▶ ユナイテッド キングダム リサーチ アンド イノベーションの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-16
(45)【発行日】2024-08-26
(54)【発明の名称】配偶子形成
(51)【国際特許分類】
C12N 5/075 20100101AFI20240819BHJP
C12N 5/0735 20100101ALI20240819BHJP
C12N 5/076 20100101ALI20240819BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240819BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20240819BHJP
C12Q 1/04 20060101ALI20240819BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20240819BHJP
【ＦＩ】
C12N5/075
C12N5/0735
C12N5/076
C12N5/10
C12N15/113 130Z
C12Q1/04
C12Q1/68
【請求項の数】
26
(21)【出願番号】P 2020554931
(86)(22)【出願日】2018-12-21
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-02-25
(86)【国際出願番号】 EP2018086642
(87)【国際公開番号】W WO2019122355
(87)【国際公開日】2019-06-27
【審査請求日】2021-12-13
(31)【優先権主張番号】1721724.1
(32)【優先日】2017-12-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(73)【特許権者】
【識別番号】520222450
【氏名又は名称】ユナイテッド キングダム リサーチ アンド イノベーション
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】ハジュコヴァ，ペトラ
(72)【発明者】
【氏名】ヒル，ピーター
(72)【発明者】
【氏名】リーチ，ハリー
【審査官】長谷川 強
(56)【参考文献】
【文献】BIOLOGY OFREPRODUCTION, 2010, vol. 83, no. 6, pp.890-892
【文献】STEM CELLS, 2016, vol.34, no. 9, pp. 2418-2428
【文献】MOLECULAR CELL, 2016, vol.63, no. 6, pp. 1066-1079
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ５／０７５
Ｃ１２Ｎ ５／０７３５
Ｃ１２Ｎ ５／０７６
Ｃ１２Ｎ ５／１０
Ｃ１２Ｎ １５／１１３
Ｃ１２Ｑ １／０４
Ｃ１２Ｑ １／６８
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
減数分裂能のある細胞を作製するインビトロの方法であって、（ｉ）前駆細胞を提供するステップであって、前記前駆細胞は、幹細胞又は始原生殖細胞様細胞（ＰＧＣＬＣ）である、ステップと、
（ｉｉ）前記前駆細胞のゲノムＤＮＡのメチル化を阻害するステップと、
（ｉｉｉ）前記前駆細胞をポリコーム抑制複合体の阻害剤で処理するステップと、その後、
（ｉｖ）前記前駆細胞を、一定期間、前記前駆細胞が減数分裂能のある細胞になるのに適した培養条件下で増殖させるステップと、
を含み、
ステップ（ｉｉ）及びステップ（ｉｉｉ）は、同時に、又はいずれかの順序で連続的に、実行することができ、前記阻害するステップ（ｉｉ）及び処理するステップ（ｉｉｉ）は、増殖させるステップ（ｉｖ）中に前記前駆細胞による生殖系列リプログラミング応答性（ＧＲＲ）遺伝子の発現を誘導するのに十分であり、前記前駆細胞は、ステップ（ｉ）及び／又は（ｉｉ）の後にＴｅｔ１を発現するか、又はＴｅｔ１の発現を開始する、方法。
【請求項2】
前記前駆細胞は、対象から得られたサンプルに由来し、前記対象は哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記対象はヒト対象である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記幹細胞はｉＰＳ細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項5】
前記ＧＲＲ遺伝子の発現は、転写活性化因子の動員に関連するか、又はそれによって誘導され、前記転写活性化因子はＴｅｔｌである、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
Ｔｅｔｌ発現は外因的に提供又は増進される、請求項４又は請求項５に記載の方法。
【請求項7】
ステップ（ｉｖ）の前又は最中に、前記前駆細胞にＴｅｔｌタンパク質が外因的に導入される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
外因的に提供された又は外因的に導入されたＴｅｔｌは、１つ以上の特定のゲノム領域を標的とするＴｅｔｌ融合コンストラクトである、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項9】
（ｖ）前記細胞内における１つ又は複数のＧＲＲ遺伝子の発現レベルを検出するステップ、を更に含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
ステップ（ｉｖ）の後に、前記減数分裂能のある細胞に対してステップ（ｖ）が実施される、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記ポリコーム抑制複合体の阻害剤は、ＰＲＣ１阻害剤及び／又はＰＲＣ２阻害剤である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記ポリコーム抑制複合体の阻害剤は、ＰＲＣ１阻害剤である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記ＰＲＣ１阻害剤はＰＲＴ４１６５である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記ポリコーム抑制複合体の阻害剤はＲＮＡｉ分子である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
ステップ（ｉｉ）は、ゲノムＤＮＡメチル化を低減する薬剤を用いて前記前駆細胞を処理することによって実施される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記ゲノムＤＮＡメチル化を低減する薬剤は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ＤＮＡメチル化の蓄積を防ぐ薬剤、又はＤＮＡメチル化の維持を阻害する薬剤である、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記ゲノムＤＮＡメチル化を低減する薬剤はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤である、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＮＭＴ１阻害剤である、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＳＧＩ１０２７又は５－アザシチジンである、請求項１７又は請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＲＮＡｉ分子である、請求項１７又は請求項１８に記載の方法。
【請求項21】
ステップ（ｉｉ）は、遺伝子編集を用いて、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子又はＤＮＡメチル化機構の成分を不活性化することによって実施される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
配偶子形成を誘導するために、前記減数分裂能のある細胞をレチノイン酸で処理することを更に含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記配偶子形成は精子形成である、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記配偶子形成は卵形成である、請求項２２に記載の方法。
【請求項25】
メチル化阻害剤と、ポリコーム抑制複合体の阻害剤とを備えるキットであって、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法による減数分裂能のある細胞のインビトロ作製のためのキット。
【請求項26】
レチノイン酸を更に含む、請求項２５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、インビトロで配偶子形成を誘導する方法に関する。本発明の方法に使用する試薬及びキットも提供される。本発明は、医学の分野、特に不妊の研究及び治療において利用される。
【背景技術】
【0002】
配偶子形成は、配偶子が生成されるプロセスである。動物では、配偶子形成は、生殖腺（雄では精巣、雌では卵巣）における減数分裂能のあるゴノサイト（gonocyte）の分裂及び分化を介して進行する。雄では、精巣において精子形成が発生し、減数分裂と有糸分裂の両方を含む多段階プロセスにおいて精原幹細胞（ＳＳＣ）から精子を生成する。ＳＳＣは出生後の精巣のゴノサイトから生じ、このゴノサイトは、同様に、胚発生中に生殖隆起に遊走する始原生殖細胞（ＰＧＣ；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ他、２０１０年）から生じる。
【0003】
ＰＧＣ（ゴノサイトの胚性前駆細胞）の特異化は、マウスでは胎生６．２５日（Ｅ６．２５）あたりに始まる。特異化に続いて、発生期のＰＧＣは、ゲノムの５－メチルシトシン（５ｍＣ）の全体的な還元3,6,7,10を含む、顕著な全体的なエピジェネティック変化2-9を経る。発生中の胚内の遊走に続いて、ＰＧＣが発生中の胚性生殖腺に到達すると、全体的なＤＮＡ脱メチル化を含むエピジェネティックリプログラミングが進行する。生殖腺ＰＧＣのこのＤＮＡ脱メチル化に関与する分子メカニズムは、精力的な研究の的になっており3,4,6,12-19,21、最近発表された所見では、５ｍＣオキシゲナーゼＴｅｔ１が生殖腺ＰＧＣのＤＮＡ脱メチル化の正しい進行に関与する重要な因子であることが示唆されている12,14,16,17。しかしながら、このエピジェネティックリプログラミングの正確な本質は、捉えどころのないままである。最近の研究では（Ｈｉｌｌ他、２０１８年）、生殖腺のエピジェネティックリプログラミングが、ＰＧＣからゴノサイトへの移行（減数分裂能のあるゴノサイトを生成する（よって、配偶子形成を開始できるようにする）ために必要となる）に決定的に関与していることが示されている。重要なことに、生殖腺のリプログラミングプロセスは、最近まで生殖腺の体細胞環境に関してのみ克服されてきた障壁となっている5,24,25,27。
【0004】
最近の研究では、いくつかの生殖系列関連遺伝子の誘導発現を介して、体細胞前駆細胞が減数分裂能のある細胞に変換されることが報告されている（Ｍｅｄｒａｎｏ他、２０１６年）。他の研究では、Ｔｅｔ１が、雌の配偶子形成の活性化中に特定の生殖系列関連遺伝子を調節する重要な因子であることが確認されている16。しかしながら、Ｔｅｔ１発現の操作が体細胞前駆細胞を減数分裂能のある細胞に変換するのに十分であることは、示されていない。
【0005】
ヒトでは、不妊は深刻な健康問題である。例えば、男性の不妊は人口の７％に及び、不妊男性の約１０％が無精子症である（Ｇａｌｄｏｎ他、２０１６年）。減数分裂能のある細胞の提供は、配偶子形成のインビトロ再現における重要なステップであり、研究や医学、特に不妊に関連して、有用性が見出されるであろう。
【発明の概要】
【0006】
発明者らは、生殖系列発生のＰＧＣからゴノサイト段階への進行に必要となる一連の遺伝子の効果的な活性化には、２つの異なる生化学的条件が必要となることを発見した（本明細書とＨｉｌｌ他（２０１８年）では、該遺伝子を「生殖系列リプログラミング応答性遺伝子（ＧＲＲ遺伝子）」と呼ぶ）。これらの遺伝子は（体細胞前駆細胞、多能性細胞又は初期生殖細胞から減数分裂能のある細胞への変換にも必要となる）、第１にＤＮＡメチル化の低減により、第２にポリコーム駆動抑制の除去により、活性化することができる。これらの生化学的条件が整うと、転写因子と活性化因子（エピジェネティック活性化因子Ｔｅｔ１を含む）は、ＧＲＲ遺伝子発現を駆動することが可能である。Ｔｅｔ１等の転写活性化因子の動員及び／又はＧＲＲ遺伝子の発現は、前駆（体細胞）細胞の減数分裂能のある細胞への変換を示す。
【0007】
したがって、第１の態様では、本発明は、減数分裂能のある細胞を作製するインビトロ法を提供し、本方法は、
（ｉ）前駆細胞を提供するステップと、
（ｉｉ）前駆細胞のゲノムＤＮＡのメチル化を阻害するステップと、
（ｉｉｉ）前駆細胞をポリコーム抑制複合体の阻害剤で処理するステップと、その後、
（ｉｖ）前駆細胞を、一定期間、前駆細胞が減数分裂能のある細胞になるのに適した培養条件下で増殖させるステップと、
を含み、ステップ（ｉｉ）及びステップ（ｉｉｉ）は、同時に、又はいずれかの順序で連続的に、実行することができる。
（ｉ）前駆細胞を提供するステップと、
（ｉｉ）前駆細胞のゲノムＤＮＡのメチル化を阻害するステップと、
（ｉｉｉ）前駆細胞をポリコーム抑制複合体の阻害剤で処理するステップと、その後、
（ｉｖ）前駆細胞を、一定期間、前駆細胞が減数分裂能のある細胞になるのに適した培養条件下で増殖させるステップと、
を含み、ステップ（ｉｉ）及びステップ（ｉｉｉ）は、同時に、又はいずれかの順序で連続的に、実行することができる。
【0008】
一部の実施形態では、前駆細胞は、対象から得られたサンプルに由来する。前駆細胞は、幹細胞、始原生殖細胞様細胞（ＰＧＣＬＣ）又は初期生殖細胞であってよい。一部の実施形態では、幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又は精原幹細胞である。
【0009】
一部の実施形態では、阻害ステップ（ｉｉ）及び処理ステップ（ｉｉｉ）は、増殖ステップ（ｉｖ）中に前駆細胞による生殖系列リプログラミング応答性（ＧＲＲ）遺伝子の発現の誘導につながる。ＧＲＲ遺伝子の発現は、転写活性化因子、例えばＴｅｔ１の動員に関連するか、又はそれによって誘導することができる。Ｔｅｔ１は前駆細胞によって発現されてよく、かつ／又は、Ｔｅｔ１は外因的に提供されてよい（例えば、外因的にＴｅｔ１を発現する核酸を送達することにより、Ｔｅｔ１の内因性発現を増進又は刺激することにより、かつ／又は、Ｔｅｔ１を外因性タンパク質の形態で提供することにより）。外因的に提供されるＴｅｔ１は、１つ以上の特定のゲノム領域を標的とする融合コンストラクトの形態であってよい。例えば、Ｔｅｔ１融合コンストラクトは、本明細書に開示されるＧＲＲ遺伝子のうち１つ以上の発現に関与するプロモーター配列又はエンハンサー配列を標的としてよい。転写活性化因子として効果的なレベルのＴｅｔ１を提供することにより、ＧＲＲ遺伝子の発現が増進される。本発明の方法により、ＧＲＲ遺伝子発現を増進することが可能であり、これらの方法は、Ｔｅｔ１発現を増加又は誘導すること、及び／又は、Ｔｅｔ１を１つ以上のＧＲＲ遺伝子に標的化することを含んでよい。
【0010】
