特許 7536300 変異が導入されたキメラ受容体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-08-09

(45)【発行日】2024-08-20

(54)【発明の名称】変異が導入されたキメラ受容体

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/72 20060101AFI20240813BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240813BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240813BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240813BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240813BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20240813BHJP

【ＦＩ】

C07K14/72

C07K19/00

C12N15/62 Z

C12N15/12 ZNA

C12N5/10

C12Q1/02

【請求項の数】 12

(21)【出願番号】P 2021025010

(22)【出願日】2021-02-19

(65)【公開番号】P2022127080

(43)【公開日】2022-08-31

【審査請求日】2022-10-07

(73)【特許権者】

【識別番号】000006770

【氏名又は名称】ヤマサ醤油株式会社

(72)【発明者】

【氏名】保科 元気

【審査官】松村 真里

(56)【参考文献】

【文献】Eur. J. Biochem.，1999年，Vol.266, No.2，p.538-548

【文献】Molecular Endocrinology，2006年，Vol.21, No.2，p.512-523

【文献】ACS CHEMICAL BIOLOGY，2008年，Vol.3, No.6，p.346-351

【文献】The Journal of Biological Chemistry，1996年，Vol.271, No.49，p.31593-31601

【文献】Mol Pharmacol.，1999年，Vol.56, No.1，p.214-225

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

Ｃ０７Ｋ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号２における（３）に記載された変異のうち少なくとも１つか、もしくは（４）に記載する変異を有することを特徴とする、配列番号２のＶ２Ｒの細胞外領域の一部を配列番号１のＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体であり、（３）に記載された変異および／または（４）に記載する変異以外には変異を有さないか、もしくは１～１０アミノ酸の変異を有しており、
ＡＶＰ１００ｐｇ／ｍＬにおける前記キメラ受容体のＳ／Ｎ比に対するオキシトシン１００ｐｇ／ｍＬにおける前記キメラ受容体のＳ／Ｎ比の比率が０．２０以上であることを特徴とする、キメラ受容体；
（３）Ｖ９０Ａ，Ｍ１２２Ａ，Ｍ１２２Ｉ，Ｍ１２２Ｔ，Ｍ１２２Ｌ，Ｍ１２２Ｇ，Ｍ１２２Ｗ，Ｍ１２２Ｐ，Ｍ１２２Ｓ，Ｍ１２２Ｎ，Ｍ１２２Ｑ，Ｍ１２２Ｅ，Ｍ１２２Ｒ，Ｍ１２２Ｋ，Ｍ１２２Ｈ，Ｍ１２２Ｆ，Ｍ１２２Ｙ，Ｍ１２２Ｄ，Ｍ１２２Ｃ，Ｙ１２６Ｆ，Ｙ１２６Ｌ
（４）（２１０）ＡＬＭＶＦ（２１４）から（２１０）ＴＬＡＶＹ（２１４）への変異

【請求項2】

変異が前記（３）に記載されたアミノ酸における点変異であることを特徴とする、請求項１に記載の、Ｖ２Ｒの細胞外領域の一部をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体。

【請求項3】

以下に記載する、配列番号２における点変異のうち、少なくとも１つを有することを特徴とする、配列番号２のＶ２Ｒの細胞外領域の一部を配列番号１のＯＸＴＲの細胞外領域に置換した請求項１又は請求項２に記載のキメラ受容体；
Ｍ１２２Ａ，Ｍ１２２Ｔ，Ｍ１２２Ｌ，Ｍ１２２Ｇ，Ｍ１２２Ｓ，Ｍ１２２Ｃ

【請求項4】

Ｖ２受容体の第一細胞外領域配列がオキシトシン受容体の第一細胞外領域配列へと置換されていることを特徴とする、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載のキメラ受容体。

【請求項5】

Ｖ２受容体の第一・第二・第三細胞外領域配列がオキシトシン受容体の第一・第二・第三細胞外領域配列へとそれぞれ置換されていることを特徴とする、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のキメラ受容体。

【請求項6】

請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の、Ｖ２Ｒの細胞外領域の一部をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体をコードするポリヌクレオチド。

【請求項7】

請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の、Ｖ２Ｒの細胞外領域の一部をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体を発現する動物細胞。

【請求項8】

請求項７に記載の動物細胞を含有する、オキシトシン測定キット。

【請求項9】

前記動物細胞がｃＡＭＰバイオセンサーを発現することを特徴とする、請求項８に記載のオキシトシン測定キット。

【請求項10】

配列番号２における（３）に記載された変異のうち少なくとも１つか、もしくは（４）に記載する変異を導入し、（３）に記載された変異および／または（４）に記載する変異以外には変異を有さないか、もしくは１～１０アミノ酸の変異を有しているキメラ受容体を得ることを特徴とし、
ＡＶＰ１００ｐｇ／ｍＬにおける前記キメラ受容体のＳ／Ｎ比に対するオキシトシン１００ｐｇ／ｍＬにおける前記キメラ受容体のＳ／Ｎ比の比率が０．２０以上である変異型キメラ受容体を得ることを特徴とする、配列番号２のＶ２Ｒの細胞外領域の一部を配列番号１のＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体のオキシトシン特異性向上方法；
（３）Ｖ９０Ａ，Ｍ１２２Ａ，Ｍ１２２Ｉ，Ｍ１２２Ｔ，Ｍ１２２Ｌ，Ｍ１２２Ｇ，Ｍ１２２Ｗ，Ｍ１２２Ｐ，Ｍ１２２Ｓ，Ｍ１２２Ｎ，Ｍ１２２Ｑ，Ｍ１２２Ｅ，Ｍ１２２Ｒ，Ｍ１２２Ｋ，Ｍ１２２Ｈ，Ｍ１２２Ｆ，Ｍ１２２Ｙ，Ｍ１２２Ｄ，Ｍ１２２Ｃ，Ｙ１２６Ｆ，Ｙ１２６Ｌ
（４）（２１０）ＡＬＭＶＦ（２１４）から（２１０）ＴＬＡＶＹ（２１４）への変異

【請求項11】

配列番号２における（３）に記載された点変異のうち少なくとも１つか、もしくは（４）に記載する変異を導入し、（３）に記載された変異および／または（４）に記載する変異以外には変異を有さないか、もしくは１～１０アミノ酸の変異を有しているキメラ受容体を得ることを特徴とする、配列番号２のＶ２Ｒの細胞外領域の一部を配列番号１のＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体のオキシトシン特異性を向上させ、かつ、オキシトシン反応性を向上させる方法；
（３）Ｖ９０Ａ，Ｍ１２２Ａ，Ｍ１２２Ｉ，Ｍ１２２Ｔ，Ｍ１２２Ｌ，Ｍ１２２Ｇ，Ｍ１２２Ｗ，Ｍ１２２Ｐ，Ｍ１２２Ｓ，Ｍ１２２Ｎ，Ｍ１２２Ｑ，Ｍ１２２Ｅ，Ｍ１２２Ｒ，Ｍ１２２Ｋ，Ｍ１２２Ｈ，Ｍ１２２Ｆ，Ｍ１２２Ｙ，Ｍ１２２Ｄ，Ｍ１２２Ｃ，Ｙ１２６Ｆ，Ｙ１２６Ｌ
（４）（２１０）ＡＬＭＶＦ（２１４）から（２１０）ＴＬＡＶＹ（２１４）への変異

【請求項12】

請求項１０または請求項１１に記載の変異に加え、以下の配列番号２におけるアミノ酸に変異を導入することを特徴とする、キメラ受容体のオキシトシン特異性を向上させ、かつ、オキシトシン反応性を向上させる方法；
Ａ１６７Ｌ，Ｌ１７７Ｖ，Ａ２１６Ｉ，Ａ２８５Ｔ，Ｐ３０６Ａ

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、変異が導入された、オキシトシン（Ｏｘｙｔｏｃｉｎ）受容体とＶ２受容体のキメラ受容体に関する。

