特許 7536066 ポリペプチドの組み換え産生中にトリスルフィド結合を減少させる方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-08-08

(45)【発行日】2024-08-19

(54)【発明の名称】ポリペプチドの組み換え産生中にトリスルフィド結合を減少させる方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 21/02 20060101AFI20240809BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240809BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20240809BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240809BHJP

   C07K 16/22 20060101ALI20240809BHJP

   C07K 16/08 20060101ALI20240809BHJP

   C07K 16/40 20060101ALI20240809BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240809BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240809BHJP

【ＦＩ】

C12P21/02 C ZNA

C12P21/02 K

C12P21/08

C07K16/18

C07K16/28

C07K16/22

C07K16/08

C07K16/40

C12N15/13

C12N5/10

【請求項の数】 47

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2022183766

(22)【出願日】2022-11-17

(62)【分割の表示】P 2018559294の分割

【原出願日】2017-05-09

(65)【公開番号】P2023027081

(43)【公開日】2023-03-01

【審査請求日】2022-12-16

(31)【優先権主張番号】62/334,433

(32)【優先日】2016-05-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】509012625

【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】ガウリツェク， マーティン

(72)【発明者】

【氏名】マルケッタ， スヴェン

(72)【発明者】

【氏名】ポップ， オリヴァー

(72)【発明者】

【氏名】シラトリ， マサル ケン

(72)【発明者】

【氏名】トレウス， トーマス

(72)【発明者】

【氏名】ウー， ジェシカ

【審査官】白井 美香保

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１３－５２４８２６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１４－５１３５４３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００６－５１７０９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１４／１４５０９８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１２／０２６４９１６（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

Ｐｕｂｍｅｄ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡＰＬＵＳ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤＳ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ポリペプチド中のトリスルフィド結合レベルを減少させるための方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドをコードする核酸を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を基本培地と接触させることであって、
前記基本培地が、
ｉ）２μＭ～３５μＭの鉄、
ｉｉ）０．１１μＭ～２μＭのリボフラビン（ビタミンＢ２）、
ｉｉｉ）４．５μＭ～８０μＭのピリドキシンまたはピリドキサール（ビタミンＢ６）、
ｉｖ）３．４μＭ～２３μＭの葉酸（ビタミンＢ９）、及び
ｖ）０．２μＭ～２．５μＭのシアノコバラミン（ビタミンＢ１２）を含む、または
前記基本培地が、
Ａ）９ｍＭ～１０ｍＭのヒポタウリンを含む、または
前記基本培地が、
１）１．５８ｍＭ～２．２５ｍＭのメチオニンを含む、前記接触させることと、
（ｂ）前記ＣＨＯ細胞を培養して、前記ポリペプチドを産生することと、
（ｃ）前記ＣＨＯ細胞によって産生される前記ポリペプチドを収集することと、を含む、前記方法。

【請求項2】

ポリペプチドを産生するための方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドをコードする核酸を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞を基本培地と接触させることであって、
前記基本培地が、
ｉ）２μＭ～３５μＭの鉄、
ｉｉ）０．１１μＭ～２μＭのリボフラビン（ビタミンＢ２）、
ｉｉｉ）４．５μＭ～８０μＭのピリドキシンまたはピリドキサール（ビタミンＢ６）、
ｉｖ）３．４μＭ～２３μＭの葉酸（ビタミンＢ９）、及び
ｖ）０．２μＭ～２．５μＭのシアノコバラミン（ビタミンＢ１２）を含む、または
前記基本培地が、
Ａ）９ｍＭ～１０ｍＭのヒポタウリンを含む、または
前記基本培地が、
１）１．５８ｍＭ～２．２５ｍＭのメチオニンを含む、前記接触させることと、
（ｂ）前記ＣＨＯ細胞を培養して、前記ポリペプチドを産生することと、
（ｃ）前記ＣＨＯ細胞によって産生される前記ポリペプチドを収集することと、を含む、前記方法。

【請求項3】

前記収集されたポリペプチドが、ｉ）～ｖ）の濃度、Ａ）の濃度、または１）の濃度が（ａ）に明記されるｉ）～ｖ）の濃度、Ａ）の濃度、または１）の濃度と異なることを除いて同一の条件下で産生されるポリペプチドよりも、少ないトリスルフィド結合レベルを有する、請求項１または請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記基本培地が、シスチンを欠く、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記基本培地が、１．４ｍＭ～３ｍＭのシステインまたはシスチンを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記基本培地が、１．５８ｍＭ～２．２５ｍＭのメチオニン及び０ｍＭ～３ｍＭのシステインを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記基本培地が、６ｍＭのシステインを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

ポリペプチド中のトリスルフィド結合レベルを減少させるための方法であって、
（ａ）細胞培養培地中で、前記ポリペプチドをコードする核酸を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培養することであって、
前記細胞培養培地が、
ｉ）２μＭ～３５μＭの鉄、
ｉｉ）０．１１μＭ～２μＭのリボフラビン（ビタミンＢ２）、
ｉｉｉ）４．５μＭ～８０μＭのピリドキシンまたはピリドキサール（ビタミンＢ６）、
ｉｖ）３．４μＭ～２３μＭの葉酸塩／葉酸（ビタミンＢ９）、及び
ｖ）０．２μＭ～２．５μＭのシアノコバラミン（ビタミンＢ１２）を含む、または
前記細胞培養培地が、
Ａ）９ｍＭ～１０ｍＭのヒポタウリンを含む、または
前記細胞培養培地が、
１）１．５８ｍＭ～２．２５ｍＭのメチオニンを含む、培養することと、
（ｂ）前記ポリペプチドを産生することと、
（ｃ）前記ＣＨＯ細胞によって産生される前記ポリペプチドを収集することと、を含む、前記方法。

【請求項9】

前記細胞培養培地中のｉ）～ｖ）の濃度、Ａ）の濃度、または１）の濃度が、植え付け後の１つ以上の添加の累積濃度である、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

ＣＥＡ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカイン、ＦＡＰ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカイン、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体、抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体、抗Ｃ５抗体、及び抗ＣＤ４０抗体からなる群から選択されるポリペプチド中のトリスルフィド結合レベルを減少させるための方法であって、
（ａ）細胞培養培地中で、前記ポリペプチドをコードする核酸を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞を培養することであって、
前記細胞培養培地が、
ｉ）２μＭ～３５μＭの鉄、
ｉｉ）０．１１μＭ～２μＭのリボフラビン（ビタミンＢ２）、
ｉｉｉ）４．５μＭ～８０μＭのピリドキシンまたはピリドキサール（ビタミンＢ６）、
ｉｖ）３．４μＭ～２３μＭの葉酸塩／葉酸（ビタミンＢ９）、及び
ｖ）０．２μＭ～２．５μＭのシアノコバラミン（ビタミンＢ１２）を含む、または
前記細胞培養培地が、
Ａ）９ｍＭ～１０ｍＭのヒポタウリンを含む、または
前記細胞培養培地が、
１）１．５８ｍＭ～２．２５ｍＭのメチオニンを含む、前記培養することと、
（ｂ）前記ポリペプチドを産生することと、
（ｃ）前記ＣＨＯ細胞によって産生される前記ポリペプチドを収集することと、を含む、前記方法。

【請求項11】

ＣＥＡ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカイン、ＦＡＰ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカイン、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体、抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体、抗Ｃ５抗体、及び抗ＣＤ４０抗体からなる群から選択されるポリペプチド中のトリスルフィド結合レベルを減少させるための方法であって、
（ａ）細胞培養培地中で、前記ポリペプチドをコードする核酸を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培養することであって、前記細胞培養培地が、以下の構成成分、
ｉ）２μＭ～３５μＭの鉄、及び
ｉｉ）１．５８ｍＭ～２．２５ｍＭのメチオニンのうちの１つ以上を含む、前記培養することと、
（ｂ）前記ポリペプチドを産生することと、
（ｃ）前記ＣＨＯ細胞によって産生される前記ポリペプチドを収集することと、を含む、前記方法。

【請求項12】

前記方法が、少なくとも１つの供給物を更に含み、供給物培地が、以下、鉄、リボフラビン、ピリドキシン、ピリドキサール、葉酸、及びシアノコバラミンのうちの１つ以上を欠く、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記供給物が、バッチ供給物である、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

バッチ供給物培地が、シスチンを欠く、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

バッチ供給物培地が、システインを欠く、請求項１３または１４に記載の方法。

【請求項16】

バッチ供給物培地が、メチオニンを欠く、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

前記鉄が、三価鉄（Ｆｅ ^３＋ ）または二価鉄（Ｆｅ ^２＋ ）である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

（Ｉ）収集前に、前記ＣＨＯ細胞の培養物にキレート剤及び還元剤を補充すること、
（ＩＩ）前記ＣＨＯ細胞の収集前細胞培養流体（ＰＨＣＣＦ）にキレート剤及び還元剤を補充すること、または
（ＩＩＩ）収集後に、前記ＣＨＯ細胞の収集された細胞培養流体（ＨＣＣＦ）にキレート剤及び還元剤を補充することを更に含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

前記還元剤が補充される前に、前記ＣＨＯ細胞の前記培養物、前記ＰＨＣＣＦ、または前記ＨＣＣＦに前記キレート剤が補充される、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記還元剤が補充される６０分～３０分前に、前記ＣＨＯ細胞の前記培養物、前記ＰＨＣＣＦ、または前記ＨＣＣＦに前記キレート剤が補充される、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記キレート剤及び前記還元剤が、前記ＣＨＯ細胞の前記培養物、前記ＰＨＣＣＦ、または前記ＨＣＣＦ中で３０分間～４日間維持される、請求項１８～２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

前記ＣＨＯ細胞の前記培養物、前記ＰＨＣＣＦ、または前記ＨＣＣＦが、１５℃～３７℃の温度で維持される、請求項１８～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

前記ＣＨＯ細胞の前記培養物、前記ＰＨＣＣＦ、または前記ＨＣＣＦが、６．５～７．５のｐＨで維持される、請求項１８～２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

前記ＣＨＯ細胞の前記培養物、前記ＰＨＣＣＦ、または前記ＨＣＣＦ中の溶解酸素（ＤＯ）の量が、少なくとも１５％である、請求項１８～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

前記ＣＨＯ細胞の前記培養物、前記ＰＨＣＣＦ、または前記ＨＣＣＦが、１５℃～３７℃の温度及び６．５～７．５のｐＨで維持され、前記ＣＨＯ細胞の前記培養物またはＨＣＣＦ中の溶解酸素（ＤＯ）の量が、少なくとも１５％である、請求項１８～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

前記還元剤が、グルタチオン（ＧＳＨ）、Ｌ－グルタチオン（Ｌ－ＧＳＨ）、システイン、Ｌ－システイン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、２，３－ｔｅｒｔ－ブチル－４－ヒドロキシアニソール、２，６－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－４－メチルフェノール、３－アミノプロパン－１－スルホン酸、アデノシルホモシステイン、アンセリン、Ｂ－アラニン、Ｂ－カロチン、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、カルノシン、カルベジロール、クルクミン、システアミン、システアミン塩酸塩、デキサメタゾン、ジアリルジスルフィド、ＤＬ－ランチオニン、ＤＬ－チオルファン、エトキシキン、没食子酸、ゲンチジン酸ナトリウム塩水和物、グルタチオンジスルフィド、グルタチオン還元エチルエステル、グリシン、ヒドロコルチゾン、ヒポタウリン、イセチオン酸アンモニウム塩、Ｌ－システイン－グルタチオンジスルフィド、Ｌ－システインスルフィン酸一水和物、リポ酸、還元リポ酸、メルカプトプロピオニルグリシン、メチオニン、メチレンビス（３－チオプロピオン酸）、シュウ酸、クエルシトリン水和物、レスベラトロール、レチノイン酸、Ｓ－カルボキシメチル－Ｌ－システイン、セレン、セレノメチオニン、ジエチルジチオカルバミン酸銀、タウリン、チオ乳酸、トリシン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ４、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、及びビタミンＢ１１からなる群から選択される、請求項１８～２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

前記還元剤が、システイン及びＬ－システインからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記還元剤が、Ｌ－システインであり、前記Ｌ－システインが、前記ＣＨＯ細胞の前記培養物またはＨＣＣＦに添加されて、３ｍＭ～６ｍＭの最終濃度が達成される、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－ジコハク酸（ＥＤＤＳ）、クエン酸塩、シュウ酸塩、酒石酸塩、エチレン－ビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、５－スルホサリチル酸、Ｎ，Ｎ－ジメチルドデシルアミンＮ－オキシド、ジチオオキサミド、エチレンジアミン、サリチルアルドキシム、Ｎ－（２’－ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（ＨＩＭＤＡ）、オキシンキノリノール、及びスルホキシンからなる群から選択される、請求項１８～２８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項30】

前記キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－ジコハク酸（ＥＤＤＳ）、及びクエン酸塩からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記キレート剤が、前記ＣＨＯ細胞の前記培養物または前記ＨＣＣＦに添加されて、２０ｍＭの最終濃度が達成される、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記ポリペプチドが、細胞培養培地へと分泌される、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項33】

前記収集されたポリペプチドを精製するステップを更に含む、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項34】

前記ＣＨＯ細胞が、組み換えＣＨＯ細胞である、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

前記方法が、ポリペプチド中のトリスルフィド結合のレベルを測定することを更に含む、請求項１～３４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項36】

前記ポリペプチド中の平均トリスルフィド結合％が、２０％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．５％未満、または０．１％未満である、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項37】

前記ポリペプチドが、抗体またはその断片である、請求項１～９及び１２～３６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項38】

前記ポリペプチドが、抗体断片であり、前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’） _２ 、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ） _２ 、ｄＡｂ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、線状抗体、一本鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記抗体またはその断片が、ＢＭＰＲ１Ｂ、Ｅ１６、ＳＴＥＡＰ１、０７７２Ｐ、ＭＰＦ、Ｎａｐｉ３ｂ、Ｓｅｍａ ５ｂ、ＰＳＣＡ ｈｌｇ、ＥＴＢＲ、ＭＳＧ７８３、ＳＴＥＡＰ２、ＴｒｐＭ４、ＣＲＩＰＴＯ、ＣＤ２１、ＣＤ７９ｂ、ＦｃＲＨ２、ＨＥＲ２、ＮＣＡ、ＭＤＰ、ＩＬ２０Ｒα、ブレビカン、ＥｐｈＢ２Ｒ、ＡＳＬＧ６５９、ＰＳＣＡ、ＧＥＤＡ、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＸＣＲ５、ＨＬＡ－ＤＯＢ、Ｐ２Ｘ５、ＣＤ７２、ＬＹ６４、ＦｃＲＨ１、ＩＲＴＡ２、ＴＥＮＢ２、ＰＭＥＬ１７、ＴＭＥＦＦ１、ＧＤＮＦ－Ｒａ１、Ｌｙ６Ｅ、ＴＭＥＭ４６、Ｌｙ６Ｇ６Ｄ、ＬＧＲ５、ＲＥＴ、ＬＹ６Ｋ、ＧＰＲ１９、ＧＰＲ５４、ＡＳＰＨＤ１、チロシナーゼ、ＴＭＥＭ１１８、ＧＰＲ１７２Ａ、ＣＤ３３、ＣＬＬ－１、Ｃ５、ＯＸ４０、α４β７及びαＥβ７インテグリンヘテロ二量体、ＩＬ－１３、ＣＤ－２０、ＦＧＦＲ、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、アミロイドベータ、ＨＥＲ３、補体因子Ｄ、ＩＬ－２２ｃ、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＤ－１、ＶＥＧＦ、アンジオポエチン２、ＣＤ３、ＦＡＰ、ＣＥＡ、ならびにＩＬ－６からなる群から選択される抗原に結合する、請求項３７に記載の方法。

【請求項40】

前記ポリペプチドが、抗体であり、前記抗体が、二重特異性抗体である、請求項３７に記載の方法。

【請求項41】

前記二重特異性抗体が、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、または抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体である、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記ポリペプチドが、免疫サイトカインである、請求項１～９及び１２～３６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項43】

前記免疫サイトカインが、ＣＥＡ－ＩＬ２ｖまたはＦＡＰ－ＩＬ２ｖである、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

細胞培養培地中で培養されたＣＨＯ細胞によって産生されるポリペプチド中のトリスルフィド結合レベルを減少させるための、細胞培養培地中の０～２．２５μＭのメチオニンの使用であって、ポリペプチドが、ＣＥＡ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカイン、ＦＡＰ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカイン、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体、抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体、抗Ｃ５抗体、及び抗ＣＤ４０抗体からなる群から選択される、使用。

【請求項45】

ポリペプチドを産生するために使用される、請求項１～４４のいずれか１項に記載の方法または使用。

【請求項46】

前記ポリペプチド中の平均トリスルフィド％が、２０％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．５％未満、または０．１％未満である、請求項４５に記載の方法または使用。

【請求項47】

請求項４５または４６に記載の方法を含む、医薬の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年５月１０日出願の米国仮出願第６２／３３４，４３３号の優先権の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出物の内容の全体が、参照により本明細書に組み込まれる：コンピュータ可読形態（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：１４６３９２０３６５４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ、記録日：２０１７年５月８日、サイズ：３４．１ＫＢ）。

【0003】

本開示は、組み換えで産生されるポリペプチド中のトリスルフィド結合を減少させるための細胞培養培地及び方法に関する。

【背景技術】

【0004】

トリスルフィド結合は、追加の硫黄原子のジスルフィド結合への挿入によって生成され、それにより３つの連続した硫黄原子の共有結合がもたらされる。トリスルフィド結合形成は、組み換えで産生される治療ポリペプチドの不均質性の原因である。治療製品は、広範囲の特性評価を受け、かつ製品の品質及び一貫性を確実にする許容基準を満たさなくてはならないため、そのような不均質性は望ましくない。したがって、治療ポリペプチドの製造中にトリスルフィド結合のレベルを減少させるための方法に対する需要が存在する。当該技術分野において、製造中に治療ポリペプチドのトリスルフィド結合レベルの可変性を最小化することに対する必要性もまた存在する。本開示は、この必要性及び他の必要性を対象とする。

【発明の概要】

【0005】

ポリペプチド中のトリスルフィド結合レベルを減少させるための方法であって、（ａ）ポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を基本培地と接触させることであって、基本培地が、以下の構成成分、ｉ）約２μＭ～約３５μＭの鉄、ｉｉ）約０．１１μＭ～約２μＭのリボフラビン（ビタミンＢ２）、ｉｉｉ）約４．５μＭ～約８０μＭのピリドキシンまたはピリドキサール（ビタミンＢ６）、ｉｖ）約３．４μＭ～約２３μＭの葉酸（ビタミンＢ９）、ｖ）約０．２μＭ～約２．５μＭのシアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、ｖｉ）約９ｍＭ～約１０ｍＭのヒポタウリン、及びｖｉｉ）約０～約１．５８ｍＭのメチオニンのうちの１つ以上を含む、接触させることと、（ｂ）宿主細胞を培養して、ポリペプチドを産生することと、（ｃ）宿主細胞によって産生されるポリペプチドを収集することとを含む、方法が提供される。関連する一態様において、ポリペプチドを産生するための方法であって、ポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を基本培地と接触させることであって、基本培地が、以下の構成成分、約２μＭ～約３５μＭの鉄、約０．１１μＭ～約２μＭのリボフラビン（ビタミンＢ２）、約４．５μＭ～約８０μＭのピリドキシンまたはピリドキサール（ビタミンＢ６）、約３．４μＭ～約２３μＭの葉酸（ビタミンＢ９）、約０．２μＭ～約２．５μＭのシアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、約９ｍＭ～約１０ｍＭのヒポタウリン、及び約０～約１．５８ｍＭのメチオニンのうちの１つ以上を含む、接触させることと、（ｂ）宿主細胞を培養して、ポリペプチドを産生することと、（ｃ）宿主細胞によって産生されるポリペプチドを収集することとを含む、方法が提供される。

【0006】

上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、収集されたポリペプチドは、１つ以上の構成成分の濃度が（ａ）に明記される濃度と異なることを除いて同一の条件下で産生されるポリペプチドよりも、少ないトリスルフィド結合レベルを有する。上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、基本培地は、シスチンを欠く。上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、基本培地は、約１．４ｍＭ～３ｍＭのシステインまたはシスチンを含む。上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、基本培地は、約０ｍＭ～約１．５８ｍＭのメチオニン及び約０ｍＭ～約３ｍＭのシステインを含む。上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、基本培地は、約６ｍＭのシステインを含む。

【0007】

ポリペプチド中のトリスルフィド結合レベルを減少させるための方法であって、（ａ）細胞培養培地中でポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を培養することであって、細胞培養培地が、以下の構成成分、ｉ）約２μＭ～約３５μＭの鉄、ｉｉ）約０．１１μＭ～約２μＭのリボフラビン（ビタミンＢ２）、ｉｉｉ）約４．５μＭ～約８０μＭのピリドキシンまたはピリドキサール（ビタミンＢ６）、ｉｖ）約３．４μＭ～約２３μＭの葉酸塩／葉酸（ビタミンＢ９）、ｖ）約０．２μＭ～約２．５μＭのシアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、ｖｉ）約９ｍＭ～約１０ｍＭのヒポタウリン、及びｖｉｉ）約０～約４．５ｍＭのメチオニンのうちの１つ以上を含む、培養することと、（ｂ）ポリペプチドを産生することと、（ｃ）宿主細胞によって産生されるポリペプチドを収集することとを含む、方法もまた提供される。上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、細胞培養培地中の構成成分のうちの１つ以上の濃度は、植え付け後の１つ以上の添加の累積濃度である。

【0008】

ＣＥＡ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカイン、ＦＡＰ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカイン、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体、抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体、抗Ｃ５抗体、及び抗ＣＤ４０抗体からなる群から選択されるポリペプチド中のトリスルフィド結合レベルを減少させるための方法であって、（ａ）細胞培養培地中でポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を培養することであって、細胞培養培地が、以下の構成成分、ｉ）約２μＭ～約３５μＭの鉄、ｉｉ）約０．１１μＭ～約２μＭのリボフラビン（ビタミンＢ２）、ｉｉｉ）約４．５μＭ～約８０μＭのピリドキシンまたはピリドキサール（ビタミンＢ６）、ｉｖ）約３．４μＭ～約２３μＭの葉酸塩／葉酸（ビタミンＢ９）、ｖ）約０．２μＭ～約２．５μＭのシアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、ｖｉ）約９ｍＭ～約１０ｍＭのヒポタウリン、及びｖｉｉ）約０～約４．５ｍＭのメチオニンのうちの１つ以上を含む、培養することと、（ｂ）ポリペプチドを産生することと、（ｃ）宿主細胞によって産生されるポリペプチドを収集することとを含む、方法が提供される。

【0009】

ＣＥＡ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカイン、ＦＡＰ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカイン、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体、抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体、抗Ｃ５抗体、及び抗ＣＤ４０抗体からなる群から選択されるポリペプチド中のトリスルフィド結合レベルを減少させるための方法であって、（ａ）細胞培養培地中でポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を培養することであって、細胞培養培地が、以下の構成成分、ｉ）約２μＭ～約３５μＭの鉄、及びｉｉ）約０～約４．５ｍＭのメチオニンのうちの１つ以上を含む、培養することと、（ｂ）ポリペプチドを産生することと、（ｃ）宿主細胞によって産生されるポリペプチドを収集することとを含む、方法もまた提供される。

【0010】

上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、本方法は、少なくとも１つの供給物を更に含み、供給物培地は、以下、鉄、リボフラビン、ピリドキシン、ピリドキサール、葉酸、及びシアノコバラミンのうちの１つ以上を欠く。上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、供給物は、バッチ供給物である。上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、バッチ供給物培地は、シスチンを欠く。上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、バッチ供給物培地は、システインを欠く。上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、バッチ供給物培地は、メチオニンを欠く。上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、鉄は、三価鉄（Ｆｅ^３＋）または二価鉄（Ｆｅ^２＋）である。

【0011】

上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、本方法は、（Ｉ）収集前に、宿主細胞の培養物にキレート剤及び還元剤を補充すること、（ＩＩ）宿主細胞の収集前細胞培養流体（ＰＨＣＣＦ）にキレート剤及び還元剤を補充すること、または（ＩＩＩ）収集後に、宿主細胞の収集された細胞培養流体（ＨＣＣＦ）にキレート剤及び還元剤を補充することを更に含む。

【0012】

宿主細胞によって産生されるポリペプチド中のトリスルフィド結合のレベルを減少させるための方法であって、（ｉ）収集前に、宿主細胞の培養物に還元剤及びキレート剤を補充すること、（ｉｉ）宿主細胞の収集前細胞培養流体（ＰＨＣＣＦ）にキレート剤及び還元剤を補充すること、または（ｉｉｉ）宿主細胞の収集された細胞培養流体（ＨＣＣＦ）に還元剤及びキレート剤を補充することを含む、方法もまた提供される。

【0013】

上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、還元剤が補充される前に、宿主細胞の培養物、ＰＨＣＣＦ、またはＨＣＣＦにキレート剤が補充される。上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、還元剤が補充される約６０分～約３０分前に、宿主細胞の培養物、ＰＨＣＣＦ、またはＨＣＣＦにキレート剤が補充される。上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、キレート剤及び還元剤は、宿主細胞の培養物、ＰＨＣＣＦ、またはＨＣＣＦ中で約３０分間～約４日間維持される。上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、宿主細胞の培養物、ＰＨＣＣＦ、またはＨＣＣＦは、約１５℃～約３７℃の温度で維持される。上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、宿主細胞の培養物、ＰＨＣＣＦ、またはＨＣＣＦは、約６．５～約７．５のｐＨで維持される。上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、宿主細胞の培養物、ＰＨＣＣＦ、またはＨＣＣＦ中の溶解酸素（ＤＯ）の量は、少なくとも約１５％である。上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、宿主細胞の培養物、ＰＨＣＣＦ、またはＨＣＣＦは、約１５℃～約３７℃の温度及び約６．５～約７．５のｐＨで維持され、宿主細胞の培養物またはＨＣＣＦ中の溶解酸素（ＤＯ）の量は、少なくとも約１５％である。

【0014】

上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、還元剤は、グルタチオン（ＧＳＨ）、Ｌ－グルタチオン（Ｌ－ＧＳＨ）、システイン、Ｌ－システイン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、２，３－ｔｅｒｔ－ブチル－４－ヒドロキシアニソール、２，６－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－４－メチルフェノール、３－アミノプロパン－１－スルホン酸、アデノシルホモシステイン、アンセリン、Ｂ－アラニン、Ｂ－カロチン、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、カルノシン、カルベジロール、クルクミン、システアミン、システアミン塩酸塩、デキサメタゾン、ジアリルジスルフィド、ＤＬ－ランチオニン、ＤＬ－チオルファン、エトキシキン、没食子酸、ゲンチジン酸ナトリウム塩水和物、グルタチオンジスルフィド、グルタチオン還元エチルエステル、グリシン、ヒドロコルチゾン、ヒポタウリン、イセチオン酸アンモニウム塩、Ｌ－システイン－グルタチオンジスルフィド、Ｌ－システインスルフィン酸一水和物、リポ酸、還元リポ酸、メルカプトプロピオニルグリシン、メチオニン、メチレンビス（３－チオプロピオン酸）、シュウ酸、クエルシトリン水和物、レスベラトロール、レチノイン酸、Ｓ－カルボキシメチル－Ｌ－システイン、セレン、セレノメチオニン、ジエチルジチオカルバミン酸銀、タウリン、チオ乳酸、トリシン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ４、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、及びビタミンＢ１１からなる群から選択される。上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、還元剤は、システイン及びＬ－システインからなる群から選択される。上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、還元剤は、Ｌ－システインであり、Ｌ－システインは、宿主細胞の培養物またはＨＣＣＦに添加されて、約３ｍＭ～約６ｍＭの最終濃度が達成される。

【0015】

上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－ジコハク酸（ＥＤＤＳ）、クエン酸塩、シュウ酸塩、酒石酸塩、エチレン－ビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、５－スルホサリチル酸、Ｎ，Ｎ－ジメチルドデシルアミンＮ－オキシド、ジチオオキサミド、エチレンジアミン、サリチルアルドキシム、Ｎ－（２’－ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（ＨＩＭＤＡ）、オキシンキノリノール、及びスルホキシンからなる群から選択される。上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－ジコハク酸（ＥＤＤＳ）、及びクエン酸塩からなる群から選択される。上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、キレート剤は、宿主細胞の培養物またはＨＣＣＦに添加されて、２０ｍＭの最終濃度が達成される。

