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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-09
(45)【発行日】2024-08-20
(54)【発明の名称】抗体のＦｃ領域改変体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/18 20060101AFI20240813BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240813BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240813BHJP
【ＦＩ】
C07K16/18 ZNA
C07K19/00
C12N15/13
【請求項の数】
2
(21)【出願番号】P 2020560003
(86)(22)【出願日】2019-12-05
(86)【国際出願番号】 JP2019047620
(87)【国際公開番号】W WO2020116560
(87)【国際公開日】2020-06-11
【審査請求日】2022-12-02
(31)【優先権主張番号】P 2018228448
(32)【優先日】2018-12-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】518433178
【氏名又は名称】株式会社バイカ・セラピュティクス
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100151301
【弁理士】
【氏名又は名称】戸崎 富哉
(72)【発明者】
【氏名】中尾 良太
(72)【発明者】
【氏名】泉 睦勝
(72)【発明者】
【氏名】服部 有宏
【審査官】松本 淳
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１２－５２１７８４（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１３／０８１１４３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１７－５１７７４５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１８／０７３１８５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】STRIETZEL C. J. et al，In Vitro functional characterization of feline IgGs，Veterinary Immunology and Immunopathology，2014年，Vol.158，pp.214-223
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ネコＩｇＧのＦｃ領域を含む親ポリペプチドの改変体であって、酸性条件下において、ネコ新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合する活性が、親ポリペプチドのネコＦｃＲｎに結合する活性よりも高く、かつ該Ｆｃ領域にアミノ酸改変を含む改変体であり、ネコＩｇＧのＦｃ領域を含む親ポリペプチドは配列番号２のネコＩｇＧのＦｃ領域を含む親ポリペプチドであり、
該Ｆｃ領域のアミノ酸改変が、
(i)４２８位セリンのロイシンへの置換、
(ii)４３４位セリンのアラニンへの置換、
(iii)４３８位グルタミンのアルギニンへの置換、及び
(iv)４４０位セリンのグルタミン酸への置換
（ここで、Ｆｃ領域におけるアミノ酸の番号付けは、ヒト抗体のＦｃ領域を基準にしたＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）である、改変体。
【請求項2】
請求項１に記載の改変体を含む抗体又はＦｃ融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、イヌ又はネコＩｇＧのＦｃ領域改変体、特に、新生児Ｆｃ受容体との結合親和性が増強されたＦｃ領域改変体に関する。
【背景技術】
【0002】
新生児Ｆｃ受容体（neonatal Fc receptor；以下ＦｃＲｎとも称する）は、ＩｇＧのＦｃ領域に結合し、血漿中にリサイクルさせることでＩｇＧがリソソームで分解されるのを回避する。ＩｇＧは、ＦｃＲｎに結合することで長い血漿中滞留性を有する。ＩｇＧとＦｃＲｎとの結合は酸性条件下(例えば、ｐＨ６．０）においてのみ認められ、中性条件下（例えば、ｐＨ７．４）において結合はほとんど認められない。通常、ＩｇＧはエンドサイトーシスを介して非特異的に細胞に取り込まれるが、エンドソーム内の酸性条件下においてエンドソーム内のＦｃＲｎに結合することで細胞表面に戻り、血漿中の中性条件下においてＦｃＲｎから解離することでリサイクルされ、結果、他の血漿中タンパク質より長い血漿中滞留性を有する。エンドソーム内でＦｃＲｎに結合しなかったＩｇＧはライソソームに進み、そこで分解される。
ＩｇＧの血漿中滞留性を改善させる方法として、酸性条件下におけるＦｃＲｎへの結合能を向上させる方法がヒトで報告されている。ＩｇＧのＦｃ領域にアミノ酸置換を導入し、酸性条件下のＦｃＲｎへの結合能を上昇させることで、エンドソーム内から血漿中へのリサイクル効率が上昇し、その結果、血漿中滞留性が改善する（特許文献１、２、非特許文献１～３）。
また、ＩｇＧのＦｃ領域を融合させたサイトカインおよび可溶性膜受容体等（Ｆｃ融合タンパク質）がヒト用の治療用医薬品として開発されているが、これらはＩｇＧと同様にＦｃＲｎとの結合を介して長い血漿中滞留性を実現している。
上記の通り、ヒトにおいてはＩｇＧのＦｃ領域とＦｃＲｎの結合を改変・応用したバイオ医薬品が開発されており、イヌ、ネコ等ヒト以外の動物においても同じように血漿中滞留性を改善したバイオ医薬品の開発が望まれている。
しかしながら、イヌ、ネコにおける抗体の血漿中滞留性を改善し、向上させるＦｃ領域のアミノ酸改変については知られていない。
ＩｇＧの血漿中滞留性を改善させる方法として、酸性条件下におけるＦｃＲｎへの結合能を向上させる方法がヒトで報告されている。ＩｇＧのＦｃ領域にアミノ酸置換を導入し、酸性条件下のＦｃＲｎへの結合能を上昇させることで、エンドソーム内から血漿中へのリサイクル効率が上昇し、その結果、血漿中滞留性が改善する（特許文献１、２、非特許文献１～３）。
また、ＩｇＧのＦｃ領域を融合させたサイトカインおよび可溶性膜受容体等（Ｆｃ融合タンパク質）がヒト用の治療用医薬品として開発されているが、これらはＩｇＧと同様にＦｃＲｎとの結合を介して長い血漿中滞留性を実現している。
上記の通り、ヒトにおいてはＩｇＧのＦｃ領域とＦｃＲｎの結合を改変・応用したバイオ医薬品が開発されており、イヌ、ネコ等ヒト以外の動物においても同じように血漿中滞留性を改善したバイオ医薬品の開発が望まれている。
しかしながら、イヌ、ネコにおける抗体の血漿中滞留性を改善し、向上させるＦｃ領域のアミノ酸改変については知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【文献】ＷＯ２００２／０６０９１９公報
【文献】ＷＯ２０１２／０８３３７０公報
【非特許文献】
【0004】
【文献】Yeung YAら、J. Immunol. (2009) 182, 7663-71.
【文献】Datta-Mannan Aら、J. Biol. Chem. (2007) 282, 1709-17.
【文献】Dall'Acqua WFら、J. Immunol. (2002) 169, 5171-80.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、酸性条件下においてＦｃＲｎとの結合能が増強された、特に血漿中滞留性が向上したイヌ及びネコのＩｇＧのＦｃ領域の改変体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、ｐＨ酸性域の条件下でのＦｃＲｎへの結合を天然のＩｇＧのＦｃ領域と比較して有意に増強することができるＩｇＧのＦｃ領域内におけるアミノ酸改変について鋭意検討し、結果、ＦｎＲｎ結合活性を野生型に比べて高めることができるアミノ酸改変（以下、本発明のアミノ酸改変とも称する）を見出して本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下の通りである。
［１］イヌ又はネコＩｇＧのＦｃ領域を含む親ポリペプチドの改変体であって、酸性条件下において、イヌ又はネコ新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合する活性が、親ポリペプチドがイヌ又はネコＦｃＲｎに結合する活性よりも高く、かつ該Ｆｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸改変を含む改変体。
［２］親ポリペプチドが抗体を構成する上記［１］に記載の改変体。
［３］親ポリペプチドがイヌＩｇＧのＦｃ領域を含む、上記［１］又は［２］に記載の改変体。
［４］親ポリペプチドがネコＩｇＧのＦｃ領域を含む、上記［１］又は［２］に記載の改変体。
［５］Ｆｃ領域のアミノ酸改変が、
(i)２５２位ロイシンのチロシン又はスレオニンへの置換、
(ii)２５４位アラニンのスレオニンへの置換、
