特許7540650IP Force 特許公報全文掲載

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一般に重症複合免疫不全症のスクリーニング検査法

発明が解決しようとする課題[発明の詳細な説明]から抜粋

のように、新生児スクリーニング検査に際して行われるダイレクト法では、乾燥血液ろ紙ディスクを反応系に入れたまま定量PCRが行われるため、血液に由来するヘモグロビン中のヘム分子などのPCR反応阻害成分の影響で、TRECsが存在するにもかかわらず適切なPCR反応が起こらないことが一定頻度で発生し、そのため、リテスト率が高くなるという問題があった。スクリーニングシステムを運用するにあたり、リテスト率が高いと、結果報告の遅れ、測定回数の増加によるコスト高などが大きな問題となる。

課題を解決するための手段[発明の詳細な説明]から抜粋

本発明者らは、従来のダイレクト法において、リテスト率を上げる要因となっているPCR反応阻害成分を排除すべく鋭意検討を重ねた結果、定量PCR反応前に乾燥血液ろ紙ディスクに対する特殊前処理工程を追加した改良ダイレクト法とすることでPCR反応阻害成分を除去できることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的には、特殊前処理工程として、乾燥血液ろ紙ディスク由来の血液由来成分を反応系から除くのに最・・・　続きを知財ポータルサイト IP Force にログインして見る

発明の効果[発明の詳細な説明]から抜粋

本発明によれば、ダイレクト法において定量PCR反応前に乾燥血液ろ紙ディスクに対する特殊前処理工程を追加することにより（改良ダイレクト法）PCR反応阻害成分を除去できることができ、その結果、従来法よりリテスト率および偽陽性率を低減することができる。

さらに、特殊前処理工程を追加した改良ダイレクト法を初回測定として実施し、その際、カットオフ未満の結果（陽性）を示した検体についてさらに抽出法での定量PCR測定を行うことで、さらにリテスト率および偽陽性率を低減することができる。

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この特許公報に記載されている図面[図面の簡単な説明]から抜粋

【図1】 図１は、本発明によるSCIDのスクリーニング方法の検査フローを示す。図１左：本発明による改良ダイレクト法。直径1.2mmの乾燥血液ろ紙1枚を切り出し、96プレートの各wellに入れる。その後特殊前処理を行い、洗浄液を取り除き、風乾した乾燥血液ろ紙が入ったwellに反応液を添加し、qPCR反応を実施する。図１右：改良ダイレクト法についで行う抽出法：直径3.2mmの乾燥血液ろ紙3枚を切り出し、これに対し市販キットを用いてカラム処理含めDNA抽出を行う。1検体当たり20μLを抽出し、この抽出液3μLを96プレートの各wellに分注し、ここに反応液を添加し、改良ダイレクト法と同設定にてqPCR反応を実施する。
【図2】 図２は、本発明によるSCIDのスクリーニング方法の検査アルゴリズムを示す。初回測定として改良ダイレクト法にてシングル測定を実施し、カットオフTRECsが20copies/μL以上であれば陰性、20copies/μL未満であれば再測定として、抽出法にてダブル測定を実施する。2データの片方でもカットオフTRECsが20copies/μL以上であれば陰性、両方ともが20copies/μL未満であれば再採血を実施する。再採血検体を用い、抽出法にてダブル測定を実施する。2データの片方でもカットオフTRECsが20copies/μL以上であれば陰性、両方ともが20copies/μL未満であれば要精密検査対象とする。
【図3】 図３は、実施例２において、PCR反応阻害物質の除去に適した特殊前処理バッファー組成および条件を検討した結果を示す。Ａ～Ｅは、それぞれ、バッファー組成候補として、水、生理食塩水、0.1%tritonX-100 in PBS、0.4M KCl in PBS、および0.4M KCl in 0.1%tritonX-100 in PBSを用いた場合の結果を示す。
【図4】 図４は、実施例４の結果を示すヒストグラムを示す。本発明の改良ダイレクト法と抽出法を組み合わせたアルゴリズムでのスクリーニング運営を行ったところ、n=16,488にて再採血が29件、率として0.18%であった。

代表図 図1本件の代表的な図

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