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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-15
(45)【発行日】2024-08-23
(54)【発明の名称】肝臓Ｘ受容体アゴニストとしてのイノトジオールおよびその用途
(51)【国際特許分類】
A61K 31/575 20060101AFI20240816BHJP
A23L 33/10 20160101ALI20240816BHJP
A61K 8/63 20060101ALI20240816BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240816BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20240816BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20240816BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20240816BHJP
A61P 9/12 20060101ALI20240816BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20240816BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240816BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20240816BHJP
A61P 17/10 20060101ALI20240816BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20240816BHJP
A61P 19/10 20060101ALI20240816BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20240816BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240816BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20240816BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20240816BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20240816BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240816BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240816BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20240816BHJP
【ＦＩ】
A61K31/575
A23L33/10
A61K8/63
A61P1/16
A61P3/04
A61P3/06
A61P9/10 101
A61P9/12
A61P13/12
A61P17/00
A61P17/06
A61P17/10
A61P19/02
A61P19/10
A61P21/00
A61P25/00
A61P25/14
A61P25/16
A61P25/28
A61P29/00
A61P29/00 101
A61P43/00 111
A61Q19/00
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2023508036
(86)(22)【出願日】2021-08-06
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-30
(86)【国際出願番号】 KR2021010447
(87)【国際公開番号】W WO2022031129
(87)【国際公開日】2022-02-10
【審査請求日】2023-02-17
(31)【優先権主張番号】10-2020-0098809
(32)【優先日】2020-08-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】523039891
【氏名又は名称】カーボエクスパート・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＲＢＯＥＸＰＥＲＴ ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100126778
【弁理士】
【氏名又は名称】品川 永敏
(74)【代理人】
【識別番号】100162684
【弁理士】
【氏名又は名称】呉 英燦
(74)【代理人】
【識別番号】100221523
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 渉
(72)【発明者】
【氏名】イ，チャンギュ
(72)【発明者】
【氏名】パン，ソヨン
(72)【発明者】
【氏名】パク，ギュピン
(72)【発明者】
【氏名】イ，ナンヨン
(72)【発明者】
【氏名】パク，ヒョナ
(72)【発明者】
【氏名】イ，ウォンヒ
【審査官】春日 淳一
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１９／２２５７８３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Inotodiol suppresses proliferation of breast cancer in rat model of type 2 diabetes mellitus via downregulation of β-catenin signaling，Biomedicine & Pharmacotherapy，2018年03月，vol.99，142-150，DOI:10.1016/j.biopha.2017.12.084
【文献】Structure determination of inonotsuoxides A and B and in vivo anti-tumor promoting activity of inotodiol from the sclerotia of Inonotus obliquus，Bioorganic & Medicinal Chemistry，2007年，vol.15, no.1，257-264，DOI:10.1016/j.bmc.2006.09.064
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ，Ａ６１Ｐ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
イノトジオール、そのプロドラッグ、またはそれらの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）媒介疾患の予防または治療用薬学的組成物であって、
前記プロドラッグが、下記の式２で表され、
前記ＬＸＲ媒介疾患が、神経変性脳疾患、自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化、異常脂質血症、脳卒中、高脂質血症、過コレステロール血症、高リポタンパク血症、高トリグリセリド血症、脂肪異栄養症、肝脂肪症、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、胆石症、メタボリックシンドローム、シンドロームＸ、末梢閉塞障害、タンパク尿、糸球体腎炎、高血圧性腎症、免疫グロビンＡ腎症、巣状糸球体硬化症、酸過剰血（高リン酸血症）、関連した酸過剰血の心血管合併症、および骨粗鬆症からなる群から選択されるいずれかである、
［式２］
【化1】
Ｒ １ およびＲ ２ のうちの少なくとも１つは－ＯＣ（Ｏ）－Ｒ ３ である］
薬学的組成物。
【請求項2】
前記Ｒ３
が、ＣＨ３（ＣＨ２）ａ
－またはＣＨ３（ＣＨ２）ｂ（ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２））ｃ（ＣＨ２）ｄ－を有する非置換直鎖状アルキルまたはアルケニル鎖であり、ａは８～２４の整数、ｂは１～５の整数、ｃは１～６の整数、ｄは３～７の整数である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項3】
前記イノトジオールまたはそのプロドラッグが、ＬＸＲの発現または活性をアップレギュレートするＬＸＲのアゴニストである、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項4】
前記神経変性脳疾患が、認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、軽度認知障害、大脳アミロイド血管症、ダウン症候群、アミロイド性脳卒中、全身性アミロイドーシス、ダッチ（Ｄｕｔｃｈ）型アミロイドーシス、ニーマン・ピック病、老人性認知症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳萎縮症、トゥレット症候群、フリードライヒ運動失調症、マチャド・ジョセフ病、レビー小体型認知症、ジストニア、進行性核上性麻痺、および前頭側頭型認知症からなる群から選択される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項5】
前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、乾癬、および多発性硬化症からなる群から選択される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項6】
イノトジオール、そのプロドラッグ、またはそれらの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）媒介疾患の予防または改善のための健康機能食品であって、
前記プロドラッグが、下記の式２で表され、
前記ＬＸＲ媒介疾患が、神経変性脳疾患、自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化、異常脂質血症、脳卒中、高脂質血症、過コレステロール血症、高リポタンパク血症、高トリグリセリド血症、脂肪異栄養症、肝脂肪症、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、胆石症、メタボリックシンドローム、シンドロームＸ、末梢閉塞障害、タンパク尿、糸球体腎炎、高血圧性腎症、免疫グロビンＡ腎症、巣状糸球体硬化症、酸過剰血（高リン酸血症）、関連した酸過剰血の心血管合併症、および骨粗鬆症からなる群から選択されるいずれかである、
［式２］
【化2】
Ｒ １ およびＲ ２ のうちの少なくとも１つは－ＯＣ（Ｏ）－Ｒ ３ である］
健康機能食品。
【請求項7】
イノトジオール、そのプロドラッグ、またはそれらの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）媒介疾患の予防または改善のための化粧料組成物であって、
前記プロドラッグが、下記の式２で表され、
前記ＬＸＲ媒介疾患が、神経変性脳疾患、自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化、異常脂質血症、脳卒中、高脂質血症、過コレステロール血症、高リポタンパク血症、高トリグリセリド血症、脂肪異栄養症、肝脂肪症、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、胆石症、メタボリックシンドローム、シンドロームＸ、末梢閉塞障害、タンパク尿、糸球体腎炎、高血圧性腎症、免疫グロビンＡ腎症、巣状糸球体硬化症、酸過剰血（高リン酸血症）、関連した酸過剰血の心血管合併症、および骨粗鬆症からなる群から選択されるいずれかである、
［式２］
【化3】
Ｒ １ およびＲ ２ のうちの少なくとも１つは－ＯＣ（Ｏ）－Ｒ ３ である］
化粧料組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
肝臓Ｘ受容体アゴニストとしてのイノトジオールおよびその肝臓Ｘ受容体媒介疾患の治療用途に関する。
【背景技術】
【0002】
