特許 7535849 出血治療のための止血促進タンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-08-08

(45)【発行日】2024-08-19

(54)【発明の名称】出血治療のための止血促進タンパク質

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20240809BHJP

   A61K 38/36 20060101ALI20240809BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20240809BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240809BHJP

   C07K 14/745 20060101ALI20240809BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240809BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240809BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240809BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240809BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12

A61K38/36

A61P7/04

A61P43/00 111

C07K14/745

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

【請求項の数】 14

(21)【出願番号】P 2019235197

(22)【出願日】2019-12-25

(62)【分割の表示】P 2017515659の分割

【原出願日】2015-05-26

(65)【公開番号】P2020062039

(43)【公開日】2020-04-23

【審査請求日】2020-01-21

【審判番号】

【審判請求日】2022-06-23

(31)【優先権主張番号】14169895.1

(32)【優先日】2014-05-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】516355405

【氏名又は名称】アカデ－ミッシュ ズィーケンハウス ライデン

【氏名又は名称原語表記】Ａｃａｄｅｍｉｓｃｈ Ｚｉｅｋｅｎｈｕｉｓ Ｌｅｉｄｅｎ

【住所又は居所原語表記】Ａｌｂｉｎｕｓｄｒｅｅｆ ２， ２３３３ ＺＡ Ｌｅｉｄｅｎ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ

(74)【代理人】

【識別番号】100097456

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 徹

(72)【発明者】

【氏名】フェルフーフ，ダニエル

(72)【発明者】

【氏名】ライツゥマ，ピーター ハー

(72)【発明者】

【氏名】ボス，メッティーネ ハーアー

【合議体】

【審判長】長井 啓子

【審判官】福井 悟

【審判官】天野 貴子

(56)【参考文献】

【文献】特表２００９－５２７２３４（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

C12N15/00-15/90

ＣＡＰＬＵＳ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１に示されるアミノ酸残基Phe-396に対応するアミノ酸残基が表１に列挙されるPhe以外のアミノ酸残基のいずれか１つによって置換されたポリペプチドである凝固因子Xaポリペプチドを含む組換えタンパク質。

【請求項2】

前記アミノ酸残基Phe-396に対応するアミノ酸残基の置換が、配列番号１のGly-289とAsp-320の間のアミノ酸残基の領域に対応する領域における１－５０個のアミノ酸残基の挿入と組み合わされている、請求項１に記載の組換えタンパク質。

【請求項3】

前記アミノ酸残基Phe-396に対応するアミノ酸残基の置換が、配列番号１のHis-311とAsp-320の間のアミノ酸残基の領域に対応する領域における１－５０個のアミノ酸残基の挿入と組み合わされている、請求項２に記載の組換えタンパク質。

【請求項4】

前記配列番号１のHis-311とAsp-320の間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域が、配列番号４、配列番号５、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１のアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の組換えタンパク質。

【請求項5】

請求項１－４のいずれか１項に記載の組換えタンパク質をコードするDNA配列を含む核酸分子。

【請求項6】

請求項５に記載の核酸分子を含む発現ベクター。

【請求項7】

請求項５に記載の核酸分子または請求項６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。

【請求項8】

請求項１－４のいずれか１項に記載のタンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。

【請求項9】

医薬として使用するための、請求項１－４のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。

【請求項10】

被験体における直接第Xa因子阻害剤の抗血液凝固効果を完全にまたは部分的に逆転させる方法で使用するための、請求項１－４のいずれか１項に記載の組換えタンパク質。

【請求項11】

被験体における直接第Xa因子阻害剤の抗血液凝固効果を完全にまたは部分的に逆転させるための医薬の製造のための、請求項１－４のいずれか１項に記載の組換えタンパク質の使用。

【請求項12】

直接第Xa因子阻害剤がリバーロキサバン（5-クロロ-N-[[(5S)-2-オキソ-3-[4-(3-オキソ-4-モルホリニル)フェニル]-5-オキサゾリジニル]メチル]-2-チオフェンカルボキサミド）、アピキサバン（1-(4-メトキシフェニル)-7-オキソ-6-[4-(2-オキソピペリジン-1-イル)フェニル]-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン-3-カルボキサミド）、エドキサバン（N'-(5-クロロピリジン-2-イル)-N-[(1S,2R,4S)-4-(ジメチルカルバモイル)-2-[(5-メチル-6,7-ジヒドロ-4H-[1,3]チアゾロ[5,4-c]ピリジン-2-カルボニル)アミノ]シクロヘキシル]オキサミド;4-メチルベンゼンスルホン酸）、およびベトリキサバン（N-(5-クロロピリジン-2-イル)-2-[[4-(N,N-ジメチルカルバムイミドイル)ベンゾイル]アミノ]-5-メトキシベンズアミド）からなる群から選択される請求項１１に記載の使用。

【請求項13】

被験者における直接第Xa因子阻害剤の抗血液凝固効果を完全にまたは部分的に逆転させる方法に使用するための、請求項８に記載の医薬組成物。

【請求項14】

被験者における直接第Xa因子阻害剤の抗血液凝固効果を完全にまたは部分的に逆転させるための医薬品の製造のための、請求項８に記載の医薬組成物の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、医学的治療の分野のものである。特に、本発明は、調節された止血応答から生じる出血合併症を治療、予防、または改善する分野のものである。

【背景技術】

【0002】

世界中の何百万人もの患者が、心房細動の予防または静脈血栓の予防および治療における脳卒中の予防管理のために、抗凝固剤を必要としている。予防法は、伝統的に、クマリンベースの経口抗凝固剤である、ビタミンK依存性血液凝固因子の合成を阻止するワルファリン（Warfarin）、アセノクマロール（Acenocoumarol）およびフェンプロクモン（Phenprocoumon）のようなビタミンK拮抗剤（VKA's）が中心である。さらなる抗凝固剤には、可溶性フィブリノゲンをフィブリンの不溶性鎖に変換するセリンプロテアーゼである酵素トロンビンを阻害する標的特異的抗凝固剤、例えばダビガトランが含まれる。いわゆる解毒剤を用いた抗凝固剤効果の効果的な逆転は、安全な薬物使用のための前提条件となっている。これは、オランダだけで、抗凝固剤で治療された10,000人を超える患者が毎年最大2,000人の死亡を含む有害な重度の出血イベントに苦しんでいることを考えると、特に重要である。（Adriaansen H., et al: “Samenvatting Medische Jaarverslagen van de Federatie van Nederlandse Trombosediensten”, 2011; 1-44）。

【0003】

現在利用可能な、過剰な抗凝固を防止するための抗凝固剤－解毒剤の組合せは、ヘパリン－プロタミンおよびワルファリン－ビタミンKである。ビタミンK依存性凝固因子II、IX、X（3-因子PCC）、または、II、VII、IX、X（4因子PCC）、および様々な量のプロテインCおよびSを含む濃縮プロトロンビン複合体（PCC）には、ワルファリン関連効果の逆転が指摘されている（たとえば、Frumkin, Ann Emerg Med, 2013, 62: 616-626を参照されたい）。新鮮凍結血漿および組換え第VIIa因子（rfVIIa）もまた、低分子量ヘパリン処置下で、重大な外傷または重度の出血を患う患者の非特異的解毒剤として使用されている（Lauritzen et al., 2005. Blood 106: Abstract 2149, 607A-608A）。また、ヘパリンまたは低分子量ヘパリン解毒剤としてのプロタミンフラグメント（米国特許第6,624,141号）および小型合成ペプチド（米国特許第6,200,955号）、および、トロンビン阻害剤の解毒剤としてのトロンビン突然変異タンパク質（米国特許第6,060,300号）も報告されている。プロトロンビン中間体および誘導体は、ヒルジンおよび他のトロンビン阻害剤に対する解毒剤として報告されている（米国特許第5,817,309号および第6,086,871号）。信頼できる臨床データがないにもかかわらず、ダビガトラン関連重度出血は、好ましくは、非特異的反転剤活性化プロトロンビン複合体濃縮物（APCC）で処理される（Siegal et al., 2014. Blood 123: 1152-1158）。

【0004】

新たに開発されたリバーロキサバン、アピキサバン、エドキサバンなどの直接的第Xa因子（FXa）阻害剤（DFXIs）は抗凝固剤であり、迅速な治療有効性、投薬の容易さ、および、薬物および食物相互作用の少なさと予測可能な薬物動態によるモニタリング要件の欠如のため、近い将来古典的なビタミンK拮抗剤（VKA）の代替品になる可能性がある。DFXIは、血液凝固第Xa因子に強く結合してその活性を停止させるように特異的に設計された小分子化合物阻害剤である。凝固第Xa因子は、通常、約60kDaの不活性前駆体（酵素前駆体）凝固第X因子（FX）として血液中に循環する必須セリンプロテアーゼであるが、血液凝固カスケードと総称される複雑な一連のタンパク質活性化工程において、血管損傷時に、その活性プロテアーゼ形態へと変換される。この系の中心は、凝固第Va因子 （FVa）と関連した凝固FXaからなるプロトロンビナーゼ複合体として知られる補因子－プロテアーゼ複合体の構造であり、これは専ら負に荷電したリン脂質膜上に集合し、不活性プロトロンビンを活性セリンプロテアーゼトロンビンへと変換する。

【0005】

DFXIを使用することの主な欠点は、抗凝固療法に伴う潜在的な生命を脅かす出血合併症を、予防し止めるための、特異的かつ適切な逆転戦略がないことである。

【0006】

DFXIは、遊離およびプロトロンビンに結合した凝固FXaを阻害するので（European Medicines Agency, 2008. イグザレルトのCHMP評価報告, Procedure No. EMEA/H/C/000944. Doc.Ref.: EMEA/543519/2008）、正常な止血の効果的な回復には、循環凝固FXaの完全な置換または血液からの阻害化合物の効果的な除去が必要とされる。

【0007】

現在、DFXI療法に関連する生命を脅かす潜在的な出血合併症を予防および阻止するための特定の逆行戦略はない。生命維持療法および外科療法の次に、限られた証拠に基づいて、3因子および4因子濃縮プロトロンビン複合体（PCC）を使用する非特異的な逆転療法が考慮され得る（Siegal et al., 2014. Blood 123: 1152-1158; Levi et al., 2014. J Thrombosis Haemostatis, Published online 8 May 2014; doi: 10.1111/jth.12599）。DFXIに関連する出血に特異的な反転戦略は、循環DFXIに結合して捕捉することによってDFXIのデコイとして働く、組換えFXa（アンデキサネット アルファ）の触媒的に不活性な形態に基づいており、それにより内因性凝固FXaが通常の凝固に関与することを可能にしている（Lu et al., 2013. Nature Medicine 19: 446）。このアプローチの欠点は、化学量論的濃度が阻害を達成するために必要とされるので、高用量のアンデキサネット アルファを投与する必要があることである（400mg IV bolus in phase III trial; Portola News Release March 19, 2014）。さらに、DFXIの半減期は部分的に腎クリアランスに依存するため、腎不全の場合、すべての循環阻害分子を捕捉するのに必要なデコイFXaの量はさらに高くなる可能性がある。この逆転戦略は、応答が遊離の内因性凝固FXaの生成に依存するので、迅速かつ直接的な凝固促進応答をもたらさない。

