▶ オリックス ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-15
(45)【発行日】2024-08-23
(54)【発明の名称】ＭｙＤ８８を標的とするＲＮＡｉ製剤及びその用途
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20240816BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20240816BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240816BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
A61K31/713
A61P27/02
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2022572518
(86)(22)【出願日】2020-08-13
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-05
(86)【国際出願番号】 KR2020010787
(87)【国際公開番号】W WO2021241803
(87)【国際公開日】2021-12-02
【審査請求日】2022-12-06
(31)【優先権主張番号】10-2020-0063281
(32)【優先日】2020-05-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】518028055
【氏名又は名称】オリックス ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ホン，スン ウ
(72)【発明者】
【氏名】パク，ジュン ヒュン
【審査官】中野 あい
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１８－５３３９５６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１４－５０９５１１（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１２／０７８５３６（ＷＯ，Ａ２）
【文献】特表２０１３－５１６１９０（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
センス鎖及びアンチセンス鎖を含む二本鎖のＲＮＡｉ誘導用核酸分子であって、前記センス鎖は、１５ないし１７ｎｔの長さを有し、前記センス鎖内の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドはアンチセンス鎖と相補的であり、
前記センス鎖は、１つ以上の化学修飾（chemical modification）を含み、
前記アンチセンス鎖は、下記（Ａ）ないし（Ｄ）からなるグループから選択され（５'→３'）：
（Ａ）Ｐ－ｍＵＧＧＵＣＵＧＧＡＡＧｍＵｍＣＡｍＣ＊Ａ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＣ、
（Ｂ）Ｐ－ｍＵｆＧｍＧｆＵｍＣｆＵｍＧｆＧｍＡｆＡｍＧｆＵｍＣｆＡｍＣ＊ｆＡ＊ｍＵ＊ｆＵ＊ｍＣ、
（Ｃ）Ｐ－ｍＵＧｍＧＵＣＵｍＧｍＧｍＡｍＡｍＧＵＣＡＣ＊ｍＡ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｃ、及び （Ｄ）Ｐ－ｍＵＧＧｆＵｆＣｆＵＧＧＡＡＧｆＵｆＣＡｆＣ＊Ａ＊ｆＵ＊ｆＵ＊ｆＣ、 ここで、＊は、ホスホロチオエート結合であり、ｍは、２'－Ｏ－メチルであり、ｆは、２'－フルオロであり、Ｐは、５'－リン酸結合である、ＲＮＡｉ誘導用核酸分子。
【請求項2】
前記ＲＮＡｉ誘導用核酸分子は、ｓｉＲＮＡである、請求項１に記載のＲＮＡｉ誘導用核酸分子。
【請求項3】
前記化学修飾は、１つ以上のヌクレオチド結合のホスホロチオエート結合への修飾、
１つ以上のヌクレオチド内の糖構造の２'炭素位置での－ＯＨ基の－Ｏ－メチルへの置換、または
コレステロール、トコフェロール、ステアリン酸、レチノイン酸、ドコサヘキサエン酸(Docosahexaenoic acid: DHA)、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸及び炭素数１０個以上の長鎖脂肪酸からなるグループから選択される親油性モイエティの導入である、請求項１に記載のＲＮＡｉ誘導用核酸分子。
【請求項4】
前記ＲＮＡｉ誘導用核酸分子は、非対称二本鎖構造を形成し、前記アンチセンス鎖の５'末端及びセンス鎖の３'末端は、ブラント末端（blunt end）を形成する、請求項１に記載のＲＮＡｉ誘導用核酸分子。
【請求項5】
前記センス鎖は、下記（ａ）ないし（ｃ）からなるグループから選択された配列を含み（５'→３'）：
（ａ）ｍＵｍＧＵＧＡＣＵＵＣＣＡＧＡＣ＊ｍＣ＊ｍＡ＊Ｌｐ、
（ｂ）ｍＵＧｍＵＧｍＡＣｍＵＵｍＣＣｍＡＧｍＡＣ＊ｍＣ＊Ａ＊Ｌｐ、及び
（ｃ）ｍＵＧｍＵＧＡｍＣｍＵｍＵｍＣｍＣＡＧＡｍＣ＊ｍＣ＊Ａ＊Ｌｐ
ここで、＊は、ホスホロチオエート結合であり、ｍは、２'－Ｏ－メチルであり、Ｌｐは親油性モイエティである、請求項１に記載のＲＮＡｉ誘導用核酸分子。
【請求項6】
前記ＲＮＡｉ誘導用核酸分子は、骨髄分化一次応答遺伝子８８（Myeloid differentiation primary response gene 88: MyD88）の発現を抑制する、請求項１に記載のＲＮＡｉ誘導用核酸分子。
【請求項7】
請求項１に記載のＲＮＡｉ誘導用核酸分子を有効成分として含む、加齢黄斑変性の治療用または予防用の薬剤学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＲＮＡ干渉現象を介して疾病を予防または治療する核酸分子及びその用途に関する。
【背景技術】
【0002】
加齢黄斑変性（Aged-related Macular Degeneration: AMD）とは、眼の黄斑内の網膜色素上皮内層の変性から惹起され、失明を起こす疾病である。黄斑は、眼の内側を覆っている光敏感性組織で構成された網膜内の小さい領域であり、中心視において重要な役割を行う。ＡＭＤは、全世界的に失明の主な原因の１つである。ＡＭＤは、「ウェット型」及び「ドライ型」で発生する。ウェット型ＡＭＤは、網膜における異常な血管成長の結果である。ウェット型ＡＭＤでは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の量の増加がそのような血管新生に寄与し、治療オプションは、ＶＥＧＦインヒビターの使用を含む。しかしながら、ＶＥＧＦインヒビターで治療された多くの患者が地図状萎縮（geographic atrophy: GA）を起こし、これは、治療後数年以内に後期ドライ型黄斑変性の主な症状である。ドライ型ＡＭＤの疾病の発症メカニズムは不明であり、ドライ型ＡＭＤのために利用可能な医学的治療が現在はない。従って、ドライ型黄斑変性及びウェット型黄斑変性の両方を治療することができる治療剤の開発が必要である。これにより、ドライ型黄斑変性及びウェット型ＡＭＤに同時に効力を示す治療剤の開発が要求されるが、まだ不十分である。
【0003】
それで、本発明者らは、ドライ型ＡＭＤ、さらにはウェット型ＡＭＤの患者を治療することができる新規かつ安全な薬物の開発に鋭意研究した結果、ＲＮＡ干渉技術を利用したＲＮＡ製剤を開発した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明の目的は、ＭｙＤ８８を標的化するＲＮＡｉ製剤を提供することである。
本発明の他の目的は、ドライ型及び／またはウェット型ＡＭＤの治療のためのＲＮＡｉ製剤及びその医薬的用途を提供することである。
本発明の他の目的は、ドライ型及び／またはウェット型ＡＭＤの治療のためのＲＮＡｉ製剤及びその医薬的用途を提供することである。
【0005】
本発明の他の目的及び利点は、添付した特許請求の範囲及び図面と共に下記の詳細な説明によって明らかになる。本明細書に記載されていない内容は、本出願の技術分野または類似した技術分野内の熟練された者であれば、十分に認識して類推することができるので、その説明を省略する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
前記目的を達成するために、一態様は、ＭｙＤ８８を標的化する二本鎖のＲＮＡｉ誘導用核酸分子を提供する。
他の態様は、前記ＲＮＡｉ誘導用核酸分子を有効成分として含む、ドライ型及び／またはウェット型黄斑変性の予防用または治療用薬剤学的組成物を提供する。
他の態様は、前記ＲＮＡｉ誘導用核酸分子を有効成分として含む、ドライ型及び／またはウェット型黄斑変性の予防用または治療用薬剤学的組成物を提供する。
【発明の効果】