(iii)２５６位スレオニンのグルタミン酸への置換、
(iv)３０８位イソロイシンのプロリンへの置換、
(v)４２８位メチオニンのロイシンへの置換、
(vi)４３３位ヒスチジンのロイシンへの置換、
(vii)４３４位アスパラギンのアラニン、セリン、チロシン又はフェニルアラニンへの置換、
(viii)４３６位チロシンのスレオニンへの置換、
(ix)４３８位グルタミンのアルギニンへの置換、及び
(x)４４０位セリンのグルタミン酸への置換
からなる群より選択される少なくとも１つ（ここで、Ｆｃ領域におけるアミノ酸の番号付けは、ヒト抗体のＦｃ領域を基準にしたＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）を含む、上記［３］に記載の改変体。
［６］Ｆｃ領域のアミノ酸改変が、
(i)４３４位アスパラギンのアラニンへの置換、
(ii)４３６位チロシンのスレオニンへの置換、
(iii)４３８位グルタミンのアルギニンへの置換、及び
(iv)４４０位セリンのグルタミン酸への置換
である上記［５］に記載の改変体。
［７］Ｆｃ領域のアミノ酸改変が、
(i)４２８位メチオニンのロイシンへの置換、
(ii)４３４位アスパラギンのアラニンへの置換、
(iii)４３６位チロシンのスレオニンへの置換、
(iv)４３８位グルタミンのアルギニンへの置換、及び
(v)４４０位セリンのグルタミン酸への置換
である上記［５］に記載の改変体。
［８］Ｆｃ領域のアミノ酸改変が、
(i)４２８位メチオニンのロイシンへの置換、
(ii)４３４位アスパラギンのアラニンへの置換、
(iii)４３８位グルタミンのアルギニンへの置換、及び
(iv)４４０位セリンのグルタミン酸への置換
である上記［５］に記載の改変体。
［９］Ｆｃ領域のアミノ酸改変が、
(i)２５２位ロイシンのチロシンへの置換、
(ii)２５４位アラニンのスレオニンへの置換、及び
(iii)２５６位スレオニンのグルタミン酸への置換
である上記［５］に記載の改変体。
［１０］Ｆｃ領域のアミノ酸改変が、
(i)４２８位メチオニンのロイシンへの置換、及び
(ii)４３４位アスパラギンのセリンへの置換
である上記［５］に記載の改変体。
［１１］Ｆｃ領域のアミノ酸改変が、
(i)３０８位イソロイシンのプロリンへの置換、及び
(ii)４３４位アスパラギンのチロシンへの置換
である上記［５］に記載の変異体。
［１２］Ｆｃ領域のアミノ酸改変が、
(i)２５２位ロイシンのスレオニンへの置換、
(ii)２５４位アラニンのスレオニンへの置換、
(iii)２５６位スレオニンのグルタミン酸への置換、
(iv)４３３位ヒスチジンのロイシンへの置換、及び
(v)４３４位アスパラギンのフェニルアラニンへの置換
である上記［５］に記載の改変体。
［１３］Ｆｃ領域のアミノ酸改変が、
(i)２５２位セリンのチロシン又はスレオニンへの置換、
(ii)２５４位セリンのスレオニンへの置換、
(iii)２５６位スレオニンのグルタミン酸への置換、
(iv)２５９位バリンのイソロイシンへの置換、
(v)３０８位イソロイシンのプロリン又はフェニルアラニンへの置換、
(vi)４２８位セリンのロイシンへの置換、
(vii)４３３位ヒスチジンのロイシンへの置換、
(viii)４３４位セリンのアラニン、チロシン又はフェニルアラニンへの置換、
(ix)４３６位ヒスチジンのスレオニンへの置換、
(x)４３８位グルタミンのアルギニンへの置換、及び
(xi)４４０位セリンのグルタミン酸への置換
からなる群より選択される少なくとも１つ（ここで、Ｆｃ領域におけるアミノ酸の番号付けは、ヒト抗体のＦｃ領域を基準にしたＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）を含む、上記［４］に記載の改変体。
［１４］Ｆｃ領域のアミノ酸改変が、
(i)４３４位セリンのアラニンへの置換、
(ii)４３６位ヒスチジンのスレオニンへの置換、
(iii)４３８位グルタミンのアルギニンへの置換、及び
(iv)４４０位セリンのグルタミン酸への置換
である上記［１３］に記載の改変体。
［１５］Ｆｃ領域のアミノ酸改変が、
(i)４２８位セリンのロイシンへの置換、
(ii)４３４位セリンのアラニンへの置換、
(iii)４３６位ヒスチジンのスレオニンへの置換、
(iv)４３８位グルタミンのアルギニンへの置換、及び
(v)４４０位セリンのグルタミン酸への置換
である上記［１３］に記載の改変体。
［１６］Ｆｃ領域のアミノ酸改変が、
(i)４２８位セリンのロイシンへの置換、
(ii)４３４位セリンのアラニンへの置換、
(iii)４３８位グルタミンのアルギニンへの置換、及び
(iv)４４０位セリンのグルタミン酸への置換
である上記［１３］に記載の改変体。
［１７］Ｆｃ領域のアミノ酸改変が、
(i)２５２位セリンのチロシンへの置換、
(ii)２５４位セリンのスレオニンへの置換、及び
(iii)２５６位スレオニンのグルタミン酸への置換
である上記［１３］に記載の改変体。
［１８］Ｆｃ領域のアミノ酸改変が、
(i)３０８位イソロイシンのプロリンへの置換、及び
(ii)４３４位セリンのチロシンへの置換
である上記［１３］に記載の改変体。
［１９］Ｆｃ領域のアミノ酸改変が、
(i)２５９位バリンのイソロイシンへの置換、
(ii)３０８位イソロイシンのフェニルアラニンへの置換、及び
(iii)４２８位セリンのロイシンへの置換
である上記［１３］に記載の改変体。
［２０］Ｆｃ領域のアミノ酸改変が、
(i)２５２位セリンのスレオニンへの置換、
(ii)２５４位セリンのスレオニンへの置換、
(iii)２５６位スレオニンのグルタミン酸への置換、
(iv)４３３位ヒスチジンのロイシンへの置換、及び
(v)４３４位セリンのフェニルアラニンへの置換
である上記［１３］に記載の改変体。
［２１］上記［１］～［２０］のいずれかに記載の改変体を含む抗体又はＦｃ融合タンパク質。
即ち、本発明は以下の通りである。
［１］イヌ又はネコＩｇＧのＦｃ領域を含む親ポリペプチドの改変体であって、酸性条件下において、イヌ又はネコ新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合する活性が、親ポリペプチドがイヌ又はネコＦｃＲｎに結合する活性よりも高く、かつ該Ｆｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸改変を含む改変体。
［２］親ポリペプチドが抗体を構成する上記［１］に記載の改変体。
［３］親ポリペプチドがイヌＩｇＧのＦｃ領域を含む、上記［１］又は［２］に記載の改変体。
［４］親ポリペプチドがネコＩｇＧのＦｃ領域を含む、上記［１］又は［２］に記載の改変体。
［５］Ｆｃ領域のアミノ酸改変が、
(i)２５２位ロイシンのチロシン又はスレオニンへの置換、
(ii)２５４位アラニンのスレオニンへの置換、
(iii)２５６位スレオニンのグルタミン酸への置換、
(iv)３０８位イソロイシンのプロリンへの置換、
(v)４２８位メチオニンのロイシンへの置換、
(vi)４３３位ヒスチジンのロイシンへの置換、
(vii)４３４位アスパラギンのアラニン、セリン、チロシン又はフェニルアラニンへの置換、
(viii)４３６位チロシンのスレオニンへの置換、
(ix)４３８位グルタミンのアルギニンへの置換、及び
(x)４４０位セリンのグルタミン酸への置換
からなる群より選択される少なくとも１つ（ここで、Ｆｃ領域におけるアミノ酸の番号付けは、ヒト抗体のＦｃ領域を基準にしたＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）を含む、上記［３］に記載の改変体。
［６］Ｆｃ領域のアミノ酸改変が、
(i)４３４位アスパラギンのアラニンへの置換、
(ii)４３６位チロシンのスレオニンへの置換、
(iii)４３８位グルタミンのアルギニンへの置換、及び
(iv)４４０位セリンのグルタミン酸への置換
である上記［５］に記載の改変体。
［７］Ｆｃ領域のアミノ酸改変が、
(i)４２８位メチオニンのロイシンへの置換、
(ii)４３４位アスパラギンのアラニンへの置換、
(iii)４３６位チロシンのスレオニンへの置換、
(iv)４３８位グルタミンのアルギニンへの置換、及び
(v)４４０位セリンのグルタミン酸への置換
である上記［５］に記載の改変体。
［８］Ｆｃ領域のアミノ酸改変が、
(i)４２８位メチオニンのロイシンへの置換、
(ii)４３４位アスパラギンのアラニンへの置換、
(iii)４３８位グルタミンのアルギニンへの置換、及び
(iv)４４０位セリンのグルタミン酸への置換
である上記［５］に記載の改変体。
［９］Ｆｃ領域のアミノ酸改変が、
(i)２５２位ロイシンのチロシンへの置換、
(ii)２５４位アラニンのスレオニンへの置換、及び
(iii)２５６位スレオニンのグルタミン酸への置換
である上記［５］に記載の改変体。
［１０］Ｆｃ領域のアミノ酸改変が、
(i)４２８位メチオニンのロイシンへの置換、及び
(ii)４３４位アスパラギンのセリンへの置換
である上記［５］に記載の改変体。
［１１］Ｆｃ領域のアミノ酸改変が、
(i)３０８位イソロイシンのプロリンへの置換、及び
(ii)４３４位アスパラギンのチロシンへの置換
である上記［５］に記載の変異体。
［１２］Ｆｃ領域のアミノ酸改変が、
(i)２５２位ロイシンのスレオニンへの置換、
(ii)２５４位アラニンのスレオニンへの置換、
(iii)２５６位スレオニンのグルタミン酸への置換、
(iv)４３３位ヒスチジンのロイシンへの置換、及び
(v)４３４位アスパラギンのフェニルアラニンへの置換
