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特許7535327がん幹細胞特異結合ペプチドを含みビタミンＢ６が結合されたポリオール基盤ポリジキシリトール遺伝子伝達体及びがん幹細胞標的治療技術
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-07
(45)【発行日】2024-08-16
(54)【発明の名称】がん幹細胞特異結合ペプチドを含みビタミンＢ６が結合されたポリオール基盤ポリジキシリトール遺伝子伝達体及びがん幹細胞標的治療技術
(51)【国際特許分類】
C07K 7/02 20060101AFI20240808BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240808BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240808BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20240808BHJP
A61K 31/711 20060101ALI20240808BHJP
A61K 47/59 20170101ALI20240808BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240808BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20240808BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240808BHJP
C08G 73/04 20060101ALI20240808BHJP
C08G 81/00 20060101ALI20240808BHJP
C12N 15/87 20060101ALI20240808BHJP
【ＦＩ】
C07K7/02
A61K48/00 ZNA
A61P35/00
A61K31/7105
A61K31/711
A61K47/59
A61P35/02
C12N15/113 Z
C12N15/09 110
C08G73/04
C08G81/00
C12N15/87 Z
【請求項の数】
18
(21)【出願番号】P 2022555099
(86)(22)【出願日】2020-03-13
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-27
(86)【国際出願番号】 KR2020003566
(87)【国際公開番号】W WO2021182663
(87)【国際公開日】2021-09-16
【審査請求日】2022-09-12
(31)【優先権主張番号】10-2020-0031434
(32)【優先日】2020-03-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】522362165
【氏名又は名称】エルバイオ インコーポレーテッド
【氏名又は名称原語表記】ＥＬＢＩＯ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】（Ｓｈｉｎ Ｒｉｍｄｏｎｇ，Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）２２０５ｈｏ ２００ｄｏｎｇ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １，Ｇｗａｎａｋ－ｒｏ Ｇｗａｎａｋ－ｇｕ Ｓｅｏｕｌ ０８８２６，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】110001139
【氏名又は名称】ＳＫ弁理士法人
(74)【代理人】
【識別番号】100130328
【弁理士】
【氏名又は名称】奥野 彰彦
(74)【代理人】
【識別番号】100130672
【弁理士】
【氏名又は名称】伊藤 寛之
(72)【発明者】
【氏名】ガルグ、バンガジ
(72)【発明者】
【氏名】パンデイ、シャムハビ
(72)【発明者】
【氏名】イ、ミョン チョル
(72)【発明者】
【氏名】キム、ボク ヒ
【審査官】太田 雄三
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１７／０２４６３０９（ＵＳ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００
Ａ６１Ｋ ４８／００
Ａ６１Ｐ ３５／００
Ｃ０７Ｋ ７／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記化学式１：
ことを特徴とするポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体（Ｄｉｘｙｌｉｔｏｌ ｄｉａｃｒｙｌａｔｅ ＶＢ－ＰＥＩ－ＴＲ７ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ、ＶＢＸＹＰ－Ｐ）。
【請求項2】
前記伝達体は、血管脳関門（ｂｌｏｏｄ ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ、ＢＢＢ）を通過する請求項１に記載のポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体。
【請求項3】
ａ）キシリトール及びアセトンを用いてアセトン／キシリトール凝縮方法によってジキシリトール（ｄｉ－ｘｙｌｉｔｏｌ）を製造する段階、ｂ）前記ａ）段階で製造したジキシリトールをアクリロイルクロライド（ａｃｒｙｌｏｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）でエステル化してジキシリトールジアクリレート（ｄＸＹＡ）を製造する段階、
ｃ）前記ｂ）段階で製造したジキシリトールジアクリレートと低分子量ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）間にマイケル付加反応を行ってポリジキシリトールポリマー（ＰｄＸＹＰ）を収得する段階、
ｄ）前記ｃ）段階で製造されたポリジキシリトールポリマー（ＰｄＸＹＰ）にビタミンＢ６を結合させる段階、
ｅ）前記ｄ）段階で製造されたビタミンＢ６を含むポリジキシリトールポリマー（ＶＢＸＹＰ）にがん幹細胞標的化ペプチド（ＴＲ－７（ａｎｔｉ－ＣＤ１３３：Ｔｈｒ－Ｉｌｅ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ））を結合させる段階、を含む
ことを特徴とするビタミンＢ６とＴＲ－７ペプチドを含むことを特徴とするポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体を製造する方法。
【請求項4】
請求項１に記載のＶＢＸＹＰ－Ｐ遺伝子伝達体に治療核酸であるＣＲＩＳＰＲ遺伝子が結合されたことを特徴とする核酸伝達複合体。
【請求項5】
請求項１に記載のＶＢＸＹＰ－Ｐ遺伝子伝達体に治療核酸であるｓｉＲＮＡが結合されたことを特徴とする核酸伝達複合体。
【請求項6】
前記核酸とポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体が１：０．５～１：１００のモル比で結合されるものである請求項４または５に記載の核酸伝達複合体。
【請求項7】
前記核酸伝達複合体が５０～２００ｎｍの平均粒子の大きさを有するものである請求項４または５に記載の核酸伝達複合体。
【請求項8】
前記核酸伝達複合体が２５～４０ｍＶ範囲のゼータ電位を示すものである請求項４または５に記載の核酸伝達複合体。
【請求項9】
前記治療核酸が、ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡとＣａｓ９遺伝子が一つのプラスミドで構成された形態である請求項４に記載の核酸伝達複合体。
【請求項10】
前記治療核酸が、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）、ｅｓｉＲＮＡ（ｅｎｄｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ－ｐｒｅｐａｒｅｄ ｓｉＲＮＡｓ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡ混成体（ｈｙｂｒｉｄ）、及びリボザイムよりなる群から選択される形態である請求項５に記載の核酸伝達複合体。
【請求項11】
前記治療核酸が、がん幹細胞のスムーズンドタンパク質（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ，ＳＭＯ）をノックアウト（Ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）するものである請求項４に記載の核酸伝達複合体。
【請求項12】
前記治療核酸が、スムーズンドタンパク質発現を抑制する、ＳＭＯ ＣＲＩＳＰＲ（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ）で配列ＴＡＴＣＧＴＧＣＣＧＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣと、ＡＧＧＡＧＧＴＧＣＧＴＡＡＣＣＧＣＡＴＣに該当するｓｇＲＮＡを含む請求項４に記載の核酸伝達複合体。
【請求項13】
前記治療核酸が、がん幹細胞のスムーズンドタンパク質（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＳＭＯ）をノックダウン（Ｋｎｏｃｋ－ｄｏｗｎ）するものである請求項５に記載の核酸伝達複合体。
【請求項14】
請求項４または５に記載の核酸伝達複合体を有効性分として含むことを特徴とする遺伝子治療用の薬学的組成物。
【請求項15】
前記核酸伝達複合体が吸入投与用剤形または注射投与用で剤形化された請求項１４に記載の組成物。
【請求項16】
前記核酸伝達複合体に含まれた治療核酸が、がん幹細胞を標的化してスムーズンドタンパク質（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＳＭＯ）の発現抑制するものである請求項１４に記載の組成物。
【請求項17】
前記組成物は、がんの治療または予防の効果を有するものである請求項１６に記載の組成物。
【請求項18】
前記がんは、多形性膠芽腫だけでなく、肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、大腸がん、結腸がん、乳がん、子宮肉腫、卵管がん腫、子宮内膜がん腫、子宮頸部がん腫、膣がん腫、外陰部がん腫、食道がん、小腸がん、甲状腺がん、副甲状線がん、軟組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、慢性または急性白血病、幼年期の固相腫瘍、分化リンパ腫、膀胱がん、腎臓がん、腎臓細胞がん腫、腎臓骨盤がん腫、第１中枢神経系リンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経橋腫及び脳下垂体アデノーマよりなる群から選択された請求項１７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ビタミンＢ６が結合されたポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体（ＶＢ－ＰｄＸＹＰまたはＶＢＸＹＰ）にがん幹細胞標的化ペプチド（ＴＲ－７ ｐｅｐｔｉｄｅ）が付着した複合体（ＶＢＸＹＰ－Ｐ）を製造する方法に関する。また、本発明は、前記遺伝子伝達体に治療核酸が結合された核酸伝達複合体、及び該当複合体を有効性分として含む遺伝子治療用の薬学的組成物に関する。また、本発明は、前記遺伝子伝達体、遺伝子伝達複合体及びこれを利用したがん幹細胞治療に関する。
【背景技術】
【0002】
グレード４の星状細胞腫である多形性膠芽腫は、最もよくある悪性の脳腫瘍であり、予後がよくなく生存率が低い。外科治療だけでは侵襲性腫瘍を完全に除去できないので、再発を防止するために化学放射線療法が主に試みられる。しかし、潜伏期にあるがん幹細胞のうち一部が治療を回避し、その後増殖及び転移して化学放射線療法に対する耐性を有した新しい腫瘍を作るが、これがすなわち腫瘍の再発原因となる。腫瘍の再発を防ぎ多形性膠芽腫を完全に治療するためには、腫瘍内部でがん幹細胞を標的とし除去する必要がある。しかし、がん幹細胞は、薬物の流出輸送体を過発現して化学治療薬物に対する抵抗性を発達させ、治療薬物を無力化する。このような難しさを克服するために、クリスパー遺伝子ハサミ技術（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）と、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）技術を利用したがん幹細胞のゲノム編集治療法に対する研究が、代案的がん治療法として注目されている。最近のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の遺伝子編集技術は、ゲノムの特定位置で遺伝子物質の追加、除去または変更を許容し、既存の他のゲノム編集方法より早く安く正確で効率的である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集ツールは、二つの主要構成要素で構成される。一つは、一本鎖のＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）で本遺伝子切断システムをゲノムの特定編集部位に案内し、二つ目の部分はＤＮＡ触媒活性を有するＣａｓ９タンパク質が該当特定部位のゲノムを切断する。この時点で、所望の遺伝子配列を獲得するために、所望の順序を挿入したり削除することができる。
【0003】
