知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-06
(45)【発行日】2024-08-15
(54)【発明の名称】ＩｇＥのリバースＬＦＩＡ
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20240807BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20240807BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 N
G01N33/53 Q
G01N33/543 521
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2022519709
(86)(22)【出願日】2020-10-02
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-20
(86)【国際出願番号】 US2020054027
(87)【国際公開番号】W WO2021086544
(87)【国際公開日】2021-05-06
【審査請求日】2022-04-08
(31)【優先権主張番号】62/926,528
(32)【優先日】2019-10-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】522122499
【氏名又は名称】チャン，ケ
【氏名又は名称原語表記】Ｚｈａｎｇ，Ｋｅ
【住所又は居所原語表記】２０１０ Ｍａｌｃｏｌｍ Ａｖｅｎｕｅ， Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ， ＣＡ ９００２５－６３０４ ＵＳＡ
(74)【代理人】
【識別番号】100146374
【弁理士】
【氏名又は名称】有馬 百子
(74)【代理人】
【識別番号】100205936
【弁理士】
【氏名又は名称】崔 海龍
(74)【代理人】
【識別番号】100132805
【弁理士】
【氏名又は名称】河合 貴之
(72)【発明者】
【氏名】チャン，ケ
【審査官】海野 佳子
(56)【参考文献】
【文献】米国特許第０６５２８３２５（ＵＳ，Ｂ１）
【文献】国際公開第２０１０／１１２９３４（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＩｇＥのリバースラテラルフローイムノアッセイ（ＩｇＥ Ｒ－ＬＦＩＡ）であって、それは、ラテラルフローイムノアッセイ形式で体液サンプルの臨床的アレルギー反応の原因となる高親和性のアレルゲン特異的ヒトＩｇＥを選択的に検出するために特別に設計された方法であり、以下のユニークな部材、特徴及び手順を有し、ａ．ＩｇＥＲ－ＬＦＩＡ試験装置は、コンジュゲートゾーンの上流に位置し、前記体液サンプルとランニング緩衝液を受容するためのサンプルゾーンと、液体によって移動できるアレルゲンにコンジュゲートしたナノ粒子を有するコンジュゲートゾーンと、前記コンジュゲートゾーンの下流に位置し、前記体液サンプル中のコンジュゲートされたアレルゲン及びヒトｌｇＥを含む複合体に結合し得る固定化タンパク質を有する試験ゾーンと、前記試験ゾーンの下流に位置し、前記試験ゾーンシグナルレベル対前記対照ゾーンシグナルレベルの比率を計算することによって前記アレルゲン特異的ＩｇＥレベルを定量化するために、残りの前記コンジュゲートされたアレルゲンに結合し得る固定化抗アレルゲン抗体を有する対照ゾーンとを含み、
ｂ．最適な接合のために、５．０～６．５の規定されたＰＨ範囲を有する溶液でナノ粒子にアレルゲンを直接結合することにより、アッセイ接合体を調製し、
ｃ．ヒトＩｇＥに強く結合し得るタンパク質を、前記ＩｇＥ Ｒ－ＬＦＩＡのアッセイ読み出しとして接合体と複合した前記形成済みのアレルゲン特異的ＩｇＥを捕捉する試薬として、試験ストリップの試験線の位置に事前に分注し、
ｄ．抗アレルゲン抗体を、アッセイ性能を検証する方法、及び前記試験線シグナルレベル対対照線シグナルレベルの比率を計算することによって前記アレルゲン特異的ＩｇＥレベルを正規化及び定量化するための内部アッセイ対照として残りの前記接合体を捕捉する試薬として、前記試験ストリップの前記対照線の位置に事前に分注する。実際には、前記対照線の抗体は、ナノ粒子にコンジュゲートされ、人工対照線形成のために前記アッセイ接合体に組み込まれた任意の抗原又はタンパク質に対する非アレルゲン特異的抗体であり得、
ｅ．前記臨床的アレルギー反応の原因となる高親和性（低親和性ではない）の前記アレルゲン特異的ＩｇＥを選択的に検出するために、前記サンプルをサンプルポートに追加してからサンプルフローが前記試験線の位置に到達するまでの時間を合計１２秒未満に制御し、
ｆ．試験結果を、視覚的に、又はアレルゲン特異的ＩｇＥレベルの定性的、半定量的、若しくは定量的測定が可能な設計されたラテラルフローリーダによって決定する、方法。。
【請求項2】
前記接合体は、中間の架橋リンカー又はステップなしで、前記アレルゲン特異的ＩｇＥを高感度及び高特異性で効果的に検出するためのＰＨ依存性吸収プロセスを介してアレルゲンを前記ナノ粒子に結合することによって直接調製される、請求項１に記載のＩｇＥ Ｒ－ＬＦＩＡ方法。