である上記［５］に記載の改変体。
［１３］Ｆｃ領域のアミノ酸改変が、
(i)２５２位セリンのチロシン又はスレオニンへの置換、
(ii)２５４位セリンのスレオニンへの置換、
(iii)２５６位スレオニンのグルタミン酸への置換、
(iv)２５９位バリンのイソロイシンへの置換、
(v)３０８位イソロイシンのプロリン又はフェニルアラニンへの置換、
(vi)４２８位セリンのロイシンへの置換、
(vii)４３３位ヒスチジンのロイシンへの置換、
(viii)４３４位セリンのアラニン、チロシン又はフェニルアラニンへの置換、
(ix)４３６位ヒスチジンのスレオニンへの置換、
(x)４３８位グルタミンのアルギニンへの置換、及び
(xi)４４０位セリンのグルタミン酸への置換
からなる群より選択される少なくとも１つ（ここで、Ｆｃ領域におけるアミノ酸の番号付けは、ヒト抗体のＦｃ領域を基準にしたＫａｂａｔのＥＵインデックスによる）を含む、上記［４］に記載の改変体。
［１４］Ｆｃ領域のアミノ酸改変が、
(i)４３４位セリンのアラニンへの置換、
(ii)４３６位ヒスチジンのスレオニンへの置換、
(iii)４３８位グルタミンのアルギニンへの置換、及び
(iv)４４０位セリンのグルタミン酸への置換
である上記［１３］に記載の改変体。
［１５］Ｆｃ領域のアミノ酸改変が、
(i)４２８位セリンのロイシンへの置換、
(ii)４３４位セリンのアラニンへの置換、
(iii)４３６位ヒスチジンのスレオニンへの置換、
(iv)４３８位グルタミンのアルギニンへの置換、及び
(v)４４０位セリンのグルタミン酸への置換
である上記［１３］に記載の改変体。
［１６］Ｆｃ領域のアミノ酸改変が、
(i)４２８位セリンのロイシンへの置換、
(ii)４３４位セリンのアラニンへの置換、
(iii)４３８位グルタミンのアルギニンへの置換、及び
(iv)４４０位セリンのグルタミン酸への置換
である上記［１３］に記載の改変体。
［１７］Ｆｃ領域のアミノ酸改変が、
(i)２５２位セリンのチロシンへの置換、
(ii)２５４位セリンのスレオニンへの置換、及び
(iii)２５６位スレオニンのグルタミン酸への置換
である上記［１３］に記載の改変体。
［１８］Ｆｃ領域のアミノ酸改変が、
(i)３０８位イソロイシンのプロリンへの置換、及び
(ii)４３４位セリンのチロシンへの置換
である上記［１３］に記載の改変体。
［１９］Ｆｃ領域のアミノ酸改変が、
(i)２５９位バリンのイソロイシンへの置換、
(ii)３０８位イソロイシンのフェニルアラニンへの置換、及び
(iii)４２８位セリンのロイシンへの置換
である上記［１３］に記載の改変体。
［２０］Ｆｃ領域のアミノ酸改変が、
(i)２５２位セリンのスレオニンへの置換、
(ii)２５４位セリンのスレオニンへの置換、
(iii)２５６位スレオニンのグルタミン酸への置換、
(iv)４３３位ヒスチジンのロイシンへの置換、及び
(v)４３４位セリンのフェニルアラニンへの置換
である上記［１３］に記載の改変体。
［２１］上記［１］～［２０］のいずれかに記載の改変体を含む抗体又はＦｃ融合タンパク質。
【発明の効果】
【0007】
本発明のＦｃ領域改変体は、酸性域条件下でのＦｃＲｎ結合活性が増強されていることから、当該改変体を用いることにより、より長い血漿中滞留性を有する抗体（ＩｇＧ）およびＦｃ融合タンパク質の提供が可能になる。
【発明を実施するための形態】
【0008】
本発明は、イヌ又はネコＩｇＧのＦｃ領域を含む親ポリペプチドの改変体であって、酸性条件下において、イヌ又はネコＦｃＲｎに結合する活性（以下、ＦｃＲｎ結合活性とも称する）が、親ペプチドのＦｃＲｎ結合活性よりも高く、かつ該Ｆｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸改変を含む改変体を提供する。以下、詳細に説明する。
【0009】
「ＦｃＲｎ」は、構造的には主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩのポリペプチドに構造的に類似し、ヒトではクラスＩのＭＨＣ分子と２２から２９％の配列同一性を有する（ヒトの参考文献：Ghetieら,Immunol. Today (1997) 18 (12), 592-598）。
ＦｃＲｎは、可溶性β鎖（または軽鎖）であるβ２－ミクログロブリン（β２ｍと記載する場合あり）と、膜貫通α鎖（または重鎖、ＦＣＧＲＴと記載する場合あり）よりなるヘテロダイマーとして発現される。ＦｃＲｎのα鎖は３つの細胞外ドメイン（α１、α２、α３）よりなり、α１およびα２ドメインが抗体のＦｃ領域におけるＦｃＲｎ結合ドメインと相互作用する（Raghavanら、Immunity (1994) 1, 303-315）。
ＦｃＲｎは生体内でβ２－ミクログロブリンとの複合体を形成する。可溶型ＦｃＲｎとβ２－ミクログロブリンとの複合体は通常の組換え発現方法（実施例の「ＦｃＲｎ発現ベクターの作製」「ＦｃＲｎタンパク質の発現と精製」の項を参照）を用いて調製し、該複合体を本発明のＦｃＲｎ結合活性の評価に用いることができる。本発明において、特に記載のない場合は、ＦｃＲｎはβ２－ミクログロブリンとの複合体として用いられる。
ＦｃＲｎは、可溶性β鎖（または軽鎖）であるβ２－ミクログロブリン（β２ｍと記載する場合あり）と、膜貫通α鎖（または重鎖、ＦＣＧＲＴと記載する場合あり）よりなるヘテロダイマーとして発現される。ＦｃＲｎのα鎖は３つの細胞外ドメイン（α１、α２、α３）よりなり、α１およびα２ドメインが抗体のＦｃ領域におけるＦｃＲｎ結合ドメインと相互作用する（Raghavanら、Immunity (1994) 1, 303-315）。
ＦｃＲｎは生体内でβ２－ミクログロブリンとの複合体を形成する。可溶型ＦｃＲｎとβ２－ミクログロブリンとの複合体は通常の組換え発現方法（実施例の「ＦｃＲｎ発現ベクターの作製」「ＦｃＲｎタンパク質の発現と精製」の項を参照）を用いて調製し、該複合体を本発明のＦｃＲｎ結合活性の評価に用いることができる。本発明において、特に記載のない場合は、ＦｃＲｎはβ２－ミクログロブリンとの複合体として用いられる。
【0010】
「親ポリペプチド」とは、本発明のアミノ酸改変が導入されたポリペプチドに対し、該改変が導入される前のポリペプチドを意味する。イヌ又はネコＩｇＧのＦｃ領域を含む親ポリペプチドとしては、イヌ又はネコの天然のＩｇＧのＦｃ領域を含むポリペプチドが挙げられ、好ましくは抗体、特にイヌ又はネコの天然のＩｇＧを構成するポリペプチドが挙げられる。親ポリペプチドのＦｃ領域にアミノ酸改変が導入されたＦｃ領域を有するポリペプチドをＦｃ領域改変体とも称し、該改変体で構成されるＩｇＧを変異型ＩｇＧとも称する。
イヌ又はネコの野生型ＩｇＧとは、天然に存在するイヌ又はネコのＩｇＧと同一のアミノ酸配列を包含し、免疫グロブリンガンマ遺伝子により実質的にコードされる抗体のクラスに属するポリペプチドを意味する。
ＩｇＧにはアイソフォームが存在し、その数は動物種によって異なる。ヒト、マウスやラットではＩｇＧ１～ＩｇＧ４の４種が知られている。イヌにおいても４つのＩｇＧ免疫グロブリンが存在し、これらはｃａＩｇＧ－Ａ、ｃａＩｇＧ－Ｂ、ｃａＩｇＧ－ＣおよびｃａＩｇＧ－Ｄと定義されている（Tang et al., Vet. Immunol. Immunopathol. 80(3-4), 259-270, 2001）。ネコでは、３種類のＩｇＧ免疫グロブリンが存在し、これらはＩｇＧ１ａ、ＩｇＧ１ｂ、ＩｇＧ２として存在が報告されている。
１）Kanai, T.H., et al., 2000. Identification of two allelic IgG1 C(H)coding regions (Cgamma1) of cat. Vet. Immunol. Immunopathol. 73(1), 53-62.
２）Strietzel,C.J., et al., 2014. In Vitro functional characterization of feline IgGs, Vet. Immunol. Immunopathol. 158 (3-4), 214-233.
イヌ又はネコの野生型ＩｇＧとは、天然に存在するイヌ又はネコのＩｇＧと同一のアミノ酸配列を包含し、免疫グロブリンガンマ遺伝子により実質的にコードされる抗体のクラスに属するポリペプチドを意味する。
ＩｇＧにはアイソフォームが存在し、その数は動物種によって異なる。ヒト、マウスやラットではＩｇＧ１～ＩｇＧ４の４種が知られている。イヌにおいても４つのＩｇＧ免疫グロブリンが存在し、これらはｃａＩｇＧ－Ａ、ｃａＩｇＧ－Ｂ、ｃａＩｇＧ－ＣおよびｃａＩｇＧ－Ｄと定義されている（Tang et al., Vet. Immunol. Immunopathol. 80(3-4), 259-270, 2001）。ネコでは、３種類のＩｇＧ免疫グロブリンが存在し、これらはＩｇＧ１ａ、ＩｇＧ１ｂ、ＩｇＧ２として存在が報告されている。
１）Kanai, T.H., et al., 2000. Identification of two allelic IgG1 C(H)coding regions (Cgamma1) of cat. Vet. Immunol. Immunopathol. 73(1), 53-62.
２）Strietzel,C.J., et al., 2014. In Vitro functional characterization of feline IgGs, Vet. Immunol. Immunopathol. 158 (3-4), 214-233.