また、本発明の方法は、細胞における１つ以上のＧＲＲ遺伝子の発現レベルの検出及び／又は定量化を含んでよい。ＧＲＲ遺伝子を表１に列挙する。発現レベルを検出及び／又は定量化する方法は、当技術分野で周知である。例えば、遺伝子のｍＲＮＡレベルは、例えばＲＴ－ＰＣＲによって測定することができる。タンパク質発現レベルを、例えばＥＬＩＳＡ等のアッセイによって測定することができる。１つ以上のＧＲＲ遺伝子の発現は、前駆細胞から減数分裂能のある細胞への変換の前、最中又は後に測定することができる。好ましくは、１つ以上のＧＲＲ遺伝子の発現は、ステップ（ｉｖ）の後に、減数分裂能のある細胞において測定される。測定されるＧＲＲ遺伝子は、Ｄａｚｌ、Ｈｏｒｍａｄ１、Ｓｙｃｐ２、Ｓｙｃｐ３、Ｍａｅ１、Ｆｋｂｐ６のうち１つ以上であってよい（表１を参照）。本発明の一部の実施形態では、ポリコーム抑制複合体の阻害剤は、ＰＲＣ１阻害剤である（ＰＲＣ１複合体が選択的に阻害されることを意味する）。本発明の他の実施形態では、ポリコーム抑制複合体の阻害剤は、ＰＲＣ２阻害剤である（ＰＲＣ２複合体が選択的に阻害されることを意味する）。更なる実施形態では、ポリコーム抑制複合体の阻害剤は、ＰＲＣ１とＰＲＣ２の両方を阻害する。
【0011】
一部の実施形態では、ポリコーム抑制複合体の阻害剤は、ＰＲＴ４１６５である。他の実施形態では、ポリコーム抑制複合体の阻害剤は、ポリコーム抑制複合体の構成要素、例えば、ＰＲＣ１又はＰＲＣ２の構成要素の発現を選択的にノックダウンするＲＮＡｉ分子である。
【0012】
本発明の一部の実施形態では、ＤＮＡメチル化の阻害（方法のステップ（ｉｉ））は、ゲノムＤＮＡメチル化を低減する薬剤で前駆細胞を処理することによって実行される。本開示に関連して、細胞を「処理する」とは、細胞を薬剤に「接触させる」こと、すなわち曝露することを意味するものと理解される。更に、「阻害する」は、「低減する」と「完全に防止する」の両方を含む。例えば、前駆細胞は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤により、ＤＮＡメチル化の蓄積を防止する薬剤により、又はＤＮＡメチル化の維持を阻害する薬剤により、処理されてよい（それと接触させられてよい）。５－アザ－２－デオキシシチジン（５－アザ－ｄｃ）は、ＤＮＡメチル化を阻害し、ＤＮＡメチル化の維持も阻害する薬剤である。
【0013】
ゲノムＤＮＡメチル化を低減する薬剤がＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤である実施形態では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤は、ＤＮＭＴ１阻害剤であってよい。例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤は、ＳＧＩ１０２７又は５－アザシチジンであってよい。或いは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤は、ＤＮＡメチル化機構の構成要素の発現をノックダウンするＲＮＡｉ分子であってよい。ＲＮＡｉ分子は、ｓｉＲＮＡ分子又はｍｉＲＮＡ分子（又はいずれかの前駆体）であってよい。
【0014】
代替の実施形態では、ＤＮＡメチル化の阻害（方法のステップ（ｉｉ））は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子を不活性化するための遺伝子編集等の技術を用いることによって、実行されてよい。したがって、ＤＮＡメチル化を阻害する様々な手段を、減数分裂能のある細胞の作製に用いることができる。例えば、メチル化機構の遺伝子ノックアウトや、メチル化機構の化学的遮断を用いることができる。
【0015】
第２の態様では、本発明は、本明細書に記載される方法によって作製された、減数分裂能のある細胞を提供する。減数分裂能のある細胞は、レチノイン酸で処理されてよい。レチノイン酸は、減数分裂能のある細胞において配偶子形成を誘導することが知られている。
【0016】
したがって、第３の態様では、本発明は、減数分裂能のある細胞をレチノイン酸で処理することにより、本発明の減数分裂能のある細胞において配偶子形成を誘導する方法を提供する。一部の実施形態では、配偶子形成は精子形成である。他の実施形態では、配偶子形成は卵形成である。
【0017】
更なる態様では、本発明は、減数分裂能のある細胞のインビトロ作製のためのキットを提供する。本発明のキットは、メチル化阻害剤と、ポリコーム抑制複合体の阻害剤とを含む。一部の実施形態では、キットはレチノイン酸も含む。また、キットは、本発明の方法に用いられる適切なハードウェア、例えば試験管、培養プレート等を含んでよい。
【0018】
更なる態様では、本発明は、哺乳動物の受胎能を評価する方法を提供する。本発明のこの態様では、１つ以上の生殖系列リプログラミング応答性（ＧＲＲ）遺伝子の核酸配列及び／又はエピジェネティック状態及び／又は遺伝子発現レベルが、哺乳動物から得られた細胞において決定される。
【0019】
関連する態様では、本発明は、細胞の減数分裂能を決定する方法を提供し、本方法は、細胞のゲノムＤＮＡ中の１つ以上の生殖系列リプログラミング応答性（ＧＲＲ）遺伝子の核酸配列、エピジェネティック状態及び／又は発現を決定することを含む。また、本発明は、表１に示される１つ以上のＧＲＲ遺伝子の発現又はエピジェネティック状態又は発現を検出するプローブから成る又は本質的に成る、プローブの群を有するキット及び／又はアッセイプレートを提供する。
【表1】
【0020】
本明細書に記載されるように、本発明の一部の実施形態は、ＧＲＲ遺伝子（例えば配列、エピジェネティック状態又は発現レベル）を検出すること、又はＧＲＲ発現を誘導することを伴う。これらの実施形態は、表１から選択される１つ以上のＧＲＲ遺伝子、例えば表１から選択されるいずれか２個、いずれか３個、いずれか４個、いずれか５個、いずれか６個、いずれか７個、いずれか８個、いずれか９個、いずれか１０個、いずれか１１個、いずれか１２個、いずれか１３個、いずれか１４個、いずれか１５個、いずれか１６個、いずれか１７個、いずれか１８個、いずれか１９個、又はいずれか２０個の遺伝子を含む、又はそれから成る、又は本質的にそれから成る一群の遺伝子の検出又は誘導を伴ってよい。一部の実施形態では、表１から選択される遺伝子は、Ｄａｚｌ、Ｈｏｒｍａｄ１、Ｓｙｃｐ２、Ｓｙｃｐ３、Ｍａｅ１、Ｆｋｂｐ６のうちの１つ以上を含んでよい。他の実施形態では、表１から選択される遺伝子は、Ｄａｚｌ、Ｈｏｒｍａｄ１、Ｓｙｃｐ２、Ｓｙｃｐ３、Ｍａｅ１、Ｆｋｂｐ６のいずれか又は全てを除外してよい。
【0021】
治療用途
【0022】
本発明の方法及び製品は、特に不妊の治療において治療用途がある。例えば、本明細書に記載されるように、本発明の方法によって作製される減数分裂能のある細胞は、例えばレチノイン酸（ＲＡ）での処置により、配偶子形成を経るように誘導することができる。このようにして作製されたガメトサイト（すなわち精母細胞；卵母細胞）は、本発明の更なる態様を構成する。本発明のガメトサイトには、例えば、不妊個体への養子移植に治療用途がある。本発明の精母細胞は、雄の不妊患者の精巣に養子移入され得ることが想定される。本発明の卵母細胞は、雌の不妊患者の卵巣に養子移入され得ることが想定される。これらのガメトサイトは、例えば、患者の細胞に由来するｉＰＳ細胞、精原幹細胞（ＳＳＣ）又はＰＧＣＬＣに対して発明の方法を実施することによって、患者自身の細胞に由来することができる。このアプローチにより、患者へのガメトサイトの自家養子移植が可能になる。
【0023】
本発明の更なる態様では、配偶子は、インビトロにおける本発明の上記ガメトサイトに由来する。このようにして、本発明は、治療的に用いることのできる、雄性配偶子、精子（精液）と雌性配偶子、卵子（卵）を提供する。例えば、本発明の配偶子は、体外受精（ＩＶＦ）用途に用いることができる。
【0024】
前駆細胞
【0025】
本明細書で説明されるように、本発明の方法は、体細胞前駆細胞を減数分裂能のある細胞に変換することが可能である。このサブセクションでは、前駆細胞として用いることのできる様々な種類の細胞について論じる。
【0026】
自然界では、減数分裂能のあるゴノサイトの前駆体は、始原生殖細胞である。ＰＧＣ様細胞（ＰＧＣＬＣ）の生成を目的とした現在のインビトロ系5,24-26では、ＰＧＣ発生の初期段階のみ再現に成功しており、生殖腺リプログラミングは、依然として、生殖腺体細胞の環境の状況でのみ克服し遂行することのできる障壁となっている5,24,25,27。本発明の一部の実施形態では、前駆細胞は、前述の従来技術の方法によって得られるＰＣＧＬＣである。
【0027】
本発明の他の実施形態では、前駆細胞は幹細胞、例えば胚性幹細胞である。ヒト胚性幹細胞は、前駆細胞の一種である。当技術分野では、ヒト胚を破壊することなくヒト胚性幹細胞を得ることができることが知られている（Ｃｈｕｎｇ他、２００８年）。マウス胚性幹細胞はまた、本発明の有効性を有用に示す一種の前駆細胞である。発明者らは、ＰＧＣにおけるＧＲＲ遺伝子のエピジェネティック調節が、血清成長マウス胚性幹細胞におけるそれと非常に類似していることを見出した。
【0028】
胚起源ではない多能性幹細胞もまた、本発明の方法における前駆細胞として用いることができる。多能性幹細胞は、以下を含む方法によって得ることができる。
【0029】
核移植によるリプログラミング。この技術は、体細胞から卵母細胞又は接合子への核の移植を伴う。場合によっては、これは、動物‐ヒトハイブリッド細胞の生成につながる可能性がある。例えば、細胞は、ヒト体細胞と動物卵母細胞若しくは接合体との融合、又はヒト卵母細胞若しくは接合体と動物体細胞との融合によって、作製することができる。
【0030】
胚性幹細胞との融合によるリプログラミング。この技術には、体細胞の胚性幹細胞との融合が含まれる。この技術は、上記の１のように、動物‐ヒトハイブリッド細胞の作成にもつながり得る。
【0031】
培養による自発的リプログラミング。この技術には、長期培養後の非多能性細胞からの多能性細胞の生成が含まれる。例えば、多能性胚性生殖（ＥＧ）細胞は、始原生殖細胞（ＰＧＣ）の長期培養によって生成されてきた（Ｍａｔｓｕｉ他、１９９２年）。骨髄由来細胞の長期培養後の多能性幹細胞の発生も報告されている（Ｊｉａｎｇ他、２００２年）。彼らは、これらの細胞を多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）と命名した。Ｓｈｉｎｏｈａｒａ他はまた、新生マウスの精巣からの生殖系列幹（ＧＳ）細胞の培養過程において多能性幹細胞を生成することができることを示し、彼らはこれを多能性生殖系列幹（ｍＧＳ）細胞と名付けた（Ｋａｎａｔｓｕ－Ｓｈｉｎｏｈａｒａ他、２００４年）。
【0032】
限定要因によるリプログラミング。例えば、マウス胚性又は成体線維芽細胞への転写因子（Ｏｃｔ－３／４、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ及びＫＬＦ４等）のレトロウイルス媒介導入によるｉＰＳ細胞の生成が、例えばＫａｊｉ他、２００２年によって記述されており、彼らはまた、２Ａペプチドに関連するｃ－Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ４及びＳｏｘ２のコード配列を含む単一の多タンパク質発現ベクターの非ウイルス性トランスフェクションについても記述しており、これは、マウス線維芽細胞とヒト線維芽細胞の両方をリプログラミングすることができる。この非ウイルス性ベクターによって作製されたｉＰＳ細胞は、多能性マーカーのロバストな発現を示し、インビトロ分化アッセイ及び成体キメラマウスの形成によって機能的に確認されたリプログラミング状態を示す。彼らは、胚性線維芽細胞から、多能性マーカーのロバストな発現を伴うリプログラミングされたヒト細胞株を確立することに成功した。人工多能性幹細胞には、胚の破壊を引き起こさない方法、より具体的には、ヒト又は哺乳動物の胚の破壊を引き起こさない方法によって、それらを得ることができるという利点がある。
【0033】
多能性幹細胞はまた、インビトロで卵割を停止し、桑実胚及び胚盤胞への発生に失敗した停止胚から得ることができ、単為生殖によって得ることができ、又は、単一の割球又は生検割球からのｈＥＳＣ系統に由来することができる。
【0034】
したがって、本発明の態様は、当該細胞が由来し得るヒト又は動物の胚の破壊を必然的に伴う方法によってのみ作製されていない細胞を用いることによって、実行又は実施することができる。この任意の限定は、特に、欧州特許庁の大審判廷の２００８年１１月２５日の決定Ｇ０００２／０６を考慮することを目的としている。
【0035】
他の実施形態では、ガメトゴニウム（gametogonium）（配偶子幹細胞）を前駆細胞として用いることができる。例えば、精原幹細胞（ＳＳＣ）は、本発明の方法に用いられる１つの好ましい前駆細胞タイプである。ＳＳＣは、精巣から、例えば精巣生検から抽出することができる。精巣吸引物は、ＳＳＣを含む細胞標品（抽出物）の供給源のひとつである。本発明の方法は、そのような精巣抽出物に対して直接実施することができ、又は、濃縮、選択及び／又は精製されたＳＳＣに対して実施することができると想定される。
【0036】
前駆細胞は、対象から得ることができる。対象は、哺乳動物の対象、例えばヒトの対象であってよい。本発明の一部の実施形態では、対象は不妊患者である。
【0037】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）
【0038】
本発明はまた、ポリコーム抑制複合体の構成要素又はＤＮＡメチル化機構の構成要素の治療的ダウンレギュレーションのための、当技術分野で既知の技術の使用を含む。これらは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の使用を含む。
【0039】
遺伝子発現を調節するために、スモールＲＮＡ分子を採用することができる。これらは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によるｍＲＮＡの標的化分解、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）によるｍＲＮＡの発生学的に調節された配列特異的翻訳抑制、標的化転写遺伝子サイレンシングを含む。
【0040】
ヘテロクロマチン複合体の標的化と、特定の染色体座でのエピジェネティック遺伝子サイレンシングにおける、ＲＮＡｉ機構とスモールＲＮＡの役割も実証されている。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）依存性の転写後サイレンシングは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）としても知られており、ｄｓＲＮＡ複合体が特定の相同遺伝子を標的として、短時間でサイレンシングを行うことができる現象である。それは、配列同一性を有するｍＲＮＡの分解を促進するためのシグナルとして機能する。２０－ｎｔ ｓｉＲＮＡは、一般に、遺伝子特異的サイレンシングを誘導するのに十分な長さであるが、宿主応答を回避するのに十分な短さである。標的遺伝子産物の発現の減少は広範囲に及ぶ可能性があり、ｓｉＲＮＡの少数の分子によって９０％のサイレンシングが誘導される。
【0041】
当技術分野では、これらのＲＮＡ配列は、それらの起源に応じて、「短鎖又は低分子干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）又は「マイクロＲＮＡ」（ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる。両方のタイプの配列を用いて、相補的ＲＮＡに結合し、ｍＲＮＡ除去（ＲＮＡｉ）をトリガーするか、又はｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を停止することにより、遺伝子発現をダウンレギュレートすることができる。ｓｉＲＮＡは、長い二本鎖ＲＮＡを処理することによって得られる。マイクロ干渉ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、内在的にコードされた小さな非コードＲＮＡであり、短いヘアピンの処理によって得られる。ｓｉＲＮＡとｍｉＲＮＡはどちらも、部分的に相補的な標的配列をもつｍＲＮＡの翻訳をＲＮＡ切断なしで阻害し、完全に相補的な配列をもつｍＲＮＡを分解することができる。