【背景技術】

【0002】

オキシトシンは、下垂体後葉から分泌される９アミノ酸からなるホルモンである。子宮筋の収縮作用による分娩の促進や出産後授乳時の射乳反射を惹起する機能があり、分娩誘発剤として臨床的に用いられている。近年では、神経伝達物質として、精神神経疾患、社会的／性的なふるまいに関与している可能性が示唆されており、精神神経疾患などのバイオマーカーとして応用が期待されている。

【0003】

アルギニンバソプレシン（ＡＶＰ : Ａｒｇｉｎｉｎｅ Ｖａｓｏｐｒｅｓｓｉｎ）は、オキシトシン同様、下垂体後葉から分泌され、腎臓における水再吸収を調節するホルモンである。９アミノ酸からなり、オキシトシンとは２アミノ酸が異なる。

【0004】

ＡＶＰの血中濃度は血中ナトリウム濃度に応じて変動することが知られているが、その濃度は非常に低くｐｇ／ｍＬレベルである。そのためＡＶＰの測定法として、感度が非常に良いＲＩＡ法（非特許文献１）が臨床的に用いられている。

【0005】

オキシトシンの血中濃度はＡＶＰのおおよそ１０倍と見積もられているが、実際には測定法や報告により１ｐｇ／ｍＬ～１０００ｐｇ／ｍＬと大きな差がある（非特許文献２、３）。これは、正確な血中オキシトシン測定系構築の難しさを反映していると考えられる。

【0006】

オキシトシン受容体（ＯＸＴＲ）は、中枢神経、子宮、乳腺等の細胞膜上に存在するオキシトシンの受容体であり、Ｇタンパク質共役受容体の一種である。下垂体後葉から分泌されるオキシトシンがＯＸＴＲに結合すると、その刺激によりＧタンパク質αｑ（Ｇαｑ）を介して細胞中のホスホリパーゼＣが活性化、ホスファチジルイノシトール４，５－ビスリン酸（ＰＩＰ２）が分解され、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）およびイノシトール１，４，５－トリスリン酸（ＩＰ３）が産生される。ＩＰ３は小胞体上のカルシウムチャネルであるＩＰ３受容体に結合して細胞質内にカルシウムを流入させる。ＤＡＧはカルシウムとともにプロテインキナーゼＣを活性化、さらに下流にシグナルを伝達する。ＯＸＴＲはオキシトシンだけでなくＡＶＰにも強い親和性を有する。

【0007】

Ｖ２受容体（Ｖ２Ｒ）は、腎集合管の細胞膜上に存在するＡＶＰ受容体であり、Ｇタンパク質共役受容体の一種である。下垂体後葉から分泌されるＡＶＰがＶ２Ｒに結合すると、その刺激により細胞中のＧタンパク質αｓ（Ｇαｓ）を介してアデニレートシクラーゼが活性化されて環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）が産生され、ｃＡＭＰシグナルによるプロテインキナーゼＡ活性化を介して、腎臓における水の再吸収が行われる。ＡＶＰの受容体として、Ｖ２Ｒのほかに、Ｖ１ａ受容体（Ｖ１ａＲ）、Ｖ１ｂ受容体（Ｖ１ｂＲ）が知られているが、それぞれ発現組織が異なる。また、Ｖ２ＲはＧαｓと、Ｖ１ａＲおよびＶ１ｂＲはＧαｑと共役することが知られている。これらの受容体はオキシトシンにも弱いながらも親和性を有する。

【0008】

Ｖ２ＲやＯＸＴＲに対する、オキシトシンやＡＶＰ結合部位は報告されているものの（非特許文献５、６）、結合部位の変異によるオキシトシン特異性向上については検討されておらず、何らの知見も存在しない。

【0009】

オキシトシンの測定法として、質量分析（特許文献１）や、抗体を用いた免疫学的測定法であるＲＩＡ法（非特許文献１、２）、酵素免疫測定法（特許文献１、非特許文献１、２、３）、免疫生物発光測定法（特許文献２）等が知られている。

【0010】

また、別の測定原理として、Ｇタンパク質共役受容体に対するリガンドや自己抗体活性を迅速に測定する方法の１つである、ｃＡＭＰバイオセンサー及びＧタンパク質共役受容体の両方が発現する哺乳動物細胞を用いてｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを測定する方法が検討されている（特許文献３）。特許文献３には、以下の工程（ａ）～（ｃ）を行うことにより、被験者試料のＴＳＨＲに対する自己抗体活性を算定することができることが記載されている。
（ａ）ｃＡＭＰバイオセンサー及びＴＳＨＲの両方が発現する動物細胞を、被験者から採取された血液試料存在下でインキュベートする工程；
（ｂ）工程（ａ）の後、前記ｃＡＭＰバイオセンサーの活性化レベルを測定する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で測定した活性化レベルと、対照における活性化レベルとを比較し、ＴＳＨＲ活性化レベルを算定する工程；

【0011】

本発明者らは、上記方法を応用して、Ｖ２Ｒの細胞外領域の一部をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体及びｃＡＭＰバイオセンサーを用いることで、受容体の活性化シグナルを良好なＳ／Ｎ比で測定できることを見出した（特許文献４）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【文献】特許第６４４５８６１号

【文献】特許第６７３４２５８号

【文献】特願２０１９－２０５９５号

【文献】特願２０２０－２１２７８５号

【非特許文献】

【0013】

【文献】田中誠仁 他, 医学と薬学, 72, 1379-1388, 2015

【文献】Szeto Angela et al, STATISTICS AND METHODS, Vol. 73, 5, 393-400, 2011

【文献】Arthur Lefevre et al, Scientific Reports, DOI:10.1038 / s41598 - 017 - 17674 - 7

【文献】Rolf Postina et al. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 271, No. 49, December 6, 31593-31601, 1996

【文献】Marek Jankowski et al. PLOS ONE, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219205 July 3, 2019

【文献】Gerald Gimpl et al. Progress in Brain Research, Vol. 170 ISSN 0079-6123, 2008

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

Ｖ２Ｒの細胞外領域の一部をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体においては、野生型のＶ２Ｒ受容体と比較して、オキシトシンに対する特異性は１００倍程度まで向上した。しかし、本発明者らの検討の中で、当該キメラ受容体のオキシトシンに対する特異性に、さらなる改善の余地があることが見いだされた。

【0015】

具体的には、Ｖ２Ｒの細胞外領域の一部をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体においては、オキシトシンを１００ｐｇ／ｍＬ含む試料と、ＡＶＰを１００ｐｇ／ｍＬ含む試料とで反応性（Ｓ／Ｎ比）を比較した場合、ＡＶＰ試料に対するＳ／Ｎ比は、オキシトシン試料に対するＳ／Ｎ比の１０倍程度であった。臨床的なオキシトシン測定に利用するためには、オキシトシンに対する特異性が高い方が、より好ましい。

【0016】

本発明は、上記の問題を解決するため、オキシトシンに対する特異性が向上したキメラ受容体を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0017】

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、Ｖ２Ｒの細胞外領域の一部をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体に、適切な変異を導入することによって、オキシトシン特異性を向上させることが可能であることを見出した。さらに、検討を進めることにより、本発明を完成させた。

