特許 7536640 ＶＥＧＦＲ－Ｆｃ融合タンパク質製剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-08-09

(45)【発行日】2024-08-20

(54)【発明の名称】ＶＥＧＦＲ－Ｆｃ融合タンパク質製剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/16 20060101AFI20240813BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240813BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20240813BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240813BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20240813BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20240813BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20240813BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20240813BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240813BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20240813BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20240813BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20240813BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20240813BHJP

   C07K 14/715 20060101ALN20240813BHJP

【ＦＩ】

A61K38/16

A61K39/395 W

A61K9/08

A61K47/68

A61K47/18

A61K47/26

A61K47/34

A61P27/02

A61P43/00 111

C12N15/62 Z ZNA

C12N15/13

C07K19/00

C07K16/00

C07K14/715

【請求項の数】 7

(21)【出願番号】P 2020527828

(86)(22)【出願日】2018-11-16

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-02-12

(86)【国際出願番号】 US2018061644

(87)【国際公開番号】W WO2019099921

(87)【国際公開日】2019-05-23

【審査請求日】2021-10-27

(31)【優先権主張番号】62/587,733

(32)【優先日】2017-11-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/618,904

(32)【優先日】2018-01-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500049716

【氏名又は名称】アムジエン・インコーポレーテツド

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ウェクスラー－コーエン，ヤエル

(72)【発明者】

【氏名】コーシック，ラーフル・ラジャン

(72)【発明者】

【氏名】カラハン，ウィリアム・ジェイ

(72)【発明者】

【氏名】パダラ，サイ・チャクラーダー

(72)【発明者】

【氏名】フェシンマイヤー，ロバート・マシュー

【審査官】横田 倫子

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１３／０３２３２４２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１４／０３９６８２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１６／２０８９８９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１７／０６６５５４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１７／１２９６８５（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３８／００

Ａ６１Ｐ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体のドメイン及びＦｃドメインを含む融合タンパク質と、
ｂ）２つの異なる糖と
を含み、緩衝剤を含まない、硝子体内投与のための液体製剤であって、第一の糖は、スクロースであり、及び第二の糖は、トレハロースであり、並びに、前記融合タンパク質は、アフリベルセプトである、製剤。

【請求項2】

ｐＨは、５．０～７．０である、請求項１に記載の製剤。

【請求項3】

前記アフリベルセプトの濃度は、約４０ｍｇ／ｍｌである、請求項１又は２に記載の製剤。

【請求項4】

前記第一の糖及び前記第二の糖の濃度は、それぞれ２％～１０％（ｗ／ｖ）である、請求項１～３のいずれか一項に記載の製剤。

【請求項5】

前記第一の糖及び前記第二の糖の濃度は、それぞれ約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％又は約５％（ｗ／ｖ）である、請求項４に記載の製剤。

【請求項6】

前記第一及び第二の糖の総濃度は、約５％、約６．５％、約７％、約７．５％、約８％、約８．５％又は約１０％（ｗ／ｖ）である、請求項４に記載の製剤。

【請求項7】

界面活性剤及び／又は等張化剤をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の製剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０１７年１１月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／５８７，７３３号明細書及び２０１８年１月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／６１８，９０４号明細書の利益を主張し、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、電子フォーマットの配列表と共に出願されている。配列表は、２０１８年１１月１５日に作成されたＡ－２２０８－ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称のファイルとして提供され、サイズが７．７８ｋｂである。電子フォーマットの配列表における情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0003】

本開示は、ＶＥＧＦＲ－Ｆｃ融合タンパク質製剤並びにこのような製剤、例えば緩衝剤を含まない製剤又は製剤が緩衝剤の緩衝能の範囲外のｐＨを有する、緩衝剤を含む製剤を製造及び使用する方法に関する。

【背景技術】

【0004】

血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、ＶＥＧＦ－Ａとも称され、新しい血管の成長を促進し、ＶＥＧＦＲ－１及びＶＥＧＦＲ－２に結合するシグナルタンパク質である。ＶＥＧＦは、多くの腫瘍で上昇することが分かっており、血管新生における役割を有する。ＶＥＧＦは、滲出加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の有意な態様である、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）などの眼内血管新生において役割を有することも分かっている。

【0005】

ＶＥＧＦ阻害剤、例えば抗ＶＥＧＦ抗体及び断片並びにデコイ受容体又はキメラ受容体は、様々な病態、例えば癌及び眼障害などを処置するための治療薬として開発されてきた。例えば、抗ＶＥＧＦ抗体及び抗ＶＥＧＦ Ｆａｂは、両方ともそれぞれベバシズマブ及びラニビズマブとして市販されている。また、アフリベルセプト、ＶＥＧＦＲ－Ｆｃ融合タンパク質又は「ＶＥＧＦ－ｔｒａｐ」は、市販されている。

【0006】

アフリベルセプトは、ＶＥＧＦＲ－１のＩｇドメイン２及びＶＥＧＦＲ－２のＩｇドメイン３に融合したＩｇＧ１ Ｆｃドメインで構成される融合タンパク質である。アフリベルセプトは、滲出型ＡＭＤを含む様々な眼病態処置のためのＥｙｌｅａ（登録商標）（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）として販売されており、硝子体内投与のために製剤化される。融合タンパク質は、特定の型の癌処置のためのＺａｌｔｒａｐ（登録商標）（ｚｉｖ－アフリベルセプト）（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）としても販売されており、静脈内投与のために製剤化される。

【0007】

眼科用製剤、特に硝子体内投与は、他の投与経路と比較して更なる安全性の懸念を有するため、より具体的な必要条件を有し得る。例えば、炎症又は他の有害反応による対象への影響が深刻な場合があるため、より具体的な必要条件が必要になる場合がある。例えば、硝子体内投与用製剤は、より狭い範囲の許容可能な浸透圧を必要とする場合がある。硝子体内投与用製剤は、より低い閾値の許容可能な粒子化を必要とする場合がある。例えば、米国特許第＜７８９＞号明細書及び米国特許第＜７８８＞号明細書を参照されたい。向上した安定性を提供する製剤を有することも有利である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【文献】米国特許第＜７８９＞号明細書

【文献】米国特許第＜７８８＞号明細書

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

本開示は、新規のタンパク質製剤の必要性を満たす製剤、例えば安定なＶＥＧＦＲ－Ｆｃ融合製剤又は硝子体内製剤を提供し、これは、凝集が少ないか又は関連する利点を有する。

【0010】

本明細書では、タンパク質製剤並びにこのような製剤を製造及び使用する方法が提供される。いくつかの実施形態において、製剤は、硝子体内投与に好適である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、ＶＥＧＦＲ－Ｆｃ融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、タンパク質製剤は、緩衝剤フリーの製剤である。一実施形態において、製剤は、緩衝剤を含み、且つ緩衝剤の緩衝能の範囲外のｐＨを有する。一実施形態において、製剤は、緩衝剤を含まない。

【0011】

一実施形態において、製剤は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体のドメイン及びＦｃドメインを含む融合タンパク質と、安定剤と、任意選択的に界面活性剤及び／又は等張化剤とを含む。したがって、いくつかの実施形態において、製剤は、緩衝剤を含まないか、又は残留量が製剤中の緩衝能を欠くような緩衝剤の残留量を含む。製剤は、４．０～８．５のｐＨを有し得る。いくつかの実施形態において、製剤は、５．０～７．０のｐＨ又は約５．０、約５．２、約５．５、約５．８、約６．０、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５又は約６．８であるｐＨを有し得る。いくつかの実施形態において、ｐＨは、５．０±０．３、５．２±０．３、５．５±０．３、５．８±０．３、６．０±０．３、６．１±０．３、６．２±０．３、６．３±０．３、６．４±０．３、６．５±０．３又は６．８±０．３である。