【0008】

このとき、DFXI抗凝固療法に関連する生命を脅かす可能性のある出血合併症を予防および停止するための直接的、適切な逆転戦略は利用できない。

【発明の概要】

【0009】

本発明は、この問題を、DFXI抗凝固療法に伴う生命を脅かす潜在的な出血合併症を予防および停止するための適切な逆行戦略として、哺乳動物、好ましくは霊長類、より好ましくはヒトの凝固FXaポリペプチドの、組換えタンパク質を含み、または組換えタンパク質からなるものであって、前記ポリペプチドが、配列番号1のGly-289とAsp-320との間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域、好ましくは配列番号1のGlu-297とAsp-320との間、より好ましくは配列番号1のVal-305とAsp-320との間、最も好ましくはHis-311とAsp-320との間、またはHis-311とTyr-319との間に改変を有し、前記改変が、少なくとも1つのアミノ酸残基の挿入および/または置換および/または欠失であり、好ましくは少なくとも1つのアミノ酸残基の挿入であるものを、提供することにより解決する。明確な定義として、アミノ酸残基の番号付けは、配列番号1で示されるヒト凝固FXアミノ酸配列に基づいている。

【発明を実施するための形態】

【0010】

配列番号1のGly-289およびAsp-320に対応するGlyとAspとの間の領域で変化したアミノ酸組成を有する触媒的に活性なヒト凝固FXaは凝血促進剤として凝固カスケードに関与し、前記因子は、前記変化したアミノ酸組成を有さない凝固FXaと比較して、DFXIによる阻害に対する感受性が低下することが見出された。したがって、本発明は、遊離の内因性凝固FXaの生成に依存しない凝血促進性解毒剤を提供するとともに、DFXI抗凝固療法に関連する合併症を予防および停止するための迅速かつ直接的な逆転戦略を提供する。

【0011】

ヒト凝固FXのアミノ酸配列は配列番号1に示されており、GENBANK（登録商標）の “AAH46125.1”＜http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AAH46125.1＞に記載されている。この配列中のアミノ酸残基番号付けは、ヒト凝固FX配列に基づいている。配列番号1に記載の配列を有する凝固FXは、プレプロリーダー配列（配列番号1のアミノ酸残基1から40）を含む前駆体であり、続いて凝固FX軽鎖に対応する配列（配列番号1のアミノ酸残基41から179 ）、凝固FXの分泌の間に除去されるRKRトリプレット（配列番号1のアミノ酸残基180から182）、および活性化ペプチド（AP）を含有する凝固FX重鎖（配列番号1のアミノ酸残基183から488） 配列番号1のアミノ酸残基183から234）および触媒性セリンプロテアーゼドメイン（配列番号1のアミノ酸残基235から488）を含む。

【0012】

ヒト凝固FXの成熟には、とりわけ、ゴルジ体におけるタンパク質分解的切断および翻訳後修飾が含まれる。成熟FXタンパク質は、ジスルフィド結合によって連結された軽鎖および重鎖からなる二本鎖分子である（Uprichardら, 2002. Blood Reviews 16: 97-1100）。成熟ヒト凝固FXは、配列番号1のArg-234とIle-235との間の重鎖上のペプチド結合の切断により活性化され、それにより凝固FXの重鎖から52残基の活性化ペプチドを放出する。得られたジスルフィド結合軽鎖および切断重鎖は、活性化FXaポリペプチドを構成する。

【0013】

ヒト凝固FXaの軽鎖のアミノ酸配列を配列番号2に示す。ヒト凝固FXaの重鎖のアミノ酸配列を配列番号3に示す。

【0014】

本明細書で使用する「組換え」という用語は、当業者に公知の組換えDNA技術を用いて産生されるタンパク質を指す。組換え凝固FXまたはFXaポリペプチドはまた、rFXまたはrFXaとして示される。組換えタンパク質は、例えば、アミノ酸組成が異なるため、および/またはグリコシル化のような翻訳後修飾の違いのために、天然タンパク質と同一ではないことが好ましい。

【0015】

本明細書で使用される「改変」という用語は、少なくとも1つのアミノ酸残基の挿入および/または置換および/または欠失を指す。 前記改変は、好ましくは、少なくとも1つのアミノ酸の挿入である。

【0016】

本明細書で使用する「凝固FXaポリペプチドを含む組換えタンパク質」という語句は、組換え凝固FXaポリペプチド、好ましくは哺乳類、より好ましくは霊長類、そして最も好ましくはヒト起源のものを含むタンパク質を包含することを意味する。この語句は、例えば、哺乳類凝固rFXaポリペプチドにプロセシングおよび/または活性化される、ヒト凝固FXなどの組換え哺乳動物前駆体タンパク質を含む。したがって、本発明のタンパク質は、好ましくは、配列番号1のGly-289とAsp-320との間、好ましくは配列番号1のGlu-297とAsp-320の間、より好ましくは配列番号1のVal-305とAsp-320の間のアミノ酸残基の領域に対応し、配列番号1のHis-311およびAsp-320を含むアミノ酸残基の少なくとも1つのアミノ酸残基の挿入および/または置換および/または欠失、好ましくは挿入を有する、組換え哺乳動物、好ましくは霊長類、より好ましくはヒト凝固FXである。さらに、前記語句には、凝固rFXaポリペプチドの他に、たとえば、欧州特許第0150126号明細書に記載されているようなFLAGタグおよび/または1つ以上の他の同等ペプチドのような、タグを構成するアミノ酸配列のような、1つまたは複数のさらなるアミノ酸配列を含むタンパク質が包含される。

【0017】

したがって、一実施形態では、本発明による凝固FXaポリペプチドを含む組換えタンパク質は、凝固第X因子ポリペプチドであり、前記ポリペプチドは、Gly-289とAsp-320との間、好ましくは配列番号1のHis-311とAsp-320との間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域に変化を有し、前記変化は、少なくとも1つのアミノ酸残基の挿入である。

【0018】

本明細書で使用される用語「凝固FX」は、不活性凝固FX前駆体タンパク質を指す。当業者は、凝固FXがプレプロタンパク質FXとも呼ばれることを知っている。本明細書で使用されるように、凝固FXは、凝固FXaポリペプチドを含む。

【0019】

本明細書で使用される「成熟凝固FX」という用語は、ジスルフィド結合によって連結された軽鎖および重鎖からなる不活性凝固FXタンパク質を指す。このFXタンパク質は、プロタンパク質FX、またはチモーゲンFXとも呼ばれる。本明細書で使用されるように、成熟凝固FXは、凝固FXaポリペプチドを含む。

【0020】

本発明のタンパク質は、好ましくは、配列番号1のGly-289とAsp-320との間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域における少なくとも1つのアミノ酸残基の少なくとも1つを、挿入および/または置換および/または欠失した、好ましくは挿入した、哺乳動物、好ましくは霊長類、より好ましくはヒトまたはヒト化された、凝固FXaポリペプチドを含む、または、凝固FXaポリペプチドである。

【0021】

本明細書で使用する「ヒト化」という用語は、タンパク質のヒトホモログに存在するアミノ酸残基の1種のタンパク質の好ましくは外部アミノ酸残基の置換またはヒト化を指し、その結果、第1の種のタンパク質は、ヒトに適用された場合、免疫原性でなく、または免疫原性が低くなる。外部残基の置換は、好ましくは、内部ドメインまたは軽鎖と重鎖との間のドメイン間接触にほとんど、または全く影響を及ぼさない。非ヒト起源、好ましくは哺乳動物起源、より好ましくは霊長類起源の本発明のタンパク質は、好ましくはヒトにおける前記タンパク質の免疫原性を低下させるためにヒト化される。

【0022】

本発明の非ヒトタンパク質は、好ましくは、人体への投与時の抗原応答のリスクが本発明の非ヒト化凝固FXaポリペプチドを含むタンパク質と比較して低いと予想される、ヒト化哺乳動物の、より好ましくはヒト化霊長類の、凝固FXaポリペプチドを含む。

【0023】

タンパク質のヒト化作業の中で、抗体に適用可能なヒト化のプロセスに注意を払うことができる。このプロセスには、Kabat et al. (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th ed., Bethesda, Md., National Institutes of Healthによるヒト抗体可変ドメインの利用可能な配列データ、該データのアップデート、その他のアクセス可能な米国および外国のデータベース（核酸およびタンパク質の両方）を利用する。ヒト化抗体を作製するために使用される方法の非限定的な例は、欧州特許第519596号明細書、米国特許第6,797,492号明細書、Padlan et al., 1991. Mol Immunol 28: 489-498に記載されている。非ヒトタンパク質のヒト化のプロセスをさらに例示すると、Sarkar et al., 2012, Journal of Lipids, Article ID 610937, p. 1-13に、ヒト配列を反映するように酵素の表面を改変することによって、パラオキソナーゼ -1がうまくヒト化されたことが記載されている。

【0024】

「凝固FXaポリペプチド」という用語は、凝固FXの触媒活性形態を指す。前記凝固FXaポリペプチドは、成熟凝固FXの重鎖からの活性化ペプチドの切断によって得られる。凝固FXaポリペプチドはプロトロンビンを活性化し、結果として凝固を促進する。本発明の文脈において、タンパク質は、それが凝血促進剤セリンプロテアーゼである場合、そして前記タンパク質の完全長アミノ酸配列、または1つのアミノ酸残基、または異なる種の凝固FX因子の間で保存されている単一のアミノ酸残基が図8に示されるような一続きである場合には、凝固FXaポリペプチドである。例えば、配列番号1のアミノ酸残基Cys-246からAla-250、Phe-260からLeu-266および/またはAsp-413からHis-423に対応するアミノ酸残基の鎖を含むポリペプチドを含む凝血促進性セリンプロテアーゼは、凝固FXaポリペプチドであると推定される。前記凝固FXaポリペプチドは、好ましくは、本発明の組換えタンパク質の局部適用および/または局所適用によって得られる。タンパク質がセリンプロテアーゼであるかどうかを決定する方法は、当技術分野で公知であり、例えばSigma-Aldrichのプロテアーゼ検出キットの配列比較および使用を含む。

【0025】

本明細書で使用される「哺乳動物凝固FXaポリペプチド」という用語は、哺乳動物、好ましくは霊長類、より好ましくはヒトに、内在的に存在する凝固FXaポリペプチドを指す。

【0026】

本明細書で使用される用語「凝固阻害剤」は、抗凝固剤を指す。用語「凝固阻害剤」は、（i）抗トロンビンの活性を刺激するヘパリンのような薬剤、（ii）ワルファリン、アセノクマロールおよびフェンプロクモンのようなクマリンベースの経口抗凝固剤ビタミンK拮抗剤、および（iii）DFXIを含むが、それらに限定されるものではない。

【0027】

本明細書で使用する「DFXI」という用語は、直接FXa阻害剤、たとえば、経口直接FXa阻害剤を意味する。DFXIは、凝固FXaに結合してその活性を停止させる小さな化合物阻害剤である。DFXIのグループには、これらに限定されるものではないが、リバーロキサバン（5-クロロ-N-[[(5S)-2-オキソ-3-[4-(3-オキソ-4-モルホリニル)フェニル]-5-オキサゾリジニル]メチル]-2-チオフェンカルボキサミド）、アピキサバン（1-(4-メトキシフェニル)-7-オキソ-6-[4-(2-オキソピペリジン-1-イル)フェニル]-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン-3-カルボキサミド）、エドキサバン（N'-(5-クロロピリジン-2-イル)-N-[(1S,2R,4S)-4-(ジメチルカルバモイル)-2-[(5-メチル-6,7-ジヒドロ-4H-[1,3]チアゾロ[5,4-c]ピリジン-2-カルボニル)アミノ]シクロヘキシル]オキサミド;4-メチルベンゼンスルホン酸）、ベトリキサバン（N-(5-クロロピリジン-2-イル)-2-[[4-(N,N-ジメチルカルバミルイミドイル)ベンゾイル]アミノ]-5-メトキシベンズアミド）、ダレキサバン（N-[2-[[4-(ヘキサヒドロ-4-メチル-1H-1,4-ジアゼピン-1-イル)ベンゾイル]アミノ]-3-ヒドロキシフェニル]-4-メトキシベンズアミド）、オタミキサバン（メチル(2R,3R)-2-[(3-カルバムイミドイルフェニル)メチル]-3-[[4-(1-オキシドピリジン-1-イウム-4-イル)ベンゾイル]アミノ]ブタノアート）、エリバキババン（2R,4R)-1-(4-クロロフェニル)-2-N-[2-フルオロ-4-(2-オキソピリジン-1-イル)フェニル]-4-メトキシピロリジン-1,2-ジカルボキサミド） 、レタキサバン（1-[1-[(2S)-3-(6-クロロナフタレン-2-イル)スルホニル-2-ヒドロキシプロパノイル]ピペリジン-4-イル]-1,3-ジアジナン-2-オン、LY517717（N-[2-[4-(1-メチルピペリジン-4-イル)ピペラジン-1-イル]-2-オキソ-1-フェニルエチル]-1H-インドール-6-カルボキサミド）および813893（N-シクロヘキシル-N-[2-[(4-メチル-1,3-チアゾール-2-イル)アミノ]-2-オキソエチル]フラン-2-カルボキサミド）が含まれる。「DOAC」（直接経口抗凝固剤）および「DFXI」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。