【0007】
一態様によるｓｉＲＮＡによれば、非特異的免疫反応、オフターゲット効果のような副作用を緩和しながら、眼球疾患であるＡＭＤと係わるタンパク質であるＭｙＤ８８をエンコーディングするｍＲＮＡに結合し、それを分解することにより、前記タンパク質の発現を抑制することができる。従って、一態様による核酸分子は、ドライ型及び／またはウェット型ＡＭＤを予防及び治療するための薬剤学的組成物の有効成分として活用可能である。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1A】本発明によるｓｉＲＮＡであるＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２１の細胞の処理によるＭｙＤ８８ ｍＲＮＡレベルの変化を示す図面である。
【図1B】本発明によるｓｉＲＮＡであるＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２２の細胞の処理によるＭｙＤ８８ ｍＲＮＡレベルの変化を示す図面である。
【図1C】本発明によるｓｉＲＮＡであるＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２３の細胞の処理によるＭｙＤ８８ ｍＲＮＡレベルの変化を示す図面である。
【図2A】正常マウスモデルにおいて、本発明によるｓｉＲＮＡであるＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２１、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２２及びＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２３の処理によるＭｙＤ８８タンパク質レベルの変化を示す図面である。
【図2B】正常マウスモデルにおいて、本発明によるｓｉＲＮＡであるＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２１、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２２及びＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２３の処理によるＭｙＤ８８タンパク質レベルの変化を示す図面である。
【図3A】Laser-induced choroidal neovascularization(CNV)マウスモデルにおいて、本発明によるｓｉＲＮＡであるＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２１、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２２及びＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２３の処理によるＭｙＤ８８タンパク質レベルの変化を示す図面である。
【図3B】Laser-injuryマウスモデルにおいて、本発明によるｓｉＲＮＡであるＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２１、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２２及びＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２３の処理によるＭｙＤ８８タンパク質レベルの変化を示す図面である。
【図4】ＣＮＶマウスモデルにおいて、本発明によるｓｉＲＮＡであるＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２１、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２２及びＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２３の投与によるＣＮＶ体積の変化を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【0009】
本発明で開示されたそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの異なる説明及び実施形態にも適用可能である。すなわち、本発明で開示された多様な要素の全ての組み合わせが本発明の範疇に属する。また、後述する具体的な叙述によって本発明の範疇が制限されるものではない。
一態様は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む二本鎖のＲＮＡｉ誘導用核酸分子であって、
一態様は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む二本鎖のＲＮＡｉ誘導用核酸分子であって、
【0010】
前記センス鎖は、１５ないし１７ｎｔの長さを有し、前記センス鎖内の少なくとも１５個の隣接したヌクレオチドは、アンチセンス鎖と相補的であり、前記センス鎖は、１つ以上の化学的変形（chemical modification）を含み、
前記アンチセンス鎖は、下記（Ａ）ないし（Ｄ）からなるグループから選択され（５’→３’）：
（Ａ）Ｐ－ｍＵＧＧＵＣＵＧＧＡＡＧｍＵｍＣＡｍＣ＊Ａ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＣ、
（Ｂ）Ｐ－ｍＵｆＧｍＧｆＵｍＣｆＵｍＧｆＧｍＡｆＡｍＧｆＵｍＣｆＡｍＣ＊ｆＡ＊ｍＵ＊ｆＵ＊ｍＣ、
（Ｃ）Ｐ－ｍＵＧｍＧＵＣＵｍＧｍＧｍＡｍＡｍＧＵＣＡＣ＊ｍＡ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｃ、及び
（Ｄ）Ｐ－ｍＵＧＧｆＵｆＣｆＵＧＧＡＡＧｆＵｆＣＡｆＣ＊Ａ＊ｆＵ＊ｆＵ＊ｆＣ、
前記アンチセンス鎖は、下記（Ａ）ないし（Ｄ）からなるグループから選択され（５’→３’）：
（Ａ）Ｐ－ｍＵＧＧＵＣＵＧＧＡＡＧｍＵｍＣＡｍＣ＊Ａ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＣ、
（Ｂ）Ｐ－ｍＵｆＧｍＧｆＵｍＣｆＵｍＧｆＧｍＡｆＡｍＧｆＵｍＣｆＡｍＣ＊ｆＡ＊ｍＵ＊ｆＵ＊ｍＣ、
（Ｃ）Ｐ－ｍＵＧｍＧＵＣＵｍＧｍＧｍＡｍＡｍＧＵＣＡＣ＊ｍＡ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｃ、及び
（Ｄ）Ｐ－ｍＵＧＧｆＵｆＣｆＵＧＧＡＡＧｆＵｆＣＡｆＣ＊Ａ＊ｆＵ＊ｆＵ＊ｆＣ、
【0011】
ここて、＊は、ホスホロチオエート結合への変形であり、ｍは、２’－Ｏ－メチルへの置換であり、ｆは、２’－フルオロへの置換であり、Ｐは、５’－リン酸基の結合である、ＲＮＡｉ誘導用核酸分子を提供する。
他の態様は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む二本鎖のＲＮＡｉ誘導用核酸分子であって、
他の態様は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む二本鎖のＲＮＡｉ誘導用核酸分子であって、
【0012】
前記アンチセンス鎖は、１９ないし２１ｎｔの長さを有し、前記アンチセンス鎖内の少なくとも１５個の隣接したヌクレオチドは、センス鎖と相補的であり、前記アンチセンス鎖は、１つ以上の化学的変形を含み、
前記センス鎖は、下記（ａ）ないし（ｃ）からなるグループから選択され（５’→３’）：
（ａ）ｍＵｍＧＵＧＡＣＵＵＣＣＡＧＡＣ＊ｍＣ＊ｍＡ＊Ｌｐ、
（ｂ）ｍＵＧｍＵＧｍＡＣｍＵＵｍＣＣｍＡＧｍＡＣ＊ｍＣ＊Ａ＊Ｌｐ、及び
（ｃ）ｍＵＧｍＵＧＡｍＣｍＵｍＵｍＣｍＣＡＧＡｍＣ＊ｍＣ＊Ａ＊Ｌｐ、
ここて、＊は、ホスホロチオエート結合への変形であり、ｍは、２’－Ｏ－メチルへの置換であり、Ｌｐは、親油性モイエティの導入である、ＲＮＡｉ誘導用核酸分子を提供する。
さらに他の態様は、ＭｙＤ８８の発現を抑制する、二本鎖のｓｉＲＮＡを含むＲＮＡｉ誘導用核酸分子であって、
前記センス鎖は、下記（ａ）ないし（ｃ）からなるグループから選択され（５’→３’）：
（ａ）ｍＵｍＧＵＧＡＣＵＵＣＣＡＧＡＣ＊ｍＣ＊ｍＡ＊Ｌｐ、
（ｂ）ｍＵＧｍＵＧｍＡＣｍＵＵｍＣＣｍＡＧｍＡＣ＊ｍＣ＊Ａ＊Ｌｐ、及び
（ｃ）ｍＵＧｍＵＧＡｍＣｍＵｍＵｍＣｍＣＡＧＡｍＣ＊ｍＣ＊Ａ＊Ｌｐ、
ここて、＊は、ホスホロチオエート結合への変形であり、ｍは、２’－Ｏ－メチルへの置換であり、Ｌｐは、親油性モイエティの導入である、ＲＮＡｉ誘導用核酸分子を提供する。
さらに他の態様は、ＭｙＤ８８の発現を抑制する、二本鎖のｓｉＲＮＡを含むＲＮＡｉ誘導用核酸分子であって、
【0013】
前記二本鎖のｓｉＲＮＡは、配列番号１の塩基配列（５’－ＵＧＧＵＣＵＧＧＡＡＧＵＣＡＣＡＵＵＣ－３’）を有するアンチセンス鎖、及び配列番号２の塩基配列（５’－ＵＧＵＧＡＣＵＵＣＣＡＧＡＣＣＡ－３’）を有するセンス鎖を含み、
【0014】
前記アンチセンス鎖とセンス鎖は、互いに相補的に結合し、アンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端は、ブラント末端（blunt end）を形成し、
【0015】
前記センス鎖の３’末端には、コレステロール、トコフェロール、ステアリン酸、レチノイン酸、ドコサヘキサエン酸(Docosahexaenoic acid: DHA)、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸及び炭素数１０個以上の長鎖脂肪酸からなるグループから選択される親油性モイエティが導入された、ＲＮＡｉ誘導用核酸分子を提供する。
【0016】
ＲＮＡｉ誘導用核酸分子
本明細書において、用語「ＲＮＡ干渉（RNA interference）」または「ＲＮＡｉ」とは、一般的に特定標的ＲＮＡの破壊を誘発し、配列特異的核酸分子によって媒介されることにより、細胞において遺伝子発現を抑制または下向き調節する技術分野において一般的に知られた生物学的過程を指称する。また、ＲＮＡｉという用語は、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳抑制、転写抑制、または後成遺伝学（epigenetics）のような配列特異的ＲＮＡ干渉を記述するために使用された他の用語と同等なものであり得る。例えば、前記ｓｉＲＮＡ分子は、転写後レベルまたは転写前レベルで遺伝子をサイレンシングさせるのに使用されうる。非制限的な例において、ｓｉＲＮＡ分子による遺伝子発現の調節は、ＲＩＳＣを介するｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ－媒介された切断からもたらされる。
本明細書において、用語「ＲＮＡ干渉（RNA interference）」または「ＲＮＡｉ」とは、一般的に特定標的ＲＮＡの破壊を誘発し、配列特異的核酸分子によって媒介されることにより、細胞において遺伝子発現を抑制または下向き調節する技術分野において一般的に知られた生物学的過程を指称する。また、ＲＮＡｉという用語は、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳抑制、転写抑制、または後成遺伝学（epigenetics）のような配列特異的ＲＮＡ干渉を記述するために使用された他の用語と同等なものであり得る。例えば、前記ｓｉＲＮＡ分子は、転写後レベルまたは転写前レベルで遺伝子をサイレンシングさせるのに使用されうる。非制限的な例において、ｓｉＲＮＡ分子による遺伝子発現の調節は、ＲＩＳＣを介するｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ－媒介された切断からもたらされる。
【0017】
本明細書において、用語「ＲＮＡｉ誘導用核酸分子」、「短い干渉ＲＮＡ（short interfering RNA）」、「ｓｉＲＮＡ分子」または「ｓｉＲＮＡ」とは、配列特異的方式によって前記ＲＮＡ干渉を媒介することにより、遺伝子発現またはウイルス複製を抑制または下向き調節することができる任意の核酸分子を指称する。前記用語は、個々の核酸分子、複数の前記核酸分子、または前記核酸分子のプール（pool）を全て指称する。前記ｓｉＲＮＡは、自己相補的な（self-complementary）センス鎖及びアンチセンス鎖を含む非対称二本鎖核酸分子であり得る。
【0018】
本明細書において、用語「遺伝子」とは、最広義の意味と見なされなければならず、構造タンパク質または調節タンパク質を暗号化することができる。このとき、調節タンパク質は、転写因子、熱衝撃タンパク質、またはＤＮＡ／ＲＮＡ複製、転写及び／または翻訳に係わるタンパク質を含む。本発明において、発現抑制の対象になる目的遺伝子は、ウイルスゲノムに内在されたものであり、動物遺伝子に統合されるか、あるいは染色体外の構成要素として存在することができる。
【0019】
本明細書において、用語「アンチセンス鎖（antisense strand）」とは、当業界で通常許容される意味を指称する。本明細書に記載されたｓｉＲＮＡ分子と係わり、前記用語は、ＭｙＤ８８ ＲＮＡに相補性を有するｓｉＲＮＡ分子のヌクレオチド配列を指称されえる。また、前記ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖（sense strand）に相補性を有する核酸配列を含む。前記ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、アンチセンス領域（antisense region）またはガイド鎖（guide strand）とも指称されえる。
【0020】
本明細書において、用語「センス鎖（sense strand）」とは、当業界で通常許容される意味を指称する。本明細書に記載されたｓｉＲＮＡ分子と係わり、前記用語は、ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖に相補性を有する、前記ｓｉＲＮＡ分子のヌクレオチド配列を指称され得る。また、前記ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖は、標的核酸配列と相同性または配列同一性を有する核酸配列を含む。また、一具体例において、前記ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖は、センス領域（sense region）またはパッセンジャー鎖（passenger strand）とも指称されえる。
【0021】
本明細書において、用語「相補性（complementarity）」または「相補的な（complementary）」とは、当業界で通常許容される意味を指称する。前記用語は、一般的に伝統的なワトソン・クリック（Watson-Crick）または本明細書に記述された他の非伝統的類型の結合によって、１つの核酸配列と他の核酸配列との間での水素結合の形成または存在を指称する。完璧な相補性は、核酸配列の全ての隣接残基が第２核酸配列で同数の隣接残基と水素結合するということを意味する。部分相補性は、核酸分子内で、多様なミスマッチ（mismatch）または非塩基対ヌクレオチド（non-based paired nucleotides）（例えば、１，２，３，４，５，６，７，８，９または１０個以上のミスマッチ、非ヌクレオチドリンカー（non-nucleotide linker）または非塩基対ヌクレオチド）を含む。前記部分相補性は、核酸分子のセンス鎖またはセンス領域と、アンチセンス鎖またはアンチセンス領域との間で、あるいは核酸分子のアンチセンス鎖またはアンチセンス領域と、それと相応する標的核酸分子との間で、バルジ（bulges）、ループ（loops）、突出（overhang）またはブラント末端（blunt end）をもたらすことができる。
【0022】
本明細書において、用語「ブラント末端（blunt end）」とは、当業界で通常許容される意味を指称する。本明細書の核酸分子と係わり、前記用語は、突出ヌクレオチドがない二本鎖ｓｉＲＮＡ分子の末端を指称されえる。本明細書に記載されたｓｉＲＮＡ分子において、アンチセンス鎖の５’－末端及びセンス鎖の３’－末端は、ブラント末端を形成するものでもある。
【0023】
ＭｙＤ８８の発現を抑制するためのＲＮＡｉ誘導用核酸分子
「ＭｙＤ８８（Myeloid differentiation primary response gene 88）」とは、骨髄分化一次応答遺伝子８８または先天性免疫信号変換アダプター（innate immune signal transduction adaptor）とも指称される。前記ＭｙＤ８８は、免疫細胞内の信号伝達に寄与し、黄斑変性のような眼球疾患と密接な関連性があるものと知られている。前記ＭｙＤ８８タンパク質は、天然的に存在する野生型ＭｙＤ８８及びその機能的変異体を含むものとも解釈され、前記ＭｙＤ８８タンパク質またはそれをコーディングする遺伝子の配列は、アメリカ国立生物工学情報センターのＧｅｎＢａｎｋなど、公知のデータベースから得られる。
「ＭｙＤ８８（Myeloid differentiation primary response gene 88）」とは、骨髄分化一次応答遺伝子８８または先天性免疫信号変換アダプター（innate immune signal transduction adaptor）とも指称される。前記ＭｙＤ８８は、免疫細胞内の信号伝達に寄与し、黄斑変性のような眼球疾患と密接な関連性があるものと知られている。前記ＭｙＤ８８タンパク質は、天然的に存在する野生型ＭｙＤ８８及びその機能的変異体を含むものとも解釈され、前記ＭｙＤ８８タンパク質またはそれをコーディングする遺伝子の配列は、アメリカ国立生物工学情報センターのＧｅｎＢａｎｋなど、公知のデータベースから得られる。