【0042】
したがって、本発明は、ポリコーム抑制複合体の構成要素、例えば、ＰＲＣ１及び／又はＰＲＣ２の発現のダウンレギュレーションのための、これらの配列の使用を提供する。
【0043】
ｓｉＲＮＡは典型的には二本鎖であり、ＲＮＡを介した標的遺伝子の機能のダウンレギュレーションの効果を最適化するために、ｓｉＲＮＡによるｍＲＮＡ標的の認識を仲介するＲＩＳＣ複合体によるｓｉＲＮＡの正しい認識を確実にし、ｓｉＲＮＡが宿主応答を低減するのに十分なほど短くなるように、ｓｉＲＮＡ分子の長さを選択することが好ましい。
【0044】
ｍｉＲＮＡは、典型的には一本鎖であり、ｍｉＲＮＡがヘアピンを形成できるようにする部分的に相補的な領域を有する。ｍｉＲＮＡは、ＤＮＡから転写されるがタンパク質には翻訳されないＲＮＡ遺伝子である。ｍｉＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡ配列は、ｍｉＲＮＡよりも長い。このＤＮＡ配列は、ｍｉＲＮＡ配列と、おおよその逆補体を含む。このＤＮＡ配列が一本鎖ＲＮＡ分子に転写されると、ｍｉＲＮＡ配列とその逆相補塩基対が、部分的に二本鎖のＲＮＡセグメントを形成する。マイクロＲＮＡ配列の設計は、当技術分野において既知である。
【図面の簡単な説明】
【0045】
次に、本発明の実施形態を、添付の図面を参照して例として説明する。
【0046】
【図1】エピジェネティックリプログラミング時の５ｍＣ及び５ｈｍＣの動態。ａ）マウスＰＧＣ発生時の重要事象。ｂ－ｃ）ｍＥＳＣとＥ９．５～Ｅ１３．５ ＰＧＣ（ＬＣ／ＭＳ）での個別の５ｍＣ（ｂ、左）と５ｈｍＣ（ｂ、右）及び複合５ｍＣ／５ｈｍＣ（ｃ）レベル。（ｂ）のアスタリスクは平均値を指す。調整ｐ値は、ＡＮＯＶＡとテューキーポストホックテストに基づく。（ｃ）の棒グラフは、（ｂ）に示した生物学的複製の中央値を示す。ｄ）Ｅ１０．５とＥ１２．５の間のゲノムの一意にマッピングされた部分から反復要素への５ｈｍＣの再分布。ｐ値は、ＡＮＯＶＡとテューキーポストホックテストの組合わせに基づく。ｅ）Ｅ１０．５及びＥ１２．５のＰＧＣにおける代表的な５ｈｍＣ免疫染色。スケールバーは１０μｍを表す。サンプルサイズとサンプルの収集方法に関する詳細は、統計と再現性のセクションで見ることができる。
【図2】Ｔｅｔ１は、ＤＮＡ脱メチル化を保護するが駆動しない。ａ－ｂ）Ｅ１３．５野生型及びＴｅｔ１－ＫＯ ＰＧＣにおける５ｈｍＣ（ａ）又は５ｍＣ（ｂ）に対する代表的な免疫染色。スケールバーは１０μｍを表す。ｃ－ｄ）野生型及びＴｅｔ１－ＫＯ ＰＧＣにおける全体的な５ｈｍＣ（ｃ）及び５ｍＣ（ｄ）のレベル（ＬＣ／ＭＳ）。サンプル数をグラフ上に示す。アスタリスクは平均値を指す。ｐ値は、両側Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定に基づく。ｅ）上図：Ｅ１４．５ Ｔｅｔ１－ＫＯ ＰＧＣの可変メチル化領域の割合（ｐ＜０．０５、＞１０％メチル化の差、ＲｎＢｅａｄｓソフトウェアから得られたｐ値）。下図：全てのＥ１４．５高メチル化２ｋＢウィンドウのＥ１２．５（中央）及びＥ１４．５（下）のＴｅｔ１－ＫＯ（赤）と野生型（青）ＰＧＣの複合５ｍＣ／５ｈｍＣレベル（ＲＲＢＳ）。Ｅ１０．５野生型ＰＧＣのＤＮＡ修飾レベルも示されている（上部パネル）。メジアン複合５ｍＣ／５ｈｍＣレベルは、垂直線で示される。サンプルサイズとサンプルの収集方法に関する詳細は、統計と再現性のセクションで見ることができる。
【図3】生殖系列リプログラミング応答性（ＧＲＲ）遺伝子。ａ）ＨＣＰ遺伝子クラスターのＰＧＣ発生の連続段階における、複合プロモーター５ｍＣ／５ｈｍＣレベル（右）、プロモーター５ｈｍＣレベル（中央）、又は遺伝子発現レベル（右）（方法を参照）。上側ヒンジと下側ヒンジは第１と第３の四分位数に対応し、中央線はメジアンに対応し、最大値と最小値はそれぞれ１．５×四分位範囲内の最高値又は最低値に対応する。ｂ）野生型ＰＧＣにおけるＥ１０．５とＥ１４．５の間のアップレギュレーションの有意性に基づいてランク付けされた、メチル化及び脱メチル化ＨＣＰ（クラスター３、図３Ａ）のＴＳＳを中心とするゲノム配列。各横線は１つの遺伝子を表す。赤の強度は、各列の上部に示される特徴の相対的な濃縮を示す。ＴＳＳ＋／－５ｋｂを示す。ｃ）生殖系列リプログラミング応答性（ＧＲＲ）遺伝子に関連する遺伝子オントロジー（ＧＯ）ｔｅｒｍ。調整ｐ－値はＤＡＶＩＤソフトウェアに基づく。サンプルサイズとサンプルの収集方法に関する詳細は、統計と再現性のセクションで見ることができる。
【図4】ＧＲＲ遺伝子活性化のエピジェネティック原理。ａ）Ｔｅｔ１－ＫＯ ＰＧＣにおけるＧＲＲ遺伝子発現動態；ｐ値は、両側対応ありウィルコクソン検定に基づく。ｂ）Ｅ１２．５又はＥ１４．５のＴｅｔ１－ＫＯ（赤）と野生型（青）ＰＧＣのＧＲＲ遺伝子での複合５ｍＣ／５ｈｍＣレベル（ＲＲＢＳ）。比較のために、ｍＥＳＣ３０（％；ＷＧＢＳ）での複合５ｍＣ／５ｈｍＣレベルを示す。ｐ値は、対応あり両側ウィルコクソン検定に基づく。ｃ－ｄ）ＧＲＲ遺伝子及びその他の関連遺伝子セットについて、Ｄｎｍｔ－ＴＫＯ（緑）又はＴｅｔ１－ＫＯ Ｄｎｍｔ－ＴＫＯと野生型ｍＥＳＣ（ｃ）の間、又は、野生型＋６ｈ ＰＲＴ４１６５処理（紫）、Ｄｎｍｔ－ＴＫＯ＋６ｈ ＤＭＳＯ処理（緑）若しくはＤｎｍｔ－ＴＫＯ＋６ｈ ＰＲＴ４１６５処理（黄）と野生型＋６ｈ ＤＭＳＯ処理ｍＥＳＣ（ｉｎ ｄ）の間の、Ｌｏｇ２倍率変化。ＦＷＥＲ調整ｐ値は、ＧＳＥＡソフトウェアに基づく（詳細については方法を参照）。サンプルサイズとサンプルの収集方法に関する具体的な詳細については、統計と再現性セクションで見ることができる。全ての箱ひげ図について、上側ヒンジと下側ヒンジは第１と第３の四分位数に対応し、中央線はメジアンに対応し、最大値と最小値はそれぞれ１．５×四分位範囲内の最高値又は最低値に対応する。
【図5】ＷＧＢＳデータセットの特性とＡｂａＳｅｑ法の検証。ａ）各対称ＣｐＧのＷＧＢＳカバレッジの分布。全ての箱ひげ図について、上側ヒンジと下側ヒンジは第１と第３の四分位数に対応し、中央線はメジアンに対応し、最大値と最小値はそれぞれ１．５×四分位範囲内の最高値又は最低値に対応する。ｂ）ＡｂａＳｅｑ法15の概要。ｃ－ｅ）Ｅ１４ ｍＥＳＣの全ての２ｋＢウィンドウ（最小４つの対称ＣｐＧ）での５ｈｍＣレベル間の相関を示す密度ヒートマップ：（ｃ）ＴＡＢ－Ｓｅｑ35（ｘ軸）及びＡｂａＳｅｑ15（ｙ軸）；（ｄ）ＴＡＢ－Ｓｅｑ35（ｘ軸）及びｈＭｅＤＩＰ36（ｙ軸）；又は（ｅ）ＡｂａＳｅｑ15（ｘ軸）及びｈＭｅＤＩＰ36（ｙ軸）。（ｃ－ｅ）については、ピアソン相関係数（ρ）を示す。サンプルサイズとサンプルの収集方法に関する具体的な詳細については、統計と再現性セクションで見ることができる。
【図6】Ｅ１０．５ ＰＧＣの５ｈｍＣレベルの更なる分析。ａ）Ｅ１０．５ ＰＧＣ（ｙ軸）及びＥ１４ ｍＥＳＣ15（ｙ軸）での２ｋＢウィンドウ（最小４つの対称ＣｐＧ）当たりの５ｈｍＣレベル間の相関を示す密度ヒートマップ。ピアソン相関係数（ρ）を示す。ｂ）Ｅ１０．５ ＰＧＣ（左）又はＥ１４ ｍＥＳＣの様々な調節エレメントでの５ｈｍＣレベル（ＡｂａＳｅｑ）15。ＡＮＯＶＡ及びダネットポストホックテストに基づくｐ値。全ての箱ひげ図について、上側ヒンジと下側ヒンジは第１と第３の四分位数に対応し、中央線はメジアンに対応し、最大値と最小値はそれぞれ１．５×四分位範囲内の最高値又は最低値に対応する。ｃ）Ｅ１０．５ ＰＧＣの異なるレベルで発現した遺伝子全体のＥ１０．５ ＰＧＣにおける５ｈｍＣレベル（上部パネル、ＡｂａＳｅｑ）と複合５ｍＣ／５ｈｍＣレベル（下部パネル、ＷＧＢＳ）を示すメタ遺伝子プロット。ｄ－ｅ）ＣｐＧアイランド（ｄ）又はアクティブな推定エンハンサー（ｅ）全体のＥ１０．５ ＰＧＣにおける５ｈｍＣレベル（上部パネル、ＡｂａＳｅｑ）と複合５ｍＣ／５ｈｍＣレベル（下部パネル、ＷＧＢＳ）を示すメタ遺伝子プロット。ｆ）ＴＡＢ－Ｓｅｑ35（％；明るい緑）又はＡｂａＳｅｑ15（リードカウント；濃い緑色）によって決定されたＥ１４ ｍＥＳＣ、又はＡｂａＳｅｑ（リードカウント；オレンジ）によって決定されたＥ１０．５ ＰＧＣにおける、ＩＣＲでの５ｈｍＣレベルを示す棒グラフ。サンプルサイズとサンプルの収集方法に関する具体的な詳細については、統計と再現性セクションで見ることができる。
【図7】ＰＧＣにおける５ｍＣ及び５ｈｍＣの動態の更なる分析。ａ）Ｅ１０．５とＥ１２．５の間のＰＧＣにおけるゲノムの一意にマッピングされた部分内の様々な特徴での、複合５ｍＣ／５ｈｍＣ（ＷＧＢＳ；左）レベル又は５ｈｍＣ（ＡｂａＳｅｑ；右）レベル。上側ヒンジと下側ヒンジは第１と第３の四分位数に対応し、中央線はメジアンに対応し、最大値と最小値はそれぞれ１．５×四分位範囲内の最高値又は最低値に対応する。ｂ）Ｅ１０．５とＥ１２．５の間のＰＧＣにおける様々なコンセンサス反復要素での複合５ｍＣ／５ｈｍＣ（ＷＧＢＳ；左）レベル又は５ｈｍＣ（ＡｂａＳｅｑ；右）レベル。アスタリスクは平均値を指す。サンプルサイズとサンプルの収集方法に関する具体的な詳細については、統計と再現性セクションで見ることができる。
【図8】５ｈｍＣは、マウス生殖腺ＰＧＣのＤＮＡ脱メチル化に続く新たな低メチル化領域を標的とする（図９ａも参照）。Ｅ１０．５生物学的複製（左）、Ｅ１０．５及びＥ１１．５ ＰＧＣ（中央）、Ｅ１０．５及びＥ１２．５ ＰＧＣ（右）の５ｈｍＣレベル間のピアソン相関（ρ）を示す密度ヒートマップ。ｂ）ステージ全体の５ｈｍＣ（オレンジ、ＡｂａＳｅｑ）又は複合５ｍＣ／５ｈｍＣ（灰、ＷＧＢＳ）の平均レベルに対して正規化された、各ステージの５ｈｍＣ（オレンジ、ＡｂａＳｅｑ）レベルと複合５ｍＣ／５ｈｍＣ（灰色、ＷＧＢＳ）レベルを示す平均Ｚスコア。平均の標準誤差は、小さすぎて表示することができない。ｃ－ｆ）Ｅ１０．５（ｃ、ｅ）またはＥ１１．５（ｄ、ｆ）ＰＧＣにおける合計（ｃ、ｄ；ｙ軸：ＡｂａＳｅｑリードカウント）又は相対（ｅ、ｆ；ｙ軸：（ＡｂａＳｅｑリードカウント）／（％；ＷＧＢＳ）の比）５ｈｍＣレベル化間の相関を示す密度ヒートマップと、Ｅ１０．５ ＰＧＣにおける最小２０％複合５ｍＣ／５ｈｍＣを用いた全ての２ｋＢウィンドウについて、これら２つのステージ（ｘ軸：％；ＷＧＢＳ）間のＰＧＣでの複合５ｍＣ／５ｈｍＣレベルの変化。ｇ）Ｅ１０．５ ＰＧＣにおける最小２０％複合５ｍＣ／５ｈｍＣを用いた全ての２ｋＢウィンドウについて、Ｅ１１．５ ＰＧＣにおける相対５ｈｍＣレベル（ｙ軸：（ＡｂａＳｅｑリードカウント）／（％；ＷＧＢＳ）の比）とＥ１１．５ ＰＧＣにおける複合５ｍＣ／５ｈｍＣレベル（ｘ軸：％；ＷＧＢＳ）との間の相関を示す密度ヒートマップ。ｈ）１）Ｅ１０．５又はＥ１１．５のいずれかで合計５ｈｍＣレベルに濃縮（緑、上側調整ポアソンｐ値＜０．０５）、又は２）Ｅ１０．５とＥ１１．５の両方で合計５ｈｍＣが枯渇（赤、下側調整ポアソンｐ値＜０．０５）のいずれかである、Ｅ１０．５ ＰＧＣにおける最小２０％合計ＤＮＡ修飾を用いた２ｋＢウィンドウについて、Ｅ１０．５とＥ１１．５の間のＰＧＣにおける複合５ｍＣ／５ｈｍＣレベルの減少を示す密度プロット。ｉ）１）Ｅ１０．５又はＥ１１．５のいずれかで合計５ｈｍＣレベルに濃縮（緑、上側調整ポアソンｐ値＜０．０５）、又は２）Ｅ１０．５とＥ１１．５の両方で合計５ｈｍＣが枯渇（赤、下側調整ポアソンｐ値＜０．０５）のいずれかである、Ｅ１０．５ ＰＧＣにおける最小２０％複合５ｍＣ／５ｈｍＣを用いた２ｋＢウィンドウについて、Ｅ１０．５ 及びＥ１１．５ ＰＧＣの複合５ｍＣ／５ｈｍＣレベル。全ての箱ひげ図について、上側ヒンジと下側ヒンジは第１と第３の四分位数に対応し、中央線はメジアンに対応し、最大値と最小値はそれぞれ１．５×四分位範囲内の最高値又は最低値に対応する。ｐ値は、両側ウィルコクソン検定に基づく。なお、密度ヒートマップの場合：１）スピアマン相関（ρｓ）を示し、２）赤線は、一般化された加法モデルによって決定された平滑化平均を表す。サンプルサイズとサンプルの収集方法に関する具体的な詳細については、統計と再現性セクションで見ることができる。
【図9】生殖腺ＰＧＣのＤＮＡ脱メチル化における５ｍＣ酸化を示唆する提案モデル。ａ）受動希釈が後に続く酸化のモデルにより、２つのステージ間で複合５ｍＣ／５ｈｍＣレベルが減少する程度（つまり、％；ＷＧＢＳ）と、この減少の直前のステージとこの減少に続くステージの両方での５ｈｍＣの合計レベルとの、正の相関が予測される。ｂ）能動メカニズムを介したＤＮＡ脱メチル化のトリガーにおける５ｍＣ酸化に関係するモデルにより、２つのステージ間で複合５ｍＣ／５ｈｍＣレベルが減少する程度（つまり、％；ＷＧＢＳ）と、この減少の直前のステージにおける相対５ｈｍＣレベルとの間の、正の相関が予測される（５ｈｍＣから５ｆＣへの更なる酸化は、５ｍＣから５ｃａＣへの完全な酸化における律速段階である39ので）。ｃ）ＤＮＡ脱メチル化の大波に続くＤＮＡ低メチル化の保護における５ｍＣの酸化に関係するモデルから、ＤＮＡ脱メチル化の大部分が２つのステージ間で失われた領域（つまり、新たに低メチル化された領域）の５ｈｍＣの相対レベルは、ＤＮＡ脱メチル化の大波の直後のステージにおいて高くなり、残留メチル化及び／又は異常なデノボメチル化が除去されることが予測される。よって、２つのステージ間で複合５ｍＣ／５ｈｍＣレベルが減少する程度（つまり％、ＷＧＢＳ）と、この減少直後のステージにおける相対５ｈｍＣレベルとの間には、限定的な相関を見ることができる。
【図10】エピジェネティックリプログラミング中のＴｅｔ１－ＫＯ ＰＧＣにおけるＴｅｔ１－３発現と遺伝子座特異的ＤＮＡメチル化。ａ）Ｅ１２．５ Ｔｅｔ１－ＫＯ及び野生型ＰＧＣにおけるＴｅｔ１総転写産物（左）又は欠失エクソン４（右）の発現。ＤＥＳｅｑ２によって計算された調整ｐ値（左）と、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定によって計算されたｐ値（右）。アスタリスクは平均値を指す。ｂ）Ｅ１２．５野生型及びＴｅｔ１－ＫＯ ＰＧＣにおけるＴｅｔ１タンパク質のＮ末端に対する代表的な免疫染色。スケールバーは１０μｍを表す。ｃ）Ｅ１２．５ Ｔｅｔ１－ＫＯ及び野生型ＰＧＣにおけるＴｅｔ２及びＴｅｔ３の発現。ＤＥＳｅｑ２によって計算された調整ｐ値。アスタリスクは平均値を指す。ｄ－ｅ）Ｅ１４．５ Ｔｅｔ１－ＫＯ ＰＧＣにおいて高メチル化と呼ばれるＩＣＲ及び生殖系列遺伝子プロモーターについて、Ｅ１２．５とＥ１４．５のＴｅｔ１－ＫＯ及び野生型ＰＧＣの雌（ｄ）又は雄（ｅ）における平均複合５ｈｍＣ／５ｍＣレベル（ＲＲＢＳ）。平均ＤＮＡ修飾レベルとｐ値は、ＲｎＢｅａｄｓソフトウェアによって計算した（詳細については方法を参照されたい）。ｆ－ｇ）Ｅ１２．５（ｆ）とＥ１３．５（ｇ）の雌のＴｅｔ１－ＫＯ及び野生型ＰＧＣにおける、Ｄａｚｌプロモーター（左）、Ｐｅｇ３ ＩＣＲ（中央）及びＩＧ－ＤＭＲ ＩＣＲ（右）の遺伝子座特異的バイサルファイトシーケンシング。サンプルサイズとサンプルの収集方法に関する具体的な詳細については、統計と再現性セクションで見ることができる。
【図11】生殖系列リプログラミング中のプロモーターＤＮＡメチル化クラスター分析。ａ）プロモーター領域での複合５ｍＣ／５ｈｍＣ動態のＫ平均クラスタリングによってグループ化された全ての遺伝子のＰＧＣ発生の連続段階における、複合プロモーター５ｍＣ／５ｈｍＣレベル（ＷＧＢＳ、右）、プロモーター５ｈｍＣレベル（ＡｂａＳｅｑ、中央）又は遺伝子発現レベル（ＲＮＡ－Ｓｅｑ、右）。ｂ－ｃ）プロモーター領域での複合５ｍＣ／５ｈｍＣ動態のＫ平均クラスタリングによってグループ化された、低ＣｐＧプロモーター（ＬＣＰ；ｂ）又は中間ＣｐＧプロモーター（ＩＣＰ；ｃ）のいずれかを含む遺伝子の３つのクラスターのＰＧＣ発生の連続段階における、複合プロモーター５ｍＣ／５ｈｍＣレベル（ＷＧＢＳ、右）、プロモーター５ｈｍＣレベル（ＡｂａＳｅｑ、中央）又は遺伝子発現レベル（ＲＮＡ－Ｓｅｑ、右）を示す箱ひげ図。全ての箱ひげ図について、上側ヒンジと下側ヒンジは第１と第３の四分位数に対応し、中央線はメジアンに対応し、最大値と最小値はそれぞれ１．５×四分位範囲内の最高値又は最低値に対応する。サンプルサイズとサンプルの収集方法に関する具体的な詳細については、統計と再現性セクションで見ることができる。