【0011】
Ｆｃ領域におけるアミノ酸の改変の例としては、アミノ酸の置換、挿入、欠失等が含まれるが、好ましくはアミノ酸の置換である。改変されるアミノ酸の数は特に限定されず、１箇所のみのアミノ酸が改変されてもよいし、２箇所以上のアミノ酸が改変されてもよい。好ましくは２～数箇所、より好ましくは２～５箇所程度のアミノ酸が改変されている。アミノ酸の改変は、ｐＨ酸性域の条件下におけるＦｎＲｎ結合活性が改変される前よりも強くなる限り特に限定はされないが、好ましくは、以下の改変である。
【0012】
（イヌの場合）
(i)２５２位ロイシンのチロシン又はスレオニンへの置換（L252Y or L252T）、
(ii)２５４位アラニンのスレオニンへの置換（A254T）、
(iii)２５６位スレオニンのグルタミン酸への置換（T256E）、
(iv)３０８位イソロイシンのプロリンへの置換（I308P）、
(v)４２８位メチオニンのロイシンへの置換（M428L）、
(vi)４３３位ヒスチジンのロイシンへの置換（H433L）、
(vii)４３４位アスパラギンのアラニン、セリン、チロシン又はフェニルアラニンへの置換（N434A, N434S, N434Y or N434F）、
(viii)４３６位チロシンのスレオニンへの置換（Y436T）、
(ix)４３８位グルタミンのアルギニンへの置換（Q438R）、及び
(x)４４０位セリンのグルタミン酸への置換（S440E）
当該改変を少なくとも１つ、好ましくは２つ以上有する。
好ましい改変の例としては以下のDFV-1～DFV-6、DFV-8が挙げられる。
DFV-1；N434A, Y436T, Q438R, S440E
DFV-2；M428L, N434A, Y436T, Q438R, S440E
DFV-3；M428L, N434A, Q438R, S440E
DFV-4；L252Y, A254T, T256E
DFV-5；M428L, N434S
DFV-6；I308P, N434Y
DFV-8；L252T, A254T, T256E, H433L, N434F
(i)２５２位ロイシンのチロシン又はスレオニンへの置換（L252Y or L252T）、
(ii)２５４位アラニンのスレオニンへの置換（A254T）、
(iii)２５６位スレオニンのグルタミン酸への置換（T256E）、
(iv)３０８位イソロイシンのプロリンへの置換（I308P）、
(v)４２８位メチオニンのロイシンへの置換（M428L）、
(vi)４３３位ヒスチジンのロイシンへの置換（H433L）、
(vii)４３４位アスパラギンのアラニン、セリン、チロシン又はフェニルアラニンへの置換（N434A, N434S, N434Y or N434F）、
(viii)４３６位チロシンのスレオニンへの置換（Y436T）、
(ix)４３８位グルタミンのアルギニンへの置換（Q438R）、及び
(x)４４０位セリンのグルタミン酸への置換（S440E）
当該改変を少なくとも１つ、好ましくは２つ以上有する。
好ましい改変の例としては以下のDFV-1～DFV-6、DFV-8が挙げられる。
DFV-1；N434A, Y436T, Q438R, S440E
DFV-2；M428L, N434A, Y436T, Q438R, S440E
DFV-3；M428L, N434A, Q438R, S440E
DFV-4；L252Y, A254T, T256E
DFV-5；M428L, N434S
DFV-6；I308P, N434Y
DFV-8；L252T, A254T, T256E, H433L, N434F
【0013】
（ネコの場合）
(i)２５２位セリンのチロシン又はスレオニンへの置換（S252Y or S252T）、
(ii)２５４位セリンのスレオニンへの置換（S254T）、
(iii)２５６位スレオニンのグルタミン酸への置換（T256E）、
(iv)２５９位バリンのイソロイシンへの置換（V259I）、
(v)３０８位イソロイシンのプロリン又はフェニルアラニンへの置換（I308P or I308F）、
(vi)４２８位セリンのロイシンへの置換（S428L）、
(vii)４３３位ヒスチジンのロイシンへの置換（H433L）、
(viii)４３４位セリンのアラニン、チロシン又はフェニルアラニンへの置換（S434A, S434Y or S434F）、
(ix)４３６位ヒスチジンのスレオニンへの置換（H436T）、
(x)４３８位グルタミンのアルギニンへの置換（Q438R）、及び
(xi)４４０位セリンのグルタミン酸への置換（S440E）
当該改変を少なくとも１つ、好ましくは２つ以上有する。
好ましい改変の例としては以下のCFV-1～CFV-4、CFV-6～DFV-8が挙げられる。
CFV-1；S434A, H436T, Q438R, S440E
CFV-2；S428L, S434A, H436T, Q438R, S440E
CFV-3；S428L, S434A, Q438R, S440E
CFV-4；S252Y, S254T, T256E
CFV-6；I308P, S434Y
CFV-7；V259I, I308F, S428L
CFV-8；S252T, S254T, T256E, H433L, S434F
(i)２５２位セリンのチロシン又はスレオニンへの置換（S252Y or S252T）、
(ii)２５４位セリンのスレオニンへの置換（S254T）、
(iii)２５６位スレオニンのグルタミン酸への置換（T256E）、
(iv)２５９位バリンのイソロイシンへの置換（V259I）、
(v)３０８位イソロイシンのプロリン又はフェニルアラニンへの置換（I308P or I308F）、
(vi)４２８位セリンのロイシンへの置換（S428L）、
(vii)４３３位ヒスチジンのロイシンへの置換（H433L）、
(viii)４３４位セリンのアラニン、チロシン又はフェニルアラニンへの置換（S434A, S434Y or S434F）、
(ix)４３６位ヒスチジンのスレオニンへの置換（H436T）、
(x)４３８位グルタミンのアルギニンへの置換（Q438R）、及び
(xi)４４０位セリンのグルタミン酸への置換（S440E）
当該改変を少なくとも１つ、好ましくは２つ以上有する。
好ましい改変の例としては以下のCFV-1～CFV-4、CFV-6～DFV-8が挙げられる。
CFV-1；S434A, H436T, Q438R, S440E
CFV-2；S428L, S434A, H436T, Q438R, S440E
CFV-3；S428L, S434A, Q438R, S440E
CFV-4；S252Y, S254T, T256E
CFV-6；I308P, S434Y
CFV-7；V259I, I308F, S428L
CFV-8；S252T, S254T, T256E, H433L, S434F
【0014】
本明細書中、置換箇所までのアミノ酸残基数を表わす数字の左側に表示したアルファベットは置換前のアミノ酸の１文字表記を示し、右側に表示したアルファベットは置換後のアミノ酸の１文字表記を示している。置換箇所までのアミノ酸残基数は、ヒトＩｇＧのＦｃ領域のＫａｂａｔのＥＵナンバリングシステムをイヌ又はネコのＦｃ領域に対応させたものである。「EUナンバリングシステム」または「EUインデックス」とは、一般的に、抗体の重鎖定常領域の残基を参照する場合に用いられる（例えば、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）。「KabatのEUナンバリングシステム」は、ヒトIgG1 EU抗体の残基ナンバリングを意味する。本明細書において特に明記していなければ、残基番号についての言及は、KabatのＥＵナンバリングをイヌ又はネコの配列に対応させたものである。
【0015】
本発明で用いられるイヌ又はネコＩｇＧのＦｃ領域を含む親ポリペプチドは、例えばＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）活性やＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）活性を増強する為の改変、プロテアーゼ抵抗性を高める為の改変、エフェクター機能を減少させる為の改変、補体に対する結合活性を減少させる改変、抗体のヘテロジェニティーや安定性を向上させる為の改変、抗原の消失を促進させる為の改変、複数分子の抗原に繰り返し結合させるための改変、血中滞留性を高める目的で定常領域のｐＩを低下させる為の改変、他の抗原に対する結合能を持たせる為の改変等が施されていても良い。より詳細にはCurrent Pharmaceutical Biotechnology, 2016, 17, 1298-1314に記載のＦｃエンジニアリングの技術を参照することができる。なお、該文献における残基番号についての言及はＫａｂａｔのＥＵナンバリングシステムに基づく。これらの改変の種類は、例えばアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入、修飾のいずれか、またはそれらの組み合わせであってもよいが、好ましくはアミノ酸の置換である。
【0016】
なお本明細書で用いられているアミノ酸の３文字表記と１文字表記の対応は以下の通りである。
アラニン：Ala：A
アルギニン：Arg：R
アスパラギン：Asn：N
アスパラギン酸：Asp：D
システイン：Cys：C
グルタミン：Gln：Q
グルタミン酸：Glu：E
グリシン：Gly：G
ヒスチジン：His：H
イソロイシン：Ile：I
ロイシン：Leu：L
リジン：Lys：K
メチオニン：Met：M
フェニルアラニン：Phe：F
プロリン：Pro：P
セリン：Ser：S
スレオニン：Thr：T
トリプトファン：Trp：W
チロシン：Tyr：Y
バリン：Val：V
アラニン：Ala：A
アルギニン：Arg：R
アスパラギン：Asn：N
アスパラギン酸：Asp：D
システイン：Cys：C
グルタミン：Gln：Q
グルタミン酸：Glu：E
グリシン：Gly：G
ヒスチジン：His：H
イソロイシン：Ile：I
ロイシン：Leu：L
リジン：Lys：K
メチオニン：Met：M
フェニルアラニン：Phe：F
プロリン：Pro：P
セリン：Ser：S
スレオニン：Thr：T
トリプトファン：Trp：W
チロシン：Tyr：Y
バリン：Val：V
【0017】
アミノ酸配列中への、このようなアミノ酸の改変（欠失、置換、挿入、付加）は、そのアミノ酸配列をコードする塩基配列を部分的に改変することにより導入することができる。この塩基配列の部分的改変は、既知の部位特異的変異導入法（Site specific mutagenesis）（Proc Natl Acsd Sci USA., 1984 Vol. 81 5662-5666; Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual(1989) Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press）やOverlap extension PCR等の公知の方法が適宜採用され得る。また、天然のアミノ酸以外のアミノ酸に改変する方法として、複数の公知の方法も採用され得る（Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357）。例えば、終止コドンの１つであるUAGコドン（アンバーコドン）の相補的アンバーサプレッサーtRNAに、非天然アミノ酸が結合したtRNAが含まれる無細胞翻訳システム（Clover Direct（Protein Express））等が好適に用いられる。
又、下記文献で実施されたヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を改変する手法を参照することができる。
Drug Metab Dispos. 2007 Jan;35(1):86-94、
Int Immunol. 2006 Dec;18(12):1759-69、
J Biol Chem. 2001 Mar 2;276(9):6591-604、
J Biol Chem. 2007;282(3):1709-17、
J Immunol. 2002;169(9):5171-80、
J Immunol. 2009;182(12):7663-71、
Molecular Cell, Vol. 7, 867-877, April, 2001、
Nat Biotechnol. 1997 Jul;15(7):637-40、
Nat Biotechnol. 2005 Oct;23(10):1283-8、
Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Dec 5;103(49):18709-14、
