特許7535527形質転換微生物、及び当該微生物を用いたポリヒドロキシアルカン酸の製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-07
(45)【発行日】2024-08-16
(54)【発明の名称】形質転換微生物、及び当該微生物を用いたポリヒドロキシアルカン酸の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20240808BHJP
C12P 7/44 20060101ALI20240808BHJP
C12P 7/42 20060101ALI20240808BHJP
C12N 15/52 20060101ALI20240808BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20240808BHJP
C12N 9/48 20060101ALI20240808BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21 ZNA
C12P7/44
C12P7/42
C12N15/52 Z
C12N15/31
C12N9/48
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2021545163
(86)(22)【出願日】2020-08-04
(86)【国際出願番号】 JP2020029763
(87)【国際公開番号】W WO2021049207
(87)【国際公開日】2021-03-18
【審査請求日】2023-06-27
(31)【優先権主張番号】P 2019163743
(32)【優先日】2019-09-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000000941
【氏名又は名称】株式会社カネカ
(74)【代理人】
【識別番号】110000556
【氏名又は名称】弁理士法人有古特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】毛利 佳弘
(72)【発明者】
【氏名】有川 尚志
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 俊輔
【審査官】坂井田 京
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第１６／１９４７７１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第１９／１４２８４５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】中国特許出願公開第１０５７７９４８８（ＣＮ，Ａ）
【文献】ZHANG, Xing-Chen et al.，Engineering cell wall synthesis mechanism for enhanced PHB accumulation in E.coli，Metabolic Engineering，2017年11月24日，Vol.45，p.32-42
【文献】UniProtKB，Accesion No.Q0K924, H16_A2405 gene，［online］, Last sequence update: October 3, 2006, ［retrived on 2020.08.25］, 〈URL:https://www.uniprot.org/uniprot/Q0K924〉
【文献】UniProtKB，Accesion No.Q0KBU9, H16_A1386 gene，［online］, Last sequence update: October 3, 2006, ［retrived on 2020.08.25］, 〈URL:https://www.uniprot.org/uniprot/Q0KBU9〉
【文献】SHEN, Rui et al.，Manipulation of polyhydroxyalkanoate granular sizes in Halomonas bluephagenesis，Metablic Engineering，2019年04月06日，Vol.54，p.117-126
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／２１
Ｃ１２Ｐ ７／４４
Ｃ１２Ｐ ７／４２
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／６３
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を有し、Ａ１３８６遺伝子、及び／又は、Ａ２４０５遺伝子の発現を低下させた、カプリアビダス・ネカトールの形質転換微生物であって、
前記Ａ１３８６遺伝子が、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドグリカンの加水分解酵素をコードする遺伝子であり、
前記Ａ２４０５遺伝子が、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドグリカンの加水分解酵素をコードする遺伝子である、形質転換微生物。
【請求項2】
さらに、配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞分裂を制御する機能を持つタンパク質をコードするｍｉｎＣ遺伝子、及び、配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む細胞分裂を制御する機能を持つタンパク質をコードするｍｉｎＤ遺伝子の発現が強化された、請求項１に記載の形質転換微生物。
【請求項3】
請求項１又は２に記載の形質転換微生物を、炭素源の存在下で培養する工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
【請求項4】
ポリヒドロキシアルカン酸が、２種以上のヒドロキシアルカン酸の共重合体である、請求項３に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
【請求項5】
前記ポリヒドロキシアルカン酸が、３－ヒドロキシヘキサン酸をモノマーユニットとして含有する共重合体である、請求項４に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
【請求項6】
前記ポリヒドロキシアルカン酸が、３－ヒドロキシ酪酸と３－ヒドロキシヘキサン酸との共重合体である、請求項５に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、形質転換微生物、及び当該微生物を用いたポリヒドロキシアルカン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
環境問題、食糧問題、健康及び安全に対する意識の高まり、天然又は自然志向の高まりなどを背景に、微生物を利用した物質製造（発酵生産、バイオ変換など）の意義及び重要性が益々高まっており、タンパク質医薬品や遺伝子治療用の核酸などの製造にも、微生物による物質生産が応用されている。例えば、酵母やバクテリアなどの微生物を利用したエタノール、酢酸、医療用タンパク質の生産などが活発に産業応用されている。
【0003】
その一例として、生分解性プラスチックとしての産業利用が期待されているポリヒドロキシアルカン酸（以下、ＰＨＡともいう）の微生物による生産が挙げられる（非特許文献１を参照）。ＰＨＡは、多くの微生物種の細胞にエネルギー蓄積物質として産生、蓄積される熱可塑性ポリエステルであり、生分解性を有している。現在、環境への意識の高まりから非石油由来のプラスチックが注目されるなか、特に、微生物が菌体内に産生、蓄積するＰＨＡは、自然界の炭素循環プロセスに取り込まれることから生態系への悪影響が小さいと予想されており、その実用化が切望されている。微生物を利用したＰＨＡ生産では、例えば、カプリアビダス属細菌に炭素源として糖、植物油脂や脂肪酸を与え、細胞内にＰＨＡを蓄積させることでＰＨＡを生産することが知られている（非特許文献２及び３を参照）。
【0004】
しかしながら、微生物を利用した物質生産においては、微生物細胞や目的生産物の分離回収工程が煩雑となり、生産コストが高くなることが問題となるケースがある。従って、分離回収効率を向上させることは、生産コストの低減のための大きな課題であった。
【0005】
ＰＨＡを生産した微生物における細胞の大型化では、例えば、細胞分裂を阻害するタンパク質ｍｉｎＣＤを過剰発現することや、ペプチドグリカン合成酵素の１つである単機能性ペプチドグリカングリコシルトランスフェラーゼを破壊することで、ＰＨＡを生産した微生物細胞が大型化することが知られている（非特許文献４及び特許文献１を参照）。しかしながら、ペプチドグリカンの加水分解酵素とＰＨＡを生産した微生物の細胞形態との関連性についてはこれまでに報告はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【文献】Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＡＪ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，１２，２０１－１０５（１９９０）
【文献】Ｓａｔｏ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１２０（３），２４６－２５１（２０１５）
【文献】Ｉｎｓｏｍｐｈｕｎ Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．，２７，３８－４５（２０１５）
【文献】Ｓｈｅｎ Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．，５４，１１７－１２６（２０１９）
【文献】国際公開第２０１６／１９４７７１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
ＰＨＡは微生物細胞内に蓄積される。微生物細胞内に蓄積されたＰＨＡを生分解性プラスチックとして利用するためには、まず、培養液から微生物細胞を分離回収することになる。微生物細胞の分離回収に際しては、遠心分離機や分離膜等を使用できるが、分離回収の容易さや効率は、微生物細胞の大きさに依存する。即ち、微生物細胞が大きいほど、遠心分離機や分離膜等を用いた分離回収を容易に効率よく実施でき、生産コストの低減につながる。
【0008】