【0028】

本明細書で使用される「相同な」という用語は、2つのアミノ酸配列の全長のパーセンテージとして表される、2つのアミノ酸配列間のアミノ酸配列同一性を指す。配列同一性は、アミノ酸配列の個々のアミノ酸残基の同一性を別のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸残基と比較することによって決定される。
本明細書で使用される場合、用語「領域」は、2つのアミノ酸残基によって境界が定められているアミノ酸残基による1区間を指す。本明細書において適用されるアミノ酸残基の番号付けは、配列番号1のアミノ酸配列に基づく。

【0029】

用語「挿入」または「挿入された」は、本明細書中で使用される場合、天然の凝固FXaポリペプチドの特定の領域におけるアミノ酸残基の付加を指し、これにより、天然の凝固因子FXaポリペプチドの当該領域のアミノ酸残基の数と比較して、当該領域のアミノ酸残基の数が増加している。

【0030】

本明細書で使用する「置換」または「置換」という用語は、凝固因子Xaポリペプチドの特定の領域または特定の部位における1つまたは複数のアミノ酸残基の置換を指し、置換によりアミノ酸配列は変更されるが、該領域内のアミノ酸残基の数は変更されない。置換は、アミノ酸残基の欠失の後に、同じ位置に異なるアミノ酸残基が挿入された結果によるものである。

【0031】

本明細書で使用される「欠失」または「欠失」という用語は、凝固因子Xaポリペプチドの特定の領域または特定の部位における1つ以上のアミノ酸残基を欠失させることを指し、それにより前記ポリペプチドの前記領域中のアミノ酸残基の数は減少している。

【0032】

本明細書で使用される「天然凝固FXaポリペプチド」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくは霊長類、さらにより好ましくはヒトにおいて自然に生じる内因性凝固FXaポリペプチドを指す。

【0033】

用語「アミノ酸組成物」は、本明細書中で使用される場合には、アミノ酸配列及び一続きの長さのアミノ酸残基を有するものであり、その長さは、一続きの長さに含まれるアミノ酸残基の数によって決定される。
1つまたは複数のアミノ酸残基の挿入、置換および/または欠失、好ましくは挿入は、当業者に周知の組換えDNA技術を用いて行うことができる。たとえば、当業者は、合成DNA、PCR技術および分子クローニングを使用して、本発明のタンパク質をコードするDNA配列を有する組換えDNA構築物を得ることができる。適切な方法および手段は、“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, CSHL Press, 2012に記載されている。

【0034】

「アミノ酸残基の間の領域に対応する」という語句は、たとえば配列番号1のHis-311とAsp-320との間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域に関しては、配列番号1のHis-311およびAsp-320に対応する別の凝固FXaの保存されたHisおよびAsp残基の残基番号が、配列番号1における前記HisおよびAsp残基に起因する残基番号とは異なることがあるものとして用いられる（前記図8参照）。アミノ酸残基数の違いは、例えば、アミノ酸残基の番号付けの異なる方法の結果であり得る。また、アミノ酸残基数の違いは、図8に示すヒト凝固FXaポリペプチドの長さと比較した凝固FXaポリペプチドの長さの違いの結果であり得る。同様に、配列番号1のアミノ酸残基Gly-289、Glu-297、Val-305およびTyr-319は、異なる種の凝固FXaポリペプチド間で保存されている（図1および8参照）。それゆえ、別の凝固FXaポリペプチド中の前記アミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を同定することができる。したがって、当業者は、本明細書で適用されるアミノ酸残基番号付けは本発明を限定するものではなく、明瞭化のためにのみ適用されることを理解するであろう。

【0035】

当業者は、本明細書に記載の領域に隣接する配列番号1の前記保存されたアミノ酸残基の間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域を同定する方法を知るであろう。配列番号1の289から322のアミノ酸残基が、異なる種の凝固FXaポリペプチド中の対応するアミノ酸残基と整列している場合、配列番号1の289位、297位、305位、311位、313位、314位、318位、319位、320位および322位のアミノ酸残基は保存されており、同一ではないが、異なる種の凝固FXaポリペプチドにおいて、特に哺乳動物においては、配列番号1のAsp-322が高度に保存された触媒残基となっている（キモトリプシノーゲンナンバリングにおけるAsp-102; Bodeら, 1989. EMBO Journal 8:3467-3475ページ; Messierら, 1996. Blood Coagulation and Fibrinolysis 7:5-14ページ、図1および8）。

【0036】

非ヒト凝固FXa中の配列番号1のGly-289およびAsp-320の中およびその付近、または対応するGlyおよびAsp残基の中およびその周辺のアミノ酸残基の高度に保存された性質のために、当業者は、配列番号1のGly-289とAsp-320との間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域を同定することができる。同じ一般原則が、本明細書に記載の領域に隣接する他のアミノ酸残基に適用される。言うなれば、特定のアミノ酸残基の保存された性質は、当業者に、どのアミノ酸残基が領域を構成するかに関する明白な指針を与えるであろう。

【0037】

当業者は、本発明が、配列番号1のGly-289とAsp-320との間、最も好ましくはHis-311とAsp-320との間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域のアミノ酸組成に関するものと理解するであろう。したがって、当業者は、本発明のタンパク質の残りのアミノ酸配列が、前記タンパク質がDFXIに対する感受性が低下した凝固促進剤FXaポリペプチドに残っているかまたは活性化されているという条件の下で、変化し得ることを理解するであろう。従って、本発明のタンパク質の残りの部分は、例えばそれが凝固FXまたは凝固FXa、異なる種のポリペプチドの間で変化するにつれて、変化し得る。

【0038】

配列番号1のGly-289とAsp-320の間、好ましくはHis-311とAsp-320の間の領域に対応する領域のアミノ酸残基の数は、異なる種の、特に哺乳類の群に属する種または霊長類の群の間の凝固FXタンパク質の間で保存されている。この領域は、チモーゲンFXタンパク質およびFXaポリペプチドにも存在する。 したがって、アミノ酸残基の数は、チモーゲンFXタンパク質およびFXaポリペプチド、ならびにチモーゲンFXタンパク質およびFXaポリペプチドの対応する領域においても保存されている。配列番号1のGly-289とAsp-320との間の領域に対応するアミノ酸残基の領域中の前記保存されたアミノ酸残基の数は、Gly-289およびAsp-320は含まず、30である。配列番号1のHis-311とAsp-320との間の領域に対応するアミノ酸残基の領域中の前記保存されたアミノ酸残基の数は、His-311およびAsp-320を含まず、8である。

【0039】

挿入および/または置換および/または欠失、好ましくは、本発明のタンパク質において、Gly-289とAsp-320との間のアミノ酸残基の領域、好ましくは配列番号1のHis-311とAsp-320との間の領域に対応するアミノ酸残基の領域における少なくとも1つのアミノ酸残基の挿入により、DFXIによる阻害に対する感受性が低下した、触媒的に活性な凝固FXaを生じることが見出された。

【0040】

ヒトFXaのTyr-319は、DFXI配位残基であることが実証されているが（Roehrigら, 2005. J Med Chem 48: 5900-5908; Pintoら, 2007. J Med Chem 50: 5339-5356）、一方で、配列番号1のAsp-322は触媒セリンプロテアーゼ部位に存在するとされる（Messierら, 1996. Blood Coagulation and Fibrinolysis 7: 5-14）。理論に拘泥するものではないが、Gly-289とAsp-320の間の領域において、配列番号1のDFXI配位残基Tyr-319または対応するチロシンおよび/または触媒ドメインに近接する、たとえば少なくとも1つのアミノ酸残基の挿入のような、改変されたアミノ酸残基は、DFXIの感度低下の原因となる。本発明のタンパク質において、配列番号1のGly-289とAsp-320との間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域は、アミノ酸残基番号およびアミノ酸配列において変更することができ、それにより、DFXIの感度が低下した触媒活性凝固FXaを生成することが見出された。

【0041】

該変化は、挿入、置換および/または欠失から選択され、好ましくは挿入であり、より好ましくは配列番号1のGly-289とAsp-320との間の領域に少なくとも1つのアミノ酸が変化した挿入である。

【0042】

挿入が1から50個、好ましくは1から20個のアミノ酸残基である本発明のタンパク質が特に好ましい。本発明のタンパク質における配列番号1のGly-289とAsp-320との間、好ましくはHis-311とAsp-320との間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域における挿入は、1から50個、好ましくは1から20個のアミノ酸残基を、含み、または、からなる。前記挿入は、好ましくは、His-311およびAsp-320の間に少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個のアミノ酸残基を含み、または、からなり、合計で9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20、21、22、23、24、25、26、27または28個となる。特に好ましいのは、9アミノ酸残基、12アミノ酸残基または13アミノ酸残基の挿入など、少なくとも5アミノ酸残基の挿入である。当業者は、アミノ酸残基が、配列番号1のGly-289とAsp-320との間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域の任意の位置に挿入され得ることを理解するであろう。挿入に適したアミノ酸残基は、表1に列挙される20個のアミノ酸残基の群から選択される。当業者は、前記挿入されたアミノ酸残基がインビボまたはインビトロで翻訳後化学変化を受け得ることを理解するであろう。上記に示したように、当業者は、配列番号1のGly-289とAsp-320との間の領域に対応するアミノ酸残基の領域に1から50個のアミノ酸残基の挿入を有する本発明のタンパク質をコードするDNA配列を有する組換えDNA構築物を得るよう、合成DNA、PCR技術および分子クローニングを使用することができる。

【0043】

本発明のタンパク質における配列番号1のGly-289とAsp-320との間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域への挿入は、好ましくは、配列番号1のThr-315とLys-316の間、Lys-316とGlu-317の間、Glu-317とThr-318の間、および/またはThr-318とTyr-319の間、または非ヒト凝固FXaポリペプチド中のこれらのアミノ酸残基に対応する2つのアミノ酸残基の間となる。

【0044】

置換が1から30個、好ましくは1から8個、より好ましくは6または7個のアミノ酸残基である本発明のタンパク質が特に好ましい。本発明のタンパク質中の配列番号1のGly-289とAsp-320との間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域におけるアミノ酸残基の置換は、好ましくは、1から30個のアミノ 配列番号1のGly-289とAsp-320との間のアミノ酸残基の領域に対応する領域の酸残基である。前記置換は、好ましくは、1、2、3、4、5、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30個のアミノ酸残基を含むか、またはそれからなる。 配列番号1に示されるような保存されたアミノ酸残基、例えばGlu-297、Val-305および/またはHis-311は置換されないことが好ましい。特に好ましいのは、6または7アミノ酸残基の置換である。

