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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-19
(45)【発行日】2024-08-27
(54)【発明の名称】網膜疾患の遺伝子治療
(51)【国際特許分類】
A61K 31/7088 20060101AFI20240820BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20240820BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240820BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240820BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20240820BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20240820BHJP
【ＦＩ】
A61K31/7088
A61K38/16
A61K48/00
A61P27/02
C12N15/85 Z
C12N15/113 Z ZNA
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2021523068
(86)(22)【出願日】2019-10-25
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-07
(86)【国際出願番号】 GB2019053036
(87)【国際公開番号】W WO2020084318
(87)【国際公開日】2020-04-30
【審査請求日】2022-10-24
(31)【優先権主張番号】1817469.8
(32)【優先日】2018-10-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(73)【特許権者】
【識別番号】507226592
【氏名又は名称】オックスフォード ユニヴァーシティ イノヴェーション リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】オーランズ、ハリー オー
(72)【発明者】
【氏名】マクラーレン、ロバート イー
(72)【発明者】
【氏名】マックレメンツ、ミシェル イー
(72)【発明者】
【氏名】バーナード、アラン アール
【審査官】春日 淳一
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／１５１８２３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１７－５０９６３２（ＪＰ，Ａ）
【文献】HUMAN GENE THERAPY，2012年04月，Vol.23，pp.356-366
【文献】Nucleic Acids Research，2017年05月，Vol.45，p.7870-7885
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ，Ａ６１Ｐ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ロドプシン導入遺伝子を発現する遺伝子治療ベクターであって、
前記導入遺伝子は機能的ロドプシンをコードするものであり、
前記導入遺伝子が配列番号５又は７の配列を含まないものであり、
前記導入遺伝子が配列番号１２及び１４のミルトロン配列を含み、
ミルトロンが、配列番号２６を含む配列、又は配列番号２６と少なくとも９８％の配列同一性を有する配列中で、ロドプシン導入遺伝子の５’ＵＴＲに組み込まれており、
配列番号２６又は配列番号２６と少なくとも９８％の配列同一性を含む組込み配列を除いた５’ＵＴＲの配列は、配列番号３９と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、
