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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-19
(45)【発行日】2024-08-27
(54)【発明の名称】タンパク質用又は細胞用の添加剤
(51)【国際特許分類】
C12N 1/00 20060101AFI20240820BHJP
C12N 1/04 20060101ALI20240820BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240820BHJP
【ＦＩ】
C12N1/00 F
C12N1/04 ZNA
C12N15/12
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2022139117
(22)【出願日】2022-09-01
(65)【公開番号】P2023036560
(43)【公開日】2023-03-14
【審査請求日】2024-03-19
(31)【優先権主張番号】P 2021142896
(32)【優先日】2021-09-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(31)【優先権主張番号】P 2021163797
(32)【優先日】2021-10-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(31)【優先権主張番号】P 2021173568
(32)【優先日】2021-10-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】000222118
【氏名又は名称】ａｒｔｉｅｎｃｅ株式会社
(72)【発明者】
【氏名】金井 勇樹
(72)【発明者】
【氏名】田尾 文哉
(72)【発明者】
【氏名】荻原 直人
(72)【発明者】
【氏名】金丸 青里香
【審査官】鳥居 敬司
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２００２／０１６４５４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開昭６１－１１８３１３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００５－１７０８１０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００９－２３６９０６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表平０３－５０１４４６（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許第０５６３０９７８（ＵＳ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－１／３８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
アミノ酸残基含有構造単位を有するアミノ酸系重合体（Ａ）を含む、細胞培養用培地添加剤であって、
前記アミノ酸系重合体（Ａ）は、下記一般式（４）～（６）で示されるアミノ酸残基構造を有する単量体（ａ１）～（ａ３）のうち少なくともいずれかを含む単量体の共重合により得られる、細胞培養用培地添加剤。
単量体（ａ１）
【化1】
・・・一般式（４）
単量体（ａ２）
【化2】
・・・一般式（５）
単量体（ａ３）
【化3】
・・・一般式（６）
（一般式（４）～（６）中の、Ａはアミノ酸残基、ＸおよびＹは、それぞれ独立してＯまたはＮＨ、Ｒ１はアルキレン基、Ｒ２はアルキレン基、１つ以上の水素原子がヒドロキシル基で置換されたアルキレン基、フェニレン基、エステル基、エーテル基、ウレタン結合、アミド結合、またはこれらの組み合わせから構成される非イオン性の２価の基、Ｒ３はＨまたはＣＨ ３ を示す。）
但し、前記アミノ酸系重合体（Ａ）が、下記［１］又は［２］である場合を除く。
［１］少なくとも下記一般式（７）で表される単量体と下記一般式（８）で表される単量体との共重合により得られる重合体。
【化4】
（一般式（７）中、Ｒ １１ は水素原子又はメチル基を示し、Ｒ １２ は単結合又は炭素数１～５の直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示す。）
【化5】
・・・一般式（８）
（一般式（８）中、Ｒ １３ は水素原子又はメチル基を示し、Ｒ １４ は水素原子、炭素数１～１０の直鎖状、分岐状もしくは環状の、アルキル基、アルコキシル基もしくはアルキルアミノ基、アリール基、又は複素環基を示す。）
［２］下記一般式（９）の１またはそれ以上の繰返単位と、下記一般式（１０）の１またはそれ以上の繰返単位とからなる重合体。
【化6】
【化7】
（一般式（９）及び（１０）中、Ｘ（一般式（９）の繰返単位において同一であっても相異なってもよい）及びＹ（一般式（１０）の繰返単位において同一であっても相異なってもよい）は重合体の主鎖を与える炭化水素残基であり、場合により置換されており；
Ｒ １ （ｎまたはｑが２またはそれ以上の場合一般式（１０）の同一繰返単位において、または一般式（１０）の相異なる繰返単位において、同一であっても相異なってもよい）は、水素またはメチル基であり；
Ｒ ２ （ｎまたはｑが２またはそれ以上の場合一般式（１０）の同一繰返単位において、または一般式（１０）の相異なる繰返単位において、同一であっても相異なってもよい）は水素またはメチル基であり；但し、単一の単位ＣＨＲ １ ＣＨＲ ２ ＯにおけるＲ １ 及びＲ ２ の両者が同時にメチル基となり得ず；
Ｒ ３ （ｑが２またはそれ以上の場合一般式（１０）の同一繰返単位において、または一般式（１０）の相異なる繰返単位において、同一であっても相異なってもよい）は、水素、もしくは５個までの炭素原子を含む低級アルキル基、もしくは５個までの炭素原子を含むアルカン酸から誘導されたアシル基であり；
ｎは１～１０の数であり；
ｐは１～４の数であり；
ｑは１～４の数であり；
各ＣＯ ２ Ｈ基は炭化水素残基Ｘに１個または複数の中介結合Ｌを経て結合され、そしてｐが２～４の場合にはＸの同一または相異なる炭素原子にＬにより結合されてよく；
Ｌは１またはそれ以上の中介結合を表わし、そしてＬは一般式（９）の繰返単位において同一であっても相異なっていてもよく、１またはそれ以上の直接結合、及びＣＯ ２ Ｈ基をＸと結合させるために各々１またはそれ以上の原子からなる鎖を与える１またはそれ以上の原子団、から選択され、但し２個よりも多くのＣＯ ２ Ｈ基はＸ中の同一炭素原子に直接に結合され得ず；
各（ＣＨＲ １ ＣＨＲ ２ Ｏ）ｎ基は炭化水素残基Ｙに１個または複数の中介結合Ｍを経て結合され、そしてｑが２～４の場合にはＹの同一または相異なる炭素原子にＭにより結合されてよく；
Ｍは１またはそれ以上の中介結合を表わし、そしてＭは一般式（１０）の繰返単位において同一であっても相異なっていてもよく、１またはそれ以上の直接結合、及び（ＣＨＲ １ ＣＨＲ ２ Ｏ）ｎ基をＹと結合させるために各々１またはそれ以上の原子からなる鎖を与える１またはそれ以上の原子団、から選択され、但し２個よりも多くのＣＨＲ １ ＣＨＲ ２ Ｏ基はＹ中の同一炭素原子に直接に結合され得ず；
－（ＣＯ ２ Ｈ基の数）：（－ＣＨＲ １ ＣＨＲ ２ Ｏ－基の数）の比は１：２０ないし２０：１の範囲内である）
【請求項2】
アミノ酸系重合体（Ａ）の質量平均分子量が２，０００以上である、請求項１記載の細胞培養用培地添加剤。
【請求項3】
アミノ酸系重合体（Ａ）の濃度が２０．０ｗ／ｖ％である水溶液において測定した不凍水の量が、前記重合体（Ａ）１ｇあたり２００ｍｇ以上である、請求項１または２に記載の細胞培養用培地添加剤。但し、上記不凍水の量は、下記の方法によって測定される。
装置：示差走査熱量計（ＤＳＣ装置；株式会社日立ハイテクサイエンスＤＳＣ６２００）
測定条件：窒素流量５０ｍＬ／分、昇温速度５℃／分
温度プログラム：（ｉ）室温から－１００℃まで冷却、（ｉｉ）－１００℃で５分間保持、（ｉｉｉ）－１００℃から３０℃まで加熱
測定方法：上記（ｉｉｉ）の過程での吸発熱量の測定を行った。
各試料について、ＤＳＣ測定後にアルミパンにピンホールをあけて真空乾燥後、その重量を測定し、重量減少分を含水量とした。
サンプル毎に、０℃付近の吸熱量から、重合体に拘束されていない自由水の量を求め、－４０℃付近における発熱量と－２０℃以上の氷点下における吸熱量から中間水の量を求め、上記で求めた各サンプルの含水量（Ｗ１－Ｗ０）（（Ｗ０：試料の乾燥重量（ｇ）、Ｗ１：試料の含水重量（ｇ））から自由水及び中間水の量を差し引いた量を不凍水の量として求めた。アミノ酸系重合体（Ａ）１ｇあたりの不凍水の量は、求められた不凍水の量を試料の乾燥重量（Ｗ０）で除することにより求めた。
【請求項4】
アミノ酸系重合体（Ａ）が、アミノ酸系重合体（Ａ）を構成する構造単位の合計１００質量％に対して、一般式（４）～（６）で示されるアミノ酸残基構造を有する単量体（ａ１）～（ａ３）に由来する少なくともいずれかの構造単位を３０～１００質量％含む、請求項１または２に記載の細胞培養用培地添加剤。
【請求項5】
請求項１または２に記載の細胞培養用培地添加剤を含む、細胞培養用培地。
【請求項6】
アミノ酸系重合体（Ａ）の培地中の濃度が０．００１～１質量％である、請求項５に記載の細胞培養用培地。
【請求項7】
請求項５に記載の細胞培養用培地中で細胞を培養する、スフェロイドまたは生理活性物質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、タンパク質用又は細胞用の添加剤に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、動物細胞を大量培養することにより、モノクローナル抗体をはじめ有用な生理活性物質（ホルモン、神経伝達物質、サイトカイン、ビタミンやミネラル、酵素、核酸など）を工業的に量産することが非常に多くなってきている。その際には増殖因子として、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）などの動物血清が頻繁に使用される。具体的にはＲＰＭ１１６４０、イーグルＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓＦ１２などの合成基礎培地に１０～２０体積％程度のウシ胎児血清（ＦＢＳ）などの動物血清を添加した培養液が一般に用いられる。
【0003】
しかしながら、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）などの動物血清は、その供給に制限があり、一般的に高価なものである。これにより、培地のコスト上昇を招き、生理活性物質の製造コストの上昇へとつながる。また、血清由来のタンパク質を含む培養液から目的とする生理活性物質を単離することが困難になる欠点にもつながる。さらに、血清にはロット間に品質のばらつきがみられる。そこで血清の使用に先立ってロットチェックを十分に行い、使用可能な血清を選択する必要があるが、この血清の選択には多くの労力を要する。それに加え、動物由来の血清に関しては、狂牛病、ウシ海綿状脳症、感染性海綿状脳、更にはクロイツフェルト・ヤコブ病といったプリオン関連の疾患に関する問題点の他、動物由来の血清はオートクレーブなどで滅菌できないため、ウイルス又はマイコプラズマ汚染される可能性があり、感染症などのリスク（安全性面）の問題が生じる。
【0004】
上記の問題を解決すべく、血清を用いない培地（無血清培地）の検討が行われてきた。
例えば、特許文献１には、グリシルグリシンを培地に添加することで、動物細胞に高濃度に有用物質を生産させることができることが開示されている。また、特許文献２には、リン脂質類似構造を有するポリマーを含有する培地で細胞培養した場合に、生理活性物質を効率的に生産できることが開示されている。また、特許文献３には、疎水性Ｄ－アミノ酸を含有する培地が、細胞増殖を促進させ、有用物質の生産量を増大させることが開示されている。
しかし、このような血清代替物を含む培地の多くは、抗体産生細胞の増殖性、生存性および抗体生産性の面で血清含有培地に比べて十分なものとは言えない。さらに血清代替物も天然物由来のものが多く、供給制限があり、一般的に高価である。
以上のことから、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）に代わる血清代替物の開発が期待されている。
例えば、特許文献１には、グリシルグリシンを培地に添加することで、動物細胞に高濃度に有用物質を生産させることができることが開示されている。また、特許文献２には、リン脂質類似構造を有するポリマーを含有する培地で細胞培養した場合に、生理活性物質を効率的に生産できることが開示されている。また、特許文献３には、疎水性Ｄ－アミノ酸を含有する培地が、細胞増殖を促進させ、有用物質の生産量を増大させることが開示されている。
しかし、このような血清代替物を含む培地の多くは、抗体産生細胞の増殖性、生存性および抗体生産性の面で血清含有培地に比べて十分なものとは言えない。さらに血清代替物も天然物由来のものが多く、供給制限があり、一般的に高価である。
以上のことから、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）に代わる血清代替物の開発が期待されている。
【0005】
また、近年バイオテクノロジーの発達とともに、生物の遺伝子資源の確保が重要にとなり、動物、植物、微生物等の細胞や組織を永久的に保存することが必要とされるようになった。従来、動物細胞を凍結保存する場合、下記の課題が挙げられる。
多くの動物細胞を長期間良好な状態で保存するには、―１３０℃以下で（水のガラス化温度以下）の凍結保存が必要とされており、温度上昇した場合は細胞の機能低下を招く。そのため、凍結細胞を輸送する際は冷却手段として液体窒素を利用した極低温輸送の形態が採用されているがコストが高い問題がある。そこで、細胞を機能低下せずに低コストで長時間輸送が可能な細胞保存液の開発が望まれている。例えば、特許文献４には、間葉系幹細胞を、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む凍結保存液を用いて凍結し、この凍結細胞を―８０℃で保存しても、解凍後の生存及び増殖能が維持できることが記載されている。この方法を用いることで、間葉系幹細胞を機能低下させずにドライアイス輸送が可能である。しかし、この凍害保護液には、血清アルブミンまたは血清が含まれることが多かった。血清の構成成分は、未だ完全に解明されておらず、その上、凍結保存中に動物細胞に何らかの変異を促す病原体ウイルス等が存在するリスクもある。また、平成２５年６月に、欧州医薬品庁の医薬品安全監視リスク評価委員会より、製剤の安全性に関する問題が示された海外臨床試験の結果を根拠としてＨＥＳ製剤の販売承認停止勧告が発表されている。よって、血清を使用することなく長時間の輸送が可能な凍結保存液が求められていた。
多くの動物細胞を長期間良好な状態で保存するには、―１３０℃以下で（水のガラス化温度以下）の凍結保存が必要とされており、温度上昇した場合は細胞の機能低下を招く。そのため、凍結細胞を輸送する際は冷却手段として液体窒素を利用した極低温輸送の形態が採用されているがコストが高い問題がある。そこで、細胞を機能低下せずに低コストで長時間輸送が可能な細胞保存液の開発が望まれている。例えば、特許文献４には、間葉系幹細胞を、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む凍結保存液を用いて凍結し、この凍結細胞を―８０℃で保存しても、解凍後の生存及び増殖能が維持できることが記載されている。この方法を用いることで、間葉系幹細胞を機能低下させずにドライアイス輸送が可能である。しかし、この凍害保護液には、血清アルブミンまたは血清が含まれることが多かった。血清の構成成分は、未だ完全に解明されておらず、その上、凍結保存中に動物細胞に何らかの変異を促す病原体ウイルス等が存在するリスクもある。また、平成２５年６月に、欧州医薬品庁の医薬品安全監視リスク評価委員会より、製剤の安全性に関する問題が示された海外臨床試験の結果を根拠としてＨＥＳ製剤の販売承認停止勧告が発表されている。よって、血清を使用することなく長時間の輸送が可能な凍結保存液が求められていた。
【0006】
細胞凍結保存には、ＤＭＳＯ、グリセリン、エチレングリコール（ＥＧ）、プロピレングリコール（ＰＧ）を含む低分子溶剤が使用されている。これらは、細胞の凍結時に、氷晶が細胞内にできることを防ぐために効果的だと考えられ、また、細胞膜透過性であり、細胞の脱水を促進させることによって、氷の結晶速度を遅らせ、氷晶形成を阻害する。しかし、ＤＭＳＯを含む場合は、細胞毒性を低減するために、解凍した細胞を洗浄するなどの処理が必要であった（特許文献７）。また特に、ＤＭＳＯを使用することで、多能性幹細胞であるＯｃｔ－４の遺伝子発現量が低下したことが報告されている。（非特許文献２）
【0007】
近年は細胞を３次元培養し、様々な形態の細胞スフェロイド（３次元培養した細胞凝集物）を形成することに注目が集まっている。３次元培養したスフェロイドでは、平面培養した細胞とは異なる機能を発揮することが知られている。細胞スフェロイドは、生体により近い細胞環境にあり、生体内の細胞機能を発揮できると考えられていることから、細胞スフェロイドを用いた解析や、スフェロイドの応用技術について活発に研究が行われている。スフェロイドでは細胞―細胞がギャップジャンクションにより連結されており、内部の細胞まで凍結保護物質が均一に拡散しにくく、スフェロイド内部と周辺部で凍結に時間差が起きてしまう。これにより、細胞間接着のねじれや破壊等を生じ、単一細胞を凍結するときに比べ複雑な要素が絡みあうことにより、スフェロイドの凍結効率の低下が懸念されている。実際に、１０ｖ／ｖ％ＤＭＳＯを含有する凍結保護剤中で、ヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞コロニー（２次元培養した細胞凝集物）を分散し、単一細胞と同様条件で緩慢凍結を行うと、解凍後の生存率が非常に低いことが報告されている（非特許文献２）。
【0008】
また、特許文献７では、ポリアミノ酸であるポリリジンのアミン基を無水コハク酸で変性したポリマーを細胞凍結保存剤として、プロピレングリコールと併用し、解凍後の生存効率を示した。更には、ヒト間葉系幹細胞やヒト脂肪由来幹細胞の未分化性を維持することが報告されている。これは、ポリリジンが、アミン基により細胞膜親和性を持ち、細胞の保護効果を果たすことに加え、カルボキシル基のマイナス電荷が細胞膜との親和性を低減されるため、細胞膜に対して非常に弱い相互作用を示し、毒性を与えずに細胞膜保護による凍害防御効果を示すことが要因と考えられる。しかし、特許文献７のポリリジンの合成プロセスが複雑であり、工業化の観点ではコストがかかるという問題があった。
【0009】
更に、幹細胞の中でもＥＳ細胞やｉＰＳ細胞は、培地成分やストレスなどによって容易に未分化状態を逸脱して分化してしまう。凍結保存液に含まれるＤＭＳＯもこのような分化因子として働くことが懸念されている。ＤＭＳＯを含まない比較データは開示されていないものの、例えば、１０ｖ／ｖ％ＤＭＳＯを凍結保存液として用いた例で凍結保存後の未分化マーカー遺伝子の発現低下が報告されている（非特許文献２）。そこで、低分子溶剤の低減により、低毒性の細胞保存液の開発も望まれる。
【0010】
このような３次元培養した細胞凝集物の凍結方法として、体性細胞に比べる大きいマウス受精卵のガラス法（ＥＧ１５ｖ／ｖ％、ＤＭＳＯ１０ｖ／ｖ％、スクロース０．５Ｍを用いて、細胞の内部を脱水置換し、一気に液体窒素温度に低下することで細胞全体をガラス化させ固定させる手法）を改良したガラス法が開発された（非特許文献３）。しかし、この手法では、ガラス液が、ＤＭＳＯ／アセトアミド／ＰＧ＝２／１／３[Ｍ］の混合液であり、非常に濃厚で浸透圧の高い溶液であった。そのため、細胞を懸濁して１５秒や３０秒で液体窒素に浸漬する必要があり、1分放置するだけでほとんどの細胞は死滅してしまう。また、解凍時にガラス化していた水が再結晶化を起こす危険性があるため、解凍をできるだけ急激に行う必要があり、操作が煩雑である。さらに、その輸送容器（液体窒素を細孔に閉じ込めた金属容器）は非常に大きく、輸送費が高額になる問題もある。その上、ガラス法により、一個ずつのコロニーや受精卵を凍結することは可能であったが、大量の細胞凝集物の凍結には不向きであった。そこで、より簡易で効率の高い凍結方法の開発が期待されている。
【0011】
一方で、従来、細胞凍結保存液には糖類と低分子溶剤の併用が多く提案されている。例えば、グリセリン２０～７０ｗ／ｖ％及びショ糖(スクロース)１０～７０ｗ／ｖ％及び所望により多価アルコール５～１０ｗ／ｖ％を含有する水溶液からなる凍害防御液を使用した植物細胞の凍結保存方法（特許文献５）、ＥＧ、Ｄ―ＭＥＭ、アルブミン、糖類を併用した凍結保存液を使用した幹細胞の凍結保存方法（特許文献６）等が報告されている。しかし、特許文献５、６に記載の方法では、植物または幹細胞のような特定細胞にしか適用できず、上記の課題を全て解決することができなかった。
【0012】
また、モノクローナル抗体をはじめとする生理活性物質はタンパク質であり、その安定性に課題がある。タンパク質はポリペプチド鎖内のファンデルワールス相互作用、水素結合、静電的相互作用などの非共有結合性の弱い極性相互作用によって高次構造が維持されており、このような高次構造により様々な機能が発現されている。これらの結合は外的なさまざまな要因（温度、ｐＨ、塩濃度、タンパク質自身の濃度、界面活性剤、変性剤、二価金属、プロテアーゼの共存）によって変化し、場合によってはタンパク質の構造が壊れて本来の機能が失われた状態となる。そのため、タンパク質の安定性は機能的な高次構造を維持する能力と言い換えることができる。
【0013】
このような理由からタンパク質を水溶液中で安定化させる必要があり、緩衝溶液中で常に所定の温度にして保存するなど保管条件の最適化や、安定化剤（アルブミンなど他のタンパク質、グリセロース・ポリエチレングリコール・スクロースなどの多価アルコール、グルタミン酸・リジンなどのアミノ酸、グルタチオン・ジチオトレイトールなどの還元剤、ＥＤＴＡなどの金属キレート剤、クエン酸などの有機酸塩、重金属塩、基質、補酵素）を単独又は併用しての使用が検討されている（非特許文献４）。
【0014】
特に合成化合物の安定化剤としては、例えば、特許文献８にはホスホリルコリン基を有する重合体、特許文献９にはポリエチレングリコール部位を有する高分子化合物、特許文献３には低分子アミンオキシド化合物、特許文献１１及び特許文献１２には両性イオンポリマー、を使用する方法が開示されている。
しかし、これらの方法はタンパク質の種類によっては、保持率や安定期間が満足できるものではない場合があり、更なる改良が求められている。
しかし、これらの方法はタンパク質の種類によっては、保持率や安定期間が満足できるものではない場合があり、更なる改良が求められている。
【0015】
また、生化学分析の分野では、抗原抗体反応による特異吸着を利用し、ＤＮＡやタンパク質を検出し可視化する方法が、サザンブロッティング法、ウエスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、免疫染色法等として広く知られている。抗体は、標的タンパク質以外とも非特異的な吸着反応を起こす。このような非特異的吸着を防ぐために、検出・測定対象表面を、非特異的な吸着は防ぐけれど特異的吸着は妨げないようなブロッキング剤を覆うような前処理が行われる。
【0016】
ブロッキング剤としては、正常血清、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、スキムミルクのような生体由来のタンパク質が知られている（特許文献１３、非特許文献５）。
また、ブロッキング剤としては、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０と称される界面活性剤、ヒドロキシアルキルセルロース、ポリビニルアルコール、（メタ）アクリロイルモルホリンとその他のモノマーとの共重合体なども知られている（特許文献１４、１５、１６）。
また、ホスホリルコリン基を側鎖に有する共重合体を用いたブロッキング剤も検討されている（特許文献１７、非特許文献６）。
