特許 7536245 オリゴデンドロサイトの作製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-08-09

(45)【発行日】2024-08-20

(54)【発明の名称】オリゴデンドロサイトの作製方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/079 20100101AFI20240813BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20240813BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20240813BHJP

【ＦＩ】

C12N5/079

C12N15/12

C12N15/113 Z

【請求項の数】 27

(21)【出願番号】P 2022578285

(86)(22)【出願日】2022-01-19

(86)【国際出願番号】 JP2022001814

(87)【国際公開番号】W WO2022163466

(87)【国際公開日】2022-08-04

【審査請求日】2023-03-15

(31)【優先権主張番号】63/141,626

(32)【優先日】2021-01-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】517123221

【氏名又は名称】アイ ピース，インコーポレイテッド

(73)【特許権者】

【識別番号】515238909

【氏名又は名称】田邊 剛士

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】田邊 剛士

【審査官】山本 匡子

(56)【参考文献】

【文献】特表２０２０－５０１５３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１９／０３２２９８１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２００７／０６９６６６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】PAWLOWSKI M. et al.，Inducible and Deterministic Forward Programming of Human Pluripotent Stem Cells into Neurons, Skelet，Stem Cell Reports，2017年04月11日，Vol.8, No.4，pp.803-812，DOI:10.1016/j.stemcr.2017.02.016

【文献】EHRLICH M. et al.，Rapid and efficient generation of oligodendrocytes from human induced pluripotent stem cells using t，Proc Natl Acad Sci U S A，2017年02月28日，E2243-E2252，DOI: 10.1073/pnas.1614412114

【文献】CHANOUMIDOU K. et al.，One-step Reprogramming of Human Fibroblasts into Oligodendrocyte-like Cells by SOX10, OLIG2, and NKX，Stem Cell Reports，2021年04月13日，Vol.16, No.4，pp.771-783，DOI: 10.1016/j.stemcr.2021.03.001

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００－５／２８

Ｃ１２Ｑ

ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞にＯＬＩＧ及びＳＯＸの組み合わせ、又はＯＬＩＧ及びＮＫＸの組み合わせを含む誘導因子を導入することを含み、前記誘導因子が、細胞増殖を促進する因子を含み、前記細胞増殖を促進する因子が、ｐ５３遺伝子を抑制する因子、Ｒｂ遺伝子を抑制する因子、及びＭＹＣから選択される少なくともいずれかである、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。

【請求項2】

前記誘導因子がＯＬＩＧ、ＮＫＸ、及びＳＯＸを含む、請求項１に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。

【請求項3】

前記誘導因子がＡＳＣＬをさらに含む、請求項１又は２に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。

【請求項4】

ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞にＯＬＩＧ及び細胞増殖を促進する因子を含む誘導因子を導入することを含み、前記細胞増殖を促進する因子が、ｐ５３遺伝子を抑制する因子、Ｒｂ遺伝子を抑制する因子、及びＭＹＣから選択される少なくともいずれかである、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。

【請求項5】

前記誘導因子がＳＯＸ、ＡＳＣＬ、及びＮＫＸからなる群から選択される少なくともいずれかを含む、請求項４に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。

【請求項6】

リプログラミング因子を導入された細胞をクローニングせずにｉＰＳ細胞を作製することと、
前記ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、
を含み、
前記誘導因子が、細胞増殖を促進する因子を含み、前記細胞増殖を促進する因子が、ｐ５３遺伝子を抑制する因子、Ｒｂ遺伝子を抑制する因子、及びＭＹＣから選択される少なくともいずれかである、
オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。

【請求項7】

リプログラミング因子を導入された細胞をクローニングせずに播種し、ｉＰＳ細胞を作製することと、
前記ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、
を含み、
前記誘導因子が、細胞増殖を促進する因子を含み、前記細胞増殖を促進する因子が、ｐ５３遺伝子を抑制する因子、Ｒｂ遺伝子を抑制する因子、及びＭＹＣから選択される少なくともいずれかである、
オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。

【請求項8】

リプログラミング因子を導入された細胞を培養器から剥離し、剥離した細胞の少なくとも一部を混合して播種し、ｉＰＳ細胞を作製することと、
前記ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、
を含み、
前記誘導因子が、細胞増殖を促進する因子を含み、前記細胞増殖を促進する因子が、ｐ５３遺伝子を抑制する因子、Ｒｂ遺伝子を抑制する因子、及びＭＹＣから選択される少なくともいずれかである、
オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。

【請求項9】

リプログラミング因子を導入された細胞を培養器から回収し、回収した細胞の少なくとも一部を混合して播種し、ｉＰＳ細胞を作製することと、
前記ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、
を含み、
前記誘導因子が、細胞増殖を促進する因子を含み、前記細胞増殖を促進する因子が、ｐ５３遺伝子を抑制する因子、Ｒｂ遺伝子を抑制する因子、及びＭＹＣから選択される少なくともいずれかである、
オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。

【請求項10】

リプログラミング因子を導入された細胞が形成する複数のコロニーのそれぞれをピックアップせずにｉＰＳ細胞を作製することと、
前記ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、
を含み、
前記誘導因子が、細胞増殖を促進する因子を含み、前記細胞増殖を促進する因子が、ｐ５３遺伝子を抑制する因子、Ｒｂ遺伝子を抑制する因子、及びＭＹＣから選択される少なくともいずれかである、
オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。

【請求項11】

リプログラミング因子を導入された細胞であって、異なるシングルセル由来の細胞同士混合して播種してｉＰＳ細胞を作製することと、
前記ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、
を含み、
前記誘導因子が、細胞増殖を促進する因子を含み、前記細胞増殖を促進する因子が、ｐ５３遺伝子を抑制する因子、Ｒｂ遺伝子を抑制する因子、及びＭＹＣから選択される少なくともいずれかである、
オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。

【請求項12】

前記播種することにおいて、前記リプログラミング因子を導入された細胞同士を混合する、請求項８、９、及び１１のいずれか１項に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。

【請求項13】

前記播種することにおいて、前記リプログラミング因子を導入された細胞のクローン同士を混合する、請求項８、９、１１、及び１２のいずれか１項に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。

【請求項14】

前記リプログラミング因子を導入された細胞が形成する複数のコロニーを互いに分離することを含まない、請求項６から１３のいずれか１項に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。

【請求項15】

前記播種することにおいて、前記リプログラミング因子を導入された細胞が形成する複数のコロニーを互いに混合する、請求項８、９、１１、１２、及び１３のいずれか１項に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。

【請求項16】

前記リプログラミング因子を導入された細胞が形成する単一のコロニーをクローニングすることを含まない、請求項６から１５のいずれか１項に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。

【請求項17】

前記リプログラミング因子を導入された細胞であって、培養器に付着している細胞を回収し、回収した細胞の少なくとも一部を培地に播種する、請求項６から１６のいずれか１項に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。

【請求項18】

前記リプログラミング因子を導入された細胞を遺伝子発現状態で区別することなく播種する、請求項６から１７のいずれか１項に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。

【請求項19】

前記リプログラミング因子を導入された細胞をリプログラミングの程度で区別することなく播種する、請求項６から１８のいずれか１項に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。

【請求項20】

前記誘導因子がＳＯＸ、ＡＳＣＬ、及びＮＫＸからなる群から選択される少なくともいずれかを含む、請求項６から１９のいずれか１項に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。

【請求項21】

体細胞にＯＬＩＧ、ＳＯＸ、ＡＳＣＬ、ＮＫＸを含む誘導因子を導入することを含み、
前記誘導因子が、細胞増殖を促進する因子を含み、前記細胞増殖を促進する因子が、ｐ５３遺伝子を抑制する因子、Ｒｂ遺伝子を抑制する因子、及びＭＹＣから選択される少なくともいずれかである、
、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。

【請求項22】

体細胞にＯＬＩＧ及び細胞増殖を促進する因子を含む誘導因子を導入することを含み、前記細胞増殖を促進する因子が、ｐ５３遺伝子を抑制する因子、Ｒｂ遺伝子を抑制する因子、及びＭＹＣから選択される少なくともいずれかである、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。

【請求項23】

前記誘導因子がＳＯＸ、ＡＳＣＬ、及びＮＫＸからなる群から選択される少なくともいずれかを含む、請求項２２に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。

【請求項24】

前記体細胞がｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞でない、請求項２１から２３のいずれか１項に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。

【請求項25】

前記体細胞が血液細胞である、請求項２１から２３のいずれか１項に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。

【請求項26】

前記体細胞が単核球である、請求項２１から２３のいずれか１項に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。

【請求項27】

前記体細胞が線維芽細胞である、請求項２１から２３のいずれか１項に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞技術に関し、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法に関する。

【背景技術】

【0002】

中枢神経系のミエリン形成細胞であるオリゴデンドロサイトは、遺伝性及び後天性白質ジストロフィーの細胞移植に有用である可能性がある（例えば、特許文献１、２参照。）。しかし、従来の幹細胞からオリゴデンドロサイトを誘導する方法は、時間がかかり、効率的でないという問題がある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【文献】特許第６５４１５７７号公報