【請求項3】
前記ナノ粒子は、直径１００ｎｍ未満のサイズのコロイド金ナノ粒子、及び銀ナノ粒子、磁性ナノ粒子、蛍光標識ナノ粒子を含む請求項１に記載のＩｇＥ Ｒ－ＬＦＩＡ方法。
【請求項4】
前記試験線において高親和性でヒトＩｇＥに強く結合し得る前記タンパク質は、ＩｇＥに対して高親和性を有する可溶型受容体（ＦｃｅＲＩａ）と、ヒツジ、ヤギ、ハムスター、ラット、ウサギ、ニワトリ、馬、ウシ、ラクダ科の動物、リャマ、軟骨魚類、ファージディスプレイ、ヒト、ヒト化及び組み換え体に由来するポリクローナル及びモノクローナル抗ヒトＩｇＥ抗体とを含み、前記タンパク質は、個別に又は組み合わせて適用し得る、請求項１に記載のＩｇＥ Ｒ－ＬＦＩＡ方法。
【請求項5】
ＩｇＥに対して高親和性を有する前記可溶型受容体（ＦｃｅＲＩａ）は、細菌、酵母、昆虫及び哺乳類細胞から、ヒト又はマウスＩｇＧのＦｃ部分と結合した融合タンパク質などの組み換えタンパク質又は融合タンパク質として発現されたＦｃｅＲＩａの細胞外ドメインである、請求項４に記載のＩｇＥ Ｒ－ＬＦＩＡ方法。
【請求項6】
ヒトＩｇＥへの強い結合能力を有する前記タンパク質は、ヒトＩｇＥへの親和性が１０－８Ｍ超のタンパク質である、請求項１に記載のＩｇＥ Ｒ－ＬＦＩＡ方法。
【請求項7】
前記対照線における抗アレルゲン抗体は、マウス、ウサギ、ラット、ハムスター、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、ラクダ科の動物、リャマ、軟骨魚類、ヒト、ヒト化及び組み換え体に由来するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である、請求項１に記載のＩｇＥ Ｒ－ＬＦＩＡ方法。
【請求項8】
前記臨床的アレルギー反応の原因となる高親和性の前記アレルゲン特異的ＩｇＥは、それらの対応するアレルゲンに対して１０－８Ｍ超、又は１０－９Ｍ超、又は１０－１０Ｍ超、又は１０－１１Ｍ超の親和性を有するアレルゲン特異的ＩｇＥである、請求項１に記載のＩｇＥ Ｒ－ＬＦＩＡ方法。
【請求項9】
前記体液サンプルは、抗凝固剤を含む又は含まない全血、血清、血漿、母乳、涙、唾液、喀痰を含む、請求項１に記載のＩｇＥ Ｒ－ＬＦＩＡ方法。。
【請求項10】
前記アレルゲンは、食物アレルゲン、環境アレルゲン、病原性アレルゲン、及び自己アレルゲンを含む請求項１に記載のＩｇＥ Ｒ－ＬＦＩＡ方法。
【請求項11】
前記食物アレルゲンは、ピーナッツ、牛乳、卵白、貝類、魚、木の実、肉、小麦、大豆、ゴマを含む請求項１０に記載のＩｇＥ Ｒ－ＬＦＩＡ方法。
【請求項12】
前記環境アレルゲンは、イエダニ、花粉、ゴキブリ、ペットの鱗屑、カビ、及びハナバチ、カリバチ、スズメバチ、黄蜂、ヒアリの毒などの昆虫アレルゲンを含む請求項１０に記載のＩｇＥ Ｒ－ＬＦＩＡ方法。
【請求項13】
前記病原性アレルゲンは、蠕虫や他の寄生蠕虫などの寄生虫、細菌、真菌、新型コロナウイルス２０１９（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）スパイク及びヌクレオカプシドタンパク質などのウイルスのアレルゲンを含む請求項１０に記載のＩｇＥ Ｒ－ＬＦＩＡ方法。
【請求項14】
前記自己アレルゲンは、ヒト由来の可溶性タンパク質、ヒト細胞表面膜タンパク質、細胞内タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びＤＮＡ／ＲＮＡとタンパク質との複合体を含む請求項１０に記載のＩｇＥ Ｒ－ＬＦＩＡ方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１９年１０月２７日に米国特許商標庁に出願された「抗原特異的ＩｇＥの測定のためのリバースラテラルフローイムノアッセイ方法」と題された米国仮特許出願第６２／９２６，５２８号に基づき、その利益を主張し、その出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年１０月２７日に米国特許商標庁に出願された「抗原特異的ＩｇＥの測定のためのリバースラテラルフローイムノアッセイ方法」と題された米国仮特許出願第６２／９２６，５２８号に基づき、その利益を主張し、その出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、ＩｇＥが特異的で反応性である抗原を着色ナノ粒子に結合する手順を使用するリバースラテラルフローイムノアッセイにより、生物学的サンプル中の抗原特異的免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）を検出又は定量化する方法及び組成物に関する。ラテラルフローイムノアッセイ装置の試験線又は試験ストリップの領域に固定化抗ＩｇＥ抗体によって形成済みの抗原特異的ＩｇＥ－抗原－ナノ粒子複合体を捕捉及び検出する。
【背景技術】
【0003】
過去数十年にわたって、免疫クロマトグラフィー装置に関連する多数の特許を取得する。これらの装置の標準機能は、
