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特許7538511トキソプラズマ原虫由来のＩＭＣ、ＲＯＰ１８及びＭＩＣ８を同時発現するウイルス様粒子、及びこれを含む薬学的組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-14
(45)【発行日】2024-08-22
(54)【発明の名称】トキソプラズマ原虫由来のＩＭＣ、ＲＯＰ１８及びＭＩＣ８を同時発現するウイルス様粒子、及びこれを含む薬学的組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 39/002 20060101AFI20240815BHJP
A61K 39/145 20060101ALI20240815BHJP
A61K 31/522 20060101ALI20240815BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240815BHJP
A61P 33/02 20060101ALI20240815BHJP
C12N 7/01 20060101ALN20240815BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20240815BHJP
C12N 15/44 20060101ALN20240815BHJP
C12N 15/30 20060101ALN20240815BHJP
【ＦＩ】
A61K39/002
A61K39/145
A61K31/522
A61P43/00 121
A61P33/02
C12N7/01
C12N15/63 Z
C12N15/44 ZNA
C12N15/30
【請求項の数】
6
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2020000954
(22)【出願日】2020-01-07
(65)【公開番号】P2021118679
(43)【公開日】2021-08-12
【審査請求日】2022-11-22
(31)【優先権主張番号】10-2020-0001828
(32)【優先日】2020-01-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊａｎｕａｒｙ ２０１９ Ｖｏｌｕｍｅ ９，Ａｒｔｉｃｌｅ ３０７３で発表
(73)【特許権者】
【識別番号】520006964
【氏名又は名称】ヘルス・パーク・カンパニー・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｈｅａｌｔｈ Ｐａｒｋ ｃｏ，．ｌｔｄ．
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100150500
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 靖
(72)【発明者】
【氏名】パク・ヒョヌ
(72)【発明者】
【氏名】チン・フイ
(72)【発明者】
【氏名】チュエン・フー・シ
【審査官】田中 晴絵
(56)【参考文献】
【文献】PLoS ONE，2019年08月29日，14(8)，e0220865
【文献】Vaccine，2012年，31，58-83
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｎ ７／０１
Ａ６１Ｋ ３９／１４５
Ａ６１Ｋ ３９／００２
Ａ６１Ｐ ３３／０２
Ａ６１Ｋ ３１／５２２
Ａ６１Ｐ ４３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ウイルス様粒子を有効成分として含む、トキソプラズマ原虫感染症の予防または治療用薬学的組成物であって、前記ウイルス様粒子は、インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ １；Ｍ１）と
トキソプラズマ原虫由来の内膜複合体タンパク質（Ｉｎｎｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ；ＩＭＣ）、ロプトリータンパク質１８（Ｒｈｏｐｔｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ １８；ＲＯＰ１８）及びミクロネームタンパク質８（Ｍｉｃｒｏｎｅｍｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ８；ＭＩＣ８）とを含む表面抗原タンパク質を含み、
前記薬学的組成物は、シトシン－ホスホロチオエート－グアニン（ＣｐＧ）と共に、対象者に鼻腔内投与される、前記薬学的組成物。
【請求項2】
前記インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１（Ｍ１）は、配列番号１のアミノ酸配列で構成され、前記内膜複合体タンパク質（ＩＭＣ）は、配列番号２のアミノ酸配列で構成され、前記ロプトリータンパク質１８（ＲＯＰ１８）は配列番号３のアミノ酸配列で構成され、前記ミクロネームタンパク質８（ＭＩＣ８）は配列番号４のアミノ酸配列で構成される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項3】
前記インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１（Ｍ１）は、配列番号５の核酸配列によってコーディングされ、前記内膜複合体タンパク質（ＩＭＣ）は、配列番号６の核酸配列によってコーディングされ、前記ロプトリータンパク質１８（ＲＯＰ１８）は配列番号７の核酸配列によってコーディングされ、前記ミクロネームタンパク質８（ＭＩＣ８）は配列番号８の核酸配列によってコーディングされる、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項4】
対象者に１回ないし３回投与される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項5】
請求項１から４のいずれか１つに記載の薬学的組成物を人間ではない、対象者に免疫学的有効量で投与する段階を含むトキソプラズマ原虫感染症の予防または治療方法。
【請求項6】
トキソプラズマ原虫感染症の予防または治療用薬剤を製造するための請求項１から４のいずれか１つに記載の薬学的組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、トキソプラズマ原虫ウイルス様粒子（ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；ＶＬＰ）及びその用途に関するものであり、詳細には、構造タンパク質としてインフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１を含み、トキソプラズマ原虫由来の内膜複合体タンパク質、ロプトリータンパク質１８及びミクロネームタンパク質８を含む表面抗原タンパク質を含むトキソプラズマ原虫感染症の予防または治療用ウイルス様粒子、及びこれを含む薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）は、コクシジウム亜綱（ｓｕｂｃｌａｓｓ ｏｆ ｃｏｃｃｉｄｉａ）に属するアピコンプレクサである。トキソプラズマ原虫は、細胞内寄生虫（ｏｂｌｉｇａｒｅ ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ｐａｒａｓｉｔｅ）として全世界的に分布する人間及び動物に対するトキソプラズマ症（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ）を引き起こす原因原虫である。
【0003】
トキソプラズマ原虫は大きく、オーシスト（ｏｏｃｙｓｔ）、タキゾイト（ｔａｃｈｙｚｏｉｔ）、ブラディゾイト（ｂｒａｄｙｚｏｉｔ）、シゾント（ｓｃｈｉｚｏｎｔ）及びガメトサイト（ｇａｍｅｔｏｃｙｔｅ）段階の５つの発育段階を経る。トキソプラズマ原虫は終宿主である猫の糞便のオーシスト（ｏｏｃｙｓｔ）によって汚染された水または野菜を摂取することによって感染したり、中間宿主である豚、羊、牛などの肉類に嚢胞（ｃｙｓｔ）として存在するトキソプラズマ原虫を摂食する時に感染し得る。
【0004】
全世界の人口の約３分の１以上がトキソプラズマ原虫に感染されたと推定され、韓国国内でもグループによって２ないし２５％の感染率を示すと報告されている。
【0005】
産婦がトキソプラズマ原虫に感染した時、トキソプラズマ原虫のトロホゾイト（ｔｒｏｐｈｏｚｏｉｔｅ）は胎盤を通じて胎児を感染させ得る。トキソプラズマ原虫の感染によって、初期の胎児は流産または死産に至り得、中後期の胎児は正常に分娩したにもかかわらず、視力損傷、水頭症、知的障害などの先天奇形を持ち得る。
【0006】
また、健康的な個体に感染したトキソプラズマ原虫は免疫系細胞、細網内皮細胞などを破壊してリンパ腺炎、脈絡網膜炎、脳脊髄炎などの疾病を誘発し得、宿主の免疫不全時に脳で増殖した嚢胞が活性化され、髄膜炎または脈絡網膜炎を引き起こし得る。
【0007】
一方、マラリアの治療剤としても使用されるピリメタミン（ｐｙｒｉｍｅｔｈａｍｉｎｅ）がトキソプラズマ症の治療剤として最も広く使用されているが、妊娠中には治療効果があまり表れず、その他にスピラマイシン（ｓｐｉｒａｍｙｃｉｎ）は薬効が大きくないため、予防用として使われている。
【0008】
また、ピリメタミンと併用されるスルファ剤（ｓｕｌｆａ ｄｒｕｇ）であるスルファメトキサゾール（ｓｕｌｆａｍｅｔｈｏｘａｚｏｌｅ）は、骨髄抑制を起こして血小板数を減少させることができ、葉酸との併用投与によりアレルギー反応、腎臓障害、血液障害、悪心、嘔吐などの副作用を誘発することができる。
【0009】
しかし、現在、最も広く使われている抗トキソプラズマ原虫剤のスルファ剤やピリメタミンは、耐性の増加により治療効果が徐々に減少しており、抗体を生成させ、トキソプラズマ原虫に対する免疫力を付与し得るワクチンも開発されていない実情である。
【0010】
一方、実際のウイルスの構造と形態学的に類似したウイルス様粒子は、いくつかのウイルスに対するワクチン抗原として提案されてきた（Ｒｏｌｄａｏ Ａ， Ｍｅｌｌａｄｏ ＭＣ， Ｃａｓｔｉｌｈｏ ＬＲ， Ｃａｒｒｏｎｄｏ ＭＪ， Ａｌｖｅｓ ＰＭ： Ｅｘｐｅｒｔ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｅｓ ２０１０， ９：１１４９－１１７６；Ｋａｎｇ ＳＭ， Ｋｉｍ ＭＣ， Ｃｏｍｐａｎｓ ＲＷ： Ｅｘｐｅｒｔ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｅｓ ２０１２， １１：９９５－１００７；Ｋｕｓｈｎｉｒ Ｎ， Ｓｔｒｅａｔｆｉｅｌｄ ＳＪ， Ｙｕｓｉｂｏｖ Ｖ： Ｖａｃｃｉｎｅ ２０１２， ３１：５８－８３）．
【0011】
ウイルス様粒子は、免疫原組成物に使用するための抗原として、最近多くの注目を集めている。ウイルス様粒子は、野生型ウイルスと類似した形態として、１つ以上の表面タンパク質を含有して体内の免疫反応を誘導し得る。ウイルス様粒子は、野生型ウイルスとは異なって遺伝物質が欠如していることから、免疫系を活性化させることができるにもかかわらず、非感染性であるため、非常に安全である。
【0012】
本発明者らは、トキソプラズマ原虫に直接作用する従来の治療剤とは異なり、体内の免疫反応を誘導して、安全で耐性の問題がなく、トキソプラズマ症に対する予防及び治療効果に優れた新規な形態のウイルス様粒子を開発しようとした。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
本発明の目的は、トキソプラズマ原虫に対する体内の免疫反応を誘導し得る新規な形態のウイルス様粒子、すなわち構造タンパク質としてインフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１を含み、トキソプラズマ原虫由来の内膜複合体タンパク質、ロプトリータンパク質１８及びミクロネームタンパク質８を含む表面抗原タンパク質を含むトキソプラズマ原虫感染症の予防または治療用ウイルス様粒子及びこれの用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0014】
本発明の一側面によると、インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ １；Ｍ１）；及びトキソプラズマ原虫由来の内膜複合体タンパク質（Ｉｎｎｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ；ＩＭＣ）、ロプトリータンパク質１８（Ｒｈｏｐｔｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ １８；ＲＯＰ１８）及びミクロネームタンパク質８（Ｍｉｃｒｏｎｅｍｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ８；ＭＩＣ８）を含む表面抗原タンパク質を含むウイルス様粒子が提供される。
【0015】
一実施形態において、上記インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１（Ｍ１）は、配列番号１のアミノ酸配列で構成されることができ、上記内膜複合体タンパク質（ＩＭＣ）は、配列番号２のアミノ酸配列で構成されることができ、上記ロプトリータンパク質１８（ＲＯＰ１８）は、配列番号３のアミノ酸配列で構成されることができ、上記ミクロネームタンパク質８（ＭＩＣ８）は、配列番号４のアミノ酸配列で構成されることができる。
【0016】
一実施形態において、上記インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１（Ｍ１）は、配列番号５の核酸配列によってコーディングされることができ、上記内膜複合体タンパク質（ＩＭＣ）は、配列番号６の核酸配列によってコーディングされることができ、上記ロプトリータンパク質１８（ＲＯＰ１８）は、配列番号７の核酸配列によってコーディングされることができ、上記ミクロネームタンパク質８（ＭＩＣ８）は、配列番号８の核酸配列によってコーディングされることができる。
【0017】
本発明の他の側面によると、上記ウイルス様粒子を有効成分として含むトキソプラズマ原虫感染症の予防または治療用の薬学的組成物が提供される。
【0018】
一実施態様において、上記薬学的組成物は、対象者に鼻腔内投与される。
【0019】
一実施態様において、上記薬学的組成物は、シトシン－ホスホロチオエート－グアニン（ＣｐＧ）と共に投与される。
【0020】
一実施態様において、上記薬学的組成物は、対象者に１回ないし３回投与される。
【0021】
本発明の他の側面によると、上記ウイルス様粒子を対象者に免疫学的有効量で投与する段階を含む、トキソプラズマ原虫感染症の予防または治療方法を提供する。
【0022】
本発明の他の側面によると、トキソプラズマ原虫感染症の予防または治療の用途で使用するための、上記ウイルス様粒子を含む組成物を提供する。
【0023】
本発明の他の側面によると、トキソプラズマ原虫感染症の予防または治療用薬剤を製造するための、上記ウイルス様粒子を含む組成物の用途を提供する。
【0024】
本発明の他の側面によると、インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１（Ｍ１）をコーディングする核酸配列；内膜複合体タンパク質（ＩＭＣ）をコーディングする核酸配列；ロプトリータンパク質１８（ＲＯＰ１８）をコーディングする核酸配列；及びミクロネームタンパク質８（ＭＩＣ８）をコーディングする核酸配列を含むウイルス様粒子の製造用発現ベクターが提供される。
【0025】
本発明の他の側面によると、上記発現ベクターにより形質転換された宿主細胞が提供される。
【0026】
一実施形態において、上記宿主細胞は、微生物、動物細胞、植物細胞、動物に由来した培養細胞または植物に由来した培養細胞であってもよい。
【0027】
本発明の他の側面によると、上記発現ベクターで宿主細胞を形質転換する段階と、上記宿主細胞を培養してウイルス様粒子を発現させる段階とを含む、ウイルス様粒子の製造方法が提供される。
【発明の效果】
【0028】
本発明のウイルス様粒子は、トキソプラズマ原虫感染による炎症性サイトカインの生成を抑制し、マウス体内のトキソプラズマ原虫嚢胞の生成を抑制するのみならず、トキソプラズマ原虫に対して著しく高いレベルの免疫性を提供することができる。
【0029】
本発明のトキソプラズマ原虫から由来した３以上のタンパク質を同時発現するウイルス様粒子は、特に優れたトキソプラズマ原虫－特異的抗体反応を誘導することができ、固体内の抗炎症性サイトカインの生成を促進して炎症反応を減少させ、また、固体内のトキソプラズマ原虫嚢胞の大きさ及び数を著しく減少させ、固体の生存率及び体重の維持に寄与することで、上記固体を効果的に保護することができる。
【0030】
本発明の効果は、上記の効果に限定されるものではなく、本発明の詳細な説明または請求の範囲に記載された発明の構成から推論可能なすべての効果を含むものと理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【図1】Ｍ１とＩＭＣ、ＲＯＰ１８、ＭＩＣ８を同時発現するＴＧ１４６ ＶＬＰ、及びＭ１とＩＭＣ（ＴＧ１）を含むＶＬＰ（ＴＧ１ ＶＬＰ）、Ｍ１とＲＯＰ１８（ＴＧ４）を含むＶＬＰ（ＴＧ４ ＶＬＰ）、Ｍ１とＭＩＣ８（ＴＧ６）を含むＶＬＰ（ＴＧ６ ＶＬＰ）を１：１：１の割合で組み合わせたＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６ ＶＬＰの概略図及びこれをウェスタンブロットで分析した結果を示す図である：（Ａ）ＴＧ１４６ ＶＬＰの概略図；（Ｂ）ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６ ＶＬＰの概略図；（Ｃ）ＴＧ１４６ ＶＬＰのウェスタンブロットの結果；（Ｄ）ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６ ＶＬＰのウェスタンブロットの結果。
【図2】ＴＧ１ ＶＬＰ、ＴＧ４ ＶＬＰ、ＴＧ６ ＶＬＰ、及びＴＧ１４６ ＶＬＰを透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察した結果を示す図である：（Ａ）ＴＧ１ ＶＬＰ；（Ｂ）ＴＧ４ ＶＬＰ；（Ｃ）ＴＧ６ ＶＬＰ；（Ｄ）ＴＧ１４６ ＶＬＰ。