【文献】国際公開第２０１１／０９１０４８号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明は、効率的なオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法を提供することを目的の一つとする。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明の態様によれば、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞にＯＬＩＧ及びＳＯＸを含む誘導因子を導入することを含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法が提供される。

【0006】

本発明の態様によれば、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞にＯＬＩＧ及びＮＫＸを含む誘導因子を導入することを含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法が提供される。

【0007】

本発明の態様によれば、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞にＯＬＩＧ、ＮＫＸ、及びＳＯＸを含む誘導因子を導入することを含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法が提供される。

【0008】

上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、誘導因子が、細胞増殖を促進する因子をさらに含んでいてもよい。

【0009】

上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、細胞増殖を促進する因子が、ｐ５３遺伝子を抑制する因子、Ｒｂ遺伝子を抑制する因子、及びＭＹＣからなる群から選択される少なくとも一つであってもよい。ＭＹＣは、ｃ－ＭＹＣであってもよい。

【0010】

上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、誘導因子がＡＳＣＬをさらに含んでいてもよい。

【0011】

また、本発明の態様によれば、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞にＯＬＩＧ及び細胞増殖を促進する因子を含む誘導因子を導入することを含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法が提供される。

【0012】

上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、細胞増殖を促進する因子が、ｐ５３遺伝子を抑制する因子、Ｒｂ遺伝子を抑制する因子、及びＭＹＣからなる群から選択される少なくとも一つであってもよい。ＭＹＣは、ｃ－ＭＹＣであってもよい。

【0013】

上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、誘導因子がＳＯＸ、ＡＳＣＬ、及びＮＫＸからなる群から選択される少なくともいずれかを含んでいてもよい。

【0014】

また、本発明の態様によれば、リプログラミング因子を導入された細胞をクローニングせずにｉＰＳ細胞を作製することと、ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、を含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法が提供される。

【0015】

また、本発明の態様によれば、リプログラミング因子を導入された細胞をクローニングせずに播種してｉＰＳ細胞を作製することと、ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、を含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法が提供される。

【0016】

また、本発明の態様によれば、リプログラミング因子を導入された細胞を培養器から剥離し、剥離した細胞の少なくとも一部を混合して播種し、ｉＰＳ細胞を作製することと、ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、を含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法が提供される。

【0017】

また、本発明の態様によれば、リプログラミング因子を導入された細胞を培養器から回収し、回収した細胞の少なくとも一部を混合して播種し、ｉＰＳ細胞を作製することと、ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、を含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法が提供される。

【0018】

また、本発明の態様によれば、リプログラミング因子を導入された細胞が形成する複数のコロニーそれぞれをピックアップせずにｉＰＳ細胞を作製することと、ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、を含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法が提供される。

【0019】

また、本発明の態様によれば、リプログラミング因子を導入された細胞であって、異なるシングルセル由来の細胞同士混合して播種してｉＰＳ細胞を作製することと、ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、を含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法が提供される。

【0020】

上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、播種することにおいて、細胞をクローニングしなくともよい。

【0021】

上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、播種することにおいて、リプログラミング因子を導入された細胞同士を混合してもよい。

【0022】

上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、播種することにおいて、リプログラミング因子を導入された細胞のクローン同士を混合してもよい。

【0023】

上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、播種することにおいて、リプログラミング因子を導入された細胞の異なるクローン同士を混合してもよい。

【0024】

上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、播種する前に、リプログラミング因子を導入された細胞が形成する複数のコロニーを互いに分離することを含まなくともよい。

【0025】

上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、播種する前に、リプログラミング因子を導入された細胞が形成する複数のコロニーのそれぞれをピックアップしなくともよい。

【0026】

上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、播種することにおいて、リプログラミング因子を導入された細胞が形成する複数のコロニーを互いに混合してもよい。

【0027】

上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、リプログラミング因子を導入された細胞が形成する単一のコロニーをクローニングすることを含まなくともよい。

【0028】

上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、リプログラミン因子を導入された細胞が形成するコロニーをピックアップすることを含まなくともよい。

【0029】

上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、リプログラミング因子を導入された細胞であって、培養器に付着している細胞を回収し、回収した細胞の少なくとも一部を培地に播種してもよい。

【0030】

上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、リプログラミング因子を導入された細胞を遺伝子発現状態で区別することなく播種してもよい。

【0031】

上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、リプログラミング因子を導入された細胞をリプログラミングの程度で区別することなく播種してもよい。

【0032】

上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、誘導因子がＳＯＸ、ＡＳＣＬ、及びＮＫＸからなる群から選択される少なくともいずれかを含んでいてもよい。

【0033】

また、本発明の態様によれば、体細胞にＯＬＩＧ、ＳＯＸ、ＡＳＣＬ、ＮＫＸを含む誘導因子を導入することを含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法が提供される。

【0034】

上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、誘導因子が、細胞増殖を促進する因子をさらに含んでいてもよい。

【0035】

また、本発明の態様によれば、体細胞にＯＬＩＧ及び細胞増殖を促進する因子を含む誘導因子を導入することを含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法が提供される。

【0036】

上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、誘導因子がＳＯＸ、ＡＳＣＬ、及びＮＫＸからなる群から選択される少なくともいずれかを含んでいてもよい。

【0037】

上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、細胞増殖を促進する因子が、ｐ５３遺伝子を抑制する因子、Ｒｂ遺伝子を抑制する因子、及びＭＹＣからなる群から選択される少なくとも一つであってもよい。ＭＹＣは、ｃ－ＭＹＣであってもよい。

【0038】

上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、体細胞がｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞でなくともよい。

【0039】

上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、体細胞が血液細胞であってもよい。

【0040】

上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、体細胞が単核球であってもよい。

【0041】

上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、体細胞が線維芽細胞であってもよい。

【発明の効果】

【0042】

本発明によれば、効率的なオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法を提供可能である。

【図面の簡単な説明】

【0043】

【図1】実施例１に係るフローサイトメーターによる測定結果を示すグラフである。

【図2】実施例１に係るＰＣＲの結果を示すグラフである。

【図3】実施例１に係るＴＲＡ１－６０陽性細胞を示す写真である。

【図4】実施例１及び実施例２に係るクローナルエフィシエンシーを示すグラフである。

【図5】実施例３に係る細胞の蛍光顕微鏡写真である。

【図6】実施例３に係る細胞の蛍光顕微鏡写真である。

【図7】実施例４に係る細胞の蛍光顕微鏡写真である。

【図8】実施例５から９に係る細胞の蛍光顕微鏡写真である。

【図9】実施例１０に係る細胞の蛍光顕微鏡写真である。

【図10】実施例１１に係る細胞の蛍光顕微鏡写真である。

【図11】実施例１２に係る細胞の蛍光顕微鏡写真である。

【図12】実施例１３から１８の結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0044】

以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお以下の示す実施形態は、この発明の技術的思想を具体化するための材料、物質、薬品、及び方法等を例示するものであって、この発明の技術的思想は構成部材の組み合わせ等を下記のものに特定するものではない。この発明の技術的思想は、特許請求の範囲において種々の変更を加えることができる。

【0045】

実施形態に係るオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法は、体細胞にＯＬＩＧ、ＳＯＸ、ＡＳＣＬ、ＮＫＸを含む誘導因子を導入することを含む。

【0046】

また、実施形態に係るオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法は、ｉＰＳ細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）又はＥＳ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）にＯＬＩＧ及びＳＯＸを含む誘導因子を導入することを含む。

【0047】

また、実施形態に係るオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法は、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞にＯＬＩＧ及びＮＫＸを含む誘導因子を導入することを含む。

【0048】

また、実施形態に係るオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法は、リプログラミング因子を導入された細胞をクローニングせずにｉＰＳ細胞を作製することと、ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、を含む。

【0049】

また、実施形態に係るオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法は、リプログラミング因子を導入された細胞をクローニングせずに播種してｉＰＳ細胞を作製することと、ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、を含む。

【0050】

また、実施形態に係るオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法は、リプログラミング因子を導入された細胞を培養器から剥離し、剥離した細胞の少なくとも一部を混合して播種し、ｉＰＳ細胞を作製することと、ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、を含む。

【0051】

また、実施形態に係るオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法は、リプログラミング因子を導入された細胞を培養器から回収し、回収した細胞の少なくとも一部を混合して播種し、ｉＰＳ細胞を作製することと、ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、を含む。

【0052】

また、実施形態に係るオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法は、リプログラミング因子を導入された細胞が形成する複数のコロニーそれぞれをピックアップせずにｉＰＳ細胞を作製することと、ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、を含む。

【0053】

また、実施形態に係るオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法は、リプログラミング因子を導入された細胞であって、異なるシングルセル由来の細胞同士混合して播種してｉＰＳ細胞を作製することと、ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、を含む。

【0054】

誘導因子は、ＯＬＩＧとＡＳＣＬを含んでいてもよい。誘導因子は、ＯＬＩＧ、ＡＳＣＬ、及びＳＯＸを含んでいてもよい。誘導因子は、ＯＬＩＧ、ＳＯＸ、ＡＳＣＬ、及びＮＫＸを含んでいてもよい。