【0016】

上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、細胞培養培地へと分泌される。上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、本方法は、収集されたポリペプチドを精製するステップを更に含む。上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、宿主細胞は、組み換え宿主細胞である。上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞である。上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、本方法は、ポリペプチド中のトリスルフィド結合のレベルを測定することを更に含む。上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、ポリペプチド中の平均トリスルフィド結合％は、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、約０．５％未満、または約０．１％未満である。

【0017】

上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、抗体またはその断片である。上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、抗体断片であり、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）_２、ｄＡｂ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、線状抗体、一本鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体からなる群から選択される。上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、抗体またはその断片は、ＢＭＰＲ１Ｂ、Ｅ１６、ＳＴＥＡＰ１、０７７２Ｐ、ＭＰＦ、Ｎａｐｉ３ｂ、Ｓｅｍａ ５ｂ、ＰＳＣＡ ｈｌｇ、ＥＴＢＲ、ＭＳＧ７８３、ＳＴＥＡＰ２、ＴｒｐＭ４、Ｃ５、ＣＲＩＰＴＯ、ＣＤ２１、ＣＤ７９ｂ、ＦｃＲＨ２、ＨＥＲ２、ＮＣＡ、ＭＤＰ、ＩＬ２０Ｒα、ブレビカン、ＥｐｈＢ２Ｒ、ＡＳＬＧ６５９、ＰＳＣＡ、ＧＥＤＡ、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＸＣＲ５、ＨＬＡ－ＤＯＢ、Ｐ２Ｘ５、ＣＤ７２、ＬＹ６４、ＦｃＲＨ１、ＩＲＴＡ２、ＴＥＮＢ２、ＰＭＥＬ１７、ＴＭＥＦＦ１、ＧＤＮＦ－Ｒａ１、Ｌｙ６Ｅ、ＴＭＥＭ４６、Ｌｙ６Ｇ６Ｄ、ＬＧＲ５、ＲＥＴ、ＬＹ６Ｋ、ＧＰＲ１９、ＧＰＲ５４、ＡＳＰＨＤ１、チロシナーゼ、ＴＭＥＭ１１８、ＧＰＲ１７２Ａ、ＣＤ３３、ＣＬＬ－１、ＯＸ４０、α４β７及びαＥβ７インテグリンヘテロ二量体、ＩＬ－１３、ＣＤ－２０、ＦＧＦＲ、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、アミロイドベータ、ＨＥＲ３、補体因子Ｄ、ＩＬ－２２ｃ、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＤ－１、ＶＥＧＦ、アンジオポエチン２、ＣＤ３、ＦＡＰ、ＣＥＡ、ならびにＩＬ－６からなる群から選択される抗原に結合する。上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、抗体であり、抗体は、二重特異性抗体である。上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、二重特異性抗体は、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、または抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体である。上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、免疫サイトカインである。上記の実施形態のいずれかに従う（か、または適用される）ある特定の実施形態において、免疫サイトカインは、ＣＥＡ－ＩＬ２ｖまたはＦＡＰ－ＩＬ２ｖである。

【0018】

ＣＥＡ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカイン、ＦＡＰ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカイン、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体、抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体、抗Ｃ５抗体、及び抗ＣＤ４０抗体からなる群から選択されるポリペプチド中のトリスルフィド結合レベルを減少させるための、細胞培養培地中の約０～約４．５μＭのメチオニンの使用もまた提供される。

【0019】

本明細書に記載される様々な実施形態の特性のうちの１つ、いくつか、または全てが組み合わされて、本発明の他の実施形態を形成することができることを理解されたい。本発明のこれら及び他の態様は、当業者に明らかとなるだろう。

【0020】

本明細書で引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願の全体が、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】培地１＋システイン（Ｃｙｓ）、培地１＋Ｃｙｓ＋Ｆｅ（鉄）、培地１＋シスチン（Ｃｙｓ－Ｃｙｓ）、培地１＋Ｃｙｓ－Ｃｙｓ＋Ｆｅ、培地２＋Ｃｙｓ、培地２＋Ｃｙｓ＋Ｆｅ、培地２＋Ｃｙｓ－Ｃｙｓ、または培地１＋Ｃｙｓ－Ｃｙｓ＋Ｆｅを含有する無細胞系中でインキュベートした、抗ＦｌｕＢ中のトリスルフィド結合％を評価するために実行した実験の結果を提供する。

【図2A】以下の構成成分、（ａ）Ｃｙｓ－Ｃｙｓ、（ｂ）Ｆｅ、ならびに（ｃ）Ｂビタミン（リボフラビン、ピリドキシン、葉酸、及びシアノコバラミン）のうちの１つ以上を補充した培地１中でインキュベートした、抗ＦｌｕＢ中のトリスルフィド結合％を評価するために実行した実験の結果を提供する。

【図2B】以下の構成成分、（ａ）Ｃｙｓ－Ｃｙｓ、（ｂ）Ｆｅ、ならびに（ｃ）Ｂビタミン（リボフラビン、ピリドキシン、葉酸、及びシアノコバラミン）のうちの１つ以上を補充した培地１中でインキュベートした、抗ＯＸ４０抗体中のトリスルフィド結合％を評価するために実行した実験の結果を提供する。

【図3】ＣＨＯ細胞培養物によって産生される抗ＯＸ４０抗体中のトリスルフィド結合レベルに対する、添加Ｃｙｓまたは添加Ｃｙｓ－Ｃｙｓの効果を評価するために実行した実験の結果を提供する。

【図4A】ＣＨＯ細胞培養物によって産生される抗ＯＸ４０抗体中のトリスルフィド結合レベルに対する、基本培地中の異なる濃度のＣｙｓの効果を評価するために実行した実験の結果を提供する。

【図4B】図４Ａに描写される各細胞培養実行によって産生される抗ＯＸ４０抗体の収率を提供する。

【図5A】ＣＨＯ細胞培養物によって産生される抗ＯＸ４０抗体中のトリスルフィド結合レベルに対する、基本培地中の異なる濃度のＣｙｓ及びＦｅならびにバッチ供給物培地中の異なる濃度のＢビタミンを提供する効果を評価するために実行した実験の結果を提供する。

【図5B】図５Ａに描写される各細胞培養実行によって産生される抗ＯＸ４０抗体の収率を提供する。

【図5C】５Ａにおける各細胞培養実行の終了時の培地中のシスチン（Ｃｙｓ－Ｃｙｓ）の残基濃度を示す。

【図6】ＣＨＯ細胞培養物によって産生される抗ＯＸ４０抗体中のトリスルフィド結合レベルに対する、基本培地中の異なる濃度のＦｅ及びバッチ供給物培地中のＢビタミンの効果を評価するために実行した実験の結果を提供する。

【図7A】抗体中のトリスルフィド結合レベルに対する、抗ＯＸ４０抗体の収集された細胞培養流体へシステインまたはシステイン＋ＥＤＴＡを添加することの効果を評価するために実行した実験の結果を提供する。

【図7B】図７Ａで試験した各々の条件下で維持した抗ＯＸ４０抗体中のジスルフィド結合低下の量を評価する、図７Ａに記載される実験のＣＥ－ＳＤＳ結果を示す。

【図8A】抗体中のトリスルフィド結合レベルに対する、抗ＯＸ４０抗体の細胞培養流体へシステイン、システイン＋ＥＤＴＡ、システイン＋ＮＴＡ、システイン＋ＥＤＤＳまたはシステイン＋クエン酸塩を添加することの、添加の０～５時間後の効果を評価するために実行した実験の結果を提供する。

【図8B】抗体中のトリスルフィド結合レベルに対する、抗ＯＸ４０抗体の細胞培養流体へシステイン、システイン＋ＥＤＴＡ、システイン＋ＮＴＡ、システイン＋ＥＤＤＳまたはシステイン＋クエン酸塩を添加することの、添加の０～９６時間後の効果を評価するために実行した実験の結果を提供する。

【図9】細胞培養中の抗ＯＸ４０抗体中のトリスルフィド結合形成に対する、ヒポタウリンの効果を評価するために実行した実験の結果を提供する。

【図10】トリスルフィド結合低下に対するメチオニン濃度低下の有意な影響を示す、予測プロファイラを提供する。

【図11】ＣＨＯ細胞培養物によって産生される二重特異性抗体中のトリスルフィド結合レベルに対する、基本培地中に異なる濃度のシステイン及びメチオニンを供給することの効果を評価するために実行した実験の結果を提供する。

【図12】ＣＨＯ細胞培養物によって産生される抗体中のトリスルフィドレベルに対する、バッチ供給物培地からのＢビタミン省略の効果を評価するために実行した実験の結果を提供する。２つの別個の実行を行った。

【発明を実施するための形態】

【0022】

本発明は、細胞培養物中で産生されるポリペプチド（抗体及び二重特異性抗体など）中のトリスルフィド結合を防止する、排除する、かつ／またはそのレベルを減少させる方法に関する。ある特定の態様において、本明細書に提供される方法は、ポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を基本培地と接触させることであって、基本培地が、以下の構成成分、ｉ）約２μＭ～約３５μＭの鉄、ｉｉ）約０．１１μＭ～約２μＭのリボフラビン（ビタミンＢ２）、ｉｉｉ）約４．５μＭ～約８０μＭのピリドキシンまたはピリドキサール（ビタミンＢ６）、ｉｖ）約３．４μＭ～約２３μＭの葉酸塩／葉酸（ビタミンＢ９）、ｖ）約０．２μＭ～約２．５μＭのシアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、ｖｉ）約９ｍＭ～約１０ｍＭのヒポタウリン、及びｖｉｉ）約０～約１．５８ｍＭのメチオニンのうちの１つ以上を含む、接触させることと、宿主細胞を培養して、ポリペプチドを産生することと、宿主細胞によって産生されるポリペプチドを収集することとを含み、それによりポリペプチド中のトリスルフィド結合のレベルを減少させる。

【0023】

関連する一態様において、ＣＥＡ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカイン、ＦＡＰ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカイン、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体、抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体、抗Ｃ５抗体、及び抗ＣＤ４０抗体からなる群から選択されるポリペプチド中のトリスルフィド結合レベルを減少させるための方法であって、細胞培養培地中でポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を培養することであって、細胞培養培地が、以下、ｉ）約２μＭ～約３５μＭの鉄、ｉｉ）約０．１１μＭ～約２μＭのリボフラビン（ビタミンＢ２）、ｉｉｉ）約４．５μＭ～約８０μＭのピリドキシンまたはピリドキサール（ビタミンＢ６）、ｉｖ）約３．４μＭ～約２３μＭの葉酸塩／葉酸（ビタミンＢ９）、ｖ）約０．２μＭ～約２．５μＭのシアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、ｖｉ）約９ｍＭ～約１０ｍＭのヒポタウリン、及びｖｉｉ）約０～約１．５８ｍＭのメチオニンのうちの１つ以上を含む、培養することと、ポリペプチドを産生することと、宿主細胞によって産生されるポリペプチドを収集することとを含み、それによりポリペプチド中のトリスルフィド結合のレベルを減少させる、方法が提供される。

【0024】

加えて、またはあるいは、本方法は、該宿主細胞の培養物もしくは細胞培養流体、該宿主細胞の収集前細胞培養流体（ＰＨＣＣＦ）、または該宿主細胞の収集された細胞培養流体（ＨＣＣＦ）にキレート剤及び還元剤を補充することを含む。

【0025】

以下の説明は、例示的な方法及びパラメータなどを明記する。しかしながら、そのような説明は本開示の範囲に対する制限としては意図されず、代わりに例示的な実施形態の説明として提供されることを認識されたい。

【0026】

一般的な技術
本明細書に記載または参照される技術及び手順は一般に、当業者によって十分に理解され、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，（２００３））、ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、及びＴｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．，Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）などに記載されている、広く利用される手法などの従来の手法を使用して一般的に用いられている。

【0027】

Ａ．定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その」は、別段内容が明確に指示しない限り、複数の参照対象を含む。したがって、例えば、「１つの分子」への言及は、２つ以上のそのような分子の組み合わせを任意で含むといった具合である。

【0028】

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当業者にとって容易に既知であるそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（かつ説明する）。

【0029】

本明細書に記載される本発明の態様及び実施形態が、態様及び実施形態「を含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」を含むことが理解される。

【0030】

「培地」及び「細胞培養培地」という用語は、細胞の成長または維持に使用される栄養源を指す。当業者によって理解されるように、栄養源は、細胞によって成長及び／または生存及び／または産物生成に必要とされる構成成分を含有しても、細胞成長及び／または生存及び／または産物生成を助ける構成成分を含有してもよい。ビタミン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、微量元素、及び界面活性剤（例えば、ポロキサマー）が、培地構成成分の例である。

【0031】

例えば、「既知組成の細胞培養培地」または「ＣＤＭ」は、動物血清及びペプトンなどの動物由来産物を含まない、明記された組成物を有する培地を指す。この用語はまた、未定義または部分定義の構成成分、例えば、動物血清、動物ペプトン（加水分解物）、植物ペプトン（加水分解物）、及び酵母ペプトン（加水分解物）などの構成成分を含まない、明記された組成物を有する培地も包含する。当業者によって理解されるように、ＣＤＭは、細胞がＣＤＭと接触し、ＣＤＭにポリペプチドを分泌するポリペプチド産生のプロセスにおいて使用され得る。したがって、組成物は、ＣＤＭ及びポリペプチド産物を含有し得ること、ならびにポリペプチド産物の存在はＣＤＭを未知組成にはしないことが理解される。

【0032】

「未知組成の細胞培養培地」は、化学組成を明記することができず、１つ以上の動物由来産物（血清及びペプトンなど）を含有し得る培地を指す。当業者によって理解されるように、未知組成の細胞培養培地は、栄養源として動物由来産物を含有し得る。この用語はまた、未定義または部分定義の構成成分、例えば、動物血清、動物ペプトン（加水分解物）、植物ペプトン（加水分解物）、または酵母ペプトン（加水分解物）などの構成成分を含む細胞培養培地も包含する。

【0033】

本明細書で使用される場合、「基本培地」は、培養プロセスの開始時に培養容器に供給される細胞培養栄養素を含有する細胞培養培地を指す。基本培地は、細胞培養周期前に細胞が植え付けられる培地であり得る。基本細胞培養培地は、バッチまたは流加細胞培養のために細胞培養周期前に供給され得る。基本細胞培養培地はまた、培養（すなわち、流加細胞培養）の終了前の期間細胞及び／または産物収集ありまたはなしで、培養プロセス中に、連続的にまたは間歇的な増分で細胞培養物に供給物培地としても供給され得る。

【0034】

本明細書で使用される場合、「供給物培地」は、培養（すなわち、流加細胞培養）の終了前の期間細胞及び／または産物収集ありまたはなしで、培養プロセス中に、細胞培養物に連続的にまたは間歇的な増分で培養容器に供給物培地として供給される細胞培養栄養素を含有する細胞培養培地を指す。

【0035】

細胞「を培養すること」は、細胞の生存及び／または成長及び／または増殖に好適な条件下で、細胞を細胞培養培地と接触させることを指す。

【0036】

「バッチ培養物」は、細胞培養のための全ての構成成分（細胞ならびに全ての栄養素及び構成成分を含む）が、培養プロセスの開始時に培養容器に供給される培養物を指す。

【0037】

「灌流培養物」は、例えば、濾過、カプセル化、微粒子担体へのアンカーなどによって細胞が培養物中に拘束され、培養培地が連続的または断続的に培養容器に導入され、そこから除去される培養物である。

【0038】

本明細書で使用される場合、「流加細胞培養物」という語句は、細胞及び培養培地が最初に培養容器に供給され、培養の終了前の周期細胞及び／または産物収集ありまたはなしで、培養プロセス中に、追加の培養物栄養素が連続的にまたは間歇的な増分で培養物に供給されるバッチ培養物を指す。

【0039】

「培養容器」は、細胞を培養するために使用される容器を指す。培養容器は、それが細胞の培養に有用である限り、任意のサイズのものであり得る。

【0040】

「微量金属」という用語は、成長、生存、及び／または産物生成のために、細胞によって少量で必要とされる金属を指す。本明細書の定義に包含される微量金属の例としては、鉄（二価鉄（Ｆｅ（ＩＩ）もしくはＦｅ^２＋とも称される）及び三価鉄（Ｆｅ（ＩＩＩ）もしくはＦｅ^３＋とも称される）を含む）、マグネシウム、リチウム、ケイ素、亜鉛、銅、クロム、ニッケル、コバルト、マンガン、アルミニウム、バナジウム、セレン、錫、カドミウム、モリブデン、ならびにチタンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0041】

「酸化防止剤」という用語は、他の分子の酸化速度を減速させる分子を指す。本明細書の定義に包含される酸化防止剤の例としては、２，３－ｔｅｒｔ－ブチル－４－ヒドロキシアニソール、２，６－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－４－メチルフェノール、３－アミノプロパン－１－スルホン酸、アデノシルホモシステイン、アンセリン、Ｂ－アラニン、Ｂ－カロチン、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、カルノシン、カルベジロール、クルクミン、システアミン、システアミン塩酸塩、システイン、デキサメタゾン、ジアリルジスルフィド、ＤＬ－ランチオニン、ＤＬ－チオルファン、エトキシキン、没食子酸、ゲンチジン酸ナトリウム塩水和物、グルタチオン（ＧＳＨ）、グルタチオンジスルフィド、グルタチオン還元エチルエステル、グリシン、ヒドロコルチゾン、ヒポタウリン、イセチオン酸アンモニウム塩、Ｌ－システイン－グルタチオンジスルフィド、Ｌ－システインスルフィン酸一水和物、リポ酸、還元リポ酸、メルカプトプロピオニルグリシン、メチオニン、メチレンビス（３－チオプロピオン酸）、シュウ酸、クェルセトリン（Ｑｕｅｒｃｅｔｒｉｎ）水和物、レスベラトロール、レチノイン酸、Ｓ－カルボキシメチル－Ｌ－システイン、セレン、セレノメチオニン、ジエチルジチオカルバミン酸銀、タウリン、チオ乳酸、トリシン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ４、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、及びビタミンＢ１１が挙げられるが、これらに限定されない。

【0042】

「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、及び／またはそれらの類似体、あるいはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによって、または合成反応によってポリマーに組み込むことができる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体などの修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立て前または後に付与され得る。

【0043】

「単離された核酸」は、その通常の文脈外であるか、またはそこから分離された、天然に存在しない配列、組み換え配列、または天然に存在する配列を意味し、包含する。単離された核酸分子は、それが自然界で見出される形態または設定以外である。したがって、単離された核酸分子は、天然細胞内に存在する核酸分子とは区別される。しかしながら、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞の染色体位置とは異なる染色体位置にあるタンパク質を通常発現する細胞内に含有される核酸分子を含む。

【0044】

「単離された」タンパク質（例えば、単離された抗体）は、その天然環境の構成成分から特定及び分離され、かつ／または回収された抗体である。その天然環境の混入構成成分は、そのタンパク質の研究的、診断的、または治療的使用と干渉する物質であり、それらには、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が含まれ得る。単離されたタンパク質は、組み換え細胞内にインサイチュでタンパク質を含むが、これは、そのタンパク質の天然環境の少なくとも１つの構成成分が存在しないためである。しかしながら、通常、単離されたタンパク質は、少なくとも１つの精製ステップによって調製されるだろう。

【0045】

「精製された」タンパク質（例えば、抗体）は、タンパク質の純度が増加しているために、それが、その天然環境において存在するよりも、ならびに／または研究室条件下で最初に産生及び／もしくは合成及び／もしくは増幅されたときよりも純粋な形態で存在していることを意味する。純度は、相対的な用語であり、必ずしも絶対純度を意味しない。

【0046】

「混入物」は、所望されるタンパク質産物とは異なる（例えば、抗体産物とは異なる）物質を指す。混入物としては、ＣＨＯＰなどの宿主細胞物質；核酸；所望されるタンパク質のバリアント、断片、凝集体、または誘導体；別のポリペプチド；エンドトキシン；ウイルス混入物；細胞培養培地構成成分などを挙げることができるが、これらに限定されない。

【0047】

「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。ポリマーは、直鎖状であっても分岐状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、かつ非アミノ酸によって中断されていてもよい。これらの用語はまた、天然修飾されているか、あるいは介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは修飾（標識構成成分とのコンジュゲーションなど）によって修飾されているアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸などを含む）の１つ以上の類似体、及び当該技術分野において既知である他の修飾を含有するポリペプチドもまた、この定義に含まれる。本明細書の定義に包含されるポリペプチドの例としては、哺乳動物タンパク質（例えば、レニンなど）、成長ホルモン（ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含む）、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、リポタンパク質、アルファ－１－アンチトリプシン、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、卵胞刺激ホルモン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、グルカゴン、凝固因子（因子ＶＩＩＩＣ、因子ＩＸ、組織因子、及びフォンウィルブランド因子など）、抗凝固因子（タンパク質Ｃなど）、心房性ナトリウム利尿因子、肺表面活性剤、プラスミノーゲン活性化因子（ウロキナーゼまたはヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ）など）、ボンベシン、トロンビン、造血成長因子、腫瘍壊死因子－アルファ及び－ベータ、エンケファリナーゼ、ＲＡＮＴＥＳ（活性化時に制御され、通常Ｔ細胞が発現及び分泌している）、ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ－１－アルファ）、血清アルブミン（ヒト血清アルブミンなど）、ミュラー管抑制因子、リラキシンＡ鎖、リラキシンＢ鎖、プロリラキシン、マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド、微生物タンパク質（ベータ－ラクタマーゼなど）、デオキシリボヌクレアーゼ、ＩｇＥ、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）（ＣＴＬＡ－４など）、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ホルモンまたは成長因子の受容体、タンパク質ＡまたはＤ、リウマトイド因子、神経栄養因子（骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン－３、－４、－５、もしくは－６（ＮＴ－３、ＮＴ－４、ＮＴ－５、もしくはＮＴ－６）、または神経成長因子（ＮＧＦ－ｂなど）など）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ及びｂＦＧＦなど）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ）（ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＴＧＦ－β４、またはＴＧＦ－β５を含む、ＴＧＦ－アルファ及びＴＧＦ－ベータなど）、インスリン様成長因子－Ｉ及び－ＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩ）、ｄｅｓ（１－３）－ＩＧＦ－Ｉ（脳ＩＧＦ－Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）、ＣＤタンパク質（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、及びＣＤ２０など）、エリスロポエチン、骨誘導因子、免疫毒素、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、インターフェロン（インターフェロン－アルファ、－ベータ、及び－ガンマなど）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（例えば、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＧ－ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ－１～ＩＬ－１０）、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｔ細胞受容体、表面膜タンパク質、崩壊促進因子、ウイルス抗原（例えば、ＡＩＤＳ外被の一部分など）、輸送タンパク質、ホーミング受容体、アドレシン、制御タンパク質、インテグリン（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ－４、及びＶＣＡＭなど）、腫瘍関連抗原（０７７２Ｐ（ＣＡ１２５、ＭＵＣ１６）（すなわち、卵巣癌抗原）、またはＨＥＲ２、ＨＥＲ３、もしくはＨＥＲ４受容体など）、イムノアドヘシン、ならびに上記に列挙されるタンパク質のいずれかの断片及び／またはバリアント、ならびに例えば、上記に列挙されるタンパク質のいずれかを含むタンパク質に結合する抗体（抗体断片を含む）が挙げられる。

【0048】

本明細書で使用される場合、「力価」という用語は、細胞培養物によって産生される、発現されたタンパク質産物の総量を、所与の量の培地体積で除したものを指す。力価は、異なる培養条件下でタンパク質産物を得た場合との比較での、力価の増加パーセンテージなどの相対的測定に関して表すか、または評価することができる。

【0049】

本明細書における「抗体」という用語は、最も広義に使用され、具体的には、それらが所望の生物学的活性を呈する限り、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を網羅する。抗体は、ヒト、ヒト化、及び／または親和性成熟であり得る。

【0050】

「完全長抗体」、「無傷抗体」、及び「全抗体」という用語は、以下に定義される抗体断片ではなく、その実質的に無傷な形態にある抗体を指すために、本明細書において互換的に使用される。これらの用語は、具体的には、Ｆｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。

【0051】

「抗体断片」は、好ましくはその抗原結合領域を含む、無傷抗体の一部分を含む（「抗原結合断片」という用語が互換的に使用され得る）。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、及びＦｖ断片、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。

【0052】

抗体のパパイン消化は、各々が単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片、及び容易に結晶化する能力を反映する名称を持つ残基「Ｆｃ」断片を産生する。ペプシン処理は、Ｆ（ａｂ’）_２断片をもたらし、これは、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋することができる。Ｆａｂ断片は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含有し、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）もまた含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域に由来する１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端への数個の残基の付加によって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を持つＦａｂ’の本明細書における表記である。Ｆ（ａｂ’）_２抗体断片は元々、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生されたものであった。抗体断片の他の化学共役もまた、既知である。

【0053】

「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含有する最小の抗体断片である。一実施形態において、二本鎖Ｆｖ種は、密接な非共有結合的会合にある１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種において、１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖及び重鎖が二本鎖Ｆｖ種における構造に類似した「二量体」構造で会合し得るように、柔軟性ペプチドリンカーによって共有結合的に連結され得る。各可変ドメインの３つのＨＶＲが相互作用して、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を定義するのは、この立体配置においてである。集合的に、６つのＨＶＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、全結合部位よりも低い親和性ではあるが、単一可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）でさえも、抗原を認識し、それに結合する能力を有する。

【0054】

「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖内に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを更に含み、これにより、ｓｃＦｖが抗原結合に所望される構造を形成することが可能になる。ｓｃＦｖに関する概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５，１９９４を参照されたい。

【0055】

「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に同種の抗体集団から得られる抗体を指し、例えば、その集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る可能な変異、例えば、天然に存在する変異を除いて同一である。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。ある特定の実施形態において、そのようなモノクローナル抗体は典型的には、標的と結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含むプロセスによって得られたものである。例えば、選択プロセスは、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、または組み換えＤＮＡクローンのプールなどの複数のクローンから特有のクローンを選択することであり得る。選択された標的結合配列が、例えば、標的への親和性の改善、標的結合配列のヒト化、細胞培養物中でのその産生の改善、インビボでのその免疫原性の低下、多重特異性抗体の作製などを行うように更に改変されてもよく、改変された標的結合配列を含む抗体もまた、本発明のモノクローナル抗体であることを理解されたい。異なる決定基（エピトープ）に対して指向された異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、それらには典型的に他の免疫グロブリンが混入していないという点で有利である。

【0056】

「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、いかなる特定の方法による抗体の産生も必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５－９７（１９７５）、Ｈｏｎｇｏ ｅｔ ａｌ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１４（３）：２５３－２６０（１９９５）、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３－６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１））、組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）、ファージ提示技術（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７（１９９２）、Ｓｉｄｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９－３１０（２００４）、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３－１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１（３４）：１２４６７－１２４７２（２００４）、及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８４（１－２）：１１９－１３２（２００４）を参照されたい）、ならびにヒト免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子座または遺伝子の一部または全部を有するヒトまたはヒト様抗体を動物において産生するための技術（例えば、ＷＯ１９９８／２４８９３、ＷＯ１９９６／３４０９６、ＷＯ１９９６／３３７３５、ＷＯ１９９１／１０７４１、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：２５５１（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３６２：２５５－２５８（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）、米国特許第５，５４５，８０７号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、及び同第５，６６１，０１６号、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：７７９－７８３（１９９２）、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３６８：８５６－８５９（１９９４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ３６８：８１２－８１３（１９９４）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５－８５１（１９９６）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８２６（１９９６）、ならびにＬｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５－９３（１９９５）を参照されたい）を含む様々な技術によって作製され得る。

【0057】

「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される、かつ／または本明細書に開示されるヒト抗体を作製するための技術のいずれかを使用して作製される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。ヒト抗体は、ファージ提示ライブラリを含む当該技術分野において既知である様々な技術を使用して産生され得る。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）。Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）、Ｂｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６－９５（１９９１）に記載の方法もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である。ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５：３６８－７４（２００１）も参照されたい。ヒト抗体は、抗原曝露に応答してそのような抗体を産生するように修飾されているが、その内因性遺伝子座が無効化されているトランスジェニック動物、例えば、免疫化異種マウスに抗原を投与することによって調製され得る（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術に関する、米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号を参照されたい）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体に関しては、例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７－３５６２（２００６）も参照されたい。