前記組み込み配列が、前記組み込み配列を除いたロドプシン導入遺伝子５’ＵＴＲ配列を配列番号３９と整列させたときにヌクレオチド４２３と４２４の間に対応する位置に挿入されている、
遺伝子治療ベクター。
【請求項2】
前記ミルトロンが配列番号２６を含む配列中の前記導入遺伝子の５’ＵＴＲに組み込まれている、請求項１に記載の遺伝子治療ベクター。
【請求項3】
前記組み込み配列を除いた５’ＵＴＲの配列が、配列番号３９と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１又は２に記載の遺伝子治療ベクター。
【請求項4】
前記組み込み配列を除いた５’ＵＴＲの配列が、配列番号３９と少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１又は２に記載の遺伝子治療ベクター。
【請求項5】
網膜色素変性を治療するための医薬の製造に使用するための請求項１～４のいずれか一項に記載の遺伝子治療ベクター。
【請求項6】
前記ロドプシン導入遺伝子が、配列番号２４及び配列番号２５の配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の遺伝子治療ベクター、又は請求項５に記載の医薬の製造に使用するための遺伝子治療ベクター。
【請求項7】
前記ロドプシン導入遺伝子が、配列番号１のコード配列を含むが、配列番号５及び７の配列がそれぞれ配列番号２４及び２５の配列で置き換えられている、請求項６に記載の遺伝子治療ベクター、又は請求項６に記載の医薬の製造に使用するための遺伝子治療ベクター。
【請求項8】
前記ロドプシン導入遺伝子の５’ＵＴＲが、配列番号２７と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１～４、６又は７のいずれか一項に記載の遺伝子治療ベクター、又は請求項５～７のいずれか一項に記載の医薬の製造に使用するための遺伝子治療ベクター。
【請求項9】
前記ロドプシン導入遺伝子の５’ＵＴＲが、配列番号２７の配列を有する、請求項８に記載の遺伝子治療ベクター、又は請求項８に記載の医薬の製造に使用するための遺伝子治療ベクター。
【請求項10】
前記ベクターが、配列番号２８の配列、又は配列番号２８の変異体であって配列番号２９のＷＰＲＥ配列が欠失している配列番号２８の変異体を含む、請求項１に記載の遺伝子治療ベクター、又は請求項５に記載の医薬の製造に使用するための遺伝子治療ベクター。
【請求項11】
前記ベクターが、配列番号３１のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の遺伝子治療ベクター、又は請求項５に記載の医薬の製造に使用するための遺伝子治療ベクター。
【請求項12】
前記ベクターが、配列番号６４のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の遺伝子治療ベクター、又は請求項５に記載の医薬の製造に使用するための遺伝子治療ベクター。
【請求項13】
請求項１～４及び６～１２のいずれか一項に記載の遺伝子治療ベクターを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、ミルトロン（ｍｉｒｔｒｏｎ）を使用して網膜疾患を処置するための遺伝子治療の方法およびそれにおいて使用するためのベクターに関する。
【背景技術】
【0002】
ミルトロンは、スプライシング後に放出され、細胞内でプロセシングされるイントロンに由来するマイクロＲＮＡである。優性疾患を処置するために遺伝子治療ベクターの一部として人工ミルトロンを使用することが提案されている。ミルトロンは、「ブロックおよび置換」処理パラダイムの一部として、同時送達されたミルトロンに耐性となるように操作された標的遺伝子のコドン改変バージョンでベクターに付随させることができる。しかしながら、ミルトロンの効率的なスプライシングおよび適切な導入遺伝子発現の両方を維持する様式でのミルトロンと導入遺伝子との同時送達は困難であり（Ｃｕｒｔｉｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４５（１３）：７８７０－７８８５（２０１７））、今日まで達成されていない。
