特許7539369病態情報生成方法、病態情報生成システム、ＨＥ４糖鎖分析キット及びＨＥ４
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-15
(45)【発行日】2024-08-23
(54)【発明の名称】病態情報生成方法、病態情報生成システム、ＨＥ４糖鎖分析キット及びＨＥ４
(51)【国際特許分類】
G01N 33/574 20060101AFI20240816BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240816BHJP
G01N 33/533 20060101ALI20240816BHJP
C07K 14/42 20060101ALN20240816BHJP
【ＦＩ】
G01N33/574 A
G01N33/53 V
G01N33/533
C07K14/42
【請求項の数】
23
(21)【出願番号】P 2021511506
(86)(22)【出願日】2020-03-24
(86)【国際出願番号】 JP2020013080
(87)【国際公開番号】W WO2020203478
(87)【国際公開日】2020-10-08
【審査請求日】2023-01-12
(31)【優先権主張番号】P 2019070727
(32)【優先日】2019-04-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000206956
【氏名又は名称】大塚製薬株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(74)【代理人】
【識別番号】100165892
【弁理士】
【氏名又は名称】坂田 啓司
(72)【発明者】
【氏名】乾 智惠
(72)【発明者】
【氏名】金子 智典
(72)【発明者】
【氏名】彼谷 高敏
【審査官】三木 隆
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１０／０９０２６４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】ZHUANG Huiyu et al.，Overexpression of Lewis y antigen promotes human epididymis protein 4-mediated invasion and metastasis of ovarian cancer cells，Biochimie，2014年，Vol.105，Page.91-98
【文献】マーク・Ｋ・成松，フコース転移酵素ファミリー，2001年05月15日，https://www.glycoforum.gr.jp/glycoword/ glycoprotein/GPB02J.html
【文献】乾智惠等，表面プラズモン共鳴励起増強蛍光分光(SPFS)を用いた卵巣癌糖鎖マーカーの開発，Konica Minolta Technology Report，2020年01月，Vol.17，Page.76-80
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／５７４
Ｇ０１Ｎ ３３／５３
Ｇ０１Ｎ ３３／５３３
Ｃ０７Ｋ １４／４２
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
卵巣癌の罹患又は発症の診断のためにＨＥ４の糖鎖を分析する方法であって、被検試料に含まれる、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、α２，３－シアル酸残基、α２，６－シアル酸残基又はマンノース残基の４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に関する情報を取得する第１工程を含み、及び
前記被験試料が、血液、血清、又は血漿である、分析方法。
【請求項2】
前記第１工程が、質量分析法又は前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のある第１物質と前記被検試料とを接触させる方法により、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に関する情報を測定する工程である、請求項１に記載の分析方法。
【請求項3】
さらに、前記被検試料に含まれる前記全てのＨＥ４の前記総量に対する前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量の比率を算出する第２工程を含む、請求項１又は２に記載の分析方法。
【請求項4】
さらに、前記４種の残基を有するＨＥ４に拘わらず、前記被検試料に含まれる全てのＨＥ４の総量を取得する第３工程を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項5】
前記第３工程が、質量分析法、クロマトグラフィー又はＨＥ４のポリペプチド鎖部分と親和性のある第２物質と前記被検試料とを接触させる方法により、前記ＨＥ４の総量を測定する工程である、請求項１～４のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項6】
前記第１工程を、前記第３工程の前に行う、請求項４又は５に記載の分析方法。
【請求項7】
前記第１工程が、前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のある第１物質と、前記被検試料とを接触させる方法により、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量を測定する工程であり、前記第１物質が、前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のあるレクチン又は抗体である、請求項６に記載の分析方法。
【請求項8】
前記第１物質が、前記４種の残基のいずれかを有する前記ＨＥ４と親和性のあるレクチンであり、ＣｏｎＡ、フジレクチン、ＳＳＡ又はＭＡＭのいずれかのレクチンである、請求項７に記載の分析方法。
【請求項9】
前記第１物質が、支持体に固定化されており、前記第３工程が、ＨＥ４のポリペプチド鎖部分と親和性のある第２物質と、前記被検試料とを接触させる方法により、前記全てのＨＥ４の前記総量を測定する工程であり、
前記第２物質が、前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のある抗体である、請求項７又は８に記載の分析方法。
【請求項10】
前記第１工程が、クロマトグラフィーによる工程である、請求項６～９のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項11】
前記第３工程を、前記第１工程の前に行う、請求項４又は５に記載の分析方法。
【請求項12】
前記第２物質が、支持体に固定されており、前記第１工程が、前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のある第１物質と、前記被検試料とを接触させる方法により、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量を測定する工程であり、
前記第１物質が、前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のあるレクチンであり、
前記第１物質が、蛍光体により標識されており、
前記第１工程は、前記第２物質に捕捉されたＨＥ４と結合した前記第１物質を標識する蛍光体から発せられた蛍光の強度を測定し、前記蛍光の強度に基づき、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量を算出する工程である、請求項１１に記載の分析方法。
【請求項13】
前記第３工程において、質量分析法又はクロマトグラフィーにより得られたピークの強度と、予め決定された基準となるピークの強度とを比較する、請求項１１に記載の分析方法。
【請求項14】
前記β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、前記α２，３－シアル酸残基、前記α２，６－シアル酸残基又は前記マンノース残基の４種の残基のうちのいずれかの残基が、ＨＥ４の糖鎖の（非還元）末端にある、請求項１～１３のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項15】
卵巣癌の罹患又は発症に関する情報を生成する病態情報生成システムであって、被検試料に含まれる、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、α２，３－シアル酸残基、α２，６－シアル酸残基又はマンノース残基の４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に関する情報を取得する第１工程部と、
前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に基づき、前記被検試料に係る被検者の卵巣癌の罹患又は発症に関する情報を生成する第２工程部と、
を有し、及び
前記被験試料が、血液、血清、又は血漿である、病態情報生成システム。
【請求項16】
糖鎖を有するＨＥ４及び抗ＨＥ４抗体を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の分析方法を実施するためのＨＥ４糖鎖分析キット。
【請求項17】
前記糖鎖の（非還元）末端にβ－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、α２，３－シアル酸残基、α２，６－シアル酸残基又はマンノース残基を有するＨＥ４と親和性のある物質及び抗ＨＥ４抗体を含む、請求項１６に記載の分析キット。
【請求項18】
前記ＨＥ４と親和性のある物質が、レクチンである、請求項１７に記載の分析キット。
【請求項19】
前記レクチンと、抗ＨＥ４抗体と、分析用基板とを組み合わせた構成である、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の分析キット。
【請求項20】
前記レクチンが、蛍光体を備え付けている、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の分析キット。
【請求項21】
蛍光体を備え付けた、フジレクチン又はＭＡＭの少なくとも一種のレクチンを含む、請求項１６～２０のいずれか一項に記載の分析キット。
【請求項22】
さらに、クロマトグラフィー装置を含む、請求項１６～２１のいずれか一項に記載の分析キット。
【請求項23】
さらに、クロマトグラフィー測定のためのラベル化試薬を含む、請求項２２に記載の分析キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、病態情報生成方法、病態情報生成システム、ＨＥ４糖鎖分析キット及びＨＥ４に関する。より詳しくは、卵巣癌などの癌の悪性度を、簡便かつ非侵襲的な方法で評価することで、患者及び医師の負担を軽減した診断を可能とする病態情報生成方法等に関する。
【背景技術】
【0002】
卵巣癌は、婦人科癌の中では乳癌に次いで発生率が高い癌である。卵巣癌は、発症初期段階の自覚症状がほとんどないことから早期発見が困難であり、発見時には既に症状が進行していることが多い。それ故、予後は不良であり、婦人科癌の中では最も死亡率が高い致命的な婦人科悪性腫瘍である。
大多数の卵巣腫瘍は良性であり、悪性と良性を鑑別することは治療方針を決定するうえで重要である。卵巣癌の診断においては、問診及び内診に加え、ＣＡ１２５を中心とした腫瘍マーカー測定、経膣超音波断層法検査、ＭＲＩ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ：磁気共鳴画像法）検査並びにＣＴ（Ｃｏｍｐｕｔｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ：コンピューター断層撮影法）検査が必要に応じて実施される。
大多数の卵巣腫瘍は良性であり、悪性と良性を鑑別することは治療方針を決定するうえで重要である。卵巣癌の診断においては、問診及び内診に加え、ＣＡ１２５を中心とした腫瘍マーカー測定、経膣超音波断層法検査、ＭＲＩ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ：磁気共鳴画像法）検査並びにＣＴ（Ｃｏｍｐｕｔｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ：コンピューター断層撮影法）検査が必要に応じて実施される。
【0003】
ＣＡ１２５は卵巣癌の診断に最もよく使用されている腫瘍マーカーであるが、子宮内膜症等の良性疾患、月経、妊娠、胸腹膜の炎症性疾患でも値の上昇が認められており、卵巣腫瘍の悪性と良性の鑑別において十分な特異性を有するとは言えないため、より有用な新規マーカーや分析方法の開発と臨床応用が期待されてきた。
【0004】
一方、卵巣癌患者の血清中に高濃度で検出され、病期進行に伴い上昇が認められるヒト精巣上体タンパク４（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｉｄｙｍｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ４：以下において、「ＨＥ４」と略称する。）は、ＷＡＰ（Ｗｈｅｙ Ａｃｉｄｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ）ファミリーに属し，ＷＦＤＣ２（ＷＡＰ Ｆｏｕｒ－Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｃｏｒｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２）とも呼ばれる分子量約２５ｋＤａの分泌型糖タンパク質であり、精巣上体遠位の上皮細胞で発見されたことからこの名が付けられた。
成熟型ヒトＨＥ４は，２つのＷＡＰドメインが繋がった構造をしているが，スプライシングにより１番目又は２番目のＷＡＰドメインが欠落し、１０個、２２個、又は２８個のアミノ酸で置換された複数のアイソフォームを生成する。
成熟型ヒトＨＥ４は，２つのＷＡＰドメインが繋がった構造をしているが，スプライシングにより１番目又は２番目のＷＡＰドメインが欠落し、１０個、２２個、又は２８個のアミノ酸で置換された複数のアイソフォームを生成する。
【0005】
ＨＥ４は、卵巣癌では血清中で強く発現し、進行癌では非常に高値を示す。ＨＥ４は、ムチン糖タンパク質であるＣＡ１２５に比べ子宮内膜症等の婦人科良性疾患で上昇することが少なく、特異性の高い腫瘍マーカーである。
しかし、ＨＥ４は、卵巣癌のほか、肺腺癌及び肺嚢胞性線維症でも発現しており、その腫瘍の大きさや浸潤性と、１番目のＷＡＰドメインが２２個のアミノ酸で置換されたＨＥ４アイソフォームの発現との関連性が示唆されている。また、ＨＥ４濃度の増加は、Ｉ型／ＩＩ型子宮体癌の場合は組織及び血清中で、移行上皮癌や初期／後期卵巣癌の場合は尿中で見られる。
しかし、ＨＥ４は、卵巣癌のほか、肺腺癌及び肺嚢胞性線維症でも発現しており、その腫瘍の大きさや浸潤性と、１番目のＷＡＰドメインが２２個のアミノ酸で置換されたＨＥ４アイソフォームの発現との関連性が示唆されている。また、ＨＥ４濃度の増加は、Ｉ型／ＩＩ型子宮体癌の場合は組織及び血清中で、移行上皮癌や初期／後期卵巣癌の場合は尿中で見られる。
【0006】
また、ＨＥ４は、正常な男女の生殖管上皮、上気道、唾液腺管、胸部で発現しているほか、遠位曲尿細管、結腸、子宮内膜でも可変的な発現が見られる。
そのため、ＨＥ４でも、卵巣腫瘍の悪性と良性の鑑別において十分な特異性を有するとは言えず、より有用な新規マーカーや分析方法の開発と臨床応用が依然として望まれる。また、卵巣癌などの、潜在的に治癒可能な初期の悪性腫瘍状態を検出するための、より有効なツールとしてＨＥ４の分析方法を開発する必要が要望されている（例えば特許文献１参照）。
そのため、ＨＥ４でも、卵巣腫瘍の悪性と良性の鑑別において十分な特異性を有するとは言えず、より有用な新規マーカーや分析方法の開発と臨床応用が依然として望まれる。また、卵巣癌などの、潜在的に治癒可能な初期の悪性腫瘍状態を検出するための、より有効なツールとしてＨＥ４の分析方法を開発する必要が要望されている（例えば特許文献１参照）。
【0007】
腫瘍の悪性と良性とを鑑別するには、内診、直腸診、超音波（エコー）検査、ＣＴ検査、ＭＲＩ検査などといった方法があるが、卵巣癌については、画像検査や診察では、良性の卵巣腫瘍と悪性腫瘍との区別が困難であるため、病理検査を行うことによって、診断を確定する必要がある。
病理検査としては、細胞診と組織診がある。細胞診では、胸水や腹水などにがん細胞が含まれていないかを検査する。手術中に採取するのが基本的な方法であるが、手術前に腹水が見られる場合は、皮膚から針を刺して、腹水を採取し検査を行う。組織診では、手術で採取した組織を検査し、良性、境界悪性、悪性の判定、組織型の判定を行い、最終的な結果が得られるまでに数週間の日数を要する。これら病理検査の方法は何れも侵襲的な検査であり、患者への負担が大きい上、結果が得られるまで時間を要する。
病理検査としては、細胞診と組織診がある。細胞診では、胸水や腹水などにがん細胞が含まれていないかを検査する。手術中に採取するのが基本的な方法であるが、手術前に腹水が見られる場合は、皮膚から針を刺して、腹水を採取し検査を行う。組織診では、手術で採取した組織を検査し、良性、境界悪性、悪性の判定、組織型の判定を行い、最終的な結果が得られるまでに数週間の日数を要する。これら病理検査の方法は何れも侵襲的な検査であり、患者への負担が大きい上、結果が得られるまで時間を要する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【文献】特表２０１３－５３６４４２公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、上記問題・状況を鑑みてなされたものであり、その解決課題は、卵巣癌などの癌の罹患、発症又は悪性度等を、迅速、簡便かつ非侵襲的な方法で精度良く評価することで、患者及び医師の負担を軽減した診断を可能とする、病態情報生成方法、病態情報生成システム及びＨＥ４糖鎖分析キット等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者は、上記課題を解決すべく、卵巣癌などの癌の発症に関連するＨＥ４の糖鎖について検討する過程において、糖鎖の（非還元）末端に特定の残基を有するＨＥ４が特定の癌と重要な相関性を有していることを見出し本発明に至った。
すなわち、本発明に係る上記課題は、以下の手段により解決される。
すなわち、本発明に係る上記課題は、以下の手段により解決される。
【0011】
１．癌の罹患又は発症に関する情報を生成する病態情報生成方法であって、
被検試料に含まれる、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、α２，３－シアル酸残基、α２，６－シアル酸残基又はマンノース残基の４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に関する情報を取得する第１工程と、
前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に基づき、前記被検試料に係る被検者の癌の罹患又は発症に関する情報を生成する第２工程と、
を有することを特徴とする病態情報生成方法。
被検試料に含まれる、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、α２，３－シアル酸残基、α２，６－シアル酸残基又はマンノース残基の４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に関する情報を取得する第１工程と、
前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に基づき、前記被検試料に係る被検者の癌の罹患又は発症に関する情報を生成する第２工程と、
を有することを特徴とする病態情報生成方法。
【0012】