【図12】通常エピジェネティックリプログラミングと同時に活性化されるレトロトランスポゾンでの野生型及びＴｅｔ１－ＫＯ ＰＧＣのＤＮＡ修飾と発現動態。ａ－ｂ）野生型ＰＧＣにおいてＥ１０．５とＥ１４．５の間に性別非依存（ａ）、雄特有（ｂ、青のボックス）又は雌特有（ｂ）の方法で有意にアップレギュレートされた（調整ｐ値＜０．０５；Ｓｌｅｕｔｈ）代表的な反復要素について、野生型ＰＧＣにおける複合５ｍＣ／５ｈｍＣ動態（％；ＷＧＢＳ；左端）、野生型ＰＧＣにおける相対５ｈｍＣ動態（ＡｂａＳｅｑリードカウントはＥ１０．５に正規化、中央左）、野生型又はＴｅｔ１－ＫＯ ＰＧＣのいずれかにおける発現動態（ＴＰＭ（transcripts per million）；ＲＮＡ－Ｓｅｑ；中央右）、野生型及びＴｅｔ１－ＫＯ ＰＧＣにおける複合５ｍＣ／５ｈｍＣ動態（％；ＲＲＢＳ；右端）全てのケースに平均値を示す。Ｅ１４．５の野生型ＰＧＣとＴｅｔ１－ＫＯ ＰＧＣの間の差次的反復発現分析の調整ｐ値は、Ｓｌｅｕｔｈソフトウェアに基づく。サンプルサイズとサンプルの収集方法に関する具体的な詳細については、統計と再現性セクションで見ることができる。
【図13】ＰＧＣ及びｍＥＳＣにおけるＴｅｔ１及び５ｍＣによるＧＲＲ遺伝子調節の特性解析。ａ）ＧＲＲ遺伝子プロモーター及び他の関連プロモーターにおけるＣｐＧ密度；ｐ値は、両側ウィルコクソン検定に基づく。ｂ）ＰＧＣにおけるＧＲＲ遺伝子プロモーター並びに非活性化メチル化ＨＣＰ及び脱メチル化ＨＣＰでの平均５ｈｍＣ動態；ｐ値は、両側対応ウィルコクソン検定に基づく。ｃ）ＧＲＲ遺伝子及び他の関連遺伝子セットについて、Ｔｅｔ１－ＫＯと野生型のＥ１４．５雄（青）又は雌（ピンク）ＰＧＣの間のＬｏｇ２倍数変化。ＦＷＥＲ調整ｐ値は、ＧＳＥＡソフトウェアに基づく（詳細については方法を参照されたい）。ｄ）ＧＲＲ遺伝子及び他の関連遺伝子セットについて、Ｄｎｍｔ１－ＣＫＯ24ｍＥＳと野生型ｍＥＳＣ（緑）の間、又はＥ１４．５雌（ピンク）又は雄（青）の野生型ＰＧＣとＥ１０．５野生型ＰＧＣの間のＬｏｇ２倍数変化。ＦＷＥＲ調整ｐ値は、ＧＳＥＡソフトウェアに基づく（詳細については方法を参照されたい）。ｅ）Ｅ１２．５（右）及びＥ１４．５（左）Ｔｅｔ１－ＫＯ ＰＧＣにおけるＧＲＲプロモーターでの複合５ｍＣ／５ｈｍＣレベル（ｘ軸；Ｔｅｔ１－ＫＯ（ＲＲＢＳ；％）－ＷＴ（ＲＲＢＳ；％））と、ＧＲＲ遺伝子発現の変化（ｙ軸；ｌｏｇ２（Ｔｅｔ１－ＫＯ／ＷＴ））との間の相関。スピアマン相関を示す。ｆ）野生型、Ｄｎｍｔ－ＴＫＯ及びＴｅｔ１－ＫＯ Ｄｎｍｔ－ＴＫＯ ｍＥＳＣにおけるＴｅｔ１及びラミンＢタンパク質発現を示す代表的なウエスタンブロット。全ての箱ひげ図について、上側ヒンジと下側ヒンジは第１と第３の四分位数に対応し、中央線はメジアンに対応し、最大値と最小値はそれぞれ１．５×四分位範囲内の最高値又は最低値に対応する。全ての図について、サンプルサイズとサンプルの収集方法に関する具体的な詳細については、統計と再現性セクションで見ることができる。サンプルサイズとサンプルの収集方法に関する具体的な詳細については、統計と再現性セクションで見ることができる。
【図14】ｍＥＳＣにおけるＧＲＲ遺伝子プロモーターのエピジェネティック特性解析。ａ）血清含有培地で増殖した野生型ｍＥＳＣにおける、ＧＲＲ遺伝子と、Ｅ１０．５とＥ１４．５の間に雄雌両方のＰＧＣで活性化された非ＧＲＲ遺伝子と、非ＧＲＲメチル化及び脱メチル化ＨＣＰ遺伝子のＴＳＳを中心としたゲノム配列。各横線は１つの遺伝子を表し、赤の強度は、各列の上部に示される特徴の相対濃縮を示す。ＴＳＳと、ＴＳＳの５ｋｂ上流及び下流の配列を示す。ｂ－ｆ）以下のレベルを表す箱ひげ図：（ｂ）複合５ｍＣ／５ｈｍＣレベル（ＷＧＢＳ）30；（ｃ）５ｈｍＣ（ＡｂａＳｅｑ）15；（ｄ）Ｔｅｔ１（ＣｈＩＰ－Ｓｅｑ）21；（ｅ）Ｒｉｎｇ１ｂ（ＣｈＩＰ－Ｓｅｑ）38及び（ｆ）血清含有培地で増殖した野生型ｍＥＳＣにおけるＧＲＲ遺伝子及び他の関連遺伝子セットのいずれかのプロモーターでのＨ２Ａｕｂレベル（ＣｈＩＰ－Ｓｅｑ）37。全ての箱ひげ図について、上側ヒンジと下側ヒンジは第１と第３の四分位数に対応し、中央線はメジアンに対応し、最大値と最小値はそれぞれ１．５×四分位範囲内の最高値又は最低値に対応する。ｐ値は、両側ウィルコクソン検定に基づく。ｇ）血清含有培地で増殖した野生型及びＴｅｔ１－ＫＯ ｍＥＳＣにおけるＧＲＲ遺伝子（左）と、ＰＧＣリプログラミング中に最初にメチル化され、続いて脱メチル化される非ＧＲＲ ＨＣＰ遺伝子（右）の、ＴＳＳ周辺のメジアンＨ３Ｋ４ｍｅ３レベル（ＣｈＩＰ－Ｓｅｑ）30を示すメタ遺伝子プロット。ｐ値は、ＴＳＳ－１ｋＢ／５００ｂｐの領域の対応両側ウィルコクソン検定に基づく。サンプルサイズとサンプルの収集方法に関する具体的な詳細については、統計と再現性セクションで見ることができる。
【図15】ＰＧＣ及びｍＥＳＣにおけるＰＲＣ１及び５ｍＣによるＧＲＲ遺伝子調節の特性解析。ａ）野生型と比較した場合の、Ｅ１１．５及び／又はＥ１２．５ ＰＲＣ１条件付きノックアウトＰＧＣにおいて、ＧＲＲ遺伝子と有意にアップレギュレートされた遺伝子との間の重複26。超幾何検定に基づくｐ値。ｂ）野生型又はＤｎｍｔ－ＴＫＯ ｍＥＳＣ＋６ｈ ＤＭＳＯ、及び野生型又はＤｎｍｔ－ＴＫＯ ｍＥＳＣ＋６ｈ ＰＲＴ４１６５（ＰＲＣ１阻害剤）における、Ｈ２Ａｕｂ及びＨ２Ａレベルを示す代表的なウエスタンブロット。ｃ）ｍＥＳＣにおける５ｍＣ及び／又はＰＲＣ１リプログラミングに対する依存性に応じたＧＲＲ遺伝子の分類（詳細については方法を参照）。サンプルサイズとサンプルの収集方法に関する具体的な詳細については、統計と再現性セクションで見ることができる。
【図16】内因性のＰＧＣからゴノサイトへの移行のモデル。ＰＧＣからゴノサイトへの移行と正常な配偶子形成に関与する生殖系列リプログラミング応答性（ＧＲＲ）遺伝子のタイムリーかつ効率的な活性化には、全体的なＤＮＡ脱メチル化の開始と、Ｔｅｔ１動員と、ＰＲＣ１媒介抑制の除去との相互作用が必要である。ＧＲＲ遺伝子活性化には、Ｔｅｔ１のＤＮＡ脱メチル化依存機能（異常な残留／デノボプロモーターＤＮＡメチル化に対する保護）と非依存機能（遺伝子プロモーター３６へのＯＧＴの潜在的な動員、ＳＥＴ１／ＣＯＭＰＡＳＳ３８を介したＨ３Ｋ４ｍｅ３の蓄積を促進する等）の両方が重要である。
【図17】レチノイン酸に応答した遺伝子発現の変化。マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）をレチノイン酸（ＲＡ）で処理した。Ｊ１細胞株は、Ｄｎｍｔ１／Ｄｎｍｔ３ａ／Ｄｎｍｔ３ｂトリプルノックアウトであるので、Ｊ１「ＴＫＯ」細胞がＤＮＡメチル化機構を欠いていることとの比較に用いられた。黒いバーはそれぞれ、Ｊ１対照と比較して、ＴＫＯ細胞におけるＤａｚｌ発現、Ｈｏｒｍａｄ１発現及びＭａｅ１発現の倍率変化を示す（いずれもＲＡで処理されていない）。灰色のバーはそれぞれ、ＲＡで処理されていないＪ１細胞と比較した、ＲＡで処理されたＪ１細胞におけるＤａｚｌ発現、Ｈｏｒｍａｄ１発現及びＭａｅ１発現の倍率変化を示す。白いバーはそれぞれ、ＲＡで処理されていないＪ１細胞と比較した、ＲＡで処理されたＴＫＯ細胞におけるＤａｚｌ発現、Ｈｏｒｍａｄ１発現及びＭａｅ１発現の倍率変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【0047】
本発明は、上記の例示的な実施形態に関連して説明されているが、本開示を考慮したとき、当業者には多くの均等な修正及び変形が明らかになるであろう。したがって、上記の本発明の例示的な実施形態は、例示であり、限定ではないと見なされる。本発明の主旨及び範囲から逸脱することなく、説明された実施形態に対する様々な変更を行うことができる。
【0048】
エピジェネティックリプログラミングにより、始原生殖細胞からゴノサイトへの移行が可能となる
【0049】
配偶子は、全能性接合子を生成する能力を通して次世代を生み出すことのできる、高度に特殊化した細胞である。マウスでは、生殖細胞は、およそ胎生期（Ｅ）６．２５１（図１ａ）から始まる始原生殖細胞（ＰＧＣ）としての発生中の胚において、最初に特定される。その後の発生中の生殖腺への移行に続いて、ＰＧＣは、Ｅ１０．５／Ｅ１１．５で、５－メチルシトシン（５ｍＣ）のゲノム全体の喪失を含む2-5,7-11広範なエピジェネティックリプログラミングの高まりを経る2-11（図１ａ）。このプロセスの根本的な分子メカニズムは謎のままであり、結果として、我々は、インビトロでこの生殖系列発生のステップを再現することができない12-14。統合的アプローチを用いて、発明者らは、この複雑なリプログラミングプロセスには、配偶子の生成と減数分裂に関与する生殖系列リプログラミング応答性（ＧＲＲ）遺伝子の重要なセットの活性化を可能にするために、プロモーター配列の特性と、ＤＮＡ（脱）メチル化と、ポリコーム（ＰＲＣ１）複合体と、Ｔｅｔ１のＤＮＡ脱メチル化に依存する機能と依存しない機能の両方との間の調整された相互作用が含まれることとを示す。また、我々の結果から、生殖腺ＰＧＣにおけるＤＮＡ脱メチル化を保護するが駆動はしないというＴｅｔ１の役割も、予想外に明らかとなった。まとめると、我々の成果により、生殖腺の生殖系列リプログラミングの基本的な生物学的役割が明らかになり、また、インビトロで完全な配偶子形成を再現することに役立つであろうＰＧＣから生殖細胞への移行のエピジェネティック原理が特定される。
【0050】
生殖腺の生殖系列リプログラミングの潜在的な役割と根本的な分子メカニズムに対処するために、発明者らは、まず、以前からＰＧＣのＤＮＡ脱メチル化に関与いるとされている3,6,9-11５ｍＣと５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）の動態及び関係を調査することに着手した。発明者らは、これを定量的に、そして全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ＷＧＢＳ、図５ａ）及びＡｂａＳｅｑ15（図５ｂ－ｅ）と組み合わせた液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を用いて単一塩基分解能で実施した。ＷＧＢＳは、５ｍＣと５ｈｍＣの複合レベルに関する情報を提供し16、ＡｂａＳｅｑ15は、特定のサンプル内のゲノム全体、ＬＣ／ＭＳと組み合わせた場合はサンプル間で、５ｈｍＣレベルのロバストな部位特異的定量化と正確な比較を可能にする（方法、図５ｂ－ｅを参照）。
【0051】
ＬＣ／ＭＳにより、発明者らは、ゲノム５ｍＣの全体レベルは、遊走（Ｅ９．５）ＰＧＣと初期生殖腺（Ｅ１０．５）ＰＧＣの間で安定しており、その後、Ｅ１０．５とＥ１１．５の間の大幅な減少と、Ｅ１１．５とＥ１３．５の間のはるかに限定されたＤＮＡ脱メチル化が生じることを観察した（図１ｂ）。５ｈｍＣに関して、ＬＣ／ＭＳ分析により、驚くべきことに、ＰＧＣにおける全体レベルが、血清を含む培養条件で増殖したマウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）のレベルよりも低いことが明らかとなった（図１ｂ）。更に、ＰＧＣにおける全体５ｈｍＣレベルは、Ｅ９．５とＥ１３．５の間で比較的一定であり、Ｅ１２．５から雌においてわずかな減少が見られる（図１ｂ）。重要なことに、５ｈｍＣレベルは、Ｅ１０．５での合計５ｍＣレベル又はＥ１０．５とＥ１１．５の間で失われた５ｍＣの量よりも常に１桁低く（図１ｂ－ｃ）、以前に示唆されているように3,17、ＤＮＡ脱メチル化が全体的に５ｈｍＣレベルの相互増加を伴わないことを実証している（図９ａ）。
【0052】
我々のＬＣ／ＭＳ測定結果と一致して、ＷＧＢＳ分析により、Ｅ１０．５とＥ１１．５の間の複合５ｍＣ／５ｈｍＣのほぼ完全な喪失が、ゲノムの一意にマッピングされた領域（uniquely mapped region）内の特徴で明らかになり、Ｅ１１．５とＥ１２．５の間では更に限定されたＤＮＡ脱メチル化が観察された（図７ａ）。以前に示唆されたように8、ＬＩＮＥ－１ＡやＥＲＶ－ＩＡＰレトロトランスポゾン等の一部の反復要素は、Ｅ１２．５ ＰＧＣにおいて比較的高いレベルの複合５ｍＣ／５ｈｍＣを保ったが、ＤＮＡメチル化の喪失もコンセンサス反復配列で観察された（図７ｂ）。Ｅ１０．５ ＰＧＣでのＡｂａＳｅｑによる５ｈｍＣ局在の詳細な分析により、全体的なレベルは低いものの（図１ｂ）、ＰＧＣでの５ｈｍＣ局在は、インプリント制御領域（ＩＣＲ；図６ａ、ｂ、ｆ）でさえ、血清成長ｍＥＳＣのそれと著しく類似していることが明らかになった。全体として、５ｈｍＣは、推定活性エンハンサーで濃縮され、遺伝子間領域及び遺伝子体に存在し、プロモーターで枯渇し、ＣｐＧアイランドの大部分では非存在であった（図６ｂ－ｆ）．転写に関しては、プロモーター領域の５ｍＣと５ｈｍＣの両方が、遺伝子発現レベルと逆の関係を示す（図６ｃ）。遺伝子体内では、５ｍＣと５ｈｍＣは、検出可能な発現のない遺伝子と比較して発現遺伝子で明らかに濃縮されているが、５ｈｍＣでは遺伝子発現との非線形関係が観察される一方、複合５ｍＣ／５ｈｍＣレベルは明確な正の相関を示す（図６ｃ）。
【0053】
検討された発生ステージにわたる５ｈｍＣパターンの詳細な分析により、５ｈｍＣの大部分がゲノムの一意にマッピングされた領域から失われ、反復要素に再局在化していることが明らかになった（図１ｄ、図７ａ－ｂ）。この再局在化は、免疫蛍光染色によっても明らかに明白であった（図１ｅ）。よって、我々のデータは、ゲノムの一意にマッピングされた領域全体にわたって、ＰＧＣにおいて５ｍＣと５ｈｍＣの両方が失われていることを示すが、５ｈｍＣの異なるキネティクスでは、より緩やかな減少を示している（図８ｂ）。しかしながら、これは、ステージ間のピアソンとスピアマンの相関が悪いことから分かるように、細胞分裂による５ｈｍＣの受動希釈3とは一致しなかった（図８ａ、図９ａ）。逆に、発明者らは、５ｈｍＣはＰＧＣにおける動的マークであると結論付けている。
【0054】
次に、全ての初期メチル化２ｋｂウィンドウ（つまり、Ｅ１０．５で最小２０％メチル化）について、Ｅ１０．５とＥ１２．５の間の生殖腺ＰＧＣにおける５ｈｍＣ蓄積とＤＮＡ脱メチル化の関係を調査した。５ｈｍＣ中間体を含むＤＮＡ脱メチル化から、５ｈｍＣの出現と５ｍＣの喪失との直接的な相関が予測される（図９ａ－ｂ）。発明者らの驚いたことに、Ｅ１０．５又はＥ１１．５での合計又は相対５ｈｍＣレベルと、これらのステージ間で複合５ｍＣ／５ｈｍＣレベルが低下する程度との間に、相関は観察されなかった（図８ｃ－ｆ）。しかしながら、全ての初期メチル化２ｋｂウィンドウについて、Ｅ１１．５での相対５ｈｍＣレベルと複合５ｍＣ／５ｈｍＣレベルの間に負の相関が観察される（図８ｇ）。よって、５ｈｍＣは、元のＤＮＡメチル化レベルに関係なく、Ｅ１１．５で新たに低メチル化された領域での複合５ｍＣ／５ｈｍＣのうちはるかに高い割合を占める。５ｈｍＣ枯渇領域は、５ｈｍＣに富む領域よりもＥ１１．５で５ｍＣをわずかに多く含むが、Ｅ１０．５とＥ１１．５の両方のＰＧＣにおいて５ｈｍＣが枯渇した配列でも、これら２つのステージ間でかなりのＤＮＡ脱メチル化が起こり（図８ｈ－ｉ）、これは、検出可能な５ｈｍＣの存在が生殖腺ＰＧＣにおける５ｍＣの喪失の前提条件ではないことを示している。よって、我々の所見から、全体的なＤＮＡ脱メチル化の最初の高まりではなく、生殖細胞におけるＤＮＡ脱メチル化後の遺伝子座特異的５ｍＣレベルの調節において、５ｈｍＣの関与が示唆される（図９ｃ）。
【0055】
この所見を拡大するために、発明者らは、以前に公開されたＴｅｔ１－ＫＯマウスモデル18を使用した（図１０ａ－ｃ）。初期ＬＣ／ＭＳ分析により、Ｅ１０．５ Ｔｅｔ１－ＫＯ生殖細胞において、Ｔｅｔ１の喪失が全体的な５ｈｍＣレベルの約５０％の低下につながることが明らかになった（図２ｃ）。Ｅ１２．５での高レベルのＴｅｔ１発現と一致して3,9,11（図１０ａ－ｃ）、ＬＣ／ＭＳ分析により、Ｔｅｔ１が脱メチル化ＰＧＣにおける主要な５ｍＣオキシゲナーゼであることが確認され、Ｅ１４．５ Ｔｅｔ１－ＫＯ生殖細胞において、全体的な５ｈｍＣレベルの約８５％の低下が観察された（図２ａ、ｃ）。重要なことに、Ｔｅｔ１－ＫＯ ＰＧＣと野生型ＰＧＣの両方のゲノムは、Ｅ１３．５までに５ｍＣのほぼ完全な枯渇に達し（図２ｂ、ｄ）、Ｔｅｔ１を介した５ｍＣ酸化が、生殖腺ＰＧＣにおけるＤＮＡ脱メチル化の大部分に直接関与していないことを明らかにした。