肝臓Ｘ受容体（Ｌｉｖｅｒ―Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＬＸＲｓ）は、脂質代謝および細胞のコレステロールホメオスタシスに関与する遺伝子の発現を調節するのに重要な役割を果たすリガンド活性化転写因子である。ＬＸＲｓアゴニストは、処理および排泄のために肝臓の周りから肝臓へのコレステロール逆転送を可能にするコレステロール逆転送（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ；ＲＣＴ）を強化することが示された。ＲＣＴは、周囲の食細胞におけるコレステロール転送（ＡＴＰ結合カセット：ＡＢＣＡ１とＡＢＣＧ１）タンパク質のアップレギュレーションによって起こる。活性ＲＣＴは、アテローム性動脈硬化（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）の進行を抑制することができると報告されている。
【0003】
ＬＸＲには、別途の遺伝子によってコードされたＬＸＲα（ＮＲ１Ｈ３）およびＬＸＲβ（ＮＲ１Ｈ２）の２つのアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）がある。ＬＸＲβは、ほとんどの組織で一般的に発現される一方、ＬＸＲαの発現は組織選択性があり、脂質ホメオスタシスにとって重要な肝臓、小腸、腎臓、脂肪組織および副腎で発現される。これら２つのＬＸＲｓは、４つのヌクレオチド（ＤＲ４）によって離隔されたコア六量体配列（ｃｏｒｅ ｈｅｘａｍｅｒｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の２つの直接反復で構成されるＬＸＲｓ応答要素（ＬＸＲＥｓ；ＬＸＲｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）を協調的に認識、または結合するために、義務的なヘテロダイマーパートナー（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ ｐａｒｔｎｅｒ）として、レチノイドＸ受容体（Ｒｅｔｉｎｏｉｄ－Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＲＸＲ）が必要だ。前記２つのＬＸＲｓのリガンド結合ドメインはかなりよく保存（～７８％アミノ酸相同）され、ステロイドホルモンおよび胆汁酸合成において中間体として作用するコレステロール酸化誘導体（オキシステロール；ｏｘｙｓｔｅｒｏｌｓ）からなる内在性リガンド（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｌｉｇａｎｄｓ）と結合する。これらのうち、２２（Ｒ）－ヒドロキシコレステロール（ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）、２４（Ｓ）－ヒドロキシコレステロール（ｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）、および２４（Ｓ），２５－エポキシコレステロール（ｅｐｏｘｙｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）が最も強力なリガンドとして報告された。これらのデータは、ＬＸＲｓがコレステロールホメオスタシスの維持に重要な役割を果たす可能性があることを示し、その後、マウスにおける遺伝子ノックアウト（ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）研究によってその役割が確認された。非ステロイド性リガンド（Ｎｏｎ－ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ｌｉｇａｎｄｓ）は同定されており、それを化学プローブ（ｐｒｏｂｅ）として利用して多くのＬＸＲｓ調節遺伝子が発見された。いくつかのＬＸＲＥを含む遺伝子は、コレステロール代謝、コレステロール逆転送（ＲＣＴ）および脂肪生成に関与している。他の遺伝子は炎症および炭水化物代謝不足ＬＸＲＥｓに関与しているが、リガンド依存的な方法ではＬＸＲｓによって抑制される。これらの発見に基づいて、前記肝臓Ｘ受容体はアテローム性動脈硬化、糖尿病、アルツハイマー病、皮膚疾患、生殖疾患および癌を含む様々な疾患の治療のための基礎を提供する細胞内コレステロールセンサーとして機能する優れた標的（ｔａｒｇｅｔ）として最近登場した。（Ｖｉｅｎｎｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ，１５（２）：２１９－２３２） さらに、ＬＸＲｓ作用物質は、腸内および腎臓リン酸ナトリウム（ＮａＰｉ）輸送体および血清リン酸塩濃度を順番に制御することが分かった。（Ｃａｌｄａｓ ｅｔａｌ．，２０１１，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，８０：５３５－５４４） したがって、ＬＸＲは、腎臓疾患、特に高リン酸血症と関連する心血管合併症の予防のための標的（ｔａｒｇｅｔ）にもなり得る。さらに、ＬＸＲｓは骨粗鬆症およびそれに関連する疾患の治療の標的として認識されている。（Ｋｌｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，２７（１２）：２４４２－５１）
【0004】
アルツハイマー病は認知症の最も一般的な形態の１つであり、脳内のアミロイドβペプチド（ａｍｙｌｏｉｄ－ｂｅｔａ（Ａβ） ｐｅｐｔｉｄｅｓ）の蓄積と堆積で特徴付けられ、病気にかかった個人の脳における神経接合機能の揺らぎと神経単位の喪失が続く。ニューロンは脳内のアミロイド前駆体タンパク質（ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＰＰ））の分裂を介してアミロイドβペプチド（ａｍｙｌｏｉｄ－ｂｅｔａ（Ａβ） ｐｅｐｔｉｄｅｓ）を産生し、アミロイドベータペプチド（ａｍｙｌｏｉｄ－ｂｅｔａ（Ａβ） ｐｅｐｔｉｄｅｓ）は末梢循環への流出を通じて、そして脳内のタンパク質分解酵素による作用で通常除去される。
【0005】
アポリポプロテインＥ（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ（ａｐｏＥ））は、アルツハイマー病において年齢関連のリスクと関連しており、Ａβホメオスタシスにおいて決定的な役割を果たす。ＬＸＲはａｐｏＥの発現を増加させ、ａｐｏＥの脂肪結合を増加させる。Ａβの低下は、細胞の内側と外側の両方で脂質化されたａｐｏＥによって改善される。ＬＸＲｓアゴニスト（ａｇｏｎｉｓｔ）治療はＡβタンパク質の加水分解の低下を促進し、プラーク（ｐｌａｑｕｅ）病を減少させ、ＡＰＰ発現の遺伝子が移植されたラットの記憶を促進した。（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｎｅｕｒｏｎ，５８：６８１－６９３）
【0006】
したがって、ＬＸＲｓアゴニストの開発を通じて、ＬＸＲｓ媒介関連疾患、例えば、動脈硬化症、アルツハイマー病、代謝性疾患などの治療の開発が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
一態様は、イノトジオール（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）、そのプロドラッグ、またはそれらの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む肝臓Ｘ受容体（Ｌｉｖｅｒ―Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＬＸＲ）アゴニストを提供することである。
【0008】
別の態様は、イノトジオール（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）、そのプロドラッグまたはそれらの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む肝臓Ｘ受容体（Ｌｉｖｅｒ―Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＬＸＲｓ）媒介疾患の予防または治療のための薬学的組成物を提供することだ。
【0009】
別の態様は、肝臓Ｘ受容体（Ｌｉｖｅｒ－Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＬＸＲｓ）アゴニスト、または肝臓Ｘ受容体媒介疾患の治療薬の製造のためのイノトジオール（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）、そのプロドラッグ、またはそれらの薬学的に許容可能な塩の用途を提供することである。
【0010】
別の態様は、イノトジオール（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）、そのプロドラッグ、またはそれらの薬学的に許容可能な塩を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、肝臓Ｘ受容体（Ｌｉｖｅｒ―Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＬＸＲｓ）をアップレギュレートする方法、肝臓Ｘ受容体媒介疾患を治療する方法を提供する。
【0011】
別の態様は、イノトジオール（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）、そのプロドラッグまたはそれらの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む肝臓Ｘ受容体（Ｌｉｖｅｒ―Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＬＸＲｓ）媒介疾患の予防または改善のための健康機能食品を提供することである。
【0012】
別の態様は、イノトジオール（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）、そのプロドラッグ、またはそれらの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む肝臓Ｘ受容体（Ｌｉｖｅｒ―Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＬＸＲｓ）媒介皮膚状態の予防または改善のための化粧料組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0013】
一態様は、イノトジオール（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）、そのプロドラッグ、またはそれらの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む肝臓Ｘ受容体（Ｌｉｖｅｒ－Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＬＸＲｓ）アゴニストを提供する。
【0014】
別の態様は、イノトジオール（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）、そのプロドラッグ、またはそれらの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む肝臓Ｘ受容体（Ｌｉｖｅｒ―Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＬＸＲｓ）媒介疾患の予防または治療のための薬学的組成物を提供する。
【0015】
別の態様は、肝臓Ｘ受容体（Ｌｉｖｅｒ―Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＬＸＲｓ）アゴニスト、または肝臓Ｘ受容体媒介疾患の治療薬の製造のためのイノトジオール、そのプロドラッグ、またはそれらの薬学的に許容可能な塩の用途を提供する。
【0016】
別の態様は、イノトジオール（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）、そのプロドラッグ、またはそれらの薬学的に許容可能な塩を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、肝臓Ｘ受容体（Ｌｉｖｅｒ―Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＬＸＲｓ）をアップレギュレートする方法、肝臓Ｘ受容体媒介疾患を治療する方法を提供する。