２．前記第１工程が、質量分析法又は前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のある第１物質と前記被検試料とを接触させる方法により、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に関する情報を測定する工程であることを特徴とする第１項に記載の病態情報生成方法。
【0013】
３．さらに、前記４種の残基を有するＨＥ４に拘わらず、前記被検試料に含まれる全てのＨＥ４の総量を取得する第３工程を有することを特徴とする第１項又は第２項に記載の病態情報生成方法。
【0014】
４．前記第３工程が、質量分析法、クロマトグラフィー又はＨＥ４のポリペプチド鎖部分と親和性のある第２物質と前記被検試料とを接触させる方法により、前記ＨＥ４の総量を測定する工程であることを特徴とする第１項から第３項までのいずれか一項に記載の病態情報生成方法。
【0015】
５．前記第２工程が、前記被検試料に含まれる前記全てのＨＥ４の前記総量に対する前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量の比率を算出する工程であることを特徴とする第４項に記載の病態情報生成方法。
【0016】
６．前記第２工程が、前記被検者の癌の罹患又は発症に関する情報として、前記被検者が癌に罹患しているか否か、前記被検者が癌に罹患している確率、前記被検者の癌の悪性度、又は前記被検者の癌のステージに関する情報を生成する工程であることを特徴とする第１項から第５項までのいずれか一項に記載の病態情報生成方法。
【0017】
７．前記第２工程が、前記被検者の癌の罹患又は発症に関する情報として、前記被検者が卵巣癌に罹患しているか否かに関する情報を生成する工程であることを特徴とする第１項から第６項までのいずれか一項に記載の病態情報生成方法。
【0018】
８．前記第１工程を、前記第３工程の前に行うことを特徴とする第３項から第７項までのいずれか一項に記載の病態情報生成方法。
【0019】
９．前記第１工程が、前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のある第１物質と、前記被検試料とを接触させる方法により、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量を測定する工程であり、
前記第１物質が、前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のあるレクチン又は抗体であることを特徴とする第８項に記載の病態情報生成方法。
前記第１物質が、前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のあるレクチン又は抗体であることを特徴とする第８項に記載の病態情報生成方法。
【0020】
１０．前記第１物質が、前記４種の残基のいずれかを有する前記ＨＥ４と親和性のあるレクチンであり、ＣｏｎＡ、フジレクチン、ＳＳＡ又はＭＡＭのいずれかのレクチンであることを特徴とする第９項に記載の病態情報生成方法。
【0021】
１１．前記第１物質が、支持体に固定化されており、
前記第３工程が、ＨＥ４のポリペプチド鎖部分と親和性のある第２物質と、前記被検試料とを接触させる方法により、前記全てのＨＥ４の前記総量を測定する工程であり、
前記第２物質が、前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のある抗体である
ことを特徴とする第９項又は第１０項に記載の病態情報生成方法。
前記第３工程が、ＨＥ４のポリペプチド鎖部分と親和性のある第２物質と、前記被検試料とを接触させる方法により、前記全てのＨＥ４の前記総量を測定する工程であり、
前記第２物質が、前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のある抗体である
ことを特徴とする第９項又は第１０項に記載の病態情報生成方法。
【0022】
１２．前記第１工程が、クロマトグラフィーによる工程であることを特徴とする第８項から第１１項までのいずれか一項に記載の病態情報生成方法。
【0023】
１３．前記第３工程を、前記第１工程の前に行うことを特徴とする第３項から第７項までのいずれか一項に記載の病態情報生成方法。
【0024】
１４．前記第２物質が、支持体に固定されており、
前記第１工程が、前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のある第１物質と、前記被検試料とを接触させる方法により、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量を測定する工程であり、
前記第１物質が、前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のあるレクチンであり、
前記第１物質が、蛍光体により標識されており、
前記第１工程は、前記第２物質に捕捉されたＨＥ４と結合した前記第１物質を標識する蛍光体から発せられた蛍光の強度を測定し、前記蛍光の強度に基づき、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量を算出する工程であることを特徴とする第１３項に記載の病態情報生成方法。
前記第１工程が、前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のある第１物質と、前記被検試料とを接触させる方法により、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量を測定する工程であり、
前記第１物質が、前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のあるレクチンであり、
前記第１物質が、蛍光体により標識されており、
前記第１工程は、前記第２物質に捕捉されたＨＥ４と結合した前記第１物質を標識する蛍光体から発せられた蛍光の強度を測定し、前記蛍光の強度に基づき、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量を算出する工程であることを特徴とする第１３項に記載の病態情報生成方法。
【0025】
１５．前記第３工程において、質量分析法又はクロマトグラフィーにより得られたピークの強度と、予め決定された基準となるピークの強度とを比較することを特徴とする第１３項に記載の病態情報生成方法。
【0026】
１６．前記β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、前記α２，３－シアル酸残基、前記α２，６－シアル酸残基又は前記マンノース残基の４種の残基のうちのいずれかの残基が、ＨＥ４の糖鎖の（非還元）末端にあることを特徴とする第１項から第１５項までのいずれか一項に記載の病態情報生成方法。
【0027】
１７．前記癌が、卵巣癌であることを特徴とする第１項から第１６項までのいずれか一項に記載の病態情報生成方法。
【0028】
１８．癌の罹患又は発症に関する情報を生成する病態情報生成システムであって、
被検試料に含まれる、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、α２，３－シアル酸残基、α２，６－シアル酸残基又はマンノース残基の４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に関する情報を取得する第１工程部と、
前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に基づき、前記被検試料に係る被検者の癌の罹患又は発症に関する情報を生成する第２工程部と、
を有することを特徴とする病態情報生成システム。
被検試料に含まれる、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、α２，３－シアル酸残基、α２，６－シアル酸残基又はマンノース残基の４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に関する情報を取得する第１工程部と、
前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に基づき、前記被検試料に係る被検者の癌の罹患又は発症に関する情報を生成する第２工程部と、
を有することを特徴とする病態情報生成システム。
【0029】
１９．第１項から第１７項までのいずれか一項に記載の病態情報生成方法を実施するためのシステムであることを特徴とする第１８項に記載の病態情報生成システム。
【0030】
２０．糖鎖を有するＨＥ４及び抗ＨＥ４抗体を含むＨＥ４糖鎖分析キットであって、
第１項から第１７項までのいずれか一項に記載の病態情報生成方法を実施するための分析キットであることを特徴とするＨＥ４糖鎖分析キット。
第１項から第１７項までのいずれか一項に記載の病態情報生成方法を実施するための分析キットであることを特徴とするＨＥ４糖鎖分析キット。
【0031】
２１.糖鎖を有するＨＥ４及び抗ＨＥ４抗体を含むＨＥ４糖鎖分析キットであって、
前記糖鎖の（非還元）末端にβ－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、α２，３－シアル酸残基、α２，６－シアル酸残基又はマンノース残基を有するＨＥ４と親和性のある物質及び抗ＨＥ４抗体を含むことを特徴とする第２０項に記載のＨＥ４糖鎖分析キット。
前記糖鎖の（非還元）末端にβ－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、α２，３－シアル酸残基、α２，６－シアル酸残基又はマンノース残基を有するＨＥ４と親和性のある物質及び抗ＨＥ４抗体を含むことを特徴とする第２０項に記載のＨＥ４糖鎖分析キット。
【0032】
２２．前記ＨＥ４と親和性のある物質が、レクチンであることを特徴とする第２１項に記載のＨＥ４糖鎖分析キット。
【0033】
２３．前記レクチンと、抗ＨＥ４抗体と、分析用基板とを組み合わせた構成であることを特徴とする第２０項から第２２項までのいずれか一項に記載のＨＥ４糖鎖分析キット。
【0034】
２４．前記レクチンが、蛍光体を備え付けていることを特徴とする第２０項から第２３項までのいずれか一項に記載のＨＥ４糖鎖分析キット。
【0035】
２５．蛍光体を備え付けた、フジレクチン又はＭＡＭの少なくとも一種のレクチンを含むことを特徴とする第２０項から第２４項までのいずれか一項に記載のＨＥ４糖鎖分析キット。
【0036】
２６．さらに、クロマトグラフィー装置を備えた構成であることを特徴とする第２０項から第２５項までのいずれか一項に記載のＨＥ４糖鎖分析キット。
【0037】
２７．さらに、クロマトグラフィー測定のためのラベル化試薬を備えた構成であることを特徴とする第２６項に記載のＨＥ４糖鎖分析キット。
【0038】
２８．癌検査用バイオマーカーとしてのＨＥ４であって、
糖鎖の（非還元）末端にβ－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、α２，３－シアル酸残基、α２，６－シアル酸残基又はマンノース残基の４種の残基のうちのいずれかの残基を有することを特徴とするＨＥ４。
糖鎖の（非還元）末端にβ－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、α２，３－シアル酸残基、α２，６－シアル酸残基又はマンノース残基の４種の残基のうちのいずれかの残基を有することを特徴とするＨＥ４。
【発明の効果】
【0039】
本発明の手段により、卵巣癌などの癌の罹患、発症又は悪性度等を、迅速、簡便かつ非侵襲的な方法で精度良く評価することで、患者及び医師の負担を軽減した診断を可能とする、病態情報生成方法、病態情報生成システム及びＨＥ４糖鎖分析キット等を提供することができる。
【0040】
本発明に係る特定の残基を有するＨＥ４の発現機構ないし作用機構については、明確にはなっていない。
しかし、被検試料における特定の残基を有するＨＥ４の量を測定することにより、被検試料に係る被検者の癌の罹患、発症又は悪性度等に関する情報を精度良く生成することができることから、簡便かつ非侵襲的な方法により被検試料に係る被検者の癌の罹患、発症又は悪性度を迅速に評価することができ、患者及び医師の負担を軽減することが可能となる。
なお、本発明の病態情報生成方法、病態情報生成システム及びＨＥ４糖鎖分析キット等は、特に５０歳以下の被検者が卵巣癌に罹患しているか否かの精度の良い情報を得ることができる点が特徴である。
しかし、被検試料における特定の残基を有するＨＥ４の量を測定することにより、被検試料に係る被検者の癌の罹患、発症又は悪性度等に関する情報を精度良く生成することができることから、簡便かつ非侵襲的な方法により被検試料に係る被検者の癌の罹患、発症又は悪性度を迅速に評価することができ、患者及び医師の負担を軽減することが可能となる。
なお、本発明の病態情報生成方法、病態情報生成システム及びＨＥ４糖鎖分析キット等は、特に５０歳以下の被検者が卵巣癌に罹患しているか否かの精度の良い情報を得ることができる点が特徴である。
【図面の簡単な説明】
【0041】
【図1】ＳＰＦＳ測定装置の構成を模式的に示す概略図
【図3】ＨＥ４糖鎖分析キットの一例を示す模式図
【図4】レクチンとしてＷＦＡを用いたレクチンカラム法による糖鎖の末端にβ－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基を有するＨＥ４（ＧａｌＮＡｃＨＥ４）の定量結果を示す図
【図5】癌検体と非癌検体（健常者と子宮内膜症患者を含む）の比較より求めたＲＯＣ曲線
【図6】５０歳以下の癌患者と非癌検体（健常者と子宮内膜症患者）の比較より求めたＲＯＣ曲線
【図7】グレード１の癌検体と非癌検体（健常者と子宮内膜症患者）の比較より求めたＲＯＣ曲線
【図8】α２，３－シアル酸を持つＨＥ４タンパク量と、卵巣癌のグレードとの関係を示す図。
【発明を実施するための形態】
【0042】
本発明の病態情報生成方法は、癌の罹患又は発症に関する情報を生成する病態情報生成方法であって、被検試料に含まれる、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、α２，３－シアル酸残基、α２，６－シアル酸残基又はマンノース残基の４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に関する情報を取得する第１工程と、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に基づき、前記被検試料に係る被検者の癌の罹患又は発症に関する情報を生成する第２工程と、を有することを特徴とする。
この特徴は、下記各実施形態に共通する又は対応する技術的特徴である。
この特徴は、下記各実施形態に共通する又は対応する技術的特徴である。
【0043】
本発明の実施形態としては、前記第１工程が、質量分析法又は前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のある第１物質と前記被検試料とを接触させる方法により、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に関する情報を測定する工程であることが本発明の効果発現及び精度の観点から好ましい。さらに、前記４種の残基を有するＨＥ４に拘わらず、前記被検試料に含まれる全てのＨＥ４の総量を取得する第３工程を有することが、上記と同様の観点から好ましい。
【0044】
また、前記第３工程が、質量分析法、クロマトグラフィー又はＨＥ４のポリペプチド鎖部分と親和性のある第２物質と前記被検試料とを接触させる方法により、前記ＨＥ４の総量を測定する工程であることが好ましい。
【0045】
本発明の実施形態としては、前記第２工程が、前記被検試料に含まれる前記全てのＨＥ４の前記総量に対する前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量の比率を算出する工程であることが、本発明の効果発現及び精度の観点から好ましい。
また、前記第２工程が、前記被検者の癌の罹患又は発症に関する情報として、前記被検者が癌に罹患しているか否か、前記被検者が癌に罹患している確率、前記被検者の癌の悪性度、又は前記被検者の癌のステージに関する情報を生成する工程であることが好ましい。さらに、前記第２工程が、前記被検者の癌の罹患又は発症に関する情報として、前記被検者が卵巣癌に罹患しているか否かに関する情報を生成する工程であることが好ましい。
また、前記第２工程が、前記被検者の癌の罹患又は発症に関する情報として、前記被検者が癌に罹患しているか否か、前記被検者が癌に罹患している確率、前記被検者の癌の悪性度、又は前記被検者の癌のステージに関する情報を生成する工程であることが好ましい。さらに、前記第２工程が、前記被検者の癌の罹患又は発症に関する情報として、前記被検者が卵巣癌に罹患しているか否かに関する情報を生成する工程であることが好ましい。
【0046】
本発明の実施形態としては、前記第１工程を、前記第３工程の前に行うことが好ましい態様の一つである。また、前記第１工程が、前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のある第１物質と、前記被検試料とを接触させる方法により、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量を測定する工程であり、前記第１物質が、前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のあるレクチン又は抗体であることが好ましい。
さらに、前記第１物質が、前記４種の残基のいずれかを有する前記ＨＥ４と親和性のあるレクチンであり、ＣｏｎＡ、フジレクチン、ＳＳＡ又はＭＡＭのいずれかのレクチンであことが好ましい。
さらに、前記第１物質が、前記４種の残基のいずれかを有する前記ＨＥ４と親和性のあるレクチンであり、ＣｏｎＡ、フジレクチン、ＳＳＡ又はＭＡＭのいずれかのレクチンであことが好ましい。
【0047】
また、前記第１物質が、支持体に固定化されており、前記第３工程が、ＨＥ４のポリペプチド鎖部分と親和性のある第２物質と、前記被検試料とを接触させる方法により、前記全てのＨＥ４の前記総量を測定する工程であり、前記第２物質が、前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のある抗体であることが本発明の効果発現の観点から好ましい。さらに、前記第１工程が、クロマトグラフィーによる工程であることが好ましい。
【0048】
本発明の別の実施形態としては、前記第３工程を、前記第１工程の前に行うことも好ましい。また、前記第２物質が、支持体に固定されており、前記第１工程が、前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のある第１物質と、前記被検試料とを接触させる方法により、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量を測定する工程であり、前記第１物質が、前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のあるレクチンであり、前記第１物質が、蛍光体により標識されており、前記第１工程は、前記第２物質に捕捉されたＨＥ４と結合した前記第１物質を標識する蛍光体から発せられた蛍光の強度を測定し、前記蛍光の強度に基づき、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量を算出する工程であることが精度等の観点から好ましい。
【0049】
さらに、前記第３工程において、質量分析法又はクロマトグラフィーにより得られたピークの強度と、予め決定された基準となるピークの強度とを比較することが、上記と同様の観点から、好ましい。
【0050】
本発明においては、前記β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、前記α２，３－シアル酸残基、前記α２，６－シアル酸残基又は前記マンノース残基の４種の残基のうちのいずれかの残基が、ＨＥ４の糖鎖の（非還元）末端にあることが、本発明の効果の観点から好ましい。また、前記癌が、卵巣癌であることが、好ましい。
【0051】