【0056】
ＬＣ／ＭＳ測定結果の裏付けとして、Ｅ１４．５ Ｔｅｔ１－ＫＯ ＰＧＣでは、ＲＲＢＳ（Reduced Representation Bisulfite Sequencing）により、限られた数の異なるメチル化領域のみが検出された（図２ｅ）。興味深いことに、これらの領域は、Ｔｅｔ１－ＫＯと野生型ＰＧＣの両方で最初に広範なＤＮＡ脱メチル化を経て、その後、特にＴ１１－ＫＯ ＰＧＣのＥ１２．５とＥ１４．５の間で、５ｍＣレベルが増加している（図２ｅ）。対照的に、野生型生殖細胞では、これらのステージの間に５ｍＣレベルは安定し、かつ／又は、わずかに更に低下している（図２ｅ）。同じＤＮＡ脱メチル化／再メチル化キネティクスは、以前に報告された9,10、ＲＲＢＳによってＥ１４．５ Ｔｅｔ１－ＫＯ ＰＧＣにおいて高メチル化されていることが判明した生殖系列遺伝子プロモーター及びＩＣＲのいくつかの例でも観察された（図１０ｄ－ｅ）。５ｍＣの大幅な濃縮は、脱メチル化ＰＧＣでの標的化バイサルファイトシーケンシングによってＤａｚｌプロモーターにおいて実際に観察されるが、Ｐｅｇ３及びＩＧ－ＤＭＲ ＩＣＲで観察される高メチル化の程度は、実際には非常に限定的である（図１０ｆ－ｇ）。更に、３つの領域全てについて、完全なメチル化を保っているクローンはほとんどなかったが、多くのクローンには、Ｔｅｔ１－ＫＯ ＰＧＣにおける異常な残留／デノボＤＮＡメチル化を除去する確率論的失敗と一致する不均一なメチル化パターンがあった（図１０ｆ－ｇ）。
【0057】
次に、観察された５ｍＣと５ｈｍＣの動態を、Ｅ１０．５－Ｅ１４．５ ＰＧＣに由来するＲＮＡ－Ｓｅｑデータセットと組み合わせて分析した（図１１）。プロモーターＤＮＡメチル化動態に基づく全ての遺伝子の初期クラスター分析により、ほとんどのプロモーターが完全に脱メチル化される一方で、全体的なＤＮＡ脱メチル化中に、高レベルの５ｍＣ／５ｈｍＣを保っている転写サイレンシングプロモーターの小さなサブセットが存在することが明らかになった（クラスター２、図１１ａ）。これらのプロモーターは、このエピジェネティック状態を決定する可能性の高い内因性レトロウイルスを含むＬＩＮＥ１及びＬＴＲと大幅に重複する（それぞれｐ値＝９．５×１０－２４、７．２×１０－８３、超幾何検定）（図７ｂ）。全体として、高レベルのプロモーター５ｍＣ及び５ｈｍＣがＥ１０．５リプログラミング前ＰＧＣにおける転写抑制と関連しているが、これらのマークの喪失は、一般に転写活性化にはつながらない（図１１ａ）。
【0058】
遺伝子の転写活性に対する５ｍＣの影響は、哺乳動物ではプロモーターＣｐＧ量に大きく依存することが示されているので19、発明者らは、特にｈｉｇｈ－ＣｐＧ（ＨＣＰ）、ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ－ＣｐＧ（ＩＣＰ）又はｌｏｗ－ＣｐＧ（ＬＣＰ）のいずれかのプロモーター19を伴う遺伝子でクラスター分析を実施した（図３ａ及び図１１ｂ－ｃ）。興味深いことに、これにより、生殖系列エピジェネティックリプログラミングの過程でＤＮＡが脱メチル化されるとともに、進行的な転写活性化を示す、一群のＨＣＰ遺伝子が生じた（クラスター３、図３ａ）。差次的発現分析により、これらの遺伝子は、ＰＧＣにおいてエピジェネティックリプログラミングと同時にアップレギュレートされた全ての遺伝子間で有意な濃縮を示し（ｐ値＜０．００１、超幾何検定）、４５の遺伝子が両方の性別で共通して活性化されることが確認された（図３ａ－ｃ）。プロモーターのメチル化動態とその活性化のタイミングを考慮して、発明者らは、これらの４５の遺伝子を「生殖系列リプログラミング応答性」（ＧＲＲ）遺伝子と呼ぶ（図３ｃ）。興味深いことに、ＧＲＲ遺伝子は、Ｄａｚｌ、Ｓｙｃｐ１－３、Ｍａｅｌ、Ｈｏｒｍａｄ１及びＲａｄ５１ｃを含む、配偶子の生成と減数分裂に関与する因子の有意な濃縮を示す（図３ｃ）。
【0059】
ＧＲＲ遺伝子（ｎ＝４５）がＤＮＡ脱メチル化を経るＨＣＰ遺伝子のサブセット全体（ｎ＝２２６；図３ａ－ｃ）の２５％未満を構成したことを考慮すると、ＤＮＡ脱メチル化は、メチル化されたＨＣＰの転写活性化のための重要な因子であり、更に他の因子が必要である可能性が高い。実際、ＧＲＲ遺伝子プロモーターは、他のメチル化ＨＣＰ及び脱メチル化ＨＣＰと比較して、非常に高いＣｐＧ密度と５ｈｍＣレベルの両方を示した（図１３ａ－ｂ）。また、プロモーターとしては異例なことに、ＤＮＡ脱メチル化の大きな高まりの直後に、ＰＧＣのＧＲＲ遺伝子プロモーターで５ｈｍＣレベルが一時的に増加したことも留意された（図７ａ、１３ｂ）。更に、それらの高いＣｐＧ密度と５ｈｍＣレベル20,21と一致して、ＧＲＲ遺伝子プロモーターは、ｍＥＳＣ21とＰＧＣ9の両方においてＴｅｔ１によって結合されることが示されている（図３ｂ）。
【0060】
観察されたＴｅｔ１の結合は、ＧＲＲ遺伝子のアップレギュレーションの程度がＴｅｔ１－ＫＯ ＰＧＣではかなり低いので、機能的に関連がある（図４ａ、図１３ｃ）。ＧＲＲ遺伝子プロモーターは、Ｅ１２．５までにＴｅｔ１の非存在下で通常のＤＮＡ脱メチル化を経るが、Ｅ１４．５ Ｔｅｔ１－ＫＯ ＰＧＣの後半でわずかな高メチル化を示す（図４ｂ）。しかしながら、この限定的なＤＮＡ高メチル化は、発現の低下との弱い相関しか示さない（図１３ｅ）。更に、Ｔｅｔ１－ＫＯ生殖細胞におけるＧＲＲ遺伝子の発現の低下は、メチル化の差異がない場合、Ｅ１２．５で既に明白であり（図４ａ－ｂ、図１３ｅ）、Ｔｅｔ１が５ｍＣ除去におけるその役割の外で転写調節因子として機能している可能性があることを示唆している21,22。ＧＲＲ遺伝子に加えて、転移因子（ＴＥ）は、生殖腺エピジェネティックリプログラミング中に５ｈｍＣの蓄積を示す（図７ｂ、図１２）。ＤＮＡメチル化の低下に加えて、一部のＴＥは、特に進化的な若いレトロトランスポゾンから、エピジェネティックリプログラミングと同時に転写活性化を示す（図１２）。興味深いことに、Ｔｅｔ１の欠如は、正常に活性化されたＴＥの転写活性化の程度も低下させるようである（図１２）。
【0061】
エピジェネティックリプログラミングとＧＲＲ遺伝子の活性化との間の因果関係を更にメカニズム的に探るために、発明者らは、インビトロモデルに目を向けた。血清成長ｍＥＳＣは生殖系列に制限されないが、ＧＲＲ遺伝子プロモーターでのエピジェネティック修飾が、リプログラミング前の生殖腺ＰＧＣにおいてインビボで観察されるものと非常に類似しているので、血清成長ｍＥＳＣは、理想的な系である（図１４ａ－ｄ）。本発明者らがインビボで観察したものと一致して、プロモーターＤＮＡの脱メチル化は、インビトロでも、ＧＲＲ遺伝子活性化にとって優位なエピジェネティックリプログラミング事象である。Ｄｎｍｔ－ＴＫＯ23 ｍＥＳＣは、ＧＲＲ遺伝子の発現の増加を示す（図４ｃ）。しかしながら、ＤＮＡメチル化が完全に存在しない場合でも、Ｔｅｔ１－ＫＯ Ｄｎｍｔ－ＴＫＯ ｍＥＳＣはＧＲＲ遺伝子をグループとして活性化できないので、これはＴｅｔ１の存在に大きく依存する（図４ｃ、図１３ｆ）。
【0062】
これらのインビトロ所見は、５ｍＣとＴｅｔ１の役割に関する我々のインビボデータを明確に裏付けたが、Ｄｎｍｔ－ＴＫＯ ｍＥＳＣ（図４ｃ）、又はＤｎｍｔ１（図１３ｄ）の条件付き削除によって早期ＤＮＡ脱メチル化を受けたＥ１０．５ ＰＧＣ（Ｄｎｍｔ１－ＣＫＯ）24（図１３ｄ）では、ＧＲＲ遺伝子がアップレギュレートされた程度は、比較的穏やかであった。よって、発明者らは、潜在的には他のエピジェネティック障壁を含む他の因子がＧＲＲ遺伝子発現を調節し得ると仮定した。これに関して、生殖腺エピジェネティックリプログラミングは、以前から様々な異なるレベルでのエピジェネティック情報の抹消と関連付けられており4,25、ポリコーム抑制複合体１（ＰＲＣ１）の除去は、ＤＮＡ脱メチル化Ｅ１１．５／Ｅ１２．５ ＰＧＣにおける減数分裂開始のタイミングを調整することが以前に示されている26。驚くべきことに、ＰＧＣにおけるＰＲＣ１削除に続いて異常にアップレギュレートされた遺伝子は、ＧＲＲ遺伝子の有意な濃縮を示し（図１５ａ）、血清成長ｍＥＳＣのＧＲＲ遺伝子のプロモーターは、Ｒｉｎｇ１ｂ結合及びＨ２ＡＫ１１９ｕｂで濃縮される（図１４ａ、ｅ、ｆ）。これに鑑みて、発明者らは、Ｄｎｍｔ－ＴＫＯ ｍＥＳＣに関連してＰＲＣ１の非常に特異的な化学的阻害を用いて、ＤＮＡメチル化とＰＲＣ１活性の両方を同時に無効にして、ＧＲＲ遺伝子調節におけるＤＮＡメチル化とＰＲＣ１の両方の役割を検証し、このようにして生殖腺エピジェネティックリプログラミングを模倣した。ＰＲＴ４１６５27によるｍＥＳＣの培養により、わずか６時間の培養後にＰＲＣ１を介したＨ２Ａユビキチン化が有意に阻害された（図１５ｂ）。５ｍＣ／ＰＲＣ１抑制の二重阻害は、驚くべきことに、４５のＧＲＲ遺伝子のうち３３の活性化につながり、５ｍＣ又はＰＲＣ１抑制の単独阻害では、それぞれ２５の遺伝子と１０の遺伝子が活性化された（図４ｄ、図１５ｃ）。組み合わせると、これらの所見は、生殖腺エピジェネティックリプログラミングが、ＧＲＲ遺伝子の発現を増強するために、エピジェネティック系の複合的な抹消4,25を伴うことを示している。
【0063】
我々の研究により、配偶子形成の正しい進行に重要な一連の生殖系列リプログラミング応答性（ＧＲＲ）遺伝子が特定された。これらの遺伝子は、５ｍＣと５ｈｍＣの両方が高レベルである独特なプロモーター配列特性を有し、Ｔｅｔ１及びＰＲＣ１の標的である。本開示は、ＤＮＡメチル化の喪失とＰＲＣ１抑制の組合わせが、ＧＲＲ遺伝子の活性化に独自に必要であり、このエピジェネティックに平衡を保った状態ではさらに、Ｔｅｔ１が完全かつ効率的な活性化を強化する必要があることを示す。Ｔｅｔ１は、エピジェネティックリプログラミングの完了後すぐに減数分裂前期を開始する雌ＰＧＣで特に重要であるようであり9、よって、これらの遺伝子のタイムリーな高発現が必要となる。重要なことに、発明者らはＥ１４．５ Ｔｅｔ１－ＫＯ ＰＧＣのＧＲＲ遺伝子プロモーターでわずかな高メチル化を観察したが、我々の研究は、Ｔｅｔ１がＤＮＡ脱メチル化に依存しないメカニズムも介してＧＲＲ遺伝子の転写を刺激することを、明確に記録している21,22。これに関連して、以前の研究では、Ｔｅｔ１がＯＧＴを遺伝子プロモーターに動員して22、それにより、ＳＥＴ１／ＣＯＭＰＡＳＳ28を介したＨ１Ｋ４ｍｅ３の蓄積を促進し、転写活性化につながることが示されている。更なる裏付けでは、ｍＥＳＣのＧＲＲ遺伝子プロモーターは、低いが検出可能なＨ３Ｋ４ｍｅ３によってマークされ、そのレベルは、Ｔｅｔ１が存在しない場合、ＤＮＡメチル化の変化なしに大幅に低下する（図４ｂ、図１４ｇ）。Ｔｅｔ１は、エンハンサー等の非プロモーターシスエレメントでの５ｍＣ／５ｈｍＣレベルの調節を介して、転写を更に増強することができる。最後に、重要なこととして、我々の研究は、Ｔｅｔ１が、生殖腺ＰＧＣにおけるエピジェネティックリプログラミング中の全体的なＤＮＡ脱メチル化の開始には直接関与しないことを示したが、むしろ発明者らは、その後の異常な残留及び／又はデノボＤＮＡメチル化の除去におけるＴｅｔ１の重要な役割を定義する（図１６）。これは、接合子のＤＮＡ脱メチル化中のデノボＤＮＡメチル化29に対する保護におけるＴｅｔ３駆動５ｍＣ酸化の役割を連想させ、全体的なリプログラミング事象では、新たに取得したエピジェネティック状態を安定させるために、５ｍＣを除去した後のデノボＤＮＡメチル化からの効率的な保護が必要であることを示唆している。まとめると、我々の研究は、生殖腺エピジェネティックリプログラミングがエピジェネティック情報の複合抹消を伴うという考えを強化し、また、このプロセスの中心的な機能は、ＧＲＲ遺伝子のタイムリーで効率的な活性化を確認し、それにより配偶子形成への進行を可能にすることであることを示唆している（図１６）。
【0064】
方法
【0065】
統計と再現性
【0066】
全ての統計的検定は、図の説明文及び／又は方法セクションに明確に記載されており、可能な場合は正確なｐ値又は調整されたｐ値が示される。ＷＧＢＳデータ（図３ａ－ｂ、図５ａ、図６ｃ－ｅ、図７ａ－ｂ、図８、図１１、図１２）では、データは、ｎ＝１（Ｅ１０．５ ＰＧＣサンプル）又はｎ＝２（その他全てのサンプル）の生物学的複製からの細胞に由来し、プールされた胚からの各複製を用いた（Ｅ１０．５：ｎ＝３９胚／４リットル；Ｅ１１．５：ｎ＝８胚／１リットル；Ｅ１２．５Ｍ／Ｆ：ｎ＝４胚／１リットル）。ＡｂａＳｅｑデータ（図１ｄ、図３ａ－ｂ、図５ｃ－ｅ、図６ａ－ｆ、図７ａ－ｂ、図８、図１１、図１２、図１３ｂ）では、データは、ｎ＝２生物学的複製からの細胞に由来し、プールされた胚からの各複製を用いた（Ｅ１０．５：ｎ＝４０胚／４リットル；Ｅ１１．５：ｎ＝８胚／１リットル；Ｅ１２．５Ｍ／Ｆ：ｎ＝４胚／１リットル）。ｍＥＳＣのＲＮＡ－Ｓｅｑでは、サンプルは、ｎ＝１細胞株からの独立培養されたｎ＝２サンプルに対応するｎ＝２生物学的複製に由来する。ＰＧＣ ＬＣ／ＭＳ、ＲＮＡ－Ｓｅｑ及びＲＲＢＳのデータについては、サンプルが由来する胚数／リットルに関する完全な詳細を参照されたい。ウエスタンブロット（図１３ｆ、図１５ｂ）は３回実施して同様の結果が得られ、代表的なブロットを示す。全ての免疫染色（図１ｅ、図２ａ－ｂ、図１０ｂ）は２回実施して同様の結果が得られ、代表的な画像を示す。従来のバイサルファイトシーケンシング（図１０ｆ－ｇ）は２回実施し、代表的なメチル化プロファイルを示す。以前に公開されたＷＧＢＳ（図１４ａ－ｂ）、ＴＡＢ－Ｓｅｑ（図５ｃ－ｅ）、ＡｂａＳｅｑ（図５ｃ－ｅ、６ｂ、１４ａ、１４ｃ）及びＣｈＩＰ－Ｓｅｑ（図３ｂ、図１４ａ、１４ｃ－ｇ）の、ｍＥＳＣ（受入番号については方法を参照）から得られたデータセットの分析では（Ｈ２Ａｕｂ ＣｈＩＰ－Ｓｅｑデータセット（ｎ＝１）以外）、分析の再現性を保証するために、生物学的複製を組合わせ（表示）と個別（表示なし）の両方で分析した。
【0067】
マウス
【0068】
全ての動物実験は、英国内務省指定施設における内務省プロジェクトライセンスの下で、かつそれに従って実施した。Ｔｅｔ１－ＫＯ ＰＧＣとの直接比較を除いて、野生型ＰＧＣは、非近交系ＭＦ１の雌を混合バックグラウンドＧＯＦ１８ΔＰＥ－ＥＧＦＰ5トランスジェニックの雄と交配させることによって産生された胚から単離した。Ｅ１２．５以降の胚の性別は、生殖腺の目視検査によって決定した。Ｔｅｔ１－ＫＯ ＰＧＣの研究では、Ｔｅｔ１ノックアウトマウス株（Ｂ６；１２９Ｓ４－Ｔｅｔ１ｔｍ１．１Ｊａｅ／Ｊ）18をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、ＧＯＦ１８ΔＰＥ－ＥＧＦＰ5トランスジェニックマウス系統に対して繁殖させた。野生型及びＴｅｔ１－ ＫＯ ＰＧＣは、Ｔｅｔ１－ヘテロ接合ＧＯＦ１８ΔＰＥ－ＥＧＦＰ－ホモ接合型の雌雄間の交配から産生された胚から単離した。Ｔｅｔ１－ヘテロ接合ＧＯＦ１８ΔＰＥ－ＥＧＦＰ－ホモ接合型の雌雄を交配させることによって産生された胚のジェノタイピングでは、エクソン４欠失を確認するために、２つの異なるプライマーセット（下記参照）を用いて、ＰＣＲを常に２回実施した。Ｅ１２．５以降の胚の性別は、生殖腺の目視検査によって決定し、更にＳｒｙのＰＣＲによって確認した。全てのケースにおいて、正午での膣プラグの出現がＥ０．５として定義されるように、交配のタイミングを決定している。
【0069】
分子生物学
【0070】
この研究では、以下のジェノタイピングプライマーを使用した：ＴＣＡＧＧＧＡＧＣＴＣＡＴＧＧＡＧＡＣＴＡ（Ｔｅｔ１フォワードプライマー１）；ＡＡＣＴＧＡＴＴＣＣＣＴＴＣＧＴＧＣＡＧ（Ｔｅｔ１フォワードプライマー２）；ＴＴＡＡＡＧＣＡＴＧＧＧＴＧＧＧＡＧＴＣ（Ｔｅｔ１リバースプライマー）；ＴＴＧＴＣＴＡＧＡＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＧＧＣＣＡＴＧＴＣＡＡ（Ｓｒｙフォワードプライマー）；ＣＣＡＣＴＣＣＴＣＴＧＴＧＡＣＡＣＴＴＴＡＧＣＣＣＴＣＣＧＡ（Ｓｒｙリバースプライマー）。