【0017】
本明細書において「イノトジオール（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）」とは、ＩＵＰＡＣ名称が（３Ｓ，５Ｒ，１０Ｓ，１３Ｒ，１４Ｒ，１７Ｒ）－１７－［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－６－メチルへプト－５－エン－２－イル］－４，４，１０，１３，１４－ペンタメチル－２，３，５，６，７，１１，１２，１５，１６，１７－デカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレンｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎ－３－オール（（３Ｓ，５Ｒ，１０Ｓ，１３Ｒ，１４Ｒ，１７Ｒ）－１７－［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ｈｙｄｒｏｘｙ－６－ｍｅｔｈｙｌｈｅｐｔ－５－ｅｎ－２－ｙｌ］－４，４，１０，１３，１４－ｐｅｎｔａｍｅｔｈｙｌ－２，３，５，６，７，１１，１２，１５，１６，１７－ｄｅｃａｈｙｄｒｏ－１Ｈ－ｃｙｃｌｏｐｅｎｔａ［ａ］ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎ－３－ｏｌ）である。
【0018】
前記イノトジオールは、チャーガ（Ｉｎｏｎｏｔｕｓ ｏｂｌｉｑｕｕｓ）の主要な生理活性成分として、従来の方法に従って化学的に合成することができ、薬学的に許容可能な塩から製造することができ、またはチャーガの抽出物から分離、精製したものであり得る。
【0019】
前記イノトジオール（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）またはそのプロドラッグは肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲｓ）アゴニストとして作用する。
【0020】
本明細書で提供されるのは、ＬＸＲｓアゴニストによって治療可能な病気または障害を有する対象を治療する方法である。一実施形態で、ＬＸＲは、ＬＸＲｓ活性をアップレギュレートすることによって調節することができる。前記方法は、有効量のイノトジオール（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）またはそのプロドラッグを投与することで実現できる。
【0021】
本明細書で提供される前記方法または薬学的組成物は、ＬＸＲｓの調節で治療することができる障害のために、特にＬＸＲｓの作用（ａｇｏｎｉｓｔ）の場合に有用であり得る。
【0022】
一実施形態では、イノトジオール（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）またはそのプロドラッグは、変化したコレステロール輸送（ａｌｔｅｒｅｄ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）、脂肪酸代謝、コレステロール吸収、コレステロール再吸収、コレステロール分泌、コレステロール排出、またはコレステロール代謝に関連する病気または障害の治療または予防のために有用である。代表的な病気または障害は、脂質障害と、癌、特に卵巣、胸、また、前立腺癌を含むホルモン依存性癌と、ニキビ肌と、炎症性皮膚疾患と、免疫障害と、撹乱された表皮バリア機能によって特徴づけられる状態と、撹乱された区別（ｄｉｓｔｕｒｂｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ)または表皮や粘膜の過渡拡散と、心血管障害と、生殖管障害と、視神経や網膜の異常と、病気で発生する神経変性疾患と、中枢または末梢神経系の損傷と、神経病性疾患、または、老化による退行プロセスと、腎臓の病気または障害と、骨粗鬆症およびそれに関連する病気を含むが、これらに限定されない。
【0023】
別の実施形態で、前記疾患または障害は、神経変性脳疾患（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｂｒａｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、自己免疫疾患（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ）、高脂質血症（ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉａ）、過コレステロール血症（ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）、高リポタンパク血症（ｈｙｐｅｒｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｅｍｉａ)、高トリグリセリド血症（ｈｙｐｅｒｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｍｉａ）、脂肪異栄養症（ｌｉｐｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、肝脂肪症（ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）、非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ）（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ）（ＮＡＦＬＤ）、過血糖（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ）、インスリン抵抗（ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）、真性糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ）、異常脂質血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）、アテローム性動脈硬化（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、胆石症（ｇａｌｌｓｔｏｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ）、ニキビ（ａｃｎｅ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、皮膚炎（ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）（幹線（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、接触皮膚炎（ｃｏｎｔａｃｔ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）に限定されない）、酸過剰血（高リン酸血症；ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈａｔｅｍｉａ）、関連した酸過剰血の心血管合併症 （ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈａｔｅｍｉａ）、癌（ｃａｎｃｅｒ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、または骨粗鬆症（ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）だ。
【0024】
別の実施形態で、前記病気および障害は尋常性座瘡（ｃｏｍｍｏｎ ａｃｎｅ）と、座瘡（ｃｏｍｅｄｏｎｅｓ）と、多形症（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｓ）と、酒さ鼻（ｒｏｓａｃｅａ）と、結節嚢胞性座瘡（ｎｏｄｕｌｏｃｙｓｔｉｃ ａｃｎｅ）と、集簇性座瘡（ａｃｎｅ ｃｏｎｇｌｏｂａｔｅ）と、老人性座瘡（ｓｅｎｉｌｅ ａｃｎｅ）と、日光（ｓｏｌａｒ）および薬品（ｍｅｄｉｃｉｎａｌ）または職業性（ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ）座瘡（ａｃｎｅ）を含むが、これらに限定されない二次ニキビ（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｃｎｅ）と、魚鱗（ｉｃｈｔｈｙｏｓｉｓ）と、魚鱗癬状態（ｉｃｈｔｈｙｏｓｉｆｏｒｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）と、ダリエ症（Ｄａｒｉｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）と、掌蹠角化症（ｐａｌｍｏｐｌａｎｔａｒ ｋｅｒａｔｏｄｅｒｍａ）と、白斑症（ｌｅｕｋｏｐｌａｋｉａ）と、白斑症様状態（ｌｅｕｋｏｐｌａｋｉｆｏｒｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）と、皮膚または粘液質（口内）脂衣類（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｏｒ ｍｕｃｏｕｓ （ｏｒａｌ） ｌｉｃｈｅｎ）と、皮膚乾癬（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、滴状乾癬（ｍｕｃｏｕｓ ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、爪乾癬（ｕｎｇｕａｌ ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、乾癬性リウマチ（ｐｓｏｒｉａｔｉｃ ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ）、皮膚アトピー（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ａｔｏｐｙ）を含むがそれに限定されず、湿疹（ｅｃｚｅｍａ）、呼吸器アトピー（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ａｔｏｐｙ）および歯肉肥大（ｇｉｎｇｉｖａｌ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ）を含み、炎症性免疫アレルギー成分を有し、細胞増殖障害を伴うか存在しない皮膚状態または痛み（ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｒ ａｆｆｌｉｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｉｍｍｕｎｏａｌｌｅｒｇｉｃ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ， ｗｉｔｈ ｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ ａ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）と、尋常性疣贅（ｃｏｍｍｏｎ ｗａｒｔｓ）、平面疣贅（ｆｌａｔ ｗａｒｔｓ）、疣贅状表皮発育異常症（ｅｐｉｄｅｒｍｏｄｙｓｐｌａｓｉａ ｖｅｒｒｕｃｉｆｏｒｍｉｓ）、口または口腔の葉状乳頭症（ｏｒａｌ ｏｒ ｆｌｏｒｉｄ ｐａｐｉｌｌｏｍａｔｏｓｅｓ）、そしてＴリンパ腫または皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｔ－ｃｅｌｌ）を含むがこれらに限定されず、ウイルスまたは非ウイルスに由来する良性または悪性皮膚または表皮の増殖と、バーソセルラーレ上皮腫（ｂａｓｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉｏｍａ）、スピノセルラーレ上皮腫（ｓｐｉｎｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉｏｍａ）含むがこれらに限定されない、紫外線によって引き起こされる増殖と、ケラトアカントーマを含むがこれらに限定されない皮膚の前癌性病変（ｐｒｅｃａｎｃｅｒｏｕｓ ｓｋｉｎ ｌｅｓｉｏｎｓ）と、全身性エリテマトーデス（ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）を含むがこれらに限定されない免疫皮膚炎（ｉｍｍｕｎｅ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｅｓ）と、水疱性免疫疾患（ｂｕｌｌｏｕｓ ｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ）と、皮膚硬化症（ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）を含むがこれらに限定されないコラーゲン疾患（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ）と、皮膚または全身状態または免疫因子を伴う痛み（ａｆｆｌｉｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）と、ＵＶ放射線曝露による皮膚障害と、光で誘発されたまたは慢性的な皮膚の老化と、化学線色素（ａｃｔｉｎｉｃ ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ）と、角化症（ｋｅｒａｔｏｓｉｓ）と、老人性乾燥（ｚｅｒｏｓｉｓ）を含むがそれに限定されない、年齢または化学線の老化（ｃｈｒｏｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｒ ａｃｔｉｎｉｃ ａｇｉｎｇ）に関連する病気と、ニキビ過多脂漏性、単純な脂漏症（ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｂｏｒｒｈｅａ）、および脂漏性皮膚炎（ａｎｄ ｓｅｂｏｒｒｈｏｅｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）を含むがこれらに限定されない皮脂機能不全（ｓｅｂａｃｅｏｕｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）と、妊娠線（ｓｔｒｅｔｃｈ ｍａｒｋｓ）を含むがこれらに限定されない瘢痕形成障害（ｃｉｃａｔｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）と、色素沈着過剰（ｈｙｐｅｒｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）、黒皮症（ｍｅｌａｓｍａ）、色素沈着減少（ｈｙｐｏｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）および白皮（ｖｉｔｉｌｉｇｏ）を含むがこれらに限定されない色素障害（ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）と、化学療法に関連する脱毛症および放射線に関連する脱毛症を含むがこれらに限定されない脱毛症（ａｌｏｐｅｃｉａ）である。
【0025】
別の実施形態で、前記疾患または障害は、神経変性脳疾患（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｂｒａｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ）または自己免疫疾患（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ）である。
【0026】
前記神経変性脳疾患は、認知症、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、パーキンソン病、ハンチントン病、軽度認知障害（ｍｉｌｄ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）、大脳アミロイド血管症、ダウン症候群、アミロイド性脳卒中（ｓｔｒｏｋｅ）、全身性アミロイドーシス、ダッチ（Ｄｕｔｃｈ）型アミロイドーシス、ニーマン・ピック病、老人性認知症、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、脊髄小脳萎縮症（Ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ Ａｔｒｏｐｈｙ）、トゥレット症候群（Ｔｏｕｒｅｔｔｅ’ｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、フリードライヒ運動失調症（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ’ ｓ Ａｔａｘｉａ）、マチャド・ジョセフ病（Ｍａｃｈａｄｏ－Ｊｏｓｅｐｈ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、レビー小体型認知症（Ｌｅｗｙ Ｂｏｄｙ Ｄｅｍｅｎｔｉａ）、ジストニア（Ｄｙｓｔｏｎｉａ）、進行性核上性麻痺（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ Ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ Ｐａｌｓｙ）、および前頭側頭型認知症（Ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ Ｄｅｍｅｎｔｉａ）からなる群から選択されるものであってもよい。
【0027】
前記自己免疫疾患は、関節リウマチ（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、皮膚炎（ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ）からなる群から選択されるものであってもよい。前記皮膚炎は、アトピー、座瘡および接触皮膚炎などを含むことができる。
【0028】
本発明者らは、イノトジオールが動物の脳に効果的に伝達されることを確認し、脳内炎症およびアミロイドベータを除去する因子として知られるＡＢＣＡ１およびＡＰＯＥ遺伝子の発現を高めることを確認し、神経変性脳疾患の予防または治療に有用に使用できることを確認した。
【0029】
また、関節炎動物モデルにおいてイノトジオールが関節炎緩和の効果があることを確認し、ＴＮＦ－αの発現を低下させることを確認し、関節炎だけでなく乾癬や皮膚炎などの自己免疫疾患の予防または治療に有用に使用できることを確認した。
【0030】
一実施形態において、イノトジオール（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）のプロドラッグは、下記の化学式１のイノトジオール化合物のヒドロキシル基と脂肪酸、グルクロン酸（ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、アルキル無水コハク酸、または、フェノール酸のカルボキシル基がエステル縮合反応によって形成されたイノトジオールのエステル誘導体化合物であり得る。
【化1】
【0031】
具体的に、前記プロドラッグは、下記の化学式２で表される化合物であり得る。
前記式で、Ｒ１およびＲ２は互いに独立して、ＯＨまたは－ＯＣ（Ｏ）－Ｒ３であり、Ｒ３は１～３０個、４～３０個、または６～３０個の炭素数を有する直線状または分枝状アルキル、アルケニル、またはアルキニル鎖であり、
Ｒ１およびＲ２のうち、少なくとも１つは－ＯＣ（Ｏ）－Ｒ３である。
【化2】
Ｒ１およびＲ２のうち、少なくとも１つは－ＯＣ（Ｏ）－Ｒ３である。
【0032】
一実施形態で、前記Ｒ３は、ＣＨ３（ＣＨ２）ａ－、またはＣＨ３（ＣＨ２）ｂ（ＣＨ＝ＣＨ［ＣＨ２］）ｃ（ＣＨ２）ｄ－を有する非置換の直線状アルキルまたはアルケニル鎖であるが、ａは８～２４の整数、ｂは１～５の整数、ｃは１～６の整数、ｄは３～７の整数である。
【0033】
本明細書において、「プロドラッグ（Ｐｒｏｄｒｕｇ）」という用語はそれ自体で生物学的に不活性であり得るが、体内でその滞留時間中に化学的／生化学的な構造改変後に有効な薬効が現れる薬物を意味することができる。すなわち、有用な薬物であるにもかかわらず、副作用、安定性、溶解性、吸収性、作用時間などで適さない性質を有していることに化学的修飾を加えて臨床使用を可能にしたものである。一実施形態に係るイノトジオール誘導体は、イノトジオールと脂肪酸とのエステル結合を介して形成された化合物であり、有機溶媒への溶解度が増加し安定性が向上しただけでなく、小腸でイノトジオールと脂肪酸に容易に分解され、小腸での吸収が容易である。例えば、前記イノトジオール誘導体は、イノトジオールとコハク酸とのエステル結合を介して形成されたものであり得る。具体的に、前記イノトジオール誘導体は、ｐ－トルエンスルホン酸触媒下でアルケニル無水コハク酸とイノトジオールとの縮合反応を行い合成することができ、アルキル無水コハク酸をイノトジオールに比べ過剰に投入して、イノトジオールの全てあるいは、少なくとも１つのヒドロキシ基にコハク酸エステル結合を誘導することができる。反応完了後、ｐ－トルエンスルホン酸を炭酸水素ナトリウムで中和して除去する。前記方法により合成されたイノトジオール誘導体化合物は、前記化学式２のＲ1及びＲ2の両方、または少なくとも１つがコハク酸エステル結合を形成して水溶性が向上したばかりでなく、エステル結合が容易に分解して小腸で容易に吸収することができる。また、他の実施形態に係るイノトジオール誘導体は、イノトジオールと脂肪酸とのエステル結合を介してイノトジオールの水溶性を増加させるだけでなく、小腸での加水分解および体内吸収度を低下させ、イノトジオール誘導体が大腸になる到達する可能性を高め、大腸内の様々な微生物によってイノトジオール誘導体が分解すると、イノトジオールの直接的な薬理作用を可能にする。例えば、前記イノトジオール誘導体は、イノトジオールとフェノール酸とのエステル結合を介して形成されたものであり得る。具体的に、前記イノトジオール誘導体は、大腸内でエステル結合が加水分解されてイノトジオールとフェノール酸を放出することにより、イノトジオールとフェノール酸それぞれの様々な生理活性が期待できる。したがって、一態様に係るプロドラッグは、イノトジオールの投与量を減らすことができるだけでなく、高濃度で摂取する時に起こり得る副作用を減少させることができる。
【0034】
前記イノトジオールのプロドラッグ誘導体は化学的／生物学的方法によって合成することができる。具体的に、前記イノトジオール誘導体は、イノトジオールと脂肪酸とのエステル化反応によって合成することができる。前記脂肪酸は、Ｃ10～Ｃ30不飽和または飽和脂肪酸であり得、Ｃ1～Ｃ10カルボン酸またはフェノール酸からなる群から選択されるものであり得る。前記不飽和脂肪酸としては、例えば、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、リノール酸、リノエライジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、ドコサヘキサエン酸などであってもよい。前記飽和脂肪酸としては、例えば、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、セロチン酸、および、ミリスチン酸などであってもよい。前記飽和カルボン酸としては、例えば、ギ酸（Ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ）、酢酸（Ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、プロピオン酸（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、酪酸（Ｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、コハク酸（ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ）などであってもよい。前記フェノール酸は、例えば、ｐ－クマル酸（ｐ－ｃｏｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ）、ケイ皮酸（ｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ）、フェルラ酸（ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ）、３，４－ジヒドロキシ安息香酸（３，４－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、ｐ－ヒドロキシ安息香酸（ｐ－ｈｙｄｒｏｘｙ ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、バニリン酸（ｖａｎｉｌｉｃ ａｃｉｄ）、コーヒー酸（ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ）、シリン酸（ｓｙｒｉｎｇｉｃ ａｃｉｄ）、シナピン酸（ｓｉｎａｐｉｎｉｃ ａｃｉｄｓ）などであってもよい。一実施形態において、前記イノトジオール誘導体は、イノトジオールと不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸およびＣ1～Ｃ10カルボン酸からなる群から選択された脂肪酸を１：１０～３０のモル比で混合して合成したものであってもよい。例えば、１：１０～３０、１：１０～２５、１：１０～２０、１：１０～１５、１：１０～１３、５：１０～３０、または５：１０～１５のモル比で混合したものであってもよい。このとき、イノトジオールおよび脂肪酸の混合割合が前記範囲未満であるか、または前記範囲を超えると、反応が十分に起こらず、イノトジオール誘導体の生成効率が低下したり、反応所要時間が長くなったりするという問題点がある。また、前記エステル化反応は、５５～６５℃で４８～９６時間反応することであり得る。このとき、エステル化反応条件が前記範囲未満であるか、または、前記範囲を超えると、反応基質である脂肪酸の完全溶解が難しく、反応がほとんど起こらないか、または、酵素活性が低下してエステル反応効率が低下し、最終産物であるイノトジオール誘導体を高収率で合成できないという問題点がある。また、前記エステル化反応が終了した後、公知の種々の蒸留方法または精製方法を通じて生成物に含まれたエステルの純度をさらに高めることができる。