【0012】

別の実施形態において、製剤は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体のドメイン及びＦｃドメインを含む融合タンパク質と、安定剤と、緩衝剤と、任意選択的に界面活性剤及び／又は等張化剤とを含み、製剤は、緩衝剤の緩衝能の範囲外のｐＨである。いくつかの実施形態において、緩衝剤は、アセテートである。いくつかの実施形態において、アセテート濃度は、０．１ｍＭ～５０ｍＭ、例えば０．５ｍＭ～５０ｍＭ、１ｍＭ～５０ｍＭ又は２．５ｍＭ～４０ｍＭなどである。一実施形態において、アセテート濃度は、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約２．５ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ又は約４０ｍＭである。製剤は、アセテートの緩衝能の範囲外のｐＨ、例えば５．８超のｐＨ、５．８～７．０のｐＨ又は約６．０、約６．１又は約６．２であるｐＨなどを有し得る。いくつかの実施形態において、ｐＨは、６．０±０．３、６．１±０．３又は６．２±０．３である。

【0013】

いくつかの実施形態において、製剤は、アミノ酸又は糖である安定剤を含む。一実施形態において、製剤は、２つの異なる安定剤、例えば２つの異なる糖を含む。

【0014】

いくつかの実施形態において、製剤は、界面活性剤、例えばポリソルベート２０、ポリソルベート８０又はプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（登録商標）Ｆ６８などを含む。いくつかの実施形態において、製剤は、界面活性剤を含まない。

【0015】

いくつかの実施形態において、製剤は、等張化剤、例えば塩化ナトリウム又は塩化カリウムなどを含む。他の実施形態において、製剤は、等張化剤を含まない。

【0016】

いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、アフリベルセプトである。いくつかの実施形態において、アフリベルセプトの濃度は、約４０ｍｇ／ｍｌである。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】実施例１に記載されている製剤に関するＳＥ－ＵＨＰＬＣによって示されるとおり、アセテート濃度とアフリベルセプト凝集レベルとの間の相関関係を示す。

【図2】目標ｐＨと、バッファー交換前のｐＨ（開始ｐＨ）及びバッファー交換後のｐＨの差との間の相関関係を示す。（図２Ａは、目標ｐＨとの相関関係を示す。図２Ｂは、滴定ｐＨとの相関関係を示す）。

【図3】実施例３に記載されているように、塩濃度と、ＳＥＣ－ＵＨＰＬＣのパーセントメインピークとの間の相関関係を示す。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本開示は、ＶＥＧＦＲ－Ｆｃ融合タンパク質製剤並びにこのような製剤を製造及び使用する方法を提供する。いくつかの実施形態において、製剤は、緩衝剤フリーの製剤である。いくつかの実施形態において、製剤は、緩衝剤を含み、及び製剤は、緩衝剤の緩衝能の範囲外のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、製剤は、緩衝剤を含まない。いくつかの実施形態において、製剤は、残留量が製剤中の緩衝能を欠くような緩衝剤の残留量を含む。

【0019】

いくつかの実施形態において、緩衝剤を含まない製剤は、安定したｐＨを維持することができる。例えば、約４０℃で１又は２週間保存した後、製剤は、約０．１又は約０．２のｐＨ単位内であるｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦＲ－Ｆｃ融合タンパク質は、対応する緩衝剤を含む製剤と比較して向上した安定性を有する。ＶＥＧＦＲ－Ｆｃ融合タンパク質の安定性は、凝集レベルの低減、例えばサイズ排除超高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＵＨＰＬＣ）などによって示され得る。ＶＥＧＦＲ－Ｆｃ融合タンパク質は、アフリベルセプトであり得る。いくつかの実施形態において、タンパク質の濃度は、約４０ｍｇ／ｍｌである。

【0020】

いくつかの実施形態において、緩衝剤を含み、且つ緩衝剤の緩衝能の範囲外のｐＨを有する製剤は、安定したｐＨを維持することができる。例えば、約４０℃で１又は２週間保存した後、製剤は、約０．１又は約０．２のｐＨ単位内であるｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦＲ－Ｆｃ融合タンパク質は、緩衝剤の緩衝能の範囲内のｐＨを有する対応する緩衝剤（同じ又は異なる緩衝剤）を含む製剤と比較して向上した安定性を有する。ＶＥＧＦＲ－Ｆｃ融合タンパク質の安定性は、凝集レベルの低減、例えばサイズ排除超高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＵＨＰＬＣ）などによって示され得る。ＶＥＧＦＲ－Ｆｃ融合タンパク質は、アフリベルセプトであり得る。いくつかの実施形態において、タンパク質の濃度は、約４０ｍｇ／ｍｌである。

【0021】

一実施形態において、製剤は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体のドメイン及びＦｃドメインを含む融合タンパク質と、安定剤と、任意選択的に界面活性剤及び／又は等張化剤とを含む。このような実施形態において、製剤は、緩衝剤を含まない。いくつかの実施形態において、製剤は、残留量が製剤中の緩衝能を欠くような緩衝剤の残留量を含む。いくつかの実施形態において、製剤は、安定したｐＨを維持することができる。例えば、約４０℃で１又は２週間保存した後、製剤は、約０．１又は約０．２のｐＨ単位内であるｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦＲ－Ｆｃ融合タンパク質は、同じ製剤であるが、緩衝剤を含む製剤と比較して向上した安定性を有する。タンパク質の安定性は、凝集レベルの低減、例えばＳＥＣ－ＵＨＰＬＣなどによって示され得る。

【0022】

別の実施形態において、製剤は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体のドメイン及びＦｃドメインを含む融合タンパク質と、緩衝剤と、安定剤と、任意選択的に界面活性剤及び／又は等張化剤とを含み、製剤は、緩衝剤の緩衝能の範囲外のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、製剤は、安定したｐＨを維持することができる。例えば、約４０℃で１又は２週間保存した後、製剤は、約０．１又は約０．２のｐＨ単位内であるｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦＲ－Ｆｃ融合タンパク質は、同じ製剤であるが、緩衝剤を含む製剤と比較して向上した安定性を有する。タンパク質の安定性は、凝集レベルの低減、例えばＳＥＣ－ＵＨＰＬＣなどによって示され得る。

【0023】

いくつかの実施形態において、製剤は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体のドメイン及びＦｃドメインを含む融合タンパク質と、安定剤と、任意選択的に界面活性剤及び／又は等張化剤とを含み、ｐＨは、５．０～７．０、５．５～６．５又は５．５～５．６である。いくつかの実施形態において、ｐＨは、約７．０、約６．９、約６．８、約６．７、約６．６、約６．５、約６．４、約６．３、６．２、約６．１、約６．０、約５．９、約５．８、約５．７、約５．６、約５．５、約５．４、約５．３、約５．２、約５．１又は約５．０である。いくつかの実施形態において、ｐＨは、約６．２である。いくつかの実施形態において、ｐＨは、７．０±０．３、６．９±０．３、６．８±０．３、６．７±０．３、６．６±０．３、６．５±０．３、６．４±０．３、６．３±０．３、６．２±０．３、６．１±０．３、６．０±０．３、５．９±０．３、５．８±０．３、５．７±０．３、５．６±０．３、５．５±０．３、５．４±０．３、５．３±０．３、５．２±０．３、５．１±０．３又は５．０±０．３である。いくつかの実施形態において、ｐＨは、６．２±０．３である。

【0024】

別の実施形態において、製剤は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体のドメイン及びＦｃドメインを含む融合タンパク質と、緩衝剤と、安定剤と、任意選択的に界面活性剤及び／又は等張化剤とを含み、製剤は、緩衝剤の緩衝能の範囲外のｐＨを有する。緩衝剤は、典型的には、そのｐＫａ値を中心とした±１ｐＨ単位の範囲の緩衝能を有する。一実施形態において、緩衝剤を含む製剤は、緩衝剤のｐＫａから１ｐＨ単位よりも大きいｐＨを有する。いくつかの実施形態において、製剤は、緩衝剤のｐＫａから少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９又は２．０ｐＨ単位であるｐＨを有する。いくつかの実施形態において、製剤は、緩衝剤のｐＫａから約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９又は約２．０ｐＨ単位であるｐＨを有する。一実施形態において、製剤は、緩衝剤のｐＫａから約１．４ｐＨ単位であるｐＨを有する。