【0058】

本明細書で使用される場合、「超可変領域」、「ＨＶＲ」、または「ＨＶ」という用語は、配列が超可変性である、かつ／または構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は、６つのＨＶＲを含み、３つがＶＨにあり（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、３つがＶＬにある（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）。天然抗体において、Ｈ３及びＬ３は、これらの６つのＨＶＲのうちで最も高い多様性を提示し、特にＨ３が、抗体に優れた特異性を与える上で特有の役割を果たすと考えられている。例えば、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１３：３７－４５（２０００）、Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｗｕ，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ２４８：１－２５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３）を参照されたい。実際には、重鎖のみからなる天然に存在するラクダ科抗体は、軽鎖の不在下で機能的であり、安定している。例えば、Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３６３：４４６－４４８（１９９３）、Ｓｈｅｒｉｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：７３３－７３６（１９９６）を参照されたい。

【0059】

いくつかのＨＶＲの描写が本明細書で使用されており、本明細書に包含される。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列可変性に基づくものであり、最も一般的に使用されている（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。代わりに、Ｃｈｏｔｈｉａは、構造的ループの位置に言及している（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））。ＡｂＭ ＨＶＲは、Ｋａｂａｔ ＨＶＲとＣｈｏｔｈｉａ構造的ループとの間の折衷案を表し、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデル化ソフトウェアによって使用されている。「接触」ＨＶＲは、入手可能な複合体結晶構造の分析に基づく。これらのＨＶＲの各々に由来する残基を、以下に記載する。

【0060】

ＨＶＲは、ＶＬ内の２４～３６または２４～３４（Ｌ１）、４６～５６または５０～５６（Ｌ２）、及び８９～９７または８９～９６（Ｌ３）、ならびにＶＨ内の２６～３５（Ｈ１）、５０～６５、または４９～６５（Ｈ２）、及び９３～１０２、９４～１０２、または９５～１０２（Ｈ３）のような「延長ＨＶＲ」を含み得る。可変ドメイン残基は、これらの定義の各々について、Ｋａｂａｔら（上記参照）に従って番号付けされる。

【0061】

「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書に定義されるＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。

【0062】

「Ｋａｂａｔにあるような可変ドメイン残基番号付け」または「Ｋａｂａｔにあるようなアミノ酸位置番号付け」という用語、及びそれらの変化形は、Ｋａｂａｔら（上記参照）における抗体の集成の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用される番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用すると、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲもしくはＨＶＲの短縮、またはそれへの挿入に対応する、より少ないアミノ酸または追加のアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従う残基５２ａ）を含み得、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔに従う残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔ番号付けは、「標準の」Ｋａｂａｔにより番号付けされた配列との、抗体の配列の相同性領域での整列によって所与の抗体について決定され得る。

【0063】

Ｋａｂａｔ番号付けシステムは一般に、可変ドメイン内の残基（およそ軽鎖の残基１～１０７及び重鎖の残基１～１１３）に言及する場合に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。「ＥＵ番号付けシステム」または「ＥＵ指標」は一般に、免疫グロブリン重鎖定常領域内の残基に言及する場合に使用される（例えば、Ｋａｂａｔら（上記参照）に報告されるＥＵ指標）。「ＫａｂａｔにあるようなＥＵ指標」とは、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。

【0064】

「薬学的製剤」という用語は、活性成分の生物学的活性が有効になるような形態であり、かつ製剤が投与される対象にとって許容できないほど有毒である追加の構成成分を何ら含有しない調製物を指す。そのような製剤は、滅菌である。

【0065】

「薬学的に許容される」担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる投薬量及び濃度でそれに曝露されている細胞または哺乳動物にとって無毒であるものである（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（２０^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ），ｅｄ．Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）。多くの場合、生理学的に許容される担体は、ｐＨ緩衝水溶液である。生理学的に許容される担体の例としては、緩衝液（リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸など）、アスコルビン酸を含む酸化防止剤、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなど）、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリジンなど）、単糖類、二糖類、及び他の炭水化物（グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む）、キレート剤（ＥＤＴＡなど）、糖アルコール（マンニトールもしくはソルビトールなど）、塩形成対イオン（ナトリウムなど）、ならびに／または非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）など）が挙げられる。

【0066】

「滅菌」製剤は、無菌であるか、または全ての生存微生物及びそれらの胞子を含まないか、もしくは本質的に含まない。

【0067】

「収集前細胞培養流体」という用語は、細胞培養の終了時、細胞培養後、または細胞収集の直前に存在する流体を指す。収集前細胞培養流体としては、本発明の１つ以上薬剤が任意で添加される細胞培養培地が挙げられるが、これに限定されない。収集前細胞培養流体としては、細胞、細胞の内容物、及び／または細胞細片が除去されていない細胞培養培地が挙げられるが、これに限定されない。細胞培養培地及び／または収集前細胞培養流体は、培養中に細胞によって培地中または溶液中に放出（例えば、分泌）されるタンパク質または抗体を含有し得る。細胞培養流体の条件は、細胞成長のために最適化される一方で、収集前及び収集細胞培養流体は、宿主細胞によって分泌されるポリペプチド（組み換えポリペプチド、例えば、抗体など）の細胞分離及び精製を最適化するように事前処理され得る。例えば、収集前ステップは、温度を低下させ、ｐＨを変化（通常約５のｐＨもしくは約７未満のｐＨへと低下）させ、凝結させることによる、収集のための培養物の調製を含み得る。細胞培養流体は、収集ステップのために、細胞が培養されている生物反応器から遠心分離機またはフィルターへと直接ポンピングされ得るため、収集前ステップは、任意であり得る。収集前に事前処理が適用されない場合、収集前細胞培養流体及び細胞培養流体は、区別不能である。

【0068】

「収集された細胞培養流体」は、遠心分離または濾過などの方法による、細胞分離プロセス中、及び細胞培養培地からの細胞分離後に存在する流体を指す。収集された細胞培養流体は、典型的には、細胞培養中に細胞によって分泌されるポリペプチド（組み換えポリペプチド、例えば、抗体など）を含む。

【0069】

Ｂ．本発明の細胞培養物及び方法
ポリペプチド中のトリスルフィド結合のレベルを減少させる方法
トリスルフィド結合は、追加の硫黄原子のジスルフィド結合への挿入によって生成され、それにより３つの連続した硫黄原子の共有結合がもたらされる。トリスルフィド結合は、ポリペプチド中のシステイン残基間に形成され得、分子内（すなわち、同じポリペプチド中の２つのシステイン間）または分子間（すなわち、別個のポリペプチド中の２つのシステイン間）に形成され得る。細胞培養中にポリペプチド中のトリスルフィド結合のレベルを減少させるための方法が本明細書に提供される。細胞培養後のプロセシング中にポリペプチド中のトリスルフィド結合のレベルを減少させるための方法もまた本明細書に提供される。本明細書の方法は、ジスルフィド結合含有ポリペプチド（例えば、抗体）の大規模産生（製造規模など）で有利に使用され得る。

【0070】

ある特定の実施形態において、宿主細胞が、例えば、細胞成長及び／またはポリペプチド産生を促進する条件下で、本明細書に記載される細胞培養培地（基本細胞培養培地など）のいずれかと組み合わされる（接触される）。ある特定の実施形態において、「播種材料」という用語は、基本培地に添加するための、種系列に由来する、ある量の宿主細胞を指す。ある特定の実施形態において、播種材料は、追加の構成成分、例えば、種系列培地を含む。ある特定の実施形態において、「初期細胞培養培地」という用語は、接種材料及び基本培地が混合された後の細胞培養培地を指す。ある特定の実施形態において、接種材料及び基本培地は、約１：５、１：４．５、１：４、１：３．５、または１：３のいずれか１つの比率（これらの間の任意の比率を含む）で混合される。ある特定の実施形態において、追加の構成成分は、連続的に、または１つ以上の間歇的な間隔のいずれかで、接種材料及び基本培地が混合されたしばらく後に、培養物に提供される。ある特定の実施形態において、「累積」という用語は、細胞による消費または生成を考慮せずに、細胞培養の開始時に添加される構成成分、及びその後添加される構成成分を含む、細胞培養中に添加される特定の構成成分（複数可）の総量を指す。

【0071】

ある特定の実施形態において、ポリペプチド中のトリスルフィド結合レベルを減少させるための方法であって、ポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を基本培地と接触させることであって、基本培地が、以下の構成成分、
ｉ）約２μＭ～約３５μＭの鉄、
ｉｉ）約０．１１μＭ～約２μＭのリボフラビン（ビタミンＢ２）、
ｉｉｉ）約４．５μＭ～約８０μＭのピリドキシンまたはピリドキサール（ビタミンＢ６）、
ｉｖ）約３．４μＭ～約２３μＭの葉酸塩／葉酸（ビタミンＢ９）、
ｖ）約０．２μＭ～約２．５μＭのシアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、
ｖｉ）約９ｍＭ～約１０ｍＭのヒポタウリン、及び
ｖｉｉ）約０～約１．５８ｍＭのメチオニンのうちの１つ以上を含む、接触させることと、
宿主細胞を培養して、ポリペプチドを産生することと、宿主細胞によって産生されるポリペプチドを収集することとを含み、それによりポリペプチド中のトリスルフィド結合のレベルを減少させる、方法が提供される。ある特定の実施形態において、収集されたポリペプチドは、１つ以上の構成成分の濃度が上に明記される濃度（複数可）と異なることを除いて同一の条件下で産生されるポリペプチドのトリスルフィド結合レベルよりも、少ないトリスルフィド結合レベルを有する。ある特定の実施形態において、収集されたポリペプチド中の平均トリスルフィド結合％は、約２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、または０．１％（トリスルフィドのモル／ポリペプチドのモル）のいずれか１つ未満である。ある特定の実施形態において、収集されたポリペプチド中の平均トリスルフィドは、１つ以上の構成成分の濃度が上に明記される濃度（複数可）と異なることを除いて同一の条件下で産生されるポリペプチドのトリスルフィド結合レベルと比較して、約１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超のいずれか１つだけ低下する。

【0072】

ある特定の実施形態において、ポリペプチドを産生するための方法であって、ポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を基本培地と接触させることであって、基本培地が、以下の構成成分、
ｉ）約２μＭ～約３５μＭの鉄、
ｉｉ）約０．１１μＭ～約２μＭのリボフラビン（ビタミンＢ２）、
ｉｉｉ）約４．５μＭ～約８０μＭのピリドキシンまたはピリドキサール（ビタミンＢ６）、
ｉｖ）約３．４μＭ～約２３μＭの葉酸塩／葉酸（ビタミンＢ９）、
ｖ）約０．２μＭ～約２．５μＭのシアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、
ｖｉ）約９ｍＭ～約１０ｍＭのヒポタウリン、及び
ｖｉｉ）約０～約１．５８ｍＭのメチオニンのうちの１つ以上を含む、接触させることと、
宿主細胞を培養して、ポリペプチドを産生することと、宿主細胞によって産生されるポリペプチドを収集することとを含み、それによりポリペプチド中のトリスルフィド結合のレベルを減少させる、方法が提供される。ある特定の実施形態において、収集されたポリペプチドは、１つ以上の構成成分の濃度が上に明記される濃度（複数可）と異なることを除いて同一の条件下で産生されるポリペプチドのトリスルフィド結合レベルよりも、少ないトリスルフィド結合レベルを有する。ある特定の実施形態において、収集されたポリペプチド中の平均トリスルフィド％は、約２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、または０．１％（トリスルフィドのモル／ポリペプチドのモル）のいずれか１つ未満である。ある特定の実施形態において、収集されたポリペプチド中の平均トリスルフィドは、１つ以上の構成成分の濃度が上に明記される濃度（複数可）と異なることを除いて同一の条件下で産生されるポリペプチドのトリスルフィド結合レベルと比較して、約１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超のいずれか１つだけ低下する。

【0073】

ある特定の実施形態において、ポリペプチド中のトリスルフィド結合レベルを減少させるための方法であって、細胞培養培地中でポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を培養することであって、細胞培養培地が、以下の構成成分、
ｉ）約２μＭ～約３５μＭの鉄、
ｉｉ）約０．１１μＭ～約２μＭのリボフラビン（ビタミンＢ２）、
ｉｉｉ）約４．５μＭ～約８０μＭのピリドキシンまたはピリドキサール（ビタミンＢ６）、
ｉｖ）約３．４μＭ～約２３μＭの葉酸塩／葉酸（ビタミンＢ９）、
ｖ）約０．２μＭ～約２．５μＭのシアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、
ｖｉ）約９ｍＭ～約１０ｍＭのヒポタウリン、及び
ｖｉｉ）約０～約４．５ｍＭのメチオニンのうちの１つ以上を含む、培養することと、
ポリペプチドを産生することと、宿主細胞によって産生されるポリペプチドを収集することとを含む、方法が提供される。ある特定の実施形態において、細胞培養培地中の構成成分のうちの１つ以上の濃度は、植え付け後の１つ以上の添加の累積濃度である。

【0074】

ある特定の実施形態において、ＣＥＡ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカイン、ＦＡＰ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカイン、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体、抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体、抗Ｃ５抗体、及び抗ＣＤ４０抗体からなる群から選択されるポリペプチド中のトリスルフィド結合レベルを減少させるための方法であって、細胞培養培地中でポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を培養することであって、細胞培養培地が、以下の構成成分、
ｉ）約２μＭ～約３５μＭの鉄、
ｉｉ）約０．１１μＭ～約２μＭのリボフラビン（ビタミンＢ２）、
ｉｉｉ）約４．５μＭ～約８０μＭのピリドキシンまたはピリドキサール（ビタミンＢ６）、
ｉｖ）約３．４μＭ～約２３μＭの葉酸塩／葉酸（ビタミンＢ９）、
ｖ）約０．２μＭ～約２．５μＭのシアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、
ｖｉ）約９ｍＭ～約１０ｍＭのヒポタウリン、及び
ｖｉｉ）約０～約４．５ｍＭのメチオニンのうちの１つ以上を含む、培養することと、
ポリペプチドを産生することと、宿主細胞によって産生されるポリペプチドを収集することとを含み、それによりポリペプチド中のトリスルフィド結合のレベルを減少させる、方法が提供される。ある特定の実施形態において、ＣＥＡ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカインは、ＲＧ７８１３である。ある特定の実施形態において、ＦＡＰ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカインは、ＲＧ７４６１である。ある特定の実施形態において、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＲＧ７８０２である。ある特定の実施形態において、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体は、ＲＧ７７１６である。ある特定の実施形態において、抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体は、ＲＧ７２２１である。ある特定の実施形態において、抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体は、ＣＡＳ番号１４４８２２１－０５－３である。ある特定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、ＲＧ７８７６である。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、初期細胞培養培地である。ある特定の実施形態において、収集されたポリペプチドは、１つ以上の構成成分の濃度が上に明記される濃度（複数可）と異なることを除いて同一の条件下で産生されるポリペプチドのトリスルフィド結合レベルよりも、少ないトリスルフィド結合レベルを有する。ある特定の実施形態において、収集されたポリペプチド中の平均トリスルフィド％は、約２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、または０．１％（トリスルフィドのモル／ポリペプチドのモル）のいずれか１つ未満である。ある特定の実施形態において、収集されたポリペプチド中の平均トリスルフィドは、１つ以上の構成成分の濃度が上に明記される濃度（複数可）と異なることを除いて同一の条件下で産生されるポリペプチドのトリスルフィド結合レベルと比較して、約１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超のいずれか１つだけ低下する。

【0075】

ある特定の実施形態において、ＣＥＡ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカイン、ＦＡＰ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカイン、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体、抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体、抗Ｃ５抗体、及び抗ＣＤ４０抗体からなる群から選択されるポリペプチド中のトリスルフィド結合レベルを減少させるための方法であって、細胞培養培地中でポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を培養することであって、細胞培養培地が、以下の構成成分、
ｉ）約２μＭ～約３５μＭの鉄、及び
ｉｉ）約０～約４．５ｍＭのメチオニンのうちの１つ以上を含む、培養することと、
ポリペプチドを産生することと、宿主細胞によって産生されるポリペプチドを収集することとを含み、それによりポリペプチド中のトリスルフィド結合のレベルを減少させる、方法が提供される。ある特定の実施形態において、ＣＥＡ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカインは、ＲＧ７８１３である。ある特定の実施形態において、ＦＡＰ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカインは、ＲＧ７４６１である。ある特定の実施形態において、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＲＧ７８０２である。ある特定の実施形態において、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体は、ＲＧ７７１６である。ある特定の実施形態において、抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体は、ＲＧ７２２１である。ある特定の実施形態において、抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体は、ＣＡＳ番号１４４８２２１－０５－３である。ある特定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、ＲＧ７８７６である。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、初期細胞培養培地である。ある特定の実施形態において、収集されたポリペプチドは、１つ以上の構成成分の濃度が上に明記される濃度（複数可）と異なることを除いて同一の条件下で産生されるポリペプチドのトリスルフィド結合レベルよりも、少ないトリスルフィド結合レベルを有する。ある特定の実施形態において、収集されたポリペプチド中の平均トリスルフィド％は、約２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、または０．１％（トリスルフィドのモル／ポリペプチドのモル）のいずれか１つ未満である。ある特定の実施形態において、収集されたポリペプチド中の平均トリスルフィドは、１つ以上の構成成分の濃度が上に明記される濃度（複数可）と異なることを除いて同一の条件下で産生されるポリペプチドのトリスルフィド結合レベルと比較して、約１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超のいずれか１つだけ低下する。

【0076】

ある特定の実施形態において、ＣＥＡ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカイン、ＦＡＰ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカイン、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体、抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体、抗Ｃ５抗体、及び抗ＣＤ４０抗体からなる群から選択されるポリペプチド中のトリスルフィド結合レベルを減少させるための、細胞培養培地中の約０～約４．５μＭのメチオニンの使用が提供される。ある特定の実施形態において、ＣＥＡ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカインは、ＲＧ７８１３である。ある特定の実施形態において、ＦＡＰ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカインは、ＲＧ７４６１である。ある特定の実施形態において、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＲＧ７８０２である。ある特定の実施形態において、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体は、ＲＧ７７１６である。ある特定の実施形態において、抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体は、ＲＧ７２２１である。ある特定の実施形態において、抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体は、ＣＡＳ番号１４４８２２１－０５－３である。ある特定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、ＲＧ７８７６である。

【0077】

ある特定の実施形態において、基本培地は、約５μＭ～約３０μＭ、約１０μＭ～約２５μＭ、または約１５μＭ～約２０μＭのいずれか１つの間（これらの値間の任意の範囲を含む）の鉄を含む。ある特定の実施形態において、基本培地は、約２μＭ、４μＭ、６μＭ、１０μＭ、１２μＭ、１４μＭ、１６μＭ、１８μＭ、２０μＭ、２２μＭ、２４μＭ、２６μＭ、２８μＭ、３０μＭ、３５μＭのいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）の鉄を含む。ある特定の実施形態において、基本培地中の鉄源は、以下、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩＩ）、クエン酸鉄（ＩＩ）、クエン酸鉄（ＩＩＩ）、硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）六水和物、硫酸鉄（ＩＩＩ）水和物、硫酸アンモニウム鉄（ＩＩＩ）十二水化物、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物、硝酸鉄（ＩＩＩ）九水和物、クエン酸アンモニウム鉄（ＩＩＩ）、酒石酸鉄（ＩＩＩ）、乳酸鉄（ＩＩ）水和物、シュウ酸鉄（ＩＩＩ）六水和物、シュウ酸鉄（ＩＩ）二水和物、鉄（ＩＩＩ）トリフルオロアセトネート、フマル酸鉄（ＩＩ）、シュウ酸アンモニウム鉄（ＩＩＩ）三水和物、グルコン酸鉄（ＩＩ）水和物、Ｄ－グルコン酸鉄（ＩＩ）二水和物、（＋）－Ｌ－アスコルビン酸鉄（ＩＩ）のいずれか１つまたはそれらの組み合わせである。

【0078】

ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、約５μＭ～約３０μＭ、約１０μＭ～約２５μＭ、または約１５μＭ～約２０μＭのいずれか１つの間（これらの値間の任意の範囲を含む）の鉄を含む。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、約２μＭ、４μＭ、６μＭ、１０μＭ、１２μＭ、１４μＭ、１６μＭ、１８μＭ、２０μＭ、２２μＭ、２４μＭ、２６μＭ、２８μＭ、３０μＭ、３５μＭのいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）の鉄を含む。ある特定の実施形態において、細胞培養培地中の鉄源は、以下、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩＩ）、クエン酸鉄（ＩＩ）、クエン酸鉄（ＩＩＩ）、硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）六水和物、硫酸鉄（ＩＩＩ）水和物、硫酸アンモニウム鉄（ＩＩＩ）十二水化物、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物、硝酸鉄（ＩＩＩ）九水和物、クエン酸アンモニウム鉄（ＩＩＩ）、酒石酸鉄（ＩＩＩ）、乳酸鉄（ＩＩ）水和物、シュウ酸鉄（ＩＩＩ）六水和物、シュウ酸鉄（ＩＩ）二水和物、鉄（ＩＩＩ）トリフルオロアセトネート、フマル酸鉄（ＩＩ）、シュウ酸アンモニウム鉄（ＩＩＩ）三水和物、グルコン酸鉄（ＩＩ）水和物、Ｄ－グルコン酸鉄（ＩＩ）二水和物、（＋）－Ｌ－アスコルビン酸鉄（ＩＩ）のいずれか１つまたはそれらの組み合わせである。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、基本培地を含む。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、基本培地及び供給物培地（バッチ供給物培地など）を含む。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、供給物培地（バッチ供給物培地など）を含む。

【0079】

ある特定の実施形態において、基本培地は、約０．１５μＭ～約１．５μＭ、約０．３μＭ～約１．０μＭ、または約０．３μＭ～約０．７５μＭのいずれか１つの間（これらの値間の任意の範囲を含む）のビタミンＢ２を含む。ある特定の実施形態において、基本培地は、約０．１１μＭ、０．２μＭ、０．４μＭ、０．６μＭ、０．８μＭ、１．０μＭ、１．２μＭ、１．４μＭ、１．６μＭ、１．８μＭ、または２μＭのいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）のリボフラビン（ビタミンＢ２）を含む。ある特定の実施形態において、基本培地中のビタミンＢ２源は、以下、リボフラビン粉末（９，Ｄ－リビトール６，７ジメチルイソアロキサジン）、リボフラビン５’－一リン酸塩、またはリボフラビン５’－一リン酸塩のナトリウム塩形態のいずれか１つまたはそれらの組み合わせである。

【0080】

ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、約０．１５μＭ～約１．５μＭ、約０．３μＭ～約１．０μＭ、または約０．３μＭ～約０．７５μＭのいずれか１つの間（これらの値間の任意の範囲を含む）のビタミンＢ２を含む。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、約０．１１μＭ、０．２μＭ、０．４μＭ、０．６μＭ、０．８μＭ、１．０μＭ、１．２μＭ、１．４μＭ、１．６μＭ、１．８μＭ、または２μＭのいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）のリボフラビン（ビタミンＢ２）を含む。ある特定の実施形態において、基本培地中のビタミンＢ２源は、以下、リボフラビン粉末（９，Ｄ－リビトール６，７ジメチルイソアロキサジン）、リボフラビン５’－一リン酸塩、またはリボフラビン５’－一リン酸塩のナトリウム塩形態のいずれか１つまたはそれらの組み合わせである。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、基本培地を含む。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、基本培地及び供給物培地（バッチ供給物培地など）を含む。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、供給物培地（バッチ供給物培地など）を含む。

【0081】

ある特定の実施形態において、基本培地は、約１．５μＭ～約７５μＭ、約５μＭ～約５０μＭ、または約２５μＭ～約４０μＭのいずれか１つの間（これらの値間の任意の範囲を含む）のビタミンＢ６を含む。ある特定の実施形態において、基本培地は、約４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、５０μＭ、５５μＭ、６０μＭ、６５μＭ、７０μＭ、７５μＭ、または８０μＭのいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）のビタミンＢ６を含む。ある特定の実施形態において、基本培地中のビタミンＢ６源は、以下、ピリドキシン、ピリドキシン一塩酸塩、ピリドキサール、ピリドキサール一塩酸塩、ピリドキサール５’－リン酸塩、ピリドキサミン、ピリドキサミン二塩酸塩、ピリドキサミン５－リン酸塩、ピリチノール、４－ピリドキシン酸のいずれか１つまたはそれらの組み合わせである。

【0082】

ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、約１．５μＭ～約７５μＭ、約５μＭ～約５０μＭ、または約２５μＭ～約４０μＭのいずれか１つの間（これらの値間の任意の範囲を含む）のビタミンＢ６を含む。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、約４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、５０μＭ、５５μＭ、６０μＭ、６５μＭ、７０μＭ、７５μＭ、または８０μＭのいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）のビタミンＢ６を含む。ある特定の実施形態において、細胞培養培地中のビタミンＢ６源は、以下、ピリドキシン、ピリドキシン一塩酸塩、ピリドキサール、ピリドキサール一塩酸塩、ピリドキサール５’－リン酸塩、ピリドキサミン、ピリドキサミン二塩酸塩、ピリドキサミン５－リン酸塩、ピリチノール、４－ピリドキシン酸のいずれか１つまたはそれらの組み合わせである。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、基本培地を含む。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、基本培地及び供給物培地（バッチ供給物培地など）を含む。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、供給物培地（バッチ供給物培地など）を含む。

【0083】

ある特定の実施形態において、基本培地は、約５μＭ～約２０μＭ、約７μＭ～約１５μＭ、または約１０μＭ～約１２μＭのいずれか１つの間（これらの値間の任意の範囲を含む）のビタミンＢ９を含む。ある特定の実施形態において、基本培地は、約３．４μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、または２３μＭのいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）のビタミンＢ９を含む。ある特定の実施形態において、基本培地中のビタミンＢ９源は、以下、葉酸、葉酸粉末、フォリン酸カルシウム塩、テトラヒドロ葉酸塩、または４－アミノ安息香酸、またはパラ－アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）のいずれか１つまたはそれらの組み合わせである。

【0084】

ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、約５μＭ～約２０μＭ、約７μＭ～約１５μＭ、または約１０μＭ～約１２μＭのいずれか１つの間（これらの値間の任意の範囲を含む）のビタミンＢ９を含む。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、約３．４μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、または２３μＭのいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）のビタミンＢ９を含む。ある特定の実施形態において、細胞培養培地のビタミンＢ９源は、以下、葉酸、フォリン酸カルシウム塩、テトラヒドロ葉酸塩、または４－アミノ安息香酸、またはパラ－アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）のいずれか１つまたはそれらの組み合わせである。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、基本培地を含む。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、基本培地及び供給物培地（バッチ供給物培地など）を含む。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、供給物培地（バッチ供給物培地など）を含む。

【0085】

ある特定の実施形態において、基本培地は、約０．５μＭ～約２．０μＭ、約１μＭ～約１．７μＭ、または約１．２μＭ～約１．５μＭのいずれか１つの間（これらの値間の任意の範囲を含む）のビタミンＢ１２を含む。ある特定の実施形態において、基本培地は、約０．２μＭ、０．４μＭ、０．６μＭ、０．８μＭ、１．０μＭ、１．２μＭ、１．４μＭ、１．６μＭ、１．８μＭ、２．０μＭ、２．２μＭ、２．４μＭ、または２．５μＭのいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）のビタミンＢ１２を含む。ある特定の実施形態において、基本培地中のビタミンＢ１２源は、以下、シアノコバラミン及びヒドロキソコバラミンのいずれか１つまたはそれらの組み合わせである。

【0086】

ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、約０．５μＭ～約２．０μＭ、約１μＭ～約１．７μＭ、または約１．２μＭ～約１．５μＭのいずれか１つの間（これらの値間の任意の範囲を含む）のビタミンＢ１２を含む。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、約０．２μＭ、０．４μＭ、０．６μＭ、０．８μＭ、１．０μＭ、１．２μＭ、１．４μＭ、１．６μＭ、１．８μＭ、２．０μＭ、２．２μＭ、２．４μＭ、または２．５μＭのいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）のビタミンＢ１２を含む。ある特定の実施形態において、細胞培養培地中のビタミンＢ１２源は、以下、シアノコバラミン及びヒドロキソコバラミンのいずれか１つまたはそれらの組み合わせである。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、基本培地を含む。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、基本培地及び供給物培地（バッチ供給物培地など）を含む。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、供給物培地（バッチ供給物培地など）を含む。

【0087】

ある特定の実施形態において、基本培地は、約２．０ｍＭ～約４０ｍＭ、約５ｍＭ～約３０ｍＭ、約７ｍＭ～約２０ｍＭ、約８ｍＭ～約１５ｍＭ、約９．２ｍＭ～約９．８ｍＭ、約９．４ｍＭ～約９．６ｍＭ、または約９．５ｍＭのいずれか１つの間（これらの値間の任意の範囲を含む）のヒポタウリンを含む。ある特定の実施形態において、基本培地は、約２ｍＭ、４ｍＭ、６ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、９．２ｍＭ、９．４ｍＭ、９．６ｍＭ、９．８ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、及び４０ｍＭのいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）のヒポタウリンを含む。ある特定の実施形態において、基本培地中のヒポタウリン源は、ヒポタウリン粉末である。