【0035】
また、前記イノトジオールと脂肪酸の混合物に生物学的酵素を加えて合成することができ、前記生物学的酵素は、高効率のイノトジオール誘導体を産生するのに適した酵素として、例えばＣａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼＢ（Ｃａｎｄｉｄａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ Ｌｉｐａｓｅ Ｂ、ＣａｌＢ）であってもよい。前記Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼＢは、最終産物であるイノトジオール誘導体の収率を高めるために、一般酵素よりも固定化酵素（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｅｎｚｙｍｅ）を使用することができ、前記固定化酵素は市販製品を使用するか、通常の方法で製造して使用することができる。また、前記Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼＢは、イノトジオール１００重量部基準で４００～５００重量部を追加してイノトジオール誘導体を合成することができる。このとき、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼＢの含有量が前記範囲未満であると、エステル反応が十分に起こらずエステルを生産する効率が低いという問題点があり、前記範囲を超えると、最終産物であるイノトジオール誘導体を高収率で合成できず経済的ではないという問題点がある。
【0036】
一態様に係る薬学的組成物は、それぞれ、通常の方法に従って、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口製剤、外用剤、坐剤および滅菌注射用溶液の形態で製剤化され、使用されてもよく、製剤化のために薬学的組成物の製造に通常使用される適切な担体、賦形剤または希釈剤を含み得る。
【0037】
前記担体または賦形剤および希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油などを含む様々な化合物または混合物があげられる。
【0038】
製剤化する場合には、通常使用する充填剤、重量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて製造することができる。
【0039】
別の態様は、イノトジオール（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）、そのプロドラッグ、またはそれらの薬学的に許容可能な塩を、それを必要とする個体に投与することを含む肝臓Ｘ受容体（Ｌｉｖｅｒ―Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＬＸＲｓ）媒介疾患を予防するまたは治療する方法を提供する。
【0040】
別の態様は、イノトジオール（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）、そのプロドラッグ、またはそれらの薬学的に許容可能な塩を、肝臓Ｘ受容体（Ｌｉｖｅｒ―Ｘレセプター；ＬＸＲｓ）媒介疾患の予防または治療用組成物の製造に使用するための用途を提供する。
【0041】
前記肝臓Ｘ受容体（Ｌｉｖｅｒ―Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＬＸＲｓ）媒介疾患は上記の通りである。
【0042】
本明細書は、コレステロール逆転送を増加させるためおよび／またはアテローム性動脈硬化の進行を抑制し、軽減を促進するための方法を提供する。
【0043】
また、本明細書は 高密度リポタンパク質－コレステロール（ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＤＬ）－ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）のレベルを増加させる必要性に関連する疾患または障害を治療する方法を提供し、必要とする哺乳動物（特に、ヒト）に対する有効量のイノトジオールまたはそのプロドラッグの投与を含む。
【0044】
また、本明細書は、低密度リポタンパク質（ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ （ＬＤＬ））－コレステロールのレベルを低下させる必要性に関連する病気または障害を治療する方法を提供し、必要とする哺乳動物（特に、ヒト）に対する有効量のイノトジオールまたはそのプロドラッグの化合物の投与を含む。
【0045】
経口投与のための固形製剤は、前記イノトジオール（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）、そのプロドラッグ、またはそれらの薬学的に許容可能な塩に少なくとも１種以上の賦形剤、例えば、デンプン、ホウ酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混合して製造することができる。また、単純な賦形剤の他に、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの潤滑剤も使用することができる。
【0046】
経口用の液状製剤としては、懸濁液、内容液剤、乳剤、シロップ等があげられるが、よく使用される単純希釈剤である水、流動パラフィン以外にも種々の賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤等を含むことができる。
【0047】
非経口投与のための製剤には、滅菌水溶液、非水溶性剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、エチルオレートなどの注射可能なエステルなどを用いることができる。坐剤の基剤としては、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）２０、カカオ脂、ラウリン脂、グリセリンゼラチンなどを用いることができる。
【0048】
一態様に係る薬学的組成物の好ましい投与量は、患者の状態、体重、疾患の程度、薬物形態、投与経路および期間によって異なるが、当業者によって適切に選択することができる。しかしながら、好ましい効果のためには、１日当たり０．０００１～２，０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．００１～２，０００ｍｇ／ｋｇで投与することができる。投与は１日に１回投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。ただし、前記投与量によって本発明の範囲を限定するものではない。
【0049】
一態様に係る薬学的組成物は、ラット、マウス、家畜、ヒトなどの哺乳動物に様々な経路で投与することができる。投与のすべての方法は、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）注射によって投与することができる。
【0050】
別の態様は、イノトジオール（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）、そのプロドラッグまたはそれらの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む肝臓Ｘ受容体（Ｌｉｖｅｒ―Ｘ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＬＸＲｓ）媒介皮膚状態の予防または改善のための化粧料組成物を提供する。
【0051】
肝臓Ｘ受容体媒介皮膚状態については上記の通りである。
【0052】
前記化粧料組成物は、例えば、柔軟化粧水、栄養化粧水、マッサージクリーム、栄養クリーム、エッセンス、マスクシート、ゲル、アンプルまたは皮膚粘着タイプの化粧料製剤であることができる。
【0053】
前記化粧料組成物に含まれる成分は、有効成分として前記組成物の他にも化粧料組成物に通常用いられる成分を含むことができ、例えば、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料および香料等の従来の補助剤および担体を含むことができる。
【0054】
別の態様は、イノトジオール、そのプロドラッグ、またはそれらの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む肝臓Ｘ受容体媒介疾患の予防または改善のための健康機能食品を提供する。
【0055】
一態様に係る健康機能食品において、前記化合物を健康機能食品の添加物として使用する場合、これをそのまま添加するか、他の食品または食品成分と併用することができ、通常の方法に従って適宜使用することができる。有効成分の混合量は、予防、健康または治療などの各使用目的に応じて適切に決定することができる。
【0056】
健康機能食品の製剤は、散剤、顆粒剤、丸剤、錠剤、カプセル剤の形態だけではなく、一般食品または飲料の形態のいずれでも可能である。
【0057】
前記食品の種類には特に制限はなく、前記物質を添加できる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディー類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料水、紅茶、ドリンク剤、アルコール飲料、およびビタミン複合剤などがあり、通常の意味での食品を全て含むことができる。
【0058】
一般に、食品または飲料の製造時に、前記化合物は原料１００重量部に対して１５重量部以下、好ましくは１０重量部以下の量で添加することができる。しかし、健康および衛生を目的とするか、または健康調節を目的とする長期間の摂取の場合には、前記量は前記範囲以下であってもよく、また天然物からの分画物を用いる点で安全性の面で問題がないため、前記範囲以上の量でも使用できる。
【0059】
一態様に係る健康機能食品のうち、飲料は、通常の飲料のように、様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。上述の天然炭水化物は、グルコース、フルクトースなどの単糖類、マルトース、スクロースなどの二糖類、およびデキストリン、シクロデキストリンなどの多糖類、キシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールであり得る。甘味剤としては、タウマチン、ステビア抽出物などの天然甘味料、サッカリン、アスパルテームなどの人工甘味剤などを用いることができる。前記天然炭水化物の割合は、本発明による飲料１００ｍＬあたり約０．０１～０．０４ｇ、好ましくは約０．０２～０．０３ｇであり得る。
