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特許7539609抗－ＣＤ３００Ｃ単クローン抗体を含むがん予防または治療用組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-16
(45)【発行日】2024-08-26
(54)【発明の名称】抗－ＣＤ３００Ｃ単クローン抗体を含むがん予防または治療用組成物
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20240819BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240819BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240819BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240819BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
A61K39/395 U
A61P35/00
A61P37/04
【請求項の数】
16
(21)【出願番号】P 2022528613
(86)(22)【出願日】2020-11-18
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-31
(86)【国際出願番号】 KR2020016264
(87)【国際公開番号】W WO2021101244
(87)【国際公開日】2021-05-27
【審査請求日】2022-05-16
(31)【優先権主張番号】10-2019-0147496
(32)【優先日】2019-11-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2020-0154076
(32)【優先日】2020-11-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】522193293
【氏名又は名称】セントリックスバイオ インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】チョン、チェウォン
(72)【発明者】
【氏名】イ、スイン
(72)【発明者】
【氏名】イム、チャンキ
【審査官】小倉 梢
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１９／２３１１８８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Sci. Rep.，2016年，Vol. 6:23942，p. 1-12
【文献】J. Innate. Immun.，2013年，Vol. 5，p. 389-400
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １６／００ － １６／４６
Ｃ１２Ｎ １５／００ － １５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１４、２０、および３６からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するｓｃＦｖのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体。
【請求項2】
前記抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体は種間交差反応性を有することを特徴とする、請求項１に記載の抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体。
【請求項3】
前記交差反応性はヒト抗原とマウス抗原に対する交差反応性であることを特徴とする、請求項２に記載の抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体。
【請求項4】
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を有効性分として含み、前記抗体は配列番号１４、２０、および３６からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するｓｃＦｖのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、がん予防または治療用薬学的組成物。
【請求項5】
前記がんは大腸がん、直膓がん、結腸がん、甲状腺がん、口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、子宮頸部がん、脳がん、肺がん、卵巣がん、膀胱がん、腎臓がん、肝臓がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、舌がん、乳ガン、子宮がん、胃がん、骨がんおよび血液がんからなる群から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項6】
前記薬学的組成物は免疫抗がん剤をさらに含むことを特徴とする、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項7】
前記免疫抗がん剤はａｎｔｉ－ＰＤ－１、ａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１、ａｎｔｉ－ＣＴＬＡ－４、ａｎｔｉ－ＫＩＲ、ａｎｔｉ－ＬＡＧ３、ａｎｔｉ－ＣＤ１３７、ａｎｔｉ－ＯＸ４０、ａｎｔｉ－ＣＤ２７６、ａｎｔｉ－ＣＤ２７、ａｎｔｉ－ＧＩＴＲ、ａｎｔｉ－ＴＩＭ３、ａｎｔｉ－４１ＢＢ、ａｎｔｉ－ＣＤ２２６、ａｎｔｉ－ＣＤ４０、ａｎｔｉ－ＣＤ７０、ａｎｔｉ－ＩＣＯＳ、ａｎｔｉ－ＣＤ４０Ｌ、ａｎｔｉ－ＢＴＬＡ、ａｎｔｉ－ＴＣＲ、およびａｎｔｉ－ＴＩＧＩＴからなる群から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項8】
前記薬学的組成物はがんの増殖、生存、転移、再発または治療耐性を抑制することを特徴とする、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項9】
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を有効性分として含み、前記抗体は配列番号１４、２０、および３６からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するｓｃＦｖのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む、免疫抗がん剤。
【請求項10】
前記免疫抗がん剤はがんの増殖、生存、転移、再発または治療耐性を抑制することを特徴とする、請求項９に記載の免疫抗がん剤。
【請求項11】
前記がんは大腸がん、直膓がん、結腸がん、甲状腺がん、口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、子宮頸部がん、脳がん、肺がん、卵巣がん、膀胱がん、腎臓がん、肝臓がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、舌がん、乳ガン、子宮がん、胃がん、骨がんおよび血液がんからなる群から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項９に記載の免疫抗がん剤。
【請求項12】
請求項１～３のいずれか１項に記載の抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を有効性分として含む、抗がん治療法の補助剤。
【請求項13】
前記補助剤は免疫細胞の免疫機能を活性化させて抗がん治療効果を向上させることを特徴とする、請求項１２に記載の補助剤。
【請求項14】
前記抗がん治療法は放射線治療法、抗がん剤治療法または免疫抗がん剤治療法である、請求項１２に記載の補助剤。
【請求項15】
請求項１～３のいずれか１項に記載の抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を有効性分として含む組成物を個体に投与する段階を含む、非ヒト対象におけるがんの予防または治療方法。
【請求項16】
請求項１～３のいずれか１項に記載の抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を有効性分として含む組成物の、非ヒト対象におけるがん予防または治療用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体、これを含むがん予防または治療用組成物、およびこれを含む抗がん免疫治療用組成物などに関する。
【背景技術】
【0002】
がんは現代人の死亡原因で最も大きな比重を占めている疾患の一つであって、多様な原因によって発生した遺伝子の突然変異によって正常細胞が変化して発生した病気であり、正常な細胞の分化、増殖、成長形態などに従わない腫瘍のうち悪性のものを指称する。がんとは、「制御されていない細胞成長」と特徴づけられ、このような異常な細胞成長によって腫瘍（ｔｕｍｏｒ）と呼ばれる細胞塊りが形成されて周囲の組織に浸透し、ひどい場合には身体の他の器官に転移したりもする。がんは手術、放射線および薬物療法などで治療をしても、多くの場合根本的な治癒ができず、患者に苦痛を与え、最終的には死に至らせる難治性慢性疾患である。特に、最近では老年人口の増加、環境の悪化などによって世界がん発生率は毎年５％以上増加している趨勢であり、ＷＨＯ報告書によると、今後２５年以内にがん発生人口は３千万人に増加し、このうち２千万人の人口はがんで死亡するであろうと推定されている。
【0003】
がんの薬物治療、すなわち、抗がん剤は一般的に細胞毒性を有している化合物であって、がん細胞を攻撃して死滅させる方式でがんを治療するが、がん細胞だけでなく正常細胞にも損傷を与えるため高い副作用を現す。したがって、副作用を減少させるために標的抗がん剤が開発された。しかし、このような標的抗がん剤の場合、副作用は低くすることができたものの、高い確率で耐性ができてしまうという限界点を露呈した。したがって、最近では体内の免疫体系を利用して毒性および耐性による問題点を減少させる免疫抗がん剤に対する関心が急増している趨勢である。このような免疫抗がん剤の一例として、がん細胞の表面のＰＤ－Ｌ１に特異的に結合してＴ細胞のＰＤ－１との結合を抑制してＴ細胞を活性化させ、がん細胞を攻撃するようにさせる免疫関門抑制剤が開発されたことがある（大韓民国公開特許１０－２０１８－００９９５５７）。しかし、このような免疫関門抑制剤の場合にも効果を示すがんの種類が多様でないため、多様ながんにおいて同一に治療効果を示す新しい抗がん免疫治療剤の開発が切に必要であるのが実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明は前記のような従来技術上の問題点を解決するために案出されたもので、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体、これを含むがん予防または治療用組成物、およびこれを含む抗がん免疫治療用組成物などを提供することをその目的とする。
【0005】
しかし、本発明が達成しようとする技術的課題は以上で言及した課題に制限されず、言及されていないさらに他の課題は以下の記載から当業界で通常の知識を有する者に明確に理解され得るであろう。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８および５０からなる群から選択されたいずれか一つ以上のＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）配列を含む、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を提供する。前記ＣＤＲ配列は、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８および５０からなる群から選択されたいずれか一つ以上のＣＤＲ配列と９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。アミノ酸配列に対する「配列相同性の％」は最適に配列された配列と比較領域とを比較することによって確認され、比較領域でアミノ酸配列の一部はさらに、配列の最適配列に対する参考配列（追加または削除を含まない）に比べて追加または削除（すなわち、ギャップ）を含むことができる。
【0007】
本発明の一具体例において、前記抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体は種間交差反応性を有することができ、前記種間交差反応は好ましくは、ヒト由来ＣＤ３００ｃ抗原と哺乳類由来ＣＤ３００ｃ抗原に対する交差反応性を意味し得、さらに好ましくはヒト抗原とマウス抗原に対する交差反応性であり得る。
【0008】
また、本発明は前記抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を有効性分として含むがん予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【0009】
本発明の一具体例において、前記がんは好ましくは、大腸がん、直膓がん、結腸がん、甲状腺がん、口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、子宮頸部がん、脳がん、肺がん、卵巣がん、膀胱がん、腎臓がん、肝臓がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、舌がん、乳ガン、子宮がん、胃がん、骨がん、血液がんなどや、がん細胞の表面にＣＤ３００ｃ蛋白質を発現するがんの種類であればこれに制限されない。
【0010】
本発明の他の具体例において、前記薬学的組成物は他の既存の免疫抗がん剤または抗がん剤をさらに含むことができ、前記免疫抗がん剤は好ましくは、ａｎｔｉ－ＰＤ－１、ａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１、ａｎｔｉ－ＣＴＬＡ－４、ａｎｔｉ－ＫＩＲ、ａｎｔｉ－ＬＡＧ３、ａｎｔｉ－ＣＤ１３７、ａｎｔｉ－ＯＸ４０、ａｎｔｉ－ＣＤ２７６、ａｎｔｉ－ＣＤ２７、ａｎｔｉ－ＧＩＴＲ、ａｎｔｉ－ＴＩＭ３、ａｎｔｉ－４１ＢＢ、ａｎｔｉ－ＣＤ２２６、ａｎｔｉ－ＣＤ４０、ａｎｔｉ－ＣＤ７０、ａｎｔｉ－ＩＣＯＳ、ａｎｔｉ－ＣＤ４０Ｌ、ａｎｔｉ－ＢＴＬＡ、ａｎｔｉ－ＴＣＲ、ａｎｔｉ－ＴＩＧＩＴなどや、現在免疫抗がん剤として使われている物質であればこれに制限されない。また、前記抗がん剤は好ましくは、ドキソルビシン、シスプラチン、ゲムシタビン、オキサリプラチン、５－ＦＵ、セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、ネシツムマブ、がん抗原、抗がんウイルスなどや現在抗がん剤として使われている物質であればこれに制限されない。前記がん抗原はがん腫に特異的ながんワクチン（ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅ）であって、好ましくは膀胱がん特異的ながん抗原としてＮＹ－ＥＳＯ－１、乳ガン特異的ながん抗原としてＨＥＲ２、大腸がん特異的ながん抗原としてＣＥＡ、肺がん特異的ながん抗原としてＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２等であり得るが、がんワクチンとして知られているがん抗原の種類であればこれに制限されない。抗がんウイルスの一例としてイムリジック、Ｐｅｘａ－Ｖｅｃなどがあるが、知られている抗がんウイルスであればこれに制限されない。前記抗がん剤を追加で含むものは好ましくは、併用投与であるか、本発明の単クローン抗体に結合された形態であってもよく、抗がん剤の伝達体内に共に含まれている形態であってもよい。
【0011】
本発明のさらに他の具体例において、前記薬学的組成物はがんまたはがん幹細胞の増殖、生存、転移、再発、抗がん剤耐性などを抑制することを特徴とするが、本発明の薬学的組成物によって発生する効果であればこれに制限されない。
【0012】
また、本発明は前記抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を有効性分として含む免疫抗がん剤を提供する。
【0013】
また、本発明は前記抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を有効性分として含む抗がん治療法の補助剤を提供する。
【0014】
本発明の一具体例において、前記補助剤は免疫細胞の免疫機能を活性化させて抗がん治療効果を向上させることができる。
【0015】
本発明の他の具体例において、前記抗がん治療法は放射線治療法、抗がん剤治療法、免疫抗がん剤治療法などであり得る。
【0016】
また、本発明は前記抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を有効性分として含む組成物を個体に投与する段階を含むがん治療方法を提供する。
【0017】
また、本発明は前記抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を有効性分として含む組成物のがん予防または治療用途を提供する。
【0018】
また、本発明は前記抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のがん治療に利用される薬剤を生産するための用途を提供する。
【発明の効果】
【0019】
