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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-19
(45)【発行日】2024-08-27
(54)【発明の名称】分化誘導用ペプチド
(51)【国際特許分類】
C07K 14/00 20060101AFI20240820BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240820BHJP
【ＦＩ】
C07K14/00 ZNA
C07K19/00
【請求項の数】
2
(21)【出願番号】P 2022515373
(86)(22)【出願日】2021-04-12
(86)【国際出願番号】 JP2021015186
(87)【国際公開番号】W WO2021210537
(87)【国際公開日】2021-10-21
【審査請求日】2023-01-10
(31)【優先権主張番号】P 2020071429
(32)【優先日】2020-04-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000001993
【氏名又は名称】株式会社島津製作所
(73)【特許権者】
【識別番号】519135633
【氏名又は名称】公立大学法人大阪
(74)【代理人】
【識別番号】110004233
【氏名又は名称】弁理士法人ＮＳＩ国際特許事務所
(74)【代理人】
【識別番号】100104802
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 尚人
(74)【代理人】
【識別番号】100186772
【弁理士】
【氏名又は名称】入佐 大心
(72)【発明者】
【氏名】松井 勇人
(72)【発明者】
【氏名】榎本 詢子
(72)【発明者】
【氏名】道上 雅孝
(72)【発明者】
【氏名】藤井 郁雄
【審査官】三谷 直也
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１９－１７２６４７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１７－１３２７４３（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許第０６５４８６３４（ＵＳ，Ｂ１）
【文献】特表２０１１－５０４８８８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５１２６７２（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
Ｇｏｏｇｌｅ／Ｇｏｏｇｌｅ Ｓｃｈｏｌａｒ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記配列番号９のアミノ酸配列である、合成ペプチド。
【化1】
【請求項2】
ＷＱＰＰＲＡＲＩＧ（配列番号４９）が、下記配列番号９、２７、４７、または４８に融合したアミノ酸配列である、合成ペプチド。【化2】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２０年４月１３日に日本国特許庁に出願された日本国出願番号第２０２０－７１４２９号の利益を主張するものである。当該日本国出願は、その出願書類（明細書、特許請求の範囲、図面、要約書）の全体が本明細書に明示されているかのように、全ての目的で参照により本明細書に援用される。
本発明は、再生医療を含む細胞培養の技術分野に属する。本発明は、多能性幹細胞から体細胞へ分化誘導するための液性因子に関するものである。詳しくは、本発明は、多能性幹細胞から体細胞へ分化誘導する際に有用なペプチドに関するものである。
本出願は、２０２０年４月１３日に日本国特許庁に出願された日本国出願番号第２０２０－７１４２９号の利益を主張するものである。当該日本国出願は、その出願書類（明細書、特許請求の範囲、図面、要約書）の全体が本明細書に明示されているかのように、全ての目的で参照により本明細書に援用される。
本発明は、再生医療を含む細胞培養の技術分野に属する。本発明は、多能性幹細胞から体細胞へ分化誘導するための液性因子に関するものである。詳しくは、本発明は、多能性幹細胞から体細胞へ分化誘導する際に有用なペプチドに関するものである。
【背景技術】
【0002】
臓器不全等の治療のため細胞を移植する場合、ドナー不足により、必要な患者にオンデマンドで医療を提供することが困難であることが問題となっている。そこで、ＥＳ／ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞から必要な臓器を生体外で作製し、患者に適用する再生医療が注目されている。必要な臓器を作製するためには、適切なタイミングで細胞に増殖因子や分化誘導因子等の液性因子を作用し、順に細胞の分化の方向を決定づける手法が一般的である。
【0003】
しかし、使用する液性因子が高価であるため、目的の細胞を作製するためのトータルコストが高くなり、再生医療の普及への障壁になっている。また、作製された細胞の機能が生体内の細胞の機能に及ばないといった問題も挙げられている。前者の液性因子が高価な理由は、液性因子は動物細胞等を使用して作られるタンパク質を主成分とするためである。後者の機能は、生体内の臓器発生を生体外で十分に模倣できていない、すなわち添加する液性因子の組み合わせが不十分であることが機能不足の理由の１つとして考えられる。
【0004】
前者の問題を解決するため、タンパク質を低分子化合物で置き換える方法が試みられている。しかし、作用メカニズムが不明な場合が多く、副作用等の予測できないリスク（例えば感染リスク（ウイルス、マイコプラズマ、プリオンなど）の発生）が危惧される。後者の問題を解決するためには、液性因子の添加濃度の向上や、種類を増やすこと、液性因子の構造改良が有効である。しかし、更なるコスト高や作業の煩雑化を促す。
【0005】
ＥＳ／ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞から必要な臓器を生体外で作製する具体的な技術としては、例えば下記のような技術が知られている。
特許文献１に記載の発明は、多能性幹細胞から心筋細胞を製造する方法に関するものであり、アクチビン、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ等の液性因子を使用して効率よく心筋へ分化誘導することが可能である。しかしながら、複数の液性因子を使用するため高価である。
特許文献１に記載の発明は、多能性幹細胞から心筋細胞を製造する方法に関するものであり、アクチビン、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ等の液性因子を使用して効率よく心筋へ分化誘導することが可能である。しかしながら、複数の液性因子を使用するため高価である。
【0006】
特許文献２～５に記載の発明は、低分子化合物を使用して心筋へ分化誘導する方法に関するものである。この中、特許文献２の発明は、フィーダー細胞であるＯＰ９を使用し、セルソーターを用いた細胞の分離が必要であり作業が煩雑である。特許文献３、４、および５の発明は、心筋細胞に特化した手法であり、他の分化系統へ使用できるか不明である。
【0007】
特許文献６に記載の発明は、膜透過ペプチドとエフリンの部分的ペプチドを含んだペプチドにより、細胞を分化誘導するものである。しかし、当該ペプチドによる分化誘導は肝細胞系列への分化を促進する作用を示すため、他の分化誘導では使用できない可能性が高い。
【0008】
特許文献７に記載の発明は、多能性幹細胞を、ヘパリン結合性増殖因子を含む培地を用いて体細胞に分化誘導する方法において、ラミニンＥ８フラグメントとヘパラン硫酸プロテオグリカンの増殖因子結合部位を含むフラグメントとが連結したコンジュゲートを細胞に接触させることを特徴とする分化誘導方法に関するものである。当該発明により、多能性幹細胞から任意の体細胞へ高効率で分化誘導することができるが、製造に動物細胞を使用するため、コストが高い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【文献】特許第６４２９２８０号公報
【文献】特許第５６１１０３５号公報
【文献】国際公開第２０１２／０２６４９１号
【文献】国際公開第２０１５／１８２７６５号
【文献】国際公開第２０１５／０３７７０６号
【文献】特開２０１１－９８９００号公報
【文献】国際公開第２０１８／０８８５０１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
細胞の高効率な分化誘導を達成するべく、ＥＳ／ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞から分化誘導する手法の開発が盛んに進められている。一方で、そのような系のほとんどは、次のような問題点を１つ以上伴う。
【0011】
・複数の液性因子を使用する。
・液性因子にタンパク質を使用するため高価である。
・タンパク質は細胞を使用して作製するため、内容物の規定（規格化）が困難である。
・作製された、例えば心筋細胞の機能が十分でない。
・液性因子にタンパク質を使用するため高価である。
・タンパク質は細胞を使用して作製するため、内容物の規定（規格化）が困難である。
・作製された、例えば心筋細胞の機能が十分でない。
【0012】
本発明は、ＥＳ／ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞から体細胞（例えば、心筋細胞）へ分化誘導するに際して、上記のような問題点を解決しうる新たな分化誘導剤ないし液性因子（ペプチド）を提供することを主な課題とする。また、本発明の課題として、例えば、多能性幹細胞から体細胞へ分化誘導するための新たな方法や、体細胞の新たな製造方法を提供することを含めることができる。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明者らは、鋭意検討した結果、多能性幹細胞から体細胞へ分化誘導する過程において、１日後の液性因子としてアクチビンと共にＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ；線維芽細胞成長因子）受容体に結合するペプチドを適用することで体細胞へ分化誘導することができ、これによって上記課題を解決しうることを見出し、本発明を完成するに到った。
本発明として、例えば、以下の態様を挙げることができる。
本発明として、例えば、以下の態様を挙げることができる。
【0014】
［１］下記で表されるアミノ酸配列（配列番号１）、またはそのアミノ酸配列のうちの１個もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失および／もしくは付加されて形成されているアミノ酸配列を分子構造上に有する、合成ペプチド：
【0015】
【化1】
【0016】
式中、配列（１）のＮ末端から１番目のＸは、Ａ、Ｒ、Ｑ、Ｖ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、またはＨであり、２番目のＸはＥまたはＨであり、３番目のＸは、Ａ、Ｑ、Ｖ、Ｙ、Ｒ、Ｌ、またはＥであり、４番目のＸはＡまたはＳであり、５番目のＸは、Ｅ、Ｌ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、またはＫであり、６番目のＸは、Ａ、Ｋ、Ｍ、Ｒ、Ｇ、またはＹであり、７番目のＸはＥまたはＤであり、８番目のＸは、Ａ、Ｑ、Ｒ、Ｙ、Ｅ、Ｋ、またはＧであり、９番目のＸはＡまたはＩであり、１０番目のＸは、Ｅ、Ｇ、Ｙ、Ｑ、Ｒ、Ｋ、またはＭであり、１１番目のＸは、Ｆ、Ａ、Ｑ、Ｖ、Ｇ、Ｉ、Ｎ、Ｒ、Ｍ、Ｄ、Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｋ、またはＥであり、１２番目のＸは、Ｇ、Ｖ、Ｋ、Ｔ、Ｐ、Ｒ、Ｍ、Ｎ、Ｅ、Ｄ、Ｓ、Ｃ、Ｗ、Ｈ、またはＡであり、１３番目のＸは、Ｇ、Ｒ、Ｅ、Ｆ、Ａ、Ｋ、Ｐ、Ｎ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｄ、Ｈ、Ｔ、またはＹであり、１４番目のＸは、Ｖ、Ｄ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｎ、Ｈ、Ｇ、Ｆ、Ｅ、Ｒ、Ｐ、Ｙ、またはＫであり、１５番目のＸは、Ｖ、Ｋ、Ｙ、Ｔ、Ｎ、Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｐ、Ｆ、Ｑ、Ｈ、またはＩであり、１６番目のＸは、Ｙ、Ｒ、Ｈ、Ｌ、Ｐ、Ｎ、Ｅ、Ｍ、Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、またはＳであり、１７番目のＸは、Ｓ、Ｋ、Ｍ、Ｇ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｖ、Ｃ、Ｌ、Ｎ、Ａ、Ｅ、Ｐ、またはＲであり、１８番目のＸは、Ｃ、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｒ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｋ、Ｙ、Ｐ、Ｌ、Ｖ、またはＭであり、１９番目のＸは、Ｅ、Ｋ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｒ、Ｇ、Ｉ、Ｆ、Ｔ、Ａ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、Ｍ、またはＹであり、２０番目のＸは、ＷまたはＧであり、２１番目のＸは、Ｑ、Ｋ、Ｆ、またはＨであり、２２番目のＸはＡまたはＬであり、２３番目のＸは、Ｖ、Ｍ、Ｄ、Ｙ、Ｋ、Ｌ、Ｉ、Ｒ、Ｓ、Ｑ、Ｇ、Ｅ、Ｈ、Ｆ、Ｎ、またはＡであり、２４番目のＸは、Ｙ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ｌ、Ｎ、Ｅ、Ｖ、Ｄ、またはＡであり、２５番目のＸは、Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｋ、Ｉ、Ｑ、Ｍ、またはＶであり、２６番目のＸは、Ｙ、Ｗ、Ｇ、Ｌ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｍ、Ｆ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｋ、Ｖ、またはＩであり、２７番目のＸは、Ｋ、Ｒ、またはＱであり、２８番目のＸは、Ｍ、Ｅ、Ｗ、Ｖ、Ｈ、Ｓ、Ｎ、Ｉ、Ｑ、Ｙ、Ｇ、Ｌ、Ｒ、Ｆ、またはＡであり、２９番目のＸは、Ｒ、Ｌ、Ｖ、Ｓ、Ｈ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、Ｋ、Ｑ、Ｗ、Ｅ、Ｉ、Ｇ、またはＡであり、３０番目のＸは、Ｆ、Ｒ、Ｄ、Ｑ、Ｍ、Ｋ、Ｌ、またはＨであり、３１番目のＸは、Ｑ、Ｇ、Ｙ、Ｒ、Ｎ、Ｉ、Ｓ、Ｈ、Ｅ、Ｍ、Ｌ、Ｄ、Ｃ、Ｗ、Ｖ、またはＦをそれぞれ表す。
［２］下記で表されるアミノ酸配列（配列番号２）、またはそのアミノ酸配列のうちの１個もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失および／もしくは付加されて形成されているアミノ酸配列を分子構造上に有する、上記［１］に記載の合成ペプチド：
［２］下記で表されるアミノ酸配列（配列番号２）、またはそのアミノ酸配列のうちの１個もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失および／もしくは付加されて形成されているアミノ酸配列を分子構造上に有する、上記［１］に記載の合成ペプチド：
【0017】
【化2】
【0018】
式中、配列（２）のＮ末端から１番目のＸは、Ｆ、Ａ、Ｑ、Ｖ、Ｇ、Ｉ、Ｎ、Ｒ、Ｍ、Ｄ、Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｋ、またはＥであり、２番目のＸは、Ｇ、Ｖ、Ｋ、Ｔ、Ｐ、Ｒ、Ｍ、Ｎ、Ｅ、Ｄ、Ｓ、Ｃ、Ｗ、Ｈ、またはＡであり、３番目のＸは、Ｇ、Ｒ、Ｅ、Ｆ、Ａ、Ｋ、Ｐ、Ｎ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｄ、Ｈ、Ｔ、またはＹであり、４番目のＸは、Ｖ、Ｄ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｎ、Ｈ、Ｇ、Ｆ、Ｅ、Ｒ、Ｐ、Ｙ、またはＫであり、５番目のＸは、Ｖ、Ｋ、Ｙ、Ｔ、Ｎ、Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｐ、Ｆ、Ｑ、Ｈ、またはＩであり、６番目のＸは、Ｙ、Ｒ、Ｈ、Ｌ、Ｐ、Ｎ、Ｅ、Ｍ、Ａ、Ｇ、Ｖ、またはＩであり、７番目のＸは、Ｓ、Ｋ、Ｍ、Ｇ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｖ、Ｃ、Ｌ、Ｎ、Ａ、Ｅ、またはＲであり、８番目のＸは、Ｃ、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｒ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｋ、Ｙ、Ｐ、Ｌ、Ｖ、またはＭであり、９番目のＸは、Ｅ、Ｋ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｒ、Ｇ、Ｉ、Ｆ、Ｔ、Ａ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、Ｍ、またはＹであり、１０番目のＸは、ＷまたはＧであり、１１番目のＸは、ＱまたはＫであり、１２番目のＸはＡまたはＬであり、１３番目のＸは、Ｖ、Ｍ、Ｄ、Ｙ、Ｋ、Ｌ、Ｉ、Ｒ、Ｓ、Ｑ、Ｇ、またはＥであり、１４番目のＸは、Ｙ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ｌ、Ｎ、Ｅ、またはＶであり、１５番目のＸは、Ｙ、Ｗ、Ｇ、Ｌ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｍ、Ｆ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｋ、またはＶであり、１６番目のＸは、ＫまたはＲであり、１７番目のＸは、Ｍ、Ｅ、Ｗ、Ｖ、Ｈ、Ｓ、Ｎ、Ｉ、Ｑ、Ｙ、Ｇ、Ｌ、またはＲであり、１８番目のＸは、Ｒ、Ｌ、Ｖ、Ｓ、Ｈ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、Ｋ、Ｑ、Ｗ、Ｅ、Ｉ、またはＧであり、１９番目のＸは、Ｑ、Ｇ、Ｙ、Ｒ、Ｎ、Ｉ、Ｓ、Ｈ、Ｅ、Ｍ、Ｌ、Ｄ、Ｃ、Ｗ、またはＶをそれぞれ表す。
［３］前記アミノ酸配列（２）のＮ末端から１番目のＸが、Ｆ、Ａ、Ｑ、Ｖ、Ｇ、Ｉ、Ｎ、Ｒ、Ｍ、Ｄ、Ｌ、Ｓ、またはＰであり、２番目のＸが、Ｇ、Ｖ、Ｋ、Ｔ、Ｐ、Ｒ、Ｍ、Ｎ、Ｅ、Ｄ、Ｓ、Ｃ、Ｗ、またはＨであり、３番目のＸが、Ｇ、Ｒ、Ｅ、Ｆ、Ａ、Ｋ、Ｐ、Ｎ、Ｌ、Ｖ、またはＭであり、４番目のＸが、Ｖ、Ｄ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｎ、Ｈ、Ｇ、Ｆ、Ｅ、またはＲであり、５番目のＸが、Ｖ、Ｋ、Ｙ、Ｔ、Ｎ、Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｐ、Ｆ、Ｑ、またはＨであり、６番目のＸが、Ｙ、Ｒ、Ｈ、Ｌ、Ｐ、Ｎ、Ｅ、Ｍ、Ａ、Ｇ、またはＶであり、７番目のＸが、Ｓ、Ｋ、Ｍ、Ｇ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｖ、Ｃ、Ｌ、Ｎ、またはＡであり、８番目のＸが、Ｃ、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｒ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｋ、Ｙ、またはＰであり、９番目のＸが、Ｅ、Ｋ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｒ、Ｇ、Ｉ、Ｆ、Ｔ、Ａ、またはＨであり、１０番目のＸがＷまたはＧであり、１３番目のＸが、Ｖ、Ｍ、Ｄ、Ｙ、Ｋ、Ｌ、Ｉ、またはＲであり、１４番目のＸが、Ｙ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ｌ、Ｎ、またはＥであり、１５番目のＸが、Ｙ、Ｗ、Ｇ、Ｌ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｍ、Ｆ、またはＲであり、１６番目のＸがＫであり、１７番目のＸが、Ｍ、Ｅ、Ｗ、Ｖ、Ｈ、Ｓ、Ｎ、Ｉ、Ｑ、またはＹであり、１８番目のＸが、Ｒ、Ｌ、Ｖ、Ｓ、Ｈ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、またはＫであり、１９番目のＸが、Ｑ、Ｇ、Ｙ、Ｒ、Ｎ、Ｉ、Ｓ、Ｈ、Ｅ、Ｍ、Ｌ、またはＤである、上記［２］に記載の合成ペプチド。
［４］前記アミノ酸配列（１）が、配列番号４～２６からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列である、上記［３］に記載の合成ペプチド。
［５］前記アミノ酸配列（２）のＮ末端から１番目のＸが、Ａ、Ｑ、Ｖ、Ｇ、Ｒ、Ｌ、Ｓ、Ｋ、またはＥであり、２番目のＸが、Ｇ、Ｖ、Ｋ、Ｔ、Ｐ、Ｒ、Ｎ、Ｅ、Ｄ、Ｓ、Ｈ、またはＡであり、３番目のＸは、Ｅ、Ｆ、Ａ、Ｐ、Ｎ、Ｖ、Ｍ、Ｄ、Ｈ、Ｔ、またはＹであり、４番目のＸは、Ｖ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｈ、Ｆ、Ｅ、Ｒ、Ｐ、Ｙ、またはＫであり、５番目のＸは、Ｖ、Ｔ、またはＩであり、６番目のＸが、Ｒ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｖ、またはＩであり、７番目のＸが、Ｓ、Ｍ、Ｇ、Ｔ、Ｌ、Ｎ、Ａ、Ｅ、またはＲであり、８番目のＸが、Ｓ、Ｔ、Ｒ、Ｑ、Ｇ、Ｌ、Ｖ、またはＭであり、９番目のＸが、Ｋ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ａ、Ｑ、Ｎ、Ｍ、またはＹであり、１０番目のＸがＧであり、１１番目のＸがＫであり、１２番目のＸがＬであり、１３番目のＸが、Ｖ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ｑ、Ｇ、またはＥであり、１４番目のＸが、Ｍ、Ｓ、Ｈ、Ｇ、Ｌ、またはＶであり、１５番目のＸが、Ｙ、Ｌ、Ｑ、Ｅ、Ｍ、Ｆ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｋ、またはＶであり、１７番目のＸが、Ｅ、Ｗ、Ｖ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｌ、またはＲであり、１８番目のＸが、Ｒ、Ｓ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｗ、Ｅ、Ｉ、またはＧであり、１９番目のＸが、Ｑ、Ｇ、Ｒ、Ｈ、Ｅ、Ｌ、Ｄ、Ｃ、Ｗ、またはＶである、上記［２］に記載の合成ペプチド。
［６］前記アミノ酸配列（１）が、配列番号２７～４６からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列である、上記［５］に記載の合成ペプチド。
［７］下記で表されるアミノ酸配列（配列番号３）、またはそのアミノ酸配列のうちの１個もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失および／もしくは付加されて形成されているアミノ酸配列を分子構造上に有する、上記［１］に記載の合成ペプチド：
［３］前記アミノ酸配列（２）のＮ末端から１番目のＸが、Ｆ、Ａ、Ｑ、Ｖ、Ｇ、Ｉ、Ｎ、Ｒ、Ｍ、Ｄ、Ｌ、Ｓ、またはＰであり、２番目のＸが、Ｇ、Ｖ、Ｋ、Ｔ、Ｐ、Ｒ、Ｍ、Ｎ、Ｅ、Ｄ、Ｓ、Ｃ、Ｗ、またはＨであり、３番目のＸが、Ｇ、Ｒ、Ｅ、Ｆ、Ａ、Ｋ、Ｐ、Ｎ、Ｌ、Ｖ、またはＭであり、４番目のＸが、Ｖ、Ｄ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｎ、Ｈ、Ｇ、Ｆ、Ｅ、またはＲであり、５番目のＸが、Ｖ、Ｋ、Ｙ、Ｔ、Ｎ、Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｐ、Ｆ、Ｑ、またはＨであり、６番目のＸが、Ｙ、Ｒ、Ｈ、Ｌ、Ｐ、Ｎ、Ｅ、Ｍ、Ａ、Ｇ、またはＶであり、７番目のＸが、Ｓ、Ｋ、Ｍ、Ｇ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｖ、Ｃ、Ｌ、Ｎ、またはＡであり、８番目のＸが、Ｃ、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｒ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｋ、Ｙ、またはＰであり、９番目のＸが、Ｅ、Ｋ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｒ、Ｇ、Ｉ、Ｆ、Ｔ、Ａ、またはＨであり、１０番目のＸがＷまたはＧであり、１３番目のＸが、Ｖ、Ｍ、Ｄ、Ｙ、Ｋ、Ｌ、Ｉ、またはＲであり、１４番目のＸが、Ｙ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ｌ、Ｎ、またはＥであり、１５番目のＸが、Ｙ、Ｗ、Ｇ、Ｌ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｍ、Ｆ、またはＲであり、１６番目のＸがＫであり、１７番目のＸが、Ｍ、Ｅ、Ｗ、Ｖ、Ｈ、Ｓ、Ｎ、Ｉ、Ｑ、またはＹであり、１８番目のＸが、Ｒ、Ｌ、Ｖ、Ｓ、Ｈ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、またはＫであり、１９番目のＸが、Ｑ、Ｇ、Ｙ、Ｒ、Ｎ、Ｉ、Ｓ、Ｈ、Ｅ、Ｍ、Ｌ、またはＤである、上記［２］に記載の合成ペプチド。
［４］前記アミノ酸配列（１）が、配列番号４～２６からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列である、上記［３］に記載の合成ペプチド。
［５］前記アミノ酸配列（２）のＮ末端から１番目のＸが、Ａ、Ｑ、Ｖ、Ｇ、Ｒ、Ｌ、Ｓ、Ｋ、またはＥであり、２番目のＸが、Ｇ、Ｖ、Ｋ、Ｔ、Ｐ、Ｒ、Ｎ、Ｅ、Ｄ、Ｓ、Ｈ、またはＡであり、３番目のＸは、Ｅ、Ｆ、Ａ、Ｐ、Ｎ、Ｖ、Ｍ、Ｄ、Ｈ、Ｔ、またはＹであり、４番目のＸは、Ｖ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｈ、Ｆ、Ｅ、Ｒ、Ｐ、Ｙ、またはＫであり、５番目のＸは、Ｖ、Ｔ、またはＩであり、６番目のＸが、Ｒ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｖ、またはＩであり、７番目のＸが、Ｓ、Ｍ、Ｇ、Ｔ、Ｌ、Ｎ、Ａ、Ｅ、またはＲであり、８番目のＸが、Ｓ、Ｔ、Ｒ、Ｑ、Ｇ、Ｌ、Ｖ、またはＭであり、９番目のＸが、Ｋ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ａ、Ｑ、Ｎ、Ｍ、またはＹであり、１０番目のＸがＧであり、１１番目のＸがＫであり、１２番目のＸがＬであり、１３番目のＸが、Ｖ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ｑ、Ｇ、またはＥであり、１４番目のＸが、Ｍ、Ｓ、Ｈ、Ｇ、Ｌ、またはＶであり、１５番目のＸが、Ｙ、Ｌ、Ｑ、Ｅ、Ｍ、Ｆ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｋ、またはＶであり、１７番目のＸが、Ｅ、Ｗ、Ｖ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｌ、またはＲであり、１８番目のＸが、Ｒ、Ｓ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｗ、Ｅ、Ｉ、またはＧであり、１９番目のＸが、Ｑ、Ｇ、Ｒ、Ｈ、Ｅ、Ｌ、Ｄ、Ｃ、Ｗ、またはＶである、上記［２］に記載の合成ペプチド。
［６］前記アミノ酸配列（１）が、配列番号２７～４６からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列である、上記［５］に記載の合成ペプチド。
［７］下記で表されるアミノ酸配列（配列番号３）、またはそのアミノ酸配列のうちの１個もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失および／もしくは付加されて形成されているアミノ酸配列を分子構造上に有する、上記［１］に記載の合成ペプチド：
【0019】
【化3】
【0020】
式中、配列（３）のＮ末端から１番目のＸは、Ａ、Ｒ、Ｑ、Ｖ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、またはＨであり、２番目のＸはＥまたはＨであり、３番目のＸは、Ａ、Ｑ、Ｖ、Ｙ、Ｒ、Ｌ、またはＥであり、４番目のＸはＡまたはＳであり、５番目のＸは、Ｅ、Ｌ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、またはＫであり、６番目のＸは、Ａ、Ｋ、Ｍ、Ｒ、Ｇ、またはＹであり、７番目のＸはＥまたはＤであり、８番目のＸは、Ａ、Ｑ、Ｒ、Ｙ、Ｅ、Ｋ、またはＧであり、９番目のＸはＡまたはＩであり、１０番目のＸは、Ｅ、Ｇ、Ｙ、Ｑ、Ｒ、Ｋ、またはＭであり、１１番目のＸはＧまたはＰであり、１２番目のＸは、Ｇ、Ｐ、Ｄ、またはＳであり、１３番目のＸは、ＧまたはＲであり、１４番目のＸは、Ｖ、Ｇ、またはＰであり、１５番目のＸはＧまたはＨであり、１６番目のＸは、Ｌ、Ｇ、またはＳであり、１７番目のＸはＰまたはＲであり、１８番目のＸはＲまたはＰであり、１９番目のＸはＬまたはＲであり、２０番目のＸはＧであり、２１番目のＸは、Ｋ、Ｆ、またはＨであり、２２番目のＸは、Ｍ、Ｙ、Ｌ、Ｒ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｆ、Ｎ、またはＡであり、２３番目のＸは、Ｒ、Ｌ、Ｎ、Ｄ、またはＡであり、２４番目のＸは、Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｋ、Ｑ、Ｍ、またはＶであり、２５番目のＸは、Ｙ、Ｌ、Ｆ、Ｒ、Ｖ、またはＩであり、２６番目のＸはＫまたはＱであり、２７番目のＸは、Ｈ、Ｙ、Ｌ、Ｆ、またはＡであり、２８番目のＸは、Ｌ、Ｎ、Ｅ、Ｇ、またはＡであり、２９番目のＸは、Ｆ、Ｒ、Ｄ、Ｑ、Ｍ、Ｋ、Ｌ、またはＨであり、３０番目のＸは、Ｇ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｌ、Ｗ、Ｖ、またはＦをそれぞれ表す。
［８］前記アミノ酸配列（１）のＮ末端から１７および１８番目のＸがＰかつ１９番目のＸがＬであるか、または、１７～１９番目のＸがいずれもＲである、上記［７］に記載の合成ペプチド。
［９］前記アミノ酸配列（１）が、配列番号４７または４８のアミノ酸配列である、上記［７］または［８］に記載の合成ペプチド。
［１０］配列番号４～４８からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列のうちの１個もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失および／もしくは付加されて形成されたアミノ酸配列からなる、上記［１］～［９］のいずれか一項に記載の合成ペプチド。
［１１］ＷＱＰＰＲＡＲＩＧ（配列番号４９）がリンカーを介してまたは直接結合している、上記［１］～［１０］のいずれか一項に記載の合成ペプチド。
［１２］前記合成ペプチドが二量体化されている、上記［１］～［１１］のいずれか一項に記載の合成ペプチド。
［１３］前記合成ペプチドの末端が分子修飾されている、上記［１］～［１２］のいずれか一項に記載の合成ペプチド。
［８］前記アミノ酸配列（１）のＮ末端から１７および１８番目のＸがＰかつ１９番目のＸがＬであるか、または、１７～１９番目のＸがいずれもＲである、上記［７］に記載の合成ペプチド。
［９］前記アミノ酸配列（１）が、配列番号４７または４８のアミノ酸配列である、上記［７］または［８］に記載の合成ペプチド。
［１０］配列番号４～４８からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列、またはそのアミノ酸配列のうちの１個もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失および／もしくは付加されて形成されたアミノ酸配列からなる、上記［１］～［９］のいずれか一項に記載の合成ペプチド。