【0060】
上記に加えて、一態様に係る健康機能食品は、様々な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤を含有することができる。さらに、本発明の睡眠改善用組成物は、天然果物ジュース、果物ジュース飲料および野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。これらの成分は独立して、または混合して使用することができる。このような添加剤の割合は限定されないが、本発明の健康機能食品１００重量部に対して０．０１～０．１重量部の範囲から選択されることが一般的である。
【発明の効果】
【0061】
一態様に係るイノトジオール（Ｉｎｏｔｏｄｉｏｌ）、そのプロドラッグは、ＬＸＲ ｂｅｔａに特異的なアゴニスト活性を有することにより、他のＬＸＲｓアゴニストと比較して顕著な安定性を有するだけでなく、ＬＸＲｓ関連疾患、例えば神経変性脳疾患、自己免疫疾患、ＮＡＳＨ、ＮＡＦＬＤなどの治療に有用に使用できる効果がある。
【図面の簡単な説明】
【0062】
【発明を実施するための形態】
【0063】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかしながら、以下の実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるものであり、以下の実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
【実施例】
【0064】
実施例１ In vivoにおけるイノトジオールのＬＸＲｓ関連因子に及ぼす影響の分析
イノトジオールがＬＸＲｓに関連するマーカーであるＡｂｃａ１、Ｓｒｅｂｆ１＿１Ｃ、ＡＱＰ１、およびＡｐｏＥ１に及ぼす影響を分析した。
まず、４ｍｇ／ｋｇ用量投与用のイノトジオールのエマルジョンを製造した。具体的に、イノトジオールとｏｌｉｖｅ ｏｉｌ（Ｍｏｎｉｎｉ，Ｃｌａｓｓｉｃｏ ｅｘｔｒａ ｖｉｒｇｉｎ ｏｌｉｖｅ ｏｉｌ）１０％、０．５％のｔｗｅｅｎ８０、滅菌水を混合してエマルジョンを製造した。その後、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＴａｃＳａｍ（株式会社ＳＡＭＴＡＫＯ ＢＩＯ ＫＯＲＥＡ）に前記調製したエマルジョンを０．１５ｍＬずつ５日間投与した。投与５日後、マウスを安楽死させた後、脾臓、肺、肝臓、腹腔細胞試料を分離した。
次に、前記分離した試料に対してｑＰＣＲを行うために、全ＲＮＡをＢｅａｄTMＴｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＢｉｏＦＡＣＴTM）試料を用いて分離した。その後、Ａｂｃａ１、Ｓｒｅｂｆ１＿１Ｃ、ＡＱＰ１、およびＡｐｏＥ１に対するプライマーを使用し、ｑＰＣＲ用反応試薬は２Ｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＢｉｏＦＡＣＴTM）、ｑＰＣＲをするために使用した装備はＡｒｉａＭｘ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲを使用した。ｑＰＣＲの条件は９５℃１５分、９５℃２０秒、－５５℃３０秒、－７２℃０．５～１ｍｉｎ／ｋｂで５０ｃｙｃｌｅ、ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅは９５℃３０秒、－６５℃３０秒、－９５℃３０秒で1サイクル行い、相対ｍＲＮＡの発現を測定した。対照群としては無処理対照群を用い、その結果を図１～図４に示した。
図１は、一実施形態に係るイノトジオールが肝臓試料中のＬＸＲ－βに特異的なアゴニストであることを示したグラフである。
図２は、一実施形態に係るイノトジオールが脾臓試料中のＬＸＲ－βに特異的なアゴニストであることを示したグラフである。
図３は、一実施形態に係るイノトジオールが腹腔細胞試料中のＬＸＲ－βに特異的なアゴニストであることを示したグラフである。
図４は、一実施形態に係るイノトジオールが肺試料中のＬＸＲ－βに特異的なアゴニストであることを示したグラフである。
図５は、一実施形態に係るイノトジオールが胸腺試料中のＬＸＲ－βに特異的なアゴニストであることを示したグラフである。
図１～図５に示すように、一実施形態に係るイノトジオールは、いくつかの試料において、Ａｂｃａ１、ＡＱＰ１、Ｓｒｅｂｆ１、およびＡｐｏＥ１の発現を増加させることがわかった。
これらの結果は、イノトジオールがＬＸＲｓとの結合によって関連遺伝子であるＡｂｃａ１、ＡＱＰ１、Ｓｒｅｂｆ１、およびＡｐｏＥ１の転写調節機能を活性化することを意味する。
また、肝臓では一般にＬＸＲ－αが多く発現され、ＬＸＲ－βは少なく発現することが知られている。したがって、肝臓試料中の前記マーカーのうち、ＬＸＲ－αによって特異的に調節されるＳｒｅｂｆ１発現の有意な増加はなく、ＬＸＲ－βによって調節されるＡＱＰ１有意な発現の増大を示したものであることを鑑みると、ＬＸＲ－αにはよく結合できずＬＸＲ－βにさらに特異的に結合してアゴニストとして作用することが分かる。
したがって、これらの結果は、イノトジオールがＬＸＲｓ媒介疾患、例えば、アテローム性動脈硬化、アルツハイマー病、ＮＡＳＨ、ＮＡＦＬＤ、代謝性疾患、皮膚炎などの治療に有用に使用できることを意味するだけでなく、ＬＸＲ－βに特異的であるため、他のＬＸＲｓアゴニストに対する安全性が確保されていることを意味する。
イノトジオールがＬＸＲｓに関連するマーカーであるＡｂｃａ１、Ｓｒｅｂｆ１＿１Ｃ、ＡＱＰ１、およびＡｐｏＥ１に及ぼす影響を分析した。
まず、４ｍｇ／ｋｇ用量投与用のイノトジオールのエマルジョンを製造した。具体的に、イノトジオールとｏｌｉｖｅ ｏｉｌ（Ｍｏｎｉｎｉ，Ｃｌａｓｓｉｃｏ ｅｘｔｒａ ｖｉｒｇｉｎ ｏｌｉｖｅ ｏｉｌ）１０％、０．５％のｔｗｅｅｎ８０、滅菌水を混合してエマルジョンを製造した。その後、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＴａｃＳａｍ（株式会社ＳＡＭＴＡＫＯ ＢＩＯ ＫＯＲＥＡ）に前記調製したエマルジョンを０．１５ｍＬずつ５日間投与した。投与５日後、マウスを安楽死させた後、脾臓、肺、肝臓、腹腔細胞試料を分離した。
次に、前記分離した試料に対してｑＰＣＲを行うために、全ＲＮＡをＢｅａｄTMＴｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＢｉｏＦＡＣＴTM）試料を用いて分離した。その後、Ａｂｃａ１、Ｓｒｅｂｆ１＿１Ｃ、ＡＱＰ１、およびＡｐｏＥ１に対するプライマーを使用し、ｑＰＣＲ用反応試薬は２Ｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＢｉｏＦＡＣＴTM）、ｑＰＣＲをするために使用した装備はＡｒｉａＭｘ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲを使用した。ｑＰＣＲの条件は９５℃１５分、９５℃２０秒、－５５℃３０秒、－７２℃０．５～１ｍｉｎ／ｋｂで５０ｃｙｃｌｅ、ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅは９５℃３０秒、－６５℃３０秒、－９５℃３０秒で1サイクル行い、相対ｍＲＮＡの発現を測定した。対照群としては無処理対照群を用い、その結果を図１～図４に示した。
図１は、一実施形態に係るイノトジオールが肝臓試料中のＬＸＲ－βに特異的なアゴニストであることを示したグラフである。
図２は、一実施形態に係るイノトジオールが脾臓試料中のＬＸＲ－βに特異的なアゴニストであることを示したグラフである。
図３は、一実施形態に係るイノトジオールが腹腔細胞試料中のＬＸＲ－βに特異的なアゴニストであることを示したグラフである。
図４は、一実施形態に係るイノトジオールが肺試料中のＬＸＲ－βに特異的なアゴニストであることを示したグラフである。
図５は、一実施形態に係るイノトジオールが胸腺試料中のＬＸＲ－βに特異的なアゴニストであることを示したグラフである。
図１～図５に示すように、一実施形態に係るイノトジオールは、いくつかの試料において、Ａｂｃａ１、ＡＱＰ１、Ｓｒｅｂｆ１、およびＡｐｏＥ１の発現を増加させることがわかった。
これらの結果は、イノトジオールがＬＸＲｓとの結合によって関連遺伝子であるＡｂｃａ１、ＡＱＰ１、Ｓｒｅｂｆ１、およびＡｐｏＥ１の転写調節機能を活性化することを意味する。
また、肝臓では一般にＬＸＲ－αが多く発現され、ＬＸＲ－βは少なく発現することが知られている。したがって、肝臓試料中の前記マーカーのうち、ＬＸＲ－αによって特異的に調節されるＳｒｅｂｆ１発現の有意な増加はなく、ＬＸＲ－βによって調節されるＡＱＰ１有意な発現の増大を示したものであることを鑑みると、ＬＸＲ－αにはよく結合できずＬＸＲ－βにさらに特異的に結合してアゴニストとして作用することが分かる。
したがって、これらの結果は、イノトジオールがＬＸＲｓ媒介疾患、例えば、アテローム性動脈硬化、アルツハイマー病、ＮＡＳＨ、ＮＡＦＬＤ、代謝性疾患、皮膚炎などの治療に有用に使用できることを意味するだけでなく、ＬＸＲ－βに特異的であるため、他のＬＸＲｓアゴニストに対する安全性が確保されていることを意味する。
【0065】
実施例２ In vivoにおけるイノトジオールの安全性分析
前記実施例１と同様に、イノトジオールが安全性の確保されたＬＸＲ－βアゴニストであることを確認するためにマウスにおける肝毒性評価を行った。イノトジオールがＬＸＲ－αのアゴニストになる場合、肝臓でＳｒｅｂｆ１を過剰発現して脂肪肝を誘導することになる。マウスへの２週間毒性実験を通して、イノトジオールのＬＸＲｓの選択性と安全性を評価した。
具体的に、雌雄ＩＣＲマウスを用いて前記イノトジオールエマルジョンを０．０ｍｇ／ｋｇ（群１）、５．０ｍｇ／ｋｇ（群２）、２０ｍｇ／ｋｇ（群３）で毎日１回、２週間経口投与した。ちなみに喘息、食品アレルギー治療などのためのイノトジオールの適正投与濃度は４．５～５．０ｍｇ／ｋｇと予測されている。対照群には１００％オリーブオイルを投与した。実験に用いた全ての個体は健康異常の兆候が見られなかったもので、すべての生きている動物に対して投与してから１５日後に、イソフルランで麻酔したうえで安楽死させた後、肝臓組織を単離して、総脂肪含量を分析しており、その結果を下記の表１に示した。イノトジオールは、表１にまとめたように、５ｍｇ／ｋｇ用量はもちろん、２０ｍｇ／ｋｇ用量でも、雌雄マウスの肝臓での総脂肪含量に有意な変化は見られなかった。
前記実施例１と同様に、イノトジオールが安全性の確保されたＬＸＲ－βアゴニストであることを確認するためにマウスにおける肝毒性評価を行った。イノトジオールがＬＸＲ－αのアゴニストになる場合、肝臓でＳｒｅｂｆ１を過剰発現して脂肪肝を誘導することになる。マウスへの２週間毒性実験を通して、イノトジオールのＬＸＲｓの選択性と安全性を評価した。
具体的に、雌雄ＩＣＲマウスを用いて前記イノトジオールエマルジョンを０．０ｍｇ／ｋｇ（群１）、５．０ｍｇ／ｋｇ（群２）、２０ｍｇ／ｋｇ（群３）で毎日１回、２週間経口投与した。ちなみに喘息、食品アレルギー治療などのためのイノトジオールの適正投与濃度は４．５～５．０ｍｇ／ｋｇと予測されている。対照群には１００％オリーブオイルを投与した。実験に用いた全ての個体は健康異常の兆候が見られなかったもので、すべての生きている動物に対して投与してから１５日後に、イソフルランで麻酔したうえで安楽死させた後、肝臓組織を単離して、総脂肪含量を分析しており、その結果を下記の表１に示した。イノトジオールは、表１にまとめたように、５ｍｇ／ｋｇ用量はもちろん、２０ｍｇ／ｋｇ用量でも、雌雄マウスの肝臓での総脂肪含量に有意な変化は見られなかった。
【表1】
【0066】
実施例３ Ｉｎ ｖｉｖｏにおいて血液及び脳組織におけるイノトジオール濃度の分析
マウスにイノトジオールを投与したとき、マウスの血液および脳組織で検出されるイノトジオール濃度を分析した。
具体的に、７週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを供給され、１週間の浄化後、グループ当たり４匹ずつ割り当てて実験した。イノトジオールを投与しなかった対照群４群と、イノトジオールを投与した４群に分けた。イノトジオールを投与した群は、イノトジオールを１０日間４．５ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与した。１１日目に対照群とイノトジオール投与群のマウスを犠牲にして血液と脳組織試料を準備した。
