特許 7536232 脂質代謝改善剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-08-09

(45)【発行日】2024-08-20

(54)【発明の名称】脂質代謝改善剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/05 20060101AFI20240813BHJP

   A23L 33/18 20160101ALI20240813BHJP

   A61K 38/01 20060101ALI20240813BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20240813BHJP

   A23J 1/02 20060101ALN20240813BHJP

   A23J 3/34 20060101ALN20240813BHJP

【ＦＩ】

A61K38/05

A23L33/18

A61K38/01

A61P3/06

A23J1/02

A23J3/34

【請求項の数】 2

(21)【出願番号】P 2018037464

(22)【出願日】2018-03-02

(65)【公開番号】P2019151581

(43)【公開日】2019-09-12

【審査請求日】2020-12-23

【審判番号】

【審判請求日】2022-07-29

(73)【特許権者】

【識別番号】000118497

【氏名又は名称】伊藤ハム株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】504139662

【氏名又は名称】国立大学法人東海国立大学機構

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】中出 浩二

(72)【発明者】

【氏名】長岡 利

【合議体】

【審判長】磯貝 香苗

【審判官】淺野 美奈

【審判官】天野 宏樹

(56)【参考文献】

【文献】特開平６－１７２２０２号公報（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平１１－２９２８９６号公報（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１７－１５５０２６号公報（ＪＰ，Ａ）

【文献】ＮＡＫＡＤＥ，Ｋｏｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌｕｍｅ ７３，Ｉｓｓｕｅ ３， ｐ．６０７－６１２

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

A61K 38/

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

アミノ酸配列がＰｈｅ－Ｐｒｏであるジペプチドからなる、脂質代謝改善剤。

【請求項2】

請求項１に記載の脂質代謝改善剤を含む、脂質代謝改善用食品組成物（但し、前記脂質代謝改善用組成物が牛心臓加水分解組成物又はその限外ろ過物である場合、及びそれらを含む場合を除く）。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ペプチドを有効成分として含む脂質代謝改善剤、脂質代謝改善用食品、及び、脂質代謝改善作用を有する動物由来のペプチドの製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

一般に、大豆タンパク質などの植物性タンパク質は、カゼインなどの動物性タンパク質と比較して、抗動脈硬化作用を有すると考えられている（非特許文献１）。しかし、現在活発に行われている有効成分の検討により（非特許文献２～１０）、このような血清コレステロール低下作用は動物性素材にも見られることが明らかにされている。実際に、本発明者は、牛乳の乳清タンパク質が、動物性タンパク質でありながら大豆タンパク質よりも、強力な血清コレステロール低下作用を発現することを発見し検討している（非特許文献２，３）。また、主要な食糧資源でありながら、従来ほとんど検討がなされていない畜産食品素材のうち、牛肉ペプチド、牛レバーペプチドが体内コレステロール低下作用を有することも見出した（非特許文献６）。さらに、動物性食餌タンパク質である牛肉に再度着目し、畜産資源の高度有効利用という観点から、廃棄部位を含めた各部位である牛肉、牛心臓、牛赤血球、牛血漿加水分解物を用いた研究を行った結果、特に牛心臓加水分解物（ＨＰＨ）が強力なコレステロール代謝改善作用を発現することを発見した（非特許文献７）。

【0003】

本発明者らはまた、ＨＰＨが肝臓の脂質代謝改善効果を有することを見出している（特許文献１）。

【0004】

さらに、本発明者らは、非特許文献８～１０の研究手法を用いて、牛心臓タンパク質加水分解物（ＨＰＨ）のコレステロール低下作用機構を明らかにした。コレステロールミセル溶解性はカゼインよりもＨＰＨで有意に低下した。Ｃａｃｏ－２細胞のコレステロール吸収抑制はカゼインミセルよりもＨＰＨミセルで有意に高かった。血清コレステロールはカゼインよりもＨＰＨで有意に低かった。放射性コレステロールで測定したコレステロール吸収はカゼインと比べてＨＰＨで有意に減少し、ＨＰＨのコレステロール低下作用は空腸のコレステロール吸収阻害によるものである。さらに、ＨＰＨ由来の牛心臓タンパク質加水分解物の限外濾過物（ＨＰＨＵ、分子量約１０００ダルトン以下のペプチド分画物）は、ラットにおいてＨＰＨよりも強力なコレステロール低下作用を示すことを本発明者らは見出している（非特許文献１１）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【文献】特開２０００－２５６２００号公報