本発明は、上記現状に鑑み、ＰＨＡを蓄積し、かつ大型化が可能な形質転換微生物、及び、当該形質転換微生物を用いたＰＨＡの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、カプリアビダス属細菌においてペプチドグリカンの加水分解酵素と推定されている、Ａ０３０２遺伝子、Ａ０５９７遺伝子、Ａ１３８６遺伝子、Ａ２２７２遺伝子、Ａ２４０５遺伝子のうちいずれかの発現を低下させた結果、Ａ１３８６遺伝子またはＡ２４０５遺伝子の発現を低下させることで、工業的に望ましいＰＨＡ蓄積量を維持しながら、微生物細胞を大型化できることを見出し、本発明に至った。さらに、上記Ａ１３８６遺伝子またはＡ２４０５遺伝子の発現を低下させることに加えて、ｍｉｎＣ遺伝子およびｍｉｎＤ遺伝子の発現を強化することで、微生物細胞をより大型化できることを見出し、本発明に至った。
【0010】
すなわち本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を有し、Ａ１３８６遺伝子、及び／又は、Ａ２４０５遺伝子の発現を低下させた、形質転換微生物に関する。好ましくは、Ａ１３８６遺伝子が、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して８５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子であり、Ａ２４０５遺伝子が、配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して８５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子である。該形質転換微生物は、さらに、ｍｉｎＣ遺伝子及びｍｉｎＤ遺伝子の発現が強化されたものであってもよい。好ましくは、前記ｍｉｎＣ遺伝子が、配列番号３に記載のアミノ酸配列に対して８５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子であり、前記ｍｉｎＤ遺伝子が、配列番号４に記載のアミノ酸配列に対して８５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子である。前記形質転換微生物は、カプリアビダス属に属することが好ましく、カプリアビダス・ネカトールの形質転換微生物であることがより好ましい。さらに本発明は、前記形質転換微生物を、炭素源の存在下で培養する工程を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法にも関する。前記ポリヒドロキシアルカン酸は、２種以上のヒドロキシアルカン酸の共重合体であることが好ましく、３－ヒドロキシヘキサン酸をモノマーユニットとして含有する共重合体であることがより好ましく、３－ヒドロキシ酪酸と３－ヒドロキシヘキサン酸との共重合体であることがさらに好ましい。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、ＰＨＡを蓄積し、かつ大型化が可能な形質転換微生物、及び、当該形質転換微生物を用いたＰＨＡの製造方法を提供することができる。本発明によると、ＰＨＡを蓄積した微生物細胞が大型化するため、培養液からの微生物細胞の分離回収が容易となり、生産コストの低減を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図2】培養後のＡ０５９７欠失破壊株（比較例２）を撮影した顕微鏡写真
【図3】培養後のＡ０３０２欠失破壊株（比較例３）を撮影した顕微鏡写真
【図4】培養後のＡ２２７２挿入破壊株（比較例４）を撮影した顕微鏡写真
【図5】培養後のＡ１３８６欠失破壊株（実施例１）を撮影した顕微鏡写真
【図6】培養後のＡ２４０５挿入破壊株（実施例２）を撮影した顕微鏡写真
【図7】培養後のＡ２４０５欠失破壊株（実施例３）を撮影した顕微鏡写真
【図8】培養後のＡ１３８６・Ａ２４０５二重破壊株（実施例４）を撮影した顕微鏡写真
【図9】培養後のｍｉｎＣＤ発現Ａ１３８６破壊株（実施例５）を撮影した顕微鏡写真
【図10】培養後のｍｉｎＣＤ発現Ａ２４０５破壊株（実施例６）を撮影した顕微鏡写真
【図11】培養後のｍｉｎＣＤ発現Ａ２４０５・Ａ１３８６破壊株（実施例７）を撮影した顕微鏡写真
【発明を実施するための形態】
【0013】
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
本実施形態に係る形質転換微生物は、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有し、Ａ１３８６遺伝子、及び／又は、Ａ２４０５遺伝子の発現を低下させた、形質転換微生物である。該形質転換生物は、さらに、ｍｉｎＣ遺伝子及びｍｉｎＤ遺伝子の発現を強化させたものであってもよい。
本実施形態に係る形質転換微生物は、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有し、Ａ１３８６遺伝子、及び／又は、Ａ２４０５遺伝子の発現を低下させた、形質転換微生物である。該形質転換生物は、さらに、ｍｉｎＣ遺伝子及びｍｉｎＤ遺伝子の発現を強化させたものであってもよい。
【0014】
（微生物）
本実施形態に係る形質転換微生物は、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有し、かつ、Ａ１３８６遺伝子の発現を低下させるように形質転換された微生物であってよい。また、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有し、かつ、Ａ２４０５遺伝子の発現を低下させるように形質転換された微生物であってよい。また、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有し、かつ、Ａ１３８６遺伝子の発現を低下させ、ｍｉｎＣ遺伝子及びｍｉｎＤ遺伝子の発現が強化されるように形質転換された微生物であってもよい。また、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有し、かつ、Ａ２４０５遺伝子の発現を低下させ、ｍｉｎＣ遺伝子及びｍｉｎＤ遺伝子の発現が強化されるように形質転換された微生物であってもよい。また、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有し、かつ、Ａ１３８６遺伝子及びＡ２４０５遺伝子の発現を低下させるように形質転換された微生物であってもよい。また、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有し、かつ、Ａ１３８６遺伝子及びＡ２４０５遺伝子の発現を低下させ、ｍｉｎＣ遺伝子及びｍｉｎＤ遺伝子の発現が強化されるように形質転換された微生物であってもよい。
本実施形態に係る形質転換微生物は、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有し、かつ、Ａ１３８６遺伝子の発現を低下させるように形質転換された微生物であってよい。また、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有し、かつ、Ａ２４０５遺伝子の発現を低下させるように形質転換された微生物であってよい。また、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有し、かつ、Ａ１３８６遺伝子の発現を低下させ、ｍｉｎＣ遺伝子及びｍｉｎＤ遺伝子の発現が強化されるように形質転換された微生物であってもよい。また、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有し、かつ、Ａ２４０５遺伝子の発現を低下させ、ｍｉｎＣ遺伝子及びｍｉｎＤ遺伝子の発現が強化されるように形質転換された微生物であってもよい。また、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有し、かつ、Ａ１３８６遺伝子及びＡ２４０５遺伝子の発現を低下させるように形質転換された微生物であってもよい。また、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有し、かつ、Ａ１３８６遺伝子及びＡ２４０５遺伝子の発現を低下させ、ｍｉｎＣ遺伝子及びｍｉｎＤ遺伝子の発現が強化されるように形質転換された微生物であってもよい。
【0015】
本実施形態に係る形質転換微生物の宿主は、特に限定されないが、好ましくは、Ａ１３８６遺伝子、Ａ２４０５遺伝子、ｍｉｎＣ遺伝子、またはｍｉｎＤ遺伝子を有する細菌である。当該細菌としては、例えば、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、ワウテルシア（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属などバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ）科に属する細菌類が好ましい例として挙げられる。安全性及びＰＨＡ生産性の観点から、より好ましくはラルストニア属、カプリアビダス属に属する細菌であり、さらに好ましくはカプリアビダス属に属する細菌であり、特に好ましくはカプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）である。
【0016】
本実施形態に係る形質転換微生物の宿主は、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を本来的に有する野生株であってもよいし、そのような野生株を人工的に突然変異処理して得られる変異株や、あるいは、遺伝子工学的手法により外来のＰＨＡ合成酵素遺伝子が導入された菌株であってもよい。外来のＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入する方法は特に限定されず、宿主の染色体上に遺伝子を直接挿入または置換する方法、宿主が保有するメガプラスミド上に遺伝子を直接挿入または置換する方法、あるいはプラスミド、ファージ、ファージミドなどのベクター上に遺伝子を配置して導入する方法などが選択でき、これらの方法のうち２つ以上を併用しても良い。導入遺伝子の安定性を考慮すると、好ましくは、宿主の染色体上または宿主が保有するメガプラスミド上に遺伝子を直接挿入または置換する方法であり、より好ましくは、宿主の染色体上に遺伝子を直接挿入または置換する方法である。
【0017】
（ＰＨＡ合成酵素遺伝子）