腫瘍内のがん細胞の生存及び再発に影響を及ぼすがん幹細胞の主要信号伝達体系をＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓ９システムを使用して壊すことは、がん幹細胞の死滅を誘導することにより腫瘍の根を除去する革新的な腫瘍治療法を提示することができる。がん幹細胞の生存及び維持に重要なソニック・ヘッジホッグ信号伝達体系（Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）は、中間調節者であるスムーズンド膜タンパク質（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＳＭＯ）により媒介される。したがって、このスムーズンドタンパク質は、がん誘発タンパク質に分類され、化学的抗がん薬物治療の標的になりもする。しかし、がん幹細胞は、化学療法薬物を処理した時、該当薬物の流出輸送体の発現を増加させることにより、薬物耐性を獲得して伝統的な抗がん治療に対して回避を行う。したがって、本発明者らは、がん幹細胞を標的化できる遺伝子伝達体を合成し、ＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓ９システムを使用して根本的なスムーズンドタンパク質の発現を抑制することにより、がん幹細胞の自己死滅を誘導する新しい方法提示しようとする。このようながん幹細胞のゲノム遺伝子編集によって、がん幹細胞の死滅を誘導することにより腫瘍全体の死滅を誘導することは、悪性腫瘍治療の新しい代案を提示できるものと予想される。したがって、がん幹細胞の死滅を誘導できる核酸治療剤を、多形性膠芽腫内のがん幹細胞に高い効率で伝達されるように設計された遺伝子伝達体の開発が継続的に要求されている。
【0004】
しかし、大体の脳疾患に対する治療法は効率的でないが、これは治療薬物が血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ、ＢＢＢ）を透過できないためである。血液脳関門は、血液から物質が脳組織に伝達されることを制限する脳血管構造であって、主に対外毛細管の内皮細胞の密着結合によって形成され、血管の周囲を囲んでおり、核酸を含む巨大分子に対して不透過性を有していると知られている。具体的には、脂溶性物質は血液脳関門を通過するが、極性物質、強電解質等の非脂溶性物質はうまく通過できないものと知られている。血液脳関門組織によって脳組織が有害物質から保護される長所があるが、脳組織治療に必要な放射線同位元素、色素、薬物等の伝達を防ぎ、人体内の他の組織に比べて治療物質の接近性が落ちる短所がある。血液脳関門を通過して脳組織に極性化合物の伝達さえ容易でない状況で、強い極性を有している大きな分子である核酸の伝達はさらに難しい実情である。血液脳関門以外に、生体内でヌクレアーゼによる分解、免疫除去（ｉｍｍｕｎｅ ｃｌｅａｒａｎｃｅ）、細胞流入の難しさ、非標的蓄積（ｏｆｆ ｔａｒｇｅｔ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）等のような生物学的妨害機作が脳組織への遺伝子伝達を難しくしている。
【0005】
大部分のウイルスベクターを介した遺伝子伝達は、全身的処理（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）を介しては血管脳関門を通過することができないので、一般的に脳に直接注射／注入する。しかし、形質導入は注入部位が制限的であり、直接注射する方法は脳組織に侵襲的な問題があった。このため、既存に全身的処理を介した脳組織への物質伝達効率を高めるために、マンニトールのような浸透剤の動脈注射を介して血管脳関門の透過性を増加させようとしたことがある。具体的には、高浸透圧マンニトールで組織を予備処理して細胞間の密着結合を緩め、多様な遺伝子／薬物伝達ビークルで処理した。しかし、マンニトールの効果は一時的に起きて３０分が過ぎた後には消え、しかも薬物またはＤＮＡが流入する前に効果が消えた。また、前記マンニトールの全身的処理は、血管脳関門の全体的な透過能相乗効果をもたらすことにより、伝達しようとする特定物質のみの透過能を高めることができなかった。
【0006】
仮に遺伝子が血管脳関門を通過したしても、細胞取込（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｐ－ｔａｋｅ）及びエンドソーム捕獲（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｔｒａｐｐｉｎｇ）過程を無事に経なくては標的細胞に伝達されることができず、動物の遺伝子治療において遺伝子を組織の標的細胞に伝達させることは、最も大きい障害物であり解決しなければならない課題である。したがって、がん幹細胞に標的化して正確に遺伝子を伝達させるための伝達体が必要である。がん幹細胞を標的化するために本発明者らは、がん幹細胞の特異標識因子、プロミニン－１（Ｐｒｏｍｉｎｉｎ－１）と知られた膜通過タンパク質であるＣＤ１３３に注目した。この膜通過タンパク質は、多くの標識因子のなかで最も代表的にがん幹細胞の表面に発現される。多くの研究者は、この標識因子を狙うことができる抗体または特異的ペプチドを発見した。本発明者らは、７つのアミノ酸で構成されたＣＤ１３３特異反応ペプチドであるＴＲ－７（ＴＩＳＷＰＰＲ）に注目し、がん幹細胞の表面に存在するＣＤ１３３を狙うことができるように前記ペプチドを含有している遺伝子伝達体の合成を試みた。
【0007】
遺伝子伝達体は毒性が低いかないものでなくてはならず、遺伝子を選択的かつ効果的に所望の細胞に伝達することができなければならない。このような核酸伝達体は、大きくウイルス性と非ウイルス性に分けることができる。最近まで臨床実験には、核酸伝達体で形質導入効率が高いウイルス性ベクター（ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）が使用されていた。しかし、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アデノウイルスとの複合体（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）のようなウイルス性ベクターは、製造過程が複雑なだけでなく、免疫原性、感染の可能性、炎症誘発、非特異的ＤＮＡの挿入等の安全性問題と、収容できるＤＮＡの大きさが限定されているという問題によって、人体に適用するには限界が多い。そこで現在は、非ウイルス性ベクター（ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）がウイルス性ベクターの代用として脚光を浴びている。
【0008】
非ウイルス性ベクターは、最小限の免疫反応で繰り返し投与することができ、特定細胞への特異的伝達が可能であり、保存安定性に優れ、大量生産が容易であるという長所を有している。このような非ウイルス性ベクターの例としては、陽イオン性リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）系列としてＮ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）、アルキルアンモニウム（ａｌｋｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）、陽イオン性コレステロール誘導体（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）、グラミシジン（ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎ）等がある。
【0009】
最近、非ウイルス性ベクターのうち陽イオン性高分子が、負電荷を帯びるＤＮＡとイオン結合を介した複合体を形成することができるので大きな関心を呼んでいる。このような陽イオン性高分子には、ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）、ポリ（４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリンエステル）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ［α－（４－アミノブチル）－Ｌ－グリコール酸］、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリ［Ｎ，Ｎ′－（ジメチルアミノ）エチル］メタクリレート（ＰＤＭＡＥＭＡ）等が含まれ、これらはＤＮＡを圧縮してナノ粒子を形成することにより、酵素分解からＤＮＡを保護し、早く細胞中に浸透してエンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）から抜け出せるように手助けをする。大部分の非ウイルス性ベクターは、ウイルス性ベクターに比べて生分解性、低い毒性、非免疫原性、使用上の簡便さ等の長所を有するが、相対的に低い形質導入効率、制限的な粒子の大きさ等の問題点を有している。
【0010】
特に、非ウイルス性ベクターとして使用される大部分の陽イオン性高分子は、血清濃度が低い環境である試験管内では高い形質導入効率を示すが、生体内環境では、血清に存在する各種因子により陽イオン性高分子／遺伝子複合体の形質導入効率が深刻に阻害されて、遺伝子の細胞内流入が円滑でないという問題点がある。これは、生体内では陽イオン性高分子／遺伝子複合体の表面に過度な正電荷が発生して、血漿タンパク質及び血液構成成分との非特異的相互作用が誘発されるためである。したがって、試験管内の無血清培地または血清が非常に低い濃度で存在する環境ではない、多量の血清が存在する生体内では、陽イオン性高分子の形質導入効率が顕著に低下し、これを生体内にそのまま適用する場合には、肺、肝臓及び脾臓での凝集、蓄積と、さらには網状内皮系によるオプソニン化（ｏｐｓｏｎｉｚａｔｉｏｎ）及び除去を誘発し得るため、前記陽イオン性高分子の治療的適用は大きく制限されざるを得ない。非ウイルス性ベクターとして最も広範囲に研究されているポリエチレンイミン（ＰＥＩ）もやはり生体内の形質導入効率が顕著に落ち、高い細胞毒性及び低い血液適合性による遺伝子の低い発現効果等の問題点を有している。したがって、既存の非ウイルス性ベクターの長所はそのまま維持しながら形質導入効率を増強させた核酸伝達体の開発が切実に要求されている。
【0011】
本発明者らは、多くの遺伝子伝達体を開発してきて、その中に非常に低い細胞毒性を示しながらもキシリトールダイマー骨格による血液脳関門（ｂｌｏｏｄ ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ、ＢＢＢ）の高い透過率、浸透圧活性で増加した膜透過率及び促進された細胞内取込と、ポリエチレンイミン骨格によるプロトンスポンジ効果によって顕著に向上した形質転換効率を示すポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ、ＰＥＩ）に、ジキシリトールジアクリレート（ｄｉｘｙｌｉｔｏｌ ｄｉａｃｒｙｌａｔｅ）を結合して製造したポリオール系浸透圧的遺伝子伝達体に、ビタミンＢ６とがん幹細胞特異付着ペプチド（ＴＲ－７）を結合させることにより、がん幹細胞への遺伝子伝達効率が高いだけでなく、多形性膠芽腫内のがん幹細胞を標的化して遺伝子を伝達させることができることを確認することにより本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
本発明の一つの目的は、がん幹細胞を標的化できる遺伝子伝達体として細胞毒性を示さないながらも形質転換効率が顕著に向上したがん幹細胞標的化ペプチドが結合されたポリジキシリトール基盤のポリマー遺伝子伝達体を提供することである。
【0013】
本発明の他の目的は、前記ポリジキシリトール基盤の標的型ポリマー遺伝子伝達体を製造する方法を提供することである。
【0014】
本発明のまた他の目的は、前記ポリジキシリトール基盤のポリマー遺伝子伝達体に治療核酸を結合させた核酸伝達複合体を提供することである。
【0015】
本発明のまた他の目的は、前記核酸伝達複合体を有効性分として含有する遺伝子治療用の薬学的組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0016】
前記目的を達成するための一つの様態として、以前に発明されたポリジキシリトールポリマー（ＰｄＸＹＰ）（化学式３）を最初の骨格としてビタミンＢ６を付着させると同時に、がん幹細胞の標識因子であるＣＤ１３３タンパク質に特異的に結合するペプチド（ＴＲ－７ ｐｅｐｔｉｄｅ）が装着された遺伝子伝達体（ＶＢＸＹＰ－Ｐ）を提供する。本発明は、既に開発されていた遺伝子伝達体であるポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体（ＰｄＸＹＰ、ＶＢ－ＰｄＸＹＰ（ＶＢＸＹＰ））を改良して、がん幹細胞を標的化して遺伝子を伝達させることができるように設計された。本発明の遺伝子伝達体は、下記化学式１の構造を有することができ
【0017】
【化1】
【0018】
スルホスクシンイミジル－６［４′－アジド－２′－ニトロフェニルアミノ］ヘキサノエート（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－６－［４´－ａｚｉｄｏ－２´－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｏ］ｈｅｘａｎｏａｔｅ、Ｓｕｌｆｏ－ＳＡＮＰＡＨ）は、化学式２の構造を有する。この連結体を用いて、既に開発されたＶＢ－ＰｄＸＹＰ（ＶＢＸＹＰ）遺伝子伝達体にがん幹細胞特異反応ペプチド（ＴＲ－７ ｐｅｐｔｉｄｅ）が結合されたポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体（Ｄｉｘｙｌｉｔｏｌ ｄｉａｃｒｙｌａｔｅ ＶＢ－ＰＥＩ－ＴＲ７ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ、ＶＢＸＹＰ－Ｐ）を製造し
【0019】
【化2】
【0020】