【0088】

ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、約２．０ｍＭ～約４０ｍＭ、約５ｍＭ～約３０ｍＭ、約７ｍＭ～約２０ｍＭ、約８ｍＭ～約１５ｍＭ、約９．２ｍＭ～約９．８ｍＭ、約９．４ｍＭ～約９．６ｍＭ、または約９．５ｍＭのいずれか１つの間（これらの値間の任意の範囲を含む）のヒポタウリンを含む。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、約２ｍＭ、４ｍＭ、６ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、９．２ｍＭ、９．４ｍＭ、９．６ｍＭ、９．８ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、及び４０ｍＭのいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）のヒポタウリンを含む。ある特定の実施形態において、細胞培養培地中のヒポタウリン源は、ヒポタウリン粉末である。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、基本培地を含む。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、基本培地及び供給物培地（バッチ供給物培地など）を含む。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、供給物培地（バッチ供給物培地など）を含む。

【0089】

ある特定の実施形態において、基本培地は、約０．５ｍＭ～約１．５ｍＭ、約０．７５ｍＭ～約１．２５ｍＭ、または約１．０ｍＭのいずれか１つの間（これらの値間の任意の範囲を含む）のメチオニンを含む。ある特定の実施形態において、基本培地は、約０ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．５ｍＭ、０．７５ｍＭ、１．０ｍＭ、１．２５ｍＭ、１．５ｍＭ、または１．５８ｍＭのいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）のメチオニンを含む。ある特定の実施形態において、基本培地中のメチオニン源は、以下、メチオニン粉末、Ｌ－メチオニン、ＤＬ－メチオニン、Ｌ－メチオニン塩酸塩溶液、Ｎ－アセチル－Ｌ－メチオニン、Ｎ－アセチル－Ｄ，Ｌ－メチオニン、Ｌ－メチオニンメチルエステル塩酸塩、Ｓ－（５′－アデノシル）－Ｌ－メチオニン塩化物二塩酸塩、及びＳ－（５′－アデノシル）－Ｌ－メチオニンヨウ化物のいずれか１つまたはそれらの組み合わせである。

【0090】

ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、約０．５ｍＭ～約４．０ｍＭ、約１．５ｍＭ～約３ｍＭ、または約２ｍＭ～約２．５ｍＭのいずれか１つの間（これらの値間の任意の範囲を含む）のメチオニンを含む。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、約０ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．５ｍＭ、０．７５ｍＭ、１．０ｍＭ、１．２５ｍＭ、１．５ｍＭ、１．７５ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、２．７５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．２５ｍＭ、３．５ｍＭ、３．７５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．２５ｍＭ、または４．５ｍＭのいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）のメチオニンを含む。ある特定の実施形態において、細胞培養培地中のメチオニン源は、以下、メチオニン粉末、Ｌ－メチオニン、ＤＬ－メチオニン、Ｌ－メチオニン塩酸塩溶液、Ｎ－アセチル－Ｌ－メチオニン、Ｎ－アセチル－Ｄ，Ｌ－メチオニン、Ｌ－メチオニンメチルエステル塩酸塩、Ｓ－（５’－アデノシル）－Ｌ－メチオニン塩化物二塩酸塩、及びＳ－（５’－アデノシル）－Ｌ－メチオニンヨウ化物のいずれか１つまたはそれらの組み合わせである。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、基本培地を含む。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、基本培地及び供給物培地（バッチ供給物培地など）を含む。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、供給物培地（バッチ供給物培地など）を含む。

【0091】

ある特定の実施形態において、基本培地は、シスチンを欠く。

【0092】

ある特定の実施形態において、基本培地は、約１．４ｍＭ～約３．０ｍＭのシステインまたはシスチン（約１．４ｍＭ、１．６ｍＭ、１．８ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２ｍＭ、２．４ｍＭ、２．６ｍＭ、２．８ｍＭ、または３．０ｍＭのいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）のシステインまたはシスチンなど）を含有する。ある特定の実施形態において、基本培地中のシステイン源は、以下、Ｌ－システイン及びＬ－システイン一塩酸塩一水和物粉末のいずれか１つまたはそれらの組み合わせである。ある特定の実施形態において、基本培地中のシスチン源は、シスチン二ナトリウム塩一水和物粉末である。

【0093】

ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、約１．４ｍＭ～約３．０ｍＭのシステインまたはシスチン（約１．４ｍＭ、１．６ｍＭ、１．８ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２ｍＭ、２．４ｍＭ、２．６ｍＭ、２．８ｍＭ、または３．０ｍＭのいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）のシステインまたはシスチンなど）を含有する。ある特定の実施形態において、細胞培養培地中のシステイン源は、以下、Ｌ－システイン及びＬ－システイン一塩酸塩一水和物粉末のいずれか１つまたはそれらの組み合わせである。ある特定の実施形態において、細胞培養培地中のシスチン源は、シスチン二ナトリウム塩一水和物粉末である。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、基本培地を含む。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、基本培地及び供給物培地（バッチ供給物培地など）を含む。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、供給物培地（バッチ供給物培地など）を含む。

【0094】

ある特定の実施形態において、基本培地は、約０ｍＭ～約１．５８ｍＭのメチオニン（約０ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．５ｍＭ、０．７５ｍＭ、１ｍＭ、１．２５ｍＭ、または１．５８ｍＭのいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）のメチオニンなど）を含む。ある特定の実施形態において、基本培地は、約０ｍＭ～約３．０ｍＭのシステイン（約０ｍＭ、０．２ｍＭ、０．４ｍＭ、０．６ｍＭ、０．８ｍＭ、１．０ｍＭ、１．２ｍＭ、１．４ｍＭ、１．６ｍＭ、１．８ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２ｍＭ、２．４ｍＭ、２．６ｍＭ、２．８ｍＭ、または３．０ｍＭのいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）のシステインなど）を含む。ある特定の実施形態において、基本培地は、約０ｍＭ～約１．５８ｍＭのメチオニン（約０ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．５ｍＭ、０．７５ｍＭ、１ｍＭ、１．２５ｍＭ、または１．５８ｍＭのいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）のメチオニンなど）、及び約０ｍＭ～約３．０ｍＭのシステイン（約０ｍＭ、０．２ｍＭ、０．４ｍＭ、０．６ｍＭ、０．８ｍＭ、１．０ｍＭ、１．２ｍＭ、１．４ｍＭ、１．６ｍＭ、１．８ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２ｍＭ、２．４ｍＭ、２．６ｍＭ、２．８ｍＭ、または３．０ｍＭのいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）のシステインなど）を含む。

【0095】

ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、約０ｍＭ～約１．５８ｍＭのメチオニン（約０ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．５ｍＭ、０．７５ｍＭ、１ｍＭ、１．２５ｍＭ、または１．５８ｍＭのいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）のメチオニンなど）を含む。ある特定の実施形態において、細胞培養物は、約０ｍＭ～約３．０ｍＭのシステイン（約０ｍＭ、０．２ｍＭ、０．４ｍＭ、０．６ｍＭ、０．８ｍＭ、１．０ｍＭ、１．２ｍＭ、１．４ｍＭ、１．６ｍＭ、１．８ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２ｍＭ、２．４ｍＭ、２．６ｍＭ、２．８ｍＭ、または３．０ｍＭのいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）のシステインなど）を含む。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、約０ｍＭ～約１．５８ｍＭのメチオニン（約０ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．５ｍＭ、０．７５ｍＭ、１ｍＭ、１．２５ｍＭ、または１．５８ｍＭのいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）のメチオニンなど）、及び約０ｍＭ～約３．０ｍＭのシステイン（約０ｍＭ、０．２ｍＭ、０．４ｍＭ、０．６ｍＭ、０．８ｍＭ、１．０ｍＭ、１．２ｍＭ、１．４ｍＭ、１．６ｍＭ、１．８ｍＭ、２．０ｍＭ、２．２ｍＭ、２．４ｍＭ、２．６ｍＭ、２．８ｍＭ、または３．０ｍＭのいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）のシステインなど）を含む。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、基本培地を含む。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、基本培地及び供給物培地（バッチ供給物培地など）を含む。ある特定の実施形態において、細胞培養培地は、供給物培地（バッチ供給物培地など）を含む。

【0096】

ある特定の実施形態において、本方法は、１つ以上の増分で、濃縮された栄養素混合物（「バッチ供給物」）を宿主細胞培養物に添加することを含む。ある特定の実施形態において、バッチ供給物培地は、鉄（Ｆｅ（ＩＩ）及び／またはＦｅ（ＩＩＩ）などのＦｅ）を欠く。ある特定の実施形態において、バッチ供給物は、以下、リボフラビン（ビタミンＢ２）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、ピリドキサール（ビタミンＢ６）、葉酸塩／葉酸（ビタミンＢ９）、及びシアノコバルミン（ビタミンＢ１２）のうちの１つ以上を欠く。ある特定の実施形態において、バッチ供給物は、リボフラビン（ビタミンＢ２）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、ピリドキサール（ビタミンＢ６）、葉酸（ビタミンＢ９）、及びシアノコバルミン（ビタミンＢ１２）を欠く。ある特定の実施形態において、バッチ供給物は、鉄（Ｆｅ（ＩＩ）及び／またはＦｅ（ＩＩＩ）などのＦｅ）、ならびに以下、リボフラビン（ビタミンＢ２）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、ピリドキサール（ビタミンＢ６）、葉酸（ビタミンＢ９）、及びシアノコバルミン（ビタミンＢ１２）のうちの１つ以上を欠く。ある特定の実施形態において、バッチ供給物は、鉄（Ｆｅ（ＩＩ）及び／またはＦｅ（ＩＩＩ）などのＦｅ）、リボフラビン（ビタミンＢ２）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、ピリドキサール（ビタミンＢ６）、葉酸（ビタミンＢ９）、ならびにシアノコバルミン（ビタミンＢ１２）を欠く。ある特定の実施形態において、バッチ供給物培地は、シスチンを欠く。ある特定の実施形態において、バッチ供給物培地は、システインを欠く。ある特定の実施形態において、バッチ供給物培地は、メチオニンを欠く。ある特定の実施形態において、バッチ供給物培地は、システイン及びメチオニンを欠く。ある特定の実施形態において、バッチ供給物培地は、システイン、シスチン、及びメチオニンを欠く。

【0097】

ある特定の実施形態において、本方法は、該宿主細胞の培養物もしくは細胞培養流体、該宿主細胞の収集前細胞培養流体（ＰＨＣＣＦ）、または該宿主細胞の収集された細胞培養流体（ＨＣＣＦ）にキレート剤及び還元剤を補充することを更に含む。

【0098】

ある特定の実施形態において、宿主細胞によって産生されるポリペプチド中のトリスルフィド結合のレベルを減少させるための方法であって、該宿主細胞の培養物もしくは細胞培養流体、該宿主細胞の収集前細胞培養流体（ＰＨＣＣＦ）、または該宿主細胞の収集された細胞培養流体（ＨＣＣＦ）にキレート剤及び還元剤を補充することを含み、それによりポリペプチド中のトリスルフィド結合のレベルを低下させる、方法が本明細書に提供される。

【0099】

ある特定の実施形態において、キレート剤及び還元剤は、収集の約４．５時間前、４．０時間前、３．５時間前、３．０時間前、２．５時間前、２．０時間前、１．５時間前、１．０時間前、または０．５時間前のいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）で培養物に添加される。ある特定の実施形態において、キレート剤及び還元剤は、収集時に培養物に添加される。

【0100】

ある特定の実施形態において、キレート剤は、還元剤の前に、該宿主細胞の培養物、細胞培養流体、ＰＨＣＣＦ、またはＨＣＣＦに添加される。ある特定の実施形態において、キレート剤は、キレート剤添加の約６０分前、５５分前、５０分前、４５分前、４０分前、３５分前、または３０分前のいずれか１つの間（これらの間の任意の値を含む）で、該宿主細胞の培養物、細胞培養流体、ＰＨＣＣＦ、またはＨＣＣＦに添加される。

【0101】

ある特定の実施形態において、還元剤は、キレート剤の前に、該宿主細胞の培養物、細胞培養流体、ＰＨＣＣＦ、またはＨＣＣＦに添加される。

【0102】

ある特定の実施形態において、キレート剤及び還元剤は、該宿主細胞の培養物、細胞培養流体、ＰＨＣＣＦ、またはＨＣＣＦに同時に添加される。

【0103】

ある特定の実施形態において、キレート剤及び還元剤は、培養物、細胞培養流体、ＰＨＣＣＦ、またはＨＣＣＦに添加され、培養物、細胞培養流体、ＰＨＣＣＦ、またはＨＣＣＦは、約１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、または３７℃のいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）の温度で維持される。ある特定の実施形態において、キレート剤及び還元剤は、培養物、細胞培養流体、ＰＨＣＣＦ、またはＨＣＣＦに添加され、培養物、細胞培養流体、ＰＨＣＣＦ、またはＨＣＣＦは、約６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、または７．５のいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）のｐＨで維持される。ある特定の実施形態において、キレート剤及び還元剤は、培養物、細胞培養流体、ＰＨＣＣＦ、またはＨＣＣＦに添加され、培養物、細胞培養流体、ＰＨＣＣＦ、またはＨＣＣＦは、約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、または３０％のいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）のＤＯ（溶解酸素）％で維持される。ある特定の実施形態において、ＨＣＣＦは、約３１％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％のいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）を含む約３０％超のＤＯ（溶解酸素）％で維持される。ある特定の実施形態において、キレート剤及び還元剤は、培養物、細胞培養流体、またはＰＨＣＣＦに添加され、培養物、細胞培養流体、またはＰＨＣＣＦは、約１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、または３７℃のいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）の温度、約６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、または７．５のいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）のｐＨ、かつ約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、または３０％のいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）のＤＯ（溶解酸素）％で維持される。ある特定の実施形態において、キレート剤及び還元剤は、ＨＣＣＦに添加され、ＨＣＣＦは、約１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、または３７℃のいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）の温度、約６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、または７．５のいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）のｐＨ、かつ約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、及び１００％のいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）のＤＯ（溶解酸素）％で維持される。

【0104】

ある特定の実施形態において、キレート剤は、以下、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－ジコハク酸（ＥＤＤＳ）、クエン酸塩、シュウ酸塩、酒石酸塩、エチレン－ビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、５－スルホサリチル酸、Ｎ，Ｎ－ジメチルドデシルアミンＮ－オキシド、ジチオオキサミド、エチレンジアミン、サリチルアルドキシム、Ｎ－（２’－ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（ＨＩＭＤＡ）、オキシンキノリノール、及びスルホキシンのいずれか１つまたはそれらの組み合わせである。ある特定の実施形態において、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－ジコハク酸（ＥＤＤＳ）、及びクエン酸塩からなる群から選択される。ある特定の実施形態において、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－ジコハク酸（ＥＤＤＳ）、またはクエン酸塩は、２０ｍＭの最終濃度を達成するように、該宿主細胞の培養物、細胞培養流体、ＰＨＣＣＦ、またはＨＣＣＦに添加される。

【0105】

ある特定の実施形態において、還元剤は、以下、グルタチオン（ＧＳＨ）、Ｌ－グルタチオン（Ｌ－ＧＳＨ）、システイン、Ｌ－システイン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、２，３－ｔｅｒｔ－ブチル－４－ヒドロキシアニソール、２，６－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－４－メチルフェノール、３－アミノプロパン－１－スルホン酸、アデノシルホモシステイン、アンセリン、Ｂ－アラニン、Ｂ－カロチン、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、カルノシン、カルベジロール、クルクミン、システアミン、システアミン塩酸塩、デキサメタゾン、ジアリルジスルフィド、ＤＬ－ランチオニン、ＤＬ－チオルファン、エトキシキン、没食子酸、ゲンチジン酸ナトリウム塩水和物、グルタチオンジスルフィド、グルタチオン還元エチルエステル、グリシン、ヒドロコルチゾン、ヒポタウリン、イセチオン酸アンモニウム塩、Ｌ－システイン－グルタチオンジスルフィド、Ｌ－システインスルフィン酸一水和物、リポ酸、還元リポ酸、メルカプトプロピオニルグリシン、メチオニン、メチレンビス（３－チオプロピオン酸）、シュウ酸塩、クエルシトリン水和物、レスベラトロール、レチノイン酸、Ｓ－カルボキシメチル－Ｌ－システイン、セレン、セレノメチオニン、ジエチルジチオカルバミン酸銀、タウリン、チオ乳酸、トリシン、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ４、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、及びビタミンＢ１１のいずれか１つまたはそれらの組み合わせである。ある特定の実施形態において、還元剤は、システイン及びＬ－システインからなる群から選択される。ある特定の実施形態において、システインまたはＬ－システインは、約３．０ｍＭ、３．５ｍＭ、４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ、５．５ｍＭ、または６ｍＭのいずれか１つ（これらの間の任意の値を含む）の最終濃度を達成するように、該宿主細胞の培養物、細胞培養流体、ＰＨＣＣＦ、またはＨＣＣＦに添加される。

【0106】

所望される種類の細胞及び／またはポリペプチド産物に好適な、当該技術分野において既知である任意の細胞培養培地が、本明細書に記載される方法において使用され得る。いくつかの実施形態において、細胞培養培地は、既知組成の培地である。他の実施形態において、細胞培養培地は、未知組成の培地である。

【0107】

Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（［ＭＥＭ］、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、ダルベッコ変法イーグル培地（［ＤＭＥＭ］、Ｓｉｇｍａ）などを含むが、これらに限定されない、市販の培地が使用され得、これらの培地のいずれも、本明細書に記載されるように改変され得る。加えて、Ｈａｍ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ ａｎｄ Ｓａｔｏ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０２：２５５（１９８０）、Ｖｉｊａｙａｓａｎｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．，６：６０５：６１１（２００５）、Ｐａｔｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９３：２１７－２２９（２００２）、米国特許第４，７６７，７０４号、同第４，６５７，８６６号、同第４，９２７，７６２号、もしくは同第４，５６０，６５５号、ＷＯ９０／０３４３０、ＷＯ８７／００１９５、米国特許第Ｒｅ．３０，９８５号、または米国特許第５，１２２，４６９号（これら全ての開示の全体が、参照により本明細書に組み込まれる）に記載される培地のいずれも、本明細書に詳述されるように改変され得る。

【0108】

本明細書に提供されるいかなる培地も、必要に応じてホルモン及び／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、もしくは上皮成長因子など）、イオン（ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオシド（アデノシン及びチミジンなど）、ならびにグルコースまたは同等のエネルギー源も補充され得る。ある特定の実施形態において、本明細書に提供される方法において使用される細胞培養培地は、既知組成の細胞培養培地である。ある特定の実施形態において、本明細書に提供される方法において使用される細胞培養培地は、未知組成の細胞培養培地である。ある特定の実施形態において、本明細書に提供される方法において使用される細胞培養培地は、植物または動物に由来するタンパク質を含有する。ある特定の実施形態において、本明細書に提供される方法において使用される細胞培養培地は、植物または動物に由来するタンパク質を含まない。任意の他の必要な補充物もまた、当業者に既知である適切な濃度で含まれ得る。

【0109】

当該技術分野において既知である任意の細胞培養技術が、本明細書に記載される方法とともに使用され得る。細胞培養技術の例としては、単一細胞培養継代、延長細胞培養継代、播種材料または接種材料、濃縮供給物補充、細胞バンク生成、灌流培養、ならびに流加培養が挙げられるが、これらに限定されない。

【0110】

ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、細胞培養培地へと分泌される。ある特定の実施形態において、本明細書に提供される方法は、細胞培養培地からポリペプチドを回収するステップを更に含む。

【0111】

ある特定の実施形態において、本明細書に提供される方法は、ポリペプチド中のトリスルフィド結合のレベルを測定することを更に含む。トリスルフィド結合の存在は、実施例に記載される方法及び当業者にとって既知である方法を含む、いくつかの方法のいずれかを使用して検出され得る。例えば、トリスルフィド結合は、ペプチドマッピングを使用して検出され得、過剰な硫黄原子（３２Ｄａ）による無傷タンパク質の質量の増加に基づいて検出され得る。ある特定の実施形態において、トリスルフィド結合は、質量スペクトルを使用して、または高圧液体クロマトグラフィー及び質量分析法（ＬＣ－ＭＳシステムを利用するペプチドマッピング）によって検出され得る。ある特定の実施形態において、トリスルフィド結合は、ペプチドマッピングを通して検出され得、無傷分子に由来する選択ペプチド（スルフィド結合を含有するものを含む）は、ＬＣ－ＭＳによって分析される。ある特定の実施形態において、トリスルフィド結合はまた、例えば、分子折り畳みまたは熱安定性を評価することによって、間接的にも検出され得る。ある特定の実施形態において、抗体中のトリスルフィド結合の存在は、例えば、非還元等電点電気泳動法のための試料調製後の断片化のレベルの増加によって実証されるように、熱処理に対する感受性の増加の結果として検出または特定され得る（例えば、ＵＳ２０１２／０２６４９１６を参照されたい）。ある特定の実施形態において、トリスルフィド結合は、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ．１２１７，５７７６－５７８４に記載される方法に従って、荷電エアロゾル検出と組み合わせた疎水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ－ＣＡＤ）を介して検出され得る。ある特定の実施形態において、本明細書に提供される方法のいずれか１つまたはそれらの組み合わせに従って産生されるポリペプチド中の平均トリスルフィド結合レベルは、約２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、または０．１％（トリスルフィドのモル／ポリペプチドのモル）のいずれか１つ未満である。

【0112】

関連する一態様において、本明細書の方法に従って産生されるポリペプチドが提供される。そのようなポリペプチドを、以下に更に詳細に説明する。

【0113】

ポリペプチドを産生及び精製する方法
本明細書に提供される方法は、任意の種類の動物細胞（組み換え動物細胞など）中で、ポリペプチド（例えば、抗体及び二重特異性抗体を含む）を産生するために使用され得る。「動物細胞」という用語は、無脊椎動物細胞、非哺乳類脊椎動物（例えば、鳥類、爬虫類、及び両生類）細胞、ならびに哺乳動物細胞を包含する。無脊椎動物細胞の例としては、以下、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（イモムシ）、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）、及びＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ（例えば、Ｌｕｃｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：４７－５５（１９８８）、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｖｏｌ．８（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９８６），ｐｐ．２７７－２７９、及びＭａｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１５：５９２－５９４（１９８５）を参照されたい）の昆虫細胞が挙げられる。

【0114】

ある特定の実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞である。宿主として発現に利用可能な哺乳動物細胞株は、当該技術分野において周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株が挙げられるが、これらに限定されず、当該技術分野において既知である発現系において使用される任意の細胞株が、本明細書に提供される方法に従ってポリペプチド（抗体または二重特異性抗体など）を産生するために使用され得る。哺乳動物細胞の例としては、ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６（ＣｒｕＣｅｌｌ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１（Ｇｌｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｃｅｌｌ２３：１７５））、ヒト胚性腎臓株（懸濁培養における成長のためにサブクローニングされた２９３、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３、または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７））、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３－２５１（１９８０））、マウスＬ細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１６３）、サル腎臓細胞（ＣＶＩ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４－６８（１９８２））、ＭＲＣ ５細胞、ＦＳ４細胞、ヒト肝細胞癌株（Ｈｅｐ Ｇ２）、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換された霊長類細胞株、正常二倍体細胞、初代細胞のインビトロ培養に由来する細胞株、初代外植片、ＨＬ－６０、Ｕ９３７、ＨａＫ、またはＪｕｒｋａｔ細胞が挙げられる。様々なシグナル伝達またはレポーターアッセイにおいてポリペプチドを使用することが望ましい場合、任意で、例えば、ＨｅｐＧ２／３Ｂ、ＫＢ、ＮＩＨ ３Ｔ３、またはＳ４９などの哺乳動物細胞株が、ポリペプチドの発現に使用され得る。ある特定の実施形態において、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞またはその誘導体（無血清培地中で成長するＶｅｇｇｉｅ ＣＨＯ及び関連する細胞株など）である（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２８：３１）。

【0115】

本発明はまた、ハイブリドーマ細胞にも適用される。「ハイブリドーマ」という用語は、免疫起源の不死細胞株と抗体産生細胞との融合によって産生されるハイブリッド細胞株を指す。この用語は、ヒト細胞及びマウス骨髄腫細胞株と融合させた後、血漿細胞と融合させた結果である、ヘテロハイブリッド骨髄腫融合体の子孫（一般的にトリオーマ細胞株として知られる）を包含する。更に、この用語は、例えば、クアドローマなどの抗体を産生する任意の不死化ハイブリッド細胞株を含むことが意図される（例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５３７：３０５３（１９８３）を参照されたい）。ハイブリッド細胞株は、ヒト及びマウスを含む任意の種のものであり得る。

【0116】

ある特定の実施形態において、哺乳動物細胞は、対象となるポリペプチドをコードする単離された外因性核酸で形質転換されている、非ハイブリドーマ哺乳動物細胞であり、特に好ましい実施形態において、これらには、抗体（二重特異性抗体など）をコードする核酸、抗体断片（リガンド結合断片など）、及びキメラ抗体が含まれる。「外因性核酸」または「異種核酸」は、細胞にとって異質であるか、または細胞に類似しているが通常は核酸が見出されない宿主細胞核酸内の位置にある、核酸配列を意味する。

【0117】

単離された核酸は、ポリペプチド核酸の天然源中それに通常伴う少なくとも１つの混入核酸分子から特定かつ分離される核酸分子である。単離された核酸分子は、それが自然界で見出される形態または設定以外である。単離された核酸は、好ましくは非染色体核酸であり、すなわち、それが天然に存在する染色体環境から単離される。したがって、単離された核酸分子は、天然細胞内に存在する核酸分子とは区別される。しかしながら、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞の染色体位置とは異なる染色体位置にある、ポリペプチドを通常発現する細胞内に含有される核酸分子を含む。

【0118】

対象となるポリペプチドは、好ましくは分泌ポリペプチドとして培養培地から回収されるが、それはまた、分泌シグナルなしで直接発現された場合、宿主細胞溶解物からも回収され得る。第１のステップとして、培養培地または溶解物を遠心分離して、微粒子状の細胞細片を除去する。その後、混入可溶性タンパク質及びポリペプチドからポリペプチドを精製するが、以下の手順、免疫親和性またはイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、ＤＥＡＥなどのシリカまたはカチオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５を使用するゲル濾過、及びＩｇＧなどの混入物を除去するためのタンパク質Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムによるものが、好適な精製手順のうちの例示的なものである。フェニルメチルスルホニルフッ化物（ＰＭＳＦ）などのプロテアーゼ阻害剤もまた、精製中のタンパク質分解を阻害するのに有用であり得る。当業者であれば、組み換え細胞培養物中での発現時のポリペプチドの特徴の変化を説明するために、対象となるポリペプチドに好適な精製方法が修正を必要とし得ることを理解するだろう。

【0119】

例示的なポリペプチド
本明細書に提供される方法に従って、様々なポリペプチドが産生され得る。例としては、例えば、成長ホルモン（ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含む）、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、リポタンパク質、アルファ－１－アンチトリプシン、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、卵胞刺激ホルモン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、グルカゴン、凝固因子（因子ＶＩＩＩＣ、因子ＩＸ、組織因子、及びフォンウィルブランド因子など）、抗凝固因子（タンパク質Ｃなど）、心房性ナトリウム利尿因子、肺表面活性剤、プラスミノーゲン活性化因子（ウロキナーゼまたはヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ）など）、ボンベシン、トロンビン、造血成長因子、腫瘍壊死因子－アルファ及び－ベータ、エンケファリナーゼ、ＲＡＮＴＥＳ（活性化時に制御され、通常Ｔ細胞が発現及び分泌している）、ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ－１－アルファ）、血清アルブミン（ヒト血清アルブミンなど）、ミュラー管抑制因子、リラキシンＡ鎖、リラキシンＢ鎖、プロリラキシン、マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド、微生物タンパク質（ベータ－ラクタマーゼなど）、デオキシリボヌクレアーゼ、ＩｇＥ、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）（ＣＴＬＡ－４など）、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ホルモンまたは成長因子の受容体、タンパク質ＡまたはＤ、リウマトイド因子、神経栄養因子（骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン－３、－４、－５、もしくは－６（ＮＴ－３、ＮＴ－４、ＮＴ－５、もしくはＮＴ－６）、または神経成長因子（ＮＧＦ－～など）など）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ及びｂＦＧＦなど）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ）（ＴＧＦ－ベータ１、ＴＧＦ－ベータ２、ＴＧＦ－ベータ３、ＴＧＦ－ベータ４、またはＴＧＦ－ベータ５を含む、ＴＧＦ－アルファ及びＴＧＦ－ベータなど）、インスリン様成長因子－Ｉ及び－ＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩ）、ｄｅｓ（ｌ－３）－ＩＧＦ－１（脳ＩＧＦ－１）、インスリン様成長因子結合タンパク質、ＣＤタンパク質（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、及びＣＤ４０など）、エリスロポエチン、骨誘導因子、免疫毒素、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、インターフェロン（インターフェロン－アルファ、－ベータ、及び－ガンマなど）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（例えば、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＧ－ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ－１～ＩＬ－１７）、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｔ細胞受容体、表面膜タンパク質、崩壊促進因子、ウイルス抗原（例えば、ＡＩＤＳ外被の一部分など）、輸送タンパク質、ホーミング受容体、アドレシン、制御タンパク質、インテグリン（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ－４、及びＶＣＡＭなど）、腫瘍関連抗原（ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、もしくはＨＥＲＡ受容体など）、ならびに上に列挙されるポリペプチドのいずれかの断片が挙げられるが、これらに限定されない。