【0003】
優性網膜色素変性（ＲＰ）は、網膜に発現されるロドプシン遺伝子の突然変異によって一般的に引き起こされる失明疾患である。現在のところ、承認された処置法はない。しかしながら、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用してＲＰ等の疾患を処置するために、網膜の細胞に遺伝子治療剤を送達する方法が開発されている（Ｆｉｓｃｈｅｒ ＭＤら（２０１７）。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．２５（８）：１８５４－１８６５）。
【発明の概要】
【発明の効果】
【0004】
本発明者らは、ミルトロンを用いて網膜における標的遺伝子のノックダウンを達成した最初の発明者である。本発明者らは、インビボで任意の疾患を治療するためのミルトロンの最初の使用を実証した。本発明者らは、転写産物の発現がミルトロンの存在によって実質的に悪影響を受けない「置換」転写産物との人工ミルトロンの同時送達を達成することに成功した。本発明者らは、導入遺伝子の５’ＵＴＲにミルトロンを配置することによって、導入遺伝子の発現の妨害を回避できることを実証した。５’ＵＴＲからの効率的なスプライシングは、ミルトロンに隣接する５’ＵＴＲの領域にエキソンスプライスエンハンサーモチーフ（ＥＳＥ）を含めることによって達成することができる。本発明者らは、インビボでの、および疾患モデルを処置するためのミルトロンの使用の成功、ミルトロンを首尾よく送達するためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の使用、ならびに単一転写物からの複数のミルトロンの同時送達による遺伝子ノックダウンの増加を実証した。
【0005】
したがって、第１の態様において、本発明は、網膜疾患の処置を必要とする対象において網膜疾患を処置する方法であって、網膜において発現される標的遺伝子の発現をノックダウンするためのミルトロンを含むベクターを対象に投与することを含む方法を提供する。
【0006】
さらなる態様において、本発明は、ロドプシンノックダウンのためのミルトロンを含む遺伝子治療ベクターを提供する。
【0007】
いくつかの場合において、ベクターは、網膜における発現のための導入遺伝子をさらに含む。
【0008】
いくつかの場合において、導入遺伝子は標的遺伝子または変異ロドプシン遺伝子の変異体であり、変異体遺伝子はミルトロンによるノックダウンに耐性である。
【0009】
いくつかの場合において、ミルトロンは導入遺伝子または変異体ロドプシン遺伝子に埋め込まれている。
【0010】
いくつかの場合において、ミルトロンは、導入遺伝子の５’ＵＴＲまたは変異体ロドプシン遺伝子に位置する。
【0011】
いくつかの場合において、５’ＵＴＲは、１つ以上のエキソンスプライスエンハンサーモチーフをさらに含む。
【0012】
いくつかの場合において、ベクターは、網膜で発現される１つ以上の標的遺伝子の発現をノックダウンするための２つ以上のミルトロンを含む。
【0013】
さらなる態様において、本開示は、上記の遺伝子治療ベクターを含む医薬組成物を提供する。
【0014】
ここで、本開示を、限定ではなく例として、添付の図面を参照してより詳細に説明する。本開示を示された場合、当業者には、多くの同等の修正および変形が明らかであろう。したがって、記載された本開示の例示的な実施形態は、例示的であり、限定的ではないと考えられる。記載された実施形態に対する様々な変更は、本開示の範囲から逸脱することなく行うことができる。上記または下記にかかわらず、本明細書に引用されるすべての文献は、その全体が参照により明示的に組み込まれる。
【0015】
本開示は、そのような組み合わせが明らかに許容されないか、または明示的に回避されると述べられている場合を除いて、記載された態様および好ましい特徴の組み合わせを含む。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ベクター」への言及は、２つ以上のそのようなエンティティを含む。
【0016】