本発明のＳｕｌｆｏ－ＳＡＮＰＡＨは、ヘテロバイファンクショナル（ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）交差連結体（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ）である。この連結体のＮ－ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、ＮＨＳ）が、ｐＨ７－９の緩衝溶液環境で伝達体の低分子量ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の１次アミン基と安定したアミド結合（ａｍｉｄｅ ｂｏｎｄ）を生成させ、３００－４６０ｎｍの紫外線光反応を介してニトロフェニルアザイド（Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ａｚｉｄｅ）がジヒドロアゼピン中間体（Ｄｅｈｙｄｒｏａｚｅｐｉｎｅ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）を経てがん幹細胞特異反応ペプチドであるＴＲ－７のアミン基と結合されることによりＶＢＸＹＰ－Ｐが製造されることができる（図３）。
【0021】
本発明の用語ＴＲ－７は、がん幹細胞の表面に特異的に存在するＣＤ１３３タンパク質に特異的に結合できる計７つのアミノ酸で構成されたペプチドである。その配列は、トレオニン－イソロイシン－セリン－トリプトファン－プロリン－プロリン－アルギニン（Ｔｈｒ－Ｉｌｅ－Ｓｅｒ－Ｔｒｐ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ）で構成されている。本配列の最初のアミノ酸と最後のアミノ酸のイニシャルを取ってＴＲ－７と命名した。ＴＲ－７は、がん幹細胞表面のＣＤ１３３と特異的に反応して、ＴＲ－７を含有している前記遺伝子伝達体を用いる場合に、がん幹細胞に標的化して治療核酸を伝達させることができる可能性を高めてくれる。
【0022】
本発明の用語ポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体（ｐｏｌｙｄｉｘｙｌｉｔｏｌ ｐｏｌｙｍｅｒ ｂａｓｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ、ＰｄＸＹＰ）は、本発明者らが特許登録した遺伝子伝達体である（１０－１８０９７９５）。この伝達体は、アセトン／キシリトール凝縮方法によってジキシリトール（ｄｉ－ｘｙｌｉｔｏｌ）を製造し、前記ジキシリトールをアクリロイルクロライド（ａｃｒｙｌｏｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）でエステル化してジキシリトールジアクリレート（ｄＸＹＡ）を製造し、前記ジキシリトールジアクリレートと低分子量ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）とのマイケル付加反応（Ｍｉｃｈｅａｌ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって製造されることができる（図１
【0023】
【化3】
【0024】
用語「キシリトール（ｘｙｌｉｔｏｌ）」は、Ｃ５Ｈ１２Ｏ５の化学式を有する糖アルコール系天然甘味料の一種を意味する。白樺、柏等から抽出され、特有な５炭糖構造を有している。本発明のポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体を製造するために、キシリトール二量体であるジキシリトールを用いた。
【0025】
用語「アクリロイルクロライド（ａｃｒｙｌｏｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）」は、一名２－プロペノイルクロライドやアクリル酸クロライドとも称されることができる。前記化合物は、水と反応してアクリル酸を生産したり、カルボキシル酸ナトリウム塩と反応してアンハイドライド（ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）を形成したり、アルコールと反応してエステル基を形成する特性を有している。本発明の具体的な一実施例では、糖アルコールの一種であるキシリトールの二量体ジキシリトールとアクリロイルクロライドを反応させ、エステル化してジキシリトールジアクリレート（ｄＸＹＡ）を形成した。
【0026】
用語「ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ、ＰＥＩ）」は、一次、二次及び三次アミノ基を有し、１，０００～１００，０００ｇ／ｍｏｌのモル質量を有する陽イオン性高分子であって、陰イオン性を有する核酸を効果的に圧縮してコロイド粒子にし、ｐＨ反応性の緩衝能力による高い遺伝子伝達効率を有して、試験管内及び生体内で遺伝子を多様な細胞に効果的に伝達することができる。本発明でポリエチレンイミンは、下記化学式４で表される線形（ｌｉｎｅａｒ）または下記化学式５で表される分枝型（ｂｒａｎｃｈｅｄ－ｔｙｐｅ）であり得、その分子量は細胞毒性を考慮して低分子量、好ましくは５０～１０，０００Ｄａ（重量平均分子量基準）である。ポリエチレンイミンは、水、アルコール、グリコール、ジメチルフォルムアミド、テトラヒドロピラン、エステル類等に溶解され、高分子量の炭化水素類、オレイン酸（ｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ジエチルエーテルには溶解されない。
【0027】
【化4】
【0028】
【化5】
【0029】
また、本発明の最終遺伝子伝達体の骨格は、前記ポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体にビタミンＢ６を追加で連結したポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体、一名ビタミンＢ６結合ポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体（ＶＢ－ＰｄＸＹＰ（ＶＢＸＹＰ））である。前記ビタミンＢ６を追加で連結したものである、ポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体は下記化学式６の構造を有することができ
【0030】
【化6】
【0031】
用語「ビタミンＢ６」は、ピリドキシン（ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ、ＰＮ）、ピリドキサール（ｐｙｒｉｄｏｘａｌ、ＰＬ）、ピリドキサミン（ｐｙｒｉｄｏｘａｍｉｎｅ、ＰＭ）、またはそれぞれのリン酸化形態（ＰＮＰ、ＰＬＰ、ＰＭＰ）等で存在し、多くの生活性酵素の補酵素として使用される。特に、補酵素として使用されるにおいては、主にＰＬＰ及びＰＭＰの形態で使用され、ＰＬＰは生物学的活性が非常に大きい形態と知られている。本発明の活性型ビタミンＢ６（ピリドキサール５′リン酸、ｐｙｒｉｄｏｘａｌ ５′ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＰＬＰ）は、下記化学式７の構造を有することができ
【0032】
【化7】
【0033】
ピリドキサール５′リン酸（ｐｙｒｉｄｏｘａｌ ５′ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＰＬＰ）と前記製造されたポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体を反応させて一時的シッフ塩基（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｓｃｈｉｆｆ ｂａｓｅ）を形成するようにした。その後ＮａＣＮＢＨ４を用いて還元し、ビタミンＢ６結合ポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体を収得した（図２）。
【0034】
本発明のＶＢＸＹＰ－Ｐは、がん幹細胞の細胞膜に存在するＣＤ１３３に標的化して結合することにより、伝達体の細胞膜付着を誘導し、このように細胞膜に付着した後にはポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体によるプロトンスポンジ効果で細胞内の核酸流入が効率的に誘導されて、顕著に向上した形質転換効率を示すことができる。また、細胞毒性が非常に低く、遺伝子伝達体として遺伝子治療に有用に使用されることができる。したがって、一般がん細胞と比べてがん幹細胞に対し高い形質転換効率を示すことができる（図８、９、１０）。
【0035】
本発明のＶＢＸＹＰ－Ｐ遺伝子伝達体は、効果的な遺伝子伝達のために１，０００～１００，０００Ｄａ範囲の分子量（重量平均分子量基準）を有することが好ましい。また、本発明の遺伝子伝達体に核酸を結合した核酸伝達複合体は、１～１００ｍＶ範囲のゼータ電位（ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を有することが効果的な遺伝子伝達のために好ましく、特に２５～５０ｍＶのゼータ電位を有することができる。前記範囲の物理化学的特性を示す時、この遺伝子伝達体は細胞のエンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）内に効果的に流入することができる。
【0036】
また一つの様態として、本発明は、ジキシリトールをアクリロイルクロライド（ａｃｒｙｌｏｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）でエステル化してジキシリトールジアクリレート（ｄＸＹＡ）を製造する段階、及びこれを低分子量ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と反応させてポリジキシリトールポリマー（ＰｄＸＹＰ）を収得する段階を含み、ＰｄＸＹＰにビタミンＢ６を結合させる段階を追加で含み、ビタミンＢ６を含むポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体（ＶＢ－ＶＢＸＹＰ［ＶＢＸＹＰ］）にがん幹細胞標的化ペプチドであるＴＲ－７をＳｕｌｆｏ－ＳＡＮＰＡＨ連結体を用いてＶＢＸＹＰ－Ｐを製造する方法を提供する。
【0037】
具体的には、本発明のＶＢＸＹＰ－Ｐ遺伝子伝達体の製造方法は、
ａ）キシリトール及びアセトンを用いてアセトン／キシリトール凝縮方法によってジキシリトール（ｄｉ－ｘｙｌｉｔｏｌ）を製造する段階、
ｂ）前記ａ）段階で製造したジキシリトールをアクリロイルクロライド（ａｃｒｙｌｏｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）でエステル化してジキシリトールジアクリレート（ｄＸＹＡ）を製造する段階、
ｃ）前記ｂ）段階で製造したジキシリトールジアクリレートと低分子量ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）間にマイケル付加反応を行ってポリジキシリトールポリマー（ＰｄＸＹＰ）を収得する段階、及び
ｄ）前記ｃ）段階で製造されたポリジキシリトールポリマー（ＰｄＸＹＰ）にビタミンＢ６を結合させる段階、
ｅ）前記ｄ）段階で製造されたビタミンＢ６を含むポリジキシリトールポリマー（ＶＢＸＹＰ）にがん幹細胞標的化ペプチド（ＴＲ－７）を結合させる段階を含む
ビタミンＢ６とＴＲ－７ペプチドを含むことを特徴とするポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体を製造する方法。
ａ）キシリトール及びアセトンを用いてアセトン／キシリトール凝縮方法によってジキシリトール（ｄｉ－ｘｙｌｉｔｏｌ）を製造する段階、
ｂ）前記ａ）段階で製造したジキシリトールをアクリロイルクロライド（ａｃｒｙｌｏｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）でエステル化してジキシリトールジアクリレート（ｄＸＹＡ）を製造する段階、
ｃ）前記ｂ）段階で製造したジキシリトールジアクリレートと低分子量ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）間にマイケル付加反応を行ってポリジキシリトールポリマー（ＰｄＸＹＰ）を収得する段階、及び
ｄ）前記ｃ）段階で製造されたポリジキシリトールポリマー（ＰｄＸＹＰ）にビタミンＢ６を結合させる段階、
ｅ）前記ｄ）段階で製造されたビタミンＢ６を含むポリジキシリトールポリマー（ＶＢＸＹＰ）にがん幹細胞標的化ペプチド（ＴＲ－７）を結合させる段階を含む
ビタミンＢ６とＴＲ－７ペプチドを含むことを特徴とするポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体を製造する方法。
【0038】
また一つの様態として、本発明は、前記ＶＢＸＹＰ－Ｐ遺伝子伝達体に治療核酸が結合された核酸伝達複合体を提供する。
【0039】
本発明のＶＢＸＹＰ－Ｐに結合されることができる治療核酸の種類は特に限定されず、本発明の目的に応じて所望の標的に伝達されて所望の治療効果を発揮することができるどんな核酸も、本発明の範囲に含まれる。例えば、本発明のポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体との複合体形態で伝達が可能な遺伝子としては、疾病と関連する治療核酸の正常遺伝子、標的タンパク質の発現抑制遺伝子、アンチセンスポリヌクレオチドを含む多様なポリヌクレオチド、リボザイムやｓｉＲＮＡを含む任意のＲＮＡ形態の遺伝子が含まれることができる。すなわち、本発明の治療核酸は、ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡとＣａｓ９遺伝子を含有しているプラスミド形態であり得、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）、ｅｓｉＲＮＡ（ｅｎｄｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ－ｐｒｅｐａｒｅｄ ｓｉＲＮＡｓ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡ混成体（ｈｙｂｒｉｄ）、及びリボザイムよりなる群から選択される形態であり得る。本発明の治療核酸は、特に特定疾患の原因となる遺伝子に対して、これを過発現させるか阻害するための核酸であり得て、特にがんの発生及び再発に作用するがん幹細胞の遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）の発現を阻害するＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡとｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）、ｅｓｉＲＮＡ（ｅｎｄｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ－ｐｒｅｐａｒｅｄ ｓｉＲＮＡｓ）、アンチセンスオリゴヌクレオチドに該当する核酸か、がんの発生や進行を防ぐのに作用する遺伝子（ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ）の発現を誘導する核酸であり得る。