また、ブロッキング剤としては、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０と称される界面活性剤、ヒドロキシアルキルセルロース、ポリビニルアルコール、（メタ）アクリロイルモルホリンとその他のモノマーとの共重合体なども知られている（特許文献１４、１５、１６）。
また、ホスホリルコリン基を側鎖に有する共重合体を用いたブロッキング剤も検討されている（特許文献１７、非特許文献６）。
【0017】
しかし、特許文献１３や非特許文献５に開示されるような生体由来のタンパク質は、強いブロッキング作用がある一方で、抗原抗体反応の阻害作用があるなど性能にばらつきが生じやすいという潜在的な課題を有している。ところで、ブロッキング剤には、染色の標的であるタンパク質に染色剤が特異吸着し、発色する際、その発色を妨げないと共に、標的以外のタンパク質を覆い、標的以外のタンパク質には染色剤が吸着せずに発色しないことが求められる。しかし、特許文献１４～１６に開示される界面活性剤等は、標的のタンパク質に対する染色剤の特異吸着による発色を妨げたり、標的以外のタンパク質を十分には覆えず、標的以外のタンパク質にも染色剤が吸着し、発色してしまったりするなどの課題を有している。さらに、特許文献１７に開示される共重合体は、原料のモノマー合成時に複数の反応やそれに伴う精製が必要であるなど生産性に問題を有していた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0018】
【文献】特開平７－２３７８０号公報
【文献】特開平４－３０４８８２号公報
【文献】特開２０１５－０２７２６５号公報
【文献】特開２０２０―３９３２６
【文献】特開平６―２９２５６４
【文献】特開２０１９―１５４３２９
【文献】特開２０１１－３０５５７
【文献】特開平１０－４５７９４号公報
【文献】特開平１０－２３７０９４号公報
【文献】特表２００７－５０９１６４号公報
【文献】国際公開第２０１９－１３１７５７号
【文献】特開２０２１－３０２０号公報
【文献】国際公開第２０１６／０５２６９０号
【文献】特開２００４－２１９１１１号公報
【文献】特開平０４－０１９５６１号公報
【文献】特開２００８－２０９１１４号公報
【文献】特開平７－０８３９２３号公報
【非特許文献】
【0019】
【文献】Ｋａｔｋｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ, ２００６, ５３（２）．１９４－２０５
【文献】Ｎｉｓｈｉｇａｋｉ Ｔ, Ｔｅｒａｍｕｒａ Ｙ, ＳｕｅｍｏｒｉＨ，Ｉｗａｔａ Ｈ, Ｃｒｙｏｂｉｌｏｇｙ ２０１０；６：１５９－１６４
【文献】Ｆｕｊｉｏｋａ Ｔ, Ｙａｓｕｃｈｉｋａ Ｋ, Ｎａｋａｍｕｒａ Ｙ, Ｎａｋａｔｓｕｊｉ Ｎ, Ｓｕｅｍｏｒｉ Ｈ, Ｉｎｔ. Ｊ. Ｄｅｖ. Ｂｉｏｌ. ２００４, ４８： １１４９－１１５４
【文献】新生化学実験講座１ タンパク質Ｉ 分離・精製・性質 １６章
【文献】「渡辺・中根 酵素抗体法」学際企画株式会社刊 ２００２年
【文献】高分子論文集 第３５巻 ７号 ４２３（１９７８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0020】
本発明の課題は、優れた添加剤を提供することにある。
【0021】
また、本発明の課題は、タンパク質の機能を損なうことなく安定保管が可能な、タンパク質安定化剤を提供することにある。また、該タンパク質安定化剤を用いたタンパク質の安定化方法を提供することにある。
【0022】
また、本発明の課題は、抗原抗体反応を利用した免疫染色および免疫測定において、非特異反応を防止し、かつ測定の妨げとならない優れたブロッキング効果を示すものであって、かつ、検出感度を向上させ、しかも性能にばらつき差が生じにくい、ブロッキング剤を提供することを目的とする。また、該ブロッキング剤を用いた免疫染色方法および免疫測定方法を提供することにある。
【0023】
また、本発明の課題は、血清を使用することなく、動物細胞培養時における生理活性物質の高産生化に適した細胞用培地添加剤を提供することにある。さらに、本発明は、該細胞用培地添加剤を含有する培地を用いた生理活性物質の製造方法も提供する。
【0024】
また、本発明は血清を使用することなく、細胞毒性が低く、細胞凝集物の凍結にも利用可能な凍結保存液、および簡易で効率の高い細胞の凍結保存方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0025】
〔１〕タンパク質用又は細胞用の添加剤であって、アミノ酸残基含有構造単位を有するアミノ酸系重合体（Ａ）を含む、添加剤。
〔２〕アミノ酸系重合体（Ａ）の質量平均分子量が２，０００以上である、請求項１記載の添加剤。
〔３〕アミノ酸系重合体（Ａ）の濃度が２０．０ｗ／ｖ％である水溶液において測定した不凍水の量が、前記重合体１ｇあたり２００ｍｇ以上である、〔１〕または〔２〕に記載の添加剤。
〔４〕アミノ酸系重合体（Ａ）が、下記一般式（１）～（３）で示される少なくともいずれかの構造単位を有する、〔１〕または〔２〕に記載の添加剤。
・・・一般式（１）
・・・一般式（２）
・・・一般式（３）
(一般式（１）～（３）中の、Ａはアミノ酸残基、ＸおよびＹは、それぞれ独立してＯまたはＮＨ、Ｒ１はアルキレン基、Ｒ２はアルキレン基、１つ以上の水素原子がヒドロキシル基で置換されたアルキレン基、フェニレン基、エステル基、エーテル基、ウレタン結合、アミド結合、またはこれらの組み合わせから構成される非イオン性の２価の基を示す。)
〔５〕アミノ酸系重合体（Ａ）が、アミノ酸系重合体（Ａ）を構成する構造単位の合計１００質量％に対して、一般式（１）～（３）で示される少なくともいずれかの構造単位を３０～１００質量％含む、〔１〕または〔２〕に記載の添加剤。
〔６〕タンパク質安定化剤またはブロッキング剤である、〔１〕または〔２〕に記載の添加剤。
〔７〕アミノ酸系重合体（Ａ）の濃度が、０．０１～３０．０ｗ／ｖ％である、〔６〕に記載の添加剤。
〔８〕〔６〕に記載のタンパク質安定化剤と、タンパク質とを共存させる、タンパク質の安定化方法。
〔９〕抗原または抗体を含む担体に〔６〕に記載のブロッキング剤を処理する工程を含む、免疫測定方法。
〔１０〕担体がラテックス粒子である、〔９〕に記載の免疫測定方法。
〔１１〕〔６〕に記載のブロッキング剤で一部または全部が被覆された、標的物質に対する抗原または抗体を含む担体。
〔１２〕〔７〕に記載の担体を備えた、免疫測定のためのキット。
〔１３〕〔１〕または〔２〕に記載の添加剤を含む、細胞用培地。
〔１４〕アミノ酸系重合体（Ａ）の培地中の濃度が０．００１～１質量％である、〔１３〕に記載の細胞用培地。
〔１５〕〔１３〕に記載の細胞用培地中で細胞を培養する、スフェロイドまたは生理活性物質の製造方法。
〔１６〕細胞凍結保護剤である、〔１〕または〔２〕に記載の添加剤。
〔１７〕〔１６〕に記載の細胞凍結保護剤を含む、細胞凍結保存液。
〔１８〕さらに低分子溶剤を含み、浸透圧は５００～２５００ｍＯｓｍ／ｋｇである、〔１７〕に記載の細胞凍結保存液。
〔１９〕アミノ酸系重合体（Ａ）の濃度は、０．１～３０．０ｗ／ｖ％である、〔１７〕に記載の細胞凍結保存液。
〔２０〕低分子溶剤がジメチルスルホキシド、プロピレングリコール、エチレングリコールおよびグリセリンからなる群より選択された少なくとも一種であり、低分子溶剤の含有量が５．０ｗ／ｖ％以下である、〔１７〕に記載の細胞凍結保存液。
〔２１〕〔１７〕に記載の細胞凍結保存液と細胞とを混合する工程と、細胞凍結保存液と細胞との混合物を凍結する工程と、を含む、細胞の凍結方法。
〔２２〕〔１７〕に記載の細胞凍結保存液を用いて凍結された、スフェロイド。
〔２３〕〔１７〕に記載の細胞凍結保存液を用いて凍結された、オルガノイド。
〔２〕アミノ酸系重合体（Ａ）の質量平均分子量が２，０００以上である、請求項１記載の添加剤。
〔３〕アミノ酸系重合体（Ａ）の濃度が２０．０ｗ／ｖ％である水溶液において測定した不凍水の量が、前記重合体１ｇあたり２００ｍｇ以上である、〔１〕または〔２〕に記載の添加剤。
〔４〕アミノ酸系重合体（Ａ）が、下記一般式（１）～（３）で示される少なくともいずれかの構造単位を有する、〔１〕または〔２〕に記載の添加剤。
【化1】
【化2】
【化3】
(一般式（１）～（３）中の、Ａはアミノ酸残基、ＸおよびＹは、それぞれ独立してＯまたはＮＨ、Ｒ１はアルキレン基、Ｒ２はアルキレン基、１つ以上の水素原子がヒドロキシル基で置換されたアルキレン基、フェニレン基、エステル基、エーテル基、ウレタン結合、アミド結合、またはこれらの組み合わせから構成される非イオン性の２価の基を示す。)
〔５〕アミノ酸系重合体（Ａ）が、アミノ酸系重合体（Ａ）を構成する構造単位の合計１００質量％に対して、一般式（１）～（３）で示される少なくともいずれかの構造単位を３０～１００質量％含む、〔１〕または〔２〕に記載の添加剤。
〔６〕タンパク質安定化剤またはブロッキング剤である、〔１〕または〔２〕に記載の添加剤。
〔７〕アミノ酸系重合体（Ａ）の濃度が、０．０１～３０．０ｗ／ｖ％である、〔６〕に記載の添加剤。
〔８〕〔６〕に記載のタンパク質安定化剤と、タンパク質とを共存させる、タンパク質の安定化方法。
〔９〕抗原または抗体を含む担体に〔６〕に記載のブロッキング剤を処理する工程を含む、免疫測定方法。
〔１０〕担体がラテックス粒子である、〔９〕に記載の免疫測定方法。
〔１１〕〔６〕に記載のブロッキング剤で一部または全部が被覆された、標的物質に対する抗原または抗体を含む担体。
〔１２〕〔７〕に記載の担体を備えた、免疫測定のためのキット。
〔１３〕〔１〕または〔２〕に記載の添加剤を含む、細胞用培地。
〔１４〕アミノ酸系重合体（Ａ）の培地中の濃度が０．００１～１質量％である、〔１３〕に記載の細胞用培地。
〔１５〕〔１３〕に記載の細胞用培地中で細胞を培養する、スフェロイドまたは生理活性物質の製造方法。
〔１６〕細胞凍結保護剤である、〔１〕または〔２〕に記載の添加剤。
〔１７〕〔１６〕に記載の細胞凍結保護剤を含む、細胞凍結保存液。
〔１８〕さらに低分子溶剤を含み、浸透圧は５００～２５００ｍＯｓｍ／ｋｇである、〔１７〕に記載の細胞凍結保存液。
〔１９〕アミノ酸系重合体（Ａ）の濃度は、０．１～３０．０ｗ／ｖ％である、〔１７〕に記載の細胞凍結保存液。
〔２０〕低分子溶剤がジメチルスルホキシド、プロピレングリコール、エチレングリコールおよびグリセリンからなる群より選択された少なくとも一種であり、低分子溶剤の含有量が５．０ｗ／ｖ％以下である、〔１７〕に記載の細胞凍結保存液。
〔２１〕〔１７〕に記載の細胞凍結保存液と細胞とを混合する工程と、細胞凍結保存液と細胞との混合物を凍結する工程と、を含む、細胞の凍結方法。
〔２２〕〔１７〕に記載の細胞凍結保存液を用いて凍結された、スフェロイド。
〔２３〕〔１７〕に記載の細胞凍結保存液を用いて凍結された、オルガノイド。
【発明の効果】
【0026】
本発明により、優れた添加剤を提供することができる。
【0027】
本発明の添加剤を利用した細胞用培地添加剤は、該添加剤を細胞用培地に添加し、得られた培地を用いて、生理活性物質の産生可能な細胞を培養した際に、生理活性物質の生産量を増大させることが可能である。特にＤＮＡ量あたりの生理活性物質の産生性を高めることができる。また、本発明の細胞用培地添加剤を添加することにより、所望の生理活性物質の産生性を促進することができるため、製造コストや手間を少なくすることができる点でも有用である。例えば、抗体の場合では抗体医薬品などのバイオ医薬品の製造に関して、大量供給に大きく貢献することができる。
【0028】
本発明の添加剤を利用した細胞凍結保護剤は、血清などの動物由来成分を使用することなく、細胞毒性が低く、細胞凝集物の凍結にも利用可能な凍結保存液、および簡易で効率の高い細胞の凍結保存方法を提供することができる。
【0029】
本発明の添加剤を利用したタンパク安定化剤は、アミノ酸残基含有構造単位を有し、かつ質量平均分子量が２，０００以上であるアミノ酸系重合体を用いることで、タンパク質の機能を損なうことなく安定保管が可能な、タンパク質安定化剤を提供することできる。また、該タンパク質安定化剤とタンパク質とを共存させることで、タンパク質の機能を損なうことなく安定保管が可能な、タンパク質の安定化方法を提供することができる。
【0030】
また、本発明の添加剤を利用したブロッキング剤は、抗原抗体反応を利用した免疫測定法において、従来よりも広範囲の測定対象の場合の非特異的反応をブロッキングすることができる。すなわち、従来のブロッキング剤または方法では、目的物質の測定が阻害されるような場合であっても、アミノ酸残基含有構造単位を有し、かつ質量平均分子量が２，０００以上であるアミノ酸系重合体を用いたブロッキングによれば、十分なブロッキング効果が得られ、そのような目的とする測定が阻害されることなく実施することができる。さらに、アミノ酸系重合体は、ウシ由来成分であるＢＳＡの使用に伴うＢＳＥの発病リスク懸念もなく、生体由来特有のロットによる性能ばらつきの懸念もなく、安定して機能を発現できる。このブロッキング剤を用いることにより、感度よくウエスタンブロッティングや免疫組織染色、ＥＬＩＳＡ法、イムノクロマト法などの抗原抗体反応を利用した生化学分析を行うことが可能になる。例えば、免疫組織染色では、基材表面に固定した病理組織に、本発明の生化学分析用ブロッキング剤を接触させた後、前記病理組織中の抗原に染色用抗体を吸着させて前記抗原を検出できる。
【発明を実施するための形態】
【0031】
本発明の添加剤は、アミノ酸残基含有構造単位を有するアミノ酸系重合体（Ａ）を含むことを特徴とする。
【0032】
＜アミノ酸系重合体（Ａ）＞
【0033】
本発明において、アミノ酸系重合体（Ａ）は、アミノ酸残基含有構造単位を有する重合体であり、アミノ酸残基構造を有する単量体を含む単量体組成物の重合体であることが好ましい。アミノ酸残基構造を有する単量体としては、アミノ酸およびアミノ酸誘導体のアミノ基、カルボキシ基、ヒドロキシ基、またはその他の反応性基を介してエチレン性不飽和基を導入したエチレン性不飽和単量体が好ましい。
【0034】
アミノ酸は、Ｄ体またはＬ体、またはその混合物であるＤＬ体やラセミ体のいずれであってもよく、特に生体を構成するアミノ酸であることから、Ｌ－アミノ酸が好ましい。その中でも、生体を構成するアミノ酸であるバリン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、アルギニン、グルタミン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、システイン、トレオニン、メチオニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、グリシン、セリンからなる群より選ばれる一種以上がより好ましい。
アミノ酸誘導体としては、アミノ酸のアミノ基、カルボシキル基、またはその他の官能基のどれか１つの水素原子が別の官能基に置換されたものであり、これらの置換基を介してエチレン性不飽和基を導入することもできる。置換基としては特に限定されないが、アミノ基、カルボキシル基、水酸基等を有するアルキル基が好ましい。
アミノ酸およびアミノ酸誘導体は保護されたものでもよいが、最終的には脱保護されていることが好ましい。
アミノ酸誘導体としては、アミノ酸のアミノ基、カルボシキル基、またはその他の官能基のどれか１つの水素原子が別の官能基に置換されたものであり、これらの置換基を介してエチレン性不飽和基を導入することもできる。置換基としては特に限定されないが、アミノ基、カルボキシル基、水酸基等を有するアルキル基が好ましい。
アミノ酸およびアミノ酸誘導体は保護されたものでもよいが、最終的には脱保護されていることが好ましい。
【0035】
アミノ酸系重合体（Ａ）は、アミノ酸系重合体（Ａ）の濃度が２０ｗ／ｖ％である水溶液において測定した不凍水量が、アミノ酸系重合体１ｇあたり２００ｍｇ以上であることが好ましく、２５０ｍｇ以上であることがより好ましい。不凍水とは―１００℃以下でも凍結しない水のことであり、この量が多いほど、細胞を凍結した際に氷の結晶成長による物理的なダメージを回避できる。一定量以上の不凍水を含有することで、細胞の細胞膜外での安定な水和状態を維持し、低分子溶剤による高い浸透速度を制御し、細胞の凍結保存性を向上することができる。
【0036】
＜質量平均分子量（Ｍｗ）＞
アミノ酸系重合体（Ａ）の質量平均分子量は、２，０００以上であることが好ましく、５，０００～１００，０００であることがより好ましい。質量平均分子量が２，０００以上であることにより、タンパク質安定化剤及びブロッキング剤として用いた際に、タンパク質の標的以外への非特異吸着を抑制できる。また、細胞用添加剤として用いた際に、細胞内への取り込みを抑制できる。質量平均分子量が１００，０００以下であることにより、水溶液とすることができ、培地等への溶解性が向上する。さらに、増粘作用を低下させ、ゲル化等の不具合を防ぐことができ、ピペット操作などの取り扱いが容易になる。
アミノ酸系重合体（Ａ）の質量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって標準ポリエチレングリコール換算で計測した値を採用する。
アミノ酸系重合体（Ａ）の質量平均分子量は、２，０００以上であることが好ましく、５，０００～１００，０００であることがより好ましい。質量平均分子量が２，０００以上であることにより、タンパク質安定化剤及びブロッキング剤として用いた際に、タンパク質の標的以外への非特異吸着を抑制できる。また、細胞用添加剤として用いた際に、細胞内への取り込みを抑制できる。質量平均分子量が１００，０００以下であることにより、水溶液とすることができ、培地等への溶解性が向上する。さらに、増粘作用を低下させ、ゲル化等の不具合を防ぐことができ、ピペット操作などの取り扱いが容易になる。
アミノ酸系重合体（Ａ）の質量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって標準ポリエチレングリコール換算で計測した値を採用する。
【0037】
アミノ酸系重合体（Ａ）は、アミノ酸残基含有構造単位として、一般式（１）～（３）で示される少なくともいずれかの構造単位を側鎖に有することが好ましい。当該構造単位は、アミノ酸系重合体を構成する構造単位の合計１００質量％に対して、合計３０～１００質量％含まれることが好ましく、４０～１００質量％がより好ましく、５０～１００質量％がより好ましい。上記の範囲であることにより、細胞表面の膜タンパク質やリン脂質との相互作用が容易になり、細胞の抗体産生性をはじめとする性能をより向上させることができる。また、細胞の凍結保存性がより向上する。さらに、タンパク質と共存させた際に、好適な水溶性を発現するとともに、極性が制御され、周囲の環境を適切に制御することができ、タンパク質安定性が向上する。
・・・一般式（１）
・・・一般式（２）
・・・一般式（３）
【化4】
【化5】
【化6】
【0038】
式（１）～（３）中の、Ａはアミノ酸残基、ＸおよびＹは、それぞれ独立してＯまたはＮＨ、Ｒ１はアルキレン基、Ｒ２はアルキレン基、１つ以上の水素原子がヒドロキシル基で置換されたアルキレン基、フェニレン基、エステル基、エーテル基、ウレタン結合、アミド結合、およびこれらの組み合わせから構成される非イオン性の２価の基を示す。
【0039】
アミノ酸残基としては、前述したアミノ酸またはアミノ酸誘導体由来の構造であれば特に限定されないが、アミノ酸およびアミノ酸誘導体のアミノ基、カルボシキル基、またはその他の官能基のどれか１つの水素原子を除いた１価の基が挙げられる。
【0040】
Ｒ１のアルキレン基としては、直鎖、分岐または環状のアルキレン基が挙げられ、例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ヘキサメチレン基、オクタメチレン、１，２－シクロヘキセン基、１，３－シクロヘキセン基、１，４－シクロヘキセン基、２－メチルプロペン基等が挙げられる。好ましくは炭素数が１～６のアルキレン基である。
Ｒ２のアルキレン基としては、Ｒ１と同様のものが挙げられ、それに加え、１つ以上の水素原子がヒドロキシル基で置換されたアルキレン基も挙げられる。
Ｒ２のフェニレン基としては、オルト-フェニレン基、メタ-フェニレン基、パラ-フェニレン基が挙げられる。
Ｒ２のエステル基としては、エステル基、チオエステル基、リン酸エステル基、硫酸エステル基、硝酸エステル基、炭酸エステル等が挙げられる。
Ｒ２のエーテル基としては、エーテル結合のほか、ポリエーテル基であってもよく、エチレングリコール基、プロピレングリコール基、テトラメチレングリコール基が挙げられ、これらが２つ以上連続した構造でも構わない。
上記以外にも、Ｒ２はウレタン結合やアミド結合でもよく、これらの置換基から２種類以上の組み合わせから構成されてもよい。
Ｒ２のアルキレン基としては、Ｒ１と同様のものが挙げられ、それに加え、１つ以上の水素原子がヒドロキシル基で置換されたアルキレン基も挙げられる。
Ｒ２のフェニレン基としては、オルト-フェニレン基、メタ-フェニレン基、パラ-フェニレン基が挙げられる。
Ｒ２のエステル基としては、エステル基、チオエステル基、リン酸エステル基、硫酸エステル基、硝酸エステル基、炭酸エステル等が挙げられる。
Ｒ２のエーテル基としては、エーテル結合のほか、ポリエーテル基であってもよく、エチレングリコール基、プロピレングリコール基、テトラメチレングリコール基が挙げられ、これらが２つ以上連続した構造でも構わない。
上記以外にも、Ｒ２はウレタン結合やアミド結合でもよく、これらの置換基から２種類以上の組み合わせから構成されてもよい。
【0041】
アミノ酸系重合体は、水溶性であることが好ましく、使用するアミノ酸系単量体や他の単量体によって水溶性を適宜調整することができる。本発明において水溶性とは、２５℃のイオン交換水中９９ｇ中に樹脂を１ｇ入れて撹拌し、２５℃で２４時間放置した後、分離・析出せずに水中で樹脂が完全に溶解可能であることを指す。
【0042】
一般式（１）または（３）で示される構造単位は、アミノ酸系重合体の水溶性の調整が容易である点で好ましい。アミノ酸系重合体（Ａ）の水溶性の観点からは、一般式（２）で示される構造単位は、アミノ酸系重合体（Ａ）を構成する構造単位の合計１００質量％に対して、７５質量％以下が好ましく、５０質量％以下がより好ましい。
【0043】
アミノ酸系重合体（Ａ）は、下記一般式（４）～（６）で示されるアミノ酸残基構造を有する単量体（ａ１）～（ａ３）のうち少なくともいずれかと、必要に応じて他の単量体とを共重合することでも得ることができる。本明細書において、このような１分子中に１つのエチレン性不飽和基と、アミノ酸残基構造とを有する単量体をアミノ酸系単量体という。
単量体（ａ１）
・・・一般式（４）
単量体（ａ２）
・・・一般式（５）
単量体（ａ３）
・・・一般式（６）
単量体（ａ１）
【化7】
単量体（ａ２）
【化8】
単量体（ａ３）
【化9】
【0044】
一般式（４）～（６）中の、Ａはアミノ酸残基、ＸおよびＹは、それぞれ独立してＯまたはＮＨ、Ｒ１はアルキレン基、Ｒ２はアルキレン基、１つ以上の水素原子がヒドロキシル基で置換されたアルキレン基、フェニレン基、エステル基、エーテル基、ウレタン結合、アミド結合、またはこれらの組み合わせから構成される非イオン性の２価の基、Ｒ３はＨまたはＣＨ３を示す。
【0045】
アミノ酸系単量体（ａ１）は、例えば、アミノ酸またはアミノ酸誘導体と、一分子中にハロゲン化アルキルおよび（メタ）アクリロイル基を有する化合物とを反応させることで得られる。このようなアミノ酸系単量体（ａ１）の好ましい製造方法としては、例えば、氷冷下でアミノ酸またはアミノ酸誘導体を含む水溶液に（メタ）アクリロイルクロライドを滴下して合成することができる。保護基で保護されたアミノ酸を使用する場合は、上記の反応後、脱保護することが好ましい。
【0046】
アミノ酸系単量体（ａ２）は、例えば、アミノ酸またはアミノ酸誘導体と、１分子中にスチレン骨格とハロゲン化アルキル基を有するエチレン性不飽和単量体とを反応させることで得られる。
このようなアミノ酸系単量体（ａ２）の好ましい製造方法としては、例えば、保護アミノ酸と、必要に応じて塩基性化合物とをあらかじめプロトン性溶媒に溶解させた後、１分子中にスチレン骨格とハロゲン化アルキル基を有するエチレン性不飽和単量体を添加して反応させて保護アミノ酸系単量体を前駆体として合成する。保護アミノ酸系単量体は脱保護させて、アミノ酸系単量体にすることが好ましい。また、保護アミノ酸に代えてプロリンを使用してアミノ酸系単量体（ａ２）を得ることもできる。
