特許 7539881 誘導された制御性Ｔ（ｉＴＲＥＧ）細胞を使用したＡＬＳ治療

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-08-16

(45)【発行日】2024-08-26

(54)【発明の名称】誘導された制御性Ｔ（ｉＴＲＥＧ）細胞を使用したＡＬＳ治療

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/17 20150101AFI20240819BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20240819BHJP

   A61K 31/7056 20060101ALI20240819BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240819BHJP

   A61K 31/675 20060101ALI20240819BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20240819BHJP

   A61K 31/513 20060101ALN20240819BHJP

   A61K 45/00 20060101ALN20240819BHJP

   A61P 37/02 20060101ALN20240819BHJP

【ＦＩ】

A61K35/17

A61P25/28

A61K31/7056

A61P43/00 121

A61K31/675

C12N5/0783

A61K31/513

A61K45/00

A61P37/02

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2021526727

(86)(22)【出願日】2019-11-15

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-18

(86)【国際出願番号】 US2019061818

(87)【国際公開番号】W WO2020102731

(87)【国際公開日】2020-05-22

【審査請求日】2022-11-15

(31)【優先権主張番号】62/768,176

(32)【優先日】2018-11-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/927,075

(32)【優先日】2019-10-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】521208468

【氏名又は名称】ラパ セラピューティクス，エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ファウラー，ダニエル，ハーディング

【審査官】六笠 紀子

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１４－５０８７１５（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１８／１０６９５８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１７／０５９１２２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Neurol. Neuroimmunol. Neuroinflamm.，2018年07月，5(4)，e465, page 1-7，doi: 10.1212/NXI.0000000000000465

【文献】Molecular Medicine Reports，2009年，2，pp.615-620

【文献】医学のあゆみ，2015年，252(1)，pp.105-110

【文献】Expert Opinion on Investigational Drugs，2017年，26(4)，pp.403-414，DOI：10.1080/13543784.2017.1302426

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３５／００－３５／７６８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

筋萎縮性側索硬化症の治療を必要とする対象において筋萎縮性側索硬化症を治療する方法に使用するための、製造されたＴ _ＲＥＧ 細胞を含む組成物であって、前記方法が、
前記対象を１つ以上の一次治療サイクルに供することであって、前記１つ以上の一次治療サイクルのそれぞれが、
前記対象にペントスタチンを投与すること、および／または
前記対象にシクロホスファミドを投与することを含む、一次治療サイクルに供することと、
前記対象を、
前記対象に治療有効量の製造されたＴ_ＲＥＧ細胞を含む組成物を投与することを含む１つ以上の免疫療法治療サイクルに供することと、を含み、
前記製造されたＴ _ＲＥＧ 細胞が、前記対象から得られたＴ細胞を脱分化し、ＩＬ－２、ＴＧＦ－βおよびＩＬ－４を含む培養培地中で脱分化Ｔ細胞を培養することにより製造される、組成物。

【請求項2】

ペントスタチンが、０．５ｍｇ／ｍ^２～４ｍｇ／ｍ^２の用量で使用される、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記シクロホスファミドが、５０ｍｇ～４００ｍｇの用量で使用される、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

前記製造されたＴ_ＲＥＧ細胞が、前記対象の体重１ｋｇ当たり１×１０^６細胞～前記対象の体重１ｋｇ当たり５×１０^６細胞の用量で使用される、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

前記製造されたＴ_ＲＥＧ細胞が、１：１、３：１、１０：１、１：３、および１：１０から選択されるセントラルメモリー細胞対エフェクターメモリー細胞の比率を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項6】

前記製造されたＴ_ＲＥＧ細胞は、以下の特性：
フローサイトメトリーによって測定した場合、ＧＡＴＡ３を発現するＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋Ｔ細胞が少なくとも５％、
フローサイトメトリーによって測定した場合、ＦＯＸＰ３を発現するＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋Ｔ細胞が少なくとも５％、
フローサイトメトリーによって測定した場合、ＣＤ７３を発現するＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋Ｔ細胞が少なくとも５％、
フローサイトメトリーによって測定した場合、ＣＤ１０３を発現するＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋Ｔ細胞が少なくとも５％、
フローサイトメトリーによって測定した場合、ＦＯＸＰ３とＧＡＴＡ３の両方を発現するＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋細胞が少なくとも５％、
フローサイトメトリーによって測定した場合、ＣＤ１５０を発現するＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋Ｔ細胞が少なくとも２０％、
３：１のビーズ：Ｔ細胞の比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを用いて共刺激した後の、ＩＬ－４の少なくとも５ｐｇ／ｍＬ／１×１０^６細胞／日の発現、
３：１のビーズ：Ｔ細胞の比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを用いて共刺激した後の、ＩＬ－２の少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ／１×１０^６細胞／日の発現、
３：１のビーズ：Ｔ細胞の比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを用いて共刺激した後の、ＩＦＮ－γの１００ｐｇ／ｍＬ／１×１０^６細胞／日未満の発現、
３：１のビーズ：Ｔ細胞の比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを用いて共刺激した後の、ＧＭ－ＣＳＦの１００ｐｇ／ｍＬ／１×１０^６細胞／日未満の発現、
３：１のビーズ：Ｔ細胞の比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを用いて共刺激した後の、ＴＮＦ－αの１０ｐｇ／ｍＬ／１×１０^６細胞／日未満の発現、
３：１のビーズ：Ｔ細胞の比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを用いて共刺激した後の、ＩＬ－１７の１０ｐｇ／ｍＬ／１×１０^６細胞／日未満の発現、および
それらの組み合わせ、のうちの１つ以上を有する、請求項１に記載の組成物。

【請求項7】

筋萎縮性側索硬化症の治療を必要とする対象において筋萎縮性側索硬化症の治療に使用するための組成物であって、
治療有効量の製造されたＴ_ＲＥＧ細胞を含み、前記製造されたＴ _ＲＥＧ 細胞が、前記対象から得られたＴ細胞を脱分化し、ＩＬ－２、ＴＧＦ－βおよびＩＬ－４を含む培養培地中で脱分化Ｔ細胞を培養することにより製造される、組成物。

【請求項8】

前記治療有効量の製造されたＴ_ＲＥＧ細胞が、前記対象の体重１ｋｇ当たり１×１０^６細胞から前記対象の体重１ｋｇ当たり５×１０^６細胞の用量である、請求項７に記載の組成物。

【請求項9】

前記製造されたＴ_ＲＥＧ細胞が１：１、３：１、１０：１、１：３、および１：１０から選択されるセントラルメモリー対エフェクターメモリー細胞の比率を含む、請求項７に記載の組成物。

【請求項10】

前記製造されたＴ_ＲＥＧ細胞は、以下の特性：
フローサイトメトリーによって測定した場合、ＧＡＴＡ３を発現するＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋Ｔ細胞が少なくとも５％、
フローサイトメトリーによって測定した場合、ＦＯＸＰ３を発現するＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋Ｔ細胞が少なくとも５％、
フローサイトメトリーによって測定した場合、ＣＤ７３を発現するＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋Ｔ細胞が少なくとも５％、
フローサイトメトリーによって測定した場合、ＣＤ１０３を発現するＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋Ｔ細胞が少なくとも５％、
フローサイトメトリーによって測定した場合、ＦＯＸＰ３とＧＡＴＡ３の両方を発現するＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋細胞が少なくとも５％、
フローサイトメトリーによって測定した場合、ＣＤ１５０を発現するＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋Ｔ細胞が少なくとも２０％、
３：１のビーズ：Ｔ細胞の比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを用いて共刺激した後の、ＩＬ－４の少なくとも５ｐｇ／ｍＬ／１×１０^６細胞／日の発現、
３：１のビーズ：Ｔ細胞の比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを用いて共刺激した後の、ＩＬ－２の少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ／１×１０^６細胞／日の発現、
３：１のビーズ：Ｔ細胞の比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを用いて共刺激した後の、ＩＦＮ－γの１００ｐｇ／ｍＬ／１×１０^６細胞／日未満の発現、
３：１のビーズ：Ｔ細胞の比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを用いて共刺激した後の、ＧＭ－ＣＳＦの１００ｐｇ／ｍＬ／１×１０^６細胞／日未満の発現、
３：１のビーズ：Ｔ細胞の比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを用いて共刺激した後の、ＴＮＦ－αの１０ｐｇ／ｍＬ／１×１０^６細胞／日未満の発現、
３：１のビーズ：Ｔ細胞の比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを用いて共刺激した後の、ＩＬ－１７の１０ｐｇ／ｍＬ／１×１０^６細胞／日未満の発現、および
それらの組み合わせ、のうちの１つ以上を有する、請求項７に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１１月１６日に出願された米国仮出願第６２／７６８，１７６号、および２０１９年１０月２８日に出願された米国仮出願第６２／９２７，０７５号に対する優先権を主張し、そのそれぞれの全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

養子Ｔ細胞療法は、がんおよび感染性疾患、自己免疫、および神経変性疾患の効果的な治療のための新たな介入である。より高い増殖電位および他の重要な属性に変換される、より原始的な分化状態を有するＴ細胞の移入は、養子移入後のインビボ効果の改善と関連付けられることがますます明らかになる。しかしながら、ほとんどの形態の養子Ｔ細胞療法は、典型的にはさらなる細胞分化をもたらすエクスビボ製造工程を必要とする。これは、成人ヒトからのＴ細胞が、既に主に進行した分化状態（エフェクターメモリー細胞と称される）にあり、多くの場合、チェックポイント阻害分子の制御下にある老化状態で存在するため、非常に問題である。培養開始時のよりナイーブなＴ細胞サブセットの単離（精製）を含む、この制限を緩和するためにアプローチを取ることができるが、このアプローチは、成人ヒト末梢血中に存在する少数のナイーブＴ細胞によって部分的に制限される。したがって、原始的な分化状態での単離されたＴ細胞は、非常に必要とされている。

【0003】

高度に分化した細胞でさえ、より原始的な状態に向かって脱分化するための固有の能力を有することは周知である。実際、最も極端な例では、分化細胞を操作して、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）状態を達成することができ、それによって、そのようなｉＰＳ細胞は、胚性幹細胞と重要な特徴を共有し、次いで、異なる組織運命への再分化に向けてさらに調節することができる。そのようなｉＰＳＣ方法論を使用した細胞療法は、多くの潜在的な臨床応用を有する。分化した体細胞からのｉＰＳ細胞の生成は、最初は、ウイルスまたは非ウイルス媒介アプローチを介して、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、ＫＬＦ４、およびｃ－ｍｙｃ、またはＳｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８を含む、主要転写因子の移入によって実証された。

【0004】

しかしながら、体細胞をｉＰＳ細胞に変換する能力は非効率であり、体細胞分化の程度に部分的に依存する。一例として、成熟マウス免疫Ｔ細胞をｉＰＳ細胞に変換する能力は、マウス造血幹細胞をｉＰＳ細胞に変換するのと比較しても３００倍低い効率である。それにもかかわらず、遺伝子移入法を用いて、成熟ヒト末梢血Ｔ細胞がｉＰＳ細胞状態への変換能力を維持することが実証された。過去１０年間にわたって、研究者らはまた、Ｔ細胞分化の初期段階に関連する転写因子を特徴付けてきた。しかしながら、種々の種類の幹細胞前駆体からのＴ細胞の再分化は、典型的には１～２ヶ月かかる比較的非効率的なプロセスである。

【0005】

脱分化の生物学はますます特徴付けられるようになっているが、脱分化に関連する特異的転写因子および転写因子動態に関しては、依然として、多くは未知である。また、脱分化を達成する遺伝子導入方法は、手間がかかり、細胞運命自殺遺伝子プログラミングなどの追加の遺伝子介入を通じて対処されなければならない奇形腫の生成などの合併症と関連付けられることを認識することも重要である。潜在的な代替として、様々な薬理学的介入を利用して、ある程度の脱分化を達成することができる。一例として、免疫抑制剤シクロスポリンの使用による細胞培養中のカルシニューリン阻害は、マウスｉＰＳ細胞の促進のためのＳｏｘ２転写因子の遺伝子送達の必要性を置き換える分子変化をもたらした。加えて、ラパマイシン（ｍＴＯＲ）の哺乳類標的を阻害する免疫抑制薬であるラパマイシンは、転写因子ＫＬＦ２の飢餓誘発性上方制御を介して末期エフェクターＴ細胞に対して脱分化の効果をもたらすことができ、これにより、Ｔ中心メモリー分子ＣＤ６２ＬおよびＣＣＲ７が増加する。加えて、ラパマイシンおよびｍＴＯＲシグナル伝達の結果として生じる阻害は、分化状態が低下したナイーブＴ細胞における細胞静止の維持に重要である。ｍＴＯＲ経路はｍＴＯＲＣ１複合体（Ｒａｐｔｏｒサブユニットを含む）およびｍＴＯＲＣ２複合体（Ｒｉｃｔｏｒサブユニットを含む）の両方からなることに留意することが重要である。ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２の両方の阻害は、メモリーＴ細胞の促進および維持の増加と関連している。注目すべきことに、ラパマイシンは、ｍＴＯＲＣ１のみを直接阻害することができるが、ｍＴＯＲＣ１の長期のラパマイシン媒介阻害では、ｍＴＯＲＣ２の下流の阻害が生じ得る。ｍＴＯＲ阻害または他の経路の阻害を介したＴ細胞成長因子シグナル伝達の低減は、より原始的な分化状態のＴ細胞に関連する別の主要分子、すなわち、ＩＬ－７受容体α（ＣＤ１２７）を上方制御することも知られている。さらなる研究では、薬理剤ラパマイシンまたはＷｎｔ－β－カテニンシグナル伝達活性化剤ＴＷＳ１１を介したＴ細胞のｍＴＯＲ経路の阻害は、マウスおよびヒトＴ細胞において以前に特定され、特徴付けられた、分化の少ないＴ幹細胞メモリー集団に向かってヒトナイーブＴ細胞の脱分化を促進した。さらなる実験モデル研究において、ＡＫＴシグナル伝達経路の薬理学的阻害、またはＰＩ３キナーゼおよび血管活性腸ペプチドシグナル伝達経路の併用阻害は、養子移植時に、分化状態が低下し、Ｔ細胞機能が増加したＴ細胞の生成をもたらした。

【0006】

ラパマイシン中のヒトＴ細胞のエクスビボ培養を介したｍＴＯＲの遮断は、サイトカイン分泌分子および細胞溶解エフェクター分子などのエフェクター分化に関連する分子のＴ細胞発現を低減することが実証されている。

【0007】

加えて、ビタミンＤの１，２５－ヒドロキシル化形態（本明細書で使用される「ビタミンＤ」）は、ヒトＴ細胞エフェクター機能を阻害することができる。ヒトＴ細胞増殖に対するビタミンＤの阻害効果は、シクロスポリンＡまたはラパマイシンなどの薬剤を使用して、免疫抑制性薬物曝露と相乗的であり得る。しかしながら、以前の研究は、Ｔ細胞エフェクターに対するビタミンＤの阻害効果は、Ｔｈ２型分子ではなくＴｈ１型分子に対して比較的特異的であることを示した。さらに、ビタミンＤは、免疫抑制性制御性Ｔ（Ｔ_ＲＥＧ）細胞集団を促進することが示された。

【0008】

ある程度矛盾する所見において、ヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞が高レベルのビタミンＤ受容体を発現することが決定され、最も高い値を有する個体は、高レベルのＴ細胞エフェクター機能および免疫老化を有する傾向があった。

【0009】

より最近の研究では、マイコバクテリウム結核感染症のマウスモデルを使用して、ビタミンＤが、ＩＦＮ－γ産生およびオートファジーに関わる機構を介して細胞内病原体のマクロファージ排除に重要であることが実証された。加えて、ヒト非小細胞癌細胞株において、ビタミンＤシグナル伝達は、放射線と組み合わせたときに抗腫瘍効果に寄与するオートファジーの細胞傷害性形態を促進することができる。最後に、ビタミンＤ受容体シグナル伝達は、正常なヒト乳房組織におけるオートファジーを促進する。このようなビタミンＤ受容体シグナル伝達の喪失は、乳癌を発症する危険性の増加と関連付けられた。先天性免疫（マクロファージの文脈）におけるビタミンＤをオートファジーに関連付けるこの証拠にもかかわらず、適応免疫中のＴ細胞におけるオートファジーに対するビタミンＤの効果、およびこの文脈において、Ｔ細胞オートファジーに対するビタミンＤおよびラパマイシンの潜在的な効果が冗長であるかどうかに関するデータは乏しい。

【0010】

Ｔ細胞生物学におけるビタミンＤの潜在的な役割に関するこれらのやや相反する結果は、ｍＲＮＡレベルおよびマイクロＲＮＡレベルの両方において、最近発見された、ゲノム全体に対するビタミンＤの広範な効果に関連している可能性が高い。そのため、免疫に対するビタミンＤの効果は、文脈に依存するフレームワークで評価される必要がある。

【0011】

免疫寛容性を維持するためには、制御性Ｔ（Ｔ_ＲＥＧ）細胞が不可欠である。Ｔ_ＲＥＧ細胞の量または質の減少は、いくつか例を挙げると、Ｉ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）、多発性硬化症、関節リウマチ、および全身性エリテマトーデスを含む多数の原発性自己免疫疾患の根本的な原因である。加えて、Ｔ_ＲＥＧ欠乏症は、原発性神経変性疾患の自然史における加速に関連している。最後に、Ｔ_ＲＥＧ欠乏症は、固形臓器および造血細胞移植設定における重篤な合併症、最も顕著には、増加した移植片拒絶率および移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）の率に関連する。免疫恒常性の維持におけるＴ_ＲＥＧ細胞のこの重要な役割を考慮すると、疾患の治療のためにＴ_ＲＥＧ細胞を促進するために多くの実験的アプローチが開発されている。そのような有望なアプローチの１つは、Ｔ_ＲＥＧ細胞の養子移入であり、これは、２つの主要なサブタイプで存在する：（１）年齢とともに関与し、それによって養子移入に利用可能なｎＴ_ＲＥＧ細胞の数を減少させる、胸腺に由来する天然（ｎ）Ｔ_ＲＥＧ細胞（「ｎＴ_ＲＥＧ」または「天然Ｔ_ＲＥＧ」）、および（２）より多くのエフェクターＴ細胞のプールから末梢で変換される誘導性（ｉ）Ｔ_ＲＥＧ細胞。ｎＴ_ＲＥＧ細胞は数が限られているため、ｎＴ_ＲＥＧ細胞を養子Ｔ細胞療法に用いる試みは、ｎＴ_ＲＥＧ細胞の単離およびその後の増殖のためのエクスビボ製造方法に依存している。養子細胞療法のためのｎＴ_ＲＥＧ細胞の臨床試験は、実施の初期段階にあり、主にＧＶＨＤの予防およびＴ１ＤＭの治療のための第Ｉ相／第ＩＩ相臨床試験にある。対照的に、ｉＴ_ＲＥＧ細胞（本開示のＴ_ＲＥＧおよびＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２細胞を含むエクスビボ産生Ｔ_ＲＥＧ細胞）を養子細胞療法で使用する可能性に関しては、他の課題、すなわち、（１）末梢エフェクターＴ細胞は比較的豊富であるが、それらは主に、限定的な複製および治療可能性を有するエフェクターメモリー成熟状態で存在すること、ならびに（２）そのような末梢エフェクターＴ細胞は、疾患発症に寄与するＴ細胞サブセット、すなわち、Ｔｈ１型およびＴｈ１７型サブセットに向かう高度な既存のエフェクター分化を有すること、が存在する。したがって、ｉＴ_ＲＥＧ細胞療法が高度に実現可能になるには、以下、（１）増殖電位の増加およびＴ_ＲＥＧ細胞治療電位の明らかな改善を有する、分化の少ないメモリー表現型へのエフェクターＴ細胞の脱分化を引き起こすこと、ならびに（２）Ｔ_ＲＥＧ表現型に向かってＴ細胞分化を促進しながら、病原性Ｔｈ１型およびＴｈ１７型経路を消滅させること、の両方を含むエクスビボ製造方法を開発する必要があるであろう。

【0012】

ＩＴ_ＲＥＧ細胞の製造は、治療される対象（自家療法の場合）または正常なドナー（同種遺伝子療法の場合）からのリンパ球含有末梢血単核細胞の収集によって開始される。典型的には、この収集は、定常状態、すなわち、いかなる成長因子の投与も行わずに行われる。しかしながら、同種異系の文脈において、収集は、ＤｉＰｅｒｓｉｏ ＪＦ，Ｓｔａｄｔｍａｕｅｒ ＥＡ，Ｎａｄｅｍａｎｅｅ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｐｌｅｒｉｘａｆｏｒ ａｎｄ Ｇ－ＣＳＦ ｖｅｒｓｕｓ ｐｌａｃｅｂｏ ａｎｄ Ｇ－ＣＳＦ ｔｏ ｍｏｂｉｌｉｚｅ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ．２００９；１１３（２３）：５７２０－５７２６に記載されるように、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）またはプレリキサフォルなどの分子を投与する文脈において行われることもある。本開示では、本発明者らは、抗ＴＮＦ－α治療薬は、Ｔ_ＲＥＧ表現型の培養入力Ｔ細胞を濃縮する目的でｉＴ_ＲＥＧ製造のためのリンパ球の収集の前に投与することができることを記載している。すなわち、本発明者らは、細胞表面の膜結合型ＴＮＦ－αを相対的に保存しながら、無血清、無細胞ＴＮＦ－αを優先的に阻害する組換え受容体である抗ＴＮＦ－α剤エタネルセプトが、ＲＮＡ配列決定によって測定される場合に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）レパートリーの大きな変化を誘導することを実証する。膜結合ＴＮＦ－αは、ＴＮＦＲ２受容体を介してＴ_ＲＥＧ細胞に陽性シグナルを提供するため、本発明者らの方法は、ｉＴ_ＲＥＧ細胞製造の前にＴ_ＲＥＧ細胞を濃縮するための堅牢な介入を提供する。抗ＴＮＦ－αモノクローナル抗体であるアダリムマブを含むが、これらに限定されない、無血清、無細胞ＴＮＦ－αを優先的に阻害する他の治療薬も、この介入に使用することができる。

【0013】

筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、進行性障害をもたらし、典型的には呼吸不全による死亡をもたらす、大脳皮質、脳幹、および脊髄に関与する原発性神経変性疾患である。ＡＬＳは、様々な遺伝的事象に起因する患者の１０％において家族性疾患であり、残りの患者は、孤発性ＡＬＳを有し、病因は知られていないが、環境要因を伴う場合がある。最新のレジストリデータ（２０１３年）は、米国におけるＡＬＳの罹患率が約１６，０００例であったことを示し、これらのデータはまた、ＡＬＳが白人、男性および、６０～６９歳の群の個人に過度に影響を与えることを示している。退役軍人、そして潜在的にプロのアメリカンフットボール選手は、ＡＬＳを発症する危険性が増加しているように見え、それによって、化学的曝露または外傷性脳損傷がこの疾患を発症する危険性を増加させる可能性があることを示唆している。ＡＬＳは、様々な臨床的提示および進行速度を有する異種疾患である。ＡＬＳ患者の平均生存期間は診断から２～４年であるが、生存期間は数ヶ月と短くなることも、または１０年を超えることもあり得る。患者報告のＡＬＳＦＲＳ－Ｒスコア（ＡＬＳ機能評価スケール、改訂版）などの疾患スコアシステムは、疾患進行の線形および非線形態様を考慮していないため、ＡＬＳ患者における予後を推定することは困難である。疾患進行速度の推定におけるこの難易度は、ＡＬＳにおける臨床試験の限界を表し、本発明者らが開発した免疫学的モニタリングを含む潜在的な疾患バイオマーカーが、プロトコル療法の構成要素として強調されるべきであることを示す。ＡＬＳの臨床的発症は潜行性であり、ほとんどの患者が上肢または下肢の脱力感、または発話または嚥下困難（延髄の発症）を呈する。ＡＬＳは、血液、脊髄液、または放射線学的検査が確定していないため、除外の診断として残っている。その結果、ＡＬＳは通常、他の疾患が除外された後の、除外の診断である。他の疾患を除外するこのプロセスは、典型的には最大１年かかることがあり、それによって治療的試みおよび臨床試験の発生を遅らせることができる。最終的にＡＬＳと診断される時点で、最大５０％の運動ニューロンが機能しなくなる可能性があるため、参照におけるこの遅延は、当然の成り行きである可能性が高い。この状況を考慮すると、通常、診断後の比較的早い時点でＡＬＳ患者を治験に利用することが推奨される。

【0014】

ＡＬＳは原発性神経変性疾患であり、神経炎症は二次的な増殖因子として作用する。この結論の証拠は、ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ－４３）の機能異常が、家族性および孤発性のＡＬＳ患者の大部分において生じるという観察から部分的に導き出される。ＴＤＰ－４３は、健常状態では核に限定され、凝集しやすいＲＮＡおよびＤＮＡ結合タンパク質であり、それによって、ＡＬＳ患者のニューロンに見られる細胞質封入体を占める。ＴＤＰ－４３経路の変化をもたらす正確な機構は、まだ完全に解明されていないが、様々な細胞ストレス事象、またはＲＮＡ中間体を介して自身を複製する遺伝子要素（後方移植性要素、ＲＴＥ）の増幅が関与しているように見える。最終的には、かかる事象は、プログラム壊死を含むニューロンにおける多面的プログラム細胞死をもたらす。注目すべきことに、ＡＬＳ患者に生じる壊死細胞死パターンは、より秩序あるアポトーシス細胞死と比較して特に免疫原性であることが示されている。実際に、ＡＬＳにおける運動ニューロン死の既知の分子媒介物であるＴＮＦ－αは、細胞死の壊死形態を産生することができる。壊死細胞死は、自己免疫誘導のために適応免疫系に提示することができる自己抗原の放出をもたらすことができる。加えて、タンパク質凝集体自体が免疫原性であり得るため、ＡＬＳ患者で生じるタンパク質凝集体（ＴＤＰ－４３、ＳＯＤ－１、ｐ６２を含むがこれらに限定されない）が、神経変性後に発する自己免疫応答の標的である可能性がある。実際、最近、ＡＬＳ患者からの単球が、ＴＤＰ－４３を含有するエクソソームでパルスされると炎症性表現型を発症することが示されている。

【0015】

原発性神経変性に応答して、先天性インフラマソームおよび適応性末梢免疫系が結合して、さらなる不正なＡＬＳ疾患進行をもたらすという広範な証拠が存在する。ＡＬＳのスーパーオキシドジスムターゼ－１（ＳＯＤ１）トランスジェニックマウスモデルにおいて、脊髄のＣＤ３^＋Ｔ細胞浸潤およびミクログリア細胞活性化は、疾患進行に寄与する炎症促進因子として認識された。さらに、ＡＬＳのＰＵ．１ノックアウトマウスモデルにおける宿主ミクログリア細胞と比較して炎症傾向が低下した野生型ミクログリア細胞の移植は、神経変性を減少させ、生存率を改善した。加えて、ＡＬＳのＳＯＤ１マウスモデルにおいて初めて、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の保護的役割が記載され、それによって、ＡＬＳにおける末梢免疫Ｔ細胞プールの両刃の剣のような性質を示した（増殖因子または保護因子のいずれかとして作用する）。ＡＬＳ患者では、末梢適応免疫系Ｔ細胞の有害な役割の直接的証拠は、脊髄に浸潤するＴ細胞がオリゴクローナルＴ細胞受容体（ＴＣＲ）レパートリーを発現することを実証することによって確認できる。さらに、末梢免疫系から出るプロフェッショナル抗原提示細胞（樹状細胞）は、炎症性末梢由来単球および常駐ＣＮＳミクログリア細胞と密接に関連して、ＡＬＳ患者脊髄組織内で単離することができる。さらに、ＡＬＳ患者において、精製された単球は、先天性炎症分子ＩＬ－１－βの増加を含む炎症促進ＲＮＡ発現プロファイルを発現し、次いで、ＣＤ４^＋Ｔ－ヘルパー－１（Ｔｈ１）、ＣＤ８^＋Ｔ細胞傷害性－１（Ｔｃ１）、およびＣＤ４^＋Ｔｈ１７媒介性神経変性免疫を促進するＩＬ－２３経路を駆動することができる。その後の研究では、ＡＬＳのＳＯＤ１マウスモデルにおける保護ＣＤ４^＋Ｔ細胞サブセットの表現型は、抗制御Ｔｈ２型サイトカインＩＬ－４およびＩＬ－１０を通じて部分的に媒介される機構を通じて炎症を低減する制御Ｔ（Ｔ_ＲＥＧ）細胞集団として特徴付けられた。

【0016】

この生物学は、以下、ミクログリア細胞は、神経変性を駆動する脳内の重要な細胞構成要素であり、ミクログリア細胞とＣＮＳ浸潤末梢ＣＤ４^＋Ｔ細胞が相互作用し、疾患の病因に影響を与える、ということを示す神経炎症研究における豊富なデータと一致する。マウスモデリング結果と一致して、ＦｏｘＰ３^＋Ｔ_ＲＥＧ細胞およびＴｈ２型Ｔ細胞について濃縮された末梢免疫系を有する患者は、主に炎症促進性Ｔｈ１型免疫プロファイルを有する患者と比較して、ＡＬＳの進行速度が低下した。さらに、ＡＬＳ患者のＴ_ＲＥＧ細胞が機能不全であり、そのような機能不全が疾患進行率および重症度と相関することが最近見出された。現在の臨床試験は、ＡＬＳの治療のためのｎＴ_ＲＥＧ細胞＋低用量ＩＬ－２投与の複数回の注入の使用を評価している（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ；ＮＣＴ０３２４１７８４）；ＩＬ－２は、ＳＴＡＴ５シグナル伝達経路を刺激するサイトカインであり、それによってｎＴ_ＲＥＧ細胞のインビボ増殖を促進することができる。

【0017】

誘導された（ｉ）Ｔ_ＲＥＧ細胞は、ｎＴ_ＲＥＧ細胞集団のように胸腺に由来せず、むしろ、ｉＴ_ＲＥＧは、Ｔｈ１細胞などの他の病原性の胸腺後Ｔ細胞サブセットから転換される集団である。ｎＴ_ＲＥＧおよびｉＴ_ＲＥＧの両方は、炎症応答の抑制において重要かつ非冗長な役割を果たすが、ｉＴ_ＲＥＧ療法の開発は、制御性Ｔ細胞の効力および製造の容易さの点で比較的有利である。さらに、ＡＬＳの養子ｉＴ_ＲＥＧ療法は、本発明者らが本開示にて説明する免疫モニタリング技法および宿主治療レジメン（ペントスタチン、シクロホスファミド、ラミブジン）と併用される場合に特に効果的である。

【0018】

１９９５年にＡＬＳ治療のために承認された最初の薬剤であったリルゾール（Ｒｉｌｕｔｅｋ（登録商標））は、ＡＬＳの罹患率と死亡率を低減するのにわずかに有効である。６０を超える分子がＡＬＳ療法のために調査されたという著しい臨床研究にもかかわらず、ささやかな臨床的成功を示したのは、抗酸化エダラボンおよびチロシンキナーゼ阻害剤マシチニブという、２つの追加の分子のみであった。最近、ＡＬＳの治療のためにＦＤＡが承認したエダラボン（Ｒａｄｉｃａｖａ（登録商標））は、最小限の臨床的利益を提供し、高価であり、２週間オン、２週間オフの毎日の連続点滴療法を必要としており、マシチニブはＦＤＡに承認されていない。ＡＬＳの治療のためのラパマイシンの第ＩＩ相試験が現在開始されている（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ０３３５９５３８）。ラパマイシンはまた、この薬剤がＴ_ＲＥＧ細胞再構築を促進する傾向に起因して、ＡＬＳで使用するのに好ましい薬剤となり得る。しかしながら、ラパマイシンによる長期療法は、実質的な毒性を有し、薬理学的モニタリングを必要とし、いくつかのモデルにおいて実際にＡＬＳを悪化させるという点で矛盾した効果を有する可能性があり、養子移入されたＴ細胞集団の拡大を限定し得る。

【0019】

したがって、非常に限られた治療選択しかない現在の状態を考慮すると、ＡＬＳの治療のための新規戦略を評価することが非常に必要である。本出願では、本発明者らは、誘導性（ｉ）制御性Ｔ（Ｔ_ＲＥＧ）細胞療法を中心とするＡＬＳの新規な治療アプローチを記載する。

【発明の概要】

【0020】

本開示は、Ｔ細胞の脱分化およびかかる細胞のＴ_ＲＥＧまたはＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２細胞への分化のための方法を対象とする。

【0021】

いくつかの実施形態において、初期の脱分化方法は、定常状態で採取された入力細胞集団（薬物投与なし）で培養を開始することを含むことができる。

【0022】

いくつかの実施形態において、本方法は、対象（自家の文脈で）、あるいは膜結合ＴＮＦ－αの相対的保存を伴って、ＴＮＦ－αの無血清、無細胞形態の阻害に対して優先的に選択的な抗ＴＮＦ－α治療薬で治療されていたか、または治療されている正常なドナー（同種異系の文脈で）から採取された入力細胞集団を用いて脱分化培養を開始することを含む。かかる治療剤としては、皮下注射によって週当たり２５～５０ｍｇの従来用量で投与することができる組換え受容体エタネルセプト、または静脈内注射によって週４０ｍｇまたは隔週４０ｍｇの従来用量で投与することができるモノクローナル抗体アダリムマブが挙げられるが、これらに限定されない。これらの事例の全てにおいて、抗ＴＮＦ－α治療薬の投薬量は、所望のバイオマーカー変化に従って調整することができ、これには、ＲＮＡ配列決定分析によるＴＣＲレパートリーの変化、ならびにフローサイトメトリーによって測定される２型ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ２）へ向かうシフト、および１型ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ１）から離れるシフトが含まれ得るが、これらに限定されない。

【0023】

いくつかの実施形態において、本方法は、ビタミンＤ、テムシロリムス、およびＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含む培養培地中で、対象からのＴ細胞を含む細胞の培養入力集団を細胞密度で植え付けることと、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁性ビーズを上記のＴ細胞および培養培地に１：１以下のビーズ：Ｔ細胞比で添加して、Ｔ細胞を刺激することと、または最も極端な例では、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８共刺激を添加しないことと、上記の培養入力集団および培養培地を一定期間インキュベートして、脱分化Ｔ細胞を得ることと、を含む。また、任意のビーズ共刺激の不在下でこの脱分化手順を実行することも可能である。

【0024】

上記の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、上記の脱分化したＴ細胞を採取することをさらに含み得る。

【0025】

上記の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、上記の脱分化したＴ細胞を採取した後に、上記の脱分化したＴ細胞の少なくとも一部をパッケージ中にパッケージ化することと、上記の脱分化したＴ細胞の上記の部分を含有する上記のパッケージを冷凍することと、をさらに含み得る。

【0026】

上記の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、細胞の上記の培養入力集団を上記の培養培地に植え付ける前に、上記の対象からの細胞の上記の培養入力集団を採取することをさらに含み得る。

【0027】

上記の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、上記の細胞の培養入力集団におけるＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲの発現レベルを測定することをさらに含んでよく、ここで、上記の細胞の培養入力集団におけるＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲの発現レベルがそれぞれ、Ｔ細胞の対照集団と比較して少なくとも５０％、より好ましくは９０％低減されるまで、上記の期間が続き、Ｔ細胞の上述の対照集団は、テムシロリムス、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤、およびビタミンＤを含まない細胞の培養入力集団と同じ条件下で製造される。

【0028】

上記の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、上記の細胞の培養入力集団におけるＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲおよびハウスキーピングタンパク質の発現レベルを測定することをさらに含んでもよく、上記の期間は、製造されたＴ細胞における、ハウスキーピングタンパク質によって正規化されたＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲの発現レベルが、テムシロリムス、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤、およびビタミンＤを含まない細胞の培養入力集団と同じ条件下で製造されたＴ細胞の対照集団における、それぞれ、ハウスキーピングタンパク質によって正規化されたＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲの発現レベルよりも少なくとも５０％、より好ましくは９０％低減されるまで続く。

【0029】

本開示はまた、上記の実施形態のいずれかの方法によって産生される脱分化Ｔ細胞を対象とする。

【0030】

本開示はまた、脱分化細胞の集団を含む組成物であって、上記の脱分化細胞の集団の少なくとも一部が、テムシロリムス、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤、およびビタミンＤを含まない細胞の培養入力集団と同じ条件下で製造されるＴ細胞の対照集団と比較して、少なくとも５０％、より好ましくは９０％低く、ＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲを発現する、組成物を対象とする。

【0031】

上記の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、上記の脱分化細胞の上記の集団の少なくとも一部を測定することをさらに含んでよく、それによって、これらは、Ｔ細胞の対照集団と比較して、以下の分子のＲＮＡ発現の少なくとも１０％、より好ましくは５０％の変化を発現し、すなわち、グランザイムＢ、ＩＬ－１０、およびＩＦＮ－γを含むが、これらに限定されないＴ細胞エフェクター分子の低減；Ｎａｎｏｇ、ＫＬＦ４、およびＫＬＦ１０を含むが、これらに限定されない分化状態の低下した細胞に関連する転写因子の増加；ＣＤ１２７、ＩＬ－７受容体α鎖を含むが、これらに限定されないナイーブＴ細胞サブセット上で優先的に発現する分子の発現の増加；Ｔ－ＢＥＴおよびＳＴＡＴ１を含むが、これらに限定されないＴＨ１型分化に関連する転写因子の低減；ならびにＨＩＦ－１αを含むが、これらに限定されない細胞生存を促進する転写因子の相対的保存を発現する。

【0032】

上記の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、上記の脱分化した細胞の上記の集団の少なくとも一部を測定することをさらに含み得、それによって、それらは、オートファジーを経験した細胞を示す分子の発現の少なくとも１０％、より好ましくは５０％変化して発現する。一例として、上記の脱分化細胞は、対照Ｔ細胞と比較して、ウェスタンブロット分析によるｐ６２の発現の増加を有する。また、Ｙｏｓｈｉｉ ＳＲ．Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ Ｎ．Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｎｄ Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ Ａｕｔｏｐｈａｇｙ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．２０１７；１８（９）：１８６５に記載されている方法などのオートファジーを測定する他の方法も適用してもよい。

【0033】

本開示はまた、上記の実施形態のいずれかの方法によって産生される脱分化Ｔ細胞を対象とする。

【0034】

本開示はまた、脱分化細胞の集団を含む組成物を対象としており、上記の脱分化した細胞の上記の集団の少なくとも一部分は、Ｔ細胞の対照集団と比較して、以下の分子のＲＮＡ発現の少なくとも１０％、より好ましくは５０％の変化を発現し、すなわち、グランザイムＢ、ＩＬ－１０、およびＩＦＮ－γを含むが、これらに限定されないＴ細胞エフェクター分子の低減；Ｎａｎｏｇ、ＫＬＦ４、およびＫＬＦ１０を含むが、これらに限定されない分化状態の低下した細胞に関連する転写因子の増加；ＣＤ１２７、ＩＬ－７受容体α鎖を含むが、これらに限定されないナイーブＴ細胞サブセット上で優先的に発現する分子の発現の増加；Ｔ－ＢＥＴおよびＳＴＡＴ１を含むが、これらに限定されないＴＨ１型分化に関連する転写因子の低減；ならびにＨＩＦ－１αを含むが、これらに限定されない細胞生存を促進する転写因子の相対的保存を発現する。

【0035】

本開示はまた、上記の脱分化細胞によって定義される脱分化細胞の集団を含む組成物であって、オートファジーを経験した細胞を示す分子の発現の少なくとも１０％、より好ましくは５０％変化して発現する組成物を対象とする。一例として、上記の脱分化細胞は、対照Ｔ細胞と比較して、ウェスタンブロット分析によるｐ６２の発現の増加を有する。また、Ｙｏｓｈｉｉ ＳＲ，Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ Ｎ．Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｎｄ Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ Ａｕｔｏｐｈａｇｙ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．２０１７；１８（９）：１８６５に記載されている方法などのオートファジーを測定する他の方法も適用することができる。

【0036】

本開示はまた、脱分化細胞の集団を含む組成物を対象としており、上記の脱分化細胞の上記の集団の少なくとも一部は、Ｔ細胞の対照集団と比較して、ＲＡＰＴＯＲおよびＲＩＣＴＯＲの両方の５０％未満を発現する。

【0037】

本開示は、脱分化Ｔ細胞をＴ_ＲＥＧまたはＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２細胞に分化させるための方法を対象とする。

【0038】

いくつかの実施形態において、本方法は、ＩＬ－２、ＩＬ－４、およびＴＧＦ－βを含む培養培地中で、本開示の脱分化Ｔ細胞、または他の方法で脱分化されたＴ細胞を培養することと、３：１（ビーズ：Ｔ細胞の比）の比率で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁性ビーズを添加することと、上記の比率（ビーズ：Ｔ細胞の比）で添加することと、脱分化Ｔ細胞を一定期間インキュベートしてＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２細胞を得ることと、を含む。

【0039】

いくつかの実施形態において、本方法は、ＩＬ－２、ＩＬ－４、およびＴＧＦ－βを含む培養培地中で、テムシロリムス、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤、およびビタミンＤを含まない細胞の培養入力集団と同じ条件下で製造されたＴ細胞の対照集団と比較して少なくとも５０％未満のＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲの発現の低減を有する脱分化Ｔ細胞を培養することと、３：１（ビーズ：Ｔ細胞の比）の比率で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁性ビーズを添加することと、上記の脱分化Ｔ細胞を一定期間インキュベートしてＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２細胞を得ることと、を含む。

【0040】

いくつかの実施形態において、本方法は、ＩＬ－２およびＴＧＦ－βを含む培養培地中で、テムシロリムス、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤、およびビタミンＤを含まない細胞の培養入力集団と同じ条件下で製造されたＴ細胞の対照集団と比較して少なくとも９０％未満のＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲの発現の低減を有する脱分化Ｔ細胞を培養することと、３：１（ビーズ：Ｔ細胞の比）の比率で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁性ビーズを添加することと、上記の脱分化Ｔ細胞を一定期間インキュベートしてＴ_ＲＥＧ細胞を得ることと、を含む。

【0041】

上記の実施形態のいずれかにおいて、培養培地は、ペメトレキセドをさらに含むことができる。

【0042】

本開示はまた、上記の方法のいずれかによって産生されるＴ_ＲＥＧまたはＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２細胞を対象とする。