【0071】
フローサイトメトリーによるＰＧＣ単離
【0072】
ＰＧＣ単離は、以前に記述されたように実施した4。簡単に言うと、胚幹（Ｅ１０．５）又は生殖隆起（Ｅ１１．５－Ｅ１４．５）を、０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ（１×）（Ｇｉｂｃｏ）又はＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて、３７℃で３分間消化した。酵素消化に続いて、１５％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｇｉｂｃｏ）で中和し、ピペッティングによって手動で解離させた。遠心分離後、細胞をヒアルロニダーゼ（３００μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ－１２に再懸濁し、手動ピペッティングによって単一細胞懸濁液を生成した。遠心分離後、細胞を、ポリビニルアルコール（１０μｇ／ｍｌ）とＥＧＴＡ（０．４ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）を補充した氷冷ＰＢＳに再懸濁した。Ａｒｉａ ＩＩｕ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）又はＡｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）フローサイトメーターを用いてＧＦＰ陽性細胞を単離し、ポリビニルアルコール（１０μｇ／ｍｌ）とＥＧＴＡ（０．４ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）を補充した氷冷ＰＢＳにソートした。
【0073】
Ｔｅｔ１－ＫＯ Ｄｎｍｔ－ＴＫＯ ｍＥＳＣの生成
【0074】
Ｔｅｔ１－ＫＯ Ｄｎｍｔ－ＴＫＯ ｍＥＳＣ株は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介したゲノム編集によって生成した。Ｔｅｔ１31（ＧＧＣＴＧＣＴＧＴＣＡＧＧＧＡＧＣＴＣＡ）を標的とするｓｇＲＮＡを含むｐＸ３３０（Ａｄｄ遺伝子、＃４２２３０）を、リポフェクタミン３０００を用いて、５×１０６個のＤｎｍｔ－ＴＫＯ ｍＥＳＣ23において、レポーターＧＦＰプラスミドと同時トランスフェクションした。翌日、ＧＦＰ陽性細胞をＦＡＣＳ（ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩ）によって９６ウェルプレートにソートした。細胞を１週間培養した後、凍結してｇＤＮＡを抽出した。Ｓｕｒｖｅｙｏｒ ａｓｓａｙ（ＩＤＴのＳｕｒｖｅｙｏｒ Ｍｕｔａｔｉｏｎ検出キットと、ＱｉａｇｅｎのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）を用いて、コロニーを変異についてスクリーニングした。Ｔｅｔ１－ＫＯ Ｄｎｍｔ－ＴＫＯ ｍＥＳＣ選択クローンを、ジェノタイプシーケンシングによって更に分析し、フレームシフト変異の存在を確認した。Ｔｅｔ１の喪失は、ＲＮＡ－Ｓｅｑとウエスタンブロットによって確認した。ジェノタイプシーケンシングとｓｕｒｖｅｙｏｒ ａｓｓａｙには、以下のプライマーを使用した：５’ＴＴＧＴＴＣＴＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＣ３’及び５’ＴＧＡＴＴＧＡＴＣＡＡＡＴＡＧＧＣＣＴＧＣ３’。
【0075】
ｍＥＳＣ細胞培養
【0076】
Ｊ１（野生型）、Ｄｎｍｔ－ＴＫＯ23及びＴｅｔ１－ＫＯ Ｄｎｍｔ－ＴＫＯ ｍＥＳＣを０．１％ゼラチン上、フィーダーを含まないＦＣＳ/ＬＩＦ培地で培養した。ＦＣＳ/ＬＩＦ培地は、１０％ＦＣＳ、０．１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸、２ｍＭ １－グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール及びマウスＬＩＦ（ＥＳＧＲＯ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を補充したＧＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）からなる。阻害剤実験では、ｍＥＳＣを１．５×１０４／ｃｍの密度で播種し、一晩放置した。翌朝、培地を５０μＭ ＰＲＣ１阻害剤ＰＲＴ４１６５（Ｉｓｍａｉｌ他，２０１３）またはＤＭＳＯ対照のいずれかを含むＦＣＳ/ＬＩＦ培地と交換し、分析のため、指示された時間に細胞をペレット化した。
【0077】
ＡｂａＳｅｑライブラリの作製
【0078】
ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、１０，０００個のソート済みＰＧＣから全ＤＮＡを単離した。５ｈｍＣプロファイリング用のＡｂａＳｅｑライブラリは、以前記述された15ように構築した。手短に言えば、ゲノムＤＮＡをグルコシル化し、次にＡｂａＳＩ酵素（ＮＥＢ）によって消化した。ビオチン化Ｐ１アダプターをＡｂａＳＩ消化したＤＮＡにライゲーションし、Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２ソニケーター（Ｃｏｖａｒｉｓ）を用いて、製造元の指示に従って断片化した。次に、切断されたＰ１ライゲーション済みＤＮＡを、製造元の仕様に従ってＤｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１ビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と混合することによって捕捉した。ＮＥＢＮｅｘｔ Ｅｎｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｍｏｄｕｌｅ（ＮＥＢ）とＮＥＢＮｅｘｔ ｄＡ－ｔａｉｌｉｎｇ Ｍｏｄｕｌｅ（ＮＥＢ）をそれぞれ２０℃と３７℃で３０分間使用することにより、ビーズに末端修復とｄＡテーリングを実施した。Ｐ２アダプターを、ｄＡテーリングされたＤＮＡのランダムに切断された末端にライゲーションした。最後に、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いて、３００ｎＭフォワードプライマー（ＰＣＲ＿Ｉ）と３００ｎＭリバースプライマー（ＰＣＲ＿ＩＩｐｅ）を追加して、ＤＮＡ全体を１６サイクル増幅した。ライブラリは、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２０００機器で配列決定した。
【0079】
全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ＷＧＢＳ）ライブラリの作製
【0080】
ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、１０，０００個のソート済みＰＧＣから全ＤＮＡを単離した。一部のケースでは、続くＤＮＡ単離において、メチル化されていないλファージＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をスパイクして、バイサルファイト変換率を評価した。製造元の指示に従い、Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２ソニケーター（Ｃｏｖａｒｉｓ）を用いてＤＮＡを断片化した。メチル化されたアダプターと以下の変更を加えて、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐプロトコルに従ってライブラリを作製した。アダプターのライゲーションに続いて、Ｉｍｐｒｉｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いてバイサルファイト変換を実行した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｂｉｏｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）マスターミックス用のＮＥＸＴｆｌｅｘ Ｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅ－Ｓｅｑ ＫｉｔとＮＥＢＮｅｘｔ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐユニバーサル及びインデックスプライマー（ＮＥＢ）を用いて、ＰＣＲ濃縮を１６サイクル実施した。ライブラリは、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）によって精製した。ライブラリは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２０００又は２５００機器で配列決定した。
【0081】
ＲＲＢＳ（Reduced representation bisulphite sequencing）ライブラリの作製
【0082】
個々のＴｅｔ１－ＫＯ胚又は野生型胚から分離されたＦＡＣＳソート済みＰＧＣからの全ＤＮＡを、ＺＲ－Ｄｕｅｔ ＤＮＡ－ＲＮＡ ＭｉｎｉＰｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ）を用いて分離し、同じジェノタイプ、ステージ及び性別の２～６個の胚（１，０００～８，０００細胞に相当）からのＤＮＡをプールし、Ｓａｖａｎｔ ＳｐｅｅｄＶａｃ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて製造元の指示に従って最終量２６μＬに濃縮した。ゲノムＤＮＡをＮＥＢバッファー２中の２０ユニットのＭｓｐＩ酵素（ＮＥＢ）により、３７℃で３時間消化し、消化されたＤＮＡをＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて精製した。メチル化されたアダプターと以下の変更を加えて、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐプロトコルに従ってライブラリを作製した。アダプターのライゲーションに続いて、Ｉｍｐｒｉｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いてバイサルファイト変換を実行した。ＫＡＰＡ Ｕｒａｃｉｌ＋ ＤＮＡポリメラーゼマスターミックス（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とＮＥＢＮｅｘｔ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐユニバーサル及びインデックスプライマー（ＮＥＢ）を用いて、ＰＣＲ濃縮を１８サイクル実施した。ライブラリは、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）によって精製した。以前に記述されたように32、プールされたライブラリは、「ダークシークエンシング」プロトコルを用いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００機器で配列決定された。
【0083】
ＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリの作製
【0084】
Ｔｅｔ１－ＫＯ ＰＧＣの研究では、個々のＴｅｔ１－ＫＯ胚又は野生型胚から分離されたソート済みＰＧＣからの全ＲＮＡを、ＺＲ－Ｄｕｅｔ ＤＮＡ－ＲＮＡ ＭｉｎｉＰｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ）を用いて分離し、同じジェノタイプ、ステージ及び性別の２～６個の胚（１，０００～８，０００細胞に相当）からのＲＮＡをプールし、ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ ５キット（Ｚｙｍｏ）を用いて最終量６μＬに濃縮した。ＭＦ１雌とＧＯＦ１８ΔＰＥ－ＥＧＦＰ雄を交配することによって産生された胚から分離された野生型ＰＧＣの研究では、６００～１，０００のソート済みＥ１０．５ ＰＧＣからの全ＲＮＡを、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＲＮＡ ＸＳキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用いて分離した。ＳＭＡＲＴｅｒ Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ ＲＮＡキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、１００ｐｇ及び３ｎｇの全ＲＮＡを使用し、製造元の指示に従って、ｃＤＮＡ合成及び増幅（１５サイクル）を実行した。増幅されたｃＤＮＡは、製造元の指示に従い、Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２ソニケーター（Ｃｏｖａｒｉｓ）によって断片化した。せん断されたｃＤＮＡを、ＮＥＢＮｅｘｔ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐキット（ＮＥＢ）を用いて、製造元の指示に従い、１５サイクルの増幅を用いてシーケンスライブラリーに変換した。ｍＥＳＣの研究では、ＺＲ－Ｄｕｅｔ ＤＮＡ－ＲＮＡ ＭｉｎｉＰｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ）を用いて全ＲＮＡを分離した。製造元の指示に従い、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）とＮＥＢＮｅｘｔ Ｐｏｌｙ（Ａ） ｍＲＮＡ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（ＮＥＢ）を用いて、５００ｎｇの全ＲＮＡから始めて、ｃＤＮＡ合成とライブラリ作製を実施した。全てのライブラリをＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）で精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００装置で配列決定した。
【0085】
バイオインフォマティクス
【0086】
全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（ＷＧＢＳ）及びＴｅｔ支援バイサルファイトシーケンシング（ＴＡＢ－Ｓｅｑ）のアライメント及び下流分析
【0087】
未加工のリードを、最初にＴｒｉｍ Ｇａｌｏｒｅ（バージョン０．３．１）を用いて－－ｐａｉｒｅｄ－－ｔｒｉｍ１オプションでトリミングした。アライメントは、マウスゲノム（ｍｍ９、ＮＣＢＩビルド３７）に対して、Ｂｉｓｍａｒｋ（バージョン０．１３．０）を用いて－ｎ １パラメーターで実行した。必要に応じて、λファージゲノムを過剰染色体として追加した。アラインされたリードをｄｅｄｕｐｌｉｃａｔｅ＿ｂｉｓｍａｒｋで重複排除した。必要に応じて、バイサルファイト変換率を、λファージゲノムにアラインされたリードを用いて、Ｍｅｔｈｐｉｐｅ（バージョン３．３．１）のｔｏ－ｍｒスクリプト（パラメーター：－ｍ ｂｉｓｍａｒｋ）及びｂｓｒａｔｅスクリプト（パラメーター：－Ｎ）を用いて計算した。ＣｐＧメチル化コールは、Ｂｉｓｍａｒｋメチル化エクストラクターを用いて、重複排除されたマッピング出力から抽出した。ＣｐＧコンテキスト内のメチル化シトシン及び非メチル化シトシンの数は、ｂｉｓｍａｒｋ２ｂｅｄＧｒａｐｈ及びｃｏｖｅｒａｇｅ２ｃｙｔｏｓｉｎｅを用いて抽出した。対称ＣｐＧは、カスタムＲスクリプトとマージした。全ての下流分析について、最小８倍のカバレッジをもつ対称ＣｐＧのみを使用した。マージされた生物学的複製からのデータに対して、全てのＷＧＢＳ分析を実行した。特定の反復要素でＤＮＡ修飾レベルを評価するために、Ｂｉｓｍａｒｋ（バージョン０．１４．４）を用いて、各データセットからの全てのリードを、－ｎ １パラメーターセットでＲｅｐｂａｓｅから構築されたコンセンサス配列に対してマッピングした。ＣｐＧメチル化コールは、Ｂｉｓｍａｒｋメチル化エクストラクター（バージョン０．１４．４）を用いて、マッピング出力から抽出した。