［１１］ＷＱＰＰＲＡＲＩＧ（配列番号４９）がリンカーを介してまたは直接結合している、上記［１］～［１０］のいずれか一項に記載の合成ペプチド。
［１２］前記合成ペプチドが二量体化されている、上記［１］～［１１］のいずれか一項に記載の合成ペプチド。
［１３］前記合成ペプチドの末端が分子修飾されている、上記［１］～［１２］のいずれか一項に記載の合成ペプチド。
【0021】
［１４］上記［１］～［１３］のいずれか一項に記載の合成ペプチドを含む、多能性幹細胞から体細胞へ分化誘導するための組成物。
［１５］さらに、アクチビン、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＩＷＰ－３、トランスフェリン、および細胞外マトリックスからなる群から選択される１種以上を含む、上記［１４］に記載の組成物。
［１６］前記体細胞が、外胚葉系細胞、中胚葉系細胞、または内胚葉系細胞である、上記［１４］または［１５］に記載の組成物。
［１７］前記外胚葉系細胞が神経細胞であり、前記中胚葉系細胞が心筋細胞であり、前記内胚葉系細胞が肝細胞である、上記［１６］に記載の組成物。
［１８］前記組成物が、培地または培養基材である、上記［１４］～［１７］のいずれか一項に記載の組成物。
［１５］さらに、アクチビン、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＩＷＰ－３、トランスフェリン、および細胞外マトリックスからなる群から選択される１種以上を含む、上記［１４］に記載の組成物。
［１６］前記体細胞が、外胚葉系細胞、中胚葉系細胞、または内胚葉系細胞である、上記［１４］または［１５］に記載の組成物。
［１７］前記外胚葉系細胞が神経細胞であり、前記中胚葉系細胞が心筋細胞であり、前記内胚葉系細胞が肝細胞である、上記［１６］に記載の組成物。
［１８］前記組成物が、培地または培養基材である、上記［１４］～［１７］のいずれか一項に記載の組成物。
【0022】
［１９］ＦＧＦ受容体に対し結合性を有する合成ペプチドを含む液性因子を多能性幹細胞の胚葉体に作用させる工程を含む、体細胞の製造方法。
［２０］前記液性因子に、さらに他の分化誘導用液性因子を含む、上記［１９］に記載の体細胞の製造方法。
［２１］前記ペプチドが、上記［１］～［１３］のいずれか一項に記載の１種以上の合成ペプチドである、上記［１９］または［２０］に記載の体細胞の製造方法。
［２２］前記他の分化誘導用液性因子が、アクチビン、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＩＷＰ－３、およびトランスフェリンからなる群から選択される１種以上である、上記［２０］または［２１］に記載の体細胞の製造方法。
［２３］前記体細胞が、外胚葉系細胞、中胚葉系細胞、または内胚葉系細胞である、上記［１９］～［２２］のいずれか一項に記載の体細胞の製造方法。
［２４］前記外胚葉系細胞が神経細胞であり、前記中胚葉系細胞が心筋細胞であり、前記内胚葉系細胞が肝細胞である、上記［２３］に記載の体細胞の製造方法。
［２０］前記液性因子に、さらに他の分化誘導用液性因子を含む、上記［１９］に記載の体細胞の製造方法。
［２１］前記ペプチドが、上記［１］～［１３］のいずれか一項に記載の１種以上の合成ペプチドである、上記［１９］または［２０］に記載の体細胞の製造方法。
［２２］前記他の分化誘導用液性因子が、アクチビン、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＩＷＰ－３、およびトランスフェリンからなる群から選択される１種以上である、上記［２０］または［２１］に記載の体細胞の製造方法。
［２３］前記体細胞が、外胚葉系細胞、中胚葉系細胞、または内胚葉系細胞である、上記［１９］～［２２］のいずれか一項に記載の体細胞の製造方法。
［２４］前記外胚葉系細胞が神経細胞であり、前記中胚葉系細胞が心筋細胞であり、前記内胚葉系細胞が肝細胞である、上記［２３］に記載の体細胞の製造方法。
【0023】
［２５］ＦＧＦ受容体に対し結合性を有する合成ペプチドを含む液性因子を多能性幹細胞の胚葉体に作用させる工程を含む、多能性幹細胞から体細胞への分化誘導方法。
［２６］前記液性因子に、さらに、他の分化誘導用液性因子を含む、上記［２５］に記載の分化誘導方法。
［２７］前記ペプチドが、上記［１］～［１３］のいずれか一項に記載の１種以上の合成ペプチドである、上記［２５］または［２６］に記載の分化誘導方法。
［２８］前記他の分化誘導用液性因子が、アクチビン、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＩＷＰ－３、およびトランスフェリンからなる群から選択される１種以上である、上記［２６］または［２７］に記載の分化誘導方法。
［２９］前記体細胞が、外胚葉系細胞、中胚葉系細胞、または内胚葉系細胞である、上記［２５］～［２８］のいずれか一項に記載の分化誘導方法。
［３０］前記外胚葉系細胞が神経細胞であり、前記中胚葉系細胞が心筋細胞であり、前記内胚葉系細胞が肝細胞である、上記［２９］に記載の分化誘導方法。
［２６］前記液性因子に、さらに、他の分化誘導用液性因子を含む、上記［２５］に記載の分化誘導方法。
［２７］前記ペプチドが、上記［１］～［１３］のいずれか一項に記載の１種以上の合成ペプチドである、上記［２５］または［２６］に記載の分化誘導方法。
［２８］前記他の分化誘導用液性因子が、アクチビン、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＩＷＰ－３、およびトランスフェリンからなる群から選択される１種以上である、上記［２６］または［２７］に記載の分化誘導方法。
［２９］前記体細胞が、外胚葉系細胞、中胚葉系細胞、または内胚葉系細胞である、上記［２５］～［２８］のいずれか一項に記載の分化誘導方法。
［３０］前記外胚葉系細胞が神経細胞であり、前記中胚葉系細胞が心筋細胞であり、前記内胚葉系細胞が肝細胞である、上記［２９］に記載の分化誘導方法。
【発明の効果】
【0024】
本発明は、分子量が中程度の合成ペプチドを用いて多能性幹細胞から体細胞へ効率的に分化誘導することができるので、従来の方法と比較して費用などを節減することができる。また、ｂＦＧＦ等の他の分化誘導用液性因子と併用することで、より効率的に当該分化誘導を促進することができる。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】心筋細胞分化誘導プロトコルを表す。
【図2】ファージ表層提示ペプチドライブラリーの立体構造を表す。
【図3】パンニング後に溶出したファージライブラリーからＦＧＦＲ１に結合するファージを取得し、そのファージミドＤＮＡに含まれるペプチドライブラリー由来の配列を網羅的に解析するまでのフローチャートを示す。
【図4】表面プラズモン共鳴法によるＦＧＦＲへの結合性実験の結果を表す。左端はＦＧＦ受容体１に対する結果を、真中はＦＧＦ受容体２に対する結果を、右端はＦＧＦ受容体３に対する結果を、それぞれ表す。各図において、縦軸はレスポンスユニット（ＲＵ）を、横軸は時間（秒）を、それぞれ示す。
【図5】心筋遺伝子マーカーの発現量を表す。左図はｃＴＮＴ遺伝子、右図はＡｃｔｉｎｉｎ－２遺伝子の発現量をそれぞれ表す。
【図6】細胞の免疫染色写真である。
【図7】細胞の免疫染色写真である。
【図8】心筋遺伝子マーカーの発現量を表す。左図はｃＴＮＴ遺伝子、右図はＡｃｔｉｎｉｎ－２遺伝子の発現量をそれぞれ表す。
【図9】心筋遺伝子マーカーの発現量を表す。左図はｃＴＮＴ遺伝子、右図はＡｃｔｉｎｉｎ－２遺伝子の発現量をそれぞれ表す。
【図10】心筋遺伝子マーカーの発現量を表す。左図はｃＴＮＴ遺伝子、右図はＡｃｔｉｎｉｎ－２遺伝子の発現量をそれぞれ表す。
【図11】表面プラズモン共鳴法による、ペプチドＨＢＤ－ＹＸおよびＨＢＤ－Ｆ３－１００ｎＸのＦＧＦＲへの結合性実験の結果を表す。
【図12】心筋分化誘導プロトコルを表す。
【図13】心筋分化誘導における遺伝子発現解析の結果を表す。
【図14】肝分化誘導プロトコルを表す。
【図15】肝分化における遺伝子発現解析の結果を表す。
【図16】肝分化におけるＣＹＰ３Ａ４活性測定の結果を表す。
【図17】神経分化誘導プロトコルを表す。
【図18】神経分化における遺伝子発現解析の結果を表す。
【発明を実施するための形態】
【0026】
以下、本発明について詳述する。
なお、本明細書において特に言及している事項（例えばペプチドの一次構造や鎖長）以外の事柄であって本発明の実施に必要な事柄（例えばペプチド合成、細胞培養技法、ペプチドを成分とする薬剤組成物の調製に関するような一般的事項）は、細胞工学、医学、薬学、有機化学、生化学、遺伝子工学、タンパク質工学、分子生物学、衛生学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。本発明は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。また、以下の説明では、場合に応じてアミノ酸をＩＵＰＡＣ－ＩＵＢガイドラインで示されたアミノ酸に関する命名法に準拠した１文字表記（但し配列表では３文字表記）で表す。本明細書中に記載されるアミノ酸配列は、常に左側がＮ末端側であり右側がＣ末端側である。
本明細書中で引用されている全ての文献の全ての内容は本明細書中に参照として組み入れられている。
なお、本明細書において特に言及している事項（例えばペプチドの一次構造や鎖長）以外の事柄であって本発明の実施に必要な事柄（例えばペプチド合成、細胞培養技法、ペプチドを成分とする薬剤組成物の調製に関するような一般的事項）は、細胞工学、医学、薬学、有機化学、生化学、遺伝子工学、タンパク質工学、分子生物学、衛生学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。本発明は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。また、以下の説明では、場合に応じてアミノ酸をＩＵＰＡＣ－ＩＵＢガイドラインで示されたアミノ酸に関する命名法に準拠した１文字表記（但し配列表では３文字表記）で表す。本明細書中に記載されるアミノ酸配列は、常に左側がＮ末端側であり右側がＣ末端側である。
本明細書中で引用されている全ての文献の全ての内容は本明細書中に参照として組み入れられている。
【0027】
１ 本発明に係る合成ペプチド
本発明に係る合成ペプチド（以下、「本発明ペプチド」という。）は、下記で表されるアミノ酸配列（配列番号１）、またはそのアミノ酸配列のうちの１個もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失および／もしくは付加されて形成されているアミノ酸配列を分子構造上に有することを特徴とする。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基の置換、欠失および／または付加が生じたとしても、本発明の効果が損なわれない範囲の少数個であることをいい、通常、１２個程度以下を意味する。かかる置換、欠失および／または付加されるアミノ酸残基は、１０個以下であることが好ましい。より好ましくは５個以下、４個以下、３個以下、ないし２個以下である。
本発明に係る合成ペプチド（以下、「本発明ペプチド」という。）は、下記で表されるアミノ酸配列（配列番号１）、またはそのアミノ酸配列のうちの１個もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失および／もしくは付加されて形成されているアミノ酸配列を分子構造上に有することを特徴とする。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基の置換、欠失および／または付加が生じたとしても、本発明の効果が損なわれない範囲の少数個であることをいい、通常、１２個程度以下を意味する。かかる置換、欠失および／または付加されるアミノ酸残基は、１０個以下であることが好ましい。より好ましくは５個以下、４個以下、３個以下、ないし２個以下である。
【0028】
【化4】
【0029】
（式中、配列（１）のＮ末端から１番目のＸは、Ａ、Ｒ、Ｑ、Ｖ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、またはＨであり、２番目のＸはＥまたはＨであり、３番目のＸは、Ａ、Ｑ、Ｖ、Ｙ、Ｒ、Ｌ、またはＥであり、４番目のＸはＡまたはＳであり、５番目のＸは、Ｅ、Ｌ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、またはＫであり、６番目のＸは、Ａ、Ｋ、Ｍ、Ｒ、Ｇ、またはＹであり、７番目のＸはＥまたはＤであり、８番目のＸは、Ａ、Ｑ、Ｒ、Ｙ、Ｅ、Ｋ、またはＧであり、９番目のＸはＡまたはＩであり、１０番目のＸは、Ｅ、Ｇ、Ｙ、Ｑ、Ｒ、Ｋ、またはＭであり、１１番目のＸは、Ｆ、Ａ、Ｑ、Ｖ、Ｇ、Ｉ、Ｎ、Ｒ、Ｍ、Ｄ、Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｋ、またはＥであり、１２番目のＸは、Ｇ、Ｖ、Ｋ、Ｔ、Ｐ、Ｒ、Ｍ、Ｎ、Ｅ、Ｄ、Ｓ、Ｃ、Ｗ、Ｈ、またはＡであり、１３番目のＸは、Ｇ、Ｒ、Ｅ、Ｆ、Ａ、Ｋ、Ｐ、Ｎ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｄ、Ｈ、Ｔ、またはＹであり、１４番目のＸは、Ｖ、Ｄ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｎ、Ｈ、Ｇ、Ｆ、Ｅ、Ｒ、Ｐ、Ｙ、またはＫであり、１５番目のＸは、Ｖ、Ｋ、Ｙ、Ｔ、Ｎ、Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｐ、Ｆ、Ｑ、Ｈ、またはＩであり、１６番目のＸは、Ｙ、Ｒ、Ｈ、Ｌ、Ｐ、Ｎ、Ｅ、Ｍ、Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｉ、またはＳであり、１７番目のＸは、Ｓ、Ｋ、Ｍ、Ｇ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｖ、Ｃ、Ｌ、Ｎ、Ａ、Ｅ、Ｐ、またはＲであり、１８番目のＸは、Ｃ、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｒ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｋ、Ｙ、Ｐ、Ｌ、Ｖ、またはＭであり、１９番目のＸは、Ｅ、Ｋ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｒ、Ｇ、Ｉ、Ｆ、Ｔ、Ａ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、Ｍ、またはＹであり、２０番目のＸは、ＷまたはＧであり、２１番目のＸは、Ｑ、Ｋ、Ｆ、またはＨであり、２２番目のＸはＡまたはＬであり、２３番目のＸは、Ｖ、Ｍ、Ｄ、Ｙ、Ｋ、Ｌ、Ｉ、Ｒ、Ｓ、Ｑ、Ｇ、Ｅ、Ｈ、Ｆ、Ｎ、またはＡであり、２４番目のＸは、Ｙ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ｌ、Ｎ、Ｅ、Ｖ、Ｄ、またはＡであり、２５番目のＸは、Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｋ、Ｉ、Ｑ、Ｍ、またはＶであり、２６番目のＸは、Ｙ、Ｗ、Ｇ、Ｌ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｍ、Ｆ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｋ、Ｖ、またはＩであり、２７番目のＸは、Ｋ、Ｒ、またはＱであり、２８番目のＸは、Ｍ、Ｅ、Ｗ、Ｖ、Ｈ、Ｓ、Ｎ、Ｉ、Ｑ、Ｙ、Ｇ、Ｌ、Ｒ、Ｆ、またはＡであり、２９番目のＸは、Ｒ、Ｌ、Ｖ、Ｓ、Ｈ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、Ｋ、Ｑ、Ｗ、Ｅ、Ｉ、Ｇ、またはＡであり、３０番目のＸは、Ｆ、Ｒ、Ｄ、Ｑ、Ｍ、Ｋ、Ｌ、またはＨであり、３１番目のＸは、Ｑ、Ｇ、Ｙ、Ｒ、Ｎ、Ｉ、Ｓ、Ｈ、Ｅ、Ｍ、Ｌ、Ｄ、Ｃ、Ｗ、Ｖ、またはＦをそれぞれ表す。）
【0030】
本発明ペプチドは、前記アミノ酸配列（１）において、Ｎ末端から１番目のＸがＡであり、２番目のＸがＥであり、３番目のＸがＡであり、４番目のＸがＡであり、５番目のＸがＥであり、６番目のＸがＡであり、７番目のＸがＥであり、８番目のＸがＡであり、９番目のＸがＡであり、１０番目のＸがＥであり、１６番目のＸが、Ｙ、Ｒ、Ｈ、Ｌ、Ｐ、Ｎ、Ｅ、Ｍ、Ａ、Ｇ、Ｖ、もしくはＩであり、１７番目のＸが、Ｓ、Ｋ、Ｍ、Ｇ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｖ、Ｃ、Ｌ、Ｎ、Ａ、Ｅ、もしくはＲであり、２１番目のＸが、ＱもしくはＫであり、２３番目のＸが、Ｖ、Ｍ、Ｄ、Ｙ、Ｋ、Ｌ、Ｉ、Ｒ、Ｓ、Ｑ、Ｇ、もしくはＥであり、２４番目のＸが、Ｙ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ｌ、Ｎ、Ｅ、もしくはＶであり、２５番目のＸがＫであり、２６番目のＸが、Ｙ、Ｗ、Ｇ、Ｌ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｍ、Ｆ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｋ、もしくはＶであり、２７番目のＸが、ＫもしくはＲであり、２８番目のＸが、Ｍ、Ｅ、Ｗ、Ｖ、Ｈ、Ｓ、Ｎ、Ｉ、Ｑ、Ｙ、Ｇ、Ｌ、もしくはＲであり、２９番目のＸが、Ｒ、Ｌ、Ｖ、Ｓ、Ｈ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、Ｋ、Ｑ、Ｗ、Ｅ、Ｉ、もしくはＧであり、３０番目のＸがＫであり、３１番目のＸが、Ｑ、Ｇ、Ｙ、Ｒ、Ｎ、Ｉ、Ｓ、Ｈ、Ｅ、Ｍ、Ｌ、Ｄ、Ｃ、Ｗ、もしくはＶであるか、またはそのアミノ酸配列のうちの１個もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失および／もしくは付加されて形成されているアミノ酸配列を、分子構造上に有する態様（以下、「１００ｎＸ系ペプチド」ともいう。）を採り得る。
【0031】
すなわち、１００ｎＸ系ペプチドは、下記で表されるアミノ酸配列（配列番号２）、またはそのアミノ酸配列のうちの１個もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失および／もしくは付加されて形成されているアミノ酸配列を分子構造上に有する。
【0032】
【化5】
【0033】
（式中、配列（２）のＮ末端から１番目のＸは、Ｆ、Ａ、Ｑ、Ｖ、Ｇ、Ｉ、Ｎ、Ｒ、Ｍ、Ｄ、Ｌ、Ｓ、Ｐ、Ｋ、またはＥであり、２番目のＸは、Ｇ、Ｖ、Ｋ、Ｔ、Ｐ、Ｒ、Ｍ、Ｎ、Ｅ、Ｄ、Ｓ、Ｃ、Ｗ、Ｈ、またはＡであり、３番目のＸは、Ｇ、Ｒ、Ｅ、Ｆ、Ａ、Ｋ、Ｐ、Ｎ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｄ、Ｈ、Ｔ、またはＹであり、４番目のＸは、Ｖ、Ｄ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｎ、Ｈ、Ｇ、Ｆ、Ｅ、Ｒ、Ｐ、Ｙ、またはＫであり、５番目のＸは、Ｖ、Ｋ、Ｙ、Ｔ、Ｎ、Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｐ、Ｆ、Ｑ、Ｈ、またはＩであり、６番目のＸは、Ｙ、Ｒ、Ｈ、Ｌ、Ｐ、Ｎ、Ｅ、Ｍ、Ａ、Ｇ、Ｖ、またはＩであり、７番目のＸは、Ｓ、Ｋ、Ｍ、Ｇ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｖ、Ｃ、Ｌ、Ｎ、Ａ、Ｅ、またはＲであり、８番目のＸは、Ｃ、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｒ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｋ、Ｙ、Ｐ、Ｌ、Ｖ、またはＭであり、９番目のＸは、Ｅ、Ｋ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｒ、Ｇ、Ｉ、Ｆ、Ｔ、Ａ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、Ｍ、またはＹであり、１０番目のＸは、ＷまたはＧであり、１１番目のＸは、ＱまたはＫであり、１２番目のＸはＡまたはＬであり、１３番目のＸは、Ｖ、Ｍ、Ｄ、Ｙ、Ｋ、Ｌ、Ｉ、Ｒ、Ｓ、Ｑ、Ｇ、またはＥであり、１４番目のＸは、Ｙ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ｌ、Ｎ、Ｅ、またはＶであり、１５番目のＸは、Ｙ、Ｗ、Ｇ、Ｌ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｍ、Ｆ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｋ、またはＶであり、１６番目のＸは、ＫまたはＲであり、１７番目のＸは、Ｍ、Ｅ、Ｗ、Ｖ、Ｈ、Ｓ、Ｎ、Ｉ、Ｑ、Ｙ、Ｇ、Ｌ、またはＲであり、１８番目のＸは、Ｒ、Ｌ、Ｖ、Ｓ、Ｈ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、Ｋ、Ｑ、Ｗ、Ｅ、Ｉ、またはＧであり、１９番目のＸは、Ｑ、Ｇ、Ｙ、Ｒ、Ｎ、Ｉ、Ｓ、Ｈ、Ｅ、Ｍ、Ｌ、Ｄ、Ｃ、Ｗ、またはＶをそれぞれ表す。）
【0034】
１００ｎＸ系ペプチドは、上記アミノ酸配列（１）において、さらに、Ｎ末端から１１番目のＸが、Ｆ、Ａ、Ｑ、Ｖ、Ｇ、Ｉ、Ｎ、Ｒ、Ｍ、Ｄ、Ｌ、Ｓ、もしくはＰであり、１２番目のＸが、Ｇ、Ｖ、Ｋ、Ｔ、Ｐ、Ｒ、Ｍ、Ｎ、Ｅ、Ｄ、Ｓ、Ｃ、Ｗ、もしくはＨであり、１３番目のＸが、Ｇ、Ｒ、Ｅ、Ｆ、Ａ、Ｋ、Ｐ、Ｎ、Ｌ、Ｖ、もしくはＭであり、１４番目のＸが、Ｖ、Ｄ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｎ、Ｈ、Ｇ、Ｆ、Ｅ、もしくはＲであり、１５番目のＸが、Ｖ、Ｋ、Ｙ、Ｔ、Ｎ、Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｐ、Ｆ、Ｑ、もしくはＨであり、１６番目のＸが、Ｙ、Ｒ、Ｈ、Ｌ、Ｐ、Ｎ、Ｅ、Ｍ、Ａ、Ｇ、もしくはＶであり、１７番目のＸが、Ｓ、Ｋ、Ｍ、Ｇ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｖ、Ｃ、Ｌ、Ｎ、もしくはＡであり、１８番目のＸが、Ｃ、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｒ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｋ、Ｙ、もしくはＰであり、１９番目のＸが、Ｅ、Ｋ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｒ、Ｇ、Ｉ、Ｆ、Ｔ、Ａ、もしくはＨであり、２０番目のＸがＷもしくはＧであり、２３番目のＸが、Ｖ、Ｍ、Ｄ、Ｙ、Ｋ、Ｌ、Ｉ、もしくはＲであり、２４番目のＸが、Ｙ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ｌ、Ｎ、もしくはＥであり、２６番目のＸが、Ｙ、Ｗ、Ｇ、Ｌ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｍ、Ｆ、もしくはＲであり、２７番目のＸがＫであり、２８番目のＸが、Ｍ、Ｅ、Ｗ、Ｖ、Ｈ、Ｓ、Ｎ、Ｉ、Ｑ、もしくはＹであり、２９番目のＸが、Ｒ、Ｌ、Ｖ、Ｓ、Ｈ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、もしくはＫであり、３１番目のＸが、Ｑ、Ｇ、Ｙ、Ｒ、Ｎ、Ｉ、Ｓ、Ｈ、Ｅ、Ｍ、Ｌ、もしくはＤであるか、またはそのアミノ酸配列のうちの１個もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失および／もしくは付加されて形成されているアミノ酸配列を、分子構造上に有する態様（以下、「１００ｎＸ」または「１００ｎＸ－Ｍｏｎｏｍｅｒ」ともいう。）を採り得る。
【0035】
すなわち、１００ｎＸは、上記アミノ酸配列（２）において、さらに、Ｎ末端から１番目のＸが、Ｆ、Ａ、Ｑ、Ｖ、Ｇ、Ｉ、Ｎ、Ｒ、Ｍ、Ｄ、Ｌ、Ｓ、もしくはＰであり、２番目のＸが、Ｇ、Ｖ、Ｋ、Ｔ、Ｐ、Ｒ、Ｍ、Ｎ、Ｅ、Ｄ、Ｓ、Ｃ、Ｗ、もしくはＨであり、３番目のＸが、Ｇ、Ｒ、Ｅ、Ｆ、Ａ、Ｋ、Ｐ、Ｎ、Ｌ、Ｖ、もしくはＭであり、４番目のＸが、Ｖ、Ｄ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｎ、Ｈ、Ｇ、Ｆ、Ｅ、もしくはＲであり、５番目のＸが、Ｖ、Ｋ、Ｙ、Ｔ、Ｎ、Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｐ、Ｇ、Ｆ、Ｑ、もしくはＨであり、６番目のＸが、Ｙ、Ｒ、Ｈ、Ｌ、Ｐ、Ｎ、Ｅ、Ｍ、Ａ、Ｇ、もしくはＶであり、７番目のＸが、Ｓ、Ｋ、Ｍ、Ｇ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｖ、Ｃ、Ｌ、Ｎ、もしくはＡであり、８番目のＸが、Ｃ、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｒ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｋ、Ｙ、もしくはＰであり、９番目のＸが、Ｅ、Ｋ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｒ、Ｇ、Ｉ、Ｆ、Ｔ、Ａ、もしくはＨであり、１０番目のＸがＷもしくはＧであり、１３番目のＸが、Ｖ、Ｍ、Ｄ、Ｙ、Ｋ、Ｌ、Ｉ、もしくはＲであり、１４番目のＸが、Ｙ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｋ、Ｈ、Ｇ、Ｌ、Ｎ、もしくはＥであり、１５番目のＸが、Ｙ、Ｗ、Ｇ、Ｌ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｍ、Ｆ、もしくはＲであり、１６番目のＸがＫであり、１７番目のＸが、Ｍ、Ｅ、Ｗ、Ｖ、Ｈ、Ｓ、Ｎ、Ｉ、Ｑ、もしくはＹであり、１８番目のＸが、Ｒ、Ｌ、Ｖ、Ｓ、Ｈ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、もしくはＫであり、１９番目のＸが、Ｑ、Ｇ、Ｙ、Ｒ、Ｎ、Ｉ、Ｓ、Ｈ、Ｅ、Ｍ、Ｌ、もしくはＤであるか、またはそのアミノ酸配列のうちの１個もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失および／もしくは付加されて形成されているアミノ酸配列を、分子構造上に有する。
【0036】
また、１００ｎＸ系ペプチドは、前記アミノ酸配列（１）において、さらに、Ｎ末端から１１番目のＸが、Ａ、Ｑ、Ｖ、Ｇ、Ｒ、Ｌ、Ｓ、Ｋ、もしくはＥであり、１２番目のＸが、Ｇ、Ｖ、Ｋ、Ｔ、Ｐ、Ｒ、Ｎ、Ｅ、Ｄ、Ｓ、Ｈ、もしくはＡであり、１３番目のＸは、Ｅ、Ｆ、Ａ、Ｐ、Ｎ、Ｖ、Ｍ、Ｄ、Ｈ、Ｔ、もしくはＹであり、１４番目のＸは、Ｖ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｈ、Ｆ、Ｅ、Ｒ、Ｐ、Ｙ、もしくはＫであり、１５番目のＸは、Ｖ、Ｔ、もしくはＩであり、１６番目のＸが、Ｒ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｖ、もしくはＩであり、１７番目のＸが、Ｓ、Ｍ、Ｇ、Ｔ、Ｌ、Ｎ、Ａ、Ｅ、もしくはＲであり、１８番目のＸが、Ｓ、Ｔ、Ｒ、Ｑ、Ｇ、Ｌ、Ｖ、もしくはＭであり、１９番目のＸが、Ｋ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ａ、Ｑ、Ｎ、Ｍ、もしくはＹであり、２０番目のＸがＧであり、２１番目のＸがＫであり、２２番目のＸがＬであり、２３番目のＸが、Ｖ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ｑ、Ｇ、もしくはＥであり、２４番目のＸが、Ｍ、Ｓ、Ｈ、Ｇ、Ｌ、もしくはＶであり、２６番目のＸが、Ｙ、Ｌ、Ｑ、Ｅ、Ｍ、Ｆ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｋ、もしくはＶであり、２８番目のＸが、Ｅ、Ｗ、Ｖ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｌ、もしくはＲであり、２９番目のＸが、Ｒ、Ｓ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｗ、Ｅ、Ｉ、もしくはＧであり、３１番目のＸが、Ｑ、Ｇ、Ｒ、Ｈ、Ｅ、Ｌ、Ｄ、Ｃ、Ｗ、もしくはＶであるか、またはそのアミノ酸配列のうちの１個もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失および／もしくは付加されて形成されているアミノ酸配列を、分子構造上に有する態様（以下、「Ｆ３－１００ｎＸ」または「Ｆ３－１００ｎＸ－Ｍｏｎｏｍｅｒ」ともいう。）を採り得る。
【0037】
すなわち、Ｆ３－１００ｎＸは、上記アミノ酸配列（２）において、さらに、Ｎ末端から１番目のＸが、Ａ、Ｑ、Ｖ、Ｇ、Ｒ、Ｌ、Ｓ、Ｋ、もしくはＥであり、２番目のＸが、Ｇ、Ｖ、Ｋ、Ｔ、Ｐ、Ｒ、Ｎ、Ｅ、Ｄ、Ｓ、Ｈ、もしくはＡであり、３番目のＸは、Ｅ、Ｆ、Ａ、Ｐ、Ｎ、Ｖ、Ｍ、Ｄ、Ｈ、Ｔ、もしくはＹであり、４番目のＸは、Ｖ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｈ、Ｆ、Ｅ、Ｒ、Ｐ、Ｙ、もしくはＫであり、５番目のＸは、Ｖ、Ｔ、もしくはＩであり、６番目のＸが、Ｒ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｖ、もしくはＩであり、７番目のＸが、Ｓ、Ｍ、Ｇ、Ｔ、Ｌ、Ｎ、Ａ、Ｅ、もしくはＲであり、８番目のＸが、Ｓ、Ｔ、Ｒ、Ｑ、Ｇ、Ｌ、Ｖ、もしくはＭであり、９番目のＸが、Ｋ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｒ、Ｔ、Ａ、Ｑ、Ｎ、Ｍ、もしくはＹであり、１０番目のＸがＧであり、１１番目のＸがＫであり、１２番目のＸがＬであり、１３番目のＸが、Ｖ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ｑ、Ｇ、もしくはＥであり、１４番目のＸが、Ｍ、Ｓ、Ｈ、Ｇ、Ｌ、もしくはＶであり、１５番目のＸが、Ｙ、Ｌ、Ｑ、Ｅ、Ｍ、Ｆ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｋ、もしくはＶであり、１７番目のＸが、Ｅ、Ｗ、Ｖ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｌ、もしくはＲであり、１８番目のＸが、Ｒ、Ｓ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｗ、Ｅ、Ｉ、もしくはＧであり、１９番目のＸが、Ｑ、Ｇ、Ｒ、Ｈ、Ｅ、Ｌ、Ｄ、Ｃ、Ｗ、もしくはＶであるか、またはそのアミノ酸配列のうちの１個もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失および／もしくは付加されて形成されているアミノ酸配列を、分子構造上に有する。
【0038】
他方、本発明ペプチドは、前記アミノ酸配列（１）のＮ末端から１１番目のＸがＧもしくはＰであり、１２番目のＸが、Ｇ、Ｐ、Ｄ、もしくはＳであり、１３番目のＸが、ＧもしくはＲであり、１４番目のＸが、Ｖ、Ｇ、もしくはＰであり、１５番目のＸがＧもしくはＨであり、１６番目のＸが、Ｌ、Ｇ、もしくはＳであり、１７番目のＸがＰもしくはＲであり、１８番目のＸがＲもしくはＰであり、１９番目のＸがＬもしくはＲであり、２０番目のＸがＧであり、２１番目のＸが、Ｋ、Ｆ、もしくはＨであり、２２番目のＸがＬであり、２３番目のＸが、Ｍ、Ｙ、Ｌ、Ｒ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｆ、Ｎ、もしくはＡであり、２４番目のＸが、Ｒ、Ｌ、Ｎ、Ｄ、もしくはＡであり、２６番目のＸが、Ｙ、Ｌ、Ｆ、Ｒ、Ｖ、もしくはＩであり、２７番目のＸがＫもしくはＱであり、２８番目のＸが、Ｈ、Ｙ、Ｌ、Ｆ、もしくはＡであり、２９番目のＸが、Ｌ、Ｎ、Ｅ、Ｇ、もしくはＡであり、３１番目のＸが、Ｇ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｌ、Ｗ、Ｖ、もしくはＦであるか、またはそのアミノ酸配列のうちの１個もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失および／もしくは付加されて形成されているアミノ酸配列を、分子構造上に有する態様（以下、「ＹＸ系ペプチド」ともいう。）をも採り得る。