【0045】

本発明のタンパク質の配列番号1のGly-289とAsp-320との間のアミノ酸残基の領域に対応する領域に存在するアミノ酸残基は、表1に記載のアミノ酸残基のいずれか1つで置換されていることが好ましく、表1の「側鎖極性」および「側鎖電荷」の欄に示されているのと同じ群のアミノ酸によって置換されていることが好ましい。好ましくは、配列番号1のAsn-312、Arg-313、Phe-314、Thr-315、Lys-316、Glu-317、Thr-318およびTyr-319の1つ以上、または本発明の非ヒトタンパク質中のそれらの対応するアミノ酸残基が、表1に示されるアミノ酸残基のいずれか1つによって置換される。配列番号1のAsn-312は、好ましくは、ThrまたはLys残基によって置換される。Arg-313は、好ましくは、塩基性極性および正に荷電した側鎖（表1参照）、より好ましくはLys残基を有するアミノ酸残基によって置換される。アミノ酸残基Thr-315は、好ましくは、中性側鎖を有する極性アミノ酸残基、または中性側鎖を有する非極性アミノ酸残基、より好ましくはVal残基によって置換される。配列番号1のLys-316は、好ましくはPro残基で置換される。配列番号1のGlu-317は、好ましくはVal残基で置換される。Thr-318は、好ましくは、中性側鎖を有する極性アミノ酸残基によって、または中性側鎖を有する非極性アミノ酸残基によって、より好ましくはSerまたはAla残基によって置換される。

【0046】

本発明のタンパク質における配列番号1のGly-289とAsp-320との間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域におけるアミノ酸残基の置換は、好ましくは、少なくとも2個のアミノ酸残基を含む、または、少なくとも2個のアミノ酸残基からなる。
少なくとも2つのアミノ酸残基の任意の組み合わせ、たとえば、配列番号1のAsn-312および配列番号1のLys-316それぞれの、Pro残基およびAla残基による置換、または、配列番号1のAsn-312、Arg-313、Thr-315、Lys-316、Glu-317、Thr-318およびTyr-319の、表1に列挙されるアミノ酸残基のいずれか1つによる置換が本発明において想定される。
特に好ましいのは、配列番号1の（i）Asn-312、（ii）Arg-313、（iii）Thr-315、（iv）Lys-316、（v）Glu-317および（vi）Thr-318を、（i）ThrまたはPro残基、（ii）Lys残基、（iii）Val残基、（iv）Pro残基、（v）Val残基および（vi）Ser残基またはAla残基でそれぞれ置換した本発明のタンパク質である。

【0047】

当業者は、本発明の非ヒトタンパク質の配列番号1のGly-289とAsp-320との間の領域に対応するアミノ酸残基の領域においてアミノ酸残基が置換されている場合、 本発明の好ましいタンパク質にはまだ存在しないことを理解するであろう。当業者であれば、上記の配列番号1の言及は、アミノ酸残基の特定の領域におけるアミノ酸残基の置換を例示する場合にのみなされることが分かるであろう。したがって、当業者は、他のアミノ酸残基または残基について、ヒト以外の凝固FXaにおいて1つまたは複数のアミノ酸残基を置換し得る徴候を有するであろう。

【0048】

本発明のタンパク質は、配列番号1のGly-289とAsp-320との間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域に、少なくとも1つのアミノ酸残基の欠失をさらに含み得る。特に好ましいのは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20または30アミノ酸残基の欠失を有する本発明のタンパク質である。

【0049】

本発明の好ましいタンパク質は、挿入および置換の組み合わせ、または挿入、置換および／または欠失の組み合わせを含む。挿入および欠失は、互いに独立して起こり得るので、たとえば、配列番号1のGly-289とAsp-320との間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域において、異なるアミノ酸位置に5アミノ酸残基の挿入および5アミノ酸の欠失が存在するが、凝固FX中のアミノ酸残基の総数に影響を及ぼすことはない。当業者は、挿入または欠失がタンパク質中のアミノ酸残基の番号付けを変化させることを理解するであろう。どこに変更があり、何が変更を構成しているのかについての簡便な評価に関して、当業者は、図8に示すように、異なる凝固FXタンパク質のアミノ酸配列の多重アライメントを行うことができる。当業者は、このようなアライメントからアミノ酸残基が変化することを推論することができる。当業者は、改変が行われたアミノ酸残基番号を評価するためのマーカーとして、保存されたアミノ酸残基、例えばGlu-297、Val-305および/またはHis-311を使用することができる。

【0050】

特に好ましいのは、挿入が1-50個、好ましくは1-20個のアミノ酸残基であり、置換は1-7個、好ましくは6個のアミノ酸残基である本発明のタンパク質である。前記好ましいタンパク質は、1-50個、好ましくは1-20個のアミノ酸残基の挿入を有し、配列番号1のGly-289とAsp-320との間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域における1-8個、好ましくは6または7個のアミノ酸残基の置換と組み合わされる。

【0051】

本発明のより好ましいタンパク質は、配列番号1のGly-289とAsp-320との間のアミノ酸残基の領域に対応した、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19の挿入 または20アミノ酸残基の置換、およびアミノ酸残基の領域における少なくとも1、2、3、4、5、6または7アミノ酸残基の置換を有する。少なくとも1から20個のアミノ酸残基の挿入が、少なくとも1、2、3、4、5、6または7個のアミノ酸残基の置換と組み合わされることを意味する。本発明は、前述の挿入および置換の可能な全ての組み合わせを対象とする。特に好ましいのは、配列番号1のGly-289とAsp-320との間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の領域に12から13アミノ酸残基の挿入および6アミノ酸残基の置換を有するタンパク質である。

【0052】

本発明のタンパク質は、最も好ましくは、配列番号4、配列番号5、配列番号9、配列番号10または配列番号11のアミノ酸配列を有する、配列番号1のアミノ酸残基His-311およびAsp-320に対応するアミノ酸残基の間にあるアミノ酸残基の領域を含む。

【0053】

さらに、配列番号1のArg-366、Gly-369、Phe-396、Asp-413、Ala-414、Cys-415、Gln-416、Ser-419、Val-437、Ser-438、Trp-439、Gly-440、Glu-441、Gly-442、Cys-443、Gly-450、Ile-451およびTyr-452の改変は、DFXIに対して脱感作されたタンパク質を生じる可能性がある。理論に縛られることなく、配列番号1のArg-366、Gly-369、Phe-396、Asp-413、Ala-414、Cys-415、Gln-416、Ser-419、Val-437、Ser-438、Trp-439、Gly-440、Glu-441、Gly-442、Cys-443、Gly-450、Ile-451およびTyr-452はDFXI配位残基である可能性が高い。文献はこの見解を間接的に支持しており、これらの残基の少なくともいくつかがDFXIの結合に関与することが示されている（Roehrig et al., 2005. J Med Chem 48: 5900-5908; Pinto et al., 2007. J Med Chem 50: 5339-5356） 。本発明のタンパク質は、Arg-366、Gly-369、Phe-396、Asp-413、Ala-414、Cys-415、Gln-416、Ser-419、Val-437、Ser-438、Trp-439、Gly-440、Glu-441、Gly-442、Cys-443、Gly-450、Ile-451およびTyr-452に相当するアミノ酸残基を置換または欠失していることが好ましい。配列番号1の配列番号1のアミノ酸残基Arg-366、Gly-369、Phe-396、Asp-413、Ala-414、Cys-415、Gln-416、Ser-419、Val-437、Ser-438、Trp-439、Gly-440、Glu-441、Gly-442、Cys-443、Gly-450、Ile-451および/またはTyr-452、または関連タンパク質中の対応するアミノ酸残基は、好ましくは、表1に列挙されるアミノ酸残基のいずれか1つによって置換される。また、好ましくは、本発明のタンパク質は、Arg-366、Glu-369、Phe-396、Asp-413、Ala-413、Ala-414、Cys-415、Gln-416、Ser-419、Val-437、Ser-438、Trp-439、Gly-440、Glu-441、Gly-442、Cys-443、Gly-450、Ile-451および/またはTyr-452由来のC末端の15アミノ酸残基N末端および15アミノ酸残基に位置するアミノ酸残基の間の領域に対応するアミノ酸残基の領域に少なくとも1つのアミノ酸残基、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20アミノ酸残基の挿入を有する。前記改変は、配列番号1のPhe-396、Arg-366、Glu-369、Asp-413、Ala-414、Cys-415、Gln-416、Ser-419、Val-437、Ser-438、Trp-439、Gly-440、Glu-441、Gly-442、Cys-443、Gly-450、Ile-451および/またはTyr-452。この段落に示されるような領域における前記挿入は、好ましくは、上で定義された配列番号1のGly-289とAsp-320との間の領域における変化と組み合わされる。

【0054】

本発明は、本発明のタンパク質と実質的に相同で生物学的に同等なタンパク質も包含する。
本発明のタンパク質は好ましくは、配列番号1またはその活性化形態に対して、60％を超える、好ましくは70％を超える、より好ましくは80％を超える、そして最も好ましくは90％を超える相同性を有するアミノ酸配列を有し、前記タンパク質は触媒的に活性（凝固促進剤）、または処理/活性化後に触媒的に活性であり、そしてDFXI、好ましくは、リバーロキサバン、アピキサバン、エドキサバンおよびベトリキサバンからなる群から選択されるDFXIに対する感受性が低下している。当業者は、凝固FXのプレプロタンパク質またはプロタンパク質がその触媒的に活性な形態にどのように処理されるかを知っている。UniProtデータベースのアクセッション番号P00742に、ヒト凝固FXの活性化ヒト凝固FXaへのプロセッシングの概要が示される。したがって、当業者は、どのアミノ酸残基が凝固FXaに存在するか存在しないかを決定することができるであろう。

【0055】

本発明の文脈において使用される用語「DFXIに対する感受性の減少」は、最大阻害の50％（Ki）を得るために必要とされるDFXIの濃度に帰し、天然の凝固FXaの値よりも本発明のポリペプチドの方が高く、ここで前記天然の凝固FXaは、好ましくは、血漿に由来するかまたは組換え生産される。DFXIのKiは、好ましくは、本発明のタンパク質を0.001から100μMのDFXIとプレインキュベートし、続いて、ペプチジル基質変換によるスペクトロザイムXaに対する触媒活性をアッセイする実験を行うことによって測定することで、決定される。本発明のタンパク質のKiは、該ネイティブ凝固FXaのKiと比較して、配列番号1のGly-298とAsp-320との間のアミノ酸残基の領域に対応するアミノ酸残基の少なくとも1つのアミノ酸残基の改変を伴わずに、好ましくは2倍以上、より好ましくは50倍から100倍、最も好ましくは100倍以上増加する。

【0056】

本発明のタンパク質は、凝固FVaに対する天然凝固FXaの結合親和性と比較して、プロトロンビナーゼ複合体中の凝固FXaの結合パートナーである凝固FVaに対する結合親和性が増大することが予想外に見出された。FVaに対する本発明のヒトまたはヒト化タンパク質の結合親和性は、FVaに対する天然ヒトFXaの結合親和性よりも少なくとも2倍高い。