EP2154157、US20070141052、WO2000/042072、WO2002/060919、WO2006/020114、WO2006/031370、WO2010/033279、WO2006/053301、WO2009/086320。
又、下記文献で実施されたヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を改変する手法を参照することができる。
Drug Metab Dispos. 2007 Jan;35(1):86-94、
Int Immunol. 2006 Dec;18(12):1759-69、
J Biol Chem. 2001 Mar 2;276(9):6591-604、
J Biol Chem. 2007;282(3):1709-17、
J Immunol. 2002;169(9):5171-80、
J Immunol. 2009;182(12):7663-71、
Molecular Cell, Vol. 7, 867-877, April, 2001、
Nat Biotechnol. 1997 Jul;15(7):637-40、
Nat Biotechnol. 2005 Oct;23(10):1283-8、
Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Dec 5;103(49):18709-14、
EP2154157、US20070141052、WO2000/042072、WO2002/060919、WO2006/020114、WO2006/031370、WO2010/033279、WO2006/053301、WO2009/086320。
【0018】
本発明において、「活性を有する」とは、その活性を測定することができる系において、測定値がその系におけるバックグラウンド値（あるいは陰性対照を測定したときの値）よりも高くなることを意味する。例えば、結合活性を有するとは、ＥＬＩＳＡやＦＡＣＳ、Ｂｉａｃｏｒｅなどの結合活性を測定することができる系において、測定値がバックグラウンド値よりも高くなることを意味する。本発明においてバックグラウンド値に対する測定値の高さは、好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上、さらに好ましくは５倍以上、特に好ましくは１０倍以上である。
例えば、本発明において、ＦｃＲｎ結合活性の値としてＫＤ（解離定数）の逆数を用いることが可能である。本発明が提供するＦｃ領域改変体のＫＤ値の測定は、例えばＢｉａｃｏｒｅ（GE Healthcare）の公知の方法を用いて行うことが可能である。Ｂｉａｃｏｒｅの場合、具体的には本発明が提供するＦｃ領域改変体あるいは該改変体を含む抗体分子をセンサーチップ上に固定化し、そこにＦｃＲｎをアナライトとして流すことでＫＤ値を測定することができる。測定を野生型ＩｇＧのＦｃ領域（野生型Ｆｃ）と変異型ＩｇＧのＦｃ領域（Ｆｃ領域改変体）およびｐＨ酸性域の条件下とｐＨ中性の条件下で行うことにより、ＫＤ（Ｆｃ領域改変体）／ＫＤ（野生型Ｆｃ）およびＫＤ（ｐＨ酸性）／ＫＤ（ｐＨ中性）の値を算出することが可能である。
ＫＤの代りにｋｄ（Dissociation rate constant：解離速度定数）を用いることも可能である。
例えば、本発明において、ＦｃＲｎ結合活性の値としてＫＤ（解離定数）の逆数を用いることが可能である。本発明が提供するＦｃ領域改変体のＫＤ値の測定は、例えばＢｉａｃｏｒｅ（GE Healthcare）の公知の方法を用いて行うことが可能である。Ｂｉａｃｏｒｅの場合、具体的には本発明が提供するＦｃ領域改変体あるいは該改変体を含む抗体分子をセンサーチップ上に固定化し、そこにＦｃＲｎをアナライトとして流すことでＫＤ値を測定することができる。測定を野生型ＩｇＧのＦｃ領域（野生型Ｆｃ）と変異型ＩｇＧのＦｃ領域（Ｆｃ領域改変体）およびｐＨ酸性域の条件下とｐＨ中性の条件下で行うことにより、ＫＤ（Ｆｃ領域改変体）／ＫＤ（野生型Ｆｃ）およびＫＤ（ｐＨ酸性）／ＫＤ（ｐＨ中性）の値を算出することが可能である。
ＫＤの代りにｋｄ（Dissociation rate constant：解離速度定数）を用いることも可能である。
【0019】
本明細書において、イヌ又はネコＦｃＲｎに結合する活性が親ポリペプチドよりも高いとは、例えば、イヌ又はネコＦｃＲｎに結合する活性が親ポリペプチドの105%以上、好ましくは110%以上、115%以上、120%以上、125%以上、特に好ましくは130%以上、135%以上、140%以上、145%以上、150%以上、155%以上、160%以上、165%以上、170%以上、175%以上、180%以上、185%以上、190%以上、195%以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、３．５倍以上、４倍以上、４．５倍以上、５倍以上、７．５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、１００倍以上であることをいう。
【0020】
ｐＨ酸性域条件においてイヌ又はネコＦｃＲｎに結合する活性が天然のイヌ又はネコＩｇＧよりも強くなるような性質を、本発明のＦｃ領域改変体に付与することができれば、そして該Ｆｃ領域改変体を用いてＩｇＧを構成することができれば、酸性条件下でのＩｇＧのＦｃＲｎへの結合を上昇させることで、エンドソーム内から血漿中へのリサイクル効率が上昇し、その結果、血漿中滞留性を改善乃至向上することができる。
【0021】
本発明において、ｐＨ酸性域の条件下におけるイヌ又はネコＦｃＲｎに対する結合活性とは、ｐＨ４．０～ｐＨ６．５でのＦｃＲｎ結合活性を意味する。好ましくはｐＨ５．０～ｐＨ６．５でのＦｃＲｎ結合活性を意味し、さらに好ましくはｐＨ５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５のいずれかでのイヌ又はネコＦｃＲｎ結合活性を意味し、特に好ましくは、生体内の早期エンドソーム内のｐＨに近いｐＨ５．８～ｐＨ６．０でのＦｃＲｎ結合活性を意味する。また、本発明において、ｐＨ中性域の条件下におけるイヌ又はネコＦｃＲｎに対する結合活性とは、ｐＨ６．７～ｐＨ１０．０でのＦｃＲｎ結合活性を意味する。好ましくは、ｐＨ７．０～ｐＨ９．０でのＦｃＲｎ結合活性を意味し、さらに好ましくはｐＨ７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０のいずれかでのＦｃＲｎ結合活性を意味し、特に好ましくは、生体内の血漿中のｐＨに近いｐＨ７．４でのＦｃＲｎ結合活性を意味する。
【0022】
ＦｃＲｎとの結合アフィニティーがｐＨ７．４では非常に低いために、そのアフィニティーを正確に測定することが難しい場合には、ｐＨ７．４の代わりにｐＨ７．０を用いることができる。測定条件に使用される温度として、ＦｃＲｎとの結合アフィニティーを、１０℃～５０℃の任意の温度で測定してもよい。好ましくは、ＦｃＲｎとの結合アフィニティーを決定するために、１５℃～４０℃の温度を使用する。特に限定されないが、２５℃という温度は好ましい態様の一つである。
【0023】
本発明において、本発明のＦｃ領域改変体をコードするポリヌクレオチドを提供することができる。ポリヌクレオチドは主にＤＮＡ、ＲＮＡ、その他核酸類似体などから構成される。本発明のＦｃ領域改変体をコードするポリヌクレオチドを、抗体を構成する他の領域をコードするポリヌクレオチドと結合させ、抗体をコードする遺伝子を構築し、適当な発現ベクターに挿入する（必要に応じて２種類の発現ベクターを用いてもよい）。あるいは、本発明のＦｃ領域改変体をコードするポリヌクレオチドを、サイトカインや可溶性膜受容体等のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと結合させてＦｃ融合タンパク質をコードする遺伝子を構築し、適当な発現ベクターに挿入する。その際、発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。その際には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。
【0024】
用いることのできるベクターとしては、挿入した遺伝子を安定に保持するものであれば種類に特に制限はなく、市販の種々のベクターを利用することができる。遺伝子クローニング用のベクターとしては例えばM13系ベクター、pUC系ベクターなどが挙げられる。本発明が提供するＦｃ領域改変体を生産する目的においてベクターを用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内でポリペプチドを発現するベクターであれば特に制限されない。例えば、試験管内発現用のベクターとしては例えばpBESTベクター（プロメガ社製）などが、大腸菌発現用のベクターとしては例えばpGEX、pET、pBluescriptベクター(Stratagene社製）などが、培養細胞発現用のベクターとしては例えばpME18S-FL3ベクター（GenBank Accession No. AB009864）などが、動物細胞発現用のベクターとしてはpcDNA、生物個体内発現用のベクターとしては例えばpME18Sベクター（Mol Cell Biol. 8:466-472(1988)）などが挙げられる。ベクターへの本発明のポリヌクレオチドの挿入は、例えば、In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit(クロンテック社製)を用いて行うことができる。
【0025】
用いることのできる宿主細胞は特に制限されず、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを好適に用いることができる。宿主細胞は、例えば、本発明のＦｃ領域改変体及びそれを含む抗体あるいはＦｃ融合タンパク質の製造や発現のための産生系として使用することができる。産生系には、インビトロおよびインビボの産生系が含まれる。インビトロの産生系としては、真核細胞を使用する産生系及び原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
【0026】
宿主細胞として使用できる真核細胞として、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞が挙げられる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、CHO（J. Exp. Med. (1995) 108:94.0）、COS、HEK293、3T3、ミエローマ、BHK（baby hamster kidney）、HeLa、Vero等、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Valle et al., Nature (1981) 291: 338-340）、及び昆虫細胞、例えば、Sf9、Sf21、Tn5が例示される。好ましくはCHO-DG44、CHO-DX11B、COS7、HEK293、BHKが用いられる。大量発現を目的とする場合には特にCHOが好ましい。宿主細胞へのベクターの導入には、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオニックリボソームDOTAP（Boehringer Mannheim製）を用いた方法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法など当業者に公知の手法を用いることができる。また、Free Style 293 Expression System（Invitrogen社製）を用いて、遺伝子導入からポリペプチドの発現までを行うこともできる。
【0027】
得られたＦｃ領域改変体又はそれを含む抗体あるいはＦｃ融合タンパク質は、宿主細胞内または細胞外（培地、乳汁など）から単離し、実質的に純粋で均一分子として精製することができる。Ｆｃ領域改変体又はそれを含む抗体あるいはＦｃ融合タンパク質の分離、精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、カラムクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせて分離、精製することができる。
【0028】
必要に応じて、本発明のＦｃ領域改変体又はそれを含む抗体あるいはＦｃ融合タンパク質に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えることや、部分的にペプチドを除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。