【0018】

すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］（１）に記載されたアミノ酸のうち少なくとも１つか、もしくは（２）に記載する領域に、変異を有することを特徴とする、Ｖ２Ｒの細胞外領域の一部をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体。
（１）Ｖ９０，Ｍ１２２，Ｙ１２６，Ａ２９５
（２）（２１０）ＡＬＭＶＦ（２１４）
［２］変異が前記（１）に記載されたアミノ酸における点変異であることを特徴とする、［１］に記載の、Ｖ２Ｒの細胞外領域の一部をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体。
［３］（３）に記載された点変異のうち少なくとも１つか、もしくは（４）に記載する変異を有することを特徴とする、［１］又は［２］に記載の、Ｖ２Ｒの細胞外領域の一部をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体；
（３）Ｖ９０Ａ，Ｍ１２２Ａ，Ｍ１２２Ｖ，Ｍ１２２Ｉ，Ｍ１２２Ｔ，Ｍ１２２Ｌ，Ｍ１２２Ｇ，Ｍ１２２Ｗ，Ｍ１２２Ｐ，Ｍ１２２Ｓ，Ｍ１２２Ｎ，Ｍ１２２Ｑ，Ｍ１２２Ｅ，Ｍ１２２Ｒ，Ｍ１２２Ｋ，Ｍ１２２Ｈ，Ｍ１２２Ｆ，Ｍ１２２Ｙ，Ｍ１２２Ｄ，Ｍ１２２Ｃ，Ｙ１２６Ｆ，Ｙ１２６Ｌ，Ａ２９５Ｖ
（４）（２１０）ＡＬＭＶＦ（２１４）から（２１０）ＴＬＡＶＹ（２１４）への変異
［４］以下に記載する点変異のうち、少なくとも１つを有することを特徴とする、［１］から［３］のいずれか１項に記載の、Ｖ２Ｒの細胞外領域の一部をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体；
Ｍ１２２Ａ，Ｍ１２２Ｖ，Ｍ１２２Ｔ，Ｍ１２２Ｌ，Ｍ１２２Ｇ，Ｍ１２２Ｓ，Ｍ１２２Ｃ，Ａ２９５Ｖ
［５］Ｖ２受容体の第一細胞外領域配列がオキシトシン受容体の第一細胞外領域配列へと置換されていることを特徴とする、［１］から［４］のいずれか１項に記載のキメラ受容体。［６］Ｖ２受容体の第一・第二・第三細胞外領域配列がオキシトシン受容体の第一・第二・第三細胞外領域配列へとそれぞれ置換されていることを特徴とする、［１］から［５］のいずれか１項に記載のキメラ受容体。
［７］［１］から［６］のいずれか１項に記載の、Ｖ２Ｒの細胞外領域の一部をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体をコードするポリヌクレオチド。
［８］［１］から［６］のいずれか１項に記載の、Ｖ２Ｒの細胞外領域の一部をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体を発現する動物細胞。
［９］［８］に記載の動物細胞を含有する、オキシトシン測定キット。
［１０］前記動物細胞がｃＡＭＰバイオセンサーを発現することを特徴とする、［９］に記載のオキシトシン測定キット。
［１１］（１）に記載されたアミノ酸のうち少なくとも１つか、もしくは（２）に記載する領域に変異を導入することを特徴とする、Ｖ２Ｒの細胞外領域の一部をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体のオキシトシン特異性向上方法；
（１）Ｖ９０，Ｍ１２２，Ｙ１２６，Ａ２９５
（２）（２１０）ＡＬＭＶＦ（２１４）
［１２］（３）に記載された点変異のうち少なくとも１つか、もしくは（４）に記載する変異を導入することを特徴とする、Ｖ２Ｒの細胞外領域の一部をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体のオキシトシン特異性を向上させ、かつ、オキシトシン反応性を向上させる方法；
（３）Ｖ９０Ａ，Ｍ１２２Ａ，Ｍ１２２Ｖ，Ｍ１２２Ｉ，Ｍ１２２Ｔ，Ｍ１２２Ｌ，Ｍ１２２Ｇ，Ｍ１２２Ｗ，Ｍ１２２Ｐ，Ｍ１２２Ｓ，Ｍ１２２Ｎ，Ｍ１２２Ｑ，Ｍ１２２Ｅ，Ｍ１２２Ｒ，Ｍ１２２Ｋ，Ｍ１２２Ｈ，Ｍ１２２Ｆ，Ｍ１２２Ｙ，Ｍ１２２Ｄ，Ｍ１２２Ｃ，Ｙ１２６Ｆ，Ｙ１２６Ｌ，Ａ２９５Ｖ
（４）（２１０）ＡＬＭＶＦ（２１４）から（２１０）ＴＬＡＶＹ（２１４）への変異
［１３］［１１］または［１２］に記載の変異に加え、以下のアミノ酸に変異を導入することを特徴とする、キメラ受容体のオキシトシン特異性を向上させ、かつ、オキシトシン反応性を向上させる方法；
Ａ１６７Ｌ，Ｌ１７７Ｖ，Ａ２１６Ｉ，Ａ２８５Ｔ，Ｌ３０６Ａ

【発明の効果】

【0019】

本発明の変異導入キメラ受容体は、変異導入前のキメラ受容体と比べ、オキシトシンに対する特異性が向上している。この特性により、オキシトシン特異的な測定に好適に用いることができる。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】図１は、本明細書実施例で用いているキメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒを示す模式図である。ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒでは、Ｖ２Ｒの第一、第二、第三細胞外領域（Ｅ１, Ｅ２, Ｅ３）配列がそれぞれＯＸＴＲの第一、第二、第三細胞外領域（Ｅ１, Ｅ２, Ｅ３）配列に置換されている。図中、Ｖ２Ｒに由来する部分は実線で、ＯＸＴＲに由来する部分は点線で示されている。

【図2】図２は、本明細書実施例で用いているキメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒについて、配列の由来を示したものである。キメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒでは、第一、第二、第三細胞外領域（Ｅ１, Ｅ２, Ｅ３）配列がそれぞれＯＸＴＲの第一、第二、第三細胞外領域（Ｅ１, Ｅ２, Ｅ３）配列に置換されている。ＯＸＴＲに由来する配列に下線が引かれている。

【図3】図３は、本明細書実施例で用いているキメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒについて、変異導入箇所を示したものである。ＯＸＴＲに由来する配列に下線が引かれている。灰色の網掛けで囲まれたアルファベットが、実施例１にて変異を導入されたアミノ酸を示す。なお、変異導入箇所のうち、連続する「ＡＬＭＶＦ」のみ、５アミノ酸が同時に置換された箇所である。その他の変異導入箇所については、たとえ連続するアミノ酸であっても、別個の点変異が導入されている。導入された点変異については、表１－１～表１－３に記載されている。

【発明を実施するための形態】

【0021】

本明細書において、「アミノ酸」とは、アミノ基とカルボキシル基を持つ有機化合物の総称である。特に限定されないが、例えばＡｌａ（Ａ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｖａｌ（Ｖ）を含む。上記アミノ酸はそれぞれ括弧内の英字１文字で表記されることもある。

【0022】

本明細書において、ＯＸＴＲおよびＶ２Ｒの由来はヒトに限定されないが、由来について特に記載のない場合、ＯＸＴＲおよびＶ２Ｒはヒト由来であることを意味する。本明細書において、ＯＸＴＲおよびＶ２Ｒのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）のデータベースに登録されているＯＸＴＲおよびＶ２Ｒアミノ酸配列であることとする。ヒト由来ＯＸＴＲ配列を配列番号１に、ヒト由来Ｖ２Ｒ配列を配列番号２に記載する。

【0023】

本明細書において、「Ｖ２Ｒの配列の一部がＯＸＴＲの配列へと置換される」とは、Ｖ２Ｒの２以上連続するアミノ酸配列が、対応するＯＸＴＲのアミノ酸配列に置換されていることを意味する。本明細書において、配列の一部がＯＸＴＲの配列へと置換されたＶ２Ｒのことを、単に「キメラ受容体」と表記することがある。

【0024】

本明細書において、「Ｖ２Ｒの細胞外領域配列」とは、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）のデータベースに登録されているＯＸＴＲおよびＶ２Ｒの細胞膜貫通領域で分断されるアミノ酸配列区画の１，３，５，７番目であることとする。ただし、Ｖ２Ｒの２番目の細胞膜貫通領域は、ＯＸＴＲおよびＶ２Ｒのアラインメントの結果、８９番目のＡｌａまでとした。

【0025】

本明細書において、ＯＸＴＲおよびＶ２Ｒの細胞膜貫通領域で分断されるアミノ酸配列区画の１番目、すなわちＮ末端から１番目の細胞外領域を、Ｅ１と表記することがある。同様に、ＯＸＴＲおよびＶ２Ｒの細胞膜貫通領域で分断されるアミノ酸配列区画の３番目、すなわちＮ末端から２番目の細胞外領域をＥ２、細胞膜貫通領域で分断されるアミノ酸配列区画の５番目をＥ３と表記することがある。