本発明に係る抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体は多様ながんの表面で発現するＣＤ３００ｃに特異的に高い結合力を有して結合されることによって、Ｔ細胞を活性化させると同時にＭ１マクロファージへの分化を促進させるため、がん細胞の増殖を効果的に抑制することによって多様ながんの免疫治療剤として効果的に使われ得る。また、本発明に係る抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体は、既存の免疫抗がん剤との併用投与を通じてその治療効果をさらに増加させ得るだけでなく、種間交差反応性を有しているので、多様な哺乳類に幅広く適用することができる。そして、細胞死滅に抵抗する能力を示す抵抗性がん細胞に本発明の抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を処理する場合、がん細胞の抵抗性を顕著に弱化させてがん再発防止にも優秀な効能を示すであろうと期待される。また、一般的にがん細胞はｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅであるＩＬ－２の生成を阻害することによって免疫系を回避するが、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体はこのようながん細胞によって遮断されたＩＬ－２の生産量を回復させることによって、活性化した免疫系を通じてがん細胞死滅を誘導させることが確認されて、より根本的な免疫抗がん剤として活用され得るものと判断される。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】本発明の抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体および／またはＣＤ３００ｃ ｓｉＲＮＡの抗がん効果を示すメカニズムを簡略に示した概略図である。
【図2】本発明の抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体が各Ｍｏｎｏｃｙｔｅ、Ｔ ｃｅｌｌ、がん細胞に作用するメカニズムを簡略に示した概略図である。
【図3】本発明の一実施例に係る抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のｎｏｎ－ｒｅｄｕｃｉｎｇ条件でのＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示した図面である。
【図4】本発明の一実施例に係る抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のｒｅｄｕｃｉｎｇ条件でのＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示した図面である。
【図5】本発明の一実施例に係る抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のＣＤ３００ｃ抗原への結合力を確認した結果を示した図面である。
【図6】本発明の一実施例に係る抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のＴ細胞活性化能をＥＬＩＳＡを利用して確認した結果を示した図面である。
【図7】本発明の一実施例に係る抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のＭ１マクロファージへの分化能をＥＬＩＳＡを利用して確認した結果を示した図面である。
【図8】本発明の一実施例に係る抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のＭ１マクロファージへの分化能をＥＬＩＳＡを利用して確認した結果を示した図面である。
【図9】本発明の一実施例に係る抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体の濃度別Ｍ１マクロファージへの分化能をＥＬＩＳＡを利用して確認した結果を示した図面である。
【図10】本発明の一実施例に係る抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体の濃度別Ｍ１マクロファージへの分化能をＥＬＩＳＡを利用して確認した結果を示した図面である。
【図11】本発明の一実施例に係る抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のＭ１マクロファージへの分化能を細胞形態で確認した結果を示した図面である。
【図12】本発明の一実施例に係るＣＬ７抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のＭ１マクロファージへの分化能をＥＬＩＳＡを利用して確認した結果を示した図面である。
【図13】本発明の一実施例に係る抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と免疫抗がん剤のＭ１マクロファージ分化能をＥＬＩＳＡを利用して比較した結果を示した図面である。
【図14】本発明の一実施例に係るＣＬ７抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と免疫抗がん剤のＭ１マクロファージへの分化能をＥＬＩＳＡを利用して比較した結果を示した図面である。
【図15】本発明の一実施例に係るＣＬ７抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と免疫抗がん剤のＭ１マクロファージへの分化能をＥＬＩＳＡを利用して比較した結果を示した図面である。
【図16】本発明の一実施例に係るＣＬ７抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と免疫抗がん剤のＭ１マクロファージへの分化能をＥＬＩＳＡを利用して比較した結果を示した図面である。
【図17】本発明の一実施例に係る抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と免疫抗がん剤のＭ０マクロファージからＭ１マクロファージへの分化能をＥＬＩＳＡを利用して比較した結果を示した図面である。
【図18】本発明の一実施例に係る抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と免疫抗がん剤のＭ１マクロファージへの分化能をＥＬＩＳＡを利用して比較した結果を示した図面である。
【図19】本発明の一実施例に係る抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のＭ２マクロファージからＭ１マクロファージへの再分化能をＥＬＩＳＡを利用して確認した結果を示した図面である。
【図20】本発明の一実施例に係る抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のＭ２マクロファージからＭ１マクロファージへの再分化能をＥＬＩＳＡを利用して確認した結果を示した図面である。
【図21】本発明の一実施例に係る抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のＭ２マクロファージからＭ１マクロファージへの再分化能をＥＬＩＳＡを利用して確認した結果を示した図面である。
【図22】本発明の一実施例に係る抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のＭ０、Ｍ１、およびＭ２マクロファージからＭ１マクロファージへの再分化能をＥＬＩＳＡを利用して確認した結果を示した図面である。
【図23】本発明の一実施例に係る抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と抗－ＰＤ－Ｌ１免疫抗がん剤との併用投与効果をＭ１マクロファージ分化能で確認した結果を示した図面である。
【図24】本発明の一実施例に係る抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と免疫抗がん剤との併用投与効果をＭ１マクロファージ分化能で確認した結果を示した図面である。
【図25】本発明の一実施例に係る抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体の０％ＦＢＳの条件でのがん細胞成長抑制効果を確認した結果を示した図面である。
【図26】本発明の一実施例に係る抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体の０．１％ＦＢＳの条件でのがん細胞成長抑制効果を確認した結果を示した図面である。
【図27】本発明の一実施例に係る抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と免疫抗がん剤のがん細胞（肺がん）成長抑制効果を比較した結果を示した図面である。
【図28】本発明の一実施例に係る抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と免疫抗がん剤のがん細胞（乳ガン）成長抑制効果を比較した結果を示した図面である。
【図29】本発明の一実施例に係る抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体の濃度別がん細胞成長抑制効果を確認した結果を示した図面である。
【図30】本発明の一実施例に係る抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と免疫抗がん剤との併用投与によるがん細胞成長抑制効果を確認した結果を示した図面である。
【図31】本発明の一実施例に係る抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と免疫抗がん剤との併用投与によるがん細胞成長抑制効果を確認した結果を示した図面である。
【図32】本発明の一実施例に係る抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と免疫抗がん剤との併用投与による作用メカニズムを確認した結果を示した図面である。
【図33】本発明の一実施例に係る抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体の結合特異性を確認した結果を示した図面である。
【図34】本発明の一実施例に係る抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のマウスでの交差反応性を確認した結果を示した図面である。
【図35】本発明の一実施例に係る抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のマウスでの抗がん効果（大腸がん）を確認した結果を示した図面である。
【図36】本発明の一実施例に係る抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体がｉｎ ｖｉｖｏでがん成長に及ぼす影響を確認した実験方法を簡略に示した図面である。
【図37】本発明の一実施例に係る抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のｉｎ ｖｉｖｏでがん成長抑制効果を確認した結果を示した図面である。
【図38】本発明の一実施例に係る抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍微細環境での腫瘍浸潤リンパ球の増加に及ぼす影響を確認した結果を示した図面である。Ｓｃａｌｅ ｂａｒは５０ｕｍを示す。
【図39】本発明の一実施例に係る抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のｉｎ ｖｉｖｏでＭ１マクロファージ増加に及ぼす影響を確認する結果を示した図面である。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本発明の抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体は、ＣＤ３００ｃ蛋白質に特異的に高い結合力を有して結合してＣＤ３００ｃのメカニズムを効果的に抑制することによってＴ細胞を活性化させ、Ｍ１マクロファージへの分化を促進させることによってがん細胞の成長、がんの発達、がんの転移などを効果的に抑制できるため、ＣＤ３００ｃ抗原を表面に発現している多様ながんの治療に効果的に使われ得る。
【0022】
本明細書において、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、免疫学的に特定の抗原と反応性を有する免疫グロブリン分子を意味し、多クローン抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、単クローン抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）およびこの機能的な断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）をすべて含む。また、前記用語はキメラ性抗体（例えば、ヒト化ミュリン抗体）および異種結合抗体（例えば、両特異性抗体）のような遺伝工学によって生産された形態を含むことができる。このうち単クローン抗体は単一抗原性部位（エピトープ、ｅｐｉｔｏｐｅ）に対して単一結合特異性および親和度を示す抗体であって、異なるエピトープに対して特異性を示す抗体を含む多クローン抗体とは異なり、単クローン抗体は抗原上の単一エピトープに対してのみ結合特異性および親和度を示すので、治療剤としての品質管理が容易である。特に、本発明の抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体は、ＣＤ３００ｃを発現するがん細胞に特異的に結合してそれ自体としても抗がん活性を示すだけでなく、免疫細胞を刺激することによってがん細胞依存性抗がん活性を最大化させることができる。前記抗体は構成のうち重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）および／または軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）の可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）を含み、前記可変領域は１次構造として抗体分子の抗原結合部位を形成する部分を含み、本発明の抗体は前記可変領域を含む一部の断片で構成され得、好ましくは前記可変領域はＣＤ３００ｃに対する可溶性受容体で代替され得るが、本発明の抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と同一の効果を示すのであればこれに制限されない。
【0023】
本明細書において、「免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）」とは、抗体と構造的特性が同一であり、抗原特異性がない抗体類似分子と抗体をすべて含む概念である。
【0024】
本明細書において、「単鎖可変領域フラグメント（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）」とは、抗体の軽鎖および重鎖の可変領域を１５個内外のアミノ酸が連結されたペプチド配列からなるリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）に連結した蛋白質であって、軽鎖可変領域－リンカー－重鎖可変領域、または重鎖可変領域－リンカー－軽鎖可変領域の順のいずれも可能であり、元の抗体と同一あるいは類似する抗原特異性を有する。連結部位は主にグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）とセリン（ｓｅｒｉｎｅ）からなる親水性の柔軟なペプチド鎖であって、「（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）３」の１５個のアミノ酸配列またはこれと類似する配列が主に使用される。
【0025】
本明細書において、「免疫抗がん剤」とは、人体が有している免疫細胞の免疫機能を活性化させてがん細胞と戦わせるがん治療方法を総称し、その一例としてａｎｔｉ－ＰＤ－１、ａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１、ａｎｔｉ－ＣＴＬＡ－４、ａｎｔｉ－ＫＩＲ、ａｎｔｉ－ＬＡＧ３、ａｎｔｉ－ＣＤ１３７、ａｎｔｉ－ＯＸ４０、ａｎｔｉ－ＣＤ２７６、ａｎｔｉ－ＣＤ２７、ａｎｔｉ－ＧＩＴＲ、ａｎｔｉ－ＴＩＭ３、ａｎｔｉ－４１ＢＢ、ａｎｔｉ－ＣＤ２２６、ａｎｔｉ－ＣＤ４０、ａｎｔｉ－ＣＤ７０、ａｎｔｉ－ＩＣＯＳ、ａｎｔｉ－ＣＤ４０Ｌ、ａｎｔｉ－ＢＴＬＡ、ａｎｔｉ－ＴＣＲ、ａｎｔｉ－ＴＩＧＩＴなどがあるが、これに制限されない。
【0026】
本明細書において、「補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）」とは、主薬物、すなわち、抗がん剤の薬効を補助して治療効果を改善および／または向上させるか、主薬物に対する耐性を抑制して治療効果を改善および／または向上させるか、主薬物の有害な作用を防ぐか緩和する目的で使われる補助薬物を意味し、本発明の補助剤は抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を有効性分として含んでいるのであれば制限がない。
【0027】
本明細書において、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」とは、本発明に係る薬学的組成物の投与によってがんなどの疾患を抑制させたり発病を遅延させるすべての行為を意味する。
【0028】
本明細書において、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、本発明に係る薬学的組成物の投与によってがんなどの症状が好転するか有利に変更されるすべての行為を意味する。
【0029】
本明細書において、「個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」とは、本発明の薬学的組成物が投与され得る対象を指し、その対象には制限がない。
【0030】