ＰＨＡ合成酵素遺伝子としては特に限定されないが、ラルストニア属、カプリアビダス属、ワウテルシア属、アルカリゲネス属、アエロモナス属、シュードモナス属、ノルカディア属、クロモバクテリウム属に類する生物に由来するＰＨＡ合成酵素遺伝子や、それらの改変体などが挙げられる。前記改変体としては、１以上のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入、又は置換されたＰＨＡ合成酵素をコードする塩基配列などを用いることができる。例えば、配列番号５～９のいずれかに記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子、及び、該アミノ酸配列に対して８５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、かつＰＨＡ合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。上記配列相同性としては好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上である。
ＰＨＡ合成酵素遺伝子としては特に限定されないが、ラルストニア属、カプリアビダス属、ワウテルシア属、アルカリゲネス属、アエロモナス属、シュードモナス属、ノルカディア属、クロモバクテリウム属に類する生物に由来するＰＨＡ合成酵素遺伝子や、それらの改変体などが挙げられる。前記改変体としては、１以上のアミノ酸残基が欠失、付加、挿入、又は置換されたＰＨＡ合成酵素をコードする塩基配列などを用いることができる。例えば、配列番号５～９のいずれかに記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子、及び、該アミノ酸配列に対して８５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、かつＰＨＡ合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。上記配列相同性としては好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上である。
【0018】
（ＰＨＡ）
本実施形態に係る形質転換微生物が生産するＰＨＡの種類としては、微生物が生産し得るＰＨＡである限り特に限定されないが、炭素数４～１６の３－ヒドロキシアルカン酸から選択される１種のモノマーの単独重合体、炭素数４～１６の３－ヒドロキシアルカン酸から選択される１種のモノマーとその他のヒドロキシアルカン酸（例えば、炭素数４～１６の２－ヒドロキシアルカン酸、４－ヒドロキシアルカン酸、５－ヒドロキシアルカン酸、６－ヒドロキシアルカン酸など）の共重合体、及び、炭素数４～１６の３－ヒドロキシアルカン酸から選択される２種以上のモノマーの共重合体が好ましい。例えば、３－ヒドロキシ酪酸（略称：３ＨＢ）のホモポリマーであるＰ（３ＨＢ）、３ＨＢと３－ヒドロキシ吉草酸（略称：３ＨＶ）の共重合体Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＶ）、３ＨＢと３－ヒドロキシヘキサン酸（略称：３ＨＨ）の共重合体Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）（略称：ＰＨＢＨ）、３ＨＢと４－ヒドロキシ酪酸（略称：４ＨＢ）の共重合体Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－４ＨＢ）、乳酸（略称：ＬＡ）を構成成分として含むＰＨＡ、例えば３ＨＢとＬＡの共重合体Ｐ（ＬＡ－ｃｏ－３ＨＢ）などが挙げられるが、これらに限定されない。この中でも、ポリマーとしての応用範囲が広いという観点から、ＰＨＢＨが好ましい。なお、生産されるＰＨＡの種類は、目的に応じて、使用する微生物の保有するあるいは別途導入されたＰＨＡ合成酵素遺伝子の種類や、その合成に関与する代謝系の遺伝子の種類、培養条件などによって適宜選択しうる。
本実施形態に係る形質転換微生物が生産するＰＨＡの種類としては、微生物が生産し得るＰＨＡである限り特に限定されないが、炭素数４～１６の３－ヒドロキシアルカン酸から選択される１種のモノマーの単独重合体、炭素数４～１６の３－ヒドロキシアルカン酸から選択される１種のモノマーとその他のヒドロキシアルカン酸（例えば、炭素数４～１６の２－ヒドロキシアルカン酸、４－ヒドロキシアルカン酸、５－ヒドロキシアルカン酸、６－ヒドロキシアルカン酸など）の共重合体、及び、炭素数４～１６の３－ヒドロキシアルカン酸から選択される２種以上のモノマーの共重合体が好ましい。例えば、３－ヒドロキシ酪酸（略称：３ＨＢ）のホモポリマーであるＰ（３ＨＢ）、３ＨＢと３－ヒドロキシ吉草酸（略称：３ＨＶ）の共重合体Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＶ）、３ＨＢと３－ヒドロキシヘキサン酸（略称：３ＨＨ）の共重合体Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）（略称：ＰＨＢＨ）、３ＨＢと４－ヒドロキシ酪酸（略称：４ＨＢ）の共重合体Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－４ＨＢ）、乳酸（略称：ＬＡ）を構成成分として含むＰＨＡ、例えば３ＨＢとＬＡの共重合体Ｐ（ＬＡ－ｃｏ－３ＨＢ）などが挙げられるが、これらに限定されない。この中でも、ポリマーとしての応用範囲が広いという観点から、ＰＨＢＨが好ましい。なお、生産されるＰＨＡの種類は、目的に応じて、使用する微生物の保有するあるいは別途導入されたＰＨＡ合成酵素遺伝子の種類や、その合成に関与する代謝系の遺伝子の種類、培養条件などによって適宜選択しうる。
【0019】
（ペプチドグリカン）
ペプチドグリカンとは、細菌の細胞壁を主要に構成する、ペプチドと糖からなる高分子化合物の一種である。ペプチドグリカンの構造は菌種によって異なるが、代表的な例として大腸菌では、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とＮ－アセチルムラミン酸（ＭｕｒＮＡｃ）という２種のアミノ糖の交互の繰り返しを単位とした糖鎖と、Ｌ－アラニン（Ｌ－Ａｌａ）－γ－Ｄ－グルタミン酸（Ｇｌｕ）－メソジアミノピメリン酸（ｍ－ＤＡＰ）－Ｄ－アラニン（Ｄ－Ａｌａ）－Ｄ－Ａｌａのペンタペプチドにより構成される。糖鎖のＭｕｒＮＡｃにペンタペプチドのＬ－Ａｌａがペプチド結合により結合している。ペンタペプチドからＤ－Ａｌａが取り除かれ、テトラペプチドになった後、テトラペプチドのｍ－ＤＡＰと別の糖鎖のテトラペプチドのＤ－Ａｌａが結合して、２つの糖鎖が架橋されることで、強固な構造を形成する。
ペプチドグリカンとは、細菌の細胞壁を主要に構成する、ペプチドと糖からなる高分子化合物の一種である。ペプチドグリカンの構造は菌種によって異なるが、代表的な例として大腸菌では、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とＮ－アセチルムラミン酸（ＭｕｒＮＡｃ）という２種のアミノ糖の交互の繰り返しを単位とした糖鎖と、Ｌ－アラニン（Ｌ－Ａｌａ）－γ－Ｄ－グルタミン酸（Ｇｌｕ）－メソジアミノピメリン酸（ｍ－ＤＡＰ）－Ｄ－アラニン（Ｄ－Ａｌａ）－Ｄ－Ａｌａのペンタペプチドにより構成される。糖鎖のＭｕｒＮＡｃにペンタペプチドのＬ－Ａｌａがペプチド結合により結合している。ペンタペプチドからＤ－Ａｌａが取り除かれ、テトラペプチドになった後、テトラペプチドのｍ－ＤＡＰと別の糖鎖のテトラペプチドのＤ－Ａｌａが結合して、２つの糖鎖が架橋されることで、強固な構造を形成する。
【0020】
（ペプチドグリカン加水分解酵素）
多くの細菌は、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニンアミダーゼ、Ｄ－アラニル－Ｄ－アラニン－エンドペプチダーゼ、Ｄ－アラニル－Ｄ－アラニン－カルボキシペプチダーゼ等、複数のペプチドグリカン加水分解酵素を有している。Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニンアミダーゼはペプチドグリカンのＭｕｒＮＡｃとＬ－ＡｌａのＮ末端の結合を切断する。Ｄ－アラニル－Ｄ－アラニン－エンドペプチダーゼはテトラペプチド同士の架橋部分に存在するｍ－ＤＡＰとＤ－Ａｌａの結合等を切断する。Ｄ－アラニル－Ｄ－アラニン－カルボキシペプチダーゼは、ペンタペプチドのＤ－ＡｌａとＤ－Ａｌａの結合を切断し、末端のＤ－Ａｌａを取り除く。
多くの細菌は、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニンアミダーゼ、Ｄ－アラニル－Ｄ－アラニン－エンドペプチダーゼ、Ｄ－アラニル－Ｄ－アラニン－カルボキシペプチダーゼ等、複数のペプチドグリカン加水分解酵素を有している。Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニンアミダーゼはペプチドグリカンのＭｕｒＮＡｃとＬ－ＡｌａのＮ末端の結合を切断する。Ｄ－アラニル－Ｄ－アラニン－エンドペプチダーゼはテトラペプチド同士の架橋部分に存在するｍ－ＤＡＰとＤ－Ａｌａの結合等を切断する。Ｄ－アラニル－Ｄ－アラニン－カルボキシペプチダーゼは、ペンタペプチドのＤ－ＡｌａとＤ－Ａｌａの結合を切断し、末端のＤ－Ａｌａを取り除く。
【0021】
ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースにおいて、カプリアビダス・ネカトールのＡ０５９７遺伝子（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＩＤ Ｑ０ＫＥＷ８）にコードされるタンパク質はＮ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニンアミダーゼと推定される。
【0022】
ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースにおいて、カプリアビダス・ネカトールのＡ０３０２遺伝子（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＩＤ Ｑ０ＫＥ２６）およびＡ１３８６遺伝子（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＩＤ Ｑ０ＫＢＵ９）にコードされるタンパク質は、Ｄ－アラニル－Ｄ－アラニン－カルボキシペプチダーゼと推定される。
【0023】
ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースにおいて、カプリアビダス・ネカトールのＡ２２７２遺伝子およびＡ２４０５遺伝子は細胞壁に関与する加水分解酵素をコードすると推定されるが、詳細な機能は報告されていない。
【0024】