【図3】陰性対照群（Ｎａiｖｅ）、ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６ ＶＬＰを注入した群（ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６）、ＴＧ１４６ ＶＬＰを注入した群（ＴＧ１４６）の１次（ｐｒｉｍｅ）及び２次（ｂｏｏｓｔ）免疫化の後、血清内トキソプラズマ原虫－特異的抗体反応のレベルと各群の寄生虫中和活性のレベルを示す図である：（Ａ）１次免疫化後ＩｇＧレベル；（Ｂ）２次免疫化後ＩｇＧレベル；（Ｃ）寄生虫中和活性。
【図4】陰性対照群（Ｎａiｖｅ）、陽性対照群（Ｎａiｖｅ＋Ｃｈａ）、ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６ ＶＬＰを注入した群（ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６＋Ｃｈａ）、ＴＧ１４６ ＶＬＰを注入した群（ＴＧ１４６＋Ｃｈａ）のチャレンジ感染後のマウスの脾臓細胞からのＴ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋）の分布をフローサイトメトリー分析で分析した結果を示す図である。
【図5】陰性対照群（Ｎａiｖｅ）、陽性対照群（Ｎａiｖｅ＋Ｃｈａ）、ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６ ＶＬＰを注入した群（ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６＋Ｃｈａ）、ＴＧ１４６ ＶＬＰを注入した群（ＴＧ１４６＋Ｃｈａ）のチャレンジ感染後のマウスの脾臓細胞からの胚中心Ｂ細胞（ＧＣ）の分布をフローサイトメトリー分析で分析した結果を示す図である。
【図6】陰性対照群（Ｎａiｖｅ）、陽性対照群（Ｎａiｖｅ＋Ｃｈａ）、ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６ ＶＬＰを注入した群（ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６＋Ｃｈａ）、ＴＧ１４６ ＶＬＰを注入した群（ＴＧ１４６＋Ｃｈａ）のチャレンジ感染後のマウスの脾臓からアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）反応レベルを確認した結果を示す図である。
【図7】陽性対照群（Ｎａiｖｅ＋Ｃｈａ）、ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６ ＶＬＰを注入した群（ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６＋Ｃｈａ）及びＴＧ１４６ ＶＬＰを注入した群（ＴＧ１４６＋Ｃｈａ）のチャレンジ感染後の体重変化及び生存率をモニタリングした結果及び寄生虫複製の抑制レベルを示す図である：（Ａ）生存率；（Ｂ）体重の変化；（Ｃ）寄生虫複製の抑制レベル。
【図8】トキソプラズマ原虫ＶＬＰとＣｐＧの併用投与に関する１回免疫化の動物実験の概略図である。
【図9】１回免疫化の動物実験時の陰性対照群（Ｎａiｖｅ）、ＴＧ１４６ ＶＬＰをＩＭ経路で注入した群（ＴＧ１４６ ＶＬＰｓ（ＩＭ））、ＴＧ１４６ ＶＬＰをＩＮ経路で注入した群（ＴＧ１４６ ＶＬＰｓ（ＩＮ））、ＴＧ１４６ ＶＬＰ及びＣｐＧをＩＭ経路で共に注入した群（ＴＧ１４６ ＶＬＰｓ＋ＣｐＧ（ＩＭ））、ＴＧ１４６ ＶＬＰ及びＣｐＧをＩＮ経路で共に注入した群（ＴＧ１４６ ＶＬＰｓ＋ＣｐＧ（ＩＮ））の免疫化の１週間後（ｗｅｅｋ １）、免疫化の４週間後（ｗｅｅｋ ４）、及びチャレンジ感染後の血清内のトキソプラズマ原虫－特異的ＩｇＧ及びＩｇＡのレベルを示す図である。
【図10】１回免疫化の動物実験時の各群のチャレンジ感染後の脾臓及び腸間膜リンパ節（ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ；ＭＬＮ）のフローサイトメトリー分析の結果を示す図である。
【図11】１回免疫化の動物実験時の各群のチャレンジ感染後の炎症性サイトカインのレベルを示す図である。
【図12】１回免疫化の動物実験時の各群のチャレンジ感染後の脳組織の嚢胞の大きさ及び数を示す図である。
【図13】１回免疫化の動物実験時の各群のチャレンジ感染後の体重の変化及び生存率をモニタリングした結果を示す図である。
【図14】トキソプラズマ原虫ＶＬＰとＣｐＧの併用投与に関する２回免疫化の動物実験の概略図である。
【図15】２回免疫化の動物実験時の陰性対照群（Ｎａiｖｅ）、ＴＧ１４６ ＶＬＰをＩＭ経路で注入した群（ＴＧ１４６ ＶＬＰｓ（ＩＭ））、ＴＧ１４６ ＶＬＰをＩＮ経路で注入した群（ＴＧ１４６ ＶＬＰｓ（ＩＮ））、ＴＧ１４６ ＶＬＰ及びＣｐＧをＩＭ経路で共に注入した群（ＴＧ１４６ ＶＬＰｓ＋ＣｐＧ（ＩＭ））、ＴＧ１４６ ＶＬＰ及びＣｐＧをＩＮ経路で共に注入した群（ＴＧ１４６ ＶＬＰｓ＋ＣｐＧ（ＩＮ））の１次（ｐｒｉｍｅ）免疫化、２次（ｂｏｏｓｔ）免疫化及びチャレンジ感染後の血清内のトキソプラズマ原虫－特異的ＩｇＧ及びＩｇＡのレベルを示す図である。
【図16】２回免疫化の動物実験時の各群のチャレンジ感染後の脾臓及び腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）のフローサイトメトリー分析の結果を示す図である。
【図17】２回免疫化の動物実験時の各群のチャレンジ感染後の炎症性サイトカインのレベルを示す図である。
【図18】２回免疫化の動物実験時の各群のチャレンジ感染後の脳組織の嚢胞の大きさ及び数を示す図である。
【図19】２回免疫化の動物実験時の各群のチャレンジ感染後の体重の変化及び生存率をモニタリングした結果を示す図である。
【図20】トキソプラズマ原虫ＶＬＰとＣｐＧの併用投与に関する３回免疫化の動物実験の概略図である。
【図21】３回免疫化の動物実験時の陰性対照群（Ｎａiｖｅ）、ＴＧ１４６ ＶＬＰをＩＭ経路で注入した群（ＴＧ１４６ ＶＬＰｓ（ＩＭ））、ＴＧ１４６ ＶＬＰをＩＮ経路で注入した群（ＴＧ１４６ ＶＬＰｓ（ＩＮ））、ＴＧ１４６ ＶＬＰ及びＣｐＧをＩＭ経路で共に注入した群（ＴＧ１４６ ＶＬＰｓ＋ＣｐＧ（ＩＭ））、ＴＧ１４６ ＶＬＰ及びＣｐＧをＩＮ経路で共に注入した群（ＴＧ１４６ ＶＬＰｓ＋ＣｐＧ（ＩＮ））の１次免疫化、２次免疫化、３次免疫化及びチャレンジ感染後の血清内のトキソプラズマ原虫－特異的ＩｇＧ及びＩｇＡのレベルを示す図である。
【図22】３回免疫化の動物実験時の各群のチャレンジ感染後の脾臓及び腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）のフローサイトメトリー分析の結果を示す図である。
【図23】３回免疫化の動物実験時の各群のチャレンジ感染後の炎症性サイトカインのレベルを示す図である。
【図24】３回免疫化の動物実験時の各群のチャレンジ感染後の脳組織の嚢胞の大きさ及び数を示す図である。
【図25】３回免疫化の動物実験時の各群のチャレンジ感染後の体重の変化及び生存率をモニタリングした結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0032】
以下では、添付した図面を参照して、本発明を説明することにする。しかし、本発明は、多様な異なる形態で具現化してもよく、したがって、ここで説明する実施形態に限定されるものではない。
【0033】
或る部分が何らかの構成要素を「含む」というとき、それを否定する別の記載がない限り、他の構成要素を除外するのではなく、他の構成要素をさらに備え得ることを意味する。
【0034】
別に定義されていなければ、分子生物学、微生物学、タンパク質精製、タンパク質工学、及びＤＮＡ配列分析及び当業者の能力の範囲内で組換えＤＮＡの分野において一般的に使用される通常の技術によって行われ得る。上記の技術は、当業者に知られており、多くの標準化された教材及び参考著書に記述されている。
【0035】
本明細書に別に定義されていなければ、使用されているすべての技術及び科学用語は、当業界に通常の技術者が通常理解しているような意味を持つ。
【0036】
本明細書に含まれる用語を含む多様な科学的辞典がよく知られており、当業界において利用可能である。本明細書に説明されているものに類似、または等価である任意の方法及び物質が、本願の実行または試験に使用されていると発見されるものの、いくつかの方法及び物質が記載されている。当業者が使用する脈絡に沿って、多様に使用することができるため、特定の方法論、プロトコル、及び試薬で本発明が制限されるものではない。
【0037】
本明細書で使用されているように、単数形は、文脈が明確に、特に指示しなければ、複数の対象を含む。また、別の指示がなければ、核酸はそれぞれ左から右に、５’から３’方向に書かれ、アミノ酸配列は左から右に、アミノからカルボキシル方向に書かれる。
【0038】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【0039】
本発明の一側面によると、インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１（Ｍ１）；及びトキソプラズマ原虫由来の内膜複合体タンパク質（ＩＭＣ）、ロプトリータンパク質１８（ＲＯＰ１８）及びミクロネームタンパク質８（ＭＩＣ８）を含む表面抗原タンパク質を含むウイルス様粒子が提供される。
【0040】
本発明の「ウイルス様粒子（ＶＬＰ）」は、ウイルス性タンパク質を伴うか、伴わない非感染性のウイルス性サブユニットを意味する。例えば、上記ウイルス様粒子は、ＤＮＡまたはＲＮＡゲノムが完全に欠如し得る。特に、本発明の一実施形態によるウイルス様粒子は、遺伝工学的な方法によって製造されることができ、構造タンパク質（ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）としてインフルエンザウイルス由来のマトリックスタンパク質１（Ｍ１）を含んでもよい。本発明のウイルス様粒子は、別の原因感染体、すなわちトキソプラズマ原虫がなくても、遺伝工学的な方法によって製造されることができるため、高い生産性及び経済性を具現することができる。
【0041】
本発明の「インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１（Ｍ１）」は、インフルエンザウイルスの構造タンパク質として、インフルエンザウイルスの外皮（ｅｎｖｅｌｏｐ）である脂肪層の内側にコート（ｃｏａｔ）を形成する基質タンパク質（ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎ）を意味する。上記インフルエンザウイルスは、Ａ、Ｂ及びＣと命名されたサブタイプで構成される。上記インフルエンザウイルスは、コアと、ウイルスの外皮との間の連結体として作用するマトリックスタンパク質１（Ｍ１）の層で取り囲まれて外形をなし、上記Ｍ１タンパク質は、インフルエンザウイルス様粒子の開発において、構造タンパク質として広く使用されることができる。
【0042】
本発明のウイルス様粒子は、インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１（Ｍ１）を構造タンパク質として含んでもよく、上記インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１（Ｍ１）の表面には、トキソプラズマ原虫に由来した１つ以上の表面抗原タンパク質を含んでもよい。
【0043】
本発明のウイルス様粒子は、表面にトキソプラズマ原虫に由来した表面抗原タンパク質を含んでいるため、特定の固体に取り込まれたとき、トキソプラズマ原虫に特異的な免疫反応を誘導することができる。したがって、本発明のウイルス様粒子は、上記固体にトキソプラズマ原虫に対する免疫力を付与することができる。
【0044】
本発明のウイルス様粒子は、当該技術分野で広く知られている方法により製造され得る。例えば、本発明のウイルス様粒子は構造タンパク質及び表面抗原タンパク質をコーディングする組換えＤＮＡ分子を用いて、所定の宿主細胞を形質転換させた後、培養して製造されることができ、細胞内で発現されたタンパク質が細胞表面で組み立てられた後、培養上清液に排出され得る。本発明のウイルス様粒子は、固体内で抗原として作用し、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）のような抗原提示細胞との反応を通じて、ＴまたはＢ免疫細胞に抗原を提示し得る。
【0045】
本発明のウイルス様粒子は、トキソプラズマ原虫に由来した表面抗原タンパク質を含んでいるものの、その他の遺伝物質は含まないため、増殖が不可能で毒性がなく安全であることから、トキソプラズマ原虫に対するワクチンとして使用され得る。本発明のウイルス様粒子の表面に導入された抗原タンパク質は、純粋に分離された組換えタンパク質に比べて高い抗原性を有し、効果的な中和抗体を形成し得る。
【0046】
本発明の「表面抗原タンパク質」は、それぞれの抗体またはＴ細胞受容体による認識の基本要素または最小単位であり、上記抗体またはＴ細胞受容体が結合する特定のドメイン、領域または分子構造を意味する。本発明の表面抗原タンパク質は、トキソプラズマ原虫に由来することができ、トキソプラズマ原虫に対する免疫活性を誘導することができれば、特に制限されない。
【0047】
一実施形態において、本発明の表面抗原タンパク質は、トキソプラズマ原虫に由来したＳＡＧ１（Ｍｅｍｂｒａｎｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＳＡＧ２、ＧＲＡ１（ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｄｅｎｓｅ－ｇｒａｎｕｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧＲＡ２、ＧＲＡ４、ＧＲＡ７、ＭＩＣ１（Ｍｉｃｒｏｎｅｍｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＭＩＣ２、ＭＩＣ４、ＭＩＣ６、ＭＩＣ７、ＭＩＣ８、ＭＩＣ９、ＭＩＣ１０、ＭＩＣ１１、ＲＯＰ１、ＲＯＰ２、ＲＯＰ３、ＲＯＰ４、ＲＯＰ５、ＲＯＰ６、ＲＯＰ７、ＲＯＰ８、ＲＯＰ９、ＲＯＰ１０、ＲＯＰ１１、ＲＯＰ１２、ＲＯＰ１３、ＲＯＰ１４、ＲＯＰ１５、ＲＯＰ１６、ＲＯＰ１７、ＲＯＰ１８、Ｍ２ＡＰ（ＭＩＣ２ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＡＭＡ１（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ａｐｉｃａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ １）及びＢＡＧ１など多様な種類のタンパク質を含んでもよく、好ましくは内膜ＩＭＣ、ＲＯＰ１８及びＭＩＣ８を同時に含んでもよい。
【0048】
本発明の「内膜複合体タンパク質（Ｉｎｎｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）」は、原形質膜の基底をなす平坦化肺胞を構成する表面膜システムとして、細胞骨格ネットワークと連結している。
【0049】
本発明の内膜複合体タンパク質は、寄生体複製、細胞運動、及び宿主細胞への侵入において重要な役割を果たす。上記内膜複合体タンパク質は、トキソプラズマ原虫内で新規細胞の形成に関与し、複製された染色質及び細胞器官は、細胞分裂の過程として、骨格の組み立てと密接に関連する（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ ａｎｄ Ｍｅｌｔｏｎ、１９６８）。
【0050】
本発明の「ロプトリータンパク質１８（Ｒｈｏｐｔｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ １８）」は、活性寄生虫の宿主細胞内への侵入に関与するトキソプラズマ原虫由来のロプトリータンパク質の一種類として、トキソプラズマ原虫の宿主細胞への寄生に必須的なタンパク質であり、細胞に対する認識、侵入、及び遺伝的破壊に基づくビルレンス（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）と密接に関係する。上記ロプトリータンパク質は、多様な種類が知られており、トキソプラズマ原虫に対する宿主細胞の効果的な免疫反応を誘導する潜在的な抗原標的であってもよい。
【0051】
本発明の「ミクロネームタンパク質８（Ｍｉｃｒｏｎｅｍｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ８）」は、トキソプラズマ原虫の宿主細胞寄生に必須的なタンパク質であり、細胞に対する認識、侵入、及び遺伝的破壊に基づくビルレンス（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）と密接に関係する。上記ミクロネームタンパク質は、多様な種類が知られており、トキソプラズマ原虫に対する宿主細胞の効果的な免疫反応を誘導する潜在的な抗原標的として研究されたことがある。
【0052】
特に、本発明者らは内膜複合体タンパク質（ＩＭＣ）、ロプトリータンパク質１８（ＲＯＰ１８）及びミクロネームタンパク質８（ＭＩＣ８）を同時発現するウイルス様粒子ワクチンが感染による炎症性サイトカインの生成を抑制し、マウスの体内寄生虫の生成を抑制するのみならず、インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１（Ｍ１）と融合した形態として固体内に取り込まれるとき、トキソプラズマ原虫に対する高いレベルの免疫性を提供し得ることを確認した。
【0053】
具体的には、内膜複合体タンパク質（ＩＭＣ）、ロプトリータンパク質１８（ＲＯＰ１８）またはミクロネームタンパク質８（ＭＩＣ８）を単独で発現するウイルス様粒子ワクチンに比べて、内膜複合体タンパク質（ＩＭＣ）、ロプトリータンパク質１８（ＲＯＰ１８）及びミクロネームタンパク質８（ＭＩＣ８）を同時発現するウイルス様粒子ワクチンは免疫化後、対象者におけるトキソプラズマ原虫－特異的抗体反応のレベル、Ｔ細胞及びＢ細胞反応のレベル及び対象者の生存率をさらに上昇させることができ、対象者の体重減少率及び寄生虫負荷（ｐａｒａｓｉｔｅ ｂｕｒｄｅｎ）をさらに低下させ得る。