【0024】
本明細書において、用語「発現（expression）」とは、当業界で通常許容される意味を指称する。前記用語は、一般的に、遺伝子が窮極的にタンパク質を生成する過程を意味する。前記発現は、転写、スプライシング、転写後変形または翻訳を含むが、それらに制限されない。本明細書で使用されているように、発現レベルは、ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルの検出によって決定またはモニタリングされえる。
【0025】
対象体におけるＭｙＤ８８遺伝子発現と係わって使用された用語「抑制」または「減少」とは、非処理群または正常対照群に対して統計的に有意な減少を指称する。前記減少は、例えば、最小３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％以上であるが、これは、検出方法または測定方法によって、検出レベル以下であってもよい。
【0026】
ｓｉＲＮＡは、短い干渉ＲＮＡ（small interfering RNA）であり、ＲＮＡｉ（RNA interference）作用に関与する。ＲＮＡｉは、１９９８年にカエノラブディティス・エレガンスで最初に発見された細胞内遺伝子調節メカニズムであり、作用メカニズムは、細胞内に投入されたＲＮＡ二本鎖のうちアンチセンス鎖が標的遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合することにより、標的遺伝子分解を誘導すると知られており、近年、最も脚光を浴びている新薬開発候補技術である。
【0027】
但し、このような可能性に対し、ｓｉＲＮＡの副作用及び短所が継続的に報告されている。ＲＮＡｉ基盤の治療剤の開発がなされるためには、１）効果的な伝達システムの不在、２）オフターゲット効果、３）免疫反応誘導、４）細胞内ＲＮＡｉ機構飽和のような障壁を克服しなければならない必要性がある。ｓｉＲＮＡが標的遺伝子の発現を直接的に調節することができる効果的な方法であるにもかかわらず、このような問題によって、治療剤の開発に困難がある。これと係わり、非対称ｓｉＲＮＡ（asymmetric shorter duplex siRNA: asiRNA）は、従来のｓｉＲＮＡが有する１９＋２構造に比べて短い二重らせん構造の長さを有する非対称ＲＮＡｉ誘導構造である。既存のｓｉＲＮＡ構造技術において確認されるオフターゲット効果、ＲＮＡｉメカニズムの飽和、ＴＬＲ３による免疫反応などの問題点を克服した技術であり、これによって副作用が低いＲＮＡｉ新薬開発が可能である。
【0028】
これに基づいて、本実施形態において、センス鎖、及び前記センス鎖と相補的なアンチセンス鎖を含む非対称ｓｉＲＮＡ(asiRNA)を提示し、一実施形態によるｓｉＲＮＡは、オフターゲット効果、ＲＮＡｉメカニズムの飽和などの問題を発生させず、安定的に高い伝達効率を維持し、かつ目的とする程度に有効にＭｙＤ８８遺伝子に対する発現を抑制することができる。
【0029】
一実施形態においては、ＭｙＤ８８を標的とするａｓｉＲＮＡをデザイン及び製作し、ＭｙＤ８８を発現する細胞に前記ａｓｉＲＮＡをトランスフェクションした後、ノックダウン効率に優れたＲＮＡｉ誘導用核酸分子、すなわち、ＭｙＤ８８ ａｓｉＲＮＡを選別した。
【0030】
一具体例において、前記ＲＮＡｉ誘導用核酸分子は、配列番号１のアンチセンス鎖及び配列番号２のセンス鎖を含み、それぞれの鎖は、化学的変形が導入されているものでもある。
また、前記アンチセンス鎖の５’－末端、及びセンス鎖の３’－末端は、ブラント末端（blunt end）を形成するものでもある。
また、前記アンチセンス鎖の５’－末端、及びセンス鎖の３’－末端は、ブラント末端（blunt end）を形成するものでもある。
【0031】
化学的変形が導入されたＲＮＡｉ誘導用核酸分子
前記ＲＮＡｉ誘導用核酸分子において、前記センス鎖またはアンチセンス鎖は、１つ以上の化学的変形（chemical modification）を含むものでもある。
前記ＲＮＡｉ誘導用核酸分子において、前記センス鎖またはアンチセンス鎖は、１つ以上の化学的変形（chemical modification）を含むものでもある。
【0032】
一般的なｓｉＲＮＡは、フォスフェートバックボーン構造による高い陰電荷及び高い分子量などの理由によって、細胞膜を通過できず、血液から速く分解及び除去され、実際標的部位にＲＮＡｉ誘導のための十分な量を伝達するのに困難がある。現在、in vitro伝達の場合、陽イオン性脂質と陽イオン性ポリマーを利用した高効率の伝達方法が多く開発されているが、in vivoの場合には、in vitroほどの高効率でｓｉＲＮＡを伝達しがたく、生体内に存在する多様なタンパク質との相互作用によってｓｉＲＮＡ伝達効率が低下するという問題点がある。
【0033】
それで、本実施形態においては、非対称ｓｉＲＮＡ構造に化学的変形を導入して細胞浸透能（cell-penetrating ability）を有するＲＮＡｉ誘導用核酸分子を提示し、より具体的には、別途の伝達体なしに効果的に細胞内伝達が可能なａｓｉＲＮＡ構造体（cell penetrating asymmetric siRNA: cp-asiRNA）を提示する。
一方、前述の化学的変形は、以下のような機能性を付与することができる：
一方、前述の化学的変形は、以下のような機能性を付与することができる：
【0034】
（１）センス鎖の３’末端への親油性モイエティの導入は、ｓｉＲＮＡが細胞膜を容易に透過可能にし、（２）センス鎖またはアンチセンス鎖の末端に隣接したフォスフェートバックボーンのホスホロチオエートなどへの置換は、核酸外部の加水分解酵素に対する抵抗性を付与し、細胞への吸収と、in vivoでｓｉＲＮＡの生物学的利用とを可能にする。（３）糖構造の２’炭素位置で－ＯＨ基に対するメチル、メトキシなどへの置換は、核酸加水分解酵素に対する抵抗性を付与し、ｓｉＲＮＡ免疫原性を低め、オフターゲット効果を低下させることができ、（４）糖構造の２’炭素位置で－ＯＨ基に対するフルオロへの置換は、二本鎖に安定性を付与し、血清での安定性を高め、in vitroとin vivoで効率的なサイレンシングを可能にする。
【0035】
一具体例において、前記アンチセンス鎖は、下記（Ａ）ないし（Ｄ）のうちいずれか１つの配列を含み（５’→３’）、ここで、＊は、ホスホロチオエート結合への変形であり、ｍは、２’－Ｏ－メチルへの置換であり、ｆは、２’－フルオロへの置換であり、Ｐは、５’－リン酸基の結合である：
（Ａ）Ｐ－ｍＵＧＧＵＣＵＧＧＡＡＧｍＵｍＣＡｍＣ＊Ａ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＣ、
（Ｂ）Ｐ－ｍＵｆＧｍＧｆＵｍＣｆＵｍＧｆＧｍＡｆＡｍＧｆＵｍＣｆＡｍＣ＊ｆＡ＊ｍＵ＊ｆＵ＊ｍＣ、
（Ｃ）Ｐ－ｍＵＧｍＧＵＣＵｍＧｍＧｍＡｍＡｍＧＵＣＡＣ＊ｍＡ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｃ、または
（Ｄ）Ｐ－ｍＵＧＧｆＵｆＣｆＵＧＧＡＡＧｆＵｆＣＡｆＣ＊Ａ＊ｆＵ＊ｆＵ＊ｆＣ。
（Ａ）Ｐ－ｍＵＧＧＵＣＵＧＧＡＡＧｍＵｍＣＡｍＣ＊Ａ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＣ、
（Ｂ）Ｐ－ｍＵｆＧｍＧｆＵｍＣｆＵｍＧｆＧｍＡｆＡｍＧｆＵｍＣｆＡｍＣ＊ｆＡ＊ｍＵ＊ｆＵ＊ｍＣ、
（Ｃ）Ｐ－ｍＵＧｍＧＵＣＵｍＧｍＧｍＡｍＡｍＧＵＣＡＣ＊ｍＡ＊Ｕ＊Ｕ＊Ｃ、または
（Ｄ）Ｐ－ｍＵＧＧｆＵｆＣｆＵＧＧＡＡＧｆＵｆＣＡｆＣ＊Ａ＊ｆＵ＊ｆＵ＊ｆＣ。
【0036】
一具体例において、前記センス鎖は、１５ないし１７ｎｔの長さを有し、前記センス鎖内の少なくとも１５個の隣接したヌクレオチドは、アンチセンス鎖と相補的であり、前記センス鎖は、少なくとも１つ以上の化学的変形を含む。前記センス鎖は、下記（ａ）ないし（ｃ）のうちいずれか１つの配列を含み（５’→３’）、ここで、＊は、ホスホロチオエート結合への変形であり、ｍは、２’－Ｏ－メチルへの置換であり、Ｌｐは、親油性モイエティの導入である：
（ａ）ｍＵｍＧＵＧＡＣＵＵＣＣＡＧＡＣ＊ｍＣ＊ｍＡ＊Ｌｐ、
（ｂ）ｍＵＧｍＵＧｍＡＣｍＵＵｍＣＣｍＡＧｍＡＣ＊ｍＣ＊Ａ＊Ｌｐ、または
（ｃ）ｍＵＧｍＵＧＡｍＣｍＵｍＵｍＣｍＣＡＧＡｍＣ＊ｍＣ＊Ａ＊Ｌｐ。
（ａ）ｍＵｍＧＵＧＡＣＵＵＣＣＡＧＡＣ＊ｍＣ＊ｍＡ＊Ｌｐ、
（ｂ）ｍＵＧｍＵＧｍＡＣｍＵＵｍＣＣｍＡＧｍＡＣ＊ｍＣ＊Ａ＊Ｌｐ、または
（ｃ）ｍＵＧｍＵＧＡｍＣｍＵｍＵｍＣｍＣＡＧＡｍＣ＊ｍＣ＊Ａ＊Ｌｐ。
【0037】
前記親油性モイエティは、コレステロール、トコフェロール、ステアリン酸、レチノイン酸、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸及び炭素数１０個以上の長鎖脂肪酸から選択され、好ましくは、コレステロール、ＤＨＡまたはパルミチン酸である。最も好ましくは、パルミチン酸である。
