特許 7536649 キメラ抗原受容体で修飾されたＮＫ－９２細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-08-09

(45)【発行日】2024-08-20

(54)【発明の名称】キメラ抗原受容体で修飾されたＮＫ－９２細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20240813BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240813BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240813BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240813BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240813BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240813BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20240813BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240813BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20240813BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20240813BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10 ZNA

A61K35/17

A61K48/00

A61K39/395 L

A61K39/395 T

A61P35/00

A61P35/02

A61P31/12

A61K45/00

C12N5/0783

C12N15/09 Z

【請求項の数】 11

(21)【出願番号】P 2020554246

(86)(22)【出願日】2019-05-21

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-07-26

(86)【国際出願番号】 US2019033411

(87)【国際公開番号】W WO2020096646

(87)【国際公開日】2020-05-14

【審査請求日】2021-12-01

(31)【優先権主張番号】62/756,395

(32)【優先日】2018-11-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/756,402

(32)【優先日】2018-11-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】520393015

【氏名又は名称】イミュニティーバイオ、インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＩｍｍｕｎｉｔｙＢｉｏ，Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】100120031

【弁理士】

【氏名又は名称】宮嶋 学

(74)【代理人】

【識別番号】100120617

【弁理士】

【氏名又は名称】浅野 真理

(74)【代理人】

【識別番号】100126099

【弁理士】

【氏名又は名称】反町 洋

(72)【発明者】

【氏名】ボイセル，ローラン エイチ．

(72)【発明者】

【氏名】クリンゲマン，ハンス ジー．

【審査官】山本 匡子

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１８－５１３６９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１７／１７２９８１（ＷＯ，Ａ２）

【文献】特表２０１７－５０４６０１（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１８／０６４５９４（ＷＯ，Ａ２）

【文献】Clemenceau B, et al.，In Vitro and In Vivo Comparison of Lymphocytes Transduced with a Human CD16 or with a Chimeric Antigen Receptor Reveals Potential Off-Target Interactions due to the IgG2 CH2-CH3 CAR-Spacer，J Immunol Res，vol.2015，2015年11月，article ID 482089

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＣＡＰＬＵＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／

ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｅｓｅｑ

Ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｇｅｎｅｓｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

トランスフェクトされた組換えプラスミド上にコードされ、且つ単一ポリペプチド鎖中に、細胞外結合ドメイン、配列番号６のポリペプチド配列を有するヒンジドメイン、配列番号７のポリペプチド配列を有する膜貫通ドメイン、及び配列番号１のポリペプチド配列を有するＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを含む膜結合組換えキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有し、
ここで前記細胞外結合ドメインが、
ＣＤ２０結合ポリペプチド配列、
ＧＤ２結合ポリペプチド配列、
ＨＥＲ-２結合ポリペプチド配列、
ＣＤ３０結合ポリペプチド配列、
ＥＧＦＲ結合ポリペプチド配列、
ＦＡＰ結合ポリペプチド配列、
ＣＤ３３結合ポリペプチド配列、
ＣＤ１２３結合ポリペプチド配列、
ＰＤ－Ｌ１結合ポリペプチド配列、
ＩＧＦ１Ｒ結合ポリペプチド配列、
ＣＳＰＧ４結合ポリペプチド配列、および
Ｂ７－Ｈ４結合ポリペプチド配列からなる群から選択されるポリペプチド配列を有するｓｃＦｖ部分を含んでなり、
ＮＫ－９２細胞である、
遺伝子組換えＮＫ細胞。

【請求項2】

前記ヒンジドメイン及び／又は前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８ヒンジドメイン及び／又はＣＤ２８膜貫通ドメインを含む、請求項１に記載の遺伝子組換えＮＫ細胞。

【請求項3】

膜結合組換えＣＤ１６をさらに有する、請求項１または２に記載の遺伝子組換えＮＫ細胞。

【請求項4】

小胞体保持配列を有する組換えサイトカインをさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の遺伝子組換えＮＫ細胞。

【請求項5】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする組換え核酸を含み、
ここで前記組換え核酸が、トランスフェクトプラスミドであり、
ここで前記ＣＡＲが、単一ポリペプチド鎖中に、細胞外結合ドメイン、配列番号６のポリペプチド配列を有するヒンジドメイン、配列番号７のポリペプチド配列を有する膜貫通ドメイン、及び配列番号１のポリペプチド配列を有するＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを含み、
ここで前記細胞外結合ドメインが、
ＣＤ２０結合ポリペプチド配列、
ＧＤ２結合ポリペプチド配列、
ＨＥＲ-２結合ポリペプチド配列、
ＣＤ３０結合ポリペプチド配列、
ＥＧＦＲ結合ポリペプチド配列、
ＦＡＰ結合ポリペプチド配列、
ＣＤ３３結合ポリペプチド配列、
ＣＤ１２３結合ポリペプチド配列、
ＰＤ－Ｌ１結合ポリペプチド配列、
ＩＧＦ１Ｒ結合ポリペプチド配列、
ＣＳＰＧ４結合ポリペプチド配列、および
Ｂ７－Ｈ４結合ポリペプチド配列からなる群から選択されるポリペプチド配列を有するｓｃＦｖ部分を含んでなり、
ＮＫ－９２細胞である、遺伝子組換えＮＫ細胞。

【請求項6】

前記ヒンジドメイン及び／又は前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８ヒンジドメイン及び／又はＣＤ２８膜貫通ドメインを含む、請求項５に記載の遺伝子組換えＮＫ細胞。

【請求項7】

前記ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインが、配列番号２の核酸配列によりコードされる、請求項５または６に記載の遺伝子組換えＮＫ細胞。

【請求項8】

それを必要とする患者におけるがんの治療のための、請求項１～７のいずれか一項に記載の遺伝子組換えＮＫ細胞を含む医薬組成物。

【請求項9】

ウイルスがんワクチン、細菌がんワクチン、酵母がんワクチン、Ｎ－８０３、抗体、幹細胞移植、及び腫瘍標的サイトカインからなる群から選択される少なくとも１つの追加的な治療用実体と組み合わせて使用するための、請求項８に記載の医薬組成物。

【請求項10】

前記がんが、白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、慢性白血病、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ性白血病、真性多血症、リンパ瘍、ホジキン病、非ホジキン病、多発性骨髄瘍、ワルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、線維肉瘍、粘液肉瘍、脂肪肉瘍、軟骨肉瘍、骨原性肉瘍、脊索瘍、血管肉瘍、内皮肉腫、リンパ管肉瘍、リンパ管内皮肉腫、滑膜瘍、中皮瘍、ユーイング腫瘍、平滑筋肉瘍、横紋筋肉腫、結腸がん、膵がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、皮脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性肺がん、腎細胞がん、肝腫瘍、胆管がん、絨毛がん、セミノーマ、胚性癌瘍、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠瘍、星状細胞瘍、髄芽瘍、頭蓋咽頭瘍、上衣瘍、松果体瘍、血管芽瘍、聴神経腫瘍、乏突起神経膠瘍、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫及び網膜芽細胞腫から選択される、請求項８又は９に記載の医薬組成物。

【請求項11】

がん又はウイルス感染の治療のための、請求項５～７のいずれか一項に記載の遺伝子組換えＮＫ細胞を含む医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、シリアル番号が米国仮特許出願第６２／７５６，３９５号明細書及び米国仮特許出願第６２／７５６，４０２号明細書（双方とも２０１８年１１月６日に出願）である我々の同時係属中の米国仮特許出願に対する優先権を主張する。

【0002】

配列表
サイズが１３４ｋｂである、１０４０７７．０００３ＰＣＴ５ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５という名称の配列表のＡＳＣＩＩテキストファイルの内容は、２０１９年５月２０日に作成され、本願とともにＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されたものであり、その全体が参照により援用される。

【0003】

発明の分野は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子組換え免疫能細胞、特にＦｃイプシロン受容体ガンマ（ＦｃεＲＩγ）シグナル伝達ドメインを有するＣＡＲを発現する修飾ＮＫ－９２細胞である。

【背景技術】

【0004】

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、自然免疫系の有意な成分を構成する細胞傷害性リンパ球である。ほとんどの場合、ＮＫ細胞は、循環リンパ球の約１０～１５％を表し、標的化細胞、例えばウイルス感染細胞及び多数の悪性細胞に結合し、それらを殺滅する。ＮＫ細胞殺傷は、特定の抗原に関して非特異的であり、予め免疫感作を行うことなく生じ得る。標的化細胞の殺滅は、典型的には、パーフォリン、グランザイム、及びグラニュライシンを含む細胞溶解性タンパク質によって媒介される。

【0005】

自家ＮＫ細胞は、治療用実体として用いられている。そのため、ＮＫ細胞は、全血の末梢血リンパ球画分から単離され、十分な数の細胞を得るために細胞培養下で拡大され、次に対象に再注入される。自家ＮＫ細胞は、少なくともいくつかの場合、生体外治療とインビボ治療の双方において中等度の有効性を示している。しかし、自家ＮＫ細胞の単離及び増殖は、時間及びコスト集約的である。さらに、自家ＮＫ細胞治療は、すべてのＮＫ細胞が細胞溶解性であるとはいえないという事実により、さらに制限される。

【0006】

これら困難の少なくとも一部は、非ホジキンリンパ腫を患っている対象の血液中で発見され、そしてインビトロで不死化された細胞溶解性がん細胞株であるＮＫ－９２細胞の使用により克服することができる（Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ８：６５２－６５８（１９９４））。ＮＫ－９２細胞がＮＫ細胞誘導体である一方で、ＮＫ－９２細胞は、通常は正常なＮＫ細胞によって提示される阻害性受容体の大部分が欠如し、活性化受容体の大部分を保持する。しかし、ＮＫ－９２細胞は、ヒトにおいて正常細胞を攻撃しないばかりか、許容できない免疫拒絶応答を誘発することがない。これらの望ましい特徴に起因し、ＮＫ－９２細胞は、例えば国際公開第１９９８／０４９２６８号パンフレット又は米国特許出願公開第２００２／０６８０４４号明細書に記載の通り、詳細に特徴づけられ、特定がんの治療における治療薬として検討された。

【0007】

腫瘍細胞と同じ組織由来の正常細胞とを区別する表現型変化は、正常な細胞表面成分の減少又はその他（即ち、対応する正常な非がん組織において検出不能な抗原）の増加を含む、特定の遺伝子産物の発現における１つ以上の変化に関連することが多い。新生物又は腫瘍細胞において発現されるが、正常細胞において発現されない、又は新生物細胞において正常細胞内で見出されるレベルを実質的に超えるレベルで発現される抗原は、「腫瘍特異抗原」又は「腫瘍関連抗原」と称されている。かかる腫瘍特異抗原は、腫瘍表現型に対するマーカーとして役立つことがある。腫瘍特異抗原は、がん／精巣特異抗原（例えば、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＰＲＡＭＥ及びＮＹ－ＥＳＯ－１）、メラニン細胞分化抗原（例えば、チロシナーゼ、メランＡ／ＭＡＲＴ、ｇｐｌ００、ＴＲＰ－１及びＴＲＰ－２）、突然変異又は異常発現抗原（例えば、ＭＵＭ－１、ＣＤＫ４、βカテニン、ｇｐ１００－ｉｎ４、ｐ１５及びＮ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ）、及び腫瘍においてより高いレベルで発現される抗原（例えば、ＣＤ１９及びＣＤ２０）を含む。

【0008】

腫瘍特異抗原は、がん免疫療法に対する標的として用いられている。１つのかかる治療では、がん細胞に対する細胞傷害性を改善するため、Ｔ細胞及びＮＫ細胞を含む免疫細胞の表面上に発現されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が用いられる。ＣＡＲは、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインに連結された一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。ｓｃＦｖは、標的細胞（例えばがん細胞）上の抗原を認識し、それに結合し、エフェクター細胞活性化を誘発する。シグナル伝達ドメインは、該受容体による細胞内シグナル伝達にとって重要である免疫受容体チロシンに基づく活性化ドメイン（ＩＴＡＭ）を有する。

【0009】

Ｔ細胞において用いられるＣＡＲの第１世代は、１つの細胞質シグナル伝達ドメインを有した。例えば、Ｔ細胞における第１世代ＣＡＲの１つのバージョンが、１つのＩＴＡＭを有するＦｃイプシロン受容体ガンマ（ＦｃεＲＩγ）からのシグナル伝達ドメインを含んだ一方で、別のバージョンは、３つのＩＴＡＭを有するＣＤ３ζからのシグナル伝達ドメインを有した。インビボ及びインビトロ試験によると、ＣＤ３ζ ＣＡＲ Ｔ細胞が、腫瘍根絶時、ＦｃεＲＩγ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも効率的であることが示された（例えば、Ｈａｙｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６６：１８２－１８７；Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ，ｅｔ ａｌ．２０１０，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｖｏｌ．２０１０，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ９５６３０４）。次に、追加的試験によると、特定の同時刺激シグナルがかかる組換えＴ細胞の十分な活性化及び増殖に求められること、並びに第２世代及び第３世代ＣＡＲを複数のシグナル伝達ドメインと組み合わせて単一のＣＡＲにすることで、組換えＣＡＲ Ｔ細胞の有効性が増強されることが示された。試験対象のＴ細胞におけるそれらの大して望ましくない言語学的効果に起因し、第１世代ＣＡＲ及びＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインは、大部分が廃棄され、１つ以上の追加的なシグナル伝達ドメインと組み合わせてＣＤ３ζを用いる新しいより効率的なＣＡＲが支持された（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎ ２０１５，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．６，Ａｒｔｉｃｌｅ １９５）。

【0010】

より最近では、選択されたＣＡＲが、ＮＫ細胞においても発現されている。例えば、ＣＡＲ修飾ＮＫ－９２細胞は、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインのみを有する第１世代ＣＡＲを用いている。Ｂ細胞リンパ腫に対するＣＤ１９及びＣＤ２０、乳がん、卵巣がん、及び扁平上皮がんに対するＥｒｂＢ２、神経芽細胞腫に対するＧＤ２、及び多発性骨髄腫に対するＣＤ１３８を含むいくつかの抗原が、これらの第１世代ＣＡＲ－ＮＫ細胞により標的にされている。ＮＫ－９２株からの第２世代ＣＡＲ－ＮＫ細胞もまた、多発性がんに対するＥｐＣＡＭ、エプスタイン・バーウイルスに対するＨＬＡ－Ａ２ ＥＢＮＡ３複合体、多発性骨髄腫に対するＣＳ１、及びＨＥＲ２陽性上皮がんに対するＥｒｂＢ２を含むいくつかの抗原に対して作出されている。第２世代ＮＫ－９２ ＣＡＲにおいてＣＤ３ζとともに用いられる最も一般的な細胞内同時刺激ドメインが、ＣＤ２８である。しかし、ＣＤ２８ドメインの潜在的効果は、ＮＫ細胞がＣＤ２８を天然には発現しないことから不明確である。さらなる第２世代ＣＡＲは、ＮＫ細胞の持続性を改善するため、ＣＤ３ζとともに４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインを組み込んでいる。それ以外では、乳がん細胞に対して試験されたＣＤ３ζ単独、ＣＤ２８及びＣＤ３ζ、又は４－１ＢＢ及びＣＤ３ζと融合されたＥｒｂＢ２ ｓｃＦｖを用いて、異なる細胞内ドメインの機能性が比較された。第２世代構築物のいずれもが第１世代ＣＡＲと比べて殺滅を改善し、ＣＤ２８及びＣＤ３ζが６５％の標的溶解を有し、４－１ＢＢ及びＣＤ３ζが６２％を溶解し、且つＣＤ３ζ単独が標的の５１％を殺滅することが見出された。最近の試験において、４－１ＢＢ及びＣＤ２８細胞内ドメインについても、Ｂ細胞悪性腫瘍に対してＮＫ－９２細胞上で発現される抗ＣＤ１９ ＣＡＲを用いて比較した。さらにそれ以外では、ＣＤ３ζ／４－１ＢＢ構築物が細胞死滅及びサイトカイン産生においてＣＤ３ζ／ＣＤ２８と比べて有効でなく、ＣＤ２８及び４－１ＢＢ同時刺激ドメインの差次的効果が強調されることが見出された。

【0011】

第３世代ＮＫ－９２ ＣＡＲは、抗ＣＤ５ ｓｃＦｖとともに、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、及び４－１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインから構成され、また種々のＴ細胞白血病及びリンパ腫細胞株及び原発性腫瘍細胞に対する特異的且つ強力な抗腫瘍活性が示された。かかる細胞はまた、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）細胞株及び原発性腫瘍細胞の異種移植片マウスモデルにおいて疾患進行を阻害することができた（Ｔｒａｎｓｌ Ｒｅｓ．２０１７ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ；１８７：３２－４３）。さらなる例では、国際公開第２０１６／２０１３０４号パンフレット及び国際公開第２０１８／０７６３９１号パンフレットは、ＮＫ細胞及びＮＫ－９２細胞において発現される第３世代ＣＤ３ζ ＣＡＲの使用について教示している。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

しかし、ＮＫ細胞（及び特にＮＫ－９２細胞）は、Ｆｃ受容体を発現するようにＮＫ－９２細胞を改変できないという極めて多数の失敗によって明らかであるように、遺伝的に修飾することが困難であることが多い。かかる困難は、ＮＫ－９２細胞に、異種発現のため、複数の組換え遺伝子又は比較的大きい組換え核酸ペイロードがトランスフェクトされる場合、さらに複雑になる。加えて、ＮＫ－９２細胞は、外来性タンパク質（例えばＣＤ１６）の組換え発現に関しての有意な予測性の欠如も示す。機能的レベルについては、たいていの場合、標的化細胞傷害性を示す一方で、ほぼすべてのＣＡＲ ＮＫ－９２細胞が、高いエフェクター対標的細胞比を必要とする。

【0013】

したがって、たとえ極めて多数の組換えＮＫ－９２細胞が当該技術分野で公知であるとしても、それらのすべて又はほぼすべてが様々な困難に直面している。結果的に、高活性ＣＡＲを有意量で発現し、且つ単純で有効な様式で容易に培養可能である、ＣＡＲを発現するＮＫ－９２細胞が求められることは変わらない。

【課題を解決するための手段】

【0014】

発明者は、ＦｃεＲＩγを有するＣＡＲを発現するＮＫ－９２細胞が、意外にも、優れた細胞溶解活性を典型的には他の構築物と比べて比較的低いエフェクター対標的細胞比で示し、且つＦｃεＲＩγを有するＣＡＲの高レベルでの発現を示すことを発見している。さらに、かかる組換え細胞はまた、ＣＤ１６を望ましいレベルで発現し、刺激性サイトカインを発現するようにさらに修飾される場合、組換えＮＫ－９２細胞はまた、外因性ＩＬ－２を必要とすることなく容易に培養された。