【0043】

本開示はまた、筋萎縮性側索硬化症の治療を必要とする対象における筋萎縮性側索硬化症の治療方法を対象とする。

【0044】

いくつかの実施形態において、本方法は、上記の対象を１つ以上の一次治療サイクルに供することを含み、上記の１つ以上の一次治療サイクルのそれぞれは、上記の対象にペントスタチンを投与すること、および／または上記の対象にシクロホスファミドを投与することと、上記の対象を、治療有効量の製造されたＴ_ＲＥＧ細胞を含む組成物を上記の対象に投与することを含む１つ以上の免疫療法治療サイクルに供することと、を含む。

【0045】

いくつかの実施形態において、方法は、第１の治療サイクル、第２の治療サイクル、任意選択で、１つ以上の追加の治療サイクル、および１つ以上の免疫療法治療サイクルを含み、上記の第１の治療サイクルは、上記の対象にペントスタチンを投与すること、および／または上記の対象にシクロホスファミドを投与することを含み、上記の第２の治療サイクルは、上記の対象にペントスタチンを投与すること、および／または上記の対象にシクロホスファミドを投与することを含み、上記の１つ以上の追加の治療サイクルのそれぞれは、上記の対象にペントスタチンを投与すること、および／または上記の対象にシクロホスファミドを投与することを含み、上記の１つ以上の免疫療法治療サイクルのそれぞれは、上記の対象にペントスタチンを投与すること、および／または上記の対象にシクロホスファミドを投与することと、製造されたＴ_ＲＥＧ細胞を上記の対象に投与することとを含む。

【0046】

いくつかの実施形態において、方法は、上記の対象に、治療有効量の製造されたＴ_ＲＥＧ細胞を投与することを含む、１つ以上の治療サイクルを含む。

【0047】

いくつかの実施形態において、方法は、治療有効量の製造されたＴ_ＲＥＧ細胞を上記の対象に投与することを含むことができる。

【図面の簡単な説明】

【0048】

【図1A】様々な条件下で処理された対照細胞および細胞の正規化されたＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ発現を示す。

【図1B】様々な条件下で処理された対照細胞および細胞の正規化されたグランザイムＢ ｍＲＮＡ発現を示す。

【図1C】様々な条件下で処理された対照細胞および細胞の正規化されたＩＬ－１０ ｍＲＮＡ発現を示す。

【図1D】様々な条件下で処理された対照細胞および細胞の正規化されたＩＦＮ－γ ｍＲＮＡ発現を示す。図１Ａ～図１Ｄは、ビタミンＤおよびテムシロリムスの組み合わせがヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞中のエフェクター分子発現を低減させることを例示している。

【図2A】様々な条件下で処理された対照細胞および細胞の正規化されたＮＡＮＯＧ ｍＲＮＡ発現を示す。

【図2B】様々な条件下で処理された対照細胞および細胞についての正規化されたＫＬＦ４ ｍＲＮＡ発現を示す。

【図2C】様々な条件下で処理された対照細胞および細胞についての正規化されたＫＬＦ１０ ｍＲＮＡ発現を示す。

【図2D】様々な条件下で処理された対照細胞および細胞についての正規化されたＩＬ－７受容体ｍＲＮＡ発現を示す。図２Ａ～図２Ｄは、ビタミンＤおよびテムシロリムスの組み合わせが、ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞中の幹細胞関連転写因子および原子的Ｔ細胞分子ＩＬ－７受容体－αの発現を増加させることを例示する。

【図3A】様々な条件下で処理した対照細胞および細胞の正規化されたＴ－ＢＥＴ ｍＲＮＡ発現を示す。

【図3B】様々な条件下で処理された対照細胞および細胞についての正規化されたＳＴＡＴ１ ｍＲＮＡ発現を示す。

【図3C】様々な条件下で処理された対照細胞および細胞についての正規化されたＨＩＦ－１－α ｍＲＮＡ発現を示す。図３Ａ～図３Ｃは、ビタミンＤとテムシロリムスとの組み合わせが、Ｔ細胞生存期間に関連する転写因子、ＨＩＦ－１－αの発現を減少させることなく、エフェクターＴｈ１／Ｔｃ１細胞に関連する転写因子の発現を減少させることを示す。

【図4】様々な条件下で処理された細胞についてのアクチン発現によって正規化されたｐ６２発現を示し、ビタミンＤ、テムシロリムス、および抗ＩＬ－２受容体遮断の組み合わせが、オートファジー関連分子ｐ６２の発現を誘導することを示す。

【図5】様々な条件下で処理された細胞についてのアクチン発現によって正規化されたＲＡＰＴＯＲ発現を示し、ビタミンＤ、テムシロリムス、および抗ＩＬ－２受容体遮断の組み合わせが、ｍＴＯＲＣ１関連分子ＲＡＰＴＯＲの発現を低減することを示す。

【図6】様々な条件下で処理された細胞についてのＧＡＰＤＨ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＳＧＫ１、Ｒａｐｔｏｒ、およびＲｉｃｔｏｒ発現のウェスタンブロットを示し、ビタミンＤ、テムシロリムス、および抗ＩＬ－２受容体遮断の組み合わせが、ｍＴＯＲＣ１関連分子Ｒａｐｔｏｒ、およびｍＴＯＲＣ２関連分子Ｒｉｃｔｏｒの発現を低減することを示す。

【図7】様々な条件下で処理された細胞のアクチン発現によって正規化されたＢＩＭ発現を示し、ビタミンＤ、テムシロリムス、および抗ＩＬ－２受容体遮断の組み合わせが、プロアポトーシス分子ＢＩＭの発現を低減することを例示する。図８は、脱分化区間中の、後続のＴ細胞収率に対する培養成分の効果を例示する（培養の１３日目における）。

【図8】（培養の１３日目における）後続のＴ細胞収率に対する脱分化区間中の培養成分の効果を例示する。

【図9A】様々な条件下で処理した細胞についてＣＤ４５ＲＡ＋であるＣＤ４細胞のパーセントを示す。

【図9B】様々な条件下で処理した細胞についてのＣＤ６２Ｌ＋およびＣＣＲ７＋であるＣＤ４細胞のパーセントを示す。

【図9C】様々な条件下で処理した細胞についてのＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、およびＣＤ１２７＋であるＣＤ４細胞のパーセントを示す。図９Ａ～図９Ｃは、（培養の１３日目における）メモリーマーカーのＣＤ４＋Ｔ細胞発現に対する脱分化区間中の培養成分の効果を例示する。

【図10A】様々な条件下で処理した細胞についてのＣＤ６２Ｌ＋およびＣＣＲ７＋であるＣＤ８細胞のパーセントを示す。

【図10B】様々な条件下で処理した細胞についてのＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、およびＣＤ１２７＋であるＣＤ８細胞のパーセントを示す。図１０Ａおよび図１０Ｂは、メモリーマーカーのＣＤ８＋Ｔ細胞発現に対する脱分化区間中の培養成分の効果を例示する。

【図11A】図１１Ａ～図１１Ｄは、分極中性培地中で培養された脱分化Ｔ細胞の炎症性Ｔｈ１／Ｔｈ１７サイトカイン分析を示す。図１１Ａ：様々な条件下で処理された細胞についてのＩＦＮ－γ分泌を示す。

【図11B】様々な条件下で処理された細胞についてのＧＭ－ＣＳＦ分泌を示す。

【図11C】様々な条件下で処理された細胞についてのＴＮＦ－α分泌を示す。

【図11D】様々な条件下で処理された細胞についてのＩＬ－１７分泌を示す。

【図12A】図１２Ａ～図１２Ｄは、分極中性培地における培養された脱分化Ｔ細胞のＩＬ－２およびＴｈ２型サイトカイン分析を示す。図１２Ａ：様々な条件下で処理された細胞についてのＩＬ－２分泌を示す。

【図12B】様々な条件下で処理された細胞についてのＩＬ－４分泌を示す。

【図12C】様々な条件下で処理された細胞についてのＩＬ－５分泌を示す。

【図12D】様々な条件下で処理された細胞についてのＩＬ－１３分泌を示す。

【図13】ハイブリッドＴｈ２／ＴＲＥＧ分極条件において、Ｔｈ１分極条件と比較して、脱分化Ｔ細胞の好ましい拡張を示す。

【図14A】様々な条件下で処理された細胞についての全ＣＤ４＋細胞のうちのＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋細胞のパーセントを示す。

【図14B】様々な条件下で処理された細胞の全ＣＤ４＋細胞のうちのＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋細胞のパーセントを示す。

【図14C】様々な条件下で処理された細胞の全ＣＤ４＋細胞のうちのＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ１２７＋細胞のパーセントを示す。図１４Ａ～図１４Ｃは、ハイブリッドＴｈ２／Ｔ_ＲＥＧ分極条件における脱分化Ｔ細胞の培養が、ナイーブおよびトリプル陽性ＴセントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞の生成をもたらすことを例示する。

【図15A】様々な条件下で処理された細胞の全ＣＤ８細胞のうちのＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋細胞のパーセントを示す。

【図15B】様々な条件下で処理された細胞についての全ＣＤ８細胞のうちのＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ１２７＋細胞のパーセントを示す。図１５Ａおよび図１５Ｂは、ハイブリッドＴｈ２／Ｔ_ＲＥＧ分極条件における脱分化Ｔ細胞の培養が、トリプル陽性ＴセントラルメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の生成をもたらすことを例示する。

【図16A】様々な条件下で処理された細胞についてのＩＬ－２分泌を示す。

【図16B】様々な条件下で処理された細胞についてのＩＬ－４分泌を示す。

【図16C】様々な条件下で処理された細胞についてのＩＬ－５分泌を示す。図１６Ａ～図１６Ｃは、ハイブリッドＴｈ２／ＴＲＥＧ分極条件における脱分化Ｔ細胞の培養が、原子的Ｔｈ２細胞サイトカイン表現型：ＩＬ－２、ＩＬ－４、およびＩＬ－５分泌を伴うＴ細胞の生成をもたらすことを例示する。

【図17A】様々な条件下で処理された細胞についてのＩＬ－１０分泌を示す。

【図17B】様々な条件下で処理された細胞についてのＩＬ－１３分泌を示す。

【図17C】様々な条件下で処理された細胞についてのＩＬ－１７分泌を示す。図１７Ａ～図１７Ｃは、ハイブリッドＴｈ２／ＴＲＥＧ分極条件における脱分化Ｔ細胞の培養が、原子的Ｔｈ２細胞サイトカイン表現型：ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、およびＩＬ－１７分泌を伴うＴ細胞の生成をもたらすことを例示する。

【図18A】様々な条件下で処理された細胞についてのＩＦＮ－γ分泌を示す。

【図18B】様々な条件下で処理された細胞についてのＴＮＦ－α分泌を示す。

【図18C】様々な条件下で処理された細胞についてのＧＭ－ＣＳＦ分泌を示す。図１８Ａ～図１８Ｃは、ハイブリッドＴｈ２／ＴＲＥＧ分極条件における脱分化Ｔ細胞の培養が、原子的Ｔｈ２細胞サイトカイン表現型：ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、およびＧＭ－ＣＳＦ分泌を伴うＴ細胞の生成をもたらすことを例示する。

【図19A】日ごと、および培養阻害剤ごとの、培養物中のＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセントを示す。

【図19B】日ごと、および培養阻害剤ごとの、培養物中のＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋Ｔ細胞のパーセントを示す。

【図19C】日ごと、および培養阻害剤ごとの、培養物中のＣＤ４＋Ｔｂｅｔ＋Ｔ細胞のパーセントを示す。

【図19D】日ごと、および培養阻害剤ごとの、培養物中のＣＤ４＋ＧＡＴＡ３＋Ｔ細胞のパーセントを示す。図１９Ａ～図１９Ｄは、ペメトレキセドを含有するハイブリッドＴｈ２／ＴＲＥＧ分極条件における脱分化Ｔ細胞の拡張された培養が、ＦＯＸＰ３およびＧＡＴＡ３転写因子を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の生成をもたらすことを例示する。

【図20A】日ごと、および培養阻害剤ごとの、培養物中のＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントを示す。

【図20B】日ごと、および培養阻害剤ごとの、培養物中のＣＤ８＋ＦＯＸＰ３＋Ｔ細胞のパーセントを示す。

【図20C】日ごと、および培養阻害剤ごとの、培養物中のＣＤ８＋Ｔｂｅｔ＋Ｔ細胞のパーセントを示す。

【図20D】日ごと、および培養阻害剤ごとの、培養物中のＣＤ８＋ＧＡＴＡ３＋Ｔ細胞のパーセントを示す。図２０Ａ～図２０Ｄは、ペメトレキセドを含有するハイブリッドＴｈ２／ＴＲＥＧ分極条件における脱分化Ｔ細胞の拡張された培養が、ＦＯＸＰ３およびＧＡＴＡ３転写因子を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の生成をもたらすことを例示する。

【図21A】日ごと、および培養阻害剤ごとの、培養物中の細胞についてＩＬ－４分泌を示す。

【図21B】日ごと、および培養阻害剤ごとの、培養物中の細胞についてＩＬ－５分泌を示す。

【図21C】日ごと、および培養阻害剤ごとの、培養物中の細胞についてＩＬ－１３分泌を示す。図２１Ａ～図２１Ｃは、ハイブリッドＴｈ２／ＴＲＥＧ極性条件における脱分化Ｔ細胞の拡張された培養が、優勢なＴｈ２サイトカイン表現型：ＩＬ－４、ＩＬ－５、およびＩＬ－１３分泌を伴って発現するＴ細胞の生成をもたらすことを例示する。

【図22A】日ごと、および培養阻害剤ごとの、培養物中の細胞についてＩＬ－２分泌を示す。

【図22B】日ごと、および培養阻害剤ごとの、培養物中の細胞についてＩＦＮ－γ分泌を示す。

【図22C】日ごと、および培養阻害剤ごとの、培養物中の細胞についてＧＭ－ＣＳＦ分泌を示す。図２２Ａ～図２２Ｃは、ハイブリッドＴｈ２／ＴＲＥＧ極性条件における脱分化Ｔ細胞の拡張された培養が、優勢なＴｈ２サイトカイン表現型：ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、およびＧＭ－ＣＳＦ分泌を伴って発現するＴ細胞の生成をもたらすことを例示する。

【図23A】抗ＴＮＦ－α療法エタネルセプト療法が、ＲＮＡ配列決定によって測定される場合に、ＴＣＲレパートリーの著しい変化をもたらし、それによって、アフェレーシスによるリンパ球の収集の前の対象治療のための新しいアプローチを表すことを例示する。

【図23B】抗ＴＮＦ－α療法エタネルセプト療法が、ＲＮＡ配列決定によって測定される場合に、ＴＣＲレパートリーの著しい変化をもたらし、それによって、アフェレーシスによるリンパ球の収集の前の対象治療のための新しいアプローチを表すことを例示する。

【図24-1】ハイブリッドＴｈ２／ＴＲＥＧ分極条件における脱分化Ｔ細胞の拡張された培養が、対照Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞と比較して、以下の分子：ＣＤ２５、ＣＤ２７、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、およびＣＴＬＡの増加したレベルを発現するＴ細胞の生成をもたらすことを例示する。

【図24-2】（図２４－１の続き）

【図25-1】ハイブリッドＴｈ２／ＴＲＥＧ分極条件における脱分化Ｔ細胞の拡張された培養が、対照Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞と比較して、以下の分子：ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＩＣＯＳ、ＬＡＩＲ１、およびＯＸ４０の増加したレベルを発現するＴ細胞の生成をもたらすことを例示する。

【図25-2】（図２５－１の続き）

【図26A-1】フローサイトメトリーによって測定される、培養開始時および培養後のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞中のＦＯＸＰ３発現を示す。

【図26A-2】（図２６Ａ－１の続き）

【図26B-1】フローサイトメトリーによって測定される、培養開始時および培養後のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞中のＧＡＴＡ３発現を示す。

【図26B-2】（図２６Ｂ－１の続き）

【図27A-1】フローサイトメトリーによって測定される、培養開始時および培養後のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞中のＣＤ７３発現を示す。

【図27A-2】（図２７Ａ－１の続き）

【図27B-1】フローサイトメトリーによって測定される、培養開始時および培養後のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞中のＣＤ１０３発現を示す。

【図27B-2】（図２７Ｂ－１の続き）

【図28A】フローサイトメトリーによって測定される、培養開始時、培養後のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞における、ならびにｍＴＯＲ阻害剤に曝露していない対照Ｔ細胞について、フローサイトメトリーによって測定されるＣＤ１５０頻度を示す。

【図28B】フローサイトメトリーによって測定される、培養開始時および培養後のＣＤ４＋Ｔ細胞についてのＣＤ２７対ＣＤ９５発現を示す。

【図29-1】異なって培養された細胞および対照細胞についてのＩＬ－４、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１７、およびＧＭ－ＣＳＦを示す。

【図29-2】（図２９－１の続き）

【図29-3】（図２９－１の続き）

【図30A-1】ＲＡＰＡ－５０１細胞を伴う、または伴わない場合について、Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞のトランスウェルアッセイのためのサイトカイン含有量を示す。

【図30A-2】（図３０Ａ－１の続き）

【図30B-1】実施例２４におけるＣＤ４およびＰＤ１のアッセイのフローサイトメトリー結果を示す。

【図30B-2】（図３０Ｂ－１の続き）

【図31A】ＲＡＰＡ－５０１細胞への曝露を伴う、または伴わない場合について、ヒトミクログリア細胞についてのＩＬ－６、ＩＰ－１０、およびＩＦＮ－γ分泌を示す。

【図31B】ＲＡＰＡ－５０１細胞への曝露を伴う、または伴わない場合について、ヒトミクログリア細胞についてのＩＬ－６、ＩＰ－１０、およびＩＦＮ－γ分泌を示す。

【図32】ＰＣレジメンおよび全体的な治療アプローチを概略的に示す。

【図33】ＰＣ前およびＰＣ後レジメンによるリンパ球収集を概略的に示す。

【図34】ｉＴ_ＲＥＧ細胞の反復用量のそれぞれの前のＰＣレジメンを概略的に示す。

【図35】ｉＴ_ＲＥＧ細胞で治療された患者のモニタリングを概略的に示す。

【図36A】抗ＴＮＦ－α療法エタネルセプト療法が、ＲＮＡ配列決定によって測定される場合に、ＴＣＲレパートリーの著しい変化をもたらし、それによって、アフェレーシスによるリンパ球の収集の前の対象治療のための新しいアプローチを表すことを示す。

【図36B】抗ＴＮＦ－α療法エタネルセプト療法が、ＲＮＡ配列決定によって測定される場合に、ＴＣＲレパートリーの著しい変化をもたらし、それによって、アフェレーシスによるリンパ球の収集の前の対象治療のための新しいアプローチを表すことを示す。

【図37-1】ハイブリッドＴｈ２／Ｔ_ＲＥＧ分極条件における脱分化Ｔ細胞の拡張された培養が、対照Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞と比較して、以下の分子：ＣＤ２５、ＣＤ２７、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、およびＣＴＬＡの増加したレベルを発現するＴ細胞の生成をもたらすことを例示する。

【図37-2】（図３７－１の続き）

【図38-1】ハイブリッドＴｈ２／Ｔ_ＲＥＧ分極条件における脱分化Ｔ細胞の拡張された培養が、対照Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞と比較して、以下の分子：ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＩＣＯＳ、ＬＡＩＲ１、およびＯＸ４０の増加したレベルを発現するＴ細胞の生成をもたらすことを例示する。

【図38-2】（図３８－１の続き）

【図39】代替プロトコル設計を示す。

【図40A】ＣＤ４^＋細胞についてのフローサイトメトリーによって測定されるＲＡＰＡ－５０１ ＧＡＴＡ３およびＦＯＸＰ３を示す。

【図40B】ＣＤ８^＋細胞についてのフローサイトメトリーによって測定されるＲＡＰＡ－５０１ ＧＡＴＡ３およびＦＯＸＰ３を示す。

【図41-1】本開示の脱分化方法の例示的なワークフローを示す。

【図41-2】（図４１－１の続き）

【図41-3】（図４１－１の続き）

【図42】本開示のハイブリッドＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の推定される作用機構を示す。

【発明を実施するための形態】

【0049】

本開示は、Ｔ細胞脱分化および得られる細胞のための方法、脱分化Ｔ細胞からヒトハイブリッド制御性Ｔ／Ｔｈ２細胞（ハイブリッドＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２細胞）を製造するための方法、ならびに誘導制御性Ｔ（ｉＴ_ＲＥＧ）細胞を使用したＡＬＳ治療のための方法を提供する。

【0050】

定義
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈からそうでないことが明確に示されない限り、複数の指示対象を含む。

【0051】

特許請求の範囲および本開示における「または」という用語の使用は、代替物のみを指すよう明示的に示されない限り、または代替物が互いに排他的である場合を除き、「および／または」を意味するように使用される。

【0052】

「約」という用語の使用は、数値と共に使用される場合、＋／－１０％を含むことが意図される。例えば、多数のアミノ酸が約２００として特定される場合、これには１８０～２２０（プラスまたはマイナス１０％）が含まれる。

【0053】

「患者」、「個体」、および「対象」という用語は、本明細書で互換可能に使用され、ヒト患者が好ましく、治療される哺乳動物対象を指す。場合によっては、本発明の方法は、マウス、ラット、およびハムスターを含むげっ歯類、ならびに霊長類を含むがこれらに限定されない、実験動物、獣医用途、ならびに疾患のための動物モデルの開発において使用されることが見出される。

【0054】

「試料」は、最も広義に本明細書で使用される。細胞、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、抗体などを含む試料は、体液、細胞調製物の可溶性画分、または細胞が成長した培地；細胞から単離または抽出された染色体、器官、または膜；溶液中もしくは基質に結合したゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはｃＤＮＡ、ポリペプチド、またはペプチド；細胞、組織、組織プリント、指紋、皮膚、または毛髪などを含み得る。

【0055】

「治療」は、障害の病理または症状の発症を予防または改変することを意図して行われる介入である。したがって、「治療」は、療法的治療および予防または防止的な措置の両方を指すことができる。治療を必要としているものには、既に障害を患っているもの、および障害が防止されるべきであるものが含まれる。腫瘍（例えば、癌）治療において、治療剤は、腫瘍細胞の病理を直接減少させるか、または腫瘍細胞に、他の治療剤、例えば、放射線および／または化学療法による治療に対する感受性をさらに付与することができる。

【0056】

本明細書で使用される場合、「治療サイクル」は、概して、一次治療サイクル、第１の治療サイクル、第２の治療サイクル、または１つ以上の追加の治療サイクルのいずれかを指すことができる。

【0057】

本明細書で使用される「免疫細胞」は、Ｂ細胞とも呼ばれるＢリンパ球、Ｔ細胞とも呼ばれるＴリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、リンフォカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、単球、マクロファージ、好中球、顆粒球、肥満細胞、血小板、ランゲルハンス細胞、幹細胞、樹状細胞、末梢血単核細胞、腫瘍浸潤（ＴＩＬ）細胞、ハイブリドーマを含む遺伝子改変免疫細胞、薬物修飾免疫細胞、ならびに上記細胞型の誘導体、前駆体または前身物質を含むが、これらに限定されない、アッセイされ得る免疫系の任意の細胞を含むことを意味する。

【0058】

「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」は、胸腺に由来し、ＣＤ３複合体のタンパク質（例えば、再配列されたＴ細胞受容体、細胞の抗原／ＭＨＣ特異性を担うＴ細胞表面上のヘテロ二量体タンパク質）に関連するヘテロ二量体受容体を有するリンパ球のサブセットである。Ｔ細胞応答は、他の細胞に対するそれらの効果（例えば、標的細胞死滅、Ｂ細胞などの他の免疫細胞の活性化）、またはそれらが産生するサイトカインについてのアッセイによって検出され得る。

【0059】

本明細書で使用される場合、「脱分化Ｔ細胞」という用語は、本開示の方法のいずれかによって脱分化されたＴ細胞を指す。ある特定の態様では、脱分化Ｔ細胞は、テムシロリムス、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤およびビタミンＤなしで同じ条件下で製造されたＴ細胞の対照集団と比較して、ＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲの発現が低下している。「脱分化Ｔ細胞」は、患者から収集されたＴ細胞、すなわち、天然に存在するＴ細胞を含まない。

【0060】

本明細書で使用される場合、「抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８」という用語は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体を指すと理解されるべきである。例えば、「抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁性ビーズ」は、それに関連する抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体部分を有する磁性ビーズを指すと理解されるべきである。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８共刺激が提供されないことが開示される事例では、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁性ビーズなどの特定の形態によっても、これはまた、他の形態の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８との共刺激を除外することができることが理解されるべきである。

【0061】

抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体による共刺激が実施される本開示において、この共刺激は、任意の形態の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体で提供されてもよいことも理解されたい。例として限定されるものではないが、共刺激が抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを使用することによって行われると示される場合、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ナノ粒子または微粒子を使用することができる。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８共刺激が提供されないことが開示される事例では、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁性ビーズなどの特定の形態によっても、これはまた、他の形態の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８との共刺激を除外することができることが理解されるべきである。

【0062】

本明細書で使用される「ヒトハイブリッドＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞」、「ｉＴＲＥＧ」、および「ＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞」という用語は、別途記載されない限り、本開示の方法によって分化された細胞を指す。本開示の「ヒトハイブリッドＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞」、「ｉＴＲＥＧ」および「ＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞」は、患者から収集したＴ細胞、すなわち、天然に存在するＴ細胞を含まない。

【0063】

本明細書で使用される場合、「製造されたＴＲＥＧ細胞」という用語は、本開示の脱分化および再分化方法によって産生される細胞を指し、別途記載されない限り、ＴＲＥＧ細胞およびヒトハイブリッドＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞を含むと理解され得る。

【0064】

本明細書で使用される場合、「対照Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞」は、別途記載されない限り、ビタミンＤ、テムシロリムス、またはＩＬ－２シグナル伝達阻害剤で処理されておらず、むしろ、２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２および２０，０００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ－αを補充した培地中で３：１（ビーズ：Ｔ細胞）の比率で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁性被覆ビーズで共刺激され、それ以外の場合、それらを比較している細胞と同じように培養された細胞を指す。細胞（または対照Ｔ細胞）の対照集団が、テムシロリムス、ビタミンＤおよびＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含む培養添加物なしで処理されたものと称される場合、または脱分化細胞の文脈において、この集団（またはＴ細胞）は、２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２および２０，０００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ－αを補充した培地中で３：１の比率で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁性被覆ビーズ（ビーズ：Ｔ細胞）とさらに共刺激され、それ以外の場合、それらを比較している細胞と同じように培養された、すなわち、それらが「対照Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞」であることも理解されたい。

【0065】

本開示は、新規の薬理学的組み合わせおよび定義されたＴ細胞共刺激条件を使用して、分化されたエフェクターメモリーＴ細胞を分化の少ないセントラルメモリー型Ｔ細胞に変換することに基づく、低減された分化状態のＴ細胞のエクスビボ生成のための新しい方法論を提供する。

【0066】

図４１に示されるように、本開示の脱分化したＴ細胞は、チェックポイント阻害剤受容体（ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、およびＬＡＧ３など）、メモリーマーカー（ＣＤ４５ＲＯなど）、ならびに運命分子（ＴＢＥＴ、ＲＯＲγ、ＦＯＸＰ３、およびＧＡＴＡ３など）の発現が少ないか、または全く発現しない静止表現型を有し得る。再分化Ｔ細胞は、ＧＡＴＡ３およびＦＯＸＰ３発現を特徴とするハイブリッド運命、ならびにＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ１５０発現を特徴とする幹細胞メモリーを有することができ、チェックポイントタンパク質発現はない。

【0067】

図４２には、本開示のハイブリッドＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の推定される作用機序が示され、これは、ＣＤ３９またはＣＤ７３受容体を介した炎症によって、およびＴＮＦ－αによってハイブリッドＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２細胞を活性化することができ、これにより細胞が病原性Ｔ細胞を調節して殺傷を防止することを可能にすることができる。

【0068】

Ｔ細胞脱分化のための方法および得られる細胞
本発明者らは、新規の薬理学的組み合わせおよび定義されたＴ細胞共刺激条件を使用して、分化されたエフェクターメモリーＴ細胞を分化の少ないセントラルメモリー型Ｔ細胞に変換することに基づく、低減された分化状態のＴ細胞のエクスビボ生成のための新しい方法論を提供する。

【0069】

一実施形態において、本方法は、ビタミンＤ、テムシロリムス、およびＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含む培養培地中で、対象からのＴ細胞を含む細胞の培養入力集団を細胞密度で植え付けることと、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁性ビーズを上記のＴ細胞および培養培地に１：１以下のビーズ：Ｔ細胞比で添加して、または任意の共刺激ビーズを添加することなく、Ｔ細胞を刺激することと、培養入力集団および培養培地を一定期間インキュベートして、脱分化Ｔ細胞を得ることと、を含む。いくつかの実施形態において、対象は、細胞の培養入力集団の収集の前に抗ＴＮＦ－α療法で治療されている。いくつかの実施形態において、抗ＴＮＦ－α療法は、エタネルセプトまたはアダリムマブである。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８との共刺激は、実施されない。

【0070】

上記の実施形態のいずれかにおいて、上記の培養培地はＩＬ－２を含有することはできず、上記の培養培地にＩＬ－２を添加することはできない。

【0071】

上記の実施形態のいずれかにおいて、上記の細胞密度は、１ｍＬ当たり約１．５×１０６Ｔ細胞～１ｍＬ当たり１８×１０６Ｔ細胞であり得る。例として限定されるものではないが、１ｍＬ当たり６×１０６Ｔ細胞～１８×１０６Ｔ細胞、１ｍＬ当たり１２×１０６Ｔ細胞～１８×１０６Ｔ細胞、１ｍＬ当たり１．５×１０６Ｔ細胞～１２×１０６Ｔ細胞、１ｍＬ当たり１．５×１０６Ｔ細胞～６×１０６Ｔ細胞、１ｍＬ当たり６×１０６Ｔ細胞～１ｍＬ当たり１２×１０６Ｔ細胞、または１ｍＬ当たり１．５×１０６Ｔ細胞、１ｍＬ当たり３×１０６Ｔ細胞、１ｍＬ当たり６×１０６Ｔ細胞、１ｍＬ当たり９×１０６Ｔ細胞、１２×１０６Ｔ細胞、１ｍＬ当たり１５×１０６Ｔ細胞、または１８×１０６Ｔ細胞が挙げられる。いくつかの実施形態において、例として限定されるものではないが、１ｍＬ当たり９×１０６Ｔ細胞または１ｍＬ当たり１８×１０６Ｔ細胞などのより高い密度で細胞培養を開始することが好ましい場合があることが予想される。

【0072】

上記の実施形態のいずれかにおいて、上記のテムシロリムスは、約０．３μＭ～約１０μＭの濃度で存在することができる。例として限定されるものではないが、上記のテムシロリムスは、約０．３μＭ～約１μＭ、０．３μＭ～約０．７５μＭ、０．３μＭ～約０．５μＭ、０．５μＭ～約１μＭ、０．７５μＭ～約１μＭ、０．５μＭ～約０．７５μＭ、０．３μＭ～約１０μＭ、０．３μＭ～約５μＭ、０．３μＭ～約３．３μＭ、１μＭ～約３．３μＭ、５μＭ～約１０μＭ、３．３μＭ～約１０μＭ、３．３μＭ～約５μＭの濃度で、または例として限定されるものではないが、約０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭ、もしくは１μＭ、２μＭ、３μＭ、３．３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、もしくは１０μＭの濃度で、上記の培養培地中に存在することができる。

【0073】

上記の実施形態のいずれかにおいて、上記のＩＬ－２シグナル伝達阻害剤は、抗ＩＬ－２受容体抗体またはその断片であり得る。例として限定されるものではないが、上記のＩＬ－２シグナル伝達阻害剤は、バシリキシマブまたはダクリズマブであり得る。例として限定されるものではないが、上記のＩＬ－２シグナル伝達阻害剤は、５～５０μｇ／ｍＬ、５～４０μｇ／ｍＬ、５～３０μｇ／ｍＬ、５～２０μｇ／ｍＬ、５～１０μｇ／ｍＬ、１０～５０μｇ／ｍＬ、２０～５０μｇ／ｍＬ、３０～５０μｇ／ｍＬ、４０～５０μｇ／ｍＬ、３０～４０μｇ／ｍＬ、２０～４０μｇ／ｍＬ、１０～４０μｇ／ｍＬ、５～４０μｇ／ｍＬ、５～３０μｇ／ｍＬ、５～２０μｇ／ｍＬ、５～１０μｇ／ｍＬ、１０～２０μｇ／ｍＬ、１０～３０μｇ／ｍＬ、２０～３０μｇ／ｍＬ、または例とし限定されるものではないが、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１５μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、３５μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、４５μｇ／ｍＬ、もしくは５０μｇ／ｍＬの濃度で上記の培養培地中に存在する。

【0074】

上記の実施形態のいずれかにおいて、例として限定されるものではないが、上記の期間は、約１．５日～約５日、１．５日～約３．５日、１．５日～約２．５日、２．５日～約３．５日、２．５日～約５日、３．５日～約５日、または約１．５日、２日、２．５日、３日、３．５日、４日、４．５日、または５日であり得る。いくつかの実施形態において、ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２還元のレベルは、最適な培養区間を決定するためのガイドとして使用され得る。いくつかの実施形態において、以下を含むがこれらに限定されない、脱分化細胞の他の分子シグネチャーを使用して、最適培養区間を決定することができる：Ｔ細胞エフェクター分子のＲＮＡ発現（すなわち、ＩＦＮ－γの減少）、転写因子のＲＮＡ発現（すなわち、ＫＬＦ４の増加）、オートファジーシグネチャーの証拠（すなわち、ｐ６２の増加）、およびナイーブＴ細胞サブセット上に存在するマーカーの上方制御（すなわち、ＣＤ１２７の増加）。

【0075】

上記の実施形態のいずれかにおいて、例として限定されるものではないが、上記のビーズ：Ｔ細胞の比は、１：３であり得るか、または共刺激を行うことはできない。例として限定されるものではないが、上記のビーズ：Ｔ細胞の比は、１：１～１：１２、１：１～１：３、１：３～１：１２であり得る。さらなる例として限定されるものではないが、上記のビーズ：Ｔ細胞の比は、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、または１：１２であり得る。最後に、最も極端な例では、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８共刺激を利用することはできない、すなわち、いくつかの実施形態において、初期脱分化プロセス中に抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８共刺激を行わない。

【0076】

上記の実施形態のいずれかにおいて、細胞の培養入力集団の共刺激は、推奨されるものよりも低い濃度で使用され得る抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８含有ナノ粒子を使用して達成され得る。例として限定されるものではないが、このようなナノ粒子は、推奨用量の約０．０１倍～約０．１倍、約０．０２５倍～約０．１倍、約０．０５倍～約０．１倍、約０．０７５倍～約０．１倍、約０．０１倍～約０．０７５倍、約０．０１倍～約０．０５倍、約０．０１倍～約０．０２５倍、約０．０２５倍～約０．０７５倍、約０．０２５倍～約０．０５倍、約０．０５倍～約０．０７５倍、または約０．０１倍、約０．０２５倍、約０．０５倍、約０．０７５倍、または約０．０１倍で使用することができる。例として、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ（登録商標）Ｔ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）などの試薬は、１×１０６Ｔ細胞当たり１０μＬの推奨用量と比較して減少した用量で使用することができ、例えば、例として、１．１μＬ（９倍の減少）または約０．１１倍であるが、これに限定されない。最後に、最も極端な例では、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８共刺激を利用することはできない、すなわち、いくつかの実施形態において、初期脱分化プロセス中に抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８共刺激を行わない。

【0077】

あるいは、製造されたＴ細胞を産生するために抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８共刺激を使用する場合、共刺激源は、溶解性抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８微粒子によって提供され得る。例として限定されるものではないが、溶解性抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８微粒子は、製造業者が推奨する強度（例えば、Ｃｌｏｕｄｚ（登録商標）；Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｅ）の２０％で使用することができる。さらなる例として、溶解性抗ＣＤ３－抗ＣＤ２８微粒子は、製造業者の推奨強度の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、または３０％で使用され得る。

【0078】

上記の実施形態のいずれかにおいて、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激は、実施される場合、所望の脱分化の細胞特性を達成するのに十分な量の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８を使用して実施することができる。

【0079】

上記の実施形態のいずれかにおいて、上記の培地は、５％のヒト血清をさらに含むことができる。例として限定されるものではないが、上記の培養培地は、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％のヒト血清、およびそれらの間の値を含む任意の範囲を含むことができる。

【0080】

上記の実施形態のいずれかにおいて、上記の培地は、Ｘ－Ｖｉｖｏ ２０培地を含むことができる。Ｔ細胞を培養するための任意の適切な培養培地が使用され得る。

【0081】

上記の実施形態のいずれかにおいて、例として限定されるものではないが、上記のビタミンＤは、約０．０３ｎＭ～約１ｎＭ、０．０３ｎＭ～約０．５ｎＭ、０．０３ｎＭ～約０．１ｎＭ、０．０３ｎＭ～約０．０５ｎＭ、０．０５ｎＭ～約０．１ｎＭ、０．０５ｎＭ～約０．５ｎＭ、０．０５ｎＭ～１ｎＭ、０．１ｎＭ～約１ｎＭ、０．１ｎＭ～約０．５ｎＭ、または０．５ｎＭ～約１ｎＭで、または例として限定されるものではないが、上記のビタミンＤは、約０．０３ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、または１ｎＭの濃度で存在することができる。

【0082】

上記の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、上記の細胞の培養入力集団におけるＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲおよびハウスキーピングタンパク質の発現レベルを測定することをさらに含むことができ、上記の期間は、製造されたＴ細胞におけるＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲの発現レベルが、Ｔ細胞の対照集団と比較して少なくとも５０％低減されるまで続き、上記のＴ細胞の対照集団は、テムシロリムス、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤、およびビタミンＤを含まない細胞の培養入力集団と同じ条件下で製造される。いくつかの実施形態において、この期間は、製造されたＴ細胞におけるＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲの発現レベルが、テムシロリムス、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤、およびビタミンＤを含まない細胞の培養入力集団と同じ条件下で製造されたＴ細胞の対照集団と比較してそれぞれ５０％以上低減されるまで続く。例として、これらに限定されないが、この期間は、テムシロリムス、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤およびビタミンＤを含まない細胞の培養入力集団と同じ条件下で製造されたＴ細胞の対照集団と比較して、ＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲの発現レベルがそれぞれ、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上低減されるまで続けることができる。

【0083】

上記の実施形態のいずれかにおいて、上記のハウスキーピングタンパク質は、アクチンであり得る。いくつかの実施形態において、ハウスキーピングタンパク質は、ＧＡＰＤＨであり得る。上記の実施形態のいずれかにおいて、発現レベルを測定する工程は、ウェスタンブロット分析によって実行され得る。

【0084】

上記の実施形態のいずれかにおいて、この期間は、上記の細胞の培養入力集団におけるＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲの発現レベルが、テムシロリムス、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤、およびビタミンＤを含まない細胞の培養入力集団と同じ条件下で製造されるＴ細胞の対照集団と比較して少なくとも５０％低減されるまで続けることができる。いくつかの実施形態において、ＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲの発現レベルの低減は、Ｔ細胞の対照集団と比較して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上であることができる。

【0085】

上記の実施形態のいずれかにおいて、初期の脱分化培養の期間は、ＲＮＡ発現パターンが、テムシロリムス、ビタミンＤ、およびＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含まない同じ条件下で培養された対照Ｔ細胞と比較して少なくとも１０％、より最適に５０％異なるまで続けることができ、すなわち、グランザイムＢ、ＩＬ－１０、およびＩＦＮ－γを含むが、これらに限定されないＴ細胞エフェクター分子の低減；Ｎａｎｏｇ、ＫＬＦ４、およびＫＬＦ１０を含むが、これらに限定されない低減された分化状態の細胞に関連する転写因子の増加；ＣＤ１２７、ＩＬ－７受容体α鎖を含むが、これらに限定されないナイーブＴ細胞サブセット上で優先的に発現される分子の発現の増加；Ｔ－ＢＥＴおよびＳＴＡＴ１を含むが、これらに限定されないＴｈ１型分化に関連する転写因子の低減；ならびにＨＩＦ－１αを含むがこれに限定されない、細胞生存を促進する転写因子の相対的保存となるまで続けることができる。

【0086】

上記の実施形態のいずれかにおいて、初期の脱分化培養の期間は、テムシロリムス、ビタミンＤ、およびＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含まない同じ条件下で培養された対照Ｔ細胞と比較して、ＲＮＡ発現パターンが少なくとも１０％、より最適には５０％異なるまで続けることができ、すなわち、オートファジーを受けた細胞を示す分子の発現に少なくとも１０％、より好ましくは５０％の変化が存在するまで続けることができる。一例として、上記の脱分化細胞は、対照Ｔ細胞と比較してウェスタンブロット分析によるｐ６２の発現の増加を有し、例として限定されるものではないが、Ｙｏｓｈｉｉ ＳＲ，Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ Ｎ．Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｎｄ Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ Ａｕｔｏｐｈａｇｙ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．２０１７；１８（９）：１８６５に記載されている方法などのオートファジーを測定する他の方法も適用してもよい。

【0087】

上記の実施形態のいずれかにおいて、培養培地は、ヒト血清、テムシロリムス、ビタミンＤ、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせを含有せず、培養開始時に培養培地に存在しないことができる。そのような実施形態において、ヒト血清、テムシロリムス、ビタミンＤ、またはＩＬ－２シグナル伝達阻害剤は、細胞の培養物入力集団の接種とほぼ同時に、またはその後の時間に培養培地に添加することができる。

【0088】

例として限定されるものではないが、１，２５－ビタミンＤ（「カルシトリオール」）の静脈内製剤を使用することができる。この製剤は、培養培地に完全に可溶性であり、腎臓において天然に産生される１，２５ヒドロキシル化を有するので、培養にビタミンＤを添加するときに存在しなければならないために、好ましい。カルシトリオールの商品名には、Ｒｏｃａｌｔｒｏｌ、Ｃａｌｃｉｊｅｘ、およびＤｅｃｏｓｔｒｉｏｌが含まれる）。Ｍａｅｓｔｒｏ ｅｔ ａｌ；Ｖｉｔａｍｉｎ Ｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２０１６：ｎｏｖｅｌ ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｎｓｉｇｈｔｓ；Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐａｔｅｎｔｓ；Ｖｏｌｕｍｅ ２６，２０１６；ｉｓｓｕｅ １１に記載されるように、リトコール酸を含むがこれらに限定されない、他のビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）リガンドがカルシトリオールに置換され得ることも想定される。