【0026】

本明細書において、Ｖ２ＲのＥ１配列をＯＸＴＲのＥ１配列へと置換したキメラ受容体を、ＯＸＴＲ（Ｅ１）－Ｖ２Ｒと表記することがある。同様に、Ｖ２ＲのＥ１、Ｅ２、Ｅ３配列をそれぞれＯＸＴＲのＥ１、Ｅ２、Ｅ３配列へと置換したキメラ受容体を、ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒと表記することがある。また、本明細書において、細胞外領域のＯＸＴＲ配列への置換以外に変異を有していないキメラ受容体のことを、「野生型キメラ受容体」と表記することがある。本明細書において、野生型キメラ受容体はＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒに限定されないが、配列の置換箇所について特に記載のない場合、ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒであることを意味する。ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒのアミノ酸配列を、配列番号３に示す。

【0027】

本明細書において、「変異を有する」とは、配列番号２に示すＶ２Ｒ受容体のアミノ酸配列が、アミノ酸の欠失、置換、挿入もしくは付加により、異なる配列となることを意味する。変異導入前後の配列を、当該技術分野で公知の方法に従って相同性が最も高くなるように整列させたとき、変異導入前後でアミノ酸配列が異なる部分を、変異箇所と定義する。アミノ酸配列を整列させるコンピュータプログラムとしてはＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ／）のＢＬＡＳＴが例示される。ＢＬＡＳＴでアミノ酸配列を比較するときのＡｌｇｏｒｉｔｈｍには、Ｂｌａｓｔｐが例示される。本明細書において、配列の一部がＯＸＴＲの配列へと置換されている以外の変異を有するキメラ受容体を、「変異型キメラ受容体」と表記することがある。

【0028】

本明細書において、アミノ酸配列に変異を有する箇所を、「Ｍ１２２」のようなアルファベット１文字、数字２文字ないし３文字の組み合わせで表記することがある。左端のアルファベット１文字は、変異導入箇所におけるアミノ酸残基を示す。数字２文字ないし３文字は、変異が導入されたキメラ受容体における当該アミノ酸残基の番号を示す。「Ｍ１２２」であれば、１２２番目のメチオニンに変異が導入されていることを表す。

【0029】

本明細書において、点変異したアミノ酸を、「Ｍ１２２Ｖ」のようなアルファベット１文字、数字２文字ないし３文字、アルファベット１文字の組み合わせで表記することがある。左端のアルファベット１文字は、変異導入箇所におけるアミノ酸残基を示す。中央の数字２文字ないし３文字は、変異が導入されたキメラ受容体における当該アミノ酸残基の番号を示す。右端のアルファベット１文字は変異した後のアミノ酸残基を示す。「Ｍ１２２Ｖ」であれば、１２２番目のメチオニンがバリンへと点変異していることを表す。

【0030】

本明細書において、複数のアミノ酸配列を、「（２１０）ＡＬＭＶＦ（２１４）」のように、括弧内の数字、アルファベット文字列、括弧内の数字の組み合わせで表記することがある。このとき、左端の括弧内の数字は配列が開始するアミノ酸残基の番号を示す。アルファベット文字列は、当該配列のアミノ酸残基を示す。右端の括弧内の数字は配列が終了するアミノ酸残基の番号を示す。「（２１０）ＡＬＭＶＦ（２１４）」であれば、２１０番目のアラニンで始まり、２１４番目のフェニルアラニンで終わる、アミノ酸配列ＡＬＭＶＦを示す。

【0031】

本明細書において、アミノ酸配列（２１０）ＡＬＭＶＦ（２１４）を（２１０）ＴＬＡＶＹ（２１４）と置換する変異を、「Ｍ１」ないし「Ｍ１変異」と表記することがある。なお、該当する部分の文脈から理解可能ではあるが、本明細書中で「Ｍ１」を「１番目のメチオニン」という意味で用いることはない。

【0032】

本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドもしくは塩基、又はそれらの等価物が、複数結合した形態で構成されているものを含む。ヌクレオチド及び塩基は、ＤＮＡ塩基又はＲＮＡ塩基を含む。上記の等価物は、例えばＤＮＡ塩基又はＲＮＡ塩基がメチル化等の化学修飾を受けているもの、又はヌクレオチドアナログを含む。ヌクレオチドアナログは、非天然のヌクレオチドを含む。
「ＤＮＡ鎖」とは、ＤＮＡ塩基又はそれらの等価物が２個以上連結した形態のことを表す。
「ＲＮＡ鎖」とは、ＲＮＡ塩基又はそれらの等価物が２個以上連結した形態のことを表す。

【0033】

本明細書において「ベクター」は、例えば大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１２、ｐＥＴ－Ｂｌｕｅ－２）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５）、酵母由来プラスミド（例えばｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、動物細胞発現プラスミド（例えばｐＡ１－１１、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ）、λファージなどのバクテリオファージ、アデノウイルス、レトロウイルス、バキュロウイルスなどのウイルス由来のベクターなどを用いることができる。これらのベクターは、プロモーター、複製開始点、又は抗生物質耐性遺伝子など、タンパク質発現に必要な構成要素を含んでいてもよい。ベクターは発現ベクターであってもよい。

【0034】

本明細書において、「ｃＡＭＰレベル」とは、各種野生型あるいは変異型キメラ受容体に起因して哺乳動物細胞内で産生されるｃＡＭＰ量を意味し、以下に記載の方法で測定した際のＲＬＵと定義する。

【0035】

［使用動物細胞］ヒト胎児腎細胞由来細胞株（ＨＥＫ２９３細胞）（ＥＣＡＣＣ［European Collection of Authenticated Cell Cultures］より入手、Cat no. 85120602）。

【0036】

［使用ベクター］GloSensor cAMP、すなわち、ホタルルシフェラーゼ（firefly luciferase）の３５９～５４４番目のアミノ酸残基と、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の制御サブユニットのｃＡＭＰ結合領域と、ホタルルシフェラーゼの４～３５５番目のアミノ酸残基とを含むタンパク質が発現するプラスミドベクター（pGloSensor-22F、Promega社製）と、野生型ヒトＶ２Ｒを発現するベクターpYS_CMV_V2R_Puro。なお、以下に記載の方法において、pYS_CMV_V2R_Puroの代わりに、適宜キメラ受容体が発現するpYS_CMVベクターを用いることもある。

【0037】

[細胞調製法]
〔１〕１．５×１０^４個のＨＥＫ２９３細胞を１０％ＦＢＳ含有Ｄ－ＭＥＭ培地に播種し、２４時間培養する。
〔２〕pGloSenso-22FとpYS_CMV_OXTR(E123)-V2R_Puroを、PEI MAX（Polyscience社製）を用いて１：４の比率で混合、２０分静置した後、ＨＥＫ２９３細胞に添加してトランスフェクションする。
〔３〕トランスフェクションされた細胞を２４時間培養した後、受容体刺激物質（例えばオキシトシンやオキシトシンを含む検体）の添加により発光強度の増加が見られるものを選抜する。

【0038】

[活性測定条件]
〔１〕細胞を２４時間培養した後、細胞を回収、インキュベート用液に６．０×１０^５cells/mLとなるよう置換し、９６ウェルハーフエリアホワイトプレート（Corning社製）に２６μＬずつ分注する。８ｍＭ D-Luciferin（OZBIOSCIENCES社製、１０ｍＭ HEPES-KOH, ｐＨ７．５で溶解）を１０μLずつ加え、室温で２時間平衡化処理を行う。
〔２〕オキシトシンを添加し、２０分間インキュベーションした後、ルミノメーターを用いてＲＬＵを測定する。測定されたＲＬＵを、ｃＡＭＰレベルと定義する。

【0039】

なお、本明細書におけるｃＡＭＰレベルの測定法は、上記測定法と同等性が担保される範囲内で、適宜改変することもできる。

【0040】

本明細書において、「受容体活性化レベル」とは、オキシトシンやＡＶＰに対する野生型あるいは変異型キメラ受容体の応答性を意味し、哺乳動物細胞中のオキシトシンやＡＶＰ非添加条件のＲＬＵに対する、オキシトシンやＡＶＰ存在下におけるｃＡＭＰレベルの比（Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）によって定義される。