【0015】

したがって、本発明の主題の一態様では、発明者は、単一ポリペプチド鎖中に、（ｉ）細胞外結合ドメイン、（ｉｉ）ヒンジドメイン、（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン、及び（ｉｖ）ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを含む膜結合組換えキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有する遺伝子組換えＮＫ細胞を検討している。最も典型的には、必然ではないが、ＮＫ細胞は、ＮＫ－９２細胞である。

【0016】

いくつかの実施形態では、細胞外結合ドメインは、腫瘍特異抗原（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＧＤ２、ＨＥＲ－２、ＣＤ３０、ＥＧＦＲ、ＦＡＰ、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＰＤ－Ｌ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＣＳＰＧ４、又はＢ７－Ｈ４）、腫瘍関連抗原（例えば、ＭＵＣ－２、ブラキュリ、ＣＥＡ）、又は患者及び腫瘍特異抗原（例えば、患者のＭＨＣ Ｉ及び／又はＭＨＣ ＩＩに対して高親和性を有するネオエピトープ）に特異的に結合してもよいｓｃＦｖを含む。或いは、細胞外結合ドメインはまた、ウイルス特異的抗原に特異的に結合してもよく、本明細書で検討される典型的なウイルスは、ＨＩＶウイルス、ＨＰＶウイルス、ＲＳＶウイルス、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、又はＨＣＶウイルスを含む。例えば、好適なウイルス抗原は、ＨＩＶウイルスのｇｐ１２０を含む。

【0017】

さらなる実施形態では、ヒンジドメイン及び／又は膜貫通ドメインは、ＣＤ８ヒンジドメイン及び／若しくはＣＤ２８膜貫通ドメインを含み、且つ／又はＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を有する。

【0018】

加えて、遺伝子組換えＮＫ細胞が膜結合組換えＣＤ１６（及び特にＣＤ１６の高親和性変異体）をさらに有してもよく、且つ／又は遺伝子組換えＮＫ細胞が小胞体保持配列を有する組換えサイトカインを発現してもよいことが検討される。

【0019】

したがって、異なる視点から見て、発明者はまた、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする組換え核酸を含む遺伝子組換えＮＫ細胞を検討しており、ここでＣＡＲは、単一ポリペプチド鎖中に、（ｉ）細胞外結合ドメイン、（ｉｉ）ヒンジドメイン、（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン、及び（ｉｖ）ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを含む。前述の通り、ＮＫ細胞がＮＫ－９２細胞であることが一般に好ましい。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、ＲＮＡであり、それはＣＤ１６及び／又は小胞体保持配列を有するサイトカインをさらにコードするポリシストロニックＲＮＡであってもよい。様々なドメインに関しては、上記と同じ検討事項が適用される。

【0020】

本主題のさらなる態様では、発明者はまた、それを必要とする患者におけるがんを治療する方法であって、本明細書で提示される遺伝子組換えＮＫ細胞を治療有効量で患者に投与し、それによりがんを治療するステップを含む方法を検討している。容易に理解されるように、検討された方法は、少なくとも１つの追加的な治療用実体、例えば、ウイルスがんワクチン、細菌がんワクチン、酵母がんワクチン（ｙｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅ）、Ｎ－８０３、抗体、幹細胞移植、及び／又は腫瘍標的サイトカインを投与するステップをさらに含むことになる。

【0021】

例えば、検討された方法によって治療されるがんは、白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、慢性白血病、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ性白血病、真性多血症、リンパ瘍、ホジキン病、非ホジキン病、多発性骨髄瘍、ワルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、固形腫瘍、例えば限定はされないが、肉腫及びがん、例えば、線維肉瘍、粘液肉瘍、脂肪肉瘍、軟骨肉瘍、骨原性肉瘍、脊索瘍、血管肉瘍、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉瘍、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑膜瘍、中皮瘍、ユーイング腫瘍、平滑筋肉瘍、横紋筋肉腫、結腸がん、膵がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、皮脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性肺がん、腎細胞がん、肝腫瘍、胆管がん、絨毛がん、セミノーマ、胚性癌瘍、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠瘍、星状細胞瘍、髄芽瘍、頭蓋咽頭瘍、上衣瘍、松果体瘍、血管芽瘍、聴神経腫瘍、乏突起神経膠瘍、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、メラノーマ、神経芽細胞腫及び網膜芽細胞腫を含む。

【0022】

同様に、発明者は、それを必要とする患者におけるウイルス感染を治療する方法であって、（ウイルス特異的抗原に特異的に結合することもある細胞外結合ドメインを有する）本明細書で提示される遺伝子組換えＮＫ細胞を治療有効量で患者に投与し、それによりウイルス感染を治療するステップを含む方法を検討している。当然ながら、検討された方法は、抗ウイルス薬を投与するステップをさらに含んでもよい。

【0023】

治療のタイプにかかわらず、患者の体表面積の１ｍ^２あたり約１×１０^８～約１×１０^１１個の細胞が患者に投与されることが検討される。

【0024】

したがって、発明者はまた、がん又はウイルス感染の治療における本明細書に提示されるような遺伝子組換えＮＫ細胞の使用を検討している。

【0025】

本主題の様々な目的、特徴、態様及び利点は、同様の数字が同様の成分を表す添付の図面とともに、好ましい実施形態の以下の詳細な説明からより明白になるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】試験対象の代表的なＣＤ１９－ＣＡＲの略図である。ＣＤ１９－ＣＡＲ変異体のすべては、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ領域（αＣＤ１９－ｓｃＦｖ）を含む細胞外ドメイン、ＣＤ８からのヒンジ領域（ＣＤ８ヒンジ）、及びＣＤ２８からの膜貫通ドメイン（ＣＤ２８ ＴＭ）を有した。ＣＤ１９ＣＡＲの細胞内ドメインは、指定通りに変更された。

【図2A】ｅＦ６６０で標識された抗ｓｃＦｖ抗体を用いたフローサイトメトリーにより測定されるときの、ＣＤ１９－ＣＡＲ ｍＲＮＡのトランスフェクション後に図１のＣＤ１９－ＣＡＲを発現するＮＫ－９２細胞の百分率についての代表的結果である。

【図2B】ｅＦ６６０で標識された抗ｓｃＦｖ抗体で標識された、ＣＤ１９－ＣＡＲを発現するＮＫ－９２細胞における蛍光強度中央値（ＭＦＩ）－バックグラウンドについての代表的結果である。

【図3A】５：１～０．３：１のエフェクター：標的比で、ＣＤ１９ＣＡＲを発現するＮＫ－９２細胞（エフェクター）により殺滅されたＮＫ－９２細胞感受性標的がん細胞（Ｋ５６２）の百分率についての代表的結果を示す。

【図3B】５：１～０．３：１のエフェクター：標的比で、ＣＤ１９ＣＡＲを発現するＮＫ－９２細胞（エフェクター）により殺滅されたＮＫ－９２細胞抵抗性のＣＤ１９陽性標的がん細胞（ＳＵＰ－Ｂ１５）の百分率についての代表的結果を示す。

【図4】２：１～０．２５：１のエフェクター：標的比で、ＳＵＰ－Ｂ１５標的細胞を用いる脱顆粒アッセイにおける、抗ＣＤ１０７ａ抗体で標識された、ＣＤ１９－ＣＡＲを発現するＮＫ－９２細胞（エフェクター）のＭＦＩについての代表的結果を示す。

【図5】実施例に記載される通り、ＩＶラージ腫瘍保有動物の代表的な生存曲線を示す。統計分析は、ログランク（マンテル・コックス）検定であった。^＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１。

【図6】ＩＶラージ腫瘍モデルにおける動物の体重変化についての代表的結果を示す。データは、平均±平均値の標準誤差である。平均値の標準誤差は、Ｎの平方根で除された標準偏差として算出された。

【図7】ＳＣラージモデルにおける代表的な腫瘍増殖曲線を示す。データは、平均±平均値の標準誤差である。統計学的解析は、二元分散分析とその後のチューキー検定による多重比較を用いて行われた；^＊＊＊，Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊，Ｐ＜０．０００１。

【図8】ＣＤ１９ ｔ－ｈａＮＫがＳＣラージ腫瘍保有マウスの肝臓における転移性疾患負荷を低減したことを示す代表的データを示す。パネルａ：１３日目の指定治療群からの動物の全肝画像。矢印は転移性病変を示す。肝臓は、写真撮影前の少なくとも２４時間、１０％ホルマリンで固定された。パネルｂ：指定日での（Ｈ＆Ｅ染色により評価された）肝臓における腫瘍細胞の病変の百分率の定量化。１３日目：^＊，Ｐ＝０．０２５７（不対両側ｔ－検定による）。１１日目及び１５日目における統計学的解析は、サンプルサイズが制限されたため、実施できなかった。生データについては表４を参照されたし。

【図9】ＳＣラージ腫瘍モデルにおける動物の体重変化についての代表的結果を示す。データは、平均±平均値の標準誤差である。

【図10】実施例に記載の通り、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ ＮＫ－９２細胞対媒体対照での腫瘍内治療後の、Ｌ１２１０－Ｌｕｃ腫瘍細胞が注射されたマウスの代表的なカプラン・マイヤー生存曲線を示す。

【図11】実施例に記載の通り、Ｌ１２１０－Ｌｕｃ腫瘍細胞が再負荷された完全奏効者対ナイーブ対照の腫瘍サイズについての代表的結果を示す。

【図12】実施例に記載の通り、ｍＣＤ１９－ＣＡＲ ＮＫ－９２細胞対媒体対照による腫瘍内治療後の、Ａ２０腫瘍細胞が注射されたマウスの代表的なカプラン・マイヤー生存曲線を示す。

【図13】実施例に記載の通り、Ａ２０腫瘍細胞が再負荷された完全奏効者対ナイーブ対照の腫瘍サイズについての代表的結果を示す。

【図14】ＢＴ－４７４細胞に対するＨＥＲ２．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞の細胞傷害性についての代表的結果を示す。

【図15】ＴＨＰ－１細胞に対するＣＤ３３．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞の細胞傷害性についての代表的結果を示す。

【図16】ＳＵＰ－Ｂ１５．ＰＤ－Ｌ１＋細胞に対するＰＤ－Ｌ１．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞の細胞傷害性についての代表的結果を示す。

【図17】Ｕ２５１細胞に対するＰＤ－Ｌ１．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞の細胞傷害性についての代表的結果を示す。

【図18】Ａ－５４９細胞に対するＥＧＦＲ．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞の細胞傷害性についての代表的結果を示す。

【図19】Ｋ５６２細胞に対するＣＤ１９．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞の細胞傷害性についての代表的結果を示す。

【図20】ＳＵＰ－Ｂ１５細胞に対するＣＤ１９．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞の細胞傷害性についての代表的結果を示す。

【図21】ＳＫＢｒ３細胞に対するＣＤ１９．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞のＡＤＣＣについての代表的結果を示す。

【図22】ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対するＩＧＦ１Ｒ．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞の細胞傷害性についての代表的結果を示す。

【図23】種々のがん細胞に対するＰＤ－Ｌ１．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞の細胞傷害性についての代表的結果を示す。

【図24】ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対するＰＤ－Ｌ１．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞の細胞傷害性についての代表的な比較結果を示す。

【図25】ＣＤ１６及びＣＤ１９．ＣＡＲの発現についての代表的結果を示す。

【図26】ＣＤ１９．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞の天然細胞傷害性についての代表的結果を示す。

【図27】ＣＤ１９．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞のＣＡＲ媒介性細胞傷害性についての代表的結果を示す。

【図28】ＣＤ１９．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞のＡＤＣＣについての代表的結果を示す。

【図29】ＣＤ１６及びＣＤ２０．ＣＡＲの発現についての代表的な比較結果を示す。

【図30】ＣＤ２０．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞の天然細胞傷害性についての代表的結果を示す。

【図31】ＣＤ１６及びＣＤ３３．ＣＡＲの発現についての代表的結果を示す。

【図32】ＣＤ３３．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞の天然細胞傷害性についての代表的結果を示す。

【図33】ＣＤ３３．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞のＣＡＲ媒介性細胞傷害性についての代表的結果を示す。

【図34】ＣＤ３３．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞のＡＤＣＣについての代表的結果を示す。

【図35】ＣＤ１６及びＥＧＦＲ．ＣＡＲの発現についての代表的結果を示す。

【図36】ＥＧＦＲ．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞の天然細胞傷害性についての代表的結果を示す。

【図37】ＥＧＦＲ．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞のＣＡＲ媒介性細胞傷害性についての代表的結果を示す。

【図38】ＥＧＦＲ．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞のＣＡＲ媒介性細胞傷害性についての代表的結果を示す。

【図39】ＥＧＦＲ．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞のＡＤＣＣについての代表的結果を示す。

【図40】ＣＤ１６及びＨＥＲ２．ＣＡＲの発現についての代表的結果を示す。

【図41】ＨＥＲ２．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞の天然細胞傷害性についての代表的結果を示す。

【図42】ＨＥＲ２．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞のＣＡＲ媒介性細胞傷害性についての代表的結果を示す。

【図43】ＨＥＲ２．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞のＡＤＣＣについての代表的結果を示す。

【図44】ＣＤ１６及びＰＤ－Ｌ１．ＣＡＲの発現についての代表的結果を示す。

【図45】ＰＤ－Ｌ１．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞の天然細胞傷害性についての代表的結果を示す。

【図46】ＰＤ－Ｌ１．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞のＣＡＲ媒介性細胞傷害性についての代表的結果を示す。

【図47】ＰＤ－Ｌ１．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞のＡＤＣＣについての代表的結果を示す。

【図48】ＣＤ１２３．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞のＣＡＲ媒介性細胞傷害性についての代表的結果を示す。

【図49】ＣＤ１２３．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞のＡＤＣＣについての代表的結果を示す。

【図50】ＣＤ１６及びＣＤ３０．ＣＡＲの発現についての代表的結果を示す。

【図51】ＣＤ３０．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞の天然細胞傷害性についての代表的結果を示す。

【図52】ＣＤ３０．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞のＣＡＲ媒介性細胞傷害性についての代表的結果を示す。

【図53】ＣＤ３０．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞のＡＤＣＣについての代表的結果を示す。

【図54】ＣＤ１６及びＢＣＭＡ．ＣＡＲの発現についての代表的結果を示す。

【図55】ＢＣＭＡ．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞のＣＡＲ媒介性細胞傷害性についての代表的結果を示す。

【図56】ＢＣＭＡ．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞のＡＤＣＣについての代表的結果を示す。

【図57】ＣＤ１６及びｇｐ１２０．ＣＡＲの発現についての代表的結果を示す。

【図58】ｇｐ１２０．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞のＧＰ１２０結合についての代表的結果を示す。

【図59】ｇｐ１２０．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞の天然細胞傷害性についての代表的結果を示す。

【図60】ｇｐ１２０．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞のＡＤＣＣについての代表的結果を示す。

【図61】ＣＤ１６及びＦＡＰ．ＣＡＲの発現についての代表的結果を示す。

【図62】ＦＡＰ．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞のＣＡＲ媒介性細胞傷害性についての代表的結果を示す。

【図63】ＣＳＰＧ４．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞におけるＣＳＰＧ４の発現についての代表的結果を示す。

【図64】ＣＳＰＧ４．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞のＣＡＲ媒介性細胞傷害性についての代表的結果を示す。

【図65】ＩＧＦ１Ｒ－ＣＡＲ、ＣＤ１６、及びＩＬ－２^ＥＲをコードする代表的なトリシストロン構築物を表す。

【発明を実施するための形態】

【0027】

現在まで、ＦｃεＲＩγを有するＣＡＲは、シグナル伝達ドメイン（例えばＣＤ３ζ）として、特に（第２世代及び第３世代ＣＡＲにおける）追加的なシグナル伝達ドメインと組み合わされると、より効率的と思われたことから、ＮＫ－９２細胞、他のＮＫ細胞株、又は内因性ＮＫ細胞において利用されていない。発明者は現在、１つのＩＴＡＭドメインのみを有する、ＦｃεＲＩγからの細胞内ドメインを含む第１世代ＣＡＲを発現するＮＫ－９２細胞が、ＣＡＲにより認識される抗原を発現するがん細胞に対して、３つのＩＴＡＭドメインを有する、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを有するＣＡＲを発現するＮＫ－９２細胞と比べて、たとえこれらのＩＴＡＭドメインが他のシグナル伝達ドメイン（即ち、第２世代又は第３世代ＣＡＲ）と組み合わされた場合であっても、等しいか又はより高い細胞傷害活性を有するという想定外の驚くべき発見をしている。特に、ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）は、その天然な状況下で、ジスルフィド結合を介して互いに共役される２つのγ鎖を含み、通常は好酸球、好塩基球、及び表皮ランゲルハンス細胞に限って発現される。発明者はまた、ＦｃεＲＩγからの細胞内ドメインを含むＣＡＲが、ＮＫ－９２細胞の表面上で、他のＣＡＲ、特にＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲよりも高いレベルで発現されたという想定外の発見をしている。

【0028】

したがって、本主題は、細胞表面上でキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変された遺伝子組換えＮＫ－９２細胞又はＮＫ細胞株を対象とする。最も典型的には、ＣＡＲは、Ｆｃイプシロン受容体ガンマ（ＦｃεＲＩγ）からの細胞内ドメインを含むが、他の実施形態では、ＣＡＲはまた、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）細胞内ドメインを含んでもよい。容易に理解されるように、ＣＡＲは、組換えＤＮＡ又はＲＮＡ分子から、ＮＫ－９２細胞により一過性に又は安定的に発現されてもよい。

【0029】

結果として、本主題の一態様では、ＮＫ細胞、ＮＫ－９２細胞又はＮＫ／ＮＫ－９２細胞株は、（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有する）ＦｃεＲＩγの細胞質ドメインを含むＮＫ－９２細胞の表面上にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する。代替的に、又は追加的に、ＣＡＲはまた、（例えば、配列番号１０のアミノ酸配列を有し、配列番号１１（コドン最適化）又は配列番号１２（非コドン最適化）の核酸によってコードされてもよい；完全長配列は配列番号４７で示される）ＣＤ３ゼータの細胞質ドメインを含んでもよい。別の態様では、ＮＫ又はＮＫ－９２細胞株は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸で形質転換されることが検討される。例えば、好ましい核酸は、（例えば、配列番号２を含むか又はそれからなる）ＦｃεＲＩγの細胞質ドメインをコードする。代替的に、又は追加的に、該核酸は、（例えば、配列番号１１（ヒト、コドン最適化）又は配列番号１２（ヒト）を含むか又はそれらからなる）ＣＤ３ゼータの細胞質ドメインをコードする。容易に理解されるように、ＣＡＲは、以下により詳述されるように、その細胞外結合ドメインを介してがん関連又はウイルス関連抗原を標的にしてもよい。

