特許 7537014 Ｌ－シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミクム変異株およびこれを用いたＬ－シトルリンの生産方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-08-09

(45)【発行日】2024-08-20

(54)【発明の名称】Ｌ－シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミクム変異株およびこれを用いたＬ－シトルリンの生産方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20240813BHJP

   C12P 13/10 20060101ALI20240813BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20240813BHJP

   C12N 15/31 20060101ALN20240813BHJP

【ＦＩ】

C12N1/21

C12P13/10 A ZNA

C12N1/20 A

C12N15/31

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2023514999

(86)(22)【出願日】2021-03-23

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-09-22

(86)【国際出願番号】 KR2021003602

(87)【国際公開番号】W WO2022071638

(87)【国際公開日】2022-04-07

【審査請求日】2023-03-03

(31)【優先権主張番号】10-2020-0127021

(32)【優先日】2020-09-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】518431347

【氏名又は名称】デサン・コーポレイション

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】ドン・ソク・イ

(72)【発明者】

【氏名】ミン・ジン・チェ

(72)【発明者】

【氏名】ムン・ジョン・キム

(72)【発明者】

【氏名】ソク・ヒョン・パク

(72)【発明者】

【氏名】ジェ・チュン・ハン

【審査官】藤山 純

(56)【参考文献】

【文献】特開昭６１－２１６６９７（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０２０／００９５６２２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】STANSEN, C et al.，Characterization of a Corynebacterium glutamicum lactate utilization operon induced during temperature-triggered glutamate production，Appl Environ Microbiol，71(10)，2005年10月，pp.5920-5928

【文献】ZHANG, B et al.，Application of CRISPRi in Corynebacterium for shikimic acid production，Biotechnol Lett，38(12)，2016年12月，pp.2153-2161

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ｃ１２Ｐ １３／１０

Ｃ１２Ｎ １／２０

Ｃ１２Ｎ １５／３１

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＮＣｇｌ２８１６遺伝子の全部または一部が挿入、置換または欠失したコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）変異株であって、ＮＣｇｌ２８１６遺伝子によって発現するタンパク質の活性が野生型コリネバクテリウムグルタミクムに比べて弱化または不活性化された、コリネバクテリウムグルタミクム変異株を含む、Ｌ－シトルリン生産用組成物。

【請求項2】

前記ＮＣｇｌ２８１６遺伝子は、配列番号１の塩基配列からなるものである、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

ａ）請求項１に規定のコリネバクテリウムグルタミクム変異株を培地で培養するステップと、
ｂ）前記培養された変異株または変異株が培養された培地からＬ－シトルリンを回収するステップとを含むＬ－シトルリンの生産方法。

【請求項4】

ＮＣｇｌ２８１６遺伝子の全部または一部が挿入、置換または欠失したコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）変異株であって、ＮＣｇｌ２８１６遺伝子によって発現するタンパク質の活性が野生型コリネバクテリウムグルタミクムに比べて弱化または不活性化された、コリネバクテリウムグルタミクム変異株を含む、Ｌ－シトルリン産生剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｌ－シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミクム変異株およびこれを用いたＬ－シトルリンの生産方法に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｌ－シトルリン（ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ）は非必須アミノ酸の一つで、シトルリンにはアンモニア代謝促進や血管拡張による血流改善、血圧低下、神経伝達、免疫力増進、活性酸素消去などの有用な作用があることが知られている。このようなシトルリンはアルギニンの生合成過程で中間生産物として合成される。微生物におけるアルギニンの生合成は、線状段階と環状段階の互いに異なる２つの経路を通して、Ｌ－グルタメート（Ｌ－ｇｌｕｔａｍａｔｅ）から８つの酵素ステップを経て行われる。線状ステップにおいて、Ｌ－アルギニンは、Ｌ－グルタメートからＮ－アセチルグルタメート（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ）、Ｎ－アセチルオルニチン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、オルニチン（ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、シトルリン（ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ）、そしてアルギニノスクシネート（ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ）を経て合成される。