【0120】

抗体産生及び精製
いくつかの実施形態において、本明細書に提供される方法に従って産生されるポリペプチドは、抗体またはその断片である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるによって産生される抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ライブラリ由来抗体、または多重特異性抗体（二重特異性抗体など）である。ある特定の実施形態において、本明細書に提供される方法によって産生される抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）_２、ｄＡｂ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、線状抗体、一本鎖抗体分子、ミニボディ、ダイアボディ、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体である。

【0121】

抗体は、例えば、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）を使用する抗体の産生において、組み換え方法を使用して産生され得る。抗体の組み換え産生について、抗体をコードする核酸が単離され、更なるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために複製可能なベクターに挿入される。抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離され、配列決定され得る。多くのベクターが利用可能である。ベクター構成成分としては一般に、以下、シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。

【0122】

抗体は、直接のみならず、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても組み換えで産生され得、この異種ポリペプチドは、好ましくは、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドである。選択された異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識及びプロセシングされる（例えば、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列、ならびにウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。

【0123】

抗体は、細胞内で産生され得るか、または培地へと直接分泌され得る。抗体が細胞内で産生される場合、第１のステップとして、粒子状の細片（宿主細胞または溶解断片のいずれか）が、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去される。抗体が培地へと分泌される場合、そのような発現系由来の上清がまず、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して濃縮され得る。タンパク質分解を阻害するために、前述のステップのいずれかにＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤が含まれてもよく、付随的混入物の成長を防止するために、抗生物質が含まれてもよい。

【0124】

当該技術分野において既知である標準のタンパク質精製方法を用いて、本明細書に提供される方法に従って産生される抗体の実質的に同種の調製物を得ることができる。以下の手順、免疫親和性またはイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、ＤＥＡＥなどのシリカまたはカチオン交換樹脂でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、及び例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５を使用するゲル濾過が、好適な精製手順のうちの例示的なものである。

【0125】

加えて、またはあるいは、抗体は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル等電点電気泳動法、透析、及び親和性クロマトグラフィーを使用して精製され得、親和性クロマトグラフィーが典型的に好ましい精製ステップのうちの１つである。ある特定の態様において、上述の細胞培養培地に由来する調製物を、タンパク質Ａ固定化固相に適用して、対象となる多重特異性抗原結合タンパク質のタンパク質Ａへの特異的結合を可能にする。その後、固相を洗浄して、固相に非特異的に結合している混入物を除去する。カオトロピック剤または中性洗剤を含有する溶液への溶出によって、多重特異性抗原結合タンパク質（二重特異性抗体など）を固相から回収する。例示的なカオトロピック剤及び中性洗剤としては、グアニジン－ＨＣＩ、尿素、過塩素酸リチウム、アルギニン、ヒスチジン、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ、及びＮＰ－４０が挙げられるが、これらに限定されず、これらの全てが市販されている。

【0126】

親和性リガンドとしてのタンパク質Ａの好適性は、抗体内に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。タンパク質Ａを使用して、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づく抗体を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１－１３（１９８３））。タンパク質Ｇは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に対して推奨されている（Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドが結合するマトリックスは、最も多くは、アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。孔制御ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定したマトリックスにより、アガロースで達成され得るよりも速い流速及び短い処理時間が可能になる。抗体がＣ_Ｈ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。タンパク質精製のための他の技術（イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）でのクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿など）もまた、回収される抗体に応じて利用可能である。

【0127】

任意の予備精製ステップ（複数可）の後、抗体（本明細書に提供される方法に従って産生される抗体など）及び混入物を含む混合物が、約２．５～４．５のｐＨの溶出緩衝液を使用して、好ましくは、低塩濃度（例えば、約０～０．２５Ｍの塩）で実行される、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供され得る。抗体の産生は、（前述の特定の方法のいずれかに対して）代替的または追加的に、ポリペプチドの混合物を含む溶液を透析することを含み得る。

【0128】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体は、その抗原結合断片である。抗原結合断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、及びＦｖ断片、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。Ｆａｂ断片は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含有し、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）もまた含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域に由来する１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端への数個の残基の付加によって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を持つＦａｂ’の本明細書における表記である。Ｆ（ａｂ’）_２抗体断片は元々、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生されたものであった。抗体断片の他の化学共役もまた、既知である。「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含有する最小抗体断片である。「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖内に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを更に含み、これにより、ｓｃＦｖが抗原結合に所望される構造を形成することが可能になる。ｓｃＦｖに関する概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４），ｐｐ．２６９－３１５を参照されたい。上述の抗体を精製するための方法のうちの多くは、抗原結合抗体断片の精製に好適に適合され得る。

【0129】

ある特定の実施形態において、本開示の細胞培養培地中で培養された細胞を使用して、二重特異性抗体を産生する。ある特定の実施形態において、二重特異性抗体は、一方のアームにある第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームにある（第２の結合特異性を提供する）ハイブリッド免疫グロブリン重鎖－軽鎖対とで構成される。二重特異性分子の半分のみにおける免疫グロブリン軽鎖の存在が、容易な分離方法を提供するため、この非対称構造が、所望される二重特異性化合物を望まれない免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離するのを容易にすることが見出された（ＷＯ９４／０４６９０を参照されたい）。二重特異性抗体の生成の更なる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照されたい。別のアプローチに従って、一対の抗体分子間の界面を操作して、組み換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体のパーセンテージを最大化することができる（Ｗ０９６／２７０１１を参照されたい）。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法において、第１の抗体分子の界面からの１つ以上の小さいアミノ酸側鎖が、より大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えられる。大きい側鎖（複数可）と同一または類似のサイズの代償「空洞」が、大きいアミノ酸側鎖をより小さいアミノ酸側鎖（例えばアラニンまたはトレオニン）に置き換えることによって、第２の抗体分子の界面上に作製される。これは、ホモ二量体などの他の望まれない最終産物を超えるヘテロ二量体の収率を増加させるための機構を提供する。二重特異性抗体としては、架橋抗体または「ヘテロコンジュゲート」抗体が挙げられる。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体のうちの一方がアビジンに共役され得、他方がビオチンに共役され得る。そのような抗体は、例えば、免疫系細胞の標的を望まれない細胞に向けるために（ＵＳ４，６７６，９８０を参照されたい）、かつＨＩＶ感染を治療するために（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３、及びＥＰ０３０８９を参照されたい）提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋方法を使用して作製され得る。好適な架橋剤は当該技術分野において周知であり、いくつかの架橋技術とともにＵ．Ｓ．４，６７６，９８０に開示されている。３以上の結合価を有する抗体が企図される。例えば、三重特異性抗体が調製され得る（Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）を参照されたい）。

【0130】

標的分子
本明細書に提供される方法に従って産生される抗体（または二重特異性抗体などの多重特異性抗体）によって標的とされ得る分子の例としては、可溶性血清タンパク質及びそれらの受容体、ならびに他の膜結合タンパク質（例えば、アドヘシン）が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、本明細書に提供される多重特異性抗原結合タンパク質は、８ＭＰＩ、８ＭＰ２、８ＭＰ３８（ＧＤＦＩＯ）、８ＭＰ４、８ＭＰ６、８ＭＰ８、ＣＳＦＩ（Ｍ－ＣＳＦ）、ＣＳＦ２（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＣＳＦ３（Ｇ－ＣＳＦ）、ＥＰＯ、ＦＧＦ１（αＦＧＦ）、ＦＧＦ２（βＦＧＦ）、ＦＧＦ３（ｉｎｔ－２）、ＦＧＦ４（ＨＳＴ）、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６（ＨＳＴ－２）、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１２Ｂ、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２３、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮ８１、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＷＩ、ＦＥＬ１、ＦＥＬ１（ＥＰＳＥＬＯＮ）、ＦＥＬ１（ＺＥＴＡ）、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢｂ３、ＬＴＡ（ＴＮＦ－β）、ＬＴＢ、ＴＮＦ（ＴＮＦ－α）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド）、ＴＮＦＳＦ９（４－１ＢＢリガンド）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰＯ３Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ－Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８、ＨＧＦ（ＶＥＧＦＤ）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ８ＲＡ、ＩＬ８ＲＢ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２Ｒ、ＩＬ１ＨＹ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＩＬ１ＲＮ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ２２ＲＡ２、ＡＩＦ１、ＨＧＦ、ＬＥＰ（レプチン）、ＰＴＮ、及びＴＨＰＯからなる群から選択される、１つ、２つ、またはそれ以上のサイトカイン、サイトカイン関連タンパク質、及びサイトカイン受容体に結合することができる。

【0131】

ある特定の実施形態において、本明細書に提供される方法を使用して、ＣＣＬＩ（１－３０９）、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１／ＭＣＡＦ）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ－Ｉα）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ－Ｉβ）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ－３）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ－２）、ＣＣＬ１１（エオタキシン）、ＣＣＬ１３（ＭＣＰ－４）、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ－Ｉδ）、ＣＣＬ１６（ＨＣＣ－４）、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）、ＣＣＬ１９（ＭＤＰ－３ｂ）、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ－３α）、ＣＣＬ２１（ＳＬＣ／エクソダス－２）、ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ－１）、ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ－１）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ－２／エオタキシン－２）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）、ＣＣＬ２６（エオタキシン－３）、ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬＩ（ＧＲＯＩ）、ＣＸＣＬ２（ＧＲ０２）、ＣＸＣＬ３（ＧＲ０３）、ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ－７８）、ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ－２）、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ１０）、ＣＸＣＬ１１（１－ＴＡＣ）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦＩ）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１６、ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）、ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）、ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤＩ）、ＳＣＹＥＩ、ＸＣＬＩ（リンホタクチン）、ＸＣＬ２（ＳＣＭ－Ｉβ）、ＢＬＲＩ（ＭＤＲ１５）、ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）、ＣＣＲＩ（ＣＫＲＩ／ＨＭ１４５）、ＣＣＲ２（ｍｃｐ－ＩＲＢ ＩＲＡ）、ＣＣＲ３（ＣＫＲ３／ＣＭＫＢＲ３）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）、ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ－Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）、ＣＣＲ７（ＣＫＲ７／ＥＢＩＩ）、ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲ１／ＣＫＲ－Ｌ１）、ＣＣＲ９（ＧＰＲ－９－６）、ＣＣＲＬ１（ＶＳＨＫ１）、ＣＣＲＬ２（Ｌ－ＣＣＲ）、ＸＣＲ１（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲ１）、ＣＭＫＬＲ１、ＣＭＫＯＲ１（ＲＤＣ１）、ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）、ＣＸＣＲ４、ＧＰＲ２（ＣＣＲ１０）、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）、ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ－Ｌ２）、ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）、ＨＭ７４、ＩＬ８ＲＡ（ＩＬ８Ｒα）、ＩＬ８ＲＢ（ＩＬ８Ｒβ）、ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）、ＴＣＰ１０、ＣＫＬＦＳＦ２、ＣＫＬＦＳＦ３、ＣＫＬＦＳＦ４、ＣＫＬＦＳＦ５、ＣＫＬＦＳＦ６、ＣＫＬＦＳＦ７、ＣＫＬＦＳＦ８、ＢＤＮＦ、Ｃ５、Ｃ５Ｒ１、ＣＳＦ３、ＧＲＣＣ１０（Ｃ１０）、ＥＰＯ、ＦＹ（ＤＡＲＣ）、ＧＤＦ５、ＨＤＦ１、ＨＤＦ１α、ＤＬ８、ＰＲＬ、ＲＧＳ３、ＲＧＳ１３、ＳＤＦ２、ＳＬＩＴ２、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＲＥＭ１、ＴＲＥＭ２、及びＶＨＬからなる群から選択される、ケモカイン、ケモカイン受容体、またはケモカイン関連タンパク質に対する抗体（または二重特異性抗体などの多重特異性抗体）を産生することができる。

【0132】

別の実施形態において、本明細書に提供される方法に従って産生される抗体または二重特異性抗体は、以下、０７７２Ｐ（ＣＡ１２５、ＭＵＣ１６）（すなわち、卵巣癌抗原）、ＡＢＣＦ１；ＡＣＶＲ１；ＡＣＶＲ１Ｂ；ＡＣＶＲ２；ＡＣＶＲ２Ｂ；ＡＣＶＲＬ１；ＡＤＯＲＡ２Ａ；アグリカン；ＡＧＲ２；ＡＩＣＤＡ；ＡＩＦ１；ＡＩＧ１；ＡＫＡＰ１；ＡＫＡＰ２；ＡＭＨ；ＡＭＨＲ２；アミロイドベータ；ＡＮＧＰＴＬ；ＡＮＧＰＴ２；ＡＮＧＰＴＬ３；ＡＮＧＰＴＬ４；ＡＮＰＥＰ；ＡＰＣ；ＡＰＯＣ１；ＡＲ；ＡＳＬＧ６５９；ＡＳＰＨＤ１（アスパラギン酸ベータ－ヒドロキシラーゼドメイン含有１；ＬＯＣ２５３９８２）；ＡＺＧＰ１（亜鉛－ａ－糖タンパク質）；Ｂ７．１；Ｂ７．２；ＢＡＤ；ＢＡＦＦ－Ｒ（Ｂ細胞活性化因子受容体、ＢＬｙＳ受容体３、ＢＲ３；ＢＡＧ１；ＢＡＩ１；ＢＣＬ２；ＢＣＬ６；ＢＤＮＦ；ＢＬＮＫ；ＢＬＲＩ（ＭＤＲ１５）；ＢＭＰ１；ＢＭＰ２；ＢＭＰ３Ｂ（ＧＤＦ１０）；ＢＭＰ４；ＢＭＰ６；ＢＭＰ８；ＢＭＰＲ１Ａ；ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形成タンパク質受容体ＩＢ型）；ＢＭＰＲ２；ＢＰＡＧ１（プレクチン）；ＢＲＣＡ１；ブレビカン；Ｃ１９ｏｒｆ１０（ＩＬ２７ｗ）；Ｃ３；Ｃ４Ａ；Ｃ５；Ｃ５Ｒ１；ＣＡＮＴ１；ＣＡＳＰ１；ＣＡＳＰ４；ＣＡＶ１；ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）；ＣＣＬ１（１－３０９）；ＣＣＬ１１（エオタキシン）；ＣＣＬ１３（ＭＣＰ－４）；ＣＣＬ１５（ＭＩＰ１δ）；ＣＣＬ１６（ＨＣＣ－４）；ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）；ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）；ＣＣＬ１９（ＭＩＰ－３β）；ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１）；ＭＣＡＦ；ＣＣＬ２０（ＭＩＰ－３α）；ＣＣＬ２１（ＭＴＰ－２）；ＳＬＣ；エクソダス－２；ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ－１）；ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ－１）；ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ－２／エオタキシン－２）；ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）；ＣＣＬ２６（エオタキシン－３）；ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）；ＣＣＬ２８；ＣＣＬ３（ＭＴＰ－Ｉα）；ＣＣＬ４（ＭＤＰ－Ｉβ）；ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）；ＣＣＬ７（ＭＣＰ－３）；ＣＣＬ８（ｍｃｐ－２）；ＣＣＮＡ１；ＣＣＮＡ２；ＣＣＮＤ１；ＣＣＮＥ１；ＣＣＮＥ２；ＣＣＲ１（ＣＫＲＩ／ＨＭ１４５）；ＣＣＲ２（ｍｃｐ－ＩＲβ／ＲＡ）；ＣＣＲ３（ＣＫＲ／ＣＭＫＢＲ３）；ＣＣＲ４；ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）；ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ－Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）；ＣＣＲ７（ＣＫＢＲ７／ＥＢＩ１）；ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲ１／ＣＫＲ－Ｌ１）；ＣＣＲ９（ＧＰＲ－９－６）；ＣＣＲＬ１（ＶＳＨＫ１）；ＣＣＲＬ２（Ｌ－ＣＣＲ）；ＣＤ１６４；ＣＤ１９；ＣＤ１Ｃ；ＣＤ２０；ＣＤ２００；ＣＤ２２（Ｂ細胞受容体ＣＤ２２－Ｂアイソフォーム）；ＣＤ２４；ＣＤ２８；ＣＤ３；ＣＤ３７；ＣＤ３８；ＣＤ３Ｅ；ＣＤ３Ｇ；ＣＤ３Ｚ；ＣＤ４；ＣＤ４０；ＣＤ４０Ｌ；ＣＤ４４；ＣＤ４５ＲＢ；ＣＤ５２；ＣＤ６９；ＣＤ７２；ＣＤ７４；ＣＤ７９Ａ（ＣＤ７９α、免疫グロブリン関連アルファ、Ｂ細胞特異的タンパク質）；ＣＤ７９Ｂ；ＣＤＳ；ＣＤ８０；ＣＤ８１；ＣＤ８３；ＣＤ８６；ＣＤＨ１（Ｅ－カドヘリン）；ＣＤＨ１０；ＣＤＨ１２；ＣＤＨ１３；ＣＤＨ１８；ＣＤＨ１９；ＣＤＨ２０；ＣＤＨ５；ＣＤＨ７；ＣＤＨ８；ＣＤＨ９；ＣＤＫ２；ＣＤＫ３；ＣＤＫ４；ＣＤＫ５；ＣＤＫ６；ＣＤＫ７；ＣＤＫ９；ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１）；ＣＤＫＮ１Ｂ（ｐ２７／Ｋｉｐ１）；ＣＤＫＮ１Ｃ；ＣＤＫＮ２Ａ（Ｐ１６ＩＮＫ４ａ）；ＣＤＫＮ２Ｂ；ＣＤＫＮ２Ｃ；ＣＤＫＮ３；ＣＥＢＰＢ；ＣＥＲ１；ＣＨＧＡ；ＣＨＧＢ；キチナーゼ；ＣＨＳＴ１０；ＣＫＬＦＳＦ２；ＣＫＬＦＳＦ３；ＣＫＬＦＳＦ４；ＣＫＬＦＳＦ５；ＣＫＬＦＳＦ６；ＣＫＬＦＳＦ７；ＣＫＬＦＳＦ８；ＣＬＤＮ３；ＣＬＤＮ７（クローディン－７）；ＣＬＬ－１（ＣＬＥＣ１２Ａ、ＭＩＣＬ、及びＤＣＡＬ２）；ＣＬＮ３；ＣＬＵ（クラスタリン）；ＣＭＫＬＲ１；ＣＭＫＯＲ１（ＲＤＣ１）；ＣＮＲ１；ＣＯＬ１８Ａ１；ＣＯＬ１Ａ１；ＣＯＬ４Ａ３；ＣＯＬ６Ａ１；補体因子Ｄ；ＣＲ２；ＣＲＰ；ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ、ＣＲ１、ＣＲＧＦ、ＣＲＩＰＴＯ、ＴＤＧＦ１、奇形腫由来成長因子）；ＣＳＦＩ（Ｍ－ＣＳＦ）；ＣＳＦ２（ＧＭ－ＣＳＦ）；ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）；ＣＴＬＡ４；ＣＴＮＮＢ１（ｂ－カテニン）；ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）；ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤＩ）；ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）；ＣＸＣＬ１（ＧＲＯ１）；ＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０）；ＣＸＣＬ１１（Ｉ－ＴＡＣ／ＩＰ－９）；ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ１）；ＣＸＣＬ１３；ＣＸＣＬ１４；ＣＸＣＬ１６；ＣＸＣＬ２（ＧＲＯ２）；ＣＸＣＬ３（ＧＲＯ３）；ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ－７８／ＬＩＸ）；ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ－２）；ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）；ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ－Ｌ２）；ＣＸＣＲ４；ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫受容体１、Ｇタンパク質共役受容体）；ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）；ＣＹＢ５；ＣＹＣ１；ＣＹＳＬＴＲ１；ＤＡＢ２ＩＰ；ＤＥＳ；ＤＫＦＺｐ４５１Ｊ０１１８；ＤＮＣＬＩ；ＤＰＰ４；Ｅ１６（ＬＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ５）；Ｅ２Ｆ１；ＥＣＧＦ１；ＥＤＧ１；ＥＦＮＡ１；ＥＦＮＡ３；ＥＦＮＢ２；ＥＧＦ；ＥＧＦＲ；ＥＬＡＣ２；ＥＮＧ；ＥＮＯ１；ＥＮＯ２；ＥＮＯ３；ＥＰＨＢ４；ＥｐｈＢ２Ｒ；ＥＰＯ；ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ－２）；ＥＲＥＧ；ＥＲＫ８；ＥＳＲ１；ＥＳＲ２；ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型受容体）；Ｆ３（ＴＦ）；ＦＡＤＤ；ＦａｓＬ；ＦＡＳＮ；ＦＣＥＲ１Ａ；ＦＣＥＲ２；ＦＣＧＲ３Ａ；ＦｃＲＨ１（Ｆｃ受容体様タンパク質１）；ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４、ＩＲＴＡ４、ＳＰＡＰ１Ａ（ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼアンカータンパク質１ａ）、ＳＰＡＰ１Ｂ、ＳＰＡＰ１Ｃ）；ＦＧＦ；ＦＧＦ１（αＦＧＦ）；ＦＧＦ１０；ＦＧＦ１１；ＦＧＦ１２；ＦＧＦ１２Ｂ； ＦＧＦ１３；ＦＧＦ１４；ＦＧＦ１６；ＦＧＦ１７；ＦＧＦ１８；ＦＧＦ１９；ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）；ＦＧＦ２０；ＦＧＦ２１；ＦＧＦ２２；ＦＧＦ２３；ＦＧＦ３（ｉｎｔ－２）；ＦＧＦ４（ＨＳＴ）；ＦＧＦ５；ＦＧＦ６（ＨＳＴ－２）；ＦＧＦ７（ＫＧＦ）；ＦＧＦ８；ＦＧＦ９；ＦＧＦＲ；ＦＧＦＲ３；ＦＩＧＦ（ＶＥＧＦＤ）；ＦＥＬｌ（ＥＰＳＩＬＯＮ）；ＦＩＬｌ（ＺＥＴＡ）；ＦＬＪ１２５８４；ＦＬＪ２５５３０；ＦＬＲＴＩ（フィブロネクチン）；ＦＬＴ１；ＦＯＳ；ＦＯＳＬ１（ＦＲＡ－１）；ＦＹ（ＤＡＲＣ）；ＧＡＢＲＰ（ＧＡＢＡａ）；ＧＡＧＥＢ１；ＧＡＧＥＣ１；ＧＡＬＮＡＣ４Ｓ－６ＳＴ；ＧＡＴＡ３；ＧＤＦ５；ＧＤＮＦ－Ｒａ１（ＧＤＮＦファミリー受容体アルファ１；ＧＦＲＡ１；ＧＤＮＦＲ；ＧＤＮＦＲＡ；ＲＥＴＬ１；ＴＲＮＲ１；ＲＥＴ１Ｌ；ＧＤＮＦＲ－アルファ１；ＧＦＲ－アルファ－１）；ＧＥＤＡ；ＧＦＩ１；ＧＧＴ１；ＧＭ－ＣＳＦ；ＧＮＡＳＩ；ＧＮＲＨＩ；ＧＰＲ２（ＣＣＲ１０）；ＧＰＲ１９（Ｇタンパク質共役受容体１９；ｍＭ．４７８７）；ＧＰＲ３１；ＧＰＲ４４；ＧＰＲ５４（ＫＩＳＳ１受容体；ＫＩＳＳ１Ｒ；ＧＰＲ５４；ＨＯＴ７Ｔ１７５；ＡＸＯＲ１２）；ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）；ＧＰＲ１７２Ａ（Ｇタンパク質共役受容体１７２Ａ；ＧＰＣＲ４１；ＦＬＪ１１８５６；Ｄ１５Ｅｒｔｄ７４７ｅ）；ＧＲＣＣＩＯ（Ｃ１０）；ＧＲＰ；ＧＳＮ（ゲルゾリン）；ＧＳＴＰ１；ＨＡＶＣＲ２；ＨＤＡＣ４；ＨＤＡＣ５；ＨＤＡＣ７Ａ；ＨＤＡＣ９；ＨＧＦ；ＨＩＦ１Ａ；ＨＯＰ１；ヒスタミン及びヒスタミン受容体；ＨＬＡ－Ａ；ＨＬＡ－ＤＯＢ（ＭＨＣクラスＩＩ分子（Ｉａ抗原）のベータサブユニット）；ＨＬＡ－ＤＲＡ；ＨＭ７４；ＨＭＯＸＩ；ＨＵＭＣＹＴ２Ａ；ＩＣＥＢＥＲＧ；ＩＣＯＳＬ；１Ｄ２；ＩＦＮ－ａ；ＩＦＮＡ１；ＩＦＮＡ２；ＩＦＮＡ４；ＩＦＮＡ５；ＩＦＮＡ６；ＩＦＮＡ７；ＩＦＮＢ１；ＩＦＮガンマ；ＤＦＮＷ１；ＩＧＢＰ１；ＩＧＦ１；ＩＧＦ１Ｒ；ＩＧＦ２；ＩＧＦＢＰ２；ＩＧＦＢＰ３；ＩＧＦＢＰ６；ＩＬ－ｌ；ＩＬ１０；ＩＬ１０ＲＡ；ＩＬ１０ＲＢ；ＩＬ１１；ＩＬ１１ＲＡ；ＩＬ－１２；ＩＬ１２Ａ；ＩＬ１２Ｂ；ＩＬ１２ＲＢ１；ＩＬ１２ＲＢ２；ＩＬ１３；ＩＬ１３ＲＡ１；ＩＬ１３ＲＡ２；ＩＬ１４；ＩＬ１５；ＩＬ１５ＲＡ；ＩＬ１６；ＩＬ１７；ＩＬ１７Ｂ；ＩＬ１７Ｃ；ＩＬ１７Ｒ；ＩＬ１８；ＩＬ１８ＢＰ；ＩＬ１８Ｒ１；ＩＬ１８ＲＡＰ；ＩＬ１９；ＩＬ１Ａ；ＩＬ１Ｂ；ＩＬＩＦ１０；ＩＬ１Ｆ５；ＩＬ１Ｆ６；ＩＬ１Ｆ７；ＩＬ１Ｆ８；ＩＬ１Ｆ９；ＩＬ１ＨＹ１；ＩＬ１Ｒ１；ＩＬ１Ｒ２；ＩＬ１ＲＡＰ；ＩＬ１ＲＡＰＬ１；ＩＬ１ＲＡＰＬ２；ＩＬ１ＲＬ１；ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬＩＲＮ；ＩＬ２；ＩＬ２０；ＩＬ２０Ｒα；ＩＬ２１Ｒ；ＩＬ２２；ＩＬ－２２ｃ；ＩＬ２２Ｒ；ＩＬ２２ＲＡ２；ＩＬ２３；ＩＬ２４；ＩＬ２５；ＩＬ２６；ＩＬ２７；ＩＬ２８Ａ；ＩＬ２８Ｂ；ＩＬ２９；ＩＬ２ＲＡ；ＩＬ２ＲＢ；ＩＬ２ＲＧ；ＩＬ３；ＩＬ３０；ＩＬ３ＲＡ；ＩＬ４；ＩＬ４Ｒ；ＩＬ５；ＩＬ５ＲＡ；ＩＬ６；ＩＬ６Ｒ；ＩＬ６ＳＴ（糖タンパク質１３０）；インフルエンザＡ；インフルエンザＢ；ＥＬ７；ＥＬ７Ｒ；ＥＬ８；ＩＬ８ＲＡ；ＤＬ８ＲＢ；ＩＬ８ＲＢ；ＤＬ９；ＤＬ９Ｒ；ＤＬＫ；ＩＮＨＡ；ＩＮＨＢＡ；ＩＮＳＬ３；ＩＮＳＬ４；ＩＲＡＫ１；ＩＲＴＡ２（免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転座関連２）；ＥＲＡＫ２；ＩＴＧＡ１；ＩＴＧＡ２；ＩＴＧＡ３；ＩＴＧＡ６（ａ６インテグリン）；ＩＴＧＡＶ；ＩＴＧＢ３；ＩＴＧＢ４（ｂ４インテグリン）；α４β７及びαＥβ７インテグリンヘテロ二量体；ＪＡＧ１；ＪＡＫ１；ＪＡＫ３；ＪＵＮ；Ｋ６ＨＦ；ＫＡＩ１；ＫＤＲ；ＫＩＴＬＧ；ＫＬＦ５（ＧＣ Ｂｏｘ ＢＰ）；ＫＬＦ６；ＫＬＫＩＯ；ＫＬＫ１２；ＫＬＫ１３；ＫＬＫ１４；ＫＬＫ１５；ＫＬＫ３；ＫＬＫ４；ＫＬＫ５；ＫＬＫ６；ＫＬＫ９；ＫＲＴ１；ＫＲＴ１９（ケラチン１９）；ＫＲＴ２Ａ；ＫＨＴＨＢ６（毛髪特異的Ｈ型ケラチン）；ＬＡＭＡＳ；ＬＥＰ（レプチン）；ＬＧＲ５（ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５；ＧＰＲ４９、ＧＰＲ６７）；Ｌｉｎｇｏ－ｐ７５；Ｌｉｎｇｏ－Ｔｒｏｙ；ＬＰＳ；ＬＴＡ（ＴＮＦ－ｂ）；ＬＴＢ；ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）；ＬＴＢ４Ｒ２；ＬＴＢＲ；ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５）、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質）；Ｌｙ６Ｅ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｅ；Ｌｙ６７，ＲＩＧ－Ｅ，ＳＣＡ－２，ＴＳＡ－１）；Ｌｙ６Ｇ６Ｄ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｇ６Ｄ；Ｌｙ６－Ｄ、ＭＥＧＴ１）；ＬＹ６Ｋ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ；ＬＹ６Ｋ；ＨＳＪ００１３４８；ＦＬＪ３５２２６）；ＭＡＣＭＡＲＣＫＳ；ＭＡＧまたはＯＭｇｐ；ＭＡＰ２Ｋ７（ｃ－Ｊｕｎ）；ＭＤＫ；ＭＤＰ；ＭＩＢ１；ミッドカイン；ＭＥＦ；ＭＩＰ－２；ＭＫＩ６７；（Ｋｉ－６７）；ｍＭＰ２；ｍＭＰ９；ＭＰＦ（ＭＰＦ、ＭＳＬＮ、ＳＭＲ、巨核球増強因子、メソテリン）；ＭＳ４Ａ１；ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４、仮定上のタンパク質ＦＬＪ２０３１５）；ＭＳＭＢ；ＭＴ３（メタロチオネクチン－１１１）；ＭＴＳＳ１；ＭＵＣ１（ムチン）；ＭＹＣ；ＭＹ０８８；Ｎａｐｉ３ｂ（ＮａＰｉ２ｂとしても知られる）（ＮＡＰＩ－３Ｂ、ＮＰＴＩＩｂ、ＳＬＣ３４Ａ２、溶質輸送体ファミリー３４（リン酸ナトリウム）、メンバー２、ＩＩ型ナトリウム依存性リン酸輸送体３ｂ）；ＮＣＡ；ＮＣＫ２；ニューロカン；ＮＦＫＢ１；ＮＦＫＢ２；ＮＧＦＢ（ＮＧＦ）；ＮＧＦＲ；ＮｇＲ－Ｌｉｎｇｏ；ＮｇＲ－Ｎｏｇｏ６６（Ｎｏｇｏ）；ＮｇＲ－ｐ７５；ＮｇＲ－Ｔｒｏｙ；ＮＭＥ１（ＮＭ２３Ａ）；ＮＯＸ５；ＮＰＰＢ；ＮＲ０Ｂ１；ＮＲ０Ｂ２；ＮＲ１Ｄ１；ＮＲ１Ｄ２；ＮＲ１Ｈ２；ＮＲ１Ｈ３；ＮＲ１Ｈ４；ＮＲ１１２；ＮＲ１１３；ＮＲ２Ｃ１；ＮＲ２Ｃ２；ＮＲ２Ｅ１；ＮＲ２Ｅ３；ＮＲ２Ｆ１；ＮＲ２Ｆ２；ＮＲ２Ｆ６；ＮＲ３Ｃ１；ＮＲ３Ｃ２；ＮＲ４Ａ１；ＮＲ４Ａ２；ＮＲ４Ａ３；ＮＲ５Ａ１；ＮＲ５Ａ２；ＮＲ６Ａ１；ＮＲＰ１；ＮＲＰ２；ＮＴ５Ｅ；ＮＴＮ４；ＯＤＺＩ；ＯＰＲＤ１；ＯＸ４０；Ｐ２ＲＸ７；Ｐ２Ｘ５（プリン受容体Ｐ２Ｘリガンド開口型イオンチャネル５）；ＰＡＰ；ＰＡＲＴ
１；ＰＡＴＥ；ＰＡＷＲ；ＰＣＡ３；ＰＣＮＡ；ＰＤ－Ｌ１；ＰＤ－Ｌ２；ＰＤ－１；ＰＯＧＦＡ；ＰＯＧＦＢ；ＰＥＣＡＭ１；ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）；ＰＧＦ；ＰＧＲ；ホスファカン；ＰＩＡＳ２；ＰＩＫ３ＣＧ；ＰＬＡＵ（ｕＰＡ）；ＰＬＧ；ＰＬＸＤＣ１；ＰＭＥＬ１７（シルバーホモログ；ＳＩＬＶ；Ｄ１２Ｓ５３Ｅ；ＰＭＥＬ１７；ＳＩ；ＳＩＬ）；ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）；ＰＰＩＤ；ＰＲＩ；ＰＲＫＣＱ；ＰＲＫＤＩ；ＰＲＬ；ＰＲＯＣ；ＰＲＯＫ２；ＰＳＡＰ；ＰＳＣＡ ｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ、Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２遺伝子）；ＰＴＡＦＲ；ＰＴＥＮ；ＰＴＧＳ２（ＣＯＸ－２）；ＰＴＮ；ＲＡＣ２（ｐ２１ Ｒａｃ２）；ＲＡＲＢ；ＲＥＴ（ｒｅｔ癌原遺伝子；ＭＥＮ２Ａ；ＨＳＣＲ１；ＭＥＮ２Ｂ；ＭＴＣ１；ＰＴＣ；ＣＤＨＦ１２；Ｈｓ．１６８１１４；ＲＥＴ５１；ＲＥＴ－ＥＬＥ１）；ＲＧＳＩ；ＲＧＳ１３；ＲＧＳ３；ＲＮＦ１１０（ＺＮＦ１４４）；ＲＯＢＯ２；Ｓ１００Ａ２；ＳＣＧＢ１Ｄ２（リポフィリンＢ）；ＳＣＧＢ２Ａ１（マンマグロビン２）；ＳＣＧＢ２Ａ２（マンマグロビン１）；ＳＣＹＥＩ（内皮単球活性化サイトカイン）；ＳＤＦ２；Ｓｅｍａ ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４５、Ｍｍ．４２０１５、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡＧ、Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ ５ｂ Ｈｌｏｇ、ｓｅｍａドメイン７回トロンボスポンジン反復配列（１型及び１型様）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）及び短い細胞質ドメイン、（セマフォリン）５Ｂ）；ＳＥＲＰＩＮＡ１；ＳＥＲＰＩＮＡ３；ＳＥＲＰ１ＮＢ５（マスピン）；ＳＥＲＰＩＮＥ１（ＰＡＩ－１）；ＳＥＲＰＤＭＦ１；ＳＨＢＧ；ＳＬＡ２；ＳＬＣ２Ａ２；ＳＬＣ３３Ａ１；ＳＬＣ４３Ａ１；ＳＬＩＴ２；ＳＰＰＩ；ＳＰＲＲ１Ｂ（Ｓｐｒｌ）；ＳＴ６ＧＡＬ１；ＳＴＡＢＩ；ＳＴＡＴ６；ＳＴＥＡＰ（６回膜貫通前立腺上皮抗原）；ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９、ＩＰＣＡ－１、ＰＣＡＮＡＰ１、ＳＴＡＭＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＳＴＭＰ、前立腺癌関連遺伝子１、前立腺癌関連タンパク質１、６回膜貫通前立腺上皮抗原２、６回膜貫通前立腺タンパク質）；ＴＢ４Ｒ２；ＴＢＸ２１；ＴＣＰＩＯ；ＴＯＧＦＩ；ＴＥＫ；ＴＥＮＢ２（推定膜貫通プロテオグリカン）；ＴＧＦＡ；ＴＧＦＢＩ；ＴＧＦＢ１ＩＩ；ＴＧＦＢ２；ＴＧＦＢ３；ＴＧＦＢＩ；ＴＧＦＢＲＩ；ＴＧＦＢＲ２；ＴＧＦＢＲ３；ＴＨＩＬ；ＴＨＢＳＩ（トロンボスポンジン－１）；ＴＨＢＳ２；ＴＨＢＳ４；ＴＨＰＯ；ＴＩＥ（Ｔｉｅ－１）；ＴＭＰ３；組織因子；ＴＬＲ１；ＴＬＲ２；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＴＬＲ５；ＴＬＲ６；ＴＬＲ７；ＴＬＲ８；ＴＬＲ９；ＴＬＲ１０；ＴＭＥＦＦ１（ＥＧＦ様及び２つのフォリスタチン様ドメインを有する膜貫通タンパク質１； トモレグリン－１）；ＴＭＥＭ４６（ｓｈｉｓａホモログ２）；ＴＮＦ；ＴＮＦ－ａ；ＴＮＦＡＥＰ２（Ｂ９４）；ＴＮＦＡＩＰ３；ＴＮＦＲＳＦＩＩＡ；ＴＮＦＲＳＦ１Ａ；ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ；ＴＮＦＲＳＦ２１；ＴＮＦＲＳＦ５；ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）；ＴＮＦＲＳＦ７；ＴＮＦＲＳＦ８；ＴＮＦＲＳＦ９；ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）；ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ）；ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰ０３Ｌ）；ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）；ＴＮＦＳＦ１３Ｂ；ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ－Ｌ）；ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）；ＴＮＦＳＦ１８；ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）；ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）；ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）；ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）；ＴＮＦＳＦＳ（ＣＤ３０リガンド）；ＴＮＦＳＦ９（４－１ＢＢリガンド）；ＴＯＬＬＩＰ；Ｔｏｌｌ様受容体；ＴＯＰ２Ａ（トポイソメラーゼＥａ）；ＴＰ５３；ＴＰＭ１；ＴＰＭ２；ＴＲＡＤＤ；ＴＭＥＭ１１８（リングフィンガータンパク質、膜貫通２；ＲＮＦＴ２；ＦＬＪ１４６２７）；ＴＲＡＦ１；ＴＲＡＦ２；ＴＲＡＦ３；ＴＲＡＦ４；ＴＲＡＦ５；ＴＲＡＦ６；ＴＲＥＭ１；ＴＲＥＭ２；ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、一過性受容体電位カチオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー４）；ＴＲＰＣ６；ＴＳＬＰ；ＴＷＥＡＫ；チロシナーゼ（ＴＹＲ；ＯＣＡＩＡ；ＯＣＡ１Ａ；チロシナーゼ；ＳＨＥＰ３）；ＶＥＧＦ；ＶＥＧＦＢ；ＶＥＧＦＣ；バーシカン；ＶＨＬ Ｃ５；ＶＬＡ－４；ＸＣＬ１（リンホタクチン）；ＸＣＬ２（ＳＣＭ－１ｂ）；ＸＣＲＩ（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲＩ）；ＹＹ１；ならびにＺＦＰＭ２から選択される、１つ以上の標的に結合することができる。