ａ．ラテラルフローアッセイの形で、吸湿性ストリップ上の反応領域の表示を可能にするプラスチック又は紙のハウジングと、
ｂ．サンプル（尿、全血、血漿、血清、唾液、又は他の体液）を追加でき、ハウジングの一端にある開口部と、
ｃ．抗原又は抗体と反応し得る固定化特異的結合部材を有する吸湿性材料と、
ｄ．サンプルポートの反対側の一端で囲まれ、横に流れるサンプル、緩衝液及びコロイドを吸収するために使用される、吸収力のある吸湿性材料のパッド、例えば、吸収性パッドと、
ｅ．適用されたサンプルを最初に吸収するためにサンプルポートの一端で使用される吸湿性材料のストリップと、
ｆ．サンプルポート材料及びラテラルフローストリップと接触し、乾燥した着色固相試薬、抗体又は他のタンパク質でコーティングされた固相を含む、吸湿性材料のストリップとを含む。
ａ．ラテラルフローアッセイの形で、吸湿性ストリップ上の反応領域の表示を可能にするプラスチック又は紙のハウジングと、
ｂ．サンプル（尿、全血、血漿、血清、唾液、又は他の体液）を追加でき、ハウジングの一端にある開口部と、
ｃ．抗原又は抗体と反応し得る固定化特異的結合部材を有する吸湿性材料と、
ｄ．サンプルポートの反対側の一端で囲まれ、横に流れるサンプル、緩衝液及びコロイドを吸収するために使用される、吸収力のある吸湿性材料のパッド、例えば、吸収性パッドと、
ｅ．適用されたサンプルを最初に吸収するためにサンプルポートの一端で使用される吸湿性材料のストリップと、
ｆ．サンプルポート材料及びラテラルフローストリップと接触し、乾燥した着色固相試薬、抗体又は他のタンパク質でコーティングされた固相を含む、吸湿性材料のストリップとを含む。
【0004】
２種類のクロマトグラフィーイムノアッセイが一般的に説明され、そのうちの１種類では、体液（尿、全血、血漿、血清、唾液）に含まれる分析物（タンパク質、ハプテン又は小分子）が検出される。分析物は、ｈＣＧ、ＦＳＨ、ＴＳＨ、トロポニン、ミオグロブリン、血清タンパク質、ウイルス又は細菌タンパク質、ハプテン、治療薬及び乱用薬物を含む。
【0005】
他の種類のクロマトグラフィーイムノアッセイでは、検出された分析物は、ウイルス若しくは細菌タンパク質（ＨＩＶ、Ａ型及びＣ型肝炎、ヘリコバクター・ピロリ、ＥＢＶ、風疹、ＣＭＶ、ＨＳＶ、デング熱、ライム、シャーガス病、ＴＢ、トキソプラズマ、自己免疫抗原など）又はアレルゲン（花粉、カビ、ほこり／ダニ、食品、動物の上皮など）などの薬剤と特異的に反応する様々なクラスのヒト抗体（複数の抗体）である。抗体の検出に関しては、通常、以下の３つの形式が使用され、
１）着色固相又はナノ粒子は、ヒトＩｇＧ抗体と反応するタンパク質又はレクチン［タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、レンチルレクチン、ジャカリン、コンカナビリンＡ、マンナン結合タンパク質、小麦胚芽レクチン、ピーナッツレクチンなど］とコンジュゲートされる。固相は、分析対象のサンプルに含まれるＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＡと特異的に反応する抗免疫グロブリンでコーティングされ得る。この場合、吸湿性ストリップは、サンプルに含まれる特定の抗体が反応する対象の分析物を含む。
１）着色固相又はナノ粒子は、ヒトＩｇＧ抗体と反応するタンパク質又はレクチン［タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、レンチルレクチン、ジャカリン、コンカナビリンＡ、マンナン結合タンパク質、小麦胚芽レクチン、ピーナッツレクチンなど］とコンジュゲートされる。固相は、分析対象のサンプルに含まれるＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＡと特異的に反応する抗免疫グロブリンでコーティングされ得る。この場合、吸湿性ストリップは、サンプルに含まれる特定の抗体が反応する対象の分析物を含む。
【0006】
２）着色固相は、ヒト免疫グロブリンが反応する分析物を含む。この場合、吸湿性ストリップは、サンプルに含まれる特定の抗体が反応する対象の分析物も含む。
【0007】
３）着色固相又はナノ粒子には、免疫グロブリンが反応する分析物を含む。吸湿性ストリップは、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、レクチン、レンチルレクチン、ジャカリン、コンカナビリンＡ、マンナン結合タンパク質、小麦胚芽レクチン、ピーナッツレクチン、又は免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭに対する抗体の混合物などの様々なクラスの免疫グロブリン又は物質に対するタンパク質を含む。
【0008】