【0040】
特に、本発明で治療核酸は、がん幹細胞の自己再生信号体系のうちの１つであるソニック・ヘッジホッグ信号伝達体系の調節者であるスムーズンドタンパク質（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＳＭＯ）に対するＳＭＯ ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡ（配列：ＴＡＴＣＧＴＧＣＣＧＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣまたはＡＧＧＡＧＧＴＧＣＧＴＡＡＣＣＧＣＡＴＣ）とｃａｓ９を含むプラスミド、ｓｉＲＮＡまたはこれのｃｏｍｐｌｅｘ ｍｉｘｔｕｒｅであるｅｓｉＲＮＡであり得、これはＳＭＯ ｓｉＲＮＡ（ｅｓｉＲＮＡ、Ｃａｔ Ｎｏ：４３９２４２０）であり得る。
【0041】
本発明による遺伝子伝達複合体の効果的な形成のために、治療核酸とＶＢＸＹＰ－Ｐ遺伝子伝達体の１：０．５～１：１００、好ましくは１：１０～１：４０、より好ましくは１：１２～１：２８のモル比で反応させることが好ましい。
【0042】
本発明者らは、本発明によるＶＢＸＹＰ－Ｐ遺伝子伝達体の治療核酸に対する凝縮能（ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ）及びゼータ電位を調査するために、多様なモル比でＶＢＸＹＰ－Ｐ遺伝子伝達体とＤＮＡを反応させた結果、これらのモル比が１：０．５以上の場合に前記ＶＢＸＹＰ－Ｐ遺伝子伝達体とＤＮＡの遺伝子伝達複合体（ＰｄＸＹＡ／ＤＮＡ）が最も効果的に形成されることを確認した（図４）。本発明による核酸伝達複合体は、平均１５０～２００ｎｍの相対的に小さくて均一な粒子の大きさの分布を示し（図５ａ）、遺伝子伝達体として使用されるのに適した粒子の大きさを有するだけでなく、表面電荷が２５～４０ｍＶの陽性ゼータ電位（ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を示し（図５ｂ）、陰イオンの細胞表面に効果的に結合できることを確認した。
【0043】
本発明者らは、ＶＢＸＹＰ－Ｐのがん幹細胞内の吸収と分解の過程を観察し、細胞の毒性を確認した（図６、図７）。遺伝子伝達体は、細胞内で吸収が容易で分解されて細胞外放出が起きることによって細胞の毒性が低いことを予想することができ、ＭＴＴ分析の結果、がん幹細胞と多形性膠芽腫の細胞株に対して高い毒性を示す２５ｋＤ ＰＥＩに比べてＶＢＸＹＰ－Ｐの細胞毒性がほとんど示されないことを確認した。
【0044】
本発明者らは、ＶＢＸＹＰ－Ｐのがん幹細胞に対する標的化能力を確認するために、代表的な非ウイルス遺伝子伝達体とＴＲ－７が付着していないＶＢＸＹＰの遺伝子伝達能力を比較分析した（図９）。緑色蛍光タンパク質遺伝子を搭載した多くの伝達体のうち、顕著に高い遺伝子伝達能力（約６０％）を示したものはＶＢＸＹＰ－Ｐのみであることを確認した。
【0045】
本発明者らは、ＶＢＸＹＰ－ＰにＳＭＯ ＣＲＩＳＰＲ（ＳＭＯｃｒ）を搭載して、がん幹細胞に伝達したとき、死滅を誘導できるか確認した。その結果、ＶＢＸＹＰ－Ｐ／ＳＭＯｃｒを処理したがん幹細胞実験群で最も低い細胞増殖能力が確認され（図１１、図１２、図１３）、細胞死滅が起きていることが確認され（図１４、図１５）、ＳＭＯの発現のみを抑制したが、信号体系の他のタンパク質の発現まで減少することによって、ＳＭＯ発現の抑制によって細胞死滅が誘導されていることをタンパク質水準で証明した（図１６、図１７）。
【0046】
本発明者らは、ＶＢＸＹＰ－ＰにＳＭＯ ｓｉＲＮＡ（ｓｉＳＭＯ）を搭載して、がん幹細胞に伝達したとき、死滅を誘導できるか確認した。その結果、前記ＣＲＩＳＰＲを用いてＳＭＯの発現を抑制したときとほとんど同一の結果を確認した。ＶＢＸＹＰ－Ｐ／ｓｉＳＭＯを処理したがん幹細胞実験群で最も低い細胞増殖能力が確認され（図１８、図１９、図２０）、細胞死滅が起きていることが確認され（図２１、図２２）、ＳＭＯの発現のみを抑制したが、信号体系の他のタンパク質の発現まで減少することによって、ＳＭＯ発現の抑制によって細胞死滅が誘導されていることをタンパク質水準で証明した（図２３、図２４）。
【0047】
最後に本研究陣は、ＶＢＸＹＰ－Ｐが血管脳関門を透過して多形性膠芽腫内のがん幹細胞を標的化して遺伝子を伝達させることができるか確認するために、試験管内３Ｄ微細流体システムを用いて実験を行った（図２５、図２６、図２７）。その結果、ＶＢＸＹＰ－ＰはＢＢＢを通過することができ、通過した後に多形性膠芽腫内の非常に少ない量で存在するがん幹細胞に標的化して遺伝子を伝達させることができることを確認した。
【0048】
また一つの様態として、本発明は、前記ＶＢＸＹＰ－Ｐに治療核酸が結合された核酸伝達複合体を有効性分として含有する遺伝子治療用の薬学的組成物を提供する。本発明の薬学的組成物は、これを構成する治療核酸の種類によって遺伝子治療が可能な疾患の治療または予防の用途で使用されることができる。
【0049】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体と共に投与されることができ、経口投与時には前記有効性分以外に結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料等を追加で含むことができる。注射剤の場合に、本発明の薬学的組成物は、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤等を混合して使用することができる。また、局所投与時に、本発明の組成物は、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤等を使用することができる。
【0050】
本発明の組成物の剤形は、上述したように薬学的に許容可能な担体と混合して多様に製造されることができ、特に吸入投与用剤形または注射投与用として製造されることができる。例えば、経口投与時には、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、サスペンション、シロップ、ウェーハ等の形態で製造することができ、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは多重投薬形態で製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤等で剤形化することができる。吸入（ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ）を介した薬物伝達は、非侵襲的（ｎｏｎ－ｉｎｖａｓｉｖｅ）方法のうちの一つで、特に肺疾患の広範囲な治療に吸入投与用剤形（例えば、エアゾール）を介した治療核酸伝達が有利に利用されることができる。これは、肺の解剖学的構造及び位置が即刻的で非侵襲的な接近を可能にし、他の機関には影響を及ぼさないながら遺伝子伝達システムの局所適用を受けることができるためである。
【0051】
一方、製剤化に適した担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシア、アルジネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート、または鉱物油等が使用されることができる。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、防腐剤等を追加で含むことができる。
【0052】
本発明の薬学的組成物は、経口または非経口投与が可能である。本発明による薬学的組成物の投与経路は、これらに限定されるものではないが、例えば、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、腸管、舌下、または局所投与が可能である。このような臨床投与のために、本発明の薬学的組成物は、公知の技術を用いて適した剤形で製剤化することができる。例えば、経口投与時には不活性希釈剤または食用担体と混合するか、硬質または軟質ゼラチンカプセルに密封されるか、または錠剤に押型して投与することができる。経口投与用の場合、有効性分は賦形剤と混合して摂取形錠剤、頬側錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェーハ等の形態で使用されることができる。また、注射用、非経口投与用等の各種剤形は、当該技術分野の公知の技法または通用する技法によって製造することができる。
【0053】
本発明の薬学的組成物の有効投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度等によってその範囲が多様であり、当該技術分野の通常の専門家によって容易に決定することができる。
【0054】
本発明の薬学的組成物は、これを構成する治療核酸と伝達体に含有されている標的化ペプチド（ＴＲ－７）が、がん幹細胞のスムーズンドタンパク質（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＳＭＯ）発現を抑制し、がん幹細胞を標的化して死滅させるものであり得、この治療核酸は、ＳＭＯ ＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡ（配列：ＴＡＴＣＧＴＧＣＣＧＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣまたはＡＧＧＡＧＧＴＧＣＧＴＡＡＣＣＧＣＡＴＣ）とｃａｓ９を含むプラスミド、またはＳＭＯ ｓｉＲＮＡ（ｅｓｉＲＮＡ、Ｃａｔ Ｎｏ：４３９２４２０）でもあり得る。本発明の薬学的組成物は、これを構成する治療核酸の種類によってがん幹細胞の治療または予防効果を有するものであり得、前記がんは、肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、大腸がん、結腸がん、乳がん、子宮肉腫、卵管がん腫、子宮内膜がん腫、子宮頸部がん腫、膣がん腫、外陰部がん腫、食道がん、小腸がん、甲状腺がん、副甲状線がん、軟組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、慢性または急性白血病、幼年期の固相腫瘍、分化リンパ腫、膀胱がん、腎臓がん、腎臓細胞がん腫、腎臓骨盤がん腫、第１中枢神経系リンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経橋腫及び脳下垂体アデノーマよりなる群から選択されたものであり得る。
【0055】
また一つの様態として、本発明は、前記で説明した本発明のポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体、これを含む核酸伝達複合体、またはこれを含む薬学的組成物を利用した遺伝子がん幹細胞治療方法を提供する。
【発明の効果】
【0056】
本発明のビタミンＢ６とがん幹細胞特異ペプチドが結合されたポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体（ＶＢＸＹＰ－Ｐ）は、既存に存在する核酸伝達体よりがん幹細胞に対して顕著に高い核酸伝達率を有し、ＤＮＡと結合時に結合体の細胞毒性はほとんどなく、何より血液脳関門を通過して多形性膠芽腫内のがん幹細胞に標的化して特異的に核酸を伝達させて形質を転換させることを確認した。これによって、本発明の遺伝子伝達体は、生体内で腫瘍内部のがん幹細胞の発現を抑制することにより多様ながん疾患に対する遺伝子治療分野で幅広く使用されることができる。
【図面の簡単な説明】
【0057】
【図1】本発明の最初の骨格となるポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体（ＰｄＸＹＡ）を合成する過程を示す図である。
【図2】本発明の骨格となるビタミンＢ６結合ポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体（ＶＢ－ＰｄＸＹＡ）を合成する過程を示す図である。
【図3】本発明の遺伝子伝達体にがん幹細胞標的マーカーであるＴＲ－７を付着させるためにＳｕｌｆｏ－ＳＡＮＰＡＨと伝達体を合成する過程を示す図である。本発明のＳｕｌｆｏ－ＳＡＮＰＡＨが結合された伝達体にがん幹細胞標的マーカーであるＴＲ－７を合成する過程を示す図である。
【図4】本発明のポリマー遺伝子伝達体であるＶＢＸＹＰ－Ｐと、ｓｉＲＮＡまたはｐＤＮＡと結合してポリプレックス（ｐｏｌｙｐｌｅｘ）を形成する形成能をゲル遅延実験した結果を示す。ＶＢＸＹＰ－ＰとｓｉＲＮＡを０．０５、０．１、０．３、０．５、１．０のモル比（Ｎ／Ｐ）にして反応させて生成したＰｄＸＹＰ－Ｐ／ｓｉＲＮＡポリプレックスをゲル電気泳動した結果を示した図である。
【図5】本発明のポリマー遺伝子伝達体の骨格となるＶＢＸＹＰと、ＴＲ－７が付着したＶＢＸＹＰ－Ｐの大きさとゼータ電位を比較した結果である。
【図6】本発明のＶＢＸＹＰ－Ｐと緑色蛍光タンパク質遺伝子（ｔＧＦＰ ｐｌａｓｍｉｄ）複合体のがん幹細胞に対する細胞内吸収と分解の過程を示す図である。