【0133】

ある特定の実施形態において、本明細書に提供される方法に従って産生される抗体（または二重特異性抗体）の標的分子としては、ＣＤタンパク質（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤＳ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１（ＣＲ２（補体受容体２）もしくはＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エプスタイン・バーウイルス受容体）またはＨｓ．７３７９２））；ＣＤ３３；ＣＤ３４；ＣＤ６４；ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２、Ｌｙｂ－２）；ＣＤ７９ｂ（ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ７９β、ＩＧｂ（免疫グロブリン関連ベータ）、Ｂ２９）；ＥｒｂＢ受容体ファミリーのＣＤ２００メンバー（ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ４受容体など）；細胞接着分子（ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０．９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、アルファ４／ベータ７インテグリン、及びアルファｖ／ベータ３インテグリン（これらのアルファまたはベータのいずれかのサブユニット（例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８、もしくは抗ＣＤ１１ｂ抗体）を含む）など）；成長因子（ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｃなど）；組織因子（ＴＦ）；アルファインターフェロン（アルファＩＦＮ）；ＴＮＦアルファ、インターロイキン（ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＬ１７ＡＦ、ＩＬ－１Ｓ、ＩＬ－１３Ｒアルファ１、ＩＬ１３Ｒアルファ２、ＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－５Ｒ、ＩＬ－９Ｒ、ＩｇＥなど）；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ－４；ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫ、ＲＳＶ Ｆタンパク質、タンパク質Ｃなどが挙げられる。

【0134】

ある特定の実施形態において、本明細書に提供される方法を使用して、補体タンパク質Ｃ５に特異的に結合する抗体（または二重特異性抗体などの多重特異性抗体）（例えば、ヒトＣ５に特異的に結合する抗Ｃ５アゴニスト抗体）を産生することができる。いくつかの実施形態において、抗Ｃ５抗体は、（ａ）ＳＳＹＹＭＡ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｂ）ＡＩＦＴＧＳＧＡＥＹＫＡＥＷＡＫＧ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、（ｃ）ＤＡＧＹＤＹＰＴＨＡＭＨＹ（配列番号２７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３、（ｄ）ＲＡＳＱＧＩＳＳＳＬＡ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｅ）ＧＡＳＥＴＥＳ（配列番号２９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び（ｆ）ＱＮＴＫＶＧＳＳＹＧＮＴ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される、１、２、３、４、５、または６つのＨＶＲを含む。例えば、いくつかの実施形態において、抗Ｃ５抗体は、（ａ）ＳＳＹＹＭＡ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｂ）ＡＩＦＴＧＳＧＡＥＹＫＡＥＷＡＫＧ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、（ｃ）ＤＡＧＹＤＹＰＴＨＡＭＨＹ（配列番号２７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３から選択される、１つ、２つ、もしくは３つのＨＶＲを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、ならびに／または（ｄ）ＲＡＳＱＧＩＳＳＳＬＡ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｅ）ＧＡＳＥＴＥＳ（配列番号２９）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び（ｆ）ＱＮＴＫＶＧＳＳＹＧＮＴ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される、１つ、２つ、もしくは３つのＨＶＲを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む。上記のＨＶＲ－Ｈ１、ＨＶＲ－Ｈ２、ＨＶＲ－Ｈ３、ＨＶＲ－Ｌ１、ＨＶＲ－Ｌ２、及びＨＶＲ－Ｌ３配列はそれぞれ、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、及び配列番号１２５としてＵＳ２０１６／０１７６９５４に開示されている。（ＵＳ２０１６／０１７６９５４の表７及び８を参照されたい。）

【0135】

ある特定の実施形態において、抗Ｃ５抗体はそれぞれ、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧ ＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬ ＳＣＡＡＳＧＦＴＶＨ ＳＳＹＹＭＡＷＶＲＱ ＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧ ＡＩＦＴＧＳＧＡＥＹ ＫＡＥＷＡＫＧＲＶＴ ＩＳＫＤＴＳＫＮＱＶ ＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶ ＤＴＡＴＹＹＣＡＳＤ ＡＧＹＤＹＰＴＨＡＭ ＨＹＷＧＱＧＴＬＶＴ ＶＳＳ（配列番号３１）
及び
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ ＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳ ＳＳＬＡＷＹＱＱＫＰ ＧＫＡＰＫＬＬＩＹＧ ＡＳＥＴＥＳＧＶＰＳ ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ ＥＤＦＡＴＹＹＣＱＮ ＴＫＶＧＳＳＹＧＮＴ ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号３２）におけるＶＨ及びＶＬ配列（それらの配列の翻訳後修飾を含む）を含む。上記のＶＨ及びＶＬ配列はそれぞれ、配列番号１０６及び配列番号１１１としてＵＳ２０１６／０１７６９５４に開示されている。（ＵＳ２０１６／０１７６９５４の表７及び８を参照されたい。）いくつかの実施形態において、抗Ｃ５抗体は、３０５Ｌ０１５である（ＵＳ２０１６／０１７６９５４を参照されたい）。

【0136】

ある特定の実施形態において、本明細書に提供される方法を使用して、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体（または二重特異性抗体などの多重特異性抗体）（例えば、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する抗ＯＸ４０アゴニスト抗体）を産生することができる。いくつかの実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、（ａ）ＤＳＹＭＳ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｂ）ＤＭＹＰＤＮＧＤＳＳＹＮＱＫＦＲＥ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、（ｃ）ＡＰＲＷＹＦＳＶ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３、（ｄ）ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｅ）ＹＴＳＲＬＲＳ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び（ｆ）ＱＱＧＨＴＬＰＰＴ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される、１、２、３、４、５、または６つのＨＶＲを含む。例えば、いくつかの実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、（ａ）ＤＳＹＭＳ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｂ）ＤＭＹＰＤＮＧＤＳＳＹＮＱＫＦＲＥ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｃ）ＡＰＲＷＹＦＳＶ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３から選択される、１つ、２つ、もしくは３つのＨＶＲを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、ならびに／または（ａ）ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｂ）ＹＴＳＲＬＲＳ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び（ｃ）ＱＱＧＨＴＬＰＰＴ（配列番号７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される、１つ、２つ、もしくは３つのＨＶＲを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体はそれぞれ、
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥ ＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶ ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴ ＤＳＹＭＳＷＶＲＱＡ ＰＧＱＧＬＥＷＩＧＤ ＭＹＰＤＮＧＤＳＳＹ ＮＱＫＦＲＥＲＶＴＩ ＴＲＤＴＳＴＳＴＡＹ ＬＥＬＳＳＬＲＳＥＤ ＴＡＶＹＹＣＶＬＡＰ ＲＷＹＦＳＶＷＧＱＧ ＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号８）
及び
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ ＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳ ＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰ ＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹ ＴＳＲＬＲＳＧＶＰＳ ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ ＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱ ＧＨＴＬＰＰＴＦＧＱ ＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号９）におけるＶＨ及びＶＬ配列（それらの配列の翻訳後修飾を含む）を含む。

【0137】

いくつかの実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、（ａ）ＮＹＬＩＥ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｂ）ＶＩＮＰＧＳＧＤＴＹＹＳＥＫＦＫＧ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、（ｃ）ＤＲＬＤＹ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３、（ｄ）ＨＡＳＱＤＩＳＳＹＩＶ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｅ）ＨＧＴＮＬＥＤ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び（ｆ）ＶＨＹＡＱＦＰＹＴ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される、１、２、３、４、５、または６つのＨＶＲを含む。例えば、いくつかの実施形態において、抗ＯＸ４０抗体は、（ａ）ＮＹＬＩＥ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、（ｂ）ＶＩＮＰＧＳＧＤＴＹＹＳＥＫＦＫＧ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、及び（ｃ）ＤＲＬＤＹ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３から選択される、１つ、２つ、もしくは３つのＨＶＲを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、ならびに／または（ａ）ＨＡＳＱＤＩＳＳＹＩＶ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、（ｂ）ＨＧＴＮＬＥＤ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２、及び（ｃ）ＶＨＹＡＱＦＰＹＴ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される、１つ、２つ、もしくは３つのＨＶＲを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む。ある特定の実施形態において、抗ＯＸ４０抗体はそれぞれ、
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥ ＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶ ＳＣＫＡＳＧＹＡＦＴ ＮＹＬＩＥＷＶＲＱＡ ＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶ ＩＮＰＧＳＧＤＴＹＹ ＳＥＫＦＫＧＲＶＴＩ ＴＲＤＴＳＴＳＴＡＹ ＬＥＬＳＳＬＲＳＥＤ ＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲ ＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶ ＴＶＳＳ（配列番号１６）
及び
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ ＩＴＣＨＡＳＱＤＩＳ ＳＹＩＶＷＹＱＱＫＰ ＧＫＡＰＫＬＬＩＹＨ ＧＴＮＬＥＤＧＶＰＳ ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ ＥＤＦＡＴＹＹＣＶＨ ＹＡＱＦＰＹＴＦＧＱ ＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１７）
におけるＶＨ及びＶＬ配列（それらの配列の翻訳後修飾を含む）を含む。

【0138】

抗ＯＸ４０抗体に関する更なる詳細は、ＷＯ２０１５／１５３５１３に提供されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0139】

ある特定の実施形態において、本明細書に提供される方法を使用して、インフルエンザウイルスＢ赤血球凝集素、すなわち、「ｆｌｕＢ」に特異的に結合する抗体（または二重特異性抗体などの多重特異性抗体）（例えば、インビトロ及び／またはインビボで、インフルエンザＢウイルスの山形系統に由来する赤血球凝集素に結合する抗体、インフルエンザＢウイルスのビクトリア系統に由来する赤血球凝集素に結合する抗体、インフルエンザＢウイルスの先祖系統に由来する赤血球凝集素に結合する抗体、またはインフルエンザＢウイルスの山形系統、ビクトリア系統、及び先祖系統に由来する赤血球凝集素に結合する抗体）を産生することができる。抗ＦｌｕＢ抗体に関する更なる詳細は、ＷＯ２０１５／１４８８０６に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0140】

ある特定の実施形態において、本明細書に提供される方法に従って産生される抗体（または二重特異性抗体）は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）－１もしくはＬＲＰ－８またはトランスフェリン受容体、ならびにベータ－セクレターゼ（ＢＡＣＥ１またはＢＡＣＥ２）、アルファ－セクレターゼ、ガンマ－セクレターゼ、ｔａｕ－セクレターゼ、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、デス受容体６（ＤＲ６）、アミロイドベータペプチド、アルファ－シヌクレイン、パーキン、ハンチンチン、ｐ７５ ＮＴＲ、ＣＤ４０、及びカスパーゼ－６からなる群から選択される、少なくとも１つの標的と結合する。

【0141】

ある特定の実施形態において、本明細書に提供される方法に従って産生される抗体は、ＣＤ４０に対するヒトＩｇＧ２抗体である。ある特定の実施形態において、抗ＣＤ４０抗体は、ＲＧ７８７６である。

【0142】

ある特定の実施形態において、本明細書に提供される方法に従って産生されるポリペプチドは、標的免疫サイトカインである。ある特定の実施形態において、標的免疫サイトカインは、ＣＥＡ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカインである。ある特定の実施形態において、ＣＥＡ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカインは、ＲＧ７８１３である。ある特定の実施形態において、標的免疫サイトカインは、ＦＡＰ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカインである。ある特定の実施形態において、ＦＡＰ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカインは、ＲＧ７４６１である。

【0143】

ある特定の実施形態において、本明細書に提供される方法に従って産生される多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、ＣＥＡ及び少なくとも１つの追加の標的分子と結合する。ある特定の実施形態において、本明細書に提供される方法に従って産生される多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、腫瘍標的サイトカイン及び少なくとも１つの追加の標的分子と結合する。ある特定の実施形態において、本明細書に提供される方法に従って産生される多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、ＩＬ２ｖ（すなわち、インターロイキン２バリアント）に融合され、ＩＬ１系免疫サイトカイン及び少なくとも１つの追加の標的分子と結合する。ある特定の実施形態において、本明細書に提供される方法に従って産生される多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、Ｔ細胞二重特異性抗体（すなわち、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーまたはＢｉＴＥ）である。

【0144】

ある特定の実施形態において、本明細書に提供される方法に従って産生される多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、ＩＬ－１アルファ及びＩＬ－１ベータ、ＩＬ－１２及びＩＬ－１Ｓ；ＩＬ－１３及びＩＬ－９；ＩＬ－１３及びＩＬ－４；ＩＬ－１３及びＩＬ－５；ＩＬ－５及びＩＬ－４；ＩＬ－１３及びＩＬ－１ベータ；ＩＬ－１３及びＩＬ－２５；ＩＬ－１３及びＴＡＲＣ；ＩＬ－１３及びＭＤＣ；ＩＬ－１３及びＭＥＦ；ＩＬ－１３及びＴＧＦ－～；ＩＬ－１３及びＬＨＲアゴニスト；ＩＬ－１２及びＴＷＥＡＫ、ＩＬ－１３及びＣＬ２５；ＩＬ－１３及びＳＰＲＲ２ａ；ＩＬ－１３及びＳＰＲＲ２ｂ；ＩＬ－１３及びＡＤＡＭＳ、ＩＬ－１３及びＰＥＤ２、ＩＬ１７Ａ及びＩＬ１７Ｆ、ＣＥＡ及びＣＤ３、ＣＤ３及びＣＤ１９、ＣＤ１３８及びＣＤ２０；ＣＤ１３８及びＣＤ４０；ＣＤ１９及びＣＤ２０；ＣＤ２０及びＣＤ３；ＣＤ３Ｓ及びＣＤ１３Ｓ；ＣＤ３Ｓ及びＣＤ２０；ＣＤ３Ｓ及びＣＤ４０；ＣＤ４０及びＣＤ２０；ＣＤ－Ｓ及びＩＬ－６；ＣＤ２０及びＢＲ３、ＴＮＦアルファ及びＴＧＦ－ベータ、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１ベータ；ＴＮＦアルファ及びＩＬ－２、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－３、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－４、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－５、ＴＮＦアルファ及びＩＬ６、ＴＮＦアルファ及びＩＬ８、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－９、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１０、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１１、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１２、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１３、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１４、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１５、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１６、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１７、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１８、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１９、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－２０、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－２３、ＴＮＦアルファ及びＩＦＮアルファ、ＴＮＦアルファ及びＣＤ４、ＴＮＦアルファ及びＶＥＧＦ、ＴＮＦアルファ及びＭＩＦ、ＴＮＦアルファ及びＩＣＡＭ－１、ＴＮＦアルファ及びＰＧＥ４、ＴＮＦアルファ及びＰＥＧ２、ＴＮＦアルファ及びＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦアルファ及びＴｅ３８、ＴＮＦアルファ及びＢＡＦＦ、ＴＮＦアルファ及びＣＤ２２、ＴＮＦアルファ及びＣＴＬＡ－４、ＴＮＦアルファ及びＧＰ１３０、ＴＮＦａ及びＩＬ－１２ｐ４０、ＶＥＧＦ及びアンジオポエチン、ＶＥＧＦ及びＨＥＲ２、ＶＥＧＦ－Ａ及びＨＥＲ２、ＶＥＧＦ－Ａ及びＰＤＧＦ、ＨＥＲ１及びＨＥＲ２、ＶＥＧＦＡ及びＡＮＧ２、ＶＥＧＦ－Ａ及びＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｃ及びＶＥＧＦ－Ｄ、ＨＥＲ２及びＤＲ５、ＶＥＧＦ及びＩＬ－８、ＶＥＧＦ及びＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ及びＭＥＴ受容体、ＥＧＦＲ及びＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ及びＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及びＣＤ６４、ＨＥＲ２及びＣＤ３、ＨＥＲ２及びＣＤ１６、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３；ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）及びＨＥＲ２、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ４、ＩＬ－１４及びＩＬ－１３、ＩＬ－１３及びＣＤ４０Ｌ、ＩＬ４及びＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦＲ１及びＩＬ－１Ｒ、ＴＮＦＲ１及びＩＬ－６Ｒ、ならびにＴＮＦＲ１及びＩＬ－１８Ｒ、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ３、ＭＡＰＧ及びＣＤ２８、ＥＧＦＲ及びＣＤ６４、ＣＳＰＧ及びＲＧＭ Ａ；ＣＴＬＡ－４及びＢＴＮ０２；ＩＧＦ１及びＩＧＦ２；ＩＧＦ１／２及びＥｒｂ２Ｂ；ＭＡＧ及びＲＧＭ Ａ；ＮｇＲ及びＲＧＭ Ａ；ＮｏｇｏＡ及びＲＧＭ Ａ；ＯＭＧｐ及びＲＧＭ Ａ；ＰＯＬ－ｌ及びＣＴＬＡ－４；ならびにＲＧＭ Ａ及びＲＧＭ Ｂから選択される、少なくとも２つの標的分子に結合する。

