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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-13
(45)【発行日】2024-08-21
(54)【発明の名称】改変ノイラミニダーゼ
(51)【国際特許分類】
C12N 9/24 20060101AFI20240814BHJP
C12N 15/56 20060101ALI20240814BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20240814BHJP
C12N 15/57 20060101ALI20240814BHJP
A61K 38/47 20060101ALI20240814BHJP
A61K 38/48 20060101ALI20240814BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240814BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240814BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20240814BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240814BHJP
【ＦＩ】
C12N9/24
C12N15/56 ZNA
C12N15/864 100Z
C12N15/57
A61K38/47
A61K38/48
A61K35/76
A61K48/00
A61P3/00
A61P43/00
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2021530672
(86)(22)【出願日】2020-07-03
(86)【国際出願番号】 JP2020026174
(87)【国際公開番号】W WO2021006202
(87)【国際公開日】2021-01-14
【審査請求日】2023-06-13
(31)【優先権主張番号】P 2019126376
(32)【優先日】2019-07-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】304020292
【氏名又は名称】国立大学法人徳島大学
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(72)【発明者】
【氏名】伊藤 孝司
(72)【発明者】
【氏名】月本 準
【審査官】小林 薫
(56)【参考文献】
【文献】月本準ほか，アミノ酸置換によるヒトノイラミニダーゼ１（ＮＥＵ１）の細胞内結晶化の抑制と医療応用，第４１回日本分子生物学会年会 要旨集，2018年，[3P-0079]
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ９／００－ ９／９９
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ （ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号：１に示されるアミノ酸配列において：（ｉ）Ｗ１７３ＮおよびＫ１７５Ｓ変異、または
（ｉｉ）Ｋ３５８Ｎ変異、を含み、
配列番号：１に示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有する配列を含み、配列番号：１で示される野生型ノイラミニダーゼと比較して細胞内での結晶化が低下している、改変ノイラミニダーゼ。
【請求項2】
配列番号：２または配列番号：３に示される配列を有する、改変ノイラミニダーゼ。
【請求項3】
請求項１または２に記載の改変ノイラミニダーゼをコードする核酸。
【請求項4】
請求項３に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項5】
ＡＡＶベクターである、請求項４に記載のベクター。
【請求項6】
さらに、カテプシンＡをコードする核酸を含む、請求項４または５に記載のベクター。
【請求項7】
請求項１または２に記載の改変ノイラミニダーゼ、または請求項４～６のいずれか１項に記載のベクターを含む、医薬組成物。
【請求項8】
ノイラミニダーゼ１活性の欠失または減弱に関連する疾患の治療のための、請求項７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
この出願は、令和１年７月５日に日本国特許庁に出願された出願番号２０１９－１２６３７６号の優先権の利益を主張する。優先権基礎出願はその全体について、出典明示により本明細書の一部とする。
この出願は、令和１年７月５日に日本国特許庁に出願された出願番号２０１９－１２６３７６号の優先権の利益を主張する。優先権基礎出願はその全体について、出典明示により本明細書の一部とする。
【0002】
本発明は、改変ノイラミニダーゼ、改変ノイラミニダーゼをコードする遺伝子に関する。本発明はまた、改変ノイラミニダーゼとカテプシンＡとの組み合わせ、改変ノイラミニダーゼをコードする遺伝子とカテプシンＡをコードする遺伝子の組み合わせに関する。本発明はまた、これらの遺伝子を含むベクターにも関する。本発明はさらに、これらを含む医薬組成物にも関する。
【背景技術】
【0003】
ノイラミニダーゼ（Ｎ－アセチル－α－ノイラミニダーゼ、リソソームシアリダーゼともいう）は、糖鎖の末端シアル酸残基を加水分解により除去するグリコシダーゼの一種である。４種類のノイラミニダーゼがヒトの細胞内に存在することが知られている。なかでも、ノイラミニダーゼ１（以下、ＮＥＵ１とも称する）は、２つの臨床的に類似する神経変性的リソソーム蓄積症：シアリドーシスおよびガラクトシアリドーシスの標的酵素として精力的に研究されている。また、特許文献１には、ＮＥＵ１欠損がアミロイドーシスにも関連すること、非特許文献１には、ＮＥＵ１ががんの転移・浸潤にも関連すること、が開示されている。
【0004】
リソソーム蓄積症（リソソーム病、ライソゾーム病ともいう）は、細胞内外の生体分子の分解代謝を行う細胞内小器官（オルガネラ）であるリソソームに含まれる酸性加水分解酵素（リソソーム酵素）または補助因子をコードする遺伝子の変異に基づく、一群の先天性代謝異常症である。かつては治らない病であったが、１９９０年以降、動物又は植物培養細胞への正常ヒトリソソーム酵素遺伝子導入株から分泌・精製される組換え酵素製剤を患者の静脈内に定期的（１－２週間隔）に継続投与する、酵素補充療法（ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ；ＥＲＴ）が実用化され、主に末梢症状を伴う９種の疾患に対して臨床応用されている（非特許文献２）。しかしながら、酵素補充療法は適用できる疾患が限られているといった問題がある。このため、リソソーム蓄積症のさらなる治療法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特表２０１４－５２６９０４号公報
【非特許文献】
【0006】
【文献】生化学、第８０巻、第１号、１３－２３、２００８
【文献】薬学雑誌、Ｖｏｌ．１３８，Ｎｏ．７（２０１８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明者は、ヒトノイラミニダーゼ１を用いた遺伝子治療を検討したところ、ヒトノイラミニダーゼ１を過剰発現させると細胞内結晶を生じ、細胞が破れることを見出した。このため、ヒトノイラミニダーゼ１を遺伝子治療に応用することは、細胞を損傷することとなり、危険を伴うことを見出した。本発明の目的の一つは、細胞内で結晶化せず、遺伝子治療に用いることが可能な改変型ノイラミニダーゼを提供することである。また、本発明のさらなる目的の一つは、ノイラミニダーゼ１をリソソームに共局在させる手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ある種の改変ノイラミニダーゼ１が、細胞内で過剰発現させても結晶化しないことを見出した。また、カテプシンＡ（ＣＴＳＡ）を過剰発現させることにより、ノイラミニダーゼ１がリソソームと共局在することを見出した。本発明は、上記知見により完成されたものである。
【0009】
すなわち、本発明は、
（１）配列番号：１に示されるアミノ酸配列において：
（ｉ）Ｗ１７３ＮおよびＫ１７５Ｓ変異、または
（ｉｉ）Ｋ３５８Ｎ変異、を含み、
配列番号：１に示されるアミノ酸配列と８０％の配列同一性を有する配列を含む、改変ノイラミニダーゼ、
（２）配列番号：２または配列番号：３に示される配列を有する、改変ノイラミニダーゼ、
（３）（１）または（２）の改変ノイラミニダーゼをコードする核酸、
（４）（３）の核酸を含む、ベクター、
（５）ＡＡＶベクターである、（４）のベクター、
（６）さらに、カテプシンＡをコードする核酸を含む、（４）または（５）のベクター、
（７）（１）または（２）の改変ノイラミニダーゼ、または（４）～（６）のいずれかのベクターを含む、医薬組成物、
（８）ノイラミニダーゼ１活性の欠失または減弱に関連する疾患の治療のための、（７）の医薬組成物、
に関する。
（１）配列番号：１に示されるアミノ酸配列において：
（ｉ）Ｗ１７３ＮおよびＫ１７５Ｓ変異、または
（ｉｉ）Ｋ３５８Ｎ変異、を含み、
配列番号：１に示されるアミノ酸配列と８０％の配列同一性を有する配列を含む、改変ノイラミニダーゼ、
（２）配列番号：２または配列番号：３に示される配列を有する、改変ノイラミニダーゼ、
（３）（１）または（２）の改変ノイラミニダーゼをコードする核酸、
（４）（３）の核酸を含む、ベクター、
（５）ＡＡＶベクターである、（４）のベクター、
（６）さらに、カテプシンＡをコードする核酸を含む、（４）または（５）のベクター、
（７）（１）または（２）の改変ノイラミニダーゼ、または（４）～（６）のいずれかのベクターを含む、医薬組成物、
（８）ノイラミニダーゼ１活性の欠失または減弱に関連する疾患の治療のための、（７）の医薬組成物、
に関する。
【発明の効果】
【0010】
本発明により、過剰発現させても結晶化しない、または結晶化がごくわずかである改変ノイラミニダーゼ１を提供することができる。また、カテプシンＡとの併用により、ノイラミニダーゼ１をリソソームと共局在させることができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】ＮＥＵ１改変型を発現するプラスミドの一例を示す図である。
【図2】野生型ＮＥＵ１と比較した、ＮＥＵ１改変型１、２のノイラミニダーゼ活性を示す図である。
【図3】野生型ＮＥＵ１を過剰発現させたときの免疫染色結果を示す図である。Ａ：ＮＥＵ１、Ｂ：リソソーム、Ｃ：ＡとＢを重ね合わせた図である。核はＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、ＮＥＵ１は抗ＮＥＵ１、リソソームはＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒを用いて染色した。
【図4】ＮＥＵ１改変型１を過剰発現させたときの免疫染色結果を示す図である。Ａ：ＮＥＵ１、Ｂ：リソソーム、Ｃ：ＡとＢを重ね合わせた図である。核はＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、ＮＥＵ１は抗ＮＥＵ１、リソソームはＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒを用いて染色した。
【図5】ＣＴＳＡ過剰発現細胞を作製する際に使用したプラスミドを示す図である。
【図6】ＣＴＳＡ過剰発現細胞においてＮＥＵ１改変型１を過剰発現させたときの免疫染色結果を示す図である。Ａ：ＮＥＵ１、Ｂ：リソソーム、Ｃ：ＡとＢを重ね合わせた図である。核はＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、ＮＥＵ１は抗ＮＥＵ１、リソソームはＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒを用いて染色した。
【図7】ＣＴＳＡ＋ＮＥＵ１改変型同時発現プラスミドの一例を示す図である。
【図8】ネガティブコントロールとして使用したＥＧＦＰを発現するプラスミドを示す図である。
【図9】各プラスミドをＮＥＵ１ノックアウトＨＥＫ２９３細胞に導入した際のノイラミニダーゼ活性を示す図である。
【図10】各プラスミドをＮＥＵ１ノックアウトＨＥＫ２９３細胞に導入した際のカルボキシペプチダーゼ活性を示す図である。
【図11】各プラスミドをＣＴＳＡノックアウトＨＥＫ２９３細胞に導入した際のノイラミニダーゼ活性を示す図である。
【図12】各プラスミドをＣＴＳＡノックアウトＨＥＫ２９３細胞に導入した際のカルボキシペプチダーゼ活性を示す図である。
【図13】ＣＴＳＡ＋ＮＥＵ１改変型同時発現ＡＡＶベクター作製の手順を示す図である。
【図14】ＣＴＳＡ＋ＮＥＵ１改変型同時発現ＡＡＶベクター作製の手順を示す図である。
【図15】ＣＴＳＡ＋ＮＥＵ１改変型同時発現ＡＡＶベクター増幅の際に使用したベクターを示す図である。
【図16】ＥＧＦＰ発現ベクター（ネガティブコントロール）、ＣＴＳＡ＋ＮＥＵ１改変型同時発現ＡＡＶベクターを各種ＨＥＫ２９３細胞に投与した際のノイラミニダーゼ活性を示す図である。
【図17】ＥＧＦＰ発現ベクター（ネガティブコントロール）、ＣＴＳＡ＋ＮＥＵ１改変型同時発現ＡＡＶベクターを各種ＨＥＫ２９３細胞に投与した際のカルボキシペプチダーゼ活性を示す図である。
【図18】健常者の皮膚繊維芽細胞のノイラミニダーゼ活性、およびガラクトシアリドーシス患者由来の皮膚繊維芽細胞にＥＧＦＰ発現ベクター（ネガティブコントロール）、またはＣＴＳＡ＋ＮＥＵ１改変型同時発現ＡＡＶベクターを投与した際のノイラミニダーゼ活性を示す図である。
【図19】健常者の皮膚繊維芽細胞のノイラミニダーゼ活性、およびシアリドーシス患者由来の皮膚繊維芽細胞にＥＧＦＰ発現ベクター（ネガティブコントロール）、またはＣＴＳＡ＋ＮＥＵ１改変型同時発現ＡＡＶベクターを投与した際のノイラミニダーゼ活性を示す図である。
【図20】ＮＥＵ１改変型導入ＣＨＯ細胞の培養上清のノイラミニダーゼ活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明は、ある態様において、改変ノイラミニダーゼを提供する。本発明は、さらなる態様において、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸を提供する。