米国特許出願第６，５２８，３２５号（Ｈｕｂｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ）及びその後の補足版米国特許出願第６，５２８，３２５ Ｂ１号（Ｈｕｂｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ）は、抗原をクロマトグラフィー粒子に結合させるアプローチを使用し、抗原特異的ＩｇＭ、ＩｇＧ及びＩｇＡを検出するためのラテラルフローベースの方法を主張し、ＩｇＭ、ＩｇＧ及びＩｇＡを含む免疫複合体は、ニトロセルロース膜の試験線に分注された抗ＩｇＭ、抗ＩｇＧ及び抗ＩｇＡ抗体によって捕捉される。同じ特許出願の別の実施形態では、本発明者らはまた、抗ＩｇＥ抗体結合クロマトグラフィー粒子を使用してアレルゲン特異的ＩｇＥを検出する方法を主張する。このＩｇＥ検出法では、アレルゲンを吸湿性ニトロセルロース膜の試験線に固定化し、ＩｇＥ含有複合体を検出する。従って、このような抗ＩｇＥ抗体コンジュゲート粒子ベースのアレルゲン特異的ＩｇＥ検出方法は、以下、「従来のラテラルフローイムノアッセイ」と呼ばれる。
【0009】
米国特許出願第７，６２９，１２７号（Ｈｕｂｓｃｈｅｒ）は、米国特許出願第６，５２８，３２５号（Ｈｕｂｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ）に記載のラテラルフローイムノアッセイの改良版を開示し、サンプルポートの上流に緩衝液ポートを設計し、サンプルポートでのサンプル適用に続いてこの緩衝液ポートにチェイス緩衝液を適用することにより、「二段階」アプローチを使用し、アレルゲン特異的ＩｇＥ検出の読み出し及び検出感度を向上させる。この方法では、抗ＩｇＥ抗体標識コンジュゲートを緩衝液ポートとサンプルポートとの間の位置で乾燥させる。従来のＬＦＩＡのこの「二段階」の代替形式では、アレルゲンをストリップの試験領域に固定化する。
【0010】
ＩｇＥ検出のための「従来のラテラルフローイムノアッセイ」の代替形式は、欧州特許第１８９１４４７Ａ１号（Ｒｕｎｄｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ）であり、アレルゲン特異的ＩｇＥの検出を改善するために二段階アプローチが適用される。この「二段階」アッセイでは、ＩｇＥを含むサンプルを最初にサンプルポートに適用し、ウィッキングパッドに向かって流し、次にサンプルポートの上流に配置された緩衝液ポートにランニング緩衝液を適用する。乾燥した抗ＩｇＥ抗体コンジュゲートを緩衝液ポートとサンプルポートとの間の位置に堆積させる。従来のＬＦＩＡのこの「二段階」の代替形式では、アレルゲンをストリップの試験領域に固定化する。
【0011】
感度及び／又は特異性の限界により、アレルゲン特異的ＩｇＥ検出のための「従来のラテラルフローイムノアッセイ」の先行発明は、アレルギー診断、特に食物アレルギー診断に広く適用することができない。生物学的サンプル中のアレルゲン特異的ＩｇＥを検出及び定量化するための従来技術における低感度の問題を克服できる高感度且つ特異的なラテラルフローベースのアッセイを食物アレルギーを含むＩｇＥ媒介アレルギーを診断するための迅速なスクリーニング及び診断ツールとして有することが望ましい。
【発明の概要】
【0012】
本発明は、アレルゲン及び抗原特異的ＩｇＥを迅速に高感度且つ特異的に検出し得る新規リバースラテラルフローイムノアッセイ（Ｒ－ＬＦＩＡ）プラットフォーム、並びにアレルギー性疾患及び自己免疫疾患を含むＩｇＥ媒介性疾患を診断するための診断ツールとしてのポイントオブケア設定に関するものである。
【0013】
従って、本発明の目的の１つは、可溶性ＩｇＥ、食品アレルゲン、自己抗原、環境アレルゲン、昆虫抗原、寄生虫抗原、細菌及びウイルス抗原、並びにＩｇＥ媒介アレルギー性疾患、自己免疫疾患、及び他のＩｇＥ媒介性疾患の原因となる合成薬物抗原又はヘプテンを含むがそれらに限定されない様々な抗原及びアレルゲンに特異性を有するヒトＩｇＥを検出し得る新規Ｒ－ＬＦＩＡプラットフォームである。
【0014】
従って、本発明の別の１つの目的は、ピーナッツ、牛乳、卵、貝類、魚、木の実、赤身肉、小麦、大豆、ゴマなどの食物アレルギー、自己免疫に基づく肥満細胞、並びに慢性自発性蕁麻疹及び他の特発性急性と慢性蕁麻疹などの好塩基球の活性化に関与する自己抗原として機能する可溶性タンパク質、膜タンパク質、細胞内タンパク質、タンパク質－ＤＮＡ複合体、タンパク質－ＲＮＡ複合体の形態の自己抗原に対するＩｇＥ媒介性疾患、ダニ、ゴキブリ、花粉、ペットの鱗屑、カビなどの環境アレルゲン、ハナバチ、カリバチ、スズメバチ、黄蜂、ヒアリの毒などの昆虫アレルゲンに対するＩｇＥ、蠕虫、十二指腸虫、他の寄生虫などの寄生虫に対するＩｇＥ、及び合成薬、抗生物質、抗腫瘍薬に対するＩｇＥを診断できることである。
【0015】
本発明の別の１つの目的は、ポイントオブケア設定で、サンプル中の１つ以上のアレルゲン又は抗原特異的ＩｇＥを定性的、半定量的、定量的、迅速に検出できる、試験ストリップ及び／又は試験ストリップを保持するためのカセットを含むリバースラテラルフローイムノアッセイ分析を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図2】新規リバースラテラルフローイムノアッセイの機構図である。図２Ａは、ピーナッツアレルゲン特異的ＩｇＥを一例として使用した、陽性アレルゲン特異的ＩｇＥ検出の図である。図２Ｂは、ピーナッツアレルゲン特異的ＩｇＥを一例として使用した、陰性アレルゲン特異的ＩｇＥ検出の図である。図２Ｃは、Ｒ－ＬＦＩＡによって検出されたピーナッツの陽性及び陰性の結果を示す実際のストリップの例である。