【0057】

結合親和性を決定するためのアッセイは、例えば、結合パートナー（例えば、FVaまたはFXa）を放射性標識と用いることによって、当該分野で公知である。結合時に放出される放射線の量は、結合親和性を計算するために使用することができる。また、表面プラズモン共鳴および二重偏光干渉法などの非放射性方法を使用して、濃度ベースのアッセイからの結合親和性を定量化することができるが、会合および解離の動態および後者では結合の際に誘導される構造変化がある。近年、マイクロスケール熱泳動（MST）、固定化フリー方法が開発され、2つのタンパク質間の結合親和性の決定が可能になった（Wienken et al., 2010. Nature Communications 1: 100）。好ましくは、凝固FVa-FXa複合体の結合親和性は、プロトロンビンまたはプロトロンビン誘導体（プレトロンビン-1、プレトロンビン-2）変換の動態（Bos et al, 2009. Blood 114: 686-692）、蛍光強度/異方性測定（Bos et al, 2012. J Biol Chem 287: 26342-51）、または、等温滴定熱量測定（ITC）によって測定することができる。

【0058】

本発明はさらに、本発明のタンパク質をコードするDNA配列を含む核酸分子を提供する。当業者であれば、本発明のタンパク質のアミノ酸配列をコードするDNA配列をどのように生成するか、および、一般的に知られている組換えDNA技術を用いて前記DNA配列を有する核酸分子を製造および単離する方法は、理解するであろう。核酸分子の配列は、好ましくは、本発明の宿主細胞における発現のためにコドン最適化されている。このようにして、特定の宿主細胞における高発現に好ましいコドンが使用される。

【0059】

本発明はまた、本発明の核酸分子を含む発現ベクターを提供する。

【0060】

核酸分子は、好ましくは、当業者に公知の組換えDNA技術を用いて発現ベクターに挿入される。本発明と関係する発現ベクターは、宿主細胞中で本発明のタンパク質の発現を指示する。これらの発現ベクターは、エピソームとして、または染色体DNAの一部として、宿主細胞において複製可能であることが好ましい。さらに、発現ベクターは、好ましくは、（i）CMVまたはSV40プロモーターなどの強力なプロモーター/エンハンサー、（ii）リボソーム結合部位および開始コドンなどの最適な翻訳開始配列、好ましくはKOZAKコンセンサス配列、および（iii）転写終結配列、タンパク質が真核細胞中で発現される場合、ポリ（A）シグナルを含む。適切な発現ベクターには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルスなどのプラスミドおよびウイルスベクターが含まれる。当業者は、使用される発現ベクターが、組換えタンパク質の発現に使用される宿主細胞に依存することを理解するであろう。本発明の発現ベクターは、好ましくは細菌細胞を含む原核細胞、より好ましくは酵母細胞および哺乳動物細胞のような真核生物宿主細胞における本発明の核酸分子の発現に適している。哺乳動物発現ベクターpCMV4が特に好ましい。

【0061】

あるいは、本発明の核酸分子は、宿主細胞のゲノムに挿入することができる。前記挿入は、好ましくは、宿主細胞における本発明の核酸分子の発現を確実にする遺伝子座または領域内にある。

【0062】

本発明はさらに、本発明の核酸分子を含む宿主細胞を提供する。本発明は、好ましくは、本発明の核酸分子を発現し、それによって本発明のタンパク質を産生する宿主細胞を提供する。前記タンパク質は、宿主細胞内で産生されるか、または好ましくは宿主細胞から分泌される。

【0063】

本発明での使用に適した宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞、哺乳類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ヒツジ細胞、サル細胞およびヒト細胞のような原核細胞および真核細胞を含む。適切な真核生物宿主細胞の例は、限定されるものではないが、HEK293細胞、ハムスター細胞株CHOおよびBHK-21;ネズミ宿主細胞NIH3T3、NSOおよびC127;サルの宿主細胞COSおよびVero;ヒト宿主細胞HeLa、PER.C6、U-937およびHep G2が含まれる。適切な細胞は、ATCCのような公的供給源やLife Technologiesから入手可能である。多くのトランスフェクション技術が当該分野で公知であり、たとえば、Graham et al., 1973. Virology 52: 456; Green et al., 2012. “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, CSHL Press; Davis et al., “Basic Methods in Molecular Biology”, 1986, Elsevier; and Chu et al., 1981. Gene 13: 197を参照されたい。当業者は、好ましくは、これらの参考文献に記載の技術を用いて、1つ以上の外因性核酸分子を適切な宿主細胞に導入する。

【0064】

本発明のタンパク質の産生のための特に好ましい宿主細胞は、HEK293細胞である。

【0065】

本発明はさらに、本発明のタンパク質、またはその薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。 本発明の医薬組成物は、好ましくは、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤、および当該分野で公知の他の材料の1つ以上を含む。 担体の特性は、当業者に知られているように、投与経路に依存する。 セリンプロテアーゼFXaを投与する潜在的な血栓症リスクを低減するために、本発明の医薬組成物は、好ましくは、被験体に投与した後に活性化される本発明のタンパク質を含む。

【0066】

「対象」という用語は、哺乳動物、好ましくはヒトの群を意味する。

【0067】

「医薬組成物」との用語は、本発明の文脈において、組成物をin vivoまたはex vivoでの治療用途に適したものにする、本発明のタンパク質と、不活性または活性の担体との組み合わせを意味する。

【0068】

本明細書で使用する「薬学的に許容される」との用語は、本発明のタンパク質の物理的および化学的特徴と適合性を有し、前記タンパク質の生物学的活性の有効性を妨害しない非毒性物質であることを指す。

【0069】

本発明の医薬組成物は、消化管、例えば経口摂取または直腸投与によって吸収される、組成物の経腸投与に適合させることができる。前記組成物は、好ましくは、タンパク質分解を防ぐよう、たとえばリポソームによってカプセル化される。

【0070】

本発明の医薬組成物は、好ましくは局所的に、たとえば創傷部またはその中に、または、創傷領域に血液を供給する血管、好ましくは、動脈に適用される。該局所投与は、例えばクリーム、泡、ゲル、ローションまたは軟膏の形態の局所投与、または、たとえば注射または注入による非経口投与であり、局所または全身の治療効果を生じる。局所効果に対する本発明のタンパク質の局所投与は、潜在的な全身性血栓症の危険性を低減する。

【0071】

本発明の医薬組成物、好ましくは、凝固FXまたは変化した凝固因子Xaポリペプチドを含む成熟凝固FXを含むものは、好ましくは非経口投与によって全身投与される。不活性プロトプロビンまたは不活性プロタンパク質の全身投与は、不活性プロトロンビンを活性セリンプロテアーゼトロンビンに変換する、負に荷電したリン脂質膜上のFVaに関連する凝固FXaからなる活性プロトロンビナーゼ複合体の形成をもたらす。

【0072】

本発明の医薬組成物は、好ましくは、組成物が静脈内、動脈内、皮下、および／または、筋肉内に導入される非経口投与に適合される。非経口投与は、本発明の医薬組成物の、体組織または体液への注射または点滴を含み、好ましくは、注射器、針またはカテーテルが使用される。代わりに、針なしの高圧投与を非経口投与のための手段として使用することができる。

【0073】

注射用組成物（例えば、静脈内用組成物）の場合、担体は、水性または油性溶液、分散液、乳濁液、および／または、懸濁液であってもよい。好ましくは、担体は、水溶液、好ましくは、蒸留滅菌水、生理食塩水、緩衝食塩水、または、注射用の他の薬学的に許容される賦形剤である。

【0074】

本発明の医薬組成物は、好ましくは、様々な治療用途に使用される。たとえば、医薬組成物は、血友病AおよびB、血友病AおよびB阻害剤患者群、または第X因子欠乏症のような、正常な血液凝固が損なわれている障害の治療または改善においてバイパス剤として使用することができる。

【0075】

本発明はさらに、被験体における凝固阻害剤の抗凝固剤効果を完全にまたは部分的に逆転させる方法における使用のための、本発明によるタンパク質または本発明による医薬組成物を提供する。

【0076】

「抗凝固剤効果」という用語は、凝固阻害剤の作用の結果である血液凝固の予防などの治療効果を指す。

【0077】

本発明はさらに、被験体における凝固阻害剤の抗凝固作用を完全にまたは部分的に逆転させるための医薬の製造のための本発明のタンパク質の使用を提供する。

【0078】

凝固阻害剤は、好ましくは、直接FXa阻害剤（DFXI）であり、より好ましくは、リバーロキサバン（5-クロロ-N-[[(5S)-2-オキソ-3-[4-(3-オキソ-4-モルホリニル)フェニル]-5-オキサゾリジニル]メチル]-2-チオフェンカルボキサミド）、アピキサバン（1-(4-メトキシフェニル)-7-オキソ-6-[4-(2-オキソピペリジン-1-イル)フェニル]-4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン-3-カルボキサミド）、エドキサバン（N'-(5-クロロピリジン-2-イル)-N-[(1S,2R,4S)-4-(ジメチルカルバモイル)-2-[(5-メチル-6,7-ジヒドロ-4H-[1,3]チアゾロ[5,4-c]ピリジン-2-カルボニル)アミノ]シクロヘキシル]オキサミド;4-メチルベンゼンスルホン酸および/またはおよび／またはベトリキサバン（N-(5-クロロピリジン-2-イル)-2-[[4-(N,N-ジメチルカルバムイミドイル)ベンゾイル]アミノ]-5-メトキシベンズアミド）である。

【0079】

本発明はさらに、被験体における凝固阻害剤の抗凝固剤効果を完全にまたは部分的に回復させる方法を提供し、該方法は治療有効量の本発明のタンパク質または本発明の医薬組成物を該被験体に投与することを含む。好ましくは、本発明の方法は、抗凝固療法に関連する出血合併症を予防または改善するために適用される。

【0080】

本明細書で使用される用語「治療有効量」は、投与される医薬組成物に含まれる活性成分の量が、意図される目的を達成するのに十分な量であり、この場合、凝固阻害剤の抗凝固作用を完全にまたは部分的に逆転させることができる。本発明の医薬組成物中の活性成分、すなわち本発明のタンパク質の量は、好ましくは約50mg～約600mgの範囲である。本発明の医薬組成物は、好ましくは、凝固阻害剤の抗凝固剤効果の完全または部分的逆転を必要とする被験体に、1回、2回または3回、好ましくは1回のみ投与される。

【0081】

明確化および簡潔な説明のために、特徴は、同じまたは別個の実施形態の一部として本明細書に記載されるが、本発明の範囲は、記載される特徴のすべてまたは一部の組み合わせを有する実施形態を含み得る。

【0082】

配列番号1（ヒト凝固因子Xタンパク質）

【0083】

配列番号2（ヒト凝固因子Xaの軽鎖）

【0084】

配列番号3（ヒト凝固因子Xaの重鎖）

【0085】

配列番号4

【0086】

配列番号5

【0087】

配列番号6（ヒト凝固FX遺伝子; 1-1473bp）

【0088】

配列番号7（改変ヒトFXタイプAのDNA配列; 1-1509bp）

【0089】

配列番号8（改変ヒトFXタイプBのDNA配列; 1-1512bp）

【0090】

配列番号9

【0091】

配列番号10

【0092】

配列番号11

【図面の簡単な説明】

【0093】

【図1】血液凝固FXaの構造。A：凝固FXaのγ-カルボキシグルタミン（'GLA'）、EGF-1および-2（'EGF'）およびセリンプロテアーゼドメイン（'SP'）の模式的構造。B：ヒトFXaセリンプロテアーゼの結晶構造（pdb 2W26）。触媒三残基のHis-276，Asp-322，Ser-419、リバーロキサバン/アピキサバン接触残基のTry-319およびPhe-396、残基316から317（球内）、および残基Gly-289、Glu-297、Val-305およびHis-311の位置を示す。C：種々の血漿FX種の領域311-322における、保存された残基（強調表示）、接触残基Tyr-319、および触媒残基Asp-322によるアライメント。＊は、配列番号1のGly-289とAsp-320との間の領域に対応する領域に挿入がある有毒な凝固FXを示す。