【0030】

さらに検討された実施形態では、ＮＫ又はＮＫ－９２細胞は、少なくとも１つのサイトカイン又はその変異体を発現するように修飾され得る。例えば、サイトカインは、組換え細胞により一過性に又は安定的に発現されてもよく、サイトカインは、小胞体保持シグナルを含んでもよい。所望される場合、ＮＫ又はＮＫ－９２細胞はまた、自殺遺伝子を発現するように修飾されてもよい（例えば、自殺遺伝子はチミジンキナーゼである）。いかなる理論にも拘束されないが、自殺遺伝子の発現が、ＮＫ－９２細胞の制御されない増殖を、好適な刺激の導入時に該細胞を選択的に殺滅するための機構を提供することにより阻止し得ることが考えられる。

【0031】

本主題の別の態様では、発明者はまた、それを必要とする患者におけるがんを治療する方法であって、本明細書に記載のようなキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変された修飾ＮＫ／ＮＫ－９２細胞又はＮＫ／ＮＫ－９２細胞株を治療有効量で患者に投与するステップを含む方法を検討している。異なる視点から見ると、発明者はまた、対象における腫瘍の治療での使用を意図した、好ましくはＦｃεＲＩγの細胞質ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する修飾ＮＫ／ＮＫ－９２細胞又はＮＫ／ＮＫ－９２細胞株を検討している。いくつかの実施形態では、該使用は、腫瘍を治療するため、本明細書に記載の修飾細胞又は細胞株を有効量で対象に投与するステップを含む。さらに他の実施形態では、腫瘍細胞を殺滅するためのインビトロ方法が検討され、該方法は、腫瘍細胞を本明細書に記載の修飾ＮＫ－９２細胞又はＮＫ－９２細胞株と接触させるステップを含んでもよい。いくつかの実施形態では、修飾ＮＫ－９２細胞又はＮＫ－９２細胞株は、腫瘍細胞上の抗原に結合するＣＡＲを発現する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、好ましくはＦｃイプシロン受容体ガンマ（ＦｃεＲＩγ）からの細胞内ドメインを含む。代替的に、又は追加的に、ＣＡＲは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）細胞内ドメインを含む。

【0032】

さらに他の実施形態では、それを必要とする患者におけるウイルス感染を治療する方法であって、本明細書に記載のようなＣＡＲを発現するＮＫ－９２細胞を治療有効量で患者に投与するステップを含む方法が記載される。

【0033】

この記載を読了すると、様々な代替的な実施形態及び代替的な用途において本発明を実施する仕方は、当業者にとって明白になるであろう。しかし、本発明の実施形態のすべてが本明細書に記載されるのではない。本明細書に提示される実施形態が、限定的でなく、あくまで例示的に提示されることは理解されるであろう。そのようなものとして、様々な代替的な実施形態のこの詳細な説明は、以下に示す通り、本発明の範囲又は幅を限定するように解釈されるべきではない。

【0034】

本発明が開示され、記載されるに先立ち、下記の態様が、特定の組成物、かかる組成物を調製する方法、又はかかるものとしてのその使用に限定されることなく、当然ながら変更されてもよいことは理解されるべきである。本明細書で用いられる用語法が、あくまで特定の態様を説明することを目的とし、限定が意図されないことも理解されるべきである。

【0035】

タイトル又はサブタイトルは、読者の利便性を目的として本明細書中で用いられてもよく、本発明の範囲に影響することは意図されない。加えて、本明細書で用いられるいくつかの用語は、より具体的には以下に定義される。

【0036】

好適なＮＫ細胞に関しては、すべてのＮＫ細胞が、本明細書での使用に適すると思われ、それ故、一次ＮＫ細胞（保存された細胞、拡大された細胞、及び／又は新鮮細胞）、不死化されている二次ＮＫ細胞、自家又は異種ＮＫ細胞（バンク、保存、新鮮など）、及び以下により詳細に記載されるような修飾ＮＫ細胞を含むことは注目されるべきである。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞がＮＫ－９２細胞であることが好ましい。ＮＫ－９２細胞株は、インターロイキン２（ＩＬ－２）の存在下で増殖することが発見された唯一の細胞株である（例えば、Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ８：６５２－６５８（１９９４）を参照）。ＮＫ－９２細胞は、好適な培地中で拡大後、広範な抗腫瘍細胞傷害性及び予想可能な収量を有するがんＮＫ細胞である。有利には、ＮＫ－９２細胞は、種々のがんに対して高い細胞溶解活性を有する。

【0037】

元のＮＫ－９２細胞株は、ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２８、ＣＤ４５、及びＣＤ５４表面マーカーを発現し、ＣＤ１、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、及びＣＤ３４マーカーを提示しなかった。培養中のかかるＮＫ－９２細胞の増殖は、インターロイキン２（例えば、ｒＩＬ－２）の存在に依存しており、そこでは増殖を維持するのにわずか１ＩＵ／ｍＬの用量で十分である。ＩＬ－７及びＩＬ－１２は、長期増殖を支持しないばかりか、ＩＬ－１α、ＩＬ－６、腫瘍壊死因子α、インターフェロンα、及びインターフェロンγを含む様々な他のサイトカインについては試験していない。一次ＮＫ細胞と比較し、ＮＫ－９２は、典型的には比較的低いエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比、例えば１：１であっても高い細胞傷害性を有する。代表的なＮＫ－９２細胞は、ＣＲＬ－２４０７という名称でアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）に寄託されている。

【0038】

したがって、好適なＮＫ細胞は、例えばＭＨＣクラスＩ分子との相互作用を低減又は消失させるために突然変異された１つ以上の修飾ＫＩＲを有してもよい。当然ながら、１つ以上のＫＩＲが欠失される、又は発現が（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどを介して）抑制されることがあることは注目されるべきである。最も典型的には、２つ以上のＫＩＲが突然変異、欠失、又は発現停止されることになり、特別に検討されるＫＩＲは、短い又は長い細胞質側末端を有し、２又は３のドメインを有するものを含む。異なる視点から見ると、修飾、発現停止、又は欠失されたＫＩＲは、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、及びＫＩＲ３ＤＳ１を含むことになる。かかる修飾細胞は、当該技術分野で周知のプロトコルを用いて調製されてもよい。或いは、かかる細胞はまた、ＮＫ細胞（‘活性化ナチュラルキラー細胞）としてＮａｎｔＫｗｅｓｔ（ＵＲＬ：ｗｗｗ．ｎａｎｔｋｗｅｓｔ．ｃｏｍを参照）から商業的に得てもよい。次に、かかる細胞は、以下にさらにより詳述される通り、ＣＡＲに対してさらに遺伝子組換えされてもよい。

【0039】

本主題の別の態様では、遺伝子改変ＮＫ細胞はまた、高親和性Ｆｃγ受容体（ＣＤ１６）を発現するように修飾されたＮＫ－９２誘導体であってもよい。Ｆｃγ受容体の高親和性変異体における配列は、当該技術分野で周知であり（例えば、Ｂｌｏｏｄ ２００９ １１３：３７１６－３７２５を参照；配列番号４３及び４４）、産生及び発現のすべての様式は、本明細書での使用に適すると思われる。かかる受容体の発現は、患者の腫瘍細胞（例えば、ネオエピトープ）、特定の腫瘍タイプ（例えば、ｈｅｒ２ｎｅｕ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡなど）に特異的である抗体、又はがんに関連する抗体（例えば、ＣＥＡ－ＣＡＭ）を用いて、腫瘍細胞の特異的標的化を可能にすると考えられる。有利には、かかる抗体は、市販されており、（例えば、Ｆｃγ受容体に結合された）細胞と併用可能である。或いは、かかる細胞はまた、ｈａＮＫ細胞としてＮａｎｔＫｗｅｓｔから商業的に得てもよい。次に、かかる細胞は、以下にさらにより詳述される通り、ＣＡＲに対してさらに遺伝子組換えされてもよい。

【0040】

したがって、本明細書での使用に適したＮＫ細胞は、（ＣＡＲ、ＣＤ１６若しくはその変異体、及びサイトカイン若しくはその変異体をコードするトリシストロン構築物がトランスフェクトされてもよい）ＮＫ－９２細胞、（ＣＡＲ及びＣＤ１６若しくはその変異体又はサイトカイン若しくはその変異体をコードする核酸がトランスフェクトされてもよい）ＣＤ１６若しくはその変異体又はサイトカイン若しくはその変異体を発現する遺伝子組換えＮＫ細胞又はＮＫ－９２細胞、並びに（ＣＡＲをコードする核酸がトランスフェクトされてもよい）ＣＤ１６若しくはその変異体及びサイトカイン若しくはその変異体を発現する遺伝子組換えＮＫ細胞又はＮＫ－９２細胞を含む。

【0041】

本明細書で検討されるＮＫ細胞の遺伝子修飾は、極めて多数の様式で実施することができ、すべての公知の様式は、本明細書での使用に適すると思われる。さらに、ＮＫ細胞にＤＮＡ又はＲＮＡがトランスフェクトされ得、トランスフェクションの特定の選択が少なくとも部分的には所望される組換え細胞のタイプ及びトランスフェクション効率に依存することは理解されるべきである。例えば、ＮＫ細胞が安定にトランスフェクトされることが所望される場合、ゲノムへの組込みのため、線状化ＤＮＡが細胞に導入されてもよい。他方、一過性トランスフェクションが所望される場合、環状ＤＮＡ又は線状ＲＮＡ（例えば、ポリＡ^＋テールを有するｍＲＮＡ）を用いてもよい。

【0042】

同様に、トランスフェクションの様式が、少なくとも部分的には、用いられる核酸のタイプに依存することは理解されるべきである。したがって、ウイルストランスフェクション、化学的トランスフェクション、機械的トランスフェクション方法はすべて、本明細書での使用に適すると思われる。例えば、一実施形態では、本明細書に記載のベクターは、一過性発現ベクターである。かかるベクターを用いて導入される外因性導入遺伝子は、細胞の核ゲノムに組み込まれず；それ故、ベクター複製の不在下で、外来導入遺伝子は、経時的に分解又は希釈されることになる。

【0043】

別の実施形態では、本明細書に記載のベクターは、細胞の安定なトランスフェクションを可能にする。一実施形態では、ベクターは、細胞のゲノムへの導入遺伝子の組み込みを可能にする。好ましくは、かかるベクターは、ポジティブ選択マーカーを有し、好適なポジティブ選択マーカーは、遺伝子を発現しない細胞を殺滅することになる条件下で細胞が増殖することを可能にする任意の遺伝子を含む。非限定例として、抗生物質耐性、例えばジェネテシン（Ｔｎ５からのｎｅｏ遺伝子）が挙げられる。

【0044】

代替的に、又は追加的に、ベクターは、プラスミドベクターである。一実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。当業者によって理解されるであろうが、任意の好適なベクターが使用可能であり、好適なベクターは当該技術分野で周知である。

【0045】

さらに他の実施形態では、細胞に、目的のタンパク質（例えばＣＡＲ）をコードするｍＲＮＡがトランスフェクトされる。ｍＲＮＡのトランスフェクションの結果、タンパク質の一過性発現がもたらされる。一実施形態では、ＮＫ－９２細胞へのｍＲＮＡのトランスフェクションは、細胞の投与の直前に実施される。一実施形態では、細胞の投与「直前」は、投与前の約１５分～約４８時間の間を指す。好ましくは、ｍＲＮＡのトランスフェクションは、投与前の約５時間～約２４時間に実施される。以下により詳述されるような少なくともいくつかの実施形態では、ＮＫ細胞へのｍＲＮＡのトランスフェクションの結果、意外にも高い割合のトランスフェクト細胞でＣＡＲの一貫した強力な発現がもたらされた。さらに、かかるトランスフェクト細胞はまた、比較的低いエフェクター対標的細胞比で高比細胞傷害性を示した。

【0046】

検討されるＣＡＲに関して、ＮＫ／ＮＫ－９２細胞が、ＣＡＲの一部を細胞表面上に曝露する一方で、シグナル伝達ドメインを細胞内空間内に維持する膜結合タンパク質としてＣＡＲを発現するように遺伝子組換えされることが認められる。最も典型的には、ＣＡＲは、少なくとも以下のエレメント（順に）：細胞外結合ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、及びＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを含むことになる。

【0047】

好ましい実施形態では、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＦｃεＲＩγのシグナル伝達ドメインを含むか又はそれからなる。例えば、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるか又は本質的にそれからなる。いくつかの実施形態では、ＦｃεＲＩγ細胞質ドメインは、唯一のシグナル伝達ドメインである。しかし、追加的なエレメント、例えば他のシグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、４－１ＢＢシグナル伝達ドメインなど）もまた含んでもよいことは理解されるべきである。これらの追加的なシグナル伝達ドメインは、ＦｃεＲＩγ細胞質ドメインの下流及び／又はＦｃεＲＩγ細胞質ドメインの上流に位置付けられてもよい。

【0048】

いくつかの実施形態では、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるか又は本質的にそれからなる。

【0049】

上記の通り、いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）のシグナル伝達ドメインを含む。一実施形態では、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達ドメインからなる。一実施形態では、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるか又は本質的にそれからなる。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるか又は本質的にそれからなる。

【0050】

ＣＡＲは、任意の好適な膜貫通ドメインを含んでもよい。一態様では、ＣＡＲは、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含む。一実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるか又は本質的にそれからなる。一実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるか又は本質的にそれからなる。一実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ膜貫通ドメイン、又はＦｃεＲＩγ膜貫通ドメインから選択される。

【0051】

ＣＡＲは、任意の好適なヒンジ領域を含んでもよい。一態様では、ＣＡＲは、ＣＤ８のヒンジ領域を含む。一実施形態では、ＣＤ８ヒンジ領域は、配列番号６のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるか又は本質的にそれからなる。一実施形態では、ＣＤ８ヒンジ領域は、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるか又は本質的にそれからなる。

【0052】

最も典型的には、必然的ではないが、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、目的の抗原に特異的に結合するｓｃＦｖ又は他の天然若しくは合成結合部分となる。特に好適な結合部分は、単一、二重、又は多重の標的特異性を有する小さい抗体断片、βバレルドメイン結合剤（ｂｅｔａ ｂａｒｒｅｌ ｄｏｍａｉｎ ｂｉｎｄｅｒｓ）、ページディスプレイ融合タンパク質（ｐａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）などを含む。他の好適な細胞外結合ドメインの中で、好ましいドメインは、腫瘍特異抗原、腫瘍関連抗原、又は患者及び腫瘍特異抗原に特異的に結合することになる。例えば、検討される抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＧＤ２、ＨＥＲ－２、ＣＤ３０、ＥＧＦＲ、ＦＡＰ、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＰＤ－Ｌ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＣＳＰＧ４、又はＢ７－Ｈ４を含む。さらなる腫瘍特異抗原が、非限定例として、米国特許出願公開第２０１３／０１８９２６８号明細書；国際公開第１９９９０２４５６６Ａ１号パンフレット；米国特許第７０９８００８号明細書；及び国際公開第２００００２０４６０号パンフレット（それらの各々は、それら全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されている。同様に、他の好ましいドメインは、（病原性）ウイルス特異的抗原、例えばＨＩＶウイルス（例えばｇｐ１２０）の抗原、ＨＰＶウイルス、ＲＳＶウイルス、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、又はＨＣＶウイルスに特異的に結合することになる。

【0053】

検討されるＣＡＲの構築に関しては、ＣＡＲが、例えば、国際公開第２０１４／０３９５２３号パンフレット；米国特許出願公開第２０１４／０２４２７０１号明細書；米国特許出願公開第２０１４／０２７４９０９号明細書；米国特許出願公開第２０１３／０２８０２８５号明細書及び国際公開第２０１４／０９９６７１号パンフレット（それらの各々は、それら全体が参照により本明細書中に援用される）に記載のような極めて多数の様式で改変され得ることは理解されるべきである。

【0054】

それ故、また異なる視点から見ると、検討されるＣＡＲは、特定のがんタイプに関連する抗原を標的にする。一実施形態では、がんは、白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、及び赤白血病を含む））及び慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病及び慢性リンパ性白血病）を含む）、真性多血症、リンパ腫（例えば、ホジキン病及び非ホジキン病）、多発性骨髄瘍、ワルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、固形腫瘍、例えば限定はされないが、肉腫及びがん、例えば、線維肉瘍、粘液肉瘍、脂肪肉瘍、軟骨肉瘍、骨原性肉瘍、脊索瘍、血管肉瘍、内皮肉腫、リンパ管肉瘍、リンパ管内皮肉腫、滑膜瘍、中皮瘍、ユーイング腫瘍、平滑筋肉瘍、横紋筋肉腫、結腸がん、膵がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、皮脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性肺がん、腎細胞がん、肝腫瘍、胆管がん、絨毛がん、セミノーマ、胚性癌瘍、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠瘍、星状細胞瘍、髄芽瘍、頭蓋咽頭瘍、上衣瘍、松果体瘍、血管芽瘍、聴神経腫瘍、乏突起神経膠瘍、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、又は網膜芽細胞腫である。

【0055】

したがって、検討されるＣＡＲは、一般に、ヒンジドメインに（直接的に）共役され、膜貫通ドメインに（直接的に）共役され、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインに（直接的に）共役された、細胞外結合ドメインの構造を有することになる。さらに検討される態様では、検討されるＣＡＲはまた、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインに追加的又は代替的に、１つ以上のシグナル伝達ドメインを含んでもよく、特に検討されるシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、４－１ＢＢシグナル伝達ドメイン、及びＣＤ２８シグナル伝達ドメインを含む。それ故、例えば、検討されるＣＡＲは、ヒンジドメイン（例えば、配列番号６などのＣＤ８ヒンジ）に共役され、次いで膜貫通ドメイン（例えば、配列番号７などのＣＤ２８ ＴＭ）に共役され、シグナル伝達ドメイン（例えば、配列番号１などのＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメイン、配列番号８などのＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、配列番号９などの４－１ＢＢシグナル伝達ドメイン、配列番号１０などのＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン）に共役された、配列番号４、２３～４２、及び４８～５９を有する結合ドメインのいずれか１つを含んでもよい。