【0029】
本発明のＦｃ領域改変体を含む抗体、あるいはＦｃ融合タンパク質は、酸性条件下でのＦｃＲｎ結合活性が増強されており、血漿中滞留性が長い。従って本発明は、該抗体を有効成分として含むイヌ又はネコを対象とした医薬組成物を提供する。医薬組成物は疾患を治療するために使用することができるが、本発明が提供する医薬組成物は、該抗体の抗原が原因の１つと考えられる疾患を治療するために使用することができる。本明細書において「治療」とは、薬理学的なおよび／または生理学的な効果を得ることを意味する。効果とは、疾患の症状を完全にあるいは部分的に妨げる点で予防的であることができ、疾患の症状を完全にあるいは部分的に治療する点で治療的であることもできる。本明細書における「治療」とは、イヌ又はネコ、もしくはそれらに近縁の動物種における疾患の治療すべてを含む。
【0030】
本発明が提供する医薬組成物は、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である（例えば、Remington's Pharmaceutical Science，latest edition，Mark Publishing Company，Easton，USA）。通常、当分野で慣用であり、治療、診断または予防目的のために対象への投与に対して適当である薬学的に許容される添加成分を含む。例えば、固体として製剤化される場合には、例えばラクトース等の充填剤、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン等の結合剤、着色剤、コーティング剤等を用いることができ、このような剤は経口投与に好適である。また、担体または賦形剤として例えば、白色ワセリン、セルロース誘導体、界面活性剤、ポリエチレングリコール、シリコーン、オリーブ油等を加えてクリーム、乳液、ローション等の形態として外用薬として患部に塗布して用いることもできる。また、液体として製剤化される場合には、通常行われている生理学的に許容される溶媒、および乳化剤、安定剤を含むことができる。溶媒としては水、ＰＢＳ、等張性生理食塩水等が挙げられ、乳化剤としては、ポリオキシエチレン系界面活性剤、脂肪酸系界面活性剤、シリコーン等が例示でき、安定剤としては、イヌ血清アルブミン、ゼラチン等のポリオール、またはソルビトール、トレハロースなどの糖類等が挙げられる。経口投与のための組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、持続放出製剤、含嗽液または粉末を形成することができる。
【0031】
本発明の医薬組成物の投与方法に特に限定はないが、注射投与することにより最も治療効果が期待できる。注射投与方法としては静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、胸腔内投与いずれの方法にも限定されない。
【0032】
投与量は、用いる抗体の種類（抗原の種類）や、個体の大きさ、投与方法、疾病の種類、症状などに依存して決定されるであろうが、治療効果および予防効果を示すのに十分な量を投与すればよい。
【0033】
本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【0034】
次に実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0035】
実施例１．野生型Ｆｃを有するＩｇＧ発現ベクターの作製
GenBank:AF354265.1に登録されている野生型イヌＩｇＧ Ｈ鎖のＦｃ領域（配列番号１、以降dog wild type Fc、dog wtFcと略する。）とGenBank:AB016710.1に登録されている野生型ネコＩｇＧ Ｈ鎖のＦｃ領域（配列番号２、以降cat wild type Fc、cat wtFcと略する。）はアミノ酸配列を元にジェンスクリプトジャパン株式会社に遺伝子合成を依頼した。
ＩｇＧ Ｈ鎖のＦｄからヒンジまでの領域（配列番号３、以降Fd-Hinge）およびＩｇＧ Ｌ鎖の全領域（配列番号４、以降Ｌ鎖）はＩＭＧＴ（参照先URL http://www.imgt.org/）のIMGT/mAb-DB ID:77に登録されているヒト化抗ヒトＩｇＥ抗体であるomalizumabのアミノ酸配列を元に、分泌シグナルペプチドとしてFd-HingeのＮ末端側にはMEFGLSWVFLVALFRGVQC（配列番号５）からなるアミノ酸が付与されるように、Ｌ鎖のＮ末端側にはMDMRVPAQLLGLLLLWLSGARC（配列番号６）からなるアミノ酸が付与されるようにジェンスクリプトジャパン株式会社に遺伝子合成を依頼した。
合成した分泌シグナルペプチドを含むomalizumabのFd-Hinge遺伝子はPCR法により増幅し、同じくPCR法により増幅したdog wtFc遺伝子およびcat wtFc遺伝子それぞれとFd-HingeがN末端側にwtFcがC末端側になるようにIn-Fusion HD Cloningキット(クロンテック社製)(以降 In-Fusionキット)を用いて連結し、同時に、pcDNA3.1(+)(Invitrogen)のCMVプロモーター直下に挿入後、大腸菌DH5αを形質転換しプラスミドを抽出することでH鎖発現用ベクターpcDNA3.1(+)/omalizumab Fd-dog wtFcおよびpcDNA3.1(+)/omalizumab Fd-cat wtFcを得た。
合成した分泌シグナルペプチドを含むomalizumabのＬ鎖遺伝子はPCR法により増幅しIn-Fusionキットを用いてpcDNA3.1(+)(Invitrogen)のCMVプロモーター直下に挿入後、大腸菌DH5αを形質転換しプラスミドを抽出することでＬ鎖発現用ベクターpcDNA3.1(+)/omalizumab Lchを得た。
いずれの場合もIn-Fusionキットの使用にあたっては添付説明書記載の方法に従い、In-Fusion反応後のDNA溶液で大腸菌DH5αコンピテント細胞（TOYOBO）の形質転換を行った。得られた形質転換体を100μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ液体培地にて３７℃にて一晩培養し、これよりNucleoBond Xtra Midiキット（タカラバイオ株式会社）を用いてプラスミドを抽出した。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者公知の方法で決定し、目的のアミノ酸配列のタンパク質がコードされている事を確認した。
GenBank:AF354265.1に登録されている野生型イヌＩｇＧ Ｈ鎖のＦｃ領域（配列番号１、以降dog wild type Fc、dog wtFcと略する。）とGenBank:AB016710.1に登録されている野生型ネコＩｇＧ Ｈ鎖のＦｃ領域（配列番号２、以降cat wild type Fc、cat wtFcと略する。）はアミノ酸配列を元にジェンスクリプトジャパン株式会社に遺伝子合成を依頼した。
ＩｇＧ Ｈ鎖のＦｄからヒンジまでの領域（配列番号３、以降Fd-Hinge）およびＩｇＧ Ｌ鎖の全領域（配列番号４、以降Ｌ鎖）はＩＭＧＴ（参照先URL http://www.imgt.org/）のIMGT/mAb-DB ID:77に登録されているヒト化抗ヒトＩｇＥ抗体であるomalizumabのアミノ酸配列を元に、分泌シグナルペプチドとしてFd-HingeのＮ末端側にはMEFGLSWVFLVALFRGVQC（配列番号５）からなるアミノ酸が付与されるように、Ｌ鎖のＮ末端側にはMDMRVPAQLLGLLLLWLSGARC（配列番号６）からなるアミノ酸が付与されるようにジェンスクリプトジャパン株式会社に遺伝子合成を依頼した。
合成した分泌シグナルペプチドを含むomalizumabのFd-Hinge遺伝子はPCR法により増幅し、同じくPCR法により増幅したdog wtFc遺伝子およびcat wtFc遺伝子それぞれとFd-HingeがN末端側にwtFcがC末端側になるようにIn-Fusion HD Cloningキット(クロンテック社製)(以降 In-Fusionキット)を用いて連結し、同時に、pcDNA3.1(+)(Invitrogen)のCMVプロモーター直下に挿入後、大腸菌DH5αを形質転換しプラスミドを抽出することでH鎖発現用ベクターpcDNA3.1(+)/omalizumab Fd-dog wtFcおよびpcDNA3.1(+)/omalizumab Fd-cat wtFcを得た。
合成した分泌シグナルペプチドを含むomalizumabのＬ鎖遺伝子はPCR法により増幅しIn-Fusionキットを用いてpcDNA3.1(+)(Invitrogen)のCMVプロモーター直下に挿入後、大腸菌DH5αを形質転換しプラスミドを抽出することでＬ鎖発現用ベクターpcDNA3.1(+)/omalizumab Lchを得た。
いずれの場合もIn-Fusionキットの使用にあたっては添付説明書記載の方法に従い、In-Fusion反応後のDNA溶液で大腸菌DH5αコンピテント細胞（TOYOBO）の形質転換を行った。得られた形質転換体を100μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ液体培地にて３７℃にて一晩培養し、これよりNucleoBond Xtra Midiキット（タカラバイオ株式会社）を用いてプラスミドを抽出した。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者公知の方法で決定し、目的のアミノ酸配列のタンパク質がコードされている事を確認した。
【0036】
omalizumab Fd-Hinge領域のアミノ酸配列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGYSITSGYSWNWIRQAPGKGLEWVASITYDGSTNYNPSVKGRITISRDDSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSHYFGHWHFAVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP（配列番号３）
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGYSITSGYSWNWIRQAPGKGLEWVASITYDGSTNYNPSVKGRITISRDDSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSHYFGHWHFAVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP（配列番号３）
【0037】
野生型イヌＩｇＧ Ｈ鎖Ｆｃ領域のアミノ酸配列
APEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK（配列番号１）
APEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK（配列番号１）
【0038】
野生型ネコＩｇＧ Ｈ鎖Ｆｃ領域のアミノ酸配列
PPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKAKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIKSFHPPDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFVYSKLSVDRSHWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPGK（配列番号２）
PPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDDSDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFNSTYRVVSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSKSLPSPIERTISKAKGQPHEPQVYVLPPAQEELSRNKVSVTCLIKSFHPPDIAVEWEITGQPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFVYSKLSVDRSHWQRGNTYTCSVSHEALHSHHTQKSLTQSPGK（配列番号２）
【0039】
omalizumab Ｌ鎖のアミノ酸配列