【0039】
すなわち、ＹＸ系ペプチドは、下記で表されるアミノ酸配列（配列番号３）、またはそのアミノ酸配列のうちの１個もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失および／もしくは付加されて形成されているアミノ酸配列を分子構造上に有する。
【化6】
【0040】
（式中、配列（３）のＮ末端から１番目のＸは、Ａ、Ｒ、Ｑ、Ｖ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、またはＨであり、２番目のＸはＥまたはＨであり、３番目のＸは、Ａ、Ｑ、Ｖ、Ｙ、Ｒ、Ｌ、またはＥであり、４番目のＸはＡまたはＳであり、５番目のＸは、Ｅ、Ｌ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、またはＫであり、６番目のＸは、Ａ、Ｋ、Ｍ、Ｒ、Ｇ、またはＹであり、７番目のＸはＥまたはＤであり、８番目のＸは、Ａ、Ｑ、Ｒ、Ｙ、Ｅ、Ｋ、またはＧであり、９番目のＸはＡまたはＩであり、１０番目のＸは、Ｅ、Ｇ、Ｙ、Ｑ、Ｒ、Ｋ、またはＭであり、１１番目のＸはＧまたはＰであり、１２番目のＸは、Ｇ、Ｐ、Ｄ、またはＳであり、１３番目のＸは、ＧまたはＲであり、１４番目のＸは、Ｖ、Ｇ、またはＰであり、１５番目のＸはＧまたはＨであり、１６番目のＸは、Ｌ、Ｇ、またはＳであり、１７番目のＸはＰまたはＲであり、１８番目のＸはＲまたはＰであり、１９番目のＸはＬまたはＲであり、２０番目のＸはＧであり、２１番目のＸは、Ｋ、Ｆ、またはＨであり、２２番目のＸは、Ｍ、Ｙ、Ｌ、Ｒ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｆ、Ｎ、またはＡであり、２３番目のＸは、Ｒ、Ｌ、Ｎ、Ｄ、またはＡであり、２４番目のＸは、Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｋ、Ｑ、Ｍ、またはＶであり、２５番目のＸは、Ｙ、Ｌ、Ｆ、Ｒ、Ｖ、またはＩであり、２６番目のＸはＫまたはＱであり、２７番目のＸは、Ｈ、Ｙ、Ｌ、Ｆ、またはＡであり、２８番目のＸは、Ｌ、Ｎ、Ｅ、Ｇ、またはＡであり、２９番目のＸは、Ｆ、Ｒ、Ｄ、Ｑ、Ｍ、Ｋ、Ｌ、またはＨであり、３０番目のＸは、Ｇ、Ｎ、Ｉ、Ｈ、Ｌ、Ｗ、Ｖ、またはＦをそれぞれ表す。）
【0041】
ＹＸ系ペプチドは、さらに、前記アミノ酸配列（１）もしくは（３）のＮ末端から１７および１８番目のＸがＰかつ１９番目のＸがＬであるか、または、１７～１９番目のＸがいずれもＲである態様（以下、「ＹＸ」または「ＹＸ－Ｍｏｎｏｍｅｒ」ともいう。）を採り得る。
【0042】
ここで「合成ペプチド」とは、当該ペプチド鎖がそれのみで独立して自然界に安定的に存在するものではなく、人為的な化学合成あるいは生合成（即ち遺伝子工学に基づく生産）によって製造され、所定の系（例えば細胞分化誘導剤を構成する組成物）の中で安定して存在し得るペプチド断片をいう。
「ペプチド」とは、複数のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマーを指す用語であり、ペプチド鎖に含まれるアミノ酸残基の数によって限定されないが、典型的には全アミノ酸残基数が概ね１００以下、好ましくは５０以下（例えば３０～５０ないし４０～５０程度）のような比較的分子量の小さいものをいう。
「ペプチド」とは、複数のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマーを指す用語であり、ペプチド鎖に含まれるアミノ酸残基の数によって限定されないが、典型的には全アミノ酸残基数が概ね１００以下、好ましくは５０以下（例えば３０～５０ないし４０～５０程度）のような比較的分子量の小さいものをいう。
【0043】
「アミノ酸残基」とは、特に言及する場合を除いて、ペプチド鎖に含まれる各アミノ酸（－ＮＨ－Ｃ（Ｒ）（Ｈ）－ＣＯ－）であって、ペプチド鎖のＮ末端アミノ酸およびＣ末端アミノ酸を包含する用語である。
なお、本発明ペプチドとしては、全てのアミノ酸残基がＬ型アミノ酸であるものが好ましいが、分化誘導活性を失わない限りにおいて、アミノ酸残基の一部または全部がＤ型アミノ酸に置換されているものであってもよい。
なお、本発明ペプチドとしては、全てのアミノ酸残基がＬ型アミノ酸であるものが好ましいが、分化誘導活性を失わない限りにおいて、アミノ酸残基の一部または全部がＤ型アミノ酸に置換されているものであってもよい。
【0044】
線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）に結合する本発明ペプチド（１００ｎＸ、Ｆ３－１００ｎＸ、もしくはＹＸ）、あるいは本発明ペプチドとヘパラン硫酸に結合するペプチドとを融合したペプチド（以下、「ＨＢＤ－１００ｎＸ」、「ＨＢＤ－Ｆ３－１００ｎＸ」、もしくは「ＨＢＤ－ＹＸ」ともいう。）、または本発明ペプチドを二量体化したペプチド（以下、「１００ｎＸ－Ｄｉｍｅｒ」、「Ｆ３－１００ｎＸ－Ｄｉｍｅｒ」、もしくは「ＹＸ－Ｄｉｍｅｒ」ともいう。）を用いることで、従来プロトコルより少ない種類の液性因子でｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞から心筋細胞などの体細胞へ分化誘導することができる。
【0045】
また、１００ｎＸ、ＨＢＤ－１００ｎＸ、または１００ｎＸ－ＤｉｍｅｒをｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ ＦＧＦ：塩基性線維芽細胞増殖因子）と合わせて作用することで、心筋細胞などの体細胞への分化を促進または心筋細胞などの体細胞の成熟化を促進しうる。
【0046】
また、ＦＧＦＲに結合するペプチド（例えば、１００ｎＸ、ＹＸ、Ｆ３－１００ｎＸ）とヘパラン硫酸に結合するペプチドを融合したペプチド（例えば、ＨＢＤ－１００ｎＸ、ＨＢＤ－ＹＸ、ＨＢＤ－Ｆ３－１００ｎＸ）を用いることにより、ｂＦＧＦを使用することなく、ｉＰＳ細胞から心筋細胞へ分化誘導しうる。
【0047】
また、ＨＢＤ－１００ｎＸを用いることにより、ｂＦＧＦを使用することなく、ｉＰＳ細胞から肝細胞または神経細胞へ分化誘導しうる。
【0048】
１００ｎＸの中、下記の表１に示す配列番号４～２６のいずれかの配列で表されるペプチドを分子構造上に有する化合物、または配列番号４～２６のいずれかの配列で表されるペプチドが好ましい。より好ましい本発明ペプチドは、配列番号５、配列番号８、または配列番号９で表されるペプチドを分子構造上に有するもの、または配列番号５、配列番号８、または配列番号９で表されるペプチドである。
【0049】
Ｆ３－１００ｎＸの中、下記の表２に示す配列番号２７～４６のいずれかの配列で表されるペプチドを分子構造上に有する化合物、または配列番号２７～４６のいずれかの配列で表されるペプチドが好ましい。より好ましい本発明ペプチドは、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、または配列番号３２で表されるペプチドを分子構造上に有するもの、または配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、または配列番号３２で表されるペプチドである。
【0050】
ＹＸの中、下記の表３に示す配列番号４７または４８のいずれかの配列で表されるペプチドを分子構造上に有する化合物、または配列番号４７または４８のいずれかの配列で表されるペプチドが好ましい。
【0051】
本発明ペプチドの態様によっては、該ペプチドを構成する全アミノ酸残基数が１００以下（特には５０以下）であるため、化学合成が容易であり、かつ安価で取扱性に優れる。
【0052】
【表1】
【0053】
【表2】
【0054】
【表3】
【0055】
本発明ペプチドは、本発明の効果を損なわない限り、配列番号１～３、および４～４８で表されるアミノ酸配列のうちの１個もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失および／または付加されて形成されていてもよい。かかる置換、欠失および／または付加されるアミノ酸残基は、１０個以下であることが好ましい。より好ましくは５個以下ないし２個以下である。また、かかる置換、欠失および／または付加されるアミノ酸残基としては、例えば、配列番号１～３においてＸで示されるアミノ残基が適当である。
【0056】
本発明ペプチドとして、ヘパラン硫酸に結合するペプチドと融合したペプチド（ＨＢＤ－１００ｎＸ）を挙げることができる。かかるヘパラン硫酸に結合するペプチドとしては、例えば、ＷＱＰＰＲＡＲＩＧ（配列番号４９）を挙げることができる。
【0057】
本発明ペプチドとヘパラン硫酸に結合するペプチドとの融合は、直接または適当なリンカーを介して行うことができる。かかるリンカーとしては、例えば、ポリアミドリンカー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー、アルキルリンカー、ポリカーボネートリンカーを挙げることができる。
本発明ペプチドは二量体化していてもよい（１００ｎＸ－Ｄｉｍｅｒ）。かかる二量体化は、２つの本発明ペプチドが直接または適当なリンカーを介して行うことができる。かかるリンカーとしては、例えば、ポリアミドリンカー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー、アルキルリンカー、ポリカーボネートリンカーを挙げることができる。
本発明ペプチドをＨＢＤ－１００ｎＸや１００ｎＸ－Ｄｉｍｅｒとすることにより、多能性幹細胞から体細胞への分化誘導をより効率的に行うことができる。
本発明ペプチドは二量体化していてもよい（１００ｎＸ－Ｄｉｍｅｒ）。かかる二量体化は、２つの本発明ペプチドが直接または適当なリンカーを介して行うことができる。かかるリンカーとしては、例えば、ポリアミドリンカー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー、アルキルリンカー、ポリカーボネートリンカーを挙げることができる。
本発明ペプチドをＨＢＤ－１００ｎＸや１００ｎＸ－Ｄｉｍｅｒとすることにより、多能性幹細胞から体細胞への分化誘導をより効率的に行うことができる。
【0058】
本発明ペプチドは、そのＮ末端またはＣ末端が適当な化合物ないし物質で分子修飾されていてもよい。かかる分子修飾は、通常、蛍光標識、多量体化などの目的で行われる。当該分子修飾用の化合物等としては、例えば、ビオチン、ファージ、ＦＩＴＣ等の蛍光化合物を挙げることができる。
【0059】
ＨＢＤ－１００ｎＸ、１００ｎＸ－Ｄｉｍｅｒ、およびＮ末端またはＣ末端の分子修飾体を含め、本発明ペプチドは、常法により化学合成（もしくは生合成）によって容易に人為的に製造することができる。例えば、従来公知の固相合成法または液相合成法のいずれを採用してもよい。アミノ基の保護基としてＢｏｃ（ｔ－ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）あるいはＦｍｏｃ（９－ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）を適用した固相合成法が好適である。本発明ペプチドは、市販のペプチド合成機を用いた固相合成法により、所望するアミノ酸配列、修飾（Ｃ末端アミド化等）部分を有するペプチド鎖を合成することができる。
【0060】
また、遺伝子工学的手法に基づいて本発明ペプチドを生合成することもできる。具体的には、所望する本発明ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ＡＴＧ開始コドンを含む。）のＤＮＡを合成する。そして、このＤＮＡと該アミノ酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、発現レベルを制御する種々のシスエレメントを包含する。）とから成る発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを、宿主細胞に応じて構築する。
【0061】
一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞に導入し、所定の条件で当該宿主細胞または該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするポリペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からポリペプチドを単離し、精製することによって、目的の本発明ペプチドを得ることができる。一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞（例えばイースト、昆虫細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞または該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするポリペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からポリペプチドを単離し、精製することによって、目的の本発明ペプチドを得ることができる。
組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該技術分野で従来から行われている方法をそのまま採用することができる。
組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該技術分野で従来から行われている方法をそのまま採用することができる。
【0062】
例えば、宿主細胞内で効率よく大量に生産させるために融合タンパク質発現システムを利用することができる。すなわち、目的の本発明ペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を化学合成し、該合成遺伝子を適当な融合タンパク質発現用ベクターの好適なサイトに導入する。そして該ベクターにより宿主細胞（典型的には大腸菌）を形質転換する。得られた形質転換体を培養して目的の融合タンパク質を調製する。次いで、該タンパク質を抽出および精製する。次いで、得られた精製融合タンパク質を所定の酵素（プロテアーゼ）で切断し、遊離した目的のペプチド断片（設計した本発明ペプチド）をアフィニティクロマトグラフィー等の方法によって回収する。このような従来公知の融合タンパク質発現システムを用いることによって、本発明ペプチドを製造することができる。
【0063】
また、無細胞タンパク質合成システム用の鋳型ＤＮＡ（即ち細胞分化誘導ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片）を構築し、ペプチド合成に必要な種々の化合物（ＡＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸類等）を使用し、いわゆる無細胞タンパク質合成システムを採用して目的のポリペプチドをインビトロ合成することができる。無細胞タンパク質合成システムについては、例えばＳｈｉｍｉｚｕらの論文（Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755(2001)）、Ｍａｄｉｎらの論文（Madin et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 97(2), 559-564(2000)）が参考になる。これら論文に記載された技術に基づいて、本願出願時点において既に多くの企業がポリペプチドの受託生産を行っており、また、無細胞タンパク質合成用キットが市販されている。
従って、ペプチド鎖を設計しさえすれば、そのアミノ酸配列に従って無細胞タンパク質合成システムによって目的の本発明ペプチドを容易に合成・生産することができる。
従って、ペプチド鎖を設計しさえすれば、そのアミノ酸配列に従って無細胞タンパク質合成システムによって目的の本発明ペプチドを容易に合成・生産することができる。
【0064】
本発明ペプチドは、当該分化誘導活性を損なわない限りにおいて、塩の形態であってもよい。例えば、常法に従って通常使用されている無機酸もしくは有機酸、または無機塩基もしくは有機塩基を付加反応させることにより得られ得る該ペプチドの酸付加塩ないし塩基付加塩を使用することができる。また、当該分化誘導活性を有する限り、他の塩（例えば金属塩）や水和物、溶媒和物などであってもよい。本発明ペプチドは、かかる塩形態のものを包含する。
【0065】
２ 本発明に係る組成物
本発明として、本発明ペプチドを含む、多能性幹細胞から体細胞へ分化誘導するための組成物（以下、「本発明組成物」という。）を挙げることができる。
本発明として、本発明ペプチドを含む、多能性幹細胞から体細胞へ分化誘導するための組成物（以下、「本発明組成物」という。）を挙げることができる。
【0066】
２．１ 多能性幹細胞について
多能性幹細胞（Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）は、当業者に周知の細胞であって、体を構成するすべての種類の細胞に分化することができる分化万能性と、その分化万能性を維持したまま増殖することができる自己複製能を併せ持つ細胞である。代表的な多能性幹細胞としては、例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞、ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、およびエピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳ細胞、Ｅｐｉｂｌａｓｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹細胞（ｎｔＥＳ）、精子幹細胞（ＧＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Ｍｕｓｅ細胞）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）を挙げることができる。
多能性幹細胞（Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）は、当業者に周知の細胞であって、体を構成するすべての種類の細胞に分化することができる分化万能性と、その分化万能性を維持したまま増殖することができる自己複製能を併せ持つ細胞である。代表的な多能性幹細胞としては、例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞、ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、およびエピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳ細胞、Ｅｐｉｂｌａｓｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹細胞（ｎｔＥＳ）、精子幹細胞（ＧＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Ｍｕｓｅ細胞）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）を挙げることができる。
【0067】
（１）ｉＰＳ細胞
ｉＰＳ細胞は、体細胞へ数種類の初期化因子（通常は３、４種の遺伝子）を導入することにより作製される多能性幹細胞である。ｉＰＳ細胞は、特定の初期化因子を、ＤＮＡまたはタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる。ｉＰＳ細胞の作製方法は、具体的には、例えば、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００９／００６９３０、ＷＯ２００９／００６９９７、ＷＯ２００９／００７８５２、ＷＯ２００８／１１８８２０、Cell Stem Cell 3(5): 568-574 (2008) 、Cell Stem Cell 4(5): 381-384 (2009)、Nature 454: 646-650 (2008) 、Cell 136(3) :411-419 (2009) 、Nature Biotechnology 26: 1269-1275 (2008) 、Cell Stem Cell 3: 475-479 (2008) 、Nature Cell Biology 11: 197-203 (2009) 、Cell 133(2): 250-264 (2008)、Cell 131(5): 861-72 (2007)、Science 318 (5858): 1917-20 (2007)に記載される。後述のＥＳ細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能を有する、体細胞由来の人工の幹細胞である。
ｉＰＳ細胞は、体細胞へ数種類の初期化因子（通常は３、４種の遺伝子）を導入することにより作製される多能性幹細胞である。ｉＰＳ細胞は、特定の初期化因子を、ＤＮＡまたはタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる。ｉＰＳ細胞の作製方法は、具体的には、例えば、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００９／００６９３０、ＷＯ２００９／００６９９７、ＷＯ２００９／００７８５２、ＷＯ２００８／１１８８２０、Cell Stem Cell 3(5): 568-574 (2008) 、Cell Stem Cell 4(5): 381-384 (2009)、Nature 454: 646-650 (2008) 、Cell 136(3) :411-419 (2009) 、Nature Biotechnology 26: 1269-1275 (2008) 、Cell Stem Cell 3: 475-479 (2008) 、Nature Cell Biology 11: 197-203 (2009) 、Cell 133(2): 250-264 (2008)、Cell 131(5): 861-72 (2007)、Science 318 (5858): 1917-20 (2007)に記載される。後述のＥＳ細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能を有する、体細胞由来の人工の幹細胞である。
【0068】
ｉＰＳ細胞は、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。一方、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ）と連動して発現する薬剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入した場合は、対応する薬剤を含む培養液（選択培養液）で培養を行うことにより樹立したｉＰＳ細胞を選択することができる。また、マーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、ｉＰＳ細胞を選択することができる。
【0069】
（２）ＥＳ細胞
ＥＳ細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。ＥＳ細胞は、受精卵の８細胞期、桑実胚後の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚由来の幹細胞であり、成体を構成するあらゆる細胞に分化する能力、いわゆる分化多能性と、自己複製による増殖能とを有している。ＥＳ細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、白血病抑制因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ））、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）などの物質を添加した培養液を用いて行うことができる。
ＥＳ細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。ＥＳ細胞は、受精卵の８細胞期、桑実胚後の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚由来の幹細胞であり、成体を構成するあらゆる細胞に分化する能力、いわゆる分化多能性と、自己複製による増殖能とを有している。ＥＳ細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、白血病抑制因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ））、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）などの物質を添加した培養液を用いて行うことができる。
【0070】
ＥＳ細胞としては、例えば、ヒト（Thomson J. A. et al., Science 282: 1145-1147 (1998) 、Biochem Biophys Res Commun. 345(3), 926-32 (2006)；アカゲザルおよびマーモセット等の霊長類（Thomson J. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844-7848 (1995）；Thomson J. A. et al., Biol. Reprod. 55: 254-259 (1996)）；ウサギ（特表２０００－５０８９１９号）；ハムスター（Doetshman T. et al., Dev. Biol. 127: 224-227 (1988)）、ブタ（Evans M. J. et al., Theriogenology 33: 125128 (1990); Piedrahita J.A. et al., Theriogenology 34: 879-891 (1990); Notarianni E. et al., J. Reprod. Fert. 40: 51-56 (1990); Talbot N. C. et al., Cell. Dev. Biol. 29A: 546-554 (1993)）、ヒツジ（Notarianni E. et al., J. Reprod. Fert. Suppl. 43: 255-260 (1991)）、ウシ（Evans M. J. et al., Theriogenology 33: 125-128 (1990); Saito S. et al., Roux. Arch. Dev. Biol. 201: 134-141 (1992)）、ミンク（Sukoyan M. A. et al., Mol. Reorod. Dev. 33: 418-431 (1993)） などのＥＳ細胞が挙げられる。
【0071】
（３）その他の多能性幹細胞
ＥｐｉＳ細胞は、受精卵着床後のエピブラストから作製される多能性幹細胞である。
精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ＥＳ細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ。神経膠細胞系由来神経栄養因子（Ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ））を含む培養液で自己複製可能であるし、またＥＳ細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、精子幹細胞を得ることができる。
ＥｐｉＳ細胞は、受精卵着床後のエピブラストから作製される多能性幹細胞である。
精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ＥＳ細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ。神経膠細胞系由来神経栄養因子（Ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ））を含む培養液で自己複製可能であるし、またＥＳ細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、精子幹細胞を得ることができる。
【0072】
ＥＧ細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ＥＳ細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、幹細胞因子（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ）などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる。ＥＧ細胞として、例えば、ヒトＥＧ細胞（Shamblott, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92: 7844-7848 (1995))が挙げられる。
ｎｔＥＳ細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のＥＳ細胞であり、受精卵由来のＥＳ細胞とほぼ同じ特性を有している。
Ｍｕｓｅ細胞は、ＷＯ２０１１／００７９００に記載された方法にて製造された多能性幹細胞である。
ｎｔＥＳ細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のＥＳ細胞であり、受精卵由来のＥＳ細胞とほぼ同じ特性を有している。
Ｍｕｓｅ細胞は、ＷＯ２０１１／００７９００に記載された方法にて製造された多能性幹細胞である。
【0073】
これら各多能性幹細胞は、ヒト由来であっても、マウスやラット、ウシ、ブタ、サル等の動物由来であってもよい。その他、ナイーブ（ｎａｉｖｅ）状態であっても、プライムされた（ｐｒｉｍｅｄ）状態であってもよい。また、マウスの線維芽細胞（例、マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ））や、ヒト新生児もしくは成人の線維芽細胞をフィーダー細胞として培養作製されたものであっても、フィーダーレス培養により作製されたものであってもよい。
【0074】
２．２ 体細胞
本発明組成物は、上記のような多能性幹細胞から体細胞へ分化誘導するために用いることができる。
本発明組成物で分化誘導される体細胞としては特に制限されず、外胚葉系細胞、中胚葉系細胞、および内胚葉系細胞のいずれであってもよい。具体的には、外胚葉由来の細胞としては、角膜細胞、神経細胞（ドーパミン産生神経細胞、運動神経細胞、末梢神経細胞等）、色素上皮細胞、皮膚細胞、内耳細胞などが挙げられる。内胚葉由来の細胞としては、肝細胞、膵前駆細胞、インスリン産生細胞、胆管細胞、肺胞上皮細胞、腸管上皮細胞などが挙げられる。中胚葉由来の細胞としては、心筋細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、血液細胞、骨細胞、軟骨細胞、腎前駆細胞、腎上皮細胞などが挙げられる。なお体細胞には最終分化した成熟細胞だけでなく、最終分化に至っていない分化途中の細胞も含まれる。この中、本発明組成物は、神経細胞、心筋細胞、または肝細胞の分化誘導に用いることが好ましい。
本発明組成物は、上記のような多能性幹細胞から体細胞へ分化誘導するために用いることができる。
本発明組成物で分化誘導される体細胞としては特に制限されず、外胚葉系細胞、中胚葉系細胞、および内胚葉系細胞のいずれであってもよい。具体的には、外胚葉由来の細胞としては、角膜細胞、神経細胞（ドーパミン産生神経細胞、運動神経細胞、末梢神経細胞等）、色素上皮細胞、皮膚細胞、内耳細胞などが挙げられる。内胚葉由来の細胞としては、肝細胞、膵前駆細胞、インスリン産生細胞、胆管細胞、肺胞上皮細胞、腸管上皮細胞などが挙げられる。中胚葉由来の細胞としては、心筋細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、血液細胞、骨細胞、軟骨細胞、腎前駆細胞、腎上皮細胞などが挙げられる。なお体細胞には最終分化した成熟細胞だけでなく、最終分化に至っていない分化途中の細胞も含まれる。この中、本発明組成物は、神経細胞、心筋細胞、または肝細胞の分化誘導に用いることが好ましい。
【0075】
ここで体細胞が心筋細胞の場合、かかる心筋細胞とは、自己拍動の特性を有する心筋の細胞を意味する。また、心筋細胞は心筋前駆細胞を含んでもよく、拍動筋肉と電気伝導組織を形成する心筋細胞および血管平滑筋を生じる能力を有する細胞を含みうる。当該心筋細胞および心筋前駆細胞は互いに混在していてもよく、また、単離された心筋前駆細胞でもよい。