【非特許文献】

【0006】

【文献】Carroll, K.K. and Hamilton, R.M.G.: J. Food Sci., 40, 18 (1975)

【文献】Nagaoka, S., Kanamaru. Y., Kuzuya, Y., Kojima, T. and Kuwata, T.: Biosci. Biotch. Biochem., 56, 1484 (1992)

【文献】長岡 利 : 日本栄養・食糧学会誌, 49, 303 (1996)

【文献】Iwami, K., Sakakibara, K. and Ibuki, F.: Agric. Biol. Chem., 50, 1217 (1986)

【文献】Sugano, M., Goto, S., Yamada, Y., Yosida, K., Hashimoto, Y., Matsuo, T. and Kimoto, M.: J. Nutr., 120,977 (1990)

【文献】長岡 利 : 食肉に関する助成研究調査成果報告書 336 (1998)

【文献】長岡 利 : 食肉に関する助成研究調査成果報告書 378 (1999)

【文献】Nagaoka, S., Awano, T., Nagata, N., Masaoka, M., Hori, G. and Hashimoto, K.: Biosci. Biotech. Biochem., 61, 354 (1997)

【文献】Nagaoka, S., Miyazaki, H., Oda, H., Aoyama, Y. and Yoshida, A.: J. Nutr., 120, 1134 (1990)

【文献】Nagaoka, S., Miwa, K., Eto, M., Kuzuya, Y., Hori, G. and Yamamoto, K.: J.Nutr. 129, 1725 (1999)

【文献】Nakade, K., Kaneko, H. Oka, T., Ahhmed, A.M., Muguruma, M., Numata, M. and Nagaoka, S.: Biosci. Biotechnol. Biochem. 73, 607 (2009)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

上記の通り、牛心臓タンパク質加水分解物の限外濾過物（ＨＰＨＵ）がコレステロール代謝改善作用を有することを本発明者らは見出しているが、活性ペプチドの特定には至っていない。
そこで本発明は、コレステロールを含む脂質の代謝改善作用を有するペプチドを提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、ＨＰＨＵの脂質代謝改善作用に寄与するペプチドを見出すべく鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。本発明は以下の発明を包含する。
（１）Ｐｈｅ－Ｐｒｏ又はＰｒｏ－Ｐｈｅで表されるアミノ酸配列を少なくとも一部に含む、アミノ酸残基数が１０以下のペプチドを含む、脂質代謝改善剤。
（２）前記ペプチドのアミノ酸残基数が５以下である、（１）に記載の脂質代謝改善剤。
（３）前記ペプチドが、Ｐｈｅ－Ｐｒｏで表されるアミノ酸配列を少なくとも一部に含む、（１）又は（２）に記載の脂質代謝改善剤。
（４）前記ペプチドが、Ｐｈｅ－Ｐｒｏで表されるアミノ酸配列からなるジペプチドである、（１）～（３）のいずれかに記載の脂質代謝改善剤。
（５）Ｐｈｅ－Ｐｒｏ又はＰｒｏ－Ｐｈｅで表されるアミノ酸配列を少なくとも一部に含む、アミノ酸残基数が１０以下のペプチドを含む、脂質代謝改善用食品組成物。
（６）前記ペプチドのアミノ酸残基数が５以下である、（５）に記載の脂質代謝改善用食品組成物。
（７）前記ペプチドが、Ｐｈｅ－Ｐｒｏで表されるアミノ酸配列を少なくとも一部に含む、（５）又は（６）に記載の脂質代謝改善用食品組成物。
（８）前記ペプチドが、Ｐｈｅ－Ｐｒｏで表されるアミノ酸配列からなるジペプチドである、（５）～（７）のいずれかに記載の脂質代謝改善用食品組成物。
（９）動物心臓タンパク質を加水分解酵素により処理する工程を含む、Ｐｈｅ－Ｐｒｏ又はＰｒｏ－Ｐｈｅで表されるアミノ酸配列を少なくとも一部に含む、アミノ酸残基数が１０以下のペプチドの製造方法。