【図7】本発明のＶＢＸＹＰ－Ｐの試験管内細胞毒性をがん幹細胞（Ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＣＳＣ）と多形性膠芽腫（Ｇｌｉｂｌａｓｔｏｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ、ＧＢＭ）でＭＴＴ分析によって評価し、ＰＥＩ ２５ ｋＤａ及びＶＢＸＹＰと比較した図である。
【図8】本発明のＶＢＸＹＰ－ＰとＤＮＡを多種の重量比（ｗ／ｗ ２：１、４：１、６：１、８：１、１０：１、２０：１）にして反応させて生成したＶＢＸＹＰ／ＤＮＡポリプレックスを、がん幹細胞と多形性膠芽腫の細胞株に処理して蛍光の発現を比較した結果を示した図である。
【図9】本発明のＶＢＸＹＰ－Ｐ遺伝子伝達体の形質転換効率を調査するために、前記遺伝子伝達体と様々に異なる遺伝子伝達体（リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ）、ＰＥＩ ２５ｋＤ、ＶＢＰＥＡ）を緑色蛍光タンパク質遺伝子（ｔＧＦＰ ｇｅｎｅ）と結合させた核酸伝達複合体を、がん幹細胞と多形性膠芽腫の細胞株に処理した後に蛍光の発現を比較した結果を示した図である。
【図10】本発明のＶＢＸＹＰ－Ｐのがん幹細胞の標的化の程度を蛍光活性細胞分類流細胞分析機（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、ＦＡＣＳ）を用いて比較分析した結果である。
【図11】本発明のＶＢＸＹＰ－Ｐとスムーズンドタンパク質（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＳＭＯ）クリスパー遺伝子ハサミプラスミド（ＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓ９ ｐｌａｓｍｉｄ）ポリプレックスをがん幹細胞に伝達したとき、がん幹細胞の増殖にどのような影響を及ぼすか細胞の生／死分析（ｃｅｌｌ ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ ａｓｓａｙ）分析をした結果である。
【図12】本発明のＶＢＸＹＰ－ＰとＳＭＯ ＣＲＩＳＰＲ（ＳＭＯｃｒ）ポリプレックスをがん幹細胞に伝達したときの細胞増殖の差を、がん幹細胞（Ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＣＳＣ）でＷＳＴ－１分析によって評価比較した図である。
【図13】本発明のＶＢＸＹＰ－ＰとＳＭＯ ＣＲＩＳＰＲ（ＳＭＯｃｒ）ポリプレックスをがん幹細胞に伝達したとき、５－エチニル－２′－デオキシウリジン（５－Ｅｔｈｙｎｙｌ－２′－ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ、ＥｄＵ）細胞増殖分析法によって細胞の増殖程度を評価比較した図である。
【図14】本発明のＶＢＸＹＰ－Ｐ用いてがん幹細胞にＳＭＯ ＣＲＩＳＰＲ伝達以後、トンネルアッセイ（ＴＵＮＥＬ ａｓｓａｙ）によって細胞死滅を評価した結果である。
【図15】本発明のＶＢＸＹＰ－Ｐを用いてがん幹細胞にＳＭＯ ＣＲＩＳＰＲ伝達以後、アネキシンＶアッセイ（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ａｓｓａｙ）によって細胞死滅を評価した結果である。
【図16】本発明のＶＢＸＹＰ－Ｐを用いてがん幹細胞にＳＭＯ ＣＲＩＳＰＲを伝達した後、スムーズンドタンパク質（ＳＭＯ）とソニック・ヘッジホッグタンパク質（Ｓｈｈ）の発現量の変化を免疫細胞化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｓｔａｉｎｉｎｇ、ＩＣＣ ｓｔａｉｎｉｎｇ）で評価分析した結果である。
【図17】本発明のＶＢＸＹＰ－Ｐを用いてがん幹細胞にＳＭＯ ＣＲＩＳＰＲを伝達した後、スムーズンドタンパク質（ＳＭＯ）とソニック・ヘッジホッグタンパク質（Ｓｈｈ）の発現量の変化をウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）タンパク質定量分析によって評価した結果である。
【図18】本発明のＶＢＸＹＰ－Ｐとスムーズンドタンパク質（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＳＭＯ）ｓｉＲＮＡのポリプレックスをがん幹細胞に伝達したとき、がん幹細胞の増殖にどのような影響を及ぼすか細胞の生／死分析（ｃｅｌｌ ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ ａｓｓａｙ）分析をした結果である。
【図19】本発明のＶＢＸＹＰ－ＰとＳＭＯ ｓｉＲＮＡのポリプレックスをがん幹細胞に伝達したとき、細胞増殖の差をがん幹細胞（Ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＣＳＣ）でＷＳＴ－１分析によって評価比較した図である。
【図20】本発明のＶＢＸＹＰ－ＰとＳＭＯ ｓｉＲＮＡ（ｓｉＳＭＯ）のポリプレックスをがん幹細胞に伝達したとき、５－エチニル－２′－デオキシウリジン（５－Ｅｔｈｙｎｙｌ－２′－ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ、ＥｄＵ）細胞増殖分析法によって細胞の増殖程度を評価比較した図面である。
【図21】本発明のＶＢＸＹＰ－Ｐを用いてがん幹細胞にＳＭＯ ｓｉＲＮＡを伝達以後、トンネルアッセイ（ＴＵＮＥＬ ａｓｓａｙ）によって細胞死滅を評価した結果である。
【図22】本発明のＶＢＸＹＰ－Ｐを用いてがん幹細胞にＳＭＯ ｓｉＲＮＡ伝達以後、アネキシンＶアッセイ（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ａｓｓａｙ）によって細胞死滅を評価した結果である。
【図23】本発明のＶＢＸＹＰ－Ｐを用いてがん幹細胞にＳＭＯ ｓｉＲＮＡを伝達した後、スムーズンドタンパク質（ＳＭＯ）とソニック・ヘッジホッグタンパク質（Ｓｈｈ）の発現量の変化を免疫細胞化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｓｔａｉｎｉｎｇ、ＩＣＣ ｓｔａｉｎｉｎｇ）で評価分析した結果である。
【図24】本発明のＶＢＸＹＰ－Ｐを用いてがん幹細胞にＳＭＯ ｓｉＲＮＡを伝達した後、スムーズンドタンパク質（ＳＭＯ）とソニック・ヘッジホッグタンパク質（Ｓｈｈ）の発現量の変化をウエスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）タンパク質定量分析によって評価した結果である。
【図25】内部に脳細胞である星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）が培養されていて、外郭通路にはヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）が培養されて試験管内３次元ＢＢＢ構造を模写した微細流体チップを利用して、本発明のＶＢＸＹＰ－ＰとＶＢＸＹＰのＢＢＢ通過可否を確認した結果と、ＢＢＢ内部細胞でｔＧＦＰの伝達による形質転換の程度を定性的に分析した結果である。
【図26】前記３次元微細流体ＢＢＢモデルチップを利用して内部にがん幹細胞のみを培養し、外郭通路にＨＵＶＥＣを培養してＢＢＢモデルを構成し、ＶＢＸＹＰ－ＰとｔＧＦＰポリプレックスのＢＢＢ通過可否とがん幹細胞に対する遺伝子の伝達可否を比較分析した結果である。
【図27】前記３次元微細流体ＢＢＢモデルチップを利用して内部に多形性膠芽腫の細胞株のみを培養し、外郭通路にＨＵＶＥＣを培養してＢＢＢモデルを構成し、ＶＢＸＹＰｄとＶＢＸＹＰ－Ｐの多形性膠芽腫内部のがん幹細胞の標的化遺伝子の伝達可否を比較分析した結果である。
【発明を実施するための最善の形態】
【0058】
本発明は、一実施例として、以前に発明されたポリジキシリトールポリマー（ＰｄＸＹＰ）（化学式３）を最初の骨格としてビタミンＢ６を付着させると同時に、がん幹細胞の標識因子であるＣＤ１３３タンパク質に特異的に結合するペプチド（ＴＲ－７ ｐｅｐｔｉｄｅ）が装着された遺伝子伝達体（ＶＢＸＹＰ－Ｐ）を提供する。本発明は、既に開発された遺伝子伝達体であるポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体（ＰｄＸＹＰ、ＶＢ－ＰｄＸＹＰ（ＶＢＸＹＰ））を改良して、がん幹細胞を標的化して遺伝子を伝達させることができるように設計された。本発明の遺伝子伝達体は、下記化学式１の構造を有することができ
【0059】
【化8】
【0060】
スルホスクシンイミジル－６［４′－アジド－２′－ニトロフェニルアミノ］ヘキサノエート（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－６－［４´－ａｚｉｄｏ－２´－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｏ］ｈｅｘａｎｏａｔｅ、Ｓｕｌｆｏ－ＳＡＮＰＡＨ）は化学式２の構造を有する。この連結体を用いて、既に開発されたＶＢ－ＰｄＸＹＰ（ＶＢＸＹＰ）遺伝子伝達体にがん幹細胞特異反応ペプチド（ＴＲ－７ ｐｅｐｔｉｄｅ）が結合されたポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体（Ｄｉｘｙｌｉｔｏｌ ｄｉａｃｒｙｌａｔｅ ＶＢ－ＰＥＩ－ＴＲ７ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ、ＶＢＸＹＰ－Ｐ）を製造した。
【発明を実施するための形態】
【0061】
以下、実施例を介して本発明をさらに詳細に説明することにする。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されない。
【0062】
実施例１：使用試薬及び物質
本発明では、本発明のビタミンＢ６を含みがん幹細胞特異ペプチドであるＴＲ－７が付着しているポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体（ＶＢＸＹＰ－Ｐ）を製造し、以下、実施例を確認するために下記の物質及び試薬を使用した。
本発明では、本発明のビタミンＢ６を含みがん幹細胞特異ペプチドであるＴＲ－７が付着しているポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体（ＶＢＸＹＰ－Ｐ）を製造し、以下、実施例を確認するために下記の物質及び試薬を使用した。
【0063】
ｂＰＥＩ（ｂｒａｎｃｈｅｄ Ｐｏｌｙ（ｅｓｔｅｒ ｉｍｉｎｅ）、Ｍｎ：１．２ｋ及び２５ｋ）、ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、アクリロイルクロライド（Ａｃｒｙｌｏｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、キシリトール（Ｘｙｌｉｔｏｌ）、ピリドキサール５－リン酸塩（ｐｙｒｉｄｏｘａｌ ５－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＰＬＰ）、４′－デオキシピリドキシン塩酸塩（４′－ｄｅｏｘｙｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ナトリウムシアノボロハイドライド（ＮａＣＮＢＨ４）、ゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、クロルプロマジン（ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅ） バフィロマイシンＡ１（ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ Ａ１）、及びＭＴＴ（３－（４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｔｈｉｏａｚｏｌ－２－ｙｌ）－２，５－ｄｉｐｈｅｎｙｌ ｔｅｔｒａ－ｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）、スルホスクシンイミジル－６［４′－アジド－２′－ニトロフェニルアミノ］ヘキサノエート（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－６－［４´－ａｚｉｄｏ－２´－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｏ］ｈｅｘａｎｏａｔｅ，Ｓｕｌｆｏ－ＳＡＮＰＡＨ）等の試薬は、シグマ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）製品を使用した。がん幹細胞の標識因子であるＣＤ１３３結合ペプチドであるＴＲ－７は、Ａ＆ＰＥＰ社を介して合成した。また、ホタルルシフェラーゼ（ｆｉｒｅｆｌｙ，Ｐｈｏｔｏｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）を暗号化するルシフェラーゼレポーター（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ）、ｐＧＬ３－ベクター及びエンハンサーはプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）から得た。ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子は、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から得た。共焦点顕微鏡分析にはＴＲＩＴＣ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）とＹＯＹＯ－１ ｉｏｄｉｄｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，インビトロジェン、Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）染料を使用した。スクランブルｓｉＲＮＡ（ｓｉＳｃｒ）は、ジェノルーションファーマシューティカル株式会社（Ｇｅｎｏｌｕｔｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）で購入し、スムーズンドｓｉＲＮＡ（ｓｉＳＭＯ）はサーモフィッシャー社（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）で購入した。また、スムーズンドＳＭＯクリスパー（ＳＭＯｃｒ）はジェンスクリプト社（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，ＵＳＡ）から得た。最後に、３Ｄ ＢＢＢ微細流体チップはシンビーボ社（Ｓｙｎｖｉｖｏ，ＵＳＡ）から購入した。