【0013】
本態様の改変ノイラミニダーゼは、配列番号：１で示される野生型ノイラミニダーゼ１のアミノ酸位置１７３のＷおよび１７５のＫが変異した配列、またはアミノ酸位置３５８のＫが変異した配列を含む。より具体的には、Ｗ１７３ＮおよびＫ１７５Ｓ変異、またはＫ３５８Ｎ変異を含む。ある実施形態において、本態様の改変ノイラミニダーゼは、上記変異を有し、配列番号：１で示されるアミノ酸配列と約７５％以上、例えば約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９１％以上、約９２％以上、約９３％以上、約９４％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の配列同一性を有する配列を含む、またはからなる。ある実施形態において、本態様の改変ノイラミニダーゼは、上記変異を有し、さらに配列番号：１で示されるアミノ酸配列において１個もしくは複数個、例えば１個～約４０個、１個～約３０個、１個～約２０個、１個～約１０個、１個～約５個、例えば１個、２個、３個、４個もしくは５個、または１個～４個、例えば１個、２個、３個もしくは４個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加したアミノ酸配列を含む、またはからなる。さらなる実施形態において、本態様の改変ノイラミニダーゼは、配列番号：２または配列番号：３に示されるアミノ酸配列を含む、またはからなる。
【0014】
本態様の改変ノイラミニダーゼをコードする核酸として、上記の改変ノイラミニダーゼをコードする核酸が挙げられる。より具体的な例として、配列番号：４で示される野生型ノイラミニダーゼ１をコードする核酸の、位置５１７～５１９の変異および位置５２３～５２５のうち２つ以上の位置での変異、または位置１０７４の変異を含む核酸が挙げられる。さらに具体的には、位置５１７～５１９がＡＡＴまたはＡＡＣ、位置５２３～５２５がＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、ＡＧＣであるか、または位置１０７４がＴまたはＣである変異を含む核酸が挙げられる。ある実施形態において、本態様の改変ノイラミニダーゼをコードする核酸は、上記変異を有し、配列番号：４で示される核酸配列と約７５％以上、例えば約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９１％以上、約９２％以上、約９３％以上、約９４％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の配列同一性を有する配列を含む、またはからなる。ある実施形態において、本態様の改変ノイラミニダーゼをコードする核酸は、上記変異を有し、さらに配列番号：４で示される核酸配列において１個もしくは複数個、例えば１個～約４０個、１個～約３０個、１個～約２０個、１個～約１０個、１個～約５個、例えば１個、２個、３個、４個もしくは５個、または１個～４個、例えば１個、２個、３個もしくは４個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加した核酸配列を含む、またはからなる。さらなる実施形態において、本態様の改変ノイラミニダーゼをコードする核酸は、配列番号：５または配列番号：６に示される核酸配列を含む、またはからなる。
【0015】
塩基配列やアミノ酸配列の同一性の決定は、インターネットを利用したホモロジー検索サイトを利用して行うことができる（例えば、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）のウェブサイトにおいて、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ、およびＳＳＥＡＲＣＨ等の相同性検索が利用できる：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｓｓ／）。また、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）において、ＢＬＡＳＴを用いた検索を行うことができる（例えば、ＮＣＢＩのウェブサイトにおけるＢＬＡＳＴのページ；ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ； Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９９０， ２１５（３）：４０３－１０； Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ． ＆ Ｇｉｓｈ， Ｗ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １９９６， ２６６：４６０－４８０； Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９７， ２５：３３８９－３４０２）。
【0016】
本明細書において、「核酸」とは、ヌクレオチドが重合した分子であり、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド等を含む。また、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ等を含む。さらに、天然のヌクレオチドのみで形成されたもの、および非天然の塩基、ヌクレオチド、ヌクレオシドを一部に含むもの、あるいは合成核酸も含む。典型的には、核酸はＤＮＡである。
【0017】
本態様の改変ノイラミニダーゼは、糖鎖等の生理的な修飾、蛍光や放射性物質のような標識、あるいは他のタンパク質との融合といった各種の修飾を加えたタンパク質であってもよい。また、製造および精製時におけるタンパク質の性質および構造の安定化や、分子間ジスルフィド結合の抑制等を目的として、システイン残基における－ＳＨ基の酸化（例えばスルホ基への変換）、グルタチオン化、ニトロシル化、アルキル化、マレイミドとの結合等を行ったものでもよい。これらのいずれも、機能的に同等である限り、本態様の改変ノイラミニダーゼとして使用できる。
【0018】
本態様の改変ノイラミニダーゼの作製方法は特に限定されず、組換え発現（哺乳類細胞、酵母、大腸菌、昆虫細胞等）、無細胞系を用いた合成などが例示できる。例えば、宿主に応じたシグナル配列をコードする核酸配列および本態様の改変ノイラミニダーゼをコードする核酸配列を有する核酸を宿主細胞に導入し、組換え発現後の培養上清から回収する方法や、宿主細胞に改変ノイラミニダーゼをコードする核酸配列を有する核酸を導入し、組換え発現後に細胞を破砕して回収する方法、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸配列を有する核酸を鋳型として無細胞系で合成するなどの方法が挙げられる。これらに使用される細胞は特に限定されず、例えばＨＥＫ２９３細胞が挙げられる。
【0019】
得られた改変ノイラミニダーゼは、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一なタンパク質として精製することができる。タンパク質の分離、精製は、通常のタンパク質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択および／または組み合わせることによりタンパク質を分離、精製することができる。
【0020】
本発明は、他の態様において、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸を含むベクターを提供する。ベクターとしては、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノアソシエートウイルスベクター、センダイウイルスベクター、センダイウイルスエンベロープベクター、パピローマウイルスベクター、などが例示できるが、これらに限定されるものではない。好ましい例として、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノアソシエートウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられる。より具体的な実施形態において、該ベクターはＡＡＶベクターである。ＡＡＶには、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型（３Ａ型および３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶならびにヒツジＡＡＶ、ならびに未知のまたは後に発見される任意の他のＡＡＶが含まれるがこれらに限定されない。ある実施形態において、ＡＡＶベクターはＡＡＶ２型である。該ベクターには、遺伝子発現を効果的に誘導するプロモーターＤＮＡ配列や、遺伝子発現を制御する因子、ＤＮＡの安定性を維持するために必要な分子が含まれてもよい。
【0021】
ある実施形態において、本態様のベクターは、カテプシンＡをコードする核酸をさらに含む。具体的には、配列番号：１３で示されるアミノ酸配列と約７５％以上、例えば約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９１％以上、約９２％以上、約９３％以上、約９４％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の配列同一性を有する配列を含む、またはからなる配列をコードする核酸、配列番号：１３で示されるアミノ酸配列において１個もしくは複数個、例えば１個～約４０個、１個～約３０個、１個～約２０個、１個～約１０個、１個～約５個、例えば１個、２個、３個、４個もしくは５個、または１個～４個、例えば１個、２個、３個もしくは４個のアミノ酸が置換、挿入、欠失および／または付加したアミノ酸配列を含む、またはからなる配列をコードする核酸、配列番号：３に示されるアミノ酸配列を含む、またはからなる配列をコードする核酸、配列番号：１４で示される核酸配列と約７５％以上、例えば約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９１％以上、約９２％以上、約９３％以上、約９４％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の配列同一性を有する核酸、配列番号：１４で示される核酸配列において１個もしくは複数個、例えば１個～約４０個、１個～約３０個、１個～約２０個、１個～約１０個、１個～約５個、例えば１個、２個、３個、４個もしくは５個、または１個～４個、例えば１個、２個、３個もしくは４個の核酸が置換、挿入、欠失および／または付加した配列を含む、またはからなる核酸、配列番号：１４で示される核酸配列を含む、またはからなる核酸、が挙げられる。
【0022】
本発明は、さらなる態様において、改変ノイラミニダーゼを分泌する細胞を提供する。ある実施形態において、改変ノイラミニダーゼを分泌する細胞は、さらにカテプシンＡも分泌する。本態様の改変ノイラミニダーゼを分泌する細胞は、例えば上記核酸配列を有する細胞である。本態様の改変ノイラミニダーゼを分泌する細胞は、例えば上記ベクターを導入することにより作製できる。
【0023】
本発明はまた、さらなる態様において、上記改変ノイラミニダーゼ、改変ノイラミニダーゼとカテプシンＡの組み合わせ、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸とカテプシンＡをコードする核酸の組み合わせ、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸を含むベクター、または改変ノイラミニダーゼを分泌する細胞を含む、医薬組成物を提供する。
【0024】
本態様の医薬組成物は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｕ．Ｓ．Ａ参照）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体が適宜使用できる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
【0025】
本態様の医薬組成物の投与方法として、経口投与または非経口投与が挙げられ、係る投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって本態様の医薬組成物を全身または局部的（例えば、皮下、皮内、皮膚表面、眼球あるいは眼瞼結膜、鼻腔粘膜、口腔内および消化管粘膜、膣・子宮内粘膜、腹腔内、髄腔内（例えば大槽内または腰髄内）、または脳室内など）に投与できる。
【0026】
また、患者の年齢、症状等により適宜投与方法を選択することができる。改変ノイラミニダーゼを投与する場合、例えば、一回の投与につき、体重１ｋｇあたり約０．００００００１ｍｇから約１０００ｍｇの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり約０．００００１から約１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量が選択できる。改変ノイラミニダーゼを分泌する細胞や改変ノイラミニダーゼをコードするＤＮＡが挿入された遺伝子治療用ベクターを投与する場合も、対象となる組織において、改変ノイラミニダーゼの量が上記範囲内となるように投与することができる。しかしながら、本組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。
【0027】
本態様の医薬組成物は、ノイラミニダーゼ１活性の欠失または減弱による疾患の治療に使用できる。疾患の例として、リソソーム蓄積症、アミロイドーシス、がん等が挙げられる。より具体的な例として、本態様の医薬組成物はガラクトシアリドーシスまたはシアリドーシスの治療に使用できる。
【0028】
本明細書において使用される用語、「患者」または「対象」は、ヒトまたは非ヒト動物が挙げられ、例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、ブタ、イヌ、ウサギ、ハムスター、モルモットなどが例示できるが、これらに制限されない。
【0029】
本明細書で使用される用語、「治療」は、例えば、症状の緩和、改善、および／または除去、軽減および／または安定化（例えばより進んだ段階へと進行しないこと）のいずれかを指す。
【0030】
本発明は、さらに以下の態様も提供する：