【0056】

さらに検討される態様では、ＮＫ細胞は、１つ以上のサイトカインを発現するようにさらに遺伝子組換えされ、それによりサイトカイン及びＣＡＲが同じ組換え核酸上にコードされる場合の選択マーカーを提供し、且つ／又は組換え細胞を外因性ＩＬ－２と独立させてもよい。したがって、いくつかの実施形態では、ＮＫ－９２細胞は、少なくとも１つのサイトカインを発現するように修飾される。特に、少なくとも１つのサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、又はその変異体である。好ましい実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－２又はその変異体であり、特に好ましい変異体は、小胞体保持シグナルを含む（例えば、配列番号１８などのヒトＩＬ－２、又はそれに加えて配列番号１９などの小胞体保持シグナル）。例えば、ＩＬ－２遺伝子は、クローン化され、ＩＬ－２を小胞体に誘導するシグナル配列とともに発現される。これにより、ＩＬ－２を細胞外に放出することなく、ＩＬ－２の自己分泌活性化にとって十分なレベルでの発現が可能になる（例えば、Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．２００５ Ｆｅｂ；３３（２）：１５９－６４．）。或いは、サイトカイン（特にＩＬ－１５）の発現はまた、組換え細胞に自己分泌増殖シグナルを提供するだけでなく、発現されたＩＬ－１５の少なくとも一部が細胞から放出されることを可能にするのに十分な量でサイトカインが発現され、それにより免疫刺激シグナルをもたらすことになる程度であってもよい。例えば、かかる発現は、シグナルペプチド及び小胞体保持配列の双方を含むヒトＩＬ－１５配列を用いて達成されてもよい。小胞体保持ＩＬ－１５における代表的なＤＮＡ及びタンパク質配列は各々、配列番号７２及び配列番号７３で示される。

【0057】

所望される場合、検討される細胞はまた、自殺遺伝子を発現してもよい。用語「自殺遺伝子」は、自殺遺伝子を発現する細胞のネガティブ選択を可能にする導入遺伝子を指す。自殺遺伝子は、該遺伝子を発現する細胞が選択的薬剤の導入により殺滅されることを可能にする安全システムとして用いられる。これは組換え遺伝子が制御されない細胞増殖をもたらす突然変異を引き起こす場合に望ましい、即ち該細胞自体はかかる増殖を行う能力がある。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ｇｐｔ遺伝子、及び大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）Ｄｅｏ遺伝子を含むいくつかの自殺遺伝子系が、同定されている。典型的には、自殺遺伝子は、該細胞に対して病的効果を有しないタンパク質をコードするが、特定化合物の存在下で該細胞を殺滅することになる。したがって、自殺遺伝子は、典型的には系の一部である。

【0058】

一実施形態では、自殺遺伝子は、ＮＫ－９２細胞内で活性がある。一実施形態では、自殺遺伝子は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子である。ＴＫ遺伝子は、野生型又は突然変異体ＴＫ遺伝子（例えば、ｔｋ３０、ｔｋ７５、ｓｒ３９ｔｋ）であってもよい。ＴＫタンパク質を発現する細胞は、ガンシクロビルを用いて殺滅され得る。別の実施形態では、自殺遺伝子は、５－フルオロシトシンの存在下で細胞に対して有毒であるシトシンデアミナーゼである。Ｇａｒｃｉａ－Ｓａｎｃｈｅｚ ｅｔ ａｌ．“Ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ ５－ｆｌｕｏｒｏｃｙｔｏｓｉｎｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｒｅｄｕｃｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ １ ｍｉｌｌｉｏｎ－ｆｏｌｄ ｗｈｅｎ ｔｈｅｙ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌｓ：ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｐｕｒｇｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．”Ｂｌｏｏｄ．１９９８ Ｊｕｌ １５；９２（２）：６７２－８２。さらなる実施形態では、自殺遺伝子は、イホスファミド又はシクロホスファミドの存在下で有毒であるチトクロムＰ４５０である。例えば、Ｔｏｕａｔｉ ｅｔ ａｌ．“Ａ ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ ｔｕｍｏｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．”Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１４；１４（３）：２３６－４６を参照。さらに別の実施形態では、自殺遺伝子は、ｉＣａｓｐ９である。Ｄｉ Ｓｔａｓｉ，（２０１１）“Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｓ ａ ｓａｆｅｔｙ ｓｗｉｔｃｈ ｆｏｒ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ．”Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ３６５：１６７３－１６８３。Ｍｏｒｇａｎ，“Ｌｉｖｅ ａｎｄ Ｌｅｔ Ｄｉｅ：Ａ Ｎｅｗ Ｓｕｉｃｉｄｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｏｖｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１２）；２０：１１－１３も参照されたし。ｉＣａｓｐ９は、小分子ＡＰ１９０３の存在下でアポトーシスを誘導する。ＡＰ１９０３は、臨床試験において十分な耐容性があることが示されており、且つ養子細胞療法との関連で用いられている、生物学的に不活性な小分子である。

【0059】

当然ながら、組換えタンパク質のすべてが個別の組換え配列から発現され得ることは注目されるべきである。しかし、複数の組換え配列が発現される場合（例えば、ＣＡＲ、ＣＤ１６、サイトカイン）、コード領域が、組換えタンパク質をコードする少なくとも２つ又は少なくとも３つのコード領域を有するポリシストロニック単位で配列されてもよいことは、一般に好ましい。したがって、導入遺伝子は、当業者に公知のいずれかの機構により発現ベクターに改変され得る。複数の導入遺伝子が細胞に挿入されるべきである場合、導入遺伝子は、同じ発現ベクター又は異なる発現ベクターに改変されてもよい。いくつかの実施形態では、該細胞に、発現されるべきトランスジェニックタンパク質をコードするｍＲＮＡがトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、該細胞に、発現されるべきトランスジェニックタンパク質をコードするＤＮＡがトランスフェクトされる。導入遺伝子、ｍＲＮＡ及びＤＮＡは、非限定例として、感染、ウイルスベクター、電気穿孔、リポフェクション、ヌクレオフェクション、又は「遺伝子銃」を含む、当該技術分野で公知の任意のトランスフェクション方法を用いて、ＮＫ－９２細胞に導入され得る。

【0060】

したがって、好ましい実施形態では、遺伝子組換えＮＫ細胞（特に細胞がＣＡＲ及びＣＤ１６又はその変異体を発現する場合）は、細胞死の３つの異なる様式：受容体（例えばＮＫＧ２Ｄ受容体）を活性化することによって媒介される一般的細胞傷害性、標的細胞に結合した抗体によって媒介されるＡＤＣＣ、及びＣＡＲ媒介性細胞傷害性を示すことは注目されるべきである。容易に理解されるように、検討される遺伝子組換え細胞は、様々な疾患、特に異常細胞が疾患特異抗原又は疾患関連抗原を提示する場合の様々ながん及びウイルス感染の治療において用いることができる。結果的には、発明者は、本明細書に記載のような修飾ＮＫ又はＮＫ－９２細胞を用いて患者を治療する方法を検討している。一実施形態では、患者はがん（例えば腫瘍）を患っており、修飾ＮＫ－９２細胞又は細胞株は、がん又は腫瘍からの細胞の表面上に発現される抗原に特異的なＣＡＲを発現する。一実施形態では、患者はウイルス感染を患っており、修飾ＮＫ－９２細胞又は細胞株は、ウイルスによって感染されている細胞の表面上に発現される抗原に特異的なＣＡＲを発現する。一実施形態では、患者は細菌感染症を患っており、修飾ＮＫ－９２細胞又は細胞株は、感染を引き起こす細菌細胞の表面上に発現される抗原に特異的なＣＡＲを発現する。

【0061】

いくつかの実施形態では、がんは、白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、及び赤白血病を含む））及び慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病及び慢性リンパ性白血病）を含む）、真性多血症、リンパ腫（例えば、ホジキン病及び非ホジキン病）、多発性骨髄瘍、ワルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、固形腫瘍、例えば限定はされないが、肉腫及びがん、例えば、線維肉瘍、粘液肉瘍、脂肪肉瘍、軟骨肉瘍、骨原性肉瘍、脊索瘍、血管肉瘍、内皮肉腫、リンパ管肉瘍、リンパ管内皮肉腫、滑膜瘍、中皮瘍、ユーイング腫瘍、平滑筋肉瘍、横紋筋肉腫、結腸がん、膵がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、皮脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性肺がん、腎細胞がん、肝腫瘍、胆管がん、絨毛がん、セミノーマ、胚性癌瘍、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠瘍、星状細胞瘍、髄芽瘍、頭蓋咽頭瘍、上衣瘍、松果体瘍、血管芽瘍、聴神経腫瘍、乏突起神経膠瘍、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫及び網膜芽細胞腫からなる群から選択される。

【0062】

検討される修飾ＮＫ又はＮＫ－９２細胞は、絶対数の細胞により個体に投与され得る。例えば、個体に、約１０００細胞／注射～最大約１００億細胞／注射、例えば、１注射あたり、約、少なくとも約、又は最大で約１×１０^８、１×１０^７、５×１０^７、１×１０^６、５×１０^６、１×１０^５、５×１０^５、１×１０^４、５×１０^４、１×１０^３、５×１０^３（など）、又はそれら数のいずれか２つの間の任意の範囲（終点含む）での修飾ＮＫ－９２細胞が投与され得る。他の実施形態では、修飾ＮＫ－９２細胞は、相対数の細胞により個体に投与され得、例えば、前記個体に、約１０００細胞～最大約１００億細胞／個体のｋｇ、例えば、個体のｋｇあたり、約、少なくとも約、又は最大で約１×１０^８、１×１０^７、５×１０^７、１×１０^６、５×１０^６、１×１０^５、５×１０^５、１×１０^４、５×１０^４、１×１０^３、５×１０^３（など）、又はそれらの数のいずれか２つの間の任意の範囲（終点含む）での修飾ＮＫ－９２細胞が投与され得る。他の実施形態では、総用量は、体表面積のｍ^２、例えば、約１×１０^１１／ｍ^２、１×１０^１０／ｍ^２、１×１０^９／ｍ^２、１×１０^８／ｍ^２、１×１０^７／ｍ^２、又はそれらの数のいずれか２つの間の任意の範囲（終点含む）により計算されてもよい。個体の平均は、約１．６ｍ^２～約１．８ｍ^２である。好ましい実施形態では、約１０億～約３０億の間のＮＫ－９２細胞が患者に投与される。

【0063】

修飾ＮＫ－９２細胞、また任意選択的には他の抗がん剤若しくは抗ウイルス剤は、がんを有する患者若しくはウイルスに感染した患者に１回投与され得るか、又は複数回、例えば、治療中、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２時間若しくは２３時間ごとに１回、又は１、２、３、４、５、６日若しくは７日ごとに１回、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０週若しくはそれ以上の週ごとに１回、又はそれらの数のいずれか２つの間の任意の範囲（終点含む）、投与され得る。

【0064】

一実施形態では、修飾ＮＫ－９２細胞が自殺遺伝子を発現する場合、修飾ＮＫ－９２細胞死を誘発するための薬剤が患者に投与される。一実施形態では、該薬剤は、ＮＫ－９２細胞が標的細胞を殺滅するのに十分である修飾ＮＫ－９２細胞の投与後のある時点に投与される。

【0065】

一実施形態では、修飾ＮＫ－９２細胞は、患者への投与前に照射される。ＮＫ－９２細胞の照射は、例えば米国特許第８，０３４，３３２号明細書（その全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されている。一実施形態では、自殺遺伝子を発現するように改変されていない修飾ＮＫ－９２細胞は、照射される。

【0066】

さらに、検討される治療がまた、他の免疫治療用実体の投与を含むことになり、特に好ましい免疫治療用実体が、ウイルスがんワクチン（例えば、がん特異抗原をコードするアデノウイルスベクター）、細菌がんワクチン（例えば、１つ以上のがん特異抗原を発現する高温性でない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、酵母がんワクチン、Ｎ－８０３（ＡＬＴ－８０３，ＡＬＴＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓとしても公知）、抗体（例えば、腫瘍関連抗原又は患者特異的腫瘍ネオ抗原に結合する）、幹細胞移植（例えば、同種又は自家）、及び腫瘍標的サイトカイン（例えば、ＮＨＳ－ＩＬ１２、腫瘍標的化抗体又はその断片に共役されたＩＬ－１２）を含むことは理解されるべきである。

【実施例】

【0067】

以下の実施例は、あくまで例示を目的とし、特許請求される発明を限定するものとして解釈されるべきではない。当業者にとって利用可能な種々の代替的技術及び方法であれば、同様に意図される発明を十分に実施することを可能にするであろう。

【0068】

実施例１： ＣＡＲ ｍＲＮＡの調製
図１に模式的に表されるＣＤ１９ＣＡＲの各変異体をコードするＤＮＡ配列を、インシリコで設計し、新規に合成し、ｍＲＮＡ発現ベクターｐＸＴ７（ＧｅｎｅＡｒｔ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にサブクローン化した。１０マイクログラム（μｇ）のプラスミドを、製造業者の使用説明書に従い、ＳａｌＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）での消化により直線化し、ＱＩＡｇｅｎゲル精製キット（ＱＩＡｇｅｎ）を用いて精製した。

【0069】

直線化ＤＮＡは、製造業者の使用説明書に従い、Ｔ７ ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ Ｕｌｔｒａ転写キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いるｍＲＮＡのインビトロ合成用の鋳型として用いた。このキットは、ｍＲＮＡのポリＡテールの長さを増加させ、それによりインビボで安定性を増強するポリアデニル化伸長ステップを含む。

【0070】

６つのＣＤ１９－ＣＡＲ変異体におけるｍＲＮＡを調製するとともに、陰性対照として緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ｍＲＮＡを調製した。ＣＤ１９－ＣＡＲポリペプチド変異体のすべてが、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ領域（αＣＤ１９－ｓｃＦｖ）（配列番号４）を含む細胞外ドメイン、ＣＤ８（配列番号６）からのヒンジ領域、及びＣＤ２８（配列番号７）からの膜貫通ドメインを有した。ＣＤ１９ＣＡＲの細胞内ドメインは以下の通りであり、図１に模式的に示した：ＣＡＲ ３ｚが、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを有し；ＣＡＲ ＦｃＲｅが、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメイン（配列番号１）を有し；ＣＡＲ ２８＿３ｚが、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに融合されたＣＤ２８シグナル伝達ドメインを有し；ＣＡＲ ＢＢ＿３ｚが、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに融合された４－１ＢＢシグナル伝達ドメインを有し；ＣＡＲ ２８＿ＢＢ＿３ｚが、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに融合された４－１ＢＢシグナル伝達ドメインに融合されたＣＤ２８シグナル伝達ドメインを有し；ＣＡＲ ＢＢ＿３ｚ＿２８が、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインに融合されたＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに融合された４－１ＢＢシグナル伝達ドメインを有した。

【0071】

より詳細には、図１のＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを有する第１世代ＣＡＲは、配列番号１３（ヒト）及び配列番号２１（マウス）の核酸配列を有し、それは配列番号２２のアミノ酸配列に翻訳した。ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有する第１世代ＣＡＲは、配列番号５の核酸配列及び配列番号３のアミノ酸配列を有した。ＣＤ２８／ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを有する第２世代ＣＡＲは、配列番号１４の核酸配列を有し、４－１ＢＢ／ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを有する第２世代ＣＡＲは、配列番号１５の核酸配列を有した。ＣＤ２８／４－１ＢＢ／ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを有する第３世代ＣＡＲは、配列番号１６の核酸配列を有し、４－１ＢＢ／ＣＤ３ζ／ＣＤ２８シグナル伝達ドメインを有する第３世代ＣＡＲは、配列番号１７の核酸配列を有した。

【0072】

ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有するさらなる第１世代ＣＡＲは、以下により詳述されるように調製した：ここでヒンジ領域は、ＣＤ８ヒンジ（配列番号６又は配列番号４５（ヒト）、配列番号４６によってコードされる）であり、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン（配列番号７）であり、またシグナル伝達ドメインは、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメイン（配列番号１、核酸配列番号２によってコードされる）であった。

【0073】

次に、次のように選択したｓｃＦｖ部分を用いて、種々の腫瘍関連標的：ＣＤ１９（コドン最適化された配列番号２３によってコードされる、配列番号４又は配列番号２４の抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖを用いる）、ＣＤ２０（コドン最適化された配列番号２５によってコードされる、配列番号２６の抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖを用いる）、ＣＤ３３（コドン最適化された配列番号２７によってコードされる、配列番号２８の抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖを用いる）、ＣＳＰＧ４（コドン最適化された配列番号２９によってコードされる、配列番号３０の抗ＣＳＰＧ４ ｓｃＦｖを用いる）、ＥＧＦＲ（コドン最適化された配列番号３１によってコードされる、配列番号３２の抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖを用いる）、ＩＧＦ１Ｒ（コドン最適化された配列番号３３によってコードされる、配列番号３４の抗ＩＧＦ１Ｒ ｓｃＦｖを用いる）、ＣＤ３０（コドン最適化された配列番号３５によってコードされる、配列番号３６の抗ＣＤ３０ ｓｃＦｖを用いる）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ（コドン最適化された配列番号３７によってコードされる、配列番号３８の抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ ｓｃＦｖを用いる）、ＧＤ２（コドン最適化された配列番号３９又は配列番号４１によってコードされる、配列番号４０又は配列番号４２の抗ＧＤ２ ｓｃＦｖを用いる）、ＣＤ１２３（コドン最適化された配列番号４８によってコードされる、配列番号４９の抗ＣＤ１２３ ｓｃＦｖを用いる）、ＰＤ－Ｌ１（コドン最適化された配列番号５０によってコードされる、配列番号５１の抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖを用いる）、Ｂ７－Ｈ４（コドン最適化された配列番号５２によってコードされる、配列番号５３の抗Ｂ７－Ｈ４ ｓｃＦｖを用いる）、及びＦＡＰ（コドン最適化された配列番号５６又は配列番号５７によってコードされる、配列番号５８又は配列番号５９の抗ＦＡＰ ｓｃＦｖを用いる）に対する標的特異性を与えた（すべてが図１のＣＡＲ ＦｃＲｅに示すような連続的配置である）。

【0074】

同様に、（すべてが図１のＣＡＲ ＦｃＲｅに示すような連続的配置で）次のように選択したｓｃＦｖ部分を用いて、種々のウイルス関連標的：ＨＩＶ ｇｐ１２０（コドン最適化された配列番号５４によってコードされる、配列番号５５の抗ｇｐ１２０ ｓｃＦｖを用いる）に対する標的特異性を与えた。

【0075】

上で調製したすべての構築物がＮＫ－９２細胞内で十分に発現され、代表的結果は、そのような修飾ＮＫ－９２細胞の生理学的活性について示す。

【0076】

実施例２：ＣＤ１９ＣＡＲ ｍＲＮＡのＮＫ－９２細胞への電気穿孔
ＮＫ－９２細胞を、５％ヒトＡＢ血清（Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＶＡ）及び５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｒｏｓｐｅｃ，Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）を添加したＸ－Ｖｉｖｏ１０培地（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で増殖させた。細胞は、ＮＫ－９２細胞用の製造業者のパラメータ（１２５０Ｖ、１０ミリ秒、３パルス）に従うＮｅｏｎ（商標）電気穿孔装置（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、また体積１００μｌ内、５μｇのｍＲＮＡ／１０^６細胞を用いて、ｍＲＮＡで電気穿孔した。電気穿孔細胞を（上と同じ）培地中で２０時間（ｈ）維持した。