本明細書において、「薬学的組成物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」とは、カプセル、錠剤、顆粒、注射剤、軟膏剤、粉末または飲み物の形態であることを特徴とすることができ、前記薬学的組成物はヒトを対象にすることを特徴とすることができる。前記薬学的組成物はこれらに限定されるものではなく、それぞれ通常の方法により散剤、顆粒剤、カプセル、錠剤、水性懸濁液などの経口型剤形、外用剤、座剤および滅菌注射溶液の形態で剤形化して使われ得る。本発明の薬学的組成物は薬剤的に許容可能な坦体を含むことができる。薬剤学的に許容される坦体は、経口投与時には結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを使用でき、注射剤の場合には緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などを混合して使用でき、局所投与用の場合には基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを使うことができる。本発明の薬学的組成物の剤形は前述したような薬剤学的に許容される坦体と混合して多様に製造され得る。例えば、経口投与時には錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル（ｅｌｉｘｉｒ）、サスペンション、シロップ、ウェハーなどの形態で製造することができ、注射剤の場合には単位投薬アンプルまたは多数回投薬の形態で製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル、徐放性製剤などに剤形することができる。
【0031】
一方、製剤化に適合な坦体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、非晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレートまたは鉱物油などが使われ得る。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などをさらに含むことができる。
【0032】
本発明に係る薬学的組成物の投与経路はこれらに限定されるものではなく、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髓内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下または直腸が含まれる。経口または非経口投与が好ましい。本願で使われた用語「非経口」とは、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、硬膜内、病巣内および頭蓋骨内注射または注入技術を含む。本発明の薬学的組成物はまた、直腸投与のための座剤の形態で投与され得る。
【0033】
本発明の薬学的組成物は使われた特定化合物の活性、年齢、体重、一般的な健常、性別、規定食 、投与時間、投与経路、排出率、薬物配合および予防または治療される特定疾患の重症度を含んだ多様な要因により多様に変わり得、前記薬学的組成物の投与量は患者の状態、体重、病気の程度、薬物の形態、投与経路および期間により異なるが、当業者によって適切に選択され得、１日０．０００１～５００ｍｇ／ｋｇまたは０．００１～５００ｍｇ／ｋｇで投与することができる。投与は一日に一度投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。前記投与量はいかなる場合であれ、本発明の範囲を限定するものではない。本発明に係る薬学的組成物は丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤に剤形化され得る。
【0034】
以下、本発明の理解を助けるために下記の実施例を提示する。しかし、下記の実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記の実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
【0035】
実施例
実施例１：抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体の選別
１．１．抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のライブラリの製作
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を選別するために、ラムダファージライブラリ、カッパファージライブラリ、ＶＨ３ＶＬ１ファージライブラリ、およびＯＰＡＬＴＬファージライブラリを利用してバイオパニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）を実施した。より詳しくは、免疫試験管（ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ）に５μｇ／ｍＬ濃度のＣＤ３００ｃ抗原を添加し、１時間の間反応させて試験管の表面に抗原を吸着させた。そして、３％のスキムミルク（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）を添加して非特異的反応を抑制させた後、さらに３％のスキムミルクに分散されている１０１２ＰＦＵの抗体ファージライブラリをそれぞれの免疫試験管に添加して抗原と結合させた。そして、ＴＢＳＴ（ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ－Ｔｗｅｅｎ２０）溶液を利用して３回洗浄して非特異的に結合されている把持を除去した後、ＣＤ３００ｃ抗原特異的に結合されている単鎖可変領域フラグメント（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）ファージ抗体を１００ｍＭのトリエチルアミン溶液を利用して溶出させた。溶出されたファージは１．０ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．８）を利用して中和させた後、大腸菌ＥＲ２５３７に処理して３７℃で１時間の間感染させ、感染させた大腸菌はカルベニシリンが含まれているＬＢ寒天培地に塗布して３７℃で１６時間の間培養した。そして、形成された大腸菌コロニーを３ｍＬのＳＢ（ｓｕｐｅｒ ｂｒｏｔｈ）－カルベニシリン培養液を利用して懸濁させ、一部は１５％グリセロールを添加して－８０℃で使用前まで保管したし、残りはＳＢ－カルベニシリン－２％葡萄糖溶液に再接種して３７℃で培養した。そして、獲得された培養液を遠心分離してファージ粒子が含まれている上層液を利用して再びバイオパニングを３回繰り返すことによって抗原特異的な抗体を確保および濃縮した。
実施例１：抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体の選別
１．１．抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のライブラリの製作
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を選別するために、ラムダファージライブラリ、カッパファージライブラリ、ＶＨ３ＶＬ１ファージライブラリ、およびＯＰＡＬＴＬファージライブラリを利用してバイオパニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）を実施した。より詳しくは、免疫試験管（ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ）に５μｇ／ｍＬ濃度のＣＤ３００ｃ抗原を添加し、１時間の間反応させて試験管の表面に抗原を吸着させた。そして、３％のスキムミルク（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）を添加して非特異的反応を抑制させた後、さらに３％のスキムミルクに分散されている１０１２ＰＦＵの抗体ファージライブラリをそれぞれの免疫試験管に添加して抗原と結合させた。そして、ＴＢＳＴ（ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ－Ｔｗｅｅｎ２０）溶液を利用して３回洗浄して非特異的に結合されている把持を除去した後、ＣＤ３００ｃ抗原特異的に結合されている単鎖可変領域フラグメント（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）ファージ抗体を１００ｍＭのトリエチルアミン溶液を利用して溶出させた。溶出されたファージは１．０ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．８）を利用して中和させた後、大腸菌ＥＲ２５３７に処理して３７℃で１時間の間感染させ、感染させた大腸菌はカルベニシリンが含まれているＬＢ寒天培地に塗布して３７℃で１６時間の間培養した。そして、形成された大腸菌コロニーを３ｍＬのＳＢ（ｓｕｐｅｒ ｂｒｏｔｈ）－カルベニシリン培養液を利用して懸濁させ、一部は１５％グリセロールを添加して－８０℃で使用前まで保管したし、残りはＳＢ－カルベニシリン－２％葡萄糖溶液に再接種して３７℃で培養した。そして、獲得された培養液を遠心分離してファージ粒子が含まれている上層液を利用して再びバイオパニングを３回繰り返すことによって抗原特異的な抗体を確保および濃縮した。
【0036】
バイオパニングを３回繰り返した後、抗体遺伝子を含んでいる大腸菌をカルベニシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布して３７℃で１６時間の間培養し、形成された大腸菌コロニーを再びＳＢ－カルベニシリン－２％葡萄糖溶液に再接種して３７℃で吸光度（ＯＤ６００ｎｍ）が０．５になるまで培養した後、ＩＰＴＧを添加して３０℃で１６時間の間追加培養した。その後、ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎを実施したし、前記結果を通じてＣＤ３００ｃ抗原に特異的に結合する抗体のライブラリプール（ｌｉｂｒａｒｙ ｐｏｏｌ）を一次的に確保した。
【0037】
１．２．抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体の選別
ＣＤ３００ｃ抗原に高い結合力を有し特異的に結合する抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を選別するために、実施例１．１と同じ方法で確保されたライブラリプールを利用してＥＬＩＳＡを実施した。より詳しくは、コーティング緩衝溶液（ｃｏａｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ；０．１ Ｍのｓｏｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ、ｐＨ９．０）にＣＤ３００ｃ抗原とＣＤ３００ａ抗原をそれぞれウェル当り５μｇ／ｍＬの濃度となるようにＥＬＩＳＡプレートに分注した後、室温で３時間の間反応させて抗原をプレートに結合させた。そして、ＰＢＳＴ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ－Ｔｗｅｅｎ２０）を利用して３回洗浄して結合されていない抗原をきれいに除去した後、それぞれのウェルに２％ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）が添加されているＰＢＳＴを３５０μＬ添加して室温で１時間の間反応させ、ＰＢＳＴを利用して再び洗浄した。そして、実施例１．１と同じ方法で確保されたｓｃＦｖを含んでいるｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｅｘｔｒａｃｔを２５μｇずつ添加し、１時間の間室温で反応させて抗原と結合させた。１時間後にＰＢＳＴを利用して３回洗浄して結合されていないｓｃＦｖを除去した後、４μｇ／ｍＬの検出用抗体を添加して再び室温で１時間の間反応させた。その後、ＰＢＳＴを利用して結合されていない検出用抗体を除去した後、ＨＲＰが結合されているａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧを添加して室温で１時間の間反応させ、再びＰＢＳＴを利用して結合されていない抗体を除去した。そして、ＴＭＢ溶液を添加して１０分の間反応させて発色させた後、２Ｎの硫酸溶液を添加して発色反応を終了させ、４５０ｎｍで吸光度を測定してＣＤ３００ｃ抗原に特異的に結合する抗体を確認した。
ＣＤ３００ｃ抗原に高い結合力を有し特異的に結合する抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を選別するために、実施例１．１と同じ方法で確保されたライブラリプールを利用してＥＬＩＳＡを実施した。より詳しくは、コーティング緩衝溶液（ｃｏａｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ；０．１ Ｍのｓｏｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ、ｐＨ９．０）にＣＤ３００ｃ抗原とＣＤ３００ａ抗原をそれぞれウェル当り５μｇ／ｍＬの濃度となるようにＥＬＩＳＡプレートに分注した後、室温で３時間の間反応させて抗原をプレートに結合させた。そして、ＰＢＳＴ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ－Ｔｗｅｅｎ２０）を利用して３回洗浄して結合されていない抗原をきれいに除去した後、それぞれのウェルに２％ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）が添加されているＰＢＳＴを３５０μＬ添加して室温で１時間の間反応させ、ＰＢＳＴを利用して再び洗浄した。そして、実施例１．１と同じ方法で確保されたｓｃＦｖを含んでいるｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｅｘｔｒａｃｔを２５μｇずつ添加し、１時間の間室温で反応させて抗原と結合させた。１時間後にＰＢＳＴを利用して３回洗浄して結合されていないｓｃＦｖを除去した後、４μｇ／ｍＬの検出用抗体を添加して再び室温で１時間の間反応させた。その後、ＰＢＳＴを利用して結合されていない検出用抗体を除去した後、ＨＲＰが結合されているａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧを添加して室温で１時間の間反応させ、再びＰＢＳＴを利用して結合されていない抗体を除去した。そして、ＴＭＢ溶液を添加して１０分の間反応させて発色させた後、２Ｎの硫酸溶液を添加して発色反応を終了させ、４５０ｎｍで吸光度を測定してＣＤ３００ｃ抗原に特異的に結合する抗体を確認した。
【0038】
１．３．抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体配列の確認
実施例１．２と同じ方法を利用して選別された抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体の塩基配列を確認した。より詳しくは、選別された抗体クローンをｐｌａｓｍｉｄ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔを利用してｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡを抽出した後、ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを実施してＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）配列を分析した。その結果、互いに異なるアミノ酸配列を有している２５種の抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を確保した。
実施例１．２と同じ方法を利用して選別された抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体の塩基配列を確認した。より詳しくは、選別された抗体クローンをｐｌａｓｍｉｄ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔを利用してｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡを抽出した後、ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを実施してＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）配列を分析した。その結果、互いに異なるアミノ酸配列を有している２５種の抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を確保した。
【0039】
ラムダファージライブラリを利用して選別された抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体は３種類であって、配列番号３６のＣＤＲ配列を含むＳＬ１８（ＤＮＡ配列は配列番号３５）、配列番号８のＣＤＲ配列を含むＣＬ４（ＤＮＡ配列は配列番号７）、および配列番号１０のＣＤＲ配列を含むＣＬ５（ＤＮＡ配列は配列番号９）であった。
【0040】
カッパファージライブラリを利用して選別された抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体は１０種類であって、配列番号２のＣＤＲ配列を含むＣＫ１（ＤＮＡ配列は配列番号１）、配列番号４のＣＤＲ配列を含むＣＫ２（ＤＮＡ配列は配列番号３）、配列番号６のＣＤＲ配列を含むＣＫ３（ＤＮＡ配列は配列番号５）、配列番号２２のＣＤＲ配列を含むＳＫ１１（ＤＮＡ配列は配列番号２１）、配列番号２４のＣＤＲ配列を含むＳＫ１２（ＤＮＡ配列は配列番号２３）、配列番号２６のＣＤＲ配列を含むＳＫ１３（ＤＮＡ配列は配列番号２５）、配列番号２８のＣＤＲ配列を含むＳＫ１４（ＤＮＡ配列は配列番号２７）、配列番号３０のＣＤＲ配列を含むＳＫ１５（ＤＮＡ配列は配列番号２９）、配列番号３２のＣＤＲ配列を含むＳＫ１６（ＤＮＡ配列は配列番号３１）、および配列番号３４のＣＤＲ配列を含むＳＫ１７（ＤＮＡ配列は配列番号３３）であった。