【0055】

ＯＬＩＧは、例えば、ＯＬＩＧ２である。ＳＯＸは、例えば、ＳＯＸ１０である。ＡＳＣＬは、例えば、ＡＳＣＬ１である。ＮＫＸは、例えば、ＮＫＸ２．２又はＮＫＸ６．１である。

【0056】

誘導因子が、細胞増殖を促進する因子をさらに含んでいてもよい。細胞増殖を促進する因子の例としては、ｐ５３遺伝子を抑制する因子、Ｒｂ遺伝子を抑制する因子、及びＭＹＣが挙げられる。細胞増殖を促進する因子は、ガン化を促進する因子、アポトーシスを抑制する因子、あるいはクロマチンをユークロマチンに誘導する因子であり得る。

【0057】

ｐ５３は、ガン抑制タンパク質である。ｐ５３遺伝子を抑制する因子は、例えば、ｐ５３のドミナントネガティブ変異体である。ｐ５３のドミナントネガティブ変異体は、体細胞に内在する野生型ｐ５３タンパク質と競合的に作用して、野生型ｐ５３タンパク質の機能を阻害し得る限り特に限定されない。ｐ５３のドミナントネガティブ変異体の例としては、マウスｐ５３のＤＮＡ結合領域に位置する２７５位（ヒトの場合は２７８位）のプロリンをセリンに点変異させたｐ５３Ｐ２７５Ｓ、マウスｐ５３の１４－３０１位（ヒトｐ５３では１１－３０４位に対応）のアミノ酸を欠失させたｐ５３ＤＤ、マウスｐ５３の５８位（ヒトの場合は６１位）のセリンをアラニンに点変異させたｐ５３Ｓ５８Ａ、ヒトｐ５３の１３５位（マウスの場合は１３２位）のシステインをチロシンに点変異させたｐ５３Ｃ１３５Ｙ、マウスｐ５３の１３５位（ヒトの場合は１３８位）のアラニンをバリンに点変異させたｐ５３Ａ１３５Ｖ、マウスｐ５３の１７２位（ヒトの場合は１７５位）のアルギニンをヒスチジンに点変異させたｐ５３Ｒ１７２Ｈ、マウスｐ５３の２７０位（ヒトの場合は２７３位）のアルギニンをヒスチジンに点変異させたｐ５３Ｒ２７０Ｈ、及びマウスｐ５３の２７８位（ヒトの場合は２８１位）のアスパラギン酸をアスパラギンに点変異させたｐ５３Ｄ２７８Ｎが挙げられる。あるいは、ｐ５３遺伝子を抑制する因子は、ｐ５３遺伝子に干渉する短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及びｓｉＲＮＡのようなＲＮＡであってもよい。

【0058】

Ｒｂは、ガン抑制タンパク質である。Ｒｂ遺伝子を抑制する因子は、例えば、Ｒｂ遺伝子に干渉する短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及びｓｉＲＮＡのようなＲＮＡであってもよい。

【0059】

ＭＹＣは、細胞周期制御の機能を喪失させ、ガン化を誘導する。ＭＹＣは、ｃ－ＭＹＣであってもよい。

【0060】

誘導因子はＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよい。ＲＮＡは、ｍＲＮＡであってもよい。なお、ここでは遺伝子記号はヒトで記載しているが、大文字・小文字表記によって、種を制限することを意図するものではない。例えば、全て大文字表記していても、マウス又はラットの遺伝子を含むことを排除するものではない。ただし、実施例においては、実際に使用した生物種に則って、遺伝子記号を表記している。

【0061】

体細胞は、例えば、幹細胞ではない細胞である。体細胞は、例えば、ｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞ではない細胞である。体細胞の例としては、線維芽細胞、血液細胞、歯髄幹細胞、ケラチノサイト、毛乳頭細胞、口腔上皮細胞、及び体性幹前駆細胞等が挙げられる。血液細胞の例としては、Ｔ細胞、並びにマクロファージ、モノサイト、単核球、Ｂ細胞、及びロゼット非形成細胞のようなＴ細胞以外の血液細胞（ｎｏｎ－Ｔ細胞）が挙げられる。体細胞は、尿に含まれる細胞であってもよい。尿に含まれる細胞の例としては、膀胱上皮細胞が挙げられる。

【0062】

体細胞は、ヒト由来であってもよいし、非ヒト動物由来であってもよい。体細胞は、一人のヒト由来であってもよいし、複数人のヒト由来であってもよい。体細胞は、一匹の非ヒト動物由来であってもよいし、複数匹の非ヒト動物由来であってもよい。体細胞は、胎児由来であってもよい。

【0063】

ｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞は、ヒト由来であってもよいし、非ヒト動物由来であってもよい。ｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞は、一人のヒト由来であってもよいし、複数人のヒト由来であってもよい。ｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞は、一匹の非ヒト動物由来であってもよいし、複数匹の非ヒト動物由来であってもよい。ｉＰＳ細胞は、胎児由来であってもよい。

【0064】

ｉＰＳ細胞は、例えば、リプログラミング因子を導入された細胞を培養することと、リプログラミング因子を導入された細胞を回収し、回収した細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代することと、を含む、培養方法によって誘導されてもよい。

【0065】

リプログラミング因子を導入される細胞は特に限定されないが、例としては、線維芽細胞、血液細胞、歯髄幹細胞、ケラチノサイト、毛乳頭細胞、口腔上皮細胞、及び体性幹前駆細胞等が挙げられる。リプログラミング因子を導入される細胞は、尿に含まれる細胞であってもよい。尿に含まれる細胞の例としては、膀胱上皮細胞が挙げられる。リプログラミング因子を導入される細胞は、ヒト由来であってもよいし、非ヒト動物由来であってもよい。リプログラミング因子を導入される細胞は、一人のヒト由来であってもよいし、複数人のヒト由来であってもよい。リプログラミング因子を導入される細胞は、一匹の非ヒト動物由来であってもよいし、複数匹の非ヒト動物由来であってもよい。

【0066】

細胞に導入されるリプログラミング因子は、例えば、ＲＮＡである。ＲＮＡは、例えば、ｍＲＮＡである。細胞に導入されるリプログラミング因子は、例えば、ＯＣＴ３／４等のＯＣＴのＲＮＡ、ＳＯＸ２等のＳＯＸのＲＮＡ、ＫＬＦ４等のＫＬＦのＲＮＡ、及びｃ－ＭＹＣ等のＭＹＣのＲＮＡを含む。リプログラミング因子ＲＮＡとして、ＯＣＴ３／４を改良したＭ_３Ｏを使用してもよい。また、リプログラミング因子ＲＮＡは、ＬＩＮ２８Ａ、ＦＯＸＨ１、ＬＩＮ２８Ｂ、ＧＬＩＳ１、ｐ５３－ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ、ｐ５３－Ｐ２７５Ｓ、Ｌ－ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４、ＤＰＰＡ５、ＺＩＣ３、ＢＣＬ－２、Ｅ－ＲＡＳ、ＴＰＴ１、ＳＡＬＬ２、ＮＡＣ１、ＤＡＸ１、ＴＥＲＴ、ＺＮＦ２０６、ＦＯＸＤ３、ＲＥＸ１、ＵＴＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、ＥＳＲＲＢ、ｍｉＲ－２９１－３ｐ、ｍｉＲ－２９４、ｍｉＲ－２９５、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、ＴＢＸ３、ＭＢＤ３ｓｈ、ＴＨ２Ａ、ＴＨ２Ｂ、及びＰ５３ＤＤからなる群から選択される少なくとも一つの因子のＲＮＡをさらに含んでいてもよい。これらのＲＮＡは、ＴｒｉＬｉｎｋから入手可能である。

【0067】

ｐ５３は、ガン抑制タンパク質である。ｐ５３のドミナントネガティブ変異体は、体細胞に内在する野生型ｐ５３タンパク質と競合的に作用して、野生型ｐ５３タンパク質の機能を阻害し得る限り特に限定されない。ｐ５３のドミナントネガティブ変異体の例としては、マウスｐ５３のＤＮＡ結合領域に位置する２７５位（ヒトの場合は２７８位）のプロリンをセリンに点変異させたｐ５３Ｐ２７５Ｓ、マウスｐ５３の１４－３０１位（ヒトｐ５３では１１－３０４位に対応）のアミノ酸を欠失させたｐ５３ＤＤ、マウスｐ５３の５８位（ヒトの場合は６１位）のセリンをアラニンに点変異させたｐ５３Ｓ５８Ａ、ヒトｐ５３の１３５位（マウスの場合は１３２位）のシステインをチロシンに点変異させたｐ５３Ｃ１３５Ｙ、マウスｐ５３の１３５位（ヒトの場合は１３８位）のアラニンをバリンに点変異させたｐ５３Ａ１３５Ｖ、マウスｐ５３の１７２位（ヒトの場合は１７５位）のアルギニンをヒスチジンに点変異させたｐ５３Ｒ１７２Ｈ、マウスｐ５３の２７０位（ヒトの場合は２７３位）のアルギニンをヒスチジンに点変異させたｐ５３Ｒ２７０Ｈ、及びマウスｐ５３の２７８位（ヒトの場合は２８１位）のアスパラギン酸をアスパラギンに点変異させたｐ５３Ｄ２７８Ｎが挙げられる。