【0077】

ＮＫ－９２細胞表面上でのＣＤ１９ＣＡＲの発現を、ｅＦ６６０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で標識した抗ｓｃＦｖ抗体を用いてのフローサイトメトリーにより測定した。図２Ａは、ＮＫ－９２細胞集団内での指定のＣＤ１９ＣＡＲの％発現を示す。図２Ｂは、指定のＣＤ１９ＣＡＲを電気穿孔した細胞の蛍光強度（ＭＦＩ、－バックグラウンド）中央値を示す。図２Ａ及び２Ｂから解釈できる通り、ＣＡＲ ＦｃＲｅは、意外にも、細胞表面でＣＤ１９ＣＡＲを発現する細胞の最高の百分率（７５．２％）とともに最高のＭＦＩ（組換え細胞上で発現したＣＡＲの量）を有し、２８＿３ｚ（６１．７％）がそれに続いた。

【0078】

実施例３：がん細胞株に対するＣＤ１９ＣＡＲを発現するＮＫ－９２細胞の細胞傷害性
インビトロでの標的がん細胞に対するＣＡＲを発現するＮＫ－９２細胞の有効性を、フローベースのインビトロ細胞傷害性アッセイを用いて、電気穿孔の２０時間後に試験した。エフェクター細胞（ＣＤ１９ＣＡＲ又はＧＦＰを発現するＮＫ－９２）を、ＰＫＨＧＬ６７標識（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）標的細胞（Ｋ５６２；又はＳＵＰＢ１５、Ｂ－ＡＬＬ、ＣＤ１９^＋）と、９６ウェルプレート内、異なるエフェクター対標的比（５：１～０．３：１）で混合し、３７℃で４時間インキュベートした。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を細胞に添加し、２時間以内にＡｔｔｕｎｅフローサイトメーター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてサンプルを分析した。細胞傷害性は、ＰＫＨ陽性標的集団内でのＰＩ陽性細胞の％により判定した。

【0079】

代表的結果を図３Ａ及び３Ｂに提示する。図３Ａからわかるように、ＮＫ－９２細胞は、ＣＤ１９ＣＡＲの発現と無関係に、Ｋ５６２細胞を殺滅する際に有効である。したがって、組換え細胞が細胞傷害性を失うことがないことは注目されるべきである。それに対し、ＧＦＰを発現するＮＫ－９２細胞は、がん細胞株ＳＵＰ－Ｂ１５を殺滅する際、非効率的であった。ＳＵＰ－Ｂ１５は、ＣＤ１９陽性であり、且つ細胞傷害性に対して抵抗性を示す急性リンパ芽球性白血病細胞株である。図３Ｂから容易に解釈できるように、試験対象のいずれかのＣＤ１９ＣＡＲの発現により、対照（ＧＦＰを発現するＮＫ－９２細胞）と比べて、ＳＵＰ－Ｂ１５細胞株に対する増強された細胞傷害活性がもたらされた。意外にも、ＣＡＲ ＦｃＲｅは、第２世代及び第３世代ＣＡＲに対して類似又は優位の細胞傷害性を示した。かかる知見は、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインがあくまで単一の単位として存在し、他のシグナル伝達ドメインと組み合わせられなかったことから特に想定外である。かかる配置は、ＣＡＲ Ｔ細胞内で用いられるとき、望ましい標的化細胞傷害性をもたらさなかった。有利には、トリシストロン性ｍＲＮＡ構築物は、優れた機能活性を有する、実質的量の所望されるＣＡＲを生成することができた。かかる構築物は、ＣＡＲの発現が一過性である必要がある場合、特に有利である。

【0080】

脱顆粒は、ＮＫ－９２細胞における分泌性顆粒からの溶解性タンパク質（例えば、パーフォリン及びグランザイム）の放出に要求される決定的ステップである。脱顆粒は、ＮＫ－９２による標的細胞の認識により開始される。構築物における脱顆粒を試験するため、９６ウェルプレート内で、エフェクター細胞（ＮＫ－９２）を非標識標的細胞（ＳＵＰ－Ｂ１５）と異なるエフェクター対標的比（５：１～０．３：１）で混合し、抗ＣＤ１０７ａ（ＦＩＴＣコンジュゲート、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を各ウェルに添加した。プレートをＣＯ_２インキュベーター内、３７℃でインキュベートし、１時間後、モネンシン（ゴルジ停止）をウェルに添加した。プレートを３７℃でさらに３時間インキュベートし、サンプルをフローサイトメトリー（Ａｔｔｕｎｅ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）により分析した。エフェクター＋標的サンプルにおける％ＣＤ１０７ａ陽性に対してＮＫ－９２細胞単独における％ＣＤ１０７ａ陽性を減算することにより脱顆粒の百分率を判定した、代表的な結果を図４に提示する。

【0081】

実施例４：ＣＤ１９ｔ－ｈａＮＫ細胞はラージ腫瘍異種移植片モデルにおける動物生存率を有意に改善した。
ＣＤ１９ｔ－ｈａＮＫ細胞（クローン１９．６）は、Ｆｃε細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ＣＤ１９ｔ－ｈａＮＫ細胞を、５％熱不活性化ヒトＡＢ血清を添加したＸ－ＶＩＶＯ（商標）１０培地で培養した。

【0082】

試験動物：動物株／種：ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウス；齢：（隔離後）試験開始時９～１０週；性別：雌；体重：試験開始時に２０～２７グラム。動物の数：ＩＶ腫瘍モデル用に２０匹；ＳＣ腫瘍モデル用に１２匹。供給業者：Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（６１０ Ｍａｉｎ Ｓｔｒｅｅｔ Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ０４６０９ＵＳ）。

【0083】

ラージ腫瘍モデル：ラージがん細胞株：ラージ細胞は、ＡＴＣＣ（カタログ番号ＣＣＬ－８６ＴＭ；ロット番号６１７２３８７１）から最初に購入し、次に投与のため、増やして調製した。

【0084】

細胞培地：ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を有する１０％ウシ胎仔血清が添加されたＡＴＣＣ配合ＲＰＭＩ－１６４０培地。

【0085】

細胞収集：対数増殖期のラージ細胞（継代１２）を遠心分離により収集した。細胞を洗浄し、ＩＶ接種用で５×１０^５生細胞／ｍＬの濃度で血清不含培地に、またＳＣ注入用で２．５×１０^６生細胞／ｍＬの濃度で培地／マトリゲル（１：１ ｖ／ｖ）に再懸濁した。動物注射前、細胞を氷上で貯蔵した。インビボ試験で用いた細胞は、９６％の生存度を有した。

【0086】

ラージ細胞接種：ラージＩＶモデル。動物２０匹に、ラージ細胞懸濁液０．２ｍＬを、２７ゲージニードルで側方尾静脈を介してＩＶ注射した（１×１０^５個の細胞の接種）。ラージＳＣモデル。動物１２匹に、ラージ細胞懸濁液０．１ｍＬを、２５ゲージニードルで両側腹部にＳＣ注入した（２．５×１０^５個の細胞の接種）。

【0087】

他の試薬：ＲＰＭＩ－１６４０培地、Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）１０培地；熱不活性化ヒト男性ＡＢ血清（ＡｃｃｅｓｓＣｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ａｃｃｅｓｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＬＬＣ）；ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）；Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐグルタミン（１００Ｘ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０３７８、ロット番号１８８１４６３、有効期限：２０１８年５月）；マトリゲル基底膜マトリックス；プルロニック（登録商標）Ｆ－６８、１０％溶液。

【0088】

実験手順
ＩＶラージモデル－無作為化：１日目と規定した、がん細胞接種後２４時間以内に、動物２０匹の体重に基づく１０匹の２群への疑似無作為化を行い、群間で類似した平均体重を得た。

【0089】

被験物質投与：２、５、８、１０、１２、及び１７日目、対数増殖期に増殖されたＣＤ１９ｔ－ｈａＮＫ細胞を遠心分離により収集し、注射体積が２００μＬの１×１０^７細胞／マウスの用量の、ＩＶ投与用に５×１０^７細胞／ｍＬの濃度で、Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）１０中で配合した。群Ａ中の動物に媒体対照を投与した一方で、群Ｃ中の動物にＣＤ１９ｔ－ｈａＮＫ細胞を投与した。

【0090】

体重：動物は、腫瘍細胞注射前と週２回、秤量した。

【0091】

臨床観察：動物は、死亡率／罹患率（Ｇ０～Ｇ４）及び毒性の臨床徴候について毎日観察した。麻痺又は瀕死動物は、安楽死させた。

【0092】

安楽死：動物は、ＣＯ_２吸入とその後の頸部脱臼により安楽死させた。死亡率事象（安楽死又は自発性）は、死亡記録に記録し（付録６）、集計し、生存曲線を計算した。

【0093】

ＳＣラージモデル－腫瘍体積測定：ＳＣ腫瘍注入後、少なくとも週２回、腫瘍の樹立について動物を試験した。腫瘍が触知可能になった時、腫瘍体積（ＴＶ）を携帯式のデジタルノギスで週１～２回測定し、式：ＴＶ＝長さ×幅２／２［長さは腫瘍の最大直径であり、幅は腫瘍の最小直径である］を用いて計算した。

【0094】

無作為化：平均腫瘍体積が注射可能サイズに達した時（この場合には１９５ｍｍ^３；移植後２４日）、腫瘍保有動物１２匹に対して、６匹の２群への疑似無作為化を行い、群間で類似した腫瘍体積を得た。これを０日目と規定した。

【0095】

被験物質投与：１、４、７、９、１１、及び１３日目、対数増殖期に増殖されたＣＤ１９ｔ－ｈａＮＫ細胞を遠心分離により収集し、１０００ｃＧｙのγ照射を施し、注射体積が２００μＬの１×１０^７細胞／マウスの用量の、ＩＶ投与用に５×１０^７細胞／ｍＬの濃度で、Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）１０培地中で配合した。表１に示す通り、群Ｄ中の動物に媒体対照を投与した一方で、群Ｆ中の動物にＣＤ１９ｔ－ｈａＮＫ細胞を投与した。

【0096】

体重。動物は、腫瘍細胞注射前と次いで週２回、秤量した。

【0097】

臨床観察。動物は、死亡率／罹患率（Ｇ０～Ｇ４）及び毒性の臨床徴候（Ｔ１～Ｔ１２）について毎日観察した。麻痺又は瀕死動物は、安楽死させた。

【0098】

エンドポイント及び安楽死。瀕死動物が罹患状態を示すとすぐに安楽死させた一方で、生存動物は、組織収集のため、予定通り、安楽死させた。具体的には、１３日目、最終用量での被験物質投与から６時間後、生存動物の半数（最大でマウス３匹／群）を安楽死させた。１５日目、最終投与から４８時間後、動物の残りを安楽死させた。

【0099】

剖検及び腫瘍及び組織収集。終了時、剖検を実施し、可視の肉眼的病変を有する臓器を収集し、１０％ホルマリンで固定し、病理学的受託検査（Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｗａｖｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に提出し、腫瘍／転移性疾患負荷の組織学的評価を行った。

【0100】

【表1】

【0101】

データ分析
腫瘍体積の計算：腫瘍体積＝長さ×幅２／２（長さ及び幅は各々、腫瘍の最大及び最小直径である）；腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）の計算：ＴＧＩ＝（ＴＣ－Ｔｔ）／ΔＴＣ×１００％（式中、ＴＣ及びＴｔは各々、試験終了時の対照群及び治療群における平均腫瘍体積であり、ΔＴＣは、対照群における平均腫瘍体積の変化である）。

【0102】

統計分析－腫瘍増殖曲線：腫瘍増殖曲線は、二元分散分析、次いでチューキー検定による多重比較により分析した。生存曲線：生存曲線は、ログランク（マンテル・コックス）検定により分析した。

【0103】

肝臓転移評価：個別日についての肝転移性疾患負荷における差異を不対両側ｔ－検定により分析した。統計学的有意性：Ｐ＜０．０５は、統計学的に有意であるとみなす。すべての統計学的分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７を用いて実施した。

【0104】

結果
ＩＶラージモデル：ＩＶ腫瘍モデルにおける主要な読み取りは、動物の生存であった。動物が、疾患に関連した罹患及び／又は麻痺に起因し、死亡が判明するか又は安楽死したとき、死亡事象を計数した。図５に示すように、媒体対照と比較し、ＣＤ１９ｔ－ｈａＮＫ細胞治療が、動物の生存率を有意に改善することができ、媒体対照群における２１．５日に対して２７日の生存中央値が得られた（Ｐ＜０．０００１）。

【0105】

試験全体を通じて、動物の体重変化もまた監視した。図６に示すように、ＣＤ１９ｔ－ｈａＮＫ治療動物は、最初の治療開始時、中等度（１０％未満）及び短期の体重減少を示したが、それはＮＫのＩＶ注入を受けた動物において珍しい現象ではなく、ＣＤ１９ｔ－ｈａＮＫ細胞に特異的ではない（参照試験：ＬＡＢＣ－ＴＸ０１７０１）。それらの体重は、治療の第１週後で、疾患進行に起因して再び減少する前、回復することができた。

【0106】

ＳＣラージモデル：ＳＣ腫瘍モデルにおける主要な読み取りは、腫瘍増殖であった。図７に示すように、７日目以降、ＣＤ１９ｔｈａＮＫ細胞は、媒体対照群と比べて、明確且つ統計学的に有意な腫瘍増殖阻害を示し、試験終了時（１３日目）、４９％のＴＧＩであった。

【0107】

さらに、ラージがたとえＳＣ接種時としても侵襲性リンパ腫モデルであるとき、がん細胞は、最終的に動物の罹患及び／又は死亡をもたらす転移の複数部位を播種し、発生させることができた。媒体群において、１１～１３日目の間、瀕死状態であるが故に安楽死したのは全部で動物３匹（５０％）であった。それに対し、ＣＤ１９ｔ－ｈａＮＫ細胞群において、予定されない死亡事象は生じなかった（表３）。

【0108】

さらに、剖検中、ＣＤ１９ｔ－ｈａＮＫ治療動物において、肝転移の定性的減少が認められた（図８Ａ）。疾患負荷の半定量評価は、代表的に採取したＨ＆Ｅ染色肝切片に対する病理学的受託検査（Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｗａｖｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により実施した。図８Ｂ及び表４にまとめたように、試験が進行するにつれて、疾患負荷が増加する明確な傾向が認められた。ＣＤ１９ｔ－ｈａＮＫ治療動物の肝臓は、媒体対照と比べて著しく低い百分率のがん浸潤領域を示した。対照群における少ないサンプル数及び予定されない早期死亡数に起因し、統計分析は、１３日目のデータに対してのみ実施できた。この分析は、疾患負荷における有意差を示し、浸潤の平均が、対照群における３０％に対してＣＤ１９ｔ－ｈａＮＫ治療動物において１０％であった。

【0109】

試験全体を通じて体重変化を監視し、図９から解釈できるように、ＩＶラージモデルと同様、治療計画の初期において、ＣＤ１９ｔ－ｈａＮＫ治療動物は、中等度（１０％未満）及び一過性の体重減少を示した。

【0110】

【表2】

【0111】

【表3】

【0112】

反復ＩＶ投与計画におけるＣＤ１９ｔ－ｈａＮＫ細胞の抗腫瘍有効性を評価するため、ＩＶ及びＳＣ腫瘍接種を伴うラージ異種移植片モデルの２つのバリエーションを各々、この試験において利用した。

【0113】

ＩＶ腫瘍モデルでは、ＣＤ１９ｔ－ｈａＮＫ細胞により、媒体対照群と比べて、動物の生存を有意に改善し、生存中央値を５．５日延長すること（２６％の増加）ができた。ＳＣ腫瘍モデルでは、ＣＤ１９ｔ－ｈａＮＫ細胞により、腫瘍増殖を有意に抑制し、試験の終了時に４９％のＴＧＩをもたらすことができた。さらに、ＣＤ１９ｔ－ｈａＮＫ治療により、動物の罹患／死亡事象の数を低減し（対照群における３／６に対して、ＣＤ１９ｔ－ｈａＮＫ治療動物では０／６）、ＳＣラージ腫瘍保有動物の肝臓における転移性疾患負荷を著しく減少させることができた。

【0114】

上のデータからわかるように、ラージ異種移植片モデルの両方のバリエーションにおいて、ＣＤ１９ｔ－ｈａＮＫ細胞は、媒体対照と比べて有意な治療効果を示した。

【0115】

実施例５．ＣＤ１９－ＣＡＲ－ＮＫ－９２細胞を用いたＬ１２１０腫瘍を有するマウスの治療は生存を増強し、治療に完全奏効したマウスは、再負荷時、Ｌ１２１０腫瘍同種移植片を拒絶した。
実験設計：６～８週齢の雄ＤＢＡ／２Ｊマウス３０匹（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を０日目、無作為化後に登録した。すべての動物は、標準環境条件下に収容し、照射済み齧歯類固形飼料ＬａｂＤｉｅｔ ５０５３上で維持し、滅菌水を自由に与えた。到着後、動物を耳パンチにより同定し、１０匹をケージに収容し、試験開始前の最低３日間、その場所に順応させた。順応後、各マウスの注射領域を剪毛し、滅菌ＥｔＯＨ塗布で洗浄した。ＰＲ０日目（０日目、無作為化前）、腫瘍細胞注射のため、動物をイソフルランで麻酔した。ＰＲ０日目、すべての動物に、２×１０^５個のＬ１２１０－Ｌｕｃ腫瘍細胞を、体積０．１ｍＬの無血清ＤＭＥＭで、右側腹部に皮下（ｓ．ｃ．）注射した。ＰＲ７日目から、すべての動物において、腫瘍をデジタルノギスで毎日測定した。約５０～１５０ｍｍ^３の腫瘍体積が測定され、且つ約１００ｍｍ^３の平均腫瘍体積が測定されたＰＲ７日目頃、試験への登録用に約１００ｍｍ^３に最も近い腫瘍を有する動物２０匹を選択し；これらの動物を、動物１０匹から各々構成される２群に無作為化した。無作為化日は、試験の０日目と考え、治療の実施はこの日に開始した。試験に登録しなかった動物は、ＣＯ_２過剰投与により直ちに安楽死させた。群１中の動物に、媒体（無血清ＤＭＥＭ）を５０μｌの腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射として投与した。群２中の動物に、２×１０^６個のｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ａＮＫ細胞を５０μｌの体積でｉ．ｔ．投与した。試験の０、２及び４日目、同一の治療を施した。