本発明の病態情報生成システムは、癌の罹患又は発症に関する情報を生成する病態情報生成システムであって、被検試料に含まれる、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、α２，３－シアル酸残基、α２，６－シアル酸残基又はマンノース残基の４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に関する情報を取得する第１工程部と、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に基づき、前記被検試料に係る被検者の癌の罹患又は発症に関する情報を生成する第２工程部と、を有することを特徴とする。また、本発明の実施形態としては、前記病態情報生成方法を実施するためのシステムであることを特徴とする。
【0052】
本発明のＨＥ４糖鎖分析キットは、糖鎖を有するＨＥ４及び抗ＨＥ４抗体を含むＨＥ４糖鎖分析キットであって、本発明の上記病態情報生成方法を実施するための分析キットであることを特徴とする。また、糖鎖を有するＨＥ４及び抗ＨＥ４抗体を含むＨＥ４糖鎖分析キットであって、前記糖鎖の（非還元）末端にβ－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、α２，３－シアル酸残基、α２，６－シアル酸残基又はマンノース残基を有するＨＥ４と親和性のある物質及び抗ＨＥ４抗体を含むことを特徴とする。
【0053】
ＨＥ４糖鎖分析キットの実施形態としては、精度及び簡便さ等の観点から、前記ＨＥ４と親和性のある物質が、レクチンであることが好ましい。また、前記レクチン、と抗ＨＥ４抗体と、分析用基板とを組み合わせた構成であることが好ましい。さらに、前記レクチンが、蛍光体を備え付けていることが好ましい。また、蛍光体を備え付けた、フジレクチン又はＭＡＭの少なくとも一種のレクチンを含むことが好ましい。
また、実施形態として、クロマトグラフィー装置を備えた構成であることが好ましい。さらに、クロマトグラフィー測定のためのラベル化試薬を備えた構成であることが好ましい。
また、実施形態として、クロマトグラフィー装置を備えた構成であることが好ましい。さらに、クロマトグラフィー測定のためのラベル化試薬を備えた構成であることが好ましい。
【0054】
本発明に係るＨＥ４は、癌検査用バイオマーカーとしてのＨＥ４であって、糖鎖の（非還元）末端にβ－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、α２，３－シアル酸残基、α２，６－シアル酸残基又はマンノース残基の４種の残基のうちのいずれかの残基を有することを特徴とする。
【0055】
以下、本発明とその構成要素、及び本発明を実施するための形態・態様について詳細な説明をする。なお、本願において、「～」は、その前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む意味で使用する。
【0056】
本願において、「検出対象糖鎖」（アナライト、「検出対象」、「被検物」ともいう。）とは、例えば特定の疾患を発症した場合に血中に比較的高濃度で存在するようになるマーカーとなる抗原である糖タンパク質が特異的に有する糖鎖であって、アナライトを検出するために、検出用レクチンを極力多く結合させることが意図される糖鎖をいう。
一方、「非検出対象糖鎖」とは、アナライトとともに検体中に存在する夾雑物（アナライトとは異なる糖タンパク質、糖脂質等）が有する糖鎖であって、アナライトの検出の障害となるため、検出用レクチンを極力結合させないことが意図される糖鎖をいう。
なお、本明細書における「検出方法」は、定性的にアナライトを検出する方法のみならず、定量的にアナライトを検出・測定する方法（アナライトの定量・測定方法）を当然に含む。また、当該検出方法は、本発明の病態情報生成方法の工程に含まれるものである。
一方、「非検出対象糖鎖」とは、アナライトとともに検体中に存在する夾雑物（アナライトとは異なる糖タンパク質、糖脂質等）が有する糖鎖であって、アナライトの検出の障害となるため、検出用レクチンを極力結合させないことが意図される糖鎖をいう。
なお、本明細書における「検出方法」は、定性的にアナライトを検出する方法のみならず、定量的にアナライトを検出・測定する方法（アナライトの定量・測定方法）を当然に含む。また、当該検出方法は、本発明の病態情報生成方法の工程に含まれるものである。
【0057】
［１］病態情報生成方法の概要
本発明の病態情報生成方法は、癌の罹患又は発症に関する情報を生成する病態情報生成方法であって、被検試料に含まれる、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、α２，３－シアル酸残基、α２，６－シアル酸残基又はマンノース残基の４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に関する情報を取得する第１工程と、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に基づき、前記被検試料に係る被検者の癌の罹患又は発症に関する情報を生成する第２工程と、を有することを特徴とする。
以下において、構成要素及び方法について詳細な説明を順次する。
本発明の病態情報生成方法は、癌の罹患又は発症に関する情報を生成する病態情報生成方法であって、被検試料に含まれる、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、α２，３－シアル酸残基、α２，６－シアル酸残基又はマンノース残基の４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に関する情報を取得する第１工程と、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に基づき、前記被検試料に係る被検者の癌の罹患又は発症に関する情報を生成する第２工程と、を有することを特徴とする。
以下において、構成要素及び方法について詳細な説明を順次する。
【0058】
＜検出対象物質及び検出対象糖鎖＞
本発明に係る検出対象物質は糖鎖を有するＨＥ４であり、検出対象糖鎖は糖鎖の（非還元）末端にβ－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、α２，３－シアル酸残基、α２，６－シアル酸残基又はマンノース残基の４種の残基のうちのいずれかの残基を有する糖鎖である。
これらを検出対象とするのは、癌、特に卵巣癌との相関性度が大きいことが、本発明者らのスクリーニングテストなどで確認されているからである。
本発明に係る検出対象物質は糖鎖を有するＨＥ４であり、検出対象糖鎖は糖鎖の（非還元）末端にβ－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、α２，３－シアル酸残基、α２，６－シアル酸残基又はマンノース残基の４種の残基のうちのいずれかの残基を有する糖鎖である。
これらを検出対象とするのは、癌、特に卵巣癌との相関性度が大きいことが、本発明者らのスクリーニングテストなどで確認されているからである。
【0059】
なお、糖鎖は、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、シアル酸などの単糖及びこれらの誘導体がグリコシド結合によって鎖状に結合した分子の総称である。生体高分子の中でも、糖鎖は、非常に多様性に富んでおり、天然に存在する生物が有する様々な機能、例えば、細胞間情報伝達や、タンパク質の機能や相互作用の調整などに深く関わっていることが明らかになりつつある。
【0060】
糖鎖は、生体内でタンパク質や脂質などに結合した複合糖質として存在することが多い。糖鎖を有する生体高分子としては、例えば、細胞の安定化に寄与する植物細胞の細胞壁のプロテオグリカン、細胞の分化、増殖、接着、移動等に影響を与える糖脂質、及び細胞間相互作用や細胞認識に関与している糖タンパク質等が挙げられる。これらの生体高分子に含まれる糖鎖が、この生体高分子と互いに機能を代行、補助、増幅、調節、あるいは阻害しあいながら高度で精密な生体反応を制御する機構が次第に明らかにされつつある。このような糖鎖と細胞の分化増殖、細胞接着、免疫、及び細胞の癌化との関係が明確にされれば、この糖鎖工学と、医学、細胞工学、あるいは臓器工学とを密接に関連させて新たな展開を図ることが期待できる。
【0061】
＜糖鎖を有するＨＥ４と親和性のある物質＞
本発明に係る糖鎖を有するＨＥ４と親和性のある物質としては、種々の物質を採用し得るが、下記レクチン群（１）～（４）の全体から選択されたいずれかのレクチン又は糖鎖認識抗体であることが好ましい。さらに、前記４種の残基のいずれかを有する前記ＨＥ４と親和性のある物質が、ＣｏｎＡ、ＷＦＡ、ＷＦＬ、ＳＳＡ又はＭＡＭのいずれかのレクチンであること、特に、ＣｏｎＡ、ＷＦＡ又はＳＳＡのいずれかであることが好ましい。
なお、本願において、「レクチン」とは、細胞膜を構成する糖タンパク質や糖脂質の糖鎖に結合活性を示すタンパク質（糖鎖結合タンパク質）の総称をいう。レクチンの詳細については、後述する。
本発明に係る糖鎖を有するＨＥ４と親和性のある物質としては、種々の物質を採用し得るが、下記レクチン群（１）～（４）の全体から選択されたいずれかのレクチン又は糖鎖認識抗体であることが好ましい。さらに、前記４種の残基のいずれかを有する前記ＨＥ４と親和性のある物質が、ＣｏｎＡ、ＷＦＡ、ＷＦＬ、ＳＳＡ又はＭＡＭのいずれかのレクチンであること、特に、ＣｏｎＡ、ＷＦＡ又はＳＳＡのいずれかであることが好ましい。
なお、本願において、「レクチン」とは、細胞膜を構成する糖タンパク質や糖脂質の糖鎖に結合活性を示すタンパク質（糖鎖結合タンパク質）の総称をいう。レクチンの詳細については、後述する。
【0062】
レクチン群：
（１）高マンノース型糖鎖を認識するタンパク質等：
Ａｒｔｏｃａｒｐｉｎ、ＣＲＬＬ、Ｃｏｎａｒｖａ、ＣＣＡ、Ｈｅｌｔｕｂａ、ｊａｃａｌｉｎ、Ｃａｌｓｅｐａ、ＭｏｒｎｉｇａＭ、ＵＤＡ、ＰＳＡ、ＬＴＡ、ＬＴＬ、ＮＰＡ、ＨＨＡ、ＨＨＬ、ＧＮＬ、ＧＮＡ、ＡＭＡ、Ｓｕｃｃｉｎｙｌａｅ及びＣｏｎＡ等のレクチンや、抗高マンノース型糖鎖抗体。
（１）高マンノース型糖鎖を認識するタンパク質等：
Ａｒｔｏｃａｒｐｉｎ、ＣＲＬＬ、Ｃｏｎａｒｖａ、ＣＣＡ、Ｈｅｌｔｕｂａ、ｊａｃａｌｉｎ、Ｃａｌｓｅｐａ、ＭｏｒｎｉｇａＭ、ＵＤＡ、ＰＳＡ、ＬＴＡ、ＬＴＬ、ＮＰＡ、ＨＨＡ、ＨＨＬ、ＧＮＬ、ＧＮＡ、ＡＭＡ、Ｓｕｃｃｉｎｙｌａｅ及びＣｏｎＡ等のレクチンや、抗高マンノース型糖鎖抗体。
【0063】
（２）Ｎ－アセチルガラクトサミン残基を認識するタンパク質：
ＢＲＬ、ＴＪＡ－ＩＩ、ＲＣＡ Ｉ、ＲＣＡ１２０、ＢＰＡ、ＢＰＬ、ＳＢＡ、ＷＦＡ、ＶＶＡ－Ｇ、ＶＶＡ、ＶＶＬ、ＰＴＬＩ、ＷＢＡＩ、ＰＴＬＩＩ、ＷＢＡＩＩ、ＲＣＡＩＩ、ＲＣＡ６０ｒｉｃｉｎ、ＷＦＡ，ＷＦＬ、ＳＢＡ、ＧＳＬ、ＳＢＡ、ＷＳＡ、ＷＪＡ及びＳＩＡ等のレクチンや、ＲＭ２等の抗Ｎ－アセチルガラクトサミン残基抗体。
ＢＲＬ、ＴＪＡ－ＩＩ、ＲＣＡ Ｉ、ＲＣＡ１２０、ＢＰＡ、ＢＰＬ、ＳＢＡ、ＷＦＡ、ＶＶＡ－Ｇ、ＶＶＡ、ＶＶＬ、ＰＴＬＩ、ＷＢＡＩ、ＰＴＬＩＩ、ＷＢＡＩＩ、ＲＣＡＩＩ、ＲＣＡ６０ｒｉｃｉｎ、ＷＦＡ，ＷＦＬ、ＳＢＡ、ＧＳＬ、ＳＢＡ、ＷＳＡ、ＷＪＡ及びＳＩＡ等のレクチンや、ＲＭ２等の抗Ｎ－アセチルガラクトサミン残基抗体。
【0064】
（３）シアル酸α２，６－残基を認識するタンパク質：
ＳＮＡ、ＥＢＬ、ＢＲＬ、ＢＲＡ２、ＴＪＡ－Ｉ、ＰＰＬ、ＳＮＡ、ＳＡＮ－Ｉ、ＳＳＡ、ＲＣＡ１２０、ＲＣＡＩ及びＡＭＡ等のレクチンや、抗シアル酸α２，６－残基抗体。
ＳＮＡ、ＥＢＬ、ＢＲＬ、ＢＲＡ２、ＴＪＡ－Ｉ、ＰＰＬ、ＳＮＡ、ＳＡＮ－Ｉ、ＳＳＡ、ＲＣＡ１２０、ＲＣＡＩ及びＡＭＡ等のレクチンや、抗シアル酸α２，６－残基抗体。
【0065】
（４）シアル酸α２，３－残基を認識するタンパク質：
ＭＡＬＩＩ、ＭＡＨ及びＭＡＭ等のレクチンや、抗シアル酸α２，３－残基抗体。
ＭＡＬＩＩ、ＭＡＨ及びＭＡＭ等のレクチンや、抗シアル酸α２，３－残基抗体。
【0066】
本発明において、特に好ましく用いられるレクチンとしては、ＨＥ４の糖鎖の（非還元）末端に結合したβ－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ、）α２，３シアル酸残基及びα２，６シアル酸残基、マンノース残基等と親和性のあるレクチンが好ましい。
例えば、特に、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基に対して親和性を有するレクチンとしては、ＷＦＡ、ＴＪＡ－ＩＩ、ＥＣＡ、ＲＣＡ１２０及びＤＳＡ等が挙げられる。
α２，３シアル酸残基に対して親和性を有するレクチンとしては、ＭＡＬ及びＭＡＭ等があげられる。また、α２，６シアル酸残基に対して親和性を有するレクチンとしては、ＳＮＡ、ＳＳＡ及びＴＪＡ－Ｉ等が挙げられる。高マンノース（ｈｉｇｈ－Ｍａｎｎｏｓｅ）に対して親和性を有するレクチンとしては、ＣｏｎＡ及びＵＤＡ等を挙げることができる。
例えば、特に、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基に対して親和性を有するレクチンとしては、ＷＦＡ、ＴＪＡ－ＩＩ、ＥＣＡ、ＲＣＡ１２０及びＤＳＡ等が挙げられる。
α２，３シアル酸残基に対して親和性を有するレクチンとしては、ＭＡＬ及びＭＡＭ等があげられる。また、α２，６シアル酸残基に対して親和性を有するレクチンとしては、ＳＮＡ、ＳＳＡ及びＴＪＡ－Ｉ等が挙げられる。高マンノース（ｈｉｇｈ－Ｍａｎｎｏｓｅ）に対して親和性を有するレクチンとしては、ＣｏｎＡ及びＵＤＡ等を挙げることができる。
【0067】
なお、ＴＪＡ－ＩＩは、キカラスウリの塊根から抽出及び精製されるレクチンであり、非還元状態の電気泳動による分子量は６４ｋＤａであるが、Ｓ－Ｓ結合した２量体であり、還元状態の電気泳動による分子量は３２ｋＤａ及び２９ｋＤａを示す。
ＷＦＡは、ノダフジの種子から抽出及び精製されるレクチンであり、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）そのものに強い親和性を示す。また、ＧａｌＮＡｃβ１→４Ｇａｌ残基、及びＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃ残基にも強い親和性を示す。
ＷＦＡは、ノダフジの種子から抽出及び精製されるレクチンであり、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）そのものに強い親和性を示す。また、ＧａｌＮＡｃβ１→４Ｇａｌ残基、及びＧａｌＮＡｃβ１→４ＧｌｃＮＡｃ残基にも強い親和性を示す。
【0068】
本発明の実施形態においては、特に、前記４種の残基のいずれかを有する前記ＨＥ４と親和性のある物質が、ＣｏｎＡ、ＷＦＡ、ＷＦＬ、ＳＳＡ又はＭＡＭのいずれかノレクチンであること、さらに、ＣｏｎＡ、ＷＦＡ又はＳＳＡのいずれかであることが好ましい。
【0069】
本発明に係る検出方法では、検出対象糖鎖を有する検出対象物（アナライト）を標識するための標識用レクチンとしてレクチンが用いられる。
また、夾雑物が有する検出対象糖鎖をマスキングするためのマスク用糖鎖認識分子としてレクチンが用いられる場合がある。本発明において、マスキングに用いられる糖鎖認識分子はレクチンに限定されるものではなく、例えば検出対象糖鎖をエピトープとして認識し、特異的に結合する抗体も包含されるが、標識用レクチンと同様、安価で大量に入手が可能であり、またタンパク質の安定性にも優れており長期間保存も可能であるという観点からは、レクチンが好適である。
また、夾雑物が有する検出対象糖鎖をマスキングするためのマスク用糖鎖認識分子としてレクチンが用いられる場合がある。本発明において、マスキングに用いられる糖鎖認識分子はレクチンに限定されるものではなく、例えば検出対象糖鎖をエピトープとして認識し、特異的に結合する抗体も包含されるが、標識用レクチンと同様、安価で大量に入手が可能であり、またタンパク質の安定性にも優れており長期間保存も可能であるという観点からは、レクチンが好適である。
【0070】
レクチンは、その種類に応じた特定の糖鎖に高い結合能で結合するが、それとは別の糖鎖にも低い結合能ながら結合することがある。したがって、本発明の検出方法は、アナライトが有する検出対象糖鎖に高い結合能で結合する一方、夾雑物が有する非検出対象糖鎖にも弱い結合能で結合するレクチンを、標識用レクチンとして用いる場合に適用される。 そして、標識用レクチンが弱い結合能で結合する非検出対象糖鎖に対して強い結合能で結合する糖鎖認識分子をマスク用糖鎖認識分子として用いる。このようなマスク用糖鎖認識分子は、標識用レクチンが強い結合能で結合する検出対象糖鎖に対しては、実質的に結合しないか、弱い結合能で結合する糖鎖認識分子（例えば標識用レクチンとは異なる種類レクチン）である必要がある。
【0071】
＜検出対象物質を含む被検試料＞
本発明に係る検出方法では、前記検出対象物質（アナライト）を含む可能性のある検体を被検試料とすることができる。前記検出対象物質を含む可能性のある被検試料（検体）は、現実に検出対象物質を含む検体であってもよいし、現実には検出対象物質を含まない被検試料（検体）であってもよい。
このような被検試料としては、例えば、血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、細胞、組織、腹水、又は器官、若しくはそれらの調製物（例えば、生検標本）等の生体試料及び生体由来試料を挙げることができる。特に、がん抗原／腫瘍マーカーを含む可能性のある、血液、血清又は血漿が被検試料として好適である。
本発明に係る検出方法では、前記検出対象物質（アナライト）を含む可能性のある検体を被検試料とすることができる。前記検出対象物質を含む可能性のある被検試料（検体）は、現実に検出対象物質を含む検体であってもよいし、現実には検出対象物質を含まない被検試料（検体）であってもよい。
このような被検試料としては、例えば、血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、細胞、組織、腹水、又は器官、若しくはそれらの調製物（例えば、生検標本）等の生体試料及び生体由来試料を挙げることができる。特に、がん抗原／腫瘍マーカーを含む可能性のある、血液、血清又は血漿が被検試料として好適である。
【0072】
前記血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、腹水などの液性の試料は、適当な緩衝液により希釈して使用することができる。また、細胞、組織、又は器官などの固形の試料は、固形の試料の体積の２～１０倍程度の適当な緩衝液で均一化（ホモジェナイズ）して、懸濁液又はその上清を、そのまま、若しくはさらに希釈して使用することができる。
【0073】
＜標識体＞
本発明の方法においては、糖鎖を有するＨＥ４（検出対象抗原）を検出するために、レクチンと複合体化させた標識体を用いることが好ましい。そのために、標識体とレクチンとを複合体化（結合）させた、標識化レクチンを用いることが好ましい。
本発明の方法においては、糖鎖を有するＨＥ４（検出対象抗原）を検出するために、レクチンと複合体化させた標識体を用いることが好ましい。そのために、標識体とレクチンとを複合体化（結合）させた、標識化レクチンを用いることが好ましい。
【0074】
標識体としては、蛍光色素（蛍光体）、酵素・補酵素、化学発光物質、放射性物質等の当業者に公知の標識体を用いることができる。
蛍光色素（蛍光体）としては、例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株））、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株））、クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株））、ローダミン・ファミリーの蛍光色素（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス（株））、シアニン・ファミリーの蛍光色素、インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素、オキサジン・ファミリーの蛍光色素、チアジン・ファミリーの蛍光色素、スクアライン・ファミリーの蛍光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株））、ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素、ピレン・ファミリーの蛍光色素、トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン（株））等の有機蛍光色素が挙げられる。