前記Ａ１３８６遺伝子は、配列番号１に記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド、又は、該アミノ酸配列に対して８５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列で示されるポリペプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子である。上記配列相同性としては好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上である。なお、配列番号１に記載のアミノ酸配列と、Ａ０３０２遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ酸配列との配列相同性は約３０％である。
【0025】
前記Ａ２４０５遺伝子は、配列番号２に記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド、又は、該アミノ酸配列に対して８５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列で示されるポリペプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子である。上記配列相同性としては好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上である。なお、配列番号２に記載のアミノ酸配列と、Ａ２２７２遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ酸配列との配列相同性は約４０％である。
【0026】
（ｍｉｎＣ遺伝子、ｍｉｎＤ遺伝子）
ｍｉｎＣ遺伝子、ｍｉｎＤ遺伝子、及び、ｍｉｎＥ遺伝子がコードするタンパク質ＭｉｎＣ、ＭｉｎＤ、及び、ＭｉｎＥは、細菌において協調して細胞分裂を制御する機能を持つタンパク質である（ＭｉｎＣＤＥシステム）。例えば大腸菌細胞内においては、ＭｉｎＤはＡＴＰ依存的に重合体を形成し、さらにＭｉｎＣと複合体を形成して、細胞の極から極へと素早く振動することが知られている。ＭｉｎＣは細胞分裂の際の隔壁形成を阻害する働きを持つ。また、ＭｉｎＥはＭｉｎＣと競合的にＭｉｎＤに結合することが知られており、細胞の中央でのみ隔壁形成が生じるように調節する働きを持つ。
ｍｉｎＣ遺伝子、ｍｉｎＤ遺伝子、及び、ｍｉｎＥ遺伝子がコードするタンパク質ＭｉｎＣ、ＭｉｎＤ、及び、ＭｉｎＥは、細菌において協調して細胞分裂を制御する機能を持つタンパク質である（ＭｉｎＣＤＥシステム）。例えば大腸菌細胞内においては、ＭｉｎＤはＡＴＰ依存的に重合体を形成し、さらにＭｉｎＣと複合体を形成して、細胞の極から極へと素早く振動することが知られている。ＭｉｎＣは細胞分裂の際の隔壁形成を阻害する働きを持つ。また、ＭｉｎＥはＭｉｎＣと競合的にＭｉｎＤに結合することが知られており、細胞の中央でのみ隔壁形成が生じるように調節する働きを持つ。
【0027】
本開示におけるｍｉｎＣ遺伝子は、配列番号３に記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＩＤ Ｑ０ＫＦＩ３）、又は、該アミノ酸配列に対して８５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列で示されるポリペプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子である。上記配列相同性としては好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上である。
【0028】
本開示におけるｍｉｎＤ遺伝子は、配列番号４に記載のアミノ酸配列で示されるポリペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ ＩＤ Ｑ０ＫＦＩ４）、又は、該アミノ酸配列に対して８５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列で示されるポリペプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子である。上記配列相同性としては好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上である。
【0029】
（遺伝子発現の低下）
本開示における「遺伝子発現の低下」とは、対象遺伝子の発現を低下させていない菌株と比較して、対象遺伝子の転写量または対象遺伝子のコードするポリペプチドの発現量が減少している状態を指す。その減少量は特に限定されないが、対象遺伝子の発現を低下させていない菌株による発現量に対して、１倍未満であればよく、好ましくは０．８倍以下、より好ましくは０．５倍以下、さらに好ましくは０．３倍以下、さらにより好ましくは０．２倍以下である。対象遺伝子の転写量または対象遺伝子のコードするポリペプチドの発現量はゼロであってもよい。また、対象遺伝子の塩基配列を改変することなどにより、該遺伝子がコードするポリペプチドが元来の機能を示さない場合も、該遺伝子発現が低下しているとみなすことができる。また、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する微生物に対して、当該ポリペプチドの機能を阻害する代謝物やタンパク質を生産するように遺伝子改変を行うことで対象遺伝子の発現を低下させることもできる。
本開示における「遺伝子発現の低下」とは、対象遺伝子の発現を低下させていない菌株と比較して、対象遺伝子の転写量または対象遺伝子のコードするポリペプチドの発現量が減少している状態を指す。その減少量は特に限定されないが、対象遺伝子の発現を低下させていない菌株による発現量に対して、１倍未満であればよく、好ましくは０．８倍以下、より好ましくは０．５倍以下、さらに好ましくは０．３倍以下、さらにより好ましくは０．２倍以下である。対象遺伝子の転写量または対象遺伝子のコードするポリペプチドの発現量はゼロであってもよい。また、対象遺伝子の塩基配列を改変することなどにより、該遺伝子がコードするポリペプチドが元来の機能を示さない場合も、該遺伝子発現が低下しているとみなすことができる。また、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する微生物に対して、当該ポリペプチドの機能を阻害する代謝物やタンパク質を生産するように遺伝子改変を行うことで対象遺伝子の発現を低下させることもできる。
【0030】
本実施形態において、遺伝子の発現を低下させる方法は特に限定されないが、対象遺伝子の一部分または全長を欠失させる方法、対象遺伝子の発現に関わる「遺伝子発現調節配列」を改変する方法や、対象遺伝子及び／またはその周辺の塩基配列を改変することにより、転写されたメッセンジャーＲＮＡの安定性を低下させる方法などが挙げられる。塩基配列を改変する方法は特に限定されず、対象遺伝子及び／またはその周辺の塩基配列の少なくとも一部の置換、欠失、挿入及び／又は付加などによって実施することができ、当業者に周知の方法により行うことができる。さらには、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する形質転換微生物に対してアンチセンスＲＮＡやＲＮＡ干渉法（ＲＮＡｉ）、ＣＲＩＳＰＲ干渉法（ＣＲＩＳＰＲｉ）などを使用することで、対象遺伝子及び／またはその周辺の塩基配列を改変することなく、対象遺伝子の発現を低下させてもよい。
【0031】
（遺伝子発現強化）
本開示における遺伝子発現の強化とは、対象遺伝子の発現が強化されていない菌株と比較して、対象遺伝子の転写量または対象遺伝子のコードするポリペプチドの発現量が増加している状態を指す。その増加量は特に限定されないが、対象遺伝子の発現が強化されていない菌株と比較して１倍超であればよく、好ましくは１．１倍以上、より好ましくは１．２倍以上、さらに好ましくは１．５倍以上、さらにより好ましくは２倍以上の増加である。
本開示における遺伝子発現の強化とは、対象遺伝子の発現が強化されていない菌株と比較して、対象遺伝子の転写量または対象遺伝子のコードするポリペプチドの発現量が増加している状態を指す。その増加量は特に限定されないが、対象遺伝子の発現が強化されていない菌株と比較して１倍超であればよく、好ましくは１．１倍以上、より好ましくは１．２倍以上、さらに好ましくは１．５倍以上、さらにより好ましくは２倍以上の増加である。
【0032】
本実施形態において、ｍｉｎＣ遺伝子およびｍｉｎＤ遺伝子の発現を強化する方法は特に限定されないが、対象遺伝子を宿主に導入する方法、宿主がゲノムＤＮＡ上に元来有する対象遺伝子の発現量を増強する方法、またはその両方を選択することができる。
【0033】
対象遺伝子を宿主に導入する方法としては特に限定されないが、宿主の染色体上に対象遺伝子を直接挿入または置換する方法、宿主が保有するメガプラスミド上に対象遺伝子を直接挿入または置換する方法、あるいはプラスミド、ファージ、ファージミドなどのベクター上に対象遺伝子を配置して導入する方法などが選択でき、これらの方法のうち２つ以上を併用しても良い。
【0034】
導入遺伝子の安定性を考慮すると、好ましくは、宿主の染色体上または宿主が保有するメガプラスミド上に対象遺伝子を直接挿入または置換する方法であり、より好ましくは、宿主の染色体上に対象遺伝子を直接挿入または置換する方法である。導入する遺伝子を確実に発現させるために、対象遺伝子が、宿主が元来有する「遺伝子発現調節配列」の下流に位置するように導入するか、または、対象遺伝子が、外来の「遺伝子発現調節配列」の下流に位置する形で導入することが好ましい。本開示における「遺伝子発現調節配列」とは、その遺伝子の転写量を制御する塩基配列（例えばプロモーター配列）、及び／または、その遺伝子から転写されたメッセンジャーＲＮＡの翻訳量を調節する塩基配列（例えばシャイン・ダルガノ配列）を含むＤＮＡ配列である。「遺伝子発現調節配列」としては、自然界に存在する任意の塩基配列を利用することもできるし、人工的に構築または改変された塩基配列を利用しても良い。
【0035】
また、宿主がゲノムＤＮＡ上に元来有する対象遺伝子の発現量を増強する方法としては特に限定されないが、対象遺伝子の上流に位置する「遺伝子発現調節配列」を改変する方法、対象遺伝子の上流に外来の「遺伝子発現調節配列」を導入する方法、あるいは、対象遺伝子及び／またはその周辺の塩基配列を改変することにより、転写されたメッセンジャーＲＮＡの安定性を向上させる方法などが挙げられる。
【0036】
「遺伝子発現調節配列」に含まれるプロモーター配列やシャイン・ダルガノ配列としては、例えば、配列番号１０～１６のいずれかに示される塩基配列、または、これら塩基配列の一部を含む塩基配列などが挙げられるが、特に限定されない。
【0037】