【0003】

Ｌ－シトルリンの生産は、一般的に細菌や酵母のような微生物を用いた発酵によって生産され、自然状態で得られた野生型菌株やそのＬ－シトルリン生産能が向上するように変形された変異株を用いることができる。最近は、Ｌ－シトルリンの生産効率を改善させるために、Ｌ－アミノ酸およびその他の有用物質の生産に多く用いられる大膓菌、コリネバクテリウムなどの微生物を対象に遺伝子組換え技術を適用して優れたＬ－シトルリン生産能を有する多様な組換え菌株または変異株およびこれを用いたＬ－シトルリンの生産方法が開発されている。韓国登録特許第１０－１１０２２６３号および第１０－１０５３４２９号によれば、Ｌ－シトルリンの生産に関わる酵素、転写因子などタンパク質の活性または発現を強化したり弱化することにより、Ｌ－シトルリン生産能が向上することを確認した。したがって、Ｌ－シトルリンの生産経路に作用する多様なタンパク質の活性または発現調節によりＬ－シトルリンの生産量も調節できると期待することができる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【文献】韓国登録特許第１０－１１０２２６３号

【文献】韓国登録特許第１０－１０５３４２９号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、Ｌ－シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）変異株を提供することを目的とする。

【0006】

また、本発明は、前記変異株を用いたＬ－シトルリンの生産方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、コリネバクテリウムグルタミクム菌株を用いてＬ－シトルリン生産能が向上した新たな変異株を開発するために研究した結果、Ｌ－シトルリンの生産経路に作用する輸送タンパク質（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒまたはｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）を暗号化するＮＣｇｌ２８１６遺伝子を除去する場合、Ｌ－シトルリンの生産量が増加することを確認することにより、本発明を完成した。

【0008】

本発明の一態様は、ＮＣｇｌ２８１６遺伝子によって発現するタンパク質の活性が弱化または不活性化された、Ｌ－シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミクム変異株を提供する。

【0009】

本発明で使用された「ＮＣｇｌ２８１６遺伝子」は、細胞膜で物質が移動する時、細胞の外と中との濃度差を乗り切って栄養を選択的に吸収または排出する能動輸送（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）に関与する多様な輸送タンパク質の中で推定内在性膜輸送タンパク質（ｐｕｔａｔｉｖｅ ｉｎｔｅｇｒａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）を暗号化する遺伝子を意味する。

【0010】

本発明の一具体例によれば、前記ＮＣｇｌ２８１６遺伝子は、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株に由来するものであってもよい。具体的には、前記コリネバクテリウム属菌株は、コリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウムクルディラクティス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ）、コリネバクテリウムデゼルティ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｓｅｒｔｉ）、コリネバクテリウムカルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウムスラナリーエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｒａｎａｒｅｅａｅ）、コリネバクテリウムルブリカンティス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｕｂｒｉｃａｎｔｉｓ）、コリネバクテリウムドオサネンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｏｓａｎｅｎｓｅ）、コリネバクテリウムエフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウムウテレクイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｔｅｒｅｑｕｉ）、コリネバクテリウムスタチオニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ）、コリネバクテリウムパケンセ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｃａｅｎｓｅ）、コリネバクテリウムシングラレ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｎｇｕｌａｒｅ）、コリネバクテリウムヒュミレデュセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）、コリネバクテリウムマリヌム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）、コリネバクテリウムハロトレランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、コリネバクテリウムスフェニスコルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｈｅｎｉｓｃｏｒｕｍ）、コリネバクテリウムフレイブルゲンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｉｂｕｒｇｅｎｓｅ）、コリネバクテリウムストリアツム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒｉａｔｕｍ）、コリネバクテリウムカニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｎｉｓ）、コリネバクテリウムアンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウムレナレ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｎａｌｅ）、コリネバクテリウムポルティソリ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｌｌｕｔｉｓｏｌｉ）、コリネバクテリウムイミタンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｉｔａｎｓ）、コリネバクテリウムカスピウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｓｐｉｕｍ）、コリネバクテリウムテスツディノリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｅｓｔｕｄｉｎｏｒｉｓ）、コリネバクテリウムシュードペラルギ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃａｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｐｅｌａｒｇｉ）またはコリネバクテリウムフラベセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）であってもよいし、これに限定されるものではない。