【0041】
ＶＨ３ＶＬ１ファージライブラリを利用して選別された抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体は１０種類であって、配列番号３８のＣＤＲ配列を含むＣＢ３０１＿Ｈ３Ｌ１＿Ａ１０（ＤＮＡ配列は配列番号３７）、配列番号４０のＣＤＲ配列を含むＣＢ３０１＿Ｈ３Ｌ１＿Ａ１２（ＤＮＡ配列は配列番号３９）、配列番号１２のＣＤＲ配列を含むＣＬ６（ＤＮＡ配列は配列番号１１）、配列番号４２のＣＤＲ配列を含むＣＢ３０１＿Ｈ３Ｌ１＿Ｅ６（ＤＮＡ配列は配列番号４１）、配列番号１４のＣＤＲ配列を含むＣＬ７（ＤＮＡ配列は配列番号１３）、配列番号４４のＣＤＲ配列を含むＣＢ３０１＿Ｈ３Ｌ１＿Ｆ４（ＤＮＡ配列は配列番号４３）、配列番号１６のＣＤＲ配列を含むＣＬ８（ＤＮＡ配列は配列番号１５）、配列番号４６のＣＤＲ配列を含むＣＢ３０１＿Ｈ３Ｌ１＿Ｇ１１（ＤＮＡ配列は配列番号４５）、配列番号１８のＣＤＲ配列を含むＣＬ９（ＤＮＡ配列は配列番号１７）、および配列番号２０のＣＤＲ配列を含むＣＬ１０（ＤＮＡ配列は配列番号１９）であった。
【0042】
ＯＰＡＬＴＬファージライブラリを利用して選別された抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体は２種類であって、配列番号４８のＣＤＲ配列を含むＣＢ３０１＿ＯＰＡＬＴＬ＿Ｂ５（ＤＮＡ配列は配列番号４７）および配列番号５０のＣＤＲ配列を含むＣＢ３０１＿ＯＰＡＬＴＬ＿Ｅ６（ＤＮＡ配列は配列番号４９）であった。
【0043】
前記結果を通じて、ＣＤ３００ｃ抗原に高い結合力を有し特異的に結合するがんの予防または治療に使用できる２５種の抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を確認することができた。
【0044】
１．４．抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体の製作および精製
実施例１．３を通じて確認した抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体の塩基配列を利用して、抗体を発現できる重鎖と軽鎖を分離した発現用ベクターを製作した。より詳しくは、分析したＣＤＲ配列を利用してｐＣＩＷ３．３ベクターにそれぞれ重鎖と軽鎖を発現できるように遺伝子を挿入して製作した。製作した重鎖と軽鎖発現用ベクターをＰＥＩ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）と１：１の質量割合で混ぜて２９３Ｔ細胞にトランスフェクションして抗体の発現を誘導した後、８日目に培養液を遠心分離して細胞を除去して培養液を獲得した。獲得した培養液は濾過過程を経た後、０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４および０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．０）が混合されている溶液を利用して再懸濁させた。そして、再懸濁させた溶液はｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｂｅａｄ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を利用したａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ方法を通じて精製したし、最終的にＥｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を利用して湧出させた。
実施例１．３を通じて確認した抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体の塩基配列を利用して、抗体を発現できる重鎖と軽鎖を分離した発現用ベクターを製作した。より詳しくは、分析したＣＤＲ配列を利用してｐＣＩＷ３．３ベクターにそれぞれ重鎖と軽鎖を発現できるように遺伝子を挿入して製作した。製作した重鎖と軽鎖発現用ベクターをＰＥＩ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）と１：１の質量割合で混ぜて２９３Ｔ細胞にトランスフェクションして抗体の発現を誘導した後、８日目に培養液を遠心分離して細胞を除去して培養液を獲得した。獲得した培養液は濾過過程を経た後、０．１Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４および０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．０）が混合されている溶液を利用して再懸濁させた。そして、再懸濁させた溶液はｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｂｅａｄ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を利用したａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ方法を通じて精製したし、最終的にＥｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を利用して湧出させた。
【0045】
製作された抗体を確認するために、精製された抗体５μｇにそれぞれＲｅｄｕｃｉｎｇ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒとＮｏｎ－ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒに添加した後、ｐｒｅ－ｍａｄｅ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用して電気泳動を実施したし、その後、クマジブルーを利用して蛋白質を染色した。各Ｎｏｎ－ｒｅｄｕｃｉｎｇ条件の結果は図３に、Ｒｅｄｕｃｉｎｇ条件の結果は図４に示した。
【0046】
【0047】
１．５．抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体の抗原結合力（Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ）の確認
実施例１．４と同じ方法で製作された抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体の中で、ＣＤ３００ｃ抗原にさらに優秀な結合力を有し特異的に結合する単クローン抗体を選別するためにＢｉｎｄｉｎｇ ＥＬＩＳＡを実施した。より詳しくは、コーティング緩衝溶液（ｃｏａｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍのｓｏｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ、ｐＨ９．０）にＣＤ３００ｃ抗原またはＣＤ３００ａ抗原をそれぞれウェル当り８μｇ／ｍＬの濃度となるようにＥＬＩＳＡプレートに分注した後、室温で３時間の間反応させて抗原をプレートに結合させた。そして、ＰＢＳＴ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ－Ｔｗｅｅｎ２０）を利用して３回洗浄して結合されていない抗原をきれいに除去した後、それぞれのウェルに５％ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）を添加されているＰＢＳＴを３００μＬ添加して室温で１時間の間反応させ、ＰＢＳＴを利用して再び洗浄した。そして、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を４倍段階希釈して入れて１時間の間室温で反応させて抗原と結合させた。１時間後にＰＢＳＴを利用して３回洗浄して結合されていない抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を除去した後、４μｇ／ｍＬの検出用抗体（ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－Ｆｃ ＩｇＧ）を添加して再び室温で１時間の間反応させた。その後、ＰＢＳＴを利用して結合されていない検出用抗体を除去した後にＴＭＢ溶液を添加して１０分の間反応させて発色させた後、２Ｎの硫酸溶液を添加して発色反応を終了させ、４５０ｎｍで吸光度を測定してＣＤ３００ｃ抗原に特異的に結合する抗体を確認した。その結果は表１および図５に示した。
実施例１．４と同じ方法で製作された抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体の中で、ＣＤ３００ｃ抗原にさらに優秀な結合力を有し特異的に結合する単クローン抗体を選別するためにＢｉｎｄｉｎｇ ＥＬＩＳＡを実施した。より詳しくは、コーティング緩衝溶液（ｃｏａｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ：０．１Ｍのｓｏｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ、ｐＨ９．０）にＣＤ３００ｃ抗原またはＣＤ３００ａ抗原をそれぞれウェル当り８μｇ／ｍＬの濃度となるようにＥＬＩＳＡプレートに分注した後、室温で３時間の間反応させて抗原をプレートに結合させた。そして、ＰＢＳＴ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ－Ｔｗｅｅｎ２０）を利用して３回洗浄して結合されていない抗原をきれいに除去した後、それぞれのウェルに５％ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）を添加されているＰＢＳＴを３００μＬ添加して室温で１時間の間反応させ、ＰＢＳＴを利用して再び洗浄した。そして、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を４倍段階希釈して入れて１時間の間室温で反応させて抗原と結合させた。１時間後にＰＢＳＴを利用して３回洗浄して結合されていない抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を除去した後、４μｇ／ｍＬの検出用抗体（ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－Ｆｃ ＩｇＧ）を添加して再び室温で１時間の間反応させた。その後、ＰＢＳＴを利用して結合されていない検出用抗体を除去した後にＴＭＢ溶液を添加して１０分の間反応させて発色させた後、２Ｎの硫酸溶液を添加して発色反応を終了させ、４５０ｎｍで吸光度を測定してＣＤ３００ｃ抗原に特異的に結合する抗体を確認した。その結果は表１および図５に示した。
【0048】
【表1】
【0049】
表１に示した通り、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のＥＣ５０（Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇ ｔｈａｔ ｃａｕｓｅｓ ５０％ｏｆ ｔｈｅ ｍａｘｉｕｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を測定した結果、４個のクローン（ＣＫ３、ＣＬ８、ＳＫ１５、ＳＫ１６）を除いて残りの１４個のクローンはすべて０．２νｇ／ｍＬ以下であって、結合親和力（Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ）が高いことを確認した。
【0050】
図５に示した通り、Ｂｉｎｄｉｎｇ ＥＬＩＳＡの結果によるｓｉｇｍｏｉｄ ｃｕｒｖｅにおいても、本発明の抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体が強い結合力でＣＤ３００ｃ抗原に結合することを確認することができた。
【0051】
実施例２：抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のＴ細胞での抗がん効果の確認
実施例１．５の方法で選別された抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体がＴ細胞を活性化させることによって抗がん効果を示すかを確認するために、ＩＬ－２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２）の生産量を確認した。ＩＬ－２はＴ細胞の成長、増殖および分化を助ける免疫因子であって、ＩＬ－２の生成量が増加するのはＴ細胞の分化、増殖、および成長が増加するように誘導する刺激が増加することによってＴ細胞を活性化させるということを意味する。より詳しくは、それぞれ２μｇ／ｗｅｌｌの濃度となるように抗－ＣＤ３単クローン抗体と抗－ＣＤ２８単クローン抗体を９６－ウェルプレートに添加して２４時間の間固定させた後、１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞（ヒトＴリンパ球細胞株）と１０μｇ／ｗｅｌｌの抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を共に処理した。そして、ＩＬ－２の生成量をＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ＩＬ－２ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ｋｉｔ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を利用して測定した後、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を処理していない対照群と比較した。その結果は図６に示した。
実施例１．５の方法で選別された抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体がＴ細胞を活性化させることによって抗がん効果を示すかを確認するために、ＩＬ－２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２）の生産量を確認した。ＩＬ－２はＴ細胞の成長、増殖および分化を助ける免疫因子であって、ＩＬ－２の生成量が増加するのはＴ細胞の分化、増殖、および成長が増加するように誘導する刺激が増加することによってＴ細胞を活性化させるということを意味する。より詳しくは、それぞれ２μｇ／ｗｅｌｌの濃度となるように抗－ＣＤ３単クローン抗体と抗－ＣＤ２８単クローン抗体を９６－ウェルプレートに添加して２４時間の間固定させた後、１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞（ヒトＴリンパ球細胞株）と１０μｇ／ｗｅｌｌの抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を共に処理した。そして、ＩＬ－２の生成量をＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ＩＬ－２ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ｋｉｔ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を利用して測定した後、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を処理していない対照群と比較した。その結果は図６に示した。
【0052】
図６に示した通り、抗－ＣＤ３単クローン抗体、抗－ＣＤ２８単クローン抗体を処理して活性化させたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞に抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を処理した場合にＩＬ－２の生成量が増加したことを確認したし、前記結果を通じて、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体がＴ細胞を活性化させることができるということと、これを通じて、抗がん免疫作用を誘発してがん組織の成長を抑制できることを確認することができた。
【0053】
実施例３：抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のマクロファージ分化能による抗がん効果確認
３．１．抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のＭ１マクロファージ分化能の確認
実施例１．５の方法で選別された抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体が単球細胞をＭ１マクロファージへの分化に誘導することを確認するために、９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅで１．５ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのＴＨＰ－１（ヒト単球細胞株）を分注し、１０μｇ／ｍＬの抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体および／または１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを処理した。そして、４８時間の間反応させた後、Ｍ１マクロファージの分化マーカーであるＴＮＦ－α（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－α）の生成量をＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｈｕｍａｎ ＴＮＦ－αＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ ｋｉｔ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を利用して測定した。その結果は図７および図８に示した。