【0038】
一具体例において、前記センス鎖は、下記から選択されるいずれか１つのセンス鎖を含み、ここで、＊は、ホスホロチオエート結合への変形であり、ｍは、２’－Ｏ－メチルへの置換であり、ｃｈｏｌは、３’－コレステロールの結合であり、ＰＡは、３’－パルミチン酸の結合である：
（ｄ）ｍＵｍＧＵＧＡＣＵＵＣＣＡＧＡＣ＊ｍＣ＊ｍＡ＊ｃｈｏｌ、
（ｅ）ｍＵＧｍＵＧｍＡＣｍＵＵｍＣＣｍＡＧｍＡＣ＊ｍＣ＊Ａ＊ｃｈｏｌ、
（ｆ）ｍＵＧｍＵＧＡｍＣｍＵｍＵｍＣｍＣＡＧＡｍＣ＊ｍＣ＊Ａ＊ｃｈｏｌ、
（ｇ）ｍＵｍＧＵＧＡＣＵＵＣＣＡＧＡＣ＊ｍＣ＊ｍＡ＊ＰＡ、
（ｈ）ｍＵＧｍＵＧｍＡＣｍＵＵｍＣＣｍＡＧｍＡＣ＊ｍＣ＊Ａ＊ＰＡ、または
（ｉ）ｍＵＧｍＵＧＡｍＣｍＵｍＵｍＣｍＣＡＧＡｍＣ＊ｍＣ＊Ａ＊ＰＡ。
他の態様は、ＲＮＡｉ誘導用核酸分子を有効成分として含む、眼球疾患の予防用または治療用薬剤学的組成物を提供する。
（ｄ）ｍＵｍＧＵＧＡＣＵＵＣＣＡＧＡＣ＊ｍＣ＊ｍＡ＊ｃｈｏｌ、
（ｅ）ｍＵＧｍＵＧｍＡＣｍＵＵｍＣＣｍＡＧｍＡＣ＊ｍＣ＊Ａ＊ｃｈｏｌ、
（ｆ）ｍＵＧｍＵＧＡｍＣｍＵｍＵｍＣｍＣＡＧＡｍＣ＊ｍＣ＊Ａ＊ｃｈｏｌ、
（ｇ）ｍＵｍＧＵＧＡＣＵＵＣＣＡＧＡＣ＊ｍＣ＊ｍＡ＊ＰＡ、
（ｈ）ｍＵＧｍＵＧｍＡＣｍＵＵｍＣＣｍＡＧｍＡＣ＊ｍＣ＊Ａ＊ＰＡ、または
（ｉ）ｍＵＧｍＵＧＡｍＣｍＵｍＵｍＣｍＣＡＧＡｍＣ＊ｍＣ＊Ａ＊ＰＡ。
他の態様は、ＲＮＡｉ誘導用核酸分子を有効成分として含む、眼球疾患の予防用または治療用薬剤学的組成物を提供する。
【0039】
前記薬剤学的組成物は、前述のＲＮＡｉ誘導用核酸分子をそのまま含むか、あるいはそれを利用するので、それら間に共通の内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
【0040】
眼球疾患
前記薬剤学的組成物は、ＭｙＤ８８遺伝子の発現を抑制することにより、異常な血管新生を阻害する機能を有するので、血管異常を伴う眼球疾患の予防または治療のための薬剤学的組成物の有効成分として活用可能である。
前記薬剤学的組成物は、ＭｙＤ８８遺伝子の発現を抑制することにより、異常な血管新生を阻害する機能を有するので、血管異常を伴う眼球疾患の予防または治療のための薬剤学的組成物の有効成分として活用可能である。
【0041】
前記眼球疾患は、例えば、黄斑変性であり、ここで、「黄斑変性」とは、新生血管が異常に成長して、黄斑が損傷され、視力に影響を及ぼす症状を伴う眼球疾患である。黄斑変性は、５０歳以上の年齢層で主に発生し、非滲出性（ドライ型）または滲出性（ウェット型）に分けられる。特に、ウェット型黄斑変性の場合は、失明を誘発し、その原因に対してはまだ正確に明らかになっていないが、危険因子と知られているのは年齢であり、環境的要因としては、喫煙、高血圧、肥満、遺伝的素因、過度な紫外線露出、低い血中抗酸化剤濃度などがある。
【0042】
薬剤学的組成物
本明細書において、用語「有効成分（effective ingredient）」とは、有益であるか、または望ましい臨床的結果または生化学的結果に影響を与える適切な有効量の成分を意味する。具体的には、有効量の製剤、活性剤または核酸分子を意味する。
本明細書において、用語「有効成分（effective ingredient）」とは、有益であるか、または望ましい臨床的結果または生化学的結果に影響を与える適切な有効量の成分を意味する。具体的には、有効量の製剤、活性剤または核酸分子を意味する。
【0043】
前記有効量は、１回またはそれ以上投与可能であり、疾病を予防するか、あるいは疾病状態を非制限的に、症状の緩和、疾病範囲の減少、疾病状態の安定化（すなわち、悪くならない）、疾病進行の遅延または速度の減少、あるいは疾病状態の改善または一時的緩和及び軽減（部分的または全体的）のための適切な量でありえる。
【0044】
本明細書において、用語「予防（prevention）」とは、疾患の発生をあらかじめ遮断するか、疾患を抑制するか、あるいは疾患の進行を遅延させるあらゆる行為を意味する。例えば、前記眼球疾患またはその特徴的な特性の発生を阻むか、発生を妨害するか、あるいは前記眼球疾患またはその特徴的な特性の発生から防御または保護することを指称する。
【0045】
本明細書において、用語「治療（treatment）」とは、治療学的治療及び予防的または予防措置方法を全て意味する。また、疾患の症状が好転するか、あるいは有益に変更されるあらゆる行為を意味する。例えば、前記眼球疾患またはその特徴的な特性を予防、減少または改善するか、あるいは対象体において前記眼球疾患またはその特徴的な特性の進行を遅延（弱化）させることである。
【0046】
本明細書において、用語「有効量（effective amount）」とは、当業界で通常許容される意味を指称する。前記用語は、一般的に、研究者、獣医師、医師またはその他臨床医師などが追い求める細胞、組織、システム、動物または人間の意図された生物学的反応（例えば、有益な反応）を導出する分子、化合物または構成物の量を意味する。具体的には、「治療学的有効量（therapeutically effective amount）」とは、例えば、疾病や障害と係わる測定可能なパラメータにおいて治療的に関連した変化があり、特定臨床的治療が効果的であると見なされるほどの望ましい医学的反応を導出可能な分子、化合物または構成物の量を意味する。前記疾病または障害の治療のための薬物の治療学的有効量は、前記パラメータにおいて治療的に関連した変化をもたらすのに必要な量でもある。
【0047】
本発明による核酸分子を含む薬剤学的組成物は、眼球内（intraocular）投与が行われる。前記核酸分子の眼球内投与は、当該投与経路が前記核酸分子を眼に入るようにする限り、眼に対する注射または直接（例えば、局所）投与によっても行われる。前述の眼への局所投与経路以外に、適する眼球内投与経路は、硝子体内（intravitreal）、網膜内、網膜下、テノン嚢下（subtenon）、眼球周囲（peri-orbital）及び眼球後方（retro-orbital）、結膜嚢内、結膜下、角膜通過（trans-corneal）及び強膜通過（trans-scleral）の投与を含む。
【0048】
前記「製薬上許容される組成物」または「製薬上許容される剤型」とは、前記核酸分子が目的とする活性を発揮するのに最適の物理的位置に効果的に分配されるようにする組成物または剤型を指称する。
他の態様は、治療学的有効量の前記薬剤学的組成物を個体に投与する段階を含む、眼球疾患を治療する方法を提供する。
他の態様は、治療学的有効量の前記薬剤学的組成物を個体に投与する段階を含む、眼球疾患を治療する方法を提供する。
【0049】
前記眼球疾患を治療する方法は、前述のＲＮＡｉ誘導用核酸分子または薬剤学的組成物をそのまま含むか、あるいはそれを利用するので、それら間に共通の内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
【0050】
本明細書において、用語「個体」とは、疾病、具体的には、眼球疾患の治療を必要とする対象を意味し、より具体的には、人間または非人間である霊長類、マウス、犬、猫、馬、牛、洋、豚、ヤギ、ラクダ、羚羊などの哺乳類をいずれも含む。
【0051】
以下、本発明を、実施例を介してより詳細に説明する。しかしながら、当該実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲が当該実施例に限定されるものではない。
【0052】
実施例１．ｓｉＲＮＡ配列及び合成
本実施例においては、ＭｙＤ８８を標的とするｓｉＲＮＡを合成したが、多様な化学的変形（２’ＯＭｅ、ＰＳ、フルオロ）と、センス鎖の３’末端にコレステロール、パルミチン酸のような親油性モイエティを導入したｓｉＲＮＡを製造したが（表１参照）、このような方法は当業界に広く公知されている。具体的には、本実施例においては、親油性モイエティであるコレステロール及びＰＡを導入するために、コレステロール－ＴＥＧ－ＣＰＧ（LGC Prime Synthesis社製）及びＰＡ－リンカー－ＣＰＧ（LGC LINK社製、下記表３参照）をそれぞれ使用した。
本実施例においては、ＭｙＤ８８を標的とするｓｉＲＮＡを合成したが、多様な化学的変形（２’ＯＭｅ、ＰＳ、フルオロ）と、センス鎖の３’末端にコレステロール、パルミチン酸のような親油性モイエティを導入したｓｉＲＮＡを製造したが（表１参照）、このような方法は当業界に広く公知されている。具体的には、本実施例においては、親油性モイエティであるコレステロール及びＰＡを導入するために、コレステロール－ＴＥＧ－ＣＰＧ（LGC Prime Synthesis社製）及びＰＡ－リンカー－ＣＰＧ（LGC LINK社製、下記表３参照）をそれぞれ使用した。