【0089】

いくつかの実施形態において、本開示の方法のいずれかによって得られる脱分化Ｔ細胞が提供される。いくつかの実施形態において、脱分化Ｔ細胞の集団を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態において、脱分化Ｔ細胞の少なくとも一部は、テムシロリムス、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤、およびビタミンＤを含まない細胞の培養入力集団と同じ条件下で製造されたＴ細胞の対照集団と比較して、５０％未満のＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲを発現する。いくつかの実施形態において、脱分化Ｔ細胞は、テムシロリムス、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤、およびビタミンＤを含まない細胞の培養入力集団と同じ条件下で製造されたＴ細胞の対照集団と比較して、５０％未満のＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲを発現する。例として限定するものではないが、上記の脱分化Ｔ細胞または脱分化Ｔ細胞の集団は、それぞれ、テムシロリムス、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤、およびビタミンＤを含まない細胞の培養入力集団と同じ条件下で製造されたＴ細胞の対照集団と比較して、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％、またはそれ未満のＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲを発現することができる。

【0090】

いくつかの実施形態において、脱分化Ｔ細胞集団または脱分化Ｔ細胞は、テムシロリムス、ビタミンＤ、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含まない同じ条件下でインキュベートされる対照Ｔ細胞集団と比較して、グランザイムＢを含むがこれに限定されない細胞溶解分子について、および／またはＩＦＮ－γを含むがこれらに限定されないサイトカイン分子については、ＲＮＡ発現の低下によって特徴付けることができる。そのような低下は、例として限定されるものではないが、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％以上であり得る。

【0091】

いくつかの実施形態において、脱分化Ｔ細胞集団または脱分化Ｔ細胞は、テムシロリムス、ビタミンＤ、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含まない同じ条件下でインキュベートされる対照Ｔ細胞集団と比較して、Ｎａｎｏｇ、ＫＬＦ４、およびＫＬＦ１０を含むがこれらに限定されないｉＰＳＣに関連する転写因子について、および／またはＩＬ－７受容体、ＣＤ１２７を含むがこれらに限定されないナイーブＴ細胞に関連する分子については、ＲＮＡ発現の増加によって特徴付けることができる。そのような増加は、例として限定されるものではないが、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％以上であり得る。

【0092】

いくつかの実施形態において、脱分化Ｔ細胞集団または脱分化Ｔ細胞は、テムシロリムス、ビタミンＤ、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含まない同じ条件下でインキュベートされる対照Ｔ細胞集団と比較して、ほぼ同等のＨＩＦ－１－α発現を同時に維持しながら、Ｔ－ＢｅｔおよびＳＴＡＴ１を含むがこれらに限定されないＴｈ１エフェクターＴ細胞に関連する転写因子については、ＲＮＡ発現の低下によって特徴付けることができる。そのような低下は、例として限定されるものではないが、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％以上であり得る。例として限定されるものではないが、ＨＩＦ－１－α発現は、約２０％、１５％、１０％、または５％、または対照Ｔ細胞集団内であり得る。

【0093】

いくつかの実施形態において、脱分化Ｔ細胞の集団または脱分化Ｔ細胞は、テムシロリムス、ビタミンＤ、およびＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含まない同じ条件下でインキュベートされたＴ細胞の対照集団と比較して、ｐ６２のタンパク質発現の増加によって特徴付けることができる。そのような増加は、例として限定されるものではないが、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％以上であり得る。

【0094】

ヒトハイブリッド制御性Ｔ／Ｔｈ２細胞（ハイブリッドＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２細胞）および脱分化Ｔ細胞からのＴ_ＲＥＧの製造方法
本開示では、本発明者らは、Ｔｈ１型およびＴｈ１７型分極の枯渇と組み合わせた早期分化状態のために増強されたｉＴＲＥＧ細胞の生成をもたらすエクスビボ製造プロセスを提供する。この方法には、２工程のプロセスが必要であり、第１の工程は、Ｔ細胞の脱分化からなり、第２の工程は、ｉＴＲＥＧ細胞製造からなる。この脱分化Ｔ細胞基質からのヒトｉＴＲＥＧ細胞の製造は、新規のサイトカインの組み合わせ（ＩＬ－２およびＴＧＦ－βサイトカインの標準的なｉＴＲＥＧ使用＋Ｔｈ２分化と古典的に関連するサイトカインＩＬ－４の追加の使用）、および任意選択で、本明細書に記載の新規の薬剤ペメトレキセドを使用して行うことができる。いくつかの実施形態において、ｉＴＲＥＧ細胞は、ペメトレキセドなしで生成され得る。かかる細胞は、ＴＲＥＧおよびＴｈ２分子の両方の発現を有するため、この方法によって生成される細胞は、「ヒトハイブリッドＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞」と称される。

【0095】

いくつかの実施形態において、本方法は、ＩＬ－２、ＩＬ－４、およびＴＧＦ－βを含む培養培地中で、本開示の脱分化Ｔ細胞を培養することと、例えば３：１（ビーズ：Ｔ細胞の比）の比率で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁性ビーズを添加することと、上記の比率（ビーズ：Ｔ細胞の比）で添加することと、脱分化Ｔ細胞を一定期間インキュベートしてＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞を得ることと、を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、本開示の脱分化したＴ細胞の集団を培養することを含む。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズの比は、共刺激が細胞を分化するのに十分である限り、変化させることができる。

【0096】

いくつかの実施形態において、本方法は、ＩＬ－２、ＩＬ－４、およびＴＧＦ－βを含む培養培地中で、テムシロリムス、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤、およびビタミンＤを含まない同じ条件下で製造されたＴ細胞の対照集団と比較してＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲの発現の低減を有する脱分化Ｔ細胞を培養することと、例えば３：１（ビーズ：Ｔ細胞の比）の比率で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁性ビーズを添加することと、上記の脱分化Ｔ細胞を一定期間インキュベートしてＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞を得ることと、を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、本開示の脱分化したＴ細胞の集団を培養することを含む。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズの比は、共刺激が細胞を分化するのに十分である限り、変化させることができる。いくつかの実施形態において、ＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲの発現は、例えば、アクチンまたはＧＡＰＤＨであるが、これらに限定されないハウスキーピングタンパク質によって正規化される。

【0097】

上記の実施形態のいずれかにおいて、ＩＬ－２は、約１００ＩＵ／ｍｌ～１０，０００ＩＵ／ｍｌ、１００ＩＵ／ｍｌ～１，０００ＩＵ／ｍｌ、１，０００ＩＵ／ｍｌ～１０，０００ＩＵ／ｍｌ、または約１００ＩＵ／ｍｌ、１，０００ＩＵ／ｍｌ、または１０，０００ＩＵ／ｍｌの濃度で上記の培養培地中に存在することができる。

【0098】

上記の実施形態のいずれかにおいて、培養培地は、ＩＬ－４．をさらに含むことができる。上記の実施形態のいずれかにおいて、ＩＬ－４は、約１００ＩＵ／ｍＬ～１０００ＩＵ／Ｍｌ、１００ＩＵ／ｍＬ～１０００ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ～２５０ＩＵ／ｍＬ、１００ＩＵ／ｍＬ～５００ＩＵ／ｍＬ、２５０ＩＵ／ｍＬ～１０００ＩＵ／ｍＬ、５００ＩＵ／ｍＬ～１０００ＩＵ／ｍＬ、２５０ＩＵ／ｍＬ～５００ＩＵ／ｍＬ、または、１００ＩＵ／ｍＬ、２００ＩＵ／ｍＬ、３００ＩＵ／ｍＬ、４００ＩＵ／ｍＬ、５００ＩＵ／ｍＬ、６００ＩＵ／ｍＬ、７００ＩＵ／ｍＬ、８００ＩＵ／ｍＬ、９００ＩＵ／ｍＬ、もしくは１０００ＩＵ／ｍＬの濃度で、上記の培養培地中に存在することができる。いくつかの実施形態において、例として限定されるものではないが、減少したＴｈ２分極を達成することが望ましい場合、１００ＩＵ／ｍＬなどのより低い濃度を使用することができる。

【0099】

上記の実施形態のいずれかにおいて、ＴＧＦ－βは、約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で上記の培養培地中に存在することができる。例として限定されるものではないが、ＴＧＦ－βの濃度は、約５ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、または１０ｎｇ／ｍＬであり得る。

【0100】

分化のための上記の実施形態のいずれかにおいて、上記のビーズ：Ｔ細胞の比は、３：１であり得る。いくつかの実施形態において、同じ効果を有する等価量の代替形態の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８を使用することができる。いくつかの実施形態において、共刺激の量は、細胞を飽和させるのに十分である。上記の実施形態のいずれかにおいて、共刺激の量は、ヒトハイブリッドＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞におけるＧＡＴＡ３およびＦＯＸＰ３の発現を増加させるのに十分であり得る。

【0101】

上記の実施形態のいずれかにおいて、培地は、ペメトレキセドをさらに含むことができる。例として限定されるものではないが、ペメトレキセドは、約１ｎＭ～１００ｎＭ、５ｎＭ～１００ｎＭ、１０ｎＭ～１００ｎＭ、２５ｎＭ～１００ｎＭ、５０ｎＭ～１００ｎＭ、７５ｎＭ～１００ｎＭ、５０ｎＭ～７５ｎＭ、２５ｎＭ～７５ｎＭ、１０ｎＭ～５０ｎＭ、１０ｎＭ～２５ｎＭの濃度で、または５ｎＭ、１０ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、７５ｎＭ、もしくは１００ｎＭのような値で存在し得る。いくつかの実施形態において、培地はペメトレキセドを含まず、ペメトレキセドは培地に添加されない。

【0102】

上記の実施形態のいずれかにおいて、上記の脱分化Ｔ細胞をインキュベートするための上記の期間は、例として限定されるものではないが、３日～４０日、２日～２０日、３日～１０日、３日～６日、６日～１０日、１０日～４０日、１０日～２０日、１０日～１５日、１５日～４０日、２０日～４０日、３０日～４０日、２０日～３０日、または１５日～３０日、または１５日～２０日であり得る。いくつかの実施形態において、例として限定されるものではないが、非常に限定的な分化状態のハイブリッドＴｈ２／ＴＲＥＧ細胞であれば、３日～１０日などの培養のより短い間隔を検討することができる。

【0103】

本開示はまた、ＩＬ－４を使用せずに上記の方法のいずれによって産生される方法およびＴＲＥＧ細胞を対象とする。

【0104】

いくつかの実施形態において、本開示の方法によって産生されるＴＲＥＧまたはＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞は、対照Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞と比較して、ＣＤ２５、ＣＤ２７、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＩＣＯＳ、ＬＡＩＲ１、およびＯＸ４０のうちの少なくとも１つのフローサイトメトリーによる増加した発現を有し得る。いくつかの実施形態において、この増加は、例として限定されるものではないが、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％以上であり得る。

【0105】

いくつかの実施形態において、本開示の方法によって産生されるＴＲＥＧまたはＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞は、対照Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞と比較して、炎症性サイトカインの分泌の減少を有することができる。例として限定されるものではないが、そのようなサイトカインは、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αを含むことができる。いくつかの実施形態において、この減少は、例として限定されるものではないが、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％以上であり得る。

【0106】

いくつかの実施形態において、本開示の方法によって産生されるＴＲＥＧまたはＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞は、対照Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞と比較して低減されたＴＢＥＴを有し、ＦＯＸＰ３発現を増加させ、および／または対照Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞と比較して増加したＩＬ－４分泌およびＧＡＴＡ３の増加した発現を有し得る。いくつかの実施形態において、この減少または増加は、例として限定されるものではないが、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％以上であり得る。

【0107】

いくつかの実施形態において、ＴＲＥＧまたはＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団は、ＧＡＴＡ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞の少なくとも５％を有することができる。例として限定されるものではないが、ＴＲＥＧまたはＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団は、ＧＡＴＡ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、または少なくとも６０％を有することができる。いくつかの実施形態において、細胞がＧＡＴＡ３を発現するかどうかは、フローサイトメトリーによって決定される。。いくつかの実施形態において、Ｔ_ＲＥＧまたはＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団は、Ｔ_ＲＥＧまたはＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団が産生されたＴ細胞の対照Ｔ細胞集団特徴と比較して、ＧＡＴＡ３を発現するＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋Ｔ細胞の増加した頻度を示すことができる。いくつかの実施形態において、増加した頻度は、５０％以上の増加であり得る。例として限定されるものではないが、増加は、５０％、１００％、２００％、３００％、５００％、１０００％、２０００％、３０００％以上であり得る。

【0108】

いくつかの実施形態において、ＴＲＥＧまたはＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団は、ＦｏｘＰ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞の少なくとも５％を有することができる。例として限定されるものではないが、ＴＲＥＧまたはＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団は、ＦｏｘＰ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも４５％を有することができる。いくつかの実施形態において、細胞がＦｏｘＰ３を発現するかどうかは、フローサイトメトリーによって決定される。いくつかの実施形態において、Ｔ_ＲＥＧまたはＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団は、Ｔ_ＲＥＧまたはＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団が産生されたＴ細胞の対照Ｔ細胞集団特徴と比較して、ＦＯＸＰ３を発現するＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋Ｔ細胞の増加した頻度を示すことができる。いくつかの実施形態において、増加した頻度は、５０％以上の増加であり得る。例として限定されるものではないが、増加は、５０％、１００％、２００％、３００％、５００％、１０００％、２０００％、３０００％以上であり得る。

【0109】

いくつかの実施形態において、ＴＲＥＧまたはＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団は、ＣＤ７３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞の少なくとも１０％を有することができる。例として限定されるものではないが、ＴＲＥＧまたはＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団は、ＣＤ７３を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、または少なくとも２５％を有することができる。例として限定されるものではないが、ＴＲＥＧまたはＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団は、ＣＤ７３を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、または少なくとも８０％を有することができる。いくつかの実施形態において、細胞がＣＤ７３を発現するかどうかは、フローサイトメトリーによって決定される。いくつかの実施形態において、Ｔ_ＲＥＧまたはＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団は、Ｔ_ＲＥＧまたはＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団が産生されたＴ細胞の対照Ｔ細胞集団特徴と比較して、ＣＤ７３を発現するＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋Ｔ細胞の増加した頻度を示すことができる。いくつかの実施形態において、増加した頻度は、５０％以上の増加であり得る。例として限定されるものではないが、増加は、５０％、１００％、２００％、３００％、５００％、１０００％、２０００％、３０００％以上であり得る。

【0110】

いくつかの実施形態において、ＴＲＥＧまたはＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団は、ＣＤ１０３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞の少なくとも１０％を有することができる。例として限定されるものではないが、ＴＲＥＧまたはＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団は、ＣＤ１０３を発現すＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を有することができる。いくつかの実施形態において、細胞がＣＤ１０３を発現するかどうかは、フローサイトメトリーによって決定される。いくつかの実施形態において、Ｔ_ＲＥＧまたはＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団は、Ｔ_ＲＥＧまたはＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団が産生されたＴ細胞の対照Ｔ細胞集団特徴と比較して、ＣＤ１０３を発現するＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋Ｔ細胞の増加した頻度を示すことができる。いくつかの実施形態において、増加した頻度は、５０％以上の増加であり得る。例として限定されるものではないが、増加は、５０％、１００％、２００％、３００％、５００％、１０００％、２０００％、３０００％以上であり得る。

【0111】

いくつかの実施形態において、Ｔ_ＲＥＧまたはＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団は、フローサイトメトリーで測定されると、ＦＯＸＰ３およびＧＡＴＡ３の両方を発現するＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋細胞の少なくとも５％を有することができる。例として限定されるものではないが、Ｔ_ＲＥＧまたはＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団は、ＦＯＸＰ３およびＧＡＴＡ３の両方を発現するＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋細胞の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％を有することができる。

【0112】

いくつかの実施形態において、ＴＲＥＧまたはＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団は、ＣＤ１５０を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞の少なくとも２０％を有することができる。例として限定されるものではないが、ＴＲＥＧまたはＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団は、ＣＤ１５０を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％を有することができる。いくつかの実施形態において、ＴＲＥＧまたはＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞集団は、ｍＴＯＲ阻害剤に曝露することなくインキュベートされたＴ細胞の対照集団と比較して、ＣＤ１５０を発現する細胞の増加した頻度を得ることができる。いくつかの実施形態において、細胞がＣＤ１５０を発現するかどうかは、フローサイトメトリーによって決定される。いくつかの実施形態において、Ｔ_ＲＥＧまたはＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団は、Ｔ_ＲＥＧまたはＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団が産生されたＴ細胞の対照Ｔ細胞集団特徴と比較して、ＣＤ１５０を発現するＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋Ｔ細胞の増加した頻度を示すことができる。いくつかの実施形態において、増加した頻度は、５０％以上の増加であり得る。例として限定されるものではないが、増加は、５０％、１００％、２００％、３００％、５００％、１０００％、２０００％、３０００％以上であり得る。

【0113】

いくつかの実施形態において、ＴＲＥＧまたはＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団は、３：１のビーズ：Ｔ細胞の比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを用いて共刺激した後に少なくとも５ｐｇ／ｍＬ／１×１０６細胞／日のＩＬ－４を発現することができる。例として限定されるものではないが、ＴＲＥＧまたはＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞集団は、１日当たり少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、または少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ／１×１０^６細胞のＩＬ－４を発現することができる。

【0114】

いくつかの実施形態において、ＴＲＥＧまたはＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団は、３：１のビーズ：Ｔ細胞の比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを用いて共刺激した後に少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ／１×１０６細胞／日のＩＬ－２を発現することができる。

【0115】

いくつかの実施形態において、ＴＲＥＧまたはＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団は、３：１のビーズ：Ｔ細胞の比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを用いて共刺激した後に少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ／１×１０６細胞／日のＩＦＮ－γまたはＧＭ－ＣＳＦを発現することができる。

【0116】

いくつかの実施形態において、ＴＲＥＧまたはＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団は、３：１のビーズ：Ｔ細胞の比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを用いて共刺激した後に１０ｐｇ／ｍＬ／１×１０６細胞／日未満のＴＮＦ－αまたはＩＬ－１７を発現することができる。

【0117】

いくつかの実施形態において、ＴＲＥＧまたはＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞は、ＧＡＴＡ３およびＦＯＸＰ３の両方を発現することができる。いくつかの実施形態において、ＴＲＥＧまたはＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞は、ＧＡＴＡ３、ＦＯＸＰ３、ＣＤ１０３およびＣＤ７３を発現することができる。いくつかの実施形態において、ＴＲＥＧまたはＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団は、フローサイトメトリーによって測定されるように、ＧＡＴＡ３を発現するＴ細胞の少なくとも５％、ＦＯＸＰ３を発現するＴ細胞の少なくとも５％、ＣＤ１０３を発現するＴ細胞の少なくとも５％、およびＣＤ７３を発現するＴ細胞の少なくとも５％によって特徴付けることができる。

【0118】

上記の実施形態のいずれかにおいて、ＴＲＥＧまたはＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞、またはその集団は、特性に互換性がある限りにおいて、上記の特性の少なくとも１つまたは任意の組み合わせを有することができる。

【0119】

誘導制御性Ｔ（ｉＴ_ＲＥＧ）細胞を用いたＡＬＳ治療のための方法
このプロトコルでは、本発明者らは、ＡＬＳのｉＴ_ＲＥＧ細胞療法を強化する免疫枯渇および免疫抑制法としてペントスタチンプラスシクロホスファミドレジメンを使用する。このＰＣレジメンは、ＡＬＳ病原体に関連するＴｈ１型免疫細胞を枯渇させ、抑制する能力のために直接的な有益な効果を有し得る。加えて、ＰＣレジメンは、より効果的なｉＴ_ＲＥＧ細胞療法のために免疫Ｔ細胞空間を増加させる宿主調節として機能する。具体的には、このプロトコルでは、本発明者らは、新しいＡＬＳ患者集団におけるレジメンの任意の潜在的な有害作用を軽減するために、ＰＣレジメンの投与量を軽減した。このプロトコルでは、本発明者らは、ペントスタチンの開始用量を４ｍｇ／ｍ^２から１ｍｇ／ｍ^２に減らし、ペントスタチンの注入回数を１サイクル当たり４回の注入という以前の値から、１サイクル当たり１回の注入という現在のプロトコル値に減らし、初期シクロホスファミドの用量を１日当たり２００ｍｇから１日当たり１００ｍｇに減らした。第２に、本発明者らは、ＰＣレジメンによって付与される免疫枯渇の程度に関する述べられた目標の観点から、ＰＣレジメンの強度を減少させた。ＡＬＳ患者集団ではより慎重なアプローチが義務付けられているため、現在のプロトコルＰＣレジメンは、ＡＬＣカウントをより控えめに、すなわち、１マイクロリットル当たり７５０個未満の細胞に減らすことを試みた。一般に、この免疫枯渇レベルは、高い日和見感染率の観点から、深刻な長期免疫不全に関連していない。

【0120】

理論に束縛されることなく、ＰＣレジメンは、ＡＬＳ病原体の進行に関与するＴｈ１／Ｔｃ１型適応免疫サブセットを枯渇させ、抑制することが予想される。しかしながら、この療法は、ＡＬＳにおける基礎となる原発事象、すなわち、誤って折り畳まれたＲＮＡ種、有害なＲＮＡ／ＤＮＡ産物のクリアランスのための不十分なオートファジー、およびその後のＰ２Ｘ７受容体駆動型ＮＬＲＰ３インフラマソームのレベルでの先天性炎症のＲＮＡ／ＤＮＡ活性化に対処しない。ＡＬＳモデルにおいて動作可能であることが示されているこのようなインフラマソーム活性化は、その後、Ｔｈ１／Ｔｃ１サブセットによって主に媒介される適応性Ｔ細胞炎症を駆動する最も早期かつ最も強力な炎症促進シグナルの１つであるＩＬ－１－β活性化を駆動する。実際、ＮＬＲＰ３阻害は、多様な神経変性疾患の治療に対する新規のアプローチを表すことが最近提案されている。ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）は、ＡＬＳの治療にも役割を果たし得る、ＨＩＶ疾患の治療について承認された抗ウイルス剤である。ＡＬＳを有する患者は、一部には、ＡＬＳの主要な機序的構成要素であるＴＤＰ－４３蓄積による調節によって、モデル系における疾患発症を駆動するヒト内因性レトロウイルス－Ｋ（ＨＥＲＶ－Ｋ）のレベルの増加を有することができる。この生物学の臨床翻訳に向けて、ダルナビル、リトナビル、ラルテグラビル、およびジドブジンのＨＩＶ抗ウイルスカクテルを評価する臨床試験（ＮＣＴ０２４３７１１０）が開始されている。ＮＲＴＩ分子ラミブジン（３ＴＣ）はまた、ＡＬＳにおいて生じるＮＬＲＰ３活性化を駆動するＰ２Ｘ７受容体を阻害することも記載されている。これらの観察に部分的に基づいて、ＡＬＳにおける先天性炎症事象、すなわち細胞内ＲＮＡ種の蓄積、炎症性経路の活性化、および結果として生じる全身性Ｔｈ１駆動型炎症の生成を模倣する疾患であるエカルディ・グティエール（Ａｉｃａｒｄｉ－Ｇｏｕｔｉｅｒｅｓ）症候群（ＡＧＳ）を有する患者における炎症を低減するためのラミブジン、ジドブジン、およびアバカビルの３つの薬物レジメンの能力を評価するための第ＩＩ相臨床試験（ＮＣＴ０２３６３４５２）が開始されている。ラミブジンは、ＮＬＲＰ３インフラマソームの強力な阻害剤として特徴付けられており、ＡＬＳ患者集団において十分に忍容される治療計画を生成することが望まれるため、本発明者らは、本プロトコルにおいてラミブジンによる単剤ＮＲＴＩ療法を追求することを選択した。

【0121】

したがって、理論に束縛されることなく、（ＰＣレジメンを介して）第１のＴｈ１／Ｔｃ１応答を枯渇させて抑制し、次いで駆動力インフラマソーム活性化を制御する連続的な戦略は、ＡＬＳに関与する複雑な神経炎症ネットワークに持続可能な調節を提供するための新しいアプローチを表すことが期待される。ＡＬＳ治療プラットフォームにおけるラミブジンの使用は、ｉＴ_ＲＥＧ細胞療法をプラットフォームにさらに組み込むという、次の工程に関しても有益であり得る。すなわち、３つの治療様式（ペントスタチン／シクロホスファミド、ラミブジン、およびｉＴ_ＲＥＧ細胞）のそれぞれは、Ｐ２Ｘ７駆動のＮＬＲＰ３媒介性インフラマソームから離れ、免疫抑制分子、アデノシンに向かってＡＴＰの輸送をシャントすることによって少なくとも部分的に動作する。第１に、ペントスタチンは、アデノシンデアミナーゼを阻害することによってアデノシンを増加させ、それによってアデノシンのイノシンへの変換を防止する。第２に、ラミブジンは、Ｐ２Ｘ７の既知の阻害剤であり、それによってインフラマソームを直接阻害する。第３に、ｉＴ_ＲＥＧ細胞は、ＡＴＰをアデノシンに向かって処理するＣＤ３９およびＣＤ７３媒介性エクトヌクレオチダーゼ活性を提供する。この最後のプロセスに関して、ミクログリア細胞は本質的にＣＤ３９およびＣＤ７３を利用して神経炎症を抑制することに留意することが重要である。

【0122】

要約すると、これらのデータは、ＡＬＳにおける原発性神経変性プロセスが二次炎症応答を生じさせるという証拠を提供し、一方では疾患進行をまだ促進することができるが、一方では、インフラマソーム活性化の制御、Ｔｈ１／Ｔｃ１型サブセットの枯渇および抑制、ならびにＴ_ＲＥＧ型サブセットの促進を含む複数の工程での治療介入となることができるという証拠を提供している。この情報を考慮すると、ＡＬＳ患者における免疫調節療法の評価には、大きな関心がある。ＡＬＳ患者における神経炎症の最適な制御には、上記の各構成要素に対処する３段階の治療、すなわち、（１）先天性インフラマソーム活性化の制御（以下に記載されるように、ラミブジン投与による）；（２）既存のＴｈ１型炎症細胞の低減（以下にさらに詳細に記載されるように、ペントスタチン／シクロホスファミドレジメンによる）；および（３）養子Ｔ細胞移入によるｉＴ_ＲＥＧ細胞の促進、が必要であるという仮説を、本発明者らは立てた。このような組み合わせアプローチが必要となり得る理由はいくつかある。まず、基礎となるインフラマソーム活性化が維持療法によって対処されない場合、宿主調節療法およびＴ_ＲＥＧ細胞療法中に達成された免疫学的および治療的利得は、基礎となる一次神経変性プロセスによって侵食されている可能性が高い。第２に、制御されていないＴｈ１駆動の炎症を有する宿主への最適化されたＴ_ＲＥＧ細胞集団単独注入でさえ、多くの理由のための困難な免疫学的課題を表す：既存のＴｈ１型細胞は、養子移入されたＴ_ＲＥＧ細胞の際に分化可塑性を発現することができ、それによって保護的Ｔ_ＲＥＧ集団を疾患の発症に寄与し得る病原性サブセットに変換することができる。第３に、養子移植されたＴ細胞集団の有効性は、ＩＬ－７およびＩＬ－１５などのＴ細胞成長因子の存在によって大きく定義することができる免疫Ｔ細胞空間の程度と複雑に連結されており、そのような免疫空間の創出は、ペントスタチン＋シクロホスファミド（ＰＣ）レジメンを含む宿主調製レジメンによって作製され、これは、同種造血幹細胞移植において何十年も利用されており、現在は癌治療のために養子Ｔ細胞移植を使用する分野で利用されている。注目すべきことに、神経変性疾患または自己免疫疾患のＴ_ＲＥＧ細胞療法を伴う以前の臨床試験は、ＰＣレジメンなどの宿主調製レジメンを組み込んでいない。

【0123】

いくつかの実施形態において、本方法は、上記の対象を１つ以上の一次治療サイクルに供することを含み、上記の１つ以上の一次治療サイクルのそれぞれは、上記の対象にペントスタチンを投与すること、および／または上記の対象にシクロホスファミドを投与することと、上記の対象を、治療有効量の製造されたＴ_ＲＥＧ細胞を含む組成物を上記の対象に投与することを含む１つ以上の免疫療法治療サイクルに供することと、を含む。当業者は、当該技術分野において既知の、本明細書に開示される方法によって、治療有効量を決定することができる。

【0124】

上記の実施形態において、１つ以上の免疫療法治療サイクルのそれぞれは、上記の対象にヌクレオシド逆転写酵素阻害剤を投与することをさらに含む。上記のヌクレオシド逆転写酵素阻害剤は、ＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害剤であり得るか、または上記のヌクレオシド逆転写酵素阻害剤は、ラミブジンであり得る。上記の１つ以上の免疫療法治療サイクルのそれぞれは、上記の対象にペントスタチンを投与すること、および／または上記の対象にシクロホスファミドを投与することをさらに含むことができる。上記の１つ以上の免疫療法治療サイクルのそれぞれの間に上記の対象にペントスタチンを投与する上記の工程は、前記１つ以上の免疫療法治療サイクルのそれぞれの１日目および４日目に実行されることができる。上記の１つ以上の免疫療法治療サイクルのそれぞれの間に上記の対象にペントスタチンを投与する上記の工程は、上記の１つ以上の免疫療法治療サイクルのそれぞれの１、２、３、４、および５日目に実行されることができる。上記の方法は、２つ以上の免疫療法治療サイクルを含むことができ、上記の２つ以上の免疫療法治療サイクルのそれぞれは、例として限定されるものではないが、０～４週間、０～３週間、０～２週間、０～１週間、および例として限定されるものではないが、０週間、１週間、２週間、３週間、または４週間などの間の任意の値で離れている。上記の１つ以上の免疫療法治療サイクルのそれぞれは、１８週間の長さであり得る。上記の１つ以上の免疫療法治療サイクルのそれぞれは、上記の対象にアデノシン受容体調節剤を投与することをさらに含むことができる。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，３２６，９８３号に開示されるもの、ラミブジン、ジドブジン、スタブジン、コルジセピン、アジドチミジン、アバカビル、

【化1】

それらの化学誘導体、それらの薬学的に許容される塩、およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない他のヌクレオシド逆転写酵素阻害剤を使用することができる。

【0125】

上記の実施形態において、例として限定されるものではないが、上記の１つ以上の一次治療サイクルは、２週間～５週間、２週間～４週間、２週間～３週間、３週間～４週間、または４週間～５週間であり得、例として限定されるものではないが、２週間、３週間、４週間、または５週間などのそれらの間の任意の値であり得る。上記の方法は、２つ以上の一次治療サイクルを含むことができ、上記の２つ以上の一次治療サイクルのそれぞれは、０～２週間離れている。例として限定されるものではないが、上記の２つ以上の一次治療サイクルのそれぞれは、０～１週間または１～２週間、および例えば、例として限定されるものではないが、１日、１週間、または２週間などの、それらの間の任意の値で、離れている。

【0126】

上記の実施形態において、本方法は、上記の１つ以上の一次治療サイクルの前に、上記の対象から末梢リンパ球を採取することをさらに含み得る。方法は、上記の対象から末梢リンパ球を採取した後、上記の製造されたＴ_ＲＥＧ細胞を得るために上記の末梢リンパ球を培養することをさらに含み得る。方法は、上記の１つ以上の一次治療サイクルの後に、上記の対象から末梢リンパ球を採取することをさらに含んでもよい。方法は、上記の１つ以上の一次治療サイクル後に上記の対象から末梢リンパ球を採取した後、上記の製造されたＴ_ＲＥＧ細胞を得るために上記の末梢リンパ球を培養することをさらに含んでもよい。方法は、上記の１つ以上の一次治療サイクルのそれぞれの後、上記の対象における絶対リンパ球数（ＡＬＣ）を測定することと、ＡＬＣが１μｌ当たり７５０未満の場合、上記の１つ以上の免疫療法治療サイクルに進むこととをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、標的ＡＬＣ値は、変化してもよく、例として、１マイクロリットル当たり０、２５０、５００、７５０、１０００、１２５０、または１５００細胞であり得るが、これらに限定されない。

【0127】

上記の実施形態において、上記の１つ以上の免疫療法治療サイクルの第１のサイクルと、上記の１つ以上の一次治療サイクルの最後のサイクルとは、０～２週間離れている。例として限定されるものではないが、上記の２つ以上の免疫療法治療サイクルのそれぞれは、０～１週間または１～２週間、および例として限定されるものではないが、０週間、１週間、または２週間などの間の任意の値で、離れている。

【0128】

上記の実施形態において、例として限定されるものではないが、ペントスタチンの用量は、０．５ｍｇ／ｍ^２～４ｍｇ／ｍ^２、１ｍｇ／ｍ^２～４ｍｇ／ｍ^２、２ｍｇ／ｍ^２～４ｍｇ／ｍ^２の用量、ならびに例として限定されるものではないが、０．５ｍｇ／ｍ^２、１ｍｇ／ｍ^２、１．５ｍｇ／ｍ^２、２ｍｇ／ｍ^２、２．５ｍｇ／ｍ^２、３ｍｇ／ｍ^２、３．５ｍｇ／ｍ^２、および４ｍｇ／ｍ^２などの間の任意の値であり得る。上記のペントスタチンは、上記の１つ以上の一次治療サイクルのそれぞれの任意の日に投与することができる。例として限定されるものではないが、ペントスタチンは、上記の１つ以上の一次治療サイクルのそれぞれの１日目、または１日目および４日目に、対象に投与することができる。

【0129】

上記の実施形態において、シクロホスファミドは、５０ｍｇ～４００ｍｇの用量で対象に投与することができる。例として限定されるものではないが、シクロホスファミドの用量は、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、または４００ｍｇと、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、または５０ｍｇとの任意の組み合わせの間の用量と、例として限定されるものではないが、５０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、または４００ｍｇなどの間の任意の値とすることができる。例として限定されるものではないが、シクロホスファミドは、上記の１つ以上の一次治療サイクルのそれぞれの１日目、２日目および３日目、または１日目、２日目、３日目、４日目および５日目に投与されることができる。

【0130】

上記の実施形態において、上記のペントスタチンおよびシクロホスファミドは、上記の対象に、単一の組成物で投与され得る。上記の単一組成物は、上記の対象に静脈内投与することができる。上記の対象にペントスタチンおよびシクロホスファミドを投与する上記の工程は、上記の対象にペントスタチンを含む第１の組成物を投与することと、上記の対象にシクロホスファミドを含む第２の組成物を投与することと、を含むことができる。

【0131】

上記の実施形態において、上記のラミブジンは、上記の対象に、１日１５０ｍｇ～１５０ｍｇの用量で１日２回投与することができる。

【0132】

上記の実施形態において、上記の製造されたＴ_ＲＥＧ細胞は、上記の１つ以上の免疫療法治療サイクルのそれぞれの間に、例として限定されるものではないが、対象の体重１ｋｇ当たり１×１０^６細胞～対象の体重１ｋｇ当たり５×１０^６細胞、対象の体重１ｋｇ当たり２×１０^６細胞～対象の体重１ｋｇ当たり５×１０^６細胞、対象の体重１ｋｇ当たり３×１０^６細胞～対象の体重１ｋｇ当たり５×１０^６細胞、対象の体重１ｋｇ当たり４×１０^６細胞～対象の体重１ｋｇ当たり５×１０^６細胞、対象の体重１ｋｇ当たり１×１０^６細胞～対象の体重１ｋｇ当たり４×１０^６細胞、対象の体重１ｋｇ当たり１×１０^６細胞～対象の体重１ｋｇ当たり３×１０^６細胞、対象の体重１ｋｇ当たり１×１０^６細胞～対象の体重１ｋｇ当たり２×１０^６細胞、およびそれらの間の任意の値、例として限定されるものではないが、対象の体重１ｋｇ当たり１×１０^６細胞、対象の体重１ｋｇ当たり２×１０^６細胞、対象の体重１ｋｇ当たり３×１０^６細胞、対象の体重１ｋｇ当たり４×１０^６細胞、または対象の体重１ｋｇ当たり５×１０^６細胞などの用量で、上記の対象に投与することができる。例として限定されるものではないが、１注入当たり、製造されたＴ_ＲＥＧ細胞の約１×１０^６～約２００×１０^６細胞を投与することができる。さらなる例として限定されるものではないが、製造されたＴ_ＲＥＧ細胞の１注入当たり、約１×１０^６～約２００×１０^６、１０×１０^６～約２００×１０^６、５０×１０^６～約２００×１０^６、１００×１０^６～約２００×１０^６、少なくとも１×１０^６、１０×１０^６、５０×１０^６、１００×１０^６、または２００×１０^６細胞を投与することができる。いくつかの実施形態において、約４０×１０^６細胞／注入が投与され得る。いくつかの実施形態において、約１２０×１０^６細胞／注入が投与され得る。上記の製造されたＴ_ＲＥＧ細胞は、１：１、３：１、１０：１、１：３、および１：１０から選択されるセントラルメモリー対エフェクターメモリー細胞の比率を含むことができる。製造されたＴ_ＲＥＧ細胞を含む上記の組成物は、正常なＴ_ＲＥＧ細胞をさらに含むことができる。上記の製造されたＴ_ＲＥＧ細胞は、上記の１つ以上の免疫療法治療サイクルのそれぞれの８日目に上記の対象に投与することができる。いくつかの実施形態において、ｉＴ_ＲＥＧおよびｎＴ_ＲＥＧは、対象に組み合わせて投与され得る。

【0133】

いくつかの実施形態において、方法は、第１の治療サイクル、第２の治療サイクル、任意選択で、１つ以上の追加の治療サイクル、および１つ以上の免疫療法治療サイクルを含み、上記の第１の治療サイクルは、上記の対象にペントスタチンを投与すること、および／または上記の対象にシクロホスファミドを投与することを含み、上記の第２の治療サイクルは、上記の対象にペントスタチンを投与すること、および／または上記の対象にシクロホスファミドを投与することを含み、上記の１つ以上の追加の治療サイクルは、上記の対象にペントスタチンを投与すること、および／または上記の対象にシクロホスファミドを投与することを含み、上記の１つ以上の免疫療法治療サイクルのそれぞれは、上記の対象にペントスタチンを投与すること、および／または上記の対象にシクロホスファミドを投与することと、製造されたＴ_ＲＥＧ細胞を上記の対象に投与することとを含むことができる。

【0134】

上記の実施形態において、上記の第１の治療サイクルは、１４日間の長さであり得る。上記の対象にペントスタチンを投与する上記の工程は、上記の第１の治療サイクルの１日目に実行されることができる。ペントスタチンを、上記の第１の治療サイクル中に１ｍｇ／ｍ^２の用量で上記の対象に投与することができる。シクロホスファミドを、上記の第１の治療サイクル中に１００ｍｇの用量で上記の対象に投与することができる。上記の対象にシクロホスファミドを投与する上記の工程は、上記の第１の治療サイクル中に繰り返すことができ、例として限定されるものではないが、上記の対象にシクロホスファミドを投与する上記の工程は、上記の第１の治療サイクルの１、２、および３日目に実行することができる。

【0135】

上記の実施形態において、上記の第２の治療サイクルは、１４日間の長さであり得る。上記の第２の治療サイクル中に、上記の対象にペントスタチンを投与する上記の工程は、上記の第２の治療サイクルの１日目に実行されることができる。ペントスタチンを、上記の第２の治療サイクル中に２ｍｇ／ｍ^２の用量で上記の対象に投与することができる。上記の第２の治療サイクル中に上記の対象にシクロホスファミドを投与する上記の工程は、上記の第２の治療サイクル中に繰り返すことができる。例として限定されるものではないが、上記の第２の治療サイクル中に上記の対象にシクロホスファミドを投与する上記の工程は、上記の第２の治療サイクルの１、２、および／または３日目に実施することができる。シクロホスファミドを、上記の第２の治療サイクル中に１００ｍｇの用量で上記の対象に投与することができる。

【0136】

上記の実施形態において、上記の対象は、上記の１つ以上の追加の治療サイクルに供され得る。上記の１つ以上の追加の治療サイクルのそれぞれは、それぞれ１４日間の長さであり得る。上記の１つ以上の追加の治療サイクルは、０～２週間離すことができる。例として限定されるものではないが、上記の２つ以上の追加の治療サイクルのそれぞれは、０～１週間、または１～２週間、例えば、例として限定されるものではないが、０週間、１週間、または２週間の間の任意の値で離すことができる。上記の１つ以上の追加の治療サイクルのそれぞれの間に上記の対象にペントスタチンを投与する上記の工程は、上記の１つ以上の追加の治療サイクルの１日目および／または４日目に実行され得る。ペントスタチンは、上記の１つ以上の追加の治療サイクルのそれぞれの間に、２ｍｇ／ｍ^２の用量で上記の対象に投与され得る。上記の対象にシクロホスファミドを投与する上記の工程は、上記の１つ以上の追加の治療サイクルのそれぞれの間に繰り返され得る。上記の１つ以上の追加の治療サイクルのそれぞれの間に上記の対象にシクロホスファミドを投与する上記の工程は、上記の１つ以上の追加の治療サイクルのそれぞれの１、２、３、４、および／または５日目に実行され得る。シクロホスファミドは、上記の１つ以上の追加の治療サイクルのそれぞれの間に１００ｍｇ～２００ｍｇの用量で上記の対象に投与され得る。上記の追加のサイクルは、上記の１つ以上の追加の治療サイクルのそれぞれの間に上記対象にペントスタチンを投与する前に、上記の対象のクレアチニンクリアランス（ＣｒＣｌ）を測定することと、上記のＣｒＣｌに基づいて上記の対象に投与されるペントスタチンの用量を調整することと、をさらに含み、ＣｒＣｌ＞６０ｍＬ／分／１．７３ｍ^２の場合、ペントスタチンは２ｍｇ／ｍ^２で投与され、６０ｍＬ／分／１．７３ｍ^２＞ＣｒＣｌ＞３０ｍＬ／分／１．７３ｍ^２の場合、ペントスタチンは１ｍｇ／ｍ^２で投与され、ＣｒＣｌ＜３０ｍＬ／分／１．７３ｍ^２の場合、ペントスタチンは投与されない。上記の追加のサイクルは、上記の１つ以上の追加の治療サイクルのそれぞれの間に上記対象にシクロホスファミドを投与する前に、絶対好中球数（ＡＮＣ）を測定することと、ＡＮＣに基づいて前記対象に投与されるシクロホスファミドの用量を調節することと、をさらに含むことができ、１マイクロリットル当たりＡＮＣ＞１０００の場合、シクロホスファミドは１００ｍｇの用量で投与され、１マイクロリットル当たりＡＮＣが５００～９９９の場合、シクロホスファミドは、５０ｍｇの用量で投与され、１マイクロリットル当たりＡＬＣ＜５０または１マイクロリットル当たりＡＮＣ＜５００の場合、シクロホスファミドは投与されない。上記の１つ以上の追加の治療サイクルは、少なくとも２つの追加の治療サイクルを含むことができ、上記の少なくとも２つの追加の治療サイクルの最終サイクルは、上記の少なくとも２つの治療サイクルの上記の最終サイクルの間に上記の対象にシクロホスファミドを投与する前に、絶対リンパ球数（ＡＬＣ）および絶対好中球数（ＡＮＣ）を測定することと、ＡＬＣおよびＡＮＣに基づいて、上記の対象に投与されるシクロホスファミドの用量を調整することとを含み、シクロホスファミドは、ＡＬＣ＞１２５０／マイクロリットルの場合、２００ｍｇの用量で投与することができ、シクロホスファミドは、ＡＮＣ＞１０００／マイクロリットルおよび７５０＜ＡＬＣ＜１２５０／マイクロリットルの場合、１００ｍｇの用量で投与することができ、シクロホスファミドは、ＡＮＣが５００～９９９／マイクロリットルの場合、５０ｍｇの用量で投与することができ、シクロホスファミドは、ＡＮＣ＜５００／マイクロリットルおよび／またはＡＬＣ＜７５０／マイクロリットルの場合、投与されなくてもよい。