【図3】リバースラテラルフローイムノアッセイ（Ｒ－ＬＦＩＡ）と従来のラテラルフローイムノアッセイ（Ｃ－ＬＦＩＡ）との比較である。図３Ａは、Ｒ－ＬＦＩＡの機構図であり、図３Ｂは、Ｃ－ＬＦＩＡの機構図である。Ｒ－ＬＦＩＡとＣ－ＬＦＩＡの両方の対応する部材は、個別にラベル付けられ、図３に示される。
【図4】同じピーナッツアレルギー血漿サンプルを使用し、Ｒ－ＬＦＩＡとＣ－ＬＦＩＡとの間の感度比較を検出する例である。アスタリスク記号は、それぞれの方法で検出される最終希釈を表す。
【図5】３つのピーナッツアレルギー血漿サンプルからＲ－ＬＦＩＡによって検出された最終希釈の例である。比較には、ＩｍｍｕｎｏＣＡＰメソッドで測定された対応する国際単位（ＩＵ）レベルが使用される。
【図6】様々な量を適用した場合のＲ－ＬＦＩＡ検出結果の例である。
【図7】既知のピーナッツアレルギーのないランダムな正規母集団からの代表的なＲ－ＬＦＩＡ検出結果の例である。
【図8】ピーナッツアレルギー性ＩｇＥを特異的に検出するが、他のアレルゲンに特異的ではないＲ－ＬＦＩＡを検出するピーナッツアレルギー性ＩｇＥの特異性の例である。
【図9】好塩基球活性化試験で確認されたピーナッツアレルギー血清サンプルのＲ－ＬＦＩＡ試験結果の例である。
【図10】予備的な診断カットオフ値決定のためのピーナッツの非アレルギー性及びアレルギー性サンプルの試験結果のまとめである。
【図11】ＩｍｍｕｎｏＣＡＰメソッド分類のクラス４よりも高いピーナッツアレルギーＩｇＥ値を持つ２８個の血漿サンプルのＲ－ＬＦＩＡ試験結果の例である。
【図12】３つのエビアレルギー血漿サンプルからＲ－ＬＦＩＡによって検出された最終希釈の例である。比較には、ＩｍｍｕｎｏＣＡＰメソッドで測定された対応するＩＵレベルが使用される。
【図13】ＩｍｍｕｎｏＣＡＰメソッド分類のクラス４よりも高いエビアレルギーＩｇＥ値を持つ１９個の血漿サンプルのＲ－ＬＦＩＡ試験結果の例である。
【発明を実施するための形態】
【0017】
本発明は、以下の説明、特許請求の範囲及び添付の図面を参照することによって理解することができる。本発明の実装を実施できるために以下に示される実施形態のこの説明は、好ましい実施形態を限定することを意図するのではなく、その特定の例として役立つことを意図する。当業者は、本発明の同じ目的を実行するための他の方法及びシステムを修正又は設計するための基礎として開示された概念及び特定の実施形態を容易に使用できることを理解すべきである。当業者はまた、その同等のアセンブリが、その最も広い形態で本発明の精神及び範囲から逸脱しないことを理解すべきである。
【0018】
３，２００万人以上のアメリカ人が、ピーナッツアレルギーなどの食物アレルギーに苦しんでいる。それらのいくつかは、現在の診断の高い偽陽性率を不必要に与える。従って、経口食品チャレンジ（ＯＦＣ）は、食物アレルギーの確定診断の絶対的基準のままである。しかし、ＯＦＣは、設備の整った医療施設で厳重な監督を必要とするリスクの高いリソースを大量に消費する手順であるため、食物アレルギー患者の大部分が日常的に利用することはできない。アレルギー反応が偶然に起こるまで、多くは確定診断なしのままである。正確な食物アレルギー診断が緊急の医療ニーズであることは明白に合意される。
【0019】
フローイムノアッセイは、環境アレルギーを含む様々な疾患のポイントオブケア（ＰＯＣ）設定に適した安価な迅速診断として広く使用される。しかし、現在のＣ－ＬＦＩＡ形式では、多くのアレルギーの有意義な診断として機能するのに十分な高感度を達成できない。利用可能な全ての市販のアレルゲン特異的ＩｇＥ試験の高い偽陽性とＣ－ＬＦＩＡの低い感度の限界を考えると、アレルゲン特異的ＩｇＥ検出のためのＲ－ＬＦＩＡの本発明は、これらの問題を軽減するように設計される。
【0020】
ピーナッツアレルギーＩｇＥ試験用のＲ－ＬＦＩＡ形式は、低親和性の交差反応性ＩｇＥを除外することで高い特異性を示すだけでなく、Ｃ－ＬＦＩＡ形式の場合と比較してＩｇＥ検出感度を約３０倍大幅に向上させ、従って、ピーナッツアレルギー診断のための臨床適用の閾値に達する。
【0021】
Ｒ－ＬＦＩＡ形式は、他の食品アレルギーＩｇＥや、同じ又は同様の高感度及び特異性を持つ他の環境アレルゲン及び自己抗原特異的ＩｇＥ試験にも適用できる。
【0022】
上記Ｒ－ＬＦＩＡは、以下の特性を備えた以下の部材で構成された試験ストリップであり、
１．サンプルパッド、
２．コンジュゲートパッド、
３．代替としてサンプルパッドとコンジュゲートパッドとの両方の目的を果たす複合パッド（図１Ａ）、
４．コンジュゲートパッドまで乾燥された抗原又はアレルゲンと結合した金ナノ粒子を含むコンジュゲート、
５．試験線の位置に抗ヒトＩｇＥ抗体が事前に分注されたタンパク質結合膜、及び対照線の位置に事前に分注された抗抗原抗体、
６．吸収性パッド、