【0076】
心筋細胞および心筋前駆細胞は、例えば、心筋マーカーである心筋トロポニン（ｃＴＮＴまたはｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔ ｔｙｐｅ ２）やαアクチニン２（ＡＣＴＮ２）、αＭＨＣ（α ｍｙｏｓｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）、ＧＡＴＡ４、ＣＸＣＲ４、Ｆｌｋ１、ＡＮＰの発現量を調べることで当該細胞に誘導されたかどうか知ることができる。当該心筋細胞は、他の細胞種と比して心筋細胞の割合を多く含有した細胞集団であってもよく、３０％以上あるいは５０％以上が心筋細胞である細胞集団であることが好ましい。
【0077】
２．３ 本発明組成物の形態
本発明組成物は、少なくとも本発明ペプチドが含まれていればよく、その他任意の適当な成分を含むことができる。
具体的には、本発明組成物として、例えば、細胞培養用の培地（液体培地、固体培地）を挙げることができる。例えば、一般的な培地であるＭＥＭ（最少必須培地）、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、またはこれらを改変した培地に、本発明ペプチドを添加して本発明組成物とすることができる。本発明組成物としての培地には、所望に応じて、血清、タンパク質（アルブミン、トランスフェリン、成長因子等）、アミノ酸、糖類、ビタミン類、脂肪酸類、抗生物質、その他目的とする体細胞の分化誘導に有効な物質（例、液性因子）等を添加してもよい。
本発明組成物は、少なくとも本発明ペプチドが含まれていればよく、その他任意の適当な成分を含むことができる。
具体的には、本発明組成物として、例えば、細胞培養用の培地（液体培地、固体培地）を挙げることができる。例えば、一般的な培地であるＭＥＭ（最少必須培地）、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、またはこれらを改変した培地に、本発明ペプチドを添加して本発明組成物とすることができる。本発明組成物としての培地には、所望に応じて、血清、タンパク質（アルブミン、トランスフェリン、成長因子等）、アミノ酸、糖類、ビタミン類、脂肪酸類、抗生物質、その他目的とする体細胞の分化誘導に有効な物質（例、液性因子）等を添加してもよい。
【0078】
本発明組成物は、また、本発明ペプチドを含む体細胞分化誘導（促進）用キットであってもよい。本発明のキットは、本発明ペプチドに加えて別の分化誘導用の液性因子を含んでもよい。本発明ペプチドと別の分化誘導用の液性因子は、別々の容器に保存されていても、同一の容器に保存されていてもよい。
【0079】
本発明組成物は、本発明ペプチドをその分化誘導活性が失われない状態で保持し得る限りにおいて、使用形態に応じて医薬上許容され得る種々の担体を含み得る。希釈剤、賦形剤等としてペプチド医薬において一般的に使用される担体が好ましい。本発明組成物の用途や形態に応じて適宜異なり得るが、典型的には、水、生理学的緩衝液、種々の有機溶媒が挙げられる。適当な濃度のアルコール（エタノール等）水溶液、グリセロール、オリーブ油のような不乾性油であり得る。またリポソームであってもよい。あるいは本発明組成物に含有させ得る他の成分としては、種々の充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、色素、香料、抗生剤等が挙げられる。あるいは他の公知の細胞分化誘導因子を含有してもよい。本発明ペプチドと他の細胞分化誘導因子（レチノイン酸、アクチビン、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＢＭＰ４等）を併用することにより、細胞分化誘導を促進（増強）することができる。
【0080】
本発明組成物の形態について特に制限はない。例えば、溶液状、懸濁状、半固形状、固形状、ゲル状を挙げることができる。典型的な形態として、例えば、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏、水性ジェル剤等が挙げられる。また、注射剤等に用いるため、使用直前に生理食塩水または適当な緩衝液（例えばＰＢＳ）等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
なお、本発明ペプチド（主成分）および種々の担体（副成分）を材料にして種々の形態の薬剤（組成物）を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準ずればよい。
なお、本発明ペプチド（主成分）および種々の担体（副成分）を材料にして種々の形態の薬剤（組成物）を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準ずればよい。
【0081】
３ 本発明に係る体細胞の製造方法
本発明として、また、ＦＧＦ受容体に対し結合性を有する合成ペプチド（以下、「ＦＧＦＲ結合ペプチド」という。）を含む液性因子を多能性幹細胞の胚葉体に作用させる工程を含む、体細胞の製造方法（以下、「本発明製造方法」という。）を挙げることができる。
本発明として、また、ＦＧＦ受容体に対し結合性を有する合成ペプチド（以下、「ＦＧＦＲ結合ペプチド」という。）を含む液性因子を多能性幹細胞の胚葉体に作用させる工程を含む、体細胞の製造方法（以下、「本発明製造方法」という。）を挙げることができる。
【0082】
上記ＦＧＦＲ結合ペプチドとしては、適当な実験結果に基づきＦＧＦ受容体に対し結合性を有すると当業者が判断するものであれば特に制限されない。ＦＧＦ受容体の中、ＦＧＦＲ１および／またはＦＧＦＲ３に結合性を有するペプチドが好ましい。ＦＧＦ受容体への結合性については、例えば、表面プラズモン共鳴法（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＳＰＲ）やＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）で確認することができる。
【0083】
当該ＦＧＦＲ結合ペプチドは、５０以下のアミノ酸残基からなるものが適当であり、３０～５０ないし４０～５０のアミノ酸残基からなるものが好ましい。また、下記の配列番号５０のアミノ酸配列を分子構造上に有するものがより好ましい。
【0084】
【化7】
【0085】
具体的な当該ＦＧＦＲ結合ペプチドとしては、例えば、本発明ペプチド、Ｐ３、Ｃ１９、Ｄｅｋａｆｉｎ１を挙げることができる。
【0086】
ＦＧＦＲ結合ペプチドは、例えば、次のようにして取得することができる。適当なファージミドベクター（例、ｐＣｏｍｂ３、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ、ｐＳＥＸ）を用いて、ファージ表層提示ペプチドライブラリーを作製する。次いで、得られたファージ表層提示ライブラリーをヒトＦｃ断片と混合し、Ｆｃに対するネガティブセレクションを行う。この操作により、ファージライブラリーの中でＦｃに結合するファージを除くことができる。その後、ファージライブラリーをＦＧＦＲ１(ＦＧＦ受容体１)－Ｆｃに作用し、結合ファージを回収する。回収したファージからファージミドＤＮＡを抽出し、ファージミドＤＮＡの網羅的解析を行う。得られたクローンのアミノ酸配列からＦｍｏｃ固相合成法などに基づきペプチドを合成する。合成したペプチドについて、上記表面プラズモン共鳴法、ＥＬＩＳＡといった技術を用いて結合活性を測定し、その測定結果に基づき目的とするＦＧＦＲ結合ペプチドを取得することができる。
【0087】
本発明製造方法において用いることができる、ＦＧＦＲ結合ペプチド以外の液性因子としては、対象とする未分化細胞種や目的（製造したい分化細胞の種類）などによって異なるが、例えば、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２： Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ－２）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４： Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ－４）、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ７）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ：ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）とも称する）、線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４：Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ４）、線維芽細胞増殖因子８（ＦＧＦ８）、線維芽細胞増殖因子１０（ＦＧＦ１０）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ： Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）、血小板由来増殖因子ＢＢ（ＰＤＧＦ－ＢＢ：Ｐｌａｔｅｌｅｔ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－ＢＢ）、Ｗｎｔ３ａタンパク質（Ｗｎｔ３ａ）、ソニック・ヘッジホッグ（Ｓｈｈ： Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ：Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－β：Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－β）、アクチビンＡ（Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ：Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ Ｍ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ：Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）とも称する）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ：Ｇｌｉａｌ－Ｃｅｌｌ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒ）、ＩＷＰ－３（ＣＡＳ Ｎｏ．６８７５６１－６０－０）、トランスフェリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ；Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）などが挙げられる。これらの液性因子は、培地に添加したものでもよく、培養中の細胞から分泌されたものでもよい。当該液性因子は１種類でも、２種類以上でもよい。
【0088】
また、生体内（インビボ）で未分化細胞（例えば所定の部位に移植したｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞その他の幹細胞）を分化誘導させる場合においては、本発明組成物（本発明ペプチド）の適当量を例えば液剤として患部（即ち生体内）に所望量供給することができる。あるいは、錠剤等の固体形態のものや軟膏等のゲル状もしくは水性ジェリー状のものを患部（例えば火傷や創傷のような体表面）に投与することができる。これにより、生体内で、典型的には患部またはその周辺に存在する分化させたい目的の未分化細胞（幹細胞等）の分化誘導効率を向上（促進）させることができる。なお、添加量および添加回数は、分化誘導させたい細胞の種類、存在部位などの条件によって異なり得るため特に限定されない。
【0089】
本発明組成物（本発明ペプチド）を生体内の必要な部位に投与することにより、その分化誘導活性によって、神経再生能力、血管新生能力、皮膚再生能力、臓器再生能力等の向上を実現することができる。また、目的の細胞種や器官（臓器）への分化が促進されることにより、例えば、皮膚組織の改善、移植臓器の早期定着、交通事故その他の物理的障害による創傷部や火傷部の早期修復を実現することができる。また、例えば、パーキンソン病、脳梗塞、アルツハイマー病、脊髄損傷による身体の麻痺、脳挫傷、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脳腫瘍、網膜変性症等の神経疾患を再生医療的アプローチによって治療することに資する薬剤組成物として使用することができる。
【0090】
さらに、材料とする幹細胞（ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞）の培養細胞株から目的の分化細胞（延いては分化した組織や器官）を効率よく生産することができる。即ち、ここで開示される生産方法（インビトロでの分化細胞または該分化細胞からなる組織体の生産方法）を採用することによって生体外（インビトロ）で効率よく生産した目的の分化細胞（あるいは該分化細胞から成る組織や器官）を、修復や再生が必要とされる患部に（即ち患者の生体内に）導入することにより、当該修復や再生を効果的に行うことができる。
【0091】
本発明製造方法は、ＦＧＦＲ結合ペプチドを含む液性因子を前記多能性幹細胞の胚葉体に作用させる工程を含み、所望の体細胞の種類などに応じた分化誘導プロトコルに従って、常法により実施することができる。当該分化誘導は、通常、細胞を培養することにより行われるが、かかる培養方法としては、例えば、接着培養法、浮遊培養法、懸濁培養法などから、多能性幹細胞から分化誘導される所望の細胞（例えば、心筋細胞）に従って、適宜選択される。
【0092】
本発明製造方法により製造しうる体細胞としては、例えば、前記した体細胞を挙げることができる。この中、本発明製造方法により中胚葉系細胞、特に心筋細胞を製造する場合には、ＦＧＦＲ結合ペプチドとして本発明ペプチドを用いることが好ましい。
【0093】
例えば、本発明製造方法で得られた体細胞が心筋細胞の場合、当該心筋細胞は、動物（好ましくはヒト）の心疾患の治療剤として用いることができる。心疾患の治療方法として、例えば、得られた心筋細胞を生理食塩水等に懸濁させ、患者の心臓の心筋層へ直接投与してもよく、あるいは得られた心筋細胞をシート化して、患者の心臓に貼付することによって行われてもよい。前者の場合、細胞単体で投与してもよく、好ましくは、生着を促すような足場材と共に投与され得る。ここで「足場材」とは、コラーゲンなどの生体由来の成分やこれに代替するポリ乳酸などの合成ポリマーが例示されるが、これらに限定されない。心筋シートを投与する場合、所望の部分を覆うように配置することによって達成される。ここで、所望の部分を覆うように配置することは、当該分野において周知技術を用いて行うことができる。配置に際し、所望の部分が大きい場合は、組織を取り巻くように配置してもよい。また、投与は、所望の効果を得るため、同部分へ数回の配置を行うこともできる。数回の配置を行う場合、所望の細胞が組織へ生着し、血管新生を行うために十分な時間をおいて行うことが望ましい。
【0094】
このような心疾患の治療の機序は、心筋シートの生着により生じる効果であってもよく、あるいは細胞の生着によらない間接的な作用（例えば、誘引物質を分泌することによるレシピエント由来細胞の損傷部位への動員による効果）であってもよい。心疾患の治療において、心筋シートを用いる場合には、心筋細胞に加えて、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン等の細胞足場材料（スキャホールド）を含んでいてもよい。あるいは、心筋細胞の他に、任意の細胞種（複数も可）を含んでいることも可能である。本発明において治療され得る心疾患は、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症、拡張型心筋症などの疾患または障害による欠損等が挙げられるがこれらに限定されない。
【0095】
本発明において、心疾患の治療に用いられる心筋細胞の細胞数は、投与される心筋細胞もしくは心筋シートが心疾患の治療において効果を発揮するような量であれば特に限定されるものではなく、患部の大きさや体躯の大きさに合わせて適宜増減して調製されてもよい。
【0096】
４ 本発明に係る、多能性幹細胞から体細胞への分化誘導方法
本発明として、また、ＦＧＦＲ結合ペプチドを含む液性因子を多能性幹細胞の胚葉体に作用させる工程を含む、多能性幹細胞から体細胞への分化誘導方法（以下、「本発明分化誘導方法」という。）を挙げることができる。
本発明として、また、ＦＧＦＲ結合ペプチドを含む液性因子を多能性幹細胞の胚葉体に作用させる工程を含む、多能性幹細胞から体細胞への分化誘導方法（以下、「本発明分化誘導方法」という。）を挙げることができる。
【0097】
上記ＦＧＦＲ結合ペプチドとしては、前記と同様のものを挙げることができる。また、ＦＧＦＲ結合ペプチド以外の液性因子や多能性幹細胞、体細胞などの用語の概念は前記と同義である。
本発明分化誘導方法は、ＦＧＦＲ結合ペプチドを含む液性因子を用いること以外は、常法により実施することができる。即ち、所望の体細胞の種類などに応じた分化誘導プロトコルに従って、適切な時期にＦＧＦＲ結合ペプチドを含む液性因子を多能性幹細胞の胚葉体に作用させることにより本発明分化誘導方法を実施することができる。
本発明分化誘導方法は、ＦＧＦＲ結合ペプチドを含む液性因子を用いること以外は、常法により実施することができる。即ち、所望の体細胞の種類などに応じた分化誘導プロトコルに従って、適切な時期にＦＧＦＲ結合ペプチドを含む液性因子を多能性幹細胞の胚葉体に作用させることにより本発明分化誘導方法を実施することができる。
【0098】
本発明分化誘導方法は、具体的には、例えば、多能性幹細胞から心筋細胞へ分化誘導する場合、図１（プロトコル２、５～９）に示す分化誘導プロトコルに従って実施することができる。図１の中、プロトコル１は、従来技術である特許文献１における心筋細胞の分化誘導プロトコル（従来プロトコル）を表す。
図１に示す通り、従来プロトコルでは、誘導開始１日後にアクチビンＡ、ＢＭＰ４、およびｂＦＧＦといった液性因子を多能性幹細胞に作用させるのに対して、本発明分化誘導方法では、その中のＢＭＰ４とｂＦＧＦとを必ずしも必要とせず、本発明ペプチドとアクチビンＡのみで心筋細胞への分化誘導を可能とする。それ故、本発明分化誘導方法は、ＢＭＰ４やｂＦＧＦといった高価なタンパク質を用いず、比較的安価な中分子の本発明ペプチドを用いて効率的に体細胞へ分化誘導することができる。
図１に示す通り、従来プロトコルでは、誘導開始１日後にアクチビンＡ、ＢＭＰ４、およびｂＦＧＦといった液性因子を多能性幹細胞に作用させるのに対して、本発明分化誘導方法では、その中のＢＭＰ４とｂＦＧＦとを必ずしも必要とせず、本発明ペプチドとアクチビンＡのみで心筋細胞への分化誘導を可能とする。それ故、本発明分化誘導方法は、ＢＭＰ４やｂＦＧＦといった高価なタンパク質を用いず、比較的安価な中分子の本発明ペプチドを用いて効率的に体細胞へ分化誘導することができる。
【0099】
また、本発明分化誘導方法では、誘導開始１日後に、従来プロトコルと同様に、ｂＦＧＦなど他の液性因子を加えて実施することができる。そうすることで一般に、体細胞への誘導をより効率的に行うことができる。
より具体的には、本発明分化誘導方法（特に心筋細胞へ分化誘導する方法）は、例えば、下記の工程を含みうる。
より具体的には、本発明分化誘導方法（特に心筋細胞へ分化誘導する方法）は、例えば、下記の工程を含みうる。
【0100】
（１）多能性幹細胞から胚様体を形成する工程
コロニーを形成した多能性幹細胞を解離して単細胞にしたのちに胚様体を形成することが好ましい。多能性幹細胞を解離させる工程においては、互いに接着して集団を形成している細胞を個々の細胞に解離（分離）させる。多能性幹細胞を解離させる方法としては、例えば、力学的に解離する方法、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する解離溶液（例えば、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＴＭ）およびＡｃｃｕｍａｘ（ＴＭ）など）またはコラゲナーゼ活性のみを有する解離溶液を用いた解離方法が挙げられる。好ましくは、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する解離溶液（特に好ましくは、Ａｃｃｕｍａｘ）を用いて多能性幹細胞を解離する方法が用いられる。
コロニーを形成した多能性幹細胞を解離して単細胞にしたのちに胚様体を形成することが好ましい。多能性幹細胞を解離させる工程においては、互いに接着して集団を形成している細胞を個々の細胞に解離（分離）させる。多能性幹細胞を解離させる方法としては、例えば、力学的に解離する方法、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する解離溶液（例えば、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＴＭ）およびＡｃｃｕｍａｘ（ＴＭ）など）またはコラゲナーゼ活性のみを有する解離溶液を用いた解離方法が挙げられる。好ましくは、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する解離溶液（特に好ましくは、Ａｃｃｕｍａｘ）を用いて多能性幹細胞を解離する方法が用いられる。
【0101】
胚様体を形成する方法として、解離した多能性幹細胞を、培養皿の表面を細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、マトリゲル（商品名）等の細胞外マトリックス、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはエンタクチンによるコーティング処理）されていないもの、もしくは、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（ｐｏｌｙ－ＨＥＭＡ）によるコーティング処理）したものを用いて浮遊培養させることが例示できる。
心筋細胞を誘導する目的で胚様体を形成させるために好適に使用される多能性幹細胞数は、例えば、１０００個から１６０００個であり、好ましくは２０００個から８０００個である。
心筋細胞を誘導する目的で胚様体を形成させるために好適に使用される多能性幹細胞数は、例えば、１０００個から１６０００個であり、好ましくは２０００個から８０００個である。
【0102】
（２）胚様体を培養液中で培養する工程
本工程において用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地へ本発明ペプチド等のＦＧＦＲ結合ペプチド、アクチビンＡなどを添加することにより調製することができる。
本工程において用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地へ本発明ペプチド等のＦＧＦＲ結合ペプチド、アクチビンＡなどを添加することにより調製することができる。
【0103】
基礎培地としては、例えば、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ライフテクノロジーズ）、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびこれらの混合培地などが包含される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、１－チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含みうる。好ましい基礎培地は、トランスフェリン、１－チオールグリセロール、Ｌ－グルタミン、アスコルビン酸を含有するＳｔｅｍＰｒｏ３４である。
【0104】
本工程における本発明ペプチド等のＦＧＦＲ結合ペプチドの濃度としては、本発明ペプチドやＦＧＦＲ結合ペプチドの種類などによって異なるが、例えば、１ｐＭ～１００μＭの範囲内が適当であり、５０ｐＭ～１００ｎＭの範囲内が好ましく、５０ｐＭ～５ｎＭの範囲内がより好ましい。
【0105】
本工程においてアクチビンＡを用いる場合には、そのアクチビンＡの濃度として、例えば、１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの範囲内が適当であり、１ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬの範囲内が好ましく、１０ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇ／ｍＬの範囲内がより好ましい。
【0106】
本工程においてｂＦＧＦを用いる場合には、そのｂＦＧＦの濃度として、例えば、１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの範囲内が適当であり、１ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇ／ｍＬの範囲内がより好ましい。
【0107】
本工程においてＢＭＰ４を用いる場合には、そのＢＭＰ４の濃度として、例えば、１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの範囲内が適当であり、１ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬの範囲内が好ましく、１ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇ／ｍＬの範囲内がより好ましい。
【0108】
培養条件については次の通りである。
培養温度は約３０～４０℃が適当であり、好ましくは約３７℃であり、低酸素条件で行われることが望ましい。ここで、低酸素条件とは、大気中の酸素分圧（２０％）より低い酸素分圧の条件であり、例えば、１％から１５％の間の酸素分圧が挙げられる。好ましくは５％である。ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ２濃度は、好ましくは約２～５％である。
培養期間については、例えば１日以上７日以下が挙げられ、心筋細胞の樹立効率を考慮すると１日以上５日以下、１．５日以上５日以下、２日以上４日以下が好ましい。
培養温度は約３０～４０℃が適当であり、好ましくは約３７℃であり、低酸素条件で行われることが望ましい。ここで、低酸素条件とは、大気中の酸素分圧（２０％）より低い酸素分圧の条件であり、例えば、１％から１５％の間の酸素分圧が挙げられる。好ましくは５％である。ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ２濃度は、好ましくは約２～５％である。
培養期間については、例えば１日以上７日以下が挙げられ、心筋細胞の樹立効率を考慮すると１日以上５日以下、１．５日以上５日以下、２日以上４日以下が好ましい。
【0109】
（３）ＶＥＧＦおよびＷｎｔ阻害剤を含有する培養液中で培養し、再凝集により胚様体を形成する工程
再凝集により胚様体を形成させるにあたり、使用する細胞数は、同細胞が互いに接着し、細胞塊を作製できる細胞数であれば、特に限定されないが１０００個以上、２００００個以下の細胞が適当であり、１００００個が好ましい。培養に際しては、工程（１）と同様に、表面が細胞接着性を向上させる目的で人工的に処理されていない培養容器、もしくは人工的に接着を抑制する処理した培養容器を用いて浮遊培養させることが好ましい。
再凝集により胚様体を形成させるにあたり、使用する細胞数は、同細胞が互いに接着し、細胞塊を作製できる細胞数であれば、特に限定されないが１０００個以上、２００００個以下の細胞が適当であり、１００００個が好ましい。培養に際しては、工程（１）と同様に、表面が細胞接着性を向上させる目的で人工的に処理されていない培養容器、もしくは人工的に接着を抑制する処理した培養容器を用いて浮遊培養させることが好ましい。
【0110】
本工程において用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地へＶＥＧＦおよびＷｎｔ阻害剤を添加することにより調製することができる。基礎培地としては、例えばＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ライフテクノロジーズ）、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびこれらの混合培地などが包含される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、１－チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有し得る。好ましい基礎培地は、トランスフェリン、１－チオールグリセロール、Ｌ－グルタミン、アスコルビン酸を含有するＳｔｅｍＰｒｏ３４である。
【0111】
ここで「Ｗｎｔ阻害剤」とは、Ｗｎｔの受容体への結合からβカテニンの蓄積へと続くシグナル伝達を阻害する物質であり、受容体であるＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーへの結合を阻害する物質、またはβカテニンの分解を促進する物質である限り特に限定されず、例えば、ＤＫＫ１タンパク質（例えば、ヒトの場合、ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿０１２２４２）、スクレロスチン（例えば、ヒトの場合、ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿０２５２３７）、ＩＷＲ－１（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＩＷＰ－２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＩＷＰ－３（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＩＷＰ－４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＰＮＵ－７４６５４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＸＡＶ９３９（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）およびこれらの誘導体などが例示される。この中、ＩＷＰ－３またはＩＷＰ－４が好ましい。
【0112】
培養液中におけるＩＷＰ－３またはＩＷＰ－４などのＷｎｔ阻害剤の濃度としては、Ｗｎｔを阻害する濃度であれば特に限定されないが、例えば、１ｎＭ～５０μＭの範囲内が適当であり、１０ｎＭ～２５μＭの範囲内が好ましく、１００ｎＭ～１０μＭの範囲内がより好ましい。
【0113】
本工程において用いられるＶＥＧＦの濃度としては、例えば、１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの範囲内が適当であり、１ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬの範囲内が好ましく、１ｎｇ／ｍＬ～２０ ｎｇ／ｍＬの範囲内がより好ましい。
【0114】
本工程では、さらに、ＢＭＰ阻害剤および／またはＴＧＦβ阻害剤を基本培地に添加してもよい。
「ＢＭＰ阻害剤」とは、Ｃｈｏｒｄｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎなどのタンパク質性阻害剤、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（すなわち、６－［４－（２－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ－１－ｙｌ－ｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ］－３－ｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ－ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）、その誘導体、およびＬＤＮ－１９３１８９（すなわち、４－（６－（４－（ｐｉｐｅｒａｚｉｎ－１－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）が例示される。ＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎおよびＬＤＮ－１９３１８９は市販されており、それぞれＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社およびＳｔｅｍｇｅｎｔ社から入手可能である。好ましくは、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎであり得る。