【0064】
実施例２：ビタミンＢ６とＴＲ－７ペプチドが結合されたポリオール系浸透圧的ポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体の製造
本発明によるビタミンＢ６とＴＲ－７ペプチドが結合されたポリオール系浸透圧的ポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体（ＶＢＸＹＰ－Ｐ）は、下記の５段階を介して合成した。この発明の遺伝子伝達体は、発明者らが以前に発明した特許物質を改良及び改善して発明した。したがって４段階までは登録特許（１０－１８０９７９５）を引用した。
本発明によるビタミンＢ６とＴＲ－７ペプチドが結合されたポリオール系浸透圧的ポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体（ＶＢＸＹＰ－Ｐ）は、下記の５段階を介して合成した。この発明の遺伝子伝達体は、発明者らが以前に発明した特許物質を改良及び改善して発明した。したがって４段階までは登録特許（１０－１８０９７９５）を引用した。
【0065】
２－１．ジキシリトールの合成
本発明者らは、ヒドロキシグループの数と立体構造（ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）が細胞間伝達に影響を及ぼすことに着眼して、浸透圧活性ヒドロキシグループを調節して細胞内伝達効率を高めた遺伝子伝達物質を開発しようとした。商業的に購買可能な８つのヒドロキシグループを有する糖アルコールが存在しないことにより、本発明者らは、図１の過程を介してオクタマーの類似体として、キシリトール二量体、ジキシリトール（ｄｉｘｙｌｉｔｏｌ）を直接合成した。
本発明者らは、ヒドロキシグループの数と立体構造（ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）が細胞間伝達に影響を及ぼすことに着眼して、浸透圧活性ヒドロキシグループを調節して細胞内伝達効率を高めた遺伝子伝達物質を開発しようとした。商業的に購買可能な８つのヒドロキシグループを有する糖アルコールが存在しないことにより、本発明者らは、図１の過程を介してオクタマーの類似体として、キシリトール二量体、ジキシリトール（ｄｉｘｙｌｉｔｏｌ）を直接合成した。
【0066】
具体的には、キシリトールをまずＲａｙｍｏｎｄ及びＨｕｄｓｏｎのアセトン／キシリトール凝縮方法を用いてジアセトンキシリトール（ｄｉａｃｅｔｏｎｅ ｘｙｌｉｔｏｌ，Ｘｙ－Ａｃ）結晶に結晶化した。ジアセトンキシリトールの末端ヒドロキシグループをｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｐｈｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＣＦ３ＳＯ２－Ｏ－ＳＯ２ＣＦ３）と反応させトリフルオロメタンスルホニルキシリトール（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｐｈｏｎｙｌ ｘｙｌｉｔｏｌ，ＴＭＳＤＸ）を生産した。前記製造したトリフルオロメタンスルホニルキシリトールを乾燥ＴＨＦ存在下でジアセトンキシリトールを同一のモル量で反応させ、ジキシリトールジアセトン（Ｘｙ－Ａｃ二量体）を形成した。この反応生成物をＨＣｌ／ＭｅＯＨ溶液で化学式環を開放させて、キシリトール二量体に最終転換させた（図１の（ａ））。
【0067】
２－２．ジキシリトールジアクリレートの合成
ジキシリトールジアクリレート（ｄＸＹＡ）単量体を、２当量のアクリロイルクロライド（Ａｃｒｙｌｏｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）でジキシリトールをエステル化して合成した。ＤＭＦ（２０ｍｌ）及びピリジン（１０ｍｌ）中にジキシリトール（１ｇ）を溶解させ、一定に撹拌しながら４℃でアクリロイルクロライド溶液（５ｍｌＤＭＦ中１．２ｍｌ溶解）を滴下方式で添加してエマルジョンを製造した。反応が完了した後、ＨＣｌ－ピリジン塩をろ過し、前記ろ過物をジエチルエーテルに一滴ずつ落とした。前記生成物をシロップ液で沈殿させ真空下で乾燥させた。
ジキシリトールジアクリレート（ｄＸＹＡ）単量体を、２当量のアクリロイルクロライド（Ａｃｒｙｌｏｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）でジキシリトールをエステル化して合成した。ＤＭＦ（２０ｍｌ）及びピリジン（１０ｍｌ）中にジキシリトール（１ｇ）を溶解させ、一定に撹拌しながら４℃でアクリロイルクロライド溶液（５ｍｌＤＭＦ中１．２ｍｌ溶解）を滴下方式で添加してエマルジョンを製造した。反応が完了した後、ＨＣｌ－ピリジン塩をろ過し、前記ろ過物をジエチルエーテルに一滴ずつ落とした。前記生成物をシロップ液で沈殿させ真空下で乾燥させた。
【0068】
２－３．ポリキシリトールポリマー（ＰｄＸＹＰ）の合成
本発明のポリキシリトールポリマー（ＰｄＸＹＰ）は、低分子量ｂＰＥＩ（Ｐｏｌｙ ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｉｍｉｄｅ，１．２ｋ）とジキシリトールジアクリレート（ｄＸＹＡ）間にマイケル付加反応を介して製造した。
本発明のポリキシリトールポリマー（ＰｄＸＹＰ）は、低分子量ｂＰＥＩ（Ｐｏｌｙ ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｉｍｉｄｅ，１．２ｋ）とジキシリトールジアクリレート（ｄＸＹＡ）間にマイケル付加反応を介して製造した。
【0069】
具体的には、ＤＭＳＯ（５ｍｌ）中に溶解された合成ｄＸＹＡ（０．３８ｇ）を１当量のｂＰＥＩ（１．２ｋＤａ、１０ｍｌＤＭＳＯ中に溶解される）に滴下方式で添加し、２４時間の間一定に撹拌しながら６０℃で反応させた。反応が完了した後、混合物を蒸溜水に対して４℃で３６時間の間Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ膜（ＭＷＣＯ：３５００Ｄａ；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して透析した。最後に、前記合成重合体を凍結乾燥させて－７０℃で保存した。
【0070】
２－４．ビタミンＢ６結合ポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体（ＶＢ－ＰｄＸＹＰまたはＶＢＸＹＰ）の合成
ピリドキサール５′リン酸（ｐｙｒｉｄｏｘａｌ ５′ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＰＬＰ）とポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体（ＰｄＸＹＰ）を反応させ、一時的シッフ塩基（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｓｃｈｉｆｆ ｂａｓｅ）を形成するようにした。その後、ＮａＣＮＢＨ４を用いて還元してビタミンＢ６結合ポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体（ＶＢ－ＰｄＸＹＰまたはＶＢＸＹＰ）を収得した（図２）。
ピリドキサール５′リン酸（ｐｙｒｉｄｏｘａｌ ５′ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＰＬＰ）とポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体（ＰｄＸＹＰ）を反応させ、一時的シッフ塩基（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｓｃｈｉｆｆ ｂａｓｅ）を形成するようにした。その後、ＮａＣＮＢＨ４を用いて還元してビタミンＢ６結合ポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体（ＶＢ－ＰｄＸＹＰまたはＶＢＸＹＰ）を収得した（図２）。
【0071】
２－５．ビタミンＢ６とＴＲ－７が結合されたポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体（ＶＢＸＹＰ－Ｐ）の合成
Ｓｕｌｆｏ－ＳＡＮＰＡＨのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ，ＮＨＳ）がｐＨ７－９緩衝溶液環境でＶＢＸＹＰ遺伝子伝達体の低分子量ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の１次アミン基と安定したアミド結合（ａｍｉｄｅ ｂｏｎｄ）を生成させ、３００－４６０ｎｍの紫外線光反応を介してニトロフェニルアザイド（Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ａｚｉｄｅ）がジヒドロアゼピン中間体（Ｄｅｈｙｄｒｏａｚｅｐｉｎｅ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）を経てがん幹細胞特異反応ペプチドであるＴＲ－７のアミン基と結合されることによりＶＢＸＹＰ－Ｐを収得した（図３）。
Ｓｕｌｆｏ－ＳＡＮＰＡＨのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ，ＮＨＳ）がｐＨ７－９緩衝溶液環境でＶＢＸＹＰ遺伝子伝達体の低分子量ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の１次アミン基と安定したアミド結合（ａｍｉｄｅ ｂｏｎｄ）を生成させ、３００－４６０ｎｍの紫外線光反応を介してニトロフェニルアザイド（Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ａｚｉｄｅ）がジヒドロアゼピン中間体（Ｄｅｈｙｄｒｏａｚｅｐｉｎｅ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）を経てがん幹細胞特異反応ペプチドであるＴＲ－７のアミン基と結合されることによりＶＢＸＹＰ－Ｐを収得した（図３）。
【0072】
実施例３：ポリマー遺伝子伝達体の特性分析
３－１．ポリマー遺伝子伝達体のナノプレックス（ＶＢＸＹＰ－Ｐ ｎａｎｏｐｌｅｘ）形成
本発明のＶＢＸＹＰ－Ｐは、ｐＤＮＡまたはｓｉＲＮＡと結合してポリプレックス（ｐｏｌｙｐｌｅｘ）形成する形成能を、ゲル遅延実験を介して確認した。具体的には、ＰｄＸＹＰとｐＤＮＡまたはｓｉＲＮＡを、０．０５、０．１、０．３、０．５、及び１．０のモル比（Ｎ／Ｐ）にして反応させて生成したＶＢＸＹＰ－Ｐ／ｐＤＮＡまたはＶＢＸＹＰ－Ｐ／ｓｉＲＮＡポリプレックスを、ゲル電気泳動してゲル遅延実験を行った。その結果、ＶＢＸＹＰ－Ｐ／ｓｉＲＮＡの場合、Ｎ／Ｐ０．３、０．５、１のモル比でポリプレックスがよく形成され（図４ａ）、ＶＢＸＹＰ－Ｐ／ＤＮＡの場合、Ｎ／Ｐ０．５、１のモル比でポリプレックスがよく形成されることを確認した（図４ｂ）。
３－１．ポリマー遺伝子伝達体のナノプレックス（ＶＢＸＹＰ－Ｐ ｎａｎｏｐｌｅｘ）形成
本発明のＶＢＸＹＰ－Ｐは、ｐＤＮＡまたはｓｉＲＮＡと結合してポリプレックス（ｐｏｌｙｐｌｅｘ）形成する形成能を、ゲル遅延実験を介して確認した。具体的には、ＰｄＸＹＰとｐＤＮＡまたはｓｉＲＮＡを、０．０５、０．１、０．３、０．５、及び１．０のモル比（Ｎ／Ｐ）にして反応させて生成したＶＢＸＹＰ－Ｐ／ｐＤＮＡまたはＶＢＸＹＰ－Ｐ／ｓｉＲＮＡポリプレックスを、ゲル電気泳動してゲル遅延実験を行った。その結果、ＶＢＸＹＰ－Ｐ／ｓｉＲＮＡの場合、Ｎ／Ｐ０．３、０．５、１のモル比でポリプレックスがよく形成され（図４ａ）、ＶＢＸＹＰ－Ｐ／ＤＮＡの場合、Ｎ／Ｐ０．５、１のモル比でポリプレックスがよく形成されることを確認した（図４ｂ）。
【0073】
３－２．ポリマー遺伝子伝達体のナノプレックス（ＶＢＸＹＰ－Ｐ ｎａｎｏｐｌｅｘ）の大きさ及びゼータ電位
本発明のＶＢＸＹＰ－Ｐと以前に発明したＶＢＸＹＰの大きさとゼータ電位を、動的光散乱（ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）装置を用いて比較分析した（図５）。その結果、ＶＢＸＹＰよりＶＢＸＹＰ－Ｐが大きさがより大きく、ＶＢＸＹＰのゼータ電位がＶＢＸＹＰ－Ｐよりさらに大きいか同じくらいであった。理論的に、ＴＲ－７ペプチドがＰｄＸＹＰのアミン基に付着するのでゼータ電位が減少する。
本発明のＶＢＸＹＰ－Ｐと以前に発明したＶＢＸＹＰの大きさとゼータ電位を、動的光散乱（ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）装置を用いて比較分析した（図５）。その結果、ＶＢＸＹＰよりＶＢＸＹＰ－Ｐが大きさがより大きく、ＶＢＸＹＰのゼータ電位がＶＢＸＹＰ－Ｐよりさらに大きいか同じくらいであった。理論的に、ＴＲ－７ペプチドがＰｄＸＹＰのアミン基に付着するのでゼータ電位が減少する。
【0074】
３－３．ポリマー遺伝子伝達体のナノプレックス（ＶＢＸＹＰ－Ｐ ｎａｎｏｐｌｅｘ）の細胞内吸収と細胞毒性の評価