蛍光色素（蛍光体）としては、例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株））、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株））、クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株））、ローダミン・ファミリーの蛍光色素（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス（株））、シアニン・ファミリーの蛍光色素、インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素、オキサジン・ファミリーの蛍光色素、チアジン・ファミリーの蛍光色素、スクアライン・ファミリーの蛍光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株））、ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素、ピレン・ファミリーの蛍光色素、トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン（株））等の有機蛍光色素が挙げられる。
【0075】
また、Ｅｕ、Ｔｂ等の希土類錯体系の蛍光色素（例えばＡＴＢＴＡ－Ｅｕ３＋）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）又はＡｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ；ＬｙｏＦｌｏｇｅｎ（登録商標））等に代表される蛍光タンパク質、ラテックスやシリカなどの蛍光微粒子等も、蛍光色素として挙げられる。
【0076】
なお、血液検体に由来する試料を分析に供する場合は、血液中の血球成分由来の鉄による吸光の影響を最小限に抑えるため、Ｃｙ５やＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７など、近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが望ましい。
放射性物質としては、ラジオアイソトープ（３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉなど）が挙げられる。
放射性物質としては、ラジオアイソトープ（３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉなど）が挙げられる。
【0077】
＜検出対象物質、標識用レクチン、マスク用糖鎖認識分子の組合せ＞
本発明の検出方法においては、検出対象物（アナライト：検出対象抗原）、標識用レクチン、及びマスク用糖鎖認識分子（レクチン）を組み合せて使用することも好ましい態様である。
がん抗原／腫瘍マーカーなどの検出対象抗原、検体中にそれとともに含まれやすい夾雑物（検出対象抗原以外の糖タンパク質や糖脂質）、それぞれが有する糖鎖の種類を考慮しながら、前者が有する検出対象糖鎖に結合しやすい標識用レクチンと、そのレクチンが同時に結合するおそれのある後者が有する非検出対象糖鎖に結合しやすいマスク用糖鎖認識分子（レクチン）を適宜選択し、組み合わせて用いることも可能である。
本発明の検出方法においては、検出対象物（アナライト：検出対象抗原）、標識用レクチン、及びマスク用糖鎖認識分子（レクチン）を組み合せて使用することも好ましい態様である。
がん抗原／腫瘍マーカーなどの検出対象抗原、検体中にそれとともに含まれやすい夾雑物（検出対象抗原以外の糖タンパク質や糖脂質）、それぞれが有する糖鎖の種類を考慮しながら、前者が有する検出対象糖鎖に結合しやすい標識用レクチンと、そのレクチンが同時に結合するおそれのある後者が有する非検出対象糖鎖に結合しやすいマスク用糖鎖認識分子（レクチン）を適宜選択し、組み合わせて用いることも可能である。
【0078】
＜ＨＥ４抗体等の抗原捕捉物質＞
本発明では、ＨＥ４（アナライト：検出対象物質）を特異的に認識して結合し、かつ、レクチンによる糖鎖認識を妨げない分子を抗原捕捉物質（リガンド）として用いることができる。
ＨＥ４に対応する適切な物質であれば抗原捕捉物質は特に限定されないが、例えば、抗体、アプタマー、合成ペプチド、ＨＥ４と結合性のあるＰＳＡ、トリプシン、プロテナーゼＫ等の酵素等を用いることができる。特に、検出対象抗原に対するモノクローナル抗体が好適である。
本発明では、ＨＥ４（アナライト：検出対象物質）を特異的に認識して結合し、かつ、レクチンによる糖鎖認識を妨げない分子を抗原捕捉物質（リガンド）として用いることができる。
ＨＥ４に対応する適切な物質であれば抗原捕捉物質は特に限定されないが、例えば、抗体、アプタマー、合成ペプチド、ＨＥ４と結合性のあるＰＳＡ、トリプシン、プロテナーゼＫ等の酵素等を用いることができる。特に、検出対象抗原に対するモノクローナル抗体が好適である。
【0079】
例えば、がん抗原／腫瘍マーカーなどを検出対象抗原とする場合は、その抗原に特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体など）を抗原捕捉物質として用いることが適切である。例えば、ＨＥ４を抗原とする場合には、抗ヒト－ＨＥ４抗体を用いればよい。
【0080】
なお、上記「抗体」は、完全抗体のみならず任意の抗体断片又は誘導体を含む意味で用いられ、完全抗体に加え、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＣＤＲ、ヒト化抗体、多機能抗体、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）等の各種抗体も包含される。
【0081】
＜捕捉支持体＞
本発明の検出方法においては、測定系に応じて、抗原捕捉物質（リガンド）を固定化する（そこに検出対象物を捕捉する）ための支持体を用いることができる。
支持体としては、例えば、アガロース、セルロースなどの不溶性の多糖類、シリコン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ナイロン樹脂、ポリカーボネート樹脂などの合成樹脂や、ガラスなどの不溶性の支持体を挙げることができる。
これらの支持体は、ビーズ（主として球状）、プレート（主として平面状）などの形状で用いられる。ビーズとしては磁気ビーズ、樹脂ビーズ等が充填されたカラムなどが使用できる。プレートの場合、マルチウェルプレート（９６穴マルチウェルプレート等）、バイオセンサーチップなどが使用できる。なお、プレート等の平面状の支持体を基板と呼ぶこともある。
本発明の検出方法においては、測定系に応じて、抗原捕捉物質（リガンド）を固定化する（そこに検出対象物を捕捉する）ための支持体を用いることができる。
支持体としては、例えば、アガロース、セルロースなどの不溶性の多糖類、シリコン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ナイロン樹脂、ポリカーボネート樹脂などの合成樹脂や、ガラスなどの不溶性の支持体を挙げることができる。
これらの支持体は、ビーズ（主として球状）、プレート（主として平面状）などの形状で用いられる。ビーズとしては磁気ビーズ、樹脂ビーズ等が充填されたカラムなどが使用できる。プレートの場合、マルチウェルプレート（９６穴マルチウェルプレート等）、バイオセンサーチップなどが使用できる。なお、プレート等の平面状の支持体を基板と呼ぶこともある。
【0082】
抗原捕捉物質（リガンド）と支持体との結合は、化学結合や物理的な吸着などの通常用いられる方法により行うことができる。これらの支持体はすべて市販のものが好適に使用できる。
なお、支持体に固定化されており、送液される検体中の検出対象物（アナライト）を捕捉して当該支持体上に固相化することができる状態の抗原捕捉物質（リガンド）を固相化リガンドと呼ぶこともある。
なお、支持体に固定化されており、送液される検体中の検出対象物（アナライト）を捕捉して当該支持体上に固相化することができる状態の抗原捕捉物質（リガンド）を固相化リガンドと呼ぶこともある。
【0083】
（１．１）病態情報生成方法の実施形態
本発明の病態情報生成方法は、癌の罹患又は発症に関する情報を生成する病態情報生成方法であって、被検試料に含まれる、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、α２，３－シアル酸残基、α２，６－シアル酸残基又はマンノース残基の４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に関する情報を取得する第１工程と、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に基づき、前記被検試料に係る被検者の癌の罹患又は発症に関する情報を生成する第２工程と、を有することを特徴とする。
以下において、基本的な各工程の好ましい態様等について説明する。
本発明の病態情報生成方法は、癌の罹患又は発症に関する情報を生成する病態情報生成方法であって、被検試料に含まれる、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、α２，３－シアル酸残基、α２，６－シアル酸残基又はマンノース残基の４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に関する情報を取得する第１工程と、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に基づき、前記被検試料に係る被検者の癌の罹患又は発症に関する情報を生成する第２工程と、を有することを特徴とする。
以下において、基本的な各工程の好ましい態様等について説明する。
【0084】
（ａ）第１工程
第１工程は、被検試料に含まれる、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、α２，３－シアル酸残基、α２，６－シアル酸残基又はマンノース残基の４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に関する情報を取得する工程である。
当該第１工程は、質量分析法又は前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のある第１物質と前記被検試料とを接触させる方法により、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に関する情報を測定する工程であることが精度、簡便さ、効率等の観点から好ましい。
第１工程は、被検試料に含まれる、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、α２，３－シアル酸残基、α２，６－シアル酸残基又はマンノース残基の４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に関する情報を取得する工程である。
当該第１工程は、質量分析法又は前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のある第１物質と前記被検試料とを接触させる方法により、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に関する情報を測定する工程であることが精度、簡便さ、効率等の観点から好ましい。
【0085】
質量分析法としては、例えば高速液体クロマトグラフ質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）、高速液体クロマトグラムタンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）、ガスクロマトグラム質量分析法（ＧＣ－ＭＳ）、ガスクロマトグラム質量分析法（ＧＣ－ＭＳ／ＭＳ）、キャピラリー電気泳道質量分析法（ＣＥ－ＭＳ）及びＩＣＰ質量分析法（ＩＣＰ－ＭＳ）などを用いることができる。４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のある第１物質と被検試料とを接触させる方法としては、例えばクロマトグラフィー（レクチンカラムなども含む。）などを用いることができる。
【0086】
この場合、前記第１物質が、前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のあるレクチン又は抗体であることが好ましい。さらに、前記第１物質が、前記４種の残基のいずれかを有する前記ＨＥ４と親和性のあるレクチンであり、ＣｏｎＡ、フジレクチン、ＳＳＡ又はＭＡＭのいずれかのレクチンであことが好ましい。
なお、前記β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、前記α２，３－シアル酸残基、前記α２，６－シアル酸残基又は前記マンノース残基の４種の残基のうちのいずれかの残基が、ＨＥ４の糖鎖の（非還元）末端にあることが好ましい。
なお、前記β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、前記α２，３－シアル酸残基、前記α２，６－シアル酸残基又は前記マンノース残基の４種の残基のうちのいずれかの残基が、ＨＥ４の糖鎖の（非還元）末端にあることが好ましい。
【0087】
（ｂ）第２工程
第２工程は、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に基づき、前記被検試料に係る被検者の癌の罹患又は発症に関する情報を生成する工程である。
当該第２工程は、前記４種の残基を有するＨＥ４に拘わらず、前記被検試料に含まれる前記全てのＨＥ４の前記総量に対する前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量の比率を算出する工程である態様であることも好ましい。
第２工程は、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に基づき、前記被検試料に係る被検者の癌の罹患又は発症に関する情報を生成する工程である。
当該第２工程は、前記４種の残基を有するＨＥ４に拘わらず、前記被検試料に含まれる前記全てのＨＥ４の前記総量に対する前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量の比率を算出する工程である態様であることも好ましい。
【0088】
また、第２工程が、前記被検者の癌の罹患又は発症に関する情報として、前記被検者が癌に罹患しているか否か、前記被検者が癌に罹患している確率、前記被検者の癌の悪性度、又は前記被検者の癌のステージに関する情報を生成する工程である態様であることも好ましい。さらに、第２工程が、前記被検者の癌の罹患又は発症に関する情報として、前記被検者が卵巣癌に罹患しているか否かに関する情報を生成する工程である態様も好ましい。
【0089】
（ｃ）第３工程
本発明病態情報生成方法においては、さらに、前記４種の残基を有するＨＥ４に拘わらず、前記被検試料に含まれる全てのＨＥ４の総量を取得する第３工程を有することが、精度の観点から、好ましい。
当該第３工程が、質量分析法又はＨＥ４のポリペプチド鎖部分と親和性のある第２物質と前記被検試料とを接触させる方法により、前記ＨＥ４の総量を測定する工程であることが好ましい。
質量分析法としては、例えば前述した各種質量分析法などを用いることができる。ＨＥ４のポリペプチド鎖部分と親和性のある第２物質と被検試料とを接触させる方法としては、ＨＥ４のポリペプチド鎖部分と親和性のある抗体を用いたクロマトグラフィーや免疫反応（ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、金コロイド法、ラテックス凝集法、放射免疫測定法、キャピラリー電気泳道法、酵素活性発光法なども含む）などを用いることができる。
本発明病態情報生成方法においては、さらに、前記４種の残基を有するＨＥ４に拘わらず、前記被検試料に含まれる全てのＨＥ４の総量を取得する第３工程を有することが、精度の観点から、好ましい。
当該第３工程が、質量分析法又はＨＥ４のポリペプチド鎖部分と親和性のある第２物質と前記被検試料とを接触させる方法により、前記ＨＥ４の総量を測定する工程であることが好ましい。
質量分析法としては、例えば前述した各種質量分析法などを用いることができる。ＨＥ４のポリペプチド鎖部分と親和性のある第２物質と被検試料とを接触させる方法としては、ＨＥ４のポリペプチド鎖部分と親和性のある抗体を用いたクロマトグラフィーや免疫反応（ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、金コロイド法、ラテックス凝集法、放射免疫測定法、キャピラリー電気泳道法、酵素活性発光法なども含む）などを用いることができる。
【0090】
また、第３工程が、ＨＥ４のポリペプチド鎖部分と親和性のある第２物質と、前記被検試料とを接触させる方法により、前記全てのＨＥ４の前記総量を測定する工程であり、前記第２物質が、前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のある抗体であり、ＨＥ４の糖鎖の検出方法が、液体クロマトグラフィーによる分離方法であり、糖鎖を有するＨＥ４を含む被験試料を前記糖鎖を捕捉する機能を有する担体に接触させ、当該糖鎖を当該担体に捕捉する工程を経た後、当該糖鎖を捕捉した担体から当該糖鎖を遊離させる工程であることが好ましい。
【0091】
さらに、第３工程が、質量分析法により、前記全てのＨＥ４の前記総量を測定する工程であり、前記糖鎖を有するＨＥ４から遊離された糖鎖を、クロマトグラフィーにより分離し、糖鎖構造分布を得る工程、及び前記糖鎖構造分布におけるピークの相対的な強度を基準における対応するピークの相対的な強度と比較する工程を含むことが好ましい。
【0092】
本発明においては、前記第２物質が、支持体に固定されており、前記第１工程が、前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のある第１物質と、前記被検試料とを接触させる方法により、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量を測定する工程であり、前記第１物質が、前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のあるレクチンであり、前記第１物質が、蛍光体により標識されており、前記第１工程は、前記第２物質に捕捉されたＨＥ４と結合した前記第１物質を標識する蛍光体から発せられた蛍光の強度を測定し、前記蛍光の強度に基づき、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量を算出する工程であることも好ましい。
【0093】
なお、本発明の実施形態としては、前記第１工程を、前記第３工程の前に行う態様であることも精度、簡便さ、効率等の観点から好ましい。また、一方、本発明の別の実施形態としては、前記第３工程を、前記第１工程の前に行うことも好ましい。
【0094】
ｉ）前記第１工程を、前記第３工程の前に行う場合
この場合、前記第１工程が、前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のある第１物質と、前記被検試料とを接触させる方法により、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量を測定する工程であり、前記第１物質が、前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のあるレクチン又は抗体であることが好ましい。さらに、前記第１物質が、前記４種の残基のいずれかを有する前記ＨＥ４と親和性のあるレクチンであり、ＣｏｎＡ、フジレクチン、ＳＳＡ又はＭＡＭのいずれかのレクチンであることが好ましい。