まず、血液中のイノトジオール濃度を分析するために、２０μＬの血清を１．５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移した後、イノトジオールをエタノールで２回抽出した。各抽出ステップにおいて、２００μＬのエタノールを血清と混合し、混合物を１０分間超音波処理した後、１４０００ｘｇで１５分間遠心分離を行った。
脳組織中のイノトジオール濃度を分析するために、脳重量を測定し、１０倍（ｖ／ｗ）の１００％エタノールと混合した後、混合物を超音波処理し、遠心分離を行った。
遠心分離後、各残渣をＣ１８カートリッジ（Ｓｅｐ－Ｐａｋ Ｃ１８ ３ｃｃ Ｖａｃ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ、２００ｍｇ Ｓｏｒｂｅｎｔ ｐｅｒ、Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いて固相抽出のために０．５ｍＬの６０％メタノールで再構成した。サンプルをカートリッジにロードし、メタノール（６ｍＬ）を用いて活性化し、次いで６０％メタノール（６ｍＬ）で調整した。次いでカートリッジを６ｍＬの６０％メタノールで洗浄した。次いでガラス管に１００％メタノール（３ｍＬ）でカートリッジを溶出してイノトジオールを回収した。試料を蒸発させた後、残渣をメタノールに溶解してＬＣ／ＭＳ分析を行った。
その結果、表２に示すように、対照群では脳組織および血液においてイノトジオールが検出されず、イノトジオールを投与した群ではイノトジオールが脳組織で平均１５１．７±２１．３ｎｇ／ｇが、血液で平均１２．１±１．３ｎｇ／ｇが検出され、脳内の血液と比較してイノトジオールが約１２倍高く検出されたことを確認した。
これらの結果は、イノトジオールが動物の脳に効果的に送達されることを示している。
マウスにイノトジオールを投与したとき、マウスの血液および脳組織で検出されるイノトジオール濃度を分析した。
具体的に、７週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを供給され、１週間の浄化後、グループ当たり４匹ずつ割り当てて実験した。イノトジオールを投与しなかった対照群４群と、イノトジオールを投与した４群に分けた。イノトジオールを投与した群は、イノトジオールを１０日間４．５ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与した。１１日目に対照群とイノトジオール投与群のマウスを犠牲にして血液と脳組織試料を準備した。
まず、血液中のイノトジオール濃度を分析するために、２０μＬの血清を１．５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移した後、イノトジオールをエタノールで２回抽出した。各抽出ステップにおいて、２００μＬのエタノールを血清と混合し、混合物を１０分間超音波処理した後、１４０００ｘｇで１５分間遠心分離を行った。
脳組織中のイノトジオール濃度を分析するために、脳重量を測定し、１０倍（ｖ／ｗ）の１００％エタノールと混合した後、混合物を超音波処理し、遠心分離を行った。
遠心分離後、各残渣をＣ１８カートリッジ（Ｓｅｐ－Ｐａｋ Ｃ１８ ３ｃｃ Ｖａｃ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ、２００ｍｇ Ｓｏｒｂｅｎｔ ｐｅｒ、Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いて固相抽出のために０．５ｍＬの６０％メタノールで再構成した。サンプルをカートリッジにロードし、メタノール（６ｍＬ）を用いて活性化し、次いで６０％メタノール（６ｍＬ）で調整した。次いでカートリッジを６ｍＬの６０％メタノールで洗浄した。次いでガラス管に１００％メタノール（３ｍＬ）でカートリッジを溶出してイノトジオールを回収した。試料を蒸発させた後、残渣をメタノールに溶解してＬＣ／ＭＳ分析を行った。
その結果、表２に示すように、対照群では脳組織および血液においてイノトジオールが検出されず、イノトジオールを投与した群ではイノトジオールが脳組織で平均１５１．７±２１．３ｎｇ／ｇが、血液で平均１２．１±１．３ｎｇ／ｇが検出され、脳内の血液と比較してイノトジオールが約１２倍高く検出されたことを確認した。
これらの結果は、イノトジオールが動物の脳に効果的に送達されることを示している。
【表2】
【0067】
実施例４ In vivoにおいて脳組織における神経変性脳疾患関連の遺伝子発現解析
マウスにイノトジオールを投与したとき、脳組織における神経変性脳疾患関の連遺伝子であるＡＢＣＡ１およびＡＰＯＥの発現を分析した。
具体的に、前記実施例３と同様に、対照群およびイノトジオール投与群マウスを準備した後、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出するために、まず５０ｍｇの脳組織サンプルを計ってから、次に乳鉢を用いて細胞を粉砕した。粉砕した試料に１ｍＬのトリゾールを分注し、ボルテックスで混合した。次いで０．２ｍＬのクロロホルムを分注した後、室温で３分間反応させた。１２，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離した後、透明な 上澄みのみを新しいチューブに移し、次いで０．５ｍＬのイソプロピルアルコールを分注してから、室温に１０分間反応させた。１２，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した後、上澄み液を全て除去し、１ｍＬの７５％エタノールを用いて不純物を除去した。７，５００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した後、７５％エタノールを加えた後、遠心分離を行い、上澄み液をできるだけ除去した後、５５℃のヒートブロックで約５分間乾燥した。ＤＥＰＣ ｗａｔｅｒを用いてサンプルを溶かした後、Ｎａｎｏｄｒｏｐを用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを１０００ｎｇ／ｕＬに定量した後、ｐｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ Ｋｏｒｅａ）を用いてｃＤＮＡ合成を進行した。Ｓｍａｒｔｇｅｎｅ Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ Ｑ－ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（サムジョンバイオサイエンス）とＡＰＯＥ遺伝子およびＡＢＣＡ１遺伝子に特異的なプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。
その結果、図６に示すように、イノトジオールを投与した群（Ｉｎｏ（１０ｍｐｋ））がイノトジオールを投与しなかった対照群（Ｎａｉｖｅ）に比べて脳組織においてＡＢＣＡ１およびＡＰＯＥ遺伝子が高く発現された。ＡＢＣＡ１はＡＰＯＥを活性化し、脳内炎症を抑制することが知られており、ＡＰＯＥの活性化はアミロイドベータを除去することが知られている。
図６は、一実施形態によるイノトジオールが神経変性脳疾患の抑制関連遺伝子の発現を高めることを確認したグラフである。
図６Ａは、一実施形態によるイノトジオールが神経変性脳疾患の抑制関連遺伝子であるＡＢＣＡ１の発現を高めることを確認したグラフであり、図６Ｂは、一実施形態によるイノトジオールが神経変性脳疾患の抑制関連遺伝子であるＡＰＯＥの発現を高めることを確認したグラフである。
したがって、これらの結果は、イノトジオールがアミロイドベータの排出と分解を促進し、ミクログリア細胞（Ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ）の炎症反応を下げる効果があることを示し、これはイノトジオールが神経変性脳疾患の治療に有用に使用できるあることを示す。
マウスにイノトジオールを投与したとき、脳組織における神経変性脳疾患関の連遺伝子であるＡＢＣＡ１およびＡＰＯＥの発現を分析した。
具体的に、前記実施例３と同様に、対照群およびイノトジオール投与群マウスを準備した後、ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出するために、まず５０ｍｇの脳組織サンプルを計ってから、次に乳鉢を用いて細胞を粉砕した。粉砕した試料に１ｍＬのトリゾールを分注し、ボルテックスで混合した。次いで０．２ｍＬのクロロホルムを分注した後、室温で３分間反応させた。１２，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離した後、透明な 上澄みのみを新しいチューブに移し、次いで０．５ｍＬのイソプロピルアルコールを分注してから、室温に１０分間反応させた。１２，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した後、上澄み液を全て除去し、１ｍＬの７５％エタノールを用いて不純物を除去した。７，５００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した後、７５％エタノールを加えた後、遠心分離を行い、上澄み液をできるだけ除去した後、５５℃のヒートブロックで約５分間乾燥した。ＤＥＰＣ ｗａｔｅｒを用いてサンプルを溶かした後、Ｎａｎｏｄｒｏｐを用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを１０００ｎｇ／ｕＬに定量した後、ｐｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ Ｋｏｒｅａ）を用いてｃＤＮＡ合成を進行した。Ｓｍａｒｔｇｅｎｅ Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ Ｑ－ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（サムジョンバイオサイエンス）とＡＰＯＥ遺伝子およびＡＢＣＡ１遺伝子に特異的なプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。
その結果、図６に示すように、イノトジオールを投与した群（Ｉｎｏ（１０ｍｐｋ））がイノトジオールを投与しなかった対照群（Ｎａｉｖｅ）に比べて脳組織においてＡＢＣＡ１およびＡＰＯＥ遺伝子が高く発現された。ＡＢＣＡ１はＡＰＯＥを活性化し、脳内炎症を抑制することが知られており、ＡＰＯＥの活性化はアミロイドベータを除去することが知られている。
図６は、一実施形態によるイノトジオールが神経変性脳疾患の抑制関連遺伝子の発現を高めることを確認したグラフである。
図６Ａは、一実施形態によるイノトジオールが神経変性脳疾患の抑制関連遺伝子であるＡＢＣＡ１の発現を高めることを確認したグラフであり、図６Ｂは、一実施形態によるイノトジオールが神経変性脳疾患の抑制関連遺伝子であるＡＰＯＥの発現を高めることを確認したグラフである。
したがって、これらの結果は、イノトジオールがアミロイドベータの排出と分解を促進し、ミクログリア細胞（Ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ）の炎症反応を下げる効果があることを示し、これはイノトジオールが神経変性脳疾患の治療に有用に使用できるあることを示す。
【0068】
実施例５ In vivoにおいてイノトジオールの関節リウマチおよび乾癬治療効果の同定
マウスにイノトジオールを投与したときに、関節リウマチの治療効果があることを確認するために、雄ＤＢＡ／１Ｊマウスにｂｏｖｉｎｅ ｔｙｐｅ ＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎを投与して関節炎を誘発させた後、イノトジオールを経口投与した。