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSHEDPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号４）
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSHEDPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号４）
【0040】
実施例２．改変型Ｆｃを有するＩｇＧ Ｈ鎖発現ベクターの作製
Ｆｃ領域のアミノ酸配列が下記表１「イヌ、ネコＦｃ改変の位置」に示されるアミノ酸に置換されるように変異アミノ酸をコードするプライマーを設計した。実施例１で作製したＨ鎖発現用ベクターpcDNA3.1(+)/omalizumab Fd-dog wtFcおよびpcDNA3.1(+)/omalizumab Fd-cat wtFcを鋳型とし、設計したプライマーを用いたPCR法にてＦｃ領域に変異が導入されたDNA断片を増幅し、In-Fusionキットを用いて増幅したDNA断片を連結することで、鋳型となったFcの任意の箇所のみに変異が導入されたＨ鎖発現ベクターを作製した。
いずれの場合もIn-Fusionキットの使用にあたっては添付説明書記載の方法に従い、In-Fusion反応後のDNA溶液で大腸菌DH5αコンピテント細胞（TOYOBO）の形質転換を行った。得られた形質転換体を100μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ液体培地にて３７℃にて一晩培養し、これよりNucleoBond Xtra Midiキット（タカラバイオ株式会社）を用いてプラスミドを抽出した。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者公知の方法で決定し、目的のアミノ酸配列のタンパク質がコードされている事を確認した。
下記表１「イヌ、ネコＦｃ改変の位置」に示されるアミノ酸置換をdog-wtFcおよびcat-wtFcのＦｃ領域に導入して種々のＦｃ領域改変体を作製した。
Ｆｃ領域のアミノ酸配列が下記表１「イヌ、ネコＦｃ改変の位置」に示されるアミノ酸に置換されるように変異アミノ酸をコードするプライマーを設計した。実施例１で作製したＨ鎖発現用ベクターpcDNA3.1(+)/omalizumab Fd-dog wtFcおよびpcDNA3.1(+)/omalizumab Fd-cat wtFcを鋳型とし、設計したプライマーを用いたPCR法にてＦｃ領域に変異が導入されたDNA断片を増幅し、In-Fusionキットを用いて増幅したDNA断片を連結することで、鋳型となったFcの任意の箇所のみに変異が導入されたＨ鎖発現ベクターを作製した。
いずれの場合もIn-Fusionキットの使用にあたっては添付説明書記載の方法に従い、In-Fusion反応後のDNA溶液で大腸菌DH5αコンピテント細胞（TOYOBO）の形質転換を行った。得られた形質転換体を100μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢ液体培地にて３７℃にて一晩培養し、これよりNucleoBond Xtra Midiキット（タカラバイオ株式会社）を用いてプラスミドを抽出した。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者公知の方法で決定し、目的のアミノ酸配列のタンパク質がコードされている事を確認した。
下記表１「イヌ、ネコＦｃ改変の位置」に示されるアミノ酸置換をdog-wtFcおよびcat-wtFcのＦｃ領域に導入して種々のＦｃ領域改変体を作製した。
【0041】
【表1】
【0042】
実施例３．抗体発現と精製
実施例１および実施例２で得られた発現ベクターをFreeStyle293細胞（Invitrogen）に、一過性に導入し、抗体の発現を行った。得られた培養上清を回収した後、0.22μmフィルターMillex(R)-GP(Merck Millipore)を通して培養上清を得た。得られた培養上清から、MabSelect SuRe（GE Healthcare）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、50mM酢酸による溶出を行い、1.5M Tris-HCl, pH7.5を加えて中和処理を行うことで抗体を精製した。得られた抗体は20mM Histidine-HCl,150mM NaCl,pH6.5の緩衝液に30kDaを分画可能な限外ろ過膜（Merck Millipore）を用いてBuffer置換を行った。精製抗体濃度は、分光光度計を用いて280nmでの吸収度を測定し、得られた値からPACEらの方法により算出された吸光係数を用いて抗体濃度を算出した（Protein Science (1995); 4, 2411-2423）。
実施例１および実施例２で得られた発現ベクターをFreeStyle293細胞（Invitrogen）に、一過性に導入し、抗体の発現を行った。得られた培養上清を回収した後、0.22μmフィルターMillex(R)-GP(Merck Millipore)を通して培養上清を得た。得られた培養上清から、MabSelect SuRe（GE Healthcare）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、50mM酢酸による溶出を行い、1.5M Tris-HCl, pH7.5を加えて中和処理を行うことで抗体を精製した。得られた抗体は20mM Histidine-HCl,150mM NaCl,pH6.5の緩衝液に30kDaを分画可能な限外ろ過膜（Merck Millipore）を用いてBuffer置換を行った。精製抗体濃度は、分光光度計を用いて280nmでの吸収度を測定し、得られた値からPACEらの方法により算出された吸光係数を用いて抗体濃度を算出した（Protein Science (1995); 4, 2411-2423）。
【0043】
実施例４．ＦｃＲｎ発現ベクターの作製
GenBank: XP_005616366.1に登録されているイヌFCGRTの細胞外領域（配列番号７、以降dog FCGRTと略する。）および、GenBank: XP_023100998.1に登録されているネコFCGRTの細胞外領域（配列番号８、以降cat FCGRTと略する。）はそれぞれＣ末端側にＨｉｓタグ（HHHHHHHH）（配列番号９）を付与したアミノ酸配列となるように、ジェンスクリプトジャパン株式会社に遺伝子合成および、合成した遺伝子のpcDNA3.1(+)(Invitrogen)へのクローニングおよびプラスミド抽出を依頼した。得られた発現ベクターはpcDNA3.1(+)/dog FCGRT、pcDNA3.1(+)/cat FCGRTとした。
GenBank: NP_001271408に登録されているイヌβ2m（配列番号１０、以降dog β2mと略する。）および、GenBank: NP_001009876に登録されているネコβ2m（配列番号１１、以降cat β2mと略する。）アミノ酸配列を元にジェンスクリプトジャパン株式会社に遺伝子合成および、合成した遺伝子のpcDNA3.1(+)(Invitrogen)へのクローニングおよびプラスミド抽出を依頼した。得られた発現ベクターはpcDNA3.1(+)/dogβ2m、pcDNA3.1(+)/catβ2mとした。
GenBank: XP_005616366.1に登録されているイヌFCGRTの細胞外領域（配列番号７、以降dog FCGRTと略する。）および、GenBank: XP_023100998.1に登録されているネコFCGRTの細胞外領域（配列番号８、以降cat FCGRTと略する。）はそれぞれＣ末端側にＨｉｓタグ（HHHHHHHH）（配列番号９）を付与したアミノ酸配列となるように、ジェンスクリプトジャパン株式会社に遺伝子合成および、合成した遺伝子のpcDNA3.1(+)(Invitrogen)へのクローニングおよびプラスミド抽出を依頼した。得られた発現ベクターはpcDNA3.1(+)/dog FCGRT、pcDNA3.1(+)/cat FCGRTとした。
GenBank: NP_001271408に登録されているイヌβ2m（配列番号１０、以降dog β2mと略する。）および、GenBank: NP_001009876に登録されているネコβ2m（配列番号１１、以降cat β2mと略する。）アミノ酸配列を元にジェンスクリプトジャパン株式会社に遺伝子合成および、合成した遺伝子のpcDNA3.1(+)(Invitrogen)へのクローニングおよびプラスミド抽出を依頼した。得られた発現ベクターはpcDNA3.1(+)/dogβ2m、pcDNA3.1(+)/catβ2mとした。
【0044】
dog FCGRT細胞外領域のアミノ酸配列
MGVPRPRSWGLGFLLFLLPTLRAADSHLSLLYHLTAVSAPPPGTPAFWASGWLGPQQYLSYNNLRAQAEPYGAWVWENQVSWYWEKETTDLRTKEGLFLEALKALGDGGPYTLQGLLGCELGPDNTSVPVAKFALNGEDFMTFDPKLGTWNGDWPETETVSKRWMQQAGAVSKERTFLLYSCPQRLLGHLERGRGNLEWKEPPSMRLKARPGSPGFSVLTCSAFSFYPPELQLRFLRNGLAAGSGEGDFGPNGDGSFHAWSSLTVKSGDEHHYRCLVQHAGLPQPLTVELESPAKSS（配列番号７）
MGVPRPRSWGLGFLLFLLPTLRAADSHLSLLYHLTAVSAPPPGTPAFWASGWLGPQQYLSYNNLRAQAEPYGAWVWENQVSWYWEKETTDLRTKEGLFLEALKALGDGGPYTLQGLLGCELGPDNTSVPVAKFALNGEDFMTFDPKLGTWNGDWPETETVSKRWMQQAGAVSKERTFLLYSCPQRLLGHLERGRGNLEWKEPPSMRLKARPGSPGFSVLTCSAFSFYPPELQLRFLRNGLAAGSGEGDFGPNGDGSFHAWSSLTVKSGDEHHYRCLVQHAGLPQPLTVELESPAKSS（配列番号７）
【0045】
cat FCGRT細胞外領域のアミノ酸配列
MGVPRPQPWGLGFLLFLLPTLRAAESHLSLLYHLTAVSSPAPGTPAFWVSGWLGPQQYLSYNNLRAQAEPCGAWVWENQVSWYWEKETTDLRNKQELFLEALKVLGEGGPYTLQGLLGCELGPDNASVPVAKFALNGEDFMDFDPKLGTWSGEWPETETISKRWMQEAGAVSKERTFLLNSCPQRLLGHLERGRGNLEWKEPPSMRLKARPGSPGFSVLTCSAFSFYPPELQLRFLRNGLAAGSGEGDFGPNGDGSFHAWSSLTVKSGDEHHYRCLVQHAGLPQPLTVELESPAKSS（配列番号８）
MGVPRPQPWGLGFLLFLLPTLRAAESHLSLLYHLTAVSSPAPGTPAFWVSGWLGPQQYLSYNNLRAQAEPCGAWVWENQVSWYWEKETTDLRNKQELFLEALKVLGEGGPYTLQGLLGCELGPDNASVPVAKFALNGEDFMDFDPKLGTWSGEWPETETISKRWMQEAGAVSKERTFLLNSCPQRLLGHLERGRGNLEWKEPPSMRLKARPGSPGFSVLTCSAFSFYPPELQLRFLRNGLAAGSGEGDFGPNGDGSFHAWSSLTVKSGDEHHYRCLVQHAGLPQPLTVELESPAKSS（配列番号８）
【0046】
dog β2mのアミノ酸配列
MAPRPALATAGFLALLLILLAACRLDAVQHPPKIQVYSRHPAENGKPNFLNCYVSGFHPPEIEIDLLKNGKEMKAEQTDLSFSKDWTFYLLVHTEFTPNEQDEFSCRVKHVTLSEPQIVKWDRDN（配列番号１０）
MAPRPALATAGFLALLLILLAACRLDAVQHPPKIQVYSRHPAENGKPNFLNCYVSGFHPPEIEIDLLKNGKEMKAEQTDLSFSKDWTFYLLVHTEFTPNEQDEFSCRVKHVTLSEPQIVKWDRDN（配列番号１０）
【0047】
cat β2mのアミノ酸配列
MARFVVLVLLGLLYLSHLDAVQHSPKVQVYSRHPAENGKPNFLNCYVSGFHPPQIDITLMKNGKKMEAEQTDLSFNRDWTFYLLVHTEFTPTVEDEYSCQVNHTTLSEPKVVKWDRDM（配列番号１１）