７．上記全ての部材は、裏当て支持体に取り付けられ、
８．サンプルパッドとコンジュゲートパッドとの間、コンジュゲートパッドとタンパク質結合膜との間、及びタンパク質結合膜と吸収性パッドとの間には重なりがある。
１．サンプルパッド、
２．コンジュゲートパッド、
３．代替としてサンプルパッドとコンジュゲートパッドとの両方の目的を果たす複合パッド（図１Ａ）、
４．コンジュゲートパッドまで乾燥された抗原又はアレルゲンと結合した金ナノ粒子を含むコンジュゲート、
５．試験線の位置に抗ヒトＩｇＥ抗体が事前に分注されたタンパク質結合膜、及び対照線の位置に事前に分注された抗抗原抗体、
６．吸収性パッド、
７．上記全ての部材は、裏当て支持体に取り付けられ、
８．サンプルパッドとコンジュゲートパッドとの間、コンジュゲートパッドとタンパク質結合膜との間、及びタンパク質結合膜と吸収性パッドとの間には重なりがある。
【0023】
上記リバースラテラルフローイムノアッセイのための前記試験手順は、
１．希釈又は非希釈の試験サンプルを、０．１ｕＬから１ｕＬの容量で、又は１ｕＬから５０ｕＬの容量で、０．１ｕＬ間隔でサンプルポートに直接適用するステップと、
２．サンプルポートへのサンプルの追加に続いて、ランニング緩衝液をすぐに滴加し、又はサンプルポートに１秒間間隔で１秒間～６０秒間、及び６０秒間～１２０秒間の設計された時間枠を待つステップと、
３．あるいは、試験される様々な量のサンプル（希釈又は非希釈）をランニング緩衝液と事前に混合してから、ラテラルフロー装置のサンプルポートに適用し得るステップと、
４．サンプル中の分析物の濃度に応じて、色濃度で示される試験結果を、５秒間～１０分間、又は１０分間より長く視覚化し得るステップと、
５．設計されたラテラルフローリーダによって色濃度を視覚化し又は読み取ることができるステップとを含む。
１．希釈又は非希釈の試験サンプルを、０．１ｕＬから１ｕＬの容量で、又は１ｕＬから５０ｕＬの容量で、０．１ｕＬ間隔でサンプルポートに直接適用するステップと、
２．サンプルポートへのサンプルの追加に続いて、ランニング緩衝液をすぐに滴加し、又はサンプルポートに１秒間間隔で１秒間～６０秒間、及び６０秒間～１２０秒間の設計された時間枠を待つステップと、
３．あるいは、試験される様々な量のサンプル（希釈又は非希釈）をランニング緩衝液と事前に混合してから、ラテラルフロー装置のサンプルポートに適用し得るステップと、
４．サンプル中の分析物の濃度に応じて、色濃度で示される試験結果を、５秒間～１０分間、又は１０分間より長く視覚化し得るステップと、
５．設計されたラテラルフローリーダによって色濃度を視覚化し又は読み取ることができるステップとを含む。
【0024】
試験サンプル中の抗原（以下、ピーナッツアレルゲンを一例として使用）特異的ＩｇＥは、コンジュゲートパッドまで乾燥された金ナノ粒子（ＧＮＰ）に事前にコンジュゲートされたアレルゲンに結合し、他のＩｇＥは結合されないままになる（図２）。ピーナッツ特異的ＩｇＥ－ピーナッツアレルゲン－ＧＮＰ複合体は、吸収性パッドに向かって流れる時、試験線の位置に印刷された抗ＩｇＥ抗体（Ａｂ）によって捕捉され、視覚化可能／検出可能な試験線シグナルを形成する。ＩｇＥフリーのピーナッツアレルゲン－ＧＮＰコンジュゲートは試験線を通過するが、対照線に印刷された抗ピーナッツＭＡｂによって捕捉され、対照線シグナルを形成する（図２Ａ）。非ピーナッツアレルギーの場合、ピーナッツアレルゲン－ＧＮＰと複合体を形成して抗ＩｇＥ Ａｂを試験線で捕捉するためにピーナッツ特異的ＩｇＥを利用することはできないため、試験線シグナルは表示／検出できない。しかし、ピーナッツアレルゲン－ＧＮＰコンジュゲートは、抗ピーナッツＭＡｂによって捕捉され、対照線を形成する（図２Ｂ）。ピーナッツの陽性及び陰性サンプルの実際の試験例は図２Ｃに示される。
【0025】
Ｒ－ＬＦＩＡ形式では、アレルゲン特異的ＩｇＥ及び他のＩｇアイソタイプは、ＧＮＰに結合したアレルゲンに結合するために直接競合する（図３Ａ）。アレルゲン特異的ＩｇＥを含むＧＮＰは、試験線に固定化抗ＩｇＥ抗体によって捕捉されるが、アレルゲン特異的ＩｇＥを含まないＧＮＰは試験線を通過し、その後、対照線に固定化抗ピーナッツＭＡｂによって捕捉される。従って、サンプル中の非アレルゲン特異的ＩｇＥ（例えば、他のＩｇＥ）レベルは、理論的には、試験線への結合についてアレルゲン特異的ＩｇＥと競合する。しかし、固定化抗ＩｇＥＡｂ量が非常に過剰であるため、血清ＩｇＥレベルが試験線の全てのＩｇＥ結合能力を飽和させることができないため、このような可能性はＬＦＩＡ設定では問題にならない。
【0026】