【0041】

本明細書において、「シグナル／ノイズ比」及び「Ｓ／Ｎ比」、「Ｓ／Ｎ ｒａｔｉｏ」とは、前記ｃＡＭＰレベル測定法に従い野生型あるいは変異型キメラ受容体を一過性発現する株において、オキシトシンやＡＶＰを添加したときの、受容体活性化レベルを意味する。ある濃度Ｘ（ｐｇ／ｍＬ）のオキシトシンやＡＶＰを添加したときの受容体活性化レベルをＸ（ｐｇ／ｍＬ）におけるＳ／Ｎ比と定義する。

【0042】

本明細書において、特定濃度におけるオキシトシン又はＡＶＰに対するＳ／Ｎ比を表す文言として、「反応性」を用いることがある。「反応性」という文言を用いるときに、オキシトシン又はＡＶＰの濃度について特に言及がない場合、オキシトシン又はＡＶＰ １００（ｐｇ／ｍＬ）における反応性を意味する。本明細書において、「反応性が向上する」とは、Ｓ／Ｎ比値が増大することを意味する。

【0043】

本明細書において、受容体の「特異性」又は「オキシトシン特異性」とは、特定濃度のオキシトシンに対する反応性と、同一濃度のＡＶＰに対する反応性の商（（ＯＸＴに対するＳ／Ｎ比）／（ＡＶＰに対するＳ／Ｎ比）；ＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏ；ＯＸＴ／ＡＶＰ比）を意味する。オキシトシン又はＡＶＰの濃度について特に言及がない場合、オキシトシン又はＡＶＰ １００（ｐｇ／ｍＬ）における特異性を意味する。「特異性が向上する」とは、当該数値が増大することを意味する。

【0044】

本明細書において「ｃＡＭＰバイオセンサー」とは、哺乳動物細胞中のｃＡＭＰの産生量及び／又は濃度に依存し、可視化（イメージング）及び／又は定量可能な、自身に由来する指標（例えば、酵素活性レベル、発色レベル、発光［蛍光］レベル）が変化するタンパク質を意味する。上記ｃＡＭＰバイオセンサーは、通常、ｃＡＭＰ結合領域を有し、かかるｃＡＭＰ結合領域にｃＡＭＰが結合することにより、ｃＡＭＰバイオセンサーの立体構造が変化し、不活性化状態から活性化状態への変化、不可視化状態から可視化状態への変化等のアロステリックな効果を有する。

【0045】

本発明の一態様は、（１）Ｖ９０，Ｍ１２２，Ｙ１２６，Ａ２９５の少なくとも１つか、（２）（２１０）ＡＬＭＶＦ（２１４）に変異を有することを特徴とする、Ｖ２Ｒの細胞外領域の一部をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体である。

【0046】

本発明の変異型キメラ受容体は、ＯＸＴ／ＡＶＰ比が向上している。当該変異型キメラ受容体は、オキシトシン特異的に受容体活性化レベルを測定できるため、好適にオキシトシンの測定に用いることができる。

【0047】

本発明に係る変異は、オキシトシンの測定に利用できる限りにおいて、アミノ酸の欠失、置換、挿入もしくは付加のいずれでも良い。受容体の機能保持の観点から、前記（１）の変異は１～１０アミノ酸からなるアミノ酸配列との置換が好ましく、１～５アミノ酸からなるアミノ酸配列との置換がより好ましく、１アミノ酸置換（点変異）であることがより好ましい。前記（２）の変異も、同じアミノ酸数である５アミノ酸置換が好ましい。また、本発明に係る変異は、オキシトシンの測定に利用できる限りにおいて、複数個所に変異が導入されていてもよい。

【0048】

本発明のキメラ受容体は、ＯＸＴ／ＡＶＰ比が０．２（野生型キメラ受容体の２倍）以上に向上することが後述の実施例にて実証されていることから、（３）Ｖ９０Ａ，Ｍ１２２Ａ，Ｍ１２２Ｖ，Ｍ１２２Ｉ，Ｍ１２２Ｔ，Ｍ１２２Ｌ，Ｍ１２２Ｇ，Ｍ１２２Ｗ，Ｍ１２２Ｐ，Ｍ１２２Ｓ，Ｍ１２２Ｎ，Ｍ１２２Ｑ，Ｍ１２２Ｅ，Ｍ１２２Ｒ，Ｍ１２２Ｋ，Ｍ１２２Ｈ，Ｍ１２２Ｆ，Ｍ１２２Ｙ，Ｍ１２２Ｄ，Ｍ１２２Ｃ，Ｙ１２６Ｆ，Ｙ１２６Ｌ，Ａ２９５Ｖのうち少なくとも１つの点変異か、もしくは（４）（２１０）ＡＬＭＶＦ（２１４）から（２１０）ＴＬＡＶＹ（２１４）への変異のうち、少なくとも１つの変異を有していることがより好ましい。但し、上記に記載した特定の変異以外の、同一箇所の変異であっても、キメラ受容体の特異性が向上する蓋然性が高いことは、後述の実施例３によって示唆されている。

【0049】

中でも、ＯＸＴ／ＡＶＰ比が０．５（野生型キメラ受容体の５倍）以上に向上することが後述の実施例にて実証されていることから、Ｍ１２２Ａ，Ｍ１２２Ｖ，Ｍ１２２Ｔ，Ｍ１２２Ｌ，Ｍ１２２Ｇ，Ｍ１２２Ｗ，Ｍ１２２Ｐ，Ｍ１２２Ｓ，Ｍ１２２Ｎ，Ｍ１２２Ｑ，Ｍ１２２Ｅ，Ｍ１２２Ｒ，Ｍ１２２Ｋ，Ｍ１２２Ｈ，Ｍ１２２Ｆ，Ｍ１２２Ｙ，Ｍ１２２Ｄ，Ｍ１２２Ｃ，Ｙ１２６Ｌのうち少なくとも１つの点変異を有していることがより好ましい。ＯＸＴ／ＡＶＰ比が１．０（野生型キメラ受容体の１０倍）以上に向上することが後述の実施例にて実証されていることから、Ｍ１２２Ａ，Ｍ１２２Ｔ，Ｍ１２２Ｇ，Ｍ１２２Ｐ，Ｍ１２２Ｓ，Ｍ１２２Ｎ，Ｍ１２２Ｅ，Ｍ１２２Ｙ，Ｍ１２２Ｃ，Ｙ１２６Ｌのうち少なくとも１つの点変異を有していることがより好ましい。ＯＸＴ／ＡＶＰ比が２．０（野生型キメラ受容体の２０倍）以上に向上することが後述の実施例にて実証されていることから、Ｍ１２２Ａ，Ｍ１２２Ｇ，Ｍ１２２Ｐ，Ｍ１２２Ｓ，Ｍ１２２Ｎ，Ｍ１２２Ｃ，Ｙ１２６Ｌのうち少なくとも１つの点変異を有していることがより好ましい。

【0050】

本発明のキメラ受容体は、変異型キメラ受容体のＯＸＴ／ＡＶＰ比が０．２（野生型キメラ受容体の２倍）以上に向上し、かつ、オキシトシン反応性が野生型キメラ受容体と比較して向上している（具体的には、オキシトシン１００（ｐｇ／ｍＬ）におけるＳ／Ｎ比が野生型キメラ受容体の１．２倍以上に向上している）ことが実証されているという点から、少なくともＭ１２２Ａ，Ｍ１２２Ｖ，Ｍ１２２Ｔ，Ｍ１２２Ｌ，Ｍ１２２Ｇ，Ｍ１２２Ｓ，Ｍ１２２Ｃ，Ａ２９５Ｖのうちいずれか１つの点変異を有していることがより好ましい。