ゲノムＤＮＡの少なくとも一部の置換、欠失、挿入及び／又は付加は、当業者に周知の方法により行うことができる。代表的な方法としてはトランスポゾンと相同組換えの機構を利用した方法（Ｏｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６２：１０６８－１０７４（１９８５））や、相同組換えの機構によって起こる部位特異的な組み込みと第二段階の相同組換えによる脱落を原理とした方法（Ｎｏｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４：１９７－２１７（１９８７））などがある。また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｓａｃＢ遺伝子を共存させて、第二段階の相同組換えによって遺伝子が脱落した微生物株をスクロース耐性株として容易に単離する方法（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６：１１９５－１２０４（１９９２）、Ｌｅｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６：４３８５－４３９３（１９９４））も利用することができる。さらに別の方法として、標的ＤＮＡを改変するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによるゲノム編集技術（Ｙ．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ Ｂｉｏｌ．２０１６，５（７）：７２１－７３２）も利用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムでは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は改変すべきゲノムＤＮＡの塩基配列の一部に結合しうる配列を有しており、Ｃａｓ９を標的に運ぶ役割をもつ。
【0038】
細胞へのベクターの導入方法としても特に限定されないが、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、スフェロプラスト法等が挙げられる。
【0039】
本実施形態に係る形質転換微生物を培養することで、菌体内にＰＨＡを蓄積させることができる。本実施形態に係る形質転換微生物を培養する方法としては、常法の微生物培養法に従うことができ、適切な炭素源が存在する培地中で培養を行なえばよい。培地組成、炭素源の添加方法、培養スケール、通気攪拌条件や、培養温度、培養時間などは特に限定されない。炭素源は、連続的に、または間欠的に培地に添加することが好ましい。
【0040】
培養時の炭素源としては、本実施形態に係る形質転換微生物が資化可能であればどのような炭素源でも使用可能である。特に限定されないが、例えば、グルコース、フルクトース、シュークロースなどの糖類；パーム油やパーム核油（これらを分別した低融点分画であるパームオレイン、パームダブルオレイン、パーム核油オレインなども含む）、コーン油、やし油、オリーブ油、大豆油、菜種油、ヤトロファ油などの油脂やその分画油類、あるいはその精製副産物；ラウリン酸、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリンスチン酸などの脂肪酸やそれらの誘導体、あるいはグリセロール等が挙げられる。また、本実施形態に係る形質転換微生物が二酸化炭素、一酸化炭素、メタン、メタノール、エタノールなどのガスやアルコール類を利用可能である場合、これらを炭素源として使用することもできる。
【0041】
本実施形態に係るＰＨＡの製造では、上記炭素源、炭素源以外の栄養源である窒素源、無機塩類、その他の有機栄養源を含む培地を用いて、前記微生物を培養することが好ましい。下記に限定されないが、窒素源としては、例えば、アンモニア；塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩；ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。その他の有機栄養源としては、例えば、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。
【0042】
培養を適切な時間行なって菌体内にＰＨＡを蓄積させた後、周知の方法を用いて菌体からＰＨＡを回収する。回収方法については特に限定されないが、例えば、培養終了後、培養液から遠心分離機や分離膜等で菌体を分離し、乾燥させた後、乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてＰＨＡを抽出し、このＰＨＡを含んだ有機溶剤溶液から濾過等によって細胞成分を除去し、その濾液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてＰＨＡを沈殿させ、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてＰＨＡを回収することができる。また、界面活性剤やアルカリ、酵素などを用いてＰＨＡ以外の細胞成分を水に溶解させた後、濾過や遠心分離によってＰＨＡ粒子を水相から分離し乾燥させて回収することもできる。
【0043】
本実施形態によると、ＰＨＡを蓄積した大粒径の微生物細胞を得ることができるので、培養液からの微生物細胞の分離を容易に効率よく実施することができる。
【実施例】
【0044】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。なお全体的な遺伝子操作は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９））に記載されているように行うことができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主等は、市場の供給者から購入し、その説明に従い使用することができる。なお、酵素としては、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。
【0045】
（製造例１）Ａ０５９７欠失破壊株の作製
まず、遺伝子欠失用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、Ａ０５９７構造遺伝子より上流および下流の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号１７）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、Ａ０５９７構造遺伝子より上流および下流の塩基配列を有する遺伝子欠失用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋Ａ０５９７ＵＤを作製した。
まず、遺伝子欠失用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、Ａ０５９７構造遺伝子より上流および下流の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号１７）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、Ａ０５９７構造遺伝子より上流および下流の塩基配列を有する遺伝子欠失用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋Ａ０５９７ＵＤを作製した。
【0046】
次に、遺伝子欠失破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋Ａ０５９７ＵＤを用いて、以下のようにしてＡ０５９７欠失破壊株の作製を行った。
遺伝子挿入破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋Ａ０５９７ＵＤで大腸菌Ｓ１７－１株（ＡＴＣＣ４７０５５）を形質転換し、それによって得た形質転換微生物を、ＫＮＫ－００５株とＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。ＫＮＫ－００５株は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上にアエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子（配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子）が導入された形質転換体であり、米国特許第７３８４７６６号明細書に記載の方法に準じて作製することができる。
遺伝子挿入破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋Ａ０５９７ＵＤで大腸菌Ｓ１７－１株（ＡＴＣＣ４７０５５）を形質転換し、それによって得た形質転換微生物を、ＫＮＫ－００５株とＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。ＫＮＫ－００５株は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上にアエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子（配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子）が導入された形質転換体であり、米国特許第７３８４７６６号明細書に記載の方法に準じて作製することができる。
【0047】
得られた培養液を、２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、りん酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、りん酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に播種し、寒天培地上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがＫＮＫ－００５株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株をプラスミドが脱落した株として取得した。さらにＰＣＲおよびＤＮＡシーケンサーによる解析により染色体上のＡ０５９７構造遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した菌株１株を単離した。このＡ０５９７遺伝子欠失株をＡ０５９７欠失破壊株と命名した。
【0048】
（製造例２）Ａ０３０２欠失破壊株の作製