「ＢＭＰ阻害剤」とは、Ｃｈｏｒｄｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎなどのタンパク質性阻害剤、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（すなわち、６－［４－（２－ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ－１－ｙｌ－ｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ］－３－ｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ－ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）、その誘導体、およびＬＤＮ－１９３１８９（すなわち、４－（６－（４－（ｐｉｐｅｒａｚｉｎ－１－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５－ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－３－ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）が例示される。ＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎおよびＬＤＮ－１９３１８９は市販されており、それぞれＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社およびＳｔｅｍｇｅｎｔ社から入手可能である。好ましくは、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎであり得る。
【0115】
培養液中におけるＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎなどのＢＭＰ阻害剤の濃度としては、ＢＭＰを阻害する濃度であれば特に限定されないが、例えば、１ｎＭ～５０ｎＭの範囲内が適当である。
【0116】
「ＴＧＦβ阻害剤」とは、ＴＧＦβの受容体への結合からＳＭＡＤへと続くシグナル伝達を阻害する物質であり、受容体であるＡＬＫファミリーへの結合を阻害する物質、またはＡＬＫファミリーによるＳＭＡＤのリン酸化を阻害する物質である限り特に限定されず、例えば、Ｌｅｆｔｙ－１（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．として、マウス：ＮＭ＿０１００９４、ヒト：ＮＭ＿０２０９９７が例示される）、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ２０２１９０（以上、R．K．Lindemann et al．，Mol．Cancer，2003，2：20）、ＳＢ５０５１２４（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＮＰＣ３０３４５、ＳＤ０９３、ＳＤ９０８、ＳＤ２０８ （Ｓｃｉｏｓ）、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ５８０２７６（Ｌｉｌｌｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ａ－８３－０１（ＷＯ２００９１４６４０８）およびこれらの誘導体を挙げることができる。好ましくは、ＳＢ４３１５４２である。
【0117】
培養液中におけるＳＢ４３１５４２などのＴＧＦβ阻害剤の濃度としては、ＡＬＫ５を阻害する濃度であれば特に限定されないが、例えば、１ｎＭ～５０ｎＭの範囲内が適当である。
【0118】
培養条件については次の通りである。
培養温度は約３０～４０℃が適当であり、好ましくは約３７℃であり、低酸素条件で行われることが望ましい。ここで、低酸素条件とは、大気中の酸素分圧（２０％）より低い酸素分圧の条件であり、ここで、低酸素条件とは、大気中の酸素分圧（２０％）より低い酸素分圧の条件であり、例えば、１％から１５％の間の酸素分圧が挙げられる。好ましくは５％である。ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ２濃度は、好ましくは約２～５％である。
培養期間は、長期間培養することにより心筋細胞の樹立に影響がでないことから、上限は特に設けられないが、４日以上培養することが好ましい。これにより、再凝集により形成された胚様体が心筋細胞に分化する。
培養温度は約３０～４０℃が適当であり、好ましくは約３７℃であり、低酸素条件で行われることが望ましい。ここで、低酸素条件とは、大気中の酸素分圧（２０％）より低い酸素分圧の条件であり、ここで、低酸素条件とは、大気中の酸素分圧（２０％）より低い酸素分圧の条件であり、例えば、１％から１５％の間の酸素分圧が挙げられる。好ましくは５％である。ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ２濃度は、好ましくは約２～５％である。
培養期間は、長期間培養することにより心筋細胞の樹立に影響がでないことから、上限は特に設けられないが、４日以上培養することが好ましい。これにより、再凝集により形成された胚様体が心筋細胞に分化する。
【0119】
（４）ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦを含有する培養液中で培養する工程
本工程において用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地へＶＥＧＦおよびｂＦＧＦを添加することにより調製することができる。基礎培地としては、例えばＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ライフテクノロジーズ）、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびこれらの混合培地などが包含される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、１－チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有し得る。好ましい基礎培地は、トランスフェリン、１－チオールグリセロール、Ｌ－グルタミン、アスコルビン酸を含有するＳｔｅｍＰｒｏ３４である。
本工程において用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地へＶＥＧＦおよびｂＦＧＦを添加することにより調製することができる。基礎培地としては、例えばＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ライフテクノロジーズ）、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびこれらの混合培地などが包含される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、１－チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有し得る。好ましい基礎培地は、トランスフェリン、１－チオールグリセロール、Ｌ－グルタミン、アスコルビン酸を含有するＳｔｅｍＰｒｏ３４である。
【0120】
本工程において用いられるＶＥＧＦの濃度としては、例えば、１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの範囲内が適当であり、１ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬの範囲内が好ましく、１ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬの範囲内がより好ましい。
【0121】
本工程において用いられるｂＦＧＦの濃度としては、例えば、１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの範囲内が適当であり、１ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬの範囲内が好ましく、１ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬの範囲内がより好ましい。
【0122】
培養条件については次の通りである。
培養温度は約３０～４０℃が適当であり、好ましくは約３７℃であり、低酸素条件で行われることが望ましい。ここで、低酸素条件とは、大気中の酸素分圧（２０％）より低い酸素分圧の条件であり、ここで、低酸素条件とは、大気中の酸素分圧（２０％）より低い酸素分圧の条件であり、例えば、１％から１５％の間の酸素分圧が挙げられる。好ましくは５％である。ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ２濃度は、好ましくは約２～５％である。
培養期間は、長期間培養することにより心筋細胞の樹立に影響がでないことから、上限は特に設けられないが、１２日以上培養することが好ましい。工程（３）で得られた細胞をさらに工程（４）に従って培養することにより、心筋細胞への分化効率が向上する。
培養温度は約３０～４０℃が適当であり、好ましくは約３７℃であり、低酸素条件で行われることが望ましい。ここで、低酸素条件とは、大気中の酸素分圧（２０％）より低い酸素分圧の条件であり、ここで、低酸素条件とは、大気中の酸素分圧（２０％）より低い酸素分圧の条件であり、例えば、１％から１５％の間の酸素分圧が挙げられる。好ましくは５％である。ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ２濃度は、好ましくは約２～５％である。
培養期間は、長期間培養することにより心筋細胞の樹立に影響がでないことから、上限は特に設けられないが、１２日以上培養することが好ましい。工程（３）で得られた細胞をさらに工程（４）に従って培養することにより、心筋細胞への分化効率が向上する。
【実施例】
【0123】
以下に実施例を示して、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。
【0124】
［実施例１］本発明ペプチドの合成
（１）ファージ表層提示ペプチドライブラリーの作製
まず、ファージミドベクター ｐＣｏｍｂ３（Barbas, C. et al., Assembly of Combinatorial Antibody Libraries on Phage Surfaces: The Gene III Site., Proc. National Acad. Sci., 88, 7978-7982 (1991), Fujii, I. et al., Evolving Catalytic Antibodies in a Phage-Displayed Combinatorial Library., Nat. Biotechnol. 16, 463-467 (1998)参照）を用いて、７つのファージ表層提示ペプチドライブラリー（ΔＰＴＡ－１０ＲＣ、ΔＰＴＡ－１２ＲＣ－１、ΔＰＴＡ－１２ＲＣ－２、ΔＰＴＡ－２０ＲＣ、ΔＰＴＡ－６Ｒ－Ｌｏｏｐ１１－Ｃ、ＭＦＬＩＶ－８Ｒ－ΔＰＴＡ－８ＲＣ－１、ＭＦＬＩＶ－８Ｒ－ΔＰＴＡ－８ＲＣ－２）を作製した（図２）。当該ライブラリーを構成するペプチド鎖はそれぞれ下記表４に示すアミノ酸配列を有する。
（１）ファージ表層提示ペプチドライブラリーの作製
まず、ファージミドベクター ｐＣｏｍｂ３（Barbas, C. et al., Assembly of Combinatorial Antibody Libraries on Phage Surfaces: The Gene III Site., Proc. National Acad. Sci., 88, 7978-7982 (1991), Fujii, I. et al., Evolving Catalytic Antibodies in a Phage-Displayed Combinatorial Library., Nat. Biotechnol. 16, 463-467 (1998)参照）を用いて、７つのファージ表層提示ペプチドライブラリー（ΔＰＴＡ－１０ＲＣ、ΔＰＴＡ－１２ＲＣ－１、ΔＰＴＡ－１２ＲＣ－２、ΔＰＴＡ－２０ＲＣ、ΔＰＴＡ－６Ｒ－Ｌｏｏｐ１１－Ｃ、ＭＦＬＩＶ－８Ｒ－ΔＰＴＡ－８ＲＣ－１、ＭＦＬＩＶ－８Ｒ－ΔＰＴＡ－８ＲＣ－２）を作製した（図２）。当該ライブラリーを構成するペプチド鎖はそれぞれ下記表４に示すアミノ酸配列を有する。
【0125】
【表4】
【0126】
これらのペプチド鎖は公知である配列（ＡＥＬＡＡＬＥＡＥＬＡＡＬＥＧＧＧＧＧＧＧＫＬＡＡＬＫＡＫＬＡＡＬＫＡ；配列番号５１）からなるペプチドＹＴ－１のアミノ酸配列を元にして構成された。表中のアミノ酸Ｘは、ＨＬＨ（ヘリックス－ループ－ヘリックス）構造を構成するそれぞれ１４アミノ酸残基からなる２本のα－ヘリックスにおいて、立体構造の保持に関与しないとされるアミノ酸であり、任意のアミノ酸に置換され得る。また、ライブラリーを構成する各ペプチド鎖はＮ末端側のα－ヘリックスのＮ末端に付加された２つのペプチドＣＡと、Ｃ末端側のα－ヘリックスのＣ末端に付加された１つのアミノ酸Ｃを有する。なお表４中ΔＰＴＡ－６Ｒ－Ｌｏｏｐ１１－Ｃは、ＹＴ－１のアミノ酸のループ部分を伸長し、ランダム化したアミノ酸配列である。
【0127】
（２）バイオパンニング
上記で得られたファージ表層提示ライブラリーを混合し、ＦＧＦＲ１（ＦＧＦ受容体１）－Ｆｃキメラに対するバイオパンニングを行った。まず、ネガティブセレクションとして、２００μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に１０１２ｃｆｕのペプチド提示ファージをｈＩｇＧ Ｆｃを固定化したプレートに作用し、ｈＩｇＧ Ｆｃに結合しないファージを回収した。回収したファージライブラリーを１００ｎＭのＦＧＦＲ１溶液と混合し、４℃で終夜反応させた（表５：Ｐａｎｎｉｎｇ Ｒｏｕｎｄ１）。
上記で得られたファージ表層提示ライブラリーを混合し、ＦＧＦＲ１（ＦＧＦ受容体１）－Ｆｃキメラに対するバイオパンニングを行った。まず、ネガティブセレクションとして、２００μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に１０１２ｃｆｕのペプチド提示ファージをｈＩｇＧ Ｆｃを固定化したプレートに作用し、ｈＩｇＧ Ｆｃに結合しないファージを回収した。回収したファージライブラリーを１００ｎＭのＦＧＦＲ１溶液と混合し、４℃で終夜反応させた（表５：Ｐａｎｎｉｎｇ Ｒｏｕｎｄ１）。
【0128】
【表5】
【0129】
反応後、プロテインＡが修飾された磁気ビーズで結合性ファージを捕え、ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄後、結合ファージをＧｌｙ－ＨＣｌ（ｐＨ２．０）で溶出した。これを２Ｍ Ｔｒｉｓで中和し、大腸菌へ感染させた。４時間培養したのち、ヘルパーファージを加え、一晩かけて大腸菌にファージを産生させた。次にこの培養上清からファージ溶液を調製した。調製したファージ溶液を、ＦＧＦＲ１溶液と混合し、４℃で終夜反応させた（表５：Ｐａｎｎｉｎｇ Ｒｏｕｎｄ２）。反応後、結合ファージを溶出した。同様に調製したファージ溶液を、ＦＧＦＲ１溶液と混合し、４℃で１時間反応させた（表５：Ｐａｎｎｉｎｇ Ｒｏｕｎｄ３）。反応後、結合ファージを溶出した。この操作をさらに２回繰り返し、Ｐａｎｎｉｎｇ Ｒｏｕｎｄ５の後に、結合ファージを溶出した。なお、ラウンドを重ねるにつれて、ＰＢＳ－Ｔによる洗浄回数を増やした（表５）。また、各ラウンドのＯｕｔｐｕｔファージの力価（タイター）を求めた。ファージの力価は、ファージと接触させた大腸菌ＴＧ１株を、３７℃一晩培養することで得られたコロニー数から求めた。その結果を表５の右端に示した。
【0130】
（３）アミノ酸配列の決定
図３＜Ｉｎｐｕｔ ｐｈａｇｅ（Ｒｏｕｎｄ５）＞に示す通り、パンニング後に溶出したファージライブラリーをＨｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃを固定化したプレートに作用し、結合しないファージを回収することでネガティブセレクションを実施した。その後、ファージライブラリーを１００ｎＭ、 １０ｎＭ、１ｎＭの各濃度に調製したＦＧＦＲ１に作用した。そして結合ファージを回収した。回収したファージのファージミドＤＮＡを抽出し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＭｉｓｅｑ用プロトコルに従ってサンプル調製し、ファージミドＤＮＡの網羅的解析を実施した。得られた配列のうち、配列出現割合が高い配列を２３種類選別した（表６）。
図３＜Ｉｎｐｕｔ ｐｈａｇｅ（Ｒｏｕｎｄ５）＞に示す通り、パンニング後に溶出したファージライブラリーをＨｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃを固定化したプレートに作用し、結合しないファージを回収することでネガティブセレクションを実施した。その後、ファージライブラリーを１００ｎＭ、 １０ｎＭ、１ｎＭの各濃度に調製したＦＧＦＲ１に作用した。そして結合ファージを回収した。回収したファージのファージミドＤＮＡを抽出し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＭｉｓｅｑ用プロトコルに従ってサンプル調製し、ファージミドＤＮＡの網羅的解析を実施した。得られた配列のうち、配列出現割合が高い配列を２３種類選別した（表６）。
【0131】
【表6】
【0132】
（４）ペプチドの合成とＦＧＦ受容体への結合性確認
上記で得られたクローンのアミノ酸配列から１種を選定し、１００ｎＸ（Ｘは９：配列番号９、以下同じ。）のペプチドを合成した。Ｆｍｏｃ固相合成法に基づき合成した。ペプチドの結合活性を測定するためにＳＰＲ装置Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）の操作マニュアルに従い、装置のセンサーチップＣＭ５に、アミンカップリング法を用いてＦＧＦＲ１をリガンドとして固定化した。また、他種のＦＧＦＲに結合するか確認するため、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３を固定化したセンサーチップを合わせて用意した。リファレンスとしてエタノールアミンを固定化し、サンプルをアナライトとして測定を行った。
上記で得られたクローンのアミノ酸配列から１種を選定し、１００ｎＸ（Ｘは９：配列番号９、以下同じ。）のペプチドを合成した。Ｆｍｏｃ固相合成法に基づき合成した。ペプチドの結合活性を測定するためにＳＰＲ装置Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）の操作マニュアルに従い、装置のセンサーチップＣＭ５に、アミンカップリング法を用いてＦＧＦＲ１をリガンドとして固定化した。また、他種のＦＧＦＲに結合するか確認するため、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３を固定化したセンサーチップを合わせて用意した。リファレンスとしてエタノールアミンを固定化し、サンプルをアナライトとして測定を行った。
【0133】
測定は全て２５℃で行い、ランニングバッファーにはＨＢＳ－ＥＰ＋を使用した。ペプチドを溶解したランニングバッファーを、各種ＦＧＦＲを固定化したセンサーチップＣＭ５へインジェクト（流速３０μｌ／ｍｉｎ、２分間）した後、ランニングバッファーを３分間流して、ペプチドを解離させた。得られたセンサーグラムに直接反応式をカーブフィッティングさせ、非線形最小二乗法により速度定数を算出した。解離定数はＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いたカイネティクス解析により算出した。解析には１：１ ｂｉｎｄｉｎｇモデルを使用した。その結果を図４に示す。
図４に示す通り、１００ｎＸは、ＦＧＦＲに対して高い結合性を有することが確認された。
図４に示す通り、１００ｎＸは、ＦＧＦＲに対して高い結合性を有することが確認された。
【0134】
［実施例２］ｉＰＳ細胞から心筋細胞への分化誘導（ＨＢＤ－１００ｎＸの評価）
次に、ヘパラン硫酸結合ペプチドＷＱＰＰＲＡＲＩＧ（配列番号４９）を１００ｎＸに融合したペプチド（ＨＢＤ－１００ｎＸ）を合成し、ｉＰＳ細胞から心筋細胞への分化誘導系に適用することを試みた。ｉＰＳ細胞は、「ｉＰＳ ｃｅｌｌ－ＫＡＣ、ｈＦＢ（Ｎ）」（ＫＡＣ社、製品番号；ＩＰＳ－Ｆ００１）（以下、ｉＰＳ－ｈＦＢ）を使用した。まず、分化誘導開始時（Ｄａｙ０）において、分化誘導開始の７日前（Ｄａｙ－７）に１００φディッシュに播種したｉＰＳ－ｈＦＢを、４ｍｌのＰＢＳで洗浄した。０．５ｘＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを３ｍｌ添加し、３７℃で３分間静置した。細胞が球状になったことを確認し、０．５ｘＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを除去した。さらに４ｍｌのＰＢＳで洗浄し、分化誘導用培地（１％ Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５０μｇ／ｍＬ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（Ｒｏｃｈｅ）、５０μｇ／ｍＬ Ａｓｃｏｒｂｉｃ Ａｃｉｄ（ｓｉｇｍａ）、３．９×１０－３％ＭＴＧ（１－Ｔｈｙｏｇｌｙｃｅｒｏｌ）（ｓｉｇｍａ）、１０μＭ Ｒｏｃｋ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｙ－２７６３２、Ｗａｋｏ）、５％ ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、および２ｎｇ／ｍＬ ＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ）を添加したＳＴＥＭＰＲＯ３４（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を４ｍｌ添加した。その後、セルスクレーパーで細胞を剥離し、ピペッティングで細胞を単離した。細胞数を測定し、８０００個／ｗｅｌｌとなるように９６ｗｅｌｌ丸底プレートに播種し、３７℃・５％ＣＯ２条件下で培養した。
次に、ヘパラン硫酸結合ペプチドＷＱＰＰＲＡＲＩＧ（配列番号４９）を１００ｎＸに融合したペプチド（ＨＢＤ－１００ｎＸ）を合成し、ｉＰＳ細胞から心筋細胞への分化誘導系に適用することを試みた。ｉＰＳ細胞は、「ｉＰＳ ｃｅｌｌ－ＫＡＣ、ｈＦＢ（Ｎ）」（ＫＡＣ社、製品番号；ＩＰＳ－Ｆ００１）（以下、ｉＰＳ－ｈＦＢ）を使用した。まず、分化誘導開始時（Ｄａｙ０）において、分化誘導開始の７日前（Ｄａｙ－７）に１００φディッシュに播種したｉＰＳ－ｈＦＢを、４ｍｌのＰＢＳで洗浄した。０．５ｘＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを３ｍｌ添加し、３７℃で３分間静置した。細胞が球状になったことを確認し、０．５ｘＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを除去した。さらに４ｍｌのＰＢＳで洗浄し、分化誘導用培地（１％ Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５０μｇ／ｍＬ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（Ｒｏｃｈｅ）、５０μｇ／ｍＬ Ａｓｃｏｒｂｉｃ Ａｃｉｄ（ｓｉｇｍａ）、３．９×１０－３％ＭＴＧ（１－Ｔｈｙｏｇｌｙｃｅｒｏｌ）（ｓｉｇｍａ）、１０μＭ Ｒｏｃｋ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｙ－２７６３２、Ｗａｋｏ）、５％ ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、および２ｎｇ／ｍＬ ＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ）を添加したＳＴＥＭＰＲＯ３４（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を４ｍｌ添加した。その後、セルスクレーパーで細胞を剥離し、ピペッティングで細胞を単離した。細胞数を測定し、８０００個／ｗｅｌｌとなるように９６ｗｅｌｌ丸底プレートに播種し、３７℃・５％ＣＯ２条件下で培養した。
【0135】
翌日（Ｄａｙ１）、１％Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１５０μｇ／ｍＬ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、 ５０μｇ／ｍＬ Ａｓｃｏｒｂｉｃ Ａｃｉｄ、３．９×１０－３％ＭＴＧ、１０ｎｇ／ｍＬ ＢＭＰ４、５ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ）および６ｎｇ／ｍＬ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ（Ｒ＆Ｄ）を添加したＳＴＥＭＰＲＯ３４を１００μｌ／ｗｅｌｌで添加した（従来プロトコル；図１、プロトコル１）。
【0136】
一方、ペプチドサンプル作用群では、１％Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１５０μｇ／ｍＬ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、５０μｇ／ｍＬ Ａｓｃｏｒｂｉｃ Ａｃｉｄ、３．９×１０－３％ＭＴＧ、０．０５μＭもしくは０．５μＭ ＨＢＤ－１００ｎＸ、および６ｎｇ／ｍＬ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ（Ｒ＆Ｄ）を添加したＳＴＥＭＰＲＯ３４を１００μｌ／ｗｅｌｌで添加した（本発明分化誘導方法；図１、プロトコル２）。さらに、対照群として、１％Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１５０μｇ／ｍＬ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、５０μｇ／ｍＬ Ａｓｃｏｒｂｉｃ Ａｃｉｄ、３．９×１０－３％ＭＴＧ、 １０ｎｇ／ｍＬ ＢＭＰ４、および６ｎｇ／ｍＬ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ（Ｒ＆Ｄ）を添加したＳＴＥＭＰＲＯ ３４を１００μｌ／ｗｅｌｌで添加した群（図１、プロトコル３）、１％Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１５０μｇ／ｍＬ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、５０μｇ／ｍＬ Ａｓｃｏｒｂｉｃ Ａｃｉｄ、 ３．９×１０－３％ＭＴＧ、および６ｎｇ／ｍＬ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ（Ｒ＆Ｄ）を添加したＳＴＥＭＰＲＯ３４を１００μｌ／ｗｅｌｌで添加した群（図１、プロトコル４）を用意した。その後、３日間、３７℃・５％ＣＯ２条件下で培養した。
【0137】
続いて（Ｄａｙ４）、得られたＥＢを２００ｇで３分間遠心分離し、培地を除去した。ＰＢＳを添加し、２００ｇで３分間遠心し上清を除去した。Ａｃｃｕｍａｘを添加し３７℃で５分静置後、 ピペティングによりシングルセルに解離し、１％Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１５０μｇ／ｍＬ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、５０μｇ／ｍＬ Ａｓｃｏｒｂｉｃ Ａｃｉｄ、３．９×１０－３％ＭＴＧ、 １０ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦおよび１μＭ ＩＷＰ－３を添加したＳＴＥＭＰＲＯ３４（Ｄａｙ４心筋誘導用培地）を２ｍｌ添加し、２００ｇで３分間遠心後に上清を除去した。Ｄａｙ４心筋誘導培地用で細胞を懸濁し、細胞数を測定した後、１００００個／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌ丸底プレートに播種した。そして、３７℃・５％ＣＯ２条件下で、４日間培養した。
【0138】
続いて（Ｄａｙ８）、９６ｗｅｌｌプレートから２４ｗｅｌｌプレートに細胞塊をまとめて移動し（１ｗｅｌｌあたり細胞塊８個以下）、細胞塊を自然沈降させてから培地を除去し１％Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１５０μｇ／ｍＬ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、５０μｇ／ｍＬ Ａｓｃｏｒｂｉｃ Ａｃｉｄ、３．９×１０－３％ＭＴＧ、１０ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦおよび５ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦを添加したＳＴＥＭＰＲＯ３４（Ｄａｙ８心筋誘導用培地）を添加し、細胞を自然沈降させ上清を除去した。Ｄａｙ８心筋誘導用培地を添加後、３７℃・５％ＣＯ２条件下で培養した。この際、２日に１度同じ条件の培地に交換した。
【0139】
培養後、得られた細胞を評価したところ、プロトコル１もしくは３では、Ｄａｙ１６～Ｄａｙ２２で細胞塊の一部が弱く拍動していた、あるいは拍動が認められなかったのに対し、プロトコル２では、Ｄａｙ１６～Ｄａｙ２２に細胞塊の全体が拍動し、８０％以上の細胞塊が拍動していた。
【0140】
また、心筋細胞に分化しているかを確認するため、Ｄａｙ２３で定量リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）により、心筋マーカーであるｃＴＮＴおよびＡｃｔｉｎｉｎの発現量を調べた。具体的には、ｔｏｔａｌ ＲＮＡをＱＩＡＧＥＮ Ｒｎｅａｓｙ Ｋｉｔ（キアゲン）により回収し、ＲＮＡをｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（サーモサイエンティフィック社製）により逆転写することでｃＤＮＡを調製した。得られたｃＤＮＡから、ｃＴＮＴ、Ａｃｔｉｎｉｎを特異的に増幅するプライマーとそれぞれの遺伝子に特異的に結合するプローブを用いて、ＴａｑＭａｎＰＣＲ法によるリアルタイムＰＣＲを実施した。内部標準コントロールとしては、ＧＡＰＤＨ量を計測した。その結果を図５に示す。
【0141】
図５に示す通り、本発明ペプチド（ＨＢＤ－１００ｎＸ）を使用したプロトコル２では、ｃＴＮＴおよびＡＣＴＮ２の発現量が従来のプロトコル１（Ｄａｙ１；ＡｃｔｉｖｉｎＡ、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦの３種類添加）、および対照のプロトコル３（Ｄａｙ１；ＡｃｔｉｖｉｎＡのみ）、プロトコル４（Ｄａｙ１；ＡｃｔｉｖｉｎＡ、ＢＭＰ４の２種類添加）と比較して有意に増加した。また、ペプチド濃度依存的に遺伝子発現量が増加することが示された。
【0142】