【0051】

さらに、本発明のキメラ受容体は、野生型キメラ受容体よりも高いオキシトシン反応性（具体的にはオキシトシン１００（ｐｇ／ｍＬ）におけるＳ／Ｎ比が野生型キメラ受容体の５．０倍以上）で、かつＯＸＴ／ＡＶＰ比が向上している（具体的にはＯＸＴ／ＡＶＰ比が０．５以上に向上している）ことが実証されているという点から、Ｍ１２２Ａ，Ｍ１２２Ｖ，Ｍ１２２Ｔ，Ｍ１２２Ｌ，Ｍ１２２Ｃのいずれかの点変異を有することがより好ましい。中でも、野生型キメラ受容体よりも非常に高いオキシトシン反応性（具体的にはＳ／Ｎ比が７．０倍以上）を有し、かつＡＶＰよりもオキシトシン優位な反応性（ＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏが１．５以上）を有することが実証されているという点から、Ｍ１２２Ａ，Ｍ１２２Ｖ，Ｍ１２２Ｔのいずれかの点変異を有することがより好ましい。

【0052】

本発明に用いることができるＯＸＴＲおよびＶ２Ｒは、オキシトシンなどの測定対象に反応を示す限りにおいて、その由来に制限はない。動物細胞にて発現した際にヒトのＯＸＴＲおよびＶ２Ｒと近い反応性を示すことから、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等由来の細胞を例示することができる。中でも、生体内のオキシトシンなどのリガンドに対する受容体活性を比較的よく反映できる点から、ヒトＯＸＴＲ及びヒトＶ２Ｒであることがより好ましい。

【0053】

本発明の変異型キメラ受容体は、これまで記載した変異の他に、ＯＸＴＲ活性の顕著な低下やＳ／Ｎ比の顕著な低下を引き起こさない範囲内で、さらにアミノ酸配列を欠失、置換、挿入もしくは付加する変異を有していても良い。一般に、特に活性と直接的に関与しない部位において、１もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入、又は他のアミノ酸による置換を受けたポリペプチドが、その生物学的活性を維持しうる(Mark et al., Proc Natl Acad Sci U S A.1984 Sep;81(18):5662-5666.、Zoller et al., Nucleic Acids Res. 1982 Oct 25;10(20):6487-6500.、Wang et al., Science. 1984 Jun 29;224(4656):1431-1433.)ことが知られている。

【0054】

本発明の変異型キメラ受容体は、Ａ１６７，Ｌ１７７，Ａ２１６，Ａ２８５，Ｌ３０６に変異を有していてもよく、中でもＡ１６７Ｌ，Ｌ１７７Ｖ，Ａ２１６Ｉ，Ａ２８５Ｔ，Ｌ３０６Ａの点変異を有していてもよい。後述の実施例２の結果より、上記の変異により、本発明のキメラ受容体におけるオキシトシン反応性が向上することが期待される。実施例４の結果より、これらの変異を導入しても、本発明のキメラ受容体におけるオキシトシン特異性向上効果は悪影響を受けない蓋然性が高いことが示唆されている。

【0055】

本発明の実施形態に係る変異型キメラ受容体は、そのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸が化学修飾を受けていてもよい。そのような場合でも、本発明の実施形態に係るキメラ受容体は、特定のアミノ酸配列を含むといえる。一般的に、タンパク質に含まれるアミノ酸が生体内で受ける化学修飾としては、例えばＮ末端修飾（例えば、アセチル化 、ミリストイル化等）、Ｃ末端修飾（例えば、アミド化、グリコシルホスファチジルイノシトール付加等）、又は側鎖修飾（例えば、リン酸化、糖鎖付加等）等が知られている。

【0056】

本発明の一態様は、前記キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドである。本発明の一態様は、前記変異型キメラ受容体を発現する、動物細胞である。

【0057】

本発明の一態様であるポリヌクレオチドは、ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて合成可能である。その他、ＤＮＡ塩基又はＲＮＡ塩基合成の受託会社（例えば、インビトロジェン社やタカラバイオ社等）から購入することもできる。本発明のポリヌクレオチド配列は、本発明の変異型キメラ受容体のアミノ酸配列と、遺伝暗号表から、適宜設計することができる。

【0058】

前記ポリヌクレオチドを含むベクターは、一般に知られている分子生物学的手法によって調製することができ、その調製方法として、例えばＴＡクローニング法、平滑末端クローニング法、ライゲーション法、Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎクローニング法、Ｇａｔｅｗａｙクローニング法、アッセンブリ―法等が例示される。

【0059】

本発明の一態様である動物細胞は、前記ベクターの導入により、前記変異型キメラ受容体が一過的（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）又は安定的（ｓｔａｂｌｅ）に発現する動物細胞であればよい。使用される細胞株に特に限定は無いが、購入や実験のし易さの点から、ヒト胎児腎細胞由来細胞株［ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞等］、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株［ＣＨＯ細胞］、ヒト骨肉腫細胞株［Ｕ２ＯＳ細胞］が好ましく、中でも遺伝子導入効率や安定増殖の点からヒト胎児腎細胞由来細胞株［ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞等］、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株［ＣＨＯ細胞］がより好ましい。

【0060】

本発明の動物細胞は、この分野で一般的に用いられている遺伝子工学的手法により作製することができる。例えば、プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス［ＣＭＶ］のＩＥ［immediate early］遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０［Simian virus 40］の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＮＦＡＴプロモーター、ＨＩＦプロモーター）と、かかるプロモーターの下流に作動可能に連結されているＴＳＨ受容体をコードする遺伝子を含むベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ｐｃＤＭ８、ｐＡＧＥ１０７、ｐＡＳ３－３、ｐＣＤＭ８）を、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥ（Diethylaminoethyl）デキストラン法、ウイルス感染法等の方法を用いて、哺乳動物細胞へ導入（トランスフェクション）することにより得ることができる。リガンドの測定に用いられるために、適宜キメラ受容体をコードする遺伝子以外の遺伝子が導入されていても良く、例えばｃＡＭＰバイオセンサーをコードする遺伝子が導入されていても良い。

【0061】

本発明に用いることのできるｃＡＭＰバイオセンサーとしては、例えば、ｃＡＭＰ結合領域（例えば、プロテインキナーゼＡ［ＰＫＡ］の制御サブユニット由来のｃＡＭＰ結合領域、Ｅｐａｃ１由来のｃＡＭＰ結合領域）を含むレポータータンパク質（例えば、ＨＲＰ［horseradish peroxidase］；アルカリホスファターゼ；β－Ｄ－ガラクトシダーゼ；緑色発光ルシフェラーゼ［ＳＬＧ］、橙色発光ルシフェラーゼ［ＳＬＯ］、赤色発光ルシフェラーゼ［ＳＬＲ］等のルシフェラーゼ；緑色蛍光タンパク質［ＧＦＰ］、赤色蛍光タンパク質［ＤｓＲｅｄ］、シアン色蛍光タンパク質［ＣＦＰ］等の蛍光タンパク質）を挙げることができ、具体的には、ＰＫＡの制御サブユニット由来のｃＡＭＰ結合領域を含むルシフェラーゼであるGloSensor cAMP（Promega社製）や、Ｅｐａｃ１由来のｃＡＭＰ結合領域を含む赤色蛍光タンパク質であるPink Flamindo（Pink Fluorescent cAMP indicator）（文献「Harada K., et al., Sci Rep. 2017 Aug 4;7(1):7351. doi: 10.1038/s41598-017-07820-6.」参照）を挙げることができ、本実施例において、その効果が実証されているため、GloSensor cAMP（Promega社製）が好ましい。

【0062】

本発明の一態様は、前記変異型キメラ受容体を発現する動物細胞を含む、オキシトシンの測定キットである。

【0063】

本発明の一態様であるオキシトシン測定キットは、常用されている試薬を適宜用いることができる。一例として、動物細胞液、発光基質液、反応プレート、標準液、希釈液のようなキット構成が考えられる。

【0064】

本発明の一態様は、（１）に記載されたアミノ酸のうち少なくとも１つか、もしくは（２）に記載する領域に変異を導入することを特徴とする、Ｖ２Ｒの細胞外領域の一部をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体のオキシトシン特異性向上方法である。
（１）Ｖ９０，Ｍ１２２，Ｙ１２６，Ａ２９５
（２）（２１０）ＡＬＭＶＦ（２１４）