この場合、前記第１工程が、前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のある第１物質と、前記被検試料とを接触させる方法により、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量を測定する工程であり、前記第１物質が、前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のあるレクチン又は抗体であることが好ましい。さらに、前記第１物質が、前記４種の残基のいずれかを有する前記ＨＥ４と親和性のあるレクチンであり、ＣｏｎＡ、フジレクチン、ＳＳＡ又はＭＡＭのいずれかのレクチンであることが好ましい。
【0095】
また、前記第１物質が、支持体（例えばレクチンカラムの担体）に固定化されており、前記第３工程が、ＨＥ４のポリペプチド鎖部分と親和性のある第２物質と、前記被検試料とを接触させる方法により、前記全てのＨＥ４の前記総量を測定する工程であり、前記第２物質が、前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のある抗体であることが本発明の効果発現の観点から好ましい。さらに、前記第１工程が、クロマトグラフィーによる工程であることが好ましい。
【0096】
ii）前記第３工程を、前記第１工程の前に行う場合
この場合、前記第２物質が、支持体に固定されており、前記第１工程が、前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のある第１物質と、前記被検試料とを接触させる方法により、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量を測定する工程であり、 前記第１物質が、前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のあるレクチンであり、前記第１物質が、蛍光体により標識されており、前記第１工程は、前記第２物質に捕捉されたＨＥ４と結合した前記第１物質を標識する蛍光体から発せられた蛍光の強度を測定し、前記蛍光の強度に基づき、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量を算出する工程であることが精度等の観点から好ましい。
この場合、前記第２物質が、支持体に固定されており、前記第１工程が、前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のある第１物質と、前記被検試料とを接触させる方法により、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量を測定する工程であり、 前記第１物質が、前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のあるレクチンであり、前記第１物質が、蛍光体により標識されており、前記第１工程は、前記第２物質に捕捉されたＨＥ４と結合した前記第１物質を標識する蛍光体から発せられた蛍光の強度を測定し、前記蛍光の強度に基づき、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量を算出する工程であることが精度等の観点から好ましい。
【0097】
さらに、前記第３工程が、質量分析法により、前記全てのＨＥ４の前記総量を測定する工程であり、前記質量分析法により得られた前記全てのＨＥ４の糖鎖構造分布と、前記糖鎖構造分布におけるピークの相対的な強度を基準における対応するピークの相対的な強度と比較する工程を更に含むことが、上記と同様の観点から、好ましい。
（１．２）ＨＥ４糖鎖の検出方法
本発明に係るＨＥ４糖鎖の検出方法は、上記のように、第１工程において、質量分析法又は前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のある第１物質と前記被検試料とを接触させる方法により、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に関する情報を測定する態様であることが好ましいが、ここでは、前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のある第１物質と前記被検試料とを接触させる方法として、前記レクチンとＨＥ４を含む可能性のある試料とを接触させ、レクチンに親和性のあるＨＥ４の量を検出・測定する方法について詳述する。
より具体的には、次の分析方法（Ａ）及び（Ｂ）を挙げることができる。
分析方法（Ａ）：特定レクチンにより、当該特定レクチンに親和性のあるＨＥ４と前記レクチンに親和性のないＨＥ４とを分別し、当該レクチンに親和性のあるＨＥ４の糖鎖又は全ＨＥ４量を検出（判定する）分析方法（以下、分析方法（Ａ）と称する。）
分析方法（Ｂ）：特定レクチンと、当該特定レクチンに親和性のあるＨＥ４とが結合した状態で当該レクチンに親和性のあるＨＥ４の量を判定する分析方法
（１．２）ＨＥ４糖鎖の検出方法
本発明に係るＨＥ４糖鎖の検出方法は、上記のように、第１工程において、質量分析法又は前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のある第１物質と前記被検試料とを接触させる方法により、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に関する情報を測定する態様であることが好ましいが、ここでは、前記４種の残基のうちのいずれかの残基と親和性のある第１物質と前記被検試料とを接触させる方法として、前記レクチンとＨＥ４を含む可能性のある試料とを接触させ、レクチンに親和性のあるＨＥ４の量を検出・測定する方法について詳述する。
より具体的には、次の分析方法（Ａ）及び（Ｂ）を挙げることができる。
分析方法（Ａ）：特定レクチンにより、当該特定レクチンに親和性のあるＨＥ４と前記レクチンに親和性のないＨＥ４とを分別し、当該レクチンに親和性のあるＨＥ４の糖鎖又は全ＨＥ４量を検出（判定する）分析方法（以下、分析方法（Ａ）と称する。）
分析方法（Ｂ）：特定レクチンと、当該特定レクチンに親和性のあるＨＥ４とが結合した状態で当該レクチンに親和性のあるＨＥ４の量を判定する分析方法
【0098】
《分析方法（Ａ）》
分析方法（Ａ）は、
（ａ）本発明のレクチンとして例えばβ－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基と親和性のあるレクチンと、ＨＥ４を含む可能性のある試料とを接触させることにより、前記レクチンに親和性のあるＨＥ４と前記レクチンに親和性のないＨＥ４とを分別する段階（以下、「分別段階（ａ）」ともいう。）、及び
（ｂ）前記試料中のレクチンに親和性のあるＨＥ４の量を判定する段階（以下、「判定段階（ｂ）」ともいう。）
を含む。
分析方法（Ａ）は、
（ａ）本発明のレクチンとして例えばβ－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基と親和性のあるレクチンと、ＨＥ４を含む可能性のある試料とを接触させることにより、前記レクチンに親和性のあるＨＥ４と前記レクチンに親和性のないＨＥ４とを分別する段階（以下、「分別段階（ａ）」ともいう。）、及び
（ｂ）前記試料中のレクチンに親和性のあるＨＥ４の量を判定する段階（以下、「判定段階（ｂ）」ともいう。）
を含む。
【0099】
前記分別段階（ａ）においてレクチンに親和性のあるＨＥ４とレクチンに親和性のないＨＥ４とを分別する方法は、レクチンとＨＥ４の親和性を利用する方法であれば、特に限定されるものではないが、例えば、担体にレクチンを結合させ、担体に結合したレクチン（以下、「レクチンアフィニティーカラム」又は単に「レクチンカラム」ともいう。）にＨＥ４を含む可能性のある試料を接触させ、レクチンに結合したＨＥ４とレクチンに結合しないＨＥ４を分離することによって行うことができる。
【0100】
担体としては、レクチンを結合させることのできるものであれば、限定されるものではないが、例えば、セファロース、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、スチレンとジビニルベンゼンのコポリマー、ポリアミド、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリエチレンオキシド、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリ塩化ビニル、ポリメチルアクリレート、ポリスチレン及びポリスチレン・コポリマー、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、コラーゲン、アルギン酸カルシウム、ラテックス、ポリスルホン、シリカ、ジルコニア、アルミナ、チタニア、セラミックスを挙げることができる。
【0101】
担体の形状も特に限定されるものではないが、粒子状のビーズ、プレート、及びゲルなどの形状の担体を用いることができる。例えば、レクチンに親和性のあるＨＥ４と前記レクチンに親和性のないＨＥ４との分別に、レクチンアフィニティーカラムを用いる場合は、担体はゲルの形状が好ましい。
【0102】
レクチンアフィニティーカラムは、定法に従って作製することが可能である。例えば、ＣＮＢｒ－活性化セファロース４Ｂを用い、メーカーの推奨するプロトコールに従って、カップリングを行い、レクチンカラムを作製することが可能である。セファロースゲルへのレクチンの結合量は、２～１０ｍｇ／ｍＬが好ましい。
【0103】
レクチンアフィニティーカラムを用いて、前記レクチンに親和性のあるＨＥ４と前記レクチンに親和性のないＨＥ４とを分別する方法は、通常のレクチンアフィニティーカラムを用いた糖タンパク質の分離方法に従って行うことができる。
レクチンアフィニティーカラムは、ＨＥ４を含む可能性のある試料を導入する前に、緩衝液で平衡化させる。平衡化緩衝液としては、例えば、０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝液、又は０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有トリス塩酸緩衝液を用いることができる。
レクチンアフィニティーカラムは、ＨＥ４を含む可能性のある試料を導入する前に、緩衝液で平衡化させる。平衡化緩衝液としては、例えば、０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝液、又は０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有トリス塩酸緩衝液を用いることができる。
【0104】
カラムを平衡化した後に、ＨＥ４を含む可能性のある試料を添加し、一定時間静置し、レクチンとＨＥ４とを接触させる。接触時間は、特に限定されるものではなく、レクチンの種類とＨＥ４の親和性によって、適宜決定することができるが、結合の速度と効率を考慮すると、通常１５分～３０分で行うことが多い。
レクチンとＨＥ４とを接触させる温度も、特に限定されるものではなく、レクチンの種類とＨＥ４との親和性によって、適宜決定することができるが、カラムの凍結防止やレクチンに親和性のないタンパク質の非特異結合の生成防止を考慮して、０℃～４０℃で行うことが可能であり、好ましくは０℃～３０℃である。
例えば、ＴＪＡ－ＩＩとＨＥ４を接触させる温度も特に限定されるものではないが、通常、４℃～１０℃で接触させるのが好ましい。また、ＷＦＡとＨＥ４とを接触させる温度も特に限定されるものではないが、通常、４℃～１０℃で接触させるのが好ましい。
レクチンとＨＥ４とを接触させる温度も、特に限定されるものではなく、レクチンの種類とＨＥ４との親和性によって、適宜決定することができるが、カラムの凍結防止やレクチンに親和性のないタンパク質の非特異結合の生成防止を考慮して、０℃～４０℃で行うことが可能であり、好ましくは０℃～３０℃である。
例えば、ＴＪＡ－ＩＩとＨＥ４を接触させる温度も特に限定されるものではないが、通常、４℃～１０℃で接触させるのが好ましい。また、ＷＦＡとＨＥ４とを接触させる温度も特に限定されるものではないが、通常、４℃～１０℃で接触させるのが好ましい。
【0105】
次に、レクチンに親和性のある結合画分（以下、「結合画分」ともいう。）と、レクチンに親和性のない非結合画分（以下、「非結合画分」ともいう。）を分別する。
レクチンへの非結合画分は、洗浄用緩衝液をカラムに添加し、素通り画分を回収することによって得ることができる。洗浄用緩衝液は、レクチンとＨＥ４の結合を解離させずに、非結合成分を流出させることのできる緩衝液であれば、限定されるものではないが、例えば、前記平衡化に用いた緩衝液を使用することができる。洗浄用緩衝液の容量は、レクチンの種類とＨＥ４との親和性に応じて、適宜決定することができるが、好ましくはカラム容量の３～７倍であり、より好ましくは５倍程度である。
レクチンへの非結合画分は、洗浄用緩衝液をカラムに添加し、素通り画分を回収することによって得ることができる。洗浄用緩衝液は、レクチンとＨＥ４の結合を解離させずに、非結合成分を流出させることのできる緩衝液であれば、限定されるものではないが、例えば、前記平衡化に用いた緩衝液を使用することができる。洗浄用緩衝液の容量は、レクチンの種類とＨＥ４との親和性に応じて、適宜決定することができるが、好ましくはカラム容量の３～７倍であり、より好ましくは５倍程度である。
【0106】
レクチンへの結合画分は、溶出用緩衝液をカラムに添加し、溶出画分を回収することによって得ることができる。溶出用緩衝液は、ハプテン糖を含んでおり、それによりレクチンに結合したＨＥ４をレクチンから分離させることができる。ハプテン糖はレクチンの特異性によって適宜選択することが可能であるが、ＴＪＡ－ＩＩの場合は、ラクトースなどをハプテン糖として用いることができ、例えば１０ｍＭラクトース、０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝液を用いて、溶出画分を回収することができる。
【0107】
また、ＷＦＡの場合は、ＧａｌＮＡｃなどをハプテン糖として用いることができ、例えば１０ｍＭＧａｌＮＡｃ、０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝液を用いて、溶出画分を回収することができる。溶出用緩衝液の容量は、適宜選択することが可能であるが、好ましくはカラム容量の３～７倍であり、より好ましくは５倍程度である。溶出の温度も特に限定されるものではないが、０～４０℃、好ましくは２～２５℃、より好ましくは４～２０℃で行うことができる。
例えば、ＴＪＡ－ＩＩからＨＥ４を溶出させる温度は、特に限定されるものではないが、室温で溶出させるのが好ましい。また、ＷＦＡからＨＥ４を溶出させる温度も、特に限定されるものではないが、室温で溶出させるのが好ましい。
例えば、ＴＪＡ－ＩＩからＨＥ４を溶出させる温度は、特に限定されるものではないが、室温で溶出させるのが好ましい。また、ＷＦＡからＨＥ４を溶出させる温度も、特に限定されるものではないが、室温で溶出させるのが好ましい。
【0108】
前記判定段階（ｂ）における、レクチンに親和性のあるＨＥ４の量の判定は、
（１）分別されたレクチンに親和性のあるＨＥ４量の測定による判定、
（２）分別前の試料中のＨＥ４量の測定、及び分別されたレクチンに親和性のあるＨＥ４の測定による判定、又は
（３）分別前の試料中のＨＥ４量の測定、及び分別されたレクチンに親和性のないＨＥ４量の測定による判定
を挙げることができる。
（１）分別されたレクチンに親和性のあるＨＥ４量の測定による判定、
（２）分別前の試料中のＨＥ４量の測定、及び分別されたレクチンに親和性のあるＨＥ４の測定による判定、又は
（３）分別前の試料中のＨＥ４量の測定、及び分別されたレクチンに親和性のないＨＥ４量の測定による判定
を挙げることができる。
【0109】
前記分別されたレクチンに親和性のあるＨＥ４量の測定による判定（１）は、前記レクチンへの結合画分中のＨＥ４量を定量的又は半定量的に測定することによって行うことができる。すなわち、患者の血液中に含まれているレクチンに親和性のあるＨＥ４の絶対量を測定することによって、判定を行うものである。
【0110】
前記分別前の試料中のＨＥ４量の測定、及び分別されたレクチンに親和性のあるＨＥ４量の測定による判定（２）は、分別前の試料中のＨＥ４量（又は、前記レクチンへの結合画分及びレクチンへの非結合画分のＨＥ４量の合計量）と前記レクチンへの結合画分中のＨＥ４量とを比較することによって行うことができる。
具体的には、分別前の試料中のＨＥ４量（又は、前記レクチンへの結合画分及びレクチンへの非結合画分のＨＥ４量の合計量）に対する、前記レクチンへの結合画分中のＨＥ４量の割合を計算することによって、レクチンに親和性のあるＨＥ４の量を判定することが可能であり、例えば、以下のいずれかの式によって求めることができる。
ＨＥ４の結合率＝（結合画分中のＨＥ４量／結合画分及び非結合画分のＨＥ４の合計量）×１００％
ＨＥ４の結合率＝（結合画分中のＨＥ４量／分別前の試料中のＨＥ４量）×１００％
具体的には、分別前の試料中のＨＥ４量（又は、前記レクチンへの結合画分及びレクチンへの非結合画分のＨＥ４量の合計量）に対する、前記レクチンへの結合画分中のＨＥ４量の割合を計算することによって、レクチンに親和性のあるＨＥ４の量を判定することが可能であり、例えば、以下のいずれかの式によって求めることができる。
ＨＥ４の結合率＝（結合画分中のＨＥ４量／結合画分及び非結合画分のＨＥ４の合計量）×１００％
ＨＥ４の結合率＝（結合画分中のＨＥ４量／分別前の試料中のＨＥ４量）×１００％
【0111】
また、分別前の試料中のＨＥ４量の測定、及び分別されたレクチンに親和性のないＨＥ４量の測定による判定（３）は、分別前の試料中のＨＥ４量（又は、前記レクチンへの結合画分及びレクチンへの非結合画分のＨＥ４量の合計量）と前記レクチンへの非結合画分中のＨＥ４量とを比較することによって行うことができる。
具体的には、分別前の試料中のＨＥ４量（又は、前記レクチンへの結合画分及びレクチンへの非結合画分のＨＥ４量の合計量）から、前記レクチンへの非結合画分中のＨＥ４量を減算することによって、レクチンに親和性のあるＨＥ４の量を判定することが可能である。例えば、以下のいずれかの式によって求めることができる。
レクチン親和性ＨＥ４量＝分別前の試料中のＨＥ４量－非結合画分中のＨＥ４量レクチン親和性ＨＥ４量＝結合画分及び非結合画分のＨＥ４の合計量－非結合画分中のＨＥ４量
具体的には、分別前の試料中のＨＥ４量（又は、前記レクチンへの結合画分及びレクチンへの非結合画分のＨＥ４量の合計量）から、前記レクチンへの非結合画分中のＨＥ４量を減算することによって、レクチンに親和性のあるＨＥ４の量を判定することが可能である。例えば、以下のいずれかの式によって求めることができる。
レクチン親和性ＨＥ４量＝分別前の試料中のＨＥ４量－非結合画分中のＨＥ４量レクチン親和性ＨＥ４量＝結合画分及び非結合画分のＨＥ４の合計量－非結合画分中のＨＥ４量
【0112】
前記（１）及び（２）の判定では、レクチンに結合したＨＥ４をレクチンから分離してその量を測定するが、前記（３）の判定のうち、分別前の試料中のＨＥ４量と非結合画分中のＨＥ４量とからの判定では、レクチンに結合したＨＥ４量を測定しないため、レクチンに結合したＨＥ４を分離せずに判定することもできる。
また、分取した結合画分及び非結合画分のＨＥ４量は、すべての画分についてＨＥ４量の測定を行うことが好ましいが、予めＨＥ４が含まれる分取画分を調べておき、その画分について測定を行い、ＨＥ４の分析を行うことも可能である。
また、分取した結合画分及び非結合画分のＨＥ４量は、すべての画分についてＨＥ４量の測定を行うことが好ましいが、予めＨＥ４が含まれる分取画分を調べておき、その画分について測定を行い、ＨＥ４の分析を行うことも可能である。
【0113】
前記判定段階（ｂ）において、レクチンに親和性のあるＨＥ４量を判定するためのＨＥ４の測定方法としては、ＨＥ４を定量的又は半定量的に判定することのできる方法であれば、特に限定されるものではないが、トータルＨＥ４の測定方法又はフリーＨＥ４の測定方法を用いることができる。
トータルＨＥ４の測定方法又はフリーＨＥ４の測定方法は、定法に従い、抗体又はその断片を用いる免疫学的手法（例えば、酵素免疫測定法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、免疫組織染色法、又はウエスタンブロット等）によって測定することができ、ＰＳＡ測定キットとして市販されているものを使用することも可能である。