セクションの見出しは、便宜上本明細書で使用されているにすぎず、決して限定するものと解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】ロドプシンＡＡＶ導入遺伝子をｋｂでの有効サイズと共に示す概略図である。ＩＴＲ、逆方向末端反復配列；ＲＨＯｐ、ヒトロドプシンプロモーター；Ｅｘ／Ｉｎｔ、ウサギβグロビン由来のスプライスアクセプターと共にニワトリβアクチン遺伝子由来の第１のエクソンおよびイントロン；ＲＨＯ、ヒトロドプシンコード配列；ＷＰＲＥ、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント；ｐＡ、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列；ＩＴＲｓｃ、突然変異した逆方向末端反復配列（自己相補性をもたらす）。
【図2】ｓｓＲＨＯ、ＷＰＲＥ、Ｅｘ／ＩｎｔおよびｓｃＲＨＯ ＡＡＶによる形質導入後の解離したＮｒｌ．ＧＦＰ／Ｒｈｏ－／－網膜細胞におけるロドプシン発現のレスキュー。（Ａ）ロドプシンから免疫染色された細胞の画像。形質導入された細胞ではロドプシン（赤色）についてＧＦＰ標識細胞（緑色）染色されるが、形質導入されていない細胞では染色されないことに留意されたい。年齢適合解離野生型細胞を陽性対照として左側のパネルに示す。（Ｂ）ｑＰＣＲによって測定された、形質導入された解離細胞におけるヒトロドプシンｍＲＮＡレベルは、他の３つのベクターと比較して、ｓｃＲＨＯの転写物の数の４倍の増加を明らかにした（＊＊ｐ＜０．０１、一元配置ＡＮＯＶＡ）。
【図3】ＲＨＯ発現ＡＡＶのインビボ比較を示す図である。（Ａ）Ｎｒｌ．ＧＦＰ／Ｒｈｏ－／－マウスに、４つのＡＡＶ－ＲＨＯウイルスの網膜下注射を行った。網膜切片におけるロドプシンについての免疫染色は、Ｅｘ／ＩｎｔおよびＳＣベクターによる最大発現を示唆した。すべてのプロモーターが、桿体特異的発現を付与した。ＧＣＬ 神経節細胞層；ＩＰＬ 内網状層；ＩＮＬ 内核層；ＯＰＬ 外網状層；ＯＮＬ 外顆粒層；ＩＳ 内側セグメント；ＯＳ 外側セグメント。（Ｂ）ＳＤ－ＯＣＴを注射から４週間後に生存マウスで行った。光受容体層（ＰＲＬ）の厚さは、免疫組織化学的所見を裏付けるＥｘ／ＩｎｔおよびＳＣ注射マウスで最大であった。＊ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡホルム－シダック多重比較検定。
【図4】ＡＡＶ－ＲＨＯを注射したＮｒｌ．ＧＦＰ／Ｒｈｏ－／－マウスの神経網膜に由来するタンパク質溶解物のウエスタンブロットである。（Ａ）ロドプシンについて染色した形質導入網膜溶解物のウエスタンブロットの例。トランスジェニックロドプシンは、はるかに低い発現レベルではあるが、形質導入されていない野生型マウスに由来するものと同様のバンドのパターンをもたらすことに留意されたい。（Ｂ）バンドデンシトメトリーは、Ｅｘ／ＩｎｔおよびＳＣベクターで最大レベルのタンパク質発現が達成されることを示した。ベクターの効果についての二元配置ＡＮＯＶＡ ｐ＜０．００１。テューキーの多重比較検定：ｓｃＲＨＯ対ｓｓＲＨＯまたはＷＰＲＥ、ｐ＜０．０１；Ｅｘ／Ｉｎｔ対ｓｓＲＨＯまたはＷＰＲＥ、ｐ＜０．０５；ｓｓＲＨＯ対ＷＰＲＥ、ｎｓ；Ｅｘ／Ｉｎｔ対ＳＣ、ｎｓ。
【図5】Ｅｘ／ＩｎｔおよびｓｃＲＨＯベクターの網膜下注射後のロドプシンの過剰発現を示すウエスタンブロットである。（Ａ）注射されていない左眼（ＯＳ）と比較した、注射された右眼（ＯＤ）におけるロドプシンバンド密度（緑色）の増加を示す例示的なウエスタンブロット。（Ｂ、Ｃ）ベータアクチンに対して正規化されたバンドデンシトメトリー。二元配置ＡＮＯＶＡ、ＳＣの効果についてはｐ＝０．２１、Ｅｘ／Ｉｎｔの効果についてはｐ＝０．０２３。
【図6】ＡＡＶ－Ｅｘ／Ｉｎｔを片側注射したＰ２３Ｈマウスの暗順応網膜電図検査（ＥＲＧ）記録から導出した強度応答曲線を示す図である。注射後１ヶ月または３ヶ月のいずれにおいても、眼間の応答の差は中間用量群において検出されず、変性の遅延は観察されなかった。高用量のベクターは毒性のようであった。