１分子中にスチレン骨格とハロゲン化アルキル基を有するエチレン性不飽和単量体としては、クロロメチルスチレン、クロロエチルスチレン、クロロプロピルスチレン、クロロブチルスチレン、ブロモメチルスチレン、ブロモエチルスチレン、ブロモプロピルスチレン、ブロモブチルスチレン等が挙げられる。これらは、オルト体、メタ体、パラ体等の構造異性体を含んでいても構わない。
このようなアミノ酸系単量体（ａ２）の好ましい製造方法としては、例えば、保護アミノ酸と、必要に応じて塩基性化合物とをあらかじめプロトン性溶媒に溶解させた後、１分子中にスチレン骨格とハロゲン化アルキル基を有するエチレン性不飽和単量体を添加して反応させて保護アミノ酸系単量体を前駆体として合成する。保護アミノ酸系単量体は脱保護させて、アミノ酸系単量体にすることが好ましい。また、保護アミノ酸に代えてプロリンを使用してアミノ酸系単量体（ａ２）を得ることもできる。
１分子中にスチレン骨格とハロゲン化アルキル基を有するエチレン性不飽和単量体としては、クロロメチルスチレン、クロロエチルスチレン、クロロプロピルスチレン、クロロブチルスチレン、ブロモメチルスチレン、ブロモエチルスチレン、ブロモプロピルスチレン、ブロモブチルスチレン等が挙げられる。これらは、オルト体、メタ体、パラ体等の構造異性体を含んでいても構わない。
【0047】
アミノ酸系単量体（ａ３）は、例えば、アクリロイル基を有する２官能のエチレン性不飽和単量体のアクリロイル基にアミノ酸のアミノ基をマイケル付加反応させる事で得る事ができる。
【0048】
二官能のエチレン性不飽和単量体としては、１分子中に２つのアクリルロイル基を有するエチレン性不飽和単量体と、１分子中に１つのアクリロイル基と１つのメタクリロイル基を有するエチレン性不飽和単量体が挙げられる。
１分子中に２つのアクリロイル基を有する２官能のエチレン性不飽和単量体としては、例えば、エチレングリコールジアクリレート、ネオペンチルグリコールジアクリレート、１，６－ヘキサンジオールジアクリレート、１，９－ノナンジオールジアクリレート、トリエチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート（共栄社製、ライトアクリレート４ＥＧ－Ａ、９ＥＧ－Ａ、１４ＥＧ－Ａ）、３－メチル―１，５－ペンタンジオールジアクリレート、ポリテトラメチレングリコールジアクリレート、ジメチロールトリシクロデカンジアクリレート、２－ブチル―２－エチル―１，３－プロパンジオールジアクリレート等が挙げられる。
１分子中に２つのアクリロイル基を有する２官能のエチレン性不飽和単量体としては、例えば、エチレングリコールジアクリレート、ネオペンチルグリコールジアクリレート、１，６－ヘキサンジオールジアクリレート、１，９－ノナンジオールジアクリレート、トリエチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート（共栄社製、ライトアクリレート４ＥＧ－Ａ、９ＥＧ－Ａ、１４ＥＧ－Ａ）、３－メチル―１，５－ペンタンジオールジアクリレート、ポリテトラメチレングリコールジアクリレート、ジメチロールトリシクロデカンジアクリレート、２－ブチル―２－エチル―１，３－プロパンジオールジアクリレート等が挙げられる。
【0049】
１分子中に１つのアクリルロイル基と１つのメタクリロイル基を有するエチレン性不飽和単量体としては、例えば、メタクリロイルクロリドとヒドロキシル基含有アクリレート、もしくはアクリロイルクロリドとヒドロキシル基含有メタクリレートのエステル化反応により得られる二官能のエチレン性不飽和単量体、カルボキシル基含有アクリレートとグリシジル基含有メタクリレートもしくは、カルボキシル基含有メタクリレートとグリシジル基含有アクリレートの開環反応により得られる２官能のエチレン性不飽和単量体、イソシアネート基含有アクリレートとヒドロキシル基含有メタクリレートもしくは、イソシアネート基含有メタクリレートとヒドロキシル基含有アクリレートの付加反応により得られる２官能のエチレン性不飽和単量体などが挙げられる。
これらの２官能のエチレン性不飽和単量体は、上記の１官能のエチレン性不飽和単量体の組み合わせで、反応させて合成しても構わないし、市販品を使用しても構わない。
ヒドロキシル基含有アクリレート（ｃ－１）としては、例えば、２－ヒドロキシエチルアクリレート、２－ヒドロキシプロピルアクリレート、４－ヒドロキシブチルアクリレート、２－アクリロイロキシエチル２－ヒドロキシエチルフタル酸、ポリエチレングリコールモノアクリレート（日油製、ブレンマーＡＥ－９０Ｕ、ＡＥ－２００、ＡＥ－４００）ポリプロピレングリコールモノアクリレート（日油製、ブレンマーＡＰ－２００、ＡＰ－４００、ＡＰ－５５０、ＡＰ－８００）、ポリエチレングリコール―ポリプロピレングリコールモノアクリレート（日油製、ブレンマーＡＥＰ）、ヒドロキシルエチルアクリルアミドなどが挙げられる。
ヒドロキシル基含有メタクリレート（ｃ－２）としては、例えば、２－ヒドロキシエチルメタクリレート、２－ヒドロキシプロピルアクリレート、２－メタクリロイロキシエチル２－ヒドロキシエチルフタル酸、ポリエチレングリコールモノメタクリレート（日油製、ＰＥ－９０、ＰＥ－２００、ＰＥ－３５０）ポリエチレングリコールモノメタクリレート（ブレンマーＰＰ－１０００、ＰＰ－５００、ＰＰ－８００）ポリエチレングリコール－ポリプロピレングリコールものメタクリレート（日油製、ブレンマー５０ＰＥＰ－３００、７０ＰＥＰ－３５０Ｂ）、ヒドロキシルエチルメタクリルアミドなどが挙げられる。
カルボキシル基含有アクリレート（ｄ－１）としては、例えば、アクリル酸、２－アクリロイロキシエチルコハク酸、２－アクリロイロキシエチルフタル酸、２－アクリロイロキシエチルヘキサヒドロフタル酸等が挙げられる。
カルボキシル基含有メタクリレート（ｄ－２）としては、例えば、メタクリル酸、２－メタクリロイロキシエチルコハク酸、２－メタクリロイロキシエチルヘキサヒドロフタル酸等が挙げられる。
グリシジル基含有メタクリレート（ｅ－１）としては、例えば、グリシジルメタクリレート等が挙げられる。グリシジル基含有アクリレート（ｅ－２）としては、例えば、グリシジルアクリレート、４－ヒドロキシブチルアクリレートグリシジルエーテル等が挙げられる。
イソシアネート基含有アクリレート（ｆ－１）としては、例えば、２－イソシアナトエチルアクリレート等が挙げられる。イソシアネート基含有メタクリレート（ｆ－２）としては、例えば、2-イソシアナトエチルメタクリレート、昭和電工社製、カレンズＭＯＩ－ＥＧ等が挙げられる。
これらの２官能のエチレン性不飽和単量体は、上記の１官能のエチレン性不飽和単量体の組み合わせで、反応させて合成しても構わないし、市販品を使用しても構わない。
ヒドロキシル基含有アクリレート（ｃ－１）としては、例えば、２－ヒドロキシエチルアクリレート、２－ヒドロキシプロピルアクリレート、４－ヒドロキシブチルアクリレート、２－アクリロイロキシエチル２－ヒドロキシエチルフタル酸、ポリエチレングリコールモノアクリレート（日油製、ブレンマーＡＥ－９０Ｕ、ＡＥ－２００、ＡＥ－４００）ポリプロピレングリコールモノアクリレート（日油製、ブレンマーＡＰ－２００、ＡＰ－４００、ＡＰ－５５０、ＡＰ－８００）、ポリエチレングリコール―ポリプロピレングリコールモノアクリレート（日油製、ブレンマーＡＥＰ）、ヒドロキシルエチルアクリルアミドなどが挙げられる。
ヒドロキシル基含有メタクリレート（ｃ－２）としては、例えば、２－ヒドロキシエチルメタクリレート、２－ヒドロキシプロピルアクリレート、２－メタクリロイロキシエチル２－ヒドロキシエチルフタル酸、ポリエチレングリコールモノメタクリレート（日油製、ＰＥ－９０、ＰＥ－２００、ＰＥ－３５０）ポリエチレングリコールモノメタクリレート（ブレンマーＰＰ－１０００、ＰＰ－５００、ＰＰ－８００）ポリエチレングリコール－ポリプロピレングリコールものメタクリレート（日油製、ブレンマー５０ＰＥＰ－３００、７０ＰＥＰ－３５０Ｂ）、ヒドロキシルエチルメタクリルアミドなどが挙げられる。
カルボキシル基含有アクリレート（ｄ－１）としては、例えば、アクリル酸、２－アクリロイロキシエチルコハク酸、２－アクリロイロキシエチルフタル酸、２－アクリロイロキシエチルヘキサヒドロフタル酸等が挙げられる。
カルボキシル基含有メタクリレート（ｄ－２）としては、例えば、メタクリル酸、２－メタクリロイロキシエチルコハク酸、２－メタクリロイロキシエチルヘキサヒドロフタル酸等が挙げられる。
グリシジル基含有メタクリレート（ｅ－１）としては、例えば、グリシジルメタクリレート等が挙げられる。グリシジル基含有アクリレート（ｅ－２）としては、例えば、グリシジルアクリレート、４－ヒドロキシブチルアクリレートグリシジルエーテル等が挙げられる。
イソシアネート基含有アクリレート（ｆ－１）としては、例えば、２－イソシアナトエチルアクリレート等が挙げられる。イソシアネート基含有メタクリレート（ｆ－２）としては、例えば、2-イソシアナトエチルメタクリレート、昭和電工社製、カレンズＭＯＩ－ＥＧ等が挙げられる。
【0050】
上記で挙げた２官能のエチレン性不飽和単量体の中でも、１分子中に１つのアクリロイル基と１つのメタクリロイル基を有するエチレン性不飽和単量体である事が好ましい。２つのアクリロイル基を有するエチレン性不飽和単量体では、２つともアミノ酸が付加された副生成物も同時に生成する。したがって、一方のアクリロイル基だけにアミノ酸が付加された目的物の収率は下がってしまう。一方で、１分子中に１つのアクリロイル基と１つのメタクリロイル基を有するエチレン性不飽和単量体では、アミノ酸がアクリロイル基に対して選択的に付加するため、メタクリロイル基だけが残った目的物をより高収率で得る事ができる。
【0051】
＜単量体（ｂ）＞
アミノ酸系重合体を得る際に、アミノ酸系単量体（ａ１）～（ａ３）の他に、１分子中に１つのエチレン性不飽和基を有するその他の単量体（ｂ）を共重合させることができる。
例えば、
メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ペンチル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、２－エチルヘキシル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、オクチル（メタ）アクリレート、ノニル（メタ）アクリレート、デシル（メタ）アクリレート、ウンデシル（メタ）アクリレート、ラウリル（メタ）アクリレート、トリデシル（メタ）アクリレート、テトラデシル（メタ）アクリレート、ペンタデシル（メタ）アクリレート、ヘキサデシル（メタ）アクリレート、ヘプタデシル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート、イソステアリル（メタ）アクリレート、ベヘニル（メタ）アクリレート、イソボルニル（メタ）アクリレート等の直鎖または分岐、脂環式アルキル基含有エチレン性不飽和モノマー；
１－プロピレン、１－ブテン、１－ペンテン、１－ヘキセン、１－オクテン、１－ノネン、１－デセンなどのα－オレフィン系エチレン性不飽和モノマー；
スチレン、α－メチルスチレン、ｏ－メチルスチレン、ｐ－メチルスチレン、ｍ－メチルスチレン、ビニルナフタレン、ベンジルアクリレート、ベンジルメタクリレート、フェノキシエチルアクリレート、フェノキシエチルメタクリレート、フェノキシジエチレングリコールアクリレート、フェノキシジエチレングリコールメタクリレート、フェノキシテトラエチレングリコールアクリレート、フェノキシテトラエチレングリコールメタクリレート、フェノキシヘキサエチレングリコールアクリレート、フェノキシヘキサエチレングリコールメタクリレート、フェニルアクリレート、フェニルメタクリレート等の芳香族エチレン性不飽和単量体；
（メタ）アクリルアミド、Ｎ－メトキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ－エトキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ－プロポキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ブトキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ペントキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（メトキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－エトキシメチル－Ｎ－メトキシメチルメタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（エトキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－エトキシメチル－Ｎ－プロポキシメチルメタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（プロポキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－ブトキシメチル－Ｎ－（プロポキシメチル）メタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（ブトキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－ブトキシメチル－Ｎ－（メトキシメチル）メタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（ペントキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－メトキシメチル－Ｎ－（ペントキシメチル）メタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド等のアミド基含有エチレン性不飽和単量体；
トリフルオロエチル（メタ）アクリレート、ヘプタデカフルオロデシル（メタ）アクリレート等のフッ素化アルキル基含有エチレン性不飽和単量体；
２－ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２－ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、４－ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、４－ヒドロキシビニルベンゼン、１－エチニル－１－シクロヘキサノール、アリルアルコール等のヒドロキシル基含有エチレン性不飽和単量体；
ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリプロピレンレングリコール（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールポリテトラメチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールポリテトラメチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等のポリオキシアルキレン親水性骨格含有の不飽和モノマーが挙げられる。
その他の単量体（ｂ）は、本発明の目的を損なわない範囲で必要に応じて適宜使用でき、２種類以上を組み合わせて使用してもよい。
アミノ酸系重合体を得る際に、アミノ酸系単量体（ａ１）～（ａ３）の他に、１分子中に１つのエチレン性不飽和基を有するその他の単量体（ｂ）を共重合させることができる。
例えば、
メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ペンチル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、２－エチルヘキシル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、オクチル（メタ）アクリレート、ノニル（メタ）アクリレート、デシル（メタ）アクリレート、ウンデシル（メタ）アクリレート、ラウリル（メタ）アクリレート、トリデシル（メタ）アクリレート、テトラデシル（メタ）アクリレート、ペンタデシル（メタ）アクリレート、ヘキサデシル（メタ）アクリレート、ヘプタデシル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート、イソステアリル（メタ）アクリレート、ベヘニル（メタ）アクリレート、イソボルニル（メタ）アクリレート等の直鎖または分岐、脂環式アルキル基含有エチレン性不飽和モノマー；
１－プロピレン、１－ブテン、１－ペンテン、１－ヘキセン、１－オクテン、１－ノネン、１－デセンなどのα－オレフィン系エチレン性不飽和モノマー；
スチレン、α－メチルスチレン、ｏ－メチルスチレン、ｐ－メチルスチレン、ｍ－メチルスチレン、ビニルナフタレン、ベンジルアクリレート、ベンジルメタクリレート、フェノキシエチルアクリレート、フェノキシエチルメタクリレート、フェノキシジエチレングリコールアクリレート、フェノキシジエチレングリコールメタクリレート、フェノキシテトラエチレングリコールアクリレート、フェノキシテトラエチレングリコールメタクリレート、フェノキシヘキサエチレングリコールアクリレート、フェノキシヘキサエチレングリコールメタクリレート、フェニルアクリレート、フェニルメタクリレート等の芳香族エチレン性不飽和単量体；
（メタ）アクリルアミド、Ｎ－メトキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ－エトキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ－プロポキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ブトキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ペントキシメチル－（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（メトキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－エトキシメチル－Ｎ－メトキシメチルメタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（エトキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－エトキシメチル－Ｎ－プロポキシメチルメタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（プロポキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－ブトキシメチル－Ｎ－（プロポキシメチル）メタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（ブトキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－ブトキシメチル－Ｎ－（メトキシメチル）メタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジ（ペントキシメチル）アクリルアミド、Ｎ－メトキシメチル－Ｎ－（ペントキシメチル）メタアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノプロピルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジエチルアクリルアミド等のアミド基含有エチレン性不飽和単量体；
トリフルオロエチル（メタ）アクリレート、ヘプタデカフルオロデシル（メタ）アクリレート等のフッ素化アルキル基含有エチレン性不飽和単量体；
２－ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２－ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、４－ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、４－ヒドロキシビニルベンゼン、１－エチニル－１－シクロヘキサノール、アリルアルコール等のヒドロキシル基含有エチレン性不飽和単量体；
ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリプロピレンレングリコール（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールポリテトラメチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールポリテトラメチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等のポリオキシアルキレン親水性骨格含有の不飽和モノマーが挙げられる。
その他の単量体（ｂ）は、本発明の目的を損なわない範囲で必要に応じて適宜使用でき、２種類以上を組み合わせて使用してもよい。
【0052】
＜アミノ酸系重合体（Ａ）の製造方法＞
アミノ酸系重合体（Ａ）は、例えば、アミノ酸系単量体（ａ１）～（ａ３）と、必要に応じて１分子中に１つのエチレン性不飽和基を有するその他の単量体（ｂ）を使用して、通常の溶液重合により得られる。製造方法としては、下記の例が挙げられる。
窒素ガス導入管、コンデンサー、および撹拌機を備えた反応容器に、アミノ酸系ビニルモノマー、必要に応じてその他の単量体（ｂ）と溶剤を仕込み、窒素置換しながら７０～８０℃に昇温する。モノマー成分の濃度は、反応時間の短縮と重合時の発熱を考慮して２０～５０重量％の範囲で行なう事が好ましい。窒素置換後、開始剤を添加し、還流条件下で反応させた。反応時間は、反応率（転化率）や残留モノマー成分の低減を考慮して５～２４時間の範囲である事が好ましい。反応率（転化率）は９８％以上とすることが好ましい。反応の終了や残留モノマーの確認は、ガスクロマトグラフィーなどの一般的な分析方法で確認する事ができる。反応終了後、冷却して目的のアミノ酸系重合体を得ることができる。
アミノ酸系重合体（Ａ）は、例えば、アミノ酸系単量体（ａ１）～（ａ３）と、必要に応じて１分子中に１つのエチレン性不飽和基を有するその他の単量体（ｂ）を使用して、通常の溶液重合により得られる。製造方法としては、下記の例が挙げられる。
窒素ガス導入管、コンデンサー、および撹拌機を備えた反応容器に、アミノ酸系ビニルモノマー、必要に応じてその他の単量体（ｂ）と溶剤を仕込み、窒素置換しながら７０～８０℃に昇温する。モノマー成分の濃度は、反応時間の短縮と重合時の発熱を考慮して２０～５０重量％の範囲で行なう事が好ましい。窒素置換後、開始剤を添加し、還流条件下で反応させた。反応時間は、反応率（転化率）や残留モノマー成分の低減を考慮して５～２４時間の範囲である事が好ましい。反応率（転化率）は９８％以上とすることが好ましい。反応の終了や残留モノマーの確認は、ガスクロマトグラフィーなどの一般的な分析方法で確認する事ができる。反応終了後、冷却して目的のアミノ酸系重合体を得ることができる。
【0053】
重合開始剤としては、ラジカル重合を開始する能力を有するものであれば特に制限なく、公知の油溶性重合開始剤や水溶性重合開始剤を使用することができる。
【0054】
油溶性重合開始剤としては特に限定されず、例えば、ベンゾイルパーオキサイド、ｔｅｒｔ－ブチルパーオキシベンゾエート、ｔｅｒｔ－ブチルハイドロパーオキサイド、ｔｅｒｔ－ブチルパーオキシ（２－エチルヘキサノエート）、ｔｅｒｔ－ブチルパーオキシ－３，５，５－トリメチルヘキサノエート、ジ－ｔｅｒｔ－ブチルパーオキサイドなどの有機過酸化物；２，２’－アゾビスイソブチロニトリル、２，２’－アゾビス－２，４－ジメチルバレロニトリル、２，２’－アゾビス（４－メトキシ－２，４－ジメチルバレロニトリル）、１，１’－アゾビス－シクロヘキサン－１－カルボニトリルなどのアゾビス化合物を挙げることができる。これらは１種類または２種類以上を混合して使用することができる。
水溶性重合開始剤としては特に限定されず、例えば、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム、過酸化水素、２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオンアミジン）ジハイドロクロライドなど、従来既知のものを好適に使用することができる。