【0054】
一実施形態において、本発明のインフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１（Ｍ１）は、配列番号１のアミノ酸配列で構成されることができ、内膜複合体タンパク質（ＩＭＣ）は、配列番号２のアミノ酸配列で構成されることができ、ロプトリータンパク質１８（ＲＯＰ１８）は配列番号３のアミノ酸配列で構成されることができ、ミクロネームタンパク質８（ＭＩＣ ８）は、配列番号４のアミノ酸配列で構成されることができる。
【0055】
本発明の配列番号１ないし４は、公知の配列であり、下記の通りに表示される。
【0056】
＜配列番号１＞インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１（Ｍ１）のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＢＯ２１７１２．１）
【0057】
＜配列番号２＞内膜複合体タンパク質（ＩＭＣ）のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＤＶ１５６１７）
【0058】
＜配列番号３＞ロプトリータンパク質ＲＯＰ１８のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＣＡＪ２７１１３）
【0059】
＜配列番号４＞ミクロネームタンパク質８（ＭＩＣ ８）のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＡＫ１９７５７）
【0060】
また、本発明のインフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１（Ｍ１）は、配列番号５の核酸配列によってコーディングされることができ、内膜複合体タンパク質（ＩＭＣ）は、配列番号６の核酸配列によってコーディングされることができ、ロプトリータンパク質１８（ＲＯＰ１８）は、配列番号７の核酸配列によってコーディングされることができ、ミクロネームタンパク質８（ＭＩＣ８）は、配列番号８の核酸配列によってコーディングされることができる。
【0061】
本発明の配列番号５ないし８は、公知の配列であり、下記の通りに表示される。
【0062】
＜配列番号５＞インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１（Ｍ１）をコーディングする核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＥＦ４６７８２４）
【0063】
＜配列番号６＞内膜複合体タンパク質（ＩＭＣ）をコーディングする核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＨＱ０１２５７９）
【0064】
＜配列番号７＞ロプトリータンパク質ＲＯＰ１８をコーディングする核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＭ０７５２０４）
【0065】
＜配列番号８＞ミクロネームタンパク質８（ＭＩＣ ８）をコーディングする核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＦ３５３１６５）
【0066】
本発明のインフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１（Ｍ１）；内膜複合体タンパク質（ＩＭＣ）、ロプトリータンパク質１８（ＲＯＰ１８）またはミクロネームタンパク質８（ＭＩＣ８）は、それぞれ上記配列番号１ないし４のアミノ酸配列で構成されたタンパク質の機能的同等物を含む。
【0067】
上記「機能的同等物」は、アミノ酸の付加、置換または欠失の結果、配列番号１ないし４のアミノ酸配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列相同性を有するもので、配列番号１ないし４のアミノ酸配列と実質的に同質の生理活性を有するタンパク質を意味する。
【0068】
上記「実質的に同質の生理活性」は、インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１（Ｍ１）；内膜複合体タンパク質（ＩＭＣ）、ロプトリータンパク質１８（ＲＯＰ１８）またはミクロネームタンパク質８（ＭＩＣ８）との構造的、機能的相同性により、トキソプラズマ原虫に対する特異的な免疫反応を誘導し得るウイルス様粒子としての活性を意味する。
【0069】
本発明の他の側面によると、本発明のウイルス様粒子を有効成分として含むトキソプラズマ原虫感染症の予防または治療用の薬学的組成物が提供される。
【0070】
上記トキソプラズマ原虫感染症は、トキソプラズマ原虫の感染によって起り得るすべての疾患及び症状を含む。トキソプラズマ原虫は、体内の多様な部位、例えばリンパ腺、脳、肺、心筋、脾臓、骨髄、腎臓、副腎、神経系などに寄生することができ、 タキゾイト（ｔａｃｈｙｚｏｉｔｅ）は細網内皮系と循環系内皮細胞の中で活発に分裂及び増殖して組職を壊死させ得る。また、感染部位に応じて、多様な疾病及び症状を引き起こし得るが、例えば、リンパ腺炎、脈絡網膜炎、髄膜炎、脳脊髄炎、肝炎、筋肉炎、心筋炎、肺炎、細尿管疾患などを含み得る、これに限定されるものではない。
【0071】
本発明の薬学的組成物は、本発明のウイルス様粒子を有効成分として含む。例えば、本発明の薬学的組成物は、形質転換宿主細胞そのもの、または形質転換細胞の乾燥粉末の形態、その培養液またはその濃縮液など、ウイルス様粒子の分離精製された多様な形態で使用されてもよい。
【0072】
上記薬学的組成物は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リポソーム、イスコム（ｉｓｃｏｍ）補助剤、合成グリコペプチド、カルボキシポリメチレン、細菌細胞壁、細菌細胞壁の誘導体、細菌ワクチン、動物ポックスウイルスタンパク質、ウイルス一部（ｓｕｂｖｉｒａｌ）粒子補助剤、コレラ毒素、Ｎ、Ｎ－ジオクタデシル－Ｎ’、Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシエチル）－プロパンジアミン、モノホスホリル脂質Ａ、ジメチルジオクタデシル－アンモニウムブロマイド及びその混合物からなる群から選択された１つ以上の第２補助剤をさらに含んでもよい。
【0073】
また、本発明の薬学的組成物は、医学的に許容可能な担体を含み得る。上記「医学的に許容可能な担体」は、任意の、及びすべての溶媒、分散媒質、コーティング剤、抗原補強剤、安定剤、希釈剤、保存剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張性作用剤、吸着遅延剤などを含み得るが、これに限定されるものではない。
【0074】
上記薬学的組成物に含まれ得る担体、賦形剤、希釈剤は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムホスフェイト、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート、及び鉱物油などを含み得るが、これに限定されるものではない。
【0075】
また、本発明の薬学的組成物は、本発明が属する技術分野で通常的に用いられる方法で製造し得る。本発明の薬学的組成物は、経口型または非経口型製剤で製造することができ、好ましくは、非経口型製剤の注射液剤で製造し、真皮内、筋肉内、腹膜内、静脈内、皮下内、鼻腔内、または硬膜外（ｅｉｄｕｒａｌ）経路で投与してもよい。好ましくは、本発明の薬学的組成物は、対象者に、筋肉内または鼻腔内投与される。さらに好ましくは、本発明の薬学的組成物は、対象者に鼻腔内投与される。
【0076】
具体的には、本発明の薬学的組成物を鼻腔内投与時、投与後の対象者の脾臓及び腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）内Ｔ細胞及びＢ細胞反応のレベルをさらに上昇させることができ、炎症性サイトカインのレベル、脳内嚢胞の大きさと数、対象者の体重減少率をさらに低下させ得る。
【0077】
具体的には、本発明の薬学的組成物は、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形及び滅菌注射溶液の形態に剤形化して使用してもよい。
【0078】
製剤化する場合には、通常的に使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤が共に使用されてもよい。
【0079】
経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ゼラチンなどと共に使用され得る。また、上記賦形剤の以外に、マグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤が使用されてもよい。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが使用されてもよく、通常的に使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に多様な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが使用されてもよい。
【0080】
非経口投与のための製剤としては、滅菌した水溶液、非水溶性剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤が使用され得る。非水溶性製剤、懸濁剤は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使用されてもよい。
【0081】
本発明の薬学的組成物は、免疫学的有効量で対象者に投与し得る。上記「免疫学的有効量」とは、トキソプラズマ原虫感染症の予防または治療効果を示し得る程度の十分な量と、副作用や深刻なまたは過度な免疫反応を起こさない程度の量を意味し、正確な投与濃度は、投与される特定の免疫原によって異なり、予防接種対象者の年齢、体重、健康、性別、対象者の薬物に対する敏感度、投与経路、投与方法など医学分野でよく知られている要素に応じて、当業者によって容易に決定されてもよいが、例えば、１日０．０００１ないし５０ｍｇ／ｋｇまたは０．００１ないし５０ｍｇ／ｋｇで投与してもよい。投与は、一日に一回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。上記投与量は、いかなる面でも、本発明の範囲を限定するものではない。
【0082】
本発明の薬学的組成物は、対象者にワクチン組成物で投与される場合、１回ないし３回、好ましくは２回ないし３回、さらに好ましくは３回投与されてもよい。本発明の薬学的組成物の投与回数が増加するほど、抗体反応のレベルをさらに上昇させることができ、炎症性サイトカインのレベル及び脳内嚢胞数をさらに低下させ得る。
【0083】
また、本発明の薬学的組成物は、ウイルス様粒子の免疫活性を増強させることできる追加のアジュバントを含むか、追加のアジュバントと同時または順次的に対象者に併用投与してもよい。本発明のウイルス様粒子と共に使用可能なアジュバントは、当業界でワクチン組成物の免疫性向上のために使用される通常のアジュバントであることができ、例えば、シトシン－ホスホロチオエート－グアニン（ＣｐＧ）、フラジェリン（Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）、水酸化アルミニウム（Ａｌｕｍｉｎｉｕｍ Ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）、モノホスホリル脂質Ａ（Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ Ｌｉｐｉｄ Ａ）、グルコピラノシル脂質Ａ（ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ ｌｉｐｉｄ Ａ）、コレラトキシン（Ｃｈｏｌｅｒａ ｔｏｘｉｎ）、ＱＳ２１（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）などを含む。好ましくは、上記アジュバントは、シトシン－ホスホロチオエート－グアニン（ＣｐＧ）を含む。
【0084】
具体的には、本発明の薬学的組成物をシトシン－ホスホロチオエート－グアニン（ＣｐＧ）と共に投与時、投与後の対象者内トキソプラズマ原虫－特異的抗体反応のレベル、及びＴ細胞及びＢ細胞反応のレベルを著しく上昇させることができ、炎症性サイトカインのレベル、脳内の嚢胞の大きさと数、対象者の体重減少率を大きく低下させ得る。
【0085】
本発明の他の側面によると、トキソプラズマ原虫感染症の予防または治療に使用されるための上記ウイルス様粒子の用途及び上記疾患治療剤の製造のための上記ウイルス様粒子の用途が提供される。
【0086】
具体的には、本発明は、トキソプラズマ原虫感染症の予防または治療用途で使用するための、上記ウイルス様粒子を含む組成物に関する。
【0087】
本発明は、さらに、トキソプラズマ原虫感染症の予防または治療用薬剤を製造するための、上記ウイルス様粒子を含む組成物の用途に関する。
【0088】
本発明の他の側面によると、上記ウイルス様粒子を対象者に免疫学的有効量で投与する段階を含むトキソプラズマ原虫感染症の予防または治療方法を提供する。
【0089】
具体的には、本発明は、上記ウイルス様粒子をトキソプラズマ原虫感染症の予防または治療が要求される対象者に免疫学的有効量で投与する段階を含むトキソプラズマ原虫感染症の予防または治療方法に関する。
【0090】
本発明の他の側面によると、インフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１（Ｍ１）をコーディングする核酸配列；内膜複合体タンパク質（ＩＭＣ）をコーディングする核酸配列；ロプトリータンパク質１８（ＲＯＰ１８）をコーディングする核酸配列；及びミクロネームタンパク質８（ＭＩＣ８）をコーディングする核酸配列を含むウイルス様粒子の製造用発現ベクターが提供される。
【0091】
本発明の発現ベクターは、連結されている核酸断片を運搬するのに用いられる核酸分子を意味する。本発明の発現ベクターは、バクテリア、プラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウイルス及び挿入可能なＤＮＡ断片（すなわち、相同組換えによって宿主細胞のゲノムの中へ挿入可能な断片）が使用されてもよいが、これに限定されるものではない。上記プラスミドは、ベクターの一種として、内部にさらにＤＮＡ断片を連結させ得る環型の二本鎖ＤＮＡループを意味する。また、ウイルスベクターは、さらなるＤＮＡをウイルスゲノムの中に連結させ得る。
【0092】
本発明の発現ベクターは、動作可能に連結された目的タンパク質を、コーディングする遺伝子の発現を指示することができるベクターを意味する。一般的に、組換えＤＮＡ技術の使用において発現ベクターはプラスミド形態であるため、プラスミド及びベクターという用語が相互交換的に使用され得る。しかし、ウイルスベクターのように同一の機能を果たす別の形態の発現ベクターも含み得る。
【0093】
例えば、上記発現ベクターは、ｐＥＴ－３ａ－ｄ、ｐＥＴ－９ａ－ｄ、ｐＥＴ－１１ａ－ｄ、ｐＥＴ－１２ａ－ｃ、ｐＥＴ－１４ｂ、ｐＥＴ－１５ｂ、ｐＥＴ－１６ｂ、ｐＥＴ－１７ｂ、ｐＥＴ－１７ｘｂ、ｐＥＴ－１９ｂ、ｐＥＴ－２０ｂ（＋）、ｐＥＴ－２１ａ－ｄ（＋）、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）、ｐＥＴ－２３ａ－ｄ（＋）、ｐＥＴ－２４ａ－ｄ（＋）、ｐＥＴ－２５ｂ（＋）、ｐＥＴ－２６ｂ（＋）、ｐＥＴ－２７ｂ（＋）、ｐＥＴ－２８ａ－ｃ（＋）、ｐＥＴ－２９ａ－ｃ（＋）、ｐＥＴ－３０ａ－ｃ（＋）、ｐＥＴ－３０ Ｅｋ／ＬＩＣ、ｐＥＴ－３０ Ｘａ／ＬＩＣ、ｐＥＴ－３１ｂ（＋）、ｐＥＴ－３２ａ－ｃ（＋）、ｐＥＴ－３２ Ｅｋ／ＬＩＣ、ｐＥＴ－３２ Ｘａ／ＬＩＣ、ｐＥＴ－３３ｂ（＋）、ｐＥＴ－３４ｂ（＋）、ｐＥＴ－３５ｂ（＋）、ｐＥＴ－３６ｂ（＋）、ｐＥＴ－３７ｂ（＋）、ｐＥＴ－３８ｂ（＋）、ｐＥＴ－３９ｂ（＋）、ｐＥＴ－４０ｂ（＋）、ｐＥＴ－４１ａ－ｃ（＋）、ｐＥＴ－４１ Ｅｋ／ＬＩＣ、ｐＥＴ－４２ａ－ｃ（＋）、ｐＥＴ－４３．１ａ－ｃ（＋）、ｐＥＴ－４３．１ Ｅｋ／ＬＩＣ、ｐＥＴ－４４ａ－ｃ（＋）、ｐＲＳＥＴＡ、ｐＲＳＥＴＢ、ｐＲＳＥＴＣ、ｐＥＳＣ－ＨＩＳ、ｐＥＳＣ－ＬＥＵ、ｐＥＳＣ－ＴＲＰ、ｐＥＳＣ－ＵＲＡ、Ｇａｔｅｗａｙ ｐＹＥＳ－ＤＥＳＴ５２、ｐＡＯ８１５、ｐＧＡＰＺ Ａ、ｐＧＡＰＺ Ｂ、ｐＧＡＰＺ Ｃ、ｐＧＡＰα Ａ、ｐＧＡＰα Ｂ、ｐＧＡＰα Ｃ、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ６ Ａ、ｐＰＩＣ６ Ｂ、ｐＰＩＣ６ Ｃ、ｐＰＩＣ６α Ａ、ｐＰＩＣ６α Ｂ、ｐＰＩＣ６α Ｃ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＹＣ２／ＣＴ、ｐＹＤ１ Ｙｅａｓｔ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｖｅｃｔｏｒ、ｐＹＥＳ２、ｐＹＥＳ２／ＣＴ、ｐＹＥＳ２／ＮＴ Ａ、ｐＹＥＳ２／ＮＴ Ｂ、ｐＹＥＳ２／ＮＴ Ｃ、ｐＹＥＳ２／ＣＴ、ｐＹＥＳ２．１、ｐＹＥＳ－ＤＥＳＴ５２、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＦＬＤ１、ＰｉｃｈｉａＰｉｎｋＴＭ、ｐ４２７－ＴＥＦ、ｐ４１７－ＣＹＣ、ｐＧＡＬ－ＭＦ、ｐ４２７－ＴＥＦ、ｐ４１７－ＣＹＣ、ＰＴＥＦ－ＭＦ、ｐＢＹ０１１、ｐＳＧＰ４７、ｐＳＧＰ４６、ｐＳＧＰ３６、ｐＳＧＰ４０、ＺＭ５５２、ｐＡＧ３０３ＧＡＬ－ｃｃｄＢ、ｐＡＧ４１４ＧＡＬｃｃｄＢ、ｐＡＳ４０４、ｐＢｒｉｄｇｅ、ｐＧＡＤ－ＧＨ、ｐＧＡＤ Ｔ７、ｐＧＢＫ Ｔ７、ｐＨＩＳ－２、ｐＯＢＤ２、ｐＲＳ４０８、ｐＲＳ４１０、ｐＲＳ４１８、ｐＲＳ４２０、ｐＲＳ４２８、ｙｅａｓｔ ｍｉｃｒｏｎ Ａ ｆｏｒｍ、ｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、ｐＲＳ４０６、ｐＹＪ４０３、ｐＹＪ４０４、ｐＹＪ４０５またはｐＹＪ４０６であってもよいが、これに限定されるものではない。
【0094】
一方、本発明の発現ベクターは、宿主細胞内に導入され、上記導入されたベクターにより形質転換された宿主細胞は、上記ウイルス様粒子を生産し得る。このとき、上記ベクターは、宿主生物体によって認識されるプロモーターを含み得る。