【0065】

本発明の一態様は、（３）に記載された点変異のうち少なくとも１つか、もしくは（４）に記載する変異を導入することを特徴とする、Ｖ２Ｒの細胞外領域の一部をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体のオキシトシン特異性を向上させ、かつ、オキシトシン反応性を向上させる方法である。
（３）Ｖ９０Ａ，Ｍ１２２Ａ，Ｍ１２２Ｖ，Ｍ１２２Ｉ，Ｍ１２２Ｔ，Ｍ１２２Ｌ，Ｍ１２２Ｇ，Ｍ１２２Ｗ，Ｍ１２２Ｐ，Ｍ１２２Ｓ，Ｍ１２２Ｎ，Ｍ１２２Ｑ，Ｍ１２２Ｅ，Ｍ１２２Ｒ，Ｍ１２２Ｋ，Ｍ１２２Ｈ，Ｍ１２２Ｆ，Ｍ１２２Ｙ，Ｍ１２２Ｄ，Ｍ１２２Ｃ，Ｙ１２６Ｆ，Ｙ１２６Ｌ，Ａ２９５Ｖ
（４）（２１０）ＡＬＭＶＦ（２１４）から（２１０）ＴＬＡＶＹ（２１４）への変異

【0066】

本発明の一態様は、前記（１）～（４）に記載の変異のいずれかに加え、Ａ１６７Ｌ，Ｌ１７７Ｖ，Ａ２１６Ｉ，Ａ２８５Ｔ，Ｌ３０６Ａのいずれかの点変異を導入することを特徴とする、キメラ受容体のオキシトシン特異性を向上させ、かつ、オキシトシン反応性を向上させる方法である。

【0067】

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

【実施例】

【0068】

実施例１．変異型キメラ受容体の調製
以下に示す方法に従い、野生型キメラ受容体を元に、変異型キメラ受容体を調製した。

【0069】

１－１．点変異の設計
Ｖ２Ｒの細胞外領域をＯＸＴＲの細胞外領域に置換したキメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒに対して、以下の変異導入検討を実施した。

【0070】

野生型キメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒのタンパク質構造を、図１に模式的に示す。当該タンパク質のアミノ酸配列について、配列番号３及び図２に示す。図２において、下線部で示すアミノ酸配列はＯＸＴＲ由来の配列を、特に下線部のない配列はＶ２Ｒ由来の配列を表している。

【0071】

キメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒへ導入した変異の箇所を、図３に示す。網掛けが変異点の位置を表す。なお、（２１０）ＡＬＭＶＦ（２１４）の変異は、後述するようにキメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒの（２１０）ＡＬＭＶＦ（２１４）配列を（２１０）ＴＬＡＶＹ（２１４）配列に置換したものである。上記以外の変異点については、いずれも点変異であり、連続する２アミノ酸以上を置換等した変異は含まれない。変異後のアミノ酸については、後述の表１－１～表１－３に記載する。

【0072】

１－２．変異キメラ受容体の発現ベクター調製
１－１．及び後述の表１－１～表１－３に記載した変異に対応するよう、変異点に相当するヌクレオチドを挟んで３’側と５’側に２０～３０ｍｅｒの人工プライマーを設計し、キメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒの３’側プライマーと変異導入するための１～５塩基を追加した５’側プライマーと、キメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒを発現するベクターpYS_CMV_OXTR(E123)-V2R_Puro用いて、東洋紡社ＫＯＤ－ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｃｏｄｅ Ｎｏ. ＳＭＫ－１０１）によるｉｎｖｅｒｓｅＰＣＲ法で、ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒ配列への点変異導入を行った。点変異導入プラスミドを形質転換した大腸菌シングルコロニーからプラスミドを精製、シーケンス解析により点変異の導入を確認した。

【0073】

１－３．キメラ受容体一過性発現細胞株の取得
１．５×１０^４個のヒト胎児腎細胞由来細胞株（ＨＥＫ２９３細胞）（ＥＣＡＣＣ［European Collection of Authenticated Cell Cultures］より入手、Cat no. 85120602）を、１０％ＦＢＳ含有Ｄ－ＭＥＭ培地とともに６ウェルマルチプレートに播種し、２４時間培養した。
１－２．にて取得した変異型キメラ受容体ベクター０.５μｇと、ホタルルシフェラーゼ（firefly luciferase）の３５９～５４４番目のアミノ酸残基と、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の制御サブユニットのｃＡＭＰ結合領域と、ホタルルシフェラーゼの４～３５５番目のアミノ酸残基とを含むタンパク質が発現するプラスミドベクター（pGloSensor-22F、Promega社製）１．５μｇを、PEI MAX（Polyscience社製）と１：４の比率で混合、２０分静置した後、ＨＥＫ２９３細胞に添加してトランスフェクションした。上記操作によって、キメラ受容体を一過性発現する、ＨＥＫ２９３細胞を取得した。

【0074】

変異型キメラ受容体の一過性発現株に対する対照として用いるため、１－２記載の野生型キメラ受容体の発現ベクターにより、野生型キメラ受容体一過性発現株も取得した。

【0075】

実施例２．変異型キメラ受容体のオキシトシンおよびＡＶＰに対する活性測定
実施例１にて得られた、pGloSensor-22Fと、変異型キメラ受容体あるいは野生型キメラ受容体を一過性発現するＨＥＫ２９３細胞に、オキシトシンあるいはＡＶＰを添加して、各変異型キメラ受容体のＳ／Ｎ比を測定した。

【0076】

測定法は以下の通りである。
[測定条件]
pGloSensor-22Fと、野生型キメラ受容体あるいは変異型キメラ受容体を一過性発現するＨＥＫ２９３細胞を２４時間培養後、細胞を回収、インキュベート用液に６．０×１０^５cells/mLとなるよう置換し、９６ウェルハーフエリアホワイトプレート（Corning社製）に２６μLずつ分注した。８ｍＭ D-Luciferin（OZBIOACIENCE社製、１０ｍＭ HEPES-KOH, ｐＨ７．５で溶解）を１０μＬずつ加え、遮光して室温で２時間静置した。２時間後、オキシトシンあるいはＡＶＰを０、０．１、１、１０、１００、１０００、１００００、１０００００ｐｇ／ｍＬとなるよう添加、２０分間インキュベーションした後のＲＬＵ値を９６ウェルマルチプレートルミノメーター（Promega社製）で測定した。

【0077】

表１－１～表１－３に、野生型キメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒに導入した変異、各キメラ受容体のオキシトシンおよびＡＶＰの各濃度におけるＳ／Ｎ比（Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）、オキシトシン１００ｐｇ／ｍＬにおける野生型キメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２ＲのＳ／Ｎ比に対する変異型キメラ受容体のＳ／Ｎ比の比率（／ＷＴ ｒａｔｉｏ）、各キメラ受容体のＡＶＰ１００ｐｇ／ｍＬにおけるＳ／Ｎ比に対するオキシトシン１００ｐｇ／ｍＬにおけるＳ／Ｎ比の比率（ＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏ）を示す。

【0078】

【表1-1】

【0079】

【表1-2】

【0080】

【表1-3】

【0081】

Ｖ９０Ａ，Ｍ１２２Ｖ，Ｙ１２６Ｆ，Ｙ１２６Ｌ，Ｍ１，Ａ２９５Ｖの変異を有する変異型キメラ受容体では、１００ｐｇ／ｍＬにおけるＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏが０．２０以上となった。野生型キメラ受容体（表中ＷＴ）の１００ｐｇ／ｍＬにおけるＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏは０．１０であるため、上記変異型キメラ受容体のＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏは、野生型キメラ受容体と比較して明確に高い値を示している。

【0082】

上記ＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏが向上した変異型キメラ受容体の中でも、Ｍ１２２Ｖ，Ｙ１２６Ｆの変異を有する変異型キメラ受容体では、１００ｐｇ／ｍＬにおけるＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏが０．５以上となった。