【図7】ＧＦＰ－ミルトロンプラスミドマップである。ＢｓｔＢ１制限部位の７６ｂｐミルトロンインサートは、ＧＦＰコード配列を妨害し、正しく完全にスプライシングされていない場合にはＧＦＰのフレームシフトを引き起こすと予測される。
【図8】ＧＦＰ－ミルトロンプラスミドによるＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションを示す図である。緑色蛍光のレベルが異なることは、ミルトロン設計間のスプライシング効率の変動を示す。
【図9】ミルトロン１～７のスプライシング効率を示す図である。（Ａ）図８に示すトランスフェクト細胞の溶解物からのシグナルに基づく正規化蛍光アッセイ。（Ｂ、Ｃ）ＰＣＲを、ＧＦＰ－ミルトロントランスフェクトＨＥＫ２９３ ｃＤＮＡからミルトロン貫通プライマーを用いて行った。（Ｂ）（Ｃ）に示すＰＣＲアンプリコンバンドからの相対デンシトメトリー読み取り値。
【図10】ＰｓｉＣＨＥＣＫ２プラスミドおよびＤｕａｌ Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を示す図である。
【図11】ヒトおよびマウスのコード配列に対するＤｕａｌ Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイで測定した、ミルトロン１～７のロドプシンノックダウン効率を示す図である。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置ＡＮＯＶＡ Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定。
【図12】ミルトロン媒介ロドプシンノックダウンを達成するためには、スプライシングおよび特異的標的配列の両方が必要であることを示す図である。
【図13】ｍＲＮＡ標的コンテクストは、ミルトロンの効力に影響を及ぼすことを示す図である。「完全ＲＨＯ」は、全長ヒトロドプシンコード配列がクローニングされたＰｓｉＣＨＥＣＫ２ベクターに対応する。「短ＲＨＯ」ＰｓｉＣＨＥＣＫ２プラスミドは、２１ｂｐのＭ３標的配列に対応するヒトロドプシン配列の領域のみを含み、２５ｂｐの５’および３’隣接ＤＮＡを有する。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、２元配置ＡＮＯＶＡ、シダックの多重比較検定。
【図14】原形質膜へのＲＨＯ－ＧＦＰ輸送を示す図である。 ＨＥＫ２９３細胞をＣＡＧ．ＲＨＯ－ＧＦＰ．ＷＰＲＥプラスミドでトランスフェクトし、ロドプシンについてＮ末端指向抗体４Ｄ２で染色した。
【図15】ＲＨＯ－Ｌｕｃは原形質膜に輸送されることを示す図である。ＨＥＫ２９３細胞をＰｓｉＣＨＥＣＫ２－ＲＨＯプラスミド（従来の二重ルシフェラーゼアッセイのために設計される；上の行）またはＲＨＯ－Ｌｕｃ．ＰｓｉＣＨＥＣＫ２プラスミド（二重ルシフェラーゼ融合アッセイのために設計される；下の行）でトランスフェクトした。対応するタンパク質の概略図を左に示す。
【図16】ＰｓｉＣＨＥＣＫ２－ＲＨＯ（「標準アッセイ」）およびＲＨＯ－Ｌｕｃ．ＰｓｉＣＨＥＣＫ２（「融合アッセイ」）と組み合わせたＤｕａｌ Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイを使用したミルトロン媒介ロドプシンノックダウンを示す図である。２つのアッセイで測定した場合のノックダウン効果は、ミルトロン２を除き、すべての場合において同様であることに留意されたい。
【図17】予測された「オフ標的」は、ミルトロン媒介性ノックダウンを受けないことを示す図である。
【図18】ＥＳＥに富むミルトロン隣接ｅＧＦＰ ＣＤＳ配列およびＥＳＥを示す図である。Ａ：５’配列。Ｂ：３’配列。スプライスドナーモチーフの上流またはミルトロンのスプライスアクセプターモチーフの下流の距離が示されている。
【図19】５’－ＵＴＲミルトロンの有効性および下流遺伝子発現に対するそれらの効果を試験するための実験設計を示す図である。