まず、遺伝子欠失用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、Ａ０３０２構造遺伝子より上流および下流の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号１８）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、Ａ０３０２構造遺伝子より上流および下流の塩基配列を有する遺伝子欠失用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋Ａ０３０２ＵＤを作製した。
まず、遺伝子欠失用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、Ａ０３０２構造遺伝子より上流および下流の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号１８）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、Ａ０３０２構造遺伝子より上流および下流の塩基配列を有する遺伝子欠失用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋Ａ０３０２ＵＤを作製した。
【0049】
次に、Ａ０３０２遺伝子欠失用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋Ａ０３０２ＵＤを、製造例１と同様の方法でＫＮＫ－００５株に導入した。さらに、製造例１と同様の方法で、染色体上のＡ０３０２構造遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した菌株１株を単離した。このＡ０３０２遺伝子欠失株をＡ０３０２欠失破壊株と命名した。
【0050】
（製造例３）Ａ１３８６欠失破壊株の作製
まず、遺伝子欠失用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、Ａ１３８６構造遺伝子より上流および下流の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号１９）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、Ａ１３８６構造遺伝子より上流および下流の塩基配列を有する遺伝子欠失用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋Ａ１３８６ＵＤを作製した。
まず、遺伝子欠失用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、Ａ１３８６構造遺伝子より上流および下流の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号１９）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、Ａ１３８６構造遺伝子より上流および下流の塩基配列を有する遺伝子欠失用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋Ａ１３８６ＵＤを作製した。
【0051】
次に、Ａ１３８６遺伝子欠失用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋Ａ１３８６ＵＤを、製造例１と同様の方法でＫＮＫ－００５株に導入した。さらに、製造例１と同様の方法で、染色体上のＡ１３８６構造遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した菌株１株を単離した。このＡ１３８６遺伝子欠失株をＡ１３８６欠失破壊株と命名した。
【0052】
（製造例４）Ａ２２７２挿入破壊株の作製
まず、Ａ２２７２遺伝子挿入破壊用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、Ａ２２７２構造遺伝子の４７～２３１番目の塩基配列のＤＮＡ断片（配列番号２０）を得た。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、Ａ２２７２構造遺伝子の４７～２３１番目の塩基配列を有する遺伝子挿入破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ－Ａ２２７２－ｉｎｄｅｌを作製した。
まず、Ａ２２７２遺伝子挿入破壊用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、Ａ２２７２構造遺伝子の４７～２３１番目の塩基配列のＤＮＡ断片（配列番号２０）を得た。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、Ａ２２７２構造遺伝子の４７～２３１番目の塩基配列を有する遺伝子挿入破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ－Ａ２２７２－ｉｎｄｅｌを作製した。
【0053】
次に、遺伝子挿入破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ－Ａ２２７２－ｉｎｄｅｌを、製造例１と同様の方法でＫＮＫ－００５株に導入した。さらにＰＣＲおよびＤＮＡシーケンサーによる解析により染色体上のＡ２２７２構造遺伝子配列内にプラスミドが挿入されることにより、Ａ２２７２遺伝子が破壊された菌株１株を単離した。このＡ２２７２遺伝子破壊株をＡ２２７２挿入破壊株と命名した。
【0054】
（製造例５）Ａ２４０５挿入破壊株の作製
まず、Ａ２４０５遺伝子挿入破壊用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、Ａ２４０５構造遺伝子の７～２０４番目の塩基配列のＤＮＡ断片（配列番号２１）を得た。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、Ａ２４０５構造遺伝子の７～２０４番目の塩基配列を有するＡ２４０５遺伝子挿入破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ－Ａ２４０５－ｉｎｄｅｌを作製した。
まず、Ａ２４０５遺伝子挿入破壊用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、Ａ２４０５構造遺伝子の７～２０４番目の塩基配列のＤＮＡ断片（配列番号２１）を得た。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、Ａ２４０５構造遺伝子の７～２０４番目の塩基配列を有するＡ２４０５遺伝子挿入破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ－Ａ２４０５－ｉｎｄｅｌを作製した。
【0055】
次に、遺伝子挿入破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ－Ａ２４０５－ｉｎｄｅｌを、製造例１と同様の方法でＫＮＫ－００５株に導入した。さらにＰＣＲおよびＤＮＡシーケンサーによる解析により染色体上のＡ２４０５構造遺伝子配列内にプラスミドが挿入されることにより、Ａ２４０５遺伝子が破壊された菌株１株を単離した。このＡ２４０５遺伝子破壊株をＡ２４０５挿入破壊株と命名した。
【0056】
（製造例６）Ａ２４０５欠失破壊株の作製
まず、遺伝子欠失用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、Ａ２４０５構造遺伝子より上流および下流の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号２２）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、Ａ２４０５構造遺伝子より上流および下流の塩基配列を有する遺伝子欠失用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋Ａ２４０５ＵＤを作製した。
まず、遺伝子欠失用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、Ａ２４０５構造遺伝子より上流および下流の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号２２）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、Ａ２４０５構造遺伝子より上流および下流の塩基配列を有する遺伝子欠失用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋Ａ２４０５ＵＤを作製した。
【0057】
次に、Ａ２４０５遺伝子欠失用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋Ａ２４０５ＵＤを、製造例１と同様の方法でＫＮＫ－００５株に導入した。さらに、製造例１と同様の方法で、染色体上のＡ２４０５構造遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した菌株１株を単離した。このＡ２４０５遺伝子欠失株をＡ２４０５欠失破壊株と命名した。
【0058】
（製造例８）Ａ１３８６・Ａ２４０５二重破壊株の作製
Ａ２４０５遺伝子欠失用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋Ａ２４０５ＵＤを、製造例１と同様の方法でＡ１３８６欠失破壊株に導入した。さらに、製造例１と同様の方法で、染色体上のＡ２４０５構造遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した菌株１株を単離した。このＡ１３８６遺伝子およびＡ２４０５遺伝子が欠失された株をＡ１３８６・Ａ２４０５二重破壊株と命名した。
Ａ２４０５遺伝子欠失用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋Ａ２４０５ＵＤを、製造例１と同様の方法でＡ１３８６欠失破壊株に導入した。さらに、製造例１と同様の方法で、染色体上のＡ２４０５構造遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した菌株１株を単離した。このＡ１３８６遺伝子およびＡ２４０５遺伝子が欠失された株をＡ１３８６・Ａ２４０５二重破壊株と命名した。
【0059】
（製造例９）ｍｉｎＣＤ発現Ａ１３８６欠失破壊株の作製