水溶性重合開始剤としては特に限定されず、例えば、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム、過酸化水素、２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオンアミジン）ジハイドロクロライドなど、従来既知のものを好適に使用することができる。
【0055】
重合時に使用する溶媒としては、アミノ酸系単量体を溶解するものであれば、任意のものを使用する事ができるが、重合後の除去を考慮すると、水、アルコール溶剤を使用する事が好ましい。また、アミノ酸系単量体を得る際に使用したアルコール溶剤は、そのまま重合工程に進む場合には、反応系から除去せずに重合時の溶剤としても使用する事も可能である。
【0056】
＜タンパク質安定化剤またはブロッキング剤＞
本発明の添加剤は、タンパク質安定化剤またはブロッキング剤としても有用である。以下に、タンパク質安定化剤及びブロッキング剤としての用途について述べる。
＜タンパク質安定化方法＞
本発明のタンパク質安定化剤と、タンパク質とを共存させることにより、タンパク質を安定に保管することができる。安定化剤とタンパク質とは、共通の溶媒に溶解又は分散させることで共存させることができる。
本発明の添加剤は、タンパク質安定化剤またはブロッキング剤としても有用である。以下に、タンパク質安定化剤及びブロッキング剤としての用途について述べる。
＜タンパク質安定化方法＞
本発明のタンパク質安定化剤と、タンパク質とを共存させることにより、タンパク質を安定に保管することができる。安定化剤とタンパク質とは、共通の溶媒に溶解又は分散させることで共存させることができる。
【0057】
安定化剤とタンパク質とを共存させる溶媒は水系の溶媒が好ましい。例えば、水やリン酸緩衝生理食塩水やトリス緩衝生理食塩水があげられる。水はメタノールやエタノール、プロピルアルコール、テトラヒドロフランなど水と混合できる有機溶剤を一部含んでもよい。
【0058】
本発明の安定化剤は、タンパク質に対して質量で１００倍共存させることが好ましく、更に好ましくは１０，０００倍共存させることである。安定化剤の添加量が十分であると、適切な安定化効果が発現できる。同じ理由から、安定化剤の含有率は溶液の全量に対して好ましくは０．０１ｗ／ｖ％以上、更に好ましくは０．１ｗ／ｖ％以上である。
【0059】
＜免疫測定方法＞
本発明のブロッキング剤を使用することで、免疫測定法において非特異的な反応を抑制することができる。本発明において、ブロッキングとは、免疫測定法において、検体中の標的物質（抗原または抗体）と該標的物質に対する抗原または抗体との抗原抗体反応以外に起因する非特異的な吸着を防止すること、また上記非特異的な吸着による担体の凝集の発生を防ぐことをいう。なお、検体中の標的物質が標的物質に対する抗原または抗体を介さずに担体に吸着すると測定値の異常が発生することがあり、それを防ぐことも含む。上記免疫測定法としては、ラテックス凝集法、ＥＬＩＳＡ法、化学発光法、免疫比濁法（ＴＩＡ）法、放射免疫測定（ＲＩＡ）、イムノクロマトグラフィー等による診断が挙げられる。
また、本発明において、ブロッキングとは、検体が病理組織であって病理組織中に含まれる抗原と前記抗原に対する抗体との抗原抗体反応以外に起因する非特異的な吸着を防止することを含む。このような免疫測定法としては、免疫染色法等が挙げられる。
本発明のブロッキング剤を使用することで、免疫測定法において非特異的な反応を抑制することができる。本発明において、ブロッキングとは、免疫測定法において、検体中の標的物質（抗原または抗体）と該標的物質に対する抗原または抗体との抗原抗体反応以外に起因する非特異的な吸着を防止すること、また上記非特異的な吸着による担体の凝集の発生を防ぐことをいう。なお、検体中の標的物質が標的物質に対する抗原または抗体を介さずに担体に吸着すると測定値の異常が発生することがあり、それを防ぐことも含む。上記免疫測定法としては、ラテックス凝集法、ＥＬＩＳＡ法、化学発光法、免疫比濁法（ＴＩＡ）法、放射免疫測定（ＲＩＡ）、イムノクロマトグラフィー等による診断が挙げられる。
また、本発明において、ブロッキングとは、検体が病理組織であって病理組織中に含まれる抗原と前記抗原に対する抗体との抗原抗体反応以外に起因する非特異的な吸着を防止することを含む。このような免疫測定法としては、免疫染色法等が挙げられる。
【0060】
検体としては、通常、血清や血漿、尿、唾液等の各種生物学的液体サンプル、糞便や食品の検体粉砕物、病理組織等が挙げられる。測定サンプルとして、ｐＨ緩衝液、タンパク質、アミノ酸等で検体を希釈した検体希釈液を用いてよい。
【0061】
担体は、該標的物質に対する抗原または抗体や、標的物質（抗原または抗体）を固定化できるものであれば特に限定されないが、ＥＬＩＳＡ用プレート、イムノクロマトグラフィー用メンブレン、ラテックス粒子、金コロイド等が挙げられる。免疫染色法の場合は検体である病理組織を固定できる基材であればよく、シャーレ等が挙げられる。また、ラテックス粒子や金コロイドの平均粒子径は、好ましくは０．０１～１μｍである。
ラテックス粒子としては、（メタ）アクリルアミド化合物、（メタ）アクリレート化合物、不飽和アルデヒド化合物、不飽和カルボン酸化合物または不飽和無水カルボン酸化合物、不飽和スルホン酸化合物、スチレン化合物等のモノマーから誘導されるポリマー粒子が挙げられる。ポリマー粒子の中でも、スチレン化合物と不飽和カルボン酸化合物との共重合体であるものが好ましい。
ラテックス粒子としては、（メタ）アクリルアミド化合物、（メタ）アクリレート化合物、不飽和アルデヒド化合物、不飽和カルボン酸化合物または不飽和無水カルボン酸化合物、不飽和スルホン酸化合物、スチレン化合物等のモノマーから誘導されるポリマー粒子が挙げられる。ポリマー粒子の中でも、スチレン化合物と不飽和カルボン酸化合物との共重合体であるものが好ましい。
【0062】
ブロッキング剤は、典型的には溶液の形態で使用される。抗原または抗体を含む担体にブロッキング剤を処理する工程としては特に限定されないが、例えば下記の方法が挙げられる。まず、担体を用意し、この担体に標的物質に対する抗原または抗体を吸着させたのち、ブロッキング剤を加えて接触させる。このとき、ブロッキング条件は、ブロッキング液を加えた状態で所定の時間保持することにより調整できる。例えば、加えられたブロッキング溶液の液温が約３７℃の場合は３０分から２時間、室温（例えば約２０℃）の場合は１時間～３時間、約４℃の場合は２時間～１２時間に保持するのが一般的な処理時間である。このような工程により、標的物質に対する抗原または抗体を含む担体の表面の一部または全部をブロッキング剤で被覆することができる。
【0063】
ブロッキング処理の後、さらに標的物質（抗原または抗体）を加えて、抗原抗体反応の特異的反応を進行させる。その後、標識を慣用の方法により測定して、免疫測定による結果を取得することができる。
【0064】
また、免疫染色法における具体的なブロッキング方法としては、例えば下記の方法が挙げられる。まず、基材表面に固定した病理組織を用意し、この組織にブロッキング剤を加えて接触させる。このとき、ブロッキング条件は、免疫測定法で記載した条件と同程度である。ブロッキング処理の後、前記病理組織中の抗原に染色用抗体を吸着させ、慣用の方法により色の濃さや染色された細胞または組織の割合などを評価する。
【0065】
ブロッキング剤の溶液の濃度は、ブロッキング剤の種類、検体及び担体の種類によって異なるが、一般に溶液の全量に対して０．０１ｗ／ｖ％～３ｗ／ｖ％で使用できる。用いる溶媒としては通常この用途に用いられる水溶性溶媒をそのまま使用でき、生理活性物質の結合処理に用いられるような溶媒、例えば水、生理食塩水、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液が挙げられる。ブロッキング剤の添加量が十分であると、適切なブロッキング効果が発現できる。ブロッキング剤の含有率は、溶液の全量に対して好ましくは０．１ｗ／ｖ％以上である。
【0066】
＜キット＞
本発明の免疫測定のためのキットは、ブロッキング剤で一部または全部が被覆された、標的物質に対する抗原または抗体を含む担体を少なくとも備えるものである。本発明のキットは、通常の免疫測定による検体中の標的物質の検出に用いるためのキットと同様にして、本発明の免疫測定方法に使用できる。
本発明の免疫測定のためのキットは、ブロッキング剤で一部または全部が被覆された、標的物質に対する抗原または抗体を含む担体を少なくとも備えるものである。本発明のキットは、通常の免疫測定による検体中の標的物質の検出に用いるためのキットと同様にして、本発明の免疫測定方法に使用できる。
【0067】
＜細胞培養用培地添加剤＞
本発明の添加剤は、細胞培養用培地添加剤としても有用である。以下に、細胞培養用培地添加剤としての用途について述べる。
本発明の添加剤は、細胞培養用培地添加剤としても有用である。以下に、細胞培養用培地添加剤としての用途について述べる。
【0068】
本発明の細胞培養用培地添加剤を含む培地で細胞を培養することで、細胞の機能を向上させることができる。特に、生理活性物質の産生の向上が期待できる。
【0069】
＜細胞用培地＞
本発明の細胞培養用培地添加剤を添加する細胞用培地としては、従来公知の細胞用培地を使用することができる、例えば、市販されている各種培地（αＭＥＭ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ／Ｆ１２など）や、これらの組み合わせが挙げられる。
本発明の細胞培養用培地添加剤を添加する細胞用培地としては、従来公知の細胞用培地を使用することができる、例えば、市販されている各種培地（αＭＥＭ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ／Ｆ１２など）や、これらの組み合わせが挙げられる。
【0070】
細胞用培地におけるアミノ酸系重合体（Ａ）の濃度は０．００１～１質量％が好ましく、０．０１～１質量％がより好ましく、０．０５～１質量％がよりさらに好ましい。
細胞用培地には、必要に応じて、各種増殖因子（上皮成長因子やインスリン様成長因子、神経成長因子、肝細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、塩基性繊維芽細胞増殖因子、トランスフェリン、ステロイドホルモン、２－メルカプトエタノールなど）や各種動物血清（ウシ胎児血清（ＦＢＳ）やウシ血清など）、血清代替物などを添加するのが好ましい。
細胞用培地には、必要に応じて、各種増殖因子（上皮成長因子やインスリン様成長因子、神経成長因子、肝細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、塩基性繊維芽細胞増殖因子、トランスフェリン、ステロイドホルモン、２－メルカプトエタノールなど）や各種動物血清（ウシ胎児血清（ＦＢＳ）やウシ血清など）、血清代替物などを添加するのが好ましい。
【0071】
＜生理活性物質の製造方法＞
本発明の細胞用培地中で細胞を培養することで、生理活性物質を高効率で生産することができる。本実施形態に係る生理活性物質の製造方法では、前述のアミノ酸系重合体（Ａ）を含む細胞用培地添加剤を含む細胞用培地を用いて、細胞を培養することを含む。
本発明の細胞用培地中で細胞を培養することで、生理活性物質を高効率で生産することができる。本実施形態に係る生理活性物質の製造方法では、前述のアミノ酸系重合体（Ａ）を含む細胞用培地添加剤を含む細胞用培地を用いて、細胞を培養することを含む。
【0072】
本実施形態に係る生理活性物質とは、例えば、抗体タンパク質（以下抗体という）やアルブミンなどである。ここで産生される抗体は特に限定されず、例えば、マウスモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体またはヒトモノクローナル抗体である。また、免疫グロブリンのクラスは特に限定されないが、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２など）である。
【0073】
＜細胞用培地で培養される細胞＞
上記細胞用培地で培養される細胞は特に限定されず、生理活性物質の生産に使用可能な細胞であればよい。特に抗体生産可能な細胞であれば、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ｒｏｄｅｎｔｍｙｅｌｏｍａ細胞、（ＳＰ２／Ｏ細胞、ＮＳＯ細胞などのマウス骨髄腫細胞など）、ハイブリドーマ、および、それらの細胞に外来遺伝子を導入した形質転換細胞が挙げられる。
上記細胞用培地で培養される細胞は特に限定されず、生理活性物質の生産に使用可能な細胞であればよい。特に抗体生産可能な細胞であれば、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ｒｏｄｅｎｔｍｙｅｌｏｍａ細胞、（ＳＰ２／Ｏ細胞、ＮＳＯ細胞などのマウス骨髄腫細胞など）、ハイブリドーマ、および、それらの細胞に外来遺伝子を導入した形質転換細胞が挙げられる。
【0074】
本発明において、培養を行う際、通常培養に用いられている容器または装置を使用することができる。例えば、マルチウェルプレート、シャーレ、培養フラスコ、スピナーフラスコ、ジャーファーメンター、ファーメンター、ローラーボトル、ホローファイバー、マイクロキャリアーなどが挙げられる。
【0075】
本実施形態における培養条件は、通常の動物細胞の培養条件でよく、例えば、５体積％ＣＯ２雰囲気下で、温度３７℃である条件とすることができる。
【0076】
培養液から細胞を採取するには、浮遊細胞の場合は、例えば、培養液を直接遠心分離機やろ過機にかけて集める。接着細胞の場合は、例えば０．２５ｗ／ｖ％トリプシン－０．０２ｗ／ｖ％ＥＤＴＡ液を添加して細胞を浮遊させた後、遠心分離やろ過により集める。
【0077】
細胞培養によって生産される生理活性物質、特に抗体は、その物質が培養液中に蓄積される場合、ろ過または遠心分離により上澄み液を得、これから採取される。また、細胞内に蓄積される物質の場合には、ろ過または遠心分離により得た細胞をホモジナイズ、超音波処理、化学薬品処理などを施し、生産物を抽出した上澄み液を得る。
【0078】
上記上澄みから抗体を分離、精製するには、公知の方法を適宜組み合わせて行う。例えば、硫安沈殿、透析、限外ろ過、電気泳動、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィなどが好ましい。
【0079】
＜細胞凍結保護剤＞
本発明の添加剤は、細胞凍結保護剤としても有用である。以下に、細胞凍結保護剤としての用途について述べる。
本発明の添加剤は、細胞凍結保護剤としても有用である。以下に、細胞凍結保護剤としての用途について述べる。
【0080】
＜細胞凍結保存液＞
本発明の細胞凍結保護剤を、例えば低分子溶剤と混合することにより、細胞凍結保存液とすることができる。細胞凍結保存液は、アミノ酸系重合体（Ａ）を含むものであり、低分子溶剤を含むことが好ましく、天然の動物由来成分を含まないことが好ましい。
また、本細胞凍結保存液は、凍結過程において、細胞が細胞膜内に脱水するのを促進させること等によって、氷晶形成を防ぐことで、細胞の生存率を向上させることができるものと考えられる。このため、該細胞保存液の浸透圧は５００～２，５００ｍＯｓｍ／ｋｇが好ましく、より好ましくは１，０００～２，５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、さらに好ましくは１，５００～２，３００ｍＯｓｍ／ｋｇである。細胞凍結保存液の浸透圧は、該細胞凍結保存液に含有されるイオンを含む全物質の濃度により定まる。細胞培養用培地の浸透圧は含まれるアミノ酸系重合体で３１０～３６０ｍＯｓｍ／ｋｇに調整することができるが、本細胞凍結保存液の浸透圧は、それ以外に糖類、アミノ酸、ビタミンなどの細胞培養用培地に含有する低分子化合物や低分子溶剤を後から添加することで適宜調整することができる。
本発明の細胞凍結保存液を用いることで、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等のコロニーや３次元培養した（幹）細胞スフェロイド等の細胞凝集物をより簡易で効率よく凍結、輸送できる。
本発明の細胞凍結保護剤を、例えば低分子溶剤と混合することにより、細胞凍結保存液とすることができる。細胞凍結保存液は、アミノ酸系重合体（Ａ）を含むものであり、低分子溶剤を含むことが好ましく、天然の動物由来成分を含まないことが好ましい。
また、本細胞凍結保存液は、凍結過程において、細胞が細胞膜内に脱水するのを促進させること等によって、氷晶形成を防ぐことで、細胞の生存率を向上させることができるものと考えられる。このため、該細胞保存液の浸透圧は５００～２，５００ｍＯｓｍ／ｋｇが好ましく、より好ましくは１，０００～２，５００ｍＯｓｍ／ｋｇ、さらに好ましくは１，５００～２，３００ｍＯｓｍ／ｋｇである。細胞凍結保存液の浸透圧は、該細胞凍結保存液に含有されるイオンを含む全物質の濃度により定まる。細胞培養用培地の浸透圧は含まれるアミノ酸系重合体で３１０～３６０ｍＯｓｍ／ｋｇに調整することができるが、本細胞凍結保存液の浸透圧は、それ以外に糖類、アミノ酸、ビタミンなどの細胞培養用培地に含有する低分子化合物や低分子溶剤を後から添加することで適宜調整することができる。
本発明の細胞凍結保存液を用いることで、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等のコロニーや３次元培養した（幹）細胞スフェロイド等の細胞凝集物をより簡易で効率よく凍結、輸送できる。
【0081】
＜凍結保存に付される細胞＞
本明細書で用いる細胞は、凍結保存に付されることがある細胞であれば特に限定されず、微生物、細菌、動物細胞、植物細胞のいずれであってもよい。ここでいう動物には、ヒトを含む哺乳類、魚類、鳥類、昆虫類等が包含される。
本発明における「動物細胞」としては、培養細胞として株化された細胞、生物組織から得られる株化されていない正常細胞、遺伝子工学的手法により得られた形質転換細胞など、いずれの形式のものであってもよい。細胞は、組織または臓器中のすべての種類の細胞などの体細胞；全能性幹細胞、多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞）、及び前駆細胞などのすべての型の幹細胞；卵母細胞；精子；および生殖細胞などの任意の型の細胞を含む。
細胞は、単離された形態または細胞含有体液、細胞コロニーや３次元培養した（幹）細胞スフェロイド、組織、臓器の形態などの単離されない細胞凝集体であってもよい。
本明細書で用いる細胞は、凍結保存に付されることがある細胞であれば特に限定されず、微生物、細菌、動物細胞、植物細胞のいずれであってもよい。ここでいう動物には、ヒトを含む哺乳類、魚類、鳥類、昆虫類等が包含される。
本発明における「動物細胞」としては、培養細胞として株化された細胞、生物組織から得られる株化されていない正常細胞、遺伝子工学的手法により得られた形質転換細胞など、いずれの形式のものであってもよい。細胞は、組織または臓器中のすべての種類の細胞などの体細胞；全能性幹細胞、多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞）、及び前駆細胞などのすべての型の幹細胞；卵母細胞；精子；および生殖細胞などの任意の型の細胞を含む。
細胞は、単離された形態または細胞含有体液、細胞コロニーや３次元培養した（幹）細胞スフェロイド、組織、臓器の形態などの単離されない細胞凝集体であってもよい。
【0082】
本発明の細胞凍結保存液に、０．１～３０．０ｗ／ｖ％のアミノ酸系重合体（Ａ）を含むことが好ましく、１．０～２０．０ｗ／ｖ％含むことがより好ましい。アミノ酸系重合体の含有量を１．０ｗ／ｖ％以上とすることで、不凍水による、充分な凍結保護効果を発揮する上で有利である。化合物の含有量を２０．０ｗ／ｖ％以下とすることで、アミノ酸系重合体が細胞凍結保護剤中に安定に分散することができる。
【0083】
＜低分子溶剤＞
本発明による細胞凍結保存液は、低分子溶剤を含むことが好ましい。低分子溶剤とは、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレングリコール（ＥＧ）、プロピレングリコール（ＰＧ）、グリセリンが挙げられる。これらは２種以上を組み合わせて使用してもよい。低分子溶剤を有することは、充分な凍結保護効果を得る上で有利である。
本発明による細胞凍結保存液中における低分子溶剤の含有量は、使用する成分の種類により適宜変更することが可能であるが、好ましくは、最終濃度が５．０ｗ／ｖ％以下となるような量である。５．０ｗ／ｖ％以下であると、細胞に対する毒性が低くなり好ましい。また、ＤＭＳＯは分化に影響を与える可能性があるため、含まないことが好ましい。
本発明による細胞凍結保存液は、低分子溶剤を含むことが好ましい。低分子溶剤とは、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレングリコール（ＥＧ）、プロピレングリコール（ＰＧ）、グリセリンが挙げられる。これらは２種以上を組み合わせて使用してもよい。低分子溶剤を有することは、充分な凍結保護効果を得る上で有利である。
本発明による細胞凍結保存液中における低分子溶剤の含有量は、使用する成分の種類により適宜変更することが可能であるが、好ましくは、最終濃度が５．０ｗ／ｖ％以下となるような量である。５．０ｗ／ｖ％以下であると、細胞に対する毒性が低くなり好ましい。また、ＤＭＳＯは分化に影響を与える可能性があるため、含まないことが好ましい。
【0084】
＜天然の動物由来成分＞
本発明の細胞凍結保存液は、天然の動物由来成分を含まないことが好ましい。天然の動物由来成分としては、例えば、アルブミン、血清、血漿及び基礎培地等が挙げられる。血清としては成牛血清、仔牛血清、新生仔牛血清、および牛胎児血清等が挙げられる。
本発明の細胞凍結保存用溶液は、天然の動物由来成分を含まないため、天然の動物由来成分のロット間での品質の違いといった問題を生じることがない上、血清に含まれる各種サイトカイン、増殖因子およびホルモン等の本来細胞保存に不必要な成分による細胞の性質の変化を回避でき、更に、由来不明な基礎培地中の成分による影響も回避できる。そのため、本発明の細胞凍結保存用溶液は、特に臨床使用において生体に安全に適用することができるという観点で、非常に有用である。しかも、後述の実施例で示されるとおり、天然の動物由来成分が含まれていなくとも細胞を良好な生存率で凍結保存することができる。
本発明の細胞凍結保存液は、天然の動物由来成分を含まないことが好ましい。天然の動物由来成分としては、例えば、アルブミン、血清、血漿及び基礎培地等が挙げられる。血清としては成牛血清、仔牛血清、新生仔牛血清、および牛胎児血清等が挙げられる。
本発明の細胞凍結保存用溶液は、天然の動物由来成分を含まないため、天然の動物由来成分のロット間での品質の違いといった問題を生じることがない上、血清に含まれる各種サイトカイン、増殖因子およびホルモン等の本来細胞保存に不必要な成分による細胞の性質の変化を回避でき、更に、由来不明な基礎培地中の成分による影響も回避できる。そのため、本発明の細胞凍結保存用溶液は、特に臨床使用において生体に安全に適用することができるという観点で、非常に有用である。しかも、後述の実施例で示されるとおり、天然の動物由来成分が含まれていなくとも細胞を良好な生存率で凍結保存することができる。
【0085】
＜細胞凍結保存液中の培地＞
本発明による細胞凍結保存液は、細胞培養用培地を含むことが好ましい。細胞培養用培地の種類は特に限定はされず、本技術的分野における当業者によって、その細胞の培養が可能である培地を適宜選択することができるが、細胞培養用培地成分は、天然の動物由来成分を含有しない動物組織培養用の基本培地の成分を用いることが好ましい。培地としては、αＭＥＭ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ／Ｆ１２等が挙げられる。また、本発明による細胞凍結保存液は、培地の含有量が高い程、低い細胞毒性を示すため、低分子溶剤、化合物以外の成分が全て培地であってもかまわない。
本発明による細胞凍結保存液は、細胞培養用培地を含むことが好ましい。細胞培養用培地の種類は特に限定はされず、本技術的分野における当業者によって、その細胞の培養が可能である培地を適宜選択することができるが、細胞培養用培地成分は、天然の動物由来成分を含有しない動物組織培養用の基本培地の成分を用いることが好ましい。培地としては、αＭＥＭ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ／Ｆ１２等が挙げられる。また、本発明による細胞凍結保存液は、培地の含有量が高い程、低い細胞毒性を示すため、低分子溶剤、化合物以外の成分が全て培地であってもかまわない。