【0011】

本発明の一具体例によれば、前記ＮＣｇｌ２８１６遺伝子は、配列番号１の塩基配列からなるものであってもよい。また、本発明の一具体例によれば、前記ＮＣｇｌ２８１６遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列で暗号化されたものであってもよい。

【0012】

本発明の一具体例によれば、前記ＮＣｇｌ２８１６遺伝子によって発現するタンパク質は、Ｌ－シトルリンの生産経路に関与する輸送タンパク質であって、このような輸送タンパク質がＬ－シトルリンの生産に及ぼす影響については知られたり、研究されたことがない。しかし、本発明者らは、輸送タンパク質を暗号化するＮＣｇｌ２８１６遺伝子を欠失させる場合、膜安定性が向上し、Ｌ－シトルリンの排出が増加するだけでなく、Ｌ－シトルリンの過剰生産時に付加的に検出される中間体６－アセチルオルニチン（６－ａｃｅｔｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）の排出を抑制してＬ－シトルリンを高収率および高濃度で生産できることを確認した。

【0013】

本発明で使用された「活性が弱化」とは、オブジェクトの遺伝子の発現量が本来の発現量より減少することを意味する。このような活性の弱化は、遺伝子を暗号化するヌクレオチド置換、挿入、欠失、またはこれらの組み合わせによりタンパク質自体の活性が本来微生物が持っているタンパク質の活性に比べて減少した場合と、これを暗号化する遺伝子の発現阻害または翻訳阻害などにより、細胞内で全体的な酵素活性の程度が天然型菌株、野生型菌株または変形前の菌株に比べて低い場合、これらの組み合わせも含む。

【0014】

本発明で使用された「不活性化」は、酵素、転写因子、輸送タンパク質などタンパク質を暗号化する遺伝子の発現が天然型菌株、野生型菌株または変形前の菌株に比べて全く発現しない場合であったり、発現してもその活性がない場合を意味する。

【0015】

本発明の一実施例によれば、コリネバクテリウムグルタミクム菌株のＮＣｇｌ２８１６遺伝子を欠失させて野生型コリネバクテリウムグルタミクム菌株またはシトルリンが過剰生産されるように既に開発されたコリネバクテリウムグルタミクム変異株に比べて、Ｌ－シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミクム変異株を取得した。

【0016】

本発明で使用された「生産能が向上した」とは、親菌株に比べてＬ－シトルリンの生産性が増加したことを意味する。前記親菌株は、変異の対象になる野生型または変異株を意味し、直接変異の対象になったり、組換えられたベクターなどで形質転換される対象を含む。本発明において、親菌株は、野生型コリネバクテリウムグルタミクム菌株または野生型から変異した菌株であってもよい。例えば、シトルリンが過剰生産されるようにオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼおよびカルバモイルリン酸合成酵素の活性が強化されたコリネバクテリウムグルタミクム変異株（韓国特許出願第１０－２０１９－０１５１３２１号参照）であってもよい。

【0017】

本発明の一実施例によれば、前記Ｌ－シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウムグルタミクム変異株は、親菌株に比べて増加したＬ－シトルリン生産能を示し、特に、親菌株に比べてＬ－シトルリンの量が０．５％以上、具体的には０．５％～５％増加したものであってもよいし、この時、副産物として生産される６－アセチルオルニチンが２０％以上、具体的には２０～５０％減少したものであってもよい。