【0137】

上記の実施形態において、上記の治療サイクル、上記の第２の治療サイクル、および上記の１つ以上の追加の治療サイクルのそれぞれは、０～２週間離すことができる。例として限定されるものではないが、上記の治療サイクル、上記の第２の治療サイクル、および上記の１つ以上の追加の治療サイクルのそれぞれは、０～１週間、または１～２週間、例として限定されるものではないが、０週間、１週間、または２週間の間の任意の値で離すことができる。

【0138】

上記の実施形態において、方法は、上記の第１の治療サイクルで上記対象にペントスタチンを投与する前に、上記の対象のクレアチニンクリアランス（ＣｒＣｌ）を測定することと、上記のＣｒＣｌに基づいて上記の対象に投与されるペントスタチンの用量を調整することと、をさらに含むことができ、ＣｒＣｌ＞６０ｍＬ／分／１．７３ｍ^２の場合、ペントスタチンは１ｍｇ／ｍ^２で投与され、６０ｍＬ／分／１．７３ｍ^２＞ＣｒＣｌ＞３０ｍＬ／分／１．７３ｍ^２の場合、ペントスタチンは０．５ｍｇ／ｍ２で投与され、ＣｒＣｌ＜３０ｍＬ／分／１．７３ｍ^２の場合、ペントスタチンは投与されない。

【0139】

上記の実施形態において、方法は、上記の第１の治療サイクルで上記対象にシクロホスファミドを投与する前に、絶対好中球数（ＡＮＣ）を測定することと、ＡＬＣおよびＡＮＣに基づいて上記の対象に投与されるシクロホスファミドの用量を調節することと、をさらに含むことができ、１マイクルリットル当たりＡＮＣ＞１０００の場合、シクロホスファミドは１００ｍｇの用量で投与され、１マイクルリットル当たりＡＮＣが５００～９９９の場合、シクロホスファミドは５０ｍｇの用量で投与され、１マイクルリットル当たりＡＮＣ＜５００の場合、シクロホスファミドは投与されない。

【0140】

上記の実施形態において、方法は、上記の第２の治療サイクルで上記対象にペントスタチンを投与する前に、上記の対象のクレアチニンクリアランス（ＣｒＣｌ）を測定することと、ＣｒＣｌに基づいて上記の対象に投与されるペントスタチンの用量を調整することと、をさらに含むことができ、ＣｒＣｌ＞６０ｍＬ／分／１．７３ｍ^２の場合、ペントスタチンは２ｍｇ／ｍ^２で投与され、６０ｍＬ／分／１．７３ｍ^２＞ＣｒＣｌ＞３０ｍＬ／分／１．７３ｍ^２の場合、ペントスタチンは１ｍｇ／ｍ^２で投与され、ＣｒＣｌ＜３０ｍＬ／分／１．７３ｍ^２の場合、ペントスタチンは投与されない。

【0141】

上記の実施形態において、方法は、上記の第２の治療サイクルで上記対象にシクロホスファミドを投与する前に、絶対好中球数（ＡＮＣ）を測定することと、ＡＮＣに基づいて上記の対象に投与されるシクロホスファミドの用量を調節することと、をさらに含むことができ、１マイクルリットル当たりＡＮＣ＞１０００の場合、シクロホスファミドは１００ｍｇの用量で投与されることができ、１マイクルリットル当たりＡＮＣが５００～９９９の場合、シクロホスファミドは５０ｍｇの用量で投与されることができ、１マイクルリットル当たりＡＮＣ＜５００の場合、シクロホスファミドは投与されない。

【0142】

上記の実施形態において、方法は、上記の１つ以上の追加の治療サイクルのそれぞれの前に、上記の対象における絶対リンパ球数（ＡＬＣ）を測定することと、ＡＬＣに基づいて上記の対象の上記の治療を調整することと、をさらに含むことができ、１マイクロリットル当たり、ＡＬＣ＜７５０の場合、上記の患者を上記１つ以上の免疫療法治療サイクルに供することを含む維持治療サイクルを、上記の対象に実施し、１マイクロリットル当たり、ＡＬＣ＞７５０の場合、上記の患者を上記の１つ以上の追加の治療サイクルに供する。

【0143】

上記の実施形態において、方法は、上記の１つ以上の追加の治療サイクルのそれぞれの前に、上記の対象における絶対リンパ球数（ＡＬＣ）を測定することと、上記のＡＬＣに基づいて上記の対象の上記の治療を調整することと、をさらに含むことができ、１マイクロリットル当たり、ＡＬＣ＜７５０の場合、上記の対象にヌクレオシド逆転写酵素阻害剤を投与することを含む維持治療サイクルを、上記の対象に実施し、上記の維持治療サイクルの前に上記の１つ以上の追加の治療サイクルをさらに投与せず、１マイクロリットル当たり、ＡＬＣ＞７５０の場合、上記の１つ以上の追加の治療サイクルに対象患者を継続させる。

【0144】

上記の実施形態において、上記の１つ以上の免疫療法治療サイクルのそれぞれは、例として限定されるものではないが、１８週間の長さであり得る。いくつかの実施形態において、免疫療法治療サイクルを、０～４週間離すことができる。免疫療法治療サイクルは、無期限を含めて繰り返すことができる。免疫療法サイクルの繰り返しは、レジメンに従って、または再発の場合であり得る。例として限定されるものではないが、免疫療法サイクルは、１年に１～４回発生することができる。ペントスタチンは、上記の１つ以上の免疫療法治療サイクルのそれぞれの１日目および４日目に、２ｍｇ／ｍ^２の用量で上記の対象に投与することができる。シクロホスファミドは、上記の１つ以上の免疫療法治療サイクルのそれぞれの１日目、２日目、３日目、４日目、および／または５日目に、１００ｍｇの用量で上記の対象に投与することができる。上記の１つ以上の免疫療法治療サイクルのそれぞれは、上記の対象にヌクレオシド逆転写酵素阻害剤を投与することをさらに含み得る。上記のヌクレオシド逆転写酵素阻害剤は、ラミブジンであり得る。上記のラミブジンは、上記の１つ以上の免疫療法治療サイクルのそれぞれの間、１日１５０ｍｇ～１日２回１５０ｍｇの用量で上記の対象に投与することができる。上記の１つ以上の免疫療法治療サイクルのそれぞれは、上記の１つ以上の免疫療法治療サイクルのそれぞれの間に、上記の対象のクレアチニンクリアランス（ＣｒＣｌ）を測定することと、上記のＣｒＣｌに基づいて上記の対象に投与されるラミブジンの用量を調整することと、をさらに含むことができ、ＣｒＣｌ＞５０ｍＬ／分／１．７３ｍ^２の場合、ラミブジンは１日２回１５０ｍｇで投与され、５０ｍＬ／分＞ＣｒＣｌ＞３０ｍＬ／分／１．７３ｍ^２の場合、ラミブジンは１５０ｍｇで投与され、ＣｒＣｌ＜３０ｍＬ／分／１．７３ｍ^２の場合、ラミブジンは投与されない。

【0145】

上記の実施形態において、方法は、治療有効量の製造されたＴ_ＲＥＧ細胞を上記の対象に投与することを含むことができる。

【0146】

上記の実施形態において、上記の製造されたＴ_ＲＥＧ細胞は、上記の１つ以上の免疫療法治療サイクルのそれぞれの８日目に上記の対象に投与することができる。例として限定されるものではないが、製造されたＴ_ＲＥＧ細胞は、上記の免疫療法サイクルの任意の日、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５日目に、対象に投与することができる。

【0147】

上記の実施形態において、上記の製造されたＴ_ＲＥＧ細胞は、対象の体重１ｋｇ当たり１×１０^６細胞～対象の体重１ｋｇ当たり５×１０^６細胞で、例として限定されるものではないが、対象の体重１ｋｇ当たり１×１０^６細胞～対象の体重１ｋｇ当たり５×１０^６細胞、対象の体重１ｋｇ当たり２×１０^６細胞～対象の体重１ｋｇ当たり５×１０^６細胞、対象の体重１ｋｇ当たり３×１０^６細胞～対象の体重１ｋｇ当たり５×１０^６細胞、対象の体重１ｋｇ当たり４×１０^６細胞～対象の体重１ｋｇ当たり５×１０^６細胞、対象の体重１ｋｇ当たり１×１０^６細胞～対象の体重１ｋｇ当たり４×１０^６細胞、対象の体重１ｋｇ当たり１×１０^６細胞～３×１０^６細胞、対象の体重１ｋｇ当たり１×１０^６細胞～対象の体重１ｋｇ当たり２×１０^６細胞、および例として限定されるものではないが、対象の体重１ｋｇ当たり１×１０^６細胞、対象の体重１ｋｇ当たり２×１０^６細胞、対象の体重１ｋｇ当たり３×１０^６細胞、対象の体重１ｋｇ当たり４×１０^６細胞、または対象の体重１ｋｇ当たり５×１０^６細胞などの間の任意の値で、投与されることができる。

【0148】

上記の１つ以上の治療サイクルのそれぞれは、上記の対象にペントスタチンを投与すること、および／または上記の対象にシクロホスファミドを投与することをさらに含むことができる。ペントスタチンは、１ｍｇ／ｍ^２～２ｍｇ／ｍ^２の用量、および例として限定されるものではないが、１ｍｇ／ｍ^２、１．５ｍｇ／ｍ^２、または２ｍｇ／ｍ^２の間の任意の値で、上記の対象に投与することができる。上記のシクロホスファミドの用量は、１００ｍｇ～２００ｍｇ、例として限定されるものではないが、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、または２００ｍｇなどの間の任意の値であり得る。上記のペントスタチンは、上記の１つ以上の治療サイクルのそれぞれの１日目および４日目に上記の対象に投与することができる。上記のシクロホスファミドは、上記の１つ以上の治療サイクルのそれぞれの１、２、３、４、および／または５日目に、上記の対象に投与することができる。上記の対象は、ペントスタチンおよびシクロホスファミドで以前に治療されていてもよい。上記の１つ以上の治療サイクルのそれぞれは、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤を上記の対象に投与することをさらに含み得る。上記のヌクレオシド逆転写酵素阻害剤は、ＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害剤であり得る。上記のヌクレオシド逆転写酵素阻害剤は、ラミブジンであり得る。上記の１つ以上の治療サイクルのそれぞれは、４週間離すことができる。

【0149】

上記の実施形態において、本方法は、上記の製造されたＴ_ＲＥＧ細胞と同時に、上記の対象に正常なＴ_ＲＥＧ細胞を投与することをさらに含むことができる。上記の実施形態において、本方法は、上記の１つ以上の治療サイクルの前に、上記の対象から末梢リンパ球を採取することをさらに含むことができる。上記の実施形態において、本方法は、上記の対象から末梢リンパ球を採取した後、上記の末梢リンパ球を培養して、上記の製造されたＴ_ＲＥＧ細胞を得ることをさらに含むことができる。

【実施例】

【0150】

以下の実施例は、本開示の方法ならびに結果として生じる脱分化およびｉＴ_ＲＥＧまたは再分化Ｔ細胞をより良く例証するために提供される。これらの実施例は、本開示に開示される方法、細胞、および組成物の範囲を限定したり、またはそうでなければ変更したりするよう意図されるものではない。

【0151】

実施例１：ビタミンＤとテムシロリムスの組み合わせはＴ細胞エフェクター分子を減少させる
本発明者らは、ヒトＴ細胞エフェクター分子発現に対するビタミンＤ、ｍＴＯＲ阻害（ラパマイシン、テムシロリムスの非経口形態を使用）、およびビタミンＤ＋テムシロリムスの組み合わせの個々の効果を直接評価した（図１を参照）。

【0152】

図１Ａ～１Ｄは、ビタミンＤおよびテムシロリムスの組み合わせがヒトＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋細胞中のエフェクター分子発現を低減させることを例示している。列＃２～＃５について、Ｔ細胞を、低レベルの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８共刺激（ビーズ対Ｔ細胞の比；１：３）、高用量のテムシロリムス（１μＭ）、ビタミンＤ（０．１または１．０ｎＭ）、およびＸ－Ｖｉｖｏ ２０培地中での培養を含む、３日間の脱分化間隔に供した。第１の列は、対照培養物（テムシロリムスなし、ビタミンＤなし、３：１のビーズ対Ｔ細胞の比の使用、およびＩ型分極サイトカインＩＦＮ－αの含有（２０，０００ＩＵ／ｍＬ、別段の定めがない限り、この量は、対照培養物のために以下の実施例１～１１で使用される））を表す。第２の列は、低ビーズ対Ｔ細胞の比およびテムシロリムスを有したが、ビタミンＤを含まなかった培養物を表し、対照的に、第３の列は、ビタミンＤ（０．１ｎＭ）を有したが、テムシロリムスを含まなかった培養物を表す。第４の列は、高用量（「ＨＤ」）ビタミンＤ（１．０ｎＭ）を有するが、テムシロリムスを含まない培養物を表す。第５の列は、テムシロリムスと組み合わせた高用量ビタミンＤ（１．０ｎＭ）の両方を有した培養物を表す。脱分化区間の最後に、細胞を採取し、ＲＮＡを単離し、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ法によりＲＮＡ発現分析を行った。示される全ての結果は相対ＲＮＡ発現を表し、結果はＴｈ１／Ｔｃ１対照培養物についての１．０の値に対して正規化される。

【0153】

低レベルのＴ細胞共刺激（１：３の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ対Ｔ細胞の比；文献で使用される典型的な比は逆の３：１である）、テムシロリムス（１μＭ）、０．１もしくは１．０ｎＭのいずれかの用量のビタミンＤ、またはテムシロリムスと高用量のビタミンＤの組み合わせを含む、３日間の培養間隔を使用した。培養後、ＲＮＡを収集し、エフェクター分子発現レベルを対照培養物と比較した。

【0154】

図１Ａが示すように、様々な培養物は、ＧＡＰＤＨを含むハウスキーピング対照遺伝子の同様のＲＮＡ発現を有した。対照的に、ビタミンＤまたはテムシロリムスを受けなかった対照Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞培養物と比較して、テムシロリムス、ビタミンＤ、またはテムシロリムス＋ビタミンＤの組み合わせの培養添加は、細胞傷害性分子グランザイムＢ（図１Ｂ）ならびにサイトカイン分子ＩＬ－１０（Ｔｈ２サイトカイン、図１Ｃ）およびＩＦＮ－γ（Ｔｈ１サイトカイン、図１Ｄ）を含むＴ細胞エフェクター分子のＲＮＡ発現の低下をもたらした。したがって、脱分化マーカーとしてのグランザイムＢおよびＩＦＮ－γは、ビタミンＤが０．１～１．０ｎＭの濃度で有効であることを示す。１μＭの用量のテムシロリムスは単独で脱分化剤として有益に作用し（列２、グランザイムＢおよびＩＦＮ－γの低減）、組み合わせて使用した場合にビタミンＤの効果を抑制しない（列５）。

【0155】

したがって、低レベルの共刺激（１：３の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ対Ｔ細胞の比）および短い３日間の培養間隔を使用して、テムシロリムス、ビタミンＤ、またはテムシロリムス＋ビタミンＤの組み合わせの添加を利用して、Ｔｈ１およびＴｈ２サイトカインエフェクターならびに細胞傷害性エフェクター機構の両方を低減することができる。

【0156】

実施例２：ビタミンＤとテムシロリムスの組み合わせは、脱分化と関連する主要転写因子を変化させる
本発明者らは、また、低レベルの共刺激後の主要転写因子の発現に対するビタミンＤ、テムシロリムス、または組み合わせの効果を評価した。

【0157】

図２Ａ～図２Ｄは、ビタミンＤおよびテムシロリムスの組み合わせが、ヒトＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞中の幹細胞関連転写因子および原子的Ｔ細胞分子ＩＬ－７受容体－αの発現を増加させることを例示する。ビタミンＤおよびテムシロリムスの組み合わせがヒトＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞中のエフェクター分子発現を低減させることを例示している。列＃２～＃５について、Ｔ細胞を、低レベルの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８共刺激（ビーズ対Ｔ細胞の比；１：３）、高用量のテムシロリムス（１μＭ）、ビタミンＤ（０．１または１．０ｎＭ）、およびＸ－Ｖｉｖｏ ２０培地中での培養を含む、３日間の脱分化間隔に供した。第１の列は、対照培養物（テムシロリムスなし、ビタミンＤなし、３：１のビーズ対Ｔ細胞の比の使用、およびＩ型分極サイトカインＩＦＮ－αの含有）を表す。第２の列は、低ビーズ対Ｔ細胞の比およびテムシロリムスを有したが、ビタミンＤを含まなかった培養物を表し、対照的に、第３の列は、ビタミンＤ（０．１ｎＭ）を有したが、テムシロリムスを含まなかった培養物を表す。第４の列は、高用量（「ＨＤ」）ビタミンＤ（１．０ｎＭ）を有するが、テムシロリムスを含まない培養物を表す。第５の列は、テムシロリムスと組み合わせた高用量ビタミンＤ（１．０ｎＭ）の両方を有した培養物を表す。脱分化区間の最後に、細胞を採取し、ＲＮＡを単離し、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ法によりＲＮＡ発現分析を行った。示される全ての結果は相対ＲＮＡ発現を表し、結果はＴｈ１／Ｔｃ１対照培養物についての１．０の値に対して正規化される。

【0158】

図２Ａが示すように、テムシロリムスまたはテムシロリムス＋ビタミンＤの組み合わせは、Ｎａｎｏｇ転写因子の上方制御をもたらし、これは、ｉＰＳＣ状態に向かった体細胞の脱分化に必要な数少ない重要因子のうちの１つとして認識される。以前、ヒト線維芽細胞において、ラパマイシンを使用したｍＴＯＲ阻害は、Ｎａｎｏｇ発現を増加させることが見出された。対照的に、ビタミンＤ受容体シグナル伝達は、ｉＰＳＣ状態に関連する転写因子の発現を低減させることが見出された。

【0159】

したがって、低レベルの共刺激を使用して、テムシロリムスは、ｉＰＳＣ転写因子Ｎａｎｏｇを増加させ、このテムシロリムスの促進効果は、０．１～１．０ｎＭの範囲の濃度でビタミンＤによって無効化されない。

【0160】

比較すると、テムシロリムスもビタミンＤも単独では、ｉＰＳＣ状態に関連する古典的転写因子の１つでもあるＫＬＦ４分子のＲＮＡ発現を増加させなかった。しかしながら、テムシロリムス＋ビタミンＤ（１．０ｎＭ）の組み合わせは、ＫＬＦ４ ＲＮＡ発現を増加させた。したがって、Ｔ細胞脱分化の試みにおいては、テムシロリムスおよびビタミンＤの両方を含むことが好ましい。図２Ｂが示すように、テムシロリムスまたはビタミンＤのいずれも単独では有益な脱分化分子ＫＬＦ４の上方制御に作用しないが、テムシロリムス（１μＭ）およびビタミンＤ（１．０ｎＭ）の組み合わせは、ＫＬＦ４を相乗的に上方制御する。

【0161】

関連する転写因子ＫＬＦ１０は、テムシロリムスとビタミンＤ（１．０ｎＭ）の組み合わせを利用したときにも上方制御された。図２Ｃが示すように、１μＭの用量のテムシロリムスは、脱分化分子ＫＬＦ１０、Ｎａｎｏｇ、およびＩＬ－７受容体αを有益に上方制御するために単独で作用する。ビタミンＤは、これらの分子を上方制御するために単独で作用するわけではないが、組み合わせて使用する場合、テムシロリムスの効果を抑制するものではない（列５）。

【0162】

最後に、本発明者らは、分化状態が低下したＴ細胞において上方制御されているＩＬ－７受容体αのＲＮＡ発現について培養細胞を評価した。重要なことに、テムシロリムス単独ではできたが、ビタミンＤ単独では、ＩＬ－７受容体αを上方制御することはできなかった。それにもかかわらず、図２Ｄに示すように、ビタミンＤ（１．０ｎＭ）とテムシロリムスの組み合わせは、ＩＬ－７受容体αの上方制御をもたらした。

【0163】

要約すると、これらのデータは、テムシロリムスと組み合わせた低レベルの共刺激を使用して、Ｔ細胞分化を強制することができることを示し、より完全な脱分化パターンのために、培養にテムシロリムスとビタミンＤを含むことが好ましい。

【0164】

実施例３：ビタミンＤとテムシロリムスの組み合わせは、ＨＩＦ－１－α発現を維持しながら、Ｔｈ１分化に関連する主要転写因子を低減する
本発明者らは、また、Ｔｈ１型分化に関連する主要転写因子、すなわちＴ－ＢＥＴおよびＳＴＡＴ１の発現に対する、ビタミンＤ、テムシロリムス、またはその組み合わせの効果を評価した。

【0165】

図３Ａ～３Ｃは、ビタミンＤとテムシロリムスとの組み合わせが、Ｔ細胞生存期間に関連する転写因子、ＨＩＦ－１－αの発現を減少させることなく、エフェクターＴｈ１／Ｔｃ１細胞に関連する転写因子の発現を減少させることを示す。ビタミンＤおよびテムシロリムスの組み合わせがヒトＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋細胞中のエフェクター分子発現を低減させることを例示している。列＃２～＃５について、Ｔ細胞を、低レベルの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８共刺激（ビーズ対Ｔ細胞の比；１：３）、高用量のテムシロリムス（１μＭ）、ビタミンＤ（０．１または１．０ｎＭ）、およびＸ－Ｖｉｖｏ ２０培地中での培養を含む、３日間の脱分化間隔に供した。第１の列は、対照培養物（テムシロリムスなし、ビタミンＤなし、３：１のビーズ対Ｔ細胞の比の使用、およびＩ型分極サイトカインＩＦＮ－αの含有）を表す。第２の列は、低ビーズ対Ｔ細胞の比およびテムシロリムスを有したが、ビタミンＤを含まなかった培養物を表し、対照的に、第３の列は、ビタミンＤ（０．１ｎＭ）を有したが、テムシロリムスを含まなかった培養物を表す。第４の列は、高用量（「ＨＤ」）ビタミンＤ（１．０ｎＭ）を有するが、テムシロリムスを含まない培養物を表す。第５の列は、テムシロリムスと組み合わせた高用量ビタミンＤ（１．０ｎＭ）の両方を有した培養物を表す。脱分化区間の最後に、細胞を採取し、ＲＮＡを単離し、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ法によりＲＮＡ発現分析を行った。示される全ての結果は相対ＲＮＡ発現を表し、結果はＴｈ１／Ｔｃ１対照培養物についての１．０の値に対して正規化される。

【0166】

重要なことに、各薬剤または薬剤の組み合わせは、Ｔ－ＢＥＴ ＲＮＡ（図３Ａ）およびＳＴＡＴ１ ＲＮＡ（図３Ｂ）の両方を下方制御した。図３Ａ～３Ｃに示すように、０．１～１．０ｎＭの用量のビタミンＤは、単独で作用して、分化分子Ｔ－ＢＥＴおよびＳＴＡＴ１を有益に下方制御する。１μＭの用量のテムシロリムスは、１．０ｎＭのビタミンＤと組み合わせても、生存促進転写因子ＨＩＦ－１αを有害に下方制御しない。しかしながら、１μＭの用量のテムシロリムスは、分化分子Ｔ－ＢＥＴおよびＳＴＡＴ１を有益に下方制御するために単独で作用し、ビタミンＤと組み合わせても同様の結果をもたらす（これら２つの薬剤は拮抗剤ではない）。

【0167】

かなり対照的に、１μＭの用量のテムシロリムス、０．１～１．０ｎＭの用量のビタミンＤ、または組み合わせは、抗腫瘍効果に重要なＴ細胞生存因子として重要な主要転写因子ＨＩＦ－１－αを下方制御しなかった（図３Ｃ）。

【0168】

要約すると、これらのデータは、低レベル共刺激、テムシロリムス、およびビタミンＤの組み合わせを使用して、全体的なＴ細胞生存に必要な主要な転写因子であるＨＩＦ－１－αを阻害することなく、Ｔｈ１生成に必要な転写因子を低減することができることを示す。

【0169】

実施例４：ビタミンＤ、テムシロリムス、および抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体の組み合わせは、オートファジーシグネチャーを増加させる
本発明者らは、また、幹様脱分化状態を促進するために重要な、ビタミンＤ、テムシロリムス、またはその組み合わせがオートファジーの過程に及ぼす効果を評価した。オートファジーのレベルは、その後のオートファジー基質ｐ６２の上方制御によって、ウェスタンブロット解析によって部分的に決定することができる。

【0170】

図４は、ビタミンＤ、テムシロリムス、および抗ＩＬ－２受容体遮断の組み合わせが、オートファジー関連分子ｐ６２の発現を誘導することを示す。ヒトＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を脱分化プロトコルに供し、これは、低レベル共刺激（１：３のビーズ対Ｔ細胞の比）、テムシロリムス（図４に示されるように「ＴＥＭ」、１．０または０．３μＭの濃度）、ビタミンＤ（示されるように「Ｄ」、０．０１、０．０３、０．１、０．３、または１．０ｎＭの濃度）、ならびに抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体（ダクリズマブ、５０μｇ／ｍｌ、示されるように「ＤＡＣ」）を使用して３日間の培養を含んだ。３日間培養間隔後、Ｔ細胞を採取し、タンパク質を単離し、オートファジー関連遺伝子ｐ６２、およびハウスキーピング遺伝子アクチンについてウェスタンブロット分析を行った。

【0171】

図４が示すように、上方制御されたｐ６２によって測定した場合、Ｔ細胞培養物中のビタミンＤの含有は、オートファジーの増加にとって重要であった。０．０１～０．１ｎＭの用量のビタミンＤは、０．３～１．０μＭの濃度のテムシロリムスと協働して、脱分化中にオートファジーマーカーｐ６２を有益に上方制御する。すなわち、図４、培養＃６（第５の列）では、ウェスタンブロット分析でのｐ６２発現は非常に少なく、これは、低レベルのオートファジーと一致する。図の凡例が示すように、この培養条件は、低レベルの共刺激、テムシロリムス、抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体ダクリズマブを受けたが、ビタミンＤを受けなかった。

【0172】

対照的に、他の培養条件は、それぞれビタミンＤ補充を受け、それぞれがｐ６２発現を増加させた（ビタミンＤの有効用量範囲、０．０１ｎＭ～１．０ｎＭ）。この図４はまた、抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体添加を伴わないビタミンＤおよびテムシロリムス添加を伴わないビタミンＤが、Ｔ細胞オートファジーの誘導に十分であったことも実証する。

【0173】

要約すると、これらのデータは、低レベル共刺激を有するビタミンＤを含むことが、単独で、または他のＴ細胞阻害剤、すなわち、抗ＩＬ－２受容体試薬またはｍＴＯＲ阻害剤テムシロリムスと組み合わせて、Ｔ細胞オートファジーを誘導するための効率的な方法であることを示す。

【0174】

実施例５：ビタミンＤ、テムシロリムス、および抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体の組み合わせは、ｍＴＯＲＣ１複合体の最適な破壊をもたらす。
本発明者らは、ｍＴＯＲＣ１シグナル伝達複合体の重要な成分であるＲａｐｔｏｒの発現に対する様々なＴ細胞培養条件の効果も評価した。重要なことに、ｍＴＯＲＣ１の阻害は、体細胞のｉＰＳＣ状態へのリプログラミングに重要であることが最近発見されている。

【0175】

図５は、ビタミンＤ、テムシロリムス、および抗ＩＬ－２受容体遮断の組み合わせが、ｍＴＯＲＣ１関連分子、ＲＡＰＴＯＲの発現を低下させることを示す。ヒトＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を脱分化プロトコルに供し、これは、低レベル共刺激（１：３のビーズ対Ｔ細胞の比）、テムシロリムス（図５に示されるように「ＴＥＭ」、１．０または０．３μＭの濃度）、ビタミンＤ（示されるように「Ｄ」、０．０１、０．０３、０．１、０．３、または１．０ｎＭの濃度）、ならびに抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体（ダクリズマブ、５０ｎｇ／ｍｌ、示されるように「ＤＡＣ」）を使用して３日間の培養を含んだ。３日間培養間隔後、Ｔ細胞を採取し、タンパク質を単離し、ｍＴＯＲＣ１複合体タンパク質Ｒａｐｔｏｒおよびハウスキーピング遺伝子アクチンについてウェスタンブロット分析を行った。

【0176】

図５が示すように、ＲＡＰＴＯＲ発現の減少によって示されるように、ｍＴＯＲＣ１複合体の最適な阻害は、Ｔ細胞を、テムシロリムス（１．０μＭ）、ビタミンＤ（０．１ｎＭ）、および抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体ダクリズマブ（５０μｇ／ｎｌ）と組み合わせて低いビーズ対Ｔ細胞の比（１：３）で共刺激したときに生じた（第１の列に示す；培養１）。

【0177】

図５が示すように、ダクリズマブの省略は、ＲＡＰＴＯＲ発現のわずかな増加をもたらし、それによって、最適なｍＴＯＲＣ１阻害のための抗ＩＬ－２受容体試薬の役割を示す。したがって、抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体ダクリズマブ（用量、５０μｇ／ｍＬ）は、ｍＴＯＲＣ１サブユニット分子であるＲａｐｔｏｒ（列２）を抑制する上で有益な役割を果たす。

【0178】

図５が示すように、ビタミンＤによるｍＴＯＲＣ１サブユニット分子ＲＡＰＴＯＲの最適な阻害は、０．０３～０．１ｎＭのビタミンＤ用量であり、この範囲よりも低いかまたはそれよりも高い濃度は、ＲＡＰＴＯＲの最適未満の抑制をもたらす。したがって、０．０３ｎＭまで低いレベルのビタミンＤは、ＲＡＰＴＯＲの最適阻害に十分である。しかしながら、ビタミンＤレベルを０．０１ｎＭに低下させると、最適以下のＲＡＰＴＯＲ阻害をもたらす。さらに、０．１ｎＭの濃度を超えてビタミンＤレベルを増加させることは、より高いレベルのＲＡＰＴＯＲ発現を有した培養物７（０．３ｎＭの濃度のビタミンＤ）によって示されるように、有害であり得る。

【0179】

さらに、図５が示すように、ＲＡＰＴＯＲの最適な下方制御は、０．３μＭの濃度でテムシロリムスを補充した培養物９がより高いレベルのＲＡＰＴＯＲ発現を有していたため、テムシロリムス用量が最適に１．０μＭであるビタミンＤとテムシロリムスの組み合わせを必要とする。

【0180】

実施例６：ビタミンＤ、テムシロリムス、および抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体の組み合わせは、ｍＴＯＲＣ１複合体およびｍＴＯＲＣ２複合体の両方を破壊する。
本発明者らは、また、ラパマイシンの阻害効果に直接感受性ではないが、ｍＴＯＲＣ１遮断の延長をもたらす条件の影響を受ける可能性があるｍＴＯＲＣ２複合体も評価した。重要なことに、ｍＴＯＲＣ２の阻害は幹細胞様状態を促進することができる。

【0181】

図６は、ビタミンＤ、テムシロリムス、および抗ＩＬ－２受容体遮断の組み合わせが、ｍＴＯＲＣ１関連分子、ＲＡＰＴＯＲ、およびｍＴＯＲＣ２関連分子、Ｒｉｃｔｏｒの発現を低下させることを示す。ヒトＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を脱分化プロトコルに供し、これは、低レベル共刺激（１：３のビーズ対Ｔ細胞の比）、テムシロリムス（図６に示されるように「ＴＥＭ」、１．０μＭの濃度）、ビタミンＤ（示されるように「Ｄ」、０．０３、０．１、０．３、または１．０ｎＭの濃度）、ならびに抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体（ダクリズマブ、５０ｎｇ／ｍｌ、示されるように「ＤＡＣ」）を使用して３日間の培養を含んだ。３日間培養間隔後、Ｔ細胞を採取し、タンパク質を単離し、ｍＴＯＲＣ１複合体タンパク質Ｒａｐｔｏｒ；ｍＴＯＲＣ２複合体タンパク質、Ｒｉｃｔｏｒ；ポストｍＴＯＲＣ１タンパク質、ｐ７０Ｓ６Ｋ；ポストｍＴＯＲＣ２タンパク質、ＳＧＫ１、およびハウスキーピング遺伝子、ＧＡＰＤＨについてウェスタンブロット分析を行った。

【0182】

図６が示すように、３つの阻害剤のうちのいずれも含有しなかった対照培養物と比較して、テムシロリムス、ビタミンＤ、および抗ＩＬ－２受容体抗体ダクリズマブを含有する培地中のＴ細胞培養物は、ｍＴＯＲＣ１分子ＲＡＰＴＯＲおよびｍＴＯＲＣ２分子Ｒｉｃｔｏｒの両方において減少した。ポストｍＴＯＲＣ１分子ｐ７０Ｓ６ＫおよびポストｍＴＯＲＣ２分子ＳＧＫ１のレベルは比較的保持された。したがって、ビタミンＤ（０．０３～１．０ｎＭの濃度）は、ｍＴＯＲＣ２サブユニットであるＲｉｃｔｏｒの下方制御のための組み合わせ剤分化の間に有効であった。そして、１μＭの濃度のテムシロリムスは、ｍＴＯＲＣ２サブユニットであるＲｉｃｔｏｒの下方制御性のための組み合わせ剤分化の間に有効であった。さらに、抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体ダクリズマブ（用量、５０μｇ／ｍＬ）は、テムシロリムスおよびビタミンＤがｍＴＯＲＣ２サブユニットＲｉｃｔｏｒを下方制御する能力を廃棄しなかった。

【0183】

したがって、低レベルの共刺激ならびにテムシロリムス、ビタミンＤ、および抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体の３部阻害レジメンを使用したＴ細胞培養は、ＲＡＰＴＯＲおよびＲｉｃｔｏｒサブユニットの両方を低減するための新規な方法を表す。

【0184】

実施例７：ビタミンＤ、テムシロリムス、および抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体の組み合わせは、プロアポトーシスＢｃｌ２ファミリーメンバー遺伝子ＢＩＭの発現を低減する。
ミトコンドリアのレベルでのオートファジー（ミトファジー）の結果、ミトコンドリアタンパク質の質を改変することができ、特に、ミトファージでは、ＢＩＭなどのアポトーシス前駆ファミリーメンバーから抗アポトーシス前駆ファミリーメンバー遺伝子へのｂｃｌ２ファミリーメンバー遺伝子に向かう有利なシフトがあり得る。さらに、アポトーシス傾向を減少させる培養方法は、脱分化能力の増加と関連付けられる。

【0185】

図７は、ビタミンＤ、テムシロリムス、および抗ＩＬ－２受容体遮断の組み合わせが、プロアポトーシス分子、ＢＩＭの発現を低下させることを示す。ヒトＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を脱分化プロトコルに供し、これは、低レベル共刺激（１：３のビーズ対Ｔ細胞の比）、テムシロリムス（図７に示されるように「ＴＥＭ」、１．０または０．３μＭの濃度）、ビタミンＤ（示されるように「Ｄ」、０．０１、０．０３、０．１、０．３、または１．０ｎＭの濃度）、ならびに抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体（ダクリズマブ、５０ｎｇ／ｍｌ、示されるように「ＤＡＣ」）を使用して３日間の培養を含んだ。３日間培養間隔後、Ｔ細胞を採取し、タンパク質を単離し、プロアポトーシス関連遺伝子ＢＩＭ、およびハウスキーピング遺伝子アクチンについてウェスタンブロット分析を行った。

【0186】

これを評価するために、本発明者らは、低強度の共刺激（１：３のビーズ対Ｔ細胞の比）および種々の阻害剤の存在で培養したＴ細胞におけるＢＩＭレベルを測定した。図７が示すように、テムシロリムス、ビタミンＤ（０．１ｎＭ）、および抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体ダクリズマブの組み合わせを含有するＴ細胞培養物は、最低レベルのＢＩＭ発現を有した。しかし、なお、図７は、抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体ダクリズマブ（用量、５０μｇ／ｍｌ）が、プロアポトーシス分子であるＢＩＭを抑制する上で有益な役割を果たすことを示す（列２）。３つの阻害剤のそれぞれは、いずれかの単一の阻害剤の不在がＢＩＭレベルを増加させたため、ＢＩＭ阻害において役割を果たすように見えた。

【0187】

したがって、本発明者らは、併用阻害剤レジメンは、アポトーシス傾向のミトコンドリア制御における好ましいシフトを誘導するための方法を表すと結論付ける。

【0188】

実施例８：３つの阻害剤脱分化レジメンは、阻害剤の除去後に後続の増殖能力を有するＴ細胞をもたらす。
低レベルの共刺激、テムシロリムス、ビタミンＤ、および抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体からなる３日間のレジメンが再分化可能な脱分化状態をもたらしたことを実証するために、本発明者らは、培養から阻害剤を除去した後、高レベルの共刺激（３：１のビーズ対Ｔ細胞の比）を使用して、培養３日目に細胞を再刺激する実験を行った。１０日後（総培養の１３日後）、Ｔ細胞を採取し、数え上げ、フローサイトメトリーによって評価した。

【0189】

図８は、（培養の１３日目における）後続のＴ細胞収率に対する脱分化区間中の培養成分の効果を例示する。ヒトＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を、低レベルの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８共刺激（ビーズ対Ｔ細胞の比、示されるように１：３もしくは１：１）、テムシロリムス（１μＭ、または低用量［「Ｌｏ」］、０．１μＭ）、ビタミンＤ（０．１ｎＭ、または１．０ｎＭの高用量［「ＨＤ」］、または０．０１ｎＭの低用量）、抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体（ダクリズマブ、５０μｇ／ｍｌ）、ならびに５％のヒトＡＢ血清を補充したＸ－Ｖｉｖｏ ２０培地中での培養を含む３日間の脱分化区間に供した。第１の列は、対照培養物（テムシロリムス、ビタミンＤ、または抗ＩＬ－２Ｒ抗体は含まない）を表す。第２の列は抗ＩＬ－２Ｒ抗体を有さない培養物を表し、第４の列は血清補充を有さない培養物を表し、第５の列は低用量ビタミンＤを表し、第６の列は高用量ビタミンＤを使用した結果を表し、第７の列は低用量テムシロリムスを使用した結果を表し、第８の列はテムシロリムスを有さない培養物を表し、第９の列はより高いビーズ比を使用した結果を表す。３日間の区間の後、培地を阻害剤なしの新鮮なＸ－Ｖｉｖｏ ２０に交換し、高レベル共刺激（３：１ビーズ対Ｔ細胞の比）を提供し、Ｔ細胞成長サイトカインＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍｌ）およびＩＬ－７（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。培養の１３日目に、生存Ｔ細胞を列挙し、全体的な収率を０日目の入力数と比較して示す。

【0190】

図８は、再分化段階の後のＴ細胞数を示す。これらのデータが示すように（列＃３）、低レベルの共刺激、テムシロリムス、ビタミンＤ、および抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体を使用して最初の３日間の脱分化区間にわたって維持されたＴ細胞は、満足のいくＴ細胞収率（培養入力の２５０％超）を有した。

【0191】

かなり対照的に、列＃４に表される培養液中で非常に低い収率が観察され、これは、最初の３日間の培養区間中に血清補充を受けなかった。したがって、このデータは、最初の３日間の培養区間が、５％のＡＢ血清を補充したＸ－Ｖｉｖｏ ２０培養培地を含む必要があることを実証する。

【0192】

また、ビタミンＤ濃度を０．０１ｎＭに低下させるか、またはビタミンＤ濃度を１．０ｎＭに増加させると、非常に低い収率がもたらされた（データは、それぞれ列＃５および＃６に示される）。したがって、ビタミンＤの好ましい濃度は、０．１ｎＭである。

【0193】

さらに、テムシロリムス濃度を０．１μＭに低下させると、得られたＴ細胞収率が低下した（列＃７）。このため、テムシロリムスの好ましい濃度は１．０μＭである。

【0194】

最後に、共刺激レベルが脱分化区間中に増加した場合（ビーズ対Ｔ細胞の比が１：３から１：１に変化し、結果が最後の列＃９に示される）、得られたＴ細胞数は非常に低かった。図８に示すように、脱分化中に低レベルの共刺激を使用する必要があり（１：３の共刺激ビーズ対Ｔ細胞の比）、これは、１：１に比率を増加させると、脱分化状態からＴ細胞を製造する能力が大幅に低下するためである（最後の列）。そのため、培養の脱分化段階における好ましいビーズ対Ｔ細胞の比は、１：３である。

【0195】

実施例９：最初の３成分の培養区間は、低減された分化と一致する細胞表面分子を発現するＣＤ４^＋Ｔ細胞の生成をもたらす。
培養の再分化段階中の様々な時点で、得られたＣＤ４^＋Ｔ細胞を、フローサイトメトリーによるメモリーマーカーの発現について評価した。