（１）必要とする対象に、上記改変ノイラミニダーゼ、改変ノイラミニダーゼとカテプシンＡの組み合わせ、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸とカテプシンＡをコードする核酸の組み合わせ、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸を含むベクター、または改変ノイラミニダーゼを分泌する細胞を投与することを含む、リソソーム蓄積症、アミロイドーシスまたはがん、好ましくはリソソーム蓄積症、より好ましくはガラクトシアリドーシスまたはシアリドーシスの治療方法；
（２）必要とする対象に、上記改変ノイラミニダーゼ、改変ノイラミニダーゼとカテプシンＡの組み合わせ、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸とカテプシンＡをコードする核酸の組み合わせ、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸を含むベクター、または改変ノイラミニダーゼを分泌する細胞を含む組成物を投与することを含む、リソソーム蓄積症、アミロイドーシスまたはがん、好ましくはリソソーム蓄積症、より好ましくはガラクトシアリドーシスまたはシアリドーシスの治療方法；
（３）リソソーム蓄積症、アミロイドーシスまたはがん、好ましくはリソソーム蓄積症、より好ましくはガラクトシアリドーシスまたはシアリドーシスの治療のための、上記改変ノイラミニダーゼ、改変ノイラミニダーゼとカテプシンＡの組み合わせ、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸とカテプシンＡをコードする核酸の組み合わせ、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸を含むベクター、または改変ノイラミニダーゼを分泌する細胞の使用；
（４）リソソーム蓄積症、アミロイドーシスまたはがん、好ましくはリソソーム蓄積症、より好ましくはガラクトシアリドーシスまたはシアリドーシスの治療のための医薬の製造における、上記改変ノイラミニダーゼ、改変ノイラミニダーゼとカテプシンＡの組み合わせ、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸とカテプシンＡをコードする核酸の組み合わせ、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸を含むベクター、または改変ノイラミニダーゼを分泌する細胞の使用、も提供する。
（１）必要とする対象に、上記改変ノイラミニダーゼ、改変ノイラミニダーゼとカテプシンＡの組み合わせ、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸とカテプシンＡをコードする核酸の組み合わせ、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸を含むベクター、または改変ノイラミニダーゼを分泌する細胞を投与することを含む、リソソーム蓄積症、アミロイドーシスまたはがん、好ましくはリソソーム蓄積症、より好ましくはガラクトシアリドーシスまたはシアリドーシスの治療方法；
（２）必要とする対象に、上記改変ノイラミニダーゼ、改変ノイラミニダーゼとカテプシンＡの組み合わせ、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸とカテプシンＡをコードする核酸の組み合わせ、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸を含むベクター、または改変ノイラミニダーゼを分泌する細胞を含む組成物を投与することを含む、リソソーム蓄積症、アミロイドーシスまたはがん、好ましくはリソソーム蓄積症、より好ましくはガラクトシアリドーシスまたはシアリドーシスの治療方法；
（３）リソソーム蓄積症、アミロイドーシスまたはがん、好ましくはリソソーム蓄積症、より好ましくはガラクトシアリドーシスまたはシアリドーシスの治療のための、上記改変ノイラミニダーゼ、改変ノイラミニダーゼとカテプシンＡの組み合わせ、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸とカテプシンＡをコードする核酸の組み合わせ、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸を含むベクター、または改変ノイラミニダーゼを分泌する細胞の使用；
（４）リソソーム蓄積症、アミロイドーシスまたはがん、好ましくはリソソーム蓄積症、より好ましくはガラクトシアリドーシスまたはシアリドーシスの治療のための医薬の製造における、上記改変ノイラミニダーゼ、改変ノイラミニダーゼとカテプシンＡの組み合わせ、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸とカテプシンＡをコードする核酸の組み合わせ、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸を含むベクター、または改変ノイラミニダーゼを分泌する細胞の使用、も提供する。
【0031】
これらの態様における、改変ノイラミニダーゼ、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸、改変ノイラミニダーゼをコードする核酸を含むベクター、改変ノイラミニダーゼを分泌する細胞、それらの形態、製剤化、投与方法、および投与量についての説明や他の実施形態は上記のとおりである。
【0032】
また、改変ノイラミニダーゼとカテプシンＡの組み合わせの場合、同時投与、逐次投与のいずれでもよく、また両者を一つの製剤としてもよい。
【0033】
本明細書において引用された先行技術文献は、その全文が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書と引用文献の記載に不一致がある場合、本明細書の記載により調整される。また、本明細書において、「約」なる用語は、±１０％、好ましくは±５％、より好ましくは±１％の範囲を意味する。また、その範囲の境界値となる数値は、本明細書に記載されているものとみなされる。
【実施例】
【0034】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本実施例は必ずしも本発明の範囲を限定するものではない。
【0035】
（各種測定方法）
＜ノイラミニダーゼ活性測定＞
１．細胞破砕液の作製
培地を除去した後、ＰＢＳで細胞を剥がし、１．５ｍＬチューブに回収する。これを５００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を除去して１ｍＬのＰＢＳで再懸濁し、再度遠心分離した。上清を除去し、２５０μの溶解バッファー（１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）／１μＭペプスタチンＡ（ペプチド研究所）／２ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、ピペッティングにより細胞破砕液を得る。
＜ノイラミニダーゼ活性測定＞
１．細胞破砕液の作製
培地を除去した後、ＰＢＳで細胞を剥がし、１．５ｍＬチューブに回収する。これを５００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を除去して１ｍＬのＰＢＳで再懸濁し、再度遠心分離した。上清を除去し、２５０μの溶解バッファー（１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）／１μＭペプスタチンＡ（ペプチド研究所）／２ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、ピペッティングにより細胞破砕液を得る。
【0036】
２．細胞破砕液のタンパク質定量
溶解バッファーで希釈した細胞破砕液を９６ウェルプレートに５μＬずつ分注する。下表の濃度の検量線を９６ウェルプレート内に作製する。
ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）のＡ液とＳ液を５０：１で混合し、各ウェルに２５μＬずつ加えた後、Ｂ液を２００μＬずつ加え、１５分間、室温で反応させる。７５０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）で測定し、タンパク質定量を行う。
溶解バッファーで希釈した細胞破砕液を９６ウェルプレートに５μＬずつ分注する。下表の濃度の検量線を９６ウェルプレート内に作製する。
【表1】
ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）のＡ液とＳ液を５０：１で混合し、各ウェルに２５μＬずつ加えた後、Ｂ液を２００μＬずつ加え、１５分間、室温で反応させる。７５０ｎｍの吸光度をプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）で測定し、タンパク質定量を行う。
【0037】
３．ノイラミニダーゼ活性測定
細胞破砕液を２０μＬずつ分注し、２０μＬの基質溶液（０．２Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）：８μＬ、Ｍｉｌｉ－Ｑ水：５μＬ、５０ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）：２μＬ、２ｍＭ ４－ＭＵ－ＮＡＮＡ（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ）：５μＬ）を加え、３７℃で３０分間反応させる。その後、０．２Ｍグリシン－ＮａＯＨバッファー（ｐＨ１０．７）を３７０μＬ加え、反応を停止させる。下表の濃度の検量線を作製する。
励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍで蛍光強度を測定し、比活性を算出する。
細胞破砕液を２０μＬずつ分注し、２０μＬの基質溶液（０．２Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）：８μＬ、Ｍｉｌｉ－Ｑ水：５μＬ、５０ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）：２μＬ、２ｍＭ ４－ＭＵ－ＮＡＮＡ（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ）：５μＬ）を加え、３７℃で３０分間反応させる。その後、０．２Ｍグリシン－ＮａＯＨバッファー（ｐＨ１０．７）を３７０μＬ加え、反応を停止させる。下表の濃度の検量線を作製する。
【表2】
励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍで蛍光強度を測定し、比活性を算出する。
【0038】
＜カルボキシペプチダーゼ活性測定＞
上記細胞破砕液を１２０００×ｇ、４℃、５分間遠心し、上清を回収して細胞抽出液とする。Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔでタンパク定量を行っておく。
上記細胞破砕液を１２０００×ｇ、４℃、５分間遠心し、上清を回収して細胞抽出液とする。Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＤＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔでタンパク定量を行っておく。
【0039】
１．１次反応
１．５ｍＬチューブ３本に細胞抽出液２５μＬを加える。基質ＭＩＸとして、０．２Ｍ ＮａＯＡｃバッファー（ｐＨ５．６）：１２．５μＬ、３ｍＭ Ｚ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）：１２．５μＬを混合したものをチューブ２本に加え、３ｍＭ Ｚ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕの代わりに水を１２．５μＬ混合したものを基質（－）としてチューブ１本に加える。３０分間、２５℃で反応させた後、１００℃の沸騰水に３分間浸し、反応を停止させる。
１．５ｍＬチューブ３本に細胞抽出液２５μＬを加える。基質ＭＩＸとして、０．２Ｍ ＮａＯＡｃバッファー（ｐＨ５．６）：１２．５μＬ、３ｍＭ Ｚ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）：１２．５μＬを混合したものをチューブ２本に加え、３ｍＭ Ｚ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕの代わりに水を１２．５μＬ混合したものを基質（－）としてチューブ１本に加える。３０分間、２５℃で反応させた後、１００℃の沸騰水に３分間浸し、反応を停止させる。
【0040】
２．２次反応
下表のとおり、検量線のスタンダードを調製する。
チューブ１本あたり、０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）：５００μＬ、０．２Ｍ Ｎ－エチルマレイミド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）：１．２５μＬ、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（Ｃｏｒｏｔａｌｕｓ ａｔｒｏｘ由来、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）／２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）：１μＬ、ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）：０．５μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ ｏ－Ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液：１５μＬを混合した２次反応液を調製し、各サンプル、スタンダードに加え、３７℃、４０分間インキュベートする。４０分後、６Ｍ ＨＣｌを５００μＬずつ各サンプル、スタンダードに加え、反応を停止させる。各サンプルおよびスタンダードを９６ウェルプレートに２００μＬずつ加え、５４０ｎｍの吸光度を測定する。