ｍｉｎＣＤ遺伝子発現用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ－ＰＡ－ｍｉｎＣＤの作製を行った。作製は以下のように行った。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、プロモーター配列とｍｉｎＣＤ遺伝子配列およびゲノム上の組込み領域の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号２３）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｍｉｎＣＤ遺伝子発現用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ＰＡ－ｍｉｎＣＤを作製した。
ｍｉｎＣＤ遺伝子発現用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ－ＰＡ－ｍｉｎＣＤの作製を行った。作製は以下のように行った。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、プロモーター配列とｍｉｎＣＤ遺伝子配列およびゲノム上の組込み領域の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号２３）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｍｉｎＣＤ遺伝子発現用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ＰＡ－ｍｉｎＣＤを作製した。
【0060】
次に、ｍｉｎＣＤ遺伝子発現用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ－ＰＡ－ｍｉｎＣＤを、製造例１と同様の方法でＡ１３８６欠失破壊株に導入した。さらに製造例１と同様の方法で、染色体上にプロモーター配列とｍｉｎＣＤ遺伝子配列が挿入された菌株１株を単離した。このｍｉｎＣＤ遺伝子発現Ａ１３８６欠失株をｍｉｎＣＤ発現Ａ１３８６破壊株と命名した。
【0061】
（製造例１０）ｍｉｎＣＤ発現Ａ２４０５破壊株の作製
ｍｉｎＣＤ遺伝子発現用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ－ＰＡ－ｍｉｎＣＤを、製造例１と同様の方法でＡ２４０５欠失破壊株に導入した。さらに製造例１と同様の方法で、染色体上にプロモーター配列とｍｉｎＣＤ遺伝子配列が挿入された菌株１株を単離した。このｍｉｎＣＤ遺伝子発現Ａ２４０５欠失株をｍｉｎＣＤ発現Ａ２４０５破壊株と命名した。
ｍｉｎＣＤ遺伝子発現用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ－ＰＡ－ｍｉｎＣＤを、製造例１と同様の方法でＡ２４０５欠失破壊株に導入した。さらに製造例１と同様の方法で、染色体上にプロモーター配列とｍｉｎＣＤ遺伝子配列が挿入された菌株１株を単離した。このｍｉｎＣＤ遺伝子発現Ａ２４０５欠失株をｍｉｎＣＤ発現Ａ２４０５破壊株と命名した。
【0062】
（製造例１１）ｍｉｎＣＤ発現Ａ２４０５・Ａ１３８６破壊株の作製
Ａ１３８６遺伝子欠失用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋Ａ１３８６ＵＤを、製造例１と同様の方法でｍｉｎＣＤ発現Ａ２４０５破壊株に導入した。さらに製造例１と同様の方法で、染色体上のＡ１３８６構造遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した菌株１株を単離した。このｍｉｎＣＤ遺伝子発現Ａ２４０５・Ａ１３８６欠失株をｍｉｎＣＤ発現Ａ２４０５・Ａ１３８６破壊株と命名した。
Ａ１３８６遺伝子欠失用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋Ａ１３８６ＵＤを、製造例１と同様の方法でｍｉｎＣＤ発現Ａ２４０５破壊株に導入した。さらに製造例１と同様の方法で、染色体上のＡ１３８６構造遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した菌株１株を単離した。このｍｉｎＣＤ遺伝子発現Ａ２４０５・Ａ１３８６欠失株をｍｉｎＣＤ発現Ａ２４０５・Ａ１３８６破壊株と命名した。
【0063】
（比較例１）ＫＮＫ－００５株によるＰＨＡ生産
下記の条件でＫＮＫ－００５株を用いた培養検討を行なった。
下記の条件でＫＮＫ－００５株を用いた培養検討を行なった。
【0064】
（培地）
種母培地の組成は１ｗ／ｖ％ Ｍｅａｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％ Ｂａｃｔｏ－Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２ｗ／ｖ％ Ｙｅａｓｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ 、０．１５ｗ／ｖ％ ＫＨ２ＰＯ４、（ｐＨ６．８）とした。
前培養培地の組成は１．１ｗ／ｖ％ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％ＫＨ２ＰＯ４、１．２９ ｗ／ｖ％（ＮＨ４）２ＳＯ４ 、０．１ｗ／ｖ％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．５ｗ／ｖ％ パームオレインオイル、０．５ｖ／ｖ％ 微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）とした。炭素源としてパームオレインオイルを１０ｇ／Ｌの濃度で一括添加した。
ＰＨＡ生産培地の組成は０．３８５ｗ／ｖ％ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．０６７ｗ／ｖ％ ＫＨ２ＰＯ４、０．２９１ｗ／ｖ％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％ 微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）とした。
種母培地の組成は１ｗ／ｖ％ Ｍｅａｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％ Ｂａｃｔｏ－Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２ｗ／ｖ％ Ｙｅａｓｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ 、０．１５ｗ／ｖ％ ＫＨ２ＰＯ４、（ｐＨ６．８）とした。
前培養培地の組成は１．１ｗ／ｖ％ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％ＫＨ２ＰＯ４、１．２９ ｗ／ｖ％（ＮＨ４）２ＳＯ４ 、０．１ｗ／ｖ％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．５ｗ／ｖ％ パームオレインオイル、０．５ｖ／ｖ％ 微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）とした。炭素源としてパームオレインオイルを１０ｇ／Ｌの濃度で一括添加した。
ＰＨＡ生産培地の組成は０．３８５ｗ／ｖ％ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．０６７ｗ／ｖ％ ＫＨ２ＰＯ４、０．２９１ｗ／ｖ％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％ 微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）とした。
【0065】
（乾燥菌体に対するＰＨＡ蓄積量の割合の測定方法）
乾燥菌体に対するＰＨＡ蓄積量の割合は次のように測定した。遠心分離によって培養液から菌体を回収、エタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体を取得した。得られた乾燥菌体１ｇに１００ｍｌのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のＰＨＡを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が３０ｍｌになるまで濃縮後、９０ｍｌのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置した。析出したＰＨＡをろ別後、５０℃で３時間真空乾燥した。乾燥ＰＨＡの重量を測定し、乾燥菌体に対する菌体内のＰＨＡ蓄積量の割合を算出した。
乾燥菌体に対するＰＨＡ蓄積量の割合は次のように測定した。遠心分離によって培養液から菌体を回収、エタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体を取得した。得られた乾燥菌体１ｇに１００ｍｌのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のＰＨＡを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が３０ｍｌになるまで濃縮後、９０ｍｌのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置した。析出したＰＨＡをろ別後、５０℃で３時間真空乾燥した。乾燥ＰＨＡの重量を測定し、乾燥菌体に対する菌体内のＰＨＡ蓄積量の割合を算出した。
【0066】
（細胞径の測定方法）
細胞径は次のように測定した。培養終了後の培養液を６５℃で６０分間処理し、菌体細胞不活化を行った後、レーザー回折・散乱式粒子径分布測定装置（マイクロトラック・ベル社製Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ ＭＴ３３００ＥＸＩＩ）により解析し細胞の体積平均径（ＭＶ）を測定した。測定は標準的な設定（粒子透過性：透過、粒子屈折率：１．８１、粒子形状：非球形、溶媒屈折率：１．３３３）で行った。
細胞径は次のように測定した。培養終了後の培養液を６５℃で６０分間処理し、菌体細胞不活化を行った後、レーザー回折・散乱式粒子径分布測定装置（マイクロトラック・ベル社製Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ ＭＴ３３００ＥＸＩＩ）により解析し細胞の体積平均径（ＭＶ）を測定した。測定は標準的な設定（粒子透過性：透過、粒子屈折率：１．８１、粒子形状：非球形、溶媒屈折率：１．３３３）で行った。
【0067】
（細胞の顕微鏡観察）
細胞の顕微鏡観察は次のように行った。培養終了後の培養液を適宜希釈し、スライドガラスにのせて乾燥させた後、フクシンによって染色した。染色された細胞を光学顕微鏡によって観察した。