【0025】

一実施形態において、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体のドメイン及びＦｃドメインを含む融合タンパク質と、緩衝剤と、安定剤と、任意選択的に界面活性剤及び／又は等張化剤とを含む製剤であって、緩衝剤の緩衝能の範囲外のｐＨを有する製剤は、緩衝剤としてアセテートを含む。アセテートのｐＫａ値は、４．８であり、したがって、その緩衝能は、３．８～５．８のｐＨ範囲である。したがって、一実施形態において、製剤は、３．８未満又は５．８超のｐＨを有する。一実施形態において、製剤のｐＨは、５．８超である。一実施形態において、ｐＨは、４．０～８．５、５．０～８．５、５．８～８．０、５．８～７．５、５．８～７．０、５．９～７．０、６．０～７．０、６．０～６．８、６．０～６．５又は６．１～６．５である。いくつかの実施形態において、ｐＨは、約７．０、約６．９、約６．８、約６．７、約６．６、約６．５、約６．４、約６．３、約６．２、約６．１、約６．０又は約５．９である。いくつかの実施形態において、ｐＨは、約６．２である。いくつかの実施形態において、ｐＨは、８．５±０．３、８．４±０．３、８．３±０．３、８．２±０．３、８．１±０．３、８．０±０．３、７．９±０．３、７．８±０．３、７．７±０．３、７．６±０．３、７．５±０．３、７．４±０．３、７．３±０．３、７．２±０．３、７．１±０．３、７．０±０．３、６．９±０．３、６．８±０．３、６．７±０．３、６．６±０．３、６．５±０．３、６．４±０．３、６．３±０．３、６．２±０．３、６．１±０．３、６．０±０．３、５．９±０．３又は５．８±０．３である。いくつかの実施形態において、ｐＨは、６．２±０３である。

【0026】

一実施形態において、製剤は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体のドメイン及びＦｃドメインを含む融合タンパク質と、アセテートと、安定剤と、任意選択的に界面活性剤及び／又は等張化剤とを含み、且つアセテートの緩衝能の範囲外のｐＨ（例えば、５．８超、例えば約６．２など）を有し、アセテートは、非塩形態のアセテート由来である。一実施形態において、アセテートは、塩形態のアセテート由来である。緩衝剤は、アセテート塩又は酢酸、例えば氷酢酸など由来のアセテートであり得る。一実施形態において、アセテートは、酢酸ナトリウム由来である。一実施形態において、アセテート又はアセテートバッファーの濃度は、０．１ｍＭ～５０ｍＭ、０．５ｍＭ～５０ｍＭ、１ｍＭ～５０ｍＭ、１ｍＭ～４０ｍＭ、２．５ｍＭ～４０ｍＭ、１ｍＭ～３０ｍＭ、１ｍＭ～２０ｍＭ、１ｍＭ～１０ｍＭ又は１ｍＭ～５ｍＭである。一実施形態において、アセテート又はアセテートバッファーの濃度は、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約２．５ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ又は約５０ｍＭである。

【0027】

いくつかの実施形態において、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体のドメイン及びＦｃドメインを含む１～３００ｍｇ／ｍｌの融合タンパク質は、本明細書で開示される製剤中に存在する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の製剤は、１～５０ｍｇ／ｍｌ、１～３００ｍｇ／ｍｌ、１～２５０ｍｇ／ｍｌ、１～２００ｍｇ／ｍｌ、１～１００ｍｇ／ｍｌの融合タンパク質を含む。一実施形態において、製剤は、１０～５０ｍｇ／ｍｌの融合タンパク質を含む。一実施形態において、製剤は、３００ｍｇ／ｍｌ未満、２５０ｍｇ／ｍｌ未満、２００ｍｇ／ｍｌ未満、１００ｍｇ／ｍｌ未満、５０ｍｇ／ｍｌ未満、４５ｍｇ／ｍｌ未満、４０ｍｇ／ｍｌ未満、３０ｍｇ／ｍｌ未満又は２５ｍｇ／ｍｌ未満の融合タンパク質を含む。一実施形態において、製剤は、約３００ｍｇ／ｍｌ、約２５０ｍｇ／ｍｌ、約２００ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ、約４５ｍｇ ｍ／、約４０ｍｇ／ｍｌ、約３０ｍｇ／ｍｌ又は約２５ｍｇ／ｍｌの融合タンパク質を含む。一実施形態において、製剤は、約４０ｍｇ／ｍｌの融合タンパク質を含む。

【0028】

いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＶＥＧＦＲ１のドメイン、ＶＥＧＦＲ２のドメイン又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＶＥＧＦＲ１のドメイン及びＶＥＧＦＲ２のドメインを含む。一実施形態において、融合タンパク質は、ＶＥＧＦＲ１のＩｇドメイン２及びＶＥＧＦＲ２のＩｇドメイン３を含む。一実施形態において、融合タンパク質は、ＶＥＧＦＲ１のＩｇドメイン２、ＶＥＧＦＲ２のＩｇドメイン３及びＩｇＧ１のＦｃドメインを含む。一実施形態において、融合タンパク質は、ＶＥＧＦ Ｔｒａｐである。別の実施形態において、融合タンパク質は、アフリベルセプトである。別の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、製剤は、約４０ｍｇ／ｍｌのアフリベルセプトを含む。一実施形態において、製剤は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む約４０ｍｇ／ｍｌの融合タンパク質を含む。一実施形態において、製剤は、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む約４０ｍｇ／ｍｌの融合タンパク質及び配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む融合タンパク質を含む。

【0029】

【化1】

【0030】

【化2】

【0031】

一実施形態において、製剤は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体のドメイン及びＦｃドメインを含む融合タンパク質（例えば、アフリベルセプト、例えば約４０ｍｇ／ｍｌのアフリベルセプト）と、緩衝剤（例えば、アセテート、例えば２．５ｍＭ～４０ｍＭのアセテート）と、安定剤と、任意選択的に界面活性剤とを含み、ｐＨは、緩衝剤の緩衝能の範囲外（例えば、緩衝剤がアセテートである場合、５．８超、例えば約６．２など）であり、安定剤は、アミノ酸又は糖である。一実施形態において、製剤は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体のドメイン及びＦｃドメインを含む融合タンパク質（例えば、アフリベルセプト、例えば約４０ｍｇ／ｍｌのアフリベルセプト）と、安定剤と、任意選択的に界面活性剤とを含み、安定剤は、アミノ酸又は糖である。

【0032】

一実施形態において、安定剤は、アミノ酸である。一実施形態において、アミノ酸は、プロリンである。別の実施形態において、アミノ酸は、グリシンである。いくつかの実施形態において、アミノ酸は、塩基性アミノ酸、例えばアルギニン又はリジンなどである。他の実施形態において、アミノ酸は、酸性アミノ酸、例えばアスパラギン酸などである。更に他の実施形態において、アミノ酸は、疎水性アミノ酸、例えばアラニンなどである。いくつかの実施形態において、製剤は、２つの異なるアミノ酸を含む。一実施形態において、安定剤は、糖である。糖は、スクロース、ソルビトール、グリセロール、トレハロース（例えば、α，α－トレハロース又はトレハロース二水和物）、マンニトール、デキストロース、デキストラン、グルコース又はこれらの任意の組み合わせであり得る。一実施形態において、安定剤は、スクロースである。別の実施形態において、安定剤は、トレハロースである。別の実施形態において、安定剤は、シクロデキストリン、例えばヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰＢＣＤ）などである。更に別の実施形態において、製剤は、２つの異なる糖、例えばスクロース及びトレハロースなどを含む。別の実施形態において、安定剤は、シクロデキストリンである。更に別の実施形態において、製剤は、１つ以上の糖及び１つ以上のアミノ酸を含む。

【0033】

安定剤の濃度は、１ｍＭ～３００ｍＭ、１０ｍＭ～３００ｍＭ、１００ｍＭ～３００ｍＭ、２００ｍＭ～３００ｍＭ及び２００ｍＭ～２８０ｍＭであり得る。一実施形態において、安定剤の濃度は、約２００ｍＭ、例えば約２００ｍＭのプロリンである。別の実施形態において、安定剤の濃度は、約２８０ｍＭ、例えば約２８０ｍＭのグリシンである。