３．１．抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のＭ１マクロファージ分化能の確認
実施例１．５の方法で選別された抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体が単球細胞をＭ１マクロファージへの分化に誘導することを確認するために、９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅで１．５ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのＴＨＰ－１（ヒト単球細胞株）を分注し、１０μｇ／ｍＬの抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体および／または１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳを処理した。そして、４８時間の間反応させた後、Ｍ１マクロファージの分化マーカーであるＴＮＦ－α（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－α）の生成量をＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｈｕｍａｎ ＴＮＦ－αＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ ｋｉｔ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を利用して測定した。その結果は図７および図８に示した。
【0054】
図７に示した通り、ＬＰＳを単独で処理した対照群（Ｃｏｎ）と比較して、ＣＬ４、ＣＬ７、ＣＬ１０、およびＳＬ１８抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体が約２倍以上ＴＮＦ－αの生成量が増加したことを確認した。
【0055】
また、図８に示した通り、ＬＰＳを単独で処理した対照群（Ｃｏｎ）と比較してＬＰＳの処理なしに抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を単独で処理した実験群において、いずれも対照群と比較してＴＮＦ－αの生成量が増加したことを確認した。
【0056】
３．２．抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体の濃度別Ｍ１マクロファージ分化能の確認
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体がＭ１マクロファージへの分化を誘導するのが濃度により増加することを確認するために、実施例３．１と同じ方法でＴＮＦ－αの生成量を確認した。抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体は１０、１、および０．１μｇ／ｍＬの濃度で処理した。その結果は図９に示した。
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体がＭ１マクロファージへの分化を誘導するのが濃度により増加することを確認するために、実施例３．１と同じ方法でＴＮＦ－αの生成量を確認した。抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体は１０、１、および０．１μｇ／ｍＬの濃度で処理した。その結果は図９に示した。
【0057】
図９に示した通り、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体の処理濃度が増加するほどＴＮＦ－αの生成量も増加することを確認した。
【0058】
より細部的な濃度を確認するために、ＣＬ７抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１３、０．１５７、および０．０７９μｇ／ｍＬの濃度で処理し、ＴＮＦ－αの生成量を確認した。その結果は図１０に示した。
【0059】
図１０に示した通り、ＴＮＦ－αの生成量が抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体の濃度依存的に増加することを確認した。
【0060】
３．３．抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体によるＭ１マクロファージ分化細胞の様相の確認
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を単球細胞に処理した時にＭ１マクロファージへの分化の様相を細胞形態で確認するために、ＴＨＰ－１に１０μｇ／ｍｌの抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を処理し、４８時間の間培養した後に細胞の形態を顕微鏡下で観察した。その結果は図１１に示した。
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を単球細胞に処理した時にＭ１マクロファージへの分化の様相を細胞形態で確認するために、ＴＨＰ－１に１０μｇ／ｍｌの抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を処理し、４８時間の間培養した後に細胞の形態を顕微鏡下で観察した。その結果は図１１に示した。
【0061】
図１１に示した通り、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を処理した実験群（ＣＬ７）の場合にＴＨＰ－１細胞の形態が浮遊細胞（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌ）からＭ１マクロファージの形態である円形の付着細胞に変わることを確認した。前記結果を通じて、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体の処理によって単球細胞がＭ１マクロファージに分化が促進されることを確認した。
【0062】
３．４．ＣＬ７抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のＭ１マクロファージ分化能の確認
ＣＬ７抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体がヒト単球細胞のＭ１マクロファージへの分化を促進させるかを再確認するために、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１β）、およびＩＬ－８（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－８）の分泌量をＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を利用して測定した。より詳しくは、９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅで１．５ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのＴＨＰ－１を分注し、１０μｇ／ｍＬの抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を処理した。そして、４８時間の間反応させた後、Ｍ１マクロファージの分化マーカーであるＴＮＦ－α、ＩＬ－１βおよびＩＬ－８の生成量をＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｈｕｍａｎ ＴＮＦ－αＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ ｋｉｔ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を利用して測定した。その結果は図１２に示した。
ＣＬ７抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体がヒト単球細胞のＭ１マクロファージへの分化を促進させるかを再確認するために、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１β）、およびＩＬ－８（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－８）の分泌量をＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を利用して測定した。より詳しくは、９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅで１．５ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのＴＨＰ－１を分注し、１０μｇ／ｍＬの抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を処理した。そして、４８時間の間反応させた後、Ｍ１マクロファージの分化マーカーであるＴＮＦ－α、ＩＬ－１βおよびＩＬ－８の生成量をＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｈｕｍａｎ ＴＮＦ－αＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ ｋｉｔ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を利用して測定した。その結果は図１２に示した。
【0063】
図１２に示した通り、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を処理していない対照群（Ｃｏｎ）の場合と比較して、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を処理した実験群において、すべて３種類のＭ１マクロファージ分化マーカーが増加したことを確認した。
【0064】
３．５．抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と免疫抗がん剤とのＭ１マクロファージ分化能の比較
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と免疫抗がん剤のＭ１マクロファージ分化能を比較するために、実施例３．１と同じ方法でＴＮＦ－αの生成量をＥＬＩＳＡ ｋｉｔで確認した。抗－ＰＤ－Ｌ１免疫抗がん剤としてはイミフィンジ（Ｉｍｆｉｎｚｉ）を１０μｇ／ｍＬの濃度で処理した。その結果は図１３に示した。
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と免疫抗がん剤のＭ１マクロファージ分化能を比較するために、実施例３．１と同じ方法でＴＮＦ－αの生成量をＥＬＩＳＡ ｋｉｔで確認した。抗－ＰＤ－Ｌ１免疫抗がん剤としてはイミフィンジ（Ｉｍｆｉｎｚｉ）を１０μｇ／ｍＬの濃度で処理した。その結果は図１３に示した。
【0065】
図１３に示した通り、免疫抗がん剤として知られているイミフィンジ（Ｉｍｆ）を単独で処理した比較群より、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体がＴＮＦ－αの生成量を顕著に増加させることを確認した。前記結果を通じて、既存に知られている免疫抗がん剤より、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体がＭ１マクロファージへの分化能を顕著に増加させることを確認することができた。
【0066】
他の免疫抗がん剤との比較のために、抗－ＰＤ－Ｌ１免疫抗がん剤であるイミフィンジ、抗－ＰＤ－１免疫抗がん剤であるキイトルーダ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）、そして、Ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ）抗体をそれぞれ１０μｇ／ｍＬの濃度で処理し、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１βおよびＩＬ－８の生成量をＥＬＩＳＡ ｋｉｔで確認した。その結果は図１４～図１６に示した。
【0067】
図１４～図１６に示した通り、イミフィンジ、キイトルーダ、ＩｇＧ抗体と比較して、ＣＬ７抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体がＴＮＦ－α、ＩＬ－１βおよびＩＬ－８の生成量を顕著に増加させることを確認したし、前記結果を通じて、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体が既存の免疫抗がん剤と比較してＭ１マクロファージへの分化促進を顕著に増加させることができることを確認することができた。
【0068】
３．６．抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と抗－ＰＤ－Ｌ１免疫抗がん剤とのＭ０マクロファージからＭ１マクロファージへの分化能の比較
【0069】
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と免疫抗がん剤のＭ０マクロファージからＭ１マクロファージへの分化能を比較するために、９６－ウェルプレートに１．５ｘ１０４ｃｅｌｌｌｓ／ｗｅｌｌのＴＨＰ－１を分注し、１０μｇ／ｍＬの抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体、１０μｇ／ｍＬのイミフィンジ、および／または２００ｎＭのＰＭＡ（ｐｈｏｒｂｏｌ－１２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ－１３－ａｃｅｔａｔｅ）を処理した。そして、４８時間の間反応させた後、ＴＮＦ－αの生成量をＥＬＩＳＡ ｋｉｔを利用して測定した。その結果は図１７に示した。
【0070】
図１７に示した通り、免疫抗がん剤であるイミフィンジを単独で処理した比較群の場合にはＴＮＦ－αが生成されなかったが、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を単独で処理した実験群ではＴＮＦ－αの生成量が増加したことを確認した。また、ＴＨＰ－１細胞にＰＭＡを処理してＭ０マクロファージに分化させた時にも、イミフィンジを処理した実験群と比較して、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を処理した実験群で顕著に高いＴＮＦ－α生成量を確認した。前記結果を通じて、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体が既存の免疫抗がん剤と比較してＭ０マクロファージのＭ１マクロファージへの分化を促進させることを確認することができた。
【0071】
３．７．抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と抗－ＰＤ－Ｌ１免疫抗がん剤とのＭ１マクロファージへの分化能の比較
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と免疫抗がん剤のＭ１マクロファージへの分化能を比較するために、実施例３．１と同じ方法でＴＮＦ－αの生成量を確認した。その結果は図１８に示した。
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と免疫抗がん剤のＭ１マクロファージへの分化能を比較するために、実施例３．１と同じ方法でＴＮＦ－αの生成量を確認した。その結果は図１８に示した。
【0072】
図１８に示した通り、ＬＰＳを処理して単球細胞をＭ１マクロファージに分化させた時、イミフィンジとＬＰＳを共に処理した実験群ではＴＮＦ－αの生成量が有意義な差を示さなかったものの、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体とＬＰＳを共に処理した実験群では抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を単独で処理した実験群と比較してＴＮＦ－αの生成量が有意義に増加したことを確認した。
【0073】
３．８．抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のＭ２マクロファージからＭ１マクロファージへの再分化能の確認
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体がＭ２マクロファージをＭ１マクロファージに再分化させることができるかを確認するために、９６－ウェルプレートに１．５ｘ１０４ｃｅｌｌｌｓ／ｗｅｌｌのＴＨＰ－１を分注し、３２０ｎＭのＰＭＡを処理して６時間の間前処理した後、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－４）およびＩＬ－１３（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１３）、そして、１０μｇ／ｍＬの抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を処理して１８時間の間反応させた。そして、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１βおよびＩＬ－８の生成量をＥＬＩＳＡ ｋｉｔで確認した。その結果は図１９～図２１に示した。