細胞の顕微鏡観察は次のように行った。培養終了後の培養液を適宜希釈し、スライドガラスにのせて乾燥させた後、フクシンによって染色した。染色された細胞を光学顕微鏡によって観察した。
【0068】
（ＰＨＡ生産培養）
ＰＨＡ生産培養は次のように行った。まず、ＫＮＫ－００５株のグリセロールストック（５０μｌ）を種母培地（１０ｍｌ）に接種して２４時間培養し種母培養を行なった。次に種母培養液を、１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ－３００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３３℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７～６．８の間でコントロールしながら２８時間培養し、前培養を行なった。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。
ＰＨＡ生産培養は次のように行った。まず、ＫＮＫ－００５株のグリセロールストック（５０μｌ）を種母培地（１０ｍｌ）に接種して２４時間培養し種母培養を行なった。次に種母培養液を、１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ－３００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３３℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７～６．８の間でコントロールしながら２８時間培養し、前培養を行なった。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。
【0069】
次に、前培養液を、２．５ＬのＰＨＡ生産培地を入れた５Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＳ－Ｕ５０型）に５．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３３℃、攪拌速度４２０ｒｐｍ、通気量２．１Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７～６．８の間でコントロールした。ｐＨコントロールには２５％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。炭素源は断続的に添加した。炭素源としてはパームオレインオイルを使用した。培養はＰＨＡ蓄積量が９０％程度に達するまで行った。ＰＨＡ蓄積量の割合および細胞径は前述のように測定した。結果を表１に示す。また、前述のように行った細胞の顕微鏡観察時に撮影した写真を図１に示す。
【0070】
（比較例２）Ａ０５９７欠失破壊株によるＰＨＡ生産
比較例１と同様の条件でＡ０５９７欠失破壊株を用いた培養検討を行なった。ＰＨＡ蓄積量の割合および細胞径の測定結果を表１に示す。また、前述のように行った細胞の顕微鏡観察写真を図２に示す。
比較例１と同様の条件でＡ０５９７欠失破壊株を用いた培養検討を行なった。ＰＨＡ蓄積量の割合および細胞径の測定結果を表１に示す。また、前述のように行った細胞の顕微鏡観察写真を図２に示す。
【0071】
培養検討の結果、前述の条件で測定したＡ０５９７欠失破壊株の細胞径は、親株であるＫＮＫ－００５株と比較して、１０％以上低下した。ＰＨＡの生産性についてはＫＮＫ－００５株と同等であった。
【0072】
（比較例３）Ａ０３０２欠失破壊株によるＰＨＡ生産
比較例１と同様の条件でＡ０３０２欠失破壊株を用いた培養検討を行なった。ＰＨＡ蓄積量の割合および細胞径の測定結果を表１に示す。また、前述のように行った細胞の顕微鏡観察写真を図３に示す。
比較例１と同様の条件でＡ０３０２欠失破壊株を用いた培養検討を行なった。ＰＨＡ蓄積量の割合および細胞径の測定結果を表１に示す。また、前述のように行った細胞の顕微鏡観察写真を図３に示す。
【0073】
培養検討の結果、前述の条件で測定したＡ０３０２欠失破壊株の細胞径は、親株であるＫＮＫ－００５株と比較して、１０％以上低下した。ＰＨＡの生産性についてはＫＮＫ－００５株と同等であった。
【0074】
（比較例４）Ａ２２７２挿入破壊株によるＰＨＡ生産
比較例１と同様の条件でＡ２２７２挿入破壊株を用いた培養検討を行なった。ＰＨＡ蓄積量の割合および細胞径の測定結果を表１に示す。また、前述のように行った細胞の顕微鏡観察写真を図４に示す。
比較例１と同様の条件でＡ２２７２挿入破壊株を用いた培養検討を行なった。ＰＨＡ蓄積量の割合および細胞径の測定結果を表１に示す。また、前述のように行った細胞の顕微鏡観察写真を図４に示す。
【0075】
培養検討の結果、前述の条件で測定したＡ２２７２挿入破壊株の細胞径は、親株であるＫＮＫ－００５株と比較して、同等であった。ＰＨＡの生産性についてはＫＮＫ－００５株と同等であった。
【0076】
（実施例１）Ａ１３８６欠失破壊株によるＰＨＡ生産
比較例１と同様の条件でＡ１３８６欠失破壊株を用いた培養検討を行なった。ＰＨＡ蓄積量の割合および細胞径の測定結果を表１に示す。また、前述のように行った細胞の顕微鏡観察写真を図５に示す。
比較例１と同様の条件でＡ１３８６欠失破壊株を用いた培養検討を行なった。ＰＨＡ蓄積量の割合および細胞径の測定結果を表１に示す。また、前述のように行った細胞の顕微鏡観察写真を図５に示す。
【0077】
培養検討の結果、前述の条件で測定したＡ１３８６欠失破壊株の細胞径は、親株であるＫＮＫ－００５株と比較して、２０％以上増大した。ＰＨＡの生産性についてもＫＮＫ－００５株と同等であった。
【0078】
（実施例２）Ａ２４０５挿入破壊株によるＰＨＡ生産
比較例１と同様の条件でＡ２４０５挿入破壊株を用いた培養検討を行なった。ＰＨＡ蓄積量の割合および細胞径の測定結果を表１に示す。また、前述のように行った細胞の顕微鏡観察写真を図６に示す。
比較例１と同様の条件でＡ２４０５挿入破壊株を用いた培養検討を行なった。ＰＨＡ蓄積量の割合および細胞径の測定結果を表１に示す。また、前述のように行った細胞の顕微鏡観察写真を図６に示す。
【0079】
培養検討の結果、前述の条件で測定したＡ２４０５挿入破壊株の細胞径は、親株であるＫＮＫ－００５株と比較して、２０％以上増大した。ＰＨＡの生産性についてもＫＮＫ－００５株と同等であった。
【0080】
（実施例３）Ａ２４０５欠失破壊株によるＰＨＡ生産
比較例１と同様の条件でＡ２４０５欠失破壊株を用いた培養検討を行なった。ＰＨＡ蓄積量の割合および細胞径の測定結果を表１に示す。また、前述のように行った細胞の顕微鏡観察写真を図７に示す。
比較例１と同様の条件でＡ２４０５欠失破壊株を用いた培養検討を行なった。ＰＨＡ蓄積量の割合および細胞径の測定結果を表１に示す。また、前述のように行った細胞の顕微鏡観察写真を図７に示す。
【0081】
培養検討の結果、前述の条件で測定したＡ２４０５欠失破壊株の細胞径は、親株であるＫＮＫ－００５株と比較して、２０％以上増大した。ＰＨＡの生産性についてもＫＮＫ－００５株と同等であった。
【0082】
（実施例４）Ａ１３８６・Ａ２４０５二重破壊株によるＰＨＡ生産
比較例１と同様の条件でＡ１３８６・Ａ２４０５二重破壊株を用いた培養検討を行なった。ＰＨＡ蓄積量の割合および細胞径の測定結果を表１に示す。また、前述のように行った細胞の顕微鏡観察写真を図８に示す。
比較例１と同様の条件でＡ１３８６・Ａ２４０５二重破壊株を用いた培養検討を行なった。ＰＨＡ蓄積量の割合および細胞径の測定結果を表１に示す。また、前述のように行った細胞の顕微鏡観察写真を図８に示す。
【0083】
培養検討の結果、前述の条件で測定したＡ１３８６・Ａ２４０５二重破壊株の細胞径は、親株であるＫＮＫ－００５株と比較して、４０％以上増大した。すなわち、Ａ１３８６破壊とＡ２４０５破壊には細胞径拡大に対する相乗効果または相加効果があった。ＰＨＡの生産性についてもＫＮＫ－００５株と同等であった。
【0084】
（実施例５）ｍｉｎＣＤ発現Ａ１３８６破壊株によるＰＨＡ生産
比較例１と同様の条件でｍｉｎＣＤ発現Ａ１３８６破壊株を用いた培養検討を行なった。ＰＨＡ蓄積量の割合および細胞径の測定結果を表１に示す。また、前述のように行った細胞の顕微鏡観察写真を図９に示す。
比較例１と同様の条件でｍｉｎＣＤ発現Ａ１３８６破壊株を用いた培養検討を行なった。ＰＨＡ蓄積量の割合および細胞径の測定結果を表１に示す。また、前述のように行った細胞の顕微鏡観察写真を図９に示す。
【0085】
培養検討の結果、前述の条件で測定したｍｉｎＣＤ発現Ａ１３８６破壊株の細胞径は、親株であるＫＮＫ－００５株と比較して、２０％以上増大した。ＰＨＡの生産性についてもＫＮＫ－００５株と同等であった。
【0086】
（実施例６）ｍｉｎＣＤ発現Ａ２４０５破壊株によるＰＨＡ生産
比較例１と同様の条件でｍｉｎＣＤ発現Ａ２４０５破壊株を用いた培養検討を行なった。ＰＨＡ蓄積量の割合および細胞径の測定結果を表１に示す。また、前述のように行った細胞の顕微鏡観察写真を図１０に示す。
比較例１と同様の条件でｍｉｎＣＤ発現Ａ２４０５破壊株を用いた培養検討を行なった。ＰＨＡ蓄積量の割合および細胞径の測定結果を表１に示す。また、前述のように行った細胞の顕微鏡観察写真を図１０に示す。
【0087】
培養検討の結果、前述の条件で測定したｍｉｎＣＤ発現Ａ２４０５破壊株の細胞径は、親株であるＫＮＫ－００５株と比較して、４０％以上増大した。すなわち、Ａ２４０５破壊とｍｉｎＣＤ発現には細胞径拡大に対する相乗効果または相加効果があった。ＰＨＡの生産性についてもＫＮＫ－００５株と同等であった。
【0088】
（実施例７）ｍｉｎＣＤ発現Ａ２４０５・Ａ１３８６破壊株によるＰＨＡ生産
比較例１と同様の条件でｍｉｎＣＤ発現Ａ２４０５・Ａ１３８６破壊株を用いた培養検討を行なった。ＰＨＡ蓄積量の割合および細胞径の測定結果を表１に示す。また、前述のように行った細胞の顕微鏡観察写真を図１１に示す。
比較例１と同様の条件でｍｉｎＣＤ発現Ａ２４０５・Ａ１３８６破壊株を用いた培養検討を行なった。ＰＨＡ蓄積量の割合および細胞径の測定結果を表１に示す。また、前述のように行った細胞の顕微鏡観察写真を図１１に示す。
【0089】
培養検討の結果、前述の条件で測定したｍｉｎＣＤ発現Ａ２４０５・Ａ１３８６破壊株の細胞径は、親株であるＫＮＫ－００５株と比較して、５０％以上増大した。すなわち、Ａ１３８６破壊とＡ２４０５破壊とｍｉｎＣＤ発現には細胞径拡大に対する相乗効果または相加効果があった。ＰＨＡの生産性についてもＫＮＫ－００５株と同等であった。
【0090】
なお、比較例および実施例の培養検討によって生産されたＰＨＡはＰＨＢＨであることをＨＰＬＣ分析にて確認した。
【0091】
【表1】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】