下表のとおり、検量線のスタンダードを調製する。
【表3】
チューブ１本あたり、０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）：５００μＬ、０．２Ｍ Ｎ－エチルマレイミド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）：１．２５μＬ、Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（Ｃｏｒｏｔａｌｕｓ ａｔｒｏｘ由来、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）／２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）：１μＬ、ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）：０．５μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ ｏ－Ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液：１５μＬを混合した２次反応液を調製し、各サンプル、スタンダードに加え、３７℃、４０分間インキュベートする。４０分後、６Ｍ ＨＣｌを５００μＬずつ各サンプル、スタンダードに加え、反応を停止させる。各サンプルおよびスタンダードを９６ウェルプレートに２００μＬずつ加え、５４０ｎｍの吸光度を測定する。
【0041】
＜免疫蛍光染色＞
１．８ウェルチャンバースライドへの継代
最終濃度１０％になるようウシ胎児血清（Ｂｉｏｓｅｒａ）を加えたＦ－１０ Ｈａｍ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＰＢＳを温めておく。トランスフェクションを２４時間行い、培地交換後さらに２４時間後のＣＨＯの培地をアスピレーターで吸引し、１×ＰＢＳ １ｍＬで洗浄する。０．０５％トリプシン－１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ １ｍＬを加え、３７℃、２分間培養する。Ｆ－１０ Ｈａｍ １ｍＬを加え、細胞を剥がし、１５ｍＬチューブに全量回収する。２００×ｇ、室温で５分間遠心し、上清を除いてＦ－１０ Ｈａｍ １ｍＬで懸濁、３０μＬを取って１．５ｍＬチューブに加える。０．３％トリパンブルー３０μＬを加え、混合して細胞を染色する。血球計数版を用いて、セルカウントを行う。８ウェルチャンバースライド（Ｔｈｅｒｍｏ）に１×１０４細胞／ウェル加え、Ｆ－１０ Ｈａｍで３００μＬにメスアップする。
１．８ウェルチャンバースライドへの継代
最終濃度１０％になるようウシ胎児血清（Ｂｉｏｓｅｒａ）を加えたＦ－１０ Ｈａｍ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＰＢＳを温めておく。トランスフェクションを２４時間行い、培地交換後さらに２４時間後のＣＨＯの培地をアスピレーターで吸引し、１×ＰＢＳ １ｍＬで洗浄する。０．０５％トリプシン－１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ １ｍＬを加え、３７℃、２分間培養する。Ｆ－１０ Ｈａｍ １ｍＬを加え、細胞を剥がし、１５ｍＬチューブに全量回収する。２００×ｇ、室温で５分間遠心し、上清を除いてＦ－１０ Ｈａｍ １ｍＬで懸濁、３０μＬを取って１．５ｍＬチューブに加える。０．３％トリパンブルー３０μＬを加え、混合して細胞を染色する。血球計数版を用いて、セルカウントを行う。８ウェルチャンバースライド（Ｔｈｅｒｍｏ）に１×１０４細胞／ウェル加え、Ｆ－１０ Ｈａｍで３００μＬにメスアップする。
【0042】
２．免疫蛍光染色
Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒで染色する場合は、Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＤＮＤ－９９（Ｔｈｅｒｍｏ）を最終濃度１μＭになるようにＦ－１０ Ｈａｍで希釈し、Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ入りの培地に交換して１時間培養する。培地を除き、ＰＢＳ ５００μＭ／ウェルで１回洗浄後に４％ＰＦＡ／ＰＢＳを２００μＬ加え、室温で３０分間固定する。５００μＬ／ウェルで３回洗浄する。５％ヤギ血清（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）、１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）／ＰＢＳを２００μＬ／ウェル加え、室温、１時間ブロッキングする。１次抗体（抗ＮＥＵ１ Ｆ－８（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、１００倍希釈）、または抗ＬＡＭＰ１（ａｂｃａｍ、３００倍希釈））で処理（１５０μＬ／ウェル）し、４℃、１６時間置く。１次抗体液を除き、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ ５００μＬで洗浄する（×５回）。ＰＢＳ ５００μＬで洗浄する（×１回）。２次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ） Ｆ（ａｂ’）２（ＣＳＴ、１０００倍希釈）またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ） Ｆ（ａｂ’）２（ＣＳＴ、１０００倍希釈））およびＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８での処理（１５０μＬ／ウェル）を、室温、１時間行う。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ ５００μＬ／ウェルで洗浄する（×５回）。ＰＢＳ ５００μＬ／ウェルで洗浄する（×２回）。５０％グリセロール／ＰＢＳで封入し、共焦点レーザー顕微鏡ＬＳＭ７００で観察する。
Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒで染色する場合は、Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＤＮＤ－９９（Ｔｈｅｒｍｏ）を最終濃度１μＭになるようにＦ－１０ Ｈａｍで希釈し、Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ入りの培地に交換して１時間培養する。培地を除き、ＰＢＳ ５００μＭ／ウェルで１回洗浄後に４％ＰＦＡ／ＰＢＳを２００μＬ加え、室温で３０分間固定する。５００μＬ／ウェルで３回洗浄する。５％ヤギ血清（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）、１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）／ＰＢＳを２００μＬ／ウェル加え、室温、１時間ブロッキングする。１次抗体（抗ＮＥＵ１ Ｆ－８（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、１００倍希釈）、または抗ＬＡＭＰ１（ａｂｃａｍ、３００倍希釈））で処理（１５０μＬ／ウェル）し、４℃、１６時間置く。１次抗体液を除き、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ ５００μＬで洗浄する（×５回）。ＰＢＳ ５００μＬで洗浄する（×１回）。２次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ） Ｆ（ａｂ’）２（ＣＳＴ、１０００倍希釈）またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ） Ｆ（ａｂ’）２（ＣＳＴ、１０００倍希釈））およびＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８での処理（１５０μＬ／ウェル）を、室温、１時間行う。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ ５００μＬ／ウェルで洗浄する（×５回）。ＰＢＳ ５００μＬ／ウェルで洗浄する（×２回）。５０％グリセロール／ＰＢＳで封入し、共焦点レーザー顕微鏡ＬＳＭ７００で観察する。
【0043】
＜ＳＤＳ－ＰＡＧＥ＞
１．分離用ゲルの作成
３０％アクリルアミド：３．１２５ｍＬ、４×下層バッファー（１．５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．８）：１．８７５ｍＬ、ＭｉｌｌｉＱ水：２．４２５ｍＬ、１０％ＳＤＳ：７５μＬ、１０％ＡＰＳ：２５μＬ、ＴＥＭＥＤ：５μＬを混合し、ゲル板に流し込んで、上に水飽和ブタノールを積層し、室温で固めて分離用ゲル（１２．５％）を作製する。
１．分離用ゲルの作成
３０％アクリルアミド：３．１２５ｍＬ、４×下層バッファー（１．５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．８）：１．８７５ｍＬ、ＭｉｌｌｉＱ水：２．４２５ｍＬ、１０％ＳＤＳ：７５μＬ、１０％ＡＰＳ：２５μＬ、ＴＥＭＥＤ：５μＬを混合し、ゲル板に流し込んで、上に水飽和ブタノールを積層し、室温で固めて分離用ゲル（１２．５％）を作製する。
【0044】
２．濃縮用ゲルの作成
３０％アクリルアミド：０．６５ｍＬ、４×上層バッファー（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．８）：１．２５ｍＬ、ＭｉｌｌｉＱ水：３．０２ｍＬ、１０％ＳＤＳ：５０μＬ、１０％ＡＰＳ：２５μＬ、ＴＥＭＥＤ：５μＬを混合し、ゲル板に流し込んで、コームを差し込み、室温で固めて濃縮用ゲルを作製する。
３０％アクリルアミド：０．６５ｍＬ、４×上層バッファー（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．８）：１．２５ｍＬ、ＭｉｌｌｉＱ水：３．０２ｍＬ、１０％ＳＤＳ：５０μＬ、１０％ＡＰＳ：２５μＬ、ＴＥＭＥＤ：５μＬを混合し、ゲル板に流し込んで、コームを差し込み、室温で固めて濃縮用ゲルを作製する。
【0045】
３．サンプル調製
６×サンプルバッファー（０．３Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、３６％グリセロール、２４％ＳＤＳ、１．２％２－メルカプトエタノール、０．０１２％ブロモフェノールブルー）を２０μＬにメスアップした細胞破砕液４０μｇ分に４μＬ加え、３分間煮沸する。ビオチン化マーカー、またはプレステインドマーカー５μＬに６×サンプルバッファーを４μＬ加え、２４μＬにＭｉｌｌｉ－Ｑ水でメスアップする。サンプルを１００℃の湯浴に３分間浸ける。
６×サンプルバッファー（０．３Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、３６％グリセロール、２４％ＳＤＳ、１．２％２－メルカプトエタノール、０．０１２％ブロモフェノールブルー）を２０μＬにメスアップした細胞破砕液４０μｇ分に４μＬ加え、３分間煮沸する。ビオチン化マーカー、またはプレステインドマーカー５μＬに６×サンプルバッファーを４μＬ加え、２４μＬにＭｉｌｌｉ－Ｑ水でメスアップする。サンプルを１００℃の湯浴に３分間浸ける。
【0046】
４．泳動
泳動槽を泳動バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ）で満たし、ゲル板をセットしてカソード側にも泳動バッファーを入れる。コームを抜き、ウェルを整えてサンプルを全量アプライする。２０ｍＡ定電流でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行う。
泳動槽を泳動バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ）で満たし、ゲル板をセットしてカソード側にも泳動バッファーを入れる。コームを抜き、ウェルを整えてサンプルを全量アプライする。２０ｍＡ定電流でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行う。
【0047】
＜ウェスタンブロッティング＞
泳動後のゲルから濃縮用ゲルを切り取り、ブロッティングバッファー（４８ｍＭ Ｔｒｉｓ、３９ｍＭグリシン、２０％メタノール）に１５分程浸す。ＰＶＤＦ膜をメタノールに浸し、さらにブロッティングバッファーに１５分間浸す。ろ紙（６枚）をブロッティングバッファーに１５分間浸す。トランスブロッターを転写バッファーで湿らせ、ろ紙（３枚）、ＰＶＤＦ膜、ゲル、ろ紙（３枚）の順にセットし、転写を開始する。１５Ｖ、約１時間行う。転写が終わったＰＶＤＦ膜を取り出し、５０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ＯＮＥ／ＴＢＳを加えて１時間、ブロッキングする。１次抗体溶液をアプライし、４℃で一晩反応させる。ＰＢＳ－Ｔで洗浄し（５分×３回）、その後、ＰＢＳで２回洗浄する。二次抗体溶液をＰＶＤＦ膜に付ける。ＰＢＳ－Ｔで洗浄し（５分×３回）、ＰＢＳで１回洗浄し、ＴＢＳで１回洗浄する。その後、ＨＲＰ標識の場合はＷｅｓｔｅｒｎ ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｕｌｔｒａ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に浸し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｃｈｅｍｉ Ｄｏｃ ＲＸＳ＋で検出する。ＡＰ標識の場合は、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｗａｋｏ）／５０ｍＭ ＭｇＳＯ４／ＴＢＳに浸し、検出する。