【0086】
＜その他＞
本発明の細胞凍結保存液は、アミノ酸系重合体や低分子溶剤以外の成分を含んでもよく、その他の成分としては、細胞培養用培地等に含まれるものであれば好適に使用できる。例えば、糖類やアミノ酸、ビタミン類、抗酸化剤、微量元素等が挙げられる。
糖類としては、グルコース、スクロース等が好ましい。
ビタミン類としては、ビオチン、パントテン酸、コリン、ホラシン（葉酸）、ｍｙｏ－イノシトール、ナイアシン、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、コバラミンなどのビタミンＢ 群のビタミン類が挙げられる。
抗酸化剤としては、グルタチオン、アスコルビン酸等が挙げられる。
微量元素としては、Ａｇ+、Ａｌ３+、Ｂａ２+、Ｃｄ２+、Ｃｏ２+、Ｃｒ３+、Ｇｅ+、Ｍｎ２+、Ｍｏ６+、ＮＩ２+、Ｒｂ+、Ｓｅ４+、Ｓｉ４+、Ｓｎ２+、Ｖ５+、Ｚｒ４+、Ｂｒ-、Ｆ-、Ｉ-等が挙げられる。
上記アミノ酸、ビタミン類、抗酸化剤、微量元素などの成分は２種以上併用してもよく、また各成分はそれぞれ２種以上用いてもよい。
更に、ｐＨ調製剤等を含んでも良い。ｐＨ調整剤としては、例えば、リン酸緩衝液および炭酸緩衝液等が挙げられる。また、Ｂａｓｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ （ＢＳＳ）にリン酸緩衝液を添加しない場合には、生理食塩水を添加したものも用いることができる。このうちリン酸緩衝液を用いることが特に好ましい。ｐＨ調整剤は細胞凍結保存用溶液中のｐＨをおよそ６．５～９．０、好ましくは７．０～８．５に調整するために適宜用いることが好ましい。なお、本発明におけるリン酸緩衝液とは、塩化ナトリウム、リン酸一ナトリウム（無水）、リン酸一カリウム（無水）、リン酸二ナトリウム（無水）、リン酸三ナトリウム（無水）、塩化カリウム、及びリン酸二水素カリウム（無水）などのことをいい、特に塩化ナトリウム、リン酸一ナトリウム（無水）、塩化カリウム、またはリン酸二水素カリウム（無水）を用いることが好ましい。また、リン酸二水素カリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、およびリン酸水素二ナトリウムの組み合わせも好ましい。ｐＨ調整剤は細胞保存液中に０．０１～１．０ｗ／ｖ％含まれることが好ましく、０．０５～０．５ｗ／ｖ％含まれることがより好ましい。
本発明の細胞凍結保存液は、アミノ酸系重合体や低分子溶剤以外の成分を含んでもよく、その他の成分としては、細胞培養用培地等に含まれるものであれば好適に使用できる。例えば、糖類やアミノ酸、ビタミン類、抗酸化剤、微量元素等が挙げられる。
糖類としては、グルコース、スクロース等が好ましい。
ビタミン類としては、ビオチン、パントテン酸、コリン、ホラシン（葉酸）、ｍｙｏ－イノシトール、ナイアシン、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、コバラミンなどのビタミンＢ 群のビタミン類が挙げられる。
抗酸化剤としては、グルタチオン、アスコルビン酸等が挙げられる。
微量元素としては、Ａｇ+、Ａｌ３+、Ｂａ２+、Ｃｄ２+、Ｃｏ２+、Ｃｒ３+、Ｇｅ+、Ｍｎ２+、Ｍｏ６+、ＮＩ２+、Ｒｂ+、Ｓｅ４+、Ｓｉ４+、Ｓｎ２+、Ｖ５+、Ｚｒ４+、Ｂｒ-、Ｆ-、Ｉ-等が挙げられる。
上記アミノ酸、ビタミン類、抗酸化剤、微量元素などの成分は２種以上併用してもよく、また各成分はそれぞれ２種以上用いてもよい。
更に、ｐＨ調製剤等を含んでも良い。ｐＨ調整剤としては、例えば、リン酸緩衝液および炭酸緩衝液等が挙げられる。また、Ｂａｓｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ （ＢＳＳ）にリン酸緩衝液を添加しない場合には、生理食塩水を添加したものも用いることができる。このうちリン酸緩衝液を用いることが特に好ましい。ｐＨ調整剤は細胞凍結保存用溶液中のｐＨをおよそ６．５～９．０、好ましくは７．０～８．５に調整するために適宜用いることが好ましい。なお、本発明におけるリン酸緩衝液とは、塩化ナトリウム、リン酸一ナトリウム（無水）、リン酸一カリウム（無水）、リン酸二ナトリウム（無水）、リン酸三ナトリウム（無水）、塩化カリウム、及びリン酸二水素カリウム（無水）などのことをいい、特に塩化ナトリウム、リン酸一ナトリウム（無水）、塩化カリウム、またはリン酸二水素カリウム（無水）を用いることが好ましい。また、リン酸二水素カリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、およびリン酸水素二ナトリウムの組み合わせも好ましい。ｐＨ調整剤は細胞保存液中に０．０１～１．０ｗ／ｖ％含まれることが好ましく、０．０５～０．５ｗ／ｖ％含まれることがより好ましい。
【0087】
＜滅菌＞
本発明による細胞凍結保存液は、滅菌されていることが好ましい。細菌等の感染のリスクが低減されるため、より安全に生体へ適用することができる。滅菌の種類としては、細胞凍結保護液の成分が変性・分解等しない方法であればどれでもよく、その中でもフィルター滅菌が好ましい。
本発明による細胞凍結保存液は、滅菌されていることが好ましい。細菌等の感染のリスクが低減されるため、より安全に生体へ適用することができる。滅菌の種類としては、細胞凍結保護液の成分が変性・分解等しない方法であればどれでもよく、その中でもフィルター滅菌が好ましい。
【0088】
＜細胞の凍結方法＞
本発明の細胞保存液を使用する細胞の凍結方法としては、特に限定されないが、細胞凍結保存液と細胞を混合する混合工程と、細胞凍結保存液と細胞の混合物を凍結する凍結工程とを含むことが好ましい。
混合工程の前に、細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）等の洗浄液を用いて洗浄してもよい。これによって、例えば、培養培地等の成分の混入をより低減することができる。
混合工程において、細胞凍結保存液１ｍＬあたりの細胞数は、特に限定されないが、好ましくは１０３～１０９個／ｍＬ、より好ましくは１０４～１０８個／ｍＬになるように調製することが好ましい。
また、細胞凝集体（コロニー、スフェロイド）の混合工程においては、細胞凍結保護剤１ｍＬあたりの細胞凝集体の数は、特に限定されないが、好ましくは１～１０５個／ｍＬ、より好ましくは１～１０３個／ｍＬになるように調製することが好ましい。
混合物は、例えば、アンプルまたはクライオチューブ等の耐寒性容器に移して、氷上でよくピペッティングする。耐寒性容器は、内部が滅菌されていることが好ましい。
凍結工程において、冷却速度は特に限定されないが、例えば、急激に冷却した場合には、細胞内と細胞外の水分の氷結に差が生じ、細胞の微細構造を破壊するおそれがあるため、耐寒性容器を温度制御可能なフリーザーもしくは緩慢凍結容器にセットし、１分間に０．５℃ から３℃ の速度で冷却を行われていることが好ましい。
温度制御可能なフリーザーもしくは緩慢凍結容器としては、ワケンビーテック社のＣｏｏｌＣｅｌｌ（登録商標）、Ｎａｌｇｅｎｅ社のＭｒ．Ｆｒｏｓｔｙ、及び日本フリーザー株式会社のバイセル等が挙げられる。最終的な凍結温度は特に限定されないが、好ましくは－８０℃以下、より好ましくは－１５０℃以下、さらに好ましくは－１９６．５℃以下である。また、－８０℃付近で保存した後、－１８０℃～－２００℃（例えば、液体窒素中）に移して保存してもよい。これにより、凍結細胞が得られる。
また、細胞のコロニー、スフェロイド等の細胞凝集体は、細胞の内部を脱水置換し、一気に液体窒素温度に低下することで細胞全体をガラス化させ固定させる方法が使用されてもよい。例えば、耐寒性容器を液体窒素に直接浸漬することにより、細胞凝集体の凍結物を得ることができる。
本発明における細胞凍結保存液は、例えば、耐寒性容器、温度制御可能なフリーザーもしくは緩慢凍結容器、または使用説明書等と組み合わせて、キットとしてもよい。キットの使用説明書には、例えば、上記の凍結保存方法等が記載されている。
本発明の細胞保存液を使用する細胞の凍結方法としては、特に限定されないが、細胞凍結保存液と細胞を混合する混合工程と、細胞凍結保存液と細胞の混合物を凍結する凍結工程とを含むことが好ましい。
混合工程の前に、細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）等の洗浄液を用いて洗浄してもよい。これによって、例えば、培養培地等の成分の混入をより低減することができる。
混合工程において、細胞凍結保存液１ｍＬあたりの細胞数は、特に限定されないが、好ましくは１０３～１０９個／ｍＬ、より好ましくは１０４～１０８個／ｍＬになるように調製することが好ましい。
また、細胞凝集体（コロニー、スフェロイド）の混合工程においては、細胞凍結保護剤１ｍＬあたりの細胞凝集体の数は、特に限定されないが、好ましくは１～１０５個／ｍＬ、より好ましくは１～１０３個／ｍＬになるように調製することが好ましい。
混合物は、例えば、アンプルまたはクライオチューブ等の耐寒性容器に移して、氷上でよくピペッティングする。耐寒性容器は、内部が滅菌されていることが好ましい。
凍結工程において、冷却速度は特に限定されないが、例えば、急激に冷却した場合には、細胞内と細胞外の水分の氷結に差が生じ、細胞の微細構造を破壊するおそれがあるため、耐寒性容器を温度制御可能なフリーザーもしくは緩慢凍結容器にセットし、１分間に０．５℃ から３℃ の速度で冷却を行われていることが好ましい。
温度制御可能なフリーザーもしくは緩慢凍結容器としては、ワケンビーテック社のＣｏｏｌＣｅｌｌ（登録商標）、Ｎａｌｇｅｎｅ社のＭｒ．Ｆｒｏｓｔｙ、及び日本フリーザー株式会社のバイセル等が挙げられる。最終的な凍結温度は特に限定されないが、好ましくは－８０℃以下、より好ましくは－１５０℃以下、さらに好ましくは－１９６．５℃以下である。また、－８０℃付近で保存した後、－１８０℃～－２００℃（例えば、液体窒素中）に移して保存してもよい。これにより、凍結細胞が得られる。
また、細胞のコロニー、スフェロイド等の細胞凝集体は、細胞の内部を脱水置換し、一気に液体窒素温度に低下することで細胞全体をガラス化させ固定させる方法が使用されてもよい。例えば、耐寒性容器を液体窒素に直接浸漬することにより、細胞凝集体の凍結物を得ることができる。
本発明における細胞凍結保存液は、例えば、耐寒性容器、温度制御可能なフリーザーもしくは緩慢凍結容器、または使用説明書等と組み合わせて、キットとしてもよい。キットの使用説明書には、例えば、上記の凍結保存方法等が記載されている。
【0089】
＜凍結細胞＞
本発明の凍結細胞は、保存の対象となる細胞によって異なるが、例えば、保存１週間経過後またはそれ以上経過後（例えば、１０日間以上、１０年以上経過後）において、良好な生存率、増殖率を達成し得る。本発明の解凍後の生存率は、解凍直後において、細胞生存率＝生細胞の数／（生細胞の数＋死細胞の数）×１００％と定義される。解凍後の生存率は、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上である。解凍直後とは、解凍後１２時間以内を意味する。
また、本発明の解凍後の増殖率は、細胞増殖率＝解凍３日後細胞の数／解凍初期に播種した細胞の数×１００％と定義される。増殖率は、１０５％以上、好ましくは１５０％以上、より好ましくは２００％以上である。
本発明の凍結細胞は、保存の対象となる細胞によって異なるが、例えば、保存１週間経過後またはそれ以上経過後（例えば、１０日間以上、１０年以上経過後）において、良好な生存率、増殖率を達成し得る。本発明の解凍後の生存率は、解凍直後において、細胞生存率＝生細胞の数／（生細胞の数＋死細胞の数）×１００％と定義される。解凍後の生存率は、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上である。解凍直後とは、解凍後１２時間以内を意味する。
また、本発明の解凍後の増殖率は、細胞増殖率＝解凍３日後細胞の数／解凍初期に播種した細胞の数×１００％と定義される。増殖率は、１０５％以上、好ましくは１５０％以上、より好ましくは２００％以上である。
【0090】
＜細胞の解凍＞
本発明に係る凍結方法または保存方法を用いて凍結保存された細胞は、上述のとおり、解凍後に良好な生存率、増殖率を示し得る（後述の実施例も参照）。解凍は、素早く行うことが好ましく、例えば、３７℃±１℃のウォーターバスに浸漬して行うことが好ましい。解凍後の細胞の使用において、細胞凍結保護剤は除去されてもよいし、除去されなくてもよい。
本発明に係る凍結方法または保存方法を用いて凍結保存された細胞は、上述のとおり、解凍後に良好な生存率、増殖率を示し得る（後述の実施例も参照）。解凍は、素早く行うことが好ましく、例えば、３７℃±１℃のウォーターバスに浸漬して行うことが好ましい。解凍後の細胞の使用において、細胞凍結保護剤は除去されてもよいし、除去されなくてもよい。
【実施例】
【0091】
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、以下の実施例は本発明の権利範囲を何ら制限するものではない。尚、実施例及び比較例におけるｍｏｌとは物質量を表し、ｍｏｌ％は全単量体中の物質量の割合を表す。
【0092】
［製造例１］
・アミノ酸系単量体１
４つ口フラスコに、Ｌ－グリシン（１０．０ｇ，０．１３３ｍｏｌ）、水酸化ナトリウム（１０．７ｇ，０．２６６ｍｏｌ)、水２５ｍＬを入れ、溶解させた。反応溶液を氷浴中で冷却し、塩化アクリロイル（１３．２６ｇ，０．１４７ｍｏｌ）を１時間かけて滴下した。滴下後、氷浴中で３０分間攪拌した後に、室温でさらに２時間攪拌した。反応液に塩酸水を加えてｐＨ１～２に調製した後に、酢酸エチルで抽出を行い、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧溜去した。得られた固体をさらにジエチルエーテルで洗浄した後、濾過し、２４時間減圧乾燥させ、下記構造のアミノ酸系単量体１（１２．１２ｇ、７０．５％）を得た。
アミノ酸系単量体１
・アミノ酸系単量体１
４つ口フラスコに、Ｌ－グリシン（１０．０ｇ，０．１３３ｍｏｌ）、水酸化ナトリウム（１０．７ｇ，０．２６６ｍｏｌ)、水２５ｍＬを入れ、溶解させた。反応溶液を氷浴中で冷却し、塩化アクリロイル（１３．２６ｇ，０．１４７ｍｏｌ）を１時間かけて滴下した。滴下後、氷浴中で３０分間攪拌した後に、室温でさらに２時間攪拌した。反応液に塩酸水を加えてｐＨ１～２に調製した後に、酢酸エチルで抽出を行い、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧溜去した。得られた固体をさらにジエチルエーテルで洗浄した後、濾過し、２４時間減圧乾燥させ、下記構造のアミノ酸系単量体１（１２．１２ｇ、７０．５％）を得た。
アミノ酸系単量体１
【化10】
【0093】
［製造例２～５］
・アミノ酸系単量体２～５
表１に示す材料に変更した以外は、製造例１と同様の方法で下記構造のアミノ酸系単量体をそれぞれ得た。また、アミノ酸は製造例１におけるＬ－グリシンと同モル量を使用した。
アミノ酸系単量体２、３、５
アミノ酸系単量体４
・アミノ酸系単量体２～５
表１に示す材料に変更した以外は、製造例１と同様の方法で下記構造のアミノ酸系単量体をそれぞれ得た。また、アミノ酸は製造例１におけるＬ－グリシンと同モル量を使用した。
アミノ酸系単量体２、３、５
【化11】
【化12】
【0094】
【表1】
【0095】
［製造例６］
・アミノ酸系単量体６
撹拌機および温度計、還流器、滴下ロートを備えた反応容器に、グリシンｔｅｒｔ－ブチル塩酸塩（５４．９ｇ，０．３２７ｍｏｌ）、水酸化ナトリウム（１９．６ｇ，０．４９１ｍｏｌ）、エタノール１００ｍＬを入れた。撹拌しながら７０℃まで昇温して溶解させた後、温度を４０℃まで冷却した。滴下ロートから、４－クロロメチルスチレン（５２．８ｇ，０．３４４ｍｏｌ）を１時間かけて滴下した。反応温度を４０℃に維持して６時間反応させた。反応後、溶液を濾過し、濾液を分取した。この濾液に酢酸エチルを少しずつ加え、冷却して再結晶させた。再度、得られた結晶をエタノールに溶解させ、酢酸エチルで再結晶下後、室温で２４時間、減圧乾燥して下記構造のアミノ酸系単量体前駆体１（８４．２１ｇ，８０．３％）を得た。
アミノ酸系単量体前駆体１
・アミノ酸系単量体６
撹拌機および温度計、還流器、滴下ロートを備えた反応容器に、グリシンｔｅｒｔ－ブチル塩酸塩（５４．９ｇ，０．３２７ｍｏｌ）、水酸化ナトリウム（１９．６ｇ，０．４９１ｍｏｌ）、エタノール１００ｍＬを入れた。撹拌しながら７０℃まで昇温して溶解させた後、温度を４０℃まで冷却した。滴下ロートから、４－クロロメチルスチレン（５２．８ｇ，０．３４４ｍｏｌ）を１時間かけて滴下した。反応温度を４０℃に維持して６時間反応させた。反応後、溶液を濾過し、濾液を分取した。この濾液に酢酸エチルを少しずつ加え、冷却して再結晶させた。再度、得られた結晶をエタノールに溶解させ、酢酸エチルで再結晶下後、室温で２４時間、減圧乾燥して下記構造のアミノ酸系単量体前駆体１（８４．２１ｇ，８０．３％）を得た。
アミノ酸系単量体前駆体１
【化13】
【0096】
撹拌機および温度計、還流器、滴下ロートを備えた反応容器に、アミノ酸系単量体前駆体１（８９．７ｇ，０．２８０ｍｏｌ）、ジクロロメタン１００ｍＬを入れ、溶解させた。反応溶液を氷浴中で冷却し、トリフルオロ酢酸（６３．９ｇ，０．５６０ｍｏｌ）を３０分間かけて滴下した。滴下後、室温でさらに２時間攪拌した。反応後、ジクロロメタンを減圧濃縮で除去した後、アセトンで再結晶させた。その後、室温で２４時間、減圧乾燥して下記構造のアミノ酸系単量体６（４５．７２ｇ，８５．４％）を得た。
アミノ酸系単量体６
アミノ酸系単量体６
【化14】
【0097】
［製造例７］
・アミノ酸系単量体７
表２に示す材料に変更した以外は、製造例６と同様な方法で下記構造のアミノ酸系単量体前駆体２を得た。また、アミノ酸は製造例６におけるグリシンｔｅｒｔ－ブチル塩酸塩と同モル量を使用した。
アミノ酸系単量体前駆体２
・アミノ酸系単量体７
表２に示す材料に変更した以外は、製造例６と同様な方法で下記構造のアミノ酸系単量体前駆体２を得た。また、アミノ酸は製造例６におけるグリシンｔｅｒｔ－ブチル塩酸塩と同モル量を使用した。
アミノ酸系単量体前駆体２
【化15】
【0098】
ついで、表２に示す材料に変更した以外は、製造例６と同様の方法で下記構造のアミノ酸系単量体７を得た。なお、アミノ酸前駆体は製造例６におけるアミノ酸系単量体前駆体１と同モル量を使用した。
アミノ酸系単量体７
アミノ酸系単量体７
【化16】
【0099】
［製造例８］
・アミノ酸系単量体８
グリシンｔｅｒｔ－ブチル塩酸塩をＬ－プロリンに変更した以外は製造例６のアミノ酸系単量体前駆体１と同様な方法で、下記構造のアミノ酸系単量体８を得た。また、Ｌ－プロリンは製造例６におけるグリシンｔｅｒｔ－ブチル塩酸塩と同モル量を使用した。
アミノ酸系単量体８
・アミノ酸系単量体８
グリシンｔｅｒｔ－ブチル塩酸塩をＬ－プロリンに変更した以外は製造例６のアミノ酸系単量体前駆体１と同様な方法で、下記構造のアミノ酸系単量体８を得た。また、Ｌ－プロリンは製造例６におけるグリシンｔｅｒｔ－ブチル塩酸塩と同モル量を使用した。
アミノ酸系単量体８
【化17】
【0100】
【表2】
【0101】
［製造例９］
・２官能の単量体１
還流器および撹拌機を備えた反応容器に、４－ヒドロキシブチルアクリレート（１３８．０ｇ，０．９５７ｍｏｌ）、ピリジン８０ｍＬを仕込んだ。氷冷しながら、メタクリル酸クロリド（１１０．１ｇ，１．０５ｍｏｌ）を１時間かけて滴下した。４時間反応させた後、溶液を濾過し、濾液を減圧溜去し、下記構造の２官能の単量体１（１３０．０ｇ，６４．０％）を得た。
２官能の単量体１
・２官能の単量体１
還流器および撹拌機を備えた反応容器に、４－ヒドロキシブチルアクリレート（１３８．０ｇ，０．９５７ｍｏｌ）、ピリジン８０ｍＬを仕込んだ。氷冷しながら、メタクリル酸クロリド（１１０．１ｇ，１．０５ｍｏｌ）を１時間かけて滴下した。４時間反応させた後、溶液を濾過し、濾液を減圧溜去し、下記構造の２官能の単量体１（１３０．０ｇ，６４．０％）を得た。
２官能の単量体１
【化18】
【0102】
［製造例１０～１２］
・２官能の単量体２～４
表３に示す材料に変更した以外は、製造例９と同様の方法で下記構造の２官能の単量体をそれぞれ得た。
２官能の単量体２
２官能の単量体３
２官能の単量体４
・２官能の単量体２～４
表３に示す材料に変更した以外は、製造例９と同様の方法で下記構造の２官能の単量体をそれぞれ得た。
２官能の単量体２
【化19】
【化20】
【化21】
【0103】
【表3】
【0104】
表３に記載したヒドロキシル基含有アクリレートを下記に示す。
・ポリエチレングリコールモノアクリレート：日油製、ブレンマーＡＥ－９０Ｕ
・ポリプロピレングリコールモノアクリレート：日油製、ブレンマーＡＰ－２００
・ポリエチレングリコールモノアクリレート：日油製、ブレンマーＡＥ－９０Ｕ
・ポリプロピレングリコールモノアクリレート：日油製、ブレンマーＡＰ－２００
【0105】
［製造例１３］
・アミノ酸系単量体９
還流器および撹拌機を備えた反応容器に、２官能の単量体１（８９．０６ｇ，０．４２０ｍｏｌ）、及びグリシンｔｅｒｔ－ブチル塩酸塩（７２．１ｇ，０．２２５ｍｏｌ）、エタノール１２０ｍＬを仕込んだ。撹拌しながら昇温した後、７０℃で５時間反応させた。反応終了後、減圧乾燥によりエタノールを除去し、アセトンで再結晶をし、下記構造のアミノ酸系単量体前駆体３（９６．１１ｇ，８８．０％）を得た。
アミノ酸系単量体前駆体３
・アミノ酸系単量体９
還流器および撹拌機を備えた反応容器に、２官能の単量体１（８９．０６ｇ，０．４２０ｍｏｌ）、及びグリシンｔｅｒｔ－ブチル塩酸塩（７２．１ｇ，０．２２５ｍｏｌ）、エタノール１２０ｍＬを仕込んだ。撹拌しながら昇温した後、７０℃で５時間反応させた。反応終了後、減圧乾燥によりエタノールを除去し、アセトンで再結晶をし、下記構造のアミノ酸系単量体前駆体３（９６．１１ｇ，８８．０％）を得た。
アミノ酸系単量体前駆体３
【化22】
【0106】
製造例６のアミノ酸系単量体前駆体１をアミノ酸系単量体前駆体３に変更した以外は、製造例６と同様の方法で下記構造のアミノ酸系単量体９を得た。
アミノ酸系単量体９
アミノ酸系単量体９
【化23】
【0107】
［製造例１４，１５］
・アミノ酸系単量体１０，１１
表４に示す材料に変更した以外は、製造例１２と同様の方法でアミノ酸系単量体１０，１１をそれぞれ得た。
・アミノ酸系単量体１０，１１
表４に示す材料に変更した以外は、製造例１２と同様の方法でアミノ酸系単量体１０，１１をそれぞれ得た。
【0108】
【表4】
【化24】
【化25】
【0109】
［製造例１６］
・アミノ酸系単量体１２
グリシンｔｅｒｔ－ブチル塩酸塩をＬ－プロリンに、かつ２官能の単量体１から２官能の単量体４に変更した以外は、製造例１３のアミノ酸系単量体前駆体９と同様の方法で下記構造のアミノ酸系単量体１２を得た。また、Ｌ－プロリンは製造例１３におけるグリシンｔｅｒｔ－ブチル塩酸塩と同モル量を使用した。
アミノ酸系単量体１２
・アミノ酸系単量体１２
グリシンｔｅｒｔ－ブチル塩酸塩をＬ－プロリンに、かつ２官能の単量体１から２官能の単量体４に変更した以外は、製造例１３のアミノ酸系単量体前駆体９と同様の方法で下記構造のアミノ酸系単量体１２を得た。また、Ｌ－プロリンは製造例１３におけるグリシンｔｅｒｔ－ブチル塩酸塩と同モル量を使用した。
アミノ酸系単量体１２
【化26】
【0110】
［重合体製造例１］
・アミノ酸系重合体１
攪拌器、温度計、滴下ロート、還流器を備えた反応容器に、エタノール１５０部を仕込み、内温を７５℃に昇温し十分に窒素置換した。別途用意しておいた、アゾビスイソブチルニトリル０．４部、（アミノ酸系単量体１）１００部を７５℃に保ちながら３時間滴下を続け、さらに８時間撹拌を続けた。反応終了後、冷却して取出した。その後、減圧乾燥でエタノールを完全に揮発させ、アミノ酸系重合体１を得た。
・アミノ酸系重合体１
攪拌器、温度計、滴下ロート、還流器を備えた反応容器に、エタノール１５０部を仕込み、内温を７５℃に昇温し十分に窒素置換した。別途用意しておいた、アゾビスイソブチルニトリル０．４部、（アミノ酸系単量体１）１００部を７５℃に保ちながら３時間滴下を続け、さらに８時間撹拌を続けた。反応終了後、冷却して取出した。その後、減圧乾燥でエタノールを完全に揮発させ、アミノ酸系重合体１を得た。