【0018】

本発明の一具体例によるコリネバクテリウムグルタミクム変異株は、親菌株においてＮＣｇｌ２８１６遺伝子を欠失する組換えベクターにより実現できる。

【0019】

本発明で使用された「ベクター」は、宿主細胞で核酸のクローニングおよび／または転移のための任意の媒介物をいう。ベクターは、他のＤＮＡ断片が結合して結合された断片の複製をもたらすことができる複製単位（ｒｅｐｌｉｃｏｎ）であってもよい。「複製単位」とは、生体内でＤＮＡ複製の自己ユニットとして機能する、すなわち、自らの調節によって複製可能な、任意の遺伝的単位（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）をいう。本発明において、ベクターは、宿主の中で複製可能なものであれば特に限定されず、当業界にて知られた任意のベクターを用いることができる。前記組換えベクターの作製に使用されたベクターは、天然状態または組換えられた状態のプラスミド、コスミド、ウイルスおよびバクテリオファージであってもよい。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＥＭＢＬ３、λＥＭＢＬ４、λＦＩＸＩＩ、λＤＡＳＨＩＩ、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１０、λｇｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、およびＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを使用することができ、プラスミドベクターとして、ｐＤＺベクター、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系およびｐＥＴ系などを使用することができるが、これらに限定されるものではない。

【0020】

本発明で使用された「形質転換」は、遺伝子を宿主細胞内に導入して宿主細胞内で発現させることができることであり、形質転換された遺伝子は、宿主細胞内で発現できれば、宿主細胞の染色体内挿入または染色体外に位置しているものでも制限なく含まれる。

【0021】

本発明の一具体例によれば、形質転換させる方法は、核酸を細胞内に導入するいかなる方法も含まれ、宿主細胞によって当分野にて公知のような好適な標準技術を選択して行うことができる。例えば、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、微細注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、陽イオンリポソーム法、および酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法などが使用できるが、これに限定されない。

【0022】

本発明の一実施例によれば、形質転換方法として、電気穿孔方法（ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５２，５４１－５４５，１９９９）を使用することができる。

【0023】

前記宿主細胞は、生体内または試験管内で本発明の組換えベクターまたはポリヌクレオチドで形質感染、形質転換、または感染した細胞を含む。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は、組換え宿主細胞、組換え細胞または組換え微生物である。

【0024】

また、本発明による組換えベクターは、選択マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）を含むことができるが、前記選択マーカーは、ベクターで形質転換された形質転換体（宿主細胞）を選別するためのものであって、前記選択マーカーが処理された培地で選択マーカーを発現する細胞のみ生存できるため、形質転換された細胞の選別が可能である。前記選択マーカーは、代表例として、カナマイシン、ストレプトマイシン、クロラムフェニコールなどがあるが、これらに限定されるものではない。

【0025】

本発明の形質転換用組換えベクター内に挿入された遺伝子は、相同性組換え交差によってコリネバクテリウム属菌株、大膓菌などの微生物のような宿主細胞内に置換されていてもよい。

【0026】

また、本発明の他の態様は、ａ）前記コリネバクテリウムグルタミクム変異株を培地で培養するステップと、ｂ）前記変異株または変異株が培養された培地からＬ－シトルリンを回収するステップとを含むＬ－シトルリンの生産方法を提供する。

【0027】

前記培養は、当業界にて知られた適切な培地と培養条件によって行われてもよいし、通常の技術者であれば、培地および培養条件を容易に調整して使用可能である。具体的には、前記培地は、液体培地であってもよいが、これに限定されるものではない。培養方法は、例えば、回分式培養（ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続式培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ）、流加式培養（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、またはこれらの組み合わせ培養を含むことができるが、これに限定されるものではない。