【0053】
【表1】
【0054】
一方、前記表１に「＊」、「ｍ」、「ｆ」、「ｃｈｏｌ」及び「ＰＡ」で表記された化学的変形は、表２に示した通りであり、「ｃｈｏｌ」及び「ＰＡ」で表記された化学的変形は、それぞれ３’－末端にコレステロール及びパルミチン酸（パルミトイル形態に導入）が添加された形態を意味する。
【0055】
【表2】
【0056】
【表3】
【0057】
実施例２．ｃｐ－ａｓｉＲＮＡ処理によるＭｙＤ８８ ｍＲＮＡレベル評価－in vitroノックダウン分析
（１）ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－３、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－５、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－７、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－１３及びＯＬＸ３０１Ａ－１１０－１４処理による分析
ＭｙＤ８８ ｍＲＮＡに対する発現抑制効果を確認するために、それぞれ１００ｎＭのｓｉＲＮＡであるＯＬＸ３０１Ａ－１１０－３、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－５、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－７、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－１３及びＯＬＸ３０１Ａ－１１０－１４それぞれをＡＲＰＥ－１９細胞に処理し、これをインキュベーション（free uptake）した後、リアルタイムｑＰＣＲでＭｙＤ８８ ｍＲＮＡの発現レベルを測定した。具体的には、ＡＲＰＥ－１９細胞は２４ウェルプレートに３×１０４cells/wellでシーディングされ、２４時間後、そこに１００ｎＭのｃｐ－ｓｉＲＮＡを添加した後、Opti-MEM medium条件で細胞をインキュベーションした。２４時間後、Ｔｒｉ－ＲＮＡ試薬（FAVORGEN）を利用してトータルＲＮＡを抽出した後、High-capacity cDNA reverse transcription kit（Applied Biosystems）を利用してｃＤＮＡを合成した。その後、TB Green Premix Ex Taq（Takara，RR420A）と表４のプライマーとを利用して、CFX Connect Real-Time PCR Detection System（BioRad）でＭｙＤ８８遺伝子の発現レベルを確認した（表５参照）。
（１）ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－３、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－５、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－７、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－１３及びＯＬＸ３０１Ａ－１１０－１４処理による分析
ＭｙＤ８８ ｍＲＮＡに対する発現抑制効果を確認するために、それぞれ１００ｎＭのｓｉＲＮＡであるＯＬＸ３０１Ａ－１１０－３、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－５、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－７、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－１３及びＯＬＸ３０１Ａ－１１０－１４それぞれをＡＲＰＥ－１９細胞に処理し、これをインキュベーション（free uptake）した後、リアルタイムｑＰＣＲでＭｙＤ８８ ｍＲＮＡの発現レベルを測定した。具体的には、ＡＲＰＥ－１９細胞は２４ウェルプレートに３×１０４cells/wellでシーディングされ、２４時間後、そこに１００ｎＭのｃｐ－ｓｉＲＮＡを添加した後、Opti-MEM medium条件で細胞をインキュベーションした。２４時間後、Ｔｒｉ－ＲＮＡ試薬（FAVORGEN）を利用してトータルＲＮＡを抽出した後、High-capacity cDNA reverse transcription kit（Applied Biosystems）を利用してｃＤＮＡを合成した。その後、TB Green Premix Ex Taq（Takara，RR420A）と表４のプライマーとを利用して、CFX Connect Real-Time PCR Detection System（BioRad）でＭｙＤ８８遺伝子の発現レベルを確認した（表５参照）。
【0058】
【表4】
【0059】
【表5】
【0060】
（２）ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２１、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２２及びＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２３処理による分析
実施例１で合成されたｓｉＲＮＡであるＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２１、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２２及びＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２３のＭｙＤ８８発現を抑制するか確認するために、以下のような実験を遂行した。
実施例１で合成されたｓｉＲＮＡであるＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２１、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２２及びＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２３のＭｙＤ８８発現を抑制するか確認するために、以下のような実験を遂行した。
【0061】
それぞれ２５、５０、１００、５００、１０００ｎＭのｓｉＲＮＡをＹ７９細胞に処理し、これをインキュベーション（free uptake）した後、リアルタイムｑＰＣＲでＭｙＤ８８ ｍＲＮＡの発現レベルを測定した。具体的には、Ｙ７９細胞は２４ウェルプレートに６×１０４cells/wellでシーディングされ、２４時間後、そこに２５、５０、１００、５００、１０００ｎＭのｓｉＲＮＡを添加した後、Opti-MEM media条件、すなわち、ＲＰＭＩ １６４０（１０％ＦＢＳ）で細胞をインキュベーションした。２４時間後、Ｔｒｉ－ＲＮＡ試薬（FAVORGEN）を利用してトータルＲＮＡを抽出した後、High-capacity cDNA reverse transcription kit（Applied Biosystems）を利用してｃＤＮＡを合成した。その後、TB Green Premix Ex Taq（Takara，RR420A）と表６のプライマーとを利用して、CFX Connect Real-Time PCR Detection System（BioRad）でＭｙＤ８８遺伝子の発現レベルを確認した（表７、図１Ａないし図１Ｃ参照）。
【0062】
【表6】
【0063】
【表7】
【0064】
実施例３．ｓｉＲＮＡ処理によるＭｙＤ８８タンパク質レベルの評価
（１）ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－３、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－５、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－７、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－１３、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－１４処理による分析
実施例１で合成されたｓｉＲＮＡのＭｙＤ８８タンパク質に対する発現抑制効果を確認するために、それぞれ１ｎＭのｓｉＲＮＡをＡＲＰＥ－１９細胞（ＡＴＣＣ）に形質感染させた後、ウェスタンブロットを介してＭｙＤ８８タンパク質の発現レベルを測定した。具体的には、ＡＲＰＥ－１９細胞を１２ウェルプレートに５×１０４cells/wellでシーディングし、２４時間後、そこに２μＭのｓｉＲＮＡを添加した後、Opti-MEM media条件で細胞をインキュベーションした。２４時間後、培地を、１０％ fetal bovine serum（FBS，Gibco）を添加したDulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F-12 Nutrient Mixture Ham（DMEM/F-12）1:1 Mixtures（Gibco）に交替し、４８時間後、ＭｙＤ８８タンパク質の発現レベルを測定した。