【0068】

ＲＮＡは、プソイドウリジン（Ψ）又は５－メチルウリジン（５ｍｅＵ）で修飾されていてもよい。ＲＮＡは、ポリアデニル化されていてもよい。

【0069】

細胞に導入されるＲＮＡは、例えば、１本鎖ＲＮＡであり、２本鎖ＲＮＡが実質的に除去されていてもよい。また、細胞に導入されるＲＮＡは、短鎖ＲＮＡ及び夾雑物等の不純物が実質的に除去されていることが好ましい。２本鎖ＲＮＡを実質的に除去するために、細胞に導入する１本鎖ＲＮＡを、精製及び／又は濃縮してもよい。細胞に導入する１本鎖ＲＮＡを精製する方法としては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いる精製方法が挙げられる。例えば、ＨＰＬＣによって、２本鎖ＲＮＡが、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、あるいは９０％以上除去される。あるいは、２本鎖ＲＮＡを実質的に除去するために、細胞に導入するＲＮＡを、２本鎖ＲＮＡを分解するリボヌクレアーゼで処理してもよい。

【0070】

細胞に導入されるＲＮＡは、ＯＣＴ３／４のＲＮＡの完全長に直接接続されたＭＹＯＤの転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）のＲＮＡをさらに含んでいてもよい。

【0071】

リプログラミング因子は、例えば、リポフェクション法により細胞に導入される。リポフェクション法とは、陰性荷電物質である核酸と、陽性荷電脂質と、の複合体を、電気的な相互作用により形成し、複合体をエンドサイトーシスや膜融合により細胞内に取り込ませる方法である。リポフェクション法は、細胞へのダメージが少なく、導入効率に優れており、操作が簡便であり、時間がかからない等の利点を有する。

【0072】

リプログラミング因子は、例えば、ＲＮＡトランスフェクション試薬を用いて培養されている細胞に導入される。例えば、細胞が単核球である場合、血液から単核球を分離した直後に、単核球にＲＮＡを導入してもよい。

【0073】

あるいは、細胞には、例えば、ウイルスベクターを用いてリプログラミング因子を導入する。ウイルスベクターは、ＲＮＡウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターは、センダイウイルスベクターであってもよい。センダイウイルスベクターは、所定の温度以上でウイルス核酸の安定性が低下する温度感受性センダイウイルスベクターであってもよい。温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸は、所定の温度未満で安定である。ウイルス核酸は、ウイルスＤＮＡであってもよいし、ウイルスＲＮＡであってもよい。ウイルス核酸はウイルスゲノムであってもよい。ウイルス核酸の安定性の低下とは、ウイルス核酸が分解すること、及びウイルス核酸の複製又は増殖が抑制されることと、の少なくとも一方であってもよい。ウイルス核酸の安定性が低下すると、ウイルス核酸の増殖、ウイルス核酸の複製速度及び遺伝子発現レベルの少なくとも一方が低下する。所定の温度とは、例えば、３６．５℃以上３７．５℃以下である。温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸の安定性、すなわち、増殖、複製速度及び遺伝子発現レベルの少なくとも一方は、所定の温度未満で高く、所定の温度以上で低くなる。例えば、温度感受性センダイウイルスベクターは、３２℃で培養されている細胞における増殖速度又は遺伝子発現レベルと比較して、３７℃で培養されている細胞における増殖速度又は遺伝子発現レベルが、１／２以下である。

【0074】

センダイウイルスは、Ｎ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ／ＨＮ遺伝子、及びＬ遺伝子をコードする。ＨＮタンパク質は、センダイウイルスが細胞に付着する際に細胞表面のシアル酸を認識してウイルス粒子を細胞に繋留させる。Ｆタンパク質は、細胞外のプロテアーゼにより切断活性化されて、繋留されているセンダイウイルスのエンベロープと標的細胞の細胞膜の融合を触媒して感染を成立させる。Ｌタンパク質は、その修飾タンパク質であるＰタンパク質とともに、感染後に細胞質でウイルス核酸の複製と複製された多コピーの核酸からの転写を触媒する。

【0075】

センダイウイルスベクターにおいてＦ遺伝子を欠失させることにより、遺伝子導入細胞から感染可能なウイルス粒子が産生されることを抑制することが可能である。また、Ｌ遺伝子及びＰ遺伝子の少なくとも一方に変異を導入することにより、センダイウイルスベクターを温度感受性にすることが可能である。

【0076】

センダイウイルスの温度感受性（ＴＳ）変異の例としては、ＴＳ７（Ｌタンパク質のＹ９４２Ｈ／Ｌ１３６１Ｃ／Ｌ１５５８Ｉ変異）、ＴＳ１２（Ｐタンパク質のＤ４３３Ａ／Ｒ４３４Ａ／Ｋ４３７Ａ変異）、ＴＳ１３（Ｐタンパク質のＤ４３３Ａ／Ｒ４３４Ａ／Ｋ４３７Ａ変異及びＬタンパク質のＬ１５５８Ｉ変異）、ＴＳ１４（Ｐタンパク質のＤ４３３Ａ／Ｒ４３４Ａ／Ｋ４３７Ａ変異及びＬタンパク質のＬ１３６１Ｃ変異）、ＴＳ１５（Ｐタンパク質のＤ４３３Ａ／Ｒ４３４Ａ／Ｋ４３７Ａ変異及びＬタンパク質のＬ１３６１Ｃ／Ｌ１５５８Ｉ変異）等が挙げられる。

【0077】

センダイウイルスベクターは、例えば、Ｍタンパク質にＧ６９Ｅ、Ｔ１１６Ａ、及びＡ１８３Ｓの変異を有し、ＨＮタンパク質にＡ２６２Ｔ、Ｇ２６４Ｒ、及びＫ４６１Ｇの変異を有し、Ｐタンパク質にＬ５１１Ｆ変異を有し、Ｌタンパク質にＮ１１９７Ｓ及びＫ１７９５Ｅ変異を有するＦ遺伝子欠失（ΔＦ）型センダイウイルスベクターであって、上記のＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を導入したセンダイウイルスベクターである。ただし、センダイウイルスベクターの温度感受性変異は、これらに限定されない。

【0078】

センダイウイルスベクターは、例えば、ＳｅＶ（ＰＭ）／ＴＳΔＦ、ＳｅＶ１８＋／ＴＳΔＦ、又はＳｅＶ（ＨＮＬ）／ＴＳΔＦであって、上記のＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を導入したセンダイウイルスベクターである。ただし、センダイウイルスベクターの温度感受性変異は、これらに限定されない。

【0079】

細胞に導入されるセンダイウイルスベクターは、温度感受性センダイウイルスベクターと温度非感受性センダイウイルスベクターとの組み合わせであってもよい。あるいは、細胞に導入されるセンダイウイルスベクターは、温度感受性センダイウイルスベクターのみであり、温度非感受性センダイウイルスベクターを含まなくともよい。例えば、細胞に導入されるセンダイウイルスベクターは、ＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を導入した温度感受性センダイウイルスベクターのみであり、温度非感受性センダイウイルスベクターを含まなくともよい。例えば、細胞に導入されるセンダイウイルスベクターは、ＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を導入した温度感受性センダイウイルスベクターと同じ以上の温度感受性を有するセンダイウイルスベクターのみであり、温度非感受性センダイウイルスベクターを含まなくともよい。例えば、細胞に導入されるセンダイウイルスベクターは、ＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を導入した温度感受性センダイウイルスベクターと同じ以上の温度感受性を有するセンダイウイルスベクターのみであり、ＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を導入した温度感受性センダイウイルスベクターより温度感受性が低いセンダイウイルスベクターを含まなくともよい。

【0080】

細胞に導入されるセンダイウイルスベクターは、任意のリプログラミング因子を搭載する。細胞に導入されるセンダイウイルスベクターは、例えば、ＫＬＦのＲＮＡ、ＯＣＴのＲＮＡ、及びＳＯＸのＲＮＡをこの順序で含み、ＭＹＣのＲＮＡを含まない温度感受性センダイウイルスベクターと、ＭＹＣのＲＮＡを含み、ＫＬＦのＲＮＡ、ＯＣＴのＲＮＡ、及びＳＯＸのＲＮＡを含まない温度感受性センダイウイルスベクターと、の組み合わせである。ただし、センダイウイルスベクターに搭載するリプログラム因子の数、組み合わせ、及び順序は任意であり、特に限定されない。

【0081】

細胞に導入されるセンダイウイルスベクターは、ＫＬＦのＲＮＡを含み、ＯＣＴのＲＮＡ及びＳＯＸのＲＮＡを含まないセンダイウイルスベクターを含んでいてもよい。ＫＬＦのＲＮＡを含み、ＯＣＴのＲＮＡ及びＳＯＸのＲＮＡを含まないセンダイウイルスベクターは、温度感受性センダイウイルスベクターであってもよいし、温度非感受性センダイウイルスベクターであってもよい。