【0083】

ＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏ ０．２０以上変異型キメラ受容体の内、Ｍ１２２Ｖ，Ｙ１２６Ｆ，Ｙ１２６Ｌ，Ａ２９５Ｖの変異を有する変異型キメラ受容体において、オキシトシン反応性が野生型と同等以上であった。特に、Ａ２９５Ｖ変異型キメラ受容体は野生型キメラ受容体と比較してオキシトシン反応性が約４．４倍、Ｍ１２２Ｖ変異型キメラ受容体はオキシトシン反応性が約１０．６倍に向上していた。

【0084】

Ａ１６７Ｌ，Ｌ１７７Ｖ，Ａ２１６Ｉ，Ａ２８５Ｔ，Ｌ３０６Ａの変異を有するキメラ受容体は、１００ｐｇ／ｍＬにおけるオキシトシン特異性（ＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏ）は野生型キメラ受容体（表中ＷＴ）と同等程度だったものの、１００ｐｇ／ｍＬにおけるオキシトシン反応性は野生型キメラ受容体（表中ＷＴ）の１．１倍以上であった。特にＡ２８５Ｔに変異を有するキメラ受容体は、オキシトシンに対する反応性が２．３２倍に向上していた。

【0085】

Ｙ１２６Ｆ，Ｙ１２６Ｌに変異を有するキメラ受容体は、ともに１００ｐｇ／ｍＬにおけるＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏが向上していた。それぞれの変異アミノ酸に注目すると、Ｙ１２６Ｆでは１２６番目のＴｙｒ（Ｙ）がＰｈｅ（Ｆ）に、Ｙ１２６Ｌでは１２６番目のＴｙｒ（Ｙ）がＬｅｕ（Ｌ）に置換されている。Ｐｈｅ（Ｆ）は芳香族含有側鎖を有するのに対し、Ｌｅｕ（Ｌ）は脂肪族側鎖を有することから、これら変異後のアミノ酸は性質を異にする。一方で、どちらの変異型キメラ受容体においてもＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏが向上していることから、本実施例においてＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏの向上が確認された変異点においては、変異後のアミノ酸の種類に関わらず、ＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏが向上する可能性が示唆された。

【0086】

実施例３．Ｍ１２２部位変異型キメラ受容体のオキシトシンおよびＡＶＰに対する活性測定
実施例２で、Ｙ１２６に点変異を有する２種類のキメラ受容体が、ともにオキシトシン特異性が向上していたことを受け、変異後のアミノ酸の種類による、オキシトシン特異性向上効果への影響を検討した。

【0087】

本実施例では、実施例２の結果より産業上有用であると思われたＭ１２２部位変異型キメラ受容体について、バリン以外のアミノ酸への置換による影響を検討した。具体的には、pGloSensor-22Fと、Ｍ１２２部位変異型キメラ受容体あるいは野生型キメラ受容体を一過性発現するＨＥＫ２９３細胞に、オキシトシンあるいはＡＶＰを添加して、各Ｍ１２２部位変異型キメラ受容体のＳ／Ｎ比を測定した。

【0088】

測定法は、Ｍ１２２部位変異型キメラ受容体を用いる以外は実施例２と同様に行った。

【0089】

野生型キメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒの、オキシトシンおよびＡＶＰ１００ｐｇ／ｍＬにおける反応比（ＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏ）を、表２－１～表２－２に示す。

【0090】

【表2-1】

【0091】

【表2-2】

【0092】

上記Ｍ１２２部位変異型キメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒにおいては、驚くべきことに、全ての変異型キメラ受容体において、ＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏが０．２０以上であり、オキシトシン特異性が向上することが見いだされた。

【0093】

また、変異型キメラ受容体におけるオキシトシン反応性を測定したところ、Ｍ１２２Ｖ，Ｍ１２２Ａ，Ｍ１２２Ｌ，Ｍ１２２Ｔ，Ｍ１２２Ｇ，Ｍ１２２Ｓ，Ｍ１２２Ｃでオキシトシン反応性が野生型キメラ受容体の１．２倍以上に向上していた。特に、Ｍ１２２Ａ，Ｍ１２２Ｖ，Ｍ１２２Ｔ，Ｍ１２２Ｌ，Ｍ１２２Ｃは／ＷＴ ｒａｔｉｏが５．０倍以上の高いオキシトシン反応性、かつ高いオキシトシン特異性（ＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏが０．５以上）を有していた。中でも、Ｍ１２２Ａ、Ｍ１２２Ｔは／ＷＴ ｒａｔｉｏが７．０倍以上の高いオキシトシン反応性、かつＡＶＰよりもオキシトシン優位な反応性（ＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏが１．５以上）を有していた。

【0094】

Ｍ１２２部位変異型キメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒの全てにおいて、野生型キメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒよりもオキシトシン特異性が向上するという本実施例の結果からは、生体内のＶ２Ｒにおいて、オキシトシン及び／又はＡＶＰとの結合性に関与するいくつかの重要なアミノ酸では、ＡＶＰ受容体はＡＶＰに対する特異性を高めるために分子進化し、オキシトシンに対する反応性を抑制するために最適化されている可能性が示唆される。本仮説に従えば、実施例２でオキシトシン特異性が向上した変異点については、いずれのアミノ酸変異であっても、オキシトシン特異性が向上する可能性が示唆される。

【0095】

実施例４．二重の変異を導入したキメラ受容体のオキシトシンおよびＡＶＰに対する活性測定
実施例２でオキシトシン反応性向上に有効と思われた変異型キメラ受容体Ａ２８５Ｔ、特異性向上に有効と思われた変異型キメラ受容体Ｙ１２６Ｆについて、二重変異型キメラ受容体（Ｙ１２６Ｆ／Ａ２８５Ｔ）を作製し、二重の変異を導入することによる影響を検討した。

【0096】

具体的には、pGloSensor-22Fと、各変異型キメラ受容体あるいは野生型キメラ受容体を一過性発現するＨＥＫ２９３細胞に、オキシトシンあるいはＡＶＰを添加して、各変異型キメラ受容体のＳ／Ｎ比を測定した。

【0097】

測定法は、単独変異Ｙ１２６Ｆの変異型キメラ受容体、Ａ２８５Ｔの変異型キメラ受容体、二重変異型キメラ受容体（Ｙ１２６Ｆ／Ａ２８５Ｔ）の各変異型キメラ受容体を用いる以外は実施例２と同様に行った。

【0098】

野生型キメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒの、オキシトシンおよびＡＶＰの各濃度におけるＳ／Ｎ比（Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）に対する、各変異型キメラ受容体ＯＸＴＲ（Ｅ１２３）－Ｖ２Ｒの比率（／ＷＴ ｒａｔｉｏ）と、オキシトシンおよびＡＶＰ１００ｐｇ／ｍＬにおける反応比（ＯＸＴ／ＡＶＰ ｒａｔｉｏ）を、表３に示す。

【0099】

【表3】

【0100】

二重変異（Ｙ１２６Ｆ／Ａ２８５Ｔ）のキメラ受容体は、Ｙ１２６Ｆのオキシトシン特異性向上と、Ａ２８５Ｔのオキシトシン反応性向上の、両特性を有していた。

【0101】

本実施例の結果からは、異なる２種類の変異（例えば、オキシトシン特異性を向上させる変異と、オキシトシン反応性を向上させる変異）を組み合わせた場合、二重変異株においては、それぞれの変異によって奏される効果を併せ持つ（上記の例であればオキシトシン特異性とオキシトシン反応性がともに高い変異型受容体が取得される）蓋然性が高いことが示唆された。このことから、本発明のうち、オキシトシン特異性を高めるがオキシトシン反応性を高めない変異についても、オキシトシン反応性を高める変異と組み合わせることにより、オキシトシン特異性とオキシトシン反応性のどちらも高いキメラ受容体を取得できることが予想され、産業上有用であると考えられた。

【産業上の利用可能性】

【0102】

本発明は、オキシトシンの特異的な測定に資するものである。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

0007536300000001.app