【0116】

毎日、動物を秤量し、一般健康について監視した。無作為化後、各週３回（３回／週）、腫瘍をデジタルノギスで測定した。腫瘍＞２５００ｍｍ^３、即ち潰瘍化している腫瘍；初期体重（０日目）の＞３０％を失った腫瘍を有するか；又は瀕死、苦悩若しくは麻痺状態であることが判明したいずれかの動物は、ＣＯ_２過剰投与により安楽死させ、死亡／屠殺の原因を記録した。３０日目、完全奏効する動物及び群４を含む追加の約１０週齢のナイーブな雄ＤＢＡ／２Ｊマウス５匹（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｂａｒｒｉｅｒ）に、再負荷腫瘍細胞接種として２×１０^５個のＬ１２１０－Ｌｕｃ腫瘍細胞を、体積０．１ｍＬの無血清ＤＭＥＭで左側腹部に皮下（ｓ．ｃ．）投与した。すべての動物に対して、秤量及び監視を毎日継続し、腫瘍測定を３回／週で６０日目まで継続した。

【0117】

結果
ウェルフェア閾値（Ｗｅｌｆａｒｅ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）までの動物の生存－初期腫瘍負荷：動物は、生存について毎日監視した。それら初期体重の３０％超の減少、２５００ｍｍ^３を超える腫瘍、食物／水を得ることができないこと、又は瀕死であることの判明を含む、動物の健康及びウェルフェア閾値に応じて安楽死が求められる動物を生存分析に含めた。腫瘍の潰瘍化に応じて安楽死が求められる動物は、生存分析に含めなかった。

【0118】

動物のウェルフェア閾値までの経時的な累積的生存を図１０に示す。Ｌ１２１０は、極めて迅速に増殖している侵襲性腫瘍細胞株であり、腫瘍負荷後２３日より長く生存した媒体処置対照動物は０％であった。それに対し、ＣＤ１９－ＣＡＲ－ａＮＫ細胞での治療により、媒体での処置と比べて生存が増強された。当然ながら、ＣＤ１９－ＣＡＲ－ａＮＫ細胞で治療した動物の２５％（２／８）が、腫瘍移植片の負荷から６１日目の試験終了にかけて生存した。

【0119】

試験治療によってもたらされた、観察された生存増強の統計学的有意性を、ログランク（マンテル・コックス）及びゲーハン・ブレスロウ・ウィルコクソン検定により評価した。ｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ａＮＫ細胞での治療により、統計学的に有意な生存の増強が得られた（ｐ＝０．０５（マンテル・コックス）；ｐ＝０．０４（ゲーハン・ブレスロウ・ウィルコクソン）。これらの結果は、マウスリンパ球性白血病のこの前臨床皮下モデルにおいて、ＣＤ１９－ＣＡＲ－ａＮＫでの治療により、ウェルフェア閾値に対して媒体と比べて統計学的に有意な生存の改善が得られたことを示す。

【0120】

完全奏効者への腫瘍の再負荷：３３日目、群２からの完全奏効動物２匹に、年齢を適合させたナイーブ動物５匹とともに、第２の接種物を２×１０^５のＬ１２１０－Ｌｕｃ細胞で負荷／再負荷し、逆（左）側腹部に注射した（原発性腫瘍は右側腹部に播種した）。動物を生存について毎日監視した。それら初期体重の３０％超の減少、２５００ｍｍ^３を超える腫瘍、食物／水を得ることができないこと、又は瀕死であることの判明を含む、動物の健康及びウェルフェア閾値に応じて安楽死が求められる動物を生存分析に含めた。腫瘍の潰瘍化に応じて安楽死が求められる動物は、生存分析に含めなかった。

【0121】

生存分析に適したナイーブ動物のすべて（５中５）が、５２日目までに腫瘍体積に応じて安楽死させる必要であったが；それに対し、２００万個のＣＤ１９－ＣＡＲ－ａＮＫ（Ｎ＝２）細胞で予め治療したすべての完全奏効動物が、試験終了（６２日目）にかけて生存した。試験治療によってもたらされた、観察された生存増強の統計学的有意性を、ログランク（マンテル・コックス）及びゲーハン・ブレスロウ・ウィルコクソン検定により評価したが、生存における増強は、小さいサンプルサイズに起因する可能性が最も高いが、統計学的に識別可能でなかった。

【0122】

腫瘍は、再負荷段階中、毎週３回（３回／週）測定し続けた。負荷／再負荷用Ｌ１２１０－Ｌｕｃ細胞の投与から対照群の生存が０％（５２日目）までの各群における平均腫瘍体積＋平均値の標準誤差を図１１に示す。

【0123】

ナイーブ動物の腫瘍は、投与の約７日後（試験４０日目）、最初に検出可能であり、着実且つ急速に増加した。それに対し、２００万個のＣＤ１９－ＣＡＲ－ａＮＫ細胞で予め治療した完全奏効動物への再負荷後、再負荷段階の全過程（３３～６１日目）にわたる任意の時点で、腫瘍なしが検出された。

【0124】

本実施例で提示されるデータは、２００万個のＣＤ１９－ＣＡＲ－ａＮＫ細胞で予め治療した完全奏効動物がＬ１２１０腫瘍細胞に対して有効な免疫応答を発現させ得ることを示唆する。

【0125】

実施例６：Ａ２０腫瘍を有するマウスのｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＮＫ－９２細胞での治療により生存が増強され、治療に完全奏効したマウスは、再負荷されるとき、Ａ２０腫瘍同種移植片を拒絶した。
実験設計
パートＡ：パートＡに役立てるため、５～７週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス４０匹（雄２０匹及び雌２０匹）がＴａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから供与された。予備無作為化（ＰＲ）の０日目、動物に対し、体積１００μＬの血清不含培地中、２．５×１０^６個のＡ２０マウスのリンパ腫細胞を、左側腹部に皮下（ｓ．ｃ．）注射した。ＰＲ７日目から毎日、腫瘍を測定した。腫瘍細胞移植の１０日後（ＰＲ１０日目；０日目）、マウスを治療群に無作為化し、各群が類似の体積及び範囲の腫瘍を有する動物を含むようにした。無作為化日を試験の０日目とみなした。腫瘍は、２６日目のパートＡの終了まで、デジタルノギスにより各週３回（３回／週）測定し、腫瘍増殖を監視した。

【0126】

０日目、３日目、及び５日目、マウスに対し、予め確立されたｉ．ｔ．手順（実験手順を参照）に従い、体積５０μｌの血清不含培地中、試験細胞又は媒体を、各動物の腫瘤に腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した。つまり、動物に、媒体のみを投与したか、又は５×１０^６個のｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＮＫ－９２を投与した。２６日目、体積＞４０ｍｍ^３の腫瘍を発現しない動物は、試験に登録せず、ＣＯ_２窒息により安楽死させ；治療に対して完全寛解（ＣＲ；数日にわたり、腫瘍＞４０ｍｍ^３の消失により検出不能（０ｍｍ^３）であり、２６日目より以前に再発がない）を示す登録済み動物を、パートＢに登録した。

【0127】

パートＢ：パートＢは、２６日目に開始した。腫瘍を有しないパートＡからの動物を、ナイーブ動物１２匹（雄６匹及び雌６匹）とともにパートＢに登録した。パートＢの全動物に対し、２．５×１０^６個のＡ２０細胞を右側腹部に投与した。腫瘍は、週２回測定した。動物は、５７日目に安楽死させた。

【0128】

結果：パートＡ－動物の生存：動物は、一般健康及び生存について毎日監視した。それら初期体重の３０％超の減少、１５００ｍｍ^３を超える腫瘍、食物／水を得ることができないこと、又は瀕死であることの判明を含む、動物の健康及びウェルフェア閾値に応じて安楽死が求められる動物を生存分析に含めた。腫瘍の潰瘍化に応じて安楽死が求められる動物は、生存分析に含めなかった。この試験では、生存分析にて検討したすべての動物は、１５００ｍｍ^３を超える腫瘍量に応じて安楽死させた。皮下腫瘍量閾値が任意のカットオフポイントを表すことから、この場合の「生存」の分析は、あくまで相対的腫瘍増殖の指標としてみなす必要がある。考えられるすべての動物における経時的な累積的生存を図１２に示す。

【0129】

１、３、及び５日目、対照動物に媒体を腫瘍内（ｉ．ｔ．）投与し：２６日目のパートＡの終了まで生存したのは動物１５匹中０匹（０％）であった。２６日目にかけて、治療を受けた全動物において、動物における生存が増強され：動物１８匹中９匹（５０％）に５００万個のｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＮＫ９２細胞を投与した。すべての群を、ログランク（マンテル・コックス）検定により相互比較した。５００万個のｍＣＤ１９－ＣＡＲ－ＮＫ９２細胞を投与した動物において、媒体を投与した動物と比べて統計学的に有意な生存の増強が観察された（ｐ＝＜０．０００１）。これらの結果は、すべての治療により、２６日目にかけて生存が、媒体での処置と比べて改善されたことを示唆する。

【0130】

パートＢ－完全奏効者への腫瘍の再負荷：治療に完全奏効した動物（０～２６日目（パートＡ）の過程にわたる治療に応答する腫瘍＞４０ｍｍ^３を有し、２６日目にかけて腫瘍体積が０．００ｍｍ^３と測定され、再増殖又は再発が生じなかった）に対し、２７日目、血清不含ＲＰＭＩ－１６４０培地０．１ｍＬ中、２．５×１０^６個のＡ２０腫瘍細胞を、第２の皮下接種で側腹部（第１の移植片から逆側）に再負荷し；試験の再負荷部分をパートＢと名づけた。ナイーブ対照として役立てるため、さらなる動物１２匹を試験のパートＢに登録し；パートＡマウスと同じ時期及びベンダーでの供与を受けた年齢を適合させたＢＡＬＢ／ｃマウスの雄６匹及び雌６匹に、２７日目、２．５×１０^６個のＡ２０腫瘍細胞を投与した。腫瘍は、５７日目にかけて、全動物に対して３回／週で測定した。パートＡの治療群及びナイーブ対照各々の平均腫瘍体積＋平均値の標準誤差を図１３に示す。ナイーブ動物への細胞接種由来の腫瘍は、予想通り、着実に増殖した一方；再負荷腫瘍細胞の完全奏効者動物への接種により、生存可能な腫瘍（＞４０ｍｍ^３）がもたらされなかった。

【0131】

要するに、本実施例に提示するデータは、ナイーブマウスと対照的に、治療に完全奏効する予め治療したマウスが、治療と無関係に再負荷として適用されたＡ２０腫瘍同種移植片を拒絶することができたことを示し、且つこれらの動物が腫瘍抗原に対する記憶応答を発現したことを示唆する。

【0132】

標的化ＣＡＲ構築物及びそれに関連する機能的データについての以下の実施例は、トランスフェクト細胞が、直線化ＤＮＡをゲノムに組み込み、それにより特異的ＣＡＲの非一過性発現のための手段を提供することを可能にする、直線化ＤＮＡのベクター構築物から得た。

【0133】

実施例７：ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有するＨＥＲ２－ＣＡＲ
本実施例において、発明者は、ＣＤ８ヒンジに共役され、次いでＣＤ２８膜貫通ドメインに共役され、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインに共役された抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖを含む、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有する第１世代ＣＡＲを構築した。そのように構築したＨＥＲ２－ＣＡＲは、配列番号６０の核酸配列を有した。

【0134】

そのように構築したＨＥＲ２．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞のＢＴ－４７４細胞に対する機能性を標準の細胞傷害性アッセイを用いて試験した、代表的結果を図１４に示す。データから容易にわかるように、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有するＣＡＲを発現するＨＥＲ２．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞は、ＢＴ－４７４標的細胞に対して有意な細胞傷害性を示した。

【0135】

さらなる実験において、発明者は、図４０に図示するように、ＨＥＲ２．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞におけるＨＥＲ２．ＣＡＲの発現を示した。ＨＥＲ２．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞の天然細胞傷害性を図４１の結果に示す一方で、ＣＡＲ媒介性細胞傷害性における結果を図４２に示す。ＨＥＲ２．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞のＡＤＣＣについての代表的データを図４３のグラフに示す。

【0136】

実施例８：ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有するＣＤ３０－ＣＡＲ
本実施例において、発明者は、ＣＤ８ヒンジに共役され、次いでＣＤ２８膜貫通ドメインに共役され、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインに共役された抗ＣＤ３０ ｓｃＦｖを含む、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有する第１世代ＣＡＲを構築した。そのように構築したＣＤ３０－ＣＡＲは、配列番号６１の核酸配列を有した。

【0137】

ＣＤ３０－ＣＡＲの発現を図５０の結果にて示す一方で、組換え細胞の天然細胞傷害性についての結果を図５１に示す。ＣＡＲ媒介性細胞傷害性を図５２の結果にて示した一方で、ＡＤＣＣについての代表的結果を図５３のデータにて示した。

【0138】

実施例９：ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有するＥＧＦＲ－ＣＡＲ
本実施例において、発明者は、ＣＤ８ヒンジに共役され、次いでＣＤ２８膜貫通ドメインに共役され、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインに共役された抗ＥＧＦＲ ｓｃＦｖを含む、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有する第１世代ＣＡＲを構築した。そのように構築したＥＧＦＲ－ＣＡＲは、配列番号６２の核酸配列を有した。

【0139】

そのように構築したＥＧＦＲ．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞のＡ－５４９細胞に対する機能性を標準の細胞傷害性アッセイを用いて試験した、代表的結果を図１７に示す。データから容易にわかるように、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有するＣＡＲを発現するＥＧＦＲ．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞は、Ａ－５４９標的細胞に対して有意な細胞傷害性を示した。ＥＧＦＲ．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞におけるＥＧＦＲ－ＣＡＲの発現を図３５に示す一方で、天然細胞傷害性の結果を図３６に示す。ＥＧＦＲ．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞のＣＡＲ媒介性細胞傷害性における代表的結果を図３７及び図３８に示す一方で、ＥＧＦＲ．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞のＡＤＣＣにおける結果を図３９に示す。

【0140】

実施例１０：ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有するＩＧＦ１Ｒ－ＣＡＲ
本実施例において、発明者は、ＣＤ８ヒンジに共役され、次いでＣＤ２８膜貫通ドメインに共役され、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインに共役された抗ＩＧＦ１Ｒ ｓｃＦｖを含む、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有する第１世代ＣＡＲを構築した。そのように構築したＩＧＦ１Ｒ－ＣＡＲは、配列番号６３の核酸配列を有し、ＩＧＦ１Ｒ－ＣＡＲ、ＣＤ１６、及びＩＬ－２^ＥＲをコードするトリシストロン構築物は、配列番号７６の核酸配列を有し、それについても図６５に模式的に図示する。

【0141】

そのように構築したＩＧＦ１Ｒ．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対する機能性を第２世代ＣＡＲ（ＣＤ２８／ＣＤ３ｚ）との比較とともに標準の細胞傷害性アッセイを用いて試験した、代表的結果を図２２に示す。データから容易にわかるように、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有するＣＡＲを発現するＩＧＦ１Ｒ．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１標的細胞に対して有意な標的特異的細胞傷害性を示し、それは第２世代ＣＡＲの細胞傷害性と同等であった。

【0142】

実施例１１：ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有するＣＤ１２３－ＣＡＲ
本実施例において、発明者は、ＣＤ８ヒンジに共役され、次いでＣＤ２８膜貫通ドメインに共役され、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインに共役された抗ＣＤ１２３ ｓｃＦｖを含む、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有する第１世代ＣＡＲを構築した。そのように構築したＣＤ１２３－ＣＡＲは、配列番号６４の核酸配列を有した。ＣＤ１２３－ＣＡＲを発現する組換えＮＫ細胞のＣＡＲ媒介性細胞傷害性についてのデータを図４８に示し、図４９は、ＣＤ１２３－ＣＡＲを発現する組換えＮＫ細胞のＡＤＣＣについての代表的データを示す。

【0143】

実施例１２：ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有するＰＤ－Ｌ１－ＣＡＲ
本実施例において、発明者は、ＣＤ８ヒンジに共役され、次いでＣＤ２８膜貫通ドメインに共役され、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインに共役された抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖを含む、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有する第１世代ＣＡＲを構築した。そのように構築したＰＤ－Ｌ１－ＣＡＲは、配列番号６５の核酸配列を有した。

【0144】

そのように構築したＰＤ－Ｌ１．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞のＳＵＰ－Ｂ１５．ＰＤ－Ｌ１^＋細胞に対する機能性を標準の細胞傷害性アッセイを用いて試験した、代表的結果を図１６に示す。データから容易にわかるように、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有するＣＡＲを発現するＰＤ－Ｌ１．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞は、ＳＵＰ－Ｂ１５．ＰＤ－Ｌ１^＋標的細胞に対して有意な細胞傷害性を示した。

【0145】

そのように構築したＰＤ－Ｌ１．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞のさらにＵ２５１細胞に対する機能性を標準の細胞傷害性アッセイを用いて試験した、代表的結果を非トランスフェクトｈａＮＫ細胞とともに図１７に示す。データから容易にわかるように、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有するＣＡＲを発現するＰＤ－Ｌ１．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞は、Ｕ２５１標的細胞に対して有意な標的特異的細胞傷害性を示した一方で、ｈａＮＫ対照細胞は、同じＵ２５１細胞に対して実質的に細胞傷害性を有しなかった。

【0146】

ＰＤ－Ｌ１に関する標的細胞特異性についてのさらなる実験では、発明者は、一般的細胞傷害性に対応する対照としてのｈａＮＫ細胞とともに、ＰＤ－Ｌ１．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞を用いて、いくつかのＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍細胞株を試験した。図２４から容易にわかるように、ＰＤ－Ｌ１．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞は、多種多様な腫瘍細胞（肺、乳、ｇｅｎｉｔｕｒｙ腫瘍細胞、さらには頭頸部小細胞がん、脊索腫）を通じて優れた細胞傷害性を有した。特に、大部分（＞８５％）の細胞を死滅させるのに、ＰＤ－Ｌ１．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞では４時間未満を要した一方で、対照ｈａＮＫ細胞では１２時間超を要した。

【0147】

図２４は、様々な他の対照細胞（指定のようなｈａＮＫ細胞）と比べてのＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対するＰＤ－Ｌ１．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞の細胞傷害性をさらに図示する。データから解釈できるように、ＰＤ－Ｌ１．ｔｈａＮＫによるＭＤＡ－ＭＢ－２３１の溶解が、５：１のＥ：Ｔ比で、セツキシマブにより改善され、ｈａＮＫ活性が、セツキシマブ及びａ－ＰＤ－Ｌ１の添加により改善された。単純なＰＤ－Ｌ１．ｔｈａｎｋは、ｈａＮＫ及びｈａＮＫ＋セツキシマブと比べて改善された細胞傷害活性を有し、単純なＰＤ－Ｌ１．ｔｈａｎｋの殺滅がｈａＮＫ＋ＰＤ－Ｌ１抗体の場合と同等であったが、ＰＤ－Ｌ１．ｔｈａｎｋ＋セツキシマブは、ｈａＮＫ＋セツキシマブ及びｈａＮＫ＋ＰＤ－Ｌ１より優れていた。１：１のＥ：Ｔ比で、ＰＤ－Ｌ１．ｔｈａＮＫ活性が、セツキシマブの存在下又は不在下で同じであり、ＰＤ－Ｌ１．ｔｈａＮＫは内因性よりも有意に優れ、ｈａｎｋ．ｈａＮＫ活性によるＡＤＣＣ媒介性殺滅が、セツキシマブ及びａ－ＰＤ－Ｌ１の添加により改善された。