具体的に、６日間の浄化期間後、Ｂｏｖｉｎｅ ｔｙｐｅ ＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ（０．０５ ｍｏｌ／Ｌ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ中２ｍｇ／ｍＬ；Ｃｈｏｎｄｒｅｘ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）に同量のｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ，Ｉｎｃ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．)を徐々に混合しながら同時にホモジェナイザーを用いてエマルジョンを調製した後、使い捨て注射器を用いてマウスの尾の皮下に０．０５ｍＬ／匹ずつ投与する方法で２回目の免疫化まで行って、関節炎を誘発した。
関節炎を誘発しなかった動物に対して健康状態に異常がなく、平均体重に近い６匹を選抜して正常対照群とし、関節炎を誘発した動物に対して健康状態に異常がなく、平均体重に近い１８匹を選抜して各群の平均体重が均等になるように、各群当たり６匹ずつ群分離した。関節炎を誘発した動物は、イノトジオールを投与しなかった群、イノトジオール４ｍｇ／ｋｇ投与群、イノトジオール１０ｍｇ／ｋｇ投与群に分けた。投与は経口投与用ゾンデが付着した使い捨て注射器を用いて投与開始日から１回／日、４週間、合計２８回、胃内に強制投与した。
関節炎症状に対する肉眼的観察は、投与開始日から２回／週、４週間行った。各動物の全ての脚の膝、足首および足の甲部位を肉眼的に観察し、下記表３の肉眼的関節炎指数（ｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｃ ｉｎｄｅｘ）評価基準に基づいて関節炎指数を記録した。各動物の全ての脚の関節炎指数を合計して、各個体の肉眼的関節炎スコア（ｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｃ ｓｃｏｒｅ、最大スコア＝１６）を算出した。
その結果、図７に示すように、イノトジオールが投与されていない関節炎動物に比べて、イノトジオールが投与された関節炎動物において関節炎スコアがより低いことを確認した。
図７は、一実施形態によるイノトジオールが関節リウマチに効果があることを示すリウマチ関節炎スコア（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｃ ｓｃｏｒｅ）グラフである。
マウスにイノトジオールを投与したときに、関節リウマチの治療効果があることを確認するために、雄ＤＢＡ／１Ｊマウスにｂｏｖｉｎｅ ｔｙｐｅ ＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎを投与して関節炎を誘発させた後、イノトジオールを経口投与した。
具体的に、６日間の浄化期間後、Ｂｏｖｉｎｅ ｔｙｐｅ ＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ（０．０５ ｍｏｌ／Ｌ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ中２ｍｇ／ｍＬ；Ｃｈｏｎｄｒｅｘ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）に同量のｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ，Ｉｎｃ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．)を徐々に混合しながら同時にホモジェナイザーを用いてエマルジョンを調製した後、使い捨て注射器を用いてマウスの尾の皮下に０．０５ｍＬ／匹ずつ投与する方法で２回目の免疫化まで行って、関節炎を誘発した。
関節炎を誘発しなかった動物に対して健康状態に異常がなく、平均体重に近い６匹を選抜して正常対照群とし、関節炎を誘発した動物に対して健康状態に異常がなく、平均体重に近い１８匹を選抜して各群の平均体重が均等になるように、各群当たり６匹ずつ群分離した。関節炎を誘発した動物は、イノトジオールを投与しなかった群、イノトジオール４ｍｇ／ｋｇ投与群、イノトジオール１０ｍｇ／ｋｇ投与群に分けた。投与は経口投与用ゾンデが付着した使い捨て注射器を用いて投与開始日から１回／日、４週間、合計２８回、胃内に強制投与した。
関節炎症状に対する肉眼的観察は、投与開始日から２回／週、４週間行った。各動物の全ての脚の膝、足首および足の甲部位を肉眼的に観察し、下記表３の肉眼的関節炎指数（ｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｃ ｉｎｄｅｘ）評価基準に基づいて関節炎指数を記録した。各動物の全ての脚の関節炎指数を合計して、各個体の肉眼的関節炎スコア（ｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｃ ｓｃｏｒｅ、最大スコア＝１６）を算出した。
【表3】
その結果、図７に示すように、イノトジオールが投与されていない関節炎動物に比べて、イノトジオールが投与された関節炎動物において関節炎スコアがより低いことを確認した。
図７は、一実施形態によるイノトジオールが関節リウマチに効果があることを示すリウマチ関節炎スコア（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｃ ｓｃｏｒｅ）グラフである。
【0069】
次に、炎症を活性化する因子であるＴＮＦ－α発現を確認した。
具体的に、マウスＴＮＦ－αと特異的に結合することができる一次抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）をｃｏａｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒに希釈して０．５～８μg／ｍＬの濃度でプレートに１００μｌ分注した後、次いで４℃で18時間保存した。その後、ｃｏａｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを除去した後、ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ）を２００μＬずつ３回、ｗａｓｈｉｎｇを行った。非特異的結合を防ぐために、２００μＬのｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）を１時間常温で反応させた。ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを用いて３回、ｗａｓｈｉｎｇを行った。標準物質（Ｂｉｏｌｇｅｎｄ）とサンプルは、ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて希釈した後、１００μＬをそれぞれ分注した後、２～４時間常温に反応させた。ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを用いて３回、ｗａｓｈｉｎｇを行った。二次抗体（ｂｉｏｔｉｎ－ｌａｂｅｌｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）は、ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて0．２５～２ｕｇ／ｍＬに希釈し、１００μｌの分注後、1時間常温で反応させた。ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを用いて３回、ｗａｓｈｉｎｇを行った。Ａｖｉｄｉｎ－Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）は、ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて１/１０００倍希釈した後、１００μＬ分注した後、常温で３０分反応させる。ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを用いて５回、ｗａｓｈｉｎｇを行った。ＴＭＢ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を１００μＬ分注し、４～３０分反応させ、色の変化が起こったら、２Ｎ Ｈ2ＳＯ4を１００ｕＬ分注して反応を停止させた。ＥＬＩＳＡプレートは、ＥＰＯＣＨマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）を用いて４５０ｎｍで確認した。
その結果、図８に示すように、イノトジオールが投与された関節炎動物においてＴＮＦ－αがより低く発現することを確認した。
図８は、一実施形態によるイノトジオールがＴＮＦ―α発現を抑制することを示すグラフである。
上記の結果は、イノトジオールが関節リウマチの治療だけでなく、乾癬の治療にも有用に使用できることを示している。
具体的に、マウスＴＮＦ－αと特異的に結合することができる一次抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）をｃｏａｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒに希釈して０．５～８μg／ｍＬの濃度でプレートに１００μｌ分注した後、次いで４℃で18時間保存した。その後、ｃｏａｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを除去した後、ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ）を２００μＬずつ３回、ｗａｓｈｉｎｇを行った。非特異的結合を防ぐために、２００μＬのｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）を１時間常温で反応させた。ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを用いて３回、ｗａｓｈｉｎｇを行った。標準物質（Ｂｉｏｌｇｅｎｄ）とサンプルは、ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて希釈した後、１００μＬをそれぞれ分注した後、２～４時間常温に反応させた。ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを用いて３回、ｗａｓｈｉｎｇを行った。二次抗体（ｂｉｏｔｉｎ－ｌａｂｅｌｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）は、ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて0．２５～２ｕｇ／ｍＬに希釈し、１００μｌの分注後、1時間常温で反応させた。ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを用いて３回、ｗａｓｈｉｎｇを行った。Ａｖｉｄｉｎ－Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）は、ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて１/１０００倍希釈した後、１００μＬ分注した後、常温で３０分反応させる。ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒを用いて５回、ｗａｓｈｉｎｇを行った。ＴＭＢ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を１００μＬ分注し、４～３０分反応させ、色の変化が起こったら、２Ｎ Ｈ2ＳＯ4を１００ｕＬ分注して反応を停止させた。ＥＬＩＳＡプレートは、ＥＰＯＣＨマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）を用いて４５０ｎｍで確認した。
その結果、図８に示すように、イノトジオールが投与された関節炎動物においてＴＮＦ－αがより低く発現することを確認した。
図８は、一実施形態によるイノトジオールがＴＮＦ―α発現を抑制することを示すグラフである。
上記の結果は、イノトジオールが関節リウマチの治療だけでなく、乾癬の治療にも有用に使用できることを示している。
【0070】
上述した本発明の説明は例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく他の具体的な形態に容易に変形が可能であることが理解できるだろう。したがって、以上で説明した実施形態はすべての点で例示的なものであり、限定的なものではないと理解すべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8】