従来のラテラルフローイムノアッセイ（Ｃ－ＬＦＩＡ）との比較である。Ｃ－ＬＦＩＡ（図３Ｂ）の場合、抗ＩｇＥ抗体はＧＮＰにコンジュゲートされる。血漿からの総ＩｇＥ、及びアレルゲン特異的ＩｇＥは、金ナノ粒子に結合した抗ＩｇＥ ＭＡｂ（抗ＩｇＥ－金コンジュゲート）によって捕捉される。金ナノ粒子を含む複合体は、アレルゲン（従ってピーナッツアレルゲン）がコーティングされた試験線上を流れる場合、アレルゲン特異的ＩｇＥが試験線で複合体を固定化するためのブリッジとして機能するため、アレルゲン特異的ＩｇＥを運ぶ複合体のみが、コーティングされたアレルゲンによって捕捉され、視覚化可能（又は検出可能）なシグナルとして堆積するが、アレルゲン特異的ＩｇＥ以外の総ＩｇＥを運ぶ金ナノ粒子複合体は、複合体が試験線を通過し、対照線でコーティングされた抗（抗ＩｇＥ）ＭＡｂによって捕捉される。この形式では、サンプル中の総ＩｇＥレベルが金ナノ粒子に結合した抗ＩｇＥへの結合についてアレルゲン特異的ＩｇＥと直接競合するため、総ＩｇＥ／アレルゲン特異的ＩｇＥ比のレベルはアッセイ感度に影響を与える重要な変数になる。この形式では、アレルゲン特異的Ｉｇ（ＩｇＭ、ＩｇＧ及びＩｇＡ）レベルは、ＧＮＰに特異的に結合してアッセイ感度に影響を与えないため、無関係である。
【0027】
（実施例１）
同じピーナッツアレルギーサンプル（ＰＬ１４２３１）を使用したＲ－ＬＦＩＡとＣ－ＬＦＩＡの検出感度の比較。アスタリスク記号は、それぞれの方法で検出される最終希釈を表す（図４）。最適なドット条件で、Ｒ－ＬＦＩＡは１：３００希釈から陽性シグナルを検出することができるが、Ｃ－ＬＦＩＡは１：１０希釈で陽性シグナルを検出することができ、ピーナッツ特異的ＩｇＥ検出に関してＣ－ＬＦＩＡよりもＲ－ＬＦＩＡの感度が３０倍高いことを示す。
同じピーナッツアレルギーサンプル（ＰＬ１４２３１）を使用したＲ－ＬＦＩＡとＣ－ＬＦＩＡの検出感度の比較。アスタリスク記号は、それぞれの方法で検出される最終希釈を表す（図４）。最適なドット条件で、Ｒ－ＬＦＩＡは１：３００希釈から陽性シグナルを検出することができるが、Ｃ－ＬＦＩＡは１：１０希釈で陽性シグナルを検出することができ、ピーナッツ特異的ＩｇＥ検出に関してＣ－ＬＦＩＡよりもＲ－ＬＦＩＡの感度が３０倍高いことを示す。
【0028】
（実施例２）
３個（ＰＡ２、ＰＡ３、ＰＡ６）のピーナッツアレルギー血漿サンプルからＲ－ＬＦＩＡによって検出された最終希釈。ＩｍｍｕｎｏＣＡＰメソッドで測定された対応するＩＵレベルは、Ｒ－ＬＦＩＡ感度限界を決定するための比較に使用される（図５）。一連の２倍希釈試験により、Ｒ－ＬＦＩＡはＩｍｍｕｎｏＣＡＰ（０．３５ＩＵ／ｍｌ、又は０．３５ｋＵＡ／Ｌ）の感度限界と同等又はそれ以下のシグナルレベルを検出できることが明らかになり、ＩｍｍｕｎｏＣＡＰＩｇＥ試験と同等又はそれ以上の感度を示す。
３個（ＰＡ２、ＰＡ３、ＰＡ６）のピーナッツアレルギー血漿サンプルからＲ－ＬＦＩＡによって検出された最終希釈。ＩｍｍｕｎｏＣＡＰメソッドで測定された対応するＩＵレベルは、Ｒ－ＬＦＩＡ感度限界を決定するための比較に使用される（図５）。一連の２倍希釈試験により、Ｒ－ＬＦＩＡはＩｍｍｕｎｏＣＡＰ（０．３５ＩＵ／ｍｌ、又は０．３５ｋＵＡ／Ｌ）の感度限界と同等又はそれ以下のシグナルレベルを検出できることが明らかになり、ＩｍｍｕｎｏＣＡＰＩｇＥ試験と同等又はそれ以上の感度を示す。
【0029】
（実施例３）
様々な量のピーナッツアレルギー血漿を使用したＲ－ＬＦＩＡ検出結果。わずか０．５ｌのＰＡ３サンプルは、Ｒ－ＬＦＩＡで測定された視覚化可能な陽性シグナルを十分にもたらす（図６）。従って、サンプル量を０．５ｕｌ～９ｕｌに段階的に増やすと、特にＡＵ値が正規化された場合、陽性シグナルレベルがほぼ直線的に増加する。これらのデータにより、Ｒ－ＬＦＩＡは高感度、診断試験用の幅広いサンプル量に対応できる実用的に柔軟なＰＡ診断ツールであることを示す。
様々な量のピーナッツアレルギー血漿を使用したＲ－ＬＦＩＡ検出結果。わずか０．５ｌのＰＡ３サンプルは、Ｒ－ＬＦＩＡで測定された視覚化可能な陽性シグナルを十分にもたらす（図６）。従って、サンプル量を０．５ｕｌ～９ｕｌに段階的に増やすと、特にＡＵ値が正規化された場合、陽性シグナルレベルがほぼ直線的に増加する。これらのデータにより、Ｒ－ＬＦＩＡは高感度、診断試験用の幅広いサンプル量に対応できる実用的に柔軟なＰＡ診断ツールであることを示す。
【0030】
（実施例４）
既知のピーナッツアレルギーのないランダムな正規母集団におけるピーナッツ特異的ＩｇＥレベル。９０％のランダムな正規母集団では、検出可能なピーナッツ特異的ＩｇＥは示されないが、約１０％は、ＡＵ＜６．０の弱い陽性を示す（例えば、サンプルＮＳ４５、図７）。これらの弱陽性サンプルは、１ｌの１００ｇ／ｍｌ粗ピーナッツ抽出物によって完全に阻害され得、Ｒ－ＬＦＩＡがランダム集団から低レベルのピーナッツ特異的ＩｇＥを検出することを示す。
既知のピーナッツアレルギーのないランダムな正規母集団におけるピーナッツ特異的ＩｇＥレベル。９０％のランダムな正規母集団では、検出可能なピーナッツ特異的ＩｇＥは示されないが、約１０％は、ＡＵ＜６．０の弱い陽性を示す（例えば、サンプルＮＳ４５、図７）。これらの弱陽性サンプルは、１ｌの１００ｇ／ｍｌ粗ピーナッツ抽出物によって完全に阻害され得、Ｒ－ＬＦＩＡがランダム集団から低レベルのピーナッツ特異的ＩｇＥを検出することを示す。
【0031】
（実施例５）