【0028】

本発明の一具体例によれば、前記培地は、適切な方式で特定菌株の要件を満たさなければならず、通常の技術者によって適宜変形可能である。コリネバクテリウム属菌株に対する培養培地は、公知の文献（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ，１９８１）を参照できるが、これに限定されるものではない。

【0029】

本発明の一具体例によれば、培地に多様な炭素源、窒素源および微量元素成分を含むことができる。使用可能な炭素源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、セルロースのような糖および炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ココナッツ油などのようなオイルおよび脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸が含まれる。これらの物質は個別的にまたは混合物として使用できるが、これに限定されるものではない。使用可能な窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆麦および尿素または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムが含まれる。窒素源も個別的にまたは混合物として使用することができるが、これに限定されるものではない。使用可能なリンの供給源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウム－含有塩が含まれてもよいし、これに限定されるものではない。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有することができ、これに限定されるものではない。その他、アミノ酸およびビタミンのような必須成長物質が含まれる。また、培養培地に適切な前駆体が使用できる。前記培地または個別成分は、培養過程で培養液に適切な方式によって回分式または連続式で添加できるが、これに限定されるものではない。

【0030】

本発明の一具体例によれば、培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸および硫酸のような化合物を微生物培養液に適切な方式で添加して培養液のｐＨを調整することができる。また、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。追加的に、培養液の好気状態を維持するために、培養液中に酸素または酸素－含有気体（例、空気）を注入することができる。培養液の温度は、通常２０℃～４５℃、例えば２５℃～４０℃であってもよい。培養期間は、有用物質が所望の生産量で得られるまで継続してもよいし、例えば１０～１６０時間であってもよい。

【0031】

本発明の一具体例によれば、前記培養された変異株および変異株が培養された培地からＬ－シトルリンを回収するステップは、培養方法によって当該分野にて公知の好適な方法を用いて培地から生産されたＬ－シトルリンを収集または回収することができる。例えば、遠心分離、濾過、抽出、噴霧、乾燥、蒸発、沈殿、結晶化、電気泳動、分別溶解（例えば、アンモニウムスルフェート沈殿）、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性およびサイズ排除）などの方法を使用することができるが、これに限定されない。

【0032】

本発明の一具体例によれば、Ｌ－シトルリンを回収するステップは、培養培地を低速遠心分離してバイオマスを除去し、得られた上澄液をイオン交換クロマトグラフィーにより分離することができる。

【0033】

本発明の一具体例によれば、前記Ｌ－シトルリンを回収するステップは、Ｌ－シトルリンを精製する工程を含むことができる。

【発明の効果】

【0034】

本発明によるコリネバクテリウムグルタミクム変異株は、ＮＣｇｌ２８１６遺伝子によって発現する輸送タンパク質の活性が弱化または不活性化されることにより、Ｌ－シトルリンを高収率および高濃度で生産することができる。

【発明を実施するための形態】

【0035】

以下、本発明をより詳細に説明する。しかし、このような説明は本発明の理解のために例として提示されたものに過ぎず、本発明の範囲がこのような例示的な説明によって制限されるものではない。

【実施例】

【0036】

実施例１．シトルリン生産菌株の転写体量の変化の分析
１－１．菌体採集
シトルリン生産菌株の転写体量の変化を分析するために、菌株成長ステップの変化時点で菌体採集を行った。

【0037】

まず、シトルリンが過剰生産されるようにオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼおよびカルバモイルリン酸合成酵素の活性が強化されたコリネバクテリウムグルタミクム変異株（韓国特許出願第１０－２０１９－０１５１３２１号参照、以下、「ＣＴ４」という）と野生型コリネバクテリウムグルタミクム菌株（ＡＴＣＣ１３０３２）をそれぞれシトルリン種培地に接種して３０℃で１０時間培養後、培養液２５０ｍＬを５Ｌ培養器の培地に接種した。初期培地に含まれた糖がすべて消尽すれば、追加培地を投入した。接種後、培養１３、２８、３５、６８時間の時点で菌体を採集して、転写体分析サンプルの製造に使用した。本実験で使用された培地の組成は、下記表１の通りである。