【図2】直接FXa阻害剤による発色性FXa活性の阻害。A：リバーロキサバン（“riva”、黒塗り記号）またはアピキサバン（“api”、白塗り記号）を（1nM－10μM）で濃度上昇させてインキュベートした組換えヒト凝固FXa（hFXa、2nM、円）または毒液P.テクスチリス凝固FXa（vptFXa、10nM、三角）によるペプチジル基質変換（SpecFXa、250μM）。基質転化率は、阻害剤の非存在下でのインキュベーションの％としてプロットされる。B、C：凝固FX欠損血漿中のトロンビン生成は、0.4μMリバーロキサバン（“riva”、黒線／黒色カラム）または2μMアピキサバン（“api”、点線／白カラム）の非存在下（灰色線／灰色カラム）または存在下で、0.5nM hFXa（パネルＢ）またはvptFXa（パネルＣ）にて行った。トロンビン形成を蛍光発生基質を用いて評価し、様々なインキュベーション時の最大トロンビン濃度を挿入図に示す。

【図3】（Ａ）修飾ヒトFX-A（mod A、レーン2,6）または改変ヒトFX-B（mod B、レーン3,7）のいずれかを安定に発現するHEK293細胞株から得られた組換えFX（200ng）の、RVV-Xアクチベーターとのインキュベーション前（レーン1,2,3）またはインキュベーション後（レーン5,6,7）の蛍光ウエスタンブロット。内因性血漿由来のヒトFXaの重鎖は約29kDaで移動する（レーン9）。タンパク質マーカー（レーン4,8）の相対重量（kDa）が示される。（Ｂ）組換えヒトFX（黒色カラム）、改変ヒトFX-A（白色カラム）または改変ヒトFX-B（灰色カラム）のいずれかを安定的に発現するHEK293細胞株由来の馴化培地中の組換えFXをFX特異的ELISAを用いて定量した。それぞれの個々のバーは、FX変異体当たり最高の達成可能な発現を有する単一の安定した細胞株を表す。

【図4】高分子基質の活性化。50μM PCPS、20nM FV（FV810、組換えB-ドメイン短縮型FV）および修飾ヒト凝固FXaタイプA（m-hFXa A）、タイプB（m-hFXa B）、組換え（r-hFXa）または血漿由来（pd-hFXa）FXa 0.1nMの存在下におけるプロトロンビン変換（1.4μM）。基質変換率はnM/分/nMでプロットされており、データは2つの独立した実験の平均値±S.Dである。

【図5】DFXIによるFXaキメラタイプAの阻害。組換えヒト凝固FXa（r-hFXa、3nM）、血漿由来ヒト凝固FXa（pd-FXa、2nM）、および毒液P.テキスリス（vptFXa、1nM）FXaと比較した、RVV-X活性化修飾ヒト凝固FXaタイプA（m-hFXa A、1nM）のペプチジル基質変換（SpecFXa、250μM）。変換率は、0.001-100μMのリバーロキサバン（パネルＡ）またはアピキサバン（パネルＢ）の存在下で測定した。データは、r-hFXa（n=1）を除いて、2つの独立した実験の平均値を表す。

【図6】改変ヒトFX-Aおよび改変ヒトFX -BのDFXIによる阻害。RVV-X活性化組換えヒト凝固FXa（r-hFXa、6nM）と比較した、RVV-X活性化修飾ヒトFX-A（m-hFXaA、1nM）および改変ヒトFX-B（m-hFXaB、7nM）によるペプチジル基質変換（SpecFXa、250μM）。変換率は、0.001-100μMのリバロキサバン（パネルＡ）およびアピキサバン（パネルＢ）の存在下で測定した。データは、2つの独立した実験の平均である。

【図7】補因子Vaおよびリン脂質の存在下でのDFXIによる修飾ヒトFX-Aまたは修飾ヒトFX-Bの阻害。50μMのPCPSおよび30nMのFV（FV810、組換えB-ドメイン短縮型）の存在下における、RVV-X活性化組み換えヒト凝固FXa（r-hFXa、3nM）と比較した、RVV-X活性化修飾ヒトFX-A（m-hFXaA、2nM）および活性化修飾ヒトFX-B（m-hFXa B、4nM）によるペプチジル基質変換（SpecFXa、250μM）。変換率は、0.001-100μMのRivaroxaban（パネルA）またはApixaban（パネルB）の存在下で測定した。データは、2つの独立した実験の平均である。

【図8】異なる種の凝固FXタンパク質の複数のアライメント。ヒト凝固FX（Genbank登録番号：AAH46125.1）（HUM）のアミノ酸配列を、M. musculus凝固FX（Genbank登録番号：AAC36345.1）（MUS）、X. tropicalis凝固FX（Genbank登録番号: NP_001015728）（Xtr）、D.rerio凝固FX（Genbank登録番号：AAM88343.1）（Dre）、T. rubripes凝固FX（Genbank登録番号：NP_001027783.1）（Tru）、P.テクスチリス凝固FXアイソフォーム1（Uniprot KB登録番号：Q1L659）（Pte1）、P.テクスチリス凝固FXアイソフォーム2（Uniprot KB登録番号：Q1L658）（Pte2）、P.テクスチリス凝固FX（pseutarin C触媒サブユニット前駆体; Genbank登録番号：AAP86642.1）（Pte3）そしてN. scutatus凝固FX（UniProtKB登録番号：P82807.2）（Nsc）のアミノ酸配列と比較する。この図では、配列番号1のGly-289、Asp-320、Tyr-319、Glu-297、Val-305およびHis-311を太字で示し、下線を付している。この図は、異なる種の凝固FXタンパク質の間の配列番号1のGly-289とAsp-320との間の領域に対応するアミノ酸残基の領域に変動があることを示す。全ての種において保存されているアミノ酸残基はコンセンサス配列に示されている。

【図9】内因性hFXおよびキメラFX変異体のアミノ酸組成。キメラFX型A（c-FX A、中央; His 311とAsp 320との間の配列は配列番号9に対応する）、タイプB（c-FX B; His 311とAsp 320との間の配列は配列番号10に対応する）およびタイプC（c-FX C; His 311とAsp 320との間の配列は配列番号11に対応する）とのアラインメントにおける内在性ヒト（hFX）のセリンプロテアーゼドメイン残基ヒスチジン91およびチロシン99（キモトリプシンナンバリング;配列番号1に示すFXのそれぞれHis 311およびTyrosine 319に対応する）。

【図10】FXaの特性評価：A：4-12％Bis-Trisゲル上の5μgFXa変異体のクマシー染色。左から右に：血漿由来因子Xa（pd-FXa）、r-hFXa、キメラ因子XaタイプA、BおよびC（-A、-B、-C）。B：50μMPCPS（75％ホスファチジルコリン、25％ホスファチジルセリン）および20nM FV（FV810、組換えB-ドメイン短縮型FV）および0.1nMのpd-FXa、r-hFXa、c-FXa-A、c-FXa-Bおよびc-FXa-Cの存在下でのプロトロンビン変換（1.4μM）。データポイントは、2つの独立した実験の平均値である。

【図11】DOACによるFXa変異体の阻害。1nMのpd-FXa（三角）、r-hFXa（丸）、キメラFXa-A（四角）、-B（菱形）および-C（十字）による標準化プロトロンビン変換をアピキサバン（左の閉じた記号）またはエドキサバン（右の開いた記号）の0.001-100μMの存在下で評価した。アピキサバンの各阻害定数（Graphpad Prism 6ソフトウェアスイートで測定）、pd-FXaに対する場合：2nM、c-FXa-A：4nM、c-FXa-A：130nM、-B：760nM-C：1270nM、エドキサバンの各阻害定数、r-hFXaに対する場合：0.5nM、c-FXa-A：3nM、-B：140nM、-C：270nM。

【図12】FXa変異体のFXa開始トロンビン生成（TG）プロファイル。DOAC Apixaban（2μM）の非存在下（A）および存在下（B）における血漿TG。FX欠乏血漿中のpd-FXa、r-hFXa、c-FXa-A、c-FXa-Bおよびc-FXa-CによるTGの開始。曲線は、少なくとも3回の独立した実験の平均である。

【図13】r-hFXおよびc-FX-Cについての組織因子（TF）開始TGプロファイル。A：1単位のr-hFX、r-hFX + Apixaban、c-FXa-Cまたはc-FXa-C + アピキサバンによる2μM DOAC アピキサバン（Apixa）の非存在下および存在下での低TF（2pM）における血漿TG。正常ヒト血漿を基準としたプロトロンビン時間ベースの凝固アッセイによってr-hFX（7μg/ml）またはc-FXa-C（16μg/ml）の1単位を定義した。曲線は、少なくとも3回の独立した実験の平均を表す。B：高TG（20pM）での血漿TG。

【図14】r-hFXおよびc-FX-Cに対するTF開始TGプロファイル-C。（上側のグラフ）：1単位のr-hFX（7μg/ ml）によるDOACエドキサバンの非存在（点線）及び200nM（明るい灰色）、600nM（暗灰色）および2000nM（黒色）の存在下における低TF（2pM）における血漿TG。（下側のグラフ）：1単位のc-FXa-C（16μg/ ml）による類似の濃度のエドキサバンを有する低TF（2pM）における血漿TG。 曲線は2つの独立した実験の平均を表す。

【0094】

【表1】

【実施例】

【0095】

実施例１

【0096】

材料と方法

【0097】

リバーロキサバン およびアピキサバンはAlsachim（(イルキルシュ、フランス）から入手し、DMSO（約30mg/ml）に溶解した。ペプチジル基質であるメトキシカルボニルシクロヘキシルグリシルアルギニン-p-ニトロアニリド（Spec-Xa）はSekisui Diagnostics（スタンフォード、コネチカット州、米国）から入手した。Roche（バーゼル、スイス）より入手のインスリン-トランスフェリン-亜セレン酸ナトリウム（ITS）を除いて、全ての組織培養試薬はLife Technologies（カールスバッド、カリフォルニア州）より得た。以前の記載（Higgins et al., 1983. J Biol Chem 258: 6503-6508）にしたがって、75％（w/w）の鶏卵のL-ホスファチジルコリンおよび25％（w/w）のブタ脳L-ホスファチジルセリン（Avanti Polar Lipids、アラバスター、アラバマ州）からなる小型単層リン脂質小胞（PCPS）が準備され、特性が明らかにされた。FX枯渇ヒト血漿は、Diagnostica Stago（パリ、フランス）から得た。全ての機能的アッセイは、HEPES緩衝生理食塩水（20mM Hepes、0.15M NaCl、pH7.5）中で実施し、5mMのCaCl₂および0.1％のポリエチレングリコール8000（試験用緩衝液）を添加した。哺乳動物発現ベクターpCMV4（Andersson et al, 1989. J Biol Chem. 264: 8222-8229）に組換えヒトFX（r-hFX）を組み込んだものは、Rodney M. Camireからの寛大な贈呈によるものである（Camire et al. 2000. Biochemistry 39: 14322-14329）。pcDNA3ベクターはInvitrogenから得られ、PACE cDNAはGenetics Institute、Boston、MAからの寛大な贈り物であった。フリンプロプロテインコンバターゼを組み込んだベクターは記載されている（米国特許第5,460,950号）。