【発明の効果】

【0009】

本発明の脂質代謝改善剤及び脂質代謝改善用食品組成物は、経口摂取により脂質代謝を改善することができる。
本発明の方法によれば、動物由来のタンパク質から脂質代謝改善作用を有するペプチドを製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】図１は、牛心臓加水分解物（ＨＰＨＵ）の限外ろ過物のゲルろ過クロマトグラフィーによる溶出パターンを示す。

【図2】図２は、ＨＰＨＵ－ｇｆ３の逆相クロマトグラフィーによる溶出パターンを示す。

【図3】図３は、ＨＰＨＵ－ｇｆ３－ＲＰＩの逆相クロマトグラフィーによる溶出パターンを示す。

【図4】図４は、ＨＰＨＵ－ｇｆ３－ＲＰＩＢの逆相クロマトグラフィーによる溶出パターンを示す。

【図5】図５は、ＨＰＨＵ－ｇｆ３－ＲＰＩＢ２のゲルろ過クロマトグラフィーによる溶出パターンを示す。

【発明を実施するための形態】

【0011】

＜ペプチド＞
本発明において活性成分として用いるペプチドは、Ｐｈｅ－Ｐｒｏ又はＰｒｏ－Ｐｈｅで表されるアミノ酸配列、好ましくはＰｈｅ－Ｐｒｏで表されるアミノ酸配列を、少なくとも一部に含む、アミノ酸残基数が１０以下のペプチド（以下「本発明のペプチド」と称する場合がある）である。

【0012】

ここでＰｈｅ－Ｐｒｏとは、フェニルアラニンのカルボキシ基にプロリンのアミノ基がアミド結合したアミノ酸配列を表し、Ｐｒｏ－Ｐｈｅとは、プロリンのカルボキシ基にフェニルアラニンのアミノ基がアミド結合したアミノ酸配列を表す。

【0013】

アミノ酸残基数が１０以下の本発明のペプチドにおいて、Ｐｈｅ－Ｐｒｏ又はＰｒｏ－Ｐｈｅで表されるアミノ酸配列はどの位置に位置していてもよい。

【0014】

本発明のペプチドのアミノ酸残基数は１０以下であればよいが、好ましくは９以下、好ましくは８以下、好ましくは７以下、好ましくは６以下、好ましくは５以下、好ましくは５以下、好ましくは３以下、最も好ましくは２である。アミノ酸残基数が２のペプチドはジペプチドと呼ばれる。本発明のペプチドがアミノ酸残基数が２のジペプチドである場合、Ｐｈｅ－Ｐｒｏ又はＰｒｏ－Ｐｈｅで表されるアミノ酸配列からなるジペプチドであり、最も好ましくは、Ｐｈｅ－Ｐｒｏで表されるアミノ酸配列からなるジペプチドである。

【0015】

本発明のペプチドは、より好ましくは分子量が１，０００ダルトン以下のペプチドであり、より好ましくは７００ダルトン以下のペプチドである。１，０００ダルトン以下又は７００ダルトン以下の本発明のペプチドは、それぞれ、分画分子量が１，０００ダルトン以下又は７００ダルトン以下の限外ろ過膜を通過するペプチドとして取得することができる。

【0016】

本発明のペプチドは塩や水和物等の各種の形態で存在していてもよい。
本発明のペプチドの製造方法は特に限定されず、天然物であってもよいし、人為的に作出されたものであってもよい。

【0017】

本発明のペプチドの好適な製造方法は、動物心臓タンパク質を加水分解酵素により処理する酵素加水分解工程を含む方法である。動物とは典型的には非ヒト動物であり、特に好ましくはウシ、ウマ、ブタ等の家畜動物であり、最も好ましくはウシである。動物心臓タンパク質としては、動物の心臓をミキサー等で粉砕したものを用いることができる。加水分解酵素としてはプロテアーゼが好ましい。プロテアーゼはエンド型プロテアーゼであってもエキソ型プロテアーゼであってもよいが、好ましくはエンド型プロテアーゼである。エンド型プロテアーゼの具体例としてはアルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ：商標）２．４Ｌが例示できる。