【0038】

【表1】

【0039】

１－２．転写体分析サンプルの製造
前記１－１で菌体採集後、培養終了液を同一の濃度で集積して、Ｒｎｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、ドイツ）を用いて使用マニュアルに従ってＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡは液体窒素に保管した状態で（株）マクロジェンに伝達して全体遺伝子転写体の分析を依頼した。

【0040】

１－３．有効遺伝子候補の選別
前記１－２で分析されたコリネバクテリウムグルタミクムの全体遺伝子転写体の分析結果に基づき、透過酵素（ｐｅｒｍｅａｓｅ）および輸送タンパク質（ｔｒａｎｓｐｏｔｅｒ）の中から、ＲＰＫＭ値が１０００を超えて発酵後半に急激に増加したり、野生型菌株に比べて３倍以上発現量が高い候補遺伝子４０個を１次選別した。参照として、野生型コリネバクテリウムグルタミクム菌株（ＡＴＣＣ１３０３２）は、シトルリン生産能がほとんどないことが知られている。

【0041】

４０個の遺伝子をそれぞれ欠損したコリネバクテリウムグルタミクム菌株をフラスコ力価培地（下記表２参照）に接種して、３０℃、２００ｒｐｍ、３０時間培養した。培養終了後、培養液を蒸留水で１００倍希釈し、０．４５ｕｍのフィルタで濾過した後、カラム（ＤｉｏｎｅｘＩｏｎＰａｃ^ＴＭ ＣＳ１２Ａ）と紫外線検出器（１９５ｍｍ）が装着された高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、菌株で生産された培養液中のＬ－シトルリンと副産物である６－アセチルオルニチン（６－ａｃｅｔｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）の濃度を測定した。候補遺伝子４０個の中から６－アセチルオルニチンの濃度が低い５個の候補群を２次選別し、野生型菌株および選別された５個の候補群のＬ－シトルリンおよび６－アセチルオルニチン（６－ａｃｅｔｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）の濃度を、下記表３に示した。

【0042】

【表2】

【0043】

【表3】

【0044】

その結果、ＮＣｇｌ２８１６遺伝子を欠損した菌株においてＬ－シトルリンの生産量が最も高くかつ、６－アセチルオルニチンの生産量が最も低いことが明らかになり、菌株のＬ－シトルリンの生産量を向上させるための欠失遺伝子としてＮＣｇｌ２８１６遺伝子を選択した。

【0045】

実施例２．ＮＣｇｌ２８１６遺伝子が欠失した変異株の製造
２－１．ベクターの作製
コリネバクテリウムグルタミクム変異株を製造するために、野生型コリネバクテリウムグルタミクム菌株（ＡＴＣＣ１３０３２）を使用した。

【0046】

まず、Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を用いて野生型菌株から染色体ＤＮＡを抽出した後、これを鋳型としてプライマー１および２とプライマー３および４の組み合わせでそれぞれＰＣＲを行った。これにより得られたＰＣＲ産物を再度プライマー１および４の組み合わせを用いてクロスオーバー（ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）ＰＣＲで増幅した後、組換えベクターｐＫ１９ｍｏｂＳａｃＢの制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ位置に挿入した。これをベクターｐＫ１９ｍｓ／△ＮＣｇｌ２８１６と名付けた。前記ベクターを作製するのに下記表４のプライマーを使用した。