【0082】

ＫＬＦのＲＮＡ、ＯＣＴのＲＮＡ、及びＳＯＸのＲＮＡを含む温度感受性センダイウイルスベクターは、例えば、Ｍタンパク質にＧ６９Ｅ、Ｔ１１６Ａ、及びＡ１８３Ｓの変異を有し、ＨＮタンパク質にＡ２６２Ｔ、Ｇ２６４Ｒ、及びＫ４６１Ｇの変異を有し、Ｐタンパク質にＬ５１１Ｆ変異を有し、Ｌタンパク質にＮ１１９７Ｓ及びＫ１７９５Ｅ変異を有するＦ遺伝子欠失型センダイウイルスベクターであって、上記のＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を有するセンダイウイルスベクターである。温度感受性変異は、例えばＴＳ７又はＴＳ１２、あるいはＴＳ１２である。

【0083】

ＫＬＦのＲＮＡ、ＯＣＴのＲＮＡ、及びＳＯＸのＲＮＡを含む温度感受性センダイウイルスベクターは、例えば、ＳｅＶ（ＰＭ）ＫＯＳ／ＴＳ７ΔＦ又はＳｅＶ（ＰＭ）ＫＯＳ／ＴＳ１２ΔＦであり、あるいはＳｅＶ（ＰＭ）ＫＯＳ／ＴＳ１２ΔＦである。

【0084】

ＭＹＣのＲＮＡを含む温度感受性センダイウイルスベクターは、例えば、Ｍタンパク質にＧ６９Ｅ、Ｔ１１６Ａ、及びＡ１８３Ｓの変異を有し、ＨＮタンパク質にＡ２６２Ｔ、Ｇ２６４Ｒ、及びＫ４６１Ｇの変異を有し、Ｐタンパク質にＬ５１１Ｆ変異を有し、Ｌタンパク質にＮ１１９７Ｓ及びＫ１７９５Ｅ変異を有するＦ遺伝子欠失型センダイウイルスべクターであって、上記のＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を有するセンダイウイルスベクターである。温度感受性変異は、例えばＴＳ１５である。

【0085】

ＭＹＣのＲＮＡを含む温度感受性センダイウイルスベクターは、例えば、ＳｅＶ（ＨＮＬ）ＭＹＣ／ＴＳ１２ΔＦ、ＳｅＶ（ＨＮＬ）ＭＹＣ／ＴＳ１３ΔＦ、又はＳｅＶ（ＨＮＬ）ＭＹＣ／ＴＳ１５ΔＦであり、あるいはＳｅＶ（ＨＮＬ）ＭＹＣ／ＴＳ１５ΔＦである。

【0086】

ＫＬＦのＲＮＡを含み、ＯＣＴのＲＮＡ及びＳＯＸのＲＮＡを含まないセンダイウイルスベクターは、例えば、Ｍタンパク質にＧ６９Ｅ、Ｔ１１６Ａ、及びＡ１８３Ｓの変異を有し、ＨＮタンパク質にＡ２６２Ｔ、Ｇ２６４Ｒ、及びＫ４６１Ｇの変異を有し、Ｐタンパク質にＬ５１１Ｆ変異を有し、Ｌタンパク質にＮ１１９７Ｓ及びＫ１７９５Ｅ変異を有するＦ遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである。ＫＬＦのＲＮＡを含み、ＯＣＴのＲＮＡ及びＳＯＸのＲＮＡを含まないセンダイウイルスベクターは、例えば、上記のＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を導入したセンダイウイルスベクターより温度感受性が弱く、所定の温度以上でもＫＬＦ遺伝子を発現可能である。

【0087】

ＫＬＦのＲＮＡを含み、ＯＣＴのＲＮＡ及びＳＯＸのＲＮＡを含まないセンダイウイルスベクターは、例えば、ＳｅＶ１８＋ＫＬＦ４／ＴＳΔＦである。

【0088】

複数種類のセンダイウイルスベクターを細胞に導入する際には、例えば、複数種類のセンダイウイルスベクターを同時に細胞に導入する。あるいは、ある種類のセンダイウイルスベクターを細胞に導入してから、４８時間以内に、全ての種類のセンダイウイルスベクターを細胞に導入することが好ましい。

【0089】

細胞を感染させる際のセンダイウイルスベクターの感染多重度（ＭＯＩ）は、例えば、０．１以上である。また、ＭＯＩは、例えば、１００以下である。

【0090】

細胞をセンダイウイルスベクターに感染させる際の温度は、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸の安定性が低下する所定の温度未満、つまり、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸が安定である温度であってもよいし、所定の温度以上であってもよい。センダイウイルスベクターが温度感受性センダイウイルスベクターのみであり、温度非感受性センダイウイルスベクターを含まない場合、細胞をセンダイウイルスベクターに感染させる際の温度は、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸の安定性が低下する所定の温度より低い温度、つまり、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸が安定である温度であることが好ましい。

【0091】

リプログラミング因子を導入される細胞は、接着培養されていてもよいし、浮遊培養されていてもよい。

【0092】

リプログラミング因子を導入される体細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１（ｉＭａｔｒｉｘ－５１１、ｎｉｐｐｉ）、ファイブロネクチン、及びビトロネクチン等の基底膜マトリックスを用いて、フィーダーフリーで培養されていてもよい。

【0093】

リプログラミング因子を導入される細胞が培養される培地としては、例えば、Ｐｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ(ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ)、Ｓｔｅｍｆｉｔ ＡＫ０２Ｎ、Ｓｔｅｍｆｉｔ ＡＫ０３（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）、及びＴｅＳＲ－Ｅ８（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等のヒトＥＳ／ｉＰＳ培地等の幹細胞培地を使用可能である。幹細胞培地は、例えば、ディッシュ、ウェル、又はチューブ等の培養器に入れられる。

【0094】

細胞をセンダイウイルスベクターに感染させた後、少なくとも２日、あるいは２日以上１０日以下、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸の安定性が低下する所定の温度より低い温度、つまり、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸が安定である温度で細胞を培養してもよい。その後、所定の温度以上で細胞を培養してもよい。所定の温度以上で細胞を培養する間、例えば２日に１回、培地を交換してもよい。

【0095】

細胞をセンダイウイルスベクターに感染させた後、少なくとも２日、あるいは２日以上１０日以下、例えば、４．０℃以上であり、３７．０℃未満の温度で細胞を培養してもよい。その後、温度を上昇させ、３６．５℃以上であり、４０．０℃以下の温度で細胞を培養してもよい。温度は１回で上げてもよいし、段階的に上げてもよい。温度を上昇させた後、細胞を培養する間、例えば２日に１回、培地を交換してもよい。

【0096】

細胞をセンダイウイルスベクターに感染させた後、幹細胞様のコロニーが現れ始めるまで、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸の安定性が低下する所定の温度未満、つまり、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸が安定である温度で細胞を培養してもよい。幹細胞様のコロニーが現れ始めた後、所定の温度以上で細胞を培養してもよい。所定の温度以上で細胞を培養する間、例えば２日に１回、培地を交換してもよい。

【0097】

細胞をセンダイウイルスベクターに感染させた後、幹細胞様のコロニーが現れ始めるまで、例えば、４．０℃以上であり、３７．０℃未満の温度で細胞を培養してもよい。幹細胞様のコロニーが現れ始めた後、温度を上昇させ、３６．５℃以上であり、４０．０℃以下の温度で細胞を培養してもよい。温度は１回で上げてもよいし、段階的に上げてもよい。温度を上昇させた後、細胞を培養する間、例えば２日に１回、培地を交換してもよい。

【0098】

細胞にリプログラミング因子を導入し、細胞を培養した後、リプログラミング因子を導入された細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種する継代を少なくとも１回実行してもよい。継代することにおいて、リプログラミング因子を導入された細胞のクローン同士を混合してもよい。継代することにおいて、リプログラミング因子を導入された細胞の異なるクローン同士を混合してもよい。その後、リプログラミング因子を導入された細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代することを、複数回実施してもよい。幹細胞が樹立するまで、リプログラミング因子を導入された細胞を回収し、回収した混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代してもよい。なお、回収した混じり合った細胞の全てを培地に播種してもよい。

【0099】

ここで、リプログラミング因子を導入された細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代するとは、例えば、リプログラミング因子を導入された細胞を、遺伝子発現状態で区別することなく継代することをいう。例えば、継代時に、リプログラミング因子を導入された細胞を、遺伝子発現状態で区別することなく、同じ培養器に播種してもよい。あるいは、リプログラミング因子を導入された細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代するとは、例えば、リプログラミング因子を導入された細胞を、リプログラミングの程度で区別することなく継代することをいう。例えば、継代時に、リプログラミング因子を導入された細胞を、リプログラミングの程度で区別することなく、同じ培養器に播種してもよい。