【0088】
ＢＥＤｔｏｏｌｓ（バージョン２．２４．０）のｍａｐＢｅｄ機能を用いて、以下のゲノム特徴の複合５ｍＣ／５ｈｍＣレベルを計算した：１）全ての２ｋｂウィンドウ（最低４つの対称ＣｐＧを含む）；２）遺伝子プロモーター（Ｅｎｓｅｍｂｌ ６７遺伝子開始サイト－１ｋＢ／＋５００ｂｐとして定義）；３）遺伝子体（Ｅｎｓｅｍｂｌ ６７遺伝子開始サイトと遺伝子終了サイトに含まれる領域として定義）；４）６日目ＰＧＣＬＣの推定活性エンハンサー33；５）インプリント制御領域；６）ＣｐＧアイランド（ＵＣＳＣ）；７）遺伝子間領域。メタ遺伝子プロットでは、ＢＥＤｔｏｏｌｓ（バージョン２．２４．０）を用いて、ゲノム特徴を同じサイズのビンに分割した：１）遺伝子体（Ｅｎｓｅｍｂｌ ６７の遺伝子開始サイトと遺伝子終了サイトに含まれる領域として定義）＋／－０．５＊遺伝子体長さ（１００ビン）；２）６日目ＰＧＣＬＣの推定活性エンハンサー33＋／－１＊推定活性エンハンサー長さ（９０ビン）；及び３）ＣｐＧアイランド（ＵＣＳＣ）＋／－１＊ＣｐＧアイランド長さ（９０ビン）。全てのケースにおいて、複合５ｍＣ／５ｈｍＣレベルは、個々のＣｐＧサイトの平均として表した。
【0089】
以前に公開されたもの19,34と同じパラメーターを用いて定義された、複合平均５ｍＣ／５ｈｍＣレベル、高ＣｐＧ（ＨＣＰ）、中間ＣｐＧ（ＩＣＰ）及び低ＣｐＧ（ＬＣＰ）プロモーターのｋ平均クラスタリング。簡単に言うと、ＬＣＰは、ＣｐＧ比＞０．４５の５００ｂｐウィンドウを含まず、ＨＣＰは、ＣｐＧ比＞０．６５でありＧＣ量＞５５％である５００－ｂｐウィンドウを少なくとも１つ含み、ＩＣＰは先の基準を満たさない。
【0090】
血清含有培地で増殖させた野生型ｍＥＳＣの遺伝子座特異的メチル化レベルを決定するために、未加工のＷＧＢＳリードをＧＳＥ４８５１９30からダウンロードし、上記のように処理した。Ｅ１４ ｍＥＳＣのＴＡＢ－ＳｅｑリードはＧＳＥ３６１７３35からダウンロードし、上記のように処理したが、例外として、最低１２倍のカバレッジをもつ対称ＣｐＧのみを用いた。
【0091】
ＡｂａＳｅｑアライメントと下流分析
【0092】
ゲノムの一意にマッピング可能な部分について、以前に記述された15ようにＡｂａＳｅｑリードを処理した。簡単に言うと、Ｔｒｉｍ Ｇａｌｏｒｅを用いて、アダプター配列と低品質塩基について未加工のシーケンシングリードをトリミングした。トリミングされたリードを、Ｂｏｗｔｉｅ（バージョン０．１２）を用いて、パラメーター－ｎ １ －ｌ ２５ －－ｂｅｓｔ －－ｓｔｒａｔａ －ｍ １で、マウスゲノム（ｍｍ９、ＮＣＢＩビルド３７）にマッピングした。５ｈｍＣの呼出しは、カスタムＰｅｒｌスクリプトを用いたＡｂａＳＩ酵素（５’－ＣＮ１１－１３↓Ｎ９－１０Ｇ－３’／３’－ＧＮ９－１０↓Ｎ１１－１３Ｃ－５’）の認識配列と切断パターンに基づいた。反復要素と非反復要素での５ｈｍＣの相対的な濃縮を評価するために、ＡｂａＳｅｑアライメントを２つの群に分けた：ユニーク（単一の最良のアライメント）と多義（等しいアライメントスコアをもつ複数の場所にマッピング）。両群を、ｍｍ９のＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒトラック（ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ）によって個別に定義された反復要素にマッピングした。ｍＥＳＣの５ｈｍＣレベルとの比較のために、ＡｂａＳｅｑリードをＧＳＥ４２８９８15からダウンロードし、同じ方法でアラインした。
【0093】
ゲノムの一意にマッピングされた部分の対称ＣｐＧにおける相対５ｈｍＣレベルの定量化では、所与のサンプルの対称ＣｐＧあたりのカウント数を、所与のライブラリの一意にマッピングされたリードと多義にマッピングされたリードの合計数に正規化し、更に、ＬＣ／ＭＳによって計算された各ステージについて、平均５ｈｍＣレベルに基づくステージ固有の正規化係数を乗じた（Ｅ１４ ＥＳＣ＝１．６４；Ｅ１０．５＝１．０；Ｅ１１．５＝１．１３；Ｅ１２．５Ｆ＝０．７６；Ｅ１２．５Ｍ＝１．０）。マウス（ｍｍ９）ＥＮＣＯＤＥプロジェクトによってブラックリストに記載されたゲノム間隔に該当する対称ＣｐＧは、全て、以降の全ての下流分析から除外した。別段の記載がない限り、マージされた生物学的複製からのデータに対して、全てのＡｂａＳｅｑ分析を実行した。
【0094】
ＢＥＤｔｏｏｌｓ（バージョン２．２４．０）のｍａｐＢｅｄ関数を用いて、ＷＧＢＳデータセット（上記を参照）で実行されたものと同じゲノム特徴について、５ｈｍＣレベルを計算した。全てのケースで、５ｈｍＣレベルを、個々のＣｐＧサイトの平均として表した。
【0095】
Ｅ１０．５及びＥ１１．５ ＰＧＣにおいて５ｈｍＣの濃縮領域又は枯渇領域を特定するために、ｍｍ９ゲノムを最初に２ｋｂウィンドウ（最小４つの対称ＣｐＧ）に分割し、各ウィンドウの平均５ｈｍＣレベルを、ＢＥＤｔｏｏｌｓ（バージョン２．２４．０）を用いて計算した。各２ｋＢウィンドウにおける５ｈｍＣ濃縮の有意性を決定するために、上側（５ｈｍＣ濃縮領域を決定するため）又は下側（５ｈｍＣ枯渇領域を決定するため）のポアソン確率ｐ値を、ｐｐｏｉｓ（ｘ、λ）を用いて計算した。ここで、ｘは、各２ｋｂウィンドウで観測された５ｈｍＣ平均値であり、λは、Ｅ１０．５での全ての２ｋｂウィンドウの５ｈｍＣ平均値の平均である。次に、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正を適用して多重検定用に補正し、２ｋｂウィンドウごとに最終的に調整された上側ｐ値及び下側ｐ値を取得した。調整済みの上側ｐ値＜０．０５のウィンドウを、５ｈｍＣが比較的濃縮されているとみなし、調整された下側ｐ値＜０．０５のウィンドウを、５ｈｍＣが比較的枯渇しているとみなした。
【0096】
特定の反復要素での５ｈｍＣの相対的濃縮を評価するために、Ｂｏｗｔｉｅを用いて、各データセットからの全てのリードを、パラメーター－ｎ １ －Ｍ １ －－ｓｔｒａｔａ －ｂｅｓｔでＲｅｐｂａｓｅから構築されたコンセンサス配列に対してマッピングした。最初に、所与のサンプル内の各配列にマッピングされたリード数を、その特定のサンプルのライブラリサイズに正規化し、次に、ＬＣ／ＭＳによって計算された各ステージの平均５ｈｍＣレベルに基づくステージ固有の正規化係数（Ｅ１０．５＝１．０；Ｅ１１．５＝１．１３；Ｅ１２．５Ｆ＝０．７６；Ｅ１２．５Ｍ＝１．０）と、Ｅ１０．５ ＰＧＣの所与の配列にマッピングされたリードの平均比率の両方に正規化した。
【0097】
ＲＲＢＳ（Reduced representation bisulphite sequencing）アライメントと下流分析
【0098】
最初に、未加工のＲＲＢＳリードを、Ｔｒｉｍ Ｇａｌｏｒｅ（バージョン０．３．１）を用いて－－ｒｒｂｓパラメーターでトリミングした。Ｂｉｓｍａｒｋ（バージョン０．１３．０）を用いて、－ｎ １パラメーターで、マウスゲノム（ｍｍ９、ＮＣＢＩビルド３７）に対してアラインメントを実行した。ＣｐＧメチル化コールは、Ｂｉｓｍａｒｋメチル化エクストラクター（バージョン０．１３．０）を用いて、マッピング出力から抽出した。ＣｐＧコンテキスト内のメチル化シトシン及び非メチル化シトシンの数は、ｂｉｓｍａｒｋ２ｂｅｄＧｒａｐｈを用いて抽出した。
【0099】
ＲｎＢｅａｄｓ（バージョン１．０．０）とＲｎＢｅａｄｓ．ｍｍ９（バージョン０．９９．０）を用いて、ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ．ｍｉｓｓｉｎｇ．ｖａｌｕｅ．ｑｕａｎｔｉｌｅを０．９５に設定し、ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ．ｍｉｓｓｉｎｇ．ｃｏｖｅｒａｇｅ．ｔｈｒｅｓｈｏｌｄを８に設定して、以下のゲノム特徴について、２つの検定群間のメチル化領域の差を特定した：１）全ての２ｋｂウィンドウ（最小４つの対称ＣｐＧを含む）；２）遺伝子プロモーター（Ｅｎｓｅｍｂｌ ６７遺伝子開始部位－１ｋＢ／＋５００ｂｐと定義）；及び３）インプリント制御領域（ｍｍ９ゲノム）。ＲｎＢｅａｄｓの出力から、以下を抽出した：１）共通してカバーされている各検定領域の各群（つまり、ステージ、性別及び／又はジェノタイプ）の平均メチル化レベル；２）共通してカバーされている各検定領域の２群間のメチル化平均値の差；及び３）共通してカバーされている各検定領域の２群間のメチル化平均値の差の有意性を表すｐ値。可変メチル化領域は、ｐ値＜０．０５である領域として特定され、メチル化の差は、２群間で１０％を超えることを意味する。
【0100】
特定の反復要素でのＤＮＡ修飾レベルを評価するために、Ｂｉｓｍａｒｋ（バージョン０．１４．４）を用いて、－ｎ １パラメーターセットでＲｅｐｂａｓｅから構築されたコンセンサス配列に対して、各データセットからの全てのリードをマッピングした。ＣｐＧメチル化コールは、Ｂｉｓｍａｒｋメチル化エクストラクター（バージョン０．１４．４）を用いてマッピング出力から抽出した。ＣｐＧコンテキストでのメチル化シトシン及び非メチル化シトシンの数は、ｂｉｓｍａｒｋ２ｂｅｄＧｒａｐｈ及びｃｏｖｅｒａｇｅ２ｃｙｔｏｓｉｎｅを用いて抽出した。可変メチル化コンセンサス反復は、ｐ値＜０．０５（両側Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定により計算）の領域として特定され、メチル化の差は、２群間で１０％を超えることを意味する。
【0101】
ｈＭｅＤＩＰアライメントと下流分析
【0102】
Ｅ１４ ｍＥＳＣの未加工ｈＭｅＤＩＰ－Ｓｅｑリード及び入力リードをＧＳＥ２８５００36からダウンロードし、Ｂｏｗｔｉｅ（バージョン０．１２．８）を用いてパラメーター－ｎ ２ －ｌ ２５ －ｍ １でマウスゲノム（ｍｍ９、ＮＣＢＩビルド３７）にアラインした。ＢＥＤｔｏｏｌｓ ｍｕｌｔｉｃｏｖを用いて、ｈＭｅＤＩＰの数と、各２ｋＢウィンドウ（最小４つの対称ＣｐＧを含む）と重複する入力リードを特定した。各２ｋＢウィンドウの最終５ｈｍＣレベルは、まず、重複しているｈＭｅＤＩＰリードの数（ライブラリサイズに正規化）を重複している入力リードの数（ライブラリサイズに正規化）によって正規化し、次に、この値を、２ｋＢウィンドウ内に含まれる対称ＣｐＧの数で割ることによって決定した。
【0103】
ＣｈＩＰ－Ｓｅｑアライメントと下流分析
【0104】
推定活性エンハンサーの呼出しでは、６日目のＰＧＣ様細胞（ＰＧＣＬＣ）のＨ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３及びＨ３Ｋ２７Ａｃの未加工ＣｈＩＰ－ＳｅｑリードをＧＳＥ６０２０４33からダウンロードし、野生型ｍＥＳＣのＨ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１及びＨ３Ｋ２７Ａｃの未加工ＣｈＩＰ－ＳｅｑリードをＧＳＥ４８５１９30からダウンロードした。必要に応じて、Ｂｏｗｔｉｅ（バージョン０．１２．８又はバージョン１．０．０）を用いて、パラメーター－ｎ ２ －ｌ ２５ －ｍ １及び－Ｃで、リードをマウスゲノム（ｍｍ９、ＮＣＢＩビルド３７）にアラインした。後続のＣｈＩＰ－Ｓｅｑ分析は、マージされた生物学的複製からのデータに対して実行した。推定活性エンハンサーを特定するために、発明者らは、まず、ＣｈｒｏｍＨＭＭを用いて８状態のクロマチンモデルを生成した。推定活性エンハンサーは、潜在的なプロモーター領域（Ｅｎｓｅｍｂｌ ６７遺伝子開始サイト－１ｋＢ／５００ｂｐ）と重複せず、６日目のＰＧＣＬＣでは（Ｈ３Ｋ２７Ａｃ＋／Ｈ３Ｋ４ｍｅ３－／Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３－）クロマチン状態内に含まれ、又は野生型ｍＥＳＣでは（Ｈ３Ｋ４ｍｅ１＋／Ｈ３Ｋ２７Ａｃ＋／Ｈ３Ｋ４ｍｅ３－／Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３－）内に含まれる全ての領域として定義された。
【0105】
転写開始部位（Ｅｎｓｅｍｂｌ ６７）周辺のエピジェネティックな修飾及び修飾因子の分析のために、野生型血清成長ｍＥＳＣにおけるＴｅｔ１結合の未加工ＣｈＩＰ－ＳｅｑリードをＧＳＥ２４８４３21からダウンロードし、野生型血清成長ｍＥＳＣにおけるＨ２ＡＫ１１９Ｕｂ１レベルの未加工ＣｈＩＰ－ＳｅｑリードをＧＳＥ３４５２０37からダウンロードし、野生型血清成長ｍＥＳＣにおけるＲｉｎｇ１ｂ結合の未加工ＣｈＩＰ－ＳｅｑリードをＥＲＰ００５５７５38からダウンロードし、野生型及びＴｅｔ１－ＫＯ血清成長ｍＥＳＣにおけるＨ３Ｋ４ｍｅ３の未加工ＣｈＩＰ－ＳｅｑリードをＧＳＥ４８５１９30からダウンロードした。Ｂｏｗｔｉｅ（バージョン０．１２．８又はバージョン１．０．０）を用いて、パラメーター－ｎ ２ －ｌ ２５ －ｍ １で、リードをマウスゲノム（ｍｍ９、ＮＣＢＩビルド３７）にアラインした。後続のＣｈＩＰ－Ｓｅｑ分析は、マージされた生物学的複製からのデータに対して実行した。転写開始部位（ＴＳＳ）周辺のＣｈＩＰ－Ｓｅｑシグナルを計算するために、Ｅｎｓｅｍｂｌ ６７遺伝子開始部位＋／－ ５ｋＢ（又は２ｋＢ）周辺のゲノム間隔を、ＢＥＤｔｏｏｌｓ ｍａｋｅｗｉｎｄｏｗｓを用いて１００（又は４０）の等しいサイズのビンに分割した。次に、ＢＥＤｔｏｏｌｓ ｍｕｌｔｉｃｏｖを用いて、各ビンに重複している検定リード及び対照リードの数を計算した。各サンプルのビンごとの検定リード及び対照リードの総数を、適切なライブラリサイズに正規化し、各ビンの濃縮倍率を、正規化済みＣｈＩＰ－Ｓｅｑ検定サンプルリードの数を正規化済みＣｈＩＰ－Ｓｅｑ対照サンプルリードの数で割ることによって決定した。遺伝子プロモーターでのＣｈＩＰ－Ｓｅｑシグナルの計算では、Ｅｎｓｅｍｂｌ ６７遺伝子開始部位＋５００ｂｐ／－１ｋＢのゲノム間隔を
【0106】
ＲＮＡ－Ｓｅｑアライメントと下流分析
【0107】
Ｔｅｔ１－ＫＯ及びＴｅｔ１－ＷＴ ＰＧＣの研究では、最初に、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃを用いて、シーケンシングリードからのＩｌｌｕｍｉｎａ及びＳｍａｒｔ－ｓｅｑアダプターをトリミングした。他のＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリでは、次世代シーケンシングの出力から生成されたｆａｓｔｑファイルを直接アライメントに用いた。Ｂｏｗｔｉｅ（バージョン０．１２．８）及びＴｏｐｈａｔ（バージョン２．０．２）を用いて、オプション－Ｎ ２ －－ｂ２－ｖｅｒｙ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ －－ｂ２－Ｌ ２５で、ＲＮＡ－Ｓｅｑリードをマウスゲノム（ｍｍ９、ＮＣＢＩビルド３７）にアラインした。Ｅｎｓｅｍｂｌ Ｇｅｎｅバージョン６７のアノテーションを、Ｔｏｐｈａｔを用いた遺伝子モデルとして用いた。ＨＴＳｅｑ（バージョン０．５．３ｐ９）を用いてアノテーション済み遺伝子あたりのリードカウントを計算し、カスタムＲスクリプトを用いて、ＦＰＫＭ（fragments detected per kilobase per million of reads）の数を計算することによって、各遺伝子の発現レベルを定量化した。２つの生物学的複製の平均ＦＰＫＭ値に基づいて、遺伝子を発現レベルのビンに割り当てた。ＤＥＳｅｑ２（バージョン１．６．３）を用いて差次的発現分析を実施し、調整ｐ値＜０．０５の遺伝子を差次的発現と見なした。野生型及びＤｎｍｔ１－ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌノックアウト並びにマッチド野生型Ｅ１０．５のＰＧＣにおける遺伝子発現レベルを決定するために、未加工ＲＮＡ－ＳｅｑリードをＧＳＥ７４９３８24からダウンロードし、上記のように処理した。