【0098】

ヒト組換え第V因子（FV）を、以前に記載されているように調製し、精製し、特徴付けした（Bos et al, 2009. Blood 114: 686-692）。以前に記載（Verhoef et al., Toxin Reviews (2013) (doi:10.3109/15569543.2013.844712））されているようにして、組換えP.テクスチリス毒FXa（vpt-FXa）を調製し、精製し、特徴付けた。血漿由来ヒト第Xa因子（pd-hFXa）、DAPA、ヒトプロトロンビンおよび抗ヒト第X因子モノクローナルマウスIgG（AHX-5050）は、Haematologic Technologies（エセックス ジャンクション、バーモント州、米国）から得た。ELISA用のFX抗原対抗体はCedarlane（バーリントン、カナダ）から得た。 RVV-Xアクチベーターは、Diagnostica Stago（パリ、フランス）、またはHaematologic Technologiesから入手した。制限エンドヌクレアーゼApa1は、New England Biolabs（イプスウィッチ、マサチューセッツ州、米国）から得た。T4-DNAリガーゼはRoche（Roche Applied Science、インディアナポリス、インディアナ州、米国）から得た。

【0099】

改変ヒトFX-AをコードするDNA配列は、配列番号7として提供される。改変ヒトFX-BをコードするDNA配列は、配列番号8として提供される。ApaI制限部位に隣接する配列番号4（改変ヒトFX-Aを生成するため）または配列番号5（改変ヒトFX-Bを生成するため）をコードするヌクレオチドは、Genscript（Piscataway、NJ、USA）Apa1およびT4-DNAリガーゼを用いてpCMV4哺乳動物発現ベクターにサブクローニングし、一貫性を保つべく配列決定した。改変ヒトFX-Aおよび改変ヒトFX-Bは、それぞれ、mod-hFX-Aおよびmod-hFX-Bとも呼ばれる。r-hFXまたは改変hFXを発現する安定なHEK293細胞株は、以前に記載されているように得られた（Larson et al., 1998. Biochemistry 37, 5029-5038）。HEK293細胞を、製造元の指示にしたがって、Lipofectamine2000を用いてpCMV4およびpcDNA-PACEベクターでコトランスフェクションした。トランスフェクタントのFX発現を、FX枯渇ヒト血漿を用いた修飾ワンステップ凝固アッセイ法によって評価した。最も高い発現レベルを有するトランスフェクタントを、T175培養フラスコ中に増殖させ、発現培地（ペニシリン/ストレプトマイシン/ファンギゾン、2mMのL-グルタミン、10μg/mlのITS、100μg/mlのGeneticin-418硫酸塩および6μg/mlのビタミンKを添加したフェノールレッド非含有DMEM-F12培地）で24時間培養した。培養上清を収集し、10.000gで遠心分離して細胞破片を除去し、10kDaカットオフフィルター（Millipore、ダルムシュタット、ドイツ）で濃縮し、HEPES緩衝生理食塩水で洗浄し、50％グリセロール中で-20℃にて保存した。グリセロールストックのFX抗原レベルを、10μg/ mlの血漿FX濃度を仮定して、ヒトプール血漿を基準として使用し、サンドイッチELISAによって、製造者の指示に従って評価した。

【0100】

発現培地を、r-hFX、改変ヒトFX -Aまたは改変ヒトFX-Bのいずれかを発現する安定な細胞系で24時間コンディショニングした。培養上清の一定分量をRVV-X（10ng/μl; Haematologic Technologies）と共に37℃で120分間インキュベートした。活性化後、改変ヒトFX-Aまたは改変ヒトFX-Bは、それぞれm-hFXa Aまたはm-hFXa Bとも呼ばれる。すべてのFXa変異体について同様の基質親和性を仮定して、次に、既知濃度のpd-hFXaを参照としてペプチジル基質変換（Spec-Xa、250μM）により培地中のFXaの濃度を決定した。高分子基質切断の定常状態の初期速度は、記載（Camire, 2002. J Biol Chem 277: 37863-70）にしたがい、25℃で不連続に測定した。PCPS（50μM）、DAPA（10μM）、およびプロトロンビン（1.4μM）をヒト組換えFV-810（Bドメイン切断型、構成的に活性型）とインキュベートすることによってプロトロンビン活性化の進行曲線を得た。
0.1nMのpd-hFXa、r-hFXa、m-hFXa B、または0.033nMのm-hFXa Aのいずれかを用いて反応を開始した。プロトロンビン変換の速度は記載（Krishnaswamy et al., 1997. Biochemistry 36, 3319-3330）にしたがい測定した。

【0101】

組換えFXおよび改変ヒトFX-Aおよび改変ヒトFX-B（200ng）をRVV-X（0.5U/ml）により37℃で60分間活性化し、プレキャスト4－12％勾配ゲルおよびMES緩衝系（Life Technologies）を用いて還元（30mMジチオスレイトール）条件下にて、電気泳動し、そして、Trans-Blot Turbo Transfer System（Bio-Rad Laboratories、ヘラクレス、カリフォルニア州、米国）を用いてニトロセルロース膜に転写した。ブロットを抗重鎖FX抗体でプローブ処理し、Dyelight-800抗マウス蛍光抗体（Thermo Scientific、ロックフォード、イリノイ州、米国）を用いてタンパク質バンドを可視化した。血漿由来hFXa（200ng）を参照として使用した。

【0102】

トロンビン生成は、以前に記載されたプロトコル（Hemker et al., 2003. Pathophysiol Haemost Thromb, 33: 4-15）から適合させた。簡単に述べると、FX欠乏血漿をトウモロコシトリプシン阻害剤（70μg/ml）、緩衝液（25mM HEPES、175mM NaCl、5mg/ml BSA、pH7.5）およびPCPS（20μM）と混合し、96ウェルマイクロプレートで37℃で10分間インキュベートした。FluCaを添加したリバーロキサバン（0.4μM）またはアピキサバン（0.2μM）でプレインキュベートしたpd-hFXa（0.5nM）またはvpt-FXa（0.5nM）の添加によりトロンビン形成を開始し、直ちに血漿混合物に移した。最終反応容量は120μlであり、そのうち64μlはFX-枯渇血漿であった。トロンビン形成を20秒ごとに30分間測定し、software suite（Thrombinoscope、バージョン5.0）を用いて検量用試料について補正した。平均内因性トロンビンポテンシャル（トロンビン生成曲線下の面積）は、少なくとも2つの個々の実験から計算した。検量用試料および蛍光基質（FluCa）はThrombinoscope（マーストリヒト、オランダ王国）から購入した。

【0103】

各FXa変異体のペプチジル基質変換（Spec-Xa、最終250μM）を、直接FXa阻害剤リバーロキサバンおよびアピキサバン（最終0,001μM－100μM）の非存在下または存在下で、環境温度にて行った。pd-hFXa（最終2nM）またはvpt-FXa（最終10nM）のカルシウム非含有ストックを試験用緩衝液で希釈し、試験用緩衝液または阻害剤の存在下で96ウェルマイクロプレート中で2分間インキュベートした。基質変換をSpec-Xaで開始し、Softmax Proソフトウェアスイート（Molecular Devices、サニーベール、カリフォルニア州、米国）を備えたSpectraMax M2eマイクロプレートリーダーで、吸収を405nMで10分間計測した。各組換えFX変異体のDFXI感受性をアッセイするために、r-hFX、改変ヒトFX-Aおよび改変ヒトFX-Bのグリセロールストック（5－40μl）を試験用緩衝液で希釈し、RVV-X（0.5 U/ ml）で37℃で60分間インキュベートした。次いで、活性化ストックを試験用緩衝液で希釈し、試験用緩衝液または阻害剤の存在下で96ウェルマイクロプレート中で2分間インキュベートし、記載した基質変換についてアッセイした。rhFX、m-hFXa Aおよびm-hFXa Bの相対濃度を、既知濃度のpd-hFXaを基準として用いた阻害剤の非存在下での基質変換率から評価した。

【0104】

結果

【0105】

毒から誘導されたP.テクスチリス（Vpt）-FXaは、DFXIによる阻害に耐性である。

【0106】

それこれまで知られている他のFXa種とは異なり、このプロテアーゼは、FXaの活性部位を可逆的に遮断するように設計された直接抗凝固剤であるリバーロキサバンおよびアピキサバンによる阻害に対して抵抗性であることが、精製された組換え毒液由来のP.tililis FXa（vptFXa）の生化学的特徴付けにより明らかにされた。以前の観察と一致して、ヒトFXa（hFXa）阻害のKiは約1nMであった（Perzborn, 2005. J Thromb Haemost, 3, 514-521）が、vptFXa阻害は少なくとも1000倍減少した（図２Ａ）。これらの知見は、in vivoフィブリン生成を模倣する血漿系において確証がされ、FXa阻害剤の生理学的濃度がvptFXa開始トロンビン形成にほとんど影響を与えないことが実証されたが、hFXaの存在により有意な減少が観察された（図２ＢおよびＣ）。

【0107】

ヒト毒液P.テクスチリスFXaキメラ。

【0108】

vptFXaに限らず、オーストラリアの蛇タイガースネーク（Notechis scutatus）からの毒FXにも存在する顕著な構造要素は、hFXa活性部位に近い位置で変化したアミノ酸組成である（図１Ｃ）。その位置を考慮して、我々はこのユニークならせん体が、リバーロキサバンおよび／またはアピキサバンとの相互作用を調節するだけでなく、FVa結合部位がこのらせん体のC末端であるので、FVaもまた調節すると仮定した（Leeら、2011. J Thromb Haemost 9：2123-2126）。この仮説を試験するために、我々は、配列番号7および8に列挙された2つのタンパク質をコードするDNA構築物を調製した。配列番号7で提供されるmod-hFX-Aキメラは、N.scutatus DNA配列の関連部分（太字および下線で示される）と配列番号8で提供されるmod-hFX-Bキメラは、P. テクスチリスの配列（太字と下線で示す）とを含む。

【0109】

これらのDNA構築物を使用して、本発明者らは、発現培地上で24時間細胞を馴化することにより、両方のキメラタンパク質を安定して産生し、続いてHEK293細胞から改変ヒトFXの発現レベルを評価したHEK293細胞株を生成した。ウェスタンブロット分析により、野生型FXと同様の両方のキメラ変異体について全長FXの発現が明らかにされた（図３Ａ）。ラッセルのViper Venom（RVV-X）からのアクチベーターとのインキュベーションにより、約29kDaの重鎖バンドの出現により示される、チモーゲンFXの約30％のFXaへのタンパク質分解活性化が生じた。改変ヒトFXa-Aおよび改変ヒトFXa-Bの両方の重鎖は、わずかに高い分子量で移動し、これは、ヒトFXaのそれに比べてそれぞれ12または13残基長いヘビ配列の挿入と一致する。培養上清中のFX抗原レベルの分析では、mod-hFX-Aの発現が約7倍減少したのに対し、mod-hFX-Bの発現は野生型ヒトFXと類似していることが示された（図３Ｂ）。mod-hFX-Aの低FX抗原レベルは、改変凝固アッセイを用いて観察された同様に低いFX活性レベルと相関していた。これは、mod-hFX-Aのタンパク質発現が他のFX変異体のタンパク質発現と比較して最適ではないが、そのFX機能は撹乱されないことを示す。

【0110】

FXのチモーゲン活性化を試験するために、我々はRussell's Viper Venom（RVV-X）のFXアクチベーターを用いて、rFXおよび改変ヒトFX-Aおよび改変ヒトFX-BをFXaに変換した。小さなFXa特異的ペプチジル基質SpectroZyme Xaの変換によって評価した場合、改変ヒトFXa-Aおよび改変ヒトFXa-Bの両方が、RVV-X活性化時にプロテアーゼ活性を示した。さらに、両方のキメラのヒト補因子FVaの存在下でのプロトロンビン変換速度は、ヒトFXa（pd-hFXaおよびr-hFXaの両方）と同様であった（図４）。まとめると、これらの所見は、ヘビ配列の挿入がヒトFXの酵素特性を著しく妨げないことを示唆している。