【0100】

あるいは、リプログラミング因子を導入された細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代するとは、例えば、リプログラミング因子を導入された細胞を、形態で区別することなく継代することをいう。例えば、継代時に、リプログラミング因子を導入された細胞を、形態で区別することなく、同じ培養器に播種してもよい。あるいは、リプログラミング因子を導入された細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代するとは、例えば、リプログラミング因子を導入された細胞を、大きさで区別することなく継代することをいう。例えば、継代時に、リプログラミング因子を導入された細胞を、大きさで区別することなく、同じ培養器に播種してもよい。

【0101】

またあるいは、リプログラミング因子を導入された細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代するとは、リプログラミング因子を導入された細胞をクローニングすることなく継代することをいう。例えば、クローニングすることなく継代する場合、リプログラミング因子を導入された細胞が形成するコロニーをピックアップしなくともよい。例えば、クローニングすることなく継代する場合、リプログラミング因子を導入された細胞が形成する複数のコロニーを互いに分離しなくともよい。例えば、継代時に、複数の異なるコロニーを形成した細胞同士を混合して、同じ培養器に播種してもよい。また、例えば、クローニングすることなく継代する場合、リプログラミング因子を導入された細胞が形成する単一のコロニーをクローニングしなくともよい。例えば、継代時に、コロニー同士を混合して、同じ培養器に播種してもよい。

【0102】

例えば、リプログラミング因子を導入された細胞が接着培養されている場合、接着培養されている細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代してもよい。例えば、継代時に、培養器から細胞を剥離し、剥離して混じり合った細胞の少なくとも一部を同じ培養器に播種してもよい。例えば、剥離液で培養器から細胞を剥がし、剥がして混じり合った細胞全体を継代してもよい。例えば、コロニーを形成していない細胞を継代してもよい。リプログラミング因子を導入された細胞が浮遊培養されている場合、浮遊培養されている細胞全体を継代してもよい。

【0103】

リプログラミング因子を導入された細胞を継代する際、細胞は低濃度で培地あるいは培養器に播種されてもよい。ここで、低濃度とは、例えば、１ｃｅｌｌ／ｃｍ^２以上であり、０．２５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下、１．２５×１０³ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下、０．２５×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下、０．２５×１０^２ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下、あるいは０．２５×１０^１ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下である。あるいは、低濃度とは、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、あるいは２個以下の細胞同士が接触可能であり、１１個以上の細胞同士が接触しない濃度である。なお、１０個以下の細胞同士が接触した細胞塊が複数あってもよい。あるいは、細胞容器底面全体が細胞で覆われた状態を１００％コンフルエントとして、低濃度とは、５％以下コンフルエント、４％以下コンフルエント、３％以下コンフルエント、２％以下コンフルエント、１％以下コンフルエント、０．５％以下コンフルエント、０．１％以下コンフルエント、０．０５％以下コンフルエント、あるいは０．０１％以下コンフルエントである。またあるいは、低濃度とは、例えば、播種された細胞においてシングルセル同士が接触しない濃度である。例えば、ウェルプレートのウェルに、シングルセルを播種してもよい。ウェルプレートは、１２ウェルプレートや９６ウェルプレートであってもよい。本発明者らの知見によれば、リプログラミング因子を導入された細胞を継代する際、低濃度で細胞を培地に播種することにより、細胞から誘導される多能性幹細胞におけるセンダイウイルスの残存を抑制することが可能である。誘導される多能性幹細胞において、センダイウイルスが残存する細胞の割合は、例えば４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、０．５％以下あるいは０％である。

【0104】

温度感受性センダイウイルスベクターを用いた場合、継代後、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸の安定性が低下する所定の温度以上で細胞を培養してよい。継代後、例えば、３６．５℃以上３８．０℃未満の温度で細胞を培養する。継代後、例えば、細胞間接着が開始するまで３６．５℃以上３８．０℃未満の温度で細胞を培養し、細胞間接着が開始した後、細胞間接着が開始するまでより高い温度、例えば、３７．５℃以上であり、４２．０℃以下の温度で細胞を培養してもよい。継代後、細胞間接着が開始する前から、３７．５℃以上であり、４２．０℃以下の温度で細胞を培養してもよい。

【0105】

リプログラミング因子を導入された細胞は、閉鎖された培養器内で培養され、継代されてもよい。閉鎖された培養器は、例えば、外部と気体、ウイルス、微生物及び不純物等の交換をしない。また、リプログラミング因子を導入された細胞を二次元培養で拡大培養してもよいし、三次元培養で拡大培養してもよい。

【0106】

リプログラミング因子を導入された細胞が多能性幹細胞に誘導され、多能性幹細胞が樹立された後、接着培養されている細胞全体を、多能性幹細胞として凍結保存してもよい。例えば、剥離液で培養器から剥がれた細胞全体を多能性幹細胞として凍結保存してもよい。また、リプログラミング因子を導入された細胞が多能性幹細胞に誘導された後、浮遊培養されている細胞全体を、多能性幹細胞として凍結保存してもよい。

【0107】

誘導された多能性幹細胞は、ＥＳ細胞に類似する扁平なコロニーを形成し、アルカリホスファターゼを発現し得る。誘導された多能性幹細胞は、未分化細胞マー力一であるＮａｎｏｇ、ＯＣＴ４、及びＳＯＸ２等を発現し得る。誘導された多能性幹細胞は、ＴＥＲＴを発現し得る。誘導された多能性幹細胞は、テ口メラーゼ活性を示し得る。

【0108】

また、細胞が多能性幹細胞に誘導されたか否かは、フローサイトメータで、未分化であることを示す細胞表面マーカーであるＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＳＳＥＡ－１、及びＳＳＥＡ５から選択される少なくとも一つの表面マーカーが陽性であるか否かを分析することにより行ってもよい。ＴＲＡ－１－６０は、ｉＰＳ／ＥＳ細胞に特異的な抗原である。ｉＰＳ細胞はＴＲＡ－１－６０陽性画分からのみできることから、ＴＲＡ－１－６０陽性細胞はｉＰＳ細胞の種と考えられる。

【0109】

細胞にオリゴデンドロサイトへの誘導因子を導入する方法は、特に限定されない。誘導因子は、例えば、エレクトロポレーション法により細胞に導入される。あるいは、誘導因子は、例えば、リポフェクション法により細胞に導入される。また、あるいは、細胞には、例えば、ウイルスベクターを用いて誘導因子を導入する。誘導因子は、インテグレーションフリーで細胞に導入されてもよい。

【0110】

オリゴデンドロサイトへの誘導因子を導入される細胞は、接着培養されていてもよいし、浮遊培養されていてもよい。

【0111】

オリゴデンドロサイトへの誘導因子を導入される体細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１（ｉＭａｔｒｉｘ－５１１、ｎｉｐｐｉ）、ファイブロネクチン、及びビトロネクチン等の基底膜マトリックスを用いて、フィーダーフリーで培養されていてもよい。

【0112】

オリゴデンドロサイトへの誘導因子を導入される細胞が培養される培地としては、例えば、Ｓｔｅｍ ｆｉｔ （味の素）、ｍＴｅＳＲ （Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等の幹細胞培地を使用可能である。

【0113】

誘導因子を導入された細胞を浮遊培養あるいは三次元培養する場合、例えば、ゲル培地が使用される。ゲル培地は、例えば、幹細胞培地にジェランガムを添加することにより調製される。

【0114】

ゲル培地は、ジェランガム、ヒアルロン酸、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、ラムナン硫酸、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の高分子化合物を含んでいてもよい。また、ゲル培地は、メチルセルロースを含んでいてもよい。メチルセルロースを含むことにより、細胞同士の凝集がより抑制される。

【0115】

あるいは、ゲル培地は、poly(glycerol monomethacrylate) (PGMA)、poly(2-hydroxypropyl methacrylate) (PHPMA）、Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)、amine terminated、carboxylic acid terminated、maleimide terminated、N-hydroxysuccinimide (NHS) ester terminated、triethoxysilane terminated、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylamide)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-butylacrylate)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid-co-octadecyl acrylate)、及びN-Isopropylacrylamideから選択される少なくとも１つの温度感受性ゲルを含んでいてもよい。

【0116】

ゲル培地は、例えば、ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）等の成長因子を含んでいてもよいし、含まなくともよい。あるいは、ゲル培地は、ｂＦＧＦ等の成長因子を、４００μｇ／Ｌ以下、４０μｇ／Ｌ以下、あるいは１０μｇ／Ｌ以下の低濃度で含んでいてもよい。

【0117】

また、ゲル培地は、ＴＧＦ－βを含んでいてもよいし、含まないか、ＴＧＦ－βを６００μｇ／Ｌ以下、３００μｇ／Ｌ以下、あるいは１００μｇ／Ｌ以下の低濃度で含んでいてもよい。