【0196】

図９Ａ～図９Ｃは、（培養の１３日目における）メモリーマーカーのＣＤ４^＋Ｔ細胞発現に対する脱分化区間中の培養成分の効果を例示する。ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、低レベルの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８共刺激（ビーズ対Ｔ細胞の比、１：３）、テムシロリムス（１μＭまたは０．１μＭ［低用量「Ｌｏ」］）、ビタミンＤ（０．１ｎＭまたは０．０１ｎＭ［低用量「Ｌｏ」］）、抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体（ダクリズマブ、５０μｇ／ｍｌ）、ならびに５％のヒトＡＢ血清を補充したＸ－Ｖｉｖｏ ２０培地中での培養を含む３日間の脱分化区間に供した（上記図９Ａ～９Ｃに示されるように）。３日間の区間の後、培地を阻害剤なしの新鮮なＸ－Ｖｉｖｏ ２０に交換し、高レベル共刺激（３：１ビーズ対Ｔ細胞の比）を提供し、Ｔ細胞成長サイトカインＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍｌ）およびＩＬ－７（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。Ｔ細胞を、ＣＤ４^＋およびＣＤ４５ＲＡ^＋マーカーの共発現（上記パネルに示される結果、培養の１３日目に評価した）；ＣＤ４^＋、ＣＤ６２Ｌ^＋、およびＣＣＲ７^＋マーカーの共発現（左下パネル；培養３日目に評価した）；ならびにＣＤ４^＋、ＣＤ６２Ｌ^＋、ＣＣＲ７^＋、およびＣＤ１２７^＋マーカーの共発現（右下パネル；培養１０日目に評価した）の評価のためのフローサイトメトリーに供した。全ての結果は、培養開始時のＣＤ４^＋Ｔ細胞の値と比較して示される（図９Ａ～９Ｃの最後の列、「０日目入力値」）。

【0197】

図９Ａに示すように、０日目の入力Ｔ細胞からの値と比較して、最初にテムシロリムス、ビタミンＤ、および抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体の組み合わせで増殖したＴ細胞は、ナイーブＴ細胞上で発現されるＣＤ４５ＲＡマーカーの比較的保存された発現を有した（列＃３）。かなり対照的に、初期の培養区間中におけるこれら３つの分子の不在とは、ナイーブＴ細胞集団の枯渇をもたらした（培養＃１）。さらに、初期の培養区間中におけるテムシロリムスの排除は、ナイーブＴ細胞集団（培養＃６）の枯渇をもたらした。

【0198】

図９Ｂに示されるように、低レベルの共刺激を組み込んだ３日の区間中に最初に増殖したＴ細胞培養物のそれぞれは、セントラルメモリー分子ＣＤ６２ＬおよびＣＣＲ７のＴ細胞発現の増加を有した。

【0199】

最後に、図９Ｃに示すように、最初にテムシロリムス、ビタミンＤ、および抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体の組み合わせで増殖したＴ細胞では、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、およびＩＬ－７受容体α（ＣＤ１２７）に対してトリプル陽性であったＴ細胞の発現が大幅に増加した（０日目の入力細胞と比較して）。初期の３日間培養中の３つの阻害剤の排除（列＃１）は、初期の培養区間がこのトリプル陽性集団の拡大を促進する能力を無効にした。加えて、初期の培養区間からテムシロリムスのみを低減または排除することもまた、トリプル陽性Ｔ細胞の頻度を大幅に低減させた（列＃５および６）。

【0200】

要約すると、これらのデータは、３つの薬物の初期培養区間が、非常に限定されたＴ細胞分化の状態であるＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、およびＣＤ１２７の共発現を含む、主に末期のエフェクターメモリー集団から低分化Ｔ細胞集団へのＣＤ４＋Ｔ細胞の転換をもたらすことを示す。

【0201】

実施例１０：最初の３成分の培養区間は、低減された分化と一致する細胞表面分子を発現するＣＤ８^＋Ｔ細胞の生成をもたらす。
培養の再分化段階中の様々な時点で、得られたＣＤ８^＋Ｔ細胞を、フローサイトメトリーによるメモリーマーカーの発現について評価した。

【0202】

図１０Ａ～図１０Ｂは、メモリーマーカーのＣＤ８^＋Ｔ細胞発現に対する脱分化区間中の培養成分の効果を例示す。ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、低レベルの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８共刺激（ビーズ対Ｔ細胞の比、１：３）、テムシロリムス（１μＭまたは０．１μＭ［低用量「Ｌｏ」］）、ビタミンＤ（０．１ｎＭまたは０．０１ｎＭ［低用量「Ｌｏ」］）、抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体（ダクリズマブ、５０μｇ／ｍｌ）、ならびに５％のヒトＡＢ血清を補充したＸ－Ｖｉｖｏ ２０培地中での培養を含む３日間の脱分化区間に供した（上記図１０Ａ～１０Ｂに示されるように）。３日間の区間の後、培地を阻害剤なしの新鮮なＸ－Ｖｉｖｏ ２０に交換し、高レベル共刺激（３：１ビーズ対Ｔ細胞の比）を提供し、Ｔ細胞成長サイトカインＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍｌ）およびＩＬ－７（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。Ｔ細胞を、ＣＤ８^＋、ＣＤ６２Ｌ^＋、およびＣＣＲ７^＋マーカーの共発現（左パネル；培養１０日目に評価した）；ならびに、ＣＤ８^＋、ＣＤ６２Ｌ^＋、ＣＣＲ７^＋、およびＣＤ１２７^＋マーカーの共発現（右パネル；培養１０日目に評価した）の評価のためのフローサイトメトリーに供した。全ての結果は、培養開始時のＣＤ８^＋Ｔ細胞の値と比較して示される（図１０Ａ～１０Ｂの最後の列、「０日目入力値」）。

【0203】

図１０Ａに示されるように、低レベルの共刺激を組み込んだ３日の区間中に最初に増殖したＴ細胞培養物のそれぞれは、セントラルメモリー分子ＣＤ６２ＬおよびＣＣＲ７のＣＤ８^＋Ｔ細胞発現の増加を有した。

【0204】

最後に、図１０Ｂに示すように、最初にテムシロリムス、ビタミンＤ、および抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体の組み合わせで増殖したＴ細胞では、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、およびＩＬ－７受容体α（ＣＤ１２７）に対してトリプル陽性であったＣＤ８^＋Ｔ細胞の発現が大幅に増加した（０日目の入力細胞と比較して）。初期の３日間培養中の３つの阻害剤の排除（列＃１）は、初期の培養区間がこのトリプル陽性集団の拡大を促進する能力を無効にした。加えて、初期の培養区間からテムシロリムスのみを低減または排除することもまた、トリプル陽性Ｔ細胞の頻度を大幅に低減させた（列＃５および６）。

【0205】

要約すると、これらのデータは、３つの薬物の初期培養区間が、非常に限定されたＴ細胞分化の状態であるＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、およびＣＤ１２７の共発現を含む、主に末期のエフェクターメモリー集団から低分化Ｔ細胞集団へのＣＤ８^＋Ｔ細胞の転換をもたらすことを示す。

【0206】

実施例１１：脱分化したＴ細胞は、低サイトカイン電位に向かって本質的なバイアスを有する
図１１Ａ～１１Ｄは、低レベルの共刺激（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズ対Ｔ細胞の比が１：３であり、これは、Ｋａｌａｍａｓｚ Ｄ、Ｌｏｎｇ ＳＡ、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ Ｒ、Ｂｕｃｋｎｅｒ ＪＨ、Ｂｅｒｅｎｓｏｎ ＲＪ、Ｂｏｎｙｈａｄｉ Ｍ．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｅｘ ｖｉｖｏ ｕｓｉｎｇ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｔｉ－ＣＤ３ ａｎｄ Ａｎｔｉ－ＣＤ２８ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ（Ｈａｇｅｒｓｔｏｗｎ、Ｍｄ：１９９７）．２００４；２７（５）：４０５－４１８に記載されている慣用的な方法と比較して低減されている）、ｍＴＯＲ阻害剤テムシロリムス；ビタミンＤ、および抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体の使用を含む、脱分化プロセスの成分を強調している。

【0207】

図１１Ａ～１１Ｄは、分極中性培地中で培養された脱分化Ｔ細胞の炎症性Ｔｈ１／Ｔｈ１７サイトカイン分析を示す。ヒトＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を、示されるように、以下の培養成分：テムシロリムス（Ｙは１μＭの濃度を示し、Ｙ、Ｌｏは、０．１μＭの濃度を示す）、ビタミンＤ（Ｙは０．１ｎＭの濃度を示し、Ｙ、Ｌｏは、０．０１ｎＭの濃度を示す）、抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体（ダクリズマブ、５０μｇ／ｍｌ）、低比率（ビーズ対Ｔ細胞の比、１：３）で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（３／２８）被覆された磁性ビーズとの共刺激、ならびに５％ヒト血清での補充を含む３日間の脱分化手順に供した。３日後、脱分化Ｔ細胞を、Ｔ細胞分極を誘導する点において強力ではない、Ｔ細胞増殖サイトカインｒｈｕ ＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍｌ）およびｒｈｕ ＩＬ－７（１０ｎｇ／ｍｌ）を補充した培地中で共刺激した（典型的なビーズ対Ｔ細胞の比３：１）。培養１０日後（合計、培養の１３日目）、Ｔ細胞を採取し、洗浄し、３／２８ビーズ（３：１比）で２４時間再刺激し、得られた上清を採取し、Ｌｕｍｉｎｅｘマルチ分析物法によってサイトカイン含有量について試験した。示される全ての結果は、１×１０^６細胞／ｍｌ／２４時間当たり、ｐｇ／ｍｌ単位でサイトカインレベルとして発現される。

【0208】

脱分化Ｔ細胞状態が、特定のサイトカイン分泌パターンに向かって固有の偏りを示したかどうかを評価するために、本発明者は、高レベルの共刺激（ビーズ対Ｔ細胞の比、３：１）およびいずれの阻害剤も含有せず、Ｔ細胞成長サイトカインＩＬ－２およびＩＬ－７のみを含有する培地中での維持を使用して、脱分化Ｔ細胞を培養した。

【0209】

図１１Ａ～１１Ｄで詳細が示されるように、脱分化前駆状態のそれぞれから再分化された結果として生じたＴ細胞は、ＩＦＮ－γ（ほとんどの値が１０００ｐｇ／ｍｌ未満）、ＴＮＦ－α（ほとんどの値が１００ｐｇ／ｍｌ未満）、およびＩＬ－１７（全ての値が１０ｐｇ／ｍｌ未満）を含む、炎症性サイトカインの分泌レベルが非常に低かった。注目すべきことに、ＧＭ－ＣＳＦは、いくつかの条件下で、はるかに高いレベル、場合によっては１０，０００ｐｇ／ｍｌを超えるレベルで分泌された。ＧＭ－ＣＳＦ値は、より高い用量のテムシロリムス（１．０μＭ）およびより高い用量のビタミンＤ（０．１ｎＭ）からなる脱分化状態で調節された。したがって、結果として生じるＧＭ－ＣＳＦのＴ細胞サイトカイン分泌の調節のために、これらより高い濃度のテムシロリムスおよびビタミンＤを組み込んだ脱分化方法からＴ細胞を拡張することが望ましい。

【0210】

特に、脱分化間隔中に低濃度のビタミンＤ（０．０１ｎＭ）を含めることは、より高い濃度のビタミンＤ（０．１ｎＭ）の使用と比較して、やや高いレベルのＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αももたらした。したがって、炎症性サイトカインＩＦＮ－γの結果として生じるＴ細胞分泌の調節に関して、約０．１ｎＭの濃度のビタミンＤを使用することが好ましい。

【0211】

さらに、図１２Ａ～１２Ｄに示されるように、脱分化前駆状態Ｔ細胞のそれぞれから再分化された結果として生じるＴ細胞は、ＩＬ－２の非常に低いレベルの分泌を有したが、再び、より高い濃度のテムシロリムスおよびビタミンＤを組み込んだ状態では、これらの薬剤のより低い濃度を使用した条件と比較して、レベルは低かった。

【0212】

図１２Ａ～１２Ｄは、分極中性培地における培養された脱分化Ｔ細胞のＩＬ－２およびＴｈ２型サイトカイン分析を示す。ヒトＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を、示されるように、以下の培養成分：テムシロリムス（Ｙは１μＭの濃度を示し、Ｙ、Ｌｏは、０．１μＭの濃度を示す）、ビタミンＤ（Ｙは０．１ｎＭの濃度を示し、Ｙ、Ｌｏは、０．０１ｎＭの濃度を示す）、抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体（ダクリズマブ、５０μｇ／ｍｌ）、低比率（ビーズ対Ｔ細胞の比、１：３）で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（３／２８）被覆された磁性ビーズとの共刺激、ならびに５％ヒト血清での補充を含む３日間の脱分化手順に供した。３日後、脱分化Ｔ細胞を、Ｔ細胞分極を誘導する点において強力ではない、Ｔ細胞増殖サイトカインｒｈｕ ＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍｌ）およびｒｈｕ ＩＬ－７（１０ｎｇ／ｍｌ）を補充した培地中で共刺激した（典型的なビーズ対Ｔ細胞の比３：１）。培養１０日後（合計、培養の１３日目）、Ｔ細胞を採取し、洗浄し、３／２８ビーズ（３：１比）で２４時間再刺激し、得られた上清を採取し、Ｌｕｍｉｎｅｘマルチ分析物法によってサイトカイン含有量について試験した。示される全ての結果は、１×１０^６細胞／ｍｌ／２４時間当たり、ｐｇ／ｍｌ単位でサイトカインレベルとして発現される。

【0213】

得られたＴ細胞はまた、Ｔｈ２型サイトカインＩＬ－４（２０ｐｇ／ｍｌ未満の値）およびＴｈ２型サイトカインＩＬ－５（６０ｐｇ／ｍｌ未満の値）の非常に低レベルの分泌を有した。しかしながら、ＩＬ－１３のレベルは、いくつかのＴ細胞培養条件において上昇し、より低い濃度でこれらの薬剤を使用した条件と比較して、より高い濃度のテムシロリムスおよびビタミンＤを組み込んだ条件において、より低いサイトカイン分泌が検出された。

【0214】

要約すると、これらのデータは、工程１脱分化プロセス後の強力な分極シグナルなし（ＩＦＮ－α、ＩＬ－４、またはＴＧＦ－βの添加なし）のＴ細胞成長サイトカイン（ＩＬ－２およびＩＬ－７）を含有する培地におけるＴ細胞の再分化が、低サイトカイン電位のＴ細胞に向かって固有の偏りを有することを示し、特に、本発明者らは、低レベルの有害なサイトカインＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、およびＩＬ－１７を実証した。この観察は、脱分化工程が、１．０μＭの濃度のテムシロリムス、０．１ｎＭの濃度のビタミンＤ、および抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体を含む培地中に低レベルの共刺激および増殖を組み込む場合、特に強力である。

【0215】

実施例１２：ハイブリッドＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２分極条件下および新規薬剤ペメトレキセドの存在下での脱分化Ｔ細胞の好ましい拡張
本発明者らは、Ｔ細胞再分化がＴ_ＲＥＧ分極サイトカインＩＬ－２およびＴＧＦ－β、またはＴｈ１分極サイトカイン、ＩＦＮ－αを組み込んだときの脱分化成分の効果を評価した。

【0216】

実際、ＴＢＥＴまたはＧＡＴＡ３のいずれかが、免疫耐性を維持するためのＴ_ＲＥＧ細胞能力を維持することが示されている。それにもかかわらず、Ｔ_ＲＥＧ細胞機能におけるＴＢＥＴまたはＧＡＴＡ３のいずれかの役割についてのこの証拠にもかかわらず、自己免疫におけるＴＢＥＴおよび結果として生じるＴｈ１型経路の非常に強い結合のために、本発明者らは、製造されたＴ_ＲＥＧ細胞におけるＧＡＴＡ３発現を優先することを選択した。したがって、本発明者らは、工程１の脱分化プロセス、およびその後の、Ｔ_ＲＥＧ分極シグナル（ＩＬ－２、ＴＧＦ－β）および主なＴｈ２分極シグナル（ＩＬ－４）の両方を含む工程２の再分化プロセスのいずれかが、ヒト「ハイブリッド」Ｔ_ＲＥＧ－Ｔｈ２細胞を生成し得るかどうかを評価した。Ｔ_ＲＥＧ細胞エクスビボ培養物へのＩＬ－４の意図的な添加が、Ｔ_ＲＥＧ表現型を促進または抑制するかのいずれかであることが示されたため、実験マウスモデルからの文献の結果は、この点に関して混合される。Ｔ_ＲＥＧ細胞製造における外因性ＩＬ－４の役割に関するこの矛盾するマウス文献に加えて、ヒトＴ_ＲＥＧ細胞に対するＩＬ－４のエクスビボ役割に関する情報は乏しいが、本研究では、ＩＬ－４がヒトＴ_ＲＥＧ細胞機能を保持したことが見出された。

【0217】

ｉＴ_ＲＥＧ細胞は、ｉＴ_ＲＥＧ細胞が病原性Ｔｈ１型またはＴｈ１７型サブセットに変換することができるインビボ分化可塑性の傾向を有すると特徴付けられているため、ハイブリッドＴｈ２成分を有するヒトｉＴ_ＲＥＧ細胞は養子Ｔ細胞療法に好ましい場合がある。他方では、Ｔｈ２型表現型への分化がｉＴ_ＲＥＧ製造内でコード化される場合、Ｔｈ２バイアスは、Ｔｈ１／Ｔｈ１７表現型への可塑性を予測可能に制限する。

【0218】

さらに、本発明者らは、医薬品ペメトレキセドがｉＴ_ＲＥＧ細胞表現型を促進するのに有益であり得るかどうかを評価した。優先的なｉＴ_ＲＥＧ細胞生成のための薬剤の使用のための前例が存在し、最も顕著には、ｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシンは、ｉＴ_ＲＥＧ細胞へ向かうシフトと関連付けられている。しかしながら、ペメトレキセドは、ｉＴ_ＲＥＧ促進効果を有することを特徴付けられていない。ペメトレキセドは葉酸塩抗代謝物として複雑な作用機序を有する。

【0219】

図１３は、ハイブリッドＴｈ２／_ＲＥＧ分極条件において、Ｔｈ１分極条件と比較して、脱分化Ｔ細胞の好ましい拡張を示す。ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を３日の脱分化手順（「工程１」）に供した。図１３に示されるように、この工程１の脱分化介入には、変動的に、阻害剤なし（「なし」）、テムシロリムス単独（「Ｔ」、１．０μＭ）、ビタミンＤ単独（「Ｄ」、０．１ｎＭ）、抗ＩＬ－Ｒモノクローナル抗体バシリキシマブ単独（「Ｂ」、１０μｇ／ｍｌ）、または阻害剤の様々な組み合わせ（Ｔ、Ｄ、もしくはＴ、Ｄ、Ｂ）が含まれた。３日後、脱分化したＴ細胞を、変動的にＴｈ１分極条件（ｒｈｕ ＩＦＮ－α、１０，０００ＩＵ／ｍｌ）、Ｔ_ＲＥＧ分極（ｒｈｕ ＩＬ－２、１００ＩＵ／ｍｌ、ｒｈｕ ＴＧＦ－β、１０ｎｇ／ｍｌ）、またはハイブリッドＴｈ２－Ｔ_ＲＥＧ分極条件（ＩＬ－２、ＴＧＦ－β、さらにｒｈｕ ＩＬ－４［１０００ＩＵ／ｍｌ］）で補充された培地中で共刺激した（典型的なビーズ対Ｔ細胞の比、３：１）。加えて、新規の阻害分子ペメトレキセドなしで（「０」）、または示されるような可変濃度のペメトレキセド（１０ｎＭ［「１０」］、３３ｎＭ［「３３」］、または１００ｎＭ［「１００」］の存在下で、可変分極条件の存在下で、Ｔ細胞培養を行った。合計１０日間の培養後、ｎ＝２４個の培養物を採取し、生細胞を列挙し、上でグラフ化した（ｙ軸は細胞数×１０^６個、入力細胞数は１．５×１０^６個であった）。

【0220】

図１３が示すように、工程１の脱分化後のＴ細胞の再分化能力は、脱分化中に添加される特異的成分、再分化中に添加される特異的サイトカイン、および再分化中のペメトレキセドの存在に依存した。

【0221】

注目すべきことに、工程１の脱分化後に十分な数のＴ細胞を再分化しようとする試みは、Ｔｈ１型分極の条件下では成功しなかった（図１３、培養物＃９～＃１６を参照；全てのＴ細胞の収率は、Ｔ細胞入力数未満であった）。脱分化条件がテムシロリムスおよびビタミンＤを単独で、または抗ＩＬ－２受容体試薬と組み合わせて含む場合、Ｔｈ１型経路に沿って再分化する非常に限定された能力が観察され、ペメトレキセドが工程２培養中に添加されていないか、または１０～１００ｎＭの範囲の濃度で添加されていない場合も観察された。

【0222】

かなり対照的に、工程１の脱分化後の十分な数のＴ細胞の再分化の試みは、ハイブリッドＴ_ＲＥＧ－Ｔｈ２分極の条件下で成功した（図１３、培養物＃２および＃５を参照）。注目すべきことに、最も厳しい脱分化条件（テムシロリムス、ビタミンＤ、および抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体の含有）において、Ｔ_ＲＥＧ－Ｔｈ２分極条件における十分なＴ細胞は、１０ｎＭの濃度でペメトレキセドを工程２培養物に添加した場合にのみ観察された。

【0223】

この最も厳しい脱分化工程１の条件を使用して、工程２中に純粋なＴ_ＲＥＧ分極条件（ＩＬ－４を含まない、ＩＬ－２＋ＴＧＦ－β）で十分な数のＴ細胞を再分化させる試みは、ペメトレキセドの存在下であっても成功しなかった（培養物＃２０および＃２１）。

【0224】

要約すると、数値の観点から、Ｔ_ＲＥＧ－Ｔｈ２ハイブリッド分極条件（ＩＬ－２、ＴＧＦ－β、およびＩＬ－４）を使用し、１０ｎＭの濃度でペメトレキセドを使用して、Ｔ細胞再分化の成功を最適に行う。

【0225】

実施例１３：ハイブリッドＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２条件における脱分化Ｔ細胞の培養は、限定的な分化状態のＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の生成をもたらす
本発明者らは、また、Ｔ細胞メモリー状態に対する様々なサイトカイン分極条件／様々なペメトレキセド条件における、この工程１の脱分化プロセス、続いて工程２の再分化の効果を評価した。すなわち、限られた分化状態のＴ細胞が養子細胞療法のための治療的有用性を向上させたことを研究は示している。したがって、限られたＴ細胞分化は、工程１／工程２のＴ細胞製造方法の有利な特徴であろう。

【0226】

図１４Ａ～図１４Ｃは、ハイブリッドＴｈ２／Ｔ_ＲＥＧ分極条件における脱分化Ｔ細胞の培養が、ナイーブおよびトリプル陽性ＴセントラルメモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞の生成をもたらすことを例示する。ヒトＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を、図１３に記載のように、変動的な分極培養条件およびペメトレキセドの変動的な存在を含有する培地中で３日間の脱分化手順およびその後の培養に供した。Ｎ＝２４の培養条件の合計のうち、好ましい細胞収率を有する培養物のみをさらに評価し、ペメトレキセド（「＋」）を含有する全ての培養物が１０ｎＭの濃度であったことが示された。上記のＴ_ＲＥＧ条件は、（「ＴＲｅｇ、ＩＬ４なし」）と示されない限り、全てＩＬ－２、ＴＧＦ－β、およびＩＬ－４（「ＴＲｅｇ」）を含有した。合計１０日間の培養後、培養物を採取し、フローサイトメトリーによって、以下の含有量について評価した：ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞（ＣＤ４５ＲＡを共発現した総ＣＤ４^＋Ｔ細胞の％として発現した；図１４Ａ）、セントラルメモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞（ＣＤ６２ＬおよびＣＣＲ７の両方を共発現した総ＣＤ４^＋Ｔ細胞の％を発現した；図１４Ｂ）、ならびにトリプル陽性セントラルメモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞（ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、およびＣＤ１２７を共発現した総ＣＤ４^＋Ｔ細胞の％を発現した；図１４Ｃ）。

【0227】

図１４Ａに示すように、ハイブリッドＴ_ＲＥＧ－Ｔｈ２状態における工程２の再分化（１０ｎＭ濃度のペメトレキセドを伴う、または伴わない）は、養子Ｔ細胞療法の実験マウスモデルにおいて好ましい、ＣＤ４^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋ナイーブＴ細胞サブセットを高頻度でもたらした。

【0228】

加えて、図１４Ｃに示すように、ハイブリッドＴ_ＲＥＧ－Ｔｈ２状態における工程２の再分化（１０ｎＭ濃度のペメトレキセドを伴う、または伴わない）は、メモリーマーカーＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、およびＣＤ１２７のトリプル陽性共発現を有するＣＤ４^＋Ｔ細胞サブセットを高頻度でもたらした。このトリプル陽性メモリー表現型は、非常に原始的な分化状態を有するＴ細胞のマーカーである。

【0229】

図１４Ｃに示すように、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、およびＣＤ１２７についてトリプル陽性であったＣＤ４^＋Ｔ細胞の頻度は、純粋なＴ_ＲＥＧ分極条件と比較して、ハイブリッドＴ_ＲＥＧ－ＴＨ２分極条件においてより高かった。

【0230】

また、図１４Ｃに示すように、テムシロリムスおよびビタミンＤだけでなく、抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体も含むより厳しい工程１の分化条件の使用は、ハイブリッドＴ_ＲＥＧ－Ｔｈ２分極条件を使用して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、およびＣＤ１２７に対してトリプル陽性であったＣＤ４細胞を最も高い頻度でもたらした。

【0231】

図１５Ａ～図１５Ｂは、ハイブリッドＴｈ２／Ｔ_ＲＥＧ分極条件における脱分化Ｔ細胞の培養が、トリプル陽性ＴセントラルメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞の生成をもたらすことを例示する。ヒトＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を、図１３に記載のように、変動的な分極培養条件およびペメトレキセドの変動的な存在を含有する培地中で３日間の脱分化手順およびその後の培養に供した。Ｎ＝２４の培養条件の合計のうち、好ましい細胞収率を有する培養物のみをさらに評価し、ペメトレキセド（「＋」）を含有する全ての培養物が１０ｎＭの濃度であったことが示された。上記のＴ_ＲＥＧ条件は、（「ＴＲｅｇ、ＩＬ４なし」）と示されない限り、全てＩＬ－２、ＴＧＦ－β、およびＩＬ－４（「ＴＲｅｇ」）を含有した。合計１０日間の培養後、培養物を採取し、フローサイトメトリーによって、以下の含有量について評価した：セントラルメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞（ＣＤ６２ＬおよびＣＣＲ７の両方を共発現した総ＣＤ８^＋Ｔ細胞の％を発現した；図１５Ａ）、ならびにトリプル陽性セントラルメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞（ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、およびＣＤ１２７を共発現した総ＣＤ８^＋Ｔ細胞の％を発現した；図１５Ｂ）。

【0232】

また、図１５Ｂに示すように、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、およびＣＤ１２７についてトリプル陽性であったＣＤ８細胞の頻度は、純粋なＴ_ＲＥＧ分極条件と比較して、ハイブリッドＴ_ＲＥＧ－ＴＨ２分極条件においてより高かった。さらに、図１５Ａ～１５Ｂに示すように、テムシロリムスおよびビタミンＤだけでなく、抗ＩＬ－２受容体モノクローナル抗体も含むより厳しい工程１の分化条件の使用は、ハイブリッドＴ_ＲＥＧ－Ｔｈ２分極条件を使用して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、およびＣＤ１２７に対してトリプル陽性であったＣＤ８^＋Ｔ細胞を最も高い頻度でもたらした。

【0233】

要約すると、これらのデータは、ハイブリッドＴ_ＲＥＧ－Ｔｈ２サイトカイン分極（ＩＬ－２、ＴＧＦ－β、およびＩＬ－４）を使用し、ならびに工程１の脱分化後にペメトレキセド（１０ｎＭ）を使用したＴ細胞再分化が、好ましく限定的な分化状態のＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞をもたらすことを示す。

【0234】

実施例１４：ハイブリッドＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２分極条件における脱分化Ｔ細胞の培養は、原始的なＴｈ２細胞サイトカイン表現型を有するＴ細胞をもたらす
工程１の脱分化後の工程２の培養条件で再分化したＴ細胞をサイトカイン分泌パターンについても評価した。サイトカイン分泌は、Ｔ細胞エフェクター機能の指標であり、したがって、Ｔ_ＲＥＧ細胞が、特にＩＬ－１７、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αなどの主要な炎症性サイトカインに関して低下したサイトカイン分泌の可能性を有することが一般的に望ましい。提案されたハイブリッドＴ_ＲＥＧ－Ｔｈ２細胞集団の場合、かかる細胞はまた、Ｔｈ２サイトカインのいくつかの分類を分泌することが予想される。

【0235】

図１６Ａ～図１６Ｃは、高レベルのＩＬ－２およびＩＬ－４分泌ならびに低レベルのＩＬ－５ 分泌に示されるように、ハイブリッドＴｈ２／ＴＲｅｇ分極条件における脱分化Ｔ細胞の培養が、原子的Ｔｈ２細胞サイトカイン表現型を伴うＴ細胞の産生をもたらすことを示す。ヒトＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を、図１３に記載のように、変動的な分極培養条件およびペメトレキセドの変動的な存在を含有する培地中で３日間の脱分化手順およびその後の培養に供した。Ｎ＝２４の培養条件の合計のうち、好ましい細胞収率を有する培養物のみをさらに評価し、ペメトレキセド（「＋」）を含有する全ての培養物が１０ｎＭの濃度であったことが示された。上記のＴ_ＲＥＧ条件は、（「ＴＲｅｇ、ＩＬ４なし」）と示されない限り、全てＩＬ－２、ＴＧＦ－β、およびＩＬ－４（「ＴＲｅｇ」）を含有した。合計１０日の培養後、Ｔ細胞を採取し、洗浄し、３／２８ビーズ（３：１比）で２４時間再刺激し、得られた上清を採取し、Ｌｕｍｉｎｅｘマルチ分析物法によってサイトカイン含有量について試験した。示される全ての結果は、１×１０^６細胞／ｍｌ／２４時間当たり、ｐｇ／ｍｌ単位でサイトカインレベルとして発現される。

【0236】

図１６Ａに示すように、培養にペメトレキセドを添加したか否かにかかわらず、ハイブリッドＴ_ＲＥＧ－ＴＨ２サイトカイン分極条件（ＩＬ－２、ＴＧＦ－β、およびＩＬ－４）で再分化したＴ細胞は、ＩＬ－２分泌について最も高い値を有した。この結果は、Ｔ細胞におけるＩＬ－２分泌が、ハイブリッド培養条件において再分化されたＴ細胞が有する、早期分化状態におけるＴ細胞の特徴であるという事前の理解と一致した。

【0237】

図１７Ａ～図１７Ｃは、低レベルのＩＬ－１０、ＩＬ－１３、およびＩＬ－１７分泌に示されるように、ハイブリッドＴｈ２／Ｔ_ＲＥＧ分極条件における脱分化Ｔ細胞の培養が、原子的Ｔｈ２細胞サイトカイン表現型を伴うＴ細胞の産生をもたらすことを示す。ヒトＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を、図１３に記載のように、変動的な分極培養条件およびペメトレキセドの変動的な存在を含有する培地中で３日間の脱分化手順およびその後の培養に供した。Ｎ＝２４の培養条件の合計のうち、好ましい細胞収率を有する培養物のみをさらに評価し、ペメトレキセド（「＋」）を含有する全ての培養物が１０ｎＭの濃度であったことが示された。上記のＴ_ＲＥＧ条件は、（「ＴＲｅｇ、ＩＬ４なし」）と示されない限り、全てＩＬ－２、ＴＧＦ－β、およびＩＬ－４（「ＴＲｅｇ」）を含有した。合計１０日の培養後、Ｔ細胞を採取し、洗浄し、３／２８ビーズ（３：１比）で２４時間再刺激し、得られた上清を採取し、Ｌｕｍｉｎｅｘマルチ分析物法によってサイトカイン含有量について試験した。示される全ての結果は、１×１０^６細胞／ｍｌ／２４時間当たり、ｐｇ／ｍｌ単位でサイトカインレベルとして発現される。

【0238】

図１８Ａ～図１８Ｃは、低レベルのＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、およびＧＭ－ＣＳＦ分泌に示されるように、ハイブリッドＴｈ２／Ｔ_ＲＥＧ分極条件における脱分化Ｔ細胞の培養が、原子的Ｔｈ２細胞サイトカイン表現型を伴うＴ細胞の産生をもたらすことを示す。
ヒトＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を、図１３に記載のように、変動的な分極培養条件およびペメトレキセドの変動的な存在を含有する培地中で３日間の脱分化手順およびその後の培養に供した。Ｎ＝２４の培養条件の合計のうち、好ましい細胞収率を有する培養物のみをさらに評価し、ペメトレキセド（「＋」）を含有する全ての培養物が１０ｎＭの濃度であったことが示された。上記のＴ_ＲＥＧ条件は、（「ＴＲｅｇ、ＩＬ４なし」）と示されない限り、全てＩＬ－２、ＴＧＦ－β、およびＩＬ－４（「ＴＲｅｇ」）を含有した。合計１０日の培養後、Ｔ細胞を採取し、洗浄し、３／２８ビーズ（３：１比）で２４時間再刺激し、得られた上清を採取し、Ｌｕｍｉｎｅｘマルチ分析物法によってサイトカイン含有量について試験した。示される全ての結果は、１×１０^６細胞／ｍｌ／２４時間当たり、ｐｇ／ｍｌ単位でサイトカインレベルとして発現される。

【0239】

さらに、図１６Ｂに示すように、培養にペメトレキセドを添加したか否かにかかわらず、ハイブリッドＴ_ＲＥＧ－ＴＨ２条件（ＩＬ－２、ＴＧＦ－β、およびＩＬ－４）で再分化したＴ細胞は、ＩＬ－４分泌について最も高い値を有した。ＩＬ－４は、Ｔｈ２分極を指示する主要サイトカインであるため、ハイブリッド条件で製造されたＴ細胞は、実際にＴｈ２分極される。一方、それらの限定的な分化状態と一致して、ハイブリッド状態で再分化された細胞は、高レベルのエフェクターＴｈ２サイトカイン（ＩＬ－５、図１６Ｃを参照；ＩＬ－１０、図１７Ａを参照；ＩＬ－１３、図１７Ｂを参照）またはエフェクターＴｈ１／Ｔｈ１７サイトカイン（ＩＦＮ－γ、図１８Ａを参照；ＴＮＦ－α、図１８Ｂを参照；ＧＭ－ＣＳＦ、図１８Ｃを参照；ＩＬ－１７、図１７Ｃを参照）を分泌しなかった。

【0240】

重要なことに、Ｔ細胞再分化プロセスにおけるＩＬ－４包含の欠如は、より高いレベルの炎症性サイトカインＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、およびＧＭ－ＣＳＦをもたらした（図１８Ａ～１８Ｃを参照）。

【0241】

要約すると、これらのデータは、工程１の脱分化細胞からのＴ_ＲＥＧ表現型へ向かうＴ細胞の再分化は、この条件から出るＴ細胞が炎症性疾患に関連するサイトカインの分泌能力を大幅に低下させるため、ハイブリッドＴ_ＲＥＧ－Ｔｈ２分極条件を最適に利用しているはずであることを示す。

【0242】

実施例１５：ハイブリッドＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２条件における脱分化Ｔ細胞の培養は、強化されたハイブリッドＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２転写因子プロファイルを有するＴ細胞をもたらす
Ｔ細胞サイトカイン表現型は、主要な転写因子によって決定される。転写因子とＴ細胞サブセットとの関連は次の通りである：ＦＯＸＰ３がＴ_ＲＥＧ細胞発達を指示し、ＴＢＥＴがＴｈ１型細胞発達を指示し、ＧＡＴＡ３がＴｈ２型発達を指示する。

【0243】

本発明者らの製造方法でこれらの転写因子を評価するために、Ｔ細胞を最初に工程１の脱分化手順に供し、その後、ハイブリッドＴ_ＲＥＧ－ＴＨ２培養条件（ＩＬ－２、ＴＧＦ－β、およびＩＬ－４）で再分化させた。加えて、本発明者らは、ペメトレキセドの効果を古典的なｍＴＯＲ阻害剤と比較した。本発明者らの実験では、ｍＴＯＲ阻害剤（ラパマイシン；Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ（登録商標））の経口製剤を使用する代わりに、薬物の水溶性の親形態であるテムシロリムス（Ｔｏｒａｃｅｌ（登録商標））を利用した。

【0244】

ｉＴ_ＲＥＧ表現型は不安定であると見なされ、したがって、本発明者らは、培養の２０日目および３２日目を含む遅延した時点で、ハイブリッドＴ_ＲＥＧ－Ｔｈ２培養条件を使用して再分化されたＴ細胞の安定性を評価した。加えて、表現型安定性を厳密に試験するために、培養の２４日目から３２日目の間に、Ｔ細胞は高レベルの共刺激（３：１のビーズ対Ｔ細胞の比）を受け、サイトカインまたは薬理剤を含まない培地中で増殖させた。

【0245】

図１９Ａ～図１９Ｄは、ペメトレキセドを含有するハイブリッドＴｈ２／Ｔ_ＲＥＧ分極条件における脱分化Ｔ細胞の拡張された培養が、ＦＯＸＰ３およびＧＡＴＡ３転写因子を発現するＣＤ４^＋Ｔ細胞の生成をもたらすことを例示する。ヒトＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を、３日間の脱分化手順に供し、その後、共刺激（３：１のビーズ対Ｔ細胞の比）し、薬理阻害剤テムシロリムス（１．０μＭ）またはペメトレキセド（１０ｎＭ）を伴うか、または伴わずに、ハイブリッドＴｈ２／Ｔ_ＲＥＧ分極条件（ＩＬ－２；ＴＧＦ－β；ＩＬ－４）を含有する培地中で増殖させた。培養物を、培養の１４日目および２４日目の両方で、３／２８ビーズで再刺激した。培養の２４日目に、転写因子発現の安定性を評価するために、培養培地は、外因性サイトカインまたは薬理阻害剤を含有しなかった。培養の１２日目、２０日目、および３２日目に、Ｔ細胞を採取し、以下の転写因子、ＦＯＸＰ３、Ｔｂｅｔ、およびＧＡＴＡ３について表面フローサイトメトリー（ＣＤ４マーカー）および細胞内染色を行った。上のデータは、培養集団全体のうちのＣＤ４細胞のパーセント（図１９Ａ）、Ｔ_ＲＥＧ転写因子ＦＯＸＰ３を発現したＣＤ４細胞のパーセント（図１９Ｂ）、Ｔｈ１転写因子Ｔｂｅｔを発現したＣＤ４細胞のパーセント（図１９Ｃ）、およびＴｈ２転写因子ＧＡＴＡ３を発現したＣＤ４細胞のパーセント（図１９Ｄ）を示す。

【0246】

図１９Ａ～１９Ｄの詳細として、Ｔ_ＲＥＧ－Ｔｈ２条件で再分化されたＴ細胞は、培養物中で経時的にＣＤ４細胞優勢に向かって徐々に移行した（図１９Ａ）。図１９Ｂに示すように、ＣＤ４細胞は、培養物中のテムシロリムスまたはペメトレキセドの存在に関わらず、培養の１２日目から３２日目まで、ＦＯＸＰ３を高頻度かつ安定的に発現した。

【0247】

図１９Ｃとして、薬理学的阻害剤の存在なしでも、Ｔｈ１転写因子ＴＢＥＴによる非常に低い頻度の汚染があった。しかしながら、最も一貫して低減したＴＢＥＴ値が、ペメトレキセドも含むハイブリッド分極条件において観察された。最後に、図１９Ｄに示すように、ペメトレキセドを補充したハイブリッドＴ_ＲＥＧ－ＴＨ２条件で製造されたＴ細胞において、培養終了Ｔｈ２関連ＧＡＴＡ３発現が最も高いことが観察された。

【0248】

図２０Ａ～図２０Ｄは、ペメトレキセドを含有するハイブリッドＴｈ２／Ｔ_ＲＥＧ分極条件における脱分化Ｔ細胞の拡張された培養が、ＦＯＸＰ３およびＧＡＴＡ３転写因子を発現するＣＤ８^＋Ｔ細胞の生成をもたらすことを例示する。ヒトＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を、３日間の脱分化手順に供し、その後、共刺激（３：１のビーズ対Ｔ細胞の比）し、薬理阻害剤テムシロリムス（１．０μＭ）またはペメトレキセド（１０ｎＭ）を伴うか、または伴わずに、ハイブリッドＴｈ２／Ｔ_ＲＥＧ分極条件（ＩＬ－２；ＴＧＦ－β；ＩＬ－４）を含有する培地中で増殖させた。培養物を、培養の１４日目および２４日目の両方で、３／２８ビーズで再刺激した。培養の２４日目に、転写因子発現の安定性を評価するために、培養培地は、外因性サイトカインまたは薬理阻害剤を含有しなかった。培養の１２日目、２０日目、および３２日目に、Ｔ細胞を採取し、以下の転写因子、ＦＯＸＰ３、Ｔｂｅｔ、およびＧＡＴＡ３について表面フローサイトメトリー（ＣＤ８マーカー）および細胞内染色を行った。上のデータは、培養集団全体のうちのＣＤ８細胞のパーセント（図２０Ａ）、Ｔ_ＲＥＧ転写因子ＦＯＸＰ３を発現したＣＤ８細胞のパーセント（図２０Ｂ）、Ｔｈ１転写因子Ｔｂｅｔを発現したＣＤ８細胞のパーセント（図２０Ｃ）、およびＴｈ２転写因子ＧＡＴＡ３を発現したＣＤ８細胞のパーセント（図２０Ｄ）を示す。

【0249】

図２０Ａに示すように、ＣＤ８細胞含有量は、培養物中で経時的に徐々にかつ控えめに減少した。Ｔ_ＲＥＧ細胞機能は概してＣＤ４細胞サブセットに起因するが、ＣＤ８^＋Ｔ_ＲＥＧ細胞もまた十分に記載されており、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞サブセットの両方を含有するＴ_ＲＥＧ集団の使用が、抗原特異性の多様化のために有利であり得ることに留意されたい。したがって、本発明者らが説明する方法は、ＣＤ４－およびＣＤ８－方Ｔ_ＲＥＧの両方を生成するため、部分的に有利である可能性がある。

【0250】

図２０Ｂが示すように（右上パネル）、この方法を使用して製造されたＣＤ８^＋Ｔ細胞は、実際に、培養中で経時的に安定し、薬理阻害剤の存在とは独立して安定したＦＯＸＰ３発現のために濃縮された。