さらに、Ｄａｙ２３にＡｃｔｉｎｉｎを免疫染色することで、心筋細胞特異的なサルコメア構造が認められるか観察した。具体的には、Ｄａｙ２３の細胞塊をコラゲナーゼ処理およびＡｃｃｕｍａｘ処理でシングルセルにし、フィブロネクチンをコーティングした２４ｗｅｌｌプレートに１００００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。翌日、細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液で固定化し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ／ＰＢＳで透過処理した。その後、５％ Ｄｏｎｋｅｙ Ｓｅｒｕｍ、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳでブロッキング処理した。０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ／ＰＢＳで洗浄後、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－Ａｃｔｉｎｉｎ抗体（Ｓｉｇｍａ）を添加し、室温で６０分間反応した。その後、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ／ＰＢＳで洗浄し、Ａｌｅｘａ５９４修飾Ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ抗体（ａｂｃａｍ）を添加し、室温で６０分間反応し、キーエンスＢＺ－Ｘ８１０で細胞の蛍光を観察した。その結果を図６および図７に示す。
【0143】
図６、７に示す通り、本発明ペプチド（ＨＢＤ－１００ｎＸ）を使用したプロトコルでは、顕著なサルコメア構造が認められ、高機能な心筋細胞が形成されていることが観察された。
【0144】
［実施例３］ｉＰＳ細胞から心筋細胞への分化誘導（１００ｎＸ－Ｄｉｍｅｒの評価）
次に、１００ｎＸを二量体化したペプチド（１００ｎＸ－Ｄｉｍｅｒ）について評価した。対照として、本発明ペプチドの単量体（１００ｎＸ－Ｍｏｎｏｍｅｒ）を用いた。
次に、１００ｎＸを二量体化したペプチド（１００ｎＸ－Ｄｉｍｅｒ）について評価した。対照として、本発明ペプチドの単量体（１００ｎＸ－Ｍｏｎｏｍｅｒ）を用いた。
【0145】
実施例２と同様に心筋細胞の分化誘導を実施し、Ｄａｙ１で使用する培地を次のように変更した。ペプチドサンプル作用群では、１％Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１５０μｇ／ｍＬ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、５０μｇ／ｍＬ Ａｓｃｏｒｂｉｃ Ａｃｉｄ、３．９×１０－３％ＭＴＧ、０．０５μＭ １００ｎＸ－Ｄｉｍｅｒもしくは１００ｎＸ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、および６ｎｇ／ｍＬ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ（Ｒ＆Ｄ）を添加したＳＴＥＭＰＲＯ３４を使用した（本発明分化誘導方法；図１、プロトコル５、６）。
【0146】
培養後、得られた細胞を評価したところ、プロトコル５では、Ｄａｙ１１で細胞塊の拍動が認められたのに対し、プロトコル６では、Ｄａｙ１６以降に拍動が認められた。また、心筋細胞に分化しているかを確認するため、Ｄａｙ２３で、定量リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）により、心筋マーカーであるｃＴＮＴおよびＡｃｔｉｎｉｎの発現量を調べた。具体的には、ｔｏｔａｌ ＲＮＡをＱＩＡＧＥＮ Ｒｎｅａｓｙ Ｋｉｔ（キアゲン）により回収し、ＲＮＡをｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（サーモサイエンティフィック社製）により逆転写することでｃＤＮＡを調製した。得られたｃＤＮＡから、ｃＴＮＴ、Ａｃｔｉｎｉｎを特異的に増幅するプライマーとそれぞれの遺伝子に特異的に結合するプローブを用いて、ＴａｑＭａｎＰＣＲ法によるリアルタイムＰＣＲを実施した。内部標準コントロールとしては、ＧＡＰＤＨ量を計測した。その結果を図８に示す。
【0147】
図８に示す通り、本発明ペプチド（１００ｎＸ－Ｄｉｍｅｒ）を使用したプロトコル５では、ｃＴＮＴおよびＡＣＴＮ２の発現量が従来のプロトコル１（Ｄａｙ１；ＡｃｔｉｖｉｎＡ、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦの３種類添加）、および対照のプロトコル３（Ｄａｙ１；ＡｃｔｉｖｉｎＡのみ）、プロトコル４（Ｄａｙ１；ＡｃｔｉｖｉｎＡ、ＢＭＰ４の２種類添加）、あるいはプロトコル６と比較して有意に増加した。
【0148】
［実施例４］ｉＰＳ細胞から心筋細胞への分化誘導（ペプチドサンプルとｂＦＧＦを混合した条件の評価）
次に、本発明ペプチドとｂＦＧＦを同時に作用する手法について評価した。
次に、本発明ペプチドとｂＦＧＦを同時に作用する手法について評価した。
【0149】
実施例２と同様に心筋分化誘導を実施し、Ｄａｙ１で使用する培地を次のように変更した。ペプチドサンプル作用群では、１％Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１５０μｇ／ｍＬ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、５０μｇ／ｍＬ Ａｓｃｏｒｂｉｃ Ａｃｉｄ、３．９×１０－３％ＭＴＧ、５ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ、０．０５－５μＭ ＨＢＤ－１００ｎＸもしくは５μＭ １００ｎＸ－Ｄｉｍｅｒもしくは５μＭ １００ｎＸ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、および６ｎｇ／ｍＬ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ（Ｒ＆Ｄ）を添加したＳＴＥＭＰＲＯ３４を使用した（本発明分化誘導方法；図１、プロトコル７、８、９）。さらに、対照群として、１％Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１５０μｇ／ｍＬ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、５０μｇ／ｍＬ Ａｓｃｏｒｂｉｃ Ａｃｉｄ、３．９×１０－３％ＭＴＧ、５ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦおよび６ｎｇ／ｍＬ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ（Ｒ＆Ｄ）を添加したＳＴＥＭＰＲＯ３４を添加した群（図１、プロトコル１０）を用意した。
【0150】
培養後、得られた細胞を評価したところ、いずれのプロトコル７、８、９、１０でも、Ｄａｙ１０～Ｄａｙ１１以降に細胞塊の拍動が認められ、群間で拍動の様子に差異は認められなかった。一方で、心筋細胞に分化しているかを確認するため、Ｄａｙ２３で、定量リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）により、心筋マーカーであるｃＴＮＴおよびＡｃｔｉｎｉｎの発現量を調べた。具体的には、ｔｏｔａｌ ＲＮＡをＱＩＡＧＥＮ Ｒｎｅａｓｙ Ｋｉｔ（キアゲン）により回収し、ＲＮＡをｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（サーモサイエンティフィック社製）により逆転写することでｃＤＮＡを調製した。得られたｃＤＮＡから、ｃＴＮＴ、Ａｃｔｉｎｉｎを特異的に増幅するプライマーとそれぞれの遺伝子に特異的に結合するプローブを用いて、ＴａｑＭａｎＰＣＲ法によるリアルタイムＰＣＲを実施した。内部標準コントロールとしては、４５Ｓ ｒＲＮＡ量を計測した。その結果を図９および図１０に示す。
【0151】
図９、図１０に示す通り、本発明ペプチド（ＨＢＤ－１００ｎＸ）をｂＦＧＦと合わせて使用した際、ｃＴＮＴおよびＡＣＴＮ２の発現量がペプチド濃度依存的に上昇した。また、本発明ペプチド（ＨＢＤ－１００ｎＸ、１００ｎＸ－Ｄｉｍｅｒ、１００ｎＸ－Ｍｏｎｏｍｅｒ）のいずれも従来のプロトコル１と比較して遺伝子発現量が有意に上昇し、ＨＢＤ－１００ｎＸが最も高い値を示した。
【0152】
したがって、１００ｎＸはｂＦＧＦと組み合わせて使用することで、心筋細胞への分化誘導を促進する、または心筋の成熟化を促進する可能性が示された。
【0153】
［実施例５］ファージ表層提示ペプチドライブラリーの作製
まず、ファージミドベクターｐＣｏｍｂ３（Barbas, C. et al., Assembly of Combinatorial Antibody Libraries on Phage Surfaces: The Gene III Site., Proc. National Acad. Sci., 88, 7978-7982 (1991), Fujii, I. et al., Evolving Catalytic Antibodies in a Phage-Displayed Combinatorial Library., Nat. Biotechnol. 16, 463-467 (1998)参照）を用いて、６つのファージ表層提示ペプチドライブラリーを作製した。当該ライブラリーを構成するペプチド鎖はそれぞれ表７に示すアミノ酸配列を有する。これらのペプチド鎖は公知である配列（ＡＥＬＡＡＬＥＡＥＬＡＡＬＥＧＧＧＧＧＧＧＫＬＡＡＬＫＡＫＬＡＡＬＫＡ；配列番号５１）からなるペプチドＹＴ－１のアミノ酸配列を元にして構成された。表中のアミノ酸Ｘは、ＨＬＨ（ヘリックス-ループ-ヘリックス）構造を構成するそれぞれ１４アミノ酸残基からなる２本のα-ヘリックスにおいて、立体構造の保持に関与しないとされるアミノ酸であり、任意のアミノ酸に置換され得る。また、ライブラリーを構成する各ペプチド鎖はＮ末端側のα-ヘリックスのＮ末端に付加された２つのペプチドＣＡと、Ｃ末端側のα-ヘリックスのＣ末端に付加された１つのアミノ酸Ｃを有する。なお表７中ΔＰＴＡ－６Ｒ－Ｌｏｏｐ１１－Ｃは、ＹＴ－１のアミノ酸のループ部分を伸長し、ランダム化したアミノ酸配列である。
まず、ファージミドベクターｐＣｏｍｂ３（Barbas, C. et al., Assembly of Combinatorial Antibody Libraries on Phage Surfaces: The Gene III Site., Proc. National Acad. Sci., 88, 7978-7982 (1991), Fujii, I. et al., Evolving Catalytic Antibodies in a Phage-Displayed Combinatorial Library., Nat. Biotechnol. 16, 463-467 (1998)参照）を用いて、６つのファージ表層提示ペプチドライブラリーを作製した。当該ライブラリーを構成するペプチド鎖はそれぞれ表７に示すアミノ酸配列を有する。これらのペプチド鎖は公知である配列（ＡＥＬＡＡＬＥＡＥＬＡＡＬＥＧＧＧＧＧＧＧＫＬＡＡＬＫＡＫＬＡＡＬＫＡ；配列番号５１）からなるペプチドＹＴ－１のアミノ酸配列を元にして構成された。表中のアミノ酸Ｘは、ＨＬＨ（ヘリックス-ループ-ヘリックス）構造を構成するそれぞれ１４アミノ酸残基からなる２本のα-ヘリックスにおいて、立体構造の保持に関与しないとされるアミノ酸であり、任意のアミノ酸に置換され得る。また、ライブラリーを構成する各ペプチド鎖はＮ末端側のα-ヘリックスのＮ末端に付加された２つのペプチドＣＡと、Ｃ末端側のα-ヘリックスのＣ末端に付加された１つのアミノ酸Ｃを有する。なお表７中ΔＰＴＡ－６Ｒ－Ｌｏｏｐ１１－Ｃは、ＹＴ－１のアミノ酸のループ部分を伸長し、ランダム化したアミノ酸配列である。
【0154】
【表7】
【0155】
［実施例６］酵母表層提示ペプチドライブラリーの作製
酵母発現用プラスミドｐＹＤ１１－ＢｘＸＮ（Ramanayake Mudiyanselage T. M. R. et al., An Immune-Stimulatory Helix-Loop-Helix Peptide: Selective Inhibition of CTLA-4-B7 Interaction, ACS Chem. Biol., 15, 360-368 (2020)参照）を用いて、6つの酵母表層提示ペプチドライブラリーを作製した。当該ライブラリーを構成するペプチド鎖はそれぞれ表８に示すアミノ酸配列を有する。これらのペプチド鎖は公知である配列（ＡＥＬＡＡＬＥＡＥＬＡＡＬＥＧＧＧＧＧＧＧＫＬＡＡＬＫＡＫＬＡＡＬＫＡ；配列番号５１）からなるペプチドＹＴ－１のアミノ酸配列を元にして構成された。表中のアミノ酸ＸおよびＺは、ＨＬＨ（ヘリックス-ループ-ヘリックス）構造を構成するそれぞれ１４アミノ酸残基からなる２本のα-ヘリックスにおいて、立体構造の保持に関与しないとされるアミノ酸であり、ＮＤＫ、ＮＮＫ、ＢＮＳのいずれかの3塩基により指定された任意のアミノ酸である。また、ライブラリーを構成する各ペプチド鎖はN末端側のα-ヘリックスのN末端に付加された2つのペプチドＣＡと、Ｃ末端側のα-ヘリックスのＣ末端に付加された２つのアミノ酸ACを有する。なお表７中ΔＰＴＡ－６Ｒ－Ｌｏｏｐ１１－Ｃ、 ΔＩＫＭＮＴ－Ｌｏｏｐ１１－Ｃ、 ΔＰＴＡ－６Ｒ－ΔＩＫＭＮＴ－Ｌｏｏｐ１１Ｃは、ＹＴ－１のアミノ酸のループ部分を伸長し、ランダム化したアミノ酸配列である。
酵母発現用プラスミドｐＹＤ１１－ＢｘＸＮ（Ramanayake Mudiyanselage T. M. R. et al., An Immune-Stimulatory Helix-Loop-Helix Peptide: Selective Inhibition of CTLA-4-B7 Interaction, ACS Chem. Biol., 15, 360-368 (2020)参照）を用いて、6つの酵母表層提示ペプチドライブラリーを作製した。当該ライブラリーを構成するペプチド鎖はそれぞれ表８に示すアミノ酸配列を有する。これらのペプチド鎖は公知である配列（ＡＥＬＡＡＬＥＡＥＬＡＡＬＥＧＧＧＧＧＧＧＫＬＡＡＬＫＡＫＬＡＡＬＫＡ；配列番号５１）からなるペプチドＹＴ－１のアミノ酸配列を元にして構成された。表中のアミノ酸ＸおよびＺは、ＨＬＨ（ヘリックス-ループ-ヘリックス）構造を構成するそれぞれ１４アミノ酸残基からなる２本のα-ヘリックスにおいて、立体構造の保持に関与しないとされるアミノ酸であり、ＮＤＫ、ＮＮＫ、ＢＮＳのいずれかの3塩基により指定された任意のアミノ酸である。また、ライブラリーを構成する各ペプチド鎖はN末端側のα-ヘリックスのN末端に付加された2つのペプチドＣＡと、Ｃ末端側のα-ヘリックスのＣ末端に付加された２つのアミノ酸ACを有する。なお表７中ΔＰＴＡ－６Ｒ－Ｌｏｏｐ１１－Ｃ、 ΔＩＫＭＮＴ－Ｌｏｏｐ１１－Ｃ、 ΔＰＴＡ－６Ｒ－ΔＩＫＭＮＴ－Ｌｏｏｐ１１Ｃは、ＹＴ－１のアミノ酸のループ部分を伸長し、ランダム化したアミノ酸配列である。
【0156】
【表8】
【0157】
［実施例７］ＦＧＦＲ３結合ペプチド取得のためのバイオパンニング
実施例５で得られたファージ表層提示ライブラリーを混合し、ＦＧＦＲ３（ＦＧＦ受容体３）－Ｆｃキメラに対するバイオパンニングを行った。まず、ネガティブセレクションとして、２００μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に１０１２ｃｆｕのペプチド提示ファージをｈＩｇＧ Ｆｃを固定化したプレートに作用させ、ｈＩｇＧ Ｆｃに結合しないファージを回収した。回収したファージライブラリーを１００ｎＭのＦＧＦＲ３溶液と混合し、４℃で終夜反応させた（表９．Ｐａｎｎｉｎｇ Ｒｏｕｎｄ１）。反応後、プロテインＡが修飾された磁気ビーズで結合性ファージを捕え、 ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄後、結合ファージをＧｌｙ－ＨＣｌ（ｐＨ ２．０）で溶出した。これを２Ｍ Ｔｒｉｓで中和し、大腸菌（ＴＧ１株）へ感染させた。４時間培養した後、 ヘルパーファージを加え、 一晩かけて大腸菌（ＴＧ１株）にファージを産生させた。次にこの培養上清からファージ溶液を調製した。調製したファージ溶液を、FGFR3溶液と混合し、４℃で終夜反応させた（表９．Ｐａｎｎｉｎｇ Ｒｏｕｎｄ２）。反応後、結合ファージを溶出した。同様に調製したファージ溶液を、ＦＧＦＲ３溶液と混合し、４℃で１時間反応させた（表９．Ｐａｎｎｉｎｇ Ｒｏｕｎｄ３）。反応後、結合ファージを溶出した。この操作をさらに繰り返し、Ｐａｎｎｉｎｇ Ｒｏｕｎｄ４の後に、結合ファージを溶出した。なお、ラウンドを重ねるにつれて、ＰＢＳ－Ｔによる洗浄回数を増やした（表９）。また、各ラウンドのＯｕｔｐｕｔファージの力価（タイター）を求めた。ファージの力価は、ファージと接触させた大腸菌ＴＧ１株を、３７℃一晩培養することで得られたコロニー数から求めた。その結果を表９の右端に示した。
実施例５で得られたファージ表層提示ライブラリーを混合し、ＦＧＦＲ３（ＦＧＦ受容体３）－Ｆｃキメラに対するバイオパンニングを行った。まず、ネガティブセレクションとして、２００μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に１０１２ｃｆｕのペプチド提示ファージをｈＩｇＧ Ｆｃを固定化したプレートに作用させ、ｈＩｇＧ Ｆｃに結合しないファージを回収した。回収したファージライブラリーを１００ｎＭのＦＧＦＲ３溶液と混合し、４℃で終夜反応させた（表９．Ｐａｎｎｉｎｇ Ｒｏｕｎｄ１）。反応後、プロテインＡが修飾された磁気ビーズで結合性ファージを捕え、 ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄後、結合ファージをＧｌｙ－ＨＣｌ（ｐＨ ２．０）で溶出した。これを２Ｍ Ｔｒｉｓで中和し、大腸菌（ＴＧ１株）へ感染させた。４時間培養した後、 ヘルパーファージを加え、 一晩かけて大腸菌（ＴＧ１株）にファージを産生させた。次にこの培養上清からファージ溶液を調製した。調製したファージ溶液を、FGFR3溶液と混合し、４℃で終夜反応させた（表９．Ｐａｎｎｉｎｇ Ｒｏｕｎｄ２）。反応後、結合ファージを溶出した。同様に調製したファージ溶液を、ＦＧＦＲ３溶液と混合し、４℃で１時間反応させた（表９．Ｐａｎｎｉｎｇ Ｒｏｕｎｄ３）。反応後、結合ファージを溶出した。この操作をさらに繰り返し、Ｐａｎｎｉｎｇ Ｒｏｕｎｄ４の後に、結合ファージを溶出した。なお、ラウンドを重ねるにつれて、ＰＢＳ－Ｔによる洗浄回数を増やした（表９）。また、各ラウンドのＯｕｔｐｕｔファージの力価（タイター）を求めた。ファージの力価は、ファージと接触させた大腸菌ＴＧ１株を、３７℃一晩培養することで得られたコロニー数から求めた。その結果を表９の右端に示した。
【0158】
【表9】
【0159】
［実施例８］ＦＧＦＲ２結合ペプチド取得のためのバイオパンニング
磁気細胞分離（Ｍａｇｎｅｔｉｃ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ：ＭＡＣＳ）により、実施例６で得られた酵母表層提示ライブラリーから、ＦＧＦＲ２（ＦＧＦ受容体２）に結合する酵母クローンをスクリーニングした。まず、 酵母表層提示ペプチドライブラリーとＦＧＦＲ２－Ｆｃ融合タンパク質を混合した後、Ｆｃ部分と結合するＰｒｏｔｅｉｎＡを標識した磁気ビーズを加えた。その後、 磁気スタンドに備え付けたＬＳカラムにチャージした。ＦＧＦＲ２に結合していない酵母細胞を除くために、７ｍＬのＰＢＳＭを２回にわたってＬＳカラムに流した。そして、ＬＳカラムを磁気スタンドから取り外し、ＳＤＣＡＡ培地を流すことで、ＦＧＦＲ２結合性酵母クローンを回収し、培養した。上記の操作を１ラウンドとし、合計３ラウンド実施した（表１０）。次にＭＡＣＳで回収した酵母からＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）を用いて、結合活性の高い酵母クローンをスクリーニングした。酵母ライブラリーにＦＧＦＲ２－Ｆｃとマウス抗FLAG抗体を結合させ、その後、抗マウスＩｇＧ－Ａｌｅｘａ４８８と抗ヒトＦｃ抗体－Ａｌｅｘａ６４７を結合させた。ＨＬＨペプチドのＣ末端にはＦＬＡＧタグが発現しているので、Ａｌｅｘａ４８８の蛍光強度よりペプチドの提示量を検出できる。また、Ａｌｅｘａ６４７の蛍光強度よりＦＧＦＲ２への結合を検出できる。そこで、Ａｌｅｘａ４８８とＡｌｅｘａ６４７の蛍光強度の高い酵母クローンをＦＡＣＳ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩＩ）で回収した。
磁気細胞分離（Ｍａｇｎｅｔｉｃ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ：ＭＡＣＳ）により、実施例６で得られた酵母表層提示ライブラリーから、ＦＧＦＲ２（ＦＧＦ受容体２）に結合する酵母クローンをスクリーニングした。まず、 酵母表層提示ペプチドライブラリーとＦＧＦＲ２－Ｆｃ融合タンパク質を混合した後、Ｆｃ部分と結合するＰｒｏｔｅｉｎＡを標識した磁気ビーズを加えた。その後、 磁気スタンドに備え付けたＬＳカラムにチャージした。ＦＧＦＲ２に結合していない酵母細胞を除くために、７ｍＬのＰＢＳＭを２回にわたってＬＳカラムに流した。そして、ＬＳカラムを磁気スタンドから取り外し、ＳＤＣＡＡ培地を流すことで、ＦＧＦＲ２結合性酵母クローンを回収し、培養した。上記の操作を１ラウンドとし、合計３ラウンド実施した（表１０）。次にＭＡＣＳで回収した酵母からＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）を用いて、結合活性の高い酵母クローンをスクリーニングした。酵母ライブラリーにＦＧＦＲ２－Ｆｃとマウス抗FLAG抗体を結合させ、その後、抗マウスＩｇＧ－Ａｌｅｘａ４８８と抗ヒトＦｃ抗体－Ａｌｅｘａ６４７を結合させた。ＨＬＨペプチドのＣ末端にはＦＬＡＧタグが発現しているので、Ａｌｅｘａ４８８の蛍光強度よりペプチドの提示量を検出できる。また、Ａｌｅｘａ６４７の蛍光強度よりＦＧＦＲ２への結合を検出できる。そこで、Ａｌｅｘａ４８８とＡｌｅｘａ６４７の蛍光強度の高い酵母クローンをＦＡＣＳ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩＩ）で回収した。
【0160】
【表10】
【0161】
［実施例９］アミノ酸配列の決定
実施例７のパンニング後に溶出したファージライブラリ（表９、Ｏｕｔｐｕｔ ｐｈａｇｅ（Ｒｏｕｎｄ４））をＨｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃを固定化したプレートに作用し、結合しないファージを回収することでネガティブセレクションを実施した。その後、ファージライブラリを１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭの各濃度に調製したＦＧＦＲ３に作用した（図３）。そして結合ファージを回収した。回収したファージのゲノムDNAを抽出し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＭｉｓｅｑ用プロトコルに従ってサンプル調製し、ファージゲノムＤＮＡの網羅的解析を実施した。得られた配列のうち、配列出現割合が高い配列を２０種類選別した（表１１）。実施例８のスクリーニングで獲得した酵母細胞をＳＤＣＡＡ寒天プレートに播種し、培養した。寒天プレート上に形成したシングルコロニーを無作為に１４つ選択し、それぞれのクローンについてサンガー法を用いて酵母発現プラスミドに組み込まれているペプチドのＤＮＡ配列を解析した（表１２）。
実施例７のパンニング後に溶出したファージライブラリ（表９、Ｏｕｔｐｕｔ ｐｈａｇｅ（Ｒｏｕｎｄ４））をＨｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃを固定化したプレートに作用し、結合しないファージを回収することでネガティブセレクションを実施した。その後、ファージライブラリを１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭの各濃度に調製したＦＧＦＲ３に作用した（図３）。そして結合ファージを回収した。回収したファージのゲノムDNAを抽出し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＭｉｓｅｑ用プロトコルに従ってサンプル調製し、ファージゲノムＤＮＡの網羅的解析を実施した。得られた配列のうち、配列出現割合が高い配列を２０種類選別した（表１１）。実施例８のスクリーニングで獲得した酵母細胞をＳＤＣＡＡ寒天プレートに播種し、培養した。寒天プレート上に形成したシングルコロニーを無作為に１４つ選択し、それぞれのクローンについてサンガー法を用いて酵母発現プラスミドに組み込まれているペプチドのＤＮＡ配列を解析した（表１２）。
【0162】
【表11】
【0163】
【表12】
【0164】
［実施例１０］ペプチドの合成とＦＧＦ受容体への結合確認
実施例８で得られたクローンのアミノ酸配列から１種を選定し、ペプチド（Ｆ３－１００ｎＸ）をＦｍｏｃ固相合成法に基づき合成した。ＳＰＲ装置Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＢＩＡＣＯＲＥ社）の操作マニュアルに従い、装置のセンサーチップＣＭ５に、 アミンカップリング法を用いてＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３をリガンドとして固定化した。リファレンスとしてエタノールアミンを固定化し、ペプチドをアナライトとして測定を行った。測定は全て２５℃で行い、ランニングバッファーにはＴＢＳを使用した。ランニングバッファーに溶解したペプチドを、各種ＦＧＦＲを固定化したセンサーチップＣＭ５へインジェクト（流速３０μＬ/ｍｉｎ、２分間）した後、ランニングバッファーを3分間流して、ペプチドを解離させた。解離定数はＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＩＡＣＯＲＥ社）を用いたカイネティクス解析により算出した。得られたセンサーグラムに直接反応式をカーブフィッティングさせ、非線形最小二乗法により速度定数を算出した。解析には１：１ ｂｉｎｄｉｎｇモデルを使用した。結果を図１１に示した。
実施例８で得られたクローンのアミノ酸配列から１種を選定し、ペプチド（Ｆ３－１００ｎＸ）をＦｍｏｃ固相合成法に基づき合成した。ＳＰＲ装置Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＢＩＡＣＯＲＥ社）の操作マニュアルに従い、装置のセンサーチップＣＭ５に、 アミンカップリング法を用いてＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３をリガンドとして固定化した。リファレンスとしてエタノールアミンを固定化し、ペプチドをアナライトとして測定を行った。測定は全て２５℃で行い、ランニングバッファーにはＴＢＳを使用した。ランニングバッファーに溶解したペプチドを、各種ＦＧＦＲを固定化したセンサーチップＣＭ５へインジェクト（流速３０μＬ/ｍｉｎ、２分間）した後、ランニングバッファーを3分間流して、ペプチドを解離させた。解離定数はＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＩＡＣＯＲＥ社）を用いたカイネティクス解析により算出した。得られたセンサーグラムに直接反応式をカーブフィッティングさせ、非線形最小二乗法により速度定数を算出した。解析には１：１ ｂｉｎｄｉｎｇモデルを使用した。結果を図１１に示した。
【0165】
［実施例１１］ＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ３に結合するペプチド（１００ｎＸ）
１００ｎＸは、実施例１と同様のペプチドを調製して実験に使用した（表６）。
１００ｎＸは、実施例１と同様のペプチドを調製して実験に使用した（表６）。
【0166】
［実施例１２］ｉＰＳ細胞から心筋への分化誘導（ＨＢＤ－１００ｎＸ、ＨＢＤ－ＹＸ、ＨＢＤ－Ｆ３－１００ｎＸの評価）
ヘパラン硫酸結合ペプチドＷＱＰＰＲＡＲＩＧ（配列番号４９）を１００ｎＸ、ＹＸ、Ｆ３－１００ｎＸに融合したペプチド（ＨＢＤ－１００ｎＸ、ＨＢＤ－ＹＸ、ＨＢＤ－Ｆ３－１００ｎＸ）を合成し、ｉＰＳ細胞から心筋細胞への分化誘導系に適用することを試みた。ｉＰＳ細胞は、「ｉＰＳ ｃｅｌｌ－ＫＡＣ、ｈＦＢ（Ｎ）」（ＫＡＣ社、製品番号；ＩＰＳ－Ｆ００１）（以下、ｉＰＳ－ｈＦＢ）を使用した。まず、分化誘導開始時（ｄａｙ０）において、分化誘導の７日前（ｄａｙ－７）に１００φディッシュに播種したｉＰＳ－ｈＦＢを、４ｍＬのＰＢＳで洗浄した。０．５ｘＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを３ｍＬ添加し、３７℃で３分間静置した。細胞が球状になったことを確認し、０．５ｘＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを除去した。 さらに４ｍＬのＰＢＳで洗浄し、分化誘導用培地（１％ Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５０μｇ/ｍＬ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（Ｒｏｃｈｅ）、５０μｇ/ｍＬ Ａｓｃｏｒｂｉｃ Ａｃｉｄ（ｓｉｇｍａ）、３．９×１０－３％ＭＴＧ （１－Ｔｈｙｏｇｌｙｃｅｒｏｌ）（ｓｉｇｍａ）、１０μＭ Ｒｏｃｋ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｙ－２７６３２、Ｗａｋｏ）、５％ ｍａｔｒｉｇｅｌ （Ｃｏｒｎｉｎｇ）、および２ｎｇ/ｍＬ ＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ）を添加したＳＴＥＭＰＲＯ ３４（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を４ｍＬ添加した。その後、セルスクレーパーで細胞を剥離し、ピペッティングで細胞を単離した。細胞数を測定し、８０００個/ｗｅｌｌとなるように９６ｗｅｌｌ丸底プレートに播種し、３７℃・５％ＣＯ２条件下で培養した。翌日（ｄａｙ１）、１％Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１５０μｇ/ｍＬ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、５０μｇ/ｍＬ Ａｓｃｏｒｂｉｃ Ａｃｉｄ、３．９×１０－３％ＭＴＧ、１０ｎｇ/ｍＬ ＢＭＰ４、５ｎｇ/ｍＬ ｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ）および６ｎｇ/ｍＬ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ（Ｒ＆Ｄ）を添加したＳＴＥＭＰＲＯ ３４を１００μｌ/ｗｅｌｌで添加した（従来プロトコル；図１２、プロトコル１）。一方、ペプチドサンプル作用群では、１％Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１５０μｇ/ｍＬ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、５０μｇ/ｍＬ Ａｓｃｏｒｂｉｃ Ａｃｉｄ、３．９×１０－３％ＭＴＧ、１０ｎｇ/ｍＬ ＢＭＰ４、０．０００５、０．００５、０．０５、０．５μＭ ＨＢＤ－１００ｎＸ、ＨＢＤ－ＹＸ、ＨＢＤ－Ｆ３－１００ｎ９（配列番号２７）および６ｎｇ/ｍＬ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ（Ｒ＆Ｄ）を添加したＳＴＥＭＰＲＯ ３４を１００μＬ/ｗｅｌｌで添加した（本発明プロトコル；図１２、プロトコル２、３、４）。その後、３日間、３７℃・５％ＣＯ２条件下で培養した。続いて（ｄａｙ４）、 得られたＥＢを２００ｇで３分間遠心分離し、培地を除去した。ＰＢＳを添加し、２００ｇ、３分間遠心し上清を除去した。Ａｃｃｕｍａｘを添加し３７℃で５分静置後、 ピペティングによりシングルセルに解離し、１％Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１５０μｇ/ｍＬ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、５０μｇ/ｍＬ Ａｓｃｏｒｂｉｃ Ａｃｉｄ、３．９×１０－３％ＭＴＧ、１０ｎｇ/ｍＬ ＶＥＧＦおよび１μＭ ＩＷＰ－３を添加したＳＴＥＭＰＲＯ ３４（心筋誘導培地Ｄａｙ４）を２ｍＬ添加し、２００ｇで３分間遠心後に上清を除去した。 心筋誘導培地Ｄａｙ４で細胞を懸濁し、細胞数を測定した後、１００００個/ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌ丸底プレートに播種した。そして、３７℃・５％ＣＯ２条件下で、４日間培養した。続いて（ｄａｙ８）、９６ ｗｅｌｌプレートから２４ ｗｅｌｌプレートに細胞塊をまとめて移動し（１ｗｅｌｌあたり細胞塊８個以下）、細胞塊を自然沈降させてから培地を除去し１％ Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１５０μｇ/ｍＬ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、５０μｇ/ｍＬ Ａｓｃｏｒｂｉｃ Ａｃｉｄ、３．９×１０－３％ＭＴＧ、１０ｎｇ/ｍＬ ＶＥＧＦおよび５ｎｇ/ｍＬ ｂＦＧＦを添加したＳＴＥＭＰＲＯ ３４（心筋誘導培地Ｄａｙ８）を添加し、細胞を自然沈降させ上清を除去した。心筋誘導培地Ｄａｙ８を添加後、３７℃・５％ＣＯ２条件下で培養した。この際、２日に１度同じ条件の培地に交換した。培養後、心筋細胞に分化しているかを確認するため、Ｄａｙ２３で定量リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）により、心筋マーカーであるｃＴＮＴおよびＡｃｔｉｎｉｎの発現量を調べた（図１３）。具体的には、ｔｏｔａｌ ＲＮＡをＱＩＡＧＥＮ Ｒｎｅａｓｙ Ｋｉｔ（キアゲン）により回収し、ＲＮＡをｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（サーモサイエンティフィック）により逆転写することでｃＤＮＡを調製した。得られたｃＤＮＡから、ｃＴＮＴ、Ａｃｔｉｎｉｎを特異的に増幅するプライマーとそれぞれの遺伝子に特異的に結合するプローブを用いて、ＴａｑＭａｎＰＣＲ法によるリアルタイムＰＣＲを実施した。内部標準コントロールとしては、ＧＡＰＤＨ量を計測した。その結果、本発明のペプチド（ＨＢＤ－１００ｎＸ、ＨＢＤ－ＹＸ、ＨＢＤ－Ｆ３－１００ｎ９（配列番号２７））を使用したプロトコル２、３、４では、ｃＴＮＴおよびＡＣＴＮ２の発現量が添加ペプチドの種類によって効果を発揮する濃度に違いは認められるものの、従来のプロトコル１（Ｄａｙ１；ＡｃｔｉｖｉｎＡ、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦの３種類添加）と比較して有意に増加した。ＨＢＤ－１００ｎＸ、ＨＢＤ－ＹＸは、ペプチド濃度依存的に遺伝子発現量が増加することが示された。ＨＢＤ－Ｆ３－１００ｎ９（配列番号２７）は、原因は不明であるが、他のペプチド添加条件とは異なる傾向を示した。