【0034】

更に他の実施形態において、製剤は、０～５０％（ｗ／ｖ）の安定剤を含む。いくつかの実施形態において、製剤は、０～２０％（ｗ／ｖ）の安定剤を含む。いくつかの実施形態において、製剤は、０～１０％（ｗ／ｖ）、５～１０％（ｗ／ｖ）又は２～１０％（ｗ／ｖ）の安定剤を含む。いくつかの実施形態において、製剤は、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％、約４．５％、約５％、約５．５％、約６％、約６．５％、約７％、約７．５％、約８％、約８．５％、約９％又は約１０％（ｗ／ｖ）の安定剤、例えば糖などを含む。糖は、スクロース又はトレハロースであり得る。一実施形態において、製剤は、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％、約４．５％、約５％、約５．５％、約６％、約６．５％、約７％、約７．５％、約８％、約８．５％、約９％、約９．５％又は約１０％（ｗ／ｖ）のスクロースを含む。一実施形態において、本製剤は、約５％のスクロースを含む。更に別の実施形態において、製剤は、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％、約４．５％、約５％、約５．５％、約６％、約６．５％、約７％、約７．５％、約８％、約８．５％、約９％、約９．５％又は約１０％（ｗ／ｖ）のトレハロースを含む。一実施形態において、製剤は、約３％（ｗ／ｖ）のトレハロースを含む。一実施形態において、製剤は、約３．５％（ｗ／ｖ）のトレハロースを含む。一実施形態において、製剤は、約４％（ｗ／ｖ）のトレハロースを含む。一実施形態において、製剤は、約４．５％（ｗ／ｖ）のトレハロースを含む。一実施形態において、製剤は、約５％（ｗ／ｖ）のトレハロースを含む。別の実施形態において、製剤は、約６．５％（ｗ／ｖ）のトレハロースを含む。

【0035】

一実施形態において、製剤は、２つの異なる糖を含む。一実施形態において、第１の糖及び第２の糖の濃度は、それぞれ０～１０％（ｗ／ｖ）、５～１０％（ｗ／ｖ）又は２～１０％（ｗ／ｖ）である。一実施形態において、第１の糖及び第２の糖の総濃度は、０～１０％（ｗ／ｖ）、５～１０％（ｗ／ｖ）又は２～１０％（ｗ／ｖ）である。別の実施形態において、第１の糖の濃度は、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％又は約５％（ｗ／ｖ）である。別の実施形態において、第２の糖の濃度は、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、４％又は約５％（ｗ／ｖ）である。一実施形態において、第１の糖は、スクロースであり、及び第２の糖は、トレハロースである。更に別の実施形態において、製剤は、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約５％、約６％、約６．５％、約７％、約７．５％、約８％、約８．５％、約９％又は約１０％（ｗ／ｖ）のスクロース及びトレハロース、例えば約１％（ｗ／ｖ）のスクロース及び約７％（ｗ／ｖ）のトレハロース、約２％（ｗ／ｖ）のスクロース及び約６％（ｗ／ｖ）のトレハロース、約３％（ｗ／ｖ）のスクロース及び約５％（ｗ／ｖ）のトレハロース、約４％（ｗ／ｖ）のスクロース及び約４％（ｗ／ｖ）のトレハロース、約５％（ｗ／ｖ）のスクロース及び約３％（ｗ／ｖ）のトレハロース、約６％（ｗ／ｖ）のスクロース及び約２％（ｗ／ｖ）のトレハロース又は約７％（ｗ／ｖ）のスクロース及び約１％（ｗ／ｖ）のトレハロースを含む。別の実施形態において、製剤は、約５％（ｗ／ｖ）のスクロース及び約３．５％（ｗ／ｖ）のトレハロース、約５％（ｗ／ｖ）のスクロース及び約４％（ｗ／ｖ）のトレハロース、約５％（ｗ／ｖ）のスクロース及び約２．５％（ｗ／ｖ）のトレハロース、約５％（ｗ／ｖ）のスクロース及び約２％（ｗ／ｖ）のトレハロース、約５％（ｗ／ｖ）のスクロース及び約１．５％（ｗ／ｖ）のトレハロース又は約４％（ｗ／ｖ）のスクロース及び約２．５％（ｗ／ｖ）のトレハロースを含む。

【0036】

一実施形態において、製剤は、界面活性剤を含まない。別の実施形態において、製剤は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体のドメイン及びＦｃドメインを含む融合タンパク質（例えば、アフリベルセプト、例えば約４０ｍｇ／ｍｌのアフリベルセプト）と、緩衝剤（例えば、アセテート、例えば２．５ｍＭ～４０ｍＭのアセテート）と、安定剤（例えば、スクロース及び／又はトレハロース）と、界面活性剤とを含み、ｐＨは、緩衝剤の緩衝能の範囲外（例えば、緩衝剤がアセテートである場合、５．８超、例えば約６．２など）である。

【0037】

一実施形態において、製剤は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体のドメイン及びＦｃドメインを含む融合タンパク質（例えば、アフリベルセプト、例えば約４０ｍｇ／ｍｌのアフリベルセプト）と、安定剤（例えば、スクロース及び／又はトレハロース）と、界面活性剤とを含む。界面活性剤は、ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテル、ポリオキシプロピレングリコールアルキルエーテル、グルコシドアルキルエーテル、ポリオキシエチレングリコールオクチルフェノールエーテル、ポリオキシエチレングリコールアルキルフェノールエーテル、グリセロールアルキルエステル、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル、ソルビタンアルキルエステル、コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ、ドデシルジメチルアミンオキシド、ポロキサマー、ポリエトキシル化獣脂アミン（ＰＯＥＡ）又はこれらの組み合わせであり得る。一実施形態において、界面活性剤は、ポリソルベートである。一実施形態において、界面活性剤は、ポリソルベート２０である。別の実施形態において、界面活性剤は、ポリソルベート８０である。更に別の実施形態において、界面活性剤は、ポロキサマー、例えばポロキサマー１８８などである。一実施形態において、界面活性剤は、プルロニック（登録商標）Ｆ－６８である。いくつかの実施形態において、製剤は、０．００１～３％（ｗ／ｖ）、０．００１～２％（ｗ／ｖ）、０．００１～１％（ｗ／ｖ）、０．００１～０．５％（ｗ／ｖ）又は０．０１％～０．１％（ｗ／ｖ）の界面活性剤を含む。いくつかの実施形態において、製剤は、約０．０３％（ｗ／ｖ）の界面活性剤、例えばポリソルベート８０などを含む。いくつかの実施形態において、製剤は、約０．０２％（ｗ／ｖ）の界面活性剤、例えばポリソルベート２０などを含む。いくつかの実施形態において、製剤は、約０．０１％（ｗ／ｖ）の界面活性剤、例えばポリソルベート８０などを含む。いくつかの実施形態において、製剤は、約０．００５％（ｗ／ｖ）の界面活性剤、例えばポリソルベート８０などを含む。いくつかの実施形態において、製剤は、約０．０３％（ｗ／ｖ）の界面活性剤、例えばポリソルベート２０などを含む。いくつかの実施形態において、製剤は、約０．０２％（ｗ／ｖ）の界面活性剤、例えばポリソルベート２０などを含む。いくつかの実施形態において、製剤は、約０．０１％（ｗ／ｖ）の界面活性剤、例えばポリソルベート２０などを含む。いくつかの実施形態において、製剤は、約０．１％（ｗ／ｖ）の界面活性剤、例えばプルロニック（登録商標）Ｆ－６８などを含む。

【0038】

一実施形態において、製剤は、アセテートと、スクロースと、トレハロースと、界面活性剤とを含む。一実施形態において、製剤は、約６．２のｐＨにおいて、約２．５ｍＭのアセテートと、約５％（ｗ／ｖ）のスクロースと、約３．５％（ｗ／ｖ）のトレハロースと、約０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０とを含む。一実施形態において、製剤は、約６．２のｐＨにおいて、約２．５ｍＭのアセテートと、約５％（ｗ／ｖ）のスクロースと、約３％（ｗ／ｖ）のトレハロースと、約５ｍＭのＮａＣｌと、約０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０とを含む。