【0095】
上記プロモーターはＳＢＥ４、３ＴＰ、ＰＡＩ－１、ｐ１５、ｐ２１、ＣＡＧＡ１２、ｈＩＮＳ、Ａ３、ＮＦＡＴ、ＮＦＫＢ、ＡＰ１、ＩＦＮＧ、ＩＬ４、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１０、ＧＰＤ、ＴＥＦ、ＡＤＨ、ＣＹＣ、ＩＮＵ１、ＰＧＫ１、ＰＨＯ５、ＴＲＰ１、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＧＵＴ２、ｔａｃ、Ｔ７、Ｔ５、ｎｍｔ、ｆｂｐ１、ＡＯＸ１、ＡＯＸ２、ＭＯＸ１及びＦＭＤ１プロモーターからなる群から選択されてもよいが、宿主細胞または発現条件など、多様な変数を考慮して変えてもよい。
【0096】
本発明のウイルス様粒子をコーディングする核酸配列は、上記プロモーター配列と動作可能に連結（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）され得る。上記「動作可能に連結される（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、一つの核酸断片が別の核酸断片と結合してその機能または発現が別の核酸断片によって影響を受けることを意味する。すなわち、本発明のウイルス様粒子をコーディングする遺伝子は、ベクター内にあるプロモーターと作動可能に連結されて発現が調節され得る。
【0097】
一方、本発明の発現ベクターは、さらなる調節配列をさらに含んでもよい。上記調節配列は、ファージＭＳ－２のレプリカーゼ遺伝子のシャイン－ダルガーノ配列及びバクテリオファージλのｃIIのシャイン－ダルガーノ配列であってもよいが、これに限定されるものではない。
【0098】
また、本発明の発現ベクターは、形質転換された宿主細胞を選別するのに必要な適切なマーカー遺伝子を含んでもよい。上記マーカー遺伝子は、抗生剤抵抗性遺伝子または蛍光タンパク質遺伝子であってもよく、上記抗生剤抵抗性遺伝子は、ヒグロマイシン抵抗性遺伝子、カナマイシン抵抗性遺伝子、クロラムフェニコール抵抗性遺伝子及びテトラサイクリン抵抗性遺伝子からなる群から選択されてもよいが、これに限定されるものではない。上記蛍光タンパク質遺伝子は、酵母－強化緑色蛍光タンパク質（ｙｅａｓｔ－ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ｙＥＧＦＰ）遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＰ）遺伝子、青色蛍光タンパク質（ｂｌｕｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＦＰ）遺伝子、及び赤色蛍光タンパク質（ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＲＦＰ）遺伝子からなる群から選択されてもよいが、これに限定されるものではない。
【0099】
本発明の他の側面によると、本発明の発現ベクターによって形質転換された宿主細胞が提供される。本発明の宿主細胞は、ウイルスによって感染されることができ、ウイルス様粒子によって免疫されることできるすべての有機体を意味する。本発明の宿主細胞は、形質転換によって代謝操作されてもよい。
【0100】
一実施形態において、本発明の宿主細胞は、微生物、動物細胞、植物細胞、動物に由来した培養細胞、または植物に由来した培養細胞であってもよい。上記適切な宿主細胞は、自然に発生するか、または野生型宿主細胞（ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）であってもよく、または変化した宿主細胞であってもよい。上記野生型宿主細胞は、組換え方法によって遺伝的に変化されていない宿主細胞であってもよい。
【0101】
本発明の宿主細胞は、工学的方法によって形質転換されて特定の遺伝子を効率的に発現することができれば、その種類は特に制限されず、好ましくは昆虫細胞であってもよい。上記昆虫細胞としては、遺伝子発現のための宿主システムとして開発されたか、または市販されているすべての細胞が使用されてもよく、例えば、スポドプテラ・フルギペルダ昆虫細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）ＳＦ２１、ＳＦ９、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）、アンティカーサ・ゲムミタリス（Ａｎｔｉｃａｒｓａ ｇｅｍｍｉｔａｌｉｓ）、ボンビクス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）、エスティグメネ・アクレア（Ｅｓｔｉｇｍｅｎｅ ａｃｒｅａ）、ヘリオティス・ビレッセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、ロイカニア・セパラタ（Ｌｅｕｃａｎｉａ ｓｅｐａｒａｔａ）、リマントリア・ディスパール（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ）、マラカソマ・ディスストリア（Ｍａｌａｃａｓｏｍａ ｄｉｓｓｔｒｉａ）、マメストラ・ブラシカエ（Ｍａｍｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、マンドゥカ・セクスタ（Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ）、プルテラ・ジロステラ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｚｙｌｏｓｔｅｌｌａ）、スポドプテラ・エクシグア（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）及びスポドプテラ・リトラリス（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｔｏｒｌｉｓ）からなる群から１つ以上選択されてもよいが、これに限定されるものではない。
【0102】
上記「代謝操作された（ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」または「代謝操作（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」は、微生物において、アルコールまたはタンパク質のような目的とする代謝産物の生産のために、生合成遺伝子、オペロンに関連する遺伝子、及びこれらの核酸配列の制御要因（ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）の合理的な経路のデザインとアセンブリを伴ってもよい。
【0103】
上記「代謝操作された」は、遺伝子操作と適切な培養条件を用いた転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）、翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）、タンパク質の安定性（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）とタンパク質の機能性（ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）の調節と最適化による代謝の流れ（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｆｌｕｘ）の最適化をさらに含んでもよい。
【0104】
生合成遺伝子は、宿主に外来性であるか、突然変異誘発（ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）または内因性宿主細胞で異種発現制御配列との関連により変形されることで、宿主（例えば、微生物）に異種性であってもよい。適切な培養条件は、培養培地ｐＨ、イオン強度、栄養含量などの条件、温度、酸素、二酸化炭素、窒素含量、湿度、及び上記微生物の物質代謝作用による化合物の生産を可能にする、その他の培養条件を含んでもよい。宿主細胞として機能し得る微生物に適合した培養条件は、当該技術分野で広く知られている。
【0105】
したがって、上記「代謝操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」または「変形された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）」宿主細胞は遺伝物質を選択された宿主または親微生物内に導入して、細胞の生理と生化学を変形または変更することにより、生産することができる。遺伝物質の導入を通じて、親微生物は、新しい性質、例えば、新しい細胞内代謝産物またはより多い量の細胞内代謝産物を生産する能力を獲得することができる。
【0106】
例えば、遺伝物質の親微生物内への導入は、化学物質を生産する新規または変形された能力をもたらし得る。親微生物に導入された遺伝物質は、化学物質の生産のための生合成経路に関与する１つ以上の酵素をコーディングする遺伝子または遺伝子の一部を含み、これらの遺伝子の発現または発現調節のための追加的な構成要素、例えば、プロモーター配列を含むこともできる。
【0107】
上記「変化された宿主細胞（ａｌｔｅｒｅｄ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」は、遺伝的に設計された宿主細胞を意味し、ここで目的タンパク質は、発現のレベルで生成されるか発現のレベルよりさらに大きいレベルで生成されるか、本質的に同一の成長条件の下で成長する未変化の、または野生型宿主細胞内における目的タンパク質の発現のレベルより大きい発現のレベルで発現され得る。上記「変形された宿主細胞（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」は、目的タンパク質をコーディングする遺伝子を過剰発現するように遺伝的に設計された野生型または変化された宿主細胞を意味する。上記変形された宿主細胞は、野生型または変化された親宿主細胞より、さらに高いレベルで目的タンパク質を発現し得る。
【0108】
一方、上記「形質転換」は、上記ベクターを微生物または特定細胞内へ運搬する方法を意味し、形質転換しようとする細胞が原核細胞である場合には、ＣａＣｌ２方法（Ｃｏｈｅｎ、Ｓ．Ｎ． ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｃ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９：２１１０－２１１４（１９７３））、ハナハン法（Ｃｏｈｅｎ、Ｓ．Ｎ． ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９：２１１０－２１１４（１９７３）；及びＨａｎａｈａｎ、Ｄ、．、Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６６：５５７－５８０（１９８３））、及びエレクトロポレーション（Ｄｏｗｅｒ、Ｗ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１６：６１２７－６１４５（１９８８））などにより実施され得る。
【0109】
形質転換しようとする細胞が真核細胞である場合には、微細注入法（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｍ．Ｒ．、Ｃｅｌｌ、２２：４７９（１９８０））、カルシウムホスフェイト沈殿法（Ｇｒａｈａｍ、Ｆ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６（１９７３））、エレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎ、Ｅ． ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｊ．、１：８４１（１９８２））、リポソーム－媒介形質感染法（Ｗｏｎｇ、Ｔ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ、１０：８７（１９８０））、ＤＥＡＥ－デキストラン処理法（Ｇｏｐａｌ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：１１８８－１１９０（１９８５））、及び遺伝子ボンバードメント（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８７：９５６８－９５７２（１９９０））などを用いて実施してもよいが、これに限定されるものではない。
【0110】
酵母のような真菌の形質転換の場合には、一般的にリチウムアセテート（Ｌｉｔｈｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ、Ｒ．Ｄ． Ｇｉｅｔｚ、Ｙｅａｓｔ １１、３５５－３６０（１９９５））、及びヒートショック（Ｋｅｉｓｕｋｅ Ｍａｔｓｕｕｒａ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｖｏｌ．１００、５；５３８－５４４（２００５））を用いた形質転換法とエレクトロポレーション（Ｎｉｎａ ＳｋｏｌｕｃｋａＡｓｉａｎ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ、９４－９８（２０１１））によって実施されてもよいが、これに限定されるものではない。
【0111】
本発明の他の側面によると、本発明の発現ベクターで宿主細胞を形質転換する段階；及び上記宿主細胞を培養してウイルス様粒子を発現させる段階を含む、ウイルス様粒子の製造方法が提供される。
【0112】
本発明の形質転換された宿主細胞はバッチ、供給－バッチまたは連続発酵条件下で培養されることができ、上記宿主細胞は、形質転換により上記ウイルス様粒子を発現し得るため、上記培養された宿主細胞から、本発明のウイルス様粒子タンパク質を収得し得る。
【0113】
このとき、古典的なバッチ発酵方法は、閉鎖的なシステムを使用することができ、上記培養媒質は発酵が実行される前に製造され、上記媒質に有機体を接種し、上記媒質に如何なる成分の添加がなくても発酵が起き得る。
【0114】
特定の場合において、成長媒質の上記炭素源の内容物ではない、上記ｐＨ及び酸素含量は、バッチ方法の間変化され得る。バッチシステムの上記代謝物及び細胞バイオマスは絶えず発酵が停止されるまで変化し得る。バッチシステムで、細胞は静止された誘導期（ｌａｇ ｐｈａｓｅ）から高度成長の対数期（ｌｏｇ ｐｈａｓｅ ）にわたって進捗し、 最終的に、成長率が減少または止まった、静止期（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｐｈａｓｅ）になり得る。一般的な期間において、対数期の上記細胞は大部分のタンパク質を作り得る。
【0115】
標準バッチシステムの変形は、「供給－バッチ発酵」システムである。上記システムで、栄養（例えば、炭素源、窒素源、Ｏ２、及び、通常的に、その他の栄養）は、それらの培養物の濃度が限界値未満に低下する時に添加されてもよい。
【0116】
供給－バッチシステムは、異化生成物抑制が細胞の代謝を抑制し、媒質が媒質内で栄養素を限られた量で有することが望ましい時に有用であり得る。供給－バッチシステムにおける実際の栄養濃度の測定は、ｐＨ、溶存酸素、及びＣＯ２のような排気ガスの部分圧のような測定可能な因子の変化に基づいて予測され得る。バッチ及び供給－バッチ発酵は、一般的なシステムとして当業界に広く知られている。
【0117】
継続的発酵は定義された培養媒質が継続してバイオリアクター（ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）に添加されるとともに、条件化された媒質の同一の量が過程の間、同時に除去される開放型システムである。継続的発酵は、一般に、細胞が、最初は対数期の成長にある一定の高密度の培養物を保持し得る。継続的発酵は、細胞の成長または最終生成物の濃度に影響を及ぼす一つの因子、または任意の数の因子を操作が可能である。
【0118】
例えば、炭素源または窒素源のような制限栄養素は固定された速度で、その他のすべてのパラメータは適宜に維持されてもよい。
【0119】
別のシステムにおいて、多くの成長に影響を与える因子は、培地の濁度によって測定される細胞の濃度が一定に維持される間、継続して変化してもよい。継続的システムは、一定の状態の成長条件を維持しようとする。したがって、媒質が抜けていくことによる細胞の損失は、発酵における細胞成長速度に対してバランスがとれ得る。生成物の形成の速度を最大化する技術のみならず、継続的発酵の過程の間、栄養素及び成長因子を保持する方法は、当業界に知られている。
【0120】
本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明の記載内容に基づいて、各構成の種類、導入の割合などを変化させて適用することができ、上記変形にも関わらず、同等の技術的効果が実現される場合であれば、本発明の技術的思考に含まれると言える。
【0121】
以下、実施例を通じて、本発明をさらに詳しく述べるが、下記一実施例により本発明が制限されないことは自明である。
【0122】
実施例１：組合せウイルス様粒子（ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６ ＶＬＰ）の製造
本願実施例で使用されるインフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１（Ｍ１）の遺伝子は、インフルエンザウイルスをＭＤＣＫ細胞に形質感染させた後、細胞を粉砕して、ウイルスを収得し、得られたＲＮＡをプライマーを用いてＰＣＲを通じて増幅して得ており、トキソプラズマ原虫内膜複合体タンパク質（ＴＧ１）、トキソプラズマ原虫ロプトリータンパク質１８（ＴＧ４）及びトキソプラズマ原虫ミクロネームタンパク質８（ＴＧ６）の遺伝子は、トキソプラズマ原虫のＲＨ ｓｔｒａｉｎを砕いてＲＮＡを収得した後、プライマーを用いてＰＣＲを通じて増幅して得た。ＴＧ１ ＶＬＰ、ＴＧ４ ＶＬＰ及びＴＧ６ ＶＬＰを生成するために、下記図式に示したように、これらの得られた遺伝子をｐＦａｓｔＢａｃベクターにそれぞれ挿入してｄｈ５ａ細胞にクローニングし、その後、得られた遺伝子をｄｈ１０ｂａｃベクターに再度クローニングした。ｄｈ１０ｂａｃベクターの遺伝子を昆虫細胞であるｓｆ９細胞に挿入して目的とする遺伝子の抗原のタンパク質を収得した。