【0018】

本発明のペプチドの製造方法は、好ましくは、加水分解工程で得られた動物心臓タンパク質加水分解物から、本発明のペプチドを高濃度化する高濃度化工程を含む。高濃度化工程は、限外ろ過による本発明のペプチドの濃縮、クロマトグラフィーを利用した本発明のペプチドの高濃度化などの工程を１以上含む。

【0019】

限外ろ過を行う場合、分画分子量が１，０００ダルトン以下の限外ろ過膜を通過する成分として、本発明のペプチドを濃縮することができる。

【0020】

クロマトグラフィーの種類は特に限定されないが、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等を１種又は２種以上組み合わせて利用することができる。

【0021】

高濃度化工程は、好ましくは、加水分解工程で得られた動物心臓タンパク質加水分解物を限外ろ過膜で処理して、限外ろ過膜の通過分として分子量１，０００ダルトン以下のペプチドを回収する限外ろ過工程と、限外ろ過工程で得られたペプチドを、クロマトグラフィーにより処理して本発明のペプチドを含む画分を回収するクロマトグラフィー工程を含む。

【0022】

本発明のペプチドは、単独のペプチドとして存在する必要はなく、他のペプチドとともに混合した状態で存在してもよい。

【0023】

＜脂質代謝改善剤及び脂質代謝改善用食品組成物＞
本発明において、脂質代謝の改善とは、血中のコレステロール、トリグリセリド等の脂質が低減することや、肝臓中のコレステロール、トリグリセリド等の脂質が低減することを指標として評価することができる。

【0024】

本発明の脂質代謝改善剤は、ヒト等の動物に摂取又は投与されたときに、該動物において脂質代謝を改善することができる。本発明の脂質代謝改善剤を動物に投与する投与経路は特に限定されないが好ましくは経口投与である。本発明の脂質代謝改善剤は、本発明のペプチド以外に、他のペプチドや、許容される他の成分を含んでもよい。他の成分としては担体、賦形剤、溶媒等が挙げられる。本発明の脂質代謝改善剤の形態は特に限定されず、液体、固体のいずれの形態であってもよく、固体の形態としては錠剤、粉末、顆粒等の任意の形態であることができる。

【0025】

本発明の脂質代謝改善用食品組成物は、ヒトにより摂取されたときに、該ヒトにおいて脂質代謝を改善することができる。本発明の脂質代謝改善用食品組成物は、本発明のペプチド以外に、他のペプチドや、食品として許容される他の成分を含んでもよい。他の成分としては担体、賦形剤、溶媒、他の食品素材等が挙げられる。本発明の脂質代謝改善用食品組成物の形態は特に限定されず、液体、固体のいずれの形態であってもよく、固体の形態としては錠剤、粉末、顆粒等の任意の形態であることができる。

【0026】

本発明の脂質代謝改善剤又は脂質代謝改善用食品組成物の動物が摂取する又は動物に投与する量は、脂質代謝を改善することができる有効量であればよいが、典型的には、１日あたり、１００ｍｇ／ｋｇ体重～６００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは、３００ｍｇ／ｋｇ体重～６００ｍｇ／ｋｇ体重であることができる。

【実施例】

【0027】

以下、本発明の実施形態を、実施例に基づき具体的に説明する。ただし本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。

【0028】

１．牛心臓加水分解物（ＨＰＨ）の調製
牛心臓４００ｋｇをミンチし、２倍量の水を加え、ｐＨ８．５、温度を５０℃に調整した。アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ：商標）２．４Ｌを８００ｇ加え、３時間酵素分解を行なった後、８０℃以上で３０分間保持し、酵素を失活させた。室温付近まで冷却後再びｐＨを７．０に調整してろ過し、不溶物を除去した。ろ液を５５℃で減圧濃縮したのち、１０℃以下に冷却し、脂肪を析出させた。濾過後、ろ液にデキストリンを３０ｋｇ加え、噴霧乾燥して、約７５ｋｇの牛心臓加水分解物（「ＨＰＨ」と称する）を得た。

【0029】

２．限外ろ過
上記のＨＰＨを、分画分子量が１，０００Ｄａ（ＭＷ）の限外ろ過膜（東洋濾紙株式会社製）により分画してろ液を回収した。回収したろ液を、牛心臓加水分解物の限外ろ過物（「ＨＰＨＵ」とする）とした。ＨＰＨＵの分子量は約１，０００Ｄａ未満である。