図６は、ＶＢＸＹＰ－Ｐの細胞内吸収と分解の過程を示している。赤色蛍光を示すＴＲＩＴＣをＶＢＸＹＰ－Ｐ遺伝子伝達体にタグした後、緑色蛍光タンパク質遺伝子とポリプレックスを形成させてがん幹細胞に処理し、７日の間、変化を観察した。その結果、３時間後に赤い蛍光を帯びたＶＢＸＹＰ－Ｐが細胞全体に発見される。しかし、時間が流れ７日が過ぎるまでに赤い蛍光が次第に消えていき、緑色蛍光が細胞内でたくさん発現されていることを確認した。これは伝達体のがん幹細胞内によく吸収されるだけでなく、遺伝子伝達がうまくなされ、分解されて細胞内に残っていないようになることを意味する。このように伝達体がよく分解されて細胞外に放出されるなら、細胞毒性が低くなることが予想できる。
図６は、ＶＢＸＹＰ－Ｐの細胞内吸収と分解の過程を示している。赤色蛍光を示すＴＲＩＴＣをＶＢＸＹＰ－Ｐ遺伝子伝達体にタグした後、緑色蛍光タンパク質遺伝子とポリプレックスを形成させてがん幹細胞に処理し、７日の間、変化を観察した。その結果、３時間後に赤い蛍光を帯びたＶＢＸＹＰ－Ｐが細胞全体に発見される。しかし、時間が流れ７日が過ぎるまでに赤い蛍光が次第に消えていき、緑色蛍光が細胞内でたくさん発現されていることを確認した。これは伝達体のがん幹細胞内によく吸収されるだけでなく、遺伝子伝達がうまくなされ、分解されて細胞内に残っていないようになることを意味する。このように伝達体がよく分解されて細胞外に放出されるなら、細胞毒性が低くなることが予想できる。
【0075】
図７は、ＶＢＸＹＰ－Ｐのがん幹細胞と多形性膠芽腫の細胞株に対する細胞毒性の分析結果である。遺伝子伝達に一般的に使用される２５ｋＤ ＰＥＩと以前に発明したＶＢＸＹＰの細胞毒性を共に比較した。その結果、高い毒性を示す２５ｋＤ ＰＥＩに比べてＶＢＸＹＰ－Ｐの細胞毒性がほとんど示されないことを確認した。
【0076】
実施例４：ビタミンＢ６とＴＲ－７ペプチドが結合されたポリオール系浸透圧的ポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体（ＶＢＸＹＰ－Ｐ）のがん幹細胞の標的化
がん幹細胞に対する最適の遺伝子伝達率を示すＶＢＸＹＰ－Ｐと遺伝子の比率（ｗ／ｗ）を確認した結果、８：１の比率で製作したポリプレックスが最も高い遺伝子伝達能力を有することを確認した（図８）。
がん幹細胞に対する最適の遺伝子伝達率を示すＶＢＸＹＰ－Ｐと遺伝子の比率（ｗ／ｗ）を確認した結果、８：１の比率で製作したポリプレックスが最も高い遺伝子伝達能力を有することを確認した（図８）。
【0077】
また、ＶＢＸＹＰ－Ｐのがん幹細胞の標的化遺伝子の伝達能力を確認するために、発明者が以前に発明した遺伝子伝達体と商用化されたいくつかの非ウイルス遺伝子伝達体（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００、２５ｋＤ ＰＥＩ、ＶＢＰＥＡ、ＰｄＸＹＰ、ＶＢＸＹＰ）との遺伝子伝達効率を比較した（図９）。その結果、がん幹細胞に対して、ただＶＢＸＹＰ－Ｐ伝達体のみが非常に高い効率で形質転換をさせた。がん幹細胞標的化ペプチドであるＴＲ－７が付着していなかったＶＢＸＹＰの場合、約３％の形質転換を起こしたが、ＶＢＸＹＰ－Ｐの場合は約６０％の形質転換を誘発させた。このような結果により、ＴＲ－７ががん幹細胞の標的化に有意味に作用するということを確認した。
【0078】
また、一つ非常に興味深い結果が確認された。ＴＲ－７が付着していないＶＢＸＹＰの場合、がん幹細胞に対する形質転換効率は低かったが、多形性膠芽腫の細胞株に対しては他の伝達体に比べて最も高い効率を示した。以前の特許（１０－２０１５－００１４３９９、１０－１８０９７９５）で確認された、ビタミンＢ６が結合された遺伝子伝達体を用いたとき、がん細胞に対して遺伝子伝達能力が優れることが、他の細胞株でも同じく適用されることを確認した。がん組織はビタミンＢ６の消耗量が高いので、細胞外ビタミンＢ６の吸収率が高い。したがってビタミンＢ６が結合された遺伝子伝達体は、がん組織に特異的な遺伝子伝達能を有することができる。ＶＢＸＹＰ－ＰもまたビタミンＢ６を含有しているが、多形性膠芽腫の細胞株に対して５％未満の遺伝子伝達効率が確認された。これはビタミンＢ６による遺伝子伝達より、ＴＲ－７による標的化伝達が優先順位にあることを予想することができる。
【0079】
さらに正確にＶＢＸＹＰ－Ｐのがん幹細胞標的化遺伝子の伝達能力を確認するために、がん幹細胞をアロフィコシアニン（ＡｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉＮ，ＡＰＣ）が付着したＣＤ１３３抗体で標識し、ＶＢＸＹＰ－Ｐ／ＧＦＰを処理した後、ＦＡＣＳ分析によって標的化能力を比較した（図１０）。その結果、ＴＲ－７がないＶＢＸＹＰに比べてＶＢＸＹＰ－Ｐの標的化能力がはるかに高いということが確認された。
【0080】
実施例５：ＶＢＸＹＰ－Ｐとクリスパーキャスナイン（ＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓ９）システムを利用したがん幹細胞のスムーズンド（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＳＭＯ）タンパク質のノックアウト（Ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）誘導による細胞死滅誘導
５－１．スムーズンドクリスパー（ＳＭＯｃｒ）の伝達によるがん幹細胞の細胞増殖の変化
最初に、細胞の生／死（ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ）分析によってＶＢＸＹＰ－Ｐ／ＳＭＯｃｒの処理以後のがん幹細胞の増殖能力の変化を確認した（図１１）。生きている細胞は緑色蛍光を帯び、死んでいく細胞は赤色蛍光を発現する。実験結果、ＶＢＸＹＰ－Ｐ／ＳＭＯｃｒを処理してがん幹細胞グループで、死んでいく細胞の比率が最も高いことが確認された。また、ＷＳＴ－１増殖評価によっても、ＶＢＸＹＰ－Ｐ／ＳＭＯｃｒを処理した実験群で有意味に同じ結果を得ることができた（図１２）。最後に、新たに合成される遺伝子に結合されて蛍光を示すＥｄＵ分析によって、ＳＭＯｃｒの伝達ががん幹細胞に及ぼす増殖能力を確認した（図１３）。その結果、前記実験結果と同じくＶＢＸＹＰ－Ｐ／ＳＭＯｃｒを処理した実験群で最も低い蛍光発現が現れた。これらの結果により、ＳＭＯｃｒの伝達ががん幹細胞の増殖能力を大きく減少させることを確認し、細胞の死滅が誘導するものであるという仮説を立てるようになった。
５－１．スムーズンドクリスパー（ＳＭＯｃｒ）の伝達によるがん幹細胞の細胞増殖の変化
最初に、細胞の生／死（ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ）分析によってＶＢＸＹＰ－Ｐ／ＳＭＯｃｒの処理以後のがん幹細胞の増殖能力の変化を確認した（図１１）。生きている細胞は緑色蛍光を帯び、死んでいく細胞は赤色蛍光を発現する。実験結果、ＶＢＸＹＰ－Ｐ／ＳＭＯｃｒを処理してがん幹細胞グループで、死んでいく細胞の比率が最も高いことが確認された。また、ＷＳＴ－１増殖評価によっても、ＶＢＸＹＰ－Ｐ／ＳＭＯｃｒを処理した実験群で有意味に同じ結果を得ることができた（図１２）。最後に、新たに合成される遺伝子に結合されて蛍光を示すＥｄＵ分析によって、ＳＭＯｃｒの伝達ががん幹細胞に及ぼす増殖能力を確認した（図１３）。その結果、前記実験結果と同じくＶＢＸＹＰ－Ｐ／ＳＭＯｃｒを処理した実験群で最も低い蛍光発現が現れた。これらの結果により、ＳＭＯｃｒの伝達ががん幹細胞の増殖能力を大きく減少させることを確認し、細胞の死滅が誘導するものであるという仮説を立てるようになった。
【0081】
５－２．スムーズンドクリスパー（ＳＭＯｃｒ）の伝達によるがん幹細胞の自己死滅（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）誘導の確認
ＳＭＯｃｒの伝達によるがん幹細胞の死滅が誘導されるか、トンネルアッセイ（ＴＵＮＥＬ ａｓｓａｙ）とオアネキシンＶ（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ）分析を行った（図１４、図１５）。トンネル分析は、カラーメトリックトンネル分析（Ｃｏｌｏｒｍｅｔｒｉｃ ｔｕｎｅｌ ａｓｓａｙ）方法を採用した。この分析法は、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＴｄＴ）という酵素を用いて、ウリジントリホスフェート（ｕｒｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＵＴＰ）を損傷したＤＮＡの３′末端に結合し、染色して濃い茶色を帯びるようになって細胞の自己死滅が起きた細胞を光学顕微鏡で観察する容易な方法である。実験結果、ＶＢＸＹＰ－Ｐ／ＳＭＯｃｒを処理したがん幹細胞実験群で濃い茶色が最も多く観察された。
ＳＭＯｃｒの伝達によるがん幹細胞の死滅が誘導されるか、トンネルアッセイ（ＴＵＮＥＬ ａｓｓａｙ）とオアネキシンＶ（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ）分析を行った（図１４、図１５）。トンネル分析は、カラーメトリックトンネル分析（Ｃｏｌｏｒｍｅｔｒｉｃ ｔｕｎｅｌ ａｓｓａｙ）方法を採用した。この分析法は、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＴｄＴ）という酵素を用いて、ウリジントリホスフェート（ｕｒｉｄｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＵＴＰ）を損傷したＤＮＡの３′末端に結合し、染色して濃い茶色を帯びるようになって細胞の自己死滅が起きた細胞を光学顕微鏡で観察する容易な方法である。実験結果、ＶＢＸＹＰ－Ｐ／ＳＭＯｃｒを処理したがん幹細胞実験群で濃い茶色が最も多く観察された。
【0082】
アネキシンＶ分析方法は、細胞の自己死滅の初期段階に細胞膜構造が壊れて細胞内部のホスファチジルセリン（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ）が細胞外部に露出するが、これと結合して蛍光を示すようになって細胞の自己死滅の初期を確認させてくれる。この実験の結果は、トンネル分析の結果と同様に、ＶＢＸＹＰ－Ｐ／ＳＭＯｃｒを処理した実験群で最も多くの蛍光が発現された。このような結果から、がん幹細胞のＳＭＯタンパク質を、ＳＭＯｃｒを用いてノックアウトさせることによってがん幹細胞の死滅を誘導できることを証明した。
【0083】
５－３．スムーズンドタンパク質のノックアウト以後のタンパク質発現の分析
本発明のＶＢＸＹＰ－Ｐを用いてＳＭＯｃｒをがん幹細胞に伝達させることによりＳＭＯのノックアウトを誘導し、それに伴うタンパク質発現の変化を免疫蛍光染色法で分析した（図１６）。その結果、ＶＢＸＹＰ－Ｐ／ＳＭＯｃｒを処理したがん幹細胞で、ＳＭＯタンパク質（緑色）とソニック・ヘッジホッグ（Ｓｈｈ）タンパク質が他の実験群に比べて最も低く発現され、ウエスタンブロットを介した定量的分析結果もまた、同じ結果が確認された（図１７）。ＳＭＯタンパク質は比較群に比べて約８６％減少し、Ｓｈｈタンパク質は比較群に比べて約９２％減少することを示した。Ｓｈｈタンパク質の場合、ディスパッチ（Ｄｉｓｐａｔｃｈ）タンパク質から自己分泌（ａｕｔｏｃｒａｉｎｅ）または傍分泌（ｐａｒａｃｒｉｎｅ）の方式で放出がなされるが、ＳＭＯタンパク質の発現抑制を介して、細胞の自己死滅が起きている細胞から不完全にＳｈｈが放出されるもので、自然にＳｈｈタンパク質の量が減少するのである。Ｓｈｈは、がん幹細胞の自己再生を誘導するソニック・ヘッジホッグ信号伝達体系を開始する重要なタンパク質である。しかし、ＳＭＯのノックアウトによってＳｈｈタンパク質の発現が減少し、これに伴いがん幹細胞の自己再生能力が落ち、細胞死滅が加速化され得るのである。
本発明のＶＢＸＹＰ－Ｐを用いてＳＭＯｃｒをがん幹細胞に伝達させることによりＳＭＯのノックアウトを誘導し、それに伴うタンパク質発現の変化を免疫蛍光染色法で分析した（図１６）。その結果、ＶＢＸＹＰ－Ｐ／ＳＭＯｃｒを処理したがん幹細胞で、ＳＭＯタンパク質（緑色）とソニック・ヘッジホッグ（Ｓｈｈ）タンパク質が他の実験群に比べて最も低く発現され、ウエスタンブロットを介した定量的分析結果もまた、同じ結果が確認された（図１７）。ＳＭＯタンパク質は比較群に比べて約８６％減少し、Ｓｈｈタンパク質は比較群に比べて約９２％減少することを示した。Ｓｈｈタンパク質の場合、ディスパッチ（Ｄｉｓｐａｔｃｈ）タンパク質から自己分泌（ａｕｔｏｃｒａｉｎｅ）または傍分泌（ｐａｒａｃｒｉｎｅ）の方式で放出がなされるが、ＳＭＯタンパク質の発現抑制を介して、細胞の自己死滅が起きている細胞から不完全にＳｈｈが放出されるもので、自然にＳｈｈタンパク質の量が減少するのである。Ｓｈｈは、がん幹細胞の自己再生を誘導するソニック・ヘッジホッグ信号伝達体系を開始する重要なタンパク質である。しかし、ＳＭＯのノックアウトによってＳｈｈタンパク質の発現が減少し、これに伴いがん幹細胞の自己再生能力が落ち、細胞死滅が加速化され得るのである。
【0084】
このような結果を土台に、本発明者らは、ＶＢＸＹＰ－Ｐ／ＳＭＯｃｒを処理したがん幹細胞でＳＭＯタンパク質の発現抑制がＳｈｈタンパク質の発現を減少させ、自己再生経路が壊れることによって細胞の自己死滅が誘導され得ることを証明した。
【0085】
実施例６：ＶＢＸＹＰ－ＰとｓｉＲＮＡを用いたがん幹細胞のスムーズンド（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＳＭＯ）タンパク質のノックダウン（Ｋｎｏｃｋ－ｄｏｗｎ）誘導による細胞死滅の誘導
６－１．スムーズンドｓｉＲＮＡ（ｓｉＳＭＯ）の伝達によるがん幹細胞の細胞増殖の変化
ＶＢＸＹＰ－Ｐ／ｓｉＳＭＯの処理以後のがん幹細胞の増殖能力の変化を確認するために、細胞の生／死（ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ）分析、ＷＳＴ－１細胞増殖評価、及びＥｄｕ分析を行った（図１８、図１９、図２０）。その結果、前記ＶＢＸＹＰ－Ｐ／ＳＭＯｃｒを伝達したときと同じ結果を確認することができた。３種の細胞増殖能力の評価において、ＶＢＸＹＰ－Ｐ／ｓｉＲＮＡを処理したがん幹細胞実験群の細胞増殖が、最も減少することが確認された。これらの結果から、ｓｉＳＭＯの伝達を介したＳＭＯタンパク質のノックダウンも同様にがん幹細胞の増殖能力を大きく減少させることを確認し、細胞の死滅が誘導するものであるという仮説を立てるようになった。