（１）ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－３、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－５、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－７、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－１３、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－１４処理による分析
実施例１で合成されたｓｉＲＮＡのＭｙＤ８８タンパク質に対する発現抑制効果を確認するために、それぞれ１ｎＭのｓｉＲＮＡをＡＲＰＥ－１９細胞（ＡＴＣＣ）に形質感染させた後、ウェスタンブロットを介してＭｙＤ８８タンパク質の発現レベルを測定した。具体的には、ＡＲＰＥ－１９細胞を１２ウェルプレートに５×１０４cells/wellでシーディングし、２４時間後、そこに２μＭのｓｉＲＮＡを添加した後、Opti-MEM media条件で細胞をインキュベーションした。２４時間後、培地を、１０％ fetal bovine serum（FBS，Gibco）を添加したDulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F-12 Nutrient Mixture Ham（DMEM/F-12）1:1 Mixtures（Gibco）に交替し、４８時間後、ＭｙＤ８８タンパク質の発現レベルを測定した。
【0065】
【表8】
【0066】
その結果、前記表８に示したように、前記ｓｉＲＮＡの処理によるＭｙＤ８８タンパク質の発現抑制効果を確認した。特に、相対的に優秀なＭｙＤ８８タンパク質発現抑制効率を示した。
【0067】
（２）ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２１、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２２及びＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２３の処理によるin vivoでのＭｙＤ８８タンパク質のノックダウン分析
１）正常マウスにおけるＭｙＤ８８タンパク質発現抑制の効能
本実施例においては、in vivoでの実施例１で合成されたｓｉＲＮＡであるＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２１、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２２及びＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２３がＭｙＤ８８タンパク質の発現を抑制するか確認するために、以下のような実験を遂行した。正常マウスにおけるＭｙＤ８８タンパク質発現抑制効能を確認するために、９週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウス（グループ当たり３匹、眼球６個）に８μｇのＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２１、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２２及びＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２３を含む１０ｍＭ ＰＢＳ混合液０．８μｌを製造して硝子体内注射（intravitreal injection: IVT）（Day 0）した。投与７日目、マウスからＲＰＥを分離してＲＩＰＡバッファ（SIGMA，R0278）を入れ、tissue grinder pestle（Scienceware，199230001）とソニケータ（Sonics，VC505）を利用して均質化した。その後、遠心分離して得た上澄液からBCA Protein Assay Kit（Thermo，23225）を利用してタンパク質を定量し、各サンプルごとに２０μｇのタンパク質を８－１６％Precast Gel（Bio-rad，456-1106）を使用して電気泳動し、ＰＶＤＦメンブレン（Bio-rad，1620177）に転写した。SuperBlock（商標）（ＴＢＳ）ブロッキングバッファ（Thermo，37535）でブロッキングし、ＭｙＤ８８抗体（1:500; Cell signaling，4283）とＶｉｎｃｕｌｉｎ抗体（1:2,000; Santa Cruz，sc-73614）、及びHRP-conjugated anti-rabbitとanti-mouse IgG（1:5,000; Santa Cruz，sc-2357とBethyl laboratories，A90-116P）を使用して各製造社のプロトコルに従って反応させた。ＥＣＬ（Thermo，34580 or 34095）を処理し、ChemiDoc XRS+（Bio-Rad，1708265）でＭｙＤ８８とＶｉｎｃｕｌｉｎタンパク質発現程度を確認した。当該試験の陰性対照群には、scrambled cp-asiRNA（SCR）投与群が使用された。その結果、ＭｙＤ８８タンパク質のレベルが約３５～４５％低くなったことを認めた（表９、図２Ａ及び図２Ｂ参照）。
１）正常マウスにおけるＭｙＤ８８タンパク質発現抑制の効能
本実施例においては、in vivoでの実施例１で合成されたｓｉＲＮＡであるＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２１、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２２及びＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２３がＭｙＤ８８タンパク質の発現を抑制するか確認するために、以下のような実験を遂行した。正常マウスにおけるＭｙＤ８８タンパク質発現抑制効能を確認するために、９週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウス（グループ当たり３匹、眼球６個）に８μｇのＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２１、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２２及びＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２３を含む１０ｍＭ ＰＢＳ混合液０．８μｌを製造して硝子体内注射（intravitreal injection: IVT）（Day 0）した。投与７日目、マウスからＲＰＥを分離してＲＩＰＡバッファ（SIGMA，R0278）を入れ、tissue grinder pestle（Scienceware，199230001）とソニケータ（Sonics，VC505）を利用して均質化した。その後、遠心分離して得た上澄液からBCA Protein Assay Kit（Thermo，23225）を利用してタンパク質を定量し、各サンプルごとに２０μｇのタンパク質を８－１６％Precast Gel（Bio-rad，456-1106）を使用して電気泳動し、ＰＶＤＦメンブレン（Bio-rad，1620177）に転写した。SuperBlock（商標）（ＴＢＳ）ブロッキングバッファ（Thermo，37535）でブロッキングし、ＭｙＤ８８抗体（1:500; Cell signaling，4283）とＶｉｎｃｕｌｉｎ抗体（1:2,000; Santa Cruz，sc-73614）、及びHRP-conjugated anti-rabbitとanti-mouse IgG（1:5,000; Santa Cruz，sc-2357とBethyl laboratories，A90-116P）を使用して各製造社のプロトコルに従って反応させた。ＥＣＬ（Thermo，34580 or 34095）を処理し、ChemiDoc XRS+（Bio-Rad，1708265）でＭｙＤ８８とＶｉｎｃｕｌｉｎタンパク質発現程度を確認した。当該試験の陰性対照群には、scrambled cp-asiRNA（SCR）投与群が使用された。その結果、ＭｙＤ８８タンパク質のレベルが約３５～４５％低くなったことを認めた（表９、図２Ａ及び図２Ｂ参照）。