【0030】

３．ゲルろ過クロマトグラフィーによる分画
上記のＨＰＨＵをゲルろ過クロマトグラフィー（ＧＦＣ）により４分画し、コレステロール（ＣＨＯＬ）ミセル溶解性に対する影響を評価した。

【0031】

ＨＰＨＵのＧＦＣによる分画は、ＡＫＴＡ ａｖａｎｔ ２５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）高速液体クロマトグラフィーにより、ＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ３０ｐｇ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行なった。検出波長は２１５ｎｍとした。

【0032】

図１に、ＨＰＨＵのＧＦＣによる溶出パターンを示す。図１に示す４つの画分（ｇｆｌ～４）を得た。

【0033】

ＨＰＨＵ、及び、ＨＰＨＵのＧＦＣによる４つの画分ＨＰＨＵ－ｇｆ１、ＨＰＨＵ－ｇｆ２、ＨＰＨＵ－ｇｆ３、ＨＰＨＵ－ｇｆ４のコレステロールミセル溶解性を評価した。比較のために、カゼイントリプシン加水分解物（ＣＴＨ）についても同様に評価した。

【0034】

各試料のコレステロールミセル溶解性は、Ｎａｇａｏｋａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｔｒ．，１２９，１７２５－１７３０（１９９０）に記載の方法に改変を加えた方法により測定した。０．７４ｋＢｑの［４－^１４Ｃ］－コレステロール（２．１ＧＢｑ／ｍｍｏｌ，ＮＥＮ）、０．１ｍｍｏｌ／ｌのコレステロール（シグマ）、６．６ｍｍｏｌ／１のタウロコール酸ナトリウム（シグマ）、１ｍｍｏｌ／ｌのオレイン酸（シグマ）、０．６ｍｍｏｌ／ｌのホスファチジルコリン（シグマ）、０．５ｍｍｏｌ／ｌのモノオレイン（シグマ）、及び、１３２ｍＭ ＮａＣｌを含む１５ｍｍｏｌ／ｌのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）という組成を有する［^１４Ｃ］標識ミセル溶液（１０ｍｌ）を調製し超音波照射（ＶＰ－５超音波ホモゲナイザー、タイテック）により混合した。３７℃で２４時間インキュベートした後、前記ミセル溶液に、試料を５ｍｇ／ｍｌの濃度で添加し、超音波照射により溶解させ、３７℃で１時間インキュベートした後、１００，０００×ｇで６０分間３７℃にて遠心分離した。上清を回収し、液体シンチレーションカウンターにより上清中の［^１４Ｃ］－コレステロールを定量した。

【0035】

実験結果の統計的分析には、Ｔｕｋｅｙ’ｓ－ｔｅｓｔを用いた。
結果を表１に示す。

【0036】

【表1】

【0037】

ＨＰＨＵ、及びＨＰＨＵのゲルろ過クロマトグラフィーによる画分の１つであるＨＰＨＵ－ｇｆ３は、カゼイントリプシン加水分解物（ＣＴＨ）と比較して、コレステロールミセル溶解性が有意に低下した（表１）。

【0038】

４．逆相クロマトグラフィーによる分画１
上記のＨＰＨＵ－ｇｆ３を、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）により４分画し、コレステロールミセル溶解性に対する影響を評価した。

【0039】

ＨＰＨＵ－ｇｆ３のＲＰＣによる分画は、ＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｉｅｒ １０ ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、ＳＯＵＲＣＥ ５ ＲＰＣ ＳＴ ４．６／１５０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。溶出液として、Ａ液（０．０６５％ トリフルオロ酢酸を含む２％アセトニトリル溶液）に、Ｂ液（０．０５０％トリフルオロ酢酸を含む８０％アセトニトリル溶液）を、図２に示すように段階的に異なる混合比で加えた溶液を用いた。検出波長は２１５ｎｍとした。