【0111】
［重合体製造例２～１６］
表５に示す配合組成で、重合体製造例１と同様の方法でアミノ酸系重合体２～１６をそれぞれ得た。表中において、質量平均分子量および不凍水量以外の数字は部数を表す。
表５に示す配合組成で、重合体製造例１と同様の方法でアミノ酸系重合体２～１６をそれぞれ得た。表中において、質量平均分子量および不凍水量以外の数字は部数を表す。
【0112】
２５℃のイオン交換水中１００ｍＬ中に、得られたアミノ酸系重合体１～１６を１ｇ入れて撹拌し溶解後、２５℃で２４時間放置した。その結果これらの樹脂は分離、析出ともに見られず、完全に溶解可能であり、水溶性であることが示された。
【0113】
＜質量平均分子量（Ｍｗ）の測定＞
重量平均分子量は、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）測定によるポリエチレングリコール換算の値として表５に示す。
装置；ＧＰＣＳＹＳＴＥＭ２４Ｈ（昭和電工社製）
カラム；ＳＢ－８０３ＨＱ+ＳＢ－８０４ＨＱ（昭和電工社製）
溶出溶媒；２０ｍＭリン酸緩衝液
標準物質；ポリエチレングリコール（アジレント・テクノロジー社製）
流速；０．５ｍＬ／分、試料溶液使用量；１０μＬ、カラム温度；４０℃
重量平均分子量は、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）測定によるポリエチレングリコール換算の値として表５に示す。
装置；ＧＰＣＳＹＳＴＥＭ２４Ｈ（昭和電工社製）
カラム；ＳＢ－８０３ＨＱ+ＳＢ－８０４ＨＱ（昭和電工社製）
溶出溶媒；２０ｍＭリン酸緩衝液
標準物質；ポリエチレングリコール（アジレント・テクノロジー社製）
流速；０．５ｍＬ／分、試料溶液使用量；１０μＬ、カラム温度；４０℃
【0114】
＜不凍水の測定＞
・アミノ酸系重合体の不凍水の測定
アミノ酸系重合体１～１６について、アミノ酸系重合体の濃度が２０．０ｗ／ｖ％である水溶液を調整した。この水溶液を不凍水の測定用サンプルとした。アミノ酸系重合体に含有される不凍水量の測定方法は、特開２０１６－０６３８０１号公報に詳しく説明される方法を用いて測定した。本願明細書に記載の発明においては、示差走査熱量計（ＤＳＣ装置；株式会社日立ハイテクサイエンスＤＳＣ６２００）を用い、窒素流量５０ｍＬ／分、５℃／分間の条件で各種の割合で含水させたポリマーにおける潜熱の移動について測定をした。
温度プログラムは、（ｉ）室温から－１００℃まで冷却、（ｉｉ）－１００℃で５分間保持、（ｉｉｉ）－１００℃から３０℃まで加熱を行った。上記（ｉｉｉ）において、水の低温結晶化に起因する発熱ピーク及び水の低温融解に起因する吸熱ピークの有無によって自由水、中間水の有無が確認される。つまり、ＤＳＣチャートにおいて、－４０℃付近における潜熱の放出や、－２０℃以上の氷点下における潜熱の吸収は、アミノ酸系重合体に含有される中間水の規則化と再不規則化に起因するものと考えられている。
ＤＳＣ装置を用いて、酸化アルミパンを室温から－１００℃まで冷却し、ついで５分間ホールドした後、昇温速度５℃／分で－１００℃から３０℃まで加熱を行う過程での吸発熱量の測定を行った。
各試料について、ＤＳＣ測定後にアルミパンにピンホールをあけて真空乾燥後、その重量を測定し、重量減少分を含水量とした。
含水率（ＷＣ）は、酸化アルミパンの質量を除外した上で、以下の式（Ｉ）で求める。
含水率（ＷＣ）＝（Ｗ１－Ｗ０）／Ｗ０（Ｉ）
（Ｗ０：試料の乾燥重量（ｇ）、Ｗ１：試料の含水重量（ｇ））
また、サンプル毎に、０℃付近の吸熱量から、自由水の量を求め、－４０℃付近における発熱量と－２０℃以上の氷点下における吸熱量から中間水の量を求め、上記で求めた各サンプルの含水量（Ｗ１－Ｗ０）から自由水と中間水の量を差し引いた量を不凍水量として求めた。アミノ酸系重合体１ｇあたりの不凍水量は、求められた不凍水量を試料の乾燥重量（Ｗ０）で除することにより求めた。実験の結果を表５に示す。
・アミノ酸系重合体の不凍水の測定
アミノ酸系重合体１～１６について、アミノ酸系重合体の濃度が２０．０ｗ／ｖ％である水溶液を調整した。この水溶液を不凍水の測定用サンプルとした。アミノ酸系重合体に含有される不凍水量の測定方法は、特開２０１６－０６３８０１号公報に詳しく説明される方法を用いて測定した。本願明細書に記載の発明においては、示差走査熱量計（ＤＳＣ装置；株式会社日立ハイテクサイエンスＤＳＣ６２００）を用い、窒素流量５０ｍＬ／分、５℃／分間の条件で各種の割合で含水させたポリマーにおける潜熱の移動について測定をした。
温度プログラムは、（ｉ）室温から－１００℃まで冷却、（ｉｉ）－１００℃で５分間保持、（ｉｉｉ）－１００℃から３０℃まで加熱を行った。上記（ｉｉｉ）において、水の低温結晶化に起因する発熱ピーク及び水の低温融解に起因する吸熱ピークの有無によって自由水、中間水の有無が確認される。つまり、ＤＳＣチャートにおいて、－４０℃付近における潜熱の放出や、－２０℃以上の氷点下における潜熱の吸収は、アミノ酸系重合体に含有される中間水の規則化と再不規則化に起因するものと考えられている。
ＤＳＣ装置を用いて、酸化アルミパンを室温から－１００℃まで冷却し、ついで５分間ホールドした後、昇温速度５℃／分で－１００℃から３０℃まで加熱を行う過程での吸発熱量の測定を行った。
各試料について、ＤＳＣ測定後にアルミパンにピンホールをあけて真空乾燥後、その重量を測定し、重量減少分を含水量とした。
含水率（ＷＣ）は、酸化アルミパンの質量を除外した上で、以下の式（Ｉ）で求める。
含水率（ＷＣ）＝（Ｗ１－Ｗ０）／Ｗ０（Ｉ）
（Ｗ０：試料の乾燥重量（ｇ）、Ｗ１：試料の含水重量（ｇ））
また、サンプル毎に、０℃付近の吸熱量から、自由水の量を求め、－４０℃付近における発熱量と－２０℃以上の氷点下における吸熱量から中間水の量を求め、上記で求めた各サンプルの含水量（Ｗ１－Ｗ０）から自由水と中間水の量を差し引いた量を不凍水量として求めた。アミノ酸系重合体１ｇあたりの不凍水量は、求められた不凍水量を試料の乾燥重量（Ｗ０）で除することにより求めた。実験の結果を表５に示す。
【0115】
【表5】
【0116】
表５に記載した単量体(ｂ)を下記に示す。
ＢＭＡ：ｎ－ブチルメタクリレート
ＨＥＡ：ヒドロキシエチルアクリレート
ＡＡ：アクリル酸
ＢＭＡ：ｎ－ブチルメタクリレート
ＨＥＡ：ヒドロキシエチルアクリレート
ＡＡ：アクリル酸
【0117】
以下に、タンパク質安定化剤、および、ブロッキング剤としての評価を示す。
【0118】
＜タンパク質安定化剤水溶液の調製＞
【0119】
［実施例１－１～１－１８、比較例１－１～１－２］
（タンパク質安定化剤水溶液１～２０）
重合体製造例１～１６で得られたアミノ酸系重合体１～１６、ポリビニルピロリドン（以下ＰＶＰ）、およびプロリンを表６に記載の濃度になるように、リン酸緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳ溶液）にて調整し、タンパク質安定化剤水溶液１～１８を得た。
ＰＶＰ：ポリビニルピロリドン、質量平均分子量１０,０００
（タンパク質安定化剤水溶液１～２０）
重合体製造例１～１６で得られたアミノ酸系重合体１～１６、ポリビニルピロリドン（以下ＰＶＰ）、およびプロリンを表６に記載の濃度になるように、リン酸緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳ溶液）にて調整し、タンパク質安定化剤水溶液１～１８を得た。
ＰＶＰ：ポリビニルピロリドン、質量平均分子量１０,０００
【0120】
＜タンパク質安定化剤の評価＞
得られたタンパク質安定化剤について以下の評価を実施した。結果を表６に示す。
得られたタンパク質安定化剤について以下の評価を実施した。結果を表６に示す。
【0121】
［評価用酵素水溶液の調整］
ＨＲＰ標識抗ＣＲＰ抗体ａｂ２４４６２（ａｂｃａｍ社製）を８．０ｎｇ／ｍＬとなるように、得られたタンパク質安定化剤水溶液１ｍＬで希釈・混合し、評価用の酵素水溶液を作成した。評価用酵素水溶液は濃度変化がないよう、よく密閉し２５℃暗所で保管した。
ＨＲＰ標識抗ＣＲＰ抗体ａｂ２４４６２（ａｂｃａｍ社製）を８．０ｎｇ／ｍＬとなるように、得られたタンパク質安定化剤水溶液１ｍＬで希釈・混合し、評価用の酵素水溶液を作成した。評価用酵素水溶液は濃度変化がないよう、よく密閉し２５℃暗所で保管した。
【0122】
［酵素活性評価］
ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト製）を用い、発色剤（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）溶液）を１０ｍＬと基質液（過酸化水素水）１００μＬを混合し発色液を得た。
この発色液１００μＬと、評価用酵素水溶液１００μＬとを９６穴ウェルプレートに加え、３０℃暗所で２０分間静置した。これに停止液（硫酸水溶液）を１００μＬ加え反応を停止させた。その後、４５０ｎｍでの吸光度をプレートリーダーＭｕｌｔｉｍｏｄｅＲｅａｄｅｒＭｉｔｈｒａｓ２ＬＢ９４３（ＢＥＲＴＨＯＬＤＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）で測定し、反応により生じたＴＭＢＺ酸化物の量を定量した。ＴＭＢＺの酸化反応はＨＲＰ標識ＣＲＰ抗体の活性と相関するため、得られた吸光度を酵素活性の指標として使用することができる。
ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト製）を用い、発色剤（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）溶液）を１０ｍＬと基質液（過酸化水素水）１００μＬを混合し発色液を得た。
この発色液１００μＬと、評価用酵素水溶液１００μＬとを９６穴ウェルプレートに加え、３０℃暗所で２０分間静置した。これに停止液（硫酸水溶液）を１００μＬ加え反応を停止させた。その後、４５０ｎｍでの吸光度をプレートリーダーＭｕｌｔｉｍｏｄｅＲｅａｄｅｒＭｉｔｈｒａｓ２ＬＢ９４３（ＢＥＲＴＨＯＬＤＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）で測定し、反応により生じたＴＭＢＺ酸化物の量を定量した。ＴＭＢＺの酸化反応はＨＲＰ標識ＣＲＰ抗体の活性と相関するため、得られた吸光度を酵素活性の指標として使用することができる。
【0123】
［タンパク質安定化効果の評価］
上記酵素活性評価を、評価用酵素水溶液の保管前と２５℃３０日間保管後の２回行い、吸光度を測定した。保管前の吸光度を１００％としたときの、保管後の吸光度の比率を計算して相対吸光度とし、下記基準にてタンパク質の変性を評価した。結果を表６に示す。
上記酵素活性評価を、評価用酵素水溶液の保管前と２５℃３０日間保管後の２回行い、吸光度を測定した。保管前の吸光度を１００％としたときの、保管後の吸光度の比率を計算して相対吸光度とし、下記基準にてタンパク質の変性を評価した。結果を表６に示す。
【0124】
３０日保管後の相対吸光度
◎：９５％以上（極めて良好）
○：９０％以上、９５％未満（良好）
△：８０％以上、９０％未満（使用可能）
×：８０％未満（使用不可）
◎：９５％以上（極めて良好）
○：９０％以上、９５％未満（良好）
△：８０％以上、９０％未満（使用可能）
×：８０％未満（使用不可）
【0125】
【表6】
【0126】
表６に示すように、本発明のタンパク質安定化剤を用いることで、高いタンパク質安定化効果が得られた。具体的には、アミノ酸系重合体１～１６を使用したタンパク安定化剤（実施例１－１～１－１８）は、保管前の吸光度に対する２５℃３０日保管後の吸光度の変化が小さく、タンパク質の構造安定化効果を確認できた。一方、ＰＶＰやプロリンを用いた比較例１－１～１－２は、タンパク質と共存させ保管しても十分な安定化効果が得られないことが分かった。これは、アミノ酸残基を有していない、または、アミノ酸単体であるため、タンパク質の外部環境を適切に制御できなかったためであると考えられる。
【0127】
＜ブロッキング剤水溶液の調製＞
【0128】
［実施例２－１～２－１８、比較例２－１～２－２］
（ブロッキング剤水溶液１～２０）
重合体製造例１～１６で製造したアミノ酸系重合体１～１６、ＰＶＰ、およびプロリンを表７に記載の濃度になるように、ＰＢＳ溶液にて調整し、ブロッキング剤水溶液１～２０を得た。
（ブロッキング剤水溶液１～２０）
重合体製造例１～１６で製造したアミノ酸系重合体１～１６、ＰＶＰ、およびプロリンを表７に記載の濃度になるように、ＰＢＳ溶液にて調整し、ブロッキング剤水溶液１～２０を得た。
【0129】
＜ブロッキング剤の評価＞
得られたブロッキング剤溶液について、下記の通り、［抗原抗体反応試験］及び［非特異吸着試験］を実施し、吸光度の差異を基準に評価した。結果を表７に示す。
得られたブロッキング剤溶液について、下記の通り、［抗原抗体反応試験］及び［非特異吸着試験］を実施し、吸光度の差異を基準に評価した。結果を表７に示す。
【0130】
［抗原抗体反応試験］
（ウェルプレートの固相抗体処理）
固相用の抗ＣＲＰ抗体ａｂ８２７９（ａｂｃａｍ社製）が２５μｇ／ｍＬの濃度になるようにＰＢＳ溶液で調整した。この固相用の抗ＣＲＰ抗体溶液をＰＳｔ製９６穴ウェルプレートに５０μＬずつ添加し、室温２時間静置した後、溶液を吸引し除去した。
（ウェルプレートの固相抗体処理）
固相用の抗ＣＲＰ抗体ａｂ８２７９（ａｂｃａｍ社製）が２５μｇ／ｍＬの濃度になるようにＰＢＳ溶液で調整した。この固相用の抗ＣＲＰ抗体溶液をＰＳｔ製９６穴ウェルプレートに５０μＬずつ添加し、室温２時間静置した後、溶液を吸引し除去した。
【0131】
（ブロッキング処理）
前述の固相抗体処理した９６穴ウェルプレートに、得られたブロッキング剤水溶液を２００μＬずつ添加し吸引除去し、これを３回繰り返した。最後にブロッキング剤水溶液を５０μＬずつ添加し、室温２時間静置した後、溶液を吸引し除去した。
前述の固相抗体処理した９６穴ウェルプレートに、得られたブロッキング剤水溶液を２００μＬずつ添加し吸引除去し、これを３回繰り返した。最後にブロッキング剤水溶液を５０μＬずつ添加し、室温２時間静置した後、溶液を吸引し除去した。
【0132】
（抗原吸着処理）
ＣＲＰ抗原８Ｃ７２（Ｈｙｔｅｓｔ社製）が２μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳ溶液で調整した。このＣＲＰ抗原溶液を、前述のブロッキング処理した９６穴ウェルプレートに５０μＬずつ添加し、３０℃２時間静置した後、溶液を吸引し除去した。その後、余剰の抗原を除去する目的で、得られたブロッキング剤水溶液を２００μＬずつ添加し吸引除去する操作を３回繰り返した。
ＣＲＰ抗原８Ｃ７２（Ｈｙｔｅｓｔ社製）が２μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳ溶液で調整した。このＣＲＰ抗原溶液を、前述のブロッキング処理した９６穴ウェルプレートに５０μＬずつ添加し、３０℃２時間静置した後、溶液を吸引し除去した。その後、余剰の抗原を除去する目的で、得られたブロッキング剤水溶液を２００μＬずつ添加し吸引除去する操作を３回繰り返した。
【0133】
（標識抗体吸着処理）
ＨＲＰ標識抗ＣＲＰ抗体ａｂ２４４６２（ａｂｃａｍ社製）が０．０８μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳ溶液で調整した。このＨＲＰ標識抗ＣＲＰ抗体溶液を、前述の抗原処理した９６穴ウェルプレートに５０μＬずつ添加し、室温２時間静置した後、溶液を吸引し除去した。その後、余剰の標識抗体を除去する目的で、得られたブロッキング剤溶液を２００μＬずつ添加し吸引除去する操作を３回繰り返した。
ＨＲＰ標識抗ＣＲＰ抗体ａｂ２４４６２（ａｂｃａｍ社製）が０．０８μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳ溶液で調整した。このＨＲＰ標識抗ＣＲＰ抗体溶液を、前述の抗原処理した９６穴ウェルプレートに５０μＬずつ添加し、室温２時間静置した後、溶液を吸引し除去した。その後、余剰の標識抗体を除去する目的で、得られたブロッキング剤溶液を２００μＬずつ添加し吸引除去する操作を３回繰り返した。
【0134】
（発色反応）
ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト製）の発色剤１０ｍＬと基質液０．１ｍＬを用いて発色溶液を調整した。この発色溶液を前述の標識抗体吸着処理した９６穴ウェルプレートに１００μＬずつ添加し、３０℃暗所で２０分静置した。次に各ウェルに住友ベークライト社製ペルオキシダーゼ用発色キットの停止液（硫酸水溶液）１００μＬを添加した。
ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト製）の発色剤１０ｍＬと基質液０．１ｍＬを用いて発色溶液を調整した。この発色溶液を前述の標識抗体吸着処理した９６穴ウェルプレートに１００μＬずつ添加し、３０℃暗所で２０分静置した。次に各ウェルに住友ベークライト社製ペルオキシダーゼ用発色キットの停止液（硫酸水溶液）１００μＬを添加した。
【0135】
（吸光度Ａ測定）
各ウェルの４５０ｎｍの吸光度（吸光度Ａとする）を測定した。これは、抗原抗体反応（特異吸着）によりウェルに吸着した抗体量を表す吸光度である。
各ウェルの４５０ｎｍの吸光度（吸光度Ａとする）を測定した。これは、抗原抗体反応（特異吸着）によりウェルに吸着した抗体量を表す吸光度である。
【0136】
［非特異吸着試験］
（ウェルプレートの固相抗体処理）
固相用抗ＣＲＰ抗体ａｂ８２７９（ａｂｃａｍ社製）が２５μｇ／ｍＬの濃度になるようにＰＢＳ溶液で調整した。この固相用抗ＣＲＰ抗体溶液をＰＳｔ製ＥＬＩＳＡ用９６穴ウェルプレートに５０μＬずつ添加し、室温２時間静置した後、溶液を吸引し除去した。
（ウェルプレートの固相抗体処理）
固相用抗ＣＲＰ抗体ａｂ８２７９（ａｂｃａｍ社製）が２５μｇ／ｍＬの濃度になるようにＰＢＳ溶液で調整した。この固相用抗ＣＲＰ抗体溶液をＰＳｔ製ＥＬＩＳＡ用９６穴ウェルプレートに５０μＬずつ添加し、室温２時間静置した後、溶液を吸引し除去した。
【0137】
（ブロッキング処理）
前述の固相抗体処理した９６穴ウェルプレートに、得られたブロッキング剤水溶液を２００μＬずつ添加し吸引除去し、これを３回繰り返した。最後にブロッキング剤水溶液を５０μＬずつ添加し、室温２時間静置した後、溶液を吸引し除去した。
前述の固相抗体処理した９６穴ウェルプレートに、得られたブロッキング剤水溶液を２００μＬずつ添加し吸引除去し、これを３回繰り返した。最後にブロッキング剤水溶液を５０μＬずつ添加し、室温２時間静置した後、溶液を吸引し除去した。
【0138】
（標識抗体吸着処理）
ＨＲＰ標識抗ＣＲＰ抗体ａｂ２４４６２（ａｂｃａｍ社製）が０．０８μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳ溶液で調整した。このＨＲＰ標識ＣＲＰ抗体溶液を、前述のブロッキング処理した９６穴ウェルプレートに５０μＬずつ添加し、室温２時間静置した後、溶液を吸引し除去した。その後、余剰の標識抗体を除去する目的で、得られたブロッキング剤水溶液を２００μＬずつ添加し吸引除去する操作を３回繰り返した。
ＨＲＰ標識抗ＣＲＰ抗体ａｂ２４４６２（ａｂｃａｍ社製）が０．０８μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳ溶液で調整した。このＨＲＰ標識ＣＲＰ抗体溶液を、前述のブロッキング処理した９６穴ウェルプレートに５０μＬずつ添加し、室温２時間静置した後、溶液を吸引し除去した。その後、余剰の標識抗体を除去する目的で、得られたブロッキング剤水溶液を２００μＬずつ添加し吸引除去する操作を３回繰り返した。
【0139】
（発色反応）
ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト製）の発色剤１０ｍＬと基質液０．１ｍＬを用いて発色溶液を調整した。この発色溶液を前述の標識抗体吸着処理した９６穴ウェルプレートに１００μＬずつ添加し、３０℃暗所で２０分静置した。次に各ウェルに住友ベークライト社製ペルオキシダーゼ用発色キットの停止液（硫酸水溶液）１００μＬを添加した。
ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト製）の発色剤１０ｍＬと基質液０．１ｍＬを用いて発色溶液を調整した。この発色溶液を前述の標識抗体吸着処理した９６穴ウェルプレートに１００μＬずつ添加し、３０℃暗所で２０分静置した。次に各ウェルに住友ベークライト社製ペルオキシダーゼ用発色キットの停止液（硫酸水溶液）１００μＬを添加した。
【0140】
（吸光度Ｂ測定）
各ウェルの４５０ｎｍの吸光度（吸光度Ｂとする）を測定した。これは、抗原がないため、標識抗体の非特異吸着によるウェルに吸着した抗体量を表す吸光度である。
各ウェルの４５０ｎｍの吸光度（吸光度Ｂとする）を測定した。これは、抗原がないため、標識抗体の非特異吸着によるウェルに吸着した抗体量を表す吸光度である。
【0141】
［評価基準］
◎：１．０≦（吸光度Ａ－吸光度Ｂ）：良好
〇：０．８≦（吸光度Ａ－吸光度Ｂ）＜１．０：使用可能
△：０．５≦（吸光度Ａ－吸光度Ｂ）＜０．８：使用不可
×：（吸光度Ａ－吸光度Ｂ）＜０．５：不良
◎：１．０≦（吸光度Ａ－吸光度Ｂ）：良好
〇：０．８≦（吸光度Ａ－吸光度Ｂ）＜１．０：使用可能
△：０．５≦（吸光度Ａ－吸光度Ｂ）＜０．８：使用不可
×：（吸光度Ａ－吸光度Ｂ）＜０．５：不良
【0142】
【表7】
【0143】
表７に示すように、本発明のブロッキング剤を用いることで、非特異反応を防止し、検出感度の高い免疫測定を行うことができた。具体的には、アミノ酸系重合体１～１６を使用したブロッキング剤（実施例２－１～２－１８）は、ＣＲＰ抗原抗体反応と非特異吸着反応の吸光度の差が大きく、ＣＲＰ抗原抗体反応を高感度に検出することができた。すなわち、これは本発明のブロッキング剤に含まれるアミノ酸系重合体が、アミノ酸残基を有するため抗体との相互作用が適切に制御され、ＣＲＰの抗原抗体反応を阻害せず、ＣＲＰ抗原抗体反応以外の非特異的な吸着反応を抑えることができたためであると考えられる。
【0144】
続いて、以下に細胞培養用培地添加剤の評価を示す。
【0145】
＜細胞培養用培地の調製＞
[実施例３－１～３－１８、比較例３－１～３－２]
（細胞培養用培地１～２０）
重合体製造例１～１６であるアミノ酸系重合体１～１６、ＰＶＰ、およびメチオニンを以下に述べるそれぞれの基礎培地に表８に記載の濃度になるように添加し、ピペッティングをすることで細胞培養用培地１～２０を得た。
[実施例３－１～３－１８、比較例３－１～３－２]
（細胞培養用培地１～２０）
重合体製造例１～１６であるアミノ酸系重合体１～１６、ＰＶＰ、およびメチオニンを以下に述べるそれぞれの基礎培地に表８に記載の濃度になるように添加し、ピペッティングをすることで細胞培養用培地１～２０を得た。
【0146】
＜細胞培養用培地添加剤の評価＞
以下の通り、細胞培養用培地添加剤の評価を行った。結果を表８に示す。
以下の通り、細胞培養用培地添加剤の評価を行った。結果を表８に示す。
【0147】
＜抗体産生細胞凝集物の発生抑制性＞
培地はＤｙｎａｍｉｓＭｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ製）を用い、Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎを１質量％になるように添加した。以後これを基礎培地とする。これを２セット用意し、アミノ酸系重合体を含む細胞培養用培地添加剤を表８に記載の濃度となるようにそれぞれ添加した。それぞれの基礎培地にＩｇＧ遺伝子を導入しＩｇＧ抗体を分泌産生するＣＨＯ細胞株を加え、ＣＨＯ細胞株の濃度が１，０００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなる細胞懸濁液を作製した。得られた細胞懸濁液２０ｍＬを、１２５ｍＬの三角フラスコに播種し、３７℃にて培養した。なお、培養中、栄養源が枯渇する前に３～４日に一度、上澄み液１５ｍＬを回収し、新たな基礎培地１５ｍＬと交換し、これを５回繰り返した。
抗体産生細胞凝集物の発生抑制性は、培地交換を５回繰り返した後の三角フラスコの液
面付近を目視観察することによって評価した。
◎：凝集物が三角フラスコの液面付近に発生していない：良好
○：凝集物が三角フラスコの液面付近に僅かに発生している：使用可
×：凝集物が三角フラスコの液面付近に一様に発生している：使用不可
培地はＤｙｎａｍｉｓＭｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ製）を用い、Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎを１質量％になるように添加した。以後これを基礎培地とする。これを２セット用意し、アミノ酸系重合体を含む細胞培養用培地添加剤を表８に記載の濃度となるようにそれぞれ添加した。それぞれの基礎培地にＩｇＧ遺伝子を導入しＩｇＧ抗体を分泌産生するＣＨＯ細胞株を加え、ＣＨＯ細胞株の濃度が１，０００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなる細胞懸濁液を作製した。得られた細胞懸濁液２０ｍＬを、１２５ｍＬの三角フラスコに播種し、３７℃にて培養した。なお、培養中、栄養源が枯渇する前に３～４日に一度、上澄み液１５ｍＬを回収し、新たな基礎培地１５ｍＬと交換し、これを５回繰り返した。
抗体産生細胞凝集物の発生抑制性は、培地交換を５回繰り返した後の三角フラスコの液
面付近を目視観察することによって評価した。
◎：凝集物が三角フラスコの液面付近に発生していない：良好
○：凝集物が三角フラスコの液面付近に僅かに発生している：使用可
×：凝集物が三角フラスコの液面付近に一様に発生している：使用不可
【0148】
＜抗体産生性＞
抗体産生細胞凝集物の発生抑制性評価と同様にしてＣＨＯ細胞の培養をし、培地交換を５回繰り返した後の細胞培養液を遠心分離することで、培地上清を回収した。培地中の抗体量を、ＢｅｔｈｙｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ製のＨｕｍａｎＩｇＧＥＬＩＳＡＱｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎＳｅｔを用いて測定した。また、沈降した細胞群のＤＮＡ量も定量し、単位ＤＮＡ量あたりの抗体生産量として算出した。アミノ酸系重合体を含む細胞用培地添加剤を加えないで培養した場合の成績を１とした場合の相対値で判定した。
◎：１．５以上（非常に良好）
○：１．２以上１．５未満（良好）
△：１以上１．２未満（やや不良）
×：１未満（不良）
抗体産生細胞凝集物の発生抑制性評価と同様にしてＣＨＯ細胞の培養をし、培地交換を５回繰り返した後の細胞培養液を遠心分離することで、培地上清を回収した。培地中の抗体量を、ＢｅｔｈｙｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ製のＨｕｍａｎＩｇＧＥＬＩＳＡＱｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎＳｅｔを用いて測定した。また、沈降した細胞群のＤＮＡ量も定量し、単位ＤＮＡ量あたりの抗体生産量として算出した。アミノ酸系重合体を含む細胞用培地添加剤を加えないで培養した場合の成績を１とした場合の相対値で判定した。
◎：１．５以上（非常に良好）
○：１．２以上１．５未満（良好）
△：１以上１．２未満（やや不良）
×：１未満（不良）
【0149】
＜アルブミン産生性評価＞
１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ培地（以下、ＤＭＥＭ培地とする）にアミノ酸系重合体を含む細胞培養用培地添加剤を表８に記載の濃度となるように添加し、攪拌をすることで細胞培養用培地を調製した。ヒト肝がん細胞株ＨｅｐＧ２細胞を、２５０，０００細胞／ｍＬとなるように上記のアミノ酸系重合体を含む細胞用培地添加剤を添加した細胞培養用培地に播種した後、９６ウェルＵ底マイクロプレートのウェルに１ウェルあたり２００μＬになるように分注した。その後、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で３日間培養した。３日間培養後のＨｅｐＧ２細胞を含む培養液を回収し、遠心分離にすることで培地上清を回収した。培地中のアルブミン量を、ＢｅｔｈｙｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ製ＡｌｂｕｍｉｎＥＬＩＳＡＱｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎＳｅｔを用いて測定した。また、沈降した細胞群のＤＮＡ量も定量し、単位ＤＮＡ量あたりのアルブミン生産量として算出した。アミノ酸系重合体（Ａ）を含む細胞培養用培地添加剤を加えないで培養した場合の成績を１とした場合の相対値で判定した。
◎：１．５以上（非常に良好）
○：１．２以上１．５未満（良好）
△：１以上１．２未満（やや不良）
×：１未満（不良）
１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ培地（以下、ＤＭＥＭ培地とする）にアミノ酸系重合体を含む細胞培養用培地添加剤を表８に記載の濃度となるように添加し、攪拌をすることで細胞培養用培地を調製した。ヒト肝がん細胞株ＨｅｐＧ２細胞を、２５０，０００細胞／ｍＬとなるように上記のアミノ酸系重合体を含む細胞用培地添加剤を添加した細胞培養用培地に播種した後、９６ウェルＵ底マイクロプレートのウェルに１ウェルあたり２００μＬになるように分注した。その後、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で３日間培養した。３日間培養後のＨｅｐＧ２細胞を含む培養液を回収し、遠心分離にすることで培地上清を回収した。培地中のアルブミン量を、ＢｅｔｈｙｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ製ＡｌｂｕｍｉｎＥＬＩＳＡＱｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎＳｅｔを用いて測定した。また、沈降した細胞群のＤＮＡ量も定量し、単位ＤＮＡ量あたりのアルブミン生産量として算出した。アミノ酸系重合体（Ａ）を含む細胞培養用培地添加剤を加えないで培養した場合の成績を１とした場合の相対値で判定した。
◎：１．５以上（非常に良好）
○：１．２以上１．５未満（良好）
△：１以上１．２未満（やや不良）
×：１未満（不良）
【0150】
＜薬物代謝酵素活性の評価＞
アルブミン産生性評価と同様に、ＨｅｐＧ２細胞を３日間培養した。その後、ＨｅｐＧ細胞をＰＢＳ溶液にて洗浄し、ＤＭＥＭ培地を入れ替えた。ＣＹＰ３Ａ４活性はＰ４５０－ＧｌｏＴＭＣＹＰ３Ａ４ＡｓｓａｙＫｉｔs（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用い、ＣＹＰ３Ａ４の基質としてＬｕｃｉｆｅｒｉｎ－ＩＰＡを用いた。ＣＹＰ３Ａ４活性値はプレートリーダー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ製）を用いて測定した。また、細胞群のＤＮＡ量も定量し、単位ＤＮＡ量あたりのＣＹＰ３Ａ４活性値として算出した。アミノ酸系重合体（Ａ）を含む細胞培養用培地添加剤を加えないで培養した場合の成績を１とした場合の相対値で判定した。
◎：１．５以上（非常に良好）
○：１．２以上１．５未満（良好）
△：１以上１．２未満（やや不良）
×：１未満（不良）
アルブミン産生性評価と同様に、ＨｅｐＧ２細胞を３日間培養した。その後、ＨｅｐＧ細胞をＰＢＳ溶液にて洗浄し、ＤＭＥＭ培地を入れ替えた。ＣＹＰ３Ａ４活性はＰ４５０－ＧｌｏＴＭＣＹＰ３Ａ４ＡｓｓａｙＫｉｔs（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用い、ＣＹＰ３Ａ４の基質としてＬｕｃｉｆｅｒｉｎ－ＩＰＡを用いた。ＣＹＰ３Ａ４活性値はプレートリーダー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ製）を用いて測定した。また、細胞群のＤＮＡ量も定量し、単位ＤＮＡ量あたりのＣＹＰ３Ａ４活性値として算出した。アミノ酸系重合体（Ａ）を含む細胞培養用培地添加剤を加えないで培養した場合の成績を１とした場合の相対値で判定した。
◎：１．５以上（非常に良好）
○：１．２以上１．５未満（良好）
△：１以上１．２未満（やや不良）
×：１未満（不良）
【0151】
＜ｑＲＴ－ＰＣＲ法による遺伝子発現解析＞
アルブミン産生性評価と同様に、ＨｅｐＧ２細胞を３日間培養した。その後、ＨｅｐＧ２細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙＭｉｃｒｏＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。抽出した各全ＲＮＡをＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅｑＰＣＲＲＴＭａｓｔｅｒＭｉｘ(ＴＯＹＯＢＯ製)を用いた逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡと目的遺伝子(ＣＹＰ３Ａ４とアルブミン)のＴａｑＭａｎｐｒｏｂｅ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、ＣＹＰ３Ａ４：Ｈｓ００６０４５０６_ｍ１,アルブミン：Ｈｓ００６０９４１１_ｍ１)を用いてｑＲＴ－ＰＣＲを実施した。リファレンス遺伝子にはＧＡＰＤＨ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、Ｈｓ０２７８６６２４_ｇ１）を用いた。各遺伝子の相対発現量はＧＡＰＤＨを基準に比較Ｃｔ法を用いて算出した。アミノ酸系重合体（Ａ）を含む細胞培養用培地添加剤を加えないで培養した場合の成績を１とした場合の相対値で判定した。
◎：２以上（非常に良好）
○：１．２以上２未満（良好）
△：１以上１．２未満（やや不良）
×：１未満（不良）
アルブミン産生性評価と同様に、ＨｅｐＧ２細胞を３日間培養した。その後、ＨｅｐＧ２細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙＭｉｃｒｏＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。抽出した各全ＲＮＡをＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅｑＰＣＲＲＴＭａｓｔｅｒＭｉｘ(ＴＯＹＯＢＯ製)を用いた逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡと目的遺伝子(ＣＹＰ３Ａ４とアルブミン)のＴａｑＭａｎｐｒｏｂｅ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、ＣＹＰ３Ａ４：Ｈｓ００６０４５０６_ｍ１,アルブミン：Ｈｓ００６０９４１１_ｍ１)を用いてｑＲＴ－ＰＣＲを実施した。リファレンス遺伝子にはＧＡＰＤＨ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、Ｈｓ０２７８６６２４_ｇ１）を用いた。各遺伝子の相対発現量はＧＡＰＤＨを基準に比較Ｃｔ法を用いて算出した。アミノ酸系重合体（Ａ）を含む細胞培養用培地添加剤を加えないで培養した場合の成績を１とした場合の相対値で判定した。
◎：２以上（非常に良好）
○：１．２以上２未満（良好）
△：１以上１．２未満（やや不良）
×：１未満（不良）
【0152】
＜スフェロイド形成性評価＞
ＤＭＥＭ培地にアミノ酸系重合体（Ａ）を含む細胞培養用培地添加剤を表８に記載の濃度になるように添加し、攪拌をすることで細胞培養用培地を調製した。ヒト肝がん細胞株ＨｅｐＧ細胞を１００，０００細胞／ｍＬとなるように、上記のアミノ酸系重合体を含む細胞用培地で調整しマイクロプレート（住友ベーラクイト社製ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅＭＳ－９０９６Ｕ）のウェルに１ウェルあたり１００μＬになるように播種した。その後、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で３日間培養した。スフェロイド形成性は、３日後に細胞培養状態を透過式光学顕微鏡４０倍で写真撮影し、細胞の形態を観察することによって、以下の基準で判定した。評価結果を表８に示す。
〇：１つのスフェロイドを形成（良好）
△：複数個のスフェロイドを形成（やや不良）
×：スフェロイドを形成しない（不良）
ＤＭＥＭ培地にアミノ酸系重合体（Ａ）を含む細胞培養用培地添加剤を表８に記載の濃度になるように添加し、攪拌をすることで細胞培養用培地を調製した。ヒト肝がん細胞株ＨｅｐＧ細胞を１００，０００細胞／ｍＬとなるように、上記のアミノ酸系重合体を含む細胞用培地で調整しマイクロプレート（住友ベーラクイト社製ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅＭＳ－９０９６Ｕ）のウェルに１ウェルあたり１００μＬになるように播種した。その後、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で３日間培養した。スフェロイド形成性は、３日後に細胞培養状態を透過式光学顕微鏡４０倍で写真撮影し、細胞の形態を観察することによって、以下の基準で判定した。評価結果を表８に示す。
〇：１つのスフェロイドを形成（良好）
△：複数個のスフェロイドを形成（やや不良）
×：スフェロイドを形成しない（不良）
【0153】
＜ＡＴＰ活性＞
ＤＭＥＭ培地にアミノ酸系重合体を含む細胞用培地添加剤を表８に記載の濃度になるように添加し、攪拌をすることで細胞培養用培地を調製した。ヒト肝がん細胞株ＨｅｐＧ２細胞を１００，０００細胞／ｍＬとなるように、上記のアミノ酸系重合体を含む細胞用培地添加剤を添加した細胞培養用培地で調整し、９６ウェルＵ底マイクロプレートのウェルに１ウェルあたり１００μＬになるように分注した。その後、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で５日間培養した。
ＡＴＰ活性は、１、５日後にＡＴＰアッセイを行うことによって評価した。具体的には、培養後のウェルに１００μＬのＡＴＰ試薬（『塊』のＡＴＰ測定試薬：東洋ビーネット社製）を添加、５回ピペッティングし、５分間室温で静置した後、１００μＬの試薬・細胞溶解液を別プレートに分取し１分間撹拌した。これをＭｉｔｈｒａｓＬＢ９４０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製）を用いて発光量を測定した。評価結果を表８に示す。
ＡＴＰ活性＝（培養５日後の発光量）／（培養１日後の発光量）×１００
◎：１２０％≦ＡＴＰ活性ＡＴＰ活性がかなり高い。（非常に良好）
〇：５０％≦ＡＴＰ活性＜１２０％ＡＴＰ活性が高い。（良好）
△：２０％≦ＡＴＰ活性＜５０％ＡＴＰ活性がやや高い。（可）
×：ＡＴＰ活性＜２０％ＡＴＰ活性が低い。（不良）
ＤＭＥＭ培地にアミノ酸系重合体を含む細胞用培地添加剤を表８に記載の濃度になるように添加し、攪拌をすることで細胞培養用培地を調製した。ヒト肝がん細胞株ＨｅｐＧ２細胞を１００，０００細胞／ｍＬとなるように、上記のアミノ酸系重合体を含む細胞用培地添加剤を添加した細胞培養用培地で調整し、９６ウェルＵ底マイクロプレートのウェルに１ウェルあたり１００μＬになるように分注した。その後、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で５日間培養した。
ＡＴＰ活性は、１、５日後にＡＴＰアッセイを行うことによって評価した。具体的には、培養後のウェルに１００μＬのＡＴＰ試薬（『塊』のＡＴＰ測定試薬：東洋ビーネット社製）を添加、５回ピペッティングし、５分間室温で静置した後、１００μＬの試薬・細胞溶解液を別プレートに分取し１分間撹拌した。これをＭｉｔｈｒａｓＬＢ９４０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製）を用いて発光量を測定した。評価結果を表８に示す。
ＡＴＰ活性＝（培養５日後の発光量）／（培養１日後の発光量）×１００
◎：１２０％≦ＡＴＰ活性ＡＴＰ活性がかなり高い。（非常に良好）
〇：５０％≦ＡＴＰ活性＜１２０％ＡＴＰ活性が高い。（良好）
△：２０％≦ＡＴＰ活性＜５０％ＡＴＰ活性がやや高い。（可）
×：ＡＴＰ活性＜２０％ＡＴＰ活性が低い。（不良）
【0154】
【表8】
【0155】
本発明のアミノ酸系重合体１～１６を使用した実施例３－１～３－１８は、優れた細胞凝集物発生抑制性、抗体産生性やアルブミン産生性、薬物代謝酵素の活性、遺伝子発現量、スフェロイド形成性、スフェロイドのＡＴＰ活性を示すことが分かった。これは、アミノ酸残基を有するアミノ酸系重合体が、細胞の代謝活性や細胞外環境を適切に制御したため細胞培養時における生理活性物質の高産生化に有用であると考えられる。一方で、比較例３－１、３－２の細胞培養用添加剤は、どの評価においても実施例３－１～３－１８の細胞用培地添加剤に劣る結果となった。
【0156】
続いて、以下に細胞凍結保護剤、および細胞凍結保存液の評価を示す。
【0157】
＜細胞凍結保存液の調製＞
【0158】
［実施例４－１］
・細胞凍結保存液１
重合体製造例１であるアミノ酸系重合体１を３０ｗ／ｖ％とＤＭＳＯを５ｗ／ｖ％、富士フィルム和光純薬製のＤＭＥＭ（製品コード：０４２－３２２５５）７０ｖ／ｖ％を配合し、十分均一になるまでピペッティングし、溶解させた後、これをフィルターで濾過して無菌的な細胞凍結保存液１を得た。
［実施例４－２～４－１８、比較例４－１～４－６］
表９に示す配合組成で、実施例４－１と同様の方法で細胞凍結保存液２～２４を得た。
・細胞凍結保存液１
重合体製造例１であるアミノ酸系重合体１を３０ｗ／ｖ％とＤＭＳＯを５ｗ／ｖ％、富士フィルム和光純薬製のＤＭＥＭ（製品コード：０４２－３２２５５）７０ｖ／ｖ％を配合し、十分均一になるまでピペッティングし、溶解させた後、これをフィルターで濾過して無菌的な細胞凍結保存液１を得た。
［実施例４－２～４－１８、比較例４－１～４－６］
表９に示す配合組成で、実施例４－１と同様の方法で細胞凍結保存液２～２４を得た。
【0159】
＜浸透圧の測定＞
薬局方に準拠する「氷点降下法」により、ＧＯＮＯＴＥＣ社製浸透圧測定装置（オズ゛モメータ）を用いて、細胞凍結保護液の浸透圧を測定した。結果を表９に示す。
薬局方に準拠する「氷点降下法」により、ＧＯＮＯＴＥＣ社製浸透圧測定装置（オズ゛モメータ）を用いて、細胞凍結保護液の浸透圧を測定した。結果を表９に示す。
【0160】
＜細胞（シングルセル）の凍結保存＞
１５ｍＬ遠心管に９ｍＬのＭＥＭα培地を分注し、洗浄用培地とした。ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（タカラバイオ社製、Ｃ－１２９７７）（パッセージ数：２）が凍結保存され、入っているクライオチューブを３７℃温水浴にて振盪し、細胞を解凍した。解凍した細胞を洗浄用ＭＥＭα培地が入った１５ｍＬ遠沈管に加え、遠心（５００×ｇ３分、室温）を行った。上清をアスピレートし、ペレットをタッピングし、ＭＥＭα培地を２ｍＬ添加し、の細胞培養用φ１００ｍｍディッシュ（ＡＧＣテクノグラス製、３０２０－１００）に、細胞を播種した。
３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて３日培養した。培養３日後、１ｍＬのトリプシンＥＤＴＡ溶液を加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで３分間静置し、細胞を細胞培養用ディッシュから剥離させ、細胞を回収した。２継代目の細胞（パッセージ数：４）をヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（以下、Ｐ－ｈＡＴＭＳＣ細胞とも呼ぶ）として以下の実験で使用した。
細胞凍結保存液１～２２ １ｍＬを、上記で得られたＰ－ｈＡＴＭＳＣ細胞の総数が１×１０６の細胞に添加し、数回ピペッティングした後に、クライオチューブに移した。そして、適量の２－プロパノールを入れたＭｒ．Ｆｒｏｓｔｙに、クライオチューブを入れ、蓋を閉め、―８０℃に設定した冷凍庫で水平に１２時間保管した後に、―１５２℃に設定した冷蔵庫で水平に３日保管した。
１５ｍＬ遠心管に９ｍＬのＭＥＭα培地を分注し、洗浄用培地とした。ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（タカラバイオ社製、Ｃ－１２９７７）（パッセージ数：２）が凍結保存され、入っているクライオチューブを３７℃温水浴にて振盪し、細胞を解凍した。解凍した細胞を洗浄用ＭＥＭα培地が入った１５ｍＬ遠沈管に加え、遠心（５００×ｇ３分、室温）を行った。上清をアスピレートし、ペレットをタッピングし、ＭＥＭα培地を２ｍＬ添加し、の細胞培養用φ１００ｍｍディッシュ（ＡＧＣテクノグラス製、３０２０－１００）に、細胞を播種した。
３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて３日培養した。培養３日後、１ｍＬのトリプシンＥＤＴＡ溶液を加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで３分間静置し、細胞を細胞培養用ディッシュから剥離させ、細胞を回収した。２継代目の細胞（パッセージ数：４）をヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（以下、Ｐ－ｈＡＴＭＳＣ細胞とも呼ぶ）として以下の実験で使用した。
細胞凍結保存液１～２２ １ｍＬを、上記で得られたＰ－ｈＡＴＭＳＣ細胞の総数が１×１０６の細胞に添加し、数回ピペッティングした後に、クライオチューブに移した。そして、適量の２－プロパノールを入れたＭｒ．Ｆｒｏｓｔｙに、クライオチューブを入れ、蓋を閉め、―８０℃に設定した冷凍庫で水平に１２時間保管した後に、―１５２℃に設定した冷蔵庫で水平に３日保管した。
【0161】
＜スフェロイド（細胞凝集体）の凍結保存＞
上記で得られたＰ－ｈＡＴＭＳＣ細胞を培養シャーレ上で培養後、トリプシン処理により剥離、回収した。その後、９６ｗｅｌｌＵ底プレート（住友ベークライト（株）製、ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）、ＭＳ－９０９６Ｕ）に１０００個細胞／ウェルの細胞数で播種し、浮遊培養することでスフェロイド形成を誘導した。培養３日後に直径約２００μｍのスフェロイドを得た。
上記のように作成したスフェロイド５０個をマイクロピペッターにて培養液中から回収し、遠心分離（５００×ｇ、３分、室温）をかけた後、上清をアスピレートし、ペレットをタッピングした。ペレットに細胞凍結保存液（Ｓ―１～１７）を添加し、スフェロイドを細胞凍結保存液中で数回ピペッティングした後に、クライオチューブに移し、蓋を閉め、―８０℃に設定した冷凍庫で水平に１２時間保管した。１２時間後、―１５２℃に設定した冷蔵庫で水平に３日保管した。
上記で得られたＰ－ｈＡＴＭＳＣ細胞を培養シャーレ上で培養後、トリプシン処理により剥離、回収した。その後、９６ｗｅｌｌＵ底プレート（住友ベークライト（株）製、ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）、ＭＳ－９０９６Ｕ）に１０００個細胞／ウェルの細胞数で播種し、浮遊培養することでスフェロイド形成を誘導した。培養３日後に直径約２００μｍのスフェロイドを得た。
上記のように作成したスフェロイド５０個をマイクロピペッターにて培養液中から回収し、遠心分離（５００×ｇ、３分、室温）をかけた後、上清をアスピレートし、ペレットをタッピングした。ペレットに細胞凍結保存液（Ｓ―１～１７）を添加し、スフェロイドを細胞凍結保存液中で数回ピペッティングした後に、クライオチューブに移し、蓋を閉め、―８０℃に設定した冷凍庫で水平に１２時間保管した。１２時間後、―１５２℃に設定した冷蔵庫で水平に３日保管した。
【0162】
＜細胞の解凍＞
クライオチューブを３７℃温水浴にて振盪し、細胞を解凍した。
クライオチューブを３７℃温水浴にて振盪し、細胞を解凍した。
【0163】
＜細胞の生存率評価＞
解凍した細胞懸濁液を１００μＬ分注し、１００μＬの０．５％のトリパンブルー染色液をピペットで注いた。数回のピペット操作により混合した後、トリパンブルー染色細胞懸濁液を血球計算盤に乗せ、１６の小さな四角を含む各１ｍｍ×１ｍｍの４つの大きな四角内で、青色に染色された死細胞と、染色されない生細胞の数を計数した。