【0118】

ゲル培地は、撹拌されなくともよい。また、ゲル培地は、フィーダー細胞を含まなくともよい。

【0119】

ゲル培地は、カドヘリン、ラミニン、フィブロネクチン、及びビトロネクチンからなる群から選択される少なくとも１種の物質を含んでいてもよい。

【0120】

実施形態に係るオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法によれば、細胞に誘導因子を導入してから、例えば、３０日以内、２０日以内、１０日以内、あるいは７日以内に、細胞をオリゴデンドロサイトに誘導することが可能である。オリゴデンドロサイトの前駆細胞のような未成熟なオリゴデンドロサイト及び成熟なオリゴデンドロサイトは、Ｏ４、ＰＬＰ（Ｍｙｅｌｉｎ Ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ）１から選択される少なくとも１つを発現する。成熟したオリゴデンドロサイトは、ＭＯＧ（Ｍｙｅｌｉｎ Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）及びＰＤＧＦＲα（血小板由来増殖因子受容体α）を発現する。

【実施例】

【0121】

（実施例１、実施例２）
ラミニン５１１をコートしたディッシュを、多能性幹細胞誘導用のディッシュとした。また、ヒト末梢血単核球細胞を血液培地に懸濁し、血球計算盤を用いて単核球細胞の数を測定して、血液培地における単核球細胞数を調整した。その後、単核球細胞を、３７℃で１日間から７日間、多能性幹細胞誘導用のディッシュ上で二次元培養した。

【0122】

二次元培養されている単核球細胞に、ＳｅＶ（ＰＭ）ｈＫＯＳ／ＴＳ１２ΔＦと、ＳｅＶ（ＨＮＬ）ｈＣ－Ｍｙｃ／ＴＳ１５ΔＦと、をＭＯＩが５になるよう添加し、多能性幹細胞誘導用のディッシュを３４℃のインキュベーターに収容して、細胞を培養した。インフェクションから２日後、血液培地をｉＰＳ細胞培地に交換した。その後、ｉＰＳ細胞培地を用いて培地交換を２日に１回行った。途中から、温度を３７℃、３８℃に段階的に上げた。

【0123】

インフェクションから８日後、幹細胞様の細胞塊が生じた。インフェクションから１４日目にほぼ全ての細胞がＴＲＡ１－６０陽性細胞となり、ｉＰＳ細胞様の形態を示した。インフェクションから１４日後、ディッシュに細胞剥離剤であるトリプルセレクトを添加し、室温で１分静置してから、細胞を含む溶液を吸引し、細胞を含む溶液を３７℃で５分から１０分インキュベートした。その後、ｉＰＳ細胞培地を添加し、細胞を含むｉＰＳ細胞培地を１５ｍＬチューブに回収した。血球計算盤を用いて細胞数を測定し、細胞を含む溶液の濃度を調整し、濃度が０．２５×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²以下となるよう細胞をウェルプレートに播種して１回目の継代をした。実施例１では、１回目の継代の際、ウェルプレートから全ての細胞を剥離させ、剥離して混じり合った細胞を、区別なく次のウェルプレートに播種した。これに対し、実施例２では、１回目の継代の際、コロニーピックして、クローニングした。なお、実施例１及び実施例２ともに、継代の際、１１個以上の細胞同士が接触しないよう、細胞を播種した。

【0124】

次に、ウェルディッシュを３７℃のインキュベーターに収容して、細胞を二次元培養した。細胞が分裂し始めてから、培養温度を３８℃に上げた。その後、実施例１及び実施例２ともに、細胞が６０％から８０％コンフルエントになるごとに全ての細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代した。２回目以降の継代時も、濃度が０．２５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２以下となるよう細胞をウェルプレートに播種した。この際も、１１個以上の細胞同士が接触しなかった。

【0125】

図１に示すように、抗センダイウイルス抗体を用いて継代を１回のみ行った細胞を染色し、実施例１に係る細胞に残存するセンダイウイルスをフローサイトメーターで評価したところ、細胞内のセンダイウイルスは消滅していた。図２に示すように、ＰＣＲによっても、実施例１に係る細胞に残存するセンダイウイルスは検出されたなかった。従来のように、１１個以上の細胞同士が接着する高い濃度で細胞を播種した場合は、細胞にセンダイウイルスが残存していた。得らえたＴＲＡ１－６０陽性細胞の免疫染色写真を図３に示す。

【0126】

また、細胞内のセンダイウイルスが消滅してから５日後に形成されたコロニー数を数えた。さらに、コロニー数を播種した細胞数で割り、クローナルエフィシエンシーを算出した。３回試験した結果を図４に示す。培地にｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓを用いて１回目の継代時に全ての細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の一部を培地に播種して継代した場合、クローナルエフィシエンシーは約５％から約８％であり、ばらつきが小さかった。培地にｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓを用いて１回目の継代の際にコロニーピックしてクローニングした場合、クローナルエフィシエンシーは１％未満になるときと、約６％になるときがあり、クローナルエフィシエンシーにばらつきがあった。培地にＳｔｅｍＦｉｔを用いて１回目の継代時に全ての細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の一部を培地に播種して継代した場合、クローナルエフィシエンシーは約１０％から約１５％であり、ばらつきが小さかった。培地にＳｔｅｍＦｉｔを用いて１回目の継代の際にコロニーピックしてクローニングした場合、クローナルエフィシエンシーは１％未満になるときと、約１６％になるときがあり、クローナルエフィシエンシーにばらつきがあった。

【0127】

したがって、１回目の継代時にリプログラミング因子を導入された全ての細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代することにより、クローナルエフィシエンシーが高くなり、かつ安定することが示された。
（実施例３）
可溶化基底膜調製品（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコートされたウェルディッシュを用意し、各ウェルに１０ｎｍｏｌ／ｍＬの濃度でＲＯＣＫ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ ｆｏｒｍｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤（Ｓｅｌｌｅｃｋ）を含むフィーダーフリー培地（ｍＴｅＳＲ（登録商標）１、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を入れた。

【0128】

ヒトｉＰＳ細胞を組織・培養細胞の剥離／分離／分散溶液（Ａｃｃｕｔａｓｅ、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分散させ、ウェルディッシュに播種した。その後、ｉＰＳ細胞を、フィーダーフリー培地中で、５％二酸化炭素濃度及び２０％酸素濃度の気体条件下で、２４時間培養した。

【0129】

剥離剤を用いてｉＰＳ細胞をウェルから剥がし、シングルセルの懸濁液を調製した。次に、Ｈｕｍａｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（登録商標、ＬＯＮＺＡ）及びエピソーマルプラスミドを用いて、エレクトロポレーションにより、誘導因子として、ＯＬＩＧ２、ＳＯＸ１０、ＡＳＣＬ１、ＮＫＸ２．２をｉＰＳ細胞に導入した。その後、誘導因子を導入された細胞を、ウェルディッシュに播種し、ｍＴｅＳＲで培養した。

【0130】

細胞に誘導因子を導入して３日目に、ウェルにオリゴデンドロサイト用培地を追加した。オリゴデンドロサイト用培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎ２（１Ｘ）、Ｂ２７（１Ｘ）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１Ｘ）、ＮＥＡＡ（１Ｘ）、インシュリン（２５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）、ＰＤＧＦ－ＡＡ（１０ｎｇ／ｍｌ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、ＩＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、ＮＴ３（１ｎｇ／ｍＬ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、ビオチン（１００ｎｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）、及びｃＡＭＰ（１μｍｏｌ／Ｌ、Ｓｉｇｍａ）より調製した。さらに５日目にも、ウェルにオリゴデンドロサイト用培地を追加した。７日目に、ウェル中の培地を全て新鮮なオリゴデンドロサイト用培地に交換した。その後、ヒト線維芽細胞又はヒトグリア細胞の上に誘導因子を導入された細胞を播種し、２１日目まで誘導因子を導入された細胞を培養した。誘導因子を導入されてから７日目の細胞を、抗Ｏ４抗体を用いて染色した。また、誘導因子を導入されてから２１日目の細胞を、抗Ｏ４抗体、抗ＰＬＰ１抗体、及び抗ＭＯＧ抗体のそれぞれを用いて染色した。

【0131】

図５に示すように、誘導因子を導入されてから７日目の細胞は、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞のマーカーであるＯ４を発現していた。また、図６に示すように、誘導因子を導入されてから２１日目の細胞は、Ｏ４、ＰＬＰ１、及びＭＯＧを発現していた。なお、誘導因子を導入されるｉＰＳ細胞が、実施例１で作製したｉＰＳ細胞であっても、実施例２で作製したｉＰＳ細胞であっても、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞のマーカーの発現は確認された。

【0132】

（実施例４）
誘導因子としてＯＬＩＧ２、ＳＯＸ１０、ＡＳＣＬ１、ＮＫＸ６．１を用いた以外は、実施例３と同様に、ｉＰＳ細胞に誘導因子を導入した。図７に示すように、誘導因子を導入された細胞は、Ｏ４を発現していた。

【0133】

（実施例５）
誘導因子としてＯＬＩＧ２、ＳＯＸ１０、ＡＳＣＬ１を用いた以外は、実施例３と同様に、ｉＰＳ細胞に誘導因子を導入した。図８（ａ）に示すように、誘導因子を導入された細胞は、Ｏ４を発現していた。

【0134】

（実施例６）
誘導因子としてＯＬＩＧ２、ＳＯＸ１０を用いた以外は、実施例３と同様に、ｉＰＳ細胞に誘導因子を導入した。図８（ｂ）に示すように、誘導因子を導入された細胞は、Ｏ４を発現していた。