【0111】

DFXIによるFXaキメラの阻害。

【0112】

RVV-X活性化修飾ヒトFX-Aに対するリバーロキサバンおよびアピキサバンの阻害定数（Ki）を評価するために、活性化された組換えタンパク質を0.001から100μMの阻害剤と共にプレインキュベートし、続いてSpectroZyme Xaに対するその触媒活性についてアッセイした。0.5μMのリバーロキサバンとのインキュベーションはr-hFXaおよびpd-hFXaの完全な阻害をもたらしたが、mod-hFXa-Aはこれらの条件下で完全に活性を維持した（図５Ａ）。さらに、キメラ変異体は、100μMのリバーロキサバンとのインキュベーション後に依然として部分色素産生活性を示した。これはP.テクスリリス毒液FXaと同様である。これらのデータは、mod-hFXa-Aの阻害のKiがヒトFXaのものと比較して少なくとも100倍増加したことを示す。我々はアピキサバンによる同様の抑制感度低下を観察した（図５Ｂ）。

【0113】

リバーロキサバンおよびアピキサバンによるmod-hFXa-Bの阻害の評価は、mod-hFXa-Aについて観察されたものと同様のKiをもたらした（図６Ａおよび６Ｂ）。したがって、アピキサバンおよびリバーロキサバンによる抑制に対する感受性の低下が示された。最後に、キメラFXa変異体のDFXI阻害は、補因子FVaおよび負に荷電したリン脂質小胞の存在下では変化しなかったが、遊離プロテアーゼおよびFVa-FXa-脂質結合複合体に集合したものは、リバーロキサバンおよびアピキサバンによる阻害に対して、等しく耐性であることが示唆された（図７ＡおよびＢ）。

【0114】

実施例２

【0115】

材料と方法

【0116】

他に示されない限り、この実施例で使用された材料および方法は、実施例１に示された材料および方法と同じまたは同様にした。

【0117】

組換えFXの構築と発現：キメラFX-A（c-FX A）、キメラFX-B（c-FX B）およびキメラFX-C（c-FX C）をコードするDNAは、Genscript（ピスカタウェイ、ニュージャージー州、米国）で合成し、Apa1およびT4-DNAリガーゼを用いてpCMV4哺乳動物発現ベクターにサブクローニングし、一貫性について配列決定した。組換えヒトまたは組換えキメラFXを発現する安定したHEK293細胞系は、以前に記載（Larson et al, 1998. Biochemistry 37, 5029-5038）されているようにして得られた。HEK293細胞を、製造者の指示に従って、Lipofectamine2000によってpCMV4およびpcDNA-PACEベクターでコトランスフェクションした。

【0118】

キメラFX（a）の精製：組換えchimerix FX生成物A、BおよびCを、免疫親和性精製をPOROS HQ20-セファロースカラム上のFXのカルシウム勾配精製に置き換えた以外は以前に記載（Camire et al, 2000）されているように、調製し、精製し、そして特徴付けた。完全にγ-カルボキシル化された組換えFXの典型的な収量は、培養上清あたり0.9mg/lであった。Sephacryl S200 HRカラム（Vt 460ml）でサイズ排除クロマトグラフィーにより単離した精製組換えキメラFXをRVV-X（0.1U/mg FX）で活性化し、50％vol/volのグリセロールを含むHBS中に-20℃で保存した。精製した産物を、クマシー染色により可視化した。

【0119】

高分子基質の活性化：高分子基質切断の定常状態初期速度を、Camire, 2002に記載されているようにして、不連続的に25℃で測定した。要するに、PCPS（50μM）、DAPA（10μM）、およびプロトロンビン（1.4μM）をヒト組換えFV-810（20nM、Bドメイン切断型、構成的に活性なFV）とインキュベートすることによってプロトロンビン活性化の進行曲線を得て、0.1nMのpd-hFXa、r-hFXa、c-FXa A、c-FXa Bまたはc-FXa Cのいずれかを用いて反応を開始した。プロトロンビン変換の速度を、Krishnaswamyら, 1997に記載されているように測定した。各組換えFXa変異体のDOAC感度を決定するために、直接FXa阻害剤エドキサバン（CAS登録番号912273-65-5;第一三共社製、Savaysaとして販売）およびアピキサバン （最終0.001μMから100μM）の存在下または非存在下において、プロトロンビン変換を測定した。

【0120】

トロンビン生成アッセイ：トロンビン生成は、以前に記載されたプロトコール（Hemker et al, 2003）に適合させた。要するに、組織因子添加FX枯渇血漿（TF、最終2または20pM）、トウモロコシトリプシン阻害剤（70μg/ml）、PCPS（20μM）および1単位（プロトロンビン時間特異的凝固活性）のr-hFX（7μg/ ml）またはキメラFX-C（16μg/ml）を加えることによって、トロンビン生成曲線を得た。血漿に基質緩衝液（Fluca）を添加することによってトロンビン形成を開始した。FXa枯渇血漿にトウモロコシトリプシン阻害剤（70μg/ ml）、試験用緩衝液およびPCPS（20μM）を添加することにより、FXaトロンビン生成曲線を得た。トロンビン形成は、リバーロキサバンまたはアピキサバンと、カルシウムを含まずFlucaを補充した試験用緩衝液とを予め混合したFXaの添加によって開始した。最終反応容積は120μlであり、そのうち64μlはFX-枯渇血漿であった。トロンビン形成は、30分ごとに20秒ごとに測定し、トロンビノスコープのソフトウェアを使用して較正用に補正した。遅延時間、平均内因性トロンビンポテンシャル（トロンビン生成曲線下の面積）、ピークおよびピークトロンビン生成までの時間は、少なくとも3つの個々の実験から計算した。

【0121】

結果

【0122】

P.テクスチリス毒素、P.テクスチリスアイソフォームおよびN.スクータティス毒液FXaのセリンプロテアーゼドメインにおける9-13残基の挿入は、ヒトおよびヘビFXのキメラを構築することを我々に促した。我々は、これらの挿入のそれぞれをヒトFXaに組み込む3つのタンパク質コードDNA構築物を作製した。（図９）。これらのDNA構築物を用いて、組換え正常ヒトFX（r-hFX）または3種類のキメラFX（c-FX A、c-FX Bおよびc-FX C）のいずれかを安定的に産生するHEK293細胞株を生成した。HEK293細胞由来の組換えヒトおよびキメラFXの発現レベルを、発現培地で細胞を24時間培養し、その後、培養上清の凝固活性を、FX枯渇血漿における修飾ワンステップPT凝固アッセイによって評価した。組換えγ-カルボキシル化FXは、連続的なイオン交換クロマトグラフィー工程によって培養上清から精製した。FXプールの一部は、ラッセルクサリヘビ蛇毒からのFXアクチベーターで活性化され、サイズ排除クロマトグラフィーによって単離され、SDS-PAGEによって特徴付けられた。精製された血漿由来因子Xaの重鎖は、約31～約34kDaでFXa-αとFXa-βの50/50混合物として移動する。FXa-α（残基436-447）のC末端部分の自己タンパク質分解による切除はβ型のFXaを生じるが、プロトロンビナーゼ集合、プロトロンビン活性化、アンチトロンビン認識、およびペプチジル基質変換に関して、両方のアイソフォームは機能的に類似している（Pryzdial and Kessler, 1996）。

【0123】

r-hFXaおよびキメラFXa-Bおよび-Cの精製産物は、FXa-βとして主に移動し、キメラFXa-AはαおよびβFXaの50/50混合物として移動する。（図１０Ａ）。コファクターFVaの存在下での負に荷電したリン脂質小胞（PCPS）上のr-hFXaおよびキメラFXa（A/B/C）による高分子基質活性化の動態は、すべてのキメラ変異体がプロトロンビナーゼ複合体に集合することを示す。しかし、キメラFXa変異体-A、-Bおよび-Cの触媒速度は、組換えヒトFXaに比べてそれぞれ8.2倍、6.8倍、および2.3倍低下する。さらに、組換えにより調製されたヒトFXaは、血漿由来のFXaと比較して触媒効率の中程度の低下を示す。（図１０Ｂ）。

【0124】

キメラFXa（A/B/C）のDOAC（アピキサバン、エドキサバン）の阻害定数（Ki）を決定するために、0.001から100μMのDOACの存在下でのプロトロンビン活性化の動態を試験した。血漿由来FXaおよび組換えヒトFXaは、ほぼ等モル濃度のDOACで完全に阻害されるが、全てのキメラFXa変異体は有意に高いFXa阻害剤濃度でプロトロンビン変換を維持することができた（アピキサバンのKi：130-1270nM、エドキサバンのKi：3-270nM）。（図１１）。キメラFXa変異体が、様々な長さおよびアミノ酸組成を有する同様に位置付けられた挿入を含むことを考えると、我々は、DOAC配位残基Tyr99および/または活性部位にそれらの挿入が近接していることが、DOACの感受性の低下に直接的な影響を及ぼすものであると推測している。

【0125】

DOACスパイク血漿におけるトロンビン生成を回復させるキメラFXaの可能性を評価するために、トロンビン生成（TG）アッセイを行った。FX枯渇ヒト血漿におけるFXa開始（5nM）トロンビン生成は、c-FXa変異体Cについての正常TGプロファイル、およびc-FXa変異体AおよびBについての正常なプロファイルに近いことを実証した（図１２Ａ）。アピキサバン（2μM）は、pd-FXa-およびr-hFXa開始TGにおける遅延時間を大幅に延長し、ピークトロンビン生成を減少させたが、これらのパラメーターは、存在するキメラFXa変異体に邪魔されなかった。（図１２Ｂ）。（表２）。これらの結果は、キメラFXa変異体が、DOAC阻害血漿における止血を回復できることを示している。さらに、キメラFX-Cのチモーゲン型は、FX枯渇血漿中のトロンビン生成を維持することもできる。低濃度の組織因子（TF、2pM）による凝固の開始は、r-hFXによるTGとは異なり、アピキサバンの影響を受けないキメラFX-Cの強いTG曲線を生成する（図１３）。低いTF濃度では、キメラFX-Cは、TGの開始およびピーク時間の短い遅延を示し、さらに、キメラFX-Cは、より大きな内因性トロンビンポテンシャル（ETP）およびより高いピークトロンビン生成を有する（表３）。しかし、これらの値は高TF（20pM）濃度で正常化する（図１３）（表３）。FXa開始TGアッセイで行った観察に基づいて、我々は、チモーゲンFX変異体AおよびBのチモーゲン形態も、DOACスパイク血漿中でTF開始TGを維持するものであると期待している。図１４は、表４と組み合わせて、DOAC阻害血漿における止血回復に対するキメラFXa変異体の効果のさらなる証拠を提供する。まとめると、これらの結果は、キメラFX（a）が、チモーゲンおよびプロテアーゼ形態の両方でDOAC阻害血漿における止血を回復できることを示す。

【0126】

表２ FXa開始TGパラメーターに対するアピキサバンの効果。値は、アピキサバン非存在下で得られたTG値について補正されたアピキサバンの存在下で得られた実験的TG値を表す。

【表2】

【0127】

表３ 低および高TF開始TG実験の概要。

【表3】

【0128】

表４ r-hFXおよびc-FX-Cに対するTF開始TGパラメーターに対するエドキサバンの効果。値は、増加する濃度のエドキサバンの存在下で得られた実験的TG値を表す。

【表4】

【図1】

【図2】

【図2-2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図8-2】

【図8-3】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】