トキソプラズマ原虫内膜複合体タンパク質（ＴＧ１）の遺伝子は、正方向プライマー（５’－ＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＡＡＣＡＣＧＧＣＧＴＧＣＴＧ－３’）及び逆方向プライマー（５’－ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＴＴＴＣＴＧＴＣＧＴＴＧＣＴＴＧＣ－３’）を用いてＰＣＲを通じて増幅した。
トキソプラズマ原虫ロプトリータンパク質１８（ＴＧ４）の遺伝子は、正方向プライマー（５’－ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＴＴＴＣＧＧＴＡＣＡＧＣＧＧＣＣＡ－３’）及び逆方向プライマー（５’－ＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＣＴＧＴＧＴＧＧＡＧＡＴＧＴＴＣＣＴＧ－３’）を用いてＰＣＲを通じて増幅した。
トキソプラズマ原虫ミクロネームタンパク質８（ＴＧ６）遺伝子は、正方向プライマー（５’－ＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＧＣＣＡＡＴＣＧＡＡＴＡＴＧ－３’）及び逆方向プライマー（５’－ＴＴＡＣＴＣＣＡＧＴＴＡＧＧＡＣＣＡＧＡＴＡＣＣＧＣＣＣＧＡ－３’）を用いてＰＣＲを通じて増幅した。
インフルエンザマトリックスタンパク質１（Ｍ１）遺伝子は、正方向プライマー（５’－ＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＡＧＴＣＴＴＣＴＡＡＣＣＧＡＧＧＴ－３’）及び逆方向プライマー（５’－ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＴＧＴＴＧＡＣ－３’）を用いてＲＴ－ＰＣＲを通じて増幅した。
本願実施例で使用されるインフルエンザウイルスマトリックスタンパク質１（Ｍ１）の遺伝子は、インフルエンザウイルスをＭＤＣＫ細胞に形質感染させた後、細胞を粉砕して、ウイルスを収得し、得られたＲＮＡをプライマーを用いてＰＣＲを通じて増幅して得ており、トキソプラズマ原虫内膜複合体タンパク質（ＴＧ１）、トキソプラズマ原虫ロプトリータンパク質１８（ＴＧ４）及びトキソプラズマ原虫ミクロネームタンパク質８（ＴＧ６）の遺伝子は、トキソプラズマ原虫のＲＨ ｓｔｒａｉｎを砕いてＲＮＡを収得した後、プライマーを用いてＰＣＲを通じて増幅して得た。ＴＧ１ ＶＬＰ、ＴＧ４ ＶＬＰ及びＴＧ６ ＶＬＰを生成するために、下記図式に示したように、これらの得られた遺伝子をｐＦａｓｔＢａｃベクターにそれぞれ挿入してｄｈ５ａ細胞にクローニングし、その後、得られた遺伝子をｄｈ１０ｂａｃベクターに再度クローニングした。ｄｈ１０ｂａｃベクターの遺伝子を昆虫細胞であるｓｆ９細胞に挿入して目的とする遺伝子の抗原のタンパク質を収得した。
トキソプラズマ原虫ロプトリータンパク質１８（ＴＧ４）の遺伝子は、正方向プライマー（５’－ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＴＴＴＣＧＧＴＡＣＡＧＣＧＧＣＣＡ－３’）及び逆方向プライマー（５’－ＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＣＴＧＴＧＴＧＧＡＧＡＴＧＴＴＣＣＴＧ－３’）を用いてＰＣＲを通じて増幅した。
トキソプラズマ原虫ミクロネームタンパク質８（ＴＧ６）遺伝子は、正方向プライマー（５’－ＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＧＣＣＡＡＴＣＧＡＡＴＡＴＧ－３’）及び逆方向プライマー（５’－ＴＴＡＣＴＣＣＡＧＴＴＡＧＧＡＣＣＡＧＡＴＡＣＣＧＣＣＣＧＡ－３’）を用いてＰＣＲを通じて増幅した。
インフルエンザマトリックスタンパク質１（Ｍ１）遺伝子は、正方向プライマー（５’－ＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＡＧＴＣＴＴＣＴＡＡＣＣＧＡＧＧＴ－３’）及び逆方向プライマー（５’－ＴＴＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＴＧＴＴＧＡＣ－３’）を用いてＲＴ－ＰＣＲを通じて増幅した。
【0123】
(1) ＴＧ１ ＶＬＰの製造
ＩＭＣ（ＴＧ１）遺伝子を制限酵素部位（ＥｃｏＲ Ｉ及びＸｈｏ Ｉ）を有するｐＦａｓｔＢａｃベクターに、Ｍ１遺伝子を制限酵素部位（ＥｃｏＲ Ｉ及びＸｈｏ Ｉ）を有するｐＦａｓｔＢａｃベクターにそれぞれ導入し、各ｐＦａｓｔＢａｃベクターのＩＭＣ（ＴＧ１）またはＭ１遺伝子の導入の有無をＥｃｏＲ Ｉ及びＸｈｏ Ｉ制限酵素でカッティングして確認した。
導入された遺伝子の核酸配列は、ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ）によって公知された配列（ＩＭＣ：ＨＱ０１２５７９、Ｍ１：ＥＦ４６７８２４）と同一のものと確認された。
次いで、ＴＧ１を発現する組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）及びＭ１を発現する組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を製造するために、各ｐＦａｓｔＢａｃベクターをｗｈｉｔｅ／ｂｌｕｅスクリーニングによって形質転換させ、ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ II（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してＳＦ９細胞内へＤＮＡ形質感染させ、組換えバキュロウイルス（ｒＢＶｓ）をＢａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を通じて、製造社のマニュアルに基づいて製造した。
ＴＧ１ ＶＬＰはＴＧ１を発現する組換えｒＢＶ及びＭ１を発現する組換えｒＢＶによって共同－感染されたＳＦ９昆虫細胞で生産された。Ｓｆ９細胞培養上清液を感染後の３日目に回収し、次いで６０００ｒｐｍで３０分間、４℃で遠心分離して細胞を除去した。上清液内のＶＬＰを精製してペレット化させた。
ＴＧ１ ＶＬＰは、４℃でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で一晩の間、再懸濁されており、不連続スクロース勾配（２０－３０－６０％）を通じて、４℃、４５，０００ｘｇで１時間にわたって回収され精製された。タンパク質濃度は、ＱｕａｎｔｉＰｒｏ ＢＣＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）によって決定された。
ＩＭＣ（ＴＧ１）遺伝子を制限酵素部位（ＥｃｏＲ Ｉ及びＸｈｏ Ｉ）を有するｐＦａｓｔＢａｃベクターに、Ｍ１遺伝子を制限酵素部位（ＥｃｏＲ Ｉ及びＸｈｏ Ｉ）を有するｐＦａｓｔＢａｃベクターにそれぞれ導入し、各ｐＦａｓｔＢａｃベクターのＩＭＣ（ＴＧ１）またはＭ１遺伝子の導入の有無をＥｃｏＲ Ｉ及びＸｈｏ Ｉ制限酵素でカッティングして確認した。
導入された遺伝子の核酸配列は、ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ）によって公知された配列（ＩＭＣ：ＨＱ０１２５７９、Ｍ１：ＥＦ４６７８２４）と同一のものと確認された。
次いで、ＴＧ１を発現する組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）及びＭ１を発現する組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を製造するために、各ｐＦａｓｔＢａｃベクターをｗｈｉｔｅ／ｂｌｕｅスクリーニングによって形質転換させ、ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ II（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してＳＦ９細胞内へＤＮＡ形質感染させ、組換えバキュロウイルス（ｒＢＶｓ）をＢａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を通じて、製造社のマニュアルに基づいて製造した。
ＴＧ１ ＶＬＰはＴＧ１を発現する組換えｒＢＶ及びＭ１を発現する組換えｒＢＶによって共同－感染されたＳＦ９昆虫細胞で生産された。Ｓｆ９細胞培養上清液を感染後の３日目に回収し、次いで６０００ｒｐｍで３０分間、４℃で遠心分離して細胞を除去した。上清液内のＶＬＰを精製してペレット化させた。
ＴＧ１ ＶＬＰは、４℃でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で一晩の間、再懸濁されており、不連続スクロース勾配（２０－３０－６０％）を通じて、４℃、４５，０００ｘｇで１時間にわたって回収され精製された。タンパク質濃度は、ＱｕａｎｔｉＰｒｏ ＢＣＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）によって決定された。
【0124】
(2) ＴＧ４ ＶＬＰの製造
ＩＭＣ（ＴＧ１）遺伝子の代わりにＲＯＰ１８（ＴＧ４）遺伝子を制限酵素部位（ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ）を有するｐＦａｓｔＢａｃベクターに導入してＴＧ４を発現する組換えｒＢＶを製造したこと以外は、ＴＧ１ ＶＬＰの製造方法と同一の方法でＴＧ４を発現する組換えｒＢＶ及びＭ１を発現する組換えｒＢＶによって共同－感染されたＳＦ９昆虫細胞でＴＧ４ ＶＬＰを製造した。このとき、ｐＦａｓｔＢａｃベクターのＲＯＰ１８（ＴＧ４）遺伝子の導入の有無をＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ制限酵素でカッティングして確認した。
導入された遺伝子の核酸配列は、ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ）によって公知された配列（ＲＯＰ１８：ＡＭ０７５２０４、Ｍ１：ＥＦ４６７８２４）と同一のものと確認された。
ＩＭＣ（ＴＧ１）遺伝子の代わりにＲＯＰ１８（ＴＧ４）遺伝子を制限酵素部位（ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ）を有するｐＦａｓｔＢａｃベクターに導入してＴＧ４を発現する組換えｒＢＶを製造したこと以外は、ＴＧ１ ＶＬＰの製造方法と同一の方法でＴＧ４を発現する組換えｒＢＶ及びＭ１を発現する組換えｒＢＶによって共同－感染されたＳＦ９昆虫細胞でＴＧ４ ＶＬＰを製造した。このとき、ｐＦａｓｔＢａｃベクターのＲＯＰ１８（ＴＧ４）遺伝子の導入の有無をＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ制限酵素でカッティングして確認した。
導入された遺伝子の核酸配列は、ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ）によって公知された配列（ＲＯＰ１８：ＡＭ０７５２０４、Ｍ１：ＥＦ４６７８２４）と同一のものと確認された。
【0125】
(3) ＴＧ６ ＶＬＰの製造
ＩＭＣ（ＴＧ１）遺伝子の代わりにＭＩＣ８（ＴＧ６）遺伝子を制限酵素部位（ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ）を有するｐＦａｓｔＢａｃベクターに導入してＴＧ６を発現する組換えｒＢＶを製造したこと以外は、ＴＧ１ ＶＬＰの製造方法と同一の方法でＴＧ６を発現する組換えｒＢＶ及びＭ１を発現する組換えｒＢＶによって共同－感染されたＳＦ９昆虫細胞でＴＧ６ ＶＬＰを製造した。このとき、ｐＦａｓｔＢａｃベクターのＭＩＣ８（ＴＧ６）遺伝子の導入の有無をＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ制限酵素でカッティングして確認した。
導入された遺伝子の核酸配列は、ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ）によって公知された配列（ＭＩＣ８：ＡＦ３５３１６５、Ｍ１：ＥＦ４６７８２４）と同一のものと確認された。
ＩＭＣ（ＴＧ１）遺伝子の代わりにＭＩＣ８（ＴＧ６）遺伝子を制限酵素部位（ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ）を有するｐＦａｓｔＢａｃベクターに導入してＴＧ６を発現する組換えｒＢＶを製造したこと以外は、ＴＧ１ ＶＬＰの製造方法と同一の方法でＴＧ６を発現する組換えｒＢＶ及びＭ１を発現する組換えｒＢＶによって共同－感染されたＳＦ９昆虫細胞でＴＧ６ ＶＬＰを製造した。このとき、ｐＦａｓｔＢａｃベクターのＭＩＣ８（ＴＧ６）遺伝子の導入の有無をＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ制限酵素でカッティングして確認した。
導入された遺伝子の核酸配列は、ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ）によって公知された配列（ＭＩＣ８：ＡＦ３５３１６５、Ｍ１：ＥＦ４６７８２４）と同一のものと確認された。
【0126】
(4)組合せウイルス様粒子（ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６ ＶＬＰ）の製造
上記のそれぞれ製造されたＴＧ１ ＶＬＰ、ＴＧ４ ＶＬＰ及びＴＧ６ ＶＬＰを１：１：１の割合で組み合わせて組合せウイルス様粒子（ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６ ＶＬＰ）を生成した。
上記のそれぞれ製造されたＴＧ１ ＶＬＰ、ＴＧ４ ＶＬＰ及びＴＧ６ ＶＬＰを１：１：１の割合で組み合わせて組合せウイルス様粒子（ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６ ＶＬＰ）を生成した。
【0127】
実施例２：多重－抗原ウイルス様粒子（ＴＧ１４６ ＶＬＰ）の製造
多重－抗原ウイルス様粒子（ＴＧ１４６ ＶＬＰ）は、ＳＦ９昆虫細胞を、実施例１で製造されたＴＧ１、ＴＧ４、ＴＧ６及びＭ１をそれぞれ発現する組換えｒＢＶｓで共同－感染させて生産した。感染されたＳＦ９細胞培養上清液をＴＧ１ ＶＬＰの製造方法と同一の方法で回収及びペレット化してＴＧ１、ＴＧ４及びＴＧ６を同時発現するＴＧ１４６ ＶＬＰを製造した。
多重－抗原ウイルス様粒子（ＴＧ１４６ ＶＬＰ）は、ＳＦ９昆虫細胞を、実施例１で製造されたＴＧ１、ＴＧ４、ＴＧ６及びＭ１をそれぞれ発現する組換えｒＢＶｓで共同－感染させて生産した。感染されたＳＦ９細胞培養上清液をＴＧ１ ＶＬＰの製造方法と同一の方法で回収及びペレット化してＴＧ１、ＴＧ４及びＴＧ６を同時発現するＴＧ１４６ ＶＬＰを製造した。
【0128】
実施例１及び２で製造されたＶＬＰは、次の通りである。
【0129】
【表1】
【0130】
実験例１：ウイルス様粒子の特性化
多重－抗原ウイルス様粒子（ＴＧ１４６ ＶＬＰ）及び組合せウイルス様粒子（ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６ ＶＬＰ）は、ウェスタンブロット及び電子顕微鏡法によって確認した。２７μｇ、９μｇ、３μｇの濃度のＴＧ１ ＶＬＰ、ＴＧ４ ＶＬＰ、ＴＧ６ ＶＬＰ及びＴＧ１４６ ＶＬＰを各レーンにＳＤＳ－ＰＡＧＥのためにローディングし、ウェスタンブロットで可視化した。ウェスタンブロットによりＴＧ１、ＴＧ４、ＴＧ６及びＭ１タンパク質を検出するために、プローブ（ｐｒｏｂｅ）として、抗－トキソプラズマ原虫ポリクローナル抗体及び抗－Ｍ１モノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を使用した。抗－トキソプラズマ原虫ポリクローナル抗体は、トキソプラズマ原虫ＭＥ４９に感染したＢＡＬＢ／ｃマウスから収得した。
その結果、ＴＧ１ ＶＬＰ及びＴＧ１４６ ＶＬＰに含まれたＴＧ１タンパク質（１７ＫＤａ）、ＴＧ４ ＶＬＰ及びＴＧ１４６ ＶＬＰに含まれたＴＧ４タンパク質（６１ＫＤａ）、ＴＧ６ ＶＬＰ及びＴＧ１４６ ＶＬＰに含まれたＴＧ６タンパク質（７５ＫＤａ）が確認されており（図１Ｃ）、及び各ＶＬＰに含まれたＭ１タンパク質（２８ＫＤａ）が確認された（図１Ｄ）。
大きさの測定のためには、ＴＧ１ ＶＬＰ、ＴＧ４ ＶＬＰ、ＴＧ６ ＶＬＰ及びＴＧ１４６ ＶＬＰを媒質染色しており、これを透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）（ＪＥＯＬ ２１００、ＪＥＯＬ ＵＳＡ、Ｉｎｃ．；Ｐｅａｂｏｄｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）で観察した。
電子顕微鏡により、上記各ＶＬＰの形態は、表面にスパイクが形成された形態で観察されており、大きさは約４０～１２０ｎｍで観察された（図２）。
多重－抗原ウイルス様粒子（ＴＧ１４６ ＶＬＰ）及び組合せウイルス様粒子（ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６ ＶＬＰ）は、ウェスタンブロット及び電子顕微鏡法によって確認した。２７μｇ、９μｇ、３μｇの濃度のＴＧ１ ＶＬＰ、ＴＧ４ ＶＬＰ、ＴＧ６ ＶＬＰ及びＴＧ１４６ ＶＬＰを各レーンにＳＤＳ－ＰＡＧＥのためにローディングし、ウェスタンブロットで可視化した。ウェスタンブロットによりＴＧ１、ＴＧ４、ＴＧ６及びＭ１タンパク質を検出するために、プローブ（ｐｒｏｂｅ）として、抗－トキソプラズマ原虫ポリクローナル抗体及び抗－Ｍ１モノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を使用した。抗－トキソプラズマ原虫ポリクローナル抗体は、トキソプラズマ原虫ＭＥ４９に感染したＢＡＬＢ／ｃマウスから収得した。
その結果、ＴＧ１ ＶＬＰ及びＴＧ１４６ ＶＬＰに含まれたＴＧ１タンパク質（１７ＫＤａ）、ＴＧ４ ＶＬＰ及びＴＧ１４６ ＶＬＰに含まれたＴＧ４タンパク質（６１ＫＤａ）、ＴＧ６ ＶＬＰ及びＴＧ１４６ ＶＬＰに含まれたＴＧ６タンパク質（７５ＫＤａ）が確認されており（図１Ｃ）、及び各ＶＬＰに含まれたＭ１タンパク質（２８ＫＤａ）が確認された（図１Ｄ）。