【0148】

さらなる実験において、発明者は、図４４に図示のように、ＰＤ－Ｌ１．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞におけるＰＤ－Ｌ１．ＣＡＲの発現を示した。ＰＤ－Ｌ１．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞の天然細胞傷害性を図４５の結果に示す一方で、ＣＡＲ媒介性細胞傷害性についての結果を図４６に示す。ＰＤ－Ｌ１．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞のＡＤＣＣについての代表的データを図４７のグラフに示す。

【0149】

実施例１３：ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有するＣＤ３３－ＣＡＲ
本実施例において、発明者は、ＣＤ８ヒンジに共役され、次いでＣＤ２８膜貫通ドメインに共役され、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインに共役された抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖを含む、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有する第１世代ＣＡＲを構築した。そのように構築したＣＤ３３．ＣＡＲは、配列番号６６の核酸配列を有した。

【0150】

そのように構築したＣＤ３３．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞のＴＨＰ－１細胞に対する機能性を標準の細胞傷害性アッセイを用いて試験した、代表的結果を図１５に示す。データから容易にわかるように、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有するＣＡＲを発現するＣＤ３３．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞は、ＴＨＰ－１標的細胞に対して有意な細胞傷害性を示した。ＮＫ－９２細胞におけるＣＤ３３ＣＡＲの強力な発現を表すさらなるデータを図３１に提示する。Ｋ５６２細胞に対するＣＤ３３．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞の天然細胞傷害性を図３２に示し、図３３は、ＴＨＰ－１細胞に対するＣＡＲ媒介性細胞傷害性についての結果を表す。図３４は、リツキシマブを伴う、ＳＵＰ－Ｂ１５ ＣＤ１９^ＫＯ／ＣＤ２０^＋に対するＣＤ３３．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞のＡＤＣＣについてのさらなる結果を示す。

【0151】

実施例１４：ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有するｇｐ１２０－ＣＡＲ
本実施例において、発明者は、ＣＤ８ヒンジに共役され、次いでＣＤ２８膜貫通ドメインに共役され、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインに共役された抗ｇｐ１２０ ｓｃＦｖを含む、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有する第１世代ＣＡＲを構築した。そのように構築したｇｐ１２０－ＣＡＲは、配列番号６７の核酸配列を有した。

【0152】

発明者は、図５７からわかるように、そのように作製した細胞が、ＣＤ１６及びｇｐ１２０ＣＡＲを有意量で発現することをさらに示した。図５８に示される通り、陰性対照としての非組換えａＮＫ細胞に対するＧＰ１２０のｇｐ１２０ＣＡＲへの結合を示した。そのように作製した細胞の天然細胞傷害性を図５９に示す一方で、対応するＡＤＣＣデータを図６０に示す。

【0153】

実施例１５：ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有するＢ７－Ｈ４－ＣＡＲ
本実施例において、発明者は、ＣＤ８ヒンジに共役され、次いでＣＤ２８膜貫通ドメインに共役され、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインに共役された抗Ｂ７－Ｈ４ ｓｃＦｖを含む、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有する第１世代ＣＡＲを構築した。そのように構築したＢ７－Ｈ４－ＣＡＲは、配列番号６８の核酸配列を有した。

【0154】

実施例１６：ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有するＢＣＭＡ－ＣＡＲ
本実施例において、発明者は、ＣＤ８ヒンジに共役され、次いでＣＤ２８膜貫通ドメインに共役され、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインに共役された抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖを含む、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有する第１世代ＣＡＲを構築した。そのように構築したＢＣＭＡ－ＣＡＲは、配列番号６９の核酸配列を有した。

【0155】

ＢＣＭＡの発現は、図５４の代表的結果に示すように確認され、図５５に示される通り、標的細胞に対するＣＡＲ媒介性細胞傷害性が示された。同様に、図５６における結果からわかるように、組換え細胞は、標的細胞に対する抗体としてリツキシマブを用いて、有意なＡＤＣＣを有した。

【0156】

実施例１７：ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有するＧＤ２－ＣＡＲ
本実施例において、発明者は、ＣＤ８ヒンジに共役され、次いでＣＤ２８膜貫通ドメインに共役され、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインに共役された抗ＧＤ２ ｓｃＦｖを含む、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有する第１世代ＣＡＲを構築した。そのように構築したＧＤ２－ＣＡＲは、配列番号７０の核酸配列を有した。

【0157】

実施例１８：ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有するＦＡＰ－ＣＡＲ
本実施例において、発明者は、ＣＤ８ヒンジに共役され、次いでＣＤ２８膜貫通ドメインに共役され、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインに共役された抗ＦＡＰ ｓｃＦｖを含む、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有する第１世代ＣＡＲを構築した。そのように構築したＦＡＰ－ＣＡＲは、配列番号７１の核酸配列を有した。ＦＡＰ－ＣＡＲの発現を図６１のデータに示し、標的細胞に対するＦＡＰ．ＣＡＲの細胞傷害性を図６２の結果に示す。

【0158】

実施例１９：ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有するＣＤ２０－ＣＡＲ
本実施例において、発明者は、ＣＤ８ヒンジに共役され、次いでＣＤ２８膜貫通ドメインに共役され、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインに共役された抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖを含む、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有する第１世代ＣＡＲを構築した。そのように構築したＣＤ２０－ＣＡＲは、配列番号７４の核酸配列を有した。

【0159】

ＮＫ－９２細胞におけるＣＤ２０ ＣＡＲの発現を図２９の結果に示す。容易にわかるように、ＣＤ２０．ＣＡＲは、（上記のような直線化ＤＮＡからのＣＤ１６とともに）組換え細胞の大部分において強力に発現される。図３０は、ＣＤ２０^＋標的細胞に対するＣＤ２０．ＣＡＲ ＮＫ細胞の細胞傷害性についての代表的結果を表す。

【0160】

実施例２０：ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有するＣＳＰＧ－４－ＣＡＲ
本実施例において、発明者は、ＣＤ８ヒンジに共役され、次いでＣＤ２８膜貫通ドメインに共役され、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインに共役された抗ＣＳＰＧ－４ ｓｃＦｖを含む、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有する第１世代ＣＡＲを構築した。そのように構築したＣＳＰＧ－４－ＣＡＲは、配列番号７５の核酸配列を有した。ＣＳＰＧ－４－ＣＡＲの発現をＦＡＣＳ分析により確認した、代表的結果を図６３に示す。図６４の代表的データに示す通り、そのように構築した細胞もまた、有意な細胞傷害性を示した。

【0161】

実施例２１：ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有するＣＤ１９－ＣＡＲ
本実施例において、発明者は、ＣＤ８ヒンジに共役され、次いでＣＤ２８膜貫通ドメインに共役され、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインに共役された抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖを含む、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有する上記のような第１世代ＣＡＲを用い、機能的試験のため、ＮＫ－９２細胞に直線化ＤＮＡをトランスフェクトした。

【0162】

一般的細胞傷害性の判定のため、そのように構築したＣＤ１９．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞のＫ５６２細胞に対する機能性を標準の細胞傷害性アッセイを用いて試験した、代表的結果を図１９に示す。容易にわかるように、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有するＣＡＲを発現するＣＤ１９．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞は、Ｋ５６２標的細胞に対して有意な細胞傷害性を示した。さらなる実験セットでは、ＳＵＰ－Ｂ１５細胞を用いて、標的特異的細胞傷害性を、対照としてのａＮＫ細胞と比べて判定した、代表的結果を図２０に示す。再び、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有するＣＡＲを発現するＣＤ１９．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞は、有意な標的特異的細胞傷害性を示した。さらに別の実験セットでは、ＳＫＢｒ３細胞を用いて、標的特異的ＡＤＣＣを、抗体としてのハーセプチン及びリツキサンを用いて判定した、代表的結果を図２１に示す。再び、ＦｃεＲＩγシグナル伝達ドメインを有するＣＡＲを発現するＣＤ１９．ＣＡＲ－ｔ－ｈａＮＫ細胞は、有意な抗体及び標的特異的ＡＤＣＣを示した。特に、組換えＮＫ細胞の倍加時間は、ａＮＫ細胞と実質的に同じであった。

【0163】

図２５は、対照に対する、ＮＫ－９２細胞におけるＣＤ１６及びＩＬ－２^ＥＲをコードするセグメントを含む直線化ＤＮＡからのＣＤ１９．ＣＡＲの発現を例示的に図示する。図２５からわかるように、該発現は、細胞の大部分にわたり非常に強力であった。ＣＤ１９．ＣＡＲ ｔ－ｈａＮＫ細胞のＫ５６２細胞に対する天然細胞傷害性及びＳＵＰ－Ｂ１５細胞に対する標的化細胞傷害性についてのさらなる結果を図２６及び図２７に表す。ＣＤ１９．ＣＡＲ ｔ－ｈａＮＫ細胞のＳＵＰ－Ｂ１５ＣＤ１９^ＫＯ／ＣＤ２０^＋細胞に対するＡＤＣＣについての代表的なさらなる結果を図２８に示す。

【0164】

実施例２２：ＮＳＧマウスにおけるヒト異種移植片モデルでのＰＤ－Ｌ１標的化ｔ－ｈａＮＫ細胞の抗腫瘍活性
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨＣＣ８２７を、ＰＤ－Ｌ１陽性である検証された異種移植片モデルとして用いて、異なる製剤中でのＰＤ－Ｌ１ ｔ－ｈａＮＫ細胞の有効性、投与レベル、及び投与経路（ＩＶ及びＩＴ）を評価した。

【0165】

動物：動物タイプ：ＮＳＧマウス（ＪＡＸ）、雌、９～１０週齢；ＭＤＡ－ＭＢ－２３１モデルにおける動物の数：２４（新鮮細胞）、及びＨＣＣ８２７モデルにおける動物の数：２４（新鮮細胞）＋６（凍結保存細胞）。腫瘍モデルでは、細胞株：ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ヒト乳腺癌）及びＨＣＣ８２７（ヒト肺腺癌）を用い、接種経路は両側腹部の皮下であり、治療開始時の平均腫瘍量は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１において約１００ｍｍ^３、ＨＣＣ８２７において約７５～８０ｍｍ^３であった。

【0166】

治療物質：新しく調製し、照射した、５Ｅ７細胞／ｍＬ又は２Ｅ７細胞／ｍＬの濃度での抗ＰＤ－Ｌ１ ｔ－ｈａＮＫ；媒体対照は、Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）１０培地であった；投与方法は、上記の通り、ＩＶ及びＩＴであった。ＩＶ ＮＫ投与用の用量は、２００μＬ中、１Ｅ７細胞／用量（新しく調整した細胞）、２００μＬ中、４Ｅ６細胞／用量（凍結保存細胞）であった；ＩＴ ＮＫ投与（新鮮細胞のみ）用の用量は、５０μＬ中、２．５Ｅ６細胞／腫瘍／用量であった。投与頻度は、４連続週にわたり週２回であり（Ｍ／Ｔｈ又はＴ／Ｆ）、投与初日を１日目と定義した。

【0167】

ＭＤＡ－ＭＢ－２３１用の試験設計を下の表４に示す（この試験は、群Ａ、Ｃ及びＤにおける一部の動物が＞２０００ｍｍ^３の組み合わせた腫瘍体積に達していた２７日目に終了した）

【0168】

【表4】

【0169】

ＨＣＣ８２７に対する試験設計を下の表５に示す（この試験は、生存動物を、目的の再設定の上、別の試験に移した２９日目に終了した）。

【0170】

【表5】

【0171】

結果：新しく調製したＰＤ－Ｌ１ ｔ－ｈａＮＫ細胞（１Ｅ７細胞／用量）が、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＨＣＣ８２７モデル双方において、顕著な長く持続する腫瘍増殖阻害をもたらした。

【0172】

ＭＤＡ－ＭＢ－２３１：腫瘍停滞：１６日目のＴＧＩ：８４％（ピーク）；２６日目のＴＧＩ：７９％（最終測定）。

【0173】

ＨＣＣ８２７：腫瘍退縮：１６日目のＴＧＩ：１２０％（ピーク）；２９日目のＴＧＩ：８４％（試験終了）。

【0174】

凍結保存ＰＤ－Ｌ１ ｔ－ｈａＮＫ細胞（４Ｅ６細胞／用量）もまた、Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）１０培地と比べて、腫瘍増殖の抑制における統計学的に有意な有効性を示した：２６日目のＴＧＩ：６０％（ピーク）、及び２９日目のＴＧＩ：４０％（試験終了）。

【0175】

新しく調製したＰＤ－Ｌ１ ｔ－ｈａＮＫ細胞（１Ｅ７細胞／用量）もまた、下の表６に示す通り、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１モデルにおいて転移性疾患負荷の有意な低減をもたらした。

【0176】

【表6】

【0177】

媒体中に存在した肝臓における可視小結節の数：２９±９、ＰＤ－Ｌ１ ｔ－ｈａＮＫ群中：０（不対両側ｔ検定により、Ｐ＝０．０１１６）。

【0178】

実施した実験に基づき、新しく調製したＰＤ－Ｌ１ ｔ－ｈａＮＫ細胞の、１Ｅ７細胞／用量の投与レベルでの週２回、４週間のＩＶ投与により、試験対象の皮下異種移植片モデルの双方において顕著な抗腫瘍有効性が示され：治療により、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍保有マウスにおいて腫瘍停滞がもたらされ、１６日目のピークＴＧＩが８４％であり且つ試験終了時のＴＧＩが７９％であり（二元分散分析とその後のチューキー検定による多重比較により、両時点においてＰ＜０．０００１）、またＨＣＣ８２７モデルにおいて腫瘍退縮がもたらされ、１６日目のピークＴＧＩが１２０％であり且つ試験終了時のＴＧＩが８４％であった（Ｐ＜０．０００１）。凍結保存ＰＤ－Ｌ１ ｔ－ｈａＮＫ細胞の、４Ｅ６細胞／用量の投与レベルでの週２回、４週間のＩＶ投与によっても、ＨＣＣ８２７腫瘍モデルにおいて有意な治療効果が示され、ピークＴＧＩが６０％（Ｐ＜０．０００１）、且つ試験終了時のＴＧＩが４０％（Ｐ＜０．０１）に達した。新しく調製したＰＤ－Ｌ１ ｔ－ｈａＮＫ細胞の、２．５Ｅ６細胞／用量／腫瘍の投与レベルでの週２回、４週間のＩＴ投与により、ＨＣＣ８２７腫瘍の増殖が有効に抑制され、その結果、２０日目のピークＴＧＩが７０％、且つ試験終了時のＴＧＩが４９％であった（Ｐ＜０．００１）。

【0179】

新しく調製したＰＤ－Ｌ１ ｔ－ｈａＮＫ細胞（１Ｅ７細胞／用量）のＩＶ投与を受けた動物において、有意な有害反応が認められた。新しく調製したＰＤ－Ｌ１ ｔ－ｈａＮＫ細胞と対照的に、（４Ｅ６細胞／用量のより低いレベルで投与した）凍結保存細胞は、ＩＶ投与後、動物にとって安全であることが判明した。ＰＤ－Ｌ１ ｔ－ｈａＮＫ細胞は、２つの皮下腫瘍モデルにおいて顕著な有効性を示した。より低い４Ｅ６細胞／用量のレベルで投与した凍結保存細胞はまた、腫瘍増殖の抑制において有意な有効性を示し、動物にとって安全であることが判明した。

【0180】

当然ながら、本明細書に提供されるすべての核酸配列において、対応するコード化タンパク質についても本明細書で明示的に検討されることは理解されるべきである。同様に、すべてのアミノ酸配列において、対応する核酸配列についても（任意のコドン使用とともに）本明細書で検討される。

【0181】

本明細書中で引用されるすべての特許出願、出版物、参考文献、及び配列受入番号は、本明細書でそれら全体が参照により援用される。

【0182】

特に定義されない限り、本明細書で用いられるすべての科学技術用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されている場合と同じ意味を有する。

【0183】

本明細書及び以下の特許請求の範囲では、いくつかの用語に対してなされる参照は、以下の意味を有するように定義されるものとする。

【0184】

本明細書で用いられる用語法は、あくまで特定の実施形態を説明することを目的とし、本発明を限定するようには意図されない。文脈上特に明示されない限り、本明細書で用いられるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、同様に複数形を含むように意図される。

【0185】

本明細書に記載のすべての数値（範囲を含む、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、量、及び分子量）が当業者が遭遇する測定値における正常な変動を含むことは理解される。したがって、本明細書に記載の数値は、＋／－０．１～１０％、例えば、＋／－０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、又は１０％の変動を含む。常に明示されるとは限らないが、すべての数値指定に用語「約」が先行してもよいことは理解されるべきである。したがって、約という用語は、数値の＋／－０．１～１０％、例えば、＋／－０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、又は１０％の変動を含む。常に明示されるとは限らないが、本明細書に記載の試薬があくまで例示的なものであり、且つそのような等価物が当該技術分野で公知であることも理解されるべきである。

【0186】

当業者によって理解されるように、ありとあらゆる目的で、特に明細書を提示するという観点で、本明細書に開示されるすべての範囲は、範囲の終点を含み、且つ範囲の終点間のすべての値を含む。本明細書に開示されるすべての範囲はまた、ありとあらゆる可能な部分範囲及びその部分範囲の組み合わせを包含する。任意の列挙される範囲は、同範囲を少なくとも等しい半分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに分解することを十分に説明し、可能にするものとして容易に理解することができる。非限定例として、本明細書で考察される各範囲は、下部３分の１、中部３分の１及び上部３分の１などに容易に分解することができる。さらに当業者によって理解されるように、「最大」、「少なくとも」などのあらゆる用語は、列挙される数を含み、後に上で考察のように部分範囲に分解可能な範囲を指す。最後に、当業者によって理解されるように、範囲は各個別メンバーを含む。したがって、例えば、１～３個の細胞を有する群は、１、２、又は３個の細胞を有する群を指す。同様に、例えば、１～５個の細胞を有する群は、１、２、３、４、又は５個の細胞を有する群を指す。

【0187】

常に明示されるとは限らないが、本明細書に記載の試薬があくまで例示的なものであり、且つそのような等価物が当該技術分野で公知であることも理解されるべきである。

【0188】

「任意選択的な」又は「任意選択的に」は、後に説明される事象又は環境が生じ得る又は生じ得ないこと、並びに該説明が事象又は環境が生じる場合の例及びそれが生じない場合の例を含むことを意味する。