【0251】

図２０Ｃが示すように（左下パネル）、Ｔ_ＲＥＧ－Ｔｈ２分極条件における再分化は、一般的に、低レベルのＴｈ１転写因子ＴＢＥＴのＣＤ８^＋Ｔ細胞発現をもたらしたが、最も低いレベルは、ペメトレキセドの存在下で一貫して観察された。

【0252】

最後に、図２０Ｄが示すように（右下のパネル）、Ｔ_ＲＥＧ－ＴＨ２条件における再分化は、ＧＡＴＡ３転写因子の発現の増加によって示されるように、実際には、Ｔｈ２型分化にもシフトしたＣＤ８^＋Ｔ細胞をもたらした。

【0253】

図４０Ａ～４０Ｂはまた、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋サブセットの両方における再分化ＴＲＥＧ－Ｔｈ２細胞についてのＧＡＴＡ３およびＦＯＸＰ３のフローサイトメトリーを示す。

【0254】

要約すると、これらの転写因子分析は、ハイブリッドＴ_ＲＥＧ－Ｔｈ２培養条件＋ペメトレキセド添加における再分化は、それがＴＢＥＴの発現を限定しながら、ＦＯＸＰ３およびＧＡＴＡ３の両方を発現するＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の両方を保存することができるため、最適であり得ることを示している。

【0255】

実施例１６：ハイブリッドＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２条件における脱分化Ｔ細胞の培養は、Ｔｈ２サイトカイン分泌プロファイルを増強したＴ細胞をもたらす
転写因子測定に加えて、本発明者らは、サイトカイン分泌能について、ハイブリッドＴ_ＲＥＧ－Ｔｈ２分極条件において再分化したＴ細胞も評価した。図２１Ａ～２１Ｄに示すように、Ｔ_ＲＥＧ－Ｔｈ２分極条件で増殖した全ての再分化培養物は、ＩＬ－４分泌が可能なＴ細胞をもたらし、それによって、薬理阻害剤の不在下であってもＴｈ２極性を達成するためのこの方法の固有の能力を実証する。

【0256】

図２１Ａ～２１Ｄは、ハイブリッドＴｈ２／Ｔ_ＲＥＧ極性条件における脱分化Ｔ細胞の拡張された培養が、優勢なＴｈ２サイトカイン表現型：ＩＬ－４、ＩＬ－５、およびＩＬ－１３分泌を伴って発現するＴ細胞の生成をもたらすことを例示する。ヒトＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を、３日間の脱分化手順に供し、その後、共刺激（３：１のビーズ対Ｔ細胞の比）し、薬理阻害剤テムシロリムス（１．０μＭ）またはペメトレキセド（１０ｎＭ）を伴うか、または伴わずに、ハイブリッドＴｈ２／Ｔ_ＲＥＧ分極条件（ＩＬ－２；ＴＧＦ－β；ＩＬ－４）を含有する培地中で増殖させた。培養物を、培養の１４日目および２４日目の両方で、３／２８ビーズで再刺激した。培養の２４日目に、転写因子発現の安定性を評価するために、培養培地は、外因性サイトカインまたは薬理阻害剤を含有しなかった。培養の１２日目、２０日目、および３２日目に、Ｔ細胞を採取し、洗浄し、３／２８ビーズ（３：１比）で２４時間再刺激し、得られた上清を採取し、Ｌｕｍｉｎｅｘマルチ分析物法によってサイトカイン含有量について試験した。示される全ての結果は、１×１０^６細胞／ｍｌ／２４時間当たり、ｐｇ／ｍｌ単位でサイトカインレベルとして発現される。Ｔｈ２サイトカインＩＬ－１０も評価した：全ての値は、１×１０^６細胞／ｍＬ／２４時間当たり２０ｐｇ／ｍｌ未満であった。

【0257】

注目すべきことに、テムシロリムスは、エフェクターＴｈ２サイトカインＩＬ－５（図２１Ｂ）およびＩＬ－１３（図２１Ｃ）を分泌するＴ_ＲＥＧ－Ｔｈ２条件におけるＴ細胞の再分化能力を鈍化させたが、ペメトレキセドの使用は、ＩＬ－５およびＩＬ－１３を分泌するＴ細胞の能力を完全に保持した。したがって、これらのデータは、ペメトレキセドがＴ_ＲＥＧ－Ｔｈ２ハイブリッドサブセットの製造とより互換性があるため、ペメトレキセドの使用が、ｍＴＯＲ阻害剤テムシロリムスなどの従来のＴ_ＲＥＧ促進剤の使用と比較して好ましいというさらなる証拠を提供する。

【0258】

さらに、Ｔ_ＲＥＧ－Ｔｈ２分極条件で再分化した全てのＴ細胞は、ＩＬ－２（図２２Ａ）、ＩＦＮ－γ（図２２Ｂ）、ＩＬ－１７（全て２０ｐｇ／ｍｌ未満の値）、およびＴＮＦ－α（全て２０ｐｇ／ｍｌ未満の値）の比較的低レベルの発現を有した。

【0259】

図２２Ａ～２２Ｄは、ハイブリッドＴｈ２／Ｔ_ＲＥＧ極性条件における脱分化Ｔ細胞の拡張された培養が、優勢なＴｈ２サイトカイン表現型：ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、およびＧＭ－ＣＳＦ分泌を伴って発現するＴ細胞の生成をもたらすことを例示する。ヒトＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を、３日間の脱分化手順に供し、その後、共刺激（３：１のビーズ対Ｔ細胞の比）し、薬理阻害剤テムシロリムス（１．０μＭ）またはペメトレキセド（１０ｎＭ）を伴うか、または伴わずに、ハイブリッドＴｈ２／Ｔ_ＲＥＧ分極条件（ＩＬ－２；ＴＧＦ－β；ＩＬ－４）を含有する培地中で増殖させた。培養物を、培養の１４日目および２４日目の両方で、３／２８ビーズで再刺激した。培養の２４日目に、転写因子発現の安定性を評価するために、培養培地は、外因性サイトカインまたは薬理阻害剤を含有しなかった。培養の１２日目、２０日目、および３２日目に、Ｔ細胞を採取し、洗浄し、３／２８ビーズ（３：１比）で２４時間再刺激し、得られた上清を採取し、Ｌｕｍｉｎｅｘマルチ分析物法によってサイトカイン含有量について試験した。示される全ての結果は、１×１０^６細胞／ｍｌ／２４時間当たり、ｐｇ／ｍｌ単位でサイトカインレベルとして発現される。炎症性サイトカインＩＬ－１７およびＴＮＦ－αも評価した：全ての値は、１×１０^６細胞／ｍＬ／２４時間当たり２０ｐｇ／ｍＬ未満であった。

【0260】

注目すべきことに、ＧＭ－ＣＳＦ分泌は、ペメトレキセドをさらに補充したＴ_ＲＥＧ－ＴＨ２ハイブリッド培養条件において再分化されたＴ細胞においてより高い程度で観察された（１０ｎＭ、図２２Ｃ）。文献における実験研究から推論すると、Ｔ_ＲＥＧ－Ｔｈ２ハイブリッド集団内の増強されたＧＭ－ＣＳＦの能力が必ずしも有害または有益のいずれかであるかどうかは明らかではない。

【0261】

要約すると、これらのデータは、Ｔ_ＲＥＧ－Ｔｈ２分極状態におけるＴ細胞の再分化が、炎症性疾患に関連するＴｈ１型およびＴｈ１７型サイトカインの分泌能力が低いＴ細胞をもたらすために、好ましいことを示す。ペメトレキセドをハイブリッドＴ_ＲＥＧ－Ｔｈ２分極条件に含めることは、Ｔｈ２サイトカイン産生能力の増加をもたらすために有利であり、これは、Ｔｈ１型およびＴｈ１７型サブセットに向かう分化可塑性に対する防御をさらに提供するであろう。

【0262】

実施例１７：入力Ｔ細胞ＴＣＲレパートリーを有益に改変させるための、アフェレーシスによるリンパ球収集前の選択抗ＴＮＦ－α試薬の使用
図２３Ａおよび２３Ｂは、ＴＮＦ－α阻害剤エタネルセプトでの治療後の、Ｔ細胞ＴＣＲ特異性の広範な上方制御および下方制御を検出するためのＲＮＡに基づくＴ細胞受容体配列決定の使用を示す。図２３では、ＲＮＡは、エタネルセプト療法による治療前および治療後のＡＬＳ患者から末梢血単核細胞から単離された。Ｒｏｓａｔｉ Ｅ、Ｄｏｗｄｓ ＣＭ、Ｌｉａｓｋｏｕ Ｅ、Ｈｅｎｒｉｋｓｅｎ ＥＫＫ、Ｋａｒｌｓｅｎ ＴＨ、Ｆｒａｎｋｅ Ａ．Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１７；１７（１）：６１によって以前記載されているように、ＲＮＡをＴＣＲレパートリープロファイリングに供した。図２３Ａにおいて、約２５％のＴＣＲ特異性が治療後試料中で上方制御されていたことが実証される（赤色で示されるように）；著しく対照的に、約２５％のＴＣＲ特異性が治療後試料中で下方制御されていた（青色で示されるように）。右上図（Ｂ）に示されるように、いくつかのＴ細胞クローンが、エタネルセプト前の０．０１の頻度（アッセイの検出限界付近）から、２４７～４８６の範囲の治療後の値に増加したため、エタネルセプト療法は、顕著なＴ細胞クローン拡張をもたらし、それによって４－ｌｏｇを超えるＴ細胞拡張と一致した。右下の図２３Ｂに示されるように、いくつかのＴ細胞クローンが、エタネルセプト前の２５９～５９８の頻度（アッセイの検出限界付近）から、０．０１の治療後の値に減少したため、エタネルセプト療法は、顕著なＴ細胞クローン収縮をもたらし、それによって４－ｌｏｇを超えるＴ細胞収縮と一致した。

【0263】

図２３Ａ～Ｂは、ＴＮＦＲ１発現Ｔｈ１型細胞を促進するＴＮＦ－αの血清無細胞形態を優先的に阻害するエタネルセプトによる抗ＴＮＦ－α療法が、Ｔ細胞受容体の上方制御および下方制御における広範な変化と関連していることを示す。これらの観察結果は、対象を、エタネルセプト、またはＴＮＦ－αの血清無細胞形態を優先的に阻害する任意の他の抗ＴＮＦ－α治療薬（モノクローナル抗体、アダリムマブなど）で前処理することを利用して、Ｔ細胞受容体レパートリーを抗原特異性に基づいて、Ｔｈ１型表現型のＴ細胞から離れる方向にシフトさせ、それによって抗原特異性に基づいてＴＲＥＧ表現型のＴ細胞を濃縮することができることを示す。

【0264】

実施例１８：ＣＤ２５、ＣＤ２７、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、およびＣＴＬＡ４の発現のために富化された細胞産物としてのＴＲＥＧ－Ｔｈ２ハイブリッド集団の特徴付け。
図２４は、製造されたｉＴＲＥＧ／Ｔｈ２ハイブリッド集団が、対照Ｔｈ１／Ｔｃ１培養物と比較して、ＣＤ２５、ＣＤ２７、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、およびＣＴＬＡ４の発現の増加を有することを示す。図２４において、ｉＴＲＥＧ／Ｔｈ２ハイブリッド集団を、Ｔ細胞分化の初期相、続いて、ＩＬ－２、ＴＧＦ－β、およびＩＬ－４を含有する培地における再分化を使用して、以前詳述された方法によって生成した。ＩＴＲＥＧ／Ｔｈ２製造の１１日目に、細胞を採取し、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞発現の関連する分子、すなわちＣＤ２５、ＣＤ２７、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、およびＣＴＬＡ４の評価のためにフローサイトメトリーに供し、Ｔｈ１／Ｔｃ１分極を評価する３つの別個の対照条件と比較した。

【0265】

図２４は、記載の条件に従って製造されたハイブリッドＴＲＥＧ－Ｔｈ２細胞が、対照Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞と比較して、フローサイトメトリーによる以下の細胞表面分子：ＣＤ２５、ＣＤ２７、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、およびＣＴＬＡ４の発現の増加を有することを示す。

【0266】

図２４が例示するように、ｉＴＲＥＧ／Ｔｈ２ハイブリッド細胞産物は、対照Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞と比較して少なくとも１０％、より好ましくは５０％高いレベルのＣＤ２５、ＣＤ２７、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、およびＣＴＬＡ４を発現するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を有する。

【0267】

ＩＬ－２受容体であるＣＤ２５は、自己免疫、特にＣＤ８＋Ｔ細胞駆動応答を管理するＴＲＥＧ細胞の能力にとって重要である。したがって、ｉＴＲＥＧ／Ｔｈ２製造細胞産物上でのＣＤ２５の発現は、望ましい特徴である。

【0268】

ＴＲＥＧ細胞上の発現が増加した共刺激分子であるＣＤ２７は、ＴＲＥＧの阻害機能に寄与することが示されている。したがって、ｉＴＲＥＧ／Ｔｈ２製造細胞産物上でのＣＤ２７の発現は、望ましい特徴である。

【0269】

２Ｂ４（ＣＤ２４４）は、最近、糖分解および細胞分裂の減衰によってＣＤ８＋Ｔ細胞応答を阻害することが示される。したがって、ｉＴＲＥＧ／Ｔｈ２製造細胞産物上での２Ｂ４の発現は、望ましい特徴である。

【0270】

ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）は共阻害受容体であり、ＢＴＬＡとヘルペスウイルス進入媒介体ＨＶＥＭとのライゲーションは、ＴＲＥＧ細胞誘導およびエフェクター免疫応答の阻害を促進する。したがって、ｉＴＲＥＧ／Ｔｈ２製造細胞産物上のＢＴＬＡの発現は、望ましい特徴である。

【0271】

ＣＴＬＡ４は、最近マラリア感染への免疫を制限する能力によって証明されるように、ＴＲＥＧ細胞の重要なエフェクター分子である。したがって、ｉＴＲＥＧ／Ｔｈ２製造細胞産物上でのＣＴＬＡ４の発現は、望ましい特徴である。

【0272】

実施例１９：ＴＧＩＴ、ＴＩＭ ３、ＩＣＯＳ、ＬＡＩＲ１、およびＯＸ４０の発現のために富化された細胞産物としてのＴＲＥＧ－Ｔｈ２ハイブリッド集団の特徴付け。
図２５は、製造されたｉＴＲＥＧ／Ｔｈ２ハイブリッド集団が、対照Ｔｈ１／Ｔｃ１培養物と比較して、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＩＣＯＳ、ＬＡＩＲ１、およびＯＸ４０の発現の増加を有することを示す。図２５において、ｉＴＲＥＧ／Ｔｈ２ハイブリッド集団を、Ｔ細胞分化の初期相、続いて、ＩＬ－２、ＴＧＦ－β、およびＩＬ－４を含有する培地における再分化を使用して、以前詳述された方法によって生成した。ＩＴＲＥＧ／Ｔｈ２製造の１１日目に、細胞を採取し、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞発現の関連する分子、すなわちＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＩＣＯＳ、ＬＡＩＲ１、およびＯＸ４０の評価のためにフローサイトメトリーに供し、Ｔｈ１／Ｔｃ１分極を評価する３つの別個の対照条件と比較した。図２５は、記載の条件に従って製造されたハイブリッドＴＲＥＧ－Ｔｈ２細胞が、対照Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞と比較して、フローサイトメトリーによる以下の細胞表面分子：ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＩＣＯＳ、ＬＡＩＲ１、およびＯＸ４０の分子の増加したレベルを発現するＴ細胞の生成をもたらすことを示す。

【0273】

図２５が例示するように、ｉＴＲＥＧ／Ｔｈ２ハイブリッド細胞産物は、対照Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞と比較して少なくとも１０％、より好ましくは５０％高いレベルのＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＩＣＯＳ、ＬＡＩＲ１、およびＯＸ４０を発現するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を有する。

【0274】

ＴＩＧＩＴは、制御性Ｔ細胞機能と関連する細胞表面共阻害受容体分子である。したがって、ｉＴＲＥＧ／Ｔｈ２製造細胞産物上のＴＩＧＩＴの発現は、望ましい特徴である。

【0275】

ＴＩＭ３は、ＴＲＥＧ細胞の阻害効果を媒介する共阻害受容体である。したがって、ｉＴＲＥＧ／Ｔｈ２製造細胞産物上でのＴＩＭ３の発現は、望ましい特徴である。

【0276】

ＩＣＯＳは、中枢神経系における免疫反応性の制御のための制御性Ｔ細胞による免疫抑制を維持するのに役立つと最近決定された共刺激分子である。したがって、ｉＴＲＥＧ／Ｔｈ２製造細胞産物上のＩＣＯＳの発現は、望ましい特徴である。

【0277】

ＬＡＩＲ１（ＣＤ３０５）は、活性化されたエフェクターメモリーＴ細胞の抑制を含む、複数の工程で炎症を遮断することができる多面的阻害分子である。したがって、ｉＴＲＥＧ／Ｔｈ２製造細胞産物上でのＬＡＩＲ１の発現は、望ましい特徴である。

【0278】

ＯＸ４０は、共刺激分子である。したがって、ｉＴＲＥＧ／Ｔｈ２製造細胞産物上でのＯＸ４０の発現は、望ましい特徴である。

【0279】

実施例２０：ＴＲＥＧ／Ｔｈ２ハイブリッド集団のＧＡＴＡ３およびＦＯＸＰ３発現の特徴付け
定常状態のアフェレーシス試料を得、Ｆｉｃｏｌｌ勾配によってリンパ球について濃縮し、次いでＧ－Ｒｅｘ培養容器に播種し、ビタミンＤ（０．３ｎＭ）、テムシロリムス（３．０μＭ）およびバシリキシマブ（３０μｇ／ｍＬ）を含有する完全培地中でインキュベートした。初期の脱分化期間後、Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁性ビーズを用いて、３：１のビーズ対Ｔ細胞の比で共刺激し、サイトカイン（ＩＬ－４（１０００ＩＵ／ｍＬ）、ＩＬ－２（１０，０００ＩＵ／ｍＬ）およびＴＧＦ－β（１００ｎｇ／ｍＬ））を添加した。６日間の培養後、Ｔ細胞を採取し、表面マーカー（ＣＤ４およびＣＤ８）ならびに細胞内分子発現（ＧＡＴＡ３およびＦＯＸＰ３）について染色し、フローサイトメトリーによって評価した。図２６Ａ～Ｂの結果は、フローサイトメトリーによって測定されるように、培養開始時および培養後（Ｔｈ２／ＴＲＥＧ）のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞についてのＦＯＸＰ３およびＧＡＴＡ３発現を示す。提供されるパーセンテージは、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋および細胞内マーカーに対して陽性と見なされる細胞の量を示す（ボックスで示される）。

【0280】

図２６Ａ～Ｂに示される結果は、製造されたＴｈ２／ＴＲＥＧ細胞産物の表現型を示す結果を示す。ＩＩ型サイトカイン表現型のＴ細胞は、それらの転写因子ＧＡＴＡ３の発現によって部分的に特徴付けられ得るが、制御性Ｔ細胞集団は、それらのＦｏｘＰ３転写因子の発現によって部分的に特定され得る。培養開始時に、非常に低い頻度のＴ細胞がＧＡＴＡ３またはＦｏｘＰ３のいずれかを発現した。かなり対照的に、Ｔｈ２／ＴＲＥＧ培養条件で製造されたＴ細胞産物は、ＧＡＴＡ３に対して単一陽性、ＦＯＸＰ３に対して単一陽性、またはＧＡＴＡ３およびＦＯＸＰ３の両方に対して二重陽性（図示せず）のいずれかであった高頻度のＴ細胞を発現した。重要なことに、示されるように、この転写因子プロファイルは、製造されたＣＤ４＋（上部パネル）およびＣＤ８＋（下部パネル）Ｔ細胞の両方で発現した。ＩＬ－４を含まない対照製造培養物は、ＧＡＴＡ３陽性Ｔ細胞の頻度を大幅に低下させ、それによって、Ｔｈ２／ＴＲＥＧハイブリッド集団（図示せず）の製造におけるＩＬ－４の重要な役割を実証した。

【0281】

本開示に詳述されるＴＲＥＧ／Ｔｈ２方法に従って製造されたＴ細胞産物の表現型特徴付けの大部分は、培養の終了時に確認することができる。しかしながら、Ｔ細胞産物は冷凍保存され得ること、したがって、解凍後の状態におけるＴ細胞の表現型特徴付けが、対象に養子移入される実際の産物を反映することに留意することが重要である。解凍後の状態のＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞は、対照Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞と比較して以下によって特徴付けることができる：（ａ）フローサイトメトリーによるＣＤ２５、ＣＤ２７、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＩＣＯＳ、ＬＡＩＲ１、およびＯＸ４０の発現の増加；（ｂ）Ｌｕｍｉｎｅｘサイトカイン分泌分析によるＩＦＮ－ｇおよびＴＮＦ－ａの低減ならびにＩＬ－４の分泌の増加；ならびに（ｃ）Ｔ細胞運命転写因子の発現の変化、すなわち、ＴＢＥＴの低減ならびにＦＯＸＰ３およびＧＡＴＡ３の増加。

【0282】

実施例２１：ＴＲＥＧ／Ｔｈ２ハイブリッド集団のＣＤ７３およびＣＤ１０３発現の特徴付け
定常状態のアフェレーシス試料を得、Ｆｉｃｏｌｌ勾配によってリンパ球について濃縮し、次いでＧ－Ｒｅｘ培養容器に播種し、ビタミンＤ（０．３ｎＭ）、テムシロリムス（３．０μＭ）およびバシリキシマブ（３０μｇ／ｍＬ）を含有する完全培地中でインキュベートした。初期の脱分化期間後、Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁性ビーズを用いて、３：１のビーズ対Ｔ細胞の比で共刺激し、サイトカイン（ＩＬ－４（１０００ＩＵ／ｍＬ）、ＩＬ－２（１０，０００ＩＵ／ｍＬ）およびＴＧＦ－β（１００ｎｇ／ｍＬ））を添加した。６日間の培養後、Ｔ細胞を採取し、表面マーカー（ＣＤ４およびＣＤ８）、ならびにエクトヌクレオチダーゼ分子ＣＤ７３、またはインテグリン分子ＣＤ１０３について染色し、フローサイトメトリーによって評価した。図２７Ａ～Ｂの結果は、フローサイトメトリーによって測定されるように、培養開始時および培養後（Ｔｈ２／ＴＲＥＧ）のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞についてのＣＤ７３およびＣＤ１０３発現を示す。提供されるパーセンテージは、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋、およびエクトヌクレオチダーゼ分子またはインテグリン分子それぞれに対して陽性と見なされる細胞の量を示す（ボックスで示される）。

【0283】

制御性Ｔ細胞集団は、免疫抑制性アデノシン基質に対して炎症促進性ＡＴＰを加水分解するように作用するＣＤ３９およびＣＤ７３エクトヌクレオチダーゼ分子の発現を含む、いくつかの定義された機構によって病原性エフェクターＴ細胞集団を抑制することができる。実際、ＣＤ３９を発現するＴＲＥＧ細胞は、増加した抑制機能を有し、炎症性腸疾患の解消と関連付けられている。さらに、ヒトＴＲＥＧ細胞の抑制機能は、ＣＤ７３によって部分的に媒介される。図２７Ａに以下に示すように、Ｔｈ２／ＴＲＥＧ培養条件で製造されたＴ細胞は、ＴＲＥＧ関連エフェクター分子ＣＤ７３の発現の増加を有することができ、ＣＤ３９はまた、ＴＲＥＧ／Ｔｈ２製造Ｔ細胞（図示せず）上で高度に発現された。ＣＤ３９／ＣＤ７３エクトヌクレオチダーゼに加えて、ＴＲＥＧ細胞機能は、上皮リンパ球局在を指示するインテグリンであるＣＤ１０３の発現とも相関している。実際、ＣＤ１０３およびＩＬ－２受容体シグナル伝達は、腸粘膜における免疫耐性を維持するために協力し、さらに、ＣＤ１０３発現ＴＲＥＧ細胞は、実験的慢性ＧＶＨＤの改善に重要である。図２７Ｂに以下に示すように、Ｔｈ２／ＴＲＥＧ培養条件で製造されたＴ細胞は、ＴＲＥＧ関連エフェクター分子ＣＤ１０３の発現の増加を有し得る。

【0284】

実施例２２：ＴＲＥＧ／Ｔｈ２ハイブリッド集団のＣＤ１５０およびＣＤ２７／ＣＤ９５発現の特徴付け
定常状態のアフェレーシス試料を、Ｆｉｃｏｌｌ勾配によってリンパ球について濃縮し、Ｇ－Ｒｅｘ培養容器に播種し、ビタミンＤ（０．３ｎＭ）、テムシロリムス（３．０μＭ）およびバシリキシマブ（３０μｇ／ｍＬ）を含有する完全培地中でインキュベートした。この初期の脱分化期間後、Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁性ビーズを用いて、３：１のビーズ対Ｔ細胞の比で共刺激し、サイトカイン（ＩＬ－４（１０００ＩＵ／ｍＬ）、ＩＬ－２（１０，０００ＩＵ／ｍＬ）およびＴＧＦ－β（１００ｎｇ／ｍＬ））を添加した。６日間の培養後、Ｔ細胞を採取し、表面マーカーについて染色し、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１５０、ＣＤ２７、ＣＤ９５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、およびＣＣＲ７について多色フローサイトメトリー分析に供した。結果を図２８Ａ～Ｂに示す。

【0285】

ＴＲＥＧ（ＲＡＰＡ－５０１）条件で培養したＴ細胞を、培養入力Ｔ細胞（「０日目」）と比較し、ｍＴＯＲ阻害剤なしで増殖した対照培養Ｔ細胞（「対照」）とも比較した。図２８Ａに示すように、ＲＡＰＡ－５０１細胞産物内に含まれるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの両方は、培養入力Ｔ細胞と比較して、また対照培養Ｔ細胞と比較して、幹細胞マーカーＣＤ１５０の発現を大幅に増加させた。図２８Ｂに示すように、ＲＡＰＡ－５０１細胞産物は、培養入力細胞と比較して、Ｔ幹細胞メモリー（ＴＳＣＭ）表現型についても濃縮された。この条件で得られたＴ細胞がエフェクターメモリーＣＤ４５ＲＯ＋であったため、対照培養はこの集団を欠いた（図示せず）。左パネル（培養入力Ｔ細胞）および右パネル（ＲＡＰＡ－５０１細胞）は、ＴＳＣＭマーカーＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、およびＣＣＲ７上でゲートした後のＴＳＣＭマーカーＣＤ９５およびＣＤ２７の発現を示し、これらのＴＳＣＭマーカーの発現において同様の差がＣＤ８＋Ｔ細胞について観察された（図示せず）。

【0286】

実験モデルにおいて、養子Ｔ細胞療法の有効性は、Ｔ細胞集団の移植の成功およびインビボ持続性に依存する。重要なことに、Ｔ細胞分化状態は、インビボ持続性を指示するのに役立ち、より少ない分化細胞は持続性を増加させる。本発明者らの初期研究では、Ｔセントラルメモリー（ＴＣＭ）表現型を発現したマウスラパマイシン耐性Ｔ細胞は、対照Ｔ細胞と比較してインビボ生着可能性が増加した。さらに、ヒトラパマイシン耐性Ｔ細胞は、異種移植片対宿主疾患のヒト間マウスモデルにおける生着も増加した。他の研究者は、Ｔエフェクターメモリー（ＴＥＭ）集団と比較して分化が低下したＴ細胞が、ＴＣＭサブセット、ナイーブＴ細胞サブセット、および最近ではＴ幹細胞メモリー（ＴＳＣＭ）サブセットを含む、インビボ持続性を増加させ、増加したインビボ効果を媒介することを決定した。Ｔ細胞分化状態とインビボＴ細胞機能との間のこの関係は、ＴＲＥＧ細胞に対して、以下のように動作可能である。（１）ＴＣＭ表現型のＴＲＥＧ細胞は、ＴＥＭ表現型のＴＲＥＧ細胞と比較して実験的ＧＶＨＤを低減する際により効果的であった；および（２）幹細胞マーカーＣＤ１５０を発現したＴＲＥＧ細胞は、幹細胞移植片拒絶の防止に非常に効果的であった。図２８Ａに以下に示すように、Ｔｈ２／ＴＲＥＧ培養条件で製造されたＴ細胞を、ＣＤ１５０マーカーの発現を含むＴ幹細胞サブセットと一致する減少した分化状態で細胞について濃縮した。

【0287】

実施例２３：ＴＲＥＧ／Ｔｈ２ハイブリッド集団のサイトカイン分泌の特徴付け
定常状態のアフェレーシス試料を、Ｆｉｃｏｌｌ勾配によってリンパ球について濃縮し、Ｇ－Ｒｅｘ培養容器に播種し、ビタミンＤ（０．３ｎＭ）、テムシロリムス（３．０μＭ）およびバシリキシマブ（３０μｇ／ｍＬ）を含有する完全培地中でインキュベートした。初期の脱分化期間後、Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁性ビーズを用いて、３：１のビーズ対Ｔ細胞の比で共刺激し、サイトカイン（ＩＬ－４（１０００ＩＵ／ｍＬ）、ＩＬ－２（１０，０００ＩＵ／ｍＬ）およびＴＧＦ－β（１００ｎｇ／ｍＬ））を添加した。この培養は、条件「Ａ」と称される。条件「Ｂ」は、同じ培養条件であったが、ＩＬ－４添加はなかった。条件「Ｃ」は、ラパマイシン（１μＭ）、ＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍＬ）、およびＴＧＦ－β（１０ｎｇ／ｍＬ）の標準ＴＲＥＧ培養条件を反映する。条件「Ｄ」は、ｍＴＯＲ阻害剤を含まないＩＦＮ－αの存在下で製造されたＴｈ１型対照培養物を反映する。培養後、Ｔ細胞を採取し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで刺激し、得られた上清をＬｕｍｉｎｅｘアッセイによってサイトカイン含有量について試験した。

【0288】

製造されたＴｈ２／ＴＲＥＧ細胞のサイトカイン分泌を評価することが重要であり得る。まず、細胞産物が、その後のＴｈ２分化のためのドライバーサイトカインであるＩＬ－４を分泌することができることが重要である。第２に、養子移植されたＴ細胞集団がＩＬ－２を分泌することが可能であることが望ましく、というのも、この能力は、外因性ＩＬ－２を必要とせずにＴ細胞がより容易にインビボで増殖することを可能にする前駆体機能を示すためである。最後に、Ｔｈ２／ＴＲＥＧ細胞集団がＴｈ１型またはＴｈ１７型サイトカインＩＦＮ－α、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１７、およびＧＭ－ＣＳＦの分泌を減少させることが重要である。図２９が示すように、製造されたＴｈ２／ＴＲＥＧ細胞産物は、Ｔｈ１型またはＴｈ１７型サイトカインの分泌を最小限に抑えながらＩＬ－４およびＩＬ－２を分泌した。

【0289】

実施例２４：ＴＲＥＧ／Ｔｈ２ハイブリッド集団によるＴｈ１／Ｔｃ１抑制の特徴付け
定常状態のアフェレーシス試料を、Ｆｉｃｏｌｌ勾配によってリンパ球について濃縮し、Ｇ－Ｒｅｘ培養容器に播種し、ビタミンＤ（０．３ｎＭ）、テムシロリムス（３．０μＭ）およびバシリキシマブ（３０μｇ／ｍＬ）を含有する完全培地中でインキュベートした。初期の脱分化期間後、Ｔｈ２／ＴＲＥＧ細胞のエクスビボ製造のために、Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁性ビーズを用いて、３：１のビーズ対Ｔ細胞の比で共刺激し、サイトカイン（ＩＬ－４（１０００ＩＵ／ｍＬ）、ＩＬ－２（１０，０００ＩＵ／ｍＬ）およびＴＧＦ－β（１００ｎｇ／ｍＬ））を添加した。並行して、Ｔ細胞をＩ型分極サイトカインＩＦＮ－αの存在下で培養して、エフェクターＴｈ１／Ｔｃ１細胞を生成した。Ｔｈ１／Ｔｃ１培養物をＲＡＰＡ－５０１細胞培養物と同じドナー（自家、「ＡＵＴＯ」）または無関係ドナー（同種異系、「ＡＬＬＯ」）から生成した。エクスビボ培養後、Ｔｈ１／Ｔｃ１エフェクターＴ細胞をトランスウェルプレートの底部チャンバーに播種し、３：１のビーズ対Ｔ細胞の比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズで共刺激した。Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞共刺激の２４時間後、ＲＡＰＡ－５０１細胞を１：１のＴｈ１／Ｔｃ１対ＲＡＰＡ５０１の比でトランスウェルプレートの上部チャンバーに添加した。（Ａ）サイトカイン含有量のＲＡＰＡ－５０１調節。２４時間（ＲＡＰＡ－５０１細胞を上部チャンバーに添加する前）および４８時間の培養（ＲＡＰＡ－５０１細胞の添加あり、またはなしのいずれか）で、培養上清を回収し、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイによってサイトカイン含有量について試験した。ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＴＮＦ－α含有量について、ｐｇ／ｍｌ／２４時間／１×１０６細胞／ｍｌ単位で結果が表される。（Ｂ）ＰＤ１のＴｈ１／Ｔｃ１細胞発現のＲＡＰＡ－５０１細胞調節は、抗原非依存的に行われる。４８時間で、２４時間時点でＲＡＰＡ－５０１細胞を添加した後、または添加なしのいずれかの後に、自家または同種異系のＴｈ１／Ｔｃ１細胞を採取し、その後、Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞をＰＤ１発現の評価のためのフローサイトメトリーに供した。

【0290】

ＲＡＰＡ－５０１細胞産物の開発中に、本発明者らは、観察されたＴ細胞抑制の分子機構を特徴付ける実験を行った。潜在的な機序を評価するための１つの方法は、トランスウェルアッセイであり、それによって、エフェクターＴ細胞およびＲＡＰＡ－５０１細胞は、細胞間の接触を防止するが、サイトカインなどの小さな可溶性媒介体による細胞通信を可能にするフィルターによって分離される。図３０Ａ～Ｂは、ＲＡＰＡ－５０１細胞が接触に依存しない様式でエフェクターＴ細胞を調節することを示す（トランスウェル容器で実施される実験）。ＲＡＰＡ－５０１細胞は、Ｔ細胞受容体に依存しない方法で作用して、エフェクターＴ細胞のサイトカイン分泌能力を抑制した。すなわち、ＲＡＰＡ－５０１細胞を含有するトランスウェルチャンバーに共刺激ビーズを添加しなかったため、ＲＡＰＡ－５０１細胞は、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＴＮＦ－αを含む炎症性サイトカインレベルを調節するために共刺激を必要としなかった（図３０Ａ）。ＴＲＥＧ細胞がＩＬ－２を消費する能力は、一般に説明される現象であるが、以前の研究では、ＩＬ－２を消費するための細胞間接触の要件が特定された。したがって、ＲＡＰＡ－５０１細胞は、接触に依存しない様式で複数の炎症性サイトカインのレベルをある程度独自的に調節することができるように見える。これらの結果は、ＲＡＰＡ－５０１細胞がサイトカインの中和のための好適な候補となることを示唆する。第２に、本発明者らは、ＲＡＰＡ－５０１細胞が、接触に依存しない様式で（トランスウェル実験の使用）でエフェクターＴ細胞生物学の追加の態様、すなわち、エフェクターＴ細胞上でプログラムされた死－１（ＰＤ－１）チェックポイント分子発現の促進を調節したことを見出した。重要なことに、図３０Ｂに示すように、ＲＡＰＡ－５０１細胞は、自家および同種異系Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞の両方でＰＤ１発現を上方制御し、それによって、ＲＡＰＡ－５０１細胞抑制機能の１つの機序が可溶性媒介体によってＴＣＲ非依存的に発生することをさらに明らかにする。

【0291】

実施例２５：ＴＲＥＧ／Ｔｈ２ハイブリッド集団によるＣＮＳマイクログリア細胞サイトカイン分泌抑制の特徴付け
ヒトミクログリア細胞（ＨＭＣ３細胞株）を最初にＩＦＮ－γ（１０ｎｇ／ｍｌ；２４時間）で活性化し、次にＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ；３時間）で活性化し、次いで、処理したＨＭＣ３細胞を、上記のように作製したＲＡＰＡ－５０１細胞を上部チャンバーに添加することなく（左パネル）、または添加して（右パネル）、トランスウェルの下部チャンバーに播種した（ＲＡＰＡ－５０１対ＨＭＣ３の比、１：４０）。ＲＡＰＡ－５０１細胞を、特許出願に記載されている方法を使用して生成し、ハイブリッドＴｈ２／ＴＲＥＧ表現型のＴ細胞を生成した。２４時間後、無細胞上清を採取し、ＬｕｍｉｎｅｘアッセイによってＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、およびＩＰ－１０の含有量について評価した（ｐｇ／ｍｌ／１×１０６細胞／ｍｌ／２４時間で測定したサイトカイン分泌）。結果を図３１に示す。

【0292】

ミクログリア細胞は、ＡＬＳにおける炎症促進因子に発達することができるＣＮＳ常駐抗原提示細胞である。製造されたヒトＴｈ２／ＴＲＥＧ細胞がヒトミクログリア細胞炎症を抑制する能力は、以前、我々が知るところではなかった。これに対処するために、本発明者らは、ヒトミクログリア細胞株ＨＭＣ ３を、ＩＦＮ－γ中で順次培養し、続いてＬＰＳエンドトキシンによって、炎症促進状態に誘導した。図３１Ａ～３１Ｂが示すように、ＲＡＰＡ－５０１ Ｔｈ２／ＴＲＥＧ細胞産物を炎症促進性ミクログリア細胞に添加することは、炎症促進性サイトカインＩＬ－６、ＩＰ－１０、およびＩＦＮ－γの培養上清含量を低下させた。この実験では、観察された免疫抑制効果は、トランスウェル容器内で、１対４０の非常に希釈されたＴＲＥＧ対炎症性ミクログリア細胞の比で発生し、それによって、ＲＡＰＡ－５０１細胞が（トランスウェル設計によって示されるように）接触に依存しない様式で、かつ高い効力（１：４０のＴＲＥＧ対ミクログリア細胞の比によって示されるように）ＣＮＳ炎症を低減することができることを示した。

【0293】

実施例２６：ペントスタチン、シクロホスファミド、およびラミブジン宿主調節プラットフォームを使用するＡＬＳのｉＴ_ＲＥＧ細胞療法。
図３２は、ＰＣレジメンおよび全体的な治療アプローチの詳細である。ＰＣレジメンは、示されるように、サイクル１～４にわたってペントスタチンまたはシクロホスファミドの用量を漸増させながら、２週間のサイクルで投与される（ＰＣレジメンの合計期間は８週間）。ペントスタチンは、１４日間のサイクルの１日目、または１日目および４日目のいずれかに投与され、シクロホスファミド（Ｃｙ）は、１４日間のサイクルの１、２、および３日目、または１、２、３、４、および５日目のいずれかに投与される。サイクル４について、ＡＬＣが１マイクロリットル当たり１２５０細胞未満である場合、Ｃｙ用量は１日当たり２００ｍｇに増加する。ＰＣレジメンの投与によって免疫枯渇および免疫抑制が実現された後、最初のｉＴ_ＲＥＧ細胞注入は、治療の８週目に行われる。インフラマソーム阻害剤ラミブジンを、プロトコル８週目から２６週目まで１５０ｍｇ ＢＩＤの用量で連続投与する。

【0294】

図３３は、ｉＴ_ＲＥＧ細胞の製造に関するさらなる詳細を提供し、ＰＣレジメン前およびＰＣレジメン後のアフェレーシスレジメンによるリンパ球の収集を示す。ＡＬＳ患者からのリンパ球は、ＰＣレジメンの直前または直後に行われる定常アフェレーシス（１０～１５リットルの収集）によって収集される。ＰＣレジメン前の収集は、Ｔ細胞がより多く見出され、免疫抑制されないため、ｉＴ_ＲＥＧ製造により有利であり得る。比較すると、ＰＣレジメン後の収集は、ｉＴ_ＲＥＧ培養物を汚染する炎症性Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞が製造前にインビボで枯渇するため、有利であり得る。ＩＴ_ＲＥＧ製造後、製品は、注入＃２、＃３、および＃４によって示されるように、ｉＴ_ＲＥＧ細胞の反復投与を可能にするために、治療用量で凍結保存される。

【0295】

図３４は、複数のｉＴ_ＲＥＧ細胞注入の戦略をさらに詳細に説明し、ｉＴ_ＲＥＧ細胞の反復用量のそれぞれの前のＰＣレジメンの並びを示す。ＰＣレジメンを、各ｉＴ_ＲＥＧ注入の前に以下に投与する：（１）疾患の発症に寄与する炎症性Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞を枯渇させ、抑制すること、および（２）養子移入されたｉＴ_ＲＥＧ集団のインビボ拡大を可能にするＩＬ－７およびＩＬ－１５などの恒常性サイトカインのインビボレベルを増加させること。ＰＣレジメンは、１日目および４日目に２ｍｇ／ｍ^２の用量のペントスタチンと、１～５日目に１日１００ｍｇの一定用量のシクロホスファミドとを組み合わせたものからなる。２日間の休憩後、ｉＴ_ＲＥＧ細胞を投与する（レジメンの８日目）。インフラマソーム阻害剤ラミブジンは、ｉＴ_ＲＥＧ細胞療法中に炎症駆動を制限するために、８週目以降継続的に投与される。

【0296】

図３５は、ｉＴ_ＲＥＧ細胞で治療された患者のモニタリングに関するさらなる詳細を提供し、示されるように、ＡＬＳのモニタリングが、患者報告ＡＬＳＦＲＳ－Ｒおよび臨床医報告Ａｐｐｅｌスコアの両方によっておよそ毎月行われることを示す。ＡＬＳ患者の炎症状態を監視するための免疫ラボは、示されるように、およそ毎月評価される。