【0047】

【表4】

【0048】

以上のプライマーを用いて、下記の条件下でＰＣＲを行った。Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（ＴＰ６００、ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ Ｉｎｃ．、日本）を用いて、それぞれのデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）１００μＭが添加された反応液に、オリゴヌクレオチド１ｐＭ、コリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡ１０ｎｇを鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ、日本）１ユニットの存在下で２５～３０周期（ｃｙｃｌｅ）を行った。ＰＣＲの実施条件は、（ｉ）変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）ステップ：９４℃で３０秒、（ｉｉ）結合（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）ステップ：５８℃で３０秒、および（ｉｉｉ）拡張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ステップ：７２℃で１～２分（１ｋｂあたり２分の重合時間付与）の条件で実施した。

【0049】

このように製造された遺伝子断片を、ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ ｃｌｏｎｉｎｇを用いて、ｐＫ１９ｍｏｂＳａｃＢベクターにクローニングした。前記ベクターを大膓菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａに形質転換させ、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）を含有するＬＢ－寒天プレート上に塗抹して、３７℃で２４時間培養した。最終的に形成されるコロニーを分離して挿入物（ｉｎｓｅｒｔ）が正確にベクターに存在するかを確認した後、このベクターを分離してコリネバクテリウムグルタミクム菌株の組換えに使用した。

【0050】

前記方法で共通して行われた過程として、当該遺伝子の増幅は、コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ１３０３２ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡからＰＣＲ方法で増幅して、戦略によってｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｃｌｏｎｉｎｇ方法でｐＫ１９ｍｏｂＳａｃＢベクターに挿入してＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａから選別した。この時、増幅された遺伝子をｐＫ１９ｍｏｂＳａｃＢベクターに挿入するために、ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ、日本）および制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ（ＮＥＢ、イギリス）を供給されたバッファーおよびプロトコルによって使用した。

【0051】

２－２．変異株の製造
親菌株として変異株ＣＴ４に、前記２－１で作製されたｐＫ１９ｍｓ／ΔＮＣｇｌ２８１６ベクターを導入して、コリネバクテリウムグルタミクム変異株を製造した。

【0052】

具体的には、ＲＧ培地（Ｂｅｅｆ ｅｘｔｒａｃｔ１０ｇ／Ｌ、ＢＨＩ４０ｇ／Ｌおよびソルビトール３０ｇ／Ｌ含有）１００ｍｌで親菌株を１次培養し、同一培地に２．５ｇ／Ｌ ｇｌｙｃｉｎｅ、４００ｍｇ／Ｌ ｉｓｏｎｉａｚｉｄおよび０．１ｍｌ／Ｌ Ｔｗｅｅｎ８０を添加した培地を製造した。その後、ＯＤ_６１０値が０．３となるように種培養液を接種した後、３０℃、１８０ｒｐｍで３～５時間培養してＯＤ_６１０値が１．６～１．８となるようにした。氷で３０分間放置した後、４℃、３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。その後、上澄液を捨てて、沈殿した親菌株を１０％グリセロール溶液で４回洗浄し、最終的に１０％グリセロール溶液０．５ｍｌに再懸濁した。電気衝撃療法（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）はバイオ・ラッド（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）エレクトロポレーター（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ）を用いて行った。エレクトロポレーションキュベット（０．２ｍｍ）に、前記方法で製造したコンピテントセル（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）を入れてｐＫ１９ｍｓ／ΔＮＣｇｌ２８１６ベクターを添加した後、２．５ｋＶ、２００Ωおよび１２．５μＦの条件で電気衝撃を加えた。電気衝撃が終わってすぐに再生（Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）培地（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ１８．５ｇ／ｌおよびソルビトール０．５Ｍ含有）１ｍｌを添加し、４６℃で６分間熱処理した。その後、室温で冷やした後、１５ｍｌのキャップチューブに移して３０℃で２時間培養し、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎｅ）３０μｇ／ｍｌが含まれた固体培地（Ｂｒａｉｎｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ４０ｇ／Ｌ、Ｄ－ソルビトール３０ｇ／Ｌ、Ｂｅｅｆ ｅｘｔｒａｃｔ１０ｇ／ＬおよびＡｇａｒ２０ｇ／Ｌ含有）に塗抹した。３０℃で２日間培養してコロニーを得た。１次相同組換えが誘導されたコロニーのうち、前記表４のプライマー１および４を用いて前記２－１と同様の条件でＰＣＲ増幅が確認されたコロニーを１次組換え株として選別し、２ＹＴ液体培地（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ１６ｇ／Ｌ、Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ１０ｇ／ＬおよびＮａＣｌ５ｇ／Ｌ含有）で１２時間培養後、２ＹＴ－１０％ｓｕｃｒｏｓｅ固体培地（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ１６ｇ／Ｌ、Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌおよびｓｕｃｒｏｓｅ１００ｇ／Ｌ含有）に塗抹し、２次相同組換えを誘導して抗生剤マーカーを除去した。２ＹＴ－１０％ｓｕｃｒｏｓｅ固体培地で培養されたコロニーを、２ＹＴ－Ｋｍ培地（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ１６ｇ／Ｌ、Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌおよびカナマイシン３０μｇ／ｍｌ含有）と２ＹＴ－１０％ｓｕｃｒｏｓｅにパッチング（ｐａｔｃｈｉｎｇ）してカナマイシンに抵抗性がなく、１０％ｓｕｃｒｏｓｅ培地で生育可能な菌株を最終的に選別した。そして、前記表４のプライマー１および４を用いて前記２－１と同様の条件でＰＣＲを行って、ＮＣｇｌ２８１６遺伝子が除去されたかを最終的に確認し、ＮＣｇｌ２８１６遺伝子が欠失した菌株をＣＴ５と名付けた。