【0145】

ある特定の実施形態において、多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。ある特定の実施形態において、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＲＧ７８０２である。ある特定の実施形態において、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号１８～２１に明記されるアミノ酸配列を含むが、以下に提供される。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ ＩＴＣＫＡＳＡＡＶＧ ＴＹＶＡＷＹＱＱＫＰ ＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳ ＡＳＹＲＫＲＧＶＰＳ
ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ ＥＤＦＡＴＹＹＣＨＱ ＹＹＴＹＰＬＦＴＦＧ ＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴ ＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰ
ＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴ ＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦ ＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫ ＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳ ＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫ ＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬ
ＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨ ＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱ ＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦ ＮＲＧＥＣ（配列番号１８）
ＱＡＶＶＴＱＥＰＳＬ ＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬ ＴＣＧＳＳＴＧＡＶＴ ＴＳＮＹＡＮＷＶＱＥ ＫＰＧＱＡＦＲＧＬＩ ＧＧＴＮＫＲＡＰＧＴ
ＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧ ＧＫＡＡＬＴＬＳＧＡ ＱＰＥＤＥＡＥＹＹＣ ＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦ ＧＧＧＴＫＬＴＶＬＳ ＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦ
ＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳ ＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶ ＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶ ＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧ ＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳ ＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶ
ＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱ ＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰ ＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥ ＰＫＳＣ（配列番号１９）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥ ＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶ ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴ ＥＦＧＭＮＷＶＲＱＡ ＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷ ＩＮＴＫＴＧＥＡＴＹ
ＶＥＥＦＫＧＲＶＴＦ ＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹ ＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤ ＴＡＶＹＹＣＡＲＷＤ ＦＡＹＹＶＥＡＭＤＹ ＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳ
ＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦ ＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳ ＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶ ＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶ ＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧ ＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳ
ＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶ ＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱ ＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰ ＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥ ＰＫＳＣＤＧＧＧＧＳ ＧＧＧＧＳＥＶＱＬＬ
ＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧ ＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ ＧＦＴＦＳＴＹＡＭＮ ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬ ＥＷＶＳＲＩＲＳＫＹ ＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳ
ＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤ ＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭ ＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶ ＹＹＣＶＲＨＧＮＦＧ ＮＳＹＶＳＷＦＡＹＷ ＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＡＳＶＡＡＰＳＶＦＩ ＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳ ＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮ ＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱ ＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧ ＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤ
ＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳ ＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥ ＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴ ＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ ＳＦＮＲＧＥＣＤＫＴ ＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥ
ＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦ ＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩ ＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶ ＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶ ＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥ ＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥ
ＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶ ＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷ ＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶ ＳＮＫＡＬＧＡＰＩＥ ＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰ ＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰ
ＣＲＤＥＬＴＫＮＱＶ ＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹ ＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳ ＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴ ＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳ ＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤ
ＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦ ＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨ ＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬ ＳＰＧＫ（配列番号２０）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥ ＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶ ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴ ＥＦＧＭＮＷＶＲＱＡ ＰＧＱＧＬＥＷＭＧ ＷＩＮＴＫＴＧＥＡＴＹ
ＶＥＥＦＫＧＲＶＴＦ ＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹ ＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤ ＴＡＶＹＹＣＡＲＷＤ ＦＡＹＹＶＥＡＭＤ ＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳ
ＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦ ＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳ ＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶ ＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶ ＳＷＮＳＧＡＬＴＳ ＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳ
ＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶ ＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱ ＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰ ＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥ ＰＫＳＣＤＫＴＨＴ ＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧ
ＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫ ＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴ ＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶ ＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮ ＷＹＶＤＧＶＥＶＨ ＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹ
ＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬ ＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧ ＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫ ＡＬＧＡＰＩＥＫＴＩ ＳＫＡＫＧＱＰＲＥ ＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＤ
ＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳ ＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤ ＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱ ＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰ ＶＬＤＳＤＧＳＦＦ ＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲ
ＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳ ＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹ ＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ Ｋ（配列番号２１）

【0146】

抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体に関する更なる詳細は、ＷＯ２０１４／１２１７１２に提供されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0147】

ある特定の実施形態において、多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体である。ある特定の実施形態において、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体二重特異性抗体は、Ｃｒｏｓｓｍａｂである。ある特定の実施形態において、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体は、ＲＧ７７１６である。ある特定の実施形態において、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、配列番号２２～２５に明記されるアミノ酸配列を含むが、以下に提供される。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧ ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ ＳＣＡＡＳＧＹＤＦＴ ＨＹＧＭＮＷＶＲＱＡ ＰＧＫＧＬＥＷＶＧＷ ＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹ
ＡＡＤＦＫＲＲＦＴＦ ＳＬＤＴＳＫＳＴＡＹ ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ ＴＡＶＹＹＣＡＫＹＰ ＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦ ＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴ
ＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳ ＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳ ＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣ ＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶ ＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴ ＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬ
ＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳ ＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧ ＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨ ＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫ ＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨ ＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡ
ＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰ ＰＫＰＫＤＴＬＭＡＳ ＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶ ＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫ ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶ ＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥ
ＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳ ＶＬＴＶＬＡＱＤＷＬ ＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳ ＮＫＡＬＧＡＰＩＥＫ ＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲ ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣ
ＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳ ＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰ ＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮ ＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴ ＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦ ＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫ
ＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳ ＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮ ＡＹＴＱＫＳＬＳＬＳ ＰＧＫ（配列番号２２）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥ ＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶ ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴ ＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡ ＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷ ＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹ
ＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭ ＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹ ＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤ ＴＡＶＹＹＣＡＲＳＰ ＮＰＹＹＹＤＳＳＧＹ ＹＹＰＧＡＦＤＩＷＧ
ＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡ ＳＶＡＡＰＳＶＦＩＦ ＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧ ＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮ ＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷ ＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮ
ＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳ ＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴ ＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫ ＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨ ＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳ ＦＮＲＧＥＣＤＫＴＨ
ＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡ ＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰ ＰＫＰＫＤＴＬＭＡＳ ＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶ ＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫ ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶ
ＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥ ＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳ ＶＬＴＶＬＡＱＤＷＬ ＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳ ＮＫＡＬＧＡＰＩＥＫ ＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲ
ＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳ ＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳ ＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰ ＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮ ＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴ ＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦ
ＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫ ＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳ ＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮ ＡＹＴＱＫＳＬＳＬＳ ＰＧＫ（配列番号２３）
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳ ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ ＩＴＣＳＡＳＱＤＩＳ ＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰ ＧＫＡＰＫＶＬＩＹＦ ＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳ
ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ ＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱ ＹＳＴＶＰＷＴＦＧＱ ＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶ ＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ
ＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡ ＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹ ＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶ ＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱ ＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤ ＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴ
ＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫ ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧ ＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮ ＲＧＥＣ（配列番号２４）
ＳＹＶＬＴＱＰＰＳＶ ＳＶＡＰＧＱＴＡＲＩ ＴＣＧＧＮＮＩＧＳＫ ＳＶＨＷＹＱＱＫＰＧ ＱＡＰＶＬＶＶＹＤＤ ＳＤＲＰＳＧＩＰＥＲ
ＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡ ＴＬＴＩＳＲＶＥＡＧ ＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷ ＤＳＳＳＤＨＷＶＦＧ ＧＧＴＫＬＴＶＬＳＳ ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ
ＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧ ＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫ ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ
ＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴ ＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳ ＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰ ＫＳＣ（配列番号２５）

【0148】

ある特定の実施形態において、多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体である。ある特定の実施形態において、抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体は、ＲＧ７２２１である。ある特定の実施形態において、抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体は、ＣＡＳ番号１４４８２２１－０５－３である。

【0149】

他の分子に任意でコンジュゲートされる可溶性抗原またはそれらの断片は、抗体を生成するための免疫原として使用され得る。受容体などの膜貫通分子では、これらの断片（例えば、受容体の細胞外ドメイン）が免疫原として使用され得る。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞が免疫原として使用され得る。そのような細胞は、天然源（例えば、がん細胞株）に由来し得るか、または膜貫通分子を発現するように組み換え技術によって形質転換された細胞であり得る。抗体を調製するのに有用な他の抗原及びそれらの形態は、当業者にとって明らかだろう。

【0150】

ある特定の実施形態において、本明細書において産生されるポリペプチド（例えば、抗体）は、色素などの化学分子または化学療法剤などの細胞傷害剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性毒素、またはそれらの断片）、あるいは放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）に更にコンジュゲートされ得る。本明細書に記載される方法を使用して産生される抗体または二重特異性抗体を含む免疫コンジュゲートは、重鎖のうちの１つのみまたは軽鎖のうちの１つのみの定常領域にコンジュゲートされた細胞傷害剤を含有し得る。

【0151】

Ｃ．薬学的組成物及び製剤
本明細書に提供される方法に従って産生されるポリペプチド（例えば、抗体または二重特異性抗体）は、それらの投与が好適となるように、好適な担体または賦形剤とともに製剤化され得る。本明細書に提供される方法に従って産生されるポリペプチド（例えば、抗体または二重特異性抗体）の好適な製剤は、所望される程度の純度を有するポリペプチド（例えば、抗体または二重特異性抗体）を、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、１つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することによって得られる。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、レシピエントに対し、用いられる投薬量及び濃度で無毒であり、緩衝剤（リン酸、クエン酸、及び他の有機酸など）、アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤、保存剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチルもしくはプロピルパラベンなど）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、及びｍ－クレゾールなど）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなど）、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなど）、単糖類、二糖類、及び他の炭水化物（グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む）、キレート剤（ＥＤＴＡなど）、糖類（スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなど）、塩形成対イオン（ナトリウムなど）、金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）、ならびに／または非イオン性界面活性剤（ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）を含む。例示的な抗体製剤は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる、Ｗ０９８／５６４１８に記載されている。皮下投与に適合した凍結乾燥製剤は、Ｗ０９７／０４８０１に記載されている。そのような凍結乾燥製剤は、好適な希釈剤により高タンパク質濃度に再構成され得、この再構成された製剤は、本明細書において治療される哺乳動物に皮下投与され得る。

【0152】

本明細書における製剤はまた、治療されている特定の適応症に必要とされる２つ以上の活性化合物、好ましくは相互に悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有してもよい。例えば、抗抗悪性腫瘍剤、成長阻害剤、細胞傷害剤、または化学療法剤を更に提供することが望ましくあり得る。そのような分子は、好適には、意図される目的のために有効な量の組み合わせで存在する。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在するポリペプチド（例えば、抗体または二重特異性抗体）の量、疾患または障害または治療の種類、ならびに上に考察される他の要因に依存する。これらは一般に、本明細書に記載されるものと同じ投薬量及び投与経路で、または従来用いられる投薬量の約１～９９％で使用される。活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によって、もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ－（メチルメタシレート）マイクロカプセル内、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロ乳濁液、ナノ粒子、及びナノカプセル）内、またはマクロ乳濁液中にも取り込まれ得る。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。徐放性調製物が調製され得る。徐放性調製物の好適な例としては、アンタゴニストを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスが挙げられ、このマトリクスは、成形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態にある。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ－グルタミン酸及びエチル－Ｌ－グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン－ビニル、分解性乳酸－グリコール酸コポリマー（ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸－グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なマイクロスフェア）など）、ならびにポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸が挙げられる。

【0153】

任意ではあるが好ましくは、製剤は、薬学的に許容される塩、好ましくは塩化ナトリウムを含有し、好ましくは、およそ生理学的濃度である。任意で、製剤は、薬学的に許容される保存剤を含有し得る。いくつかの実施形態において、保存剤濃度は、０．１～２．０％の、典型的には体積濃度の範囲である。好適な保存剤としては、薬学の技術分野において既知であるものが挙げられる。ベンジルアルコール、フェノール、ｍ－クレゾール、メチルパラベン、及びプロピルパラベンが、好ましい保存剤である。任意で、製剤は、薬学的に許容される界面活性剤を０．００５～０．０２％の濃度で含み得る。

【0154】

徐放性調製物が調製され得る。徐放性調製物の好適な例としては、本明細書に提供される方法に従って産生されるポリペプチド（例えば、抗体または二重特異性抗体）を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスが挙げられ、このマトリクスは、成形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ－グルタミン酸及びエチル－Ｌ－グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン－酢酸ビニル、分解性乳酸－グリコール酸コポリマー（ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸－グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドで構成される注射可能なマイクロスフェア）など）、ならびにポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン－酢酸ビニル及び乳酸－グリコール酸などのポリマーが１００日間を超える分子の放出を可能にする一方で、特定のヒドロゲルは、より短い期間にわたってタンパク質を放出する。本明細書に提供される方法に従って産生されるカプセル化されたポリペプチド（複数可）（例えば、抗体または二重特異性抗体）が長期間体内に残存する場合、それらは、３７℃の水分への曝露の結果として変性または凝集し、生物学的活性の喪失、及び免疫原性の変化の可能性をもたらし得る。関与する機構に応じて、安定化のための合理的な戦略が考案され得る。例えば、凝集機構が、チオ－ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ－Ｓ結合の形成であると発見された場合、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含有量を制御し、適当な添加剤を使用し、かつ特定のポリマーマトリクス組成物を開発することによって、達成され得る。

【0155】

本明細書に提供される方法に従って産生されるポリペプチド（例えば、抗体または二重特異性抗体）は、ボーラスとしてのまたは一定期間にわたる連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、くも膜下腔内、経口、局所、または吸入経路によるものなどの既知の方法に従って、ヒト対象に投与される。広範囲の副作用または毒性が、タンパク質によって認識される標的分子に対するアンタゴニズムに関連付けられる場合には、局所投与が特に所望され得る。エキソビボ戦略もまた、治療用途に使用され得る。エキソビボ戦略は、対象から得られた細胞に、本発明に提供されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを形質移入または形質導入することを伴う。その後、形質移入または形質導入された細胞を対象に戻す。これらの細胞は、造血細胞（例えば、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｔ細胞、もしくはＢ細胞）、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、角化細胞、または筋肉細胞を非限定的に含む、広範囲の種類のいずれかであり得る。

【0156】

一例において、本明細書に提供される方法に従って産生されるポリペプチド（例えば、抗体または二重特異性抗体）は、腫瘍の障害または位置が許容する場合、例えば、直接注射によって局所投与され、注射は定期的に繰り返すことができる。ポリペプチド（例えば、抗体または二重特異性抗体）は、局所再発または転移を防止または低下させるために、対象に全身送達すること、または腫瘍の外科的切除の後に腫瘍細胞、例えば、腫瘍もしくは腫瘍床に直接送達することもできる。

【0157】

Ｄ．製造品及びキット
本明細書に提供される方法に従って産生される１つ以上のポリペプチド（例えば、抗体または二重特異性抗体）と、障害（例えば、自己免疫疾患またはがん）の治療または診断に有用な物質とを含有する製造品もまた提供される。ある特定の実施形態において、製造品は、容器と、容器上のもしくは容器に付随するラベルまたは添付文書とを含む。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料から形成され得る。容器は、病態の治療に有効である組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって穿刺可能な栓を有する静注溶液バッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本明細書に提供される方法に従って産生されるポリペプチド（例えば、抗体または二重特異性抗体）である。ラベルまたは添付文書は、組成物が特定の病態の治療に使用されることを示す。ラベルまたは添付文書は、本明細書に提供される方法に従って産生されるポリペプチド（例えば、抗体または二重特異性抗体）を含む組成物を対象に投与するための説明書を更に含むだろう。本明細書に記載される併用治療薬を含む製造品及びキットもまた企図される。

【0158】

「添付文書」は、は、適応症、使用法、投薬量、投与、禁忌症に関する情報、及び／またはそのような治療製品の使用に関する警告を含有する、治療製品の商業用パッケージに通例含まれる説明書を指す。ある特定の実施形態において、添付文書は、組成物が、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、腎細胞癌、神経膠腫、または卵巣癌を治療するために使用されることを示す。

【0159】

加えて、製造品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル溶液、及びデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第２の容器を更に含み得る。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的観点及びユーザの観点から考慮される他の材料を更に含んでもよい。

【0160】

様々な目的のため、例えば、細胞からの２つ以上の標的抗原の精製または免疫沈降のために有用なキットもまた提供される。２つ以上の標的抗原の単離及び精製のために、キットは、ビーズ（例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ）に共役した、本明細書に提供される方法に従って産生されるポリペプチド（例えば、抗体または二重特異性抗体）を含有し得る。抗原をインビトロで、例えば、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットで検出及び定量化するための、本明細書に提供される方法に従って産生されるポリペプチド（例えば、抗体または二重特異性抗体）を含有するキットが提供され得る。製造品と同様に、キットは、容器と、容器上のもしくは容器に付随するラベルまたは添付文書とを含む。容器は、本明細書に提供される方法に従って産生される少なくとも１つのポリペプチド（例えば、抗体または二重特異性抗体）を含む組成物を保持する。例えば、希釈剤及び緩衝液、または対照抗体を含有する追加の容器が含まれてもよい。そのラベルまたは添付文書は、その組成物の説明及び意図されているインビトロまたは診断用途についての説明書を提供し得る。

【実施例】

【0161】

本開示は、以下の実施例を参照することにより完全に理解されるだろう。しかしながら、これらは、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に記載される実施例及び実施形態が例証を目的とするものに過ぎないこと、ならびにそれを考慮した様々な修正または変更が当業者に示唆され、本出願の趣旨及び範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることが理解される。

【0162】

実施例１：無細胞系における組み換えポリペプチド中のトリスルフィド形成に対するシステイン、シスチン、鉄（Ｆｅ）、及びＢビタミンの効果
一連の第１の実験を無細胞系で実行して、細胞外に分泌される組み換えポリペプチド中のトリスルフィド形成に寄与する細胞培養培地中の構成成分を特定した。特に、実験は、そのようなポリペプチド中のトリスルフィド結合レベルに対するシステイン、シスチン、微量元素（鉄など）、及びＢビタミンの効果を調査した。

【0163】

Ａ．システイン、シスチン、及び鉄の非細胞効果
簡潔には、１１％のトリスルフィドを含有する例示的なポリペプチドである抗ＦｌｕＢを、（ａ）６ｍＭのＬ－システイン（Ｃｙｓ）、（ｂ）３ｍＭのシスチン（Ｃｙｓ－Ｃｙｓ）、（ｃ）６ｍＭのＬ－システイン（Ｃｙｓ）及び３５μＭのＦｅ（鉄）、または（ｄ）３ｍＭのシスチン（Ｃｙｓ－Ｃｙｓ）及び３５μＭのＦｅ（鉄）を補充した培地１中でインキュベートした。上述のように補充したインキュベーションを培地２（すなわち、培地１とは異なる組成物を有する培地）中で反復した。抗ＦｌｕＢに関する更なる詳細は、ＷＯ２０１５／１４８８０６に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0164】

培地１及び培地２は、それらが含有する栄養素及び構成成分の数、種類、及び濃度が異なる。具体的には、培地１中のビタミンＢ２及びビタミンＢ６の濃度は、培地２中のビタミンＢ２及びビタミンＢ６の濃度とは異なる。

【0165】

培地中の抗ＦｌｕＢの最終濃度は、１．５ｇ／Ｌである。インキュベーションは、３７℃の温度設定点、５％のＣＯ_２設定点を有するインキュベーター内で実行した。インキュベーション混合物をキャップ付きチューブスピン生物反応器内に保持し、２２５ｒｐｍで振盪した。半分の複製物は通気キャップを有するチューブスピン内に保持し、もう半分の複製物は非通気キャップを有するチューブスピン内に保持した。振盪チューブスピン反応器の温度、ＣＯ_２、及び撹拌は、ＣＨＯ抗体産生培養物中の抗体の濃度、及びＣＨＯ（または他の哺乳動物）細胞培養物に使用される温度の適切範囲内であった。

【0166】

８つのインキュベーターの各々の試料を、０時間、６時間、２４時間、及び７２時間で取得し、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ．１２１７，５７７６－５７８４及びＣｏｒｎｅｌｌら（印刷中）に記載される方法に従って、荷電エアロゾル検出と組み合わせた疎水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ－ＣＡＤ）を介して各時点での抗ＦｌｕＢ中のトリスルフィド％を決定した。

【0167】

図１に示されるように、培地１＋Ｃｙｓまたは培地２＋Ｃｙｓ中の抗ＦｌｕＢのインキュベーションは、１１％からほぼ０％へとトリスルフィド結合レベルを急速に減少させ、そのような効果は７２時間持続した。抗ＦｌｕＢ中のトリスルフィド結合レベルは、培地１＋Ｃｙｓ－Ｃｙｓまたは培地２＋Ｃｙｓ－Ｃｙｓ中、７２時間のインキュベーションの経過にわたって著しい影響はなかった。トリスルフィド結合レベルは、抗ＦｌｕＢを培地１＋Ｃｙｓ＋Ｆｅまたは培地２＋Ｃｙｓ＋Ｆｅ中でインキュベートしたときに急速に減少し、そのような効果は約６時間持続した。しかしながら、６時間後、抗ＦｌｕＢ中のトリスルフィド結合レベルは約１５％（すなわち、初期トリスルフィド結合レベルよりもわずかに高い）まで増加した。この観察は、Ｆｅが存在する無細胞系においてＣｙｓがＣｙｓ－Ｃｙｓへと変換されるのに必要とされる時間量と一貫しており、この時点で、組成物は、Ｃｙｓ－Ｃｙｓ及びＦｅを含有するものとして作用する（以下を参照されたい）。培地１＋Ｃｙｓ－Ｃｙｓ＋Ｆｅまたは培地２＋Ｃｙｓ－Ｃｙｓ＋Ｆｅ中での抗ＦｌｕＢのインキュベーションは、７２時間のインキュベーションの経過にわたってトリスルフィド結合レベルを約４０％まで著しく増加させた。４５％のトリスルフィドを含有する抗ＦｌｕＢについて、類似の結果が観察された（データ示さず）。ガス交換は、トリスルフィド形成に対して影響がなかった（データ示さず）。

【0168】

まとめると、図１の結果は、１）トリスルフィド結合レベルはＣｙｓが存在するときに低下するが、ＣｙｓのＣｙｓ－Ｃｙｓへの変換が許容される場合にトリスルフィド結合レベルは増加し得ること、２）細胞外抗体プールにおけるトリスルフィド形成にはＦｅが必要とされ、トリスルフィド形成はＦｅ及びシスチン（Ｃｙｓ－Ｃｙｓ）の両方の存在下で有意に増加すること、ならびに３）培地１及び培地２の両方において観察された結果の類似性を考慮すると、トリスルフィド形成に対するＦｅ及びシスチン（Ｃｙｓ－Ｃｙｓ）の効果は細胞培養培地に依存しないようであることを実証する。

【0169】

図１に示される結果はまた、シスチン（Ｃｙｓ－Ｃｙｓ）などのポリスルフィドが、硫黄移動して抗体中でトリスルフィド結合を生成するための硫黄プールとしての役割を果たし得ることも実証する。Ｆｅを有さない培地１＋Ｃｙｓ中または培地１＋Ｃｙｓ＋Ｆｅ中で抗ＦｌｕＢをインキュベートしたとき、Ｈ_２Ｓが、ヘッドスペースにおいて検出可能であった（データ示さず）。抗ＦｌｕＢを培地１＋Ｃｙｓ＋Ｆｅ中でインキュベートしたとき、より高いレベルのＨ２Ｓが検出された（データ示さず）。培地１＋Ｃｙｓ－Ｃｙｓ＋Ｆｅ中または培地１＋Ｃｙｓ－Ｃｙｓ中で抗ＦｌｕＢをインキュベートしたとき、Ｈ_２Ｓ（ｇ）は、ヘッドスペースにおいて検出不能であった（データ示さず）。１つの特定の理論によって拘束されることを意図するものではないが、そのような結果は、ＣｙｓまたはＣｙｓ＋Ｆｅの存在がＨ_２Ｓ（ｇ）の形成をもたらさず、したがって、ヘッドスペースにおけるＨ_２Ｓ（ｇ）レベルが検出不能である場合ですら、トリスルフィド形成に寄与したことを示唆する。

【0170】

Ｂ．鉄及びＢビタミンの非細胞効果
更なる一連の実験において、以下、（ａ）３ｍＭのシスチン（Ｃｙｓ－Ｃｙｓ）、（ｂ）３５μＭのＦｅ、及び（ｃ）Ｂビタミン（１．８４μＭのリボフラビン（ビタミンＢ２）、２４．９μＭのピリドキシン（ビタミンＢ６）、２２．５μＭの葉酸（ビタミンＢ９）、及び２．２５μＭのシアノコバラミン（ビタミンＢ１２））の構成成分のうちの１つ以上を補充した培地１中で抗ＦｌｕＢを７２時間インキュベートした。図２Ａに示されるように、Ｃｙｓ－ＣｙｓまたはＣｙｓ－Ｃｙｓ＋Ｂビタミンを補充した培地１中で抗ＦｌｕＢをインキュベートしたとき、トリスルフィド結合レベルは、著しい影響はなかった。Ｆｅ＋Ｃｙｓ－ＣｙｓまたはＦｅ＋Ｃｙｓ－Ｃｙｓ＋Ｂビタミンを補充した培地１中で抗ＦｌｕＢをインキュベートしたとき、トリスルフィド結合レベルは著しく（すなわち、１１％から約４０％へと）増加したものの、トリスルフィド結合レベルは、無細胞系におけるＢ－ビタミンの存在下または不在下でおよそ同じであった。

【0171】

抗ＯＸ４０抗体（すなわち、１％のトリスルフィドを含有する例示的なポリペプチド）を使用して、上述の実験を反復した。本実施例において使用された抗ＯＸ４０抗体は、配列番号８に明記される重鎖可変ドメイン、及び配列番号９に明記される軽鎖可変ドメインを含む。配列番号８及び９を以下に提供する。抗ＯＸ４０抗体に関する更なる詳細は、ＷＯ２０１５／１５３５１３に提供されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列番号８：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥ ＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶ ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴ ＤＳＹＭＳＷＶＲＱＡ ＰＧＱＧＬＥＷＩＧＤ ＭＹＰＤＮＧＤＳＳＹ ＮＱＫＦＲＥＲＶＴＩ ＴＲＤＴＳＴＳＴＡＹ ＬＥＬＳＳＬＲＳＥＤ ＴＡＶＹＹＣＶＬＡＰ ＲＷＹＦＳＶＷＧＱＧ ＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号９：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ ＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳ ＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰ ＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹ ＴＳＲＬＲＳＧＶＰＳ ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ ＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱ ＧＨＴＬＰＰＴＦＧＱ ＧＴＫＶＥＩＫ

【0172】

Ｃｙｓ－Ｃｙｓ、Ｆｅ、及びＢビタミンを欠く培地１中での抗ＯＸ４０ Ａｂのインキュベーションは、トリスルフィド結合レベルに対して影響がなかった。図２Ｂを参照されたい。Ｆｅ＋Ｂビタミンを含有する培地１中で抗ＯＸ４０ Ａｂをインキュベートしたときも、トリスルフィド結合レベルは未変化のままであった。Ｃｙｓ－ＣｙｓまたはＣｙｓ－Ｃｙｓ及びＢビタミンの両方を補充した培地１中で抗ＯＸ４０ Ａｂをインキュベートしたとき、トリスルフィド結合レベルは、１％から約１０～１５％へと増加した。Ｆｅ＋Ｃｙｓ－ＣｙｓまたはＦｅ＋Ｃｙｓ－Ｃｙｓ＋Ｂビタミンの両方を補充した培地１中で抗ＯＸ４０ Ａｂをインキュベートしたとき、トリスルフィド結合レベルは、著しく（すなわち、１％から約７５％へと）増加した。ここでも、Ｂビタミンの存在は、トリスルフィド結合レベルに著しく影響を与えなかった。

【0173】

まとめると、図１ならびに２Ａ及び２Ｂの結果は、１）培地中のＦｅ及びシスチン（Ｃｙｓ－Ｃｙｓ）の存在が、無細胞系におけるポリペプチド中のトリスルフィド結合の形成に寄与すること、ならびに２）抗体を無細胞系においてインキュベートしたとき（以下に記載される細胞培養系において観察される効果とは対照的に）、Ｂビタミン（Ｂ２、Ｂ６、Ｂ９、及びＢ１２）が、トリスルフィド結合レベルに著しいく影響を与えないことを実証する。

【0174】

実施例２：哺乳動物細胞によって産生されるポリペプチド中のトリスルフィド形成に影響を及ぼす細胞培養培地構成成分
別の一連の実験を実行して、トリスルフィド結合レベルに対するシステイン（Ｃｙｓ）、シスチン（Ｃｙｓ－Ｃｙｓ）、鉄、及びＢビタミンの効果を評価したが、今回は、これらの化合物が細胞培養環境においてどのような効果を有するかについて対処するするために、無細胞プロセスにおいてではなく、細胞培養プロセスにおいて実行した。

【0175】

Ａ．細胞培養中のシステイン及びシスチンの効果
一組の細胞培養実験を実行して、培養中のトリスルフィド形成に対する、添加システイン（Ｃｙｓ）または添加シスチン（Ｃｙｓ－Ｃｙｓ）の効果を評価した。簡潔には、抗ＯＸ４０ Ａｂを産生するＣＨＯ細胞を、以下の表１に示される４つのプロトコルうちの１つに従って、２リットルの生物反応器内で１４日間の実行にわたって培養した。