大きさの測定のためには、ＴＧ１ ＶＬＰ、ＴＧ４ ＶＬＰ、ＴＧ６ ＶＬＰ及びＴＧ１４６ ＶＬＰを媒質染色しており、これを透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）（ＪＥＯＬ ２１００、ＪＥＯＬ ＵＳＡ、Ｉｎｃ．；Ｐｅａｂｏｄｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）で観察した。
電子顕微鏡により、上記各ＶＬＰの形態は、表面にスパイクが形成された形態で観察されており、大きさは約４０～１２０ｎｍで観察された（図２）。
【0131】
実験例２：動物モデルにおけるトキソプラズマ原虫ＶＬＰの防御免疫試験
２－１．動物モデルの作製
７週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスをランダムに別の実験グループ（グループ当たり２０匹）に分け、ＴＧ１４６ ＶＬＰまたはＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６ ＶＬＰを投与した。０及び４週目に各グループのマウスを鼻腔内（ＩＮ）免疫化するために、６０μｇのＴＧ１４６ ＶＬＰ、及びＴＧ１ ＶＬＰ、ＴＧ４ ＶＬＰ、ＴＧ６ ＶＬＰをそれぞれ２０μｇずつ組み合わせた総６０μｇのＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６ ＶＬＰを使用した。２次免疫化の４週間後、マウスをトキソプラズマ原虫（ＧＴ１）１×１０３タキゾイトで腹腔内（ＩＰ）注射することで、チャレンジさせた。各グループの１０匹のマウスは、チャレンジ－後７日目に犠牲され、腹膜液、及び脾臓のサンプルを採取した。生きている各グループの１０匹のマウスは、体重の変化及び生存率をモニタリングするために死亡するまで毎日観察した。
２－１．動物モデルの作製
７週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスをランダムに別の実験グループ（グループ当たり２０匹）に分け、ＴＧ１４６ ＶＬＰまたはＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６ ＶＬＰを投与した。０及び４週目に各グループのマウスを鼻腔内（ＩＮ）免疫化するために、６０μｇのＴＧ１４６ ＶＬＰ、及びＴＧ１ ＶＬＰ、ＴＧ４ ＶＬＰ、ＴＧ６ ＶＬＰをそれぞれ２０μｇずつ組み合わせた総６０μｇのＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６ ＶＬＰを使用した。２次免疫化の４週間後、マウスをトキソプラズマ原虫（ＧＴ１）１×１０３タキゾイトで腹腔内（ＩＰ）注射することで、チャレンジさせた。各グループの１０匹のマウスは、チャレンジ－後７日目に犠牲され、腹膜液、及び脾臓のサンプルを採取した。生きている各グループの１０匹のマウスは、体重の変化及び生存率をモニタリングするために死亡するまで毎日観察した。
【0132】
２－２．トキソプラズマ原虫－特異的抗体反応及び抗体中和活性試験
１次（ｐｒｉｍｅ）及び２次（ｂｏｏｓｔ）免疫化後の４週目に、すべてのグループからマウスの血清を採取した。ナイーブマウスの血清を陰性対照群として使用し、トキソプラズマ原虫（ＭＥ４９）に感染したマウスの血清を陽性対照群として使用した。トキソプラズマ原虫－特異的ＩｇＧ抗体を酵素－結合免疫吸着分析法（ＥＬＩＳＡ）で分析した。平らな９６―ウェル免疫プレートを４℃で一晩ウェル当たり０．０５Ｍのカーボネート‐ビカーボネート緩衝液（ｐＨ ９．６）中、０．５μｇ／ｍＬの最終濃度で１００μＬのトキソプラズマ原虫抗原でコーティングした。その後、ウェル当たり１００μＬの血清サンプル（ＰＢＳＴ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ ｗｉｔｈ Ｔｗｅｅｎ ２０）で１：１００で希釈）を１次抗体反応として３７℃で２時間、プレートで恒温処理した。ＰＢＳＴ中のＨＲＰ－コンジュゲートされた塩素抗－マウスＩｇＧ（１００μＬ／ウェル、ＰＢＳＴで１：２、０００で希釈）をトキソプラズマ原虫－特異的ＩｇＧ反応を測定するために使用した。
一方、２次免疫化後４週目に、マウスの血清を採取し、補体を５６℃で３０分間不活性化させた。その後、免疫化からの血清５０μＬを３７℃で１時間トキソプラズマ原虫（ＧＴ１）１００タキゾイトと共に恒温処理した。タキゾイト及び血清の混合物を使用してナイーブマウス（各グループの１０匹のマウス）を腹腔内（ＩＰ）感染させた。タキゾイト及びＰＢＳの混合物を対照群として使用した。感染後７日目に、マウスの腹腔からトキソプラズマ原虫のタキゾイトを採取して顕微鏡下で血球系チャンバーで計数した。
その結果、図３に示されたように、トキソプラズマ原虫－特異的ＩｇＧ抗体が１次免疫化（図３Ａ）及び２次免疫化（図３Ｂ）以後に誘導されたことがわかったし、特に、多重－抗原ＶＬＰ（ＴＧ１４６）グループが組合せＶＬＰ（ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６）グループに比べて２次免疫化後トキソプラズマ原虫－特異的ＩｇＧ抗体反応のレベルが有意的に高かったことがわかった（＊Ｐ＜０．０５）。また、ＶＬＰ免疫化されたマウスの血清を使用して血清中和活性を評価した結果、ＰＢＳ対照群及びナイーブマウスの血清に比べて、多重－抗原ＶＬＰ（ＴＧ１４６）及び組合せＶＬＰ（ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６）の血清のいずれもトキソプラズマ原虫（ＧＴ１）の複製を有意に抑制した（図３Ｃ、＊Ｐ＜０．０５）。
１次（ｐｒｉｍｅ）及び２次（ｂｏｏｓｔ）免疫化後の４週目に、すべてのグループからマウスの血清を採取した。ナイーブマウスの血清を陰性対照群として使用し、トキソプラズマ原虫（ＭＥ４９）に感染したマウスの血清を陽性対照群として使用した。トキソプラズマ原虫－特異的ＩｇＧ抗体を酵素－結合免疫吸着分析法（ＥＬＩＳＡ）で分析した。平らな９６―ウェル免疫プレートを４℃で一晩ウェル当たり０．０５Ｍのカーボネート‐ビカーボネート緩衝液（ｐＨ ９．６）中、０．５μｇ／ｍＬの最終濃度で１００μＬのトキソプラズマ原虫抗原でコーティングした。その後、ウェル当たり１００μＬの血清サンプル（ＰＢＳＴ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ ｗｉｔｈ Ｔｗｅｅｎ ２０）で１：１００で希釈）を１次抗体反応として３７℃で２時間、プレートで恒温処理した。ＰＢＳＴ中のＨＲＰ－コンジュゲートされた塩素抗－マウスＩｇＧ（１００μＬ／ウェル、ＰＢＳＴで１：２、０００で希釈）をトキソプラズマ原虫－特異的ＩｇＧ反応を測定するために使用した。
一方、２次免疫化後４週目に、マウスの血清を採取し、補体を５６℃で３０分間不活性化させた。その後、免疫化からの血清５０μＬを３７℃で１時間トキソプラズマ原虫（ＧＴ１）１００タキゾイトと共に恒温処理した。タキゾイト及び血清の混合物を使用してナイーブマウス（各グループの１０匹のマウス）を腹腔内（ＩＰ）感染させた。タキゾイト及びＰＢＳの混合物を対照群として使用した。感染後７日目に、マウスの腹腔からトキソプラズマ原虫のタキゾイトを採取して顕微鏡下で血球系チャンバーで計数した。
その結果、図３に示されたように、トキソプラズマ原虫－特異的ＩｇＧ抗体が１次免疫化（図３Ａ）及び２次免疫化（図３Ｂ）以後に誘導されたことがわかったし、特に、多重－抗原ＶＬＰ（ＴＧ１４６）グループが組合せＶＬＰ（ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６）グループに比べて２次免疫化後トキソプラズマ原虫－特異的ＩｇＧ抗体反応のレベルが有意的に高かったことがわかった（＊Ｐ＜０．０５）。また、ＶＬＰ免疫化されたマウスの血清を使用して血清中和活性を評価した結果、ＰＢＳ対照群及びナイーブマウスの血清に比べて、多重－抗原ＶＬＰ（ＴＧ１４６）及び組合せＶＬＰ（ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６）の血清のいずれもトキソプラズマ原虫（ＧＴ１）の複製を有意に抑制した（図３Ｃ、＊Ｐ＜０．０５）。
【0133】
２－３．免疫細胞反応試験
チャレンジ感染後７日目に、マウスの脾臓細胞からのＴ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋）及び胚中心Ｂ細胞（ＧＣ）の分布をフローサイトメトリー分析で分析した。簡単に、染色緩衝液（０．１ Ｍ ＰＢＳ中２％ウシ血清アルブミン及び０．１％アジ化ナトリウム）で１×１０６の脾臓細胞（各チューブ）をＦｃ Ｂｌｏｃｋ（ｃｌｏｎｅ ２．４Ｇ２；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）と共に４℃で１５分間恒温処理した。表面染色のために、細胞を表面抗体（ＣＤ３ｅ－ＰＥ－Ｃｙ５、ＣＤ４－ＦＩＴＣ、ＣＤ８ａ－ＰＥ、Ｂ２２０－ＦＩＴＣ、ＧＬ７－ＰＥ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）と共に４℃で３０分間恒温処理した。脾臓細胞を染色緩衝液で洗浄し、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して獲得前４℃で３０分間、４％パラホルムアルデヒドで固定した。データをＣ６解析ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して分析した。
その結果、図４及び５に示されたように、チャレンジ－後７日目に、陽性対照群のマウスのグループ（Ｎａiｖｅ＋Ｃｈａ）に比べて、多重－抗原ＶＬＰで免疫化されたグループ（ＴＧ１４６＋Ｃｈａ）または組合せＶＬＰで免疫化されたグループ（ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６＋Ｃｈａ）で有意的に高いレベルのＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞が発見された（図４、＊Ｐ＜０．０５）。特に、組合せＶＬＰで免疫化されたグループ（ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６＋Ｃｈａ）に比べて、多重－抗原ＶＬＰで免疫化されたグループ（ＴＧ１４６＋Ｃｈａ）で有意に高いレベルのＣＤ４＋Ｔ細胞の反応が発見された（＊Ｐ＜０．０５）。また、多重－抗原ＶＬＰで免疫化されたグループ（ＴＧ１４６＋Ｃｈａ）は組合せＶＬＰで免疫化されたグループ（ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６＋Ｃｈａ）に比べて有意にさらに高いレベルの胚中心Ｂ細胞の反応を示した（図５、＊Ｐ＜０．０５）。このことから、ＴＧ１、ＴＧ４及びＴＧ６を同時発現するウイルス様粒子ワクチンの著しく優れた免疫反応レベルを確認した。
チャレンジ感染後７日目に、マウスの脾臓細胞からのＴ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋）及び胚中心Ｂ細胞（ＧＣ）の分布をフローサイトメトリー分析で分析した。簡単に、染色緩衝液（０．１ Ｍ ＰＢＳ中２％ウシ血清アルブミン及び０．１％アジ化ナトリウム）で１×１０６の脾臓細胞（各チューブ）をＦｃ Ｂｌｏｃｋ（ｃｌｏｎｅ ２．４Ｇ２；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）と共に４℃で１５分間恒温処理した。表面染色のために、細胞を表面抗体（ＣＤ３ｅ－ＰＥ－Ｃｙ５、ＣＤ４－ＦＩＴＣ、ＣＤ８ａ－ＰＥ、Ｂ２２０－ＦＩＴＣ、ＧＬ７－ＰＥ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）と共に４℃で３０分間恒温処理した。脾臓細胞を染色緩衝液で洗浄し、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して獲得前４℃で３０分間、４％パラホルムアルデヒドで固定した。データをＣ６解析ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して分析した。
その結果、図４及び５に示されたように、チャレンジ－後７日目に、陽性対照群のマウスのグループ（Ｎａiｖｅ＋Ｃｈａ）に比べて、多重－抗原ＶＬＰで免疫化されたグループ（ＴＧ１４６＋Ｃｈａ）または組合せＶＬＰで免疫化されたグループ（ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６＋Ｃｈａ）で有意的に高いレベルのＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞が発見された（図４、＊Ｐ＜０．０５）。特に、組合せＶＬＰで免疫化されたグループ（ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６＋Ｃｈａ）に比べて、多重－抗原ＶＬＰで免疫化されたグループ（ＴＧ１４６＋Ｃｈａ）で有意に高いレベルのＣＤ４＋Ｔ細胞の反応が発見された（＊Ｐ＜０．０５）。また、多重－抗原ＶＬＰで免疫化されたグループ（ＴＧ１４６＋Ｃｈａ）は組合せＶＬＰで免疫化されたグループ（ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６＋Ｃｈａ）に比べて有意にさらに高いレベルの胚中心Ｂ細胞の反応を示した（図５、＊Ｐ＜０．０５）。このことから、ＴＧ１、ＴＧ４及びＴＧ６を同時発現するウイルス様粒子ワクチンの著しく優れた免疫反応レベルを確認した。
【0134】
２－４．アポトーシス分析
脾臓細胞のアポトーシスを分析するために、アネキシンＶ及びＰＩをＢＤアポトーシス検出キットＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して染色した。脾臓細胞をチャレンジ－後７日目に収集した。その後、結合緩衝液中１×１０５細胞を４００×ｇで１０分間遠心分離して上清液を廃棄した。細胞を５μｌアネキシンＶ－ＦＩＴＣ及びＰＩで室温で１５分間、暗闇の中で染色した。死滅細胞の数をＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）で測定し、Ｃ６解析ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）で分析した。
その結果、図６に示されたように、非－免疫化された陽性対照群（Ｎａiｖｅ＋Ｃｈａ）で有意に高いレベルのアポトーシス反応が発見されたのに対し、多重－抗原ＶＬＰで免疫化されたグループ（ＴＧ１４６＋Ｃｈａ）や組合せＶＬＰで免疫化されたグループ（ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６＋Ｃｈａ）は有意に低いレベルのアポトーシス反応を起した。特に、組合せＶＬＰで免疫化されたグループ（ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６＋Ｃｈａ）に比べて、多重－抗原ＶＬＰで免疫化されたグループ（ＴＧ１４６＋Ｃｈａ）が有意に低いレベルのアポトーシス反応を示した（＊Ｐ＜０．０５）。
脾臓細胞のアポトーシスを分析するために、アネキシンＶ及びＰＩをＢＤアポトーシス検出キットＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して染色した。脾臓細胞をチャレンジ－後７日目に収集した。その後、結合緩衝液中１×１０５細胞を４００×ｇで１０分間遠心分離して上清液を廃棄した。細胞を５μｌアネキシンＶ－ＦＩＴＣ及びＰＩで室温で１５分間、暗闇の中で染色した。死滅細胞の数をＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）で測定し、Ｃ６解析ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）で分析した。
その結果、図６に示されたように、非－免疫化された陽性対照群（Ｎａiｖｅ＋Ｃｈａ）で有意に高いレベルのアポトーシス反応が発見されたのに対し、多重－抗原ＶＬＰで免疫化されたグループ（ＴＧ１４６＋Ｃｈａ）や組合せＶＬＰで免疫化されたグループ（ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６＋Ｃｈａ）は有意に低いレベルのアポトーシス反応を起した。特に、組合せＶＬＰで免疫化されたグループ（ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６＋Ｃｈａ）に比べて、多重－抗原ＶＬＰで免疫化されたグループ（ＴＧ１４６＋Ｃｈａ）が有意に低いレベルのアポトーシス反応を示した（＊Ｐ＜０．０５）。
【0135】
２－５．トキソプラズマ原虫へのチャレンジ感染に対する生存率、体重の変化及び寄生虫負荷試験
前述のように、ＶＬＰワクチンの保護的効能を測定するために、免疫化されたマウス及び対照群マウスを２次免疫化後の４週目に、致死のトキソプラズマ原虫ＧＴ１種（１×１０３タキゾイト）で腹腔内（ＩＰ）注射によってチャレンジさせた。また、ＶＬＰワクチンの効能を評価するために、チャレンジ感染後７日目に、マウスの腹腔からトキソプラズマ原虫のタキゾイトを採取した後、計数した。
その結果、図７に示されたように、すべてのマウスがチャレンジ後１４日以内に死亡した他のグループ（Ｎａiｖｅ＋Ｃｈａ、ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６＋Ｃｈａ）に比べて、多重－抗原ＶＬＰで免疫化されたグループ（ＴＧ１４６＋Ｃｈａ）でマウスは、１４日まで一部生存した（図７Ａ）。また、多重－抗原ＶＬＰで免疫化されたマウス（ＴＧ１４６＋Ｃｈａ）は１１日目に１０．５％の体重損失のみを示したのに対し、組合せＶＬＰで免疫化されたマウス（ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６＋Ｃｈａ）は１３日目に２１．５％、及び陽性対照群のマウス（Ｎａiｖｅ＋Ｃｈａ）は９日目に１６．８％の体重損失を示した（図７Ｂ）。最後に、多重－抗原ＶＬＰで免疫化されたマウス（ＴＧ１４６＋Ｃｈａ）または組合せＶＬＰで免疫化されたマウス（ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６＋Ｃｈａ）は、非－免疫化された陽性対照群（Ｎａiｖｅ＋Ｃｈａ）に比べて寄生虫の複製を大幅に抑制し（図７Ｃ、＊Ｐ＜０．０５）、特に、ＴＧ１４６＋ＣｈａはＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６＋Ｃｈａに比べて有意に高い寄生虫の複製抑制を示した（＊Ｐ＜０．０５）。このことから、ＴＧ１４６ ＶＬＰでマウスを免疫化する場合、トキソプラズマ原虫感染症をより効果的に抑制できることが分かる。