ヘパラン硫酸結合ペプチドＷＱＰＰＲＡＲＩＧ（配列番号４９）を１００ｎＸ、ＹＸ、Ｆ３－１００ｎＸに融合したペプチド（ＨＢＤ－１００ｎＸ、ＨＢＤ－ＹＸ、ＨＢＤ－Ｆ３－１００ｎＸ）を合成し、ｉＰＳ細胞から心筋細胞への分化誘導系に適用することを試みた。ｉＰＳ細胞は、「ｉＰＳ ｃｅｌｌ－ＫＡＣ、ｈＦＢ（Ｎ）」（ＫＡＣ社、製品番号；ＩＰＳ－Ｆ００１）（以下、ｉＰＳ－ｈＦＢ）を使用した。まず、分化誘導開始時（ｄａｙ０）において、分化誘導の７日前（ｄａｙ－７）に１００φディッシュに播種したｉＰＳ－ｈＦＢを、４ｍＬのＰＢＳで洗浄した。０．５ｘＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを３ｍＬ添加し、３７℃で３分間静置した。細胞が球状になったことを確認し、０．５ｘＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを除去した。 さらに４ｍＬのＰＢＳで洗浄し、分化誘導用培地（１％ Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５０μｇ/ｍＬ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（Ｒｏｃｈｅ）、５０μｇ/ｍＬ Ａｓｃｏｒｂｉｃ Ａｃｉｄ（ｓｉｇｍａ）、３．９×１０－３％ＭＴＧ （１－Ｔｈｙｏｇｌｙｃｅｒｏｌ）（ｓｉｇｍａ）、１０μＭ Ｒｏｃｋ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｙ－２７６３２、Ｗａｋｏ）、５％ ｍａｔｒｉｇｅｌ （Ｃｏｒｎｉｎｇ）、および２ｎｇ/ｍＬ ＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ）を添加したＳＴＥＭＰＲＯ ３４（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を４ｍＬ添加した。その後、セルスクレーパーで細胞を剥離し、ピペッティングで細胞を単離した。細胞数を測定し、８０００個/ｗｅｌｌとなるように９６ｗｅｌｌ丸底プレートに播種し、３７℃・５％ＣＯ２条件下で培養した。翌日（ｄａｙ１）、１％Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１５０μｇ/ｍＬ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、５０μｇ/ｍＬ Ａｓｃｏｒｂｉｃ Ａｃｉｄ、３．９×１０－３％ＭＴＧ、１０ｎｇ/ｍＬ ＢＭＰ４、５ｎｇ/ｍＬ ｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ）および６ｎｇ/ｍＬ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ（Ｒ＆Ｄ）を添加したＳＴＥＭＰＲＯ ３４を１００μｌ/ｗｅｌｌで添加した（従来プロトコル；図１２、プロトコル１）。一方、ペプチドサンプル作用群では、１％Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１５０μｇ/ｍＬ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、５０μｇ/ｍＬ Ａｓｃｏｒｂｉｃ Ａｃｉｄ、３．９×１０－３％ＭＴＧ、１０ｎｇ/ｍＬ ＢＭＰ４、０．０００５、０．００５、０．０５、０．５μＭ ＨＢＤ－１００ｎＸ、ＨＢＤ－ＹＸ、ＨＢＤ－Ｆ３－１００ｎ９（配列番号２７）および６ｎｇ/ｍＬ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ（Ｒ＆Ｄ）を添加したＳＴＥＭＰＲＯ ３４を１００μＬ/ｗｅｌｌで添加した（本発明プロトコル；図１２、プロトコル２、３、４）。その後、３日間、３７℃・５％ＣＯ２条件下で培養した。続いて（ｄａｙ４）、 得られたＥＢを２００ｇで３分間遠心分離し、培地を除去した。ＰＢＳを添加し、２００ｇ、３分間遠心し上清を除去した。Ａｃｃｕｍａｘを添加し３７℃で５分静置後、 ピペティングによりシングルセルに解離し、１％Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１５０μｇ/ｍＬ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、５０μｇ/ｍＬ Ａｓｃｏｒｂｉｃ Ａｃｉｄ、３．９×１０－３％ＭＴＧ、１０ｎｇ/ｍＬ ＶＥＧＦおよび１μＭ ＩＷＰ－３を添加したＳＴＥＭＰＲＯ ３４（心筋誘導培地Ｄａｙ４）を２ｍＬ添加し、２００ｇで３分間遠心後に上清を除去した。 心筋誘導培地Ｄａｙ４で細胞を懸濁し、細胞数を測定した後、１００００個/ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌ丸底プレートに播種した。そして、３７℃・５％ＣＯ２条件下で、４日間培養した。続いて（ｄａｙ８）、９６ ｗｅｌｌプレートから２４ ｗｅｌｌプレートに細胞塊をまとめて移動し（１ｗｅｌｌあたり細胞塊８個以下）、細胞塊を自然沈降させてから培地を除去し１％ Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１５０μｇ/ｍＬ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、５０μｇ/ｍＬ Ａｓｃｏｒｂｉｃ Ａｃｉｄ、３．９×１０－３％ＭＴＧ、１０ｎｇ/ｍＬ ＶＥＧＦおよび５ｎｇ/ｍＬ ｂＦＧＦを添加したＳＴＥＭＰＲＯ ３４（心筋誘導培地Ｄａｙ８）を添加し、細胞を自然沈降させ上清を除去した。心筋誘導培地Ｄａｙ８を添加後、３７℃・５％ＣＯ２条件下で培養した。この際、２日に１度同じ条件の培地に交換した。培養後、心筋細胞に分化しているかを確認するため、Ｄａｙ２３で定量リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）により、心筋マーカーであるｃＴＮＴおよびＡｃｔｉｎｉｎの発現量を調べた（図１３）。具体的には、ｔｏｔａｌ ＲＮＡをＱＩＡＧＥＮ Ｒｎｅａｓｙ Ｋｉｔ（キアゲン）により回収し、ＲＮＡをｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（サーモサイエンティフィック）により逆転写することでｃＤＮＡを調製した。得られたｃＤＮＡから、ｃＴＮＴ、Ａｃｔｉｎｉｎを特異的に増幅するプライマーとそれぞれの遺伝子に特異的に結合するプローブを用いて、ＴａｑＭａｎＰＣＲ法によるリアルタイムＰＣＲを実施した。内部標準コントロールとしては、ＧＡＰＤＨ量を計測した。その結果、本発明のペプチド（ＨＢＤ－１００ｎＸ、ＨＢＤ－ＹＸ、ＨＢＤ－Ｆ３－１００ｎ９（配列番号２７））を使用したプロトコル２、３、４では、ｃＴＮＴおよびＡＣＴＮ２の発現量が添加ペプチドの種類によって効果を発揮する濃度に違いは認められるものの、従来のプロトコル１（Ｄａｙ１；ＡｃｔｉｖｉｎＡ、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦの３種類添加）と比較して有意に増加した。ＨＢＤ－１００ｎＸ、ＨＢＤ－ＹＸは、ペプチド濃度依存的に遺伝子発現量が増加することが示された。ＨＢＤ－Ｆ３－１００ｎ９（配列番号２７）は、原因は不明であるが、他のペプチド添加条件とは異なる傾向を示した。
【0167】
［実施例１３］ｉＰＳ細胞から肝細胞への分化誘導（１００ｎＸの評価）
ｉＰＳ細胞から肝細胞への分化誘導系に１００ｎＸを適用することを試みた。ｉＰＳ細胞は、「ｉＰＳ ｃｅｌｌ－ＫＡＣ、ｈＦＢ（Ｎ）」（ＫＡＣ社、製品番号；ＩＰＳ－Ｆ００１）（以下、ｉＰＳ－ｈＦＢ）を使用した。分化誘導の７日前（ｄａｙ－７）に１００φディッシュに播種したｉＰＳ－ｈＦＢを、４ｍＬのＰＢＳで洗浄した。０．５ｘＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを３ｍＬ添加し、３７℃で３分間静置した。細胞が球状になったことを確認し、０．５ｘＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを除去した。 さらに４ｍＬのＰＢＳで洗浄し、４ｍＬのＳｔｅｍＦｉｔを添加後、セルスクレーパーで剥離しピペッティングで細胞をシングルセルに単離した。その後、１．５×１０５ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌで６ｗｅｌｌプレートに播種した。分化誘導開始日（Ｄａｙ０）に、培地を除去し、分化誘導用培地（Ｂ－２７ Ｐｌｕｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）、１００ ｎｇ/ｍＬ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ（Ｒ＆Ｄ）を添加したＲＰＭＩ１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ））を２ｍＬ/ｗｅｌｌで添加した。同様の培地を使用してＤａｙ３に培地を交換した。Ｄａｙ５で培地を除去し、Ｂ－２７ Ｐｌｕｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）、２０ｎｇ/ｍＬ ＢＭＰ４、２０ｎｇ/ｍＬ ｂＦＧＦを添加したＲＰＭＩ１６４０を２ ｍＬ/ｗｅｌｌで添加した（従来プロトコル；図１４、プロトコル１）。一方、ペプチドサンプル作用群では、Ｂ－２７ Ｐｌｕｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）、２０ｎｇ/ｍＬ ＢＭＰ４、０．１ｎＭ ＨＢＤ－１００ｎＸもしくは１００ｎＸ－ｍｏｎｏｍｅｒを添加したＲＰＭＩ１６４０を２ｍＬ/ｗｅｌｌで添加した（従来プロトコル；図１４、プロトコル３、４）。さらに、対照群として、Ｂ－２７ Ｐｌｕｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）、２０ｎｇ/ｍＬ ＢＭＰ４を添加したＲＰＭＩ１６４０を２ ｍＬ/ｗｅｌｌで添加した（従来プロトコル；図１４、プロトコル２）。同様の培地を使用してＤａｙ８に培地を交換した。全ての条件においてＤａｙ１０で培地を除去し、Ｂ－２７ Ｐｌｕｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）、２０ ｎｇ/ｍＬ ＨＧＦを添加したＲＰＭＩ１６４０を２ ｍＬ/ｗｅｌｌで添加した。同様の培地を使用してＤａｙ１２およびＤａｙ１４に培地を交換した。Ｄａｙ１５にＨＣＭ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（Ｌｏｎｚａ）（ＨＢＭ、Ａｓｃｏｒｂｉｃ Ａｃｉｄ、ＢＳＡ－ＦＡＦ、 Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ、Ｔｒａｎｓｆｅｒｉｎ、ＧＡ－１０００、Ｉｎｓｕｌｉｎを含有）を用いて、２ｍＬ/ｗｅｌｌで培地交換した。Ｄａｙ１７およびＤａｙ１８に同様の培地で培地交換した。培養後、肝細胞に分化しているかを確認するため、Ｄａｙ２０で定量リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）により、肝マーカーであるＡｌｂｕｍｉｎ（ＡＬＢ）、ＣＹＰ３Ａ４および胆管マーカーであるＩＴＧＢ４の発現量を調べた（図１５）。具体的には、ｔｏｔａｌ ＲＮＡをＱＩＡＧＥＮ Ｒｎｅａｓｙ Ｋｉｔ（キアゲン）により回収し、ＲＮＡをｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（サーモサイエンティフィック）により逆転写することでｃＤＮＡを調製した。得られたｃＤＮＡから、ＡＬＢ、ＣＹＰ３Ａ４、ＩＴＧＢ４を特異的に増幅するプライマーとそれぞれの遺伝子に特異的に結合するプローブを用いて、ＴａｑＭａｎＰＣＲ法によるリアルタイムＰＣＲを実施した。内部標準コントロールとしては、ＧＡＰＤＨ量を計測した。その結果、本発明のペプチド（１００ｎＸ－ｍｏｎｏｍｅｒ）を使用したプロトコル４では、ＡＬＢの発現量が従来のプロトコル１（Ｄａｙ５；ＢＭＰ４、ｂＦＧＦの2種類添加）、および対照のプロトコル２（Ｄａｙ５；ＢＭＰ４添加）と比較して有意に増加した。また、ＣＹＰ３Ａ４およびＩＴＧＢ４の遺伝子発現量が対照のプロトコル２（Ｄａｙ５；ＢＭＰ４添加）と比較して有意に増加し、従来のプロトコル１（Ｄａｙ５；ＢＭＰ４、ｂＦＧＦの２種類添加）と同程度であった。以上から、１００ｎＸ－ｍｏｎｏｍｅｒは従来のｂＦＧＦと同等以上に肝分化を促進することが示された。
ｉＰＳ細胞から肝細胞への分化誘導系に１００ｎＸを適用することを試みた。ｉＰＳ細胞は、「ｉＰＳ ｃｅｌｌ－ＫＡＣ、ｈＦＢ（Ｎ）」（ＫＡＣ社、製品番号；ＩＰＳ－Ｆ００１）（以下、ｉＰＳ－ｈＦＢ）を使用した。分化誘導の７日前（ｄａｙ－７）に１００φディッシュに播種したｉＰＳ－ｈＦＢを、４ｍＬのＰＢＳで洗浄した。０．５ｘＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを３ｍＬ添加し、３７℃で３分間静置した。細胞が球状になったことを確認し、０．５ｘＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを除去した。 さらに４ｍＬのＰＢＳで洗浄し、４ｍＬのＳｔｅｍＦｉｔを添加後、セルスクレーパーで剥離しピペッティングで細胞をシングルセルに単離した。その後、１．５×１０５ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌで６ｗｅｌｌプレートに播種した。分化誘導開始日（Ｄａｙ０）に、培地を除去し、分化誘導用培地（Ｂ－２７ Ｐｌｕｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）、１００ ｎｇ/ｍＬ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ（Ｒ＆Ｄ）を添加したＲＰＭＩ１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ））を２ｍＬ/ｗｅｌｌで添加した。同様の培地を使用してＤａｙ３に培地を交換した。Ｄａｙ５で培地を除去し、Ｂ－２７ Ｐｌｕｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）、２０ｎｇ/ｍＬ ＢＭＰ４、２０ｎｇ/ｍＬ ｂＦＧＦを添加したＲＰＭＩ１６４０を２ ｍＬ/ｗｅｌｌで添加した（従来プロトコル；図１４、プロトコル１）。一方、ペプチドサンプル作用群では、Ｂ－２７ Ｐｌｕｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）、２０ｎｇ/ｍＬ ＢＭＰ４、０．１ｎＭ ＨＢＤ－１００ｎＸもしくは１００ｎＸ－ｍｏｎｏｍｅｒを添加したＲＰＭＩ１６４０を２ｍＬ/ｗｅｌｌで添加した（従来プロトコル；図１４、プロトコル３、４）。さらに、対照群として、Ｂ－２７ Ｐｌｕｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）、２０ｎｇ/ｍＬ ＢＭＰ４を添加したＲＰＭＩ１６４０を２ ｍＬ/ｗｅｌｌで添加した（従来プロトコル；図１４、プロトコル２）。同様の培地を使用してＤａｙ８に培地を交換した。全ての条件においてＤａｙ１０で培地を除去し、Ｂ－２７ Ｐｌｕｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）、２０ ｎｇ/ｍＬ ＨＧＦを添加したＲＰＭＩ１６４０を２ ｍＬ/ｗｅｌｌで添加した。同様の培地を使用してＤａｙ１２およびＤａｙ１４に培地を交換した。Ｄａｙ１５にＨＣＭ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（Ｌｏｎｚａ）（ＨＢＭ、Ａｓｃｏｒｂｉｃ Ａｃｉｄ、ＢＳＡ－ＦＡＦ、 Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ、Ｔｒａｎｓｆｅｒｉｎ、ＧＡ－１０００、Ｉｎｓｕｌｉｎを含有）を用いて、２ｍＬ/ｗｅｌｌで培地交換した。Ｄａｙ１７およびＤａｙ１８に同様の培地で培地交換した。培養後、肝細胞に分化しているかを確認するため、Ｄａｙ２０で定量リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）により、肝マーカーであるＡｌｂｕｍｉｎ（ＡＬＢ）、ＣＹＰ３Ａ４および胆管マーカーであるＩＴＧＢ４の発現量を調べた（図１５）。具体的には、ｔｏｔａｌ ＲＮＡをＱＩＡＧＥＮ Ｒｎｅａｓｙ Ｋｉｔ（キアゲン）により回収し、ＲＮＡをｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（サーモサイエンティフィック）により逆転写することでｃＤＮＡを調製した。得られたｃＤＮＡから、ＡＬＢ、ＣＹＰ３Ａ４、ＩＴＧＢ４を特異的に増幅するプライマーとそれぞれの遺伝子に特異的に結合するプローブを用いて、ＴａｑＭａｎＰＣＲ法によるリアルタイムＰＣＲを実施した。内部標準コントロールとしては、ＧＡＰＤＨ量を計測した。その結果、本発明のペプチド（１００ｎＸ－ｍｏｎｏｍｅｒ）を使用したプロトコル４では、ＡＬＢの発現量が従来のプロトコル１（Ｄａｙ５；ＢＭＰ４、ｂＦＧＦの2種類添加）、および対照のプロトコル２（Ｄａｙ５；ＢＭＰ４添加）と比較して有意に増加した。また、ＣＹＰ３Ａ４およびＩＴＧＢ４の遺伝子発現量が対照のプロトコル２（Ｄａｙ５；ＢＭＰ４添加）と比較して有意に増加し、従来のプロトコル１（Ｄａｙ５；ＢＭＰ４、ｂＦＧＦの２種類添加）と同程度であった。以上から、１００ｎＸ－ｍｏｎｏｍｅｒは従来のｂＦＧＦと同等以上に肝分化を促進することが示された。
【0168】
［実施例１４］１００ｎＸを使用して分化誘導した肝細胞の機能評価
実施例１３と同様の手法でｉＰＳ細胞を分化誘導し、Ｄａｙ２０においてＰＢＳで細胞を洗浄後、３μＭルシフェリン－ＩＰＡを含んだＨＣＭ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（Ｌｏｎｚａ）を用いて１ｍＬ/ｗｅｌｌで培地交換した。３７℃で１時間反応後、上清１００μＬを９６ｗｅｌｌホワイトプレートに移した後、Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを１００μＬ/ｗｅｌｌで添加した。室温で２０分間反応し、発光値を測定した。また、細胞を破砕し、ＴａＫａＲａ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いてタンパク質を定量し、発光値を補正した。その結果、ＣＹＰ３Ａ４活性は対照のプロトコル２（Ｄａｙ５；ＢＭＰ４添加）と比較して有意に増加し、従来のプロトコル１（Ｄａｙ５；ＢＭＰ４、ｂＦＧＦの２種類添加）と同程度の活性を示した。以上から、１００ｎＸ－ｍｏｎｏｍｅｒはｂＦＧＦと同程度のレベルで肝機能に寄与することが示された（図１６）。
実施例１３と同様の手法でｉＰＳ細胞を分化誘導し、Ｄａｙ２０においてＰＢＳで細胞を洗浄後、３μＭルシフェリン－ＩＰＡを含んだＨＣＭ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（Ｌｏｎｚａ）を用いて１ｍＬ/ｗｅｌｌで培地交換した。３７℃で１時間反応後、上清１００μＬを９６ｗｅｌｌホワイトプレートに移した後、Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを１００μＬ/ｗｅｌｌで添加した。室温で２０分間反応し、発光値を測定した。また、細胞を破砕し、ＴａＫａＲａ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いてタンパク質を定量し、発光値を補正した。その結果、ＣＹＰ３Ａ４活性は対照のプロトコル２（Ｄａｙ５；ＢＭＰ４添加）と比較して有意に増加し、従来のプロトコル１（Ｄａｙ５；ＢＭＰ４、ｂＦＧＦの２種類添加）と同程度の活性を示した。以上から、１００ｎＸ－ｍｏｎｏｍｅｒはｂＦＧＦと同程度のレベルで肝機能に寄与することが示された（図１６）。
【0169】
［実施例１５］ｉＰＳ細胞から神経細胞への分化誘導（１００ｎＸの評価）
ｉＰＳ細胞から神経細胞への分化誘導系に１００ｎＸを適用することを試みた。ｉＰＳ細胞は、「ｉＰＳ ｃｅｌｌ－ＫＡＣ、ｈＦＢ（Ｎ）」（ＫＡＣ社、製品番号；ＩＰＳ－Ｆ００１）（以下、ｉＰＳ－ｈＦＢ）を使用した。まず、分化誘導開始時（ｄａｙ０）において、分化誘導の７日前（ｄａｙ－７）に１００φディッシュに播種したｉＰＳ－ｈＦＢを、４ｍＬのＰＢＳで洗浄した。０．５ｘＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを３ｍＬ添加し、３７℃で３分間静置した。細胞が球状になったことを確認し、０．５ｘＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを除去した。 さらに４ｍＬのＰＢＳで洗浄し、分化誘導用培地（２０％ ＫＳＲ（Ｔｈｅｒｍｏ）、１ｘＮＥＡＡ（Ｔｈｅｒｍｏ）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（和光純薬）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｔｈｅｒｍｏ）、２０μＭ Ｙ２７６３２（和光純薬）、３μＭ ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ（和光純薬）、５μＭ ＳＢ４３１５４２（和光純薬）を添加したＧ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ）を４ｍＬ添加した。その後、セルスクレーパーで細胞を剥離し、ピペッティングで細胞を単離した。細胞数を測定し、９０００個/ｗｅｌｌとなるように９６ｗｅｌｌ丸底プレートに播種し、３７℃・５％ＣＯ２条件下で培養した。Ｄａｙ３において、２０％ ＫＳＲ（Ｔｈｅｒｍｏ）、１ｘＮＥＡＡ（Ｔｈｅｒｍｏ）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール(和光純薬)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｔｈｅｒｍｏ）、２０μＭ Ｙ２７６３２（和光純薬）、３μＭ ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ（和光純薬）、５μＭ ＳＢ４３１５４２（和光純薬）、０．３ｎＭ ｂＦＧＦを含むＧ－ＭＥＭを１００μｌ/ｗｅｌｌで添加した（従来プロトコル；図１７、プロトコル１）。 一方、ペプチドサンプル作用群では、２０％ ＫＳＲ（Ｔｈｅｒｍｏ）、１ｘＮＥＡＡ（Ｔｈｅｒｍｏ）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール(和光純薬)、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム（Ｔｈｅｒｍｏ）、２０μＭ Ｙ２７６３２（和光純薬）、３μＭ ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ（和光純薬）、５μＭ ＳＢ４３１５４２（和光純薬）、０．２５ｎＭ ＨＢＤ－１００ｎＸもしくは１００ｎＸ－ｍｏｎｏｍｅｒを含むＧ－ＭＥＭを１００ μＬ/ｗｅｌｌで添加した（図１４、プロトコル３、４）。対照群として、２０％ ＫＳＲ（Ｔｈｅｒｍｏ）、１ｘＮＥＡＡ（Ｔｈｅｒｍｏ）、０．１ ｍＭ ２－メルカプトエタノール（和光純薬）、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム（Ｔｈｅｒｍｏ）、２０μＭ Ｙ２７６３２（和光純薬）、３μＭ ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ（和光純薬）、５μＭ ＳＢ４３１５４２（和光純薬）を含むＧ－ＭＥＭを１００ μＬ/ｗｅｌｌで添加した群を用意した（（図１４、プロトコル２）。Ｄａｙ６において、Ｙ２７６３２（和光純薬）を除いた各条件の培地に１００μｌ/ｗｅｌｌで全量交換した。同様に、Ｄａｙ１０およびＤａｙ１４で培地交換した。Ｄａｙ１８で培地を除去し、１％ Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１％ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを含むＤＭＥＭ/Ｆ１２（ＧｌｕｔａＭａｘ）（Ｔｈｅｒｍｏ）を添加した細胞をＥＺＳＰＨＥＲＥ（ＡＧＣテクノグラス）に２ ｍＬ/ｗｅｌｌで移動した。Ｄａｙ２１、２４、２７で１％ Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを含むＤＭＥＭ/Ｆ１２（ＧｌｕｔａＭａｘ）（Ｔｈｅｒｍｏ）で培地交換した。さらに、Ｄａｙ３０およびＤａｙ３３に１％ Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１％ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを含むＤＭＥＭ/Ｆ１２（ＧｌｕｔａＭａｘ）（Ｔｈｅｒｍｏ）で培地交換した。培養後、神経細胞に分化しているかを確認するため、Ｄａｙ３５で定量リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）により、神経マーカーであるＳＹＮ１、ＭＡＰ２、Ｎｒ２ｆ１の発現量を調べた（図１８）。具体的には、ｔｏｔａｌ ＲＮＡをＱＩＡＧＥＮ Ｒｎｅａｓｙ Ｋｉｔ（キアゲン）により回収し、ＲＮＡをｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（サーモサイエンティフィック）により逆転写することでｃＤＮＡを調製した。得られたｃＤＮＡから、ＳＹＮ１、ＭＡＰ２、Ｎｒ２ｆ１を特異的に増幅するプライマーとそれぞれの遺伝子に特異的に結合するプローブを用いて、ＴａｑＭａｎＰＣＲ法によるリアルタイムＰＣＲを実施した。内部標準コントロールとしては、ＧＡＰＤＨ量を計測した。その結果、本発明のペプチド（ＨＢＤ－１００ｎＸ）を使用したプロトコル３では、Ｎｒ２ｆ１の遺伝子発現量が従来のプロトコル１（Ｄａｙ３；ｂＦＧＦ添加）、および対照のプロトコル２（Ｄａｙ３；ｂＦＧＦ非添加）と比較して有意に増加した。また、ＳＹＮ１およびＭＡＰ２の遺伝子発現量が対照のプロトコル２（Ｄａｙ３；ｂＦＧＦ非添加）と比較して有意に増加し、従来のプロトコル１（Ｄａｙ３；ｂＦＧＦ添加）と同程度であった。また、本発明のペプチド（１００ｎＸ－ｍｏｎｏｍｅｒ）を使用したプロトコル４では、いずれの遺伝子においても対照のプロトコル２（Ｄａｙ３；ｂＦＧＦ非添加）と比較して遺伝子発現量が増加する傾向を示した。なかでもＮｒ２ｆ１の遺伝子発現量は対照のプロトコル２（Ｄａｙ３；ｂＦＧＦ非添加）と比較して有意に増加し、従来のプロトコル１（Ｄａｙ３；ｂＦＧＦ添加）と同程度であった。以上から、ＨＢＤ－１００ｎＸは従来のｂＦＧＦと同等以上に神経分化を促進すること、１００ｎＸ－ｍｏｎｏｍｅｒは従来のｂＦＧＦと同程度に神経分化に寄与することが示された。