トータルＨＥ４の測定方法又はフリーＨＥ４の測定方法は、定法に従い、抗体又はその断片を用いる免疫学的手法（例えば、酵素免疫測定法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、免疫組織染色法、又はウエスタンブロット等）によって測定することができ、ＰＳＡ測定キットとして市販されているものを使用することも可能である。
【0114】
後述の実施例の解析により、本発明のＨＥ４の分析方法に用いることのできるＭＡＭ 又はＷＦＡを用いたレクチンアフィニティーカラムは、試料中のＨＥ４を約１００％（少なくとも、９７％以上）回収することが可能であることが分かった。
【0115】
《分析方法（Ｂ）》
前記分析方法（Ｂ）は、レクチンにより直接レクチンに親和性のあるＨＥ４を検出する方法であるが、具体的には、電気泳動によるレクチンブロット、又はドットブロットによるレクチンブロットを挙げることができる。どちらのレクチンブロットも、定法に従って行うことができるが、電気泳動によるレクチンブロットの場合、ＨＥ４を含む可能性のある試料を電気泳動し、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜にＨＥ４を転写し、サンプルメンブレンとして用いる。ドットブロットによるレクチンブロットの場合、ドットブロッティング装置により、ＨＥ４を含む可能性のある試料をニトロセルロース膜、又はＰＶＤＦ膜などに吸着させ、サンプルメンブレンとして用いる。サンプルメンブレンは、ブロッキングバッファーでブロッキングを行い、ビオチン標識したレクチン、例えばビオチン標識ＷＦＡ又はビオチン標識ＴＪＡ－ＩＩを含む溶液中で接触させる。その後、発色酵素、又は発光酵素、例えばＨＲＰで標識されたアビジンと接触させ、発色液又は発光液を接触させ、得られたシグナルを検出する。
前記分析方法（Ｂ）は、レクチンにより直接レクチンに親和性のあるＨＥ４を検出する方法であるが、具体的には、電気泳動によるレクチンブロット、又はドットブロットによるレクチンブロットを挙げることができる。どちらのレクチンブロットも、定法に従って行うことができるが、電気泳動によるレクチンブロットの場合、ＨＥ４を含む可能性のある試料を電気泳動し、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜にＨＥ４を転写し、サンプルメンブレンとして用いる。ドットブロットによるレクチンブロットの場合、ドットブロッティング装置により、ＨＥ４を含む可能性のある試料をニトロセルロース膜、又はＰＶＤＦ膜などに吸着させ、サンプルメンブレンとして用いる。サンプルメンブレンは、ブロッキングバッファーでブロッキングを行い、ビオチン標識したレクチン、例えばビオチン標識ＷＦＡ又はビオチン標識ＴＪＡ－ＩＩを含む溶液中で接触させる。その後、発色酵素、又は発光酵素、例えばＨＲＰで標識されたアビジンと接触させ、発色液又は発光液を接触させ、得られたシグナルを検出する。
【0116】
更に、レクチンにより直接レクチンに親和性のあるＨＥ４を検出する方法（Ｂ）としては、イムノブロット及び酵素免疫法を一部変更して行うことができる。具体的には、前記ＨＥ４に対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を、ニトロセルロース膜など、又はＥＬＩＳＡプレートなどに固相化し、ブロッキングバッファーでブロッキングを行う。ＨＥ４を含む可能性のある試料をニトロセルロース膜、又はＥＬＩＳＡプレートなどに接触させ、次にビオチン標識したレクチン、例えばビオチン標識ＷＦＡ又はビオチン標識ＴＪＡ－ＩＩを接触させる。その後、発色酵素、又は発光酵素、例えばＨＲＰで標識されたアビジンを結合させ、発色液又は発光液によりシグナルを検出することができる。
【0117】
本発明のＨＥ４の分析方法に用いる被検試料としては、前記被検試料を用いることができるが、血液、血清、血漿、腹水又は卵巣の生検標本が好ましく、特には血液、血清、又は血漿が好ましい。
健常人の血液、血清、又は血漿中のβ－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基及び／又はα２，３シアル酸残基及びα２，６シアル酸残基を有するＨＥ４と癌患者におけるこれらの糖鎖を有するＨＥ４の含有量又は比率が異なるからである。
健常人の血液、血清、又は血漿中のβ－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基及び／又はα２，３シアル酸残基及びα２，６シアル酸残基を有するＨＥ４と癌患者におけるこれらの糖鎖を有するＨＥ４の含有量又は比率が異なるからである。
【0118】
前記尿、血液、血清、血漿、髄液、唾液、及び腹水などの液性の試料は、前記分析方法（Ａ）又は分析方法（Ｂ）において、それぞれの分析方法に応じて適当な緩衝液により希釈して使用することができる。また、細胞、組織、又は器官などの固形の試料は、固形の試料の体積の２～１０倍程度の適当な緩衝液で均一化（ホモジェナイズ）して、懸濁液又はその上清を、前記分析方法（Ａ）又は分析方法（Ｂ）において、そのまま、又は更に希釈して使用することができる。
【0119】
例えば、前記分析方法（Ａ）において、レクチンアフィニティーカラムを用いる場合、前記液体試料、又は固形の試料の懸濁液若しくはその上清は、適当な緩衝液により希釈して用いることができる。希釈倍率は、レクチンとＨＥ４との結合が阻害されなければ、特に限定されないが、好ましくは２～４００倍であり、より好ましくは２～３００倍であり、最も好ましくは４～２００倍である。
また、レクチンアフィニティーカラムにアプライする試料の容量は、カラムのベッドボリュームの４０％以下が好ましく、３０％以下がより好ましく、２０％以下が、最も好ましい。例えば１ｍＬのベッドボリュームのレクチンアフィニティーカラムを用いる場合、４００μＬ以下が好ましく、３００μＬ以下がより好ましく、２００μＬ以下が最も好ましい。
また、レクチンアフィニティーカラムにアプライする試料の容量は、カラムのベッドボリュームの４０％以下が好ましく、３０％以下がより好ましく、２０％以下が、最も好ましい。例えば１ｍＬのベッドボリュームのレクチンアフィニティーカラムを用いる場合、４００μＬ以下が好ましく、３００μＬ以下がより好ましく、２００μＬ以下が最も好ましい。
【0120】
＜サンドイッチ型アッセイ－＞
本発明に係るサンドイッチ型アッセイは、標識化レクチン及び測定領域に固相化された捕捉物質を用いて、検出対象物質としてのＨＥ４を定量するためのサンドイッチ型アッセイであって、測定領域に非特異的に吸着した夾雑物が有する、検出対象物質と同じ糖鎖への標識レクチンの結合を抑制する処理を含む。
なお、「測定領域」は、詳細は後述するが、そこから発せられる蛍光の強度が測定される領域（空間）であって、固相化された捕捉物質、それを担持している支持体、さらにそれらを載せている部材の表面などを含む領域を指す。
本発明に係るサンドイッチ型アッセイは、標識化レクチン及び測定領域に固相化された捕捉物質を用いて、検出対象物質としてのＨＥ４を定量するためのサンドイッチ型アッセイであって、測定領域に非特異的に吸着した夾雑物が有する、検出対象物質と同じ糖鎖への標識レクチンの結合を抑制する処理を含む。
なお、「測定領域」は、詳細は後述するが、そこから発せられる蛍光の強度が測定される領域（空間）であって、固相化された捕捉物質、それを担持している支持体、さらにそれらを載せている部材の表面などを含む領域を指す。
【0121】
測定領域に非特異的に吸着した夾雑物が有する、検出対象物質と同じ糖鎖への標識化レクチンの結合を抑制する処理は特に限定されるものではなく、その夾雑物の種類（糖タンパク質か、糖脂質か）の他、検出対象物質、捕捉物質、標識化レクチン、測定系などに応じて改変することが可能である。
本明細書では主に、夾雑物が検出対象物質と同じ糖鎖を有するＨＥ４である場合の実施形態に即して本発明を説明するが、夾雑物が検出対象物質と同じ糖鎖を有する糖タンパク質以外の物質、例えば糖脂質である場合についても、その説明を応用して、所期の作用効果が奏されるように本発明を実施することが可能である。
本明細書では主に、夾雑物が検出対象物質と同じ糖鎖を有するＨＥ４である場合の実施形態に即して本発明を説明するが、夾雑物が検出対象物質と同じ糖鎖を有する糖タンパク質以外の物質、例えば糖脂質である場合についても、その説明を応用して、所期の作用効果が奏されるように本発明を実施することが可能である。
【0122】
＜ＳＳ結合開裂剤＞
本発明の典型的な実施形態において、測定領域に非特異的に吸着した夾雑物は、検出対象物質と同じ糖鎖を有する糖タンパク質である。この場合、その糖鎖への標識化レクチンの結合を抑制する処理は、ジスルフィド結合を開裂する作用を呈する物質（本明細書において「ＳＳ結合開裂剤」と称する。）を夾雑物としての糖タンパク質に接触させることにより、検出対象物質と同じ糖鎖を含むドメインを遊離させる処理であることが好適である。
本発明の典型的な実施形態において、測定領域に非特異的に吸着した夾雑物は、検出対象物質と同じ糖鎖を有する糖タンパク質である。この場合、その糖鎖への標識化レクチンの結合を抑制する処理は、ジスルフィド結合を開裂する作用を呈する物質（本明細書において「ＳＳ結合開裂剤」と称する。）を夾雑物としての糖タンパク質に接触させることにより、検出対象物質と同じ糖鎖を含むドメインを遊離させる処理であることが好適である。
【0123】
夾雑物のジスルフィド結合を開裂する作用を呈する物質（ＳＳ結合開裂剤）は特に限定されるものではないが、例えば還元剤、すなわち－Ｓ－Ｓ－の架橋構造を－ＳＨ及びＨＳ－の２つのスルフヒドリル基（チオール基）に還元する作用を呈する化合物が好適である。
【0124】
還元剤は特に限定されるものではなく、タンパク質のジスルフィド結合を開裂するために用いられている各種の還元剤の中から選択することができる。そのような還元剤としては、例えば、亜硫酸、次亜硫酸、亜リン酸、次亜リン酸などの低級酸素酸塩、水酸化アルカリ、求核剤となるチオール塩などが挙げられる。具体的には、例えば、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオグリセロール、トルエンチオスルフィン酸ナトリウム、２－メルカプトエタノール、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２－メルカプトエチルアミン塩酸塩、臭化２－アミノエチルイソチオウロニウム臭化水素酸塩、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンなどを用いることができ、これらの中では特にメタ重亜硫酸ナトリウムが好ましい。
ＳＳ結合開裂剤としては上記のような化合物以外にも、ジスルフィド還元酵素（ジスルフィドレダクターゼ）を用いることができる。
ＳＳ結合開裂剤としては上記のような化合物以外にも、ジスルフィド還元酵素（ジスルフィドレダクターゼ）を用いることができる。
【0125】
＜カラムクロマトグラフィー＞
カラムクロマトグラフィーを用いた分析（測定）方法としては（ａ）検体由来の試料からＨＥ４を精製する工程と、（ｂ）前記工程（ａ）で精製したＨＥ４からＨＥ４誘導体を調製する工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）で得られたＨＥ４誘導体を標識する工程と、（ｄ）前記工程（ｃ）で得られた標識化ＨＥ４誘導体を高速液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳道等のクロマトグラフィーを用いて高マンノース型糖鎖、Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、シアル酸α２，６－残基、シアル酸α２，３－残基に起因するシグナルを検出することにより、ＨＥ４上の糖鎖構造の解析を行う。
カラムクロマトグラフィーを用いた分析（測定）方法としては（ａ）検体由来の試料からＨＥ４を精製する工程と、（ｂ）前記工程（ａ）で精製したＨＥ４からＨＥ４誘導体を調製する工程と、（ｃ）前記工程（ｂ）で得られたＨＥ４誘導体を標識する工程と、（ｄ）前記工程（ｃ）で得られた標識化ＨＥ４誘導体を高速液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳道等のクロマトグラフィーを用いて高マンノース型糖鎖、Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、シアル酸α２，６－残基、シアル酸α２，３－残基に起因するシグナルを検出することにより、ＨＥ４上の糖鎖構造の解析を行う。
【0126】
例えば、工程（１）では血清検体中のアルブミンをｐｒｏｔｅｉｎＡアガロース（ＰＩＥＲＣＥ）などを用いて除去する工程、ＨＥ４タンパクを、抗ＨＥ４抗体を備え付けたビーズ等を用いてＨＥ４タンパクを精製する工程等が挙げられる。工程（ｂ）では工程（ａ）で回収したＨＥ４タンパクプロテイナーゼＫ、サーモリシン等を用いて、糖鎖とＨＥ４タンパクを切断する工程等がある。
工程（ｃ）では、工程（ｂ）で調整されたＨＥ４誘導体にＢＯＡ、ＰＡ、２－ＡＡ、２－ＡＢ等の糖鎖のアルデヒド基と結合するような化合物でラベル化する方法がある。
なお、前記レクチンアフィニティーカラム（「レクチンカラム」ともいう。）を高速液体クロマトグラフィー装置に装着して測定する方法も好ましい。
工程（ｃ）では、工程（ｂ）で調整されたＨＥ４誘導体にＢＯＡ、ＰＡ、２－ＡＡ、２－ＡＢ等の糖鎖のアルデヒド基と結合するような化合物でラベル化する方法がある。
なお、前記レクチンアフィニティーカラム（「レクチンカラム」ともいう。）を高速液体クロマトグラフィー装置に装着して測定する方法も好ましい。
【0127】
＜質量分析法＞
前記カラムクロマトグラフィー法の前記工程（ａ）～（ｂ）と同様に調製されたＨＥ４誘導体を質量分析法によって分析する工程を含む。
質量分析法としては、ＬＣ－ＭＳ、ＭＡＬＤＩ－ＴｏＦ－ＭＳ、ＧＣ－ＭＳ等を使用することができる。質量分析の方法としては、下記のような方法で実施することができる。質量分析において、測定対象の試料をイオン化した後、生成された様々なイオンを質量分析装置に送り込み、イオンの質量数ｍ、価数ｚの比である質量対電荷比ｍ／ｚ毎に、イオン強度を測定する。この結果得られたマススペクトルは、各質量対電荷比ｍ／ｚ値に対する、測定されたイオン強度のピーク（イオンピーク）からなる。
前記カラムクロマトグラフィー法の前記工程（ａ）～（ｂ）と同様に調製されたＨＥ４誘導体を質量分析法によって分析する工程を含む。
質量分析法としては、ＬＣ－ＭＳ、ＭＡＬＤＩ－ＴｏＦ－ＭＳ、ＧＣ－ＭＳ等を使用することができる。質量分析の方法としては、下記のような方法で実施することができる。質量分析において、測定対象の試料をイオン化した後、生成された様々なイオンを質量分析装置に送り込み、イオンの質量数ｍ、価数ｚの比である質量対電荷比ｍ／ｚ毎に、イオン強度を測定する。この結果得られたマススペクトルは、各質量対電荷比ｍ／ｚ値に対する、測定されたイオン強度のピーク（イオンピーク）からなる。
【0128】
このように、試料をイオン化した、そのものを質量分析することをＭＳ１と呼ぶ。多段解離が可能なタンデム型質量分析装置では、ＭＳ１で検出されたイオンピークのうち、ある特定の質量対電荷比ｍ／ｚの値を有するイオンピークを選定して（選択したイオン種を親イオンと呼ぶ。）、更に、そのイオンを、ガス分子との衝突等により解離分解し、生成した解離イオン種に対して、質量分析して、同様にマススペクトルが得られる。ここで、親イオンをｎ段解離して、その解離イオン種を質量分析することをＭＳｎ＋１と呼ぶ。このように、タンデム型質量分析装置では、親イオンを多段（１段、２段、…、ｎ段）に解離させ、各段階で生成したイオン種の質量数を分析する（ＭＳ２、ＭＳ３、…、ＭＳｎ＋１）。
【0129】
＜表面プラズモン励起増強蛍光分光：ＳＰＦＳ）法＞
本発明の検出方法に用いる測定法として、表面プラズモン励起増強蛍光分光（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ－ｆｉｅｌｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＳＰＦＳ）法が好適に用いられる。ＳＰＦＳは、誘電体部材上に形成された金属薄膜に全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる角度で励起光を照射したときに、金属薄膜を透過したエバネッセント波が表面プラズモンとの共鳴により数十倍～数百倍に増強されることを利用して、金属薄膜近傍に捕捉されたアナライト（分析対象物）を標識する蛍光体を効率的に励起させ、その蛍光シグナルを測定する方法である。このようなＳＰＦＳは、一般的な蛍光標識法などに比べて極めて感度が高いため、サンプル中にアナライトがごく微量しか存在しない場合であってもそれを定量することができる。
本発明の検出方法に用いる測定法として、表面プラズモン励起増強蛍光分光（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ－ｆｉｅｌｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＳＰＦＳ）法が好適に用いられる。ＳＰＦＳは、誘電体部材上に形成された金属薄膜に全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる角度で励起光を照射したときに、金属薄膜を透過したエバネッセント波が表面プラズモンとの共鳴により数十倍～数百倍に増強されることを利用して、金属薄膜近傍に捕捉されたアナライト（分析対象物）を標識する蛍光体を効率的に励起させ、その蛍光シグナルを測定する方法である。このようなＳＰＦＳは、一般的な蛍光標識法などに比べて極めて感度が高いため、サンプル中にアナライトがごく微量しか存在しない場合であってもそれを定量することができる。
【0130】
＜ＳＰＦＳ用測定部材＞
ＳＰＦＳ用測定部材は、一般的に、サンドイッチ型免疫複合体を形成してＳＰＦＳによる蛍光測定を行うための場（測定領域）が形成されているセンサチップと、サンドイッチ型免疫複合体の形成などに用いられる各種の溶液（アナライトを含む試料、標識リガンド溶液、その他の反応試薬等）を測定領域上に保持することのできる、流路又はウェルを構築するための部材とを積層化した構成をとる。
ＳＰＦＳ用測定部材は、一般的に、サンドイッチ型免疫複合体を形成してＳＰＦＳによる蛍光測定を行うための場（測定領域）が形成されているセンサチップと、サンドイッチ型免疫複合体の形成などに用いられる各種の溶液（アナライトを含む試料、標識リガンド溶液、その他の反応試薬等）を測定領域上に保持することのできる、流路又はウェルを構築するための部材とを積層化した構成をとる。
【0131】
センサチップは、基本的に、金属薄膜の裏面に励起光を導入するための透明支持体と、当該透明支持体上に形成された、表面プラズモン共鳴を発生させるための金属薄膜と、当該金属薄膜上に形成された、アナライトをセンサ表面に捕捉するための反応層とを含み、さらに必要に応じて、金属薄膜と反応層の間に形成された、蛍光体が金属薄膜に近接しすぎることにより起こる蛍光の金属消光を防止するためのスペーサ層を含んでいてもよい。
【0132】
反応層が形成されている部位が測定領域に相当する。流路又はウェルの底面全域に反応層を形成して測定領域としてもよいし、底面の一部のみに（必要であれば所望のパターニングで）反応層を形成して測定領域としてもよい。測定領域の面積は、一般的にレーザー光として照射される励起光の照射面積を考慮しながら調整することができる。例えば、励起光のスポット径が１ｍｍφ程度であれば、上記アッセイエリアは通常、少なくとも数ｍｍ四方の面積を有するものとなるよう設計される。
【0133】
ＳＰＦＳのシステムを、密閉流路を通じて各種の溶液を送液する「流路型」とする場合、センサチップの上に、流路を形成するための穴のあいた「フローセル」を積載し、必要に応じてさらにその上に、上記フローセルの穴に対応する位置に送液導入口及び送液排出口のあいた「天板」を積載し、これらを密着させて固定するようにして、測定部材を構築する。上記フローセルの穴に対応する位置のセンサチップ表面が、流路の底面をなし、そこに測定領域が形成される。流路型の場合、例えばポンプやチューブを含む送液手段を用いて、各種の液体を送液導入口から流路内に送液して送液排出口から排出することができ、必要に応じて往復型、循環型の送液を行うこともできる。送液速度や送液（循環）時間などの条件は、試料の量や試料中のアナライトの濃度、流路ないしウェルのサイズや反応層の態様（固相化リガンドの密度等）、ポンプの性能等を考慮しながら、適宜調整することができる。