【0040】

図２に、ＨＰＨＵ－ｇｆ３のＲＰＣによる溶出パターンを示す。図２に示す４つの画分（ＨＰＨＵ－ｇｆ３－ＲＰＩ、－ＲＰＩＩ、－ＲＰＩＩＩ、－ＲＰＩＶ）を得た。

【0041】

上記の実験３と同様の手順により、各試料のコレステロールミセル溶解性を評価した。
実験結果の統計的分析には、Ｔｕｋｅｙ’ｓ－ｔｅｓｔを用いた。
結果を表２に示す。

【0042】

【表2】

【0043】

ＨＰＨＵのＧＦＣによる分画物であるｇｆ３はＣＴＨと比較して、コレステロールミセル溶解性が低下傾向を示し、さらに、ｇｆ３のＲＰＣによる分画物であるｇｆ３－ＲＰＩ、ｇｆ３－ＲＰＩＩ、ｇｆ３－ＲＰＩＩＩでは有意に低下した（表２）。

【0044】

なお、予備的な機器分析によるペプチド分析から、ｇｆ３－ＲＰＩ、ｇｆ３－ＲＰＩＩ、ｇｆ３－ＲＰＩＩＩは、種々のペプチドの混合物であることから、活性ペプチドの特定のために、以下に示す更なる分画精製を行った。

【0045】

５．逆相クロマトグラフィーによる分画２
上記のＨＰＨＵ－ｇｆ３－ＲＰＩを逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）により６分画し、コレステロールミセル溶解性に対する影響を評価した。

【0046】

ＲＰＣによる分画は、ＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｉｅｒ １０ ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、ＳＯＵＲＣＥ ５ ＲＰＣ ＳＴ ４．６／１５０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。溶出液として、Ａ液（０．０６５％ トリフルオロ酢酸を含む１％アセトニトリル溶液）に、Ｂ液（０．０５０％トリフルオロ酢酸を含む８０％アセトニトリル溶液）を、図３に示すように連続的に変化する混合比で加えた溶液を用いた。検出波長は２１５ｎｍとした。

【0047】

図３に、ＨＰＨＵ－ｇｆ３－ＲＰＩのＲＰＣによる溶出パターンを示す。図３に示す６つの画分（ＨＰＨＵ－ｇｆ３－ＲＰＩＡ、－ＲＰＩＢ、－ＲＰＩＣ、－ＲＰＩＤ、－ＲＰＩＥ、－ＲＰＩＦ）を得た。

【0048】

上記の実験３と同様の手順により、各試料のコレステロールミセル溶解性を評価した。
実験結果の統計的分析には、Ｔｕｋｅｙ’ｓ－ｔｅｓｔを用いた。
結果を表３に示す。

【0049】

【表3】

【0050】

コレステロールミセル溶解性はＣＴＨと比較して、ＨＰＨＵのＧＦＣ－ＲＰＣ分画物であるＨＰＨＵ－ｇｆ３－ＲＰＩ、ＨＰＨＵ－ｇｆ３－ＲＰＩＡ、ＨＰＨＵ－ｇｆ３－ＲＰＩＢ、ＨＰＨＵ－ｇｆ３－ＲＰＩＣ、ＨＰＨＵ－ｇｆ３－ＲＰＩＤおよびＨＰＨＵ－ｇｆ３－ＲＰＩＥでは有意に低下した。ＨＰＨＵ－ｇｆ３－ＲＰＩＢで、最大のコレステロールミセル溶解性の低下を示した（表３）。

【0051】

６．逆相クロマトグラフィーによる分画３
上記のＨＰＨＵ－ｇｆ３－ＲＰＩＢを逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）により更に４分画し、コレステロールミセル溶解性に対する影響を評価した。

【0052】

ＲＰＣによる分画は、ＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、ＳＯＵＲＣＥ ５ ＲＰＣ ＳＴ ４．６／１５０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。溶出液として、Ａ液（０．０６５％トリフルオロ酢酸を含む１％アセトニトリル溶液）に、Ｂ液（０．０５％トリフルオロ酢酸を含む８０％アセトニトリル溶液）を、図４に示すように連続的に変化する混合比で加えた溶液を用いた。検出波長は２１５ｎｍとした。

【0053】

図４に、ＨＰＨＵ－ｇｆ３－ＲＰＩＢのＲＰＣによる溶出パターンを示す。図４に示す４つの画分（ＨＰＨＵ－ｇｆ３－ＲＰＩＢ１、ＨＰＨＵ－ｇｆ３－ＲＰＩＢ２、ＨＰＨＵ－ｇｆ３－ＲＰＩＢ３、ＨＰＨＵ－ｇｆ３－ＲＰＩＢ４）を得た。