【図20】ミルトロンは、ＧＦＰのＣＤＳではなく５’－ＵＴＲに位置する場合により効果的であることを示す図である。二重ルシフェラーゼアッセイを、Ｍ２とＭ２－ＵＴＲ（Ａ）、Ｍ３とＭ３－ＵＴＲ（Ｂ）、およびＭ５とＭ５－ＵＴＲ（Ｃ）とを比較して行った。すべての場合においてｎ＝６であった。ｎｓ、有意でない；＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；多重比較のための補正を伴う二元配置ＡＮＯＶＡ。
【図21】増強されたスプライシングは、５’－ＵＴＲミルトロンの改善された有効性を説明し得ることを示す図である。（Ａ）入れ子型および５’－ＵＴＲのミルトロンのＰＣＲスプライス産物分析。（Ｂ）バンドデンシトメトリー。ｎ＝３、＊＊ｐ＜０．０１、二元配置ＡＮＯＶＡシダックの多重比較検定。
【図22】５’－ＵＴＲからのミルトロン３および５の正確なスプライシングが、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞からの増幅されたｃＤＮＡのサンガー配列決定によって確認されることを示す図である。
【図23】タンデムのミルトロンがロドプシンノックダウンの増加をもたらすことを示す図である。（Ａ、Ｂ）５’－ＵＴＲ内の直列の２コピーのＭ３は、１コピーよりも有効である。（Ｃ、Ｄ）直列のＭ３の１つのコピーおよびＭ５の１つのコピーは、５’－ＵＴＲにおいてミルトロン単独よりも有効である。示されるデータは、その対応する種に対するＭ５のバージョン（Ｍ５ＨおよびＭ５Ｍ）に関するものである。ｎｓ＝有意ではない；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；２元配置ＡＮＯＶＡシダックの多重比較検定。
【図24】タンデム５’－ＵＴＲミルトロンのスプライス分析を示す図である。非スプライシング型（４１２ｂｐ）、単一スプライシング型（３３６ｂｐ）またはエキソンスキップド（１６６ｂｐ）転写物について予測されたものに対応するバンドは検出されなかったことに留意されたい。
【図25】タンデム５’－ＵＴＲミルトロンのスプライス分析を示す図である。サンガー配列決定により、ＧＦＰの５’－ＵＴＲにおけるタンデムミルトロンの独立した正確なスプライシングが確認された。
【図26】ＧＦＰの５’－ＵＴＲ内に位置するミルトロンが、ＲＨＯ－ルシフェラーゼ融合タンパク質を効果的にノックダウンすることを示す図である。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１二元配置ＡＮＯＶＡシダックの多重比較検定。
【図27】５’－ＵＴＲミルトロンのレポーター遺伝子発現を示す図である。５’－ＵＴＲミルトロン－ＧＦＰコンストラクトでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、ＣＡＧ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥのものと比較した。ｎ＝６；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置ＡＮＯＶＡダネットの多重比較検定。
【図28】Ｍ３／Ｍ５Ｈ－ＵＴＲ（赤い矢印）は、ヒトおよびマウスロドプシンの両方の＞７５％のノックダウンを達成することを示す図である。
【図29】ロドプシンのコドン修飾は、ミルトロンに対する耐性を付与することを示す図である。
【図30】ＲＨＯＭ３／５Ｒ配列がインビトロでロドプシンの発現をもたらすことを示す図である。（Ａ）ＲＨＯおよびＲＨＯＭ３／５Ｒの両方から翻訳されたロドプシンタンパク質は、Ｎ末端特異的モノクローナル抗体（４Ｄ２、Ａｂｃａｍ）、Ｃ末端特異的抗体（１Ｄ４、Ａｂｃａｍ）およびポリクローナル抗体（ａｂ３４２４、Ａｂｃａｍ）によって認識される。（Ｂ）ロドプシンは、両方の場合において原形質膜に輸送される。
【図31】ＲＨＯＭ３／５Ｒは、桿体由来の網膜電図を駆動することができることを示す図である。注射から４週間後のＲｈｏ－／－マウスの注射した右眼および注射していない左眼に由来するａ波およびｂ波に対する暗順応強度応答曲線。注入の効果についての二元配置ＡＮＯＶＡ、ａ波についてはｐ＝０．００２２、ｂ波についてはｐ＝０．００４３。