【0134】
一方、ＳＰＦＳのシステムを、上記流路よりも広い空間に各種の溶液を貯留させる「ウェル型」とする場合、センサチップの上に、ウェルを形成するための貫通孔を有する「ウェル部材」を積載して固定することにより測定部材を構築する。ウェル型の場合、例えばピペット状の部材を用いて、各種の液体をウェルに添加し、除去することができる。
【0135】
上記フローセルは、例えばシート状のポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製とすることができる。上記天板は、測定領域から発せられる蛍光を測定できるよう透明性を有する材料で作製され、例えばプレート状のポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）製とすることができる。あるいは、フローセル及び天板を、成形加工やフォトリソグラフィにより所望の形状にしたプラスチック製とすることも可能である。
【0136】
センサチップ上にフローセル又はウェル部材を密着させて固定する手段は特に限定されるものではなく、一般的には物理的に上下から圧力をかけるようにすればよく、必要であれば、透明支持体と同じ光屈折率を有する接着剤、マッチングオイル、透明粘着シートなどを用いてもよい。
【0137】
＜ＳＰＦＳ用測定装置＞
本発明に係る測定法は、一般的なＳＰＦＳ用測定装置を使用して実施することができる。ＳＰＦＳ用測定装置は、基本的に、ＳＰＦＳ用測定部材が着脱可能となっており、使用する蛍光体に応じた適切な波長の励起光（好適にはレーザー光）を照射するための光源、励起光をセンサチップの金属薄膜の裏面に所定の角度で入射させるためのプリズム（透明支持体が平面基板状のセンサチップを使用する場合）、金属薄膜で反射した光を受光しその強度を測定する受光器、蛍光体から発せられる蛍光を集光するためのレンズ及びその蛍光の強度を測定するための検出器、励起光及び蛍光から所定の波長を有する光のみを透過させそれ以外の光をカットするための各種のフィルタなどを備える。
本発明に係る測定法は、一般的なＳＰＦＳ用測定装置を使用して実施することができる。ＳＰＦＳ用測定装置は、基本的に、ＳＰＦＳ用測定部材が着脱可能となっており、使用する蛍光体に応じた適切な波長の励起光（好適にはレーザー光）を照射するための光源、励起光をセンサチップの金属薄膜の裏面に所定の角度で入射させるためのプリズム（透明支持体が平面基板状のセンサチップを使用する場合）、金属薄膜で反射した光を受光しその強度を測定する受光器、蛍光体から発せられる蛍光を集光するためのレンズ及びその蛍光の強度を測定するための検出器、励起光及び蛍光から所定の波長を有する光のみを透過させそれ以外の光をカットするための各種のフィルタなどを備える。
【0138】
より具体的な態様は、例えば、特開２０１０―１４５２７２号公報、特開２０１１－８０９３５号公報、特開２００８－１０２１１７号公報、特許第３５６２９１２号公報など、各種の文献を参照することができる。
【0139】
【0140】
図１及び図２に示すように、本発明の定量測定装置１０は、鉛直断面形状が略台形であるプリズム形状の誘電体部材１２と、この誘電体部材１２の水平な上面１２ａに形成された金属膜１４とを有するセンサチップ１６を備えており、このセンサチップ１６は、定量測定装置１０のセンサチップ装填部１８に装填されている。
【0141】
また、誘電体部材１２の下方の一方の側面１２ｂの側には、図に示すように、光源２０が配置されており、この光源２０からの入射光２２が、誘電体部材１２の外側下方から、誘電体部材１２の側面１２ｂに入射して、誘電体部材１２を介して、誘電体部材１２の上面１２ａに形成された金属膜１４に向かって照射されるようになっている。
【0142】
また、光源２０と誘電体部材１２との間には、光源２０から照射されるレーザー光を、金属膜１４上で表面プラズモンを効率よく発生させるＰ偏光とするための偏光フィルタを設けることもできる。
【0143】
また、誘電体部材１２の下方の他方の側面１２ｃの側には、図１に示すように、入射光２２が金属膜１４によって反射された金属膜反射光２４を受光する受光手段２６が備えられている。
【0144】
なお、光源２０には、光源２０から照射される入射光２２の、金属膜１４に対する入射角α１を適宜変更可能とする入射角調整手段（図示せず）が備えられている。一方で、受光手段２６にも、図示しない可動手段が備えられており、金属膜反射光２４の反射角が変わった場合にも、光源２０と同期して、確実に金属膜反射光２４を受光するように構成されている。
【0145】
なお、センサチップ１６、光源２０、受光手段２６によって、本発明の定量測定装置１０のＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：表面プラズモン共鳴）測定を行うＳＰＲ測定部２８が構成されている。
また、センサチップ１６の上方には、後述するような蛍光物質が励起されて発光した蛍光３０を受光するための光検出手段３２が備えられている。
また、センサチップ１６の上方には、後述するような蛍光物質が励起されて発光した蛍光３０を受光するための光検出手段３２が備えられている。
【0146】
なお、センサチップ１６と、光検出手段３２との間には、例えば、カットフィルタや集光レンズなどを設けることもできる。
なお、センサチップ１６、光源２０、光検出手段３２によって、本発明の定量測定装置１０のＳＰＦＳ測定を行うＳＰＦＳ測定部３４が構成されている。
なお、センサチップ１６、光源２０、光検出手段３２によって、本発明の定量測定装置１０のＳＰＦＳ測定を行うＳＰＦＳ測定部３４が構成されている。
【0147】
また、受光手段２６及び光検出手段３２は、それぞれ、定量演算手段４０に接続されており、受光手段２６によって受光した金属膜反射光２４の光量と、光検出手段３２によって受光した蛍光３０の光量とが、定量演算手段４０に送信されるように構成されている。
【0148】
また、本実施例のセンサチップ１６では、金属膜１４の上面１４ａに微細流路３６が形成されている。この微細流路３６の一部には、検出対象抗原（アナライト）と特異的に結合する分子（リガンド）が固相化されたセンサ部３８が設けられている。
【0149】
[２] 病態情報生成システム
本発明の病態情報生成システムは、癌の罹患又は発症に関する情報を生成する病態情報生成システムであって、被検試料に含まれる、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、α２，３－シアル酸残基、α２，６－シアル酸残基又はマンノース残基の４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に関する情報を取得する第１工程部と、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に基づき、前記被検試料に係る被検者の癌の罹患又は発症に関する情報を生成する第２工程部と、を有することを特徴とする。
実施形態としては、本発明の上記病態情報生成方法を実施するためのシステムであることが好ましい。
本発明の病態情報生成システムは、癌の罹患又は発症に関する情報を生成する病態情報生成システムであって、被検試料に含まれる、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、α２，３－シアル酸残基、α２，６－シアル酸残基又はマンノース残基の４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に関する情報を取得する第１工程部と、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に基づき、前記被検試料に係る被検者の癌の罹患又は発症に関する情報を生成する第２工程部と、を有することを特徴とする。
実施形態としては、本発明の上記病態情報生成方法を実施するためのシステムであることが好ましい。
【0150】
［３］ＨＥ４糖鎖分析キット
本発明のＨＥ４糖鎖分析キットは、本発明のＨＥ４糖鎖分析キットは、糖鎖を有するＨＥ４及び抗ＨＥ４抗体を含むＨＥ４糖鎖分析キットであって、本発明の上記病態情報生成方法を実施するための分析キットであることを特徴とする。また、糖鎖を有するＨＥ４及び抗ＨＥ４抗体を含むＨＥ４糖鎖分析キットであって、前記糖鎖の（非還元）末端にβ－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、α２，３－シアル酸残基、α２，６－シアル酸残基又はマンノース残基を有するＨＥ４と親和性のある物質及び抗ＨＥ４抗体を含むことを特徴とする。
本発明のＨＥ４糖鎖分析キットは、本発明のＨＥ４糖鎖分析キットは、糖鎖を有するＨＥ４及び抗ＨＥ４抗体を含むＨＥ４糖鎖分析キットであって、本発明の上記病態情報生成方法を実施するための分析キットであることを特徴とする。また、糖鎖を有するＨＥ４及び抗ＨＥ４抗体を含むＨＥ４糖鎖分析キットであって、前記糖鎖の（非還元）末端にβ－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、α２，３－シアル酸残基、α２，６－シアル酸残基又はマンノース残基を有するＨＥ４と親和性のある物質及び抗ＨＥ４抗体を含むことを特徴とする。
【0151】
実施形態としては、前記ＨＥ４と親和性のある物質が、前記レクチン群（１）～（４）の全体から選択されたいずれかのレクチンであることが、本発明の効果発現の観点から好ましい。また、前記ＨＥ４と親和性のある物質が、前記レクチン群（１）～（４）のうち、複数の群から選択された２種以上のレクチンであることが好ましい。
【0152】
本発明のＨＥ４糖鎖分析キットとしては、正確な測定を行う観点から、前記レクチン、と抗ＨＥ４抗体と、分析用基板とを組み合わせた構成であることが好ましい。また、前記レクチンが蛍光体を備え付けていることが好ましい。さらに、蛍光体を備え付けた、ＷＦＡ又はＭＡＭの少なくとも一種のレクチンを含むことが好ましい。
【0153】
実施形態としては、さらに、正確さ、簡便さの観点から、クロマトグラフィー装置を備えた構成であることが好ましい。また、さらに、クロマトグラフィー測定のためのラベル化試薬を備えた構成であることが好ましい。
【0154】
図３に本発明のＨＥ４糖鎖分析キットの一例の模式図を示す。本発明のＨＥ４糖鎖分析キット５０の一形態例は、図３に示すように、少なくとも検体保持ウェル５１、検体回収ウェル５２、薬剤用ウェル５３及び検体チップ５４が連結し、一体化されており、注入された検体等の液体を送液しながら、検出ができるようになっている。例えば、国際公開第２０１７/１３０３６９号に開示されている検出用カートリッジが参考となる。
【0155】
なお、薬剤回収ウェル５３には、糖鎖の末端にβ－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、α２，３－シアル酸残基、α２，６－シアル酸残基又は高マンノース残基を有するＨＥ４と親和性のある物質、又はＨＥ４抗体のようなＨＥ４ペプチドに親和性のある物質をウェル内に保持することができる。前記ＨＥ４糖鎖と親和性のある物質とＨＥ４抗体の両方を薬剤ウェル内に備え付けておいてもよい。
本発明のＨＥ４糖鎖分析キットは、前記本発明のＨＥ４糖鎖の検出方法を実施するためのキットとして好ましく適用できる。
本発明のＨＥ４糖鎖分析キットは、前記本発明のＨＥ４糖鎖の検出方法を実施するためのキットとして好ましく適用できる。
【0156】
［４］ 癌検査法
本発明の病態情報生成方法は、癌の罹患又は発症に関する情報を生成する病態情報生成方法であって、被検試料に含まれる、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、α２，３－シアル酸残基、α２，６－シアル酸残基又はマンノース残基の４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に関する情報を取得する第１工程と、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に基づき、前記被検試料に係る被検者の癌の罹患又は発症に関する情報を生成する第２工程と、を有することを特徴とする。
本発明の病態情報生成方法は、癌の罹患又は発症に関する情報を生成する病態情報生成方法であって、被検試料に含まれる、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、α２，３－シアル酸残基、α２，６－シアル酸残基又はマンノース残基の４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に関する情報を取得する第１工程と、前記４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４の量に基づき、前記被検試料に係る被検者の癌の罹患又は発症に関する情報を生成する第２工程と、を有することを特徴とする。
【0157】
本発明の病態情報生成方法は、癌の診断又は発症を予測するためにＨＥ４糖鎖の検出を行う癌検査法であって、特定レクチンに親和性のある糖鎖を有するＨＥ４の糖鎖の定量値、又は全ＨＥ４の定量値に対する前記糖鎖の定量値の比率に基づき、被験者が、患者が卵巣癌に罹患しているかどうかを評価することを特徴とする。また、卵巣癌患者の癌の悪性度又はステージを評価することを特徴とする。
【0158】
前記ＨＥ４糖鎖の分析方法により、試料中のレクチンに親和性のあるＨＥ４の量を分析することにより、卵巣癌の罹患の可能性及び悪性度等を鑑別することができる。
前記ＨＥ４の分析方法により、レクチンに親和性のあるＨＥ４の量を測定し、健常人から採取した血液等中のレクチンに親和性のあるＨＥ４の量と比較することにより、前記患者が卵巣癌であるか否かを判定することができる。より具体的には、健常人の試料中に存在するレクチンに親和性のあるＨＥ４と比べて、前記患者の試料中に存在するレクチンに親和性のあるＨＥ４が有意に多い場合に前記患者は卵巣癌であると判定することができる。
前記ＨＥ４の分析方法により、レクチンに親和性のあるＨＥ４の量を測定し、健常人から採取した血液等中のレクチンに親和性のあるＨＥ４の量と比較することにより、前記患者が卵巣癌であるか否かを判定することができる。より具体的には、健常人の試料中に存在するレクチンに親和性のあるＨＥ４と比べて、前記患者の試料中に存在するレクチンに親和性のあるＨＥ４が有意に多い場合に前記患者は卵巣癌であると判定することができる。
【実施例】
【0159】
以下に実施例及び比較例を示し本発明の具体的な説明を行うが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【0160】
［実施例１］：レクチンカラム法によるＧａｌＮＡｃＨＥ４の定量
本実施例１では、レクチンとしてＷＦＡを用いたＷＦＡカラムを作製して、卵巣癌と診断された患者及び、非癌検体である、健常者、子宮内膜症患者について、本発明に係るＨＥ４糖鎖分析方法により、糖鎖の末端にβ－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基を有するＨＥ４（「ＧａｌＮＡｃＨＥ４」と略記する。）の量を測定した。
本実施例１では、レクチンとしてＷＦＡを用いたＷＦＡカラムを作製して、卵巣癌と診断された患者及び、非癌検体である、健常者、子宮内膜症患者について、本発明に係るＨＥ４糖鎖分析方法により、糖鎖の末端にβ－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基を有するＨＥ４（「ＧａｌＮＡｃＨＥ４」と略記する。）の量を測定した。
【0161】
（ＷＦＡカラムの作製）
ＷＦＡアガロースゲル（Ｊ－ケミカル製、ＭＡＭ濃度３ｍｇ／ｍL）を１．５ｍLをＰｉｅｒｃｅ（登録商標） Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）に加え、１ｍLあたり０．５ｍｇの密度でＷＦＡが結合したセファロース溶液を充填したＷＦＡカラムを作製した。
ＷＦＡアガロースゲル（Ｊ－ケミカル製、ＭＡＭ濃度３ｍｇ／ｍL）を１．５ｍLをＰｉｅｒｃｅ（登録商標） Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）に加え、１ｍLあたり０．５ｍｇの密度でＷＦＡが結合したセファロース溶液を充填したＷＦＡカラムを作製した。
【0162】
（ＨＥ４糖鎖の量を測定）
４℃の条件下で、ＷＦＡセファロース溶液２ｍLを０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝液で平衡化した。血清試料１～５０μＬをリン酸緩衝液で希釈し、２００μＬとして、カラムにアプライし、３０分保持した。その後、５倍容量の洗浄用緩衝液（０．１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液）でカラムを洗浄し、各１ｍＬずつ分画してＷＦＡ非結合画分を得た。カラムを室温に戻した後、５倍容量の溶出緩衝液（１０ｍＭラクトース、０．１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液）で、１ｍＬずつ分画して溶出し、ＷＦＡ結合画分を得た。
４℃の条件下で、ＷＦＡセファロース溶液２ｍLを０．１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝液で平衡化した。血清試料１～５０μＬをリン酸緩衝液で希釈し、２００μＬとして、カラムにアプライし、３０分保持した。その後、５倍容量の洗浄用緩衝液（０．１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液）でカラムを洗浄し、各１ｍＬずつ分画してＷＦＡ非結合画分を得た。カラムを室温に戻した後、５倍容量の溶出緩衝液（１０ｍＭラクトース、０．１％ＢＳＡ含有リン酸緩衝液）で、１ｍＬずつ分画して溶出し、ＷＦＡ結合画分を得た。
【0163】
ＷＦＡカラムによる分別前の血清試料、ＷＦＡ非結合画分、及びＷＦＡ結合画分について、トータルＨＥ４量を、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ ｉ１０００ＳＲ（ａｂｂｏｔｔ社製）を用いて測定した。
ＷＦＡカラムからのＨＥ４回収率は常に９７％～１００％であった。表Ｉに分別前の全（ｔｏｔａｌ）Ｈｅ４量、ＷＦＡ結合比率（ＧａｌＮＡｃＨＥ４比率）、卵巣癌患者のグレード（ｇｒａｄｅ）の値を示す。
ＷＦＡカラムからのＨＥ４回収率は常に９７％～１００％であった。表Ｉに分別前の全（ｔｏｔａｌ）Ｈｅ４量、ＷＦＡ結合比率（ＧａｌＮＡｃＨＥ４比率）、卵巣癌患者のグレード（ｇｒａｄｅ）の値を示す。
【0164】
なお、ＷＦＡ結合率は次の式により計算した。
ＷＦＡ結合率＝（ＷＦＡ結合画分中のＨＥ４量／（ＷＦＡ結合画分のＨＥ４量＋ＷＦＡ非結合画分中のＨＥ４量）×１００％
また、ＷＦＡ結合率は検体中の全ＨＥ４に対する、末端ＧａｌＮＡｃ糖鎖ＨＥ４を示している。なお、ｔｏｔａｌ ＨＥ４はすべての糖鎖構造を含めたＨＥ４タンパク質の濃度を表す。
上記測定の結果を表Ｉと図４に示す。
ＷＦＡ結合率＝（ＷＦＡ結合画分中のＨＥ４量／（ＷＦＡ結合画分のＨＥ４量＋ＷＦＡ非結合画分中のＨＥ４量）×１００％
また、ＷＦＡ結合率は検体中の全ＨＥ４に対する、末端ＧａｌＮＡｃ糖鎖ＨＥ４を示している。なお、ｔｏｔａｌ ＨＥ４はすべての糖鎖構造を含めたＨＥ４タンパク質の濃度を表す。
上記測定の結果を表Ｉと図４に示す。
【0165】
【表1】
【0166】
表Ｉ及び図４に示した結果から、卵巣癌のグレードが高くなるにしたがって、全ＨＥ４（ｔｏｔａｌ ＨＥ４）のうち、ＧａｌＮＡｃ末端を持つ糖鎖の含有比率が低下していることが、特に当該含有比率の平均値の対比によって、明らかに分かる。
卵巣癌患者について、ＨＥ４タンパクの糖鎖構造含有率が変化しおり、卵巣癌の診断において、全ＨＥ４のうちＧａｌＮＡｃＨＥ４の含有比率から、卵巣癌検体におけるグレード診断情報が得られることが分かる。