【0039】

一実施形態において、製剤は、緩衝剤を含まない。いくつかの実施形態において、製剤は、残留量が製剤中の緩衝能を欠くような緩衝剤の残留量を含む。一実施形態において、製剤は、約６．２のｐＨにおいて、約５％（ｗ／ｖ）のスクロースと、約３．５％（ｗ／ｖ）のトレハロースと、約０．０１％（ｗ／ｖ）の界面活性剤（例えば、ポリソルベート）とを含む。一実施形態において、製剤は、約６．２のｐＨにおいて、約５％（ｗ／ｖ）のスクロースと、約３．５％（ｗ／ｖ）のトレハロースと、約０．０２％（ｗ／ｖ）の界面活性剤（例えば、ポリソルベート）とを含む。一実施形態において、製剤は、約６．２のｐＨにおいて、約５％（ｗ／ｖ）のスクロースと、約３．５％（ｗ／ｖ）のトレハロースと、約０．０３％（ｗ／ｖ）の界面活性剤（例えば、ポリソルベート）とを含む。一実施形態において、製剤は、約６．２のｐＨにおいて、約５％（ｗ／ｖ）のスクロースと、約３．５％（ｗ／ｖ）のトレハロースと、約０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０とを含む。一実施形態において、製剤は、約６．２のｐＨにおいて、約５％（ｗ／ｖ）のスクロースと、約３．５％（ｗ／ｖ）のトレハロースと、約０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０とを含む。一実施形態において、製剤は、約６．２のｐＨにおいて、約５％（ｗ／ｖ）のスクロースと、約３．５％（ｗ／ｖ）のトレハロースと、約０．０３％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０とを含む。一実施形態において、製剤は、約６．２のｐＨにおいて、約５％（ｗ／ｖ）のスクロースと、約３％（ｗ／ｖ）のトレハロースと、約５ｍＭの塩化ナトリウムと、約０．０１％（ｗ／ｖ）の界面活性剤（例えば、ポリソルベート）とを含む。一実施形態において、製剤は、約６．２のｐＨにおいて、約５％（ｗ／ｖ）のスクロースと、約３％（ｗ／ｖ）のトレハロースと、約５ｍＭの塩化ナトリウムと、約０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０とを含む。

【0040】

一実施形態において、製剤は、等張化剤を含まない。別の実施形態において、製剤は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体のドメイン及びＦｃドメインを含む融合タンパク質（例えば、アフリベルセプト、例えば約４０ｍｇ／ｍｌのアフリベルセプト）と、緩衝剤（例えば、アセテート、例えば２．５ｍＭ～４０ｍＭのアセテート）と、安定剤（例えば、スクロース及び／又はトレハロース）と、等張化剤とを含み、ｐＨは、緩衝剤の緩衝能の範囲外（例えば、緩衝剤がアセテートである場合、５．８超、例えば約６．２など）である。別の実施形態において、製剤は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体のドメイン及びＦｃドメインを含む融合タンパク質（例えば、アフリベルセプト、例えば約４０ｍｇ／ｍｌのアフリベルセプト）と、緩衝剤（例えば、アセテート、例えば２．５ｍＭ～４０ｍＭのアセテート）と、安定剤（例えば、スクロース及び／又はトレハロース）と、等張化剤と、界面活性剤とを含み、ｐＨは、緩衝剤の緩衝能の範囲外（例えば、緩衝剤がアセテートである場合、５．８超、例えば約６．２など）である。一実施形態において、製剤は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体のドメイン及びＦｃドメインを含む融合タンパク質（例えば、アフリベルセプト、例えば約４０ｍｇ／ｍｌのアフリベルセプト）と、安定剤（例えば、スクロース及び／又はトレハロース）と、等張化剤とを含む。別の実施形態において、製剤は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体のドメイン及びＦｃドメインを含む融合タンパク質（例えば、アフリベルセプト、例えば約４０ｍｇ／ｍｌのアフリベルセプト）と、安定剤（例えば、スクロース及び／又はトレハロース）と、等張化剤と、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）とを含む。

【0041】

等張化剤の濃度は、１ｍＭ～２５０ｍＭ、５ｍＭ～２００ｍＭ、４０ｍＭ～２００ｍＭ又は４０ｍＭ～１５０ｍＭであり得る。一実施形態において、等張化剤の濃度は、約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１４０ｍＭ又は約１５０ｍＭである。等張化剤は、塩、例えば塩化物塩などであり得る。一実施形態において、等張化剤は、塩化ナトリウムである。別の実施形態において、等張化剤は、塩化カリウムである。

【0042】

いくつかの実施形態において、本明細書で開示される製剤は、更なる賦形剤を含み得る。一実施形態において、製剤は、ポリマー賦形剤、例えばヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）又はポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）を更に含み得る。

【0043】

いくつかの実施形態において、本明細書で開示される製剤は、硝子体内投与、例えば滲出型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）などの眼病態の治療に使用される。いくつかの実施形態において、病態は、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）又は糖尿病性網膜症（ＤＲ）後の黄斑浮腫である。更に他の実施形態において、病態は、失明を引き起こす。一実施形態において、製剤は、プレフィルドシリンジで使用することができる。一実施形態において、プレフィルドシリンジは、製剤の硝子体内投与のためのものである。

【0044】

いくつかの実施形態において、本明細書で開示される製剤は、１０μｍ以上の粒径について、１ミリリットル当たり１００粒子未満、７５粒子未満、５０粒子未満、２５粒子未満、２０粒子未満、１５粒子未満、１０粒子未満、５粒子未満又は２粒子未満の粒子数（例えば、不可視粒子濃度又は数）を有する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される製剤は、２５μｍ以上の粒径について、１ミリリットル当たり１００粒子未満、７５粒子未満、５０粒子未満、２５粒子未満、２０粒子未満、１５粒子未満、１０粒子未満、５粒子未満又は２粒子未満の粒子数を有する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される製剤は、５０μｍ以上の粒径について、１ミリリットル当たり１００粒子未満、７５粒子未満、５０粒子未満、２５粒子未満、２０粒子未満、１５粒子未満、１０粒子未満、５粒子未満又は２粒子未満の粒子数を有する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される製剤は、１０μｍ以上の粒径について、１ミリリットル当たり５０粒子未満の粒子数を有する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される製剤は、２５μｍ以上の粒径について、１ミリリットル当たり５粒子未満の粒子数を有する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される製剤は、５０μｍ以上の粒径について、１ミリリットル当たり２粒子未満の粒子数を有する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される製剤は、１０μｍ以上の粒径について、１ミリリットル当たり平均５０粒子以下の粒子数を有する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される製剤は、２５μｍ以上の粒径について、１ミリリットル当たり平均５粒子以下の粒子数を有する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される製剤は、５０μｍ以上の粒径について、１ミリリットル当たり平均２粒子以下の粒子数を有する。

【0045】

いくつかの実施形態において、粒子数は、ＨＩＡＣにより開発された市販のカウンターなどの液中パーティクルカウンタの使用によるなど、光遮蔽により測定される。いくつかの実施形態において、粒子数は、２５℃の温度で測定される。いくつかの実施形態において、第２の製剤と比較して第１の製剤で粒子数が少ないか又は不可視粒子数が少ない場合、第１の製剤（例えば、緩衝剤を含まない製剤又は緩衝剤を含む製剤であって、製剤のｐＨは、緩衝剤の緩衝能の範囲外である、製剤）は、第２の製剤（例えば、緩衝剤を含む製剤であって、製剤のｐＨは、緩衝剤の緩衝能の範囲内である、製剤）よりも望ましいと判断される。別の実施形態において、第１の製剤は、第２の製剤と同様の粒子数又は不可視粒子数を有する（例えば、有意差がない）。

【0046】

いくつかの実施形態において、第１の製剤の融合タンパク質が、１つ以上のプロセスストレス後及び／又は所定の期間の保存後、第２の製剤の融合タンパク質よりも元々の特徴又は特性を多く保持する場合、第１の製剤（例えば、緩衝剤を含まない製剤又は緩衝剤を含む製剤であって、製剤のｐＨは、緩衝剤の緩衝能の範囲外である、製剤）は、第２の製剤（例えば、緩衝剤を含む製剤であって、製剤のｐＨは、緩衝剤の緩衝能の範囲内である、製剤）よりも安定であると判断される。製剤の安定性は、例えば、米国特許第８，０９２，８０３号明細書及び同第９，９８２，０３２号明細書並びに国際公開第２０１７１２９６８５号パンフレット及び同第２０１８０９４３１６号パンフレットに記載されているような当該技術分野で公知のタンパク質の特性及び特徴を分析することにより判断され得る。