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体がＭ２マクロファージをＭ１マクロファージに再分化させることができるかを確認するために、９６－ウェルプレートに１．５ｘ１０４ｃｅｌｌｌｓ／ｗｅｌｌのＴＨＰ－１を分注し、３２０ｎＭのＰＭＡを処理して６時間の間前処理した後、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－４）およびＩＬ－１３（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１３）、そして、１０μｇ／ｍＬの抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を処理して１８時間の間反応させた。そして、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１βおよびＩＬ－８の生成量をＥＬＩＳＡ ｋｉｔで確認した。その結果は図１９～図２１に示した。
【0074】
図１９～図２１に示した通り、ＰＭＡを前処理していない実験群の場合には、ＩＬ－４およびＩＬ－１３と抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を共に処理した実験群でＴＮＦ－α、ＩＬ－１βおよびＩＬ－８の生成量が増加したし、ＰＭＡを前処理した実験群でも同一にＩＬ－４およびＩＬ－１３と抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を共に処理した実験群でＴＮＦ－α、ＩＬ－１βおよびＩＬ－８の生成量が増加したことを確認した。前記結果を通じて、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体がＭ２マクロファージを再びＭ１マクロファージに効果的に再分化させることができることを確認することができた。
【0075】
３．９．抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のＭ０、Ｍ１、およびＭ２マクロファージからＭ１マクロファージへの再分化能の確認
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体がＭ０、Ｍ１、およびＭ２マクロファージをＭ１マクロファージに再分化させることができるかを確認するために、９６－ウェルプレートに１．５ｘ１０４ｃｅｌｌｌｓ／ｗｅｌｌのＴＨＰ－１を分注し、１０μｇ／ｍＬの抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を４８時間の間前処理し、１００ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ、１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ、そして、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４およびＩＬ－１３を処理して２４時間の間反応させた。そして、ＴＮＦ－αの生成量をＥＬＩＳＡ ｋｉｔで確認した。その結果は図２２に示した。
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体がＭ０、Ｍ１、およびＭ２マクロファージをＭ１マクロファージに再分化させることができるかを確認するために、９６－ウェルプレートに１．５ｘ１０４ｃｅｌｌｌｓ／ｗｅｌｌのＴＨＰ－１を分注し、１０μｇ／ｍＬの抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を４８時間の間前処理し、１００ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ、１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ、そして、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４およびＩＬ－１３を処理して２４時間の間反応させた。そして、ＴＮＦ－αの生成量をＥＬＩＳＡ ｋｉｔで確認した。その結果は図２２に示した。
【0076】
図２２に示した通り、ＰＭＡを単独で処理したＭ０マクロファージ対照群、ＬＰＳを単独で処理したＭ１マクロファージ対照群、そして、ＩＬ－４およびＩＬ－１３を単独で処理したＭ２マクロファージ対照群と比較して、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を前処理した実験群において、ＴＮＦ－αの生成量がすべて有意義に増加したことを確認した。前記結果を通じて、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体はＭ０、Ｍ１およびＭ２マクロファージをＭ１マクロファージに分化させる能力が優秀であることを確認することができた。
【0077】
前記結果を通じて、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体は既存の免疫抗がん剤よりもＭ１マクロファージへの分化を促進させて抗がん免疫作用を誘発し、がん組織の成長を抑制できることを確認することができた。特に、がん細胞の増殖および転移を促進させるのに関与すると知られているＭ２マクロファージをＭ１マクロファージに再分化させることを通じて抗がん効果を示すことができることを確認することができた。
【0078】
実施例４：抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と免疫抗がん剤の併用投与効果確認
４．１．抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と抗－ＰＤ－Ｌ１免疫抗がん剤との併用投与効果確認
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と抗－ＰＤ－Ｌ１免疫抗がん剤との併用投与を通じてのがん治療効果を確認するために、ＮＦ－κＢ（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ－ｌｉｇｈｔ－ｃｈａｉｎ－ｅｎｈａｎｃｅｒ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｂ ｃｅｌｌｓ）信号の伝達を確認した。より詳しくは、６－ウェルプレートに８．８ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのＴＨＰ－１を分注し、１０μｇ／ｍＬのＣＬ７抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体および／または１０μｇ／ｍＬのイミフィンジを処理した。そして、２４時間の間培養した後にリン酸化されたＮＦ－κＢ（ｐ－ＮＦ－κＢ）をウエスタンブロッティング（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を利用して確認した。その結果は図２３に示した。
４．１．抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と抗－ＰＤ－Ｌ１免疫抗がん剤との併用投与効果確認
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と抗－ＰＤ－Ｌ１免疫抗がん剤との併用投与を通じてのがん治療効果を確認するために、ＮＦ－κＢ（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａ－ｌｉｇｈｔ－ｃｈａｉｎ－ｅｎｈａｎｃｅｒ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｂ ｃｅｌｌｓ）信号の伝達を確認した。より詳しくは、６－ウェルプレートに８．８ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのＴＨＰ－１を分注し、１０μｇ／ｍＬのＣＬ７抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体および／または１０μｇ／ｍＬのイミフィンジを処理した。そして、２４時間の間培養した後にリン酸化されたＮＦ－κＢ（ｐ－ＮＦ－κＢ）をウエスタンブロッティング（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を利用して確認した。その結果は図２３に示した。
【0079】
図２３に示した通り、免疫抗がん剤であるイミフィンジを単独で投与した実験群と比較して、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を処理した実験群でｐ－ＮＦ－κＢの量が増加したし、イミフィンジと抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を併用投与した実験群ではｐ－ＮＦ－κＢの量がさらに増加したことを確認した。前記結果を通じて、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体とイミフィンジを併用投与する場合にＭ１マクロファージへの分化が促進されることを確認することができた。
【0080】
４．２．抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と抗－ＰＤ－Ｌ１免疫抗がん剤および／または抗－ＰＤ－１免疫抗がん剤との併用投与効果確認
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と抗－ＰＤ－Ｌ１免疫抗がん剤および／または抗－ＰＤ－１免疫抗がん剤との併用投与を通じてのがん治療効果を確認するために、ｐ３８ＭＡＰＫ（ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓｅ）とＥＲＫ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ）の信号の伝達を確認した。より詳しくは、６－ウェルプレートに８．８ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのＴＨＰ－１を分注し、１０μｇ／ｍＬのＣＬ７抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体、１０μｇ／ｍＬのイミフィンジ、および／または１０μｇ／ｍＬのキイトルーダを処理した。そして、４８時間の間培養した後にリン酸化されたｐ３８ＭＡＰＫ（ｐ－ｐ３８ＭＡＰＫ）、リン酸化されたＥＲＫ（ｐ－ＥＲＫ）をウエスタンブロッティング（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を利用して確認した。その結果は図２４に示した。
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と抗－ＰＤ－Ｌ１免疫抗がん剤および／または抗－ＰＤ－１免疫抗がん剤との併用投与を通じてのがん治療効果を確認するために、ｐ３８ＭＡＰＫ（ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓｅ）とＥＲＫ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ）の信号の伝達を確認した。より詳しくは、６－ウェルプレートに８．８ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのＴＨＰ－１を分注し、１０μｇ／ｍＬのＣＬ７抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体、１０μｇ／ｍＬのイミフィンジ、および／または１０μｇ／ｍＬのキイトルーダを処理した。そして、４８時間の間培養した後にリン酸化されたｐ３８ＭＡＰＫ（ｐ－ｐ３８ＭＡＰＫ）、リン酸化されたＥＲＫ（ｐ－ＥＲＫ）をウエスタンブロッティング（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を利用して確認した。その結果は図２４に示した。
【0081】
図２４に示した通り、免疫抗がん剤を単独で処理した実験群ではｐ－ｐ３８ＭＡＰＫとｐ－ＥＲＫ蛋白質がいずれも観察されなかったが、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体の場合には二種類の蛋白質がすべて観察された。また、免疫抗がん剤との併用投与した実験群ではｐ－ｐ３８ＭＡＰＫ蛋白質の量がさらに増加することを確認した。
【0082】
前記結果を通じて、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体がＭＡＰＫ信号の伝達を通じて、Ｍ１マクロファージへの分化を促進させ、免疫抗がん剤と併用投与する場合にその効果がさらに増加することを確認したし、これを通じて、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体は単独でも免疫抗がん剤として使われ得るが、既存の免疫抗がん剤との併用投与を通じて、抗がん治療効果をさらに増加させることができることを確認することができた。
【0083】
実施例５：抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗がん効果
５．１．抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のがん細胞成長抑制効果確認
ＣＤ３００ｃを標的とする単クローン抗体ががん細胞の成長に及ぼす影響を確認するために、Ａ５４９（ヒト肺がん細胞株）を利用して細胞増殖分析を実施した。より詳しくは、９６－ウェルプレートに０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）条件では２ｘ１０４細胞を分注したし、０．１％ウシ胎児血清条件では６ｘ１０３細胞を分注した。そして、１０μｇ／ｍＬの抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を処理して５日間培養した。そして、ＣＣＫ－８（ＤＯＪＩＮＤＯ）を処理してＯＤ４５０ｎｍで吸光度を測定して抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のがん細胞成長抑制効果を確認した。その結果は図２５および図２６に示した。
５．１．抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のがん細胞成長抑制効果確認
ＣＤ３００ｃを標的とする単クローン抗体ががん細胞の成長に及ぼす影響を確認するために、Ａ５４９（ヒト肺がん細胞株）を利用して細胞増殖分析を実施した。より詳しくは、９６－ウェルプレートに０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）条件では２ｘ１０４細胞を分注したし、０．１％ウシ胎児血清条件では６ｘ１０３細胞を分注した。そして、１０μｇ／ｍＬの抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を処理して５日間培養した。そして、ＣＣＫ－８（ＤＯＪＩＮＤＯ）を処理してＯＤ４５０ｎｍで吸光度を測定して抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のがん細胞成長抑制効果を確認した。その結果は図２５および図２６に示した。
【0084】
図２５に示した通り、０％ＦＢＳ条件でＳＫ１１およびＳＫ１４抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を除いては、すべてがん細胞の増殖を抑制する効果を示すことを確認した。
【0085】
図２６に示した通り、０．１％ＦＢＳ条件では実験に使ったすべての抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体ががん細胞の増殖を抑制する効果を示すことを確認した。
【0086】
５．２．抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体の免疫抗がん剤とのがん細胞成長抑制効果の比較
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と免疫抗がん剤とのがん細胞成長抑制効果を比較するために、Ａ５４９（ヒト肺がん細胞株）とＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ヒト乳ガン細胞株）を利用して細胞成長抑制効果を確認した。より詳しくは、９６－ウェルプレートに０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）条件では２ｘ１０４細胞を分注したし、０．１％ウシ胎児血清条件では６ｘ１０３細胞を分注した。そして、１０μｇ／ｍＬの抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を処理して５日間培養した後、光学顕微鏡で観察した。その結果は図２７および図２８に示した。
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と免疫抗がん剤とのがん細胞成長抑制効果を比較するために、Ａ５４９（ヒト肺がん細胞株）とＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ヒト乳ガン細胞株）を利用して細胞成長抑制効果を確認した。より詳しくは、９６－ウェルプレートに０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）条件では２ｘ１０４細胞を分注したし、０．１％ウシ胎児血清条件では６ｘ１０３細胞を分注した。そして、１０μｇ／ｍＬの抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を処理して５日間培養した後、光学顕微鏡で観察した。その結果は図２７および図２８に示した。