泳動後のゲルから濃縮用ゲルを切り取り、ブロッティングバッファー（４８ｍＭ Ｔｒｉｓ、３９ｍＭグリシン、２０％メタノール）に１５分程浸す。ＰＶＤＦ膜をメタノールに浸し、さらにブロッティングバッファーに１５分間浸す。ろ紙（６枚）をブロッティングバッファーに１５分間浸す。トランスブロッターを転写バッファーで湿らせ、ろ紙（３枚）、ＰＶＤＦ膜、ゲル、ろ紙（３枚）の順にセットし、転写を開始する。１５Ｖ、約１時間行う。転写が終わったＰＶＤＦ膜を取り出し、５０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ＯＮＥ／ＴＢＳを加えて１時間、ブロッキングする。１次抗体溶液をアプライし、４℃で一晩反応させる。ＰＢＳ－Ｔで洗浄し（５分×３回）、その後、ＰＢＳで２回洗浄する。二次抗体溶液をＰＶＤＦ膜に付ける。ＰＢＳ－Ｔで洗浄し（５分×３回）、ＰＢＳで１回洗浄し、ＴＢＳで１回洗浄する。その後、ＨＲＰ標識の場合はＷｅｓｔｅｒｎ ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｕｌｔｒａ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に浸し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｃｈｅｍｉ Ｄｏｃ ＲＸＳ＋で検出する。ＡＰ標識の場合は、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｗａｋｏ）／５０ｍＭ ＭｇＳＯ４／ＴＢＳに浸し、検出する。
【0048】
実施例１．改変ノイラミニダーゼの作製および活性確認
１．野生型ヒトノイラミニダーゼ１をコードする遺伝子の増幅
ヒトノイラミニダーゼ１をコードする遺伝子（配列番号：４）を、以下のプライマー
フォワードプライマー：TTTTTCTAGACACCATGACTGGGGAGCGAC（配列番号：７）
リバースプライマー：ATATAAGCTTTCAGAGTGTCCCATAGA（配列番号：８）、
を用いて９４℃２分間を１回、９４℃３０秒間、５７℃３０秒間、６８℃６０秒間のサイクルを３５サイクル行うＰＣＲ反応により増幅した。ＰＣＲ反応液は、フォワードプライマー：１μＬ（５０ｐｍｏｌ）、リバースプライマー：１μＬ（５０ｐｍｏｌ）、テンプレートプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１ Ｈｙｇｒｏ （－） ＮＥＵ１）：１μＬ（１０ｎｇ）、１０×ＫＯＤバッファー：５μＬ、２５ｍＭ ＭｇＳＯ４：２μＬ、２ｍＭ ｄＮＴＰｓ：５μＬ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ（Ｔｏｙｏｂｏ）：１μＬを、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で５０μＬにメスアップして調製した。
１．野生型ヒトノイラミニダーゼ１をコードする遺伝子の増幅
ヒトノイラミニダーゼ１をコードする遺伝子（配列番号：４）を、以下のプライマー
フォワードプライマー：TTTTTCTAGACACCATGACTGGGGAGCGAC（配列番号：７）
リバースプライマー：ATATAAGCTTTCAGAGTGTCCCATAGA（配列番号：８）、
を用いて９４℃２分間を１回、９４℃３０秒間、５７℃３０秒間、６８℃６０秒間のサイクルを３５サイクル行うＰＣＲ反応により増幅した。ＰＣＲ反応液は、フォワードプライマー：１μＬ（５０ｐｍｏｌ）、リバースプライマー：１μＬ（５０ｐｍｏｌ）、テンプレートプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１ Ｈｙｇｒｏ （－） ＮＥＵ１）：１μＬ（１０ｎｇ）、１０×ＫＯＤバッファー：５μＬ、２５ｍＭ ＭｇＳＯ４：２μＬ、２ｍＭ ｄＮＴＰｓ：５μＬ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ（Ｔｏｙｏｂｏ）：１μＬを、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で５０μＬにメスアップして調製した。
【0049】
２．改変型１および２の作製および増幅
上述のプライマーに加えて、改変型１の作製のため、以下のプライマー、
フォワードプライマー：CTACCATGTTGGTAAACAGCAGCGATGATGGTGTTTC（配列番号：９）
リバースプライマー：GAAACACCATCATCGCTGCTGTTTACCAACATGGTAG（配列番号：１０）、
および改変型２の作製のため、以下のプライマー、
フォワードプライマー：CTCATGGCGGAACGAGACAGTCC（配列番号：１１）
リバースプライマー：GGACTGTCTCGTTCCGCCATGAG（配列番号：１２）、
を使用した。
上記１．と同様にＰＣＲ増幅した後、エタノール１２５μＬ、２Ｍ ＮａＣｌ ５μＬを加え、１８０００×ｇ、４℃、３０分間遠心した。上清を除き、ＤＮＡサンプルバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、３３％グリセロール、０．３％ブロモフェノールブルー）で溶解した。全量を１％アガロースゲルで泳動した。Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で主要バンドを切り出し、ＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡフラグメントを当モル混合した。２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２μＬ、２ｍＭ ｄＮＴＰｓ ５μＬ、ＫＯＤ ｐｌｕｓバッファー５μＬ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ １μＬを加え、水で５０μＬにメスアップした。これを、９４℃２分間を１回、９４℃３０秒間、５７℃３０秒間、６８℃８０秒間のサイクルを３５サイクル行うＰＣＲ反応により増幅した。
上述のプライマーに加えて、改変型１の作製のため、以下のプライマー、
フォワードプライマー：CTACCATGTTGGTAAACAGCAGCGATGATGGTGTTTC（配列番号：９）
リバースプライマー：GAAACACCATCATCGCTGCTGTTTACCAACATGGTAG（配列番号：１０）、
および改変型２の作製のため、以下のプライマー、
フォワードプライマー：CTCATGGCGGAACGAGACAGTCC（配列番号：１１）
リバースプライマー：GGACTGTCTCGTTCCGCCATGAG（配列番号：１２）、
を使用した。
上記１．と同様にＰＣＲ増幅した後、エタノール１２５μＬ、２Ｍ ＮａＣｌ ５μＬを加え、１８０００×ｇ、４℃、３０分間遠心した。上清を除き、ＤＮＡサンプルバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、３３％グリセロール、０．３％ブロモフェノールブルー）で溶解した。全量を１％アガロースゲルで泳動した。Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で主要バンドを切り出し、ＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡフラグメントを当モル混合した。２５ｍＭ ＭｇＳＯ４ ２μＬ、２ｍＭ ｄＮＴＰｓ ５μＬ、ＫＯＤ ｐｌｕｓバッファー５μＬ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ １μＬを加え、水で５０μＬにメスアップした。これを、９４℃２分間を１回、９４℃３０秒間、５７℃３０秒間、６８℃８０秒間のサイクルを３５サイクル行うＰＣＲ反応により増幅した。
【0050】
３．制限酵素処理
ＰＣＲ後の反応液にＴＥ飽和フェノールとＣＩＡ（クロロホルムとイソアミルアルコールを２４：１で混合したもの）を２５μＬずつ加え、よく振った。４℃、２００００×ｇ、５分間遠心分離した。上清を新しい１．５ｍＬチューブに回収し、ＣＩＡを５０μＬ加えた。４℃、２００００×ｇ、５分間遠心分離した。上清を新しい１．５ｍＬチューブに回収し、エタノール１２５μＬと２Ｍ ＮａＣｌを５μＬ加えた。２００００×ｇ、４℃、２０分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを風乾した。Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水を１０μＬ加え、ペレットを溶解した。下表のとおり制限酵素反応液を調製し、３７℃、１６時間反応させた。
ＰＣＲ後の反応液にＴＥ飽和フェノールとＣＩＡ（クロロホルムとイソアミルアルコールを２４：１で混合したもの）を２５μＬずつ加え、よく振った。４℃、２００００×ｇ、５分間遠心分離した。上清を新しい１．５ｍＬチューブに回収し、ＣＩＡを５０μＬ加えた。４℃、２００００×ｇ、５分間遠心分離した。上清を新しい１．５ｍＬチューブに回収し、エタノール１２５μＬと２Ｍ ＮａＣｌを５μＬ加えた。２００００×ｇ、４℃、２０分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを風乾した。Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水を１０μＬ加え、ペレットを溶解した。下表のとおり制限酵素反応液を調製し、３７℃、１６時間反応させた。
【表4】
【0051】
４．ライゲーション
制限酵素反応液を全量、１％アガロースゲルで泳動した。主要バンドを切り出し、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔでＤＮＡを精製した。プラスミド２５ｆｍｏｌ、インサート１２５ｆｍｏｌを混合し、同体積のＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｍｉｇｈｔｙ ｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ）を加え、１６℃、１６時間反応させた。
制限酵素反応液を全量、１％アガロースゲルで泳動した。主要バンドを切り出し、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔでＤＮＡを精製した。プラスミド２５ｆｍｏｌ、インサート１２５ｆｍｏｌを混合し、同体積のＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｍｉｇｈｔｙ ｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ）を加え、１６℃、１６時間反応させた。
【0052】
５．大腸菌の形質転換
ライゲーション産物をＤＨ５αコンピテントセル（ニッポンジーン）１００μＬに加え、３０分間氷上に置いた。６０秒間、４２℃でヒートショックを加えた。ＳＯＣ培地を３００μＬ加え、３７℃、１時間インキュベートした。ＬＢ（１００μｇ／ｍＬアンピシリン入り）に全量塗った。３７℃、１４時間インキュベートした。
ライゲーション産物をＤＨ５αコンピテントセル（ニッポンジーン）１００μＬに加え、３０分間氷上に置いた。６０秒間、４２℃でヒートショックを加えた。ＳＯＣ培地を３００μＬ加え、３７℃、１時間インキュベートした。ＬＢ（１００μｇ／ｍＬアンピシリン入り）に全量塗った。３７℃、１４時間インキュベートした。
【0053】
６．ミニプレップ
ＬＢ培地２ｍＬに１００ｍｇ／ｍＬアンピシリンを２μＬ加えた。コロニーを爪楊枝で拾って培地に入れ、３７℃、１６時間振とうした。菌液１ｍＬをとり、室温、１０００×ｇ、５分間遠心分離した。上清を除き、氷冷したＳｏｌＩ（５０ｍＭスクロース、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を１００μＬ加え、再懸濁した。ＳｏｌＩＩ（０．２Ｍ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ）を２００μＬ加え、転倒混和して氷上で５分間放置した。氷冷したＳｏｌＩＩＩ（３Ｍ酢酸カリウム、２Ｍ酢酸）を１５０μＬ加え、転倒混和した。１２０００×ｇ、４℃、５分間遠心分離した。上清を取り、１０ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ Ａ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を１μＬ入れ、３７℃、１時間インキュベートした。ＴＥ飽和フェノールとＣＩＡを２５５μＬずつ加え、よく振り混ぜた。１２０００×ｇ、５分間、４℃遠心分離した。上清を回収し、ＣＩＡ ４５０μＬを加え、よく振り混ぜた。１２０００×ｇ、５分間、４℃遠心分離した。上清を取り、２－プロパノールを４５０μＬ加え、よく混ぜた。１８０００×ｇ、２０分間、４℃遠心分離した。上清を除き、７５％エタノールを１ｍＬ加えた。１８０００×ｇ、４℃、５分間遠心分離した。上清を除き、ペレットを風乾した。ＴＥバッファー（ｐＨ８．０）１０μＬでペレットを溶かした。各ＤＮＡ溶液１μＬ、１０×Ｍバッファー２μＬ、０．１％ＢＳＡ ２μＬ、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水１４μＬ、Ｘｂａ Ｉ ０．５μＬ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ０．５μＬをそれぞれ混合し、３７℃、１時間、インキュベートした。６×ＤＮＡサンプルバッファーを４μＬ加え、１％アガロースゲルで泳動した。
ＬＢ培地２ｍＬに１００ｍｇ／ｍＬアンピシリンを２μＬ加えた。コロニーを爪楊枝で拾って培地に入れ、３７℃、１６時間振とうした。菌液１ｍＬをとり、室温、１０００×ｇ、５分間遠心分離した。上清を除き、氷冷したＳｏｌＩ（５０ｍＭスクロース、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を１００μＬ加え、再懸濁した。ＳｏｌＩＩ（０．２Ｍ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ）を２００μＬ加え、転倒混和して氷上で５分間放置した。氷冷したＳｏｌＩＩＩ（３Ｍ酢酸カリウム、２Ｍ酢酸）を１５０μＬ加え、転倒混和した。１２０００×ｇ、４℃、５分間遠心分離した。上清を取り、１０ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ Ａ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を１μＬ入れ、３７℃、１時間インキュベートした。ＴＥ飽和フェノールとＣＩＡを２５５μＬずつ加え、よく振り混ぜた。１２０００×ｇ、５分間、４℃遠心分離した。上清を回収し、ＣＩＡ ４５０μＬを加え、よく振り混ぜた。１２０００×ｇ、５分間、４℃遠心分離した。上清を取り、２－プロパノールを４５０μＬ加え、よく混ぜた。１８０００×ｇ、２０分間、４℃遠心分離した。上清を除き、７５％エタノールを１ｍＬ加えた。１８０００×ｇ、４℃、５分間遠心分離した。上清を除き、ペレットを風乾した。ＴＥバッファー（ｐＨ８．０）１０μＬでペレットを溶かした。各ＤＮＡ溶液１μＬ、１０×Ｍバッファー２μＬ、０．１％ＢＳＡ ２μＬ、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水１４μＬ、Ｘｂａ Ｉ ０．５μＬ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ０．５μＬをそれぞれ混合し、３７℃、１時間、インキュベートした。６×ＤＮＡサンプルバッファーを４μＬ加え、１％アガロースゲルで泳動した。