【0047】

一実施形態において、例えば国際公開第２０１７１２９６８５号パンフレットに記載のものなど、当該技術分野で公知の１つ以上のプロセスストレス又はストレス条件後、第１の製剤が第２の製剤よりも凝集が少ない場合、第１の製剤（例えば、緩衝剤を含まない製剤又は緩衝剤を含む製剤であって、製剤のｐＨは、緩衝剤の緩衝能の範囲外である、製剤）は、第２の製剤（例えば、緩衝剤を含む製剤であって、製剤のｐＨは、緩衝剤の緩衝能の範囲内である、製剤）よりも安定であると判断される。一実施形態において、ストレス条件は、振盪である。別の実施形態において、ストレス条件は、１回以上の凍結／融解サイクル、例えば１、２、３、４又は５回の凍結／融解サイクルである。別の実施形態において、ストレス条件は、振動、圧力及び／又は落下衝撃である。一実施形態において、ストレス条件は、光露光である。一実施形態において、ストレス条件は、混合である。一実施形態において、製剤は、任意の１つ以上のストレス条件にさらされる。ストレス条件は、振盪、１回以上の凍結／融解サイクル、濾過、混合、光露光、振動、圧力、落下衝撃ストレス及び／又はこれらの組み合わせを含み得る。一実施形態において、ストレスプロセスは、振盪（例えば、２５℃で３００ｒｐｍを７日間）；１℃／分の速度で２５℃～－２０℃において３回の凍結／融解サイクルを含み、各冷却／加熱工程後、温度を１０分間一定に保つ。別の実施形態において、ストレスプロセスは、２５℃～－３０℃において３回の凍結／融解サイクル；０．２μｍのＰＶＤＦフィルタを通す濾過；任意選択的に混合；２℃～８℃での保持、光露光及び完全な輸送シミュレーションを含む（例えば、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間若しくは１１０時間超又は２４～１１０時間、４８～９６時間、例えば約５０時間、約６０時間、約７０時間、約８０時間、約９０時間、約１００時間若しくは約１００時間などの時系列で、これは、振動、圧力及び落下衝撃ストレスを含む）。

【0048】

別の実施形態において、第１の製剤が、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約３カ月、約４カ月、約５カ月、約６カ月、約７カ月、約８カ月、約９カ月、約１０カ月、約１１カ月、約１２カ月、約１５カ月、約１８カ月、約２１カ月、約２４カ月、約３０カ月又は約３６カ月保存後、第２の製剤よりも凝集が少ない場合、第１の製剤（例えば、緩衝剤を含まない製剤又は緩衝剤を含む製剤であって、製剤のｐＨは、緩衝剤の緩衝能の範囲外である、製剤）は、第２の製剤（例えば、緩衝剤を含む製剤であって、製剤のｐＨは、緩衝剤の緩衝能の範囲内である、製剤）よりも安定であると判断される。保存は、所定の温度、例えば約４０℃、約３０℃、約２５℃、約５℃、約－２０℃又は約－３０℃でなされ得る。

【0049】

一実施形態において、第１の製剤が、１つ以上のプロセスストレス及び所定の期間（例えば、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約３カ月、約４カ月、約５カ月、約６カ月、約７カ月、約８カ月、約９カ月、約１０カ月、約１１カ月、約１５カ月、約１８カ月、約２１カ月、約２４カ月、約３０カ月又は約３６カ月、約４０℃、約３０℃、約２５℃、約５℃、約－２０℃又は約－３０℃において）の保存後、第２の製剤よりも凝集が少ない場合、第１の製剤（例えば、緩衝剤を含まない製剤又は緩衝剤を含む製剤であって、製剤のｐＨは、緩衝剤の緩衝能の範囲外である、製剤）は、第２の製剤（例えば、緩衝剤を含む製剤であって、製剤のｐＨは、緩衝剤の緩衝能の範囲内である、製剤）よりも安定である。

【0050】

製剤の安定性は、例えば、米国特許第８，０９２，８０３号明細書及び同第９，９８２，０３２号明細書並びに国際公開第２０１７１２９６８５号パンフレット及び同第２０１８０９４３１６号パンフレットに記載されているような当該技術分野で公知の任意の方法により判断され得る。一実施形態において、製剤の安定性は、クロマトグラフィー、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、例えばサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）若しくはサイズ排除超高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＵＨＰＬＣ）又は疎水性高速液体クロマトグラフィー（ＨＩ－ＨＰＬＣ）によって判断され、ここで、ストレスプロセス及び／又は保存条件前の第１の製剤からの第１のピークの変化又は差が、ストレスプロセス及び／又は保存条件後の同じ製剤からの第２のピークと比較して小さく、ストレスプロセス及び／又は保存条件前後のそれぞれの第１のピーク及び第２のピークの変化又は差が大きい第２の製剤と比較して小さいことは、第１の製剤が第２の製剤よりも安定していることを示す。

【0051】

別の実施形態において、製剤の安定性は、製剤の濁度（例えば、ＯＤ_４０５ｎｍでの測定など）、回収されたタンパク質の割合（例えば、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ－ＨＰＬＣ）により判断される）及び／又はタンパク質の純度（例えば、ＳＥ－ＨＰＬＣにより測定される）によって測定され、ここで、より低い濁度、より高い回収率及びより高い純度が高い安定生を示す。いくつかの実施形態において、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（還元又は非還元）を使用して、製剤の安定性を判断する。いくつかの実施形態において、非対称フロー式フィールドフローフラクショネーション（ＡＦ４）が使用される。他の実施形態において、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、例えばキャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）が使用される。第２の製剤と比較して、第１の製剤でのフラグメントの増加及び／又はＩＥＦの変化は、第１の製剤の安定性が低いことを示す。任意の１つの方法又は方法の組み合わせを使用して製剤の安定性を判断することができる。

【0052】

詳細な説明及び以下の実施例は、本発明を例示するものであり、本発明をそれに限定するものとして解釈されるべきではない。本発明の説明に基づき、当業者によって様々な変更形態及び修正形態がなされ得、またそのような変更形態及び修正形態は、本発明に含まれる。

【実施例】

【0053】

実施例１：ｐＨ６．２のアセテート製剤のアフリベルセプト安定性
アフリベルセプトの安定性を、アセテートの理想的な緩衝能の範囲外のｐＨで濃度を変化させるアセテート製剤中で試験した。緩衝剤は、ｐＫａ値を中心におよそ±１のｐＨ単位の緩衝能力範囲を有するため、アセテートのｐＫａ値は、４．８であり、約３．８～約５．８のｐＨ範囲の緩衝能を有する。アセテート濃度を変化させて、アフリベルセプトのｐＨ及び安定性プロファイルを維持する能力に対するアセテート濃度の影響を試験した。Ｅｙｌｅａ（登録商標）は、ｐＨ６．２において、１０ｍＭリン酸ナトリウム、４０ｍＭ塩化ナトリウム、５％スクロース、０．０３％ポリソルベート２０中の４０ｍｇ／ｍＬアフリベルセプトとして製剤化されており、この製剤は、比較のために含まれた（製剤８）。

【0054】

４０ｍｇ／ｍｌのアフリベルセプトを、表１で指定された製剤とバッファー交換した。バッファー交換後、界面活性剤を異なる製剤に添加した。バッファー交換の性能は、浸透圧、タンパク質濃度及びｐＨを試験することにより検証した。４０℃のストレス条件で最大２週間保存する前に、各製剤に濾過、３回の凍結／融解サイクル及び落下衝撃プロセスストレスを行った。

【0055】

【表1】

【0056】

表１の各製剤に関するｐＨを０、１週及び２週の時点で測定し、表２に示す。また、製剤についてのＴ＝０及びＴ＝１週のｐＨ間のｐＨ差又はデルタ並びにＴ＝０及びＴ＝２週間のｐＨ差又はデルタを表２に示す。