ピーナッツ特異的ＩｇＥ検出のためのＲ－ＬＦＩＡの特異性。ピーナッツＩｇＥＲ－ＬＦＩＡは、Ａｒａ ｈ１及びＡｒａ ｈ２に特異的な組み換えＩｇＥとのみ反応するが、１００ＩＵ／ｍｌのアレルゲン特異的ＩｇＥと牛乳（Ｂｏｓ ｄ５及びＢｏｓ ｄ８）、エビ（Ｐｅｎ ａ１）、卵（Ｇａｌ ｄ１）、魚（Ｇａｄ ｍ１）、樺花粉（Ｂｅｔ ｖ１）及びハウスダニ（Ｄｅｒ ｐ１）と交差反応しない。陽性対照として、ＰＡサンプルＰＬ ２６２５９は強い陽性反応性を示す（図８）。
ピーナッツ特異的ＩｇＥ検出のためのＲ－ＬＦＩＡの特異性。ピーナッツＩｇＥＲ－ＬＦＩＡは、Ａｒａ ｈ１及びＡｒａ ｈ２に特異的な組み換えＩｇＥとのみ反応するが、１００ＩＵ／ｍｌのアレルゲン特異的ＩｇＥと牛乳（Ｂｏｓ ｄ５及びＢｏｓ ｄ８）、エビ（Ｐｅｎ ａ１）、卵（Ｇａｌ ｄ１）、魚（Ｇａｄ ｍ１）、樺花粉（Ｂｅｔ ｖ１）及びハウスダニ（Ｄｅｒ ｐ１）と交差反応しない。陽性対照として、ＰＡサンプルＰＬ ２６２５９は強い陽性反応性を示す（図８）。
【0032】
（実施例６）
Ｒ－ＬＦＩＡ ＩｇＥ試験結果と好塩基球活性化試験（ＢＡＴ）の結果との相関。ＢＡＴで確認された１１個のピーナッツアレルギーサンプルは全てピーナッツＩｇＥ Ｒ－ＬＦＩＡを使用して高いＡＵレベルを示す（図９）。
Ｒ－ＬＦＩＡ ＩｇＥ試験結果と好塩基球活性化試験（ＢＡＴ）の結果との相関。ＢＡＴで確認された１１個のピーナッツアレルギーサンプルは全てピーナッツＩｇＥ Ｒ－ＬＦＩＡを使用して高いＡＵレベルを示す（図９）。
【0033】
（実施例７）
ピーナッツＩｇＥＲ－ＬＦＩＡの診断カットオフ値。この予備研究から得られたデータを使用し、カットオフ値がＡＵ＝６に設定される場合、Ｒ－ＬＦＩＡはピーナッツアレルギー診断に対して１００％（１１／１１）の陽性の予測値と１００％（２５１／２５１）の陰性の予測値を表す（図１０）。
ピーナッツＩｇＥＲ－ＬＦＩＡの診断カットオフ値。この予備研究から得られたデータを使用し、カットオフ値がＡＵ＝６に設定される場合、Ｒ－ＬＦＩＡはピーナッツアレルギー診断に対して１００％（１１／１１）の陽性の予測値と１００％（２５１／２５１）の陰性の予測値を表す（図１０）。
【0034】
（実施例８）
ピーナッツ特異的ＩｇＥレベルが１７．５ＩＵ／ｍｌを超える血漿サンプルのＲ－ＬＦＩＡＩｇＥ試験結果（ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ分類のクラスＩＶ以上）（図１１）。これらのデータは、ＩｍｍｕｎｏＣＡＰによって決定されたクラスＩＶレベルのＰＳ－ＩｇＥのサンプルの２１．５％（６／２８）に、Ｒ－ＬＦＩＡで測定されたＡＵが含まれないか非常に低いことをまとめて示す。
ピーナッツ特異的ＩｇＥレベルが１７．５ＩＵ／ｍｌを超える血漿サンプルのＲ－ＬＦＩＡＩｇＥ試験結果（ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ分類のクラスＩＶ以上）（図１１）。これらのデータは、ＩｍｍｕｎｏＣＡＰによって決定されたクラスＩＶレベルのＰＳ－ＩｇＥのサンプルの２１．５％（６／２８）に、Ｒ－ＬＦＩＡで測定されたＡＵが含まれないか非常に低いことをまとめて示す。
【0035】
（実施例９）
３つのエビアレルギー血漿サンプルからＲ－ＬＦＩＡによって検出された最終希釈。ＩｍｍｕｎｏＣＡＰメソッドで測定された対応するＩＵレベルは、Ｒ－ＬＦＩＡ感度限界を決定するための比較に使用される（図１２）。一連の２倍希釈試験により、Ｒ－ＬＦＩＡはＩｍｍｕｎｏＣＡＰ（０．３５ＩＵ／ｍｌ、又は０．３５ｋＵＡ／Ｌ）の感度限界と同等又はそれ以下のシグナルレベルを検出できることが明らかになり、ＩｍｍｕｎｏＣＡＰＩｇＥ試験と同等又はそれ以上の感度を示す。
３つのエビアレルギー血漿サンプルからＲ－ＬＦＩＡによって検出された最終希釈。ＩｍｍｕｎｏＣＡＰメソッドで測定された対応するＩＵレベルは、Ｒ－ＬＦＩＡ感度限界を決定するための比較に使用される（図１２）。一連の２倍希釈試験により、Ｒ－ＬＦＩＡはＩｍｍｕｎｏＣＡＰ（０．３５ＩＵ／ｍｌ、又は０．３５ｋＵＡ／Ｌ）の感度限界と同等又はそれ以下のシグナルレベルを検出できることが明らかになり、ＩｍｍｕｎｏＣＡＰＩｇＥ試験と同等又はそれ以上の感度を示す。
【0036】
（実施例１０）
エビ特異的ＩｇＥレベルが１７．５ＩＵ／ｍｌを超える血漿サンプルのＲ－ＬＦＩＡＩｇＥ試験結果（ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ分類のクラスＩＶ以上）（図１３）。これらのデータは、ＩｍｍｕｎｏＣＡＰによって決定されたクラスＩＶレベルのＰＳ－ＩｇＥのサンプルの１５．８％（３／１９）に、Ｒ－ＬＦＩＡで測定されたＡＵが含まれないか非常に低いことをまとめて示す。
エビ特異的ＩｇＥレベルが１７．５ＩＵ／ｍｌを超える血漿サンプルのＲ－ＬＦＩＡＩｇＥ試験結果（ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ分類のクラスＩＶ以上）（図１３）。これらのデータは、ＩｍｍｕｎｏＣＡＰによって決定されたクラスＩＶレベルのＰＳ－ＩｇＥのサンプルの１５．８％（３／１９）に、Ｒ－ＬＦＩＡで測定されたＡＵが含まれないか非常に低いことをまとめて示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