【0068】
【表9】
【0069】
２）Laser-induced CNVマウスモデルにおけるＭｙＤ８８タンパク質発現抑制の効能
ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２１、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２２及びＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２３のLaser-injuryマウスモデルにおけるＭｙＤ８８タンパク質発現抑制効果を確認するために、９週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウス（グループ当たり６匹、眼球１２個）にLaser induced CNV（パワー：１３０ｍＷ、持続時間：８０ｍｓ、サイズ：７５μｍ、６レーザ／眼球）を与えた直後、４μｇのＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２１、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２２及びＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２３を含む１０ｍＭ ＰＢＳ混合液０．８μｌを製造して硝子体内注射（intravitreal injection: IVT）（Day 0）した。投与７日目、前記と同じ方法によってマウスＲＰＥを分離し、各サンプルごとに２０μｇのタンパク質に対するウェスタンブロット解析を介してＭｙＤ８８タンパク質発現レベルを測定した。当該試験の陰性対照群には、scrambled cp-asiRNA（ＳＣＲ）投与群が使用された。その結果、ＭｙＤ８８タンパク質のレベルが約３０～３５％低くなったことを認めた（表１０、図３Ａ及び図３Ｂ参照）。
ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２１、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２２及びＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２３のLaser-injuryマウスモデルにおけるＭｙＤ８８タンパク質発現抑制効果を確認するために、９週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウス（グループ当たり６匹、眼球１２個）にLaser induced CNV（パワー：１３０ｍＷ、持続時間：８０ｍｓ、サイズ：７５μｍ、６レーザ／眼球）を与えた直後、４μｇのＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２１、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２２及びＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２３を含む１０ｍＭ ＰＢＳ混合液０．８μｌを製造して硝子体内注射（intravitreal injection: IVT）（Day 0）した。投与７日目、前記と同じ方法によってマウスＲＰＥを分離し、各サンプルごとに２０μｇのタンパク質に対するウェスタンブロット解析を介してＭｙＤ８８タンパク質発現レベルを測定した。当該試験の陰性対照群には、scrambled cp-asiRNA（ＳＣＲ）投与群が使用された。その結果、ＭｙＤ８８タンパク質のレベルが約３０～３５％低くなったことを認めた（表１０、図３Ａ及び図３Ｂ参照）。
【0070】
【表10】
【0071】
３）ＣＮＶモデルにおけるＣＮＶ体積減少の確認
本実施例においては、レーザ光凝固による脈絡膜新生血管（Choroidal neovascularization: CNV）が誘導されたマウスにおけるＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２１、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２２及びＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２３の投与による治療効能を評価した。具体的には、９週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウス（グループ当たり８匹、８眼球）にレーザ光凝固（パワー：１３０ｍＷ、持続時間：８０ｍｓ、サイズ：７５μｍ、４レーザ／眼球）を誘導した直後、１及び２μｇのＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２１、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２２及びＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２３を含む１０ｍＭ ＰＢＳ混合液０．８μｌを製造して硝子体内注射（intravitreal injection: IVT）（Day 0）した。それから６日目にマウスの眼球から分離したＲＰＥ ｆｌａｔは、血管内皮細胞に特異的なIsolectin B4（Vector laboratories，FL-1201）蛍光染色を行った。その後、共焦点顕微鏡（Leica，TCS SP8）を利用して、蛍光が観察される開始地点から終了地点まで撮影した。Image J softwareを介して撮影されたイメージから、ＩＢ４染色が行われた領域を数値化してＣＮＶ体積を測定し、陰性対照群との相対的な％比較を介して治療効能を評価した。当該試験の陰性対照群には、１０ｍＭ ＰＢＳ投与群が使用され、陽性対照群には、１及び２μｇのＯＬＸ１００２０投与群が使用された。その結果、ＣＮＶ体積が約３０～４０％減少することを確認し、陽性対照群に比べてもその効能が優秀であることを認めた（表１１、図４参照）。
本実施例においては、レーザ光凝固による脈絡膜新生血管（Choroidal neovascularization: CNV）が誘導されたマウスにおけるＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２１、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２２及びＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２３の投与による治療効能を評価した。具体的には、９週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウス（グループ当たり８匹、８眼球）にレーザ光凝固（パワー：１３０ｍＷ、持続時間：８０ｍｓ、サイズ：７５μｍ、４レーザ／眼球）を誘導した直後、１及び２μｇのＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２１、ＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２２及びＯＬＸ３０１Ａ－１１０－２３を含む１０ｍＭ ＰＢＳ混合液０．８μｌを製造して硝子体内注射（intravitreal injection: IVT）（Day 0）した。それから６日目にマウスの眼球から分離したＲＰＥ ｆｌａｔは、血管内皮細胞に特異的なIsolectin B4（Vector laboratories，FL-1201）蛍光染色を行った。その後、共焦点顕微鏡（Leica，TCS SP8）を利用して、蛍光が観察される開始地点から終了地点まで撮影した。Image J softwareを介して撮影されたイメージから、ＩＢ４染色が行われた領域を数値化してＣＮＶ体積を測定し、陰性対照群との相対的な％比較を介して治療効能を評価した。当該試験の陰性対照群には、１０ｍＭ ＰＢＳ投与群が使用され、陽性対照群には、１及び２μｇのＯＬＸ１００２０投与群が使用された。その結果、ＣＮＶ体積が約３０～４０％減少することを確認し、陽性対照群に比べてもその効能が優秀であることを認めた（表１１、図４参照）。
【0072】
【表11】
【0073】
前述の本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須的な特徴を変更せずにも他の具体的な形態に容易に変形可能であるということを理解できるであろう。従って、前述の実施形態は、あらゆる面において例示的なものであり、限定的ではないものと理解しなければならない。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【配列表】