【0057】

【表2】

【0058】

表２に示すように、Ｔ＝０と、それに続く４０℃において保存した２週間との間のｐＨ差は、最大０．２のｐＨ単位であり、典型的な製造のばらつき（通常、±０．３ｐＨ単位）内であり、アフリベルセプトの品質属性に影響を与えることが予想されないｐＨシフトである。更に、その緩衝能ｐＨ内に緩衝剤を含む製剤８は、０．１ｐＨ単位のシフトも示した。したがって、活性緩衝剤を含まない製剤（すなわち緩衝剤の緩衝能の範囲外のｐＨを有するため、活性緩衝剤ではない緩衝剤を含む製剤）は、活性緩衝剤を含む製剤と同じ程度にｐＨを維持することができた。

【0059】

表１に記載された製剤のタンパク質安定性を判断するために、サイズ排除超高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＵＨＰＬＣ）によって製剤を試験し、バッファー交換後及び保存中の凝集パターンを分析した。ＳＥＣ－ＵＨＰＬＣは、流体力学的体積の違いに基づいて、タンパク質を分離する。より大きい流体力学的体積を有する分子は、より小さい体積を有する分子よりも早く溶出する。試料をＳＥ－ＵＨＰＬＣカラム上にロードし、均一濃度で分離し、溶離液をＵＶ吸光度でモニタリングした。統合された総面積と比較した分離された各成分のパーセンテージを計算することによって純度を決定した。ＳＥＣ－ＵＨＰＬＣで測定された製剤のメインピーク値（パーセンテージなど）が高いほど、凝集のレベルが低いことを示すため、製剤の安定性が高くなる。安定性の向上の別の兆候は、別の製剤と比較して、最初の時点とその後の時点との間のメインピーク値の変化がないことである。

【0060】

表１の各製剤に関するメインピークのパーセンテージを、４０℃で保存された製剤について０、１週及び２週の時点で測定し、表３に示す。また、製剤についてのＴ＝０及びＴ＝１週のメインピークパーセンテージ間の差又はデルタ値並びにＴ＝０及びＴ＝２週のメインピークパーセンテージ間の差又はデルタ値を表３に示す。

【0061】

【表3】

【0062】

向上した安定性プロファイルは、凝集レベルの低減によって示され、したがってメインピーク値が高く、デルタ値が低くなる。驚くべきことに、アセテートの理想的な緩衝能ｐＨ範囲の範囲外のｐＨであった全てのアセテートバッファー製剤（製剤１～７）は、ホスフェートの理想的な緩衝能ｐＨ範囲の範囲内のｐＨであったホスフェートバッファー製剤（製剤８）と比較して凝集レベルの低減を示した。また、驚くべきことに、結果は、図１に示すように、アセテート濃度の低減と凝集レベルの低減との間に強い相関関係があり、したがってアフリベルセプト安定性が向上していることを示した。

【0063】

実施例２：緩衝剤を含まない製剤のアフリベルセプト安定性
凝集レベルにより判断したように、アフリベルセプトの安定性は、アセテートの理想的な緩衝能範囲の範囲外のｐＨを有する製剤において、アセテート濃度が低いほど改善されることを実施例１は示した。したがって、緩衝剤を含まない製剤を試験して、緩衝剤を含まない製剤におけるアフリベルセプトの安定性を判断した。

【0064】

緩衝剤が存在しない製剤において、アフリベルセプトの安定性及び製剤が目標ｐＨに到達して維持する能力を試験するために、アフリベルセプトを、ＣＥＸカラムを用いて細胞培養物から１００ｍＭのＮａアセテート、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０に３．６ｍｇ／ｍＬで精製した。組成物の目標ｐＨは、それぞれｐＨ５．０、５．５、５．８、６．２、６．４又は６．８であった。しかし、滴定される場合、ｐＨは、それぞれ５．０、５．５、６．０、６．２、６．５及び６．９（表４）であった。次いで、タンパク質を４０ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、５％スクロース、５％トレハロース製剤バッファーとバッファー交換した。バッファー交換後のｐＨ及びタンパク質濃度を試験し、試料を４０℃で最大２週間のストレス条件で保存した。

【0065】

【表4】

【0066】

目標ｐＨと、バッファー交換前のｐＨ（開始ｐＨ）とバッファー交換後のｐＨの差との間の相関関係を図２に示す（図２Ａは、目標ｐＨとの相関関係を示し、図２Ｂは、滴定ｐＨとの相関関係を示す）。開始ｐＨとバッファー交換後のｐＨとの間には、最大０．４単位の差があった。開始ｐＨとバッファー交換後のｐＨとの間の差は、図２Ｂで示すように、線形相関を有する。したがって、目標ｐＨは、開始ｐＨを調節することによって得ることができる。

【0067】

表４の各製剤についてのバッファー交換前、バッファー交換及びＵＦ／ＤＦ後、４０℃で１週間及び２週間のｐＨを表５に示す。

【0068】

【表5】

【0069】

ｐＨは、表５に示されるようなストレス条件で保存する期間にわたって安定を維持した。製剤のｐＨは、４０℃での保存１週間後、製剤ＶＩの０．１単位減少を除いて同じままであった。４０℃において２週間後、ｐＨは、典型的な製造のばらつき（通常、±０．３ｐＨ単位）内であり、アフリベルセプトの品質属性に影響を与えることが予想されないｐＨシフトである０．１～０．２単位ずつ低下した。

【0070】

表４で記載された製剤の安定性を判断するために、実施例１で記載されるように、ＳＥＣ－ＵＨＰＬＣによって製剤を試験した。ＳＥＣ－ＵＨＰＬＣで測定された製剤のメインピーク値（パーセンテージなど）が高いほど、凝集のレベルが低いことを示すため、製剤の安定性が高くなる。安定性の向上の別の兆候は、別の製剤と比較して、最初の時点とその後の時点との間のメインピーク値の変化がないことである。

【0071】

表４の各製剤についてのメインピークのパーセンテージを、４０℃で保存された製剤について０、１週及び２週（それぞれＴ＝０、Ｔ＝１ｗ、Ｔ＝２ｗ）の時点で測定し、表６に示す。また、製剤についてのＴ＝０及びＴ＝１週のメインピークパーセンテージ間の差又はデルタ値並びにＴ＝０及びＴ＝２週のメインピークパーセンテージ間の差又はデルタ値を表６に示す。

【0072】

【表6】

【0073】

表６は、最も低いｐＨ（製剤Ｉ）を除いて、ｐＨ上昇とパーセントメインピークの減少との間に相関関係があることを示す。ｐＨが低下すると、低減した凝集レベルにより判断されるように、アフリベルセプトの安定性が上昇する。

【0074】

実施例３：緩衝剤を含まず、等張化剤及び／若しくは界面活性剤を含むか又は含まない製剤のアフリベルセプト安定性
実施例２は、アフリベルセプトが、凝集レベルにより判断されるように、緩衝剤を含まない製剤で安定であることを示した。ｐＨ６．２の緩衝剤を含まない製剤における塩及び界面活性剤のアフリベルセプトの安定性への効果を試験し、ｐＨ６．２の緩衝剤を含有する製剤と比較した。

【0075】

緩衝剤が存在しない製剤において、アフリベルセプトの安定性及び製剤が目標ｐＨに到達して維持する能力を試験するために、アフリベルセプトを、ＣＥＸカラムを用いて細胞培養物から１００ｍＭのＮａアセテート、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０に６．５ｍｇ／ｍＬで精製した。組成物のｐＨは、最終目標ｐＨ６．２を達成するように、ｐＨ６．４まで調節され、実施例２で観察された、バッファー交換前のｐＨとバッファー交換後のｐＨとの間のｐＨドリフトを計算した。次いで、タンパク質を４０ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、表７に示される製剤とバッファー交換した。バッファー交換後、界面活性剤を異なる製剤に添加した。バッファー交換後のｐＨ及びタンパク質濃度を試験し、試料を４０℃において最大２週間のストレス条件で保存した。Ｅｙｌｅａ（登録商標）は、ｐＨ６．２において、１０ｍＭリン酸ナトリウム、４０ｍＭ塩化ナトリウム、５％スクロース、０．０３％ポリソルベート２０中の４０ｍｇ／ｍＬアフリベルセプトとして製剤化されており、緩衝剤を含むこの製剤は、比較のために含まれた（製剤Ａ）。