【0054】

上記の実験３と同様の手順により、各試料のコレステロールミセル溶解性を評価した。
実験結果の統計的分析には、Ｔｕｋｅｙ’ｓ－ｔｅｓｔを用いた。結果を表４に示す。

【0055】

【表4】

【0056】

ＨＰＨＵ－ｇｆ３－ＲＰＩＢ２はＣＴＨやＨＰＨＵと比較して、コレステロールミセル溶解性が顕著に有意に低下した（表４）。

【0057】

７．有効成分の特定１
上記のＨＰＨＵ－ｇｆ３－ＲＰＩＢ２を、ＡＫＴＡ ａｖａｎｔ ２５でＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅ １０／３００ ＧＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）カラムを用いたゲルろ過クロマトグラフィーに供して分画した。そして、同じ装置及びカラムを用いて、既知分子量の基準ペプチド（ＩＩＡＥＫＫ、ＩＩＡＥ、ＩＩＡ、ＩＡ、Ｇ）を分画した。得られたピークの保留時間及び基準ペプチドの分子量から、ピークの保留時間と分子量との検量線を作成した。この検量線から、ＨＰＨＵ－ｇｆ３－ＲＰＩＢ２に含まれるペプチドの分子量を推定した。検出波長は２２０ｎｍとした。

【0058】

図５に溶出パターンを示す。図５においてＡは分子量２００～７００に相当する保留時間の範囲であり、Ｂは７５～２００に相当する保留時間の範囲であり、Ｃは分子量７５以下に相当する保留時間の範囲を示す。ＨＰＨＵ－ｇｆ３－ＲＰＩＢ２に含まれるペプチドのうち、分子量７５～２００が全体の約６２％、分子量２００～７００が約３３％であった。

【0059】

８．有効成分の特定２
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法－飛行時間型質量分析法）により、ＨＰＨＵ－ｇｆ３－ＲＰＩＢ２の質量分析を行った。その結果、複数のピークのなかの１つとして、質量電荷比Ｍ／Ｚが２６０．２２のピークが検出された。また、ＭＳ／ＭＳによる質量スペクトルでは、質量電荷比Ｍ／Ｚ２６１．１８のベースピークとＭ／Ｚ１４７．６６のフラグメントピークが検出された。これらの結果と、ウシ心筋のミオシン－７の既知のアミノ酸配列の情報から、ＨＰＨＵ－ｇｆ３－ＲＰＩＢ２には、Ｎ末端にフェニルアラニンが位置し、Ｃ末端にプロリンが位置するジペプチド（Ｐｈｅ－Ｐｒｏ＝ＦＰ）が含まれると結論付けた。

【0060】

９．ペプチドＦＰの生理活性
化学的に合成した市販のジペプチドＦＰを用いて、高脂コレステロール血症ラットにおいて、脂質代謝に対する影響を評価した。
高脂コレステロール食（ＨＦＣ）の食餌組成を表５に示す。

【0061】

【表5】

【0062】

Ｗｉｓｔａｒ系雄ラット４週齢を実験に使用した。ＦＰは１４日間ゾンデによって経口投与した。ＦＰの投与量は６００ｍｇ／ｋｇ体重／日とした。解剖前８時間絶食後に解剖し、血液を採取し、遠心分離により血漿を得て、－８０℃で保管したのち、分析した。

【0063】

なお、実験結果の統計的分析にはＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔを用いた。
結果を表６に示す。「ＨＦＣ」は高脂コレステロール食を与え、ＦＰを与えなかった対照群である。「ＨＦＣＦＰ」は、高脂コレステロール食とＦＰを与えた試験群である。

【0064】

【表6】

【0065】

表６に示す結果から、体重増加量、食餌摂取量、肝臓重量には、群間で有意な変化は認められなかった。血清コレステロール、肝臓総脂質、肝臓コレステロールは、対照群（ＨＦＣ）と比較して、試験群（ＨＦＣＦＰ）で有意に低下した。血清トリグリセリドは、対照群と比較して、試験群で低下傾向を示した。今回の結果は、世界初のコレステロール代謝改善ジペプチドの発見を意味するものである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】