【0053】

実施例３．ＮＣｇｌ２８１６遺伝子が欠失した変異株のＬ－シトルリンの生産性の確認
親菌株として使用されたシトルリンを過剰生産するコリネバクテリウムグルタミクム変異株（ＣＴ４）および実施例２で製造されたＮＣｇｌ２８１６遺伝子が欠失した菌株（ＣＴ５）のＬ－シトルリンの生産性を比較した。

【0054】

各菌株をシトルリン種培地に接種して３０℃で１０時間培養後、培養液２５０ｍＬを５Ｌ培養器の培地に接種した。初期培地に含まれた糖がすべて消尽すれば、追加培地を投入した。本実験で使用された培地の組成は、前記表１の通りである。培養終了後、培養液を蒸留水で１００倍希釈し、０．４５ｕｍのフィルタで濾過した後、カラム（ＤｉｏｎｅｘＩｏｎＰａｃ^ＴＭ ＣＳ１２Ａ）と紫外線検出器（１９５ｍｍ）が装着された高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、菌株で生産された培養液中のＬ－シトルリンと副産物である６－アセチルオルニチン（６－ａｃｅｔｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）の濃度を測定し、その結果を下記表５に示した。

【0055】

【表5】

【0056】

前記表５に示しているように、ＮＣｇｌ２８１６遺伝子が欠失したコリネバクテリウムグルタミクム変異株ＣＴ５は、既に開発された変異株ＣＴ４に比べてＬ－シトルリンの生産性が約２％増加したのに対し、副産物である６－アセチルオルニチンの生産が約４４％減少したことが確認された。この結果を通して、ＮＣｇｌ２８１６遺伝子によって発現するタンパク質の活性が弱化または不活性化されることにより、菌株のＬ－シトルリン生産能が向上するだけでなく、副産物の生成が減少してＬ－シトルリンを高純度で生産できることが分かった。

【0057】

これまで本発明についてその好ましい実施例を中心に説明した。本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明が本発明の本質的な特性を逸脱しない範囲で変形された形態で実現できることを理解するであろう。そのため、開示された実施例は、限定的な観点ではなく、説明的な観点で考慮されなければならない。本発明の範囲は上述した説明ではなく特許請求の範囲に示されており、それと同等の範囲内にあるすべての差異は本発明に含まれたものと解釈されなければならない。

【配列表】

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