【0076】

【表7】

【0077】

表７の各製剤についてのＴ＝０、１週及び２週でのｐＨを表８に示す。

【0078】

【表8】

【0079】

表７の製剤についての出発材料は、バッファー交換後の製剤のｐＨシフトに適応させるためにｐＨ６．４に調整され、Ｔ＝０での製剤ＡのｐＨは、６．４（表８）であり、目標ｐＨ６．２よりも高かった（表７）が、±０．３単位の製造ばらつきの範囲内であった。Ｔ＝０と、それに続く４０℃において保存した２週間との間の差は、最大０．２のｐＨ単位であり、典型的な製造のばらつきの範囲（通常、±０．３ｐＨ単位）内であり、アフリベルセプトの品質属性に影響を与えることが予想されないｐＨシフトである。更に、緩衝剤の存在は、緩衝剤を含まない製剤を用いた場合と同様に、０．１ｐＨ単位の違いをもたらした。したがって、試験した全ての製剤について、ｐＨは、ストレス条件下での保存にわたって安定したままであった。

【0080】

表７で記載された製剤の安定性を判断するために、実施例１で記載されるように、ＳＥＣ－ＵＨＰＬＣによって製剤を試験した。ＳＥＣ－ＵＨＰＬＣで測定された製剤のメインピーク値（パーセンテージなど）が高いほど、凝集のレベルが低いことを示すため、製剤の安定性が高くなる。安定性の向上の別の兆候は、別の製剤と比較して、最初の時点とその後の時点との間のメインピーク値の変化がないことである。

【0081】

表７の各製剤についてのメインピークのパーセンテージを、４０℃で保存された製剤について０、１週及び２週（それぞれＴ＝０、Ｔ＝１ｗ、Ｔ＝２ｗ）の時点で測定し、表９に示す。また、製剤についてのＴ＝０及びＴ＝１週のメインピークパーセンテージ間の差又はデルタ値並びにＴ＝０及びＴ＝２週のメインピークパーセンテージ間の差又はデルタ値を表９に示す。

【0082】

【表9】

【0083】

表９は、塩又は界面活性剤の存在に関わらず、緩衝剤を含まない全ての製剤が、緩衝剤を含む製剤（製剤Ａ）と比較してより高いメインピークパーセンテージを示し、凝集の減少又は安定性の向上を示したことを示す。それぞれ界面活性剤を含有及び含有しない製剤Ｂ及びＦ間の凝集レベルを比較する場合、匹敵するパーセントメインピークが観察され、緩衝剤を含まないアフリベルセプト製剤は、ＳＥ－ＨＰＬＣにより測定されるその凝集の観点から、界面活性剤の有無に関わらず安定していることを示す。

【0084】

塩濃度とパーセントメインピークの減少との間には、図３で見られるように、直接的相関関係が観察される。しかし、緩衝剤を含まない全ての製剤は、緩衝製剤（製剤Ａ）と比較して凝集レベルが低かった。

【0085】

実施例４：３つのより大規模の検討についての緩衝剤を含まない製剤のアフリベルセプト安定性
実施例１～３は、小規模な検討であり；約２～１０ｍＬはバッファー交換が行われ、約８０μＬ～約２８０μＬは、安定性を確保した。先行する実施例で試験された製剤のいくつかを、より大規模への結果の適用性を実証するために３つの別々の検討で大規模に検討した（表１０）。Ｅｙｌｅａ（登録商標）は、ｐＨ６．２において、１０ｍＭリン酸ナトリウム、４０ｍＭ塩化ナトリウム、５％スクロース、０．０３％ポリソルベート２０中の４０ｍｇ／ｍＬアフリベルセプトとして製剤化されており、緩衝剤を含み、且つ緩衝剤の緩衝範囲内のｐＨであるこの製剤は、３つの検討（製剤ａ、ｆ及びｊ）の全ての比較のために含まれた。１００ｍＬ～１０００ｍＬでバッファー交換を実施し、バッファー交換後、界面活性剤を異なる製剤に添加した。バッファー交換後のｐＨ、浸透圧及びタンパク質濃度を試験し、適切なバッファー交換の実行を確保した。異なる製剤を、凍結－融解、混合、濾過、ホールド、充填、光露光及び輸送シミュレーション（振動、圧力及び落下衝撃ストレスを含む）を含む様々なプロセスストレスにかけた。プロセスストレスに続いて、全ての製剤からの試料を様々な保存温度：４０℃、３０℃、２５℃、５℃及び－３０℃で安定させた。

【0086】

【表10】

【0087】

Ｔ＝０及び様々な時点並びに様々な温度でのｐＨは、表１１Ａ及び表１１Ｂに示す。表１１Ａ及び表１１Ｂで試験された全ての条件の最大及び最小ｐＨ並びに全ての製剤についてのＴ＝０と様々な条件との最大差を表１１Ｃに示した。

【0088】

【表11】

【0089】

【表12】

【0090】

【表13】

【0091】

表１１Ｃは、緩衝剤の存在に関わらず、全ての製剤についてのＴ＝０と様々な条件との最大差が、最大６カ月という長期間保存にわたって０．２ｐＨ単位であることを示す。これは、緩衝剤を含まない製剤が、様々な温度保存条件下での長期間保存にわたり、安定したｐＨを維持できることを示す。

【0092】

表１０で記載された製剤の安定性を判断するために、実施例１で記載されるように、ＳＥＣ－ＵＨＰＬＣによって製剤を試験した。ＳＥＣ－ＵＨＰＬＣで測定された製剤のメインピーク値（パーセンテージなど）が高いほど、凝集のレベルが低いことを示すため、製剤の安定性が高くなる。安定性の向上の別の兆候は、別の製剤と比較して、最初の時点とその後の時点との間のメインピーク値の変化がないことである。結果を表１２Ａ及び表１２Ｂ並びに図４で示す。

【0093】

【表14】

【0094】

【表15】

【0095】

表１２Ａ及び表１２Ｂに示すように、３つ全ての検討（それぞれ検討１、２及び３について製剤ａ～ｅ、ｆ～ｉ及びｊ～ｋ）について、各検討で緩衝剤を含まない製剤（緩衝剤を含むが、緩衝剤の緩衝能の範囲外であるｐＨの製剤を含む）は、試験された全ての安定性条件下において、Ｅｙｌｅａ（登録商標）製剤（それぞれ製剤ａ、ｆ及びｊ）と比較して凝集が低減されているか又は同等であった。

【0096】

加えて、製剤の不可視粒子レベルを光遮蔽（ＨＩＡＣ）により試験し、粒子を生成するタンパク質の傾向に対する製剤の影響を検討した。製剤ａ～ｋの１ｍＬ当たりの２μｍ、５μｍ、１０μｍ、２５μｍ及び５０μｍの粒子数の結果をそれぞれ表１３Ａ～表１３Ｅに示す。

【0097】

【表16】

【0098】

【表17】

【0099】

【表18】

【0100】

【表19】

【0101】

【表20】

【0102】

緩衝剤を含まない製剤（緩衝剤を含むが、緩衝剤の緩衝能の範囲外であるｐＨの製剤を含む）は、緩衝剤を含むが、緩衝剤の緩衝能の範囲内のｐＨを有する製剤（すなわち製剤ａ、ｆ及びｊ）と有意に違いがない不可視カウントを示した。

【0103】

本発明が様々な実施形態の観点から記載されている一方、変更形態及び修正形態が当業者に想到されることが理解される。したがって、添付の特許請求の範囲は、特許請求される本発明の範囲内にあるそのような均等な変形形態の全てを包含することを意図する。加えて、本明細書で使用される項目見出しは、単に構成的な目的のためのものであり、記載する主題を限定すると解釈すべきではない。

【0104】

本出願に引用された全ての参照文献は、あらゆる目的のために参照により明示的に本明細書に組み込まれる。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【配列表】

0007536640000001.app