解凍した細胞懸濁液を１００μＬ分注し、１００μＬの０．５％のトリパンブルー染色液をピペットで注いた。数回のピペット操作により混合した後、トリパンブルー染色細胞懸濁液を血球計算盤に乗せ、１６の小さな四角を含む各１ｍｍ×１ｍｍの４つの大きな四角内で、青色に染色された死細胞と、染色されない生細胞の数を計数した。
【0164】
＜評価基準＞
細胞の生存率％を下記の式にて算出した。
（生存率％）＝（非染色細胞の数）／（非染色細胞と青色に染色された細胞との総数）
◎：生存率％≧９０％（特に良好）
〇：９０％＞生存率％≧７５％（良好）
△：７５％＞生存率％≧６０％（可）
×：６０％＞生存率％（不良）
評価結果を表９に示す。
細胞の生存率％を下記の式にて算出した。
（生存率％）＝（非染色細胞の数）／（非染色細胞と青色に染色された細胞との総数）
◎：生存率％≧９０％（特に良好）
〇：９０％＞生存率％≧７５％（良好）
△：７５％＞生存率％≧６０％（可）
×：６０％＞生存率％（不良）
評価結果を表９に示す。
【0165】
＜シングルセルの増殖性評価＞
１０％のウシ胎児血清と、１％のペニシリンーストレプトマイシンーアンホテリシンＢ（共にＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）とを添加したＤＭＥＭ（以下：（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％ＰＳ）培地）を１５ｍＬ遠心管に９ｍＬ分注し、洗浄用培地とした。解凍した細胞を洗浄用培地へ加え、遠心分離（５００×ｇ３分、室温）を行った。上清をアスピレートし、ペレットをタッピングし、（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％ＰＳ）培地を２ｍＬ添加し、ＡＧＣテクノグラス製のφ３５ｍｍＩＷＡＫＩ接着処理ディッシュに細胞を播種した。播種する前に１００μＬ分注し、細胞数を血球計算盤で計測した。３７℃、５％ＣＯ２にて、インキュベーターで３日培養した。培養３日後、０．５ｍＬのトリプシンＥＤＴＡ溶液を加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで３分間静置し、残りの細胞を接着処理から剥離した。剥離した細胞の数は血球計算盤で計測した。細胞増殖率を、（培養３日後細胞の数）／（播種した細胞の数）×１００％によって計算した。評価結果を表９に示す。
＜評価基準＞
◎：増殖率％≧２００％（特に良好）
〇：２００％＞増殖率％≧１５０％（良好）
△：１５０％＞増殖率％≧１０５％（可）
×：１０５％＞増殖率％（不良）
１０％のウシ胎児血清と、１％のペニシリンーストレプトマイシンーアンホテリシンＢ（共にＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）とを添加したＤＭＥＭ（以下：（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％ＰＳ）培地）を１５ｍＬ遠心管に９ｍＬ分注し、洗浄用培地とした。解凍した細胞を洗浄用培地へ加え、遠心分離（５００×ｇ３分、室温）を行った。上清をアスピレートし、ペレットをタッピングし、（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％ＰＳ）培地を２ｍＬ添加し、ＡＧＣテクノグラス製のφ３５ｍｍＩＷＡＫＩ接着処理ディッシュに細胞を播種した。播種する前に１００μＬ分注し、細胞数を血球計算盤で計測した。３７℃、５％ＣＯ２にて、インキュベーターで３日培養した。培養３日後、０．５ｍＬのトリプシンＥＤＴＡ溶液を加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで３分間静置し、残りの細胞を接着処理から剥離した。剥離した細胞の数は血球計算盤で計測した。細胞増殖率を、（培養３日後細胞の数）／（播種した細胞の数）×１００％によって計算した。評価結果を表９に示す。
＜評価基準＞
◎：増殖率％≧２００％（特に良好）
〇：２００％＞増殖率％≧１５０％（良好）
△：１５０％＞増殖率％≧１０５％（可）
×：１０５％＞増殖率％（不良）
【0166】
＜シングルセルの未分化評価―定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）＞
増殖性評価で使用した培養の３日後の細胞に、ＴＲＩｚｏｌ試薬（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ．ＵＳＡ）で培養物から全ＲＮＡを抽出し、製造業者のプロトコルに従ってＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭＲＴＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ）（Ｔａｋａｒａ、Ｃａｔ＃ＲＲ０３６Ａ）でｃＤＮＡを合成した。ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＤｉｃｅＲｅａｌＴｉｍｅＳｙｓｔｅｍ（ＴａｋａｒａＴＰ９００）を用いて、ＴＢＧｒｅｅｎＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＩＩ（Ｔａｋａｒａ、ＲＲ８２０Ａ）を用いて３回行った。
ｑＲＴ－ＰＣＲの容量は２５μＬであり、１μＬ（μｇ）ｃＤＮＡ、１２．５μＬＴＢＧｒｅｅｎＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＩＩ（Ｔａｋａｒａ、ＲＲ８２０Ａ）、それぞれ１μＬの特異的フォワード及びリバースプライマー、並びに９．５μＬ滅菌水を含有する。
増殖性評価で使用した培養の３日後の細胞に、ＴＲＩｚｏｌ試薬（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ．ＵＳＡ）で培養物から全ＲＮＡを抽出し、製造業者のプロトコルに従ってＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭＲＴＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ）（Ｔａｋａｒａ、Ｃａｔ＃ＲＲ０３６Ａ）でｃＤＮＡを合成した。ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＤｉｃｅＲｅａｌＴｉｍｅＳｙｓｔｅｍ（ＴａｋａｒａＴＰ９００）を用いて、ＴＢＧｒｅｅｎＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＩＩ（Ｔａｋａｒａ、ＲＲ８２０Ａ）を用いて３回行った。
ｑＲＴ－ＰＣＲの容量は２５μＬであり、１μＬ（μｇ）ｃＤＮＡ、１２．５μＬＴＢＧｒｅｅｎＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＩＩ（Ｔａｋａｒａ、ＲＲ８２０Ａ）、それぞれ１μＬの特異的フォワード及びリバースプライマー、並びに９．５μＬ滅菌水を含有する。
【0167】
ｑＲＴ－ＰＣＲは、９５℃で３０秒間、続いて、９５℃で５秒間、６０℃で３０秒間の４０サイクル、次いで、９５℃で１５秒間、６０℃で３０秒間、９５℃で１５秒間の反応を行った。
データは、ΔΔＣｔ比定量により解析した。データをＧＡＰＤＨレベルに対して標準化し、対象値と比較した。
データは、ΔΔＣｔ比定量により解析した。データをＧＡＰＤＨレベルに対して標準化し、対象値と比較した。
【0168】
使用したプライマーの配列は以下の通りである：
ＳＳＥＡ１（Ｆｕｔ４としても知られる）
フォワードプライマー：ＧＣＡＧＧＧＣＣＣＡＡＧＡＴＴＡＡＣＴＧＡＣ（配列番号１）
リバースプライマー：ＡＡＧＣＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＡＡＧＡＡ（配列番号２）
Ｓｏｘ２
フォワードプライマー：ＧＴＴＣＴＡＧＴＧＧＴＡＣＧＴＴＡＧＧＣＧＣＴＴＣ（配列番号３）
リバースプライマー：ＴＣＧＣＣＣＧＧＡＧＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＴＡ（配列番号４）
Ｎａｎｏｇ
フォワードプライマー：ＴＧＣＣＴＣＡＣＡＣＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣ（配列番号５）
リバースプライマー：ＡＧＴＧＧＧＴＴＧＴＴＴＧＣＣＴＴＴＧＧ（配列番号６）
Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｇａｐｄｈ）（内部陽性対照として）
ＳＳＥＡ１（Ｆｕｔ４としても知られる）
フォワードプライマー：ＧＣＡＧＧＧＣＣＣＡＡＧＡＴＴＡＡＣＴＧＡＣ（配列番号１）
リバースプライマー：ＡＡＧＣＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＡＡＧＡＡ（配列番号２）
Ｓｏｘ２
フォワードプライマー：ＧＴＴＣＴＡＧＴＧＧＴＡＣＧＴＴＡＧＧＣＧＣＴＴＣ（配列番号３）
リバースプライマー：ＴＣＧＣＣＣＧＧＡＧＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＴＡ（配列番号４）
Ｎａｎｏｇ
フォワードプライマー：ＴＧＣＣＴＣＡＣＡＣＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣ（配列番号５）
リバースプライマー：ＡＧＴＧＧＧＴＴＧＴＴＴＧＣＣＴＴＴＧＧ（配列番号６）
Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｇａｐｄｈ）（内部陽性対照として）
【0169】
[統計解析]
データは、一元配置分散分析（Ｏｎｅ－ｗａｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆｖａｒｉａｎｃｅ）（ＡＮＯＶＡ）により分析した。有意なF比の場合、Ｔｕｋｅｙの事後試験を行った．有意水準Ｐ＜０．０５とし、他に示さない限り平均±標準偏差として示した。すべてのデータは、特に示さない限り少なくとも３回独立した実験から得た。
データは、一元配置分散分析（Ｏｎｅ－ｗａｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆｖａｒｉａｎｃｅ）（ＡＮＯＶＡ）により分析した。有意なF比の場合、Ｔｕｋｅｙの事後試験を行った．有意水準Ｐ＜０．０５とし、他に示さない限り平均±標準偏差として示した。すべてのデータは、特に示さない限り少なくとも３回独立した実験から得た。
【0170】
・遺伝子発現量の評価基準
[ＳＳＥＡ１、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ]
◎：２≦遺伝子発現量；遺伝子発現量がかなり高い。
〇：１．５≦遺伝子発現量＜２；遺伝子発現量が高い。
△：１≦遺伝子発現量＜１．５；遺伝子発現量がやや高い。
×：遺伝子発現量＜１；遺伝子発現量が低い。
[ＳＳＥＡ１、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ]
◎：２≦遺伝子発現量；遺伝子発現量がかなり高い。
〇：１．５≦遺伝子発現量＜２；遺伝子発現量が高い。
△：１≦遺伝子発現量＜１．５；遺伝子発現量がやや高い。
×：遺伝子発現量＜１；遺伝子発現量が低い。
【0171】
＜スフェロイド（細胞凝集体）の生存率評価＞
解凍したスフェロイドを洗浄用培地へ加え、遠心分離（５００×ｇ３分、室温）を行った。上清をアスピレートし、ＰＢＳを２ｍｌ添加し、培地洗浄した後、上清を更にアスピレートし、Ａｃｃｕｍａｘ（イノベーティブセルテクノロジーズ製）を２ｍＬ添加し、ペレットをタッピングした後に、２０分間静置し、単一浮遊細胞を得た。洗浄用培地へ加え、遠心分離（５００ｘｇ３分、室温）を行い、上清をアスピレートで除去した。ＰＢＳを２ｍＬ添加した後、１００μＬ分注し、１００μＬの０．５％のトリパンブルー染色液にピペットで注いた。数回のピペット操作により混合した後、トリパンブルー染色細胞懸濁液を血球計算盤に乗せ、青色に染色された死細胞と、染色されない生細胞の数を計数した。
解凍したスフェロイドを洗浄用培地へ加え、遠心分離（５００×ｇ３分、室温）を行った。上清をアスピレートし、ＰＢＳを２ｍｌ添加し、培地洗浄した後、上清を更にアスピレートし、Ａｃｃｕｍａｘ（イノベーティブセルテクノロジーズ製）を２ｍＬ添加し、ペレットをタッピングした後に、２０分間静置し、単一浮遊細胞を得た。洗浄用培地へ加え、遠心分離（５００ｘｇ３分、室温）を行い、上清をアスピレートで除去した。ＰＢＳを２ｍＬ添加した後、１００μＬ分注し、１００μＬの０．５％のトリパンブルー染色液にピペットで注いた。数回のピペット操作により混合した後、トリパンブルー染色細胞懸濁液を血球計算盤に乗せ、青色に染色された死細胞と、染色されない生細胞の数を計数した。
【0172】
＜評価基準＞
細胞の生存率％を下記の式にて算出した。
（生存率％）＝（非染色細胞の数）／（非染色細胞と青色に染色された細胞との総数）
◎：生存率％≧５０％（特に良好）
○：５０％＞生存率％≧４０％（良好）
△：４０％＞生存率％≧２０％（可）
×：２０％＞生存率％（不良）
評価結果を表９に示す。
細胞の生存率％を下記の式にて算出した。
（生存率％）＝（非染色細胞の数）／（非染色細胞と青色に染色された細胞との総数）
◎：生存率％≧５０％（特に良好）
○：５０％＞生存率％≧４０％（良好）
△：４０％＞生存率％≧２０％（可）
×：２０％＞生存率％（不良）
評価結果を表９に示す。
【0173】
＜再播種におけるスフェロイドの増殖性評価＞
細胞凍結保存液１～２２を使用し、スフェロイド（細胞凝集体）の凍結実験の保存全ての培養物を０．２５％Ｔｒｙｓｉｎ－ＥＤＴＡで３７℃３分間解離させた後に、ＭＥＭα培地で２回洗浄し、３００ｇで５分間４℃遠心分離した後、スフェロイド及び単細胞を回収した。
ＭＥＭα中に、播種初期の細胞数を、５×１０４細胞/ウェルになるように調整し、ＴＰＰ社製培養用平底２４平面ウェル（ポリスチレン製、培養表面は接着処理有）に播種した。培養後６日目にスフェロイド縁部の接着、伸展状態を観察し、細胞のコンフルエント状態を評価した。
・再播種におけるスフェロイドの細胞増殖性の評価基準
◎：視野にスフェロイドが観察されず、細胞の接着、伸展が観察され、細胞がコンフルエントとなっている。細胞の増殖性が優れている。
〇：視野にスフェロイドが観察されず、細胞の接着、伸展が観察されるが、細胞がコンフルエントとなっていない。細胞の増殖性が良好である。
△：視野に直径が２００μｍ以下（２００μｍを含む）のスフェロイドが１つ以上、培養面に残留していることが観察される。細胞の増殖性がやや良好となっている。
×：視野に直径が２００μｍ以上のスフェロイドが１つ以上、培養面に残留していることが観察される。細胞の増殖性が不良となる。
細胞凍結保存液１～２２を使用し、スフェロイド（細胞凝集体）の凍結実験の保存全ての培養物を０．２５％Ｔｒｙｓｉｎ－ＥＤＴＡで３７℃３分間解離させた後に、ＭＥＭα培地で２回洗浄し、３００ｇで５分間４℃遠心分離した後、スフェロイド及び単細胞を回収した。
ＭＥＭα中に、播種初期の細胞数を、５×１０４細胞/ウェルになるように調整し、ＴＰＰ社製培養用平底２４平面ウェル（ポリスチレン製、培養表面は接着処理有）に播種した。培養後６日目にスフェロイド縁部の接着、伸展状態を観察し、細胞のコンフルエント状態を評価した。
・再播種におけるスフェロイドの細胞増殖性の評価基準
◎：視野にスフェロイドが観察されず、細胞の接着、伸展が観察され、細胞がコンフルエントとなっている。細胞の増殖性が優れている。
〇：視野にスフェロイドが観察されず、細胞の接着、伸展が観察されるが、細胞がコンフルエントとなっていない。細胞の増殖性が良好である。
△：視野に直径が２００μｍ以下（２００μｍを含む）のスフェロイドが１つ以上、培養面に残留していることが観察される。細胞の増殖性がやや良好となっている。
×：視野に直径が２００μｍ以上のスフェロイドが１つ以上、培養面に残留していることが観察される。細胞の増殖性が不良となる。
【0174】
＜スフェロイドの未分化評価―定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）＞
増殖性評価で使用した培養の３日後の細胞に、ＴＲＩｚｏｌ試薬（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ．ＵＳＡ）で培養物から全ＲＮＡを抽出し、製造業者のプロトコルに従ってＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭＲＴＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ）（Ｔａｋａｒａ、Ｃａｔ＃ＲＲ０３６Ａ）でｃＤＮＡを合成した。ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＤｉｃｅＲｅａｌＴｉｍｅＳｙｓｔｅｍ（ＴａｋａｒａＴＰ９００）を用いて、ＴＢＧｒｅｅｎＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＩＩ（Ｔａｋａｒａ、ＲＲ８２０Ａ）を用いて３回行った。
ｑＲＴ－ＰＣＲの容量は２５μＬであり、１μＬ（μｇ）ｃＤＮＡ、１２．５μＬＴＢＧｒｅｅｎＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＩＩ（Ｔａｋａｒａ、ＲＲ８２０Ａ）、それぞれ１μＬの特異的フォワード及びリバースプライマー、並びに９．５μＬ滅菌水を含有する。
増殖性評価で使用した培養の３日後の細胞に、ＴＲＩｚｏｌ試薬（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ．ＵＳＡ）で培養物から全ＲＮＡを抽出し、製造業者のプロトコルに従ってＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭＲＴＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＰｅｒｆｅｃｔＲｅａｌＴｉｍｅ）（Ｔａｋａｒａ、Ｃａｔ＃ＲＲ０３６Ａ）でｃＤＮＡを合成した。ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＤｉｃｅＲｅａｌＴｉｍｅＳｙｓｔｅｍ（ＴａｋａｒａＴＰ９００）を用いて、ＴＢＧｒｅｅｎＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＩＩ（Ｔａｋａｒａ、ＲＲ８２０Ａ）を用いて３回行った。
ｑＲＴ－ＰＣＲの容量は２５μＬであり、１μＬ（μｇ）ｃＤＮＡ、１２．５μＬＴＢＧｒｅｅｎＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＩＩ（Ｔａｋａｒａ、ＲＲ８２０Ａ）、それぞれ１μＬの特異的フォワード及びリバースプライマー、並びに９．５μＬ滅菌水を含有する。
【0175】
ｑＲＴ－ＰＣＲは、９５℃で３０秒間、続いて、９５℃で５秒間、６０℃で３０秒間の４０サイクル、次いで、９５℃で１５秒間、６０℃で３０秒間、９５℃で１５秒間の反応を行った。
データは、ΔΔＣｔ比定量により解析した。データをＧＡＰＤＨレベルに対して標準化し、対象値と比較した。
データは、ΔΔＣｔ比定量により解析した。データをＧＡＰＤＨレベルに対して標準化し、対象値と比較した。
【0176】
使用したプライマーの配列は以下の通りである：
ＳＳＥＡ１（Ｆｕｔ４としても知られる）
フォワードプライマー：ＧＣＡＧＧＧＣＣＣＡＡＧＡＴＴＡＡＣＴＧＡＣ（配列番号１）
リバースプライマー：ＡＡＧＣＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＡＡＧＡＡ（配列番号２）
Ｓｏｘ２
フォワードプライマー：ＧＴＴＣＴＡＧＴＧＧＴＡＣＧＴＴＡＧＧＣＧＣＴＴＣ（配列番号３）
リバースプライマー：ＴＣＧＣＣＣＧＧＡＧＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＴＡ（配列番号４）
Ｎａｎｏｇ
フォワードプライマー：ＴＧＣＣＴＣＡＣＡＣＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣ（配列番号５）
リバースプライマー：ＡＧＴＧＧＧＴＴＧＴＴＴＧＣＣＴＴＴＧＧ（配列番号６）
Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｇａｐｄｈ）（内部陽性対照として）
ＳＳＥＡ１（Ｆｕｔ４としても知られる）
フォワードプライマー：ＧＣＡＧＧＧＣＣＣＡＡＧＡＴＴＡＡＣＴＧＡＣ（配列番号１）
リバースプライマー：ＡＡＧＣＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＡＡＧＡＡ（配列番号２）
Ｓｏｘ２
フォワードプライマー：ＧＴＴＣＴＡＧＴＧＧＴＡＣＧＴＴＡＧＧＣＧＣＴＴＣ（配列番号３）
リバースプライマー：ＴＣＧＣＣＣＧＧＡＧＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＴＡ（配列番号４）
Ｎａｎｏｇ
フォワードプライマー：ＴＧＣＣＴＣＡＣＡＣＧＧＡＧＡＣＴＧＴＣ（配列番号５）
リバースプライマー：ＡＧＴＧＧＧＴＴＧＴＴＴＧＣＣＴＴＴＧＧ（配列番号６）
Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｇａｐｄｈ）（内部陽性対照として）
【0177】
[統計解析]
データは、一元配置分散分析（Ｏｎｅ－ｗａｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆｖａｒｉａｎｃｅ）（ＡＮＯＶＡ）により分析した。有意なF比の場合、Ｔｕｋｅｙの事後試験を行った．有意水準Ｐ＜０．０５とし、他に示さない限り平均±標準偏差として示した。すべてのデータは、特に示さない限り少なくとも３回独立した実験から得た。
データは、一元配置分散分析（Ｏｎｅ－ｗａｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆｖａｒｉａｎｃｅ）（ＡＮＯＶＡ）により分析した。有意なF比の場合、Ｔｕｋｅｙの事後試験を行った．有意水準Ｐ＜０．０５とし、他に示さない限り平均±標準偏差として示した。すべてのデータは、特に示さない限り少なくとも３回独立した実験から得た。
【0178】
・遺伝子発現量の評価基準
[ＳＳＥＡ１、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ]
◎：２≦遺伝子発現量；遺伝子発現量がかなり高い。
〇：１．５≦遺伝子発現量＜２；遺伝子発現量が高い。
△：１≦遺伝子発現量＜１．５；遺伝子発現量がやや高い。
×：遺伝子発現量＜１；遺伝子発現量が低い。
[ＳＳＥＡ１、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ]
◎：２≦遺伝子発現量；遺伝子発現量がかなり高い。
〇：１．５≦遺伝子発現量＜２；遺伝子発現量が高い。
△：１≦遺伝子発現量＜１．５；遺伝子発現量がやや高い。
×：遺伝子発現量＜１；遺伝子発現量が低い。
【0179】
【表9】
【0180】
以上から、本発明の細胞凍結保存液を用いることで、解凍後の細胞の生存率、増殖率、未分化性が良好であることが示された。
【0181】
これは本発明の細胞凍結保存液に含まれるアミノ酸系重合体が、近傍の水と強く相互作用している大量の不凍水を含有し、凍結工程において通常の水のような水素結合を形成せず、凍結の際の氷の結晶成長による物理的なダメージを回避し、解凍後の細胞生存率、増殖率を確保したためであると考えられる。
また、細胞凍結保護剤中の不凍水の存在により、細胞膜外での安定な水和状態を維持し、低分子溶剤による膜内へ浸透速度の制御は可能となり、スフェロイドの凍結の過程において、スフェロイド内部と周辺部で凍結に時間差を緩和することで、解凍後のスフェロイドの生存率を確保したためであると考えられる。
それに対して、比較例４－１～４－６はアミノ酸系共重合体を含まない細胞凍結保存液であり、スフェロイドの凍結保存ができなかったと考えられる。
また、細胞凍結保護剤中の不凍水の存在により、細胞膜外での安定な水和状態を維持し、低分子溶剤による膜内へ浸透速度の制御は可能となり、スフェロイドの凍結の過程において、スフェロイド内部と周辺部で凍結に時間差を緩和することで、解凍後のスフェロイドの生存率を確保したためであると考えられる。
それに対して、比較例４－１～４－６はアミノ酸系共重合体を含まない細胞凍結保存液であり、スフェロイドの凍結保存ができなかったと考えられる。