【0108】
エピジェネティックリプログラミング中にＰＧＣでメチル化され脱メチル化するＨＣＰ（クラスター３、図４Ａ）は、Ｅ１０．５とＥ１４．５のＰＧＣにおける遺伝子発現の間の活性化（α）の有意性に基づいてランク付けした（図４Ｂ）。βが倍数変化の方向性を表し（つまり、ｌｏｇ２（ＦＣ）＜０の場合、β＝－１；それ以外の場合、β＝＋１）、γがＤＥＳｅｑ２によって計算された調整ｐ値を表す場合、α＝β×（１－γ）である。１）野生型、Ｄｎｍｔ－ＴＫＯ及びＴｅｔ１－ＫＯ Ｄｎｍｔ－ＴＫＯのｍＥＳＣ（図６Ａ）；２）野生型＋６ｈ ＤＭＳＯ処理、Ｄｎｍｔ－ＴＫＯ＋６ｈ ＤＭＳＯ処理、野生型＋６ｈ ＰＲＴ４１６５処理、Ｄｎｍｔ－ＴＫＯ＋６ｈ ＰＲＴ４１６５処理（図６Ｃ）；３）Ｔｅｔ１－ＫＯ Ｅ１４．５ ＰＧＣ対野生型Ｅ１４．５ ＰＧＣ（図５Ｂ）；又は３）Ｄｎｍｔ１－ＣＫＯ Ｅ１０．５ ＰＧＣ対野生型Ｅ１０．５ ＰＧＣ（図１３Ｇ）において、ＧＲＲ遺伝子の発現レベルを比較するために、最初に、ペアワイズ差次的発現分析を、各条件対各他の条件について、ＤＥＳｅｑ２によって実行した。各ペアワイズ差次的発現検定では、各遺伝子に統計量αが割り当てられた。ここで、βがｌｏｇ２（ＦＣ）を表し、γがＤＥＳｅｑ２によって計算された調整ｐ値を表す場合、α＝β×（１－γ）である。その後、αに基づいてランク付けされた遺伝子リストを、ＧＲＲ遺伝子セットとＧＳＥＡホールマーク遺伝子セットの組合わせの全般のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションを検定するための遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）に使用し、その後、ＧＳＥＡ ＦＷＥＲ調整ｐ値を使用した。生殖系列リプログラミング応答性遺伝子とＰＧＣにおいてＰＲＣ１によって抑制された遺伝子（図６Ｂ）の重複については、Ｅ１１．５及び／又はＥ１２．５ ＰＲＣ１－ＫＯ ＰＧＣにおいてアップレギュレートされたコールされた遺伝子のリストを、２６からダウンロードした。
【0109】
ＧＲＲ遺伝子の分類（図１４、表１）のために、最初にペアワイズ差次的発現分析を実施した。５ｍＣリプログラミング依存ＧＲＲ遺伝子を、１）Ｄｎｍｔ－ＴＫＯ対ＷＴ、Ｄｎｍｔ－ＴＫＯ＋ＰＲＣ１阻害剤対ＷＴ、及びＤｎｍｔ－ＴＫＯ＋ＰＲＣ１阻害剤対ＷＴ＋ＰＲＣ１阻害剤においてアップレギュレートされ、２）ＷＴ＋ＰＲＣ１阻害剤対ＷＴではアップレギュレートされない遺伝子として定義した。ＰＲＣ１リプログラミング依存ＧＲＲ遺伝子を、１）ＷＴ＋ＰＲＣ１阻害剤対ＷＴ、Ｄｎｍｔ－ＴＫＯ＋ＰＲＣ１阻害剤対ＷＴ、及びＤｎｍｔ－ＴＫＯ＋ＰＲＣ１阻害剤対Ｄｎｍｔ－ＴＫＯにおいてアップレギュレートされ、２）Ｄｎｍｔ－ＴＫＯ対ＷＴではアップレギュレートされない遺伝子として定義した。５ｍＣ／ＰＲＣ１リプログラミング依存ＧＲＲ遺伝子を、以下のいずれかの遺伝子として定義した：１）ＷＴ＋ＰＲＣ１阻害剤対ＷＴ、Ｄｎｍｔ－ＴＫＯ対ＷＴ、Ｄｎｍｔ－ＴＫＯ＋ＰＲＣ１阻害剤対ＷＴ、Ｄｎｍｔ－ＴＫＯ＋ＰＲＣ１阻害剤対Ｄｎｍｔ－ＴＫＯ、及びＤｎｍｔ－ＴＫＯ＋ＰＲＣ１阻害剤対ＷＴ＋ＰＲＣ１阻害剤においてアップレギュレートされる遺伝子；又は、２）Ｄｎｍｔ－ＴＫＯ＋ＰＲＣ１阻害剤対ＷＴ、Ｄｎｍｔ－ＴＫＯ＋ＰＲＣ１阻害剤対Ｄｎｍｔ－ＴＫＯ、及びＤｎｍｔ－ＴＫＯ＋ＰＲＣ１阻害剤対ＷＴ＋ＰＲＣ１阻害剤においてアップレギュレートされ、ＷＴ＋ＰＲＣ１阻害剤対ＷＴ及びＤｎｍｔ－ＴＫＯ対ＷＴではアップレギュレートされない遺伝子。５ｍＣ／ＰＲＣ１リプログラミング非依存又は不足のＧＲＲ遺伝子を、Ｄｎｍｔ－ＴＫＯ対ＷＴ、Ｄｎｍｔ－ＴＫＯ＋ＰＲＣ１阻害剤対ＷＴ及びＤｎｍｔ－ＴＫＯ＋ＰＲＣ１阻害剤対ＷＴ＋ＰＲＣ１阻害剤、及びＷＴ＋ＰＲＣ１阻害剤対ＷＴではアップレギュレートされない遺伝子として定義した。これらの５つのクラスのうち１つに該当する遺伝子は、信頼度の低い分類（ｌ．ｃ．ｃ．）遺伝子として記載した。
【0110】
免疫蛍光法によるＴｅｔ１及び５ｍＣ／５ｈｍＣの検出
【0111】
最初に、胚幹（Ｅ１０．５）又は生殖隆起（Ｅ１２．５／Ｅ１３．５）を、４℃で３０分間、２％ＰＦＡ（ＰＢＳ中）で固定した。固定後、組織をＰＢＳで１０分間３回洗浄し、次にＰＢＳ中１５％スクロース中で一晩インキュベートした。翌日、ＰＢＳ中１％ＢＳＡで洗浄した後、組織をＯＣＴ Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒａｙｍｏｎｄ Ｌａｍｂ）に包埋し、液体窒素を用いて凍結した。その後、サンプルを－８０℃で保存した。Ｌｅｉｃａ ＣＭ １９５０クライオスタットを用いて、凍結した包埋組織から１０μｍの切片を切り出した。切片をポリリジンスライド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に定着させ、ＰＢＳ中２％ＰＦＡで３分間、後固定した。
【0112】
Ｔｅｔ１の検出のために、切片をＰＢＳで５分間３回洗浄した。０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む１％ＢＳＡ／ＰＢＳで３０分間室温でインキュベートした後、切片を同じ緩衝液中で、リストされた１次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。続いて、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む１％ＢＳＡ／ＰＢＳで切片を５分間３回洗浄し、同じ緩衝液中で２次抗体と暗所で室温で１時間インキュベートした。２次抗体のインキュベーションの後、ＰＢＳで５分間３回洗浄した。次に、ＤＮＡをＤＡＰＩ（１００ｎｇ／ｍｌ）で染色した。最後にＰＢＳで１０分間洗浄した後、切片をＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でマウントした。
【0113】
５ｈｍＣ／５ｍＣの検出のために、切片をＰＢＳで５分間３回洗浄した。固定後の切片を、最初に０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中）で３０分間透過処理し、続いて、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中のＲＮａｓｅ Ａ（１０ｍｇ／ｍｌ；Ｒｏｃｈｅ）で、３７℃で１時間処理した。ＰＢＳで５分間３回洗浄した後、切片を３７℃で１０～２０分間４Ｎ ＨＣｌでインキュベートして、ゲノムＤＮＡを変性させ、その後ＰＢＳで１０分間３回洗浄した。０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む１％ＢＳＡ／ＰＢＳで３０分間室温でインキュベートした後、切片を同じ緩衝液中で、リストされた１次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。続いて、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む１％ＢＳＡ／ＰＢＳで切片を５分間３回洗浄し、同じ緩衝液中で２次抗体と暗所で室温で１時間インキュベートした。２次抗体のインキュベーションの後、ＰＢＳで５分間３回洗浄した。次に、ＤＮＡをヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（０．２５ｍｇ／ｍｌ）で染色した。最後にＰＢＳで１０分間洗浄した後、切片をＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でマウントした。
【0114】
この研究では、以下の１次抗体を使用した：抗ＳＳＥＡ１（Ｐ．Ｂｅｖｅｒｌｙ博士からＧ．Ｄｕｒｃｏｖａ Ｈｉｌｌｓ博士を介して贈与）；抗ＭＶＨ（Ａｂｃａｍ ２７５９１又はＡｂｃａｍ １３８４０）；抗５ｈｍＣ（Ａｃｔｉｖｅ ｍｏｔｉｆ ３９７９１）、抗５ｍＣ（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ Ｃ１５２０００８１－１００）；抗Ｔｅｔ１（ＧｅｎｅＴｅｘ ＧＴＸ１２５８８８）；抗ＧＦＰ（Ａｂｃａｍ ５４５０）。この研究では、以下の２次抗体を使用した：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７ヤギ抗マウスＩｇＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ２１２３８）；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ１１００８）；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４０５ヤギ抗マウスＩｇＧ１：３００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ３１５５３）；ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ１：３００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ１１００１）；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４０５ヤギ抗ウサギＩｇＧ１：３００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ３１５５６）；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ１００４２）；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ１１０５５）。
【0115】
遺伝子座特異的バイサルファイトシーケンシング
【0116】
ゲノムＤＮＡのバイサルファイト処理は、Ｉｍｐｒｉｎｔ ＤＮＡ修飾キット（Ｓｉｇｍａ）を用いて実施した。Ｄａｚ１プロモーターのセミネステッド増幅には、以下のプライマーを使用した：Ｆ１：ＧＡＴＴＴＴＴＧＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＴＴＡＧＧＡＴ；Ｆ２：ＴＴＴＡＴＴＴＡＡＧＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＧＧＴＡＴＴ；Ｒ：ＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＴＡＧＧＣＣＡＧＣＴＧＡＧＡＧＡＡＴＴＣＴ。ＩＧ－ＤＭＲ ＩＣＲのセミネステッド増幅には、以下のプライマーを使用した：Ｆ１：ＧＴＧＴＴＡＡＧＧＴＡＴＡＴＴＡＴＧＴＴＡＧＴＧＴＴＡＧＧ；Ｆ２：ＡＴＡＴＴＡＴＧＴＴＡＧＴＧＴＴＡＧＧＡＡＧＧＡＴＴＧＴＧ；Ｒ：ＴＡＣＡＡＣＣＣＴＴＣＣＣＴＣＡＣＴＣＣＡＡＡＡＡＴＴ。Ｐｅｇ３ ＩＣＲのネステッド増幅には、以下のプライマーを用いた：Ｆ１：ＴＴＴＴＴＡＧＡＴＴＴＴＧＴＴＴＧＧＧＧＧＴＴＴＴＴＡＡＴＡ；Ｆ２：ＴＴＧＡＴＡＡＴＡＧＴＡＧＴＴＴＧＡＴＴＧＧＴＡＧＧＧＴＧＴ；Ｒ１：ＡＡＴＣＣＣＴＡＴＣＡＣＣＴＡＡＡＴＡＡＣＡＴＣＣＣＴＡＣＡ；Ｒ２：ＡＴＣＴＡＣＡＡＣＣＴＴＡＴＣＡＡＴＴＡＣＣＣＴＴＡＡＡＡＡ。メチル化レベルは、重複バイサルファイト配列を除外したデフォルト設定を用いて、ＱＵＭＡによって評価した。
【0117】
質量分析
【0118】
１００～２，０００のＦＡＣＳソートＰＧＣからのゲノムＤＮＡを、製造元の指示に従いＺＲ－Ｄｕｅｔ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅａｓｅａｒｃｈ）を用いて抽出し、ＬＣ／ＭＳグレードの水で溶出した。ＮＥＢが提供する消化酵素ミックスを用いて、ＤＮＡをヌクレオシドに消化した。既知量の合成ヌクレオシドと消化ＤＮＡで作られた希釈系列に、同量の同位体標識ヌクレオシド（Ｔ．Ｃａｒｅｌｌ博士（ＬＭＵ、ドイツ）から提供）をスパイクし、ＵＨＰＬＣ１２９０システム（Ａｇｉｌｅｎｔ）とＡｇｉｌｅｎｔ ６４９０トリプル四重極質量分析計を用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＲＨＤ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８ ２．１×１００ｍｍ １．８ｕカラムで分離した。個々のヌクレオシドの量を計算するために、同位体標識されたヌクレオシドに対する標識されていないヌクレオシドの比率を表す標準曲線を生成し、ピーク面積値を対応する量に変換するために使用した。定量化の閾値は、１０を超える信号対雑音比（ピークツーピーク法で計算）である。
【0119】
ウエスタンブロット法
【0120】
ｍＥＳＣを、ＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１．０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．５％デオキシ塩素酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０）及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、１１ ６９７ ４９８ ００１）中で超音波処理することによって溶解した。細胞片を１４０００ｇで５分間、４℃で遠心分離することによって除去した。ＢＣＡタンパク質アッセイを用いて、タンパク質を定量化した（Ｔｈｅｒｍｏ、２３２２７）。２μｇ（Ｈ２Ａ及びＨ２Ａｕｂの場合）又は２０μｇ（Ｔｅｔ１の場合）の各タンパク質抽出物を１５％又は８％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにロードし、電気泳動後にＰＶＤＦ膜に転写した。膜を５％ＢＳＡで１時間ブロックし、次に、以下の希釈率で１次抗体と４度で一晩インキュベートした：抗Ｈ２Ａ抗体（Ａｂｃａｍ、１８２５５）１：２０００；抗ユビキチンＨ２Ａ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ８２４０）１：２０００；抗Ｔｅｔ１抗体［Ｎ１］（ＧｅｎｅＴｅｘ ＧＴＸ１２５８８８）１：１０００；抗ラミンＢ抗体（Ｃ２０）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｓｃ－６２１６）１：１００００。ロバ抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｓｃ－２０７７）又はロバ抗ヤギＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｓｃ－２０５６）２次抗体を、室温で１時間インキュベートした。Ｌｕｍｉｎａｔａ Ｃｒｅｓｃｅｎｄｏ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ基質（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、ブロットを展開した。
【0121】
参考文献
【0122】
アルファベット順の参考文献：
【0123】
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【0124】
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【0126】
上記で参照された全ての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図6-4】
【図7-1】
【図7-2】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図10-3】
【図11-1】
【図11-2】
【図11-3】
【図12-1】
【図12-2】
【図12-3】
【図12-4】
【図13-1】
【図13-2】
【図14-1】
【図14-2】
【図15-1】
【図15-2】
【図16】
【図17】