前述のように、ＶＬＰワクチンの保護的効能を測定するために、免疫化されたマウス及び対照群マウスを２次免疫化後の４週目に、致死のトキソプラズマ原虫ＧＴ１種（１×１０３タキゾイト）で腹腔内（ＩＰ）注射によってチャレンジさせた。また、ＶＬＰワクチンの効能を評価するために、チャレンジ感染後７日目に、マウスの腹腔からトキソプラズマ原虫のタキゾイトを採取した後、計数した。
その結果、図７に示されたように、すべてのマウスがチャレンジ後１４日以内に死亡した他のグループ（Ｎａiｖｅ＋Ｃｈａ、ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６＋Ｃｈａ）に比べて、多重－抗原ＶＬＰで免疫化されたグループ（ＴＧ１４６＋Ｃｈａ）でマウスは、１４日まで一部生存した（図７Ａ）。また、多重－抗原ＶＬＰで免疫化されたマウス（ＴＧ１４６＋Ｃｈａ）は１１日目に１０．５％の体重損失のみを示したのに対し、組合せＶＬＰで免疫化されたマウス（ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６＋Ｃｈａ）は１３日目に２１．５％、及び陽性対照群のマウス（Ｎａiｖｅ＋Ｃｈａ）は９日目に１６．８％の体重損失を示した（図７Ｂ）。最後に、多重－抗原ＶＬＰで免疫化されたマウス（ＴＧ１４６＋Ｃｈａ）または組合せＶＬＰで免疫化されたマウス（ＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６＋Ｃｈａ）は、非－免疫化された陽性対照群（Ｎａiｖｅ＋Ｃｈａ）に比べて寄生虫の複製を大幅に抑制し（図７Ｃ、＊Ｐ＜０．０５）、特に、ＴＧ１４６＋ＣｈａはＴＧ１／ＴＧ４／ＴＧ６＋Ｃｈａに比べて有意に高い寄生虫の複製抑制を示した（＊Ｐ＜０．０５）。このことから、ＴＧ１４６ ＶＬＰでマウスを免疫化する場合、トキソプラズマ原虫感染症をより効果的に抑制できることが分かる。
【0136】
実験例３：動物モデルにおけるトキソプラズマ原虫ＶＬＰとＣｐＧの併用投与試験
３－１．１回免疫化の動物実験
３－１－１．動物モデルの作製
図８に示されたように、７週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスをランダムに別の実験グループ（グループ当たり６匹）に分け、２００μｇのＴＧ１４６ＶＬＰまたは２００μｇのＴＧ１４６ ＶＬＰ＋１０μｇの免疫補強剤ＣｐＧを０日目に筋肉内（ＩＭ）または鼻腔内（ＩＮ）投与した（１次免疫化）。１次免疫化の３０日後、マウスを致死量のトキソプラズマ原虫ＭＥ４９ ４５０嚢胞で口腔経路を通じてチャレンジさせた。各グループの３匹のマウスは、チャレンジ－後３０日目に犠牲され、脳、脾臓、及び腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）を分離して免疫細胞の活性を確認し、血清における抗体反応、脳における炎症反応、脳で検出された嚢胞の大きさと数を確認した。生きている各グループの３匹のマウスは、体重の変化及び生存率をモニタリングした。
３－１．１回免疫化の動物実験
３－１－１．動物モデルの作製
図８に示されたように、７週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスをランダムに別の実験グループ（グループ当たり６匹）に分け、２００μｇのＴＧ１４６ＶＬＰまたは２００μｇのＴＧ１４６ ＶＬＰ＋１０μｇの免疫補強剤ＣｐＧを０日目に筋肉内（ＩＭ）または鼻腔内（ＩＮ）投与した（１次免疫化）。１次免疫化の３０日後、マウスを致死量のトキソプラズマ原虫ＭＥ４９ ４５０嚢胞で口腔経路を通じてチャレンジさせた。各グループの３匹のマウスは、チャレンジ－後３０日目に犠牲され、脳、脾臓、及び腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）を分離して免疫細胞の活性を確認し、血清における抗体反応、脳における炎症反応、脳で検出された嚢胞の大きさと数を確認した。生きている各グループの３匹のマウスは、体重の変化及び生存率をモニタリングした。
【0137】
３－１－２．トキソプラズマ原虫－特異的抗体反応試験
チャレンジ感染後３０日目にマウスの血清を採取した後、実験例２－２と同一の方法でＥＬＩＳＡでＩｇＧ及びＩｇＡのレベルを測定するのに使用した。
その結果、図９に示されたように、非－免疫化された陰性対照群（Ｎａiｖｅ）に比べて、ＩＮ経路の免疫化及びＩＭ経路の免疫化でいずれもＴＧ１４６ ＶＬＰを投与したグループ（ＴＧ１４６ ＶＬＰｓ）とＴＧ１４６ ＶＬＰ及びＣｐＧを共に投与したグループ（ＴＧ１４６ ＶＬＰｓ＋ＣｐＧ）の抗体の反応レベルがすべて有意に高く、特にＩＭ経路の免疫化に比べてＩＮ経路の免疫化は、さらに高いレベルの血清ＩｇＡを誘導した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
チャレンジ感染後３０日目にマウスの血清を採取した後、実験例２－２と同一の方法でＥＬＩＳＡでＩｇＧ及びＩｇＡのレベルを測定するのに使用した。
その結果、図９に示されたように、非－免疫化された陰性対照群（Ｎａiｖｅ）に比べて、ＩＮ経路の免疫化及びＩＭ経路の免疫化でいずれもＴＧ１４６ ＶＬＰを投与したグループ（ＴＧ１４６ ＶＬＰｓ）とＴＧ１４６ ＶＬＰ及びＣｐＧを共に投与したグループ（ＴＧ１４６ ＶＬＰｓ＋ＣｐＧ）の抗体の反応レベルがすべて有意に高く、特にＩＭ経路の免疫化に比べてＩＮ経路の免疫化は、さらに高いレベルの血清ＩｇＡを誘導した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
【0138】
３－１－３．免疫細胞反応試験
チャレンジ感染後３０日目に分離したマウスの脾臓及び腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）からＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、胚中心Ｂ細胞及びＢ細胞の活性を実験例２－３と同一の方法で分析した。
その結果、図１０に示されたように、チャレンジ－後３０日目に、ＩＮ経路の免疫化でＴＧ１４６ ＶＬＰグループに比べてＴＧ１４６ ＶＬＰｓ＋ＣｐＧグループの脾臓及びＭＬＮ内ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、胚中心Ｂ細胞及びＢ細胞のレベルが有意に高かく、ＩＭ経路の場合、脾臓内ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、胚中心Ｂ細胞及びＢ細胞、及びＭＬＮ内ＣＤ４＋Ｔ細胞、胚中心Ｂ細胞及びＢ細胞のレベルが有意にさらに高かった（＊Ｐ＜０．０５）。特に、ＩＭ経路の免疫化に比べてＩＮ経路の免疫化は、さらに高いレベルの脾臓及びＭＬＮ内ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、胚中心Ｂ細胞及びＢ細胞の反応を誘導した。
チャレンジ感染後３０日目に分離したマウスの脾臓及び腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）からＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、胚中心Ｂ細胞及びＢ細胞の活性を実験例２－３と同一の方法で分析した。
その結果、図１０に示されたように、チャレンジ－後３０日目に、ＩＮ経路の免疫化でＴＧ１４６ ＶＬＰグループに比べてＴＧ１４６ ＶＬＰｓ＋ＣｐＧグループの脾臓及びＭＬＮ内ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、胚中心Ｂ細胞及びＢ細胞のレベルが有意に高かく、ＩＭ経路の場合、脾臓内ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、胚中心Ｂ細胞及びＢ細胞、及びＭＬＮ内ＣＤ４＋Ｔ細胞、胚中心Ｂ細胞及びＢ細胞のレベルが有意にさらに高かった（＊Ｐ＜０．０５）。特に、ＩＭ経路の免疫化に比べてＩＮ経路の免疫化は、さらに高いレベルの脾臓及びＭＬＮ内ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、胚中心Ｂ細胞及びＢ細胞の反応を誘導した。
【0139】
３－１－４．炎症反応試験
免疫化されたマウスの感染後の炎症反応が抑制される程度を確認するために、チャレンジ－後３０日目に分離されたマウスの脳を粉砕し、１００００ＲＰＭで５分間遠心分離した後、上清液で炎症性サイトカイン（ＩＦＮ－γ及びＩＬ－６）の濃度を製造社の指針に基づきＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して測定した。
その結果、図１１に示されたように、高いレベルの炎症性サイトカインＩＦＮ－γ及びＩＬ－６を示し、脳で高い炎症反応が誘導された陽性対照群（Ｎａiｖｅ＋ｃｈａ）に比べて、ＩＮ経路の免疫化及びＩＭ経路の免疫化でいずれもＴＧ１４６ ＶＬＰ及びＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧで免疫化されたマウスの脳細胞で、低いレベルのＩＦＮ－γ及びＩＬ－６が測定されており、その中でも、ＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧで免疫化されたグループで、ＴＧ１４６ ＶＬＰで免疫化されたグループに比べて有意に低いレベルのＩＦＮ－γ及びＩＬ－６を示した（＊Ｐ＜０．０５）。
免疫化されたマウスの感染後の炎症反応が抑制される程度を確認するために、チャレンジ－後３０日目に分離されたマウスの脳を粉砕し、１００００ＲＰＭで５分間遠心分離した後、上清液で炎症性サイトカイン（ＩＦＮ－γ及びＩＬ－６）の濃度を製造社の指針に基づきＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して測定した。
その結果、図１１に示されたように、高いレベルの炎症性サイトカインＩＦＮ－γ及びＩＬ－６を示し、脳で高い炎症反応が誘導された陽性対照群（Ｎａiｖｅ＋ｃｈａ）に比べて、ＩＮ経路の免疫化及びＩＭ経路の免疫化でいずれもＴＧ１４６ ＶＬＰ及びＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧで免疫化されたマウスの脳細胞で、低いレベルのＩＦＮ－γ及びＩＬ－６が測定されており、その中でも、ＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧで免疫化されたグループで、ＴＧ１４６ ＶＬＰで免疫化されたグループに比べて有意に低いレベルのＩＦＮ－γ及びＩＬ－６を示した（＊Ｐ＜０．０５）。
【0140】
３－１－５．感染による脳内嚢胞の大きさと数の試験
チャレンジ－後３０日目に分離されたマウスの脳を粉砕し、脳組織を採取し、シリンジを使用して、４００μｌＰＢＳで均質化した。均質化された溶液を４５％Ｐｅｒｃｏｌｌに再懸濁した後、４℃、１２１００ＲＰＭで２０分間遠心分離した。その後、嚢胞層を慎重に収集し、ＰＢＳで６０００ＲＰＭで２０分間洗浄した。収集された嚢胞５μｌを顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭｉ８、Ｌｅｉｃａ、Ｗｅｔｚｌａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で５つの領域下で、５回繰り返して計数した。
その結果、図１２に示されたように、ＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧで鼻腔内免疫化された場合、嚢胞の大きさが最も小さく、ＴＧ１４６ ＶＬＰ及びＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧで免疫化された場合、ＩＮ経路の免疫化及びＩＭ経路の免疫化でいずれも嚢胞数が著しく減少し、その中でも、ＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧで免疫化されたグループで、ＴＧ１４６ ＶＬＰで免疫化されたグループに比べて有意に少ない数の嚢胞を示した（＊Ｐ＜０．０５）。
チャレンジ－後３０日目に分離されたマウスの脳を粉砕し、脳組織を採取し、シリンジを使用して、４００μｌＰＢＳで均質化した。均質化された溶液を４５％Ｐｅｒｃｏｌｌに再懸濁した後、４℃、１２１００ＲＰＭで２０分間遠心分離した。その後、嚢胞層を慎重に収集し、ＰＢＳで６０００ＲＰＭで２０分間洗浄した。収集された嚢胞５μｌを顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭｉ８、Ｌｅｉｃａ、Ｗｅｔｚｌａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で５つの領域下で、５回繰り返して計数した。
その結果、図１２に示されたように、ＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧで鼻腔内免疫化された場合、嚢胞の大きさが最も小さく、ＴＧ１４６ ＶＬＰ及びＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧで免疫化された場合、ＩＮ経路の免疫化及びＩＭ経路の免疫化でいずれも嚢胞数が著しく減少し、その中でも、ＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧで免疫化されたグループで、ＴＧ１４６ ＶＬＰで免疫化されたグループに比べて有意に少ない数の嚢胞を示した（＊Ｐ＜０．０５）。
【0141】
３－１－６．感染による生存率及び体重の変化試験
ＶＬＰ接種後３０日目にトキソプラズマ原虫ＭＥ４９をチャレンジ感染させ、３５日間、各グループのマウスの生存率と体重変化率を測定した。
その結果、図１３に示されたように、陽性対照群（Ｎａiｖｅ＋Ｃｈａ）の場合、感染後３５日目にすべて死亡したが、ＩＮまたはＩＭ経路の免疫化グループ（ＴＧ１４６ ＶＬＰ及びＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧ）の場合では、すべてのマウスが生存した。また、体重の変化を観察した結果、ＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧで鼻腔内免疫化された場合、最も少ない体重減少率を示した。
ＶＬＰ接種後３０日目にトキソプラズマ原虫ＭＥ４９をチャレンジ感染させ、３５日間、各グループのマウスの生存率と体重変化率を測定した。
その結果、図１３に示されたように、陽性対照群（Ｎａiｖｅ＋Ｃｈａ）の場合、感染後３５日目にすべて死亡したが、ＩＮまたはＩＭ経路の免疫化グループ（ＴＧ１４６ ＶＬＰ及びＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧ）の場合では、すべてのマウスが生存した。また、体重の変化を観察した結果、ＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧで鼻腔内免疫化された場合、最も少ない体重減少率を示した。
【0142】
３－２．２回免疫化の動物実験
３－２－１．動物モデルの作製
図１４に示されたように、実験例３－１の２００μｇのＴＧ１４６ＶＬＰまたは２００μｇのＴＧ１４６ ＶＬＰ＋１０μｇのＣｐＧをＩＭまたはＩＮ経路で接種したマウスを、１次免疫化後３０日目にそれぞれ１２０μｇのＴＧ１４６ＶＬＰまたは１２０μｇのＴＧ１４６ ＶＬＰ＋５μｇのＣｐＧを同一の経路で投与した（２次免疫化）。２次免疫化の３０日後、マウスを致死量のトキソプラズマ原虫ＭＥ４９ ４５０嚢胞で口腔経路を通じてチャレンジ感染させた後、感染の程度が最大化される感染後３０日目にマウスを犠牲にして、脳、脾臓及び腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）を分離し、免疫細胞の活性を確認し、血清における抗体反応、脳における炎症反応、脳で検出された嚢胞の大きさと数を確認した。生きている各グループのマウスは、体重の変化及び生存率をモニタリングした。
３－２－１．動物モデルの作製
図１４に示されたように、実験例３－１の２００μｇのＴＧ１４６ＶＬＰまたは２００μｇのＴＧ１４６ ＶＬＰ＋１０μｇのＣｐＧをＩＭまたはＩＮ経路で接種したマウスを、１次免疫化後３０日目にそれぞれ１２０μｇのＴＧ１４６ＶＬＰまたは１２０μｇのＴＧ１４６ ＶＬＰ＋５μｇのＣｐＧを同一の経路で投与した（２次免疫化）。２次免疫化の３０日後、マウスを致死量のトキソプラズマ原虫ＭＥ４９ ４５０嚢胞で口腔経路を通じてチャレンジ感染させた後、感染の程度が最大化される感染後３０日目にマウスを犠牲にして、脳、脾臓及び腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）を分離し、免疫細胞の活性を確認し、血清における抗体反応、脳における炎症反応、脳で検出された嚢胞の大きさと数を確認した。生きている各グループのマウスは、体重の変化及び生存率をモニタリングした。
【0143】
３－２－２．トキソプラズマ原虫－特異的抗体反応試験
１回免疫化の動物実験のように、１次及び２次免疫化、及びチャレンジ感染後３０日目に収得したマウスの血清におけるＩｇＧ及びＩｇＡの抗体反応を確認した。
その結果、図１５に示されたように、ＣｐＧが追加的に接種されたマウスのグループでチャレンジ感染後の抗体反応のレベルが有意に高く、その中でも、ＩＭ経路の免疫化に比べてＩＮ経路の免疫化は、より高いレベルの血清ＩｇＡを誘導した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
１回免疫化の動物実験のように、１次及び２次免疫化、及びチャレンジ感染後３０日目に収得したマウスの血清におけるＩｇＧ及びＩｇＡの抗体反応を確認した。
その結果、図１５に示されたように、ＣｐＧが追加的に接種されたマウスのグループでチャレンジ感染後の抗体反応のレベルが有意に高く、その中でも、ＩＭ経路の免疫化に比べてＩＮ経路の免疫化は、より高いレベルの血清ＩｇＡを誘導した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