^＊細胞消費及び生成は計算には考慮しない。

【0176】

産生細胞培養物の成長期を開始するために、ＣＨＯ細胞をおよそ１．０×１０^６個の細胞／ｍＬで、１Ｌの基本培地を含有する２Ｌの撹拌生物反応器（Ａｐｐｌｉｋｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）内に植え付けた。細胞を、３、６、及び９日目に１リットル当たり１００ｍＬの細胞培養流体（すなわち、プロトコル３及び４の場合）、または３日目の１リットル当たり２００ｍＬの細胞培養流体（すなわち、プロトコル１及び２の場合）のいずれかのバッチ供給物培地の添加によって、流加様式で培養した。バッチ供給物培地は、ＣｙｓまたはＣｙｓ－Ｃｙｓは含有しなかった。表１に記載されるように、バッチ供給物培地を提供したのと同じ日に、ＣｙｓまたはＣｙｓ－Ｃｙｓを、基本培地中の産生培養物に、原液（すなわち、１０ｍＬの４５０ｍＭのＣｙｓまたは１０ｍｌの２２５ｍＭのＣｙｓ－Ｃｙｓ）からの補充を介して供給した。システインまたはシスチンは、全ての産生実行の全システインモノマー電位が同等に維持されるような量で供給した（すなわち、１×２０％のバッチ供給物戦略または３×１０％のバッチ供給物戦略のいずれかについて、２×システイン（Ｃｙｓ）濃度対１×シスチン（Ｃｙｓ－Ｃｙｓ））。

【0177】

グルコースの濃度を毎日分析し、グルコース濃度が３ｇ／Ｌになったとき、５００ｇ／Ｌのグルコース原液を補充して、グルコース枯渇を防止した。反応器は、較正された溶解酸素、ｐＨ、及び温度プローブを備えた。空気及び／または酸素でのスパージングを通して、溶解酸素をオンラインで制御した。ＣＯ_２またはＮａ_２ＣＯ_３の添加を通して、ｐＨを制御し、必要に応じて消泡剤を培養物に添加した。０～３日目まで、細胞培養物をｐＨ７．０及び３７℃の温度で維持し、３日目以降は３３℃で維持した。細胞培養物を２７５ｒｐｍで撹拌し、溶解酸素レベルは酸素飽和の３０％であった。オフライン測定のために、試料を毎日取得した。ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ ＦＬＥＸ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して、オフライン浸透圧、ｐＨ、及び代謝物、生細胞密度（ＶＣＣ）、細胞生存率を毎日測定し、約７００×ｇで１０分間の細胞懸濁液の遠心分離後の血中血球容積（ＰＣＶ）もまた測定した。加えて、６日目～１４日目まで上清試料を毎日取得して、タンパク質Ａに基づくＨＰＬＣ法を使用して産物濃度を決定した。上清試料を０、３、４、６、８、１０、１２、及び１４日目に取得して、アミノ酸誘導体化法、その後ＲＰ－ＨＰＬＣ法を使用して細胞外アミノ酸濃度を決定した。

【0178】

７、１０、及び１４日目に各培養物から試料を取得し、上述のＨＩＬＩＣ－ＣＡＤを介して各時点での抗ＯＸ４０ Ａｂ中のトリスルフィド％を決定した。図３に示されるように、トリスルフィド％は、プロトコル２及び４に従って培養した細胞によって産生される抗ＯＸ４０ Ａｂ中で最も高かった。プロトコル１に従って培養した細胞によって産生される抗ＯＸ４０ Ａｂ中のトリスルフィド％は、７日目～１０日目の間に着実に増加し、その後、１４日目の収集では約１５％まで減少した。プロトコル３に従って培養した細胞によって産生された抗ＯＸ４０ Ａｂ中のトリスルフィド％は、７日目～１０日目まで低いままであり、１４日目の収集では約１７．５％まで増加した。１つの特定の理論によって拘束されることを意図するものではないが、図３に示される結果は、細胞培養物産生プロセスにおいて、Ｃｙｓが添加されるとき、Ｃｙｓ形態の使用はより低いトリスルフィド結合レベルをもたらすことを示唆する（非細胞機構）。培養終了時のトリスルフィド結合レベルの上昇は、トリスルフィドを低下させるための還元形態のシステインが残っていないことによるものである可能性が高く、結果として、Ｃｙｓ供給後の実行後期において、非細胞機構がトリスルフィド形成に向かうプロセスを駆動する。したがって、結果は、システインを細胞培養実行の初期に提供することが、収集されたポリペプチド中のより低いトリスルフィド結合レベルをもたらし得ることを示唆する。

【0179】

Ｂ．トリスルフィドを制御するためのシステイン／シスチン供給の最適化
追加の実験を実行して、産生細胞培養実行の基本培地中にのみ供給したときの、トリスルフィド形成に対するシステイン濃度の影響を評価した。抗ＯＸ４０ Ａｂを産生するＣＨＯ細胞を、１４日間の産生細胞培養実行にわたって、２リットルの生物反応器内で培養した。基本培地に、（ａ）６ｍＭのシステイン、（ｂ）４．５ｍＭのシステイン、または（ｃ）３ｍＭのシステインを補充した。これらの実験において、細胞培養物には、システインを欠くバッチ供給物培地を供給した。７、１０、１２、及び１４日目に各培養物から試料を取得し、上述のＨＩＬＩＣ－ＣＡＤを介して各時点での抗ＯＸ４０ Ａｂ中のトリスルフィド％を決定した。図４Ａは、抗ＯＸ４０ Ａｂ中のトリスルフィド結合レベルが、産生培養の開始時のシステインの初期濃度に相関したことを実証する。３ｍＭのシステインを含有する基本培地中で培養した細胞によって産生される抗ＯＸ４０ Ａｂ中のトリスルフィド％は、７日目～１４日目まで着実に減少し、１４日目には０％のトリスルフィドが収集された。図４Ａを参照されたい。各培養物からの抗ＯＸ４０ Ａｂ収率は、同等であった。図４Ｂを参照されたい。まとめると、図４Ａ及び４Ｂの結果は、基本培地中のシステイン濃度を最適化して、収集時点で、ポリペプチド収率に影響を与えずに、ポリペプチド中のトリスルフィド％が著しく低下する（または排除すらされる）条件を達成することができることを示す。１つの特定の理論によって拘束されることを意図するものではないが、そのような結果は、より低い濃度で細胞培養実行の初期に提供されると、システインは細胞によって消費され、故に分泌ポリペプチド中でのトリスルフィド結合形成をもたらす細胞外シスチンの形成を防止することを示唆する。

【0180】

Ｃ．鉄及びＢビタミンレベルは、トリスルフィド結合レベルに影響を与える。
更なる実験を実行して、培養中のポリペプチド中のトリスルフィド形成に対する、Ｆｅ濃度及び／またはＢビタミン（例えば、リボフラビン、ピリドキシン、葉酸、及びシアノコバラミン）濃度の効果を評価した。抗ＯＸ４０ Ａｂを産生するＣＨＯ細胞を、以下の表２に示される４つのプロトコルうちの１つに従って、２リットルの生物反応器内で１４日間の産生細胞培養実行にわたって培養した。

^＊基本培地中のＢビタミン＝１．８４μＭのビタミンＢ２、２４．９μＭのビタミンＢ６、２２．５μＭのビタミンＢ９、及び２．２５μＭのビタミンＢ１２
^＊＊バッチ供給物培地中のＢビタミン＝１２．５μＭのビタミンＢ２、２５０μＭのビタミンＢ６、１５０μＭのビタミンＢ９、及び１０μＭのビタミンＢ１２

【0181】

産生細胞培養物の成長期を開始するために、ＣＨＯ細胞をおよそ１．０×１０^６個の細胞／ｍＬで、１Ｌの基本培地を含有する２Ｌの撹拌生物反応器（Ａｐｐｌｉｋｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）内に植え付けた。溶解酸素、ｐＨ、温度、撹拌条件は、上述のものと同じであった。グルコース濃度、浸透圧、ｐＨ、代謝物濃度、生細胞密度（ＶＣＣ）、細胞生存率、及びその後の濃縮細胞体積を、上述のように測定した。加えて、６日目～１４日目まで上清試料を毎日取得して、タンパク質Ａに基づくＨＰＬＣ法を使用して産物濃度を決定した。上清試料を０、３、４、６、８、１０、１２、及び１４日目に取得して、アミノ酸誘導体化法、その後ＲＰ－ＨＰＬＣ法を使用して細胞外アミノ酸濃度を決定した。

【0182】

７、１０、１２、及び１４日目に各培養物から試料を取得し、上述のＨＩＬＩＣ－ＣＡＤを介して各時点での抗ＯＸ４０ Ａｂ中のトリスルフィド％を決定した。図５Ａに示されるように、トリスルフィド％は、プロトコルＡに従って培養した細胞によって産生される抗ＯＸ４０ Ａｂ中で最も高かった。プロトコルＣに従って培養した細胞によって産生される抗ＯＸ４０ Ａｂ中のトリスルフィド％は、７日目～１４日目まで着実に減少し、１４日目には０％のトリスルフィドが収集された。注目すべきことに、プロトコルＢに従って培養した細胞によって産生された抗ＯＸ４０ Ａｂ中のトリスルフィド結合レベルは、約１０％（７日目）から約５％（１４日目）へと減少した。各培養物からの抗ＯＸ４０ Ａｂ収率は、同等であった。図５Ｂを参照されたい。

【0183】

図５Ｃは、各細胞培養物の終了時の培地中のシスチン（Ｃｙｓ－Ｃｙｓ）の残基濃度を示す。１４日目に、プロトコルＡ及びＢの培地中では高レベルのＣｙｓ－Ｃｙｓが測定された一方で、プロトコルＣの培地中ではＣｙｓ－Ｃｙｓは検出されなかった。そのような結果は、プロトコルＣにおいて使用された基本培地中の低濃度のＣｙｓが培養中に細胞によって完全に消費されたという事実、ならびにプロトコルＡ及びＢにおいて基本培地中に提供された高濃度のＣｙｓが培養中に細胞によって完全には消費されず、故に、残りのＣｙｓのＣｙｓ－Ｃｙｓへの酸化をもたらしたという事実と一貫している。注目すべきことに、プロトコルＢにおける１４日目の高い残基Ｃｙｓ－Ｃｙｓは、抗ＯＸ４０ Ａｂ中でトリスルフィド形成の増加をもたらさなかった。まとめると、これらの結果は、ＣｙｓがＣｙｓ－Ｃｙｓに変換されるために、経時的に高いトリスルフィド結合レベルをもたらし得る条件である、高レベルのＣｙｓの存在下ですら、Ｂビタミン及びＦｅ濃度を制御することによって、トリスルフィド結合レベルを低下させることができることを実証する。Ｂビタミン及びＦｅ濃度を制御することによって、トリスルフィド結合レベルを、Ｃｙｓ－Ｃｙｓに変換される残基Ｃｙｓが最小で存在するように基本培地中のＣｙｓ濃度を最適化することによって得られるレベルに類似したレベルまで、低下させることができる。

【0184】

Ｄ．細胞培養物中のＢビタミン及び鉄の相対的効果
トリスルフィド形成に対するＢビタミン及びＦｅの相対的寄与を決定するために、抗ＯＸ４０ Ａｂを産生するＣＨＯ細胞を、上述の条件下、１リットルの基本培地を含有する２リットルの生物反応器内で１４日間の産生細胞培養にわたって培養し、以下の表３に示される４つのプロトコルのうちの１つに従って実行した。

^＊基本培地中のＢビタミン＝１．８４μＭのビタミンＢ２、２４．９μＭのビタミンＢ６、２２．５μＭのビタミンＢ９、及び２．２５μＭのビタミンＢ１２
^＊＊バッチ供給物培地中のＢビタミン＝１２．５μＭのビタミンＢ２、２５０μＭのビタミンＢ６、１５０μＭのビタミンＢ９、及び１０μＭのビタミンＢ１２
^＊＊＊基本培地中またはバッチ供給物中にはシスチン（Ｃｙｓ－Ｃｙｓ）は提供されなかった

【0185】

１０、１２日目、及び１４日目の収集時に抗ＯＸ４０ Ａｂの試料を取得し、上述のＨＩＬＩＣ－ＣＡＤを介して各試料の抗ＯＸ４０ Ａｂ中のトリスルフィド％を決定した。図６に示されるように、トリスルフィド％は、プロトコルＤ（すなわち、低Ｆｅ、低Ｂビタミン）及びＦ（すなわち、高Ｆｅ及び低Ｂビタミン）に従って培養した細胞によって産生された、収集された抗ＯＸ４０ Ａｂ中で最も低かった。プロトコルＤに従って産生された抗ＯＸ４０ Ａｂは、約１７～２０％のトリスルフィドを有し、プロトコルＦに従って産生された抗ＯＸ４０ Ａｂは、約１７～２５％のトリスルフィドを有した。プロトコルＧ（すなわち、高Ｆｅ、高Ｂビタミン）に従って培養した細胞によって産生された抗ＯＸ４０ Ａｂ中のトリスルフィド％は、約４５％～５５％であった。図２Ａ及び２Ｂに提示される結果とは対照的に、プロトコルＥ（すなわち、低Ｆｅ、高Ｂビタミン）に従って培養した細胞によって産生された抗ＯＸ４０ Ａｂ中のトリスルフィド％は、約３５％～５０％であった。１０及び１２日目に取得した試料中で、類似の結果が見られた（データ示さず）。Ｂビタミンが非細胞効果を有さないことを示す図２Ａ及び２Ｂに示される結果とともにまとめると、図６に示される結果は、Ｂビタミンが、トリスルフィド結合の形成に著しく寄与し、細胞に関連する機構を通してそれを行うことを示す。

【0186】

実施例３：組み換え発現させたポリペプチドの収集前及び収集後の細胞培養流体を、還元剤及びキレート剤とともにインキュベートすることの、ポリペプチド中のトリスルフィド形成に対する効果
更なる実験を実行して、収集されたポリペプチド中のトリスルフィド結合形成を緩和する戦略を特定した。抗ＯＸ４０ Ａｂの収集された細胞培養流体（ＨＣＣＦ）を、以下の表４に概説される条件のうちの１つの下でインキュベートした。各条件を、温度、ｐＨ、及び溶解酸素（ＤＯ）について制御した。条件２及び３下では、システイン（すなわち、例示的な還元剤）を添加する３０分前に、ＨＣＣＦをＥＤＴＡ（すなわち、例示的な金属キレート剤）とともにインキュベートした。混合物を各々４．５時間保持して、典型的な細胞培養物収集の期間をシミュレーションした。試料を１５℃の水浴に移動させ、最大４日間（９６時間）保持して、下流精製前の冷却保持時間をシミュレーションした。

【0187】

図７Ａに示されるように、条件１におけるシステイン（Ｃｙｓ）のＨＣＣＦへの添加は、Ｃｙｓ添加の時間に対して測定される抗ＯＸ４０ Ａｂ中のトリスルフィド％を、インキュベーションの最初の３０分間以内に２４％から２％へと減少させた。その後、トリスルフィド結合レベルは、３３℃で４．５時間後に約１１％まで上昇し、１５℃で４日間保持した後に約２１％まで着実に増加した。条件２下では、ＥＤＴＡとともにインキュベートしたＣｙｓのＨＣＣＦへの添加は、抗ＯＸ４０ Ａｂ中のトリスルフィド％を、３３℃でのインキュベーションの最初の３０分間以内に２４％から１％未満まで減少させた。トリスルフィド結合レベルは、４日間の保持の終了時に約５％まで上昇した。条件３下では、ＥＤＴＡとともにインキュベートしたＣｙｓのＨＣＣＦへの添加もまた、抗ＯＸ４０ Ａｂ中のトリスルフィド％を、２０℃でのインキュベーションの最初の３０分間以内に２４％から１％未満まで減少させた。トリスルフィド結合レベルは、２０℃で４．５時間後に約２％まで上昇し、１５℃で４日間保持した後に約４％まで更に上昇した。Ｃｙｓ及びＥＤＴＡのＨＣＣＦへの添加は、ＣＥ－ＳＤＳによる主要ピークのわずかな減少をもたらし、これは潜在的には、還元剤の添加による少量のタンパク質還元を示す。図７Ｂを参照されたい。

【0188】

類似の研究を、収集前の細胞培養流体（ＣＣＦ）でも実行した。キレート剤ありまたはなしでＣＣＦを約４５分間インキュベートし、その後、温度、ｐＨ、及び溶解酸素（ＤＯ）を表５に概説されるように制御した条件下で還元剤ありまたはなしを補充した。この混合物を４．５時間保持し、その後、遠心分離し、濾過して、細胞を除去した。細胞を除去した後、試料を１５℃で最大４日間（９６時間）保持した。

【0189】

図８Ａ及び８Ｂに示されるように、還元剤またはキレート剤を補充しなかったＣＣＦ（すなわち、条件Ａ）中のトリスルフィド結合レベルは、高いままであった（約３５％）。Ｃｙｓ単独のＣＣＦへの添加（すなわち、条件Ｂ）は、抗ＯＸ４０ Ａｂ中のトリスルフィド％を、インキュベーションの最初の３０分間以内に３７％から６％まで減少させた。その後、トリスルフィド結合レベルは、３３℃で４．５時間後に約４％まで上昇し、１５℃で４日間の保持終了時に収集後の約１３％まで着実に増加した。Ｃｙｓ、及びＥＤＴＡ、ＮＴＳ、ＥＤＤＳ、またはクエン酸塩のうちのいずれか１つの、ＣＣＦへの添加（すなわち、条件Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＦ）もまた、抗ＯＸ４０ Ａｂ中のトリスルフィド％を、インキュベーションの最初の３０分間以内に約３０～４０％から３％以下へと減少させた。その後、３３℃で４．５時間インキュベートする間、及び収集後に１５℃で４日間保持した後、トリスルフィド結合レベルは低く、すなわち、５％またはそれ未満に留まった。

【0190】

まとめると、図７及び８に示される結果は、還元剤の添加がＨＣＣＦまたはＣＣＦ中のポリペプチド中のトリスルフィド％を減少させること、及びキレート剤の添加が低いトリスルフィド結合レベルの維持に必要とされることを実証する。更に、トリスルフィド結合レベルの減少は、著しいタンパク質低下を伴わない。

【0191】

実施例４：ポリペプチド産生中のトリスルフィド形成に対するヒポタウリンの効果
産生中の組み換えポリペプチド中でのトリスルフィド形成に対するヒポタウリンの効果を試験するために、抗体産物を産生するＣＨＯ細胞培養物を、高いトリスルフィド結合レベル（すなわち、２５％～４５％のトリスルフィド）を有するポリペプチドを生成することが知られるプロセスで実行した。細胞は、単一の接種材料系列から供給され、４つの同型産生培養物を植え付けるのに使用した。３つの培養を、ヒポタウリンを有さない対照条件下で実行した。残りの培養物は、基本培地中に１ｇ／Ｌのヒポタウリンを含んだ。全ての他の培地／溶液添加及びプロセスパラメータは、４つ全ての培養物について同じであった。細胞成長は、著しく影響されないようであったが、生存率は、ヒポタウリンを含む条件について、培養の終了時により良好に維持された（データ示さず）。最終収集された産物中のトリスルフィド結合レベルは、対照条件の３９．９±２．７％に対して、ヒポタウリンを含む培養物（２．２％）について著しくより低かった。図９を参照されたい。

【0192】

実施例５：ポリペプチド産生中のトリスルフィド形成に対する、硫黄代謝において重要な役割を果たすアミノ酸の効果
産生中の組み換えポリペプチド中のトリスルフィド形成に対するメチオニン及びシステインの効果を評価するために、以下の表６に示されるプロトコルのうちの１つに従う１４日間の産生細胞培養実行にわたって、３７℃及び７％のＣＯ_２の振盪２４ウェルの深プレート中、自動化ロボット細胞培養システムによって、ＢｓＡｂ１を産生するＣＨＯ細胞を培養した（接種材料＝６×１０^６個の生細胞／ｍｌ）（ＲＴＥ＝微量元素溶液、Ｃｙｓ量は１つ目が培地であり、２つ目が供給物である）。３、６、及び９日目、１０％の培養体積で培養物に１０ｍＭのメチオニンを供給した。合計３６の条件を試験した。

●「－１」として与えられるＳｅｒの濃度＝１：７．６４ｍＭであり、「１」として与えられるＳｅｒの濃度＝４．５ｍＭである。
●「－１」として与えられるＭｅｔの濃度＝１．５８ｍＭであり、「１」として与えられるＭｅｔの濃度＝２．２５ｍＭである。
●Ｃｙｓ濃度は（培地、供給物）として与えられ、培地濃度は３ｍＭまたは７．５ｍＭであり、供給物濃度は１５ｍＭまたは０ｍＭである。
●ＲＴＥ＝微量元素溶液である。

【0193】

ロボット結果に基づいて、トリスルフィド結合レベル低下に対するメチオニン及びセリンの影響の選別パラメータ推定値を、Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＪＭＰで計算した。図１０は、トリスルフィド低下に対するメチオニン濃度低下の著しい影響を示す、予測プロファイラを提供する。（計算はロボット結果に基づく）。セリン濃度は、ＢｓＡｂ１中ではトリスルフィド低下の効果を有するとは見出されなかった。

【0194】

次に、ＢｓＡｂ１を産生するＣＨＯ細胞を、以下の表７に以下に示される２つのプロトコルうちの１つに従って、上述の条件下、２リットルの生物反応器内で培養した。

【0195】

ｐＨ対照について、培地中の炭酸塩緩衝液系、ＣＯ_２ガス処理、及び１ＭのＮａＨＣＯ_３溶液を使用した。３段階の通気速度、撹拌機速度、及び酸素ガス処理カスケードを使用して、ｐＯ_２を制御した。

【0196】

プロトコルＩにおいて、硫黄含有アミノ酸であるシステイン及びメチオニンを基本培地から省略し、システインを供給物培地から省略し、セリン濃度を増加させて、システインの欠如を代償した。図１１に示されるように、硫黄含有アミノ酸の省略は、収集時、ＢｓＡｂ１中のノブ・アンド・ホール領域において、トリスルフィドのレベルの９６％の（すなわち、１２．５％から０．５％への）減少をもたらした。そのような結果は、両方の自動化細胞培養系において観察された結果と一貫していた。

【0197】

次に、以下の表８に提供される２つのプロトコルのうちの１つに従って、ＢｓＡｂ１を発現するＣＨＯ細胞を上述のように培養した。

＊プロトコルＪ及びＫにおいて細胞を成長させた培地は、プロトコルＨ及びＩにおいて使用した培地とは異なった。

【0198】

図１０に示されるように、基本培地中のメチオニン濃度の減少は、収集時、ＢｓＡｂ１中のノブ・アンド・ホール領域において、トリスルフィドのレベルの１７．４％の（すなわち、４．６％から３．８％への）減少をもたらした。そのような結果は、自動化細胞培養系において観察された結果と一貫していた。

【0199】

実施例６：哺乳動物細胞によって産生されるポリペプチド中のトリスルフィド形成に対するＢビタミンレベルの相対的効果
第２の哺乳動物細胞株によって産生されるポリペプチドへのトリスルフィド形成に対するＢビタミンの相対的寄与を評価するために、以下の表９に示される２つのプロトコルのうちの１つに従って、抗体を産生するＣＨＯ細胞を、１．２リットルの基本培地を含有する２リットルの生物反応器内で１４日間の産生細胞培養実行にわたって培養した。

【0200】

産生細胞培養物の成長期を開始するために、ＣＨＯ細胞をおよそ１．０×１０^６個の細胞／ｍＬで、１．２Ｌの基本培地を含有する２Ｌの撹拌生物反応器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内に植え付けた。細胞を、３、６、及び９日目の１リットル当たり１００ｍＬのいずれかの細胞培養流体のバッチ供給物培地の添加によって、流加様式で培養した。バッチ供給物培地は、ＣｙｓまたはＣｙｓ－Ｃｙｓは含有しなかった。６ｍＭのＣｙｓを、基本培地中の産生培養物に供給した。

【0201】

グルコースの濃度を毎日分析し、グルコース濃度が３ｇ／Ｌになったとき、５００ｇ／Ｌのグルコース原液を補充して、グルコース枯渇を防止した。反応器は、較正された溶解酸素、ｐＨ、及び温度プローブを備えた。空気及び／または酸素でのスパージングを通して、溶解酸素をオンラインで制御した。ＣＯ_２またはＮａ_２ＣＯ_３の添加を通して、ｐＨを制御した。細胞培養物をｐＨ７．０及び３７℃の温度で維持した。細胞培養物を２３３ｒｐｍで撹拌し、溶解酸素レベルは酸素飽和の３０％であった。１４日目に試料を取得し、抗体中のトリスルフィド％を決定した

【0202】

図１２に示されるように、バッチ供給物培地からＢビタミンを省略することによる培養物中のＢビタミン濃度の減少は、８７．５％の（すなわち、２６．７９％から３．３４％まで）トリスルフィド濃度の著しい低下をもたらす。結果は、各設定での２回の実行（生物学的二連）で一貫している。

【0203】

前述の実施例は、例証目的のために提供されているにすぎず、決して本発明の範囲を限定することは意図されない。本明細書に示され、記載される修正に加えて、本発明の様々な修正が前述の説明から当業者に明らかとなり、添付の特許請求の範囲内に含まれる。

＜配列表＞

SEQUENCE LISTING

<110> GAWLITZEK, Martin
MARKERT, Sven
POPP, Oliver
SHIRATORI, Masaru Ken
TROEBS, Thomas
WUU, Jessica

<120> METHODS OF DECREASING TRISULFIDE BONDS
DURING RECOMBINANT PRODUCTION OF POLYPEPTIDES


<130> 146392036540

<140> Not Yet Assigned
<141> Concurrently Herewith

<150> US 62/334,433
<151> 2016-05-10

<160> 32

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

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<220>
<223> Synthetic Construct

<400> 15
Val His Tyr Ala Gln Phe Pro Tyr Thr
1 5

<210> 16
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic Construct

<400> 16
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Asp Thr Tyr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser


<210> 17
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic Construct

<400> 17
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Ile Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val His Tyr Ala Gln Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105

<210> 18
<211> 215
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic Construct

<400> 18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215

<210> 19
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic Construct

<400> 19
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala
100 105 110
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
115 120 125
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
130 135 140
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
145 150 155 160
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
180 185 190
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
195 200 205
Val Glu Pro Lys Ser Cys
210

<210> 20
<211> 694
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic Construct

<400> 20
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu
225 230 235 240
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
245 250 255
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val
260 265 270
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser
275 280 285
Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
290 295 300
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met
305 310 315 320
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His
325 330 335
Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
340 345 350
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val
355 360 365
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
370 375 380
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
385 390 395 400
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
405 410 415
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
420 425 430
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
435 440 445
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
450 455 460
Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
465 470 475 480
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
485 490 495
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
500 505 510
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
515 520 525
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
530 535 540
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
545 550 555 560
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly
565 570 575
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
580 585 590
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
595 600 605
Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
610 615 620
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
625 630 635 640
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
645 650 655
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
660 665 670
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
675 680 685
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
690

<210> 21
<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic Construct

<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450

<210> 22
<211> 453
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic Construct

<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
225 230 235 240
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ala Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu Ala Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn Ala Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450

<210> 23
<211> 463
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic Construct

<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Pro Asn Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Pro Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
130 135 140
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
165 170 175
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His
225 230 235 240
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
245 250 255
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ala Ser Arg Thr
260 265 270
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
275 280 285
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
290 295 300
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
305 310 315 320
Val Leu Thr Val Leu Ala Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
325 330 335
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
340 345 350
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
355 360 365
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
370 375 380
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
385 390 395 400
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
405 410 415
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
420 425 430
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
435 440 445
His Asn Ala Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455 460

<210> 24
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic Construct

<400> 24
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210

<210> 25
<211> 213
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic Construct

<400> 25
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr
35 40 45
Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His
85 90 95
Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser
100 105 110
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
115 120 125
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
130 135 140
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
145 150 155 160
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
180 185 190
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
195 200 205
Glu Pro Lys Ser Cys
210

<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic Construct

<400> 26
Ala Ile Phe Thr Gly Ser Gly Ala Glu Tyr Lys Ala Glu Trp Ala Lys
1 5 10 15
Gly


<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic Construct

<400> 27
Asp Ala Gly Tyr Asp Tyr Pro Thr His Ala Met His Tyr
1 5 10

<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic Construct

<400> 28
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ser Leu Ala
1 5 10

<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic Construct

<400> 29
Gly Ala Ser Glu Thr Glu Ser
1 5

<210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic Construct

<400> 30
Gln Asn Thr Lys Val Gly Ser Ser Tyr Gly Asn Thr
1 5 10

<210> 31
<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic Construct

<400> 31
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val His Ser Ser
20 25 30
Tyr Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Gly Ala Ile Phe Thr Gly Ser Gly Ala Glu Tyr Lys Ala Glu Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ser Asp Ala Gly Tyr Asp Tyr Pro Thr His Ala Met His Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120

<210> 32
<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Synthetic Construct

<400> 32
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Glu Thr Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Thr Lys Val Gly Ser Ser
85 90 95
Tyr Gly Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

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