６－１．スムーズンドｓｉＲＮＡ（ｓｉＳＭＯ）の伝達によるがん幹細胞の細胞増殖の変化
ＶＢＸＹＰ－Ｐ／ｓｉＳＭＯの処理以後のがん幹細胞の増殖能力の変化を確認するために、細胞の生／死（ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ）分析、ＷＳＴ－１細胞増殖評価、及びＥｄｕ分析を行った（図１８、図１９、図２０）。その結果、前記ＶＢＸＹＰ－Ｐ／ＳＭＯｃｒを伝達したときと同じ結果を確認することができた。３種の細胞増殖能力の評価において、ＶＢＸＹＰ－Ｐ／ｓｉＲＮＡを処理したがん幹細胞実験群の細胞増殖が、最も減少することが確認された。これらの結果から、ｓｉＳＭＯの伝達を介したＳＭＯタンパク質のノックダウンも同様にがん幹細胞の増殖能力を大きく減少させることを確認し、細胞の死滅が誘導するものであるという仮説を立てるようになった。
【0086】
６－２．スムーズンドｓｉＲＮＡ（ｓｉＳＭＯ）の伝達によるがん幹細胞の自己死滅（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）誘導の確認
ｓｉＳＭＯを伝達してＳＭＯのノックダウンを誘導した後、上述した細胞の自己死滅を確認するために用いた、トンネルアッセイとアネキシンＶ分析を行った（図２１、図２２）。その結果は、ＶＢＸＹＰ－Ｐを使用してｓｉＳＭＯをがん幹細胞に伝達させた実験群で、最も多くの細胞の自己死滅が発生することを確認することができた。
ｓｉＳＭＯを伝達してＳＭＯのノックダウンを誘導した後、上述した細胞の自己死滅を確認するために用いた、トンネルアッセイとアネキシンＶ分析を行った（図２１、図２２）。その結果は、ＶＢＸＹＰ－Ｐを使用してｓｉＳＭＯをがん幹細胞に伝達させた実験群で、最も多くの細胞の自己死滅が発生することを確認することができた。
【0087】
６－３．スムーズンドタンパク質のノックダウン以後のタンパク質発現の分析
本発明のＶＢＸＹＰ－Ｐを使用してｓｉＳＭＯをがん幹細胞に伝達させることによってＳＭＯタンパク質のノックダウンを誘導し、それに伴うタンパク質の発現変化を上述の蛍光免疫染色分析とウエスタンブロットタンパク質定量分析法を用いて比較分析を行なった（図２３、図２４）。その結果、ＶＢＸＹＰ－Ｐ／ｓｉＳＭＯを処理したがん幹細胞実験群で、ＳＭＯタンパク質と、Ｓｈｈタンパク質の発現が最も低くなることを確認することができた。ウエスタンブロットタンパク質定量分析によって、ＶＢＸＹＰ－Ｐ／ｓｉＳＭＯを処理した実験群と、何も処理をしていない比較群と比較したとき、ＳＭＯタンパク質の量が約７４％減少し、Ｓｈｈタンパク質の量が約６３％減少したことを確認した。このような結果を土台に、本発明者らは、前記の内容によりＳＭＯｃｒを用いたＳＭＯノックアウトによるがん幹細胞の細胞の自己死滅の誘導と同様に、ＶＢＸＹＰ－Ｐ／ｓｉＳＭＯを処理したがん幹細胞で、ＳＭＯがノックダウンされることによってＳｈｈタンパク質の発現を減少させ、自己再生経路が壊れることによって細胞の自己死滅が誘導され得ることを証明した。
本発明のＶＢＸＹＰ－Ｐを使用してｓｉＳＭＯをがん幹細胞に伝達させることによってＳＭＯタンパク質のノックダウンを誘導し、それに伴うタンパク質の発現変化を上述の蛍光免疫染色分析とウエスタンブロットタンパク質定量分析法を用いて比較分析を行なった（図２３、図２４）。その結果、ＶＢＸＹＰ－Ｐ／ｓｉＳＭＯを処理したがん幹細胞実験群で、ＳＭＯタンパク質と、Ｓｈｈタンパク質の発現が最も低くなることを確認することができた。ウエスタンブロットタンパク質定量分析によって、ＶＢＸＹＰ－Ｐ／ｓｉＳＭＯを処理した実験群と、何も処理をしていない比較群と比較したとき、ＳＭＯタンパク質の量が約７４％減少し、Ｓｈｈタンパク質の量が約６３％減少したことを確認した。このような結果を土台に、本発明者らは、前記の内容によりＳＭＯｃｒを用いたＳＭＯノックアウトによるがん幹細胞の細胞の自己死滅の誘導と同様に、ＶＢＸＹＰ－Ｐ／ｓｉＳＭＯを処理したがん幹細胞で、ＳＭＯがノックダウンされることによってＳｈｈタンパク質の発現を減少させ、自己再生経路が壊れることによって細胞の自己死滅が誘導され得ることを証明した。
【0088】
実施例７：血液脳関門（ｂｌｏｏｄ ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ、ＢＢＢ）と脳腫瘍関門（ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒ ｂａｒｒｉｅｒ、ＢＴＢ）を透過して多形性膠芽腫内のがん幹細胞に標的化遺伝子を伝達
７－１．３次元ＢＢＢ微細流体チップを利用したＢＢＢ及びＢＴＢ模写モデルの構築
３次元ＢＢＢ微細流体チップの中心部に脳組織を模写するために、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）を培養し、外郭部に血管を模写するためにヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を培養した後、血管部に該当する所に注射器ポンプを用いて持続的に培地を送り流すことにより（０．０２～０．５μＬ／ｍｉｎ）、実際の血管と類似に生成されるように誘導した。また、ＢＴＢを模写するためにチップの中心部に多形性膠芽腫細胞またはがん幹細胞を培養し、外郭部にヒト臍帯血管内皮細胞を培養した後、外郭血管部に持続的に培地を送り流すことにより（０．０２～０．５μＬ／ｍｉｎ）、実際の血管と類似に生成されるように誘導した。
７－１．３次元ＢＢＢ微細流体チップを利用したＢＢＢ及びＢＴＢ模写モデルの構築
３次元ＢＢＢ微細流体チップの中心部に脳組織を模写するために、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）を培養し、外郭部に血管を模写するためにヒト臍帯血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を培養した後、血管部に該当する所に注射器ポンプを用いて持続的に培地を送り流すことにより（０．０２～０．５μＬ／ｍｉｎ）、実際の血管と類似に生成されるように誘導した。また、ＢＴＢを模写するためにチップの中心部に多形性膠芽腫細胞またはがん幹細胞を培養し、外郭部にヒト臍帯血管内皮細胞を培養した後、外郭血管部に持続的に培地を送り流すことにより（０．０２～０．５μＬ／ｍｉｎ）、実際の血管と類似に生成されるように誘導した。
【0089】
７－２．ＶＢＸＹＰとＶＢＸＹＰ－ＰのＢＢＢ透過率の比較
ＶＢＸＹＰとＶＢＸＹＰ－ＰにＴＲＩＴＣで標識を付けて赤色蛍光を帯びるようにした後、ＧＦＰ遺伝子と複合体を形成させ、３次元ＢＢＢ微細流体モデルの血管部に０．０１μＬ／ｍｉｎの速度で１２０分間送り流しながら、星状細胞が培養されている中心部にどのくらい透過して入るのか定性的に確認し、イメージ分析によって各伝達体の透過率を計算した。また、４８時間以後に該当遺伝子伝達体によってどのくらい形質転換が起きたか確認した。その結果、ＶＢＸＹＰとＶＢＸＹＰ－Ｐ遺伝子伝達体どちらもＢＢＢを透過し、ＶＢＸＹＰのＢＢＢ透過率がより高かった。４８時間以後の形質転換の程度は二つの実験群で同じような結果を示した（図２５）。
ＶＢＸＹＰとＶＢＸＹＰ－ＰにＴＲＩＴＣで標識を付けて赤色蛍光を帯びるようにした後、ＧＦＰ遺伝子と複合体を形成させ、３次元ＢＢＢ微細流体モデルの血管部に０．０１μＬ／ｍｉｎの速度で１２０分間送り流しながら、星状細胞が培養されている中心部にどのくらい透過して入るのか定性的に確認し、イメージ分析によって各伝達体の透過率を計算した。また、４８時間以後に該当遺伝子伝達体によってどのくらい形質転換が起きたか確認した。その結果、ＶＢＸＹＰとＶＢＸＹＰ－Ｐ遺伝子伝達体どちらもＢＢＢを透過し、ＶＢＸＹＰのＢＢＢ透過率がより高かった。４８時間以後の形質転換の程度は二つの実験群で同じような結果を示した（図２５）。
【0090】
７－３．ＶＢＸＹＰ－Ｐのがん幹細胞に対する標的化遺伝子の伝達
がん幹細胞が中心部に培養されている３次元微細流体チップ内の血管部に、ＶＢＸＹＰ－Ｐ／ＧＦＰを０．０１μＬ／ｍｉｎの速度で１２０分間送り流しながら、どのくらい模写された血管を透過して中心部の細胞に遺伝子を伝達させることができるのか確認した（図２６）。その結果、単純なＢＢＢモデルにＶＢＸＹＰ－Ｐを送り流したときより透過率は顕著に落ちた。しかし、４８時間以後、星状細胞での形質転換率と比較してがん幹細胞に対して非常に高い形質転換が確認された。これは、前記実験によって確認したＶＢＸＹＰ－Ｐが、がん幹細胞に対して高い形質転換能力を有しているということを、３次元ＢＴＢモデルを介して再確認したものである。腫瘍細胞は、星状細胞に比べて非常に密度が高く構成されて増殖することにより、遺伝子伝達体の透過率は落ち得るが、標的化機能性遺伝子伝達体を用いるならば、所望の遺伝子を目標に伝達させることができることを確認することができた。最後に、３次元微細流体チップの中心部に多形性膠芽腫を培養し、血管部にそれぞれＶＢＸＹＰ－Ｐ／ＧＦＰとＶＢＸＹＰ／ＧＦＰを０．０１μＬ／ｍｉｎの速度で１２０分間送り流しながら、遺伝子伝達体の透過率と４８時間以後の形質転換の程度を比較した（図２７）。その結果、一般的なＢＢＢモデルに各伝達体を適用したときと比較すると、全体的に透過率が顕著に落ちるが、各伝達体の透過率の様相は類似していた。本モデルでも同じくＶＢＸＹＰ／ＧＦＰがＶＢＸＹＰ－Ｐ／ＧＦＰより高い透過率を示した。しかし、４８時間以後、ＶＢＸＹＰ－Ｐ／ＧＦＰを処理した実験群で有意味に高い形質転換された細胞が発見された。これらの結果により、ＶＢＸＹＰ－ＰはＢＢＢとＢＴＢを透過できるだけでなく、腫瘍内部に非常に少ない量で存在するがん幹細胞に標的化して遺伝子を伝達させることができることを本実験によって証明した。
これら全ての実施例から、がん幹細胞を標的化できるＶＢＸＹＰ－Ｐという遺伝子伝達体を発明し、この伝達体に、がん幹細胞の自己再生信号伝達体系を壊すことにより細胞の自己死滅を誘導できるスムーズンド（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＳＭＯ）ＣＲＩＳＰＲ、ｓｉＲＮＡを用いて、がん幹細胞の死滅を誘導できることを示し、その機作を糾明した。また、本発明の遺伝子伝達体がＢＢＢを通過できるだけでなく、脳腫瘍内部のがん幹細胞を標的化することができることを、３次元微細流体システムを介して証明した。
がん幹細胞が中心部に培養されている３次元微細流体チップ内の血管部に、ＶＢＸＹＰ－Ｐ／ＧＦＰを０．０１μＬ／ｍｉｎの速度で１２０分間送り流しながら、どのくらい模写された血管を透過して中心部の細胞に遺伝子を伝達させることができるのか確認した（図２６）。その結果、単純なＢＢＢモデルにＶＢＸＹＰ－Ｐを送り流したときより透過率は顕著に落ちた。しかし、４８時間以後、星状細胞での形質転換率と比較してがん幹細胞に対して非常に高い形質転換が確認された。これは、前記実験によって確認したＶＢＸＹＰ－Ｐが、がん幹細胞に対して高い形質転換能力を有しているということを、３次元ＢＴＢモデルを介して再確認したものである。腫瘍細胞は、星状細胞に比べて非常に密度が高く構成されて増殖することにより、遺伝子伝達体の透過率は落ち得るが、標的化機能性遺伝子伝達体を用いるならば、所望の遺伝子を目標に伝達させることができることを確認することができた。最後に、３次元微細流体チップの中心部に多形性膠芽腫を培養し、血管部にそれぞれＶＢＸＹＰ－Ｐ／ＧＦＰとＶＢＸＹＰ／ＧＦＰを０．０１μＬ／ｍｉｎの速度で１２０分間送り流しながら、遺伝子伝達体の透過率と４８時間以後の形質転換の程度を比較した（図２７）。その結果、一般的なＢＢＢモデルに各伝達体を適用したときと比較すると、全体的に透過率が顕著に落ちるが、各伝達体の透過率の様相は類似していた。本モデルでも同じくＶＢＸＹＰ／ＧＦＰがＶＢＸＹＰ－Ｐ／ＧＦＰより高い透過率を示した。しかし、４８時間以後、ＶＢＸＹＰ－Ｐ／ＧＦＰを処理した実験群で有意味に高い形質転換された細胞が発見された。これらの結果により、ＶＢＸＹＰ－ＰはＢＢＢとＢＴＢを透過できるだけでなく、腫瘍内部に非常に少ない量で存在するがん幹細胞に標的化して遺伝子を伝達させることができることを本実験によって証明した。
これら全ての実施例から、がん幹細胞を標的化できるＶＢＸＹＰ－Ｐという遺伝子伝達体を発明し、この伝達体に、がん幹細胞の自己再生信号伝達体系を壊すことにより細胞の自己死滅を誘導できるスムーズンド（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ、ＳＭＯ）ＣＲＩＳＰＲ、ｓｉＲＮＡを用いて、がん幹細胞の死滅を誘導できることを示し、その機作を糾明した。また、本発明の遺伝子伝達体がＢＢＢを通過できるだけでなく、脳腫瘍内部のがん幹細胞を標的化することができることを、３次元微細流体システムを介して証明した。
【0091】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せずに、他の具体的な形態で実施されることができる。これと関連して、以上で記述した実施例は、全ての面で例示的なものであり限定的なものではない。本発明の範囲は、前記詳細な説明よりは後述する特許請求の範囲の意味及び範囲そしてその等価概念から導出される全ての変更または変形された形態が、本発明の範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【0092】
本発明のビタミンＢ６とがん幹細胞特異ペプチドが結合されたポリジキシリトールポリマー遺伝子伝達体（ＶＢＸＹＰ－Ｐ）は、既存に存在する核酸伝達体よりがん幹細胞に対して顕著に高い核酸伝達率を有し、ＤＮＡと結合時に結合体の細胞毒性はほとんどなく、何より血液脳関門を通過して多形性膠芽腫内のがん幹細胞に標的化して特異的に核酸を伝達させて形質を転換させることを確認した。これによって、本発明の遺伝子伝達体は、生体内で腫瘍内部のがん幹細胞の発現を抑制することにより多様ながん疾患に対する遺伝子治療分野で幅広く使用されることができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】