【0297】

実施例２７：入力Ｔ細胞ＴＣＲレパートリーを有益に改変させるための、アフェレーシスによるリンパ球収集前の選択抗ＴＮＦ－α試薬の使用
図３６Ａ～３６Ｂは、ＴＮＦＲ１発現Ｔｈ１型細胞を促進するＴＮＦ－αの血清無細胞形態を優先的に阻害するエタネルセプトによる抗ＴＮＦ－α療法が、Ｔ細胞受容体の上方制御および下方制御における広範な変化と関連していることを示す。図３６～３６Ｂは、ＴＮＦ－α阻害剤、エタネルセプトによる治療後のＴ細胞ＴＣＲ特異性の広範な上下制御を検出するためのＲＮＡに基づくＴ細胞受容体配列決定の使用を示す。図３６～３６Ｂでは、ＲＮＡは、エタネルセプト療法による治療前および治療後のＡＬＳ患者から末梢血単核細胞から単離された。Ｒｏｓａｔｉ Ｅ、Ｄｏｗｄｓ ＣＭ、Ｌｉａｓｋｏｕ Ｅ、Ｈｅｎｒｉｋｓｅｎ ＥＫＫ、Ｋａｒｌｓｅｎ ＴＨ、Ｆｒａｎｋｅ Ａ．Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１７；１７（１）：６１によって以前記載されているように、ＲＮＡをＴＣＲレパートリープロファイリングに供した。図３６Ａで示されるように、約２５％のＴＣＲ特異性が治療後試料中で上方制御されていたことが実証される（赤色で示されるように）；著しく対照的に、約２５％のＴＣＲ特異性が治療後試料中で下方制御されていた（青色で示されるように）。図３６Ｂに示されるように、いくつかのＴ細胞クローンが、エタネルセプト前の０．０１の頻度（アッセイの検出限界付近）から、２４７～４８６の範囲の治療後の値に増加したため、エタネルセプト療法は、顕著なＴ細胞クローン拡張をもたらし、それによって４－ｌｏｇを超えるＴ細胞拡張と一致した。図３６Ｂに示されるように、エタネルセプト療法は、いくつかのＴ細胞クローンが、２５９～５９８の前エタネルセプトの頻度から０．０１の治療後の値に減少し、それによって、４－ｌｏｇを超えるＴ細胞クローン収縮と一致するため、顕著なＴ細胞クローン収縮をもたらした。これらの観察は、対象を、エタネルセプトまたはＴＮＦ－αの血清非細胞形態（モノクローナル抗体、アダリムマブなど）を優先的に阻害する任意の他の抗ＴＮＦ－α治療薬で予め治療することを利用して、抗原特異的にＴｈ１型表現型のＴ細胞から離れるようにＴ細胞受容体レパートリーをシフトさせることができ、それによって、Ｔ_ＲＥＧ型表現型のＴ細胞を豊富にすることを示す。

【0298】

実施例２８：ＣＤ２５、ＣＤ２７、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、およびＣＴＬＡ４の発現のために富化された細胞産物としてのＴ_ＲＥＧ－Ｔｈ２ハイブリッド集団の特徴付け。
図３７は、記載の条件に従って製造されたハイブリッドＴ_ＲＥＧ－Ｔｈ２細胞が、対照Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞と比較して、フローサイトメトリーによる以下の細胞表面分子：ＣＤ２５、ＣＤ２７、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、およびＣＴＬＡ４の発現の増加を有することを示す。図３７において、ＩＬ－２、ＴＧＦ－β、およびＩＬ－４を含有するハイブリッドＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２培地において、Ｔ細胞分化の初期相、続いて再分化を使用して、以前詳述された方法によって、ｉＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２ハイブリッド集団を生成した。細胞を回収し、関連する分子、すなわち、ＣＤ２５、ＣＤ２７、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、およびＣＴＬＡ４のＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞発現の評価のためのフローサイトメトリーに供し、Ｔｈ１／Ｔｃ１分極を評価する３つの別個の対照条件と比較した。

【0299】

図３７が例示するように、ｉＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２ハイブリッド細胞産物は、対照Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞と比較して少なくとも１０％、より好ましくは５０％高いレベルのＣＤ２５、ＣＤ２７、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、およびＣＴＬＡ４を発現するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を有する。

【0300】

ＩＬ－２受容体であるＣＤ２５は、自己免疫、特にＣＤ８＋Ｔ細胞駆動応答を管理するＴ_ＲＥＧ細胞の能力にとって重要である。したがって、ｉＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２製造細胞産物上でのＣＤ２５の発現は、望ましい特徴である。

【0301】

Ｔ_ＲＥＧ細胞上の発現が増加した共刺激分子であるＣＤ２７は、Ｔ_ＲＥＧの阻害機能に寄与することが示されている。したがって、ｉＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２製造細胞産物上でのＣＤ２７の発現は、望ましい特徴である。

【0302】

２Ｂ４（ＣＤ２４４）は、最近、糖分解および細胞分裂の減衰によってＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を阻害することが示される。したがって、ｉＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２製造細胞産物上での２Ｂ４の発現は、望ましい特徴である。

【0303】

ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）は共阻害受容体であり、ＢＴＬＡとヘルペスウイルス進入媒介体ＨＶＥＭとのライゲーションは、Ｔ_ＲＥＧ細胞誘導およびエフェクター免疫応答の阻害を促進する。したがって、ｉＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２製造細胞産物上でのＢＴＬＡの発現は、望ましい特徴である。

【0304】

ＣＴＬＡ４は、最近マラリア感染への免疫を制限する能力によって証明されるように、Ｔ_ＲＥＧ細胞の重要なエフェクター分子である。したがって、ｉＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２製造細胞産物上でのＣＴＬＡ４の発現は、望ましい特徴である。

【0305】

実施例２９：ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＩＣＯＳ、ＬＡＩＲ１、およびＯＸ４０の発現のために富化された細胞産物としてのＴ_ＲＥＧ－Ｔｈ２ハイブリッド集団の特徴付け。
図３８は、記載の条件に従って製造されたハイブリッドＴ_ＲＥＧ－Ｔｈ２細胞が、対照Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞と比較して、フローサイトメトリーによる以下の細胞表面分子：ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＩＣＯＳ、ＬＡＩＲ１、およびＯＸ４０の分子の増加したレベルを発現するＴ細胞の生成をもたらすことを示す。図３８において、ｉＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２ハイブリッド集団を、Ｔ細胞分化の初期相、続いて、ＩＬ－２、ＴＧＦ－β、およびＩＬ－４を含有する培地における再分化を使用して、以前詳述された方法によって生成した。ｉＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２製造の１１日目に、細胞を採取し、ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞発現の関連する分子、すなわちＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＩＣＯＳ、ＬＡＩＲ１、およびＯＸ４０の評価のためにフローサイトメトリーに供し、Ｔｈ１／Ｔｃ１分極を評価する３つの別個の対照条件と比較した。

【0306】

図３８が例示するように、ｉＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２ハイブリッド細胞産物は、対照Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞と比較して少なくとも１０％、より好ましくは５０％高いレベルのＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＩＣＯＳ、ＬＡＩＲ１、およびＯＸ４０を発現するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を有する。

【0307】

ＴＩＧＩＴは、例えば、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫における免疫抑制環境への寄与を含む、制御性Ｔ細胞機能と関連する細胞表面共阻害性受容体分子である。したがって、ｉＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２製造細胞産物上でのＴＩＧＩＴの発現は、望ましい特徴である。

【0308】

ＴＩＭ３は、例えば、頭頸部扁平上皮細胞癌に浸潤するＴ細胞の抑制を含む、Ｔ_ＲＥＧ細胞の阻害効果を媒介する共阻害受容体である。したがって、ｉＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２製造細胞産物上でのＴＩＭ３の発現は、望ましい特徴である。

【0309】

ＩＣＯＳは、中枢神経系における免疫反応性の制御のための制御性Ｔ細胞による免疫抑制を維持するのに役立つと最近決定された共刺激分子である。したがって、ｉＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２製造細胞産物上でのＩＣＯＳの発現は、望ましい特徴である。

【0310】

ＬＡＩＲ１（ＣＤ３０５）は、活性化されたエフェクターメモリーＴ細胞の抑制を含む、複数の工程で炎症を遮断することができる多面的阻害分子である。したがって、ｉＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２製造細胞産物上でのＬＡＩＲ１の発現は、望ましい特徴である。

【0311】

ＯＸ４０は共刺激分子である。したがって、ｉＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２製造細胞産物上でのＯＸ４０の発現は、望ましい特徴である。

【0312】

本開示に詳述される Ｔ_ＲＥＧ／Ｔｈ２方法に従って製造されたＴ細胞産物の表現型特徴付けの大部分は、培養の終了時に確認することができる。しかしながら、Ｔ細胞産物は冷凍保存され得ること、したがって、解凍後の状態におけるＴ細胞の表現型特徴付けが、対象に養子移入される実際の産物を反映することに留意することが重要である。解凍後の状態のＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２細胞は、対照Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞と比較して以下によって特徴付けることができる。（ａ）フローサイトメトリーによるＣＤ２５、ＣＤ２７、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＩＣＯＳ、ＬＡＩＲ１、およびＯＸ４０の発現の増加；（ｂ）Ｌｕｍｉｎｅｘサイトカイン分泌分析によるＩＦＮ－ｇおよびＴＮＦ－ａの低減ならびにＩＬ－４の分泌の増加；ならびに（ｃ）Ｔ細胞運命転写因子の発現の変化、すなわち、ＴＢＥＴの低減ならびにＦＯＸＰ３およびＧＡＴＡ３の増加。

【0313】

ｉＴ_ＲＥＧ産生のためのアフェレーシス。
ペントスタチン／シクロホスファミドレジメンによる治療の前に、対象はリンパ球アフェレーシス手順を受ける。この末梢リンパ球収集の目的は、養子Ｔ細胞療法のためのｉＴ_ＲＥＧ細胞を製造することである。

【0314】

アフェレーシスは、ＣＳ－３０００または同等の機械上の１０～１５リットルの収集で構成される。アフェレーシス産物は、プロトコルスポンサー、Ｒａｐａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓに送付され、ｉＴ_ＲＥＧ細胞は、特殊培養条件を使用してエクスビボ培養によって製造される。

【0315】

研究目的
第１の目的ＡＬＳ患者の炎症性サブセットにおけるＰＣレジメンおよび維持ラミブジン療法との関連での、ｉＴ_ＲＥＧ細胞注入の安全性を決定する。

【0316】

第２の目的ＩＴ_ＲＥＧ療法がＡＬＳ患者の炎症マーカーを阻害する能力を決定する。予備的な方法で、患者報告および臨床医報告のＡＬＳスコアに対するｉＴ_ＲＥＧ療法の効果を決定する。

【0317】

参加資格の基準
Ｗｏｒｌｄ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ Ｅｌ Ｅｓｃｏｒｉａｌ Ｃｒｉｔｅｒｉａ（世界神経学会、エル・エスコリアル診断基準）に従って、臨床検査室支援により孤発性または家族性ＡＬＳの疑いがある、可能性がある、または発症が確定されたとして診断された、孤発性または家族性ＡＬＳを有する対象。年齢、１８歳以上７５歳以下カルノフスキー・パフォーマンス・ステータスが７０％以上であること。ＭＵＧＡまたは２Ｄ心エコー図による駆出分画率が医療機関の正常限界内であること。血清クレアチニンが２．０ｍｇ／ｄｌ以下である。ＡＳＴおよびＡＬＴは、正常値の上限の３倍以下である。ビリルビンが１．５以下（ギルバート病に起因する場合を除く）。肺機能検査で５０％以上の補正ＤＬＣＯである。

【0318】

二次試験エンドポイントを評価するために、対象は、スクリーニング間隔中に少なくとも２つの別個の血液試料を評価した後、末梢血液細胞集団における炎症マーカーの証拠を有さなければならない。潜在的な患者の炎症状態を評価するために使用されるアッセイには、フローサイトメトリー、サイトカイン分泌解析、およびウェスタンブロット解析による細胞シグナル伝達事象が含まれる。他の試験は、運動ニューロンタンパク質またはＡＬＳ関連タンパク質凝集体などの潜在的な自己抗原に対するＴ細胞受容体レパートリーの試験またはインビトロ感作を含み得る。サイトカイン分泌は、刺激なしで（自律型サイトカイン分泌）、および抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８共刺激；ＬＰＳエンドトキシン曝露；ＣＤ４０リガンド曝露；アデノシンＡ２_ＡおよびＡ３受容体アゴニズムおよびアンタゴニズム；Ｔ細胞（ＰＤ１、ＴＩＭ－３）および単球（ＣＤ４７、ＣＤ２００）チェックポイント阻害；ならびにＲＮＡ配列決定によるＴ細胞受容体クローン性の評価を含むが、これらに限定されない様々なモダリティの刺激を用いて評価される。潜在的な対象が試験に含めるのに十分な炎症を有すると見なされるかどうかの決定は、これらの試験の全てのマトリックス分析に基づいて行われ、その決定は、免疫アッセイが実施されるＲａｐａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌａｂの医療ディレクターと協議して試験ＰＩまたはリードアソシエイト研究者によって行われる。

【0319】

除外基準には、リルゾール（Ｒｉｌｕｔｅｋ（登録商標））またはエダラボン（Ｒａｄｉｃａｖａ（登録商標））療法を積極的に服用している患者が含まれる（１ヶ月以上安定した用量で服用している場合を除く）。以下はまた、除外基準を表す：プロトコルの３０日以内に任意の治験介入を受けたこと、予測の６０％未満の肺バイタルキャパシティ測定、能動的非制御性感染、３つ以下の薬剤によって十分に制御されていない高血圧、登録後６ヶ月以内に脳血管事故の病歴、登録後６ヶ月以内に肺塞栓の病歴の記録、または臨床的に有意な心臓病理（登録前６ヶ月以内に心筋梗塞によって定義されるような、ＮＹＨＹに従ったクラスＩＩＩもしくはＩＶの心不全、制御不能な狭心症、重度の制御不能な心室不整脈、または急性虚血もしくは能動伝導系異常の心電図的証拠）。冠動脈バイパスグラフトまたは血管形成術の既往がある患者は、心臓学的評価を受け、症例ごとに検討される。ＨＩＶ、Ｂ型肝炎、またはＣ型肝炎について血清陽性の患者は除外される。妊娠していることがわかっている、または妊娠が判明した患者は除外され、避妊を実施したくない妊娠年齢の患者も除外される。患者は、ＰＩの裁量により、または参加を許可することが許容できない医学的または精神的リスクとなると見なされる場合は除外されることがある。

【0320】

ＰＣレジメンによるＡＬＳ 患者の治療
８週間のＰＣレジメンの目的は、ＡＬＳ疾患の発症に寄与するＴｈ１／Ｔｃ１細胞を部分的に枯渇させ、抑制することである。加えて、ＰＣレジメンの直後にｉＴ_ＲＥＧ細胞注入が続く８週目以降の時点で、ＰＣレジメンは、Ｔ細胞恒常性サイトカイン、特にＩＬ－７およびＩＬ－１５の増加の創出を急性にもたらすことも意図される。

【0321】

ＰＣレジメンは、１４日間のサイクルとして投与されるが、ロジスティック障害が発生した場合、または任意の有害事象を評価および／または治療するために追加の時間が必要な場合、サイクル間の最大２週間の追加の遅延が許容される場合がある。サイクル＃１について、ペントスタチン（１日目に１ｍｇ／ｍ^２ ｉ．ｖ．）は、シクロホスファミド（１、２、および３日目に１日１００ｍｇ ｐ．ｏ．）と組み合わせて投与される。用量制限毒性が発生していない限り投与されるサイクル＃２は、ペントスタチンの増加した用量（１日目に２ｍｇ／ｍ^２ ｉ．ｖ．）と、同じ用量のシクロホスファミド（１、２、および３日目に１日１００ｍｇ ｐ．ｏ．）との組み合わせからなる。用量制限毒性が発生しておらず、かつ絶対リンパ球数が１マイクロリットル当たり７５０細胞を超える限り投与されるサイクル＃３および＃４は、５日間のシクロホスファミド（１、２、３、４、および５日目に１日１００ｍｇ ｐ．ｏ．）と組み合わせた、２回用量のペントスタチン（１日目および４日目に２ｍｇ／ｍ^２ ｉ．ｖ．）からなる。

【0322】

ＡＬＣ数がサイクル＃３またはサイクル＃４の前に１マイクロリットル当たり７５０細胞以下である場合、それ以上のサイクルは投与されず、患者はラミブジンによる維持療法に進む。サイクル＃４の前に、絶対リンパ球数が１マイクロリットル当たり１２５０細胞を超える場合、シクロホスファミドの用量を倍増させる（１、２、３、４、および５日目に、１日に２００ｍｇのｐ．ｏ．）。

【0323】

ペントスタチン投与に関する具体的な内容：（ａ）調製：ペントスタチンは、バイアル取扱説明書に従って、２ｍｇ／ｍｌの濃度に、調剤部門によって再構成される。次に、適切な患者特異的用量を０．９％の塩化ナトリウムに添加して、合計体積５０ｍＬを構成する；（ｂ）用量および投与：ペントスタチンの投与量は、腎機能障害について調整される（以下を参照）；ペントスタチンの各用量は、３０～６０分にわたって静脈内投与される；（ｃ）前投薬および抗嘔吐療法：注入の前に、３０～６０分にわたって０．９％塩化ナトリウムの１リットルを注入する。ペントスタチンは、催吐性であり得る。抗嘔吐レジメンガイドラインは以下の通りである（ＰＩの裁量によりバリエーションは許容される）：（１）ペントスタチンの各用量の６０分前に静脈内注入によるデキサメタゾン１２ｍｇ；（２）加えて、嘔吐対照のために必要であれば、各サイクルの最初の５日間に経口デキサメタゾンを投与してもよい；（３）オンダンセトロンは、ペントスタチンの各用量の６０分前に静脈内注入による８ｍｇの用量で投与してもよい；（４）残りの治療のために、オンダンセトロンは、サイクル中に必要であれば１日目から１４日目の間、１２時間ごとに８ｍｇ（錠剤）の経口用量で投与してもよい；ならびに（５）アプレピタントは、制御されていない吐き気および嘔吐を有する患者において、必要に応じて、抗嘔吐レジメンに添加してもよい。

【0324】

ペントスタチン用量低減に関連する仕様：ペントスタチンおよびＣｒＣｌの各予定用量を計算する前に、血清クレアチニンレベルを得る。ＣｒＣｌは、２４時間尿によって得られるか、またはＣｏｃｋｃｒｏｆｔ－Ｇａｕｌｔ式によって計算される。対象がペントスタチンおよびシクロホスファミド療法中にクレアチニンレベルの上昇を経験する場合、その後の投与は、以下のように修正される：ＣｒＣｌ≧６０（ｍＬ／分／１．７３ｍ^２）について：意図されるペントスタチン用量の１００％を投与する（サイクル＃１、＃２についてはペントスタチン１ｍｇ／ｍ^２；サイクル＃３、＃４についてはペントスタチン２ｍｇ／ｍ^２）；３０≦ＣｒＣｌ＜６０について：意図されるペントスタチン用量の５０％を投与する（サイクル＃１、＃２についてはペントスタチン０．５ｍｇ／ｍ^２；サイクル＃３、＃４についてはペントスタチン１ｍｇ／ｍ^２）；ＣｒＣｌ＜３０について：ペントスタチンを保持する。

【0325】

ペントスタチンは、神経学的毒性（発作、昏睡）と関連することはほとんどないため、ＣＮＳ毒性の評価に特に注意が必要である。ＰＣレジメンが、グレード２以上の重篤度の任意の新しい神経学的毒性または既存の任意の神経学的毒性の悪化に関連する場合、施設ＰＩに連絡して、さらなるペントスタチン療法およびさらなるプロトコル療法が許可されるかどうかを話し合う必要がある。

【0326】

シクロホスファミド投与の具体的な態様：水和。シクロホスファミドは膀胱炎を引き起こす可能性があるため、患者は十分な水分補給を維持することが重要である。最低限、尿に透明な色を保つために、患者は少なくとも１日に２～４リットルの液体を飲む必要がある。また、睡眠前に膀胱を空にすることも特に重要である。経口シクロホスファミドは、１、２、および３日目（サイクル＃１および＃２の場合）、または１、２、３、４、および５日目（サイクル＃３および＃４の場合）に、１日１００ｍｇの固定用量で投与される。しかしながら、サイクル＃４の前に（１マイクロリットル当たり１２５０細胞を超えるＡＬＣによって定義されるように）ＡＬＣの実質的な低減を有さない患者に関して、サイクル＃４のシクロホスファミド用量は、１、２、３、４、および５日目にわたって、１日当たり２００ｍｇに増加する。患者が経口療法に耐えることができない場合、シクロホスファミドのＩＶ注入が許可される。ＩＶ用量は、意図される経口用量と同じである。ＩＶ注入の場合、シクロホスファミドは、バイアル取扱説明書に従って、ＨＵＭＣ調剤部門によって、２０ｍｇ／ｍｌの濃度に再構成される。次に、適切な用量（１００ｍｇまたは２００ｍｇ）をＤ５Ｗまたは０．９％の塩化ナトリウム１００ｍｌ中で希釈し、３０分間にわたって静脈内に注入する。

【0327】

ＰＣサイクルが好中球の絶対数の大幅な減少をもたらすことは予想されない。ただし、次のサイクルの直前の決定時にＡＮＣが特定の値を下回る場合、シクロホスファミドの用量は以下のように調整される：（１）１マイクロリットル当たり１０００個以上の細胞のＡＮＣ値については、意図される用量の１００％が投与される；（２）１マイクロリットル当たり５００～９９９細胞のＡＮＣ値については、意図される用量の５０％が投与される；および（３）ＡＮＣ値が１マイクロリットル当たり５００細胞である場合、シクロホスファミドは投与されない。加えて、１マイクロリットル当たり５００細胞未満のＡＮＣ値について、Ｇ－ＣＳＦ療法を開始する決定は、ＰＩによって検討され得る。

【0328】

８週間のＰＣレジメンの定量的目標は、ＡＬＣ値を１マイクロリットル当たり約７５０細胞に低減することである。疾患の病因に寄与するＴ細胞のこの程度の枯渇および抑制は、神経炎症プロセスを制御するためにｉＴ_ＲＥＧ細胞の移植および生物学的活性を成功させることを可能にすると、本発明者らは仮説を立てる。しかしながら、潜在的には、宿主Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞におけるより厳しい低減が、ｉＴ_ＲＥＧ細胞がそれらの完全な抑制機能を発揮することを可能にするために必要とされ得る。そのような場合、ＰＣレジメンは、ｉＴ_ＲＥＧ細胞療法の前に、１マイクロリットル当たり５００、２５０、または０のＡＬＣなどのより低いＡＬＣ値を標的にするために強化または延長され得る。他方では、潜在的には、ｉＴ_ＲＥＧ細胞療法が非常に有効であり、１マイクロリットル当たり７５０細胞のＡＬＣ値さえもあまりにも厳しいと見なされ得る。そのような場合、ＰＣレジメンは、１マイクロリットル当たり１０００、１２５０、または１５００細胞などのより高いＡＬＣ値を標的にするために、非集中化または持続時間の短縮が可能である。

【0329】

ラミブジン維持療法に関する実施
ＰＣレジメンが完了したら、患者はラミブジンによる維持療法に進み、これはプロトコルの６ヶ月目の試験終了日まで続く。ラミブジン（経口錠剤）を１５０ｍｇ ｐ．ｏ ＢＩＤの用量で投与する。推定クレアチニンクリアランスが５０ｍｌ／分未満に減少した場合、ラムビジンを１日１回の１５０ｍｇ ｐ．ｏの用量に減少させ、ラミブジンを３０ｍｌ／分未満の推定クレアチニンクリアランス値のために中止する。

【0330】

先に述べたように、ラミブジンの述べられた目的は、ＡＬＳ病原体における近位事象を表すＮＬＲＰ３インフラマソームを下方制御することである。したがって、本発明者らは、他のインフラマソーム阻害剤が当社のプロトコルプラットフォームでの使用に好適であるか、またはおそらく好ましいであろうことを想定している。例えば、潜在的に改善されたリスク：利益比を有するインフラマソーム阻害剤が開発されている。

【0331】

ラミブジンは、それらの作用機序は実際には補完的であるため、ｉＴ_ＲＥＧ細胞療法に対して拮抗するとは予測されないことに留意することが重要である。この補完的な対照は、ラパマイシン（多種多様なＴ細胞応答を阻害することができる）およびＩＬ－２（インビボでのＴ_ＲＥＧ増殖を促進する点で狭い治療ウィンドウを有し、炎症性Ｔ細胞集団を促進することができる）などのＴ_ＲＥＧ細胞療法のために提案される他の介入とは対照的である。

【0332】

支持療法
好中球減少症の場合、患者に全身性抗生物質予防薬を投与する必要はない。抗生物質を開始する決定は、プロトコルＰＩに依存する。

【0333】

全ての患者は、プロトコル療法の開始時から試験終了まで、アシクロビル（またはそのプロドラッグのバラシクロビル）を用いたＨＳＶまたはＶＺＶの経口抗ウイルス予防薬を投与され得る。

【0334】

全ての患者は、プロトコル療法の開始時から試験終了まで、経口抗真菌予防（第１選択薬：フルコナゾール）を投与され得る。プロトコルＰＩの承認に従って、代替薬が許可される。

【0335】

全ての患者は、治験参加時に（治験終了時の来院まで続く）、ニューモシスチスＰＪＰの予防を開始する。患者は、経口コトリモキサゾール（トリメトプリム１６０ｍｇ／スルファメトキサゾール８００ｍｇ）を、月曜日、水曜日、金曜日に１錠を経口投与される。プロトコルＰＩの承認に従って、代替のスケジュールまたは代替薬が許可される。

【0336】

ＩＴ_ＲＥＧ細胞を用いるＡＬＳ患者の治療：製品の製造および表現型
以前詳述したように、ｉＴ_ＲＥＧ細胞産物は、ＰＣレジメンの前の試験エントリの時点または８週間のＰＣレジメンの完了の時点のいずれかでアフェレーシスによって収集される自家Ｔ細胞から製造される。各アフェレーシス収集物は、固有の利点を有し得る：初期の収集物は、より高いＴ細胞収率を有し、一方、ＰＣ後の収集物は、Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞が比較的枯渇したＴ細胞集団から構成される。

【0337】

ｉＴ_ＲＥＧ細胞は、炎症性表現型から抗炎症性Ｔ_ＲＥＧ表現型へのエフェクターＴ細胞変換の原理に基づいて製造されるため、ＣＤ４^＋、ＣＤ２５^＋、およびＣＤ１２７の低発現を典型的に特徴とする比較的希少なｎＴ_ＲＥＧ集団を得るためにモノクローナル抗体／カラム選択方法またはフローサイトメトリーのいずれかを必要とする高価で手間のかかる天然Ｔ_ＲＥＧ精製工程は必要ないであろう。加えて、ＣＤ８^＋Ｔ_ＲＥＧ細胞が免疫抑制を媒介することが示されており、ｉＴ_ＲＥＧ細胞療法に増加した多様性を提供する点で有益であり得るため、ｉＴ_ＲＥＧ細胞集団からＣＤ８^＋Ｔ細胞を除去する必要はないであろう。

【0338】

ＣＤ６２ＬおよびＣＣＲ７などの細胞表面マーカーの発現に基づいてセントラルメモリー型であると定義され得る限られた分化状態のＴ_ＲＥＧ細胞が、インビボ調節機能を増加させたことが示されている。他方では、より分化したエフェクターメモリー状態のＴ_ＲＥＧ細胞取得は、ＩＬ－１０、ＣＴＬＡ－４などの抑制機能を媒介する分子、エクトヌクレオチダーゼ分子ＣＤ３９およびＣＤ７３、ならびにパーフォリンおよびｆａｓリガンドなどの細胞溶解分子などの上方制御を可能にすることも知られている。これらのデータは、セントラルおよびエフェクターメモリーサブセットの両方の集団を含有するｉＴ_ＲＥＧ細胞産物を注入することが有益であることを示し、したがって、本発明者らが利用するｉＴ_ｒｅｇ細胞産物は、両方のサブセットからの表現を有することを示す。

【0339】

加えて、ｉＴ_ＲＥＧ細胞は、制御性Ｔ細胞分化プログラムを指示する転写因子であるＦｏｘＰ３を発現する必要がある。さらに、ＦｏｘＰ３発現および結果として生じる制御機能が経時的に悪化し得ることが示されているため、ｉＴ_ＲＥＧ細胞産物は、培養物中で長期間にわたって安定したＦｏｘＰ３発現を有する必要がある。

【0340】

さらに、ＦｏｘＰ３は、正真正銘の炎症性Ｔ細胞サブセットによって一過性に発現することができるため、ＦｏｘＰ３単独では、制御性Ｔ細胞表現型の同定に十分ではないことがヒトにおいて示されている。したがって、ＦｏｘＰ３を発現するが、Ｔｈ１／Ｔｃ１型転写因子ＴＢＥＴまたはＴｈ１型サイトカインＩＬ－２またはＩＦＮ－γなどの炎症性Ｔ細胞サブセットに関連する分子の共発現も比較的欠如しているｉＴ_ＲＥＧ細胞産物を製造することが重要である。

【0341】

最後に、ｉＴ_ＲＥＧ細胞産物が制御性表現型から炎症表現型への分化可塑性の能力を低下させることが重要である。すなわち、Ｔ_ＲＥＧ細胞は、それらの抑制表現型において比較的不安定であり得、これは、実際に神経変性疾患の媒介に寄与し得る炎症性Ｔ細胞サブセットへの形質転換をもたらし得ることが十分に文書で説明されている。したがって、ｉＴ_ＲＥＧ細胞産物は、ＦｏｘＰ３を安定的に発現し、Ｔｈ１／Ｔｃ１サブセットへの変換の減少した傾向も示す必要がある。Ｔｈ１型サブセットへのＴ_ＲＥＧ細胞分化可塑性に対するさらなる保護手段として、本発明者らは、任意のかかる分化がＴｈ２型系統に向けられるように、意図的に、ＩＬ－４をｉＴ_ＲＥＧ細胞製造プロセスに組み込む。ここで、Ｔｈ２型系統は、Ｔ_ＲＥＧ細胞の維持およびＴ_ＲＥＧ細胞抑制機能の重要性があると思われ、Ｔ_ＲＥＧ細胞のデフォルト経路として説明されており、ＡＬＳの設定において抗炎症効果を媒介することができる。制御性Ｔ細胞のＴｈ２様状態の潜在的に有益な役割についてのこの証拠にもかかわらず、Ｔ_ＲＥＧ細胞療法の製造方法には、培養中に外因性ＩＬ－４を意図的に添加することが含まれていない（Ｔ_ＲＥＧ製造の最近の実施例に例証されるように）。

【0342】

製造の最後に、ｉＴ_ＲＥＧ細胞産物を、治療細胞用量（１～５×１０^６細胞／ｋｇ）で少なくとも４つの単回使用アリコートに凍結保存する。

【0343】

ＩＴ_ＲＥＧ細胞を用いるＡＬＳ患者の治療：Ｔ_ＲＥＧ細胞集団の組み合わせ
ＩＴ_ＲＥＧ細胞集団を、レシピエント体重１ｋｇ当たり１～５×１０^６細胞の用量で注入する。以前の研究と比較して相対的に低い、この用量のＴ_ＲＥＧ細胞療法は、いくつかの因子によって促進される：ＰＣレジメンは、ｉＴ_ＲＥＧ細胞の生着に十分な免疫学的空間を提供する；ｉＴ_ＲＥＧ細胞は、養子移植後の細胞持続性に関連する記憶プロファイルを発現する；およびｉＴ_ＲＥＧ細胞産物は、少なくとも４つの臨床的に関連する治療用量に凍結保存され、それによって複数の治療サイクルを可能にする。

【0344】

以前詳述したように、ｉＴ_ＲＥＧ細胞産物は、多様なメモリー分化状態（セントラルメモリー［ＣＭ］プラスエフェクターメモリー［ＥＭ］）を含有し、それにより、神経炎症の長期制御および即時制御の両方を可能にする。そのようなセントラルメモリー集団とエフェクターメモリー集団の比率を、臨床状況に応じて最適な結果のために制御することが可能であり、すなわち、臨床パラメーターに基づいて、ＣＭ：ＥＭ細胞のｉＴ_ＲＥＧ分布は、１：１、３：１、１０：１、１：３、または１：１０であり得る。

【0345】

同様に、臨床状況に応じて、ＣＤ４^＋ｉＴ_ＲＥＧ細胞対ＣＤ８^＋ｉＴ_ＲＥＧ細胞の比を制御して治療効果を向上させることが可能であろう。

【0346】

最後に、ｉＴ_ＲＥＧおよびｎＴ_ＲＥＧ細胞は異なるＴ細胞受容体レパートリーを発現し、したがって免疫抑制を媒介する点で補完的であり得るため、本発明者らは、ｉＴ_ＲＥＧ細胞を使用する最適な療法がｎＴ_ＲＥＧ細胞の共投与によって達成され得ることを想定する。

【0347】

ＩＴ_ＲＥＧ細胞を用いるＡＬＳ患者の治療：薬剤との併用
ＩＴ_ＲＥＧ細胞療法は、ＰＣレジメンの免疫調節効果およびラミブジンのインフラマソーム阻害効果を含むプラットフォームと組み合わせたときに、神経炎症を制御するのに十分であり得る。

【0348】

しかしながら、本発明者らは、プラットフォームの変更によってｉＴ_ＲＥＧ細胞療法が最適化される可能性があることを想定している。例として限定されるものではないが、療法は、ＰＣレジメンの強度を変更すること、ペントスタチンと相乗効果を発揮するために別の薬剤でシクロホスファミドを置換すること、またはＰＣレジメンに第３の成分を添加すること、例えば、抗ＴＮＦ療法後の低用量ＩＬ－２療法を添加すること、によって最適化することができ、これらは、本発明者らの推論によれば、インビボでＴ_ＲＥＧ細胞を予測可能に増加させる。例として限定されるものではないが、低用量ＩＬ－２療法は、Ｐｈａｍ ＭＮ、ｖｏｎ Ｈｅｒｒａｔｈ ＭＧ、Ｖｅｌａ ＪＬ．Ａｎｔｉｇｅｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｌｏｗ Ｄｏｓｅ ｏｆ ＩＬ－２ ｉｎ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｙｐｅ １ Ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１５；６：６５１に記載されている。

【0349】

さらに、本発明者らは、ラミブジンが、最近合成された分子と同様のより強力またはより特異的なインフラマソーム阻害剤で置き換えられ得ることが想定される。

【0350】

最終的に、ＡＬＳにおける炎症のための駆動は、誤って折り畳まれたＲＮＡ要素の蓄積および不十分なオートファジーなどの、より近位の事象によって開始される。この点で、オートファジーを促進することができる薬剤、特にラパマイシンをＡＬＳ療法に利用する根拠がある。しかしながら、ＡＬＳの治療のためのラパマイシンの臨床試験は現在開始されたばかりに過ぎず（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ 識別子：ＮＣＴ０３３５９５３８）、さらに、このプロトコルは、ラパマイシン（実質的な毒性と関連付けられ得る）、一定用量のラパマイシン（患者間の薬物変動性の大きさをもたらし得る）、および比較的低い用量のラパマイシン（ｍＴＯＲ経路の強力な阻害および結果としてのオートファジーの促進に必要な高い薬物レベルを保証しない）の連続療法を評価している。これらの制限を回避するために、本発明者らは、ｉＴ_ＲＥＧ細胞療法とラパマイシンを組み合わせて、以下のパラメーターを使用してオートファジーを促進する：薬物毒性を制限し、ｉＴ_ＲＥＧ細胞のラパマイシン阻害の可能性を制限するための断続的なラパマイシン療法の使用（例として、ｍＴＯＲ阻害療法で１週間、ｍＴＯＲ療法で３週間の回復を加えたが、これに限定されない）；ｍＴＯＲ経路のより一貫した阻害のための均質な薬物レベルを確保するためのラパマイシンレベルの血清検査と組み合わせた、ラパマイシンの負荷用量を含む、ラパマイシンの可変投与の使用；および約５～１２ｎｇ／ｍｌの典型的な標的に優先して３０ｎｇ／ｍｌの血清ラパマイシンレベルを達成するための、高用量ラパマイシン療法の使用。Ｍｏｓｓｏｂａ ＭＥ，Ｈａｌｖｅｒｓｏｎ ＤＣ，Ｋｕｒｌａｎｄｅｒ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ－Ｄｏｓｅ Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ Ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ Ｐｌｕｓ Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ Ｙｉｅｌｄｓ Ｓｔａｂｌｅ Ｍｉｘｅｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｓｍ ａｎｄ Ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｇｒａｆｔ－Ｖｅｒｓｕｓ－Ｔｕｍｏｒ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１５；２１（１９）：４３１２－４３２０を参照されたい。

【0351】

さらに、ラパマイシン療法は、中枢神経系への薬物の浸透が不十分であるため、神経変性疾患におけるオートファジーの促進には最適ではない可能性がある。この点で、ラパマイシン類似体テムシロリムスによる静脈内療法でさえ、脳脊髄液中に薬物の有意なレベルをもたらさなかった。この制限を克服するために、本発明者らは、神経変性疾患の状況下でオートファジーを最適に促進するためにｍＴＯＲ阻害剤の一貫したＣＳＦ薬物レベルを達成するために、リソソーム蓄積疾患の治療に利用されるのと同様の方法で、留置されたオンマヤリザーバーを通じてテムシロリムスを投与することを想定する。

【0352】

ＩＴ_ＲＥＧ細胞を用いるＡＬＳ患者の治療：免疫モニタリング
ＡＬＳのｉＴ_ＲＥＧ細胞療法の文脈において、疾患に関連する神経炎症経路を調節するその能力の観点から、細胞療法の成功を定量化することが重要であろう。つまり、神経変性疾患の臨床経過のモニタリングは、患者コホート全体の疾患進行における大きな変動性を考慮すると不十分である。神経炎症を最適に治療する能力は、様々な薬理学的薬剤との組み合わせを含む、ｉＴ_ＲＥＧ細胞の複数回の注入を必要とするであろう。したがって、免疫バイオマーカーを利用して治療決定の指導を支援することが重要であろう。

【0353】

ＩＴ_ＲＥＧ細胞注入および関連薬理剤の反復投与に関する治療決定は、本発明者らが開発した末梢血単核細胞の専門的な試験に基づく。これらの試験は、炎症性モニタリングに関連するいくつかの重要な問題に対処し、これには、自発的サイトカイン測定；サイトカイン測定におけるＴ細胞および単球の協調性；サイトカイン分泌のマスキング解除における組換えヒトＣＤ４０リガンド、Ｔ細胞チェックポイント阻害剤経路、および単球チェックポイント経路の役割；ウェスタンブロットによるタンパク質定量化などの様々な技術によるインフラマソーム活性化の評価；炎症性事象の指標としての末梢Ｔ細胞のアデノシン受容体生物学の評価；Ｔｈ１関連分子ＴＢＥＴ、ＩＬ－２、またはＩＦＮ－γとのＦｏｘＰ３転写因子共発現を評価するためのフローサイトメトリーの使用；ＲＮＡ配列決定によるＴ細胞受容体レパートリーの特徴付け；ならびに疾患発症中に発生するタンパク質凝集体などの潜在的な神経自己抗原に対する抗原特異的Ｔ細胞応答の検出が含まれる。

【0354】

プロトコル評価
医師または中級プロバイダーによる臨床評価は、１４日間のサイクルが意図されるＰＣレジメンの各サイクルの１日目に実施される。患者は、１４日間のＰＣサイクル中（理想的には、サイクルの８日目前後）に１回、現地のプロバイダーによって診察される。これらの来院では、差異的かつ完全な代謝パネルを有するＣＢＣ（完全な代謝パネルは、典型的には、電解質、クレアチニン、肝臓トランスアミナーゼ、およびビリルビンを含む約１４の試験を含む；使用される特定のパネルは、プロトコルに必須ではない）が得られ、ラボ結果がプロトコル研究者に送付される。

【0355】

ＰＣレジメンを含むインターバルの完了時（約２ヶ月目）、患者は、３、４、５、および６ヶ月目に毎月診察され、６ヶ月目の来院は、試験終了の来院を表す。これらの臨床評価の時点で実施される試験には以下が含まれる：（１）暫定的な病歴および身体検査；（２）差異的および血小板数を有するＣＢＣ；（３）完全な代謝パネル；ならびに（４）免疫サブセット列挙（ＴＢＮＫパネル）。

【0356】

研究の免疫パラメーターを監視するために、一元的な監視とより深い分析を可能にするために、末梢血試料がＲａｐａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓに送られる。血液試料は、Ｒａｐａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓに送られた上部緑色のヘパリン化チューブ（細胞アッセイ用）中の３０ｍｌと、上部赤色のチューブ（血清アッセイ用）中の５ｍｌからなる。

【0357】

Ｒａｐａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓに送られた同じ試料を使用して、本発明者らは、ＲＮＡ発現、上清／ルミネックスアッセイ、フローサイトメトリー、およびウェスタンブロットによるリン酸化分析による細胞シグナル伝達事象によって測定される炎症促進性または抗炎症性サイトカインまたは細胞サブセットに対するＰＣレジメンおよびラミブジン維持療法の効果を調査する。

【0358】

血清は、ＡＬＳの潜在的なバイオマーカーについて評価される。例として、Ｂｅａｃｈ ＴＧ．Ａ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｗｉｌｌ Ｔｈｅｙ Ｓｗｉｎｇ Ｕｓ Ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ Ｖａｌｌｅｙ？ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１７；６（Ｓｕｐｐｌ １）：５－１３に記載されるバイオマーカーなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0359】

本発明者らは、患者のＴＣＲレパートリーを特徴付け、治療介入がレパートリーに影響を与えるかどうかを評価する。

【0360】

インビトロ研究は、「免疫特性評価研究」の一般カテゴリに該当する。これらは、マルチパラメーターＦＡＣＳ解析による異なる細胞サブセットの分離、またはその後の特徴付けによる磁性ビーズによる分離に焦点を当てる。具体的には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、造血系統、免疫機能サブセット、サイトカイン産生、および活性化状態の指標となるマーカーの発現についてフローサイトメトリーによって分析する。細胞サブセットは、Ｔ細胞受容体レパートリー多様性について分析される。細胞は、Ｔリンパ球または単球機能の異なる経路を活性化することが知られている特定の抗原および有糸分裂原を含む多数の異なる刺激でインビトロで活性化され得る。アッセイには、Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生、および遺伝子発現が含まれ得る。進行中のデータ分析に使用される特定のアッセイは、研究目的の変更を構成することなく、研究過程中に現場の技術および知識が進化するにつれて修正、削除、または置き換えられる。

【0361】

応答基準
患者報告のＡＬＳＦＳ－Ｒスコアおよび臨床医報告のＡｐｐｅｌスコアは、上記のように、様々な時点で測定される。

【0362】

毒性基準
毒性は、ＮＣＩの有害事象共通用語基準（ＣＴＣＡＥ）に従って等級付けされる（ｈｔｔｐ：／／ｃｔｅｐ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖから入手可能）。ＣＴＣＡＥバージョン４．０のコピーは、ＣＴＥＰホームページからダウンロードできる。試験に関与する全ての治療領域および担当者は、ＣＴＣＡＥバージョン４．０のコピーにアクセスできる必要がある。