【0087】
図２７に示した通り、Ａ５４９細胞株で免疫抗がん剤であるイミフィンジより抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体ががん細胞の増殖をさらに効果的に抑制することを確認した。
【0088】
図２８に示した通り、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株で免疫抗がん剤であるイミフィンジより抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体ががん細胞の増殖をさらに効果的に抑制することを確認した。
【0089】
５．３．抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体の濃度別がん細胞成長抑制効果確認
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体の濃度によるがん細胞成長抑制効果を確認するために、９６－ウェルプレートに０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）条件では２ｘ１０４Ａ５４９細胞を分注し、１０μｇ／ｍＬの抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を処理して５日間培養した。そして、ＣＣＫ－８（ＤＯＪＩＮＤＯ）を処理して３時間の間反応させた後、ＯＤ４５０ｎｍで吸光度を測定して抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のがん細胞成長抑制効果を確認した。その結果は図２９に示した。
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体の濃度によるがん細胞成長抑制効果を確認するために、９６－ウェルプレートに０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）条件では２ｘ１０４Ａ５４９細胞を分注し、１０μｇ／ｍＬの抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を処理して５日間培養した。そして、ＣＣＫ－８（ＤＯＪＩＮＤＯ）を処理して３時間の間反応させた後、ＯＤ４５０ｎｍで吸光度を測定して抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のがん細胞成長抑制効果を確認した。その結果は図２９に示した。
【0090】
図２９に示した通り、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体の濃度により依存的にがん細胞の成長が抑制されることを確認した。
【0091】
５．４．抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と免疫抗がん剤の併用投与によるがん治療効果確認
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と免疫抗がん剤の併用投与によるがん治療効果を確認するために、実施例５．１と同じ方法で細胞増殖分析を実施した。免疫抗がん剤としてはイミフィンジを使った。その結果は図３０に示した。
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と免疫抗がん剤の併用投与によるがん治療効果を確認するために、実施例５．１と同じ方法で細胞増殖分析を実施した。免疫抗がん剤としてはイミフィンジを使った。その結果は図３０に示した。
【0092】
図３０に示した通り、免疫抗がん剤の単独投与と比較して、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と免疫抗がん剤の併用投与時にがん細胞の成長が効果的に抑制されることを確認した。
【0093】
また、光学顕微鏡を利用してがん細胞成長抑制効果を確認した。その結果は図３１に示した。
図３１に示した通り、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と免疫抗がん剤の併用投与時にがん細胞の成長が効果的に抑制されることを確認した。
図３１に示した通り、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と免疫抗がん剤の併用投与時にがん細胞の成長が効果的に抑制されることを確認した。
【0094】
５．５．抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と免疫抗がん剤の併用投与に対する作用メカニズム確認
がん細胞の細胞死滅信号伝達メカニズムにおいて、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と免疫抗がん剤の併用投与による作用メカニズムを確認するために、Ａ５４９細胞に抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体、イミフィンジ、および／またはキイトルーダを１０μｇ／ｍＬの濃度で処理して細胞死滅マーカーであるＣａｓｐａｓｅ－９切断型（ｃｌｅａｖｅｄ ｆｏｒｍ）の量をウエスタンブロッティング（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を実施して確認した。その結果は図３２に示した。
がん細胞の細胞死滅信号伝達メカニズムにおいて、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と免疫抗がん剤の併用投与による作用メカニズムを確認するために、Ａ５４９細胞に抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体、イミフィンジ、および／またはキイトルーダを１０μｇ／ｍＬの濃度で処理して細胞死滅マーカーであるＣａｓｐａｓｅ－９切断型（ｃｌｅａｖｅｄ ｆｏｒｍ）の量をウエスタンブロッティング（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を実施して確認した。その結果は図３２に示した。
【0095】
図３２に示した通り、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を単独で処理した実験群と比較して、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体とイミフィンジを併用投与した場合にＣａｓｐａｓｅ－９切断型の量が増加し、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体、イミフィンジおよびキイトルーダを併用投与した場合にＣａｓｐａｓｅ－９切断型の量がさらに増加することを確認した。前記結果を通じて、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と免疫抗がん剤を併用投与する場合にがん細胞の細胞死滅信号伝達メカニズムがさらに活性化し、これを通じて、がん細胞の増殖この効果的に抑制され得ることを確認することができた。
【0096】
実施例６：抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のヒト抗原とマウス抗原間の優秀な交差反応性確認
６．１．抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体の特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）確認
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のヒト抗原とマウス抗原間の交差反応性を確認する前に、まず抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体の特異性を確認するために、既にＣＤ３００ｃ抗原と拮抗作用をするものとして知られているだけでなく、蛋白質配列が類似するＣＤ３００ａ抗原に対する抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体の交差反応性（ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）を確認した。より詳しくは、ＣＤ３００ａ抗原を０．０３９、０．６３、および１０μｇ／ｍＬの濃度で処理した後、実施例１．５と同じ方法でＢｉｎｄｉｎｇ ＥＬＩＳＡを実施した。その結果は図３３に示した。
６．１．抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体の特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）確認
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のヒト抗原とマウス抗原間の交差反応性を確認する前に、まず抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体の特異性を確認するために、既にＣＤ３００ｃ抗原と拮抗作用をするものとして知られているだけでなく、蛋白質配列が類似するＣＤ３００ａ抗原に対する抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体の交差反応性（ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）を確認した。より詳しくは、ＣＤ３００ａ抗原を０．０３９、０．６３、および１０μｇ／ｍＬの濃度で処理した後、実施例１．５と同じ方法でＢｉｎｄｉｎｇ ＥＬＩＳＡを実施した。その結果は図３３に示した。
【0097】
図３３に示した通り、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体がＣＤ３００ａに結合しないことを確認したし、前記結果を通じて、類似する配列であるＣＤ３００ａに結合しないほど高い結合特異性を示すことを確認することができた。
【0098】
６．２抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のマウスマクロファージ（Ｒａｗ２６４．７）のＭ１分化能の確認
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体がマウスマクロファージにおいてもＭ１マクロファージへの分化能を促進させることができるかを確認するために、９６－ウェルプレートにマウスマクロファージ（Ｒａｗ２６４．７）を１ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で分注した後、１０μｇ／ｍＬの抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を共に処理して培養した。そして、ＴＮＦ－αの生成量をＥＬＩＳＡ ｋｉｔで確認した。その結果は図３４に示した。
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体がマウスマクロファージにおいてもＭ１マクロファージへの分化能を促進させることができるかを確認するために、９６－ウェルプレートにマウスマクロファージ（Ｒａｗ２６４．７）を１ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で分注した後、１０μｇ／ｍＬの抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を共に処理して培養した。そして、ＴＮＦ－αの生成量をＥＬＩＳＡ ｋｉｔで確認した。その結果は図３４に示した。
【0099】
図３４に示した通り、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を処理した実験群ではＴＮＦ－αの生成量が増加したことを確認したし、前記結果を通じて、ヒトだけでなくマウスにおいても同一に作用してＭ１マクロファージへの分化を促進させることを確認することができた。
【0100】
６．３抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のマウス大腸がん細胞（ＣＴ２６）の成長抑制効果
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体がマウスでも抗がん効果を示すかを確認するために、ＣＴ２６（マウス大腸がん細胞株）を利用して実施例４．１と同じ方法で細胞増殖分析を実施した。その結果は図３５に示した。
図３５に示した通り、マウスでも抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体はがん治療効果を示すことを確認した。
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体がマウスでも抗がん効果を示すかを確認するために、ＣＴ２６（マウス大腸がん細胞株）を利用して実施例４．１と同じ方法で細胞増殖分析を実施した。その結果は図３５に示した。
図３５に示した通り、マウスでも抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体はがん治療効果を示すことを確認した。
【0101】
実施例７：抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のｉｎ ｖｉｖｏでの抗がん効果
７．１．抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のｉｎ ｖｉｖｏでのがん成長抑制効果確認
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体の抗がん効果を生体内条件（ｉｎ ｖｉｖｏ）で確認するために、大腸がん細胞株（ＣＴ２６）２ｘ１０５個を８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下注射（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）で移植して同種移植マウス腫瘍モデル（Ｓｙｎｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ）を製作した。動物の飼育および実験はすべてＳＰＦ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅ）施設で進行した。実験方法は図３６に簡略に示した。大腸がん細胞株を移植して１２日後に、腫瘍の大きさが５０～１００ｍｍ３であるマウスに抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体ＣＬ７、抗－ＰＤ－１抗体、および単クローン抗体ＣＬ７と抗－ＰＤ－１抗体（Ｃｏｍｂｏ）をそれぞれマウスに注射し、対照群ではリン酸塩緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）を同量注射した。より詳しくは、１週間に２回、２週間で総４回をマウスに腹腔内注射（Ｉｎｔｒａ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）でそれぞれを１０ｍｇ／ｋｇずつ注射した。そして、２５日間がんの大きさを測定した。その結果は図３７に示した。
７．１．抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のｉｎ ｖｉｖｏでのがん成長抑制効果確認
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体の抗がん効果を生体内条件（ｉｎ ｖｉｖｏ）で確認するために、大腸がん細胞株（ＣＴ２６）２ｘ１０５個を８週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下注射（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）で移植して同種移植マウス腫瘍モデル（Ｓｙｎｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ）を製作した。動物の飼育および実験はすべてＳＰＦ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅ）施設で進行した。実験方法は図３６に簡略に示した。大腸がん細胞株を移植して１２日後に、腫瘍の大きさが５０～１００ｍｍ３であるマウスに抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体ＣＬ７、抗－ＰＤ－１抗体、および単クローン抗体ＣＬ７と抗－ＰＤ－１抗体（Ｃｏｍｂｏ）をそれぞれマウスに注射し、対照群ではリン酸塩緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）を同量注射した。より詳しくは、１週間に２回、２週間で総４回をマウスに腹腔内注射（Ｉｎｔｒａ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）でそれぞれを１０ｍｇ／ｋｇずつ注射した。そして、２５日間がんの大きさを測定した。その結果は図３７に示した。
【0102】
図３７に示した通り、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を単独投与した実験群で対照群と比較してがんの成長が抑制されることを確認したし、抗－ＰＤ－１抗体と併用投与した場合にはがんの成長がさらに効果的に抑制されることを確認した。
【0103】
７．２．抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍微細環境での腫瘍浸潤リンパ球増加効果確認