【0054】
７．ミディプレップ
ミニプレップで、インサートが正確に挿入されているプラスミドを持つコロニーを１ｍＬのＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン入り）に入れ、１２時間、３７℃で培養した。２００ｍＬのＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン入り）に移し、３７℃で１６時間培養した。Ｈｉｐｕｒｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｍｉｄｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて、ＤＮＡを抽出・精製した。得られたプラスミドに目的の変異が入っているか、配列を確認した（ＮＥＵ１改変型導入プラスミドについて、図１）。
ミニプレップで、インサートが正確に挿入されているプラスミドを持つコロニーを１ｍＬのＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン入り）に入れ、１２時間、３７℃で培養した。２００ｍＬのＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬアンピシリン入り）に移し、３７℃で１６時間培養した。Ｈｉｐｕｒｅ ｐｌａｓｍｉｄ ｍｉｄｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて、ＤＮＡを抽出・精製した。得られたプラスミドに目的の変異が入っているか、配列を確認した（ＮＥＵ１改変型導入プラスミドについて、図１）。
【0055】
８．ＨＥＫ２９３細胞へのトランスフェクション
最終濃度１０％になるよう、ウシ胎児血清（Ｂｉｏｓｅｒａ）を加えたＤＭＥＭ（４５００ｍｇ／ｍＬグルコース）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＰＢＳを温めておいた。１０ｃｍディッシュ（Ｉｗａｋｉ Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅＩｃｏａｔｅｄ）で培養したＨＥＫ２９３の培地をアスピレーターで吸引し、１×ＰＢＳ ４ｍＬで洗浄した。０．０５％トリプシン－１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ １ｍＬを加え、３７℃、２分間培養した。ＤＭＥＭ １ｍＬを加え、細胞を剥がし、１５ｍＬチューブに全量回収した。２００×ｇ、室温で５分間遠心し、上清を除いてＤＭＥＭ １ｍＬで懸濁、３０μＬを取って１．５ｍＬチューブに加えた。０．３％トリパンブルー３０μＬを加え、混合して細胞を染色した。血球計数版を用いて、セルカウントを行った。３５ｍｍディッシュ（Ｉｗａｋｉ Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅＩｃｏａｔｅｄ）に細胞を１×１０６個撒いた。最終１．５ｍＬになるようにＤＭＥＭを加えた。５％ＣＯ２、３７℃で２４時間培養した。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ）を１５０μＬ×２×プラスミド数分注した。一方に各プラスミド２．５μｇ、Ｐ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ）を５μＬ加えた。もう一方にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ）を７．５μＬ加えた。両液を混ぜて１５分間、室温に置いた。混合液を細胞にかけ、２４時間、培養した。培地を新しいＤＭＥＭ ２ｍＬに交換した。
最終濃度１０％になるよう、ウシ胎児血清（Ｂｉｏｓｅｒａ）を加えたＤＭＥＭ（４５００ｍｇ／ｍＬグルコース）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＰＢＳを温めておいた。１０ｃｍディッシュ（Ｉｗａｋｉ Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅＩｃｏａｔｅｄ）で培養したＨＥＫ２９３の培地をアスピレーターで吸引し、１×ＰＢＳ ４ｍＬで洗浄した。０．０５％トリプシン－１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ １ｍＬを加え、３７℃、２分間培養した。ＤＭＥＭ １ｍＬを加え、細胞を剥がし、１５ｍＬチューブに全量回収した。２００×ｇ、室温で５分間遠心し、上清を除いてＤＭＥＭ １ｍＬで懸濁、３０μＬを取って１．５ｍＬチューブに加えた。０．３％トリパンブルー３０μＬを加え、混合して細胞を染色した。血球計数版を用いて、セルカウントを行った。３５ｍｍディッシュ（Ｉｗａｋｉ Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅＩｃｏａｔｅｄ）に細胞を１×１０６個撒いた。最終１．５ｍＬになるようにＤＭＥＭを加えた。５％ＣＯ２、３７℃で２４時間培養した。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ）を１５０μＬ×２×プラスミド数分注した。一方に各プラスミド２．５μｇ、Ｐ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ）を５μＬ加えた。もう一方にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ）を７．５μＬ加えた。両液を混ぜて１５分間、室温に置いた。混合液を細胞にかけ、２４時間、培養した。培地を新しいＤＭＥＭ ２ｍＬに交換した。
【0056】
９．ＮＥＵ１の活性確認
上記＜ノイラミニダーゼ活性測定＞に記載の方法に従って、野生型ＮＥＵ１、ＮＥＵ１改変型１、２のノイラミニダーゼ活性を測定した。得られた測定値から、ＮＥＵ１未導入細胞のノイラミニダーゼ活性の測定値を差し引いた値をノイラミニダーゼ活性とした。結果を下表、および図２に示す。改変型１、２とも、野生型ＮＥＵ１よりは低いものの、比較的高い活性を示した。
上記＜ノイラミニダーゼ活性測定＞に記載の方法に従って、野生型ＮＥＵ１、ＮＥＵ１改変型１、２のノイラミニダーゼ活性を測定した。得られた測定値から、ＮＥＵ１未導入細胞のノイラミニダーゼ活性の測定値を差し引いた値をノイラミニダーゼ活性とした。結果を下表、および図２に示す。改変型１、２とも、野生型ＮＥＵ１よりは低いものの、比較的高い活性を示した。
【0057】
【表5】
【0058】
実施例２．改変ノイラミニダーゼの結晶化の有無の確認
１．ＣＨＯ細胞へのトランスフェクション
上記野生型ＮＥＵ１およびＮＥＵ１改変型１（以下、特に断らない場合はＮＥＵ１改変型１を単にＮＥＵ１改変型とも称する）をコードする遺伝子を組み込んだプラスミドで、ＣＨＯ細胞をトランスフェクトした。具体的には、以下の手順で実施した。最終濃度１０％になるよう、ウシ胎児血清（Ｂｉｏｓｅｒａ）を加えたＦ－１０ Ｈａｍ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＰＢＳを温めておいた。１０ｃｍディッシュ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）で培養したＣＨＯの培地をアスピレーターで吸い、１×ＰＢＳ ５ｍＬで洗浄した。０．０５％トリプシン－１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ １ｍＬを加え、３７℃、２分間培養した。Ｆ－１０ Ｈａｍ １ｍＬを加え、細胞を剥がし、１５ｍＬチューブに全量回収した。２００×ｇ、室温で５分間遠心分離し、上清を除いてＦ－１０ Ｈａｍ １ｍＬで懸濁、３０μＬを取って１．５ｍＬチューブに加えた。０．３％トリパンブルー３０μＬを加え、混合して細胞を染色した。血球計数版を用いて、セルカウントを行った。３５ｍｍディッシュ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に細胞を１×１０６個撒いた。最終１．５ｍＬになるようにＦ－１０ Ｈａｍを加えた。５％ＣＯ２、３７℃で２４時間培養した。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ）を１５０μＬ×２×プラスミド数分注した。一方に各プラスミド２．５μｇ、Ｐ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ）を５μＬ加えた。もう一方にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ）を７．５μＬ加えた。両液を混ぜて１５分間、室温に置いた。混合液を細胞にかけ、２４時間培養した。培地を新しいＦ－１０ Ｈａｍ ２ｍＬに交換した。
１．ＣＨＯ細胞へのトランスフェクション
上記野生型ＮＥＵ１およびＮＥＵ１改変型１（以下、特に断らない場合はＮＥＵ１改変型１を単にＮＥＵ１改変型とも称する）をコードする遺伝子を組み込んだプラスミドで、ＣＨＯ細胞をトランスフェクトした。具体的には、以下の手順で実施した。最終濃度１０％になるよう、ウシ胎児血清（Ｂｉｏｓｅｒａ）を加えたＦ－１０ Ｈａｍ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＰＢＳを温めておいた。１０ｃｍディッシュ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）で培養したＣＨＯの培地をアスピレーターで吸い、１×ＰＢＳ ５ｍＬで洗浄した。０．０５％トリプシン－１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ １ｍＬを加え、３７℃、２分間培養した。Ｆ－１０ Ｈａｍ １ｍＬを加え、細胞を剥がし、１５ｍＬチューブに全量回収した。２００×ｇ、室温で５分間遠心分離し、上清を除いてＦ－１０ Ｈａｍ １ｍＬで懸濁、３０μＬを取って１．５ｍＬチューブに加えた。０．３％トリパンブルー３０μＬを加え、混合して細胞を染色した。血球計数版を用いて、セルカウントを行った。３５ｍｍディッシュ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に細胞を１×１０６個撒いた。最終１．５ｍＬになるようにＦ－１０ Ｈａｍを加えた。５％ＣＯ２、３７℃で２４時間培養した。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ）を１５０μＬ×２×プラスミド数分注した。一方に各プラスミド２．５μｇ、Ｐ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ）を５μＬ加えた。もう一方にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ）を７．５μＬ加えた。両液を混ぜて１５分間、室温に置いた。混合液を細胞にかけ、２４時間培養した。培地を新しいＦ－１０ Ｈａｍ ２ｍＬに交換した。
【0059】
２．細胞内結晶化確認
上記＜免疫蛍光染色＞に記載の方法に従って、遺伝子導入して４日後に、ＮＥＵ１については抗ＮＥＵ１抗体、リソソームについては抗ＬＡＭＰ１を用いて免疫染色を行った。
上記＜免疫蛍光染色＞に記載の方法に従って、遺伝子導入して４日後に、ＮＥＵ１については抗ＮＥＵ１抗体、リソソームについては抗ＬＡＭＰ１を用いて免疫染色を行った。
【0060】
野生型での結果を図３、改変型１での結果を図４に示す。図３に示すとおり、野生型ではＮＥＵ１の結晶化が観察された。図４に示すとおり、改変型１ではＮＥＵ１の結晶化は観察されなかった。なお、改変型２については、若干の結晶化が確認されたものの、野生型に比べてごくわずかであった。また、図に示すとおり、ＮＥＵ１はリソソームとはほとんど共局在が見られなかった。
【0061】
実施例３．カテプシンＡ過剰発現細胞におけるＮＥＵ１のリソソームとの共局在
公知の方法に従って形質転換を行い、ヒトカテプシンＡ（ＣＴＳＡ）ｃＤＮＡ（配列番号：１４）の全長を有するｐＣＸＮ２プラスミド（ｐＣＸＮ２ ＣＴＳＡという）を作成した（図５）。上記の方法に従い、ＣＨＯ細胞をｐＣＸＮ２ ＣＴＳＡでトランスフェクトした。培地交換２４時間後、新しい培地２ｍＬに交換した。選択薬剤として４００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を加え、３日間培養した。培地交換し、再度選択薬剤を加え、さらに１週間培養した。選択薬剤無しの培地に交換し、細胞を増やした。得られたＣＴＳＡ過剰発現細胞に、上記のＮＥＵ１改変型１を上記の方法に従い導入、免疫染色を行った。結果を図６に示す。図に示されるとおり、ＣＴＳＡ過剰発現細胞において、ＮＥＵ１改変型はリソソームと共局在した。このことは、ＣＴＳＡが十分にあれば、ＮＥＵ１がリソソームへ輸送されることを示す。
公知の方法に従って形質転換を行い、ヒトカテプシンＡ（ＣＴＳＡ）ｃＤＮＡ（配列番号：１４）の全長を有するｐＣＸＮ２プラスミド（ｐＣＸＮ２ ＣＴＳＡという）を作成した（図５）。上記の方法に従い、ＣＨＯ細胞をｐＣＸＮ２ ＣＴＳＡでトランスフェクトした。培地交換２４時間後、新しい培地２ｍＬに交換した。選択薬剤として４００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を加え、３日間培養した。培地交換し、再度選択薬剤を加え、さらに１週間培養した。選択薬剤無しの培地に交換し、細胞を増やした。得られたＣＴＳＡ過剰発現細胞に、上記のＮＥＵ１改変型１を上記の方法に従い導入、免疫染色を行った。結果を図６に示す。図に示されるとおり、ＣＴＳＡ過剰発現細胞において、ＮＥＵ１改変型はリソソームと共局在した。このことは、ＣＴＳＡが十分にあれば、ＮＥＵ１がリソソームへ輸送されることを示す。