ｉＰＳ細胞から神経細胞への分化誘導系に１００ｎＸを適用することを試みた。ｉＰＳ細胞は、「ｉＰＳ ｃｅｌｌ－ＫＡＣ、ｈＦＢ（Ｎ）」（ＫＡＣ社、製品番号；ＩＰＳ－Ｆ００１）（以下、ｉＰＳ－ｈＦＢ）を使用した。まず、分化誘導開始時（ｄａｙ０）において、分化誘導の７日前（ｄａｙ－７）に１００φディッシュに播種したｉＰＳ－ｈＦＢを、４ｍＬのＰＢＳで洗浄した。０．５ｘＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを３ｍＬ添加し、３７℃で３分間静置した。細胞が球状になったことを確認し、０．５ｘＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを除去した。 さらに４ｍＬのＰＢＳで洗浄し、分化誘導用培地（２０％ ＫＳＲ（Ｔｈｅｒｍｏ）、１ｘＮＥＡＡ（Ｔｈｅｒｍｏ）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール（和光純薬）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｔｈｅｒｍｏ）、２０μＭ Ｙ２７６３２（和光純薬）、３μＭ ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ（和光純薬）、５μＭ ＳＢ４３１５４２（和光純薬）を添加したＧ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ）を４ｍＬ添加した。その後、セルスクレーパーで細胞を剥離し、ピペッティングで細胞を単離した。細胞数を測定し、９０００個/ｗｅｌｌとなるように９６ｗｅｌｌ丸底プレートに播種し、３７℃・５％ＣＯ２条件下で培養した。Ｄａｙ３において、２０％ ＫＳＲ（Ｔｈｅｒｍｏ）、１ｘＮＥＡＡ（Ｔｈｅｒｍｏ）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール(和光純薬)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｔｈｅｒｍｏ）、２０μＭ Ｙ２７６３２（和光純薬）、３μＭ ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ（和光純薬）、５μＭ ＳＢ４３１５４２（和光純薬）、０．３ｎＭ ｂＦＧＦを含むＧ－ＭＥＭを１００μｌ/ｗｅｌｌで添加した（従来プロトコル；図１７、プロトコル１）。 一方、ペプチドサンプル作用群では、２０％ ＫＳＲ（Ｔｈｅｒｍｏ）、１ｘＮＥＡＡ（Ｔｈｅｒｍｏ）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール(和光純薬)、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム（Ｔｈｅｒｍｏ）、２０μＭ Ｙ２７６３２（和光純薬）、３μＭ ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ（和光純薬）、５μＭ ＳＢ４３１５４２（和光純薬）、０．２５ｎＭ ＨＢＤ－１００ｎＸもしくは１００ｎＸ－ｍｏｎｏｍｅｒを含むＧ－ＭＥＭを１００ μＬ/ｗｅｌｌで添加した（図１４、プロトコル３、４）。対照群として、２０％ ＫＳＲ（Ｔｈｅｒｍｏ）、１ｘＮＥＡＡ（Ｔｈｅｒｍｏ）、０．１ ｍＭ ２－メルカプトエタノール（和光純薬）、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム（Ｔｈｅｒｍｏ）、２０μＭ Ｙ２７６３２（和光純薬）、３μＭ ＩＷＲ－１－ｅｎｄｏ（和光純薬）、５μＭ ＳＢ４３１５４２（和光純薬）を含むＧ－ＭＥＭを１００ μＬ/ｗｅｌｌで添加した群を用意した（（図１４、プロトコル２）。Ｄａｙ６において、Ｙ２７６３２（和光純薬）を除いた各条件の培地に１００μｌ/ｗｅｌｌで全量交換した。同様に、Ｄａｙ１０およびＤａｙ１４で培地交換した。Ｄａｙ１８で培地を除去し、１％ Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１％ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを含むＤＭＥＭ/Ｆ１２（ＧｌｕｔａＭａｘ）（Ｔｈｅｒｍｏ）を添加した細胞をＥＺＳＰＨＥＲＥ（ＡＧＣテクノグラス）に２ ｍＬ/ｗｅｌｌで移動した。Ｄａｙ２１、２４、２７で１％ Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを含むＤＭＥＭ/Ｆ１２（ＧｌｕｔａＭａｘ）（Ｔｈｅｒｍｏ）で培地交換した。さらに、Ｄａｙ３０およびＤａｙ３３に１％ Ｎ－２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１％ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを含むＤＭＥＭ/Ｆ１２（ＧｌｕｔａＭａｘ）（Ｔｈｅｒｍｏ）で培地交換した。培養後、神経細胞に分化しているかを確認するため、Ｄａｙ３５で定量リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）により、神経マーカーであるＳＹＮ１、ＭＡＰ２、Ｎｒ２ｆ１の発現量を調べた（図１８）。具体的には、ｔｏｔａｌ ＲＮＡをＱＩＡＧＥＮ Ｒｎｅａｓｙ Ｋｉｔ（キアゲン）により回収し、ＲＮＡをｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（サーモサイエンティフィック）により逆転写することでｃＤＮＡを調製した。得られたｃＤＮＡから、ＳＹＮ１、ＭＡＰ２、Ｎｒ２ｆ１を特異的に増幅するプライマーとそれぞれの遺伝子に特異的に結合するプローブを用いて、ＴａｑＭａｎＰＣＲ法によるリアルタイムＰＣＲを実施した。内部標準コントロールとしては、ＧＡＰＤＨ量を計測した。その結果、本発明のペプチド（ＨＢＤ－１００ｎＸ）を使用したプロトコル３では、Ｎｒ２ｆ１の遺伝子発現量が従来のプロトコル１（Ｄａｙ３；ｂＦＧＦ添加）、および対照のプロトコル２（Ｄａｙ３；ｂＦＧＦ非添加）と比較して有意に増加した。また、ＳＹＮ１およびＭＡＰ２の遺伝子発現量が対照のプロトコル２（Ｄａｙ３；ｂＦＧＦ非添加）と比較して有意に増加し、従来のプロトコル１（Ｄａｙ３；ｂＦＧＦ添加）と同程度であった。また、本発明のペプチド（１００ｎＸ－ｍｏｎｏｍｅｒ）を使用したプロトコル４では、いずれの遺伝子においても対照のプロトコル２（Ｄａｙ３；ｂＦＧＦ非添加）と比較して遺伝子発現量が増加する傾向を示した。なかでもＮｒ２ｆ１の遺伝子発現量は対照のプロトコル２（Ｄａｙ３；ｂＦＧＦ非添加）と比較して有意に増加し、従来のプロトコル１（Ｄａｙ３；ｂＦＧＦ添加）と同程度であった。以上から、ＨＢＤ－１００ｎＸは従来のｂＦＧＦと同等以上に神経分化を促進すること、１００ｎＸ－ｍｏｎｏｍｅｒは従来のｂＦＧＦと同程度に神経分化に寄与することが示された。
【産業上の利用可能性】
【0170】
本発明は、細胞を分化する、または細胞の分化を促進する細胞研究用材料として有用である。また、再生医療のための組織構築、薬物スクリーニング用細胞の調製などにおいても有用である。
【配列表フリーテキスト】
【0171】
配列番号１：Ｎ末端から３番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓを表す。
配列番号１：Ｎ末端から４番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＧｌｕまたはＨｉｓを表す。
配列番号１：Ｎ末端から６番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、またはＧｌｕを表す。
配列番号１：Ｎ末端から７番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＡｌａまたはＳｅｒを表す。
配列番号１：Ｎ末端から９番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、またはＬｙｓを表す。
配列番号１：Ｎ末端から１０番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、またはＴｙｒを表す。
配列番号１：Ｎ末端から１１番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＧｌｕまたはＡｓｐを表す。
配列番号１：Ｎ末端から１３番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、またはＧｌｙを表す。
配列番号１：Ｎ末端から１４番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＡｌａまたはＩｌｅを表す。
配列番号１：Ｎ末端から１６番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＭｅｔを表す。
配列番号１：Ｎ末端から１８番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、またはＧｌｕを表す。
配列番号１：Ｎ末端から１９番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、またはＡｌａを表す。
配列番号１：Ｎ末端から２０番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、またはＴｙｒを表す。
配列番号１：Ｎ末端から２１番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｐｈｅ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、またはＬｙｓを表す。
配列番号１：Ｎ末端から２２番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＩｌｅを表す。
配列番号１：Ｎ末端から２３番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、またはＳｅｒを表す。
配列番号１：Ｎ末端から２４番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、またはＡｒｇを表す。
配列番号１：Ｎ末端から２５番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＭｅｔを表す。
配列番号１：Ｎ末端から２６番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、またはＴｙｒを表す。
配列番号１：Ｎ末端から２７番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＴｒｐまたはＧｌｙを表す。
配列番号１：Ｎ末端から２８番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓを表す。
配列番号１：Ｎ末端から２９番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＡｌａまたはＬｅｕを表す。
配列番号１：Ｎ末端から３０番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、またはＡｌａを表す。
配列番号１：Ｎ末端から３１番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、またはＡｌａを表す。
配列番号１：Ｎ末端から３３番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｍｅｔ、またはＶａｌを表す。
配列番号１：Ｎ末端から３４番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、またはＩｌｅを表す。
配列番号１：Ｎ末端から３５番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、またはＧｌｎを表す。
配列番号１：Ｎ末端から３７番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、またはＡｌａを表す。
配列番号１：Ｎ末端から３８番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、またはＡｌａを表す。
配列番号１：Ｎ末端から４０番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、またはＨｉｓを表す。
配列番号１：Ｎ末端から４１番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、またはＰｈｅを表す。
配列番号１：Ｎ末端から４番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＧｌｕまたはＨｉｓを表す。
配列番号１：Ｎ末端から６番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、またはＧｌｕを表す。
配列番号１：Ｎ末端から７番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＡｌａまたはＳｅｒを表す。
配列番号１：Ｎ末端から９番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、またはＬｙｓを表す。
配列番号１：Ｎ末端から１０番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、またはＴｙｒを表す。
配列番号１：Ｎ末端から１１番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＧｌｕまたはＡｓｐを表す。
配列番号１：Ｎ末端から１３番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、またはＧｌｙを表す。
配列番号１：Ｎ末端から１４番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＡｌａまたはＩｌｅを表す。
配列番号１：Ｎ末端から１６番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＭｅｔを表す。
配列番号１：Ｎ末端から１８番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、またはＧｌｕを表す。
配列番号１：Ｎ末端から１９番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、またはＡｌａを表す。
配列番号１：Ｎ末端から２０番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、またはＴｙｒを表す。
配列番号１：Ｎ末端から２１番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｐｈｅ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、またはＬｙｓを表す。
配列番号１：Ｎ末端から２２番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＩｌｅを表す。
配列番号１：Ｎ末端から２３番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、またはＳｅｒを表す。
配列番号１：Ｎ末端から２４番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、またはＡｒｇを表す。
配列番号１：Ｎ末端から２５番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＭｅｔを表す。
配列番号１：Ｎ末端から２６番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、またはＴｙｒを表す。
配列番号１：Ｎ末端から２７番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＴｒｐまたはＧｌｙを表す。
配列番号１：Ｎ末端から２８番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓを表す。
配列番号１：Ｎ末端から２９番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＡｌａまたはＬｅｕを表す。
配列番号１：Ｎ末端から３０番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、またはＡｌａを表す。
配列番号１：Ｎ末端から３１番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、またはＡｌａを表す。
配列番号１：Ｎ末端から３３番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｍｅｔ、またはＶａｌを表す。
配列番号１：Ｎ末端から３４番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、またはＩｌｅを表す。
配列番号１：Ｎ末端から３５番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、またはＧｌｎを表す。
配列番号１：Ｎ末端から３７番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、またはＡｌａを表す。
配列番号１：Ｎ末端から３８番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、またはＡｌａを表す。
配列番号１：Ｎ末端から４０番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、またはＨｉｓを表す。
配列番号１：Ｎ末端から４１番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、またはＰｈｅを表す。
【0172】
配列番号２：Ｎ末端から１８番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、またはＧｌｕを表す。
配列番号２：Ｎ末端から１９番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、またはＡｌａを表す。
配列番号２：Ｎ末端から２０番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、またはＴｙｒを表す。
配列番号２：Ｎ末端から２１番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｐｈｅ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、またはＬｙｓを表す。
配列番号２：Ｎ末端から２２番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＩｌｅを表す。
配列番号２：Ｎ末端から２３番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、またはＩｌｅを表す。
配列番号２：Ｎ末端から２４番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、またはＡｒｇを表す。
配列番号２：Ｎ末端から２５番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＭｅｔを表す。
配列番号２：Ｎ末端から２６番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、またはＴｙｒを表す。
配列番号２：Ｎ末端から２７番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＴｒｐまたはＧｌｙを表す。
配列番号２：Ｎ末端から２８番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＧｌｎまたはＬｙｓを表す。
配列番号２：Ｎ末端から２９番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＡｌａまたはＬｅｕを表す。
配列番号２：Ｎ末端から３０番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、またはＧｌｕを表す。
配列番号２：Ｎ末端から３１番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、またはＶａｌを表す。
配列番号２：Ｎ末端から３４番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、またはＶａｌを表す。
配列番号２：Ｎ末端から３５番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＬｙｓまたはＡｒｇを表す。
配列番号２：Ｎ末端から３７番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、またはＡｒｇを表す。
配列番号２：Ｎ末端から３８番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、またはＧｌｙを表す。
配列番号２：Ｎ末端から４１番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ、またはＶａｌを表す。
配列番号２：Ｎ末端から１９番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、またはＡｌａを表す。
配列番号２：Ｎ末端から２０番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、またはＴｙｒを表す。
配列番号２：Ｎ末端から２１番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｐｈｅ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、またはＬｙｓを表す。
配列番号２：Ｎ末端から２２番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、またはＩｌｅを表す。
配列番号２：Ｎ末端から２３番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、またはＩｌｅを表す。
配列番号２：Ｎ末端から２４番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、またはＡｒｇを表す。
配列番号２：Ｎ末端から２５番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＭｅｔを表す。
配列番号２：Ｎ末端から２６番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、またはＴｙｒを表す。
配列番号２：Ｎ末端から２７番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＴｒｐまたはＧｌｙを表す。
配列番号２：Ｎ末端から２８番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＧｌｎまたはＬｙｓを表す。
配列番号２：Ｎ末端から２９番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＡｌａまたはＬｅｕを表す。
配列番号２：Ｎ末端から３０番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、またはＧｌｕを表す。
配列番号２：Ｎ末端から３１番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、またはＶａｌを表す。
配列番号２：Ｎ末端から３４番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、またはＶａｌを表す。
配列番号２：Ｎ末端から３５番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＬｙｓまたはＡｒｇを表す。
配列番号２：Ｎ末端から３７番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、またはＡｒｇを表す。
配列番号２：Ｎ末端から３８番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、またはＧｌｙを表す。
配列番号２：Ｎ末端から４１番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ、またはＶａｌを表す。
【0173】
配列番号３：Ｎ末端から３番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓを表す。
配列番号３：Ｎ末端から４番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＧｌｕまたはＨｉｓを表す。
配列番号３：Ｎ末端から６番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、またはＧｌｕを表す。
配列番号３：Ｎ末端から７番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＡｌａまたはＳｅｒを表す。
配列番号３：Ｎ末端から９番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、またはＬｙｓを表す。
配列番号３：Ｎ末端から１０番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、またはＴｙｒを表す。
配列番号３：Ｎ末端から１１番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＧｌｕまたはＡｓｐを表す。
配列番号３：Ｎ末端から１３番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、またはＧｌｙを表す。
配列番号３：Ｎ末端から１４番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＡｌａまたはＩｌｅを表す。
配列番号３：Ｎ末端から１６番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＭｅｔを表す。
配列番号３：Ｎ末端から１８番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＧｌｙまたはＰｒｏを表す。
配列番号３：Ｎ末端から１９番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、またはＳｅｒを表す。
配列番号３：Ｎ末端から２０番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＧｌｙまたはＡｒｇを表す。
配列番号３：Ｎ末端から２１番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、またはＰｒｏを表す。
配列番号３：Ｎ末端から２２番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＧｌｙまたはＨｉｓを表す。
配列番号３：Ｎ末端から２３番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、またはＳｅｒを表す。
配列番号３：Ｎ末端から２４番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＰｒｏまたはＡｒｇを表す。
配列番号３：Ｎ末端から２５番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＡｒｇまたはＰｒｏを表す。
配列番号３：Ｎ末端から２６番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＬｅｕまたはＡｒｇを表す。
配列番号３：Ｎ末端から２７番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｇｌｙを表す。
配列番号３：Ｎ末端から２８番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓを表す。
配列番号３：Ｎ末端から３０番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、またはＡｌａを表す。
配列番号３：Ｎ末端から３１番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、またはＡｌａを表す。
配列番号３：Ｎ末端から３３番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｍｅｔ、またはＶａｌを表す。
配列番号３：Ｎ末端から３４番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、またはＩｌｅを表す。
配列番号３：Ｎ末端から３５番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＬｙｓまたはＧｌｎを表す。
配列番号３：Ｎ末端から３７番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、またはＡｌａを表す。
配列番号３：Ｎ末端から３８番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、またはＡｌａを表す。
配列番号３：Ｎ末端から４０番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、またはＨｉｓを表す。
配列番号３：Ｎ末端から４１番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、またはＰｈｅを表す。
配列番号３：Ｎ末端から４番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＧｌｕまたはＨｉｓを表す。
配列番号３：Ｎ末端から６番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、またはＧｌｕを表す。
配列番号３：Ｎ末端から７番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＡｌａまたはＳｅｒを表す。
配列番号３：Ｎ末端から９番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、またはＬｙｓを表す。
配列番号３：Ｎ末端から１０番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、またはＴｙｒを表す。
配列番号３：Ｎ末端から１１番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＧｌｕまたはＡｓｐを表す。
配列番号３：Ｎ末端から１３番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、またはＧｌｙを表す。
配列番号３：Ｎ末端から１４番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＡｌａまたはＩｌｅを表す。
配列番号３：Ｎ末端から１６番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＭｅｔを表す。
配列番号３：Ｎ末端から１８番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＧｌｙまたはＰｒｏを表す。
配列番号３：Ｎ末端から１９番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、またはＳｅｒを表す。
配列番号３：Ｎ末端から２０番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＧｌｙまたはＡｒｇを表す。
配列番号３：Ｎ末端から２１番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、またはＰｒｏを表す。
配列番号３：Ｎ末端から２２番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＧｌｙまたはＨｉｓを表す。
配列番号３：Ｎ末端から２３番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、またはＳｅｒを表す。
配列番号３：Ｎ末端から２４番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＰｒｏまたはＡｒｇを表す。
配列番号３：Ｎ末端から２５番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＡｒｇまたはＰｒｏを表す。
配列番号３：Ｎ末端から２６番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＬｅｕまたはＡｒｇを表す。
配列番号３：Ｎ末端から２７番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｇｌｙを表す。
配列番号３：Ｎ末端から２８番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓを表す。
配列番号３：Ｎ末端から３０番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、またはＡｌａを表す。
配列番号３：Ｎ末端から３１番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、またはＡｌａを表す。
配列番号３：Ｎ末端から３３番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｍｅｔ、またはＶａｌを表す。
配列番号３：Ｎ末端から３４番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、またはＩｌｅを表す。
配列番号３：Ｎ末端から３５番目のアミノ酸残基であるＸａａは、ＬｙｓまたはＧｌｎを表す。
配列番号３：Ｎ末端から３７番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、またはＡｌａを表す。
配列番号３：Ｎ末端から３８番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、またはＡｌａを表す。
配列番号３：Ｎ末端から４０番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、またはＨｉｓを表す。
配列番号３：Ｎ末端から４１番目のアミノ酸残基であるＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、またはＰｈｅを表す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】