卵巣癌患者について、ＨＥ４タンパクの糖鎖構造含有率が変化しおり、卵巣癌の診断において、全ＨＥ４のうちＧａｌＮＡｃＨＥ４の含有比率から、卵巣癌検体におけるグレード診断情報が得られることが分かる。
【0167】
[実施例２]：レクチンカラム法による各種糖鎖を有するＨＥ４の定量
（癌細胞の培養）
ＪＣＲＢ細胞バンク購入より購入した卵巣癌細胞（細胞番号ＪＣＲＢ１０４６、細胞名ＯＶＳＡＨＯ）の培養を行った。
ＲＰＭＩ １６４０ Ｍｅｄｉｕｍ１１８７５－０９３ ２０ｍLに、ＯＶＳＡＨＯ細胞懸濁液を２．７～４．２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍLの濃度になるように加え、Ｎｕｎｃ細胞培養用処理済みＥａｓＹＦｌａｓｋに加えて、３６．７℃、ＣＯ２５％濃度環境下で３日間培養した。細胞培養した上清を回収し卵巣癌細胞培養上清を作製した。
（癌細胞の培養）
ＪＣＲＢ細胞バンク購入より購入した卵巣癌細胞（細胞番号ＪＣＲＢ１０４６、細胞名ＯＶＳＡＨＯ）の培養を行った。
ＲＰＭＩ １６４０ Ｍｅｄｉｕｍ１１８７５－０９３ ２０ｍLに、ＯＶＳＡＨＯ細胞懸濁液を２．７～４．２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍLの濃度になるように加え、Ｎｕｎｃ細胞培養用処理済みＥａｓＹＦｌａｓｋに加えて、３６．７℃、ＣＯ２５％濃度環境下で３日間培養した。細胞培養した上清を回収し卵巣癌細胞培養上清を作製した。
【0168】
（レクチンカラムの作製）
実施例１のＷＦＡアガロースの代わりに、ＣｏｎＡ、ＡＡＬ ＭＡＭ、ＳＳＡをアガロースに結合させたレクチンアガロースを、ＷＦＡアガロースを用いたレクチンカラムと同様の方法で、レクチンカラムを作製した。
（各種ＨＥ４糖鎖の量を測定）
上記で作製した各種レクチンカラムを実施する検体試料（サンプル）としては、上記培養した卵巣癌細胞の培養上清と、健常者女性の血清を用い、実施例１と同様にレクチンカラムを用いて測定した。結果を表IIに示す。
実施例１のＷＦＡアガロースの代わりに、ＣｏｎＡ、ＡＡＬ ＭＡＭ、ＳＳＡをアガロースに結合させたレクチンアガロースを、ＷＦＡアガロースを用いたレクチンカラムと同様の方法で、レクチンカラムを作製した。
（各種ＨＥ４糖鎖の量を測定）
上記で作製した各種レクチンカラムを実施する検体試料（サンプル）としては、上記培養した卵巣癌細胞の培養上清と、健常者女性の血清を用い、実施例１と同様にレクチンカラムを用いて測定した。結果を表IIに示す。
【0169】
【表2】
【0170】
表IIに示した結果から分かるように、健常者から分泌されるＨＥ４と、卵巣癌細胞から分泌されるＨＥ４では、その糖鎖構造が異なっており、トータルＨＥ４の量に対して、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、高マンノース、フコース残基を持つＨＥ４の含有比率は癌化に伴い低下する。
【0171】
特にβ－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基の糖鎖を持つＨＥ４の含有比率が変化していることが分かる。また、α２，３－シアル酸、α２，６－シアル酸の含有比率（分泌量）は増加することが分かる。
上記結果から分かるように、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基の糖鎖を持つＨＥ４は、他種の残基の糖鎖を有するＨＥ４より、含有比率の変化が比較的著しいことから、癌か非癌かの鑑別において特に有用である。
上記結果から分かるように、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基の糖鎖を持つＨＥ４は、他種の残基の糖鎖を有するＨＥ４より、含有比率の変化が比較的著しいことから、癌か非癌かの鑑別において特に有用である。
【0172】
[実施例３]：表面プラズモン励起増強蛍光分光法による測定
本実施例３では、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（「ＳＰＦＳ」）により、次のようにして測定した。
本実施例３では、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（「ＳＰＦＳ」）により、次のようにして測定した。
【0173】
（プラズモンセンサの作製）
厚さ１ｍｍのガラス製の透明平面基板「Ｓ－ＬＡＬ１０」（（株）オハラ製、屈折率〔ｎｄ〕＝１．７２）を、プラズマドライクリーナー「ＰＤＣ２００」（ヤマト科学（株）製）でプラズマ洗浄した。プラズマ洗浄された該基板の片面に、まずクロム膜をスパッタリング法により形成し、さらにその表面に金膜をスパッタリング法により形成した。このクロム膜の厚さは１～３ｎｍ、金膜の厚さは４４～５２ｎｍであった。
厚さ１ｍｍのガラス製の透明平面基板「Ｓ－ＬＡＬ１０」（（株）オハラ製、屈折率〔ｎｄ〕＝１．７２）を、プラズマドライクリーナー「ＰＤＣ２００」（ヤマト科学（株）製）でプラズマ洗浄した。プラズマ洗浄された該基板の片面に、まずクロム膜をスパッタリング法により形成し、さらにその表面に金膜をスパッタリング法により形成した。このクロム膜の厚さは１～３ｎｍ、金膜の厚さは４４～５２ｎｍであった。
【0174】
次いで、このようにして得られた基板を２５ｍｇ／ｍＬに調整した１０－カルボキシ－１－デカンチオールのエタノール溶液１０ｍＬに２４時間浸漬し、金膜の表面に自己組織化単分子膜（Ｓｅｌｆ－Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ；ＳＡＭ）を形成した。この基板をエタノール溶液から取り出し、エタノール及びイソプロパノールで順次洗浄した後、エアガンを用いて乾燥させた。
続いて、分子量５０万のカルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕を１ｍｇ／ｍＬと、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕を０．５ｍＭと、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕を１ｍＭとを含むＰＢＳにＳＡＭを形成した基板を１時間浸漬し、ＳＡＭにＣＭＤを固定化し、１ＮのＮａＯＨ水溶液に３０分間浸漬することで未反応のコハク酸エステルを加水分解させた。
続いて、分子量５０万のカルボキシメチルデキストラン〔ＣＭＤ〕を１ｍｇ／ｍＬと、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド〔ＮＨＳ〕を０．５ｍＭと、水溶性カルボジイミド〔ＷＳＣ〕を１ｍＭとを含むＰＢＳにＳＡＭを形成した基板を１時間浸漬し、ＳＡＭにＣＭＤを固定化し、１ＮのＮａＯＨ水溶液に３０分間浸漬することで未反応のコハク酸エステルを加水分解させた。
【0175】
得られた基板の表面（金膜＋ＳＡＭ＋３次元構造を有する固相化層がこの順で形成されている表面）に、２ｍｍ×１４ｍｍの穴を有する厚さ０．５ｍｍのシート状のシリコンゴムスペーサを設け、該表面が流路の内側となるように基板を配置し（ただし、該シリコンゴムスペーサは送液に触れない状態とする。）、流路の外側から基板を覆うように厚さ２ｍｍのポリメチルメタクリレート板を乗せ圧着し、ビスで流路と該ポリメチルメタクリレート板とを固定した。
【0176】
送液として超純水を１０分間、その後ＰＢＳを２０分間、ペリスタポンプにより、室温、流速５００μＬ／ｍｉｎで循環させた。続いて、ＮＨＳを５０ｍＭと、ＷＳＣを１００ｍＭとを含むＰＢＳを５ｍＬ送液し、２０分間循環送液させた後に、抗ＨＥ４モノクローナル抗体（３Ｃ２４；ｈｙｔｅｓｔ製）溶液２．５ｍＬを３０分間循環送液することで、３次元構造を有する固相化層上に一次抗体を固相化した。最後に質量１％牛血清アルブミン〔ＢＳＡ〕を含むＰＢＳ緩衝生理食塩水にて、３０分間循環送液することで非特異吸着防止処理を行うことで、プラズモンセンサを作製した。
【0177】
（蛍光標識ＭＡＭの作製）
ＭＡＭ（Ｊ１１０、Ｊケミカル社製）を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標名）６４７タンパク質ラベリングキット（インビトロゲン社）を用いて蛍光標識化した。手順はそのキットに添付されたプロトコールに従った。未反応のレクチン及び蛍光色素を除去するため、限外濾過膜（日本ミリポア（株）製）を用いて反応物を精製し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＭＡＭ溶液を得た。吸光度を測定してその溶液のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＭＡＭの濃度を求めた。
蛍光標識ＭＡＭ濃度を５μｇ／ｍLになるように、３％ＢＳＡ（ｂｏｖａｌ社製）、ＰＢＳ（日本ジーン社製）溶液に添加した。
ＭＡＭ（Ｊ１１０、Ｊケミカル社製）を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標名）６４７タンパク質ラベリングキット（インビトロゲン社）を用いて蛍光標識化した。手順はそのキットに添付されたプロトコールに従った。未反応のレクチン及び蛍光色素を除去するため、限外濾過膜（日本ミリポア（株）製）を用いて反応物を精製し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＭＡＭ溶液を得た。吸光度を測定してその溶液のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＭＡＭの濃度を求めた。
蛍光標識ＭＡＭ濃度を５μｇ／ｍLになるように、３％ＢＳＡ（ｂｏｖａｌ社製）、ＰＢＳ（日本ジーン社製）溶液に添加した。
【0178】
（血液検体の調製）
癌の疑いがある患者に由来する血清サンプル及び、癌の確定診断を受けた患者に由来する血清サンプルそれぞれについて、リン酸緩衝溶液にて３～５４倍希釈し、血清検体を調整した。
癌の疑いがある患者に由来する血清サンプル及び、癌の確定診断を受けた患者に由来する血清サンプルそれぞれについて、リン酸緩衝溶液にて３～５４倍希釈し、血清検体を調整した。
【0179】
（ＳＰＦＳによる測定）
第１洗浄工程：Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を０．０５質量％含むトリス緩衝生理食塩水を１０分間、循環送液した。
ブランク測定工程：トリス緩衝生理食塩水で流路を満たした状態で、波長６３５ｎｍのレーザー光を、光学フィルタによりフォトン量を調節し、プリズムを通じて、プラズモン励起センサーの裏面から金属薄膜に照射した。測定領域の上部に設置された、倍率２０倍の対物レンズを付けたＣＣＤイメージセンサー（テキサスインスツルメント（株））で、蛍光成分以外の波長をカットするフィルタを通過した光の強度を測定した。この測定値は、ＭＡＭを標識した蛍光体が発する蛍光を含まないノイズ値であるので、ブランク値とする。
第１次反応工程：前記抗ＨＥ４抗体固相化領域が形成された流路に、前記調整した血清検体を３０分間循環送液した。
第１洗浄工程：Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を０．０５質量％含むトリス緩衝生理食塩水を１０分間、循環送液した。
ブランク測定工程：トリス緩衝生理食塩水で流路を満たした状態で、波長６３５ｎｍのレーザー光を、光学フィルタによりフォトン量を調節し、プリズムを通じて、プラズモン励起センサーの裏面から金属薄膜に照射した。測定領域の上部に設置された、倍率２０倍の対物レンズを付けたＣＣＤイメージセンサー（テキサスインスツルメント（株））で、蛍光成分以外の波長をカットするフィルタを通過した光の強度を測定した。この測定値は、ＭＡＭを標識した蛍光体が発する蛍光を含まないノイズ値であるので、ブランク値とする。
第１次反応工程：前記抗ＨＥ４抗体固相化領域が形成された流路に、前記調整した血清検体を３０分間循環送液した。
【0180】
第２洗浄工程：Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を０．０５質量％含むトリス緩衝生理食塩
第２次反応工程：前記調整した標識ＭＡＭ溶液を１０分間循環送液した。
第２次反応工程：前記調整した標識ＭＡＭ溶液を１０分間循環送液した。
【0181】
第３洗浄工程：Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を０．０５質量％含むトリス緩衝生理食塩水を１０分間、循環送液した。
【0182】
シグナル測定工程：トリス緩衝生理食塩水で流路を満たした状態で、波長６３５ｎｍのレーザー光を、光学フィルタによりフォトン量を調節し、プリズムを通じて、プラズモン励起センサーの裏面から金属薄膜に照射した。測定領域の上部に設置された、倍率２０倍の対物レンズを付けたＣＣＤイメージセンサー（テキサスインスツルメント（株））で、蛍光成分以外の波長をカットするフィルタを通過した光の強度を測定した（シグナル値）。この測定値は、ＨＥ４抗体に結合したＨＥ４上に存在する、α２，３－シアル酸残基（以下、「ｓｉａ２，３」と略記する。）を有する糖鎖（ｓｉａ２，３－糖鎖）に結合したＭＡＭを標識した蛍光体が発する蛍光であり、シグナル測定工程から得られた蛍光光量からブランク測定工程において得られた蛍光光量を差し引いた値に検体を希釈した倍率をかけたものをｓｉａ２，３-糖鎖量の定量値（相対的蛍光強度値；単位：ｐＷ）とした。表III及びIVの実施例（ｓｉａ２，３－ＨＥ４）の欄に示した数値は、当該蛍光強度値である。
【0183】
【表3】
【0184】
【表4】
【0185】
（ＲＯＣ曲線の算出方法）
表III及び表IVに示した結果より求めたＲＯＣ曲線を図５、図６（Ａ、Ｂ、Ｃ）及び図７（Ａ、Ｂ、Ｃ）に示す。
なお、（１）癌検体と非癌検体（健常者と子宮内膜症患者を含む）、（２）５０歳以下の癌患者と非癌検体（健常者と子宮内膜症患者）、及び（３）グレード１の癌検体と非癌検体（健常者と子宮内膜症患者）の比較より求めたＲＯＣ曲線をそれぞれ、図５～７に示す。当該図に基づいて決定されるＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＲＯＣ－ＡＵＣ）等を表Ｖにまとめて示す。
表III及び表IVに示した結果より求めたＲＯＣ曲線を図５、図６（Ａ、Ｂ、Ｃ）及び図７（Ａ、Ｂ、Ｃ）に示す。
なお、（１）癌検体と非癌検体（健常者と子宮内膜症患者を含む）、（２）５０歳以下の癌患者と非癌検体（健常者と子宮内膜症患者）、及び（３）グレード１の癌検体と非癌検体（健常者と子宮内膜症患者）の比較より求めたＲＯＣ曲線をそれぞれ、図５～７に示す。当該図に基づいて決定されるＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＲＯＣ－ＡＵＣ）等を表Ｖにまとめて示す。
【0186】
なお、ここで示すＲＯＣ曲線線（「受診者動作特性曲線」ともいう。）は、横軸に偽陽性率、縦軸に感度をプロットし、閾値を媒介変数として大から小へ変化させるときに描かれる曲線である。はじめは、陽性者も陰性者も捕捉しにくいので、どちらも小さな値をとるが、次第に感度が上がり、遅れて偽陽性度が上がる。最終的には、感度も偽陽性度も１００％になる。バイオマーカーが有能であれば、ＲＯＣ曲線は４５度の傾斜から左上に離れる。すなわち、ＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＲＯＣ－ＡＵＣ）は、バイオマーカーの性能を表す。
【0187】
【表5】
【0188】
表III～Ｖ及び図５～７に示した結果から、本発明に係るバイオマーカーであるα２，３－シアル酸末端ＨＥ４のＲＯＣ曲線は０．７を超えていることから優れたバイオマーカーであることが分かる。特に５０歳以下の癌患者と非癌患者の診断においては、トータルＨＥ４、ＲＯＭＡと比較して、α２，３－シアル酸ＨＥ４の評価結果に基づくＲＯＣ曲線下面積が最も大きいことから、本発明に係るα２，３－シアル酸は優れたバイオマーカーであることが分かる。
なお、表Ｖに示したようにＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＲＯＣ－ＡＵＣ）が０．７を超えたこと、そして最適な閾値での感度及び特異度が高いことは、本発明のバイオマーカーの診断性能が高いことを示している。
なお、表Ｖに示したようにＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＲＯＣ－ＡＵＣ）が０．７を超えたこと、そして最適な閾値での感度及び特異度が高いことは、本発明のバイオマーカーの診断性能が高いことを示している。
【0189】
図８に、実施例３の測定結果から得られた、α２，３－シアル酸残基末端を持つＨＥ４タンパク量と、卵巣癌のグレード（健常者、Ｇ１、Ｇ２、及びＧ３）との関係を示す。Ｙ軸はα２，３－シアル酸定量値であるΔＳ値の対数でプロットしている。
得られた結果から、卵巣癌のグレードが高いほど、α２，３－シアル酸残基末端を持つＨＥ４の量が増加していることが分かる。ＨＥ４タンパクの糖鎖構造含有率が変化しおり、卵巣癌の診断において、α２，３－シアル酸残基を有する糖鎖を持つＨＥ４量が、卵巣癌のグレードと相関があることが分かる。
得られた結果から、卵巣癌のグレードが高いほど、α２，３－シアル酸残基末端を持つＨＥ４の量が増加していることが分かる。ＨＥ４タンパクの糖鎖構造含有率が変化しおり、卵巣癌の診断において、α２，３－シアル酸残基を有する糖鎖を持つＨＥ４量が、卵巣癌のグレードと相関があることが分かる。
【0190】
＜結論＞
以上の結果に基づき、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、α２，３－シアル酸残基、α２，６－シアル酸残基又はマンノース残基の４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４が、卵巣癌のバイオマーカーになり得ることが示された。
したがって、本発明により、卵巣癌を含む癌の罹患又は発症に関する情報を生成する病態情報生成方法及び病態情報生成方法システムを提供することができる。すなわち、簡易かつ安価な方法で、卵巣癌に関連して発現するＨＥ４を効果的に検出することができるため、卵巣癌の早期発見、診断及び治療が可能になる。また、本発明の方法により、患者血液を用いて卵巣癌を低侵襲的に検出できるため、卵巣癌を簡便かつ迅速に検出することが可能になる。
以上の結果に基づき、β－Ｎ－アセチルガラクトサミン残基、α２，３－シアル酸残基、α２，６－シアル酸残基又はマンノース残基の４種の残基のうちのいずれかの残基を有するＨＥ４が、卵巣癌のバイオマーカーになり得ることが示された。
したがって、本発明により、卵巣癌を含む癌の罹患又は発症に関する情報を生成する病態情報生成方法及び病態情報生成方法システムを提供することができる。すなわち、簡易かつ安価な方法で、卵巣癌に関連して発現するＨＥ４を効果的に検出することができるため、卵巣癌の早期発見、診断及び治療が可能になる。また、本発明の方法により、患者血液を用いて卵巣癌を低侵襲的に検出できるため、卵巣癌を簡便かつ迅速に検出することが可能になる。
【産業上の利用可能性】
【0191】
本発明は、医療の分野において利用することができる。
【符号の説明】
【0192】
１０ 定量測定装置
１２ 誘電体部材
１２ａ 上面 １２ｂ 側面
１２ｃ 側面
１４ 金属膜
１４ａ 上面
１６ センサチップ
１８ センサチップ装填部
２０ 光源
２２ 入射光
２４ 金属膜反射光
２６ 受光手段
２８ ＳＰＲ測定部
３０ 蛍光
３２ 光検出手段
３４ ＳＰＦＳ測定部
３６ 微細流路
３８ センサ部
４０ 定量演算手段
５０ ＨＥ４糖鎖分析キット
５１ 検体保持ウェル
５２ 検体回収ウェル
５３ 薬剤用ウェル
５４ 検体チップ
１２ 誘電体部材
１２ａ 上面 １２ｂ 側面
１２ｃ 側面
１４ 金属膜
１４ａ 上面
１６ センサチップ
１８ センサチップ装填部
２０ 光源
２２ 入射光
２４ 金属膜反射光
２６ 受光手段
２８ ＳＰＲ測定部
３０ 蛍光
３２ 光検出手段
３４ ＳＰＦＳ測定部
３６ 微細流路
３８ センサ部
４０ 定量演算手段
５０ ＨＥ４糖鎖分析キット
５１ 検体保持ウェル
５２ 検体回収ウェル
５３ 薬剤用ウェル
５４ 検体チップ
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】