【0135】

（実施例７）
誘導因子としてＯＬＩＧ２、ＡＳＣＬ１を用いた以外は、実施例３と同様に、ｉＰＳ細胞に誘導因子を導入した。図８（ｃ）に示すように、誘導因子を導入された細胞は、Ｏ４を発現していた。

【0136】

（実施例８）
誘導因子としてＯＬＩＧ２を用いた以外は、実施例３と同様に、ｉＰＳ細胞に誘導因子を導入した。図８（ｄ）に示すように、誘導因子を導入された細胞は、Ｏ４を発現していた。

【0137】

（実施例９）
誘導因子としてＯＬＩＧ２、ＮＫＸ２．２を用いた以外は、実施例３と同様に、ｉＰＳ細胞に誘導因子を導入した。図８（ｅ）に示すように、誘導因子を導入された細胞は、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞のマーカーであるＯ４を発現していた。

【0138】

（実施例１０）
可溶化基底膜調製品（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコートされたウェルディッシュを用意し、各ウェルに培地を入れた。さらに、Ｆｉｃｏｌｌ（ＧＥ）で分離したヒト成人末梢血由来単核球を、ウェルディッシュに播種した。その後、単核球を、３７℃で１日間から７日間、血液培地（ＳｔｅｍＳｐａｎ、登録商標、ＳＦＥＭ ＩＩ、ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）で培養した。培地は、２０ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ３、１０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ６、１０ｎｇ／ｍＬのＧＣＳＦ、５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ３、１０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦを含んでいた。５％二酸化炭素濃度及び２０％酸素濃度の気体条件下で、ディッシュ上で培養した。

【0139】

単核球をウェルから回収し、シングルセルの懸濁液を調製した。次に、ＣＤ３４＋細胞用Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（登録商標、ＬＯＮＺＡ）及びエピソーマルプラスミドを用いて、エレクトロポレーションにより、誘導因子としてＯＬＩＧ２、ＳＯＸ１０、ＡＳＣＬ１、ＮＫＸ２．２を単核球に導入した。その後、誘導因子を導入された細胞を、ウェルディッシュに播種し、血液培地で培養した。

【0140】

細胞に誘導因子を導入して３日目に、ウェルにオリゴデンドロサイト用培地を追加した。さらに５日目にも、ウェルにオリゴデンドロサイト用培地を追加した。７日目に、ウェル中の培地を全て新鮮なオリゴデンドロサイト用培地に交換した。その後、ヒト線維芽細胞の上に誘導因子を導入された細胞を播種し、２８日目まで誘導因子を導入された細胞を培養した。誘導因子を導入されてから２８日目の細胞を、抗Ｏ４抗体、抗ＰＬＰ１抗体、及び抗ＭＯＧ抗体のそれぞれを用いて染色した。図９に示すように、誘導因子を導入されてから２８日目の細胞は、Ｏ４、ＰＬＰ１、及びＭＯＧを発現していた。

【0141】

（実施例１１）
可溶化基底膜調製品（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコートされたウェルディッシュを用意し、各ウェルに培地（１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）を入れた。さらに、ヒト新生児線維芽細胞を、ウェルディッシュに播種した。その後、線維芽細胞を、３７℃で１日間から７日間、５％二酸化炭素濃度及び２０％酸素濃度の気体条件下で、ディッシュ上で培養した。

【0142】

剥離剤を用いて線維芽細胞をウェルから剥がし、シングルセルの懸濁液を調製した。次に、Ｈｕｍａｎ Ｄｅｒｍａｌ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（登録商標、ＬＯＮＺＡ）及びエピソーマルプラスミドを用いて、エレクトロポレーションにより、誘導因子としてＯＬＩＧ２、ＳＯＸ１０、ＡＳＣＬ１、ＮＫＸ２．２を線維芽細胞に導入した。その後、誘導因子を導入された細胞を、ウェルディッシュに播種し、１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ培地で培養した。

【0143】

細胞に誘導因子を導入して３日目に、ウェルにオリゴデンドロサイト用培地を追加した。さらに５日目にも、ウェルにオリゴデンドロサイト用培地を追加した。７日目に、ウェル中の培地を全て新鮮なオリゴデンドロサイト用培地に交換した。その後、ヒト線維芽細胞の上に誘導因子を導入された細胞を播種し、２８日目まで誘導因子を導入された細胞を培養した。誘導因子を導入されてから２８日目の細胞を、抗Ｏ４抗体、抗ＰＬＰ１抗体、及び抗ＭＯＧ抗体のそれぞれを用いて染色した。図１０に示すように、誘導因子を導入されてから２８日目の細胞は、Ｏ４、ＰＬＰ１、及びＭＯＧを発現していた。

【0144】

（実施例１２）
可溶化基底膜調製品（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコートされたウェルディッシュを用意し、各ウェルに培地を入れた。さらに、ヒト成人末梢血由来Ｔ細胞を、ウェルディッシュに播種した。その後、Ｔ細胞を、３７℃で１日間から７日間、５％二酸化炭素濃度及び２０％酸素濃度の気体条件下で、ディッシュ上で拡大培養した。なお、拡大培養は、必ずしもしなくともよい。３０Ｕ／ｍＬのインターロイキン２及びヒトＴ細胞増殖刺激用ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｓ ＣＤ３／ＣＤ２８、ＢＤ）を添加した培地無血清培地（Ｘ－ＶＩＶＯ１０、Ｌｏｎｚａ）を用いた。

【0145】

Ｔ細胞をウェルから回収し、シングルセルの懸濁液を調製した。次に、Ｔｃｅｌｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎキット（登録商標、ＬＯＮＺＡ）及びエピソーマルプラスミドを用いて、エレクトロポレーションにより、誘導因子としてＯＬＩＧ２、ＳＯＸ１０、ＡＳＣＬ１、ＮＫＸ２．２をＴ細胞に導入した。その後、誘導因子を導入された細胞を、ウェルディッシュに播種し、３０Ｕ／ｍＬのインターロイキン２及びヒトＴ細胞増殖刺激用ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｓ ＣＤ３／ＣＤ２８、ＢＤ）を添加した無血清培地（Ｘ－ＶＩＶＯ１０、Ｌｏｎｚａ）で培養した。

【0146】

細胞に誘導因子を導入して３日目に、ウェルにオリゴデンドロサイト用培地を追加した。さらに５日目にも、ウェルにオリゴデンドロサイト用培地を追加した。７日目に、ウェル中の培地を全て新鮮なオリゴデンドロサイト用培地に交換した。その後、ヒト線維芽細胞の上に誘導因子を導入された細胞を播種し、２８日目まで誘導因子を導入された細胞を培養した。誘導因子を導入されてから２８日目の細胞を、抗Ｏ４抗体、抗ＰＬＰ１抗体、及び抗ＭＯＧ抗体のそれぞれを用いて染色した。図１１に示すように、誘導因子を導入されてから２８日目の細胞は、Ｏ４、ＰＬＰ１、及びＭＯＧを発現していた。

【0147】

（実施例１３）
誘導因子にｐ５３ＤＤを加えた以外は、実施例３と同様に、ヒトｉＰＳ細胞からオリゴデンドロサイトを誘導した。結果を図１２に示す。ｐ５３ＤＤを加えると、Ｏ４陽性を示す細胞の割合が上昇した。

【0148】

（実施例１４）
誘導因子にＲＢ遺伝子のｓｈＲＮＡを加えた以外は、実施例３と同様に、ヒトｉＰＳ細胞からオリゴデンドロサイトを誘導した。結果を図１２に示す。Ｒｂ Ｓｈを加えると、Ｏ４陽性を示す細胞の割合が上昇した。

【0149】

（実施例１５）
誘導因子にｃ－ＭＹＣを加えた以外は、実施例３と同様に、ヒトｉＰＳ細胞からオリゴデンドロサイトを誘導した。結果を図１２に示す。ｃ－ＭＹＣを加えると、Ｏ４陽性を示す細胞の割合が上昇した。

【0150】

（実施例１６）
誘導因子にｐ５３ＤＤを加えた以外は、実施例１０と同様に、ヒト成人末梢血由来単核球からオリゴデンドロサイトを誘導した。結果を図１２に示す。ｐ５３ＤＤを加えると、Ｏ４陽性を示す細胞の割合が上昇した。

【0151】

（実施例１７）
誘導因子にＲＢ Ｓｈを加えた以外は、実施例１０と同様に、ヒト成人末梢血由来単核球からオリゴデンドロサイトを誘導した。結果を図１２に示す。Ｒｂ Ｓｈを加えると、Ｏ４陽性を示す細胞の割合が上昇した。

【0152】

（実施例１８）
誘導因子にｃ－ＭＹＣを加えた以外は、実施例１０と同様に、ヒト成人末梢血由来単核球からオリゴデンドロサイトを誘導した。結果を図１２に示す。ｃ－ＭＹＣを加えると、Ｏ４陽性を示す細胞の割合が上昇した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】