【0363】

試験薬（ペントスタチン、シクロホスファミド、ラミブジン）とおそらくまたは間違いなく関連する属性を有する任意のグレード４または５の毒性（ＣＴＣＡＥバージョン４．０）は、用量制限毒性（ＤＬＴ）と見なされる。以下の毒性：生化学的グレード４の毒性（腎臓および肝臓値を除く）、グレード４の嘔吐、グレード４の発熱、および７日以内に解消する感染に関連するグレード４の毒性、はＤＬＴとはみなされない。

【0364】

統計上の考慮事項
この研究デザインには、ペントスタチンおよびシクロホスファミドレジメンの安全性とラミブジン療法（プラットフォーム）の維持を評価するための標準的な３＋３方法が組み込まれている。最初の３人の患者において、ペントスタチン／シクロホスファミドレジメンの完了を通じてＤＬＴを発症する患者がいない場合、レジメンは、コホートを合計ｎ＝１０人の患者に拡大するために安全であると判定される。他方では、最初の患者の３人のうち１人がＤＬＴを発症した場合、増加分は、合計ｎ＝６人の患者に増加となる。そのような場合、最初の６人の患者のうち１人以下がＤＬＴを発症する場合、コホート内のｎ＝１０の数への増加に進めることができる。

【0365】

このプラットフォームが正常に開発されると、本発明者らは、ｉＴ_ＲＥＧ細胞注入の安全性と潜在的な有効性を評価する。最初に、パイロット試験を実施して、疾患に関連する神経炎症経路を阻害するｉＴ_ＲＥＧ細胞の複数回注入の能力を評価する。

【0366】

神経変性に関連するバイオマーカーを効果的に調節する能力が文書化されると、本発明者らは、ｉＴ_ＲＥＧ細胞療法がＡＬＳ患者の臨床転帰を改善することができるかどうかを評価するために（過去の対照データまたは無作為化コホート設計のいずれかを使用して）第ＩＩ相臨床試験を実施する。

【0367】

リスク／ベネフィット分析
本試験に関わった患者の推定生存期間は、試験参加から約２～４年であると予測される。

【0368】

第１のプロトコル構成要素は、ペントスタチンおよびシクロホスファミドからなる４サイクルの免疫枯渇および免疫抑制レジメン（ＰＣレジメン）からなる。本発明者らは、ＰＣレジメンが、ＡＬＳ進行に寄与する病原性免疫細胞を排除および抑制すると仮定し、したがって、患者は、生活の質の向上または最終的には疾患の進行の減少の形態でこの効果から利益を得る可能性がある。しかしながら、中枢神経系に関してＰＣレジメンの予期しない毒性がある場合がある。ＰＣレジメンがこの新しいＡＬＳ患者集団において比較的安全であることを確証するのに役立つように投薬修正が行われているが、ＰＣレジメンが矛盾的な効果を有し、実際にＡＬＳ進行速度を増加させるか、またはいくつかの他の神経学的毒性を引き起こす可能性がある。まれにペントスタチンは、心臓または腎臓などの他の臓器にも毒性を引き起こし得る。ＰＣレジメンから予想される最も一般的な毒性は、リンパ球の枯渇であるが、この効果は治療の理論的根拠の一部である。他方では、ＰＣレジメンは、骨髄系細胞を排除する可能性があり、それによって細菌または真菌感染の可能性を増加させる。ＰＣレジメンは、Ｔ細胞免疫抑制と関連することが予想され、したがって、日和見性ウイルス感染を生じ得る。

【0369】

第２のプロトコル構成要素は、抗ウイルス薬ラミブジンによる維持療法からなる。中枢神経系から発生する炎症を低減するために仮説通りに薬物が作用する場合、患者はこの療法から利益を得ることができる。ラミブジンは、一般に、主に胃腸副作用および膵炎以外には非常に耐容性の高い薬物である。

【0370】

第３のプロトコル構成要素は、ｉＴ_ＲＥＧ細胞の複数の注入からなる。炎症を制御する細胞療法が、炎症が開始される微小環境内で直接生じるため、細胞療法が、薬物療法を通じて容易に複製することができない複数の分子作用機構を通じて動作するため、ならびに細胞療法の効果がメモリー細胞効果によって長く持続することができるため、患者は、この療法から利益を得ることができる。

【0371】

代替プロトコル設計
図３９は、代替のプロトコル設計を提供する。リンパ球は、定常状態のアフェレーシスによって収集され、アフェレーシス産物は、Ｒａｐａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）に出荷される。ＲＡＰＡ－５０１細胞製造後、ｎ＝４用量のＲＡＰＡ－５０１細胞は、臨床的に指示された細胞用量で単回使用の注入バッグ中で凍結保存される。治療区間は６ヶ月、続いて６ヶ月の観察区間とする。コホート＃１は、４０×１０^６細胞／注入の用量で４サイクルにわたって投与されるＲＡＰＡ－５０１細胞を受ける。コホート＃１は、安全性コホートを表し、標準的な３＋３設計を利用する。０／３または１／６以下の患者が用量制限毒性（ＤＬＴ）を経験した場合、コホート＃ ２への前進が生じる。コホート＃２は、Ｔ細胞用量が１２０×１０^６細胞／注入に増大することを除いて、上記の試験プロトコルと同じ４サイクルのＲＡＰＡ－５０１細胞を投与される。コホート＃３では、４つのＲＡＰＡ－５０１細胞注入のそれぞれの前に、単剤（それぞれコホート＃１または＃２に従い、４０または１２０×１０^６細胞／注入のいずれか）＋ ＰＣレジメンによる宿主コンディショニングのいずれかとして安全に投与することができるＲＡＰＡ－５０１細胞の最高用量を評価する。ＰＣレジメンは、ペントスタチン（１日目および４日目に２ｍｇ／ｍ^２）、シクロホスファミド（１日１００ｍｇ、１～５日目）、６日目および７日目に無治療、ならびに８日目にＲＡＰＡ－５０１細胞注入からなる。

【0372】

脱分化の実施形態：
１．Ｔ細胞の脱分化方法であって、
ビタミンＤ、テムシロリムス、およびＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含む培養培地中に、対象由来のＴ細胞を含む細胞の培養入力集団を細胞密度で植え付けることと、
抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁性ビーズを上記のＴ細胞および培養培地に１：１～１：１２のビーズ：Ｔ細胞比で添加することと、
上記の細胞の培養入力集団および培養培地を一定期間インキュベートして、脱分化Ｔ細胞を得ることと、を含む、方法。
２．上記の脱分化Ｔ細胞を採取することをさらに含む、実施形態１に記載の方法。
３．上記の脱分化Ｔ細胞を採取した後に、
上記の脱分化Ｔ細胞の少なくとも一部分をパッケージ中にパッケージ化することと、
上記の脱分化Ｔ細胞の上記の一部を含有する上記のパッケージを冷凍することと、をさらに含む、実施形態２に記載の方法。
４．上記の細胞の培養入力集団を上記の培養培地に植え付ける前に、
上記の対象から上記の細胞の培養入力集団を採取すること、をさらに含む、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法。
５．上記の培養培地はＩＬ－２を含有せず、ＩＬ－２は上記の培養培地に添加されない、実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法。
６．上記の細胞密度は、１ｍＬ当たり少なくとも１．５×１０６Ｔ細胞である、実施形態１～５のいずれか１つに記載の方法。
７．上記のテムシロリムスが、約０．３μＭ～約１μＭの濃度で上記の培養培地中に存在する、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法。
８．上記のテムシロリムスが、約１μＭの濃度で上記の培養培地中に存在する、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法。
９．上記のＩＬ－２シグナル伝達阻害剤が、抗ＩＬ－２受容体抗体またはその断片である、実施形態１～８のいずれか１つに記載の方法。
１０．上記のＩＬ－２シグナル伝達阻害剤が、バシリキシマブまたはダクリズマブである、実施形態９に記載の方法。
１１．上記のＩＬ－２シグナル伝達阻害剤が、５～５０μｇ／ｍＬの濃度で上記の培養培地中に存在する、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．上記の期間が約３日間である、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の方法。
１３．上記のビーズ：Ｔ細胞比が、１：３である、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．上記の培養培地が、５％のヒト血清をさらに含む、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．上記の培養培地がＸ－Ｖｉｖｏ ２０培地を含む、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の方法。
１６．上記のビタミンＤが、約０．０３ｎＭ～約１ｎＭで上記の培養培地中に存在する、実施形態１～１５のいずれか１つに記載の方法。
１７．上記のビタミンＤが、約０．１ｎＭで上記の培養培地中に存在する、実施形態１～１５のいずれか１つに記載の方法。
１８．上記の細胞の培養入力集団におけるＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲの発現レベルを測定することをさらに含み、
上記の期間が、テムシロリムス、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤およびビタミンＤを含まない細胞の培養入力集団と同じ条件下で製造されたＴ細胞の対照集団と比較して、細胞の培養入力集団におけるＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲの発現レベルが少なくとも５０％、より好ましくは９０％低減されるまで続くものである、実施形態１～１１および１３～１７のいずれか１つに記載の方法。
１９．上記の細胞の培養入力集団におけるＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲおよびハウスキーピングタンパク質の発現レベルを測定することをさらに含み、
上記の期間が、ハウスキーピングタンパク質の発現レベルについて正規化した後に、テムシロリムス、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤およびビタミンＤを含まない細胞の培養入力集団と同じ条件下で製造されたＴ細胞の対照集団と比較して、上記の細胞の培養入力集団におけるＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲのそれぞれの発現レベルが少なくとも５０％低減されるまで続くものである、実施形態１～１１および１３～１７のいずれか１つに記載の方法。
２０．上記のハウスキーピングタンパク質が、アクチンまたはＧＡＰＤＨである、実施形態１９に記載の方法。
２１．発現レベルを測定する上記の工程は、ウェスタンブロット分析によって実行される、実施形態１８～２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．上記の細胞の培養入力集団におけるＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲの発現レベルを測定することをさらに含み、
上記の期間が、テムシロリムス、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤およびビタミンＤを含まない細胞の培養入力集団と同じ条件下で製造されたＴ細胞の対照集団と比較して、細胞の培養入力集団におけるＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲの発現レベルが少なくとも５０％、より好ましくは９０％低減されるまで続くものである、実施形態１～１１および１３～１７のいずれか１つに記載の方法。
２３．実施形態１～２２のいずれか１つに記載の方法によって産生される脱分化Ｔ細胞。
２４．脱分化Ｔ細胞の集団を含む組成物であって、
上記の脱分化Ｔ細胞の上記の集団の少なくとも一部は、Ｔ細胞の対照集団と比較して、ＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲの両方の５０％未満を発現し、Ｔ細胞の対照集団は、テムシロリムス、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤、およびビタミンＤを含まない細胞の培養入力集団と同じ条件下で製造される、組成物。
２５．Ｔ細胞の脱分化方法であって、
ビタミンＤおよびテムシロリムスを含む培養培地中に、対象由来のＴ細胞を含む細胞の培養入力集団を細胞密度で植え付けることと、
抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁性ビーズを上記のＴ細胞および培養培地に、ビーズ：Ｔ細胞比が１：１以下で添加して、上記のＴ細胞を刺激することと、
上記の細胞の培養入力集団および培養培地を一定期間インキュベートして、脱分化Ｔ細胞を得ることと、を含む、方法。
２６．上記の脱分化Ｔ細胞を採取することをさらに含む、実施形態２５に記載の方法。
２７．上記の脱分化Ｔ細胞を採取した後に、
上記の脱分化Ｔ細胞の少なくとも一部分をパッケージ中にパッケージ化することと、
上記の脱分化Ｔ細胞の上記の一部を含有する上記のパッケージを冷凍すること、をさらに含む、実施形態２６に記載の方法。
２８．上記の細胞の培養入力集団を上記の培養培地に植え付ける前に、
上記の対象から上記の細胞の培養入力集団を採取すること、をさらに含む、実施形態２５～２７のいずれか１つに記載の方法。
２９．上記の培養培地はＩＬ－２を含有せず、ＩＬ－２は上記の培養培地に添加されない、実施形態２５～２８のいずれか１つに記載の方法。
３０．上記の細胞密度が１ｍＬ当たり１．５×１０６Ｔ細胞である、実施形態２５～２９のいずれか１つに記載の方法。
３１．上記のテムシロリムスが、約０．３μＭ～約１μＭの濃度で上記の培養培地中に存在する、実施形態２５～３０のいずれか１つに記載の方法。
３２．上記のテムシロリムスが、約１μＭの濃度で上記の培養培地中に存在する、実施形態２５～３０のいずれか１つに記載の方法。
３３．上記の期間が約３日間である、実施形態２５～３２のいずれか１つに記載の方法。
３４．上記のビーズ：Ｔ細胞比が、１：３である、実施形態２５～３３のいずれか１つに記載の方法。
３５．上記の培養培地が、５％のヒト血清をさらに含む、実施形態２５～３４のいずれか１つに記載の方法。
３６．上記の培養培地がＸ－Ｖｉｖｏ ２０培地を含む、実施形態２５～３５のいずれか１つに記載の方法。
３７．上記のビタミンＤが、約０．０３ｎＭ～約１ｎＭで上記の培養培地中に存在する、実施形態２５～３６のいずれか１つに記載の方法。
３８．上記のビタミンＤが、約０．１ｎＭで上記の培地中に存在する、実施形態２５～３７のいずれか１つに記載の方法。
３９．上記の細胞の培養入力集団におけるＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲの発現レベルを測定することをさらに含み、
上記の期間が、テムシロリムス、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤およびビタミンＤを含まない細胞の培養入力集団と同じ条件下で製造されたＴ細胞の対照集団と比較して、上記の細胞の培養入力集団におけるＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲの発現レベルが少なくとも５０％低減されるまで続くものである、実施形態２５～３２および３４～３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．上記の細胞の培養入力集団におけるＲＡＰＴＯＲ、ＲＩＣＴＯＲおよびハウスキーピングタンパク質の発現レベルを測定することをさらに含み、
上記の期間が、ハウスキーピングタンパク質の発現について正規化した後に、テムシロリムス、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤およびビタミンＤを含まない細胞の培養入力集団と同じ条件下で製造されたＴ細胞の対照集団と比較して、細胞の培養入力集団におけるＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲの発現レベルが５０％まで、またはより好ましくは９０％まで低減されるまで続くものである、実施形態２５～３２および３４～３８のいずれか１つに記載の方法。
４１．上記のハウスキーピングタンパク質が、アクチンまたはＧＡＰＤＨである、実施形態４０に記載の方法。
４２．発現レベルを測定する上記の工程は、ウェスタンブロット分析によって実行される、実施形態３９～４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．上記の細胞の培養入力集団におけるＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲの発現レベルを測定することをさらに含み、
上記の期間が、テムシロリムス、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤およびビタミンＤを含まない細胞の培養入力集団と同じ条件下で製造されたＴ細胞の対照集団と比較して、細胞の培養入力集団におけるＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲの発現レベルが少なくとも５０％、より好ましくは９０％低減されるまで続くものである、実施形態２５～３２および３４～３８のいずれか１つに記載の方法。
４４．実施形態２５～４３のいずれか１つに記載の方法によって産生される脱分化Ｔ細胞。
４５．これらの方法で特定される培養添加物を含むことなく培養されたＴ細胞の対照集団と比較して、以下のＴ細胞分化分子：グランザイムＢを含むがこれらに限定されない細胞溶解分子、およびＩＦＮ－γを含むがこれらに限定されないサイトカイン分子について、ＲＮＡの発現が少なくとも１０％低減し、より好ましくは５０％低減することを特徴とする、脱分化Ｔ細胞集団。
４６．これらの方法で特定される培養添加物を含むことなく培養されたＴ細胞の対照集団と比較して、以下のＴ細胞分化分子：Ｎａｎｏｇ、ＫＬＦ４、およびＫＬＦ１０を含むがこれらに限定されない人工多能性幹細胞に関連する転写因子、ならびにＩＬ－７受容体、ＣＤ１２７を含むがこれらに限定されないナイーブＴ細胞に関連する分子について、ＲＮＡの発現が少なくとも１０％増加し、より好ましくは５０％増加することを特徴とする、脱分化Ｔ細胞集団。
４７．これらの方法で特定される培養添加物を含むことなく培養されたＴ細胞の対照集団と比較して、以下のＴ細胞分化分子：Ｔ－ＢｅｔおよびＳＴＡＴ１を含むがこれらに限定されないＴｈ１エフェクターＴ細胞に関連する転写因子について、ＲＮＡの発現が少なくとも１０％減少し、より好ましくは５０％減少することを特徴とするが、付随的に、ＨＩＦ－１－αを含むがこれらに限定されない細胞生存に関連する転写因子については、同等の発現を有し得る、脱分化Ｔ細胞集団。
４８．これらの方法で特定される培養添加物を含むことなく培養されたＴ細胞の対照集団と比較して、オートファジー関連分子ｐ６２のウェスタンブロット分析によるタンパク質レベルの上昇を含むがこれらに限定されない、オートファジーの分子マーカーの発現が少なくとも１０％増加し、より好ましくは５０％増加することを特徴とする、脱分化Ｔ細胞集団。
４９．抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁性ビーズを上記のＴ細胞および培養培地に１：１～１：１２のビーズ：Ｔ細胞比で添加する上記の工程が実行されない、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の方法。
５０．上記のＴ細胞を刺激するために、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁性ビーズを上記のＴ細胞および培養培地に１：１以下のビーズ：Ｔ細胞比で添加する上記の工程が実行されない、実施形態２５～４３のいずれか１つに記載の方法。
５１．以下の特性：
テムシロリムス、ビタミンＤ、およびＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含まない同じ条件下でインキュベートされた対照Ｔ細胞集団と比較して、グランザイムＢ、ＩＬ－１０、およびＩＦＮ－γのうちの１つ以上のｍＲＮＡ発現が少なくとも１０％減少し、より好ましくは５０％減少している、
テムシロリムス、ビタミンＤ、およびＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含まない同じ条件下でインキュベートされた対照Ｔ細胞集団と比較して、Ｎａｎｏｇ、ＫＬＦ４、ＫＬＦ１０、およびＣＤ１２７のうちの１つ以上のｍＲＮＡ発現が少なくとも１０％増加し、より好ましくは５０％増加している、
テムシロリムス、ビタミンＤ、およびＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含まない同じ条件下でインキュベートされた対照Ｔ細胞集団と比較して、Ｔ－Ｂｅｔ およびＳＴＡＴ１のうちの１つ以上のｍＲＮＡ発現が少なくとも１０％減少し、より好ましくは５０％減少している、
テムシロリムス、ビタミンＤ、およびＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含まない同じ条件下でインキュベートされた対照Ｔ細胞集団の約２０％以内のＨＩＦ－１－α発現、
テムシロリムス、ビタミンＤ、およびＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含まない同じ条件下でインキュベートされた対照Ｔ細胞集団と比較して、ｐ６２発現が少なくとも１０％増加し、より好ましくは５０％増加している、
テムシロリムス、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤およびビタミンＤを含まない細胞の培養入力集団と同じ条件下で製造されたＴ細胞の対照集団と比較して、ＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲの発現レベルが少なくとも５０％、より好ましくは９０％低減されている、
ハウスキーピングタンパク質によって正規化されたＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲの発現レベルが、テムシロリムス、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤およびビタミンＤを含まない細胞の培養入力集団と同じ条件下で製造されたＴ細胞の対照集団と比較して、少なくとも５０％、より好ましくは９０％低減されている、ならびに
それらの組み合わせ、のうちの１つ以上を特徴とする、脱分化Ｔ細胞の集団。
５２．以下の特性：
テムシロリムス、ビタミンＤ、およびＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含まない同じ条件下でインキュベートされた対照Ｔ細胞と比較して、グランザイムＢ、ＩＬ－１０、およびＩＦＮ－γのうちの１つ以上のｍＲＮＡ発現が少なくとも１０％減少し、より好ましくは５０％減少している、
テムシロリムス、ビタミンＤ、およびＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含まない同じ条件下でインキュベートされた対照Ｔ細胞と比較して、Ｎａｎｏｇ、ＫＬＦ４、ＫＬＦ１０、およびＣＤ１２７のうちの１つ以上のｍＲＮＡ発現が少なくとも１０％増加し、より好ましくは５０％増加している、
テムシロリムス、ビタミンＤ、およびＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含まない同じ条件下でインキュベートされた対照Ｔ細胞と比較して、Ｔ－Ｂｅｔ およびＳＴＡＴ１のうちの１つ以上のｍＲＮＡ発現が少なくとも１０％減少し、より好ましくは５０％減少している、
テムシロリムス、ビタミンＤ、およびＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含まない同じ条件下でインキュベートされた対照Ｔ細胞の約２０％以内のＨＩＦ－１－α発現、
テムシロリムス、ビタミンＤ、およびＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含まない同じ条件下でインキュベートされた対照Ｔ細胞集団と比較して、ｐ６２発現が少なくとも１０％増加し、より好ましくは５０％増加している、
テムシロリムス、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤およびビタミンＤを含まない細胞の培養入力集団と同じ条件下で製造された対照Ｔ細胞と比較して、ＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲの発現レベルが少なくとも５０％、より好ましくは９０％低減されている、
ハウスキーピングタンパク質によって正規化されたＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲの発現レベルが、テムシロリムス、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤およびビタミンＤを含まない細胞の培養入力集団と同じ条件下で製造された対照Ｔ細胞と比較して、少なくとも５０％、より好ましくは９０％低減されている、ならびに
それらの組み合わせ、のうちの１つ以上を特徴とする、脱分化Ｔ細胞。

【0373】

再分化実施形態：
１．脱分化Ｔ細胞をＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞に分化するための方法であって、
ＩＬ－２、ＩＬ－４、およびＴＧＦ－βを含む培養培地で脱分化Ｔ細胞を培養すること、
抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁性ビーズを３：１の比率（ビーズ：Ｔ細胞の比）で添加すること、
上記の脱分化Ｔ細胞を一定期間インキュベートしてＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞を得ること、を含む、方法。
２．上記の培養培地が、ペメトレキセドをさらに含む、実施形態１に記載の方法。
３．上記のＩＬ－２が、約１００ＩＵ／ｍＬの濃度で上記の培養培地中に存在する、実施形態１～２のいずれか１つに記載の方法。
４．上記のＩＬ－４が、約１０００ＩＵ／ｍＬの濃度で上記の培養培地中に存在する、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法。
５．上記のＴＧＦ－βが、約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で上記の培養培地中に存在する、実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法。
６．上記のペメトレキセドが、最大１００ｎＭの濃度で上記の培養培地中に存在する、実施形態２に記載の方法。
７．上記のペメトレキセドが、約１０ｎＭの濃度で上記の培養培地中に存在する、実施形態２に記載の方法。
８．上記のＩＬ－２が、約１００ＩＵ／ｍＬの濃度で上記の培養培地中に存在する、実施形態６～７のいずれか１つに記載の方法。
９．上記のＩＬ－４が、約１０００ＩＵ／ｍＬの濃度で上記の培養培地中に存在する、実施形態６～８のいずれか１つに記載の方法。
１０．上記のＴＧＦ－βが、約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で上記の培養培地中に存在する、実施形態６～９のいずれか１つに記載の方法。
１１．脱分化Ｔ細胞をＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞に分化するための方法であって、
脱分化Ｔ細胞を培養することであって、上記の脱分化Ｔ細胞が、ＩＬ－２、ＩＬ－４、およびＴＧＦ－βを含む培養培地中で、対照Ｔ細胞と比較して少なくとも１０％低減されたレベルでＲＡＰＴＯＲおよびＲＩＣＴＯＲを発現する、培養すること、
抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁性ビーズを３：１の比率（ビーズ：Ｔ細胞の比）で添加すること、
前記脱分化Ｔ細胞を一定期間インキュベートしてＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞を得ること、を含む、方法。
１２．上記の培養培地が、ペメトレキセドをさらに含む、実施形態１１に記載の方法。
１３．上記のＩＬ－２が、約１００ＩＵ／ｍＬの濃度で上記の培養培地中に存在する、実施形態１１～１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．上記のＩＬ－４が、約１０００ＩＵ／ｍＬの濃度で上記の培養培地中に存在する、実施形態１１～１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．上記のＴＧＦ－βが、約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で上記の培養培地中に存在する、実施形態１１～１４のいずれか１つに記載の方法。
１６．上記のペメトレキセドが、最大１００ｎＭの濃度で上記の培養培地中に存在する、実施形態１２に記載の方法。
１７．上記のペメトレキセドが、約１０ｎＭの濃度で上記の培養培地中に存在する、実施形態１２に記載の方法。
１８．上記のＩＬ－２が、約１００ＩＵ／ｍＬの濃度で上記の培養培地中に存在する、実施形態１６～１７のいずれか１つに記載の方法。
１９．上記のＩＬ－４が、約１０００ＩＵ／ｍＬの濃度で上記の培養培地中に存在する、実施形態１６～１８のいずれか１つに記載の方法。
２０．上記のＴＧＦ－βが、約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で上記の培養培地中に存在する、実施形態１６～１９のいずれか１つに記載の方法。
２１．上記の培養培地が、５％のヒトＡＢ血清で補充されたＸ－Ｖｉｖｏ ２０である、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．上記の期間が、３日～４０日である、実施形態１～２１のいずれか１つに記載の方法。
２３．実施形態１～２２のいずれか１つに記載の方法によって産生される、ＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞。
２４．脱分化Ｔ細胞をＴＲＥＧ細胞に分化するための方法であって、
ＩＬ－２およびＴＧＦ－βを含む培養培地中で、Ｔ細胞の対照集団と比較して、ＲＡＰＴＯＲおよびＲＩＣＴＯＲの発現が低下した脱分化Ｔ細胞を培養することと、
抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁性ビーズを３：１の比率（ビーズ：Ｔ細胞の比）で添加することと、
上記の脱分化Ｔ細胞を一定期間インキュベートしてＴＲＥＧ細胞を得ることと、を含む、方法。
２５．上記の培養培地が、ペメトレキセドをさらに含む、実施形態２４に記載の方法。
２６．上記のＩＬ－２が、約１００ＩＵ／ｍＬの濃度で上記の培養培地中に存在する、実施形態２４～２５のいずれか１つに記載の方法。
２７．上記のＴＧＦ－βが、約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で上記の培養培地中に存在する、実施形態２４～２６のいずれか１つに記載の方法。
２８．上記のペメトレキセドが、最大１００ｎＭの濃度で上記の培養培地中に存在する、実施形態２５に記載の方法。
２９．上記のペメトレキセドが、約１０ｎＭの濃度で上記の培養培地中に存在する、実施形態２５に記載の方法。
３０．上記のＩＬ－２が、約１００ＩＵ／ｍＬの濃度で上記の培養培地中に存在する、実施形態２８～２９のいずれか１つに記載の方法。
３１．上記のＴＧＦ－βが、約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で上記の培養培地中に存在する、実施形態２８～３０のいずれか１つに記載の方法。
３２．脱分化Ｔ細胞をＴＲＥＧ細胞に分化するための方法であって、
脱分化Ｔ細胞を培養することであって、上記の脱分化Ｔ細胞が、ＩＬ－２およびＴＧＦ－βを含む培養培地中で、対照Ｔ細胞と比較して少なくとも１０％低減されたレベルでＲＡＰＴＯＲおよびＲＩＣＴＯＲを発現する、培養すること、
抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆磁性ビーズを３：１の比率（ビーズ：Ｔ細胞の比）で添加すること、
上記の脱分化Ｔ細胞を一定期間インキュベートしてＴＲＥＧ細胞を得ること、を含む、方法。
３３．上記の培養培地が、ペメトレキセドをさらに含む、実施形態３２に記載の方法。
３４．上記のＩＬ－２が、約１００ＩＵ／ｍＬの濃度で上記の培養培地中に存在する、実施形態３２～３３のいずれか１つに記載の方法。
３５．上記のＴＧＦ－βが、約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で上記の培養培地中に存在する、実施形態３２～３４のいずれか１つに記載の方法。
３６．上記のペメトレキセドが、最大１００ｎＭの濃度で上記の培養培地中に存在する、実施形態３３に記載の方法。
３７．上記のペメトレキセドが、約１０ｎＭの濃度で上記の培養培地中に存在する、実施形態３３に記載の方法。
３８．上記のＩＬ－２が、約１００ＩＵ／ｍＬの濃度で上記の培養培地中に存在する、実施形態３６～３７のいずれか１つに記載の方法。
３９．上記のＴＧＦ－βが、約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で上記の培養培地中に存在する、実施形態３６～３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．上記の培養培地が、５％のＡＢ血清を補充したＸ－Ｖｉｖｏ ２０培地である、実施形態２４～３９のいずれか１つに記載の方法。
４１．上記の期間が、３日～４０日である、実施形態２４～４０のいずれか１つに記載の方法。
４２．上記の脱分化Ｔ細胞が、Ｔ細胞の対照集団と比較して、ＲＡＰＴＯＲおよびＲＩＣＴＯＲの発現が低下している、実施形態１～４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．実施形態１～２２および２４～４２のいずれか１つに記載の方法によって産生される、ＴＲＥＧ細胞。
４４．後続のＴ細胞培養のためにアフェレーシスによって収集されるリンパ球が、定常状態で得られるか、あるいは血清を中和する点において比較的選択的である抗ＴＮＦ－α治療薬、ＴＮＦ－αの無細胞形態、最も顕著には、組換え受容体分子エタネルセプト、またはモノクローナル抗体アダリムマブでの対象の治療後に得られる、実施形態１～２２および２４～４２のいずれか１つに記載の方法によって産生される、ＴＲＥＧ細胞またはハイブリッドＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞。
４５．ＴＲＥＧ細胞またはハイブリッドＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞またはそれらの集団が、対照Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞と比較して、以下の分子：ＣＤ２５、ＣＤ２７、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＩＣＯＳ、ＬＡＩＲ１、ＯＸ４０、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つのフローサイトメトリーによって増加した発現を有する、実施形態１～２２および２４～４２のいずれか１つに記載の方法によって産生されるＴＲＥＧ細胞またはハイブリッドＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞。
４６．ＴＲＥＧ細胞またはハイブリッドＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞またはそれらの集団が、対照Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞と比較して、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αを含む炎症性サイトカインの分泌が低減している、実施形態１～２２および２４～４２のいずれか１つに記載の方法によって産生されるＴＲＥＧ細胞またはハイブリッドＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞。
４７．上記のＴＲＥＧ細胞またはハイブリッドＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞またはそれらの集団が、対照Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞と比較して、Ｔ細胞運命の転写因子の改変された発現を有し、最も顕著には、ＴＢＥＴの減少およびＦＯＸＰ３の増加を有する、実施形態１～２２および２４～４２のいずれか１つに記載の方法によって産生されるＴＲＥＧ細胞またはハイブリッドＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞。
４８．上記のＴＲＥＧ細胞またはハイブリッドＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞またはそれらの集団が、対照Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞と比較して、Ｔｈ２サイトカインＩＬ－４の分泌の増加、およびＴｈ２転写因子ＧＡＴＡ３の発現の増加を含む、追加の表現型形質を有する、実施形態１～２２および２４～４２のいずれか１つに記載の方法によって産生されるＴＲＥＧ細胞またはハイブリッドＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞。
４９．ＧＡＴＡ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも５％を有するＴＲＥＧまたはＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団。
５０．ＦｏｘＰ３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも５％を有するＴＲＥＧまたはＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団
５１．ＣＤ７３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも１０％を有するＴＲＥＧまたはＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団。
５２．ＣＤ１０３を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも１０％を有するＴＲＥＧまたはＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団。
５３．ＣＤ１５０を発現するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも２０％を有するＴＲＥＧまたはＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団。
５４．３：１のビーズ：Ｔ細胞の比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを用いて共刺激した後に少なくとも５ｐｇ／ｍＬ／１×１０６細胞／日のＩＬ－４を発現するＴＲＥＧまたはＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団。
５５．３：１のビーズ：Ｔ細胞の比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを用いて共刺激した後に少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ／１×１０６細胞／日のＩＬ－２を発現するＴＲＥＧまたはＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団。
５６．３：１のビーズ：Ｔ細胞の比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを用いて共刺激した後に少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ／１×１０６細胞／日のＩＦＮ－γまたはＧＭ－ＣＳＦを発現するＴＲＥＧまたはＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団。
５７．３：１のビーズ：Ｔ細胞の比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを用いて共刺激した後に１００ｐｇ／ｍＬ／１×１０６細胞／日未満の ＴＮＦ－αまたはＩＬ－１７Ｆを発現するＴＲＥＧまたはＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団。
５８．以下の特性：
対照Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞と比較して、フローサイトメトリーによって測定されるＣＤ２５、ＣＤ２７、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＩＣＯＳ、ＬＡＩＲ１、ＯＸＯ４０、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上の発現が、少なくとも１０％増加している、
対照Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞と比較して少なくとも１０％減少したＩＦＮ－γの分泌、
対照Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞と比較して少なくとも１０％減少したＴＮＦ－αの分泌、
対照Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞と比較して少なくとも１０％減少したＴＢＥＴの発現、
対照Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞と比較して少なくとも１０％増加したＦＯＸＰ３の発現、
フローサイトメトリーによって測定した場合、ＧＡＴＡ３を発現するＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋Ｔ細胞が少なくとも５％、
フローサイトメトリーによって測定した場合、ＦＯＸＰ３を発現するＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋Ｔ細胞が少なくとも５％、
フローサイトメトリーによって測定した場合、ＣＤ７３を発現するＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋Ｔ細胞が少なくとも５％、
フローサイトメトリーによって測定した場合、ＣＤ１０３を発現するＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋Ｔ細胞が少なくとも５％、
フローサイトメトリーによって測定した場合、ＦＯＸＰ３とＧＡＴＡ３の両方を発現するＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋細胞が少なくとも５％、
フローサイトメトリーによって測定した場合、ＣＤ１５０を発現するＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋Ｔ細胞が少なくとも２０％、
Ｔ_ＲＥＧまたはＴ_ＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団が産生されたＴ細胞特有のＴ細胞集団と比較して、ＧＡＴＡ３、ＦｏｘＰ３、ＣＤ７３、ＣＤ１０３、およびＣＤ１５０のうちの１つ以上の発現が少なくとも５０％増加している、
３：１のビーズ：Ｔ細胞の比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを用いて共刺激した後の、ＩＬ－４の少なくとも５ｐｇ／ｍＬ／１×１０^６細胞／日の分泌、
３：１のビーズ：Ｔ細胞の比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを用いて共刺激した後の、ＩＬ－２の少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ／１×１０^６細胞／日の分泌、
３：１のビーズ：Ｔ細胞の比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを用いて共刺激した後の、ＩＦＮ－γの１００ｐｇ／ｍＬ／１×１０^６細胞／日未満の分泌、
３：１のビーズ：Ｔ細胞の比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを用いて共刺激した後の、ＧＭ－ＣＳＦの１００ｐｇ／ｍＬ／１×１０^６細胞／日未満の分泌、
３：１のビーズ：Ｔ細胞の比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを用いて共刺激した後の、ＴＮＦ－αの１０ｐｇ／ｍＬ／１×１０^６細胞／日未満の分泌、
３：１のビーズ：Ｔ細胞比での抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズとの共刺激後のＩＬ－１７の１０ｐｇ／ｍＬ／１×１０^６細胞／日未満の分泌、および
それらの組み合わせ、のうちの１つ以上を有する、ＴＲＥＧまたはＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞の集団。
５９．以下の特性：
対照Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞と比較して、フローサイトメトリーによって測定されるＣＤ２５、ＣＤ２７、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＩＣＯＳ、ＬＡＩＲ１、ＯＸＯ４０、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上の発現が、少なくとも１０％増加している、
対照Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞と比較して少なくとも１０％減少したＩＦＮ－γの分泌、
対照Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞と比較して少なくとも１０％減少したＴＮＦ－αの分泌、
対照Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞と比較して少なくとも１０％減少したＴＢＥＴの発現、
対照Ｔｈ１／Ｔｃ１細胞と比較して少なくとも１０％増加したＦＯＸＰ３の発現、
３：１のビーズ：Ｔ細胞の比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを用いて共刺激した後の、ＩＬ－４の少なくとも５ｐｇ／ｍＬ／１×１０^６細胞／日の分泌、
３：１のビーズ：Ｔ細胞の比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを用いて共刺激した後の、ＩＬ－２の少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ／１×１０^６細胞／日の分泌、
３：１のビーズ：Ｔ細胞の比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを用いて共刺激した後の、ＩＦＮ－γの１００ｐｇ／ｍＬ／１×１０^６細胞／日未満の分泌、
３：１のビーズ：Ｔ細胞の比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを用いて共刺激した後の、ＧＭ－ＣＳＦの１００ｐｇ／ｍＬ／１×１０^６細胞／日未満の分泌、
３：１のビーズ：Ｔ細胞の比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを用いて共刺激した後の、ＴＮＦ－αの１０ｐｇ／ｍＬ／１×１０^６細胞／日未満の分泌、
３：１のビーズ：Ｔ細胞比での抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズとの共刺激後のＩＬ－１７の１０ｐｇ／ｍＬ／１×１０^６細胞／日未満の分泌、
ＧＡＴＡ３、ＦＯＸＰ３、ＣＤ７３、およびＣＤ１０３の発現、ならびに
それらの組み合わせ、のうちの１つ以上を有する、ＴＲＥＧまたはＴＲＥＧ／Ｔｈ２細胞。
６０．脱分化Ｔ細胞が、以下の特性：
テムシロリムス、ビタミンＤ、およびＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含まない同じ条件下でインキュベートされた対照Ｔ細胞集団と比較して、グランザイムＢ、ＩＬ－１０、およびＩＦＮ－γのうちの１つ以上のｍＲＮＡ発現が少なくとも１０％減少し、より好ましくは５０％減少している、
テムシロリムス、ビタミンＤ、およびＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含まない同じ条件下でインキュベートされた対照Ｔ細胞集団と比較して、Ｎａｎｏｇ、ＫＬＦ４、ＫＬＦ１０、およびＣＤ１２７のうちの１つ以上のｍＲＮＡ発現が少なくとも１０％増加し、より好ましくは５０％増加している、
テムシロリムス、ビタミンＤ、およびＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含まない同じ条件下でインキュベートされた対照Ｔ細胞集団と比較して、Ｔ－Ｂｅｔ およびＳＴＡＴ１のうちの１つ以上のｍＲＮＡ発現が少なくとも１０％減少し、より好ましくは５０％減少している、
テムシロリムス、ビタミンＤ、およびＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含まない同じ条件下でインキュベートされた対照Ｔ細胞集団の約２０％以内のＨＩＦ－１－α発現、
テムシロリムス、ビタミンＤ、およびＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含まない同じ条件下でインキュベートされた対照Ｔ細胞集団と比較して、ｐ６２発現が少なくとも１０％増加し、より好ましくは５０％増加している、
テムシロリムス、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤およびビタミンＤを含まない細胞の培養入力集団と同じ条件下で製造されたＴ細胞の対照集団と比較して、ＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲの発現レベルが少なくとも５０％、より好ましくは９０％低減されている、
ハウスキーピングタンパク質によって正規化されたＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲの発現レベルが、テムシロリムス、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤およびビタミンＤを含まない細胞の培養入力集団と同じ条件下で製造されたＴ細胞の対照集団と比較して、少なくとも５０％、より好ましくは９０％低減されている、ならびに
それらの組み合わせ、のうちの１つ以上を有する、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。
６１．脱分化Ｔ細胞が、以下の特性：
テムシロリムス、ビタミンＤ、およびＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含まない同じ条件下でインキュベートされた対照Ｔ細胞と比較して、グランザイムＢ、ＩＬ－１０、およびＩＦＮ－γのうちの１つ以上のｍＲＮＡ発現が少なくとも１０％減少し、より好ましくは５０％減少している、
テムシロリムス、ビタミンＤ、およびＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含まない同じ条件下でインキュベートされた対照Ｔ細胞と比較して、Ｎａｎｏｇ、ＫＬＦ４、ＫＬＦ１０、およびＣＤ１２７のうちの１つ以上のｍＲＮＡ発現が少なくとも１０％増加し、より好ましくは５０％増加している、
テムシロリムス、ビタミンＤ、およびＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含まない同じ条件下でインキュベートされた対照Ｔ細胞と比較して、Ｔ－Ｂｅｔ およびＳＴＡＴ１のうちの１つ以上のｍＲＮＡ発現が少なくとも１０％減少し、より好ましくは５０％減少している、
テムシロリムス、ビタミンＤ、およびＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含まない同じ条件下でインキュベートされた対照Ｔ細胞の約２０％以内のＨＩＦ－１－α発現、
テムシロリムス、ビタミンＤ、およびＩＬ－２シグナル伝達阻害剤を含まない同じ条件下でインキュベートされた対照Ｔ細胞集団と比較して、ｐ６２発現が少なくとも１０％増加し、より好ましくは５０％増加している、
テムシロリムス、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤およびビタミンＤを含まない細胞の培養入力集団と同じ条件下で製造された対照Ｔ細胞と比較して、ＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲの発現レベルが少なくとも５０％、より好ましくは９０％低減されている、
ハウスキーピングタンパク質によって正規化されたＲＡＰＴＯＲまたはＲＩＣＴＯＲの発現レベルが、テムシロリムス、ＩＬ－２シグナル伝達阻害剤およびビタミンＤを含まない細胞の培養入力集団と同じ条件下で製造された対照Ｔ細胞と比較して、少なくとも５０％、より好ましくは９０％低減されている、ならびに
それらの組み合わせ、のうちの１つ以上を有する、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図15A】

【図15B】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図17A】

【図17B】

【図17C】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【図19A】

【図19B】

【図19C】

【図19D】

【図20A】

【図20B】

【図20C】

【図20D】

【図21A】

【図21B】

【図21C】

【図22A】

【図22B】

【図22C】

【図23A】

【図23B】

【図24-1】

【図24-2】

【図25-1】

【図25-2】

【図26A-1】

【図26A-2】

【図26B-1】

【図26B-2】

【図27A-1】

【図27A-2】

【図27B-1】

【図27B-2】

【図28A】

【図28B】

【図29-1】

【図29-2】

【図29-3】

【図30A-1】

【図30A-2】

【図30B-1】

【図30B-2】

【図31A】

【図31B】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36A】

【図36B】

【図37-1】

【図37-2】

【図38-1】

【図38-2】

【図39】

【図40A】

【図40B】

【図41-1】

【図41-2】

【図41-3】

【図42】