【0189】

用語「含む」は、組成物及び方法が列挙要素を含むといっても、それ以外を除外しないことを意味することが意図される。「本質的に～からなる」は、組成物及び方法を定義するために用いられるとき、組み合わせに対して任意の本質的意義のある別の要素を除外することを意味するものとする。例えば、本明細書で定義されるような要素から本質的になる組成物であれば、主張される発明の基本的且つ新規な特徴に実質的に影響しない他の要素を除外しないことになる。「～からなる」は、微量に留まらない他の成分を除外し、且つ実質的な方法ステップが列挙されることを意味するものとする。これら移行語の各々によって定義される実施形態は、本開示の範囲内に含まれる。

【0190】

本明細書で用いられるとき、「免疫療法」は、標的細胞に接触するとき、細胞傷害性を誘導する能力がある、ＮＫ－９２細胞（修飾又は非修飾）、天然に存在する又は修飾されたＮＫ細胞又はＴ細胞の単独又は組み合わせのいずれかでの使用を指す。

【0191】

本明細書で用いられるとき、「ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞」は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスによる制限がなく、特異抗原刺激の不在下で標的細胞を殺滅する免疫系の細胞である。標的細胞は、腫瘍細胞又はウイルスを保有する細胞であってもよい。ＮＫ細胞は、ＣＤ５６の存在及びＣＤ３表面マーカーの不在によって特徴づけられる。

【0192】

用語「内因性ＮＫ細胞」は、ＮＫ－９２細胞株と区別されるように、ドナー（又は患者）由来のＮＫ細胞を指すように用いられる。内因性ＮＫ細胞は、一般に内部でＮＫ細胞が濃縮されている細胞の異質集団である。内因性ＮＫ細胞は、患者の自家又は同種治療が意図されてもよい。

【0193】

用語「ＮＫ－９２」は、Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）に記載された高度に強力な唯一の細胞株（その権利はＮａｎｔＫｗｅｓｔによって所有される）に由来するナチュラルキラー細胞を指す（以降、「ＮＫ－９２（商標）細胞」）。不死ＮＫ細胞株は、元は非ホジキンリンパ腫を有する患者から得た。特に指定されない限り、用語「ＮＫ－９２（商標）」は、元のＮＫ－９２細胞株、及び（例えば、外因性遺伝子の導入により）修飾されているＮＫ－９２細胞株を指すことが意図される。ＮＫ－９２（商標）細胞、並びにその代表的及び非限定的修飾は、米国特許第７，６１８，８１７号明細書；米国特許第８，０３４，３３２号明細書；米国特許第８，３１３，９４３号明細書；米国特許第９，１８１，３２２号明細書；米国特許第９，１５０，６３６号明細書；及び公開された米国特許出願第１０／００８，９５５号明細書（それらのすべてはそれら全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されており、野生型ＮＫ－９２（商標）、ＮＫ－９２（商標）－ＣＤ１６、ＮＫ－９２（商標）－ＣＤ１６－γ、ＮＫ－９２（商標）－ＣＤ１６－ζ、ＮＫ－９２（商標）－ＣＤ１６（Ｆ１７６Ｖ）、ＮＫ－９２（商標）ＭＩ、及びＮＫ－９２（商標）ＣＩを含む。ＮＫ－９２細胞は、当業者にとって公知であり、かかる細胞は、ＮａｎｔＫｗｅｓｔ，Ｉｎｃ．から容易に入手可能である。

【0194】

用語「ａＮＫ」は、Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）に記載された高度に強力な唯一の細胞株に由来する非修飾ナチュラルキラー細胞を指し、その権利はＮａｎｔＫｗｅｓｔによって所有される（以降、「ａＮＫ（商標）細胞」）。用語「ｈａＮＫ」は、細胞表面上でＣＤ１６を発現するように修飾された、Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）に記載された高度に強力な唯一の細胞株に由来するナチュラルキラー細胞を指し、その権利はＮａｎｔＫｗｅｓｔによって所有される（以降、「ＣＤ１６＋ＮＫ－９２（商標）細胞」又は「ｈａＮＫ（登録商標）細胞」）。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６＋ＮＫ－９２（商標）細胞は、細胞表面上に高親和性ＣＤ１６受容体を含む。用語「ｔａＮＫ」は、キメラ抗原受容体を発現するように修飾された、Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）に記載された高度に強力な唯一の細胞株に由来するナチュラルキラー細胞を指し、その権利はＮａｎｔＫｗｅｓｔによって所有される（以降、「ＣＡＲ修飾ＮＫ－９２（商標）細胞」又は「ｔａＮＫ（登録商標）細胞」）。用語「ｔ－ｈａＮＫ」は、細胞表面上でＣＤ１６を発現し、且つキメラ抗原受容体を発現するように修飾された、Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）に記載された高度に強力な唯一の細胞株に由来するナチュラルキラー細胞を指し、その権利はＮａｎｔＫｗｅｓｔによって所有される（以降、「ＣＡＲ修飾ＣＤ１６＋ＮＫ－９２（商標）細胞」又は「ｔ－ｈａＮＫ（商標）細胞」）。いくつかの実施形態では、ｔ－ｈａＮＫ（商標）細胞は、細胞表面上に高親和性ＣＤ１６受容体を発現する。

【0195】

「修飾ＮＫ－９２細胞」は、外因性遺伝子又はタンパク質、例えばＦｃ受容体、ＣＡＲ、サイトカイン（ＩＬ－２又はＩＬ－１２など）、及び／又は自殺遺伝子を発現するＮＫ－９２細胞を指す。いくつかの実施形態では、修飾ＮＫ－９２細胞は、導入遺伝子、例えばＦｃ受容体、ＣＡＲ、サイトカイン（ＩＬ－２又はＩＬ－１２など）、及び／又は自殺遺伝子をコードするベクターを含む。一実施形態では、修飾ＮＫ－９２細胞は、少なくとも１つのトランスジェニックタンパク質を発現する。

【0196】

本明細書で用いられるとき、「非照射ＮＫ－９２細胞」は、照射されていないＮＫ－９２細胞である。照射は、該細胞を成長及び増殖不能にする。最適な活性を保つため、照射と注入との間の時間が４時間以内である必要があることから、ＮＫ－９２細胞が患者の治療前に治療施設又は他のいくつかの地点で照射されることは想定される。或いは、ＮＫ－９２細胞は、別の機構により増殖することから阻止してもよい。

【0197】

本明細書で用いられるとき、ＮＫ－９２細胞の「不活性化」は、該細胞を増殖不能にする。不活性化はまた、ＮＫ－９２細胞の死滅に関連することがある。ＮＫ－９２細胞が、治療用途において病理に関連した細胞の生体外サンプルを有効にパージしてから、又は身体内部に存在している多数若しくはすべての標的細胞を有効に殺滅するため、哺乳動物の身体内部に十分な期間存在してから、不活性化されることがあることは想定される。不活性化は、非限定例として、ＮＫ－９２細胞が感受性のある不活性化剤を投与することにより誘導されてもよい。

【0198】

本明細書で用いられるとき、用語「細胞傷害性」及び「細胞溶解性」は、ＮＫ－９２細胞などのエフェクター細胞の活性を説明するために用いられるとき、同義であることが意図される。一般に、細胞傷害活性は、種々の生物学的、生化学的、又は生物物理的機構のいずれかによる標的細胞の殺滅に関する。細胞溶解は、より詳細には、エフェクターが標的細胞の原形質膜を溶解し、それによりその物理的完全性を破壊するような活性に関する。これにより、標的細胞の殺滅がもたらされる。理論によって拘束されることを望まないが、ＮＫ－９２細胞の細胞傷害性効果が細胞溶解に起因すると考えられる。

【0199】

細胞／細胞集団に関連する用語「殺滅する」は、細胞／細胞集団の死滅をもたらすことになるいずれかの操作のタイプを含むことが意図される。

【0200】

用語「Ｆｃ受容体」は、Ｆｃ領域として知られる抗体の一部に結合することにより免疫細胞の保護的機能に寄与する、特定の細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞）の表面上に見出されるタンパク質を指す。抗体のＦｃ領域の細胞のＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合により、細胞の食作用性又は細胞傷害活性が、抗体媒介性食作用又は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を介して刺激される。ＦｃＲは、それが認識する抗体のタイプに基づいて分類される。例えば、Ｆｃ－γ受容体（ＦＣγＲ）は、抗体のＩｇＧクラスに結合する。ＦＣγＲＩＩＩ－Ａ（ＣＤ１６とも称される；配列番号２０）は、ＩｇＧ抗体に結合し、ＡＤＣＣを活性化する低親和性Ｆｃ受容体である。ＦＣγＲＩＩＩ－Ａは、典型的にはＮＫ細胞上に見出される。ＮＫ－９２細胞は、ＦＣγＲＩＩＩ－Ａを発現しない。Ｆｃ－ε受容体（ＦｃεＲ）は、ＩｇＥ抗体のＦｃ領域に結合する。

【0201】

用語「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）は、本明細書で用いられるとき、細胞外抗原結合ドメインが細胞内シグナル伝達ドメインに融合されたものを指す。ＣＡＲは、細胞傷害性を増強するため、Ｔ細胞又はＮＫ細胞において発現され得る。一般に、細胞外抗原結合ドメインは、目的の細胞上に見出される抗原に特異的なｓｃＦｖである。ＣＡＲを発現するＮＫ－９２細胞は、ｓｃＦｖドメインの特異性に基づいて、細胞表面上に特定の抗原を発現する細胞を標的にする。ｓｃＦｖドメインは、腫瘍特異抗原及びウイルス特異的抗原を含む任意の抗原を認識するように改変され得る。例えば、ＣＤ１９ＣＡＲは、いくつかのがんによって発現される細胞表面マーカーであるＣＤ１９を認識する。

【0202】

用語「腫瘍特異抗原」は、本明細書で用いられるとき、がん又は腫瘍性細胞上に提示されるが、がん細胞と同じ組織又は系統に由来する正常細胞上で検出不能である抗原を指す。腫瘍特異抗原はまた、本明細書で用いられるとき、腫瘍関連抗原、即ちがん細胞上で、がん細胞と同じ組織又は系統に由来する正常細胞と比べてより高いレベルで発現される抗原を指す。

【0203】

用語「ウイルス特異的抗原」は、本明細書で用いられるとき、ウイルス感染細胞上に提示されるが、ウイルス感染細胞と同じ組織又は系統に由来する正常細胞上で検出不能である抗原を指す。一実施形態では、ウイルス特異的抗原は、感染細胞の表面上に発現されるウイルスタンパク質である。

【0204】

用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」及び「オリゴヌクレオチド」は、互換可能に用いられ、任意の長さのヌクレオチドの高分子形態、即ちデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド又はその類似体のいずれかを指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有する可能性があり、既知又は未知の任意の機能を実行することがある。以下は、ポリヌクレオチドの非限定例：遺伝子又は遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴ又はＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマーである。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体を含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリヌクレオチドのアセンブリの前又は後に設けることができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断され得る。ポリヌクレオチドは、重合後、例えば標識成分とのコンジュゲーションにより、さらに修飾され得る。該用語はまた、二本鎖及び一本鎖分子の双方を指す。特に指定又は要求されない限り、ポリヌクレオチドである本発明のいずれかの実施形態は、二本鎖形態と二本鎖形態を形成することが知られるか又は予測される２つの相補的一本鎖形態の各々の双方を包含する。

【0205】

ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドがＲＮＡであるとき、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；チミン（Ｔ）；及びチミンに対応するウラシル（Ｕ）の特定配列からなる。したがって、用語「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット順の表現である。

【0206】

「相同性」又は「同一性」又は「類似性」は、２つのペプチド間又は２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較を目的として整列されてもよい各配列内の位置を比較することにより判定され得る。比較される配列内の位置が同じ塩基又はアミノ酸で占められるとき、分子はその位置で相同性がある。配列間の相同性の程度は、配列によって共有されるマッチ又は相同位置の数の関数である。

【0207】

本明細書で用いられるとき、「パーセント同一性」は、２つのペプチド間又は２つの核酸分子間の配列同一性を指す。パーセント同一性は、比較を目的として整列されてもよい各配列内の位置を比較することにより判定され得る。比較される配列内の位置が同じ塩基又はアミノ酸で占められるとき、分子はその位置で同一性がある。相同性ヌクレオチド配列は、本明細書に示されるヌクレオチド配列の天然に存在する対立遺伝子変異体及び突然変異をコードする配列を含む。相同性ヌクレオチド配列は、ヒト以外の哺乳動物種のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。相同性アミノ酸配列は、保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、ここでポリペプチドは、同じ結合性及び／又は活性を有する。いくつかの実施形態では、相同性アミノ酸配列は、１５以下、１０以下、５以下又は３以下の保存的アミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド又はアミノ酸配列は、本明細書に記載の配列に対して、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又はそれより大きいパーセントの同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド又はアミノ酸配列は、本明細書に記載の配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する。パーセント同一性は、例えば、スミス及びウォーターマンのアルゴリズムを用いて、デフォルト設定を用いる、Ｇａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，ＵＮＩＸ向けのバージョン８，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）により判定可能である（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２－４８９）。パーセント配列同一性の判定に適したアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－４０２，１９７７）、及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０）の各々に記載のＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを含む。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により公的に利用可能である（インターネットｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラムは（ヌクレオチド配列の場合）、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４及び両ストランドの比較を用いる。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワード長３、及び期待値（Ｅ）１０、並びにＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５，１９８９を参照）のアラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４を用いる。

【0208】

いくつかの実施形態では、核酸配列は、特定種における発現のため、コドン最適化され、例えば、マウス配列は、ヒトにおける発現のため、コドン最適化され得る（コドン最適化核酸配列によってコードされるタンパク質の発現）。したがって、いくつかの実施形態では、コドン最適化核酸配列は、本明細書に記載の核酸配列に対して、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％又はより大きいパーセント同一性を有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化核酸配列は、本明細書に記載の配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する。

【0209】

用語「発現する」は、遺伝子産物（例えばタンパク質）の生成を指す。用語「一過性」は、発現を参照するとき、あるポリヌクレオチドが細胞のゲノム中に組み込まれないことを意味する。用語「安定な」は、発現を参照するとき、あるポリヌクレオチドが細胞のゲノム中に組み込まれる、又はポジティブ選択マーカー（即ち、特定の増殖条件下で利益をもたらす細胞によって発現される外因性遺伝子）が導入遺伝子の発現を維持するために利用されることを意味する。

【0210】

用語「サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）」又は「サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）」は、免疫系の細胞に影響する生体分子の一般的クラスを指す。代表的なサイトカインとして、限定はされないがインターフェロン及びインターロイキン（ＩＬ）、特に、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８及びＩＬ－２１が挙げられる。好ましい実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－２である。

【0211】

本明細書で用いられるとき、用語「ベクター」は、ベクターが、例えば形質転換のプロセスにより、許容細胞内に置かれるときに複製されてもよいように、インタクトなレプリコンを含む非染色体核酸を指す。ベクターは、１つの細胞型、例えば細菌において複製することがあるが、別の細胞、例えば哺乳動物細胞において複製する能力をわずかに有するか又は有しない。ベクターは、ウイルス性であってもよく、又は非ウイルス性であってもよい。核酸を送達するための代表的な非ウイルスベクターは、ネイキッドＤＮＡ；カチオン性脂質と単独で又はカチオン性ポリマーと組み合わせて複合体化したＤＮＡ；アニオン性及びカチオン性リポソーム；場合によってはリポソーム中に含まれる、不均一なポリリジン、規定長のオリゴペプチド、及びポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーと縮合されたＤＮＡを含むＤＮＡ－タンパク質複合体及び粒子；並びにウイルス及びポリリジン－ＤＮＡを含む三元複合体を用いたもの、を含む。一実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター、例えばアデノウイルスである。ウイルスベクターは、当該技術分野で周知である。

【0212】

本明細書で用いられるとき、用語「標的化される」は、タンパク質発現を参照するとき、限定はされないが、タンパク質又はポリペプチドを細胞内又は細胞外の適切な目的地に誘導することを含むように意図される。標的化は、典型的には、ポリペプチド鎖内のアミノ酸残基のストレッチである、シグナルペプチド又は標的化ペプチドを通じて達成される。これらのシグナルペプチドは、ポリペプチド配列内のどこかに位置づけることができるが、Ｎ末端上に位置づけられることが多い。ポリペプチドはまた、Ｃ末端上にシグナルペプチドを有するように改変され得る。シグナルペプチドは、ポリペプチドを、原形質膜、ゴルジ、エンドソーム、小胞体、及び他の細胞区画に対して位置する細胞外区域に誘導し得る。例えば、Ｃ末端上に特定のアミノ酸配列（例えばＫＤＥＬ）を有するポリペプチドは、ＥＲルーメン内に保持されるか又はＥＲルーメンに再び輸送される。

【0213】

本明細書で用いられるとき、用語「標的」は、腫瘍の標的化を参照するとき、ＮＫ－９２細胞が腫瘍細胞（即ち標的細胞）を認識し、殺滅する能力を指す。これに関連する用語「標的化される」は、例えば、ＮＫ－９２細胞によって発現されるＣＡＲが、腫瘍によって発現される細胞表面抗原を認識し、それに結合する能力を指す。

【0214】

本明細書で用いられるとき、用語「トランスフェクトする」は、核酸の細胞への挿入を指す。トランスフェクションは、核酸が細胞に侵入することを可能にする任意の手段を用いて実施されてもよい。ＤＮＡ及び／又はｍＲＮＡは、細胞にトランスフェクトされてもよい。好ましくは、トランスフェクト細胞は、核酸によってコードされる遺伝子産物（即ちタンパク質）を発現する。

【0215】

用語「自殺遺伝子」は、その導入遺伝子を発現する細胞のネガティブ選択を可能にする導入遺伝子を指す。自殺遺伝子は、該遺伝子を発現する細胞が選択的薬剤の導入によって殺滅されることを可能にするような安全システムとして用いられる。いくつかの自殺遺伝子システムが同定されており、例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ｇｐｔ遺伝子、及び大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）Ｄｅｏ遺伝子が挙げられる（例えば、Ｙａｚａｗａ Ｋ，Ｆｉｓｈｅｒ Ｗ Ｅ，Ｂｒｕｎｉｃａｒｄｉ Ｆ Ｃ：Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ．Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｓｕｒｇ．２００２ Ｊｕｌｙ；２６（７）：７８３－９も参照されたし）。一実施形態では、自殺遺伝子は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子である。ＴＫ遺伝子は、野生型又は突然変異体ＴＫ遺伝子であってもよい（例えば、ｔｋ３０、ｔｋ７５、ｓｒ３９ｔｋ）。ＴＫタンパク質を発現する細胞は、ガンシクロビルを用いて殺滅され得る。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A-3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A-8B】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24-1】

【図24-2】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51】

【図52】

【図53】

【図54】

【図55】

【図56】

【図57】

【図58】

【図59】

【図60】

【図61】

【図62】

【図63】

【図64】

【図65】

【配列表】

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