【0062】
実施例４．２つの遺伝子（ＣＴＳＡおよびＮＥＵ１改変型）を同時発現するベクターの作製
１．ＮＥＵ１改変型１（ｍｏｄ ＮＥＵ１）のｃＤＮＡ増幅、ベクターへの組み込み
以下のプライマー
フォワードプライマー：TTTTGAATTCCACCATGACTGGGGAGCGACC（配列番号：１５）
リバースプライマー：AAAAAGATCTTCAGAGTGTCCCATAGACAC（配列番号：１６）、
を用いて、上記実施例１．１と同様の手順で調製した。
１．ＮＥＵ１改変型１（ｍｏｄ ＮＥＵ１）のｃＤＮＡ増幅、ベクターへの組み込み
以下のプライマー
フォワードプライマー：TTTTGAATTCCACCATGACTGGGGAGCGACC（配列番号：１５）
リバースプライマー：AAAAAGATCTTCAGAGTGTCCCATAGACAC（配列番号：１６）、
を用いて、上記実施例１．１と同様の手順で調製した。
【0063】
２．制限酵素処理
下表のとおり制限酵素反応液を調製した以外は、実施例１．３と同様の手順で処理した。
下表のとおり制限酵素反応液を調製した以外は、実施例１．３と同様の手順で処理した。
【表6】
【0064】
３．ライゲーション、４．大腸菌の形質転換、５．ミニプレップ
制限酵素としてＥｃｏＲ Ｉ ０．５μＬ、Ｂｇｌ ＩＩ ０．５μＬを使用する以外は、実施例１．４～６と同様の手順で処理した。得られたインサートが正確に組み込まれているプラスミドをｐＢＩ－ＣＭＶ１ ｍｏｄ ＮＥＵ１とし、次のＣＴＳＡ ｃＤＮＡ組み込みに用いた。
制限酵素としてＥｃｏＲ Ｉ ０．５μＬ、Ｂｇｌ ＩＩ ０．５μＬを使用する以外は、実施例１．４～６と同様の手順で処理した。得られたインサートが正確に組み込まれているプラスミドをｐＢＩ－ＣＭＶ１ ｍｏｄ ＮＥＵ１とし、次のＣＴＳＡ ｃＤＮＡ組み込みに用いた。
【0065】
６．ＣＴＳＡ ｃＤＮＡ増幅
ＣＴＳＡ ｃＤＮＡをコードする遺伝子（配列番号：１４）を、以下のプライマー
フォワードプライマー：TTTTAGATCTCACCATGATCCGAGCCGCGCC（配列番号：１７）
リバースプライマー：AAAAGCGGCCGCTCAGTATGGCTGCTTGTTC（配列番号：１８）、
テンプレートプラスミドとしてｐＣＸＮ２ ＣＴＳＡを用いて、実施例１．１と同様の手順で処理した。
ＣＴＳＡ ｃＤＮＡをコードする遺伝子（配列番号：１４）を、以下のプライマー
フォワードプライマー：TTTTAGATCTCACCATGATCCGAGCCGCGCC（配列番号：１７）
リバースプライマー：AAAAGCGGCCGCTCAGTATGGCTGCTTGTTC（配列番号：１８）、
テンプレートプラスミドとしてｐＣＸＮ２ ＣＴＳＡを用いて、実施例１．１と同様の手順で処理した。
【0066】
７．制限酵素処理
下表のとおり制限酵素反応液を調製した以外は、実施例１．３と同様の手順で処理した。
下表のとおり制限酵素反応液を調製した以外は、実施例１．３と同様の手順で処理した。
【表7】
【0067】
８．ライゲーション、９．大腸菌の形質転換、１０．ミニプレップ
制限酵素としてＢｇｌ ＩＩ ０．５μＬ、Ｎｏｔ Ｉ ０．５μＬを使用する以外は、実施例１．４～６と同様の手順で処理した。得られたインサートが正確に組み込まれているプラスミドをｐＢＩ－ＣＭＶ１ ＣＴＳＡ＋ｍｏｄ ＮＥＵ１（図７）とし、以降の実験に用いた。
制限酵素としてＢｇｌ ＩＩ ０．５μＬ、Ｎｏｔ Ｉ ０．５μＬを使用する以外は、実施例１．４～６と同様の手順で処理した。得られたインサートが正確に組み込まれているプラスミドをｐＢＩ－ＣＭＶ１ ＣＴＳＡ＋ｍｏｄ ＮＥＵ１（図７）とし、以降の実験に用いた。
【0068】
１１．ミディプレップ
実施例１．７と同様の手順で処理した。
実施例１．７と同様の手順で処理した。
【0069】
実施例５．各種プラスミドを導入した細胞における酵素活性
上記のＣＴＳＡ＋ｍｏｄ ＮＥＵ１に加え、ＥＧＦＰ（ネガティブコントロール、図８）、ＣＴＳＡ（図５）、ｍｏｄ ＮＥＵ１（図１）の各プラスミドを、上述の方法に従い、それぞれＣＴＳＡノックアウト（ＫＯ）またはＮＥＵ１ノックアウトＨＥＫ２９３細胞に導入した。導入後、界面活性剤で細胞を溶解し、上記の方法に従い、ノイラミニダーゼ活性およびカルボキシペプチダーゼ活性をそれぞれ測定した。結果を図９～１２に示す。両酵素を同時に発現するプラスミドを導入した細胞は、ＣＴＳＡ ＫＯ、ＮＥＵ１ ＫＯ細胞の両方で、ノイラミニダーゼ活性とカルボキシペプチダーゼ活性が上昇した。また、ノイラミニダーゼのみを発現するプラスミドを導入した細胞は、ＮＥＵ１ ＫＯ細胞では通常のＨＥＫ２９３細胞と同程度のノイラミニダーゼ活性を示したが、ＣＴＳＡ ＫＯ細胞では通常のＨＥＫ２９３細胞よりも低いノイラミニダーゼ活性を示した。これにより、ノイラミニダーゼ活性には、ＣＴＳＡ活性が重要であることが明らかとなった。ｍｏｄ ＮＥＵ１のみを導入したプラスミドであっても、通常と同程度のＮＥＵ１活性を示しており、結晶化しないことを考慮すれば、野生型ＮＥＵ１よりも有効であると考えられる。また、ＣＴＳＡとＮＥＵ１を同時発現するベクターは、リソソーム蓄積症、特にガラクトシアリドーシス、シアリドーシスの遺伝子治療に有効である可能性が高いことが示された。
上記のＣＴＳＡ＋ｍｏｄ ＮＥＵ１に加え、ＥＧＦＰ（ネガティブコントロール、図８）、ＣＴＳＡ（図５）、ｍｏｄ ＮＥＵ１（図１）の各プラスミドを、上述の方法に従い、それぞれＣＴＳＡノックアウト（ＫＯ）またはＮＥＵ１ノックアウトＨＥＫ２９３細胞に導入した。導入後、界面活性剤で細胞を溶解し、上記の方法に従い、ノイラミニダーゼ活性およびカルボキシペプチダーゼ活性をそれぞれ測定した。結果を図９～１２に示す。両酵素を同時に発現するプラスミドを導入した細胞は、ＣＴＳＡ ＫＯ、ＮＥＵ１ ＫＯ細胞の両方で、ノイラミニダーゼ活性とカルボキシペプチダーゼ活性が上昇した。また、ノイラミニダーゼのみを発現するプラスミドを導入した細胞は、ＮＥＵ１ ＫＯ細胞では通常のＨＥＫ２９３細胞と同程度のノイラミニダーゼ活性を示したが、ＣＴＳＡ ＫＯ細胞では通常のＨＥＫ２９３細胞よりも低いノイラミニダーゼ活性を示した。これにより、ノイラミニダーゼ活性には、ＣＴＳＡ活性が重要であることが明らかとなった。ｍｏｄ ＮＥＵ１のみを導入したプラスミドであっても、通常と同程度のＮＥＵ１活性を示しており、結晶化しないことを考慮すれば、野生型ＮＥＵ１よりも有効であると考えられる。また、ＣＴＳＡとＮＥＵ１を同時発現するベクターは、リソソーム蓄積症、特にガラクトシアリドーシス、シアリドーシスの遺伝子治療に有効である可能性が高いことが示された。
【0070】
実施例６．ＣＴＳＡ＋ｍｏｄ ＮＥＵ１同時発現ＡＡＶ２の作製
１．テンプレート用ｐＢＩ－ＣＭＶ１ ＣＴＳＡ＋ｍｏｄ ＮＥＵ１ ＮＶ 作成
下表のとおり制限酵素反応液を調製し、風乾したペレットの溶解に使用するＭｉｌｌｉ－Ｑ水を１０μＬから８μＬに変更し、制限酵素としてＥｃｏＲ Ｖ ０．５μＬ、Ｘｈｏ Ｉ（Ｔａｋａｒａ）０．５μＬを使用する以外は、実施例１．３～６と同様の手順で処理した。バンドが１本のものを、ｐＢＩ－ＣＭＶ１ ＣＴＳＡ＋ｍｏｄ ＮＥＵ１ ＮＶとして、ＡＡＶ製造用ベクター作製用テンプレートとして用いた（図１３）。
１．テンプレート用ｐＢＩ－ＣＭＶ１ ＣＴＳＡ＋ｍｏｄ ＮＥＵ１ ＮＶ 作成
下表のとおり制限酵素反応液を調製し、風乾したペレットの溶解に使用するＭｉｌｌｉ－Ｑ水を１０μＬから８μＬに変更し、制限酵素としてＥｃｏＲ Ｖ ０．５μＬ、Ｘｈｏ Ｉ（Ｔａｋａｒａ）０．５μＬを使用する以外は、実施例１．３～６と同様の手順で処理した。バンドが１本のものを、ｐＢＩ－ＣＭＶ１ ＣＴＳＡ＋ｍｏｄ ＮＥＵ１ ＮＶとして、ＡＡＶ製造用ベクター作製用テンプレートとして用いた（図１３）。
【表8】
【0071】
２．ＣＴＳＡ、ｍｏｄ ＮＥＵ１同時発現ユニットおよびＥＧＦＰ ｃＤＮＡ増幅
以下のプライマー
フォワードプライマー：TTTTAAGCTTGAGTCAGTGAGCGAGGAAGC（配列番号：１９）、
TTTTGAATTCCACCATGGTGAGCAAGGG（配列番号：２０）、
リバースプライマー：TTTTTCTAGATCAGAGTGTCCCATAGACACTG（配列番号：２１）、
AAAAAGATCTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC（配列番号：２２）、
テンプレートプラスミドとしてｐＢＩ－ＣＭＶ１ ＣＴＳＡ＋ｍｏｄ ＮＥＵ１ ＮＶ、およびｐＥＧＦＰ－Ｎ１（Ｔａｋａｒａ）を用いて、実施例１．１と同様の手順で処理した。
３．制限酵素処理
下表のとおり制限酵素反応液を調製した以外は、実施例１．３と同様の手順で処理した。
以下のプライマー
フォワードプライマー：TTTTAAGCTTGAGTCAGTGAGCGAGGAAGC（配列番号：１９）、
TTTTGAATTCCACCATGGTGAGCAAGGG（配列番号：２０）、
リバースプライマー：TTTTTCTAGATCAGAGTGTCCCATAGACACTG（配列番号：２１）、
AAAAAGATCTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC（配列番号：２２）、
テンプレートプラスミドとしてｐＢＩ－ＣＭＶ１ ＣＴＳＡ＋ｍｏｄ ＮＥＵ１ ＮＶ、およびｐＥＧＦＰ－Ｎ１（Ｔａｋａｒａ）を用いて、実施例１．１と同様の手順で処理した。
３．制限酵素処理
下表のとおり制限酵素反応液を調製した以外は、実施例１．３と同様の手順で処理した。
【表9】
【表10】
【0072】
４．ライゲーション、５．大腸菌の形質転換、６．ミニプレップ
制限酵素としてＢｇｌ ＩＩ ０．５μＬ、Ｎｏｔ Ｉ ０．５μＬを使用する以外は、実施例１．４～６と同様の手順で処理した。得られたインサートが正確に組み込まれているベクターをｐＡＡＶ－ＣＭＶ ＣＴＳＡ＋ｍｏｄ ＮＥＵ１（図１４）あるいはｐＡＡＶ－ＣＭＶ ＥＧＦＰとし、以降の実験に用いた。
制限酵素としてＢｇｌ ＩＩ ０．５μＬ、Ｎｏｔ Ｉ ０．５μＬを使用する以外は、実施例１．４～６と同様の手順で処理した。得られたインサートが正確に組み込まれているベクターをｐＡＡＶ－ＣＭＶ ＣＴＳＡ＋ｍｏｄ ＮＥＵ１（図１４）あるいはｐＡＡＶ－ＣＭＶ ＥＧＦＰとし、以降の実験に用いた。
【0073】
７．ミディプレップ
実施例１．７と同様の手順で処理した。
実施例１．７と同様の手順で処理した。
【0074】
実施例７．ＣＴＳＡ＋ｍｏｄ ＮＥＵ１同時発現ＡＡＶ２のＨＥＫ２９３細胞へのトランスフェクション
１．ＨＥＫ２９３ＦＴ播種
最終濃度１０％になるよう、ウシ胎児血清（Ｂｉｏｓｅｒａ）を加えたＤＭＥＭ（４５００ｍｇ／ｍＬグルコース）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＰＢＳを温めておいた。１０ｃｍディッシュ（Ｉｗａｋｉ Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅＩｃｏａｔｅｄ）で培養したＨＥＫ２９３の培地をアスピレーターで吸引し、１×ＰＢＳ ４ｍＬで洗浄した。０．０５％トリプシン－１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ １ｍＬを加え、３７℃、２分間培養した。ＤＭＥＭ １ｍＬを加え、細胞を剥がし、１５ｍＬチューブに全量回収した。２００×ｇ、室温で５分間遠心し、上清を除いてＤＭＥＭ ３ｍＬで懸濁、３０μＬを取って１．５ｍＬチューブに加えた。０．３％トリパンブルー３０μＬを加え、混合して細胞を染色した。血球計数版を用いて、セルカウントを行った。１０ｃｍディッシュ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に細胞を４×１０６個撒いた。最終１０ｍＬになるようにＤＭＥＭを加えた。５％ＣＯ２、３７℃で２４時間培養した。
１．ＨＥＫ２９３ＦＴ播種
最終濃度１０％になるよう、ウシ胎児血清（Ｂｉｏｓｅｒａ）を加えたＤＭＥＭ（４５００ｍｇ／ｍＬグルコース）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＰＢＳを温めておいた。１０ｃｍディッシュ（Ｉｗａｋｉ Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅＩｃｏａｔｅｄ）で培養したＨＥＫ２９３の培地をアスピレーターで吸引し、１×ＰＢＳ ４ｍＬで洗浄した。０．０５％トリプシン－１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ １ｍＬを加え、３７℃、２分間培養した。ＤＭＥＭ １ｍＬを加え、細胞を剥がし、１５ｍＬチューブに全量回収した。２００×ｇ、室温で５分間遠心し、上清を除いてＤＭＥＭ ３ｍＬで懸濁、３０μＬを取って１．５ｍＬチューブに加えた。０．３％トリパンブルー３０μＬを加え、混合して細胞を染色した。血球計数版を用いて、セルカウントを行った。１０ｃｍディッシュ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に細胞を４×１０６個撒いた。最終１０ｍＬになるようにＤＭＥＭを加えた。５％ＣＯ２、３７℃で２４時間培養した。
【0075】
２．トランスフェクション
ＣａｌＰｈｏｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔａｋａｒａ）を使用した。Ｃａｌｃｉｕｍ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを滅菌水で６倍希釈した。希釈したＣａｌｃｉｕｍ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １０００μＬにプラスミド３種類（ｐＡＡＶ－ＣＭＶ ＥＧＦＰまたはｐＡＡＶ ＣＴＳＡ＋ｍｏｄ ＮＥＵ１；ｐＲＣ２－ｍｉ３４２；ｐＨｅｌｐｅｒ、各ＴＥバッファー（ｐＨ８．０）中１μｇ／μＬ、図１５）を６μＬずつ加えた。２×ＨＢＳを１０１８μＬ加え、１５回激しく振って混合した。室温で３分間静置し、細胞に全量加えた。１２時間後、ＤＭＥＭ（２％ウシ胎児血清）８ｍＬに全量培地交換した。
ＣａｌＰｈｏｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔａｋａｒａ）を使用した。Ｃａｌｃｉｕｍ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを滅菌水で６倍希釈した。希釈したＣａｌｃｉｕｍ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １０００μＬにプラスミド３種類（ｐＡＡＶ－ＣＭＶ ＥＧＦＰまたはｐＡＡＶ ＣＴＳＡ＋ｍｏｄ ＮＥＵ１；ｐＲＣ２－ｍｉ３４２；ｐＨｅｌｐｅｒ、各ＴＥバッファー（ｐＨ８．０）中１μｇ／μＬ、図１５）を６μＬずつ加えた。２×ＨＢＳを１０１８μＬ加え、１５回激しく振って混合した。室温で３分間静置し、細胞に全量加えた。１２時間後、ＤＭＥＭ（２％ウシ胎児血清）８ｍＬに全量培地交換した。
【0076】
３．ＡＡＶの抽出
細胞に０．５Ｍ ＥＤＴＡ－ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）を１００μＬ加え、１０分間、室温に置いた。細胞をはがし、１５ｍＬチューブに回収した。ディッシュを２ｍＬのＤＭＥＭ＋２５μＬの０．５Ｍ ＥＤＡＴ－ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）で洗いこみ、上記のチューブに回収した。１７００×ｇ、４℃、１０分間遠心分離した。可能な限り上清を除き、ボルテックスで細胞をほぐした。５００μＬのＡＡＶ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａ（Ｔａｋａｒａ）を加えた。１５秒間ボルテックスした。１．５ｍＬチューブに中身を移し、１００００×ｇ、４℃、１０分間遠心分離した。再度、１５秒間のボルテックス～遠心分離を行った。上清を新しい１．５ｍＬチューブに移し、ＡＡＶ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂ（Ｔａｋａｒａ）を５０μＬ加え、混合した。１００μＬずつ分注し、－８０℃で保存した。
細胞に０．５Ｍ ＥＤＴＡ－ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）を１００μＬ加え、１０分間、室温に置いた。細胞をはがし、１５ｍＬチューブに回収した。ディッシュを２ｍＬのＤＭＥＭ＋２５μＬの０．５Ｍ ＥＤＡＴ－ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）で洗いこみ、上記のチューブに回収した。１７００×ｇ、４℃、１０分間遠心分離した。可能な限り上清を除き、ボルテックスで細胞をほぐした。５００μＬのＡＡＶ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａ（Ｔａｋａｒａ）を加えた。１５秒間ボルテックスした。１．５ｍＬチューブに中身を移し、１００００×ｇ、４℃、１０分間遠心分離した。再度、１５秒間のボルテックス～遠心分離を行った。上清を新しい１．５ｍＬチューブに移し、ＡＡＶ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂ（Ｔａｋａｒａ）を５０μＬ加え、混合した。１００μＬずつ分注し、－８０℃で保存した。
【0077】
４．ＡＡＶ定量
ＡＡＶ溶液：５μＬ、水：１２μＬ、１０×ＤＮａｓｅバッファー：２μＬ、ＤＮａｓｅ Ｉ（Ｔａｋａｒａ）：１μＬを、ピペッティングで穏やかに混ぜてＤＮａｓｅ反応液を調製し、７℃、３０分間→９５℃、１０分間反応させた。以下のプライマー、
フォワードプライマー：5'-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT（配列番号：２３）
リバースプライマー：5'-CGGCCTCAGTGAGCGA（配列番号：２４）、
を使用して、ｉＱ ＣＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｓｕｐｅｒｍｉｘ（２×）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）：１０μＬ、１００μＭフォワードプライマー：０．１μＬ、１００μＭリバースプライマー：０．１μＬ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ：４．８μＬを混合し、全量で１５μＬ／サンプルのマスターミックスを調製した。ｐＡＡＶ－ＣＭＶを２×１０９ ｍｏｌｅｓ／μＬに希釈した。
下表のようにプラスミドを段階希釈した。
次のようにサンプルを希釈した。
１：２０希釈：サンプル５μＬ＋水９５μＬ、
１：１００希釈：１：２０希釈を２０μＬ＋水８０μＬ、
１：５００希釈：１：１００希釈を２０μＬ＋水８０μＬ、
１：２５００希釈：１：５００希釈を２０μＬ＋水８０μＬ、
各サンプルとスタンダードを５μＬずつ９６ウェルプレートにアプライし、マスターミックスを１５μＬずつ加え、ピペッティングして混ぜた。９５℃３分間／９５℃１５秒間／６０℃６０秒間／ｒｅａｄ ｐｌａｔｅ／ステップ３から４０サイクル／融解曲線５５℃→９５℃の条件でＰＣＲを行った。解析にはＢｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ ＣｏｎｎｅｃｔリアルタイムＰＣＲ解析システムを用いた。
ＡＡＶ溶液：５μＬ、水：１２μＬ、１０×ＤＮａｓｅバッファー：２μＬ、ＤＮａｓｅ Ｉ（Ｔａｋａｒａ）：１μＬを、ピペッティングで穏やかに混ぜてＤＮａｓｅ反応液を調製し、７℃、３０分間→９５℃、１０分間反応させた。以下のプライマー、
フォワードプライマー：5'-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT（配列番号：２３）
リバースプライマー：5'-CGGCCTCAGTGAGCGA（配列番号：２４）、
を使用して、ｉＱ ＣＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｓｕｐｅｒｍｉｘ（２×）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）：１０μＬ、１００μＭフォワードプライマー：０．１μＬ、１００μＭリバースプライマー：０．１μＬ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ：４．８μＬを混合し、全量で１５μＬ／サンプルのマスターミックスを調製した。ｐＡＡＶ－ＣＭＶを２×１０９ ｍｏｌｅｓ／μＬに希釈した。
下表のようにプラスミドを段階希釈した。
【表11】
次のようにサンプルを希釈した。
１：２０希釈：サンプル５μＬ＋水９５μＬ、
１：１００希釈：１：２０希釈を２０μＬ＋水８０μＬ、
１：５００希釈：１：１００希釈を２０μＬ＋水８０μＬ、
１：２５００希釈：１：５００希釈を２０μＬ＋水８０μＬ、
各サンプルとスタンダードを５μＬずつ９６ウェルプレートにアプライし、マスターミックスを１５μＬずつ加え、ピペッティングして混ぜた。９５℃３分間／９５℃１５秒間／６０℃６０秒間／ｒｅａｄ ｐｌａｔｅ／ステップ３から４０サイクル／融解曲線５５℃→９５℃の条件でＰＣＲを行った。解析にはＢｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ ＣｏｎｎｅｃｔリアルタイムＰＣＲ解析システムを用いた。
【0078】
５．ノイラミニダーゼ活性およびカルボキシペプチダーゼ活性の測定
ウイルスを含む抽出液を１×１０５ｖｇ／細胞でＮＥＵ１ノックアウト（ＫＯ）あるいはＣＴＳＡ ＫＯ ＨＥＫ２９３に添加し、１週間培養した。界面活性剤で細胞を溶解し、４－ＭＵ－ＮＡＮＡでノイラミニダーゼ活性を、Ｚ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－ＯＨでカルボキシペプチダーゼ活性を測定した。結果を図１６、１７に示す。図に示すとおり、ＣＴＳＡ ＫＯ、ＮＥＵ１ ＫＯ ＨＥＫ２９３の両方で、ＡＡＶ２ ＣＴＳＡ＋ｍｏｄ ＮＥＵ１を添加するとノイラミニダーゼ活性、およびカルボキシペプチダーゼ活性が上昇した
ウイルスを含む抽出液を１×１０５ｖｇ／細胞でＮＥＵ１ノックアウト（ＫＯ）あるいはＣＴＳＡ ＫＯ ＨＥＫ２９３に添加し、１週間培養した。界面活性剤で細胞を溶解し、４－ＭＵ－ＮＡＮＡでノイラミニダーゼ活性を、Ｚ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－ＯＨでカルボキシペプチダーゼ活性を測定した。結果を図１６、１７に示す。図に示すとおり、ＣＴＳＡ ＫＯ、ＮＥＵ１ ＫＯ ＨＥＫ２９３の両方で、ＡＡＶ２ ＣＴＳＡ＋ｍｏｄ ＮＥＵ１を添加するとノイラミニダーゼ活性、およびカルボキシペプチダーゼ活性が上昇した
【0079】
実施例７．ＣＴＳＡ＋ｍｏｄ ＮＥＵ１同時発現ＡＡＶ２の感染
ウイルスを含む抽出液を２×１０５ｖｇ／細胞あるいは１×１０５ｖｇ／細胞でガラクトシアリドーシス（ＧＳ）、またはシアリドーシス（ＳＤ）患者由来皮膚繊維芽細胞に添加し、１週間培養した。ガラクトシアリドーシス患者由来皮膚繊維芽細胞F598、シアリドーシス患者由来皮膚繊維芽細胞F643、およびポジティブコントロールとして健常者由来皮膚繊維芽細胞F258、を使用した。界面活性剤で細胞を溶解し、４－ＭＵ－ＮＡＮＡでノイラミニダーゼ活性を測定した。結果を図１８、１９に示す。ＧＳ患者由来、ＳＤ患者由来皮膚繊維芽細胞の両方で、ＡＡＶ２ ＣＴＳＡ＋ｍｏｄ ＮＥＵ１を添加するとノイラミニダーゼ活性が上昇した。
ウイルスを含む抽出液を２×１０５ｖｇ／細胞あるいは１×１０５ｖｇ／細胞でガラクトシアリドーシス（ＧＳ）、またはシアリドーシス（ＳＤ）患者由来皮膚繊維芽細胞に添加し、１週間培養した。ガラクトシアリドーシス患者由来皮膚繊維芽細胞F598、シアリドーシス患者由来皮膚繊維芽細胞F643、およびポジティブコントロールとして健常者由来皮膚繊維芽細胞F258、を使用した。界面活性剤で細胞を溶解し、４－ＭＵ－ＮＡＮＡでノイラミニダーゼ活性を測定した。結果を図１８、１９に示す。ＧＳ患者由来、ＳＤ患者由来皮膚繊維芽細胞の両方で、ＡＡＶ２ ＣＴＳＡ＋ｍｏｄ ＮＥＵ１を添加するとノイラミニダーゼ活性が上昇した。
【0080】
実施例８．ＮＥＵ１改変型はＣＨＯ細胞上清に分泌される
実施例２．１と同様の手順でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、無血清培地で培養し、培養上清を回収し、精製ＣＴＳＡを加えて上記の方法に従い、ノイラミニダーゼ活性を測定した。結果を図２０に示す。培地１Ｌあたり、１．１８ｍｇのＮＥＵ１改変型１が分泌されていた。
実施例２．１と同様の手順でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、無血清培地で培養し、培養上清を回収し、精製ＣＴＳＡを加えて上記の方法に従い、ノイラミニダーゼ活性を測定した。結果を図２０に示す。培地１Ｌあたり、１．１８ｍｇのＮＥＵ１改変型１が分泌されていた。
【0081】
実施例９．ＣＴＳＡ＋ｍｏｄ ＮＥＵ１同時発現ＡＡＶ２ベクターの精製
Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ． ａｌ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ６， ９７３－９８５ （１９９９）に記載される非連続グラジエント法に基づいてベクターを精製する。凍結保存していた細胞に１ｍＭ塩化マグネシウム入りＰＢＳ（ＰＢＳ－ＭＫ）を加え、融解する。ＤＮａｓｅ Ｉ、およびＲＮａｓｅ Ａを加え、３７℃、１時間反応させる。１００００×ｇ、１０℃、５分間遠心し、上清を０．４５μｍフィルターでフィルトレーションする。また、ＰＢＳ－ＭＫをフィルターに通し、フィルター内に残った液を押し出す。超遠心チューブにサンプルを加え、長い針を付けたシリンジで、１５％イオジキサノール／１ＭＮａＣｌ／ＰＢＳ－ＭＫをサンプルの下にアプライする。次いで、２５％イオジキサノール／フェノールレッド／ＰＢＳ－ＭＫを下層にアプライする。また、４０％イオジキサノール／ＰＢＳ－ＭＫを下層にアプライする。さらに、５４％イオジキサノール／ＰＢＳ－ＭＫを下層にアプライする。５００００ｒｐｍ（使用ローターは７０．１ Ｔｉ、２０００００×ｇ）、１８℃、２時間遠心する。遠心終了後、４０％イオジキサノール層を回収する。１００ｋＤａ ｃｕｔ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ でＰＢＳにバッファー交換する。
Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ． ａｌ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ６， ９７３－９８５ （１９９９）に記載される非連続グラジエント法に基づいてベクターを精製する。凍結保存していた細胞に１ｍＭ塩化マグネシウム入りＰＢＳ（ＰＢＳ－ＭＫ）を加え、融解する。ＤＮａｓｅ Ｉ、およびＲＮａｓｅ Ａを加え、３７℃、１時間反応させる。１００００×ｇ、１０℃、５分間遠心し、上清を０．４５μｍフィルターでフィルトレーションする。また、ＰＢＳ－ＭＫをフィルターに通し、フィルター内に残った液を押し出す。超遠心チューブにサンプルを加え、長い針を付けたシリンジで、１５％イオジキサノール／１ＭＮａＣｌ／ＰＢＳ－ＭＫをサンプルの下にアプライする。次いで、２５％イオジキサノール／フェノールレッド／ＰＢＳ－ＭＫを下層にアプライする。また、４０％イオジキサノール／ＰＢＳ－ＭＫを下層にアプライする。さらに、５４％イオジキサノール／ＰＢＳ－ＭＫを下層にアプライする。５００００ｒｐｍ（使用ローターは７０．１ Ｔｉ、２０００００×ｇ）、１８℃、２時間遠心する。遠心終了後、４０％イオジキサノール層を回収する。１００ｋＤａ ｃｕｔ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ でＰＢＳにバッファー交換する。
【0082】
実施例１０．ｉｎ ｖｉｖｏ脳室内投与プロトコール
ＣＴＳＡ ｍｕｔａｎｔマウスを麻酔し、頭皮を切り開く。ブレグマから右に１ｍｍ、尾の方に０．５ｍｍの位置に二段針を差し込み、ＡＡＶ溶液を２５μＬ投与する。カイロの上にマウスを置き、麻酔から覚めるまで体温を維持する。１週間後、解剖して大脳と小脳に分け、酵素活性を測定する。
ＣＴＳＡ ｍｕｔａｎｔマウスを麻酔し、頭皮を切り開く。ブレグマから右に１ｍｍ、尾の方に０．５ｍｍの位置に二段針を差し込み、ＡＡＶ溶液を２５μＬ投与する。カイロの上にマウスを置き、麻酔から覚めるまで体温を維持する。１週間後、解剖して大脳と小脳に分け、酵素活性を測定する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【配列表】