【0144】
３－２－３．免疫細胞反応試験
１回免疫化の動物実験のように、チャレンジ感染後３０日目に分離したマウスの脾臓及び腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）からＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、胚中心Ｂ細胞及びＢ細胞の活性を分析した。
その結果、図１６に示されたように、チャレンジ－後３０日目に、ＩＮ経路の免疫化及びＩＭ経路の免疫化でいずれも陽性対照群（Ｎａiｖｅ＋Ｃｈａ）に比べて免疫化グループ（ＴＧ１４６ ＶＬＰ及びＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧ）で脾臓及びＭＬＮ内ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、胚中心Ｂ細胞及びＢ細胞のレベルが有意に高く（＊Ｐ＜０．０５）、特に、ＩＭ経路の免疫化に比べてＩＮ経路の免疫化は、さらに高いレベルの免疫細胞反応を誘導し、脾臓より腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）から、さらに高いレベルの免疫細胞活性が現れた。
１回免疫化の動物実験のように、チャレンジ感染後３０日目に分離したマウスの脾臓及び腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）からＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、胚中心Ｂ細胞及びＢ細胞の活性を分析した。
その結果、図１６に示されたように、チャレンジ－後３０日目に、ＩＮ経路の免疫化及びＩＭ経路の免疫化でいずれも陽性対照群（Ｎａiｖｅ＋Ｃｈａ）に比べて免疫化グループ（ＴＧ１４６ ＶＬＰ及びＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧ）で脾臓及びＭＬＮ内ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、胚中心Ｂ細胞及びＢ細胞のレベルが有意に高く（＊Ｐ＜０．０５）、特に、ＩＭ経路の免疫化に比べてＩＮ経路の免疫化は、さらに高いレベルの免疫細胞反応を誘導し、脾臓より腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）から、さらに高いレベルの免疫細胞活性が現れた。
【0145】
３－２－４．炎症反応試験
１回免疫化の動物実験のように、チャレンジ－後３０日目に分離されたマウスの脳で炎症反応を確認し、炎症反応の指標である炎症性サイトカインＩＦＮ－γ及びＩＬ－６のレベルを分析し、グループ間比較した。
その結果、図１７に示されたように、陽性対照群（Ｎａiｖｅ＋ｃｈａ）で炎症性サイトカインＩＦＮ－γ及びＩＬ－６のレベルが最も高く、その他の免疫化グループ（ＴＧ１４６ ＶＬＰ及びＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧ）ではＩＮ経路の免疫化及びＩＭ経路の免疫化でいずれも有意に低いレベルのＩＦＮ－γ及びＩＬ－６を示した。その中でも、ＣｐＧが追加的に接種されたマウスのグループで、そうでないマウスのグループよりもさらに低いレベルのＩＦＮ－γ及びＩＬ－６を示した（＊Ｐ＜０．０５）。
１回免疫化の動物実験のように、チャレンジ－後３０日目に分離されたマウスの脳で炎症反応を確認し、炎症反応の指標である炎症性サイトカインＩＦＮ－γ及びＩＬ－６のレベルを分析し、グループ間比較した。
その結果、図１７に示されたように、陽性対照群（Ｎａiｖｅ＋ｃｈａ）で炎症性サイトカインＩＦＮ－γ及びＩＬ－６のレベルが最も高く、その他の免疫化グループ（ＴＧ１４６ ＶＬＰ及びＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧ）ではＩＮ経路の免疫化及びＩＭ経路の免疫化でいずれも有意に低いレベルのＩＦＮ－γ及びＩＬ－６を示した。その中でも、ＣｐＧが追加的に接種されたマウスのグループで、そうでないマウスのグループよりもさらに低いレベルのＩＦＮ－γ及びＩＬ－６を示した（＊Ｐ＜０．０５）。
【0146】
３－２－５．感染による脳内嚢胞の大きさと数の試験
１回免疫化の動物実験のように、チャレンジ－後３０日目に分離されたマウスの脳で収集された嚢胞の大きさと数を確認した。
その結果、図１８に示されたように、陽性対照群（Ｎａiｖｅ＋ｃｈａ）はＩＮまたはＩＭ経路の免疫化グループ（ＴＧ１４６ ＶＬＰ及びＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧ）に比べて極めて多い嚢胞数の差を示し、免疫化グループの中では、ＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧで鼻腔内免疫化させた場合の嚢胞数が最も少なかった。免疫化グループ間の嚢胞の大きさの差は大きくなかったが、この場合にも、Ｎａiｖｅ＋ｃｈａに比べてＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧ（ＩＮ）における嚢胞の大きさが最も小さかった（＊Ｐ＜０．０５）。
１回免疫化の動物実験のように、チャレンジ－後３０日目に分離されたマウスの脳で収集された嚢胞の大きさと数を確認した。
その結果、図１８に示されたように、陽性対照群（Ｎａiｖｅ＋ｃｈａ）はＩＮまたはＩＭ経路の免疫化グループ（ＴＧ１４６ ＶＬＰ及びＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧ）に比べて極めて多い嚢胞数の差を示し、免疫化グループの中では、ＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧで鼻腔内免疫化させた場合の嚢胞数が最も少なかった。免疫化グループ間の嚢胞の大きさの差は大きくなかったが、この場合にも、Ｎａiｖｅ＋ｃｈａに比べてＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧ（ＩＮ）における嚢胞の大きさが最も小さかった（＊Ｐ＜０．０５）。
【0147】
３－２－６．感染による生存率及び体重の変化試験
１回免疫化の動物実験のように、チャレンジ－後３５日間、各グループのマウスの生存率と体重変化率を測定した。
その結果、図１９に示されるように、陽性対照群（Ｎａiｖｅ＋ｃ ｈａ）の場合、感染後３５日目にすべて死亡したが、ＩＮまたはＩＭ経路の免疫化グループ（ＴＧ１４６ ＶＬＰ及びＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧ）の場合では、すべてのマウスが生存しており、体重の変化も少なかった。
１回免疫化の動物実験のように、チャレンジ－後３５日間、各グループのマウスの生存率と体重変化率を測定した。
その結果、図１９に示されるように、陽性対照群（Ｎａiｖｅ＋ｃ ｈａ）の場合、感染後３５日目にすべて死亡したが、ＩＮまたはＩＭ経路の免疫化グループ（ＴＧ１４６ ＶＬＰ及びＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧ）の場合では、すべてのマウスが生存しており、体重の変化も少なかった。
【0148】
３－３．３回免疫化の動物実験
３－３－１．動物モデルの作製
図２０に示されたように、２００μｇのＴＧ１４６ＶＬＰまたは２００μｇのＴＧ１４６ ＶＬＰ＋１０μｇのＣｐＧをＩＭまたはＩＮ経路で接種した後（１次免疫化、実験例３－１）、１２０μｇのＴＧ１４６ＶＬＰまたは１２０μｇのＴＧ１４６ ＶＬＰ＋５μｇのＣｐＧを接種した（２次免疫化、実験例３－２）マウスに、２次免疫化の３０日後に２次免疫化と同一の量で免疫化させた（３次免疫化）。３次免疫化後の３０日目にマウスを致死量のトキソプラズマ原虫ＭＥ４９ ４５０嚢胞で口腔経路を通じてチャレンジ感染させた後、感染の程度が最大化される感染後３０日目にマウスを犠牲にして、脳、脾臓及び腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）を分離し、免疫細胞の活性を確認し、血清における抗体反応、脳における炎症反応、脳で検出された嚢胞の大きさと数を確認した。生きている各グループのマウスは、体重の変化及び生存率をモニタリングした。
３－３－１．動物モデルの作製
図２０に示されたように、２００μｇのＴＧ１４６ＶＬＰまたは２００μｇのＴＧ１４６ ＶＬＰ＋１０μｇのＣｐＧをＩＭまたはＩＮ経路で接種した後（１次免疫化、実験例３－１）、１２０μｇのＴＧ１４６ＶＬＰまたは１２０μｇのＴＧ１４６ ＶＬＰ＋５μｇのＣｐＧを接種した（２次免疫化、実験例３－２）マウスに、２次免疫化の３０日後に２次免疫化と同一の量で免疫化させた（３次免疫化）。３次免疫化後の３０日目にマウスを致死量のトキソプラズマ原虫ＭＥ４９ ４５０嚢胞で口腔経路を通じてチャレンジ感染させた後、感染の程度が最大化される感染後３０日目にマウスを犠牲にして、脳、脾臓及び腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）を分離し、免疫細胞の活性を確認し、血清における抗体反応、脳における炎症反応、脳で検出された嚢胞の大きさと数を確認した。生きている各グループのマウスは、体重の変化及び生存率をモニタリングした。
【0149】
３－３－２．トキソプラズマ原虫－特異的抗体反応試験
１回及び２回免疫化の動物実験のように、１次、２次及び３次免疫化、及びチャレンジ感染後３０日目に収得したマウスの血清におけるＩｇＧ及びＩｇＡの抗体反応を確認した。
その結果、図２１に示されたように、免疫化の回数に応じて次第に増加するＩｇＧ抗体の反応レベルを確認することができ、陽性対照群（Ｎａiｖｅ＋ｃ ｈａ）に比べて有意に高い免疫反応を示した。また、ＩＭ経路の免疫化に比べてＩＮ経路の免疫化は、より高いレベルの血清ＩｇＡを誘導した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
１回及び２回免疫化の動物実験のように、１次、２次及び３次免疫化、及びチャレンジ感染後３０日目に収得したマウスの血清におけるＩｇＧ及びＩｇＡの抗体反応を確認した。
その結果、図２１に示されたように、免疫化の回数に応じて次第に増加するＩｇＧ抗体の反応レベルを確認することができ、陽性対照群（Ｎａiｖｅ＋ｃ ｈａ）に比べて有意に高い免疫反応を示した。また、ＩＭ経路の免疫化に比べてＩＮ経路の免疫化は、より高いレベルの血清ＩｇＡを誘導した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【0150】
３－３－３．免疫細胞反応試験
１回及び２回免疫化の動物実験のように、チャレンジ感染後３０日目に分離したマウスの脾臓及び腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）からＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、胚中心Ｂ細胞及びＢ細胞の活性を分析した。
その結果、図２２に示されたように、ＩＮ経路の免疫化においてＴＧ１４６ ＶＬＰグループに比べてＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧグループの脾臓及びＭＬＮ内のＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、胚中心Ｂ細胞及びＢ細胞のレベルが有意にさらに高く、ＩＭ経路の場合、脾臓内のＣＤ８＋Ｔ細胞及びＢ細胞、及びＭＬＮ内のＣＤ４＋Ｔ細胞、胚中心Ｂ細胞及びＢ細胞のレベルが有意にさらに高かった（＊Ｐ＜０．０５）。特に、追加的にＴＧ１４６ ＶＬＰ及びＣｐＧを鼻腔内接種した場合、最も優れた免疫細胞活性が現れた。
１回及び２回免疫化の動物実験のように、チャレンジ感染後３０日目に分離したマウスの脾臓及び腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）からＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、胚中心Ｂ細胞及びＢ細胞の活性を分析した。
その結果、図２２に示されたように、ＩＮ経路の免疫化においてＴＧ１４６ ＶＬＰグループに比べてＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧグループの脾臓及びＭＬＮ内のＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、胚中心Ｂ細胞及びＢ細胞のレベルが有意にさらに高く、ＩＭ経路の場合、脾臓内のＣＤ８＋Ｔ細胞及びＢ細胞、及びＭＬＮ内のＣＤ４＋Ｔ細胞、胚中心Ｂ細胞及びＢ細胞のレベルが有意にさらに高かった（＊Ｐ＜０．０５）。特に、追加的にＴＧ１４６ ＶＬＰ及びＣｐＧを鼻腔内接種した場合、最も優れた免疫細胞活性が現れた。
【0151】
３－３－４．炎症反応試験
１回及び２回免疫化の動物実験のように、チャレンジ－後３０日目に分離されたマウスの脳で炎症反応を確認し、炎症反応の指標である炎症性サイトカインＩＦＮ－γ及びＩＬ－６のレベルを分析して、グループ間で比較した。
その結果、図２３に示されたように、陽性対照群（Ｎａiｖｅ＋ｃｈａ）で炎症性サイトカインＩＦＮ－γ及びＩＬ－６のレベルが最も高く、その他の免疫化グループ（ＴＧ１４６ ＶＬＰ及びＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧ）ではＩＮ経路の免疫化及びＩＭ経路の免疫化でいずれも有意に低いレベルのＩＦＮ－γ及びＩＬ－６を示した。その中でも、ＣｐＧが追加的に接種されたマウスのグループで、さらに低いレベルのＩＦＮ－γ及びＩＬ－６を示した（＊Ｐ＜０．０５）。また、１次及び２次免疫化以後、分析した炎症反応試験の結果と比較したとき、３次免疫化において著しく低下した炎症反応の結果を確認することができた（図１１、１７、及び２３）。
１回及び２回免疫化の動物実験のように、チャレンジ－後３０日目に分離されたマウスの脳で炎症反応を確認し、炎症反応の指標である炎症性サイトカインＩＦＮ－γ及びＩＬ－６のレベルを分析して、グループ間で比較した。
その結果、図２３に示されたように、陽性対照群（Ｎａiｖｅ＋ｃｈａ）で炎症性サイトカインＩＦＮ－γ及びＩＬ－６のレベルが最も高く、その他の免疫化グループ（ＴＧ１４６ ＶＬＰ及びＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧ）ではＩＮ経路の免疫化及びＩＭ経路の免疫化でいずれも有意に低いレベルのＩＦＮ－γ及びＩＬ－６を示した。その中でも、ＣｐＧが追加的に接種されたマウスのグループで、さらに低いレベルのＩＦＮ－γ及びＩＬ－６を示した（＊Ｐ＜０．０５）。また、１次及び２次免疫化以後、分析した炎症反応試験の結果と比較したとき、３次免疫化において著しく低下した炎症反応の結果を確認することができた（図１１、１７、及び２３）。
【0152】
３－３－５．感染による脳内嚢胞の大きさと数の試験
１回及び２回免疫化の動物実験のように、チャレンジ－後３０日目に分離されたマウスの脳で収集された嚢胞の大きさと数を確認した。
その結果、１次及び２次免疫化の後分離した脳における嚢胞数より、３次免疫化の時の嚢胞数が著しく減少したことを確認することができ（図１２、１８及び２４）、図２４に示されたように、ＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧで鼻腔内免疫化させた場合の嚢胞数が最も少なかった。嚢胞の大きさもＮａiｖｅ＋ｃｈａに比べてＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧ（ＩＮ）における嚢胞の大きさが最も小さかった（＊Ｐ＜０．０５）。
１回及び２回免疫化の動物実験のように、チャレンジ－後３０日目に分離されたマウスの脳で収集された嚢胞の大きさと数を確認した。
その結果、１次及び２次免疫化の後分離した脳における嚢胞数より、３次免疫化の時の嚢胞数が著しく減少したことを確認することができ（図１２、１８及び２４）、図２４に示されたように、ＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧで鼻腔内免疫化させた場合の嚢胞数が最も少なかった。嚢胞の大きさもＮａiｖｅ＋ｃｈａに比べてＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧ（ＩＮ）における嚢胞の大きさが最も小さかった（＊Ｐ＜０．０５）。
【0153】
３－３－６．感染による生存率及び体重の変化試験
１回及び２回免疫化の動物実験のように、チャレンジ－後３５日間、各グループのマウスの生存率と体重変化率を測定した。
その結果、図２５に示されたように、陽性対照群（Ｎａiｖｅ＋ｃ ｈａ）の場合、感染後３５日目にすべて死亡したが、ＩＮまたはＩＭ経路の免疫化グループ（ＴＧ１４６ ＶＬＰ及びＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧ）の場合では、すべてのマウスが生存し、体重変化も少なかった。
１回及び２回免疫化の動物実験のように、チャレンジ－後３５日間、各グループのマウスの生存率と体重変化率を測定した。
その結果、図２５に示されたように、陽性対照群（Ｎａiｖｅ＋ｃ ｈａ）の場合、感染後３５日目にすべて死亡したが、ＩＮまたはＩＭ経路の免疫化グループ（ＴＧ１４６ ＶＬＰ及びＴＧ１４６ ＶＬＰ＋ＣｐＧ）の場合では、すべてのマウスが生存し、体重変化も少なかった。
【0154】
発明の説明は、例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者は、本発明の技術的思考や必須的な特徴を変更せずに、別の具体的な形態に容易に変形し得ることを理解できるだろう。したがって、上述の実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的なものではないと理解すべきである。例えば、単一型で説明されている各構成要素は、分散されて実施されることもでき、同様に、分散されたものと説明されている構成要素も結合された形態で実施され得る。
【0155】
本発明の範囲は、後述する特許請求の範囲によって示され、請求の範囲の意味及び範囲並びにその均等概念から導出される、すべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【配列表】