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体が腫瘍微細環境（ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ；ＴＭＥ）で腫瘍浸潤リンパ球（ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ＴＩＬ）に及ぼす影響を確認するために、実施例７．１と同じ方法で実験した２５日目のマウスを安楽死させた後、１％ＰＦＡ（ｐａｒａ－ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）をマウス血管内に注入後貫流させ、がん組織を獲得した。そして、獲得されたがん組織を１％ＰＦＡを利用して固定させ、順次１０％、２０％、３０％スクロース溶液を利用して脱水した。脱水されたがん組織はＯＣＴコンパウンド（Ｏｐｔｉｍａｌ ｃｕｔｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）で冷凍させた後、冷凍組織切片機（Ｃｒｙｏｔｏｍｅ）を利用してがん組織を５０μｍ厚さで切片にし、腫瘍浸潤リンパ球マーカーであるＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ３１＋がん血管細胞を染色した。その結果は図３８に示した。
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体が腫瘍微細環境（ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ；ＴＭＥ）で腫瘍浸潤リンパ球（ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ；ＴＩＬ）に及ぼす影響を確認するために、実施例７．１と同じ方法で実験した２５日目のマウスを安楽死させた後、１％ＰＦＡ（ｐａｒａ－ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）をマウス血管内に注入後貫流させ、がん組織を獲得した。そして、獲得されたがん組織を１％ＰＦＡを利用して固定させ、順次１０％、２０％、３０％スクロース溶液を利用して脱水した。脱水されたがん組織はＯＣＴコンパウンド（Ｏｐｔｉｍａｌ ｃｕｔｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）で冷凍させた後、冷凍組織切片機（Ｃｒｙｏｔｏｍｅ）を利用してがん組織を５０μｍ厚さで切片にし、腫瘍浸潤リンパ球マーカーであるＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ３１＋がん血管細胞を染色した。その結果は図３８に示した。
【0104】
図３８に示した通り、抗－ＰＤ－１抗体を単独投与した実験群と比較して、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を投与した実験群でＣＤ８＋Ｔ細胞が増加したことを確認したし、これを通じて、ＣＤ３００ｃ単クローン抗体が腫瘍微細環境で腫瘍浸潤リンパ球を増加させて抗がん効果を示すことを確認することができた。
【0105】
７．３．抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体のｉｎ ｖｉｖｏでのＭ１マクロファージ増加効果確認
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体がｉｎ ｖｉｖｏでがん組織内のＭ１マクロファージを増加させるかを確認するために、実施例７．２と同じ方法で準備したがん組織切片を利用してＭ１マクロファージマーカーであるｉＮＯＳとＭ２マクロファージマーカーであるＣＤ２０６を染色した。その結果は図３９に示した。
抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体がｉｎ ｖｉｖｏでがん組織内のＭ１マクロファージを増加させるかを確認するために、実施例７．２と同じ方法で準備したがん組織切片を利用してＭ１マクロファージマーカーであるｉＮＯＳとＭ２マクロファージマーカーであるＣＤ２０６を染色した。その結果は図３９に示した。
【0106】
図３９に示した通り、抗－ＰＤ－１抗体を処理した実験群ではＭ１マクロファージが対照群と比較して一部増加したが、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を処理した実験群ではＭ１マクロファージが顕著に増加し、Ｍ２マクロファージはほとんど観察されないことを確認した。また、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体と抗－ＰＤ－１抗体を併用投与した実験群でもＭ１マクロファージが増加したことを確認した。前記結果を通じて、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体が既存の免疫抗がん剤と比較してＭ１マクロファージへの分化を効果的に促進させることができることを確認することができた。
【0107】
前記結果を通じて、本発明の抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体はＣＤ３００ｃ抗原に対して高い特異性を有して結合することができ、マウスなどのような種間交差反応性を示すことを確認したので、多様な個体に使用できることを確認した。また、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体はＴ細胞を活性化させ、Ｍ１マクロファージへの分化を促進させることによって免疫抗がん剤の作用をすることによって、がん細胞の増殖、転移などを効果的に抑制できるということをｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏですべて確認しただけでなく、既存の免疫抗がん剤との併用投与を通じてその治療効果をさらに増加させることができることを確認したので、ＣＤ３００ｃ抗原を発現する多様ながんの抗がん免疫治療に効果的に使用できることを確認することができた。
【0108】
前述した本発明の説明は例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者は本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく他の具体的な形態に容易に変形できることが理解できるであろう。したがって、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり限定的ではないものと理解されるべきである。
（付記）
本開示は以下の態様を含む。
項１：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８および５０からなる群から選択されたいずれか一つ以上のＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）配列を含む、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体。
項２：前記抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体は種間交差反応性を有することを特徴とする、項１に記載の抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体。
項３：前記交差反応性はヒト抗原とマウス抗原に対する交差反応性であることを特徴とする、項２に記載の抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体。
項４：抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を有効性分として含む、がん予防または治療用薬学的組成物。
項５：前記抗体は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８および５０からなる群から選択されたいずれか一つ以上のＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）配列を含むことを特徴とする、項４に記載の薬学的組成物。
項６：前記がんは大腸がん、直膓がん、結腸がん、甲状腺がん、口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、子宮頸部がん、脳がん、肺がん、卵巣がん、膀胱がん、腎臓がん、肝臓がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、舌がん、乳ガン、子宮がん、胃がん、骨がんおよび血液がんからなる群から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、項４に記載の薬学的組成物。
項７：前記薬学的組成物は免疫抗がん剤をさらに含むことを特徴とする、項４に記載の薬学的組成物。
項８：前記免疫抗がん剤はａｎｔｉ－ＰＤ－１、ａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１、ａｎｔｉ－ＣＴＬＡ－４、ａｎｔｉ－ＫＩＲ、ａｎｔｉ－ＬＡＧ３、ａｎｔｉ－ＣＤ１３７、ａｎｔｉ－ＯＸ４０、ａｎｔｉ－ＣＤ２７６、ａｎｔｉ－ＣＤ２７、ａｎｔｉ－ＧＩＴＲ、ａｎｔｉ－ＴＩＭ３、ａｎｔｉ－４１ＢＢ、ａｎｔｉ－ＣＤ２２６、ａｎｔｉ－ＣＤ４０、ａｎｔｉ－ＣＤ７０、ａｎｔｉ－ＩＣＯＳ、ａｎｔｉ－ＣＤ４０Ｌ、ａｎｔｉ－ＢＴＬＡ、ａｎｔｉ－ＴＣＲ、およびａｎｔｉ－ＴＩＧＩＴからなる群から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、項７に記載の薬学的組成物。
項９：前記薬学的組成物はがんの増殖、生存、転移、再発または抗がん剤耐性を抑制することを特徴とする、項４に記載の薬学的組成物。
項１０：抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を有効性分として含む、免疫抗がん剤。
項１１：前記抗体は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８および５０からなる群から選択されたいずれか一つ以上のＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）配列を含むことを特徴とする、項１０に記載の免疫抗がん剤。
項１２：前記免疫抗がん剤はがんの増殖、生存、転移、再発または抗がん剤耐性を抑制することを特徴とする、項１０に記載の免疫抗がん剤。
項１３：前記がんは大腸がん、直膓がん、結腸がん、甲状腺がん、口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、子宮頸部がん、脳がん、肺がん、卵巣がん、膀胱がん、腎臓がん、肝臓がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、舌がん、乳ガン、子宮がん、胃がん、骨がんおよび血液がんからなる群から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、項１０に記載の免疫抗がん剤。
項１４：抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を有効性分として含む、抗がん治療法の補助剤。
項１５：前記補助剤は免疫細胞の免疫機能を活性化させて抗がん治療効果を向上させることを特徴とする、項１４に記載の補助剤。
項１６：前記抗がん治療法は放射線治療法、抗がん剤治療法または免疫抗がん剤治療法である、項１４に記載の補助剤。
項１７：抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を有効性分として含む組成物を個体に投与する段階を含む、がんの予防または治療方法。
項１８：抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を有効性分として含む、組成物のがん予防または治療用途。
（付記）
本開示は以下の態様を含む。
項１：配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８および５０からなる群から選択されたいずれか一つ以上のＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）配列を含む、抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体。
項２：前記抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体は種間交差反応性を有することを特徴とする、項１に記載の抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体。
項３：前記交差反応性はヒト抗原とマウス抗原に対する交差反応性であることを特徴とする、項２に記載の抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体。
項４：抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を有効性分として含む、がん予防または治療用薬学的組成物。
項５：前記抗体は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８および５０からなる群から選択されたいずれか一つ以上のＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）配列を含むことを特徴とする、項４に記載の薬学的組成物。
項６：前記がんは大腸がん、直膓がん、結腸がん、甲状腺がん、口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、子宮頸部がん、脳がん、肺がん、卵巣がん、膀胱がん、腎臓がん、肝臓がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、舌がん、乳ガン、子宮がん、胃がん、骨がんおよび血液がんからなる群から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、項４に記載の薬学的組成物。
項７：前記薬学的組成物は免疫抗がん剤をさらに含むことを特徴とする、項４に記載の薬学的組成物。
項８：前記免疫抗がん剤はａｎｔｉ－ＰＤ－１、ａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１、ａｎｔｉ－ＣＴＬＡ－４、ａｎｔｉ－ＫＩＲ、ａｎｔｉ－ＬＡＧ３、ａｎｔｉ－ＣＤ１３７、ａｎｔｉ－ＯＸ４０、ａｎｔｉ－ＣＤ２７６、ａｎｔｉ－ＣＤ２７、ａｎｔｉ－ＧＩＴＲ、ａｎｔｉ－ＴＩＭ３、ａｎｔｉ－４１ＢＢ、ａｎｔｉ－ＣＤ２２６、ａｎｔｉ－ＣＤ４０、ａｎｔｉ－ＣＤ７０、ａｎｔｉ－ＩＣＯＳ、ａｎｔｉ－ＣＤ４０Ｌ、ａｎｔｉ－ＢＴＬＡ、ａｎｔｉ－ＴＣＲ、およびａｎｔｉ－ＴＩＧＩＴからなる群から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、項７に記載の薬学的組成物。
項９：前記薬学的組成物はがんの増殖、生存、転移、再発または抗がん剤耐性を抑制することを特徴とする、項４に記載の薬学的組成物。
項１０：抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を有効性分として含む、免疫抗がん剤。
項１１：前記抗体は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８および５０からなる群から選択されたいずれか一つ以上のＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ）配列を含むことを特徴とする、項１０に記載の免疫抗がん剤。
項１２：前記免疫抗がん剤はがんの増殖、生存、転移、再発または抗がん剤耐性を抑制することを特徴とする、項１０に記載の免疫抗がん剤。
項１３：前記がんは大腸がん、直膓がん、結腸がん、甲状腺がん、口腔がん、咽頭がん、喉頭がん、子宮頸部がん、脳がん、肺がん、卵巣がん、膀胱がん、腎臓がん、肝臓がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、舌がん、乳ガン、子宮がん、胃がん、骨がんおよび血液がんからなる群から選択されたいずれか一つ以上であることを特徴とする、項１０に記載の免疫抗がん剤。
項１４：抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を有効性分として含む、抗がん治療法の補助剤。
項１５：前記補助剤は免疫細胞の免疫機能を活性化させて抗がん治療効果を向上させることを特徴とする、項１４に記載の補助剤。
項１６：前記抗がん治療法は放射線治療法、抗がん剤治療法または免疫抗がん剤治療法である、項１４に記載の補助剤。
項１７：抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を有効性分として含む組成物を個体に投与する段階を含む、がんの予防または治療方法。
項１８：抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体を有効性分として含む、組成物のがん予防または治療用途。
【産業上の利用可能性】
【0109】
本発明の抗－ＣＤ３００ｃ単クローン抗体はＣＤ３００ｃ抗原に特異的に結合するため、ＣＤ３００ｃ抗原を分泌するすべてのがんの治療に使われ得るだけでなく、種間交差反応性を有することによって多様な個体の抗がん治療に使うことができる。また、免疫抗がん剤としての作用を通じて抗がん効果を示すため、がんの増殖、発達、転移などを効果的に抑制して多様ながんの免疫治療に効果的に使うことができる。
【図1】
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【図37】
【図38】
【図39】
【配列表】