MARFVVLVLLGLLYLSHLDAVQHSPKVQVYSRHPAENGKPNFLNCYVSGFHPPQIDITLMKNGKKMEAEQTDLSFNRDWTFYLLVHTEFTPTVEDEYSCQVNHTTLSEPKVVKWDRDM（配列番号１１）
【0048】
実施例５．ＦｃＲｎタンパク質の発現と精製
実施例４で得られたpcDNA3.1(+)/dog FCGRTと pcDNA3.1(+)/dogβ2mの組み合わせ、およびpcDNA3.1(+)/cat FCGRTとpcDNA3.1(+)/catβ2mの組み合わせで発現ベクターをFreeStyle293細胞（Invitrogen社）に共トランスフェクションし、イヌおよびネコのFcRnタンパク質を発現させた。培養し、得られた培養上清を回収した後、0.22μmフィルターMillex(R)-GP（Merck Millipore）を通して培養上清を得た。得られた培養上清は原則として次の２ステップで精製した。第１ステップはＨｉｓタグに対するアフィニティカラムクロマトグラフィー（His Trap HP）を行い、20 mM Tris, 0.5 M NaCl, 10 mM imidazole, pH 7.4及び20 mM Tris, 0.5 M NaCl, 500 mM imidazole, pH 7.4の緩衝液を用いたイミダゾール濃度のグラジェント溶出により目的となるタンパク質を分画した。第２ステップはゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Superdex200）を使用し、D-PBS(-), pH7.0緩衝液への置換とサイズ分画を行い、目的となるタンパク質の精製を行った。精製タンパク質については、分光光度計を用いて280nmでの吸収度を測定し、得られた値からPACEらの方法により算出された吸光係数を用いて精製タンパク質の濃度を算出した(Protein Science (1995); 4, 2411-2423)。
実施例４で得られたpcDNA3.1(+)/dog FCGRTと pcDNA3.1(+)/dogβ2mの組み合わせ、およびpcDNA3.1(+)/cat FCGRTとpcDNA3.1(+)/catβ2mの組み合わせで発現ベクターをFreeStyle293細胞（Invitrogen社）に共トランスフェクションし、イヌおよびネコのFcRnタンパク質を発現させた。培養し、得られた培養上清を回収した後、0.22μmフィルターMillex(R)-GP（Merck Millipore）を通して培養上清を得た。得られた培養上清は原則として次の２ステップで精製した。第１ステップはＨｉｓタグに対するアフィニティカラムクロマトグラフィー（His Trap HP）を行い、20 mM Tris, 0.5 M NaCl, 10 mM imidazole, pH 7.4及び20 mM Tris, 0.5 M NaCl, 500 mM imidazole, pH 7.4の緩衝液を用いたイミダゾール濃度のグラジェント溶出により目的となるタンパク質を分画した。第２ステップはゲル濾過カラムクロマトグラフィー（Superdex200）を使用し、D-PBS(-), pH7.0緩衝液への置換とサイズ分画を行い、目的となるタンパク質の精製を行った。精製タンパク質については、分光光度計を用いて280nmでの吸収度を測定し、得られた値からPACEらの方法により算出された吸光係数を用いて精製タンパク質の濃度を算出した(Protein Science (1995); 4, 2411-2423)。
【0049】
試験例１：Ｂｉａｃｏｒｅによる相互作用測定（結合解析）
取得された抗体のイヌおよびネコのＦｃＲｎに対する結合能の評価
取得された抗体について、イヌおよびネコのＦｃＲｎに対する結合能があるかどうかを判断するため、BiacoreX100（GE Healthcare）を用いて評価した。血漿中条件として、ｐＨ７．４を設定した。エンドソーム内条件（酸性条件）としては、ｐＨ６．０を設定した。Sensor chip Protein L（GE Healthcare）に目的抗体をキャプチャーさせ、抗原としてイヌ、ネコＦｃＲｎを用いた。３種類のランニングバッファー(１; 50 mmol/L リン酸, 150 mmol/L NaCl, 0.05%(w/v)Tween-20, pH7.4、 ２; 50 mmol/L リン酸, 150 mmol/L NaCl, 0.05%(w/v)Tween-20, pH7.0、 ３; 50 mmol/L リン酸, 150 mmol/L NaCl, 0.05%(w/v)Tween-20, pH6.0)を用いて測定した。
取得された抗体のイヌおよびネコのＦｃＲｎに対する結合能の評価
取得された抗体について、イヌおよびネコのＦｃＲｎに対する結合能があるかどうかを判断するため、BiacoreX100（GE Healthcare）を用いて評価した。血漿中条件として、ｐＨ７．４を設定した。エンドソーム内条件（酸性条件）としては、ｐＨ６．０を設定した。Sensor chip Protein L（GE Healthcare）に目的抗体をキャプチャーさせ、抗原としてイヌ、ネコＦｃＲｎを用いた。３種類のランニングバッファー(１; 50 mmol/L リン酸, 150 mmol/L NaCl, 0.05%(w/v)Tween-20, pH7.4、 ２; 50 mmol/L リン酸, 150 mmol/L NaCl, 0.05%(w/v)Tween-20, pH7.0、 ３; 50 mmol/L リン酸, 150 mmol/L NaCl, 0.05%(w/v)Tween-20, pH6.0)を用いて測定した。
【0050】
測定の実施方法
ランニングバッファーで希釈した抗体を流速５μＬ／分で１分間インジェクトし、センサーチップにキャプチャーさせた。そのあと、ランニングバッファーで1600, 800, 400, 200, 100 nMに希釈したＦｃＲｎとランニングバッファー（参照溶液として）を流速３０ｕＬ／分で２分間インジェクトして、キャプチャーさせた抗体と相互作用させ、さらに流速３０μＬ／分で１０分間ランニングバッファーを流してＦｃＲｎの解離を観察した。最後に、10 mmol/L Glycine-HCl、pH1.7を流速３０μＬ／分で２回１分間インジェクトし、センサーチップを再生した。再生の操作により、センサーチップにキャプチャーした抗体を洗浄し、センサーチップを繰り返し用いた。
野生型ＩｇＧとＦｃＲｎとの結合アフィニティーがｐＨ７．４では非常に低いために、ＫＤ値の算出が困難であることから、アフィニティーを正確に測定することが難しい場合には、ｐＨ７．４の代わりにｐＨ７．０を用いて測定を実施した。
ランニングバッファーで希釈した抗体を流速５μＬ／分で１分間インジェクトし、センサーチップにキャプチャーさせた。そのあと、ランニングバッファーで1600, 800, 400, 200, 100 nMに希釈したＦｃＲｎとランニングバッファー（参照溶液として）を流速３０ｕＬ／分で２分間インジェクトして、キャプチャーさせた抗体と相互作用させ、さらに流速３０μＬ／分で１０分間ランニングバッファーを流してＦｃＲｎの解離を観察した。最後に、10 mmol/L Glycine-HCl、pH1.7を流速３０μＬ／分で２回１分間インジェクトし、センサーチップを再生した。再生の操作により、センサーチップにキャプチャーした抗体を洗浄し、センサーチップを繰り返し用いた。
野生型ＩｇＧとＦｃＲｎとの結合アフィニティーがｐＨ７．４では非常に低いために、ＫＤ値の算出が困難であることから、アフィニティーを正確に測定することが難しい場合には、ｐＨ７．４の代わりにｐＨ７．０を用いて測定を実施した。
【0051】
解析方法
各Ｆｃ領域改変体を含む抗体のＦｃＲｎに対する解離定数ＫＤ（mol/L）を算出するため、速度論的な解析は以下の方法に従って実施した。まず、上記のセンサーチップに目的の抗体をキャプチャーさせ、ランニングバッファーで希釈したＦｃＲｎを相互作用させ、得られたセンサーグラムに対してBiacore Evaluation Softwareにより測定結果を1:1 binding modelでglobal fittingさせることで結合速度定数ｋａ（L/mol/s）、解離速度定数ｋｄ（1/s）を算出し、その値から解離定数ＫＤ（mol/L）を算出した。
得られたセンサーグラムが箱型ですぐに平衡状態に達する場合は、ＦｃＲｎをインジェクトしている間の平衡値（＝結合量）が解離定数ＫＤ（Ｍ）を反映しており、各改変体のＦｃＲｎに対する解離定数ＫＤ（mol/L）の算出は、Ｂｉａｃｏｒｅの測定結果として得られたセンサーグラムに対してBiacore Evaluation Softwareを用いてsteady state affinity解析を行うことで算出した。
1:1 binding modelで相互作用する分子のBiacore上での挙動は以下の式１によってあらわすことができる。
Req = C x Rmax / (KD + C) +RI （式１）
上記式中の各項目の意味は下記の通り。
Req(RU):定常状態結合レベル（steady state binding levels）
Rmax(RU):アナライトの表面結合能（Affinity binding capacity of the surface）
RI(RU):試料中の容量屈折寄与（Bulk refractive index contribution in the sample）
Ｃ（Ｍ）：アナライト濃度(Analyte concentration)
ＫＤ（Ｍ）：平衡解離定数(Equilibrium dissociation constant)
結果を下記表に示す。
各Ｆｃ領域改変体を含む抗体のＦｃＲｎに対する解離定数ＫＤ（mol/L）を算出するため、速度論的な解析は以下の方法に従って実施した。まず、上記のセンサーチップに目的の抗体をキャプチャーさせ、ランニングバッファーで希釈したＦｃＲｎを相互作用させ、得られたセンサーグラムに対してBiacore Evaluation Softwareにより測定結果を1:1 binding modelでglobal fittingさせることで結合速度定数ｋａ（L/mol/s）、解離速度定数ｋｄ（1/s）を算出し、その値から解離定数ＫＤ（mol/L）を算出した。
得られたセンサーグラムが箱型ですぐに平衡状態に達する場合は、ＦｃＲｎをインジェクトしている間の平衡値（＝結合量）が解離定数ＫＤ（Ｍ）を反映しており、各改変体のＦｃＲｎに対する解離定数ＫＤ（mol/L）の算出は、Ｂｉａｃｏｒｅの測定結果として得られたセンサーグラムに対してBiacore Evaluation Softwareを用いてsteady state affinity解析を行うことで算出した。
1:1 binding modelで相互作用する分子のBiacore上での挙動は以下の式１によってあらわすことができる。
Req = C x Rmax / (KD + C) +RI （式１）
上記式中の各項目の意味は下記の通り。
Req(RU):定常状態結合レベル（steady state binding levels）
Rmax(RU):アナライトの表面結合能（Affinity binding capacity of the surface）
RI(RU):試料中の容量屈折寄与（Bulk refractive index contribution in the sample）
Ｃ（Ｍ）：アナライト濃度(Analyte concentration)
ＫＤ（Ｍ）：平衡解離定数(Equilibrium dissociation constant)
結果を下記表に示す。
【0052】
【表2】
【0053】
【表3】
【0054】
【表4】
【0055】
【表5】
【0056】
得られたこれらの結果は、ヒトで報告されている結果と必ずしも一致しない。特に、DFV-7のアミノ酸置換は、ヒトでは酸性条件下でのＦｃＲｎとの結合を著しく増強している（Zelevsky, J et al， Nat Technol (2010) 28, 157-159）のに対し、イヌではその効果は全く認めなかった。このことは、イヌやネコの抗体医薬の調製には、その効果を、イヌやネコのＦｃＲｎを用いて確認することの重要性を強く示している。
【産業上の利用可能性】
【0057】
本発明のＦｃ領域改変体は、酸性域条件下でのＦｃＲｎ結合活性が増強されていることから、当該改変体を用いることにより、より長い血漿中滞留性を有する抗体（ＩｇＧ）およびＦｃ融合タンパク質の提供が可能になる。
【0058】
本出願は、日本で出願された特願２０１８－２２８４４８（出願日：２０１８年１２月５日）を基礎としておりその内容は本明細書に全て包含されるものである。
【配列表】