【図32】ＲＨＯＭ３／Ｍ５Ｒ転写産物から翻訳されたロドプシンは外側セグメントへ輸送されることを示す図である。Ｎｒｌ．ＧＦＰ／Ｒｈｏ－／－マウス（桿体がＧＦＰで標識されている）に、ＡＡＶ２／８Ｙ７３３Ｆ．ＲＨＯｐ．Ｅｘ／Ｉｎｔ．Ｍ３／Ｍ５．ＲＨＯＭ３／５Ｒ．ＷＰＲＥの片側網膜下注射を行った。４週間後、動物を屠殺し、網膜切片をロドプシン（赤色）について免疫染色した。
【図33】「ブロック」および置換」ＡＡＶベクターのゲノムを示す図である。
【図34】低用量（２×１０８ｇｃ）および高用量（２×１０９ｇｃ）のＡＡＶ注入ＲｈｏＰ２３Ｈ／＋網膜に由来するｃＤＮＡを、転写産物のミルトロン領域にまたがるプライマーを用いたＰＣＲの鋳型として使用したことを示す図である。上記のゲルは、一次ＰＣＲ産物が、両方のミルトロンが個別にスプライシングされた転写物から予想されるサイズに対応することを示している（バンドデンシトメトリーに基づいて＞９０％（左））。
【図35】ｍＲＮＡ分析：ミルトロン３は、インビボでマウスロドプシンのノックダウンを誘導することを示す図である。ミルトロンを含まないＡＡＶ－Ｅｘ／Ｉｎｔの送達後、低用量または高用量ではｍＲｈｏの有意な減少は認められなかった。ミルトロン含有ベクターを高用量で送達した場合、総網膜ｍＲｈｏ ｍＲＮＡの３４％ノックダウンが、偽注射した他眼と比較して明らかであった（Ｐ＝０．００２４、二元配置ＡＮＯＶＡシダックの多重比較検定）。低用量では有意なノックダウンは見られなかった。
【図36】ｍＲＮＡ分析の続き：ＡＡＶ－Ｍ３／５Ｈ．ＲＨＯＭ３／５Ｒ．ＷＰＲＥの送達後のヒトＲＨＯ補充レベルを示す図である。偽注射された他眼における天然マウスＲｈｏレベルに対する倍率変化として表されるヒトＲＨＯによる「置換」。低用量では、ＲＨＯ補充は天然レベルに近似する。高用量では４．６倍の増加が見られ（Ｐ＝０．００１１、二元配置ＡＮＯＶＡシダックの多重比較検定）、過剰発現の程度が示唆される。
【図37】ｍＲＮＡ分析の続きを示す図である。ヒトＲＨＯ発現は、ミルトロン含有ベクターで処置した眼においてｍＲｈｏノックダウンと相関する（右）が、ミルトロン３で処理されないＡＡＶでは相関しない（左）。合わせて、この遺伝子発現分析は、インビボでの人工ミルトロンの機能の最初の実証を表す。
【図38】２×１０８ｇｃのＡＡＶ－Ｍ３／５．ＲＨＯを注射したＰ２３Ｈ眼における光受容体層の厚さの相対的レスキュー（黄色矢印）を示す図である。処置マウスの水平子午線に沿って撮影した代表的なＳＤ－ＯＣＴ画像。耳側および鼻側網膜において、ＰＲＬ厚さは、注射された眼の方が注射されていない眼よりも大きかった（両方ともｐ＜０．０００１、２元配置ＡＮＯＶＡ、シダックの多重比較検定）。網膜上側位置（網膜剥離の影響による可能性がある）または下側位置（不十分な用量による可能性がある）について有意差は検出されなかった。
【図39】低用量（ＬＤ：２×１０８ｇｃ）ＡＡＶ－Ｍ３／５．ＲＨＯの網膜下送達が、ＳＤ－ＯＣＴによってインビボで測定した場合に光受容体層（ＰＲＬ）の相対的保存につながるという初期の証拠を示す図である。注射眼対非注射眼のＰＲＬ厚の比を、注射から１ヶ月後のＬＤ群および偽注射群の網膜位置の関数として示す。水平子午線（鼻側および耳側網膜）に沿って、ＬＤでは網膜の厚さが増加したが（比＞１）、偽注射眼では増加しなかったことに留意されたい。
【図40】処置効果を探求するＯＣＴ分析を示す図である。ＯＣＴは、網膜の非侵襲的なインビボ断面画像化を提供する。すべてのコホートについて、右眼に注射し、対照として左眼には注射しなかった。低用量コホートでは、全体的な光受容体層（ＰＲＬ）の厚さに対する小さいが有意なプラスの効果が見られたが、偽群では小さいが有意な損傷効果が見られた（手術に起因し得る）。高用量を注射した眼では、全体的な平均ＰＲＬ厚の有意な変化は見られなかった。 ベクター＝ＡＡＶ．ＲＨＯｐ．Ｅｘ／Ｉｎｔ．Ｍ３．Ｍ５Ｈ．ＲＨＯＭ３／５Ｒ．ＷＰＲＥ
【図41】上網膜下注射後の網膜位置による３つの群のＯＣＴ分析を示す図である。ベクター＝ＡＡＶ．ＲＨＯｐ．Ｅｘ／Ｉｎｔ．Ｍ３．Ｍ５Ｈ．ＲＨＯＭ３／５Ｒ．ＷＰＲＥ
【図42】ＡＡＶ－Ｅｘ／Ｉｎｔベクターを用いたＯＣＴ分析を示す図である。示されるデータは、注射から１ヶ月後および２ヶ月後である。ミルトロンを含むベクターからの同等のデータ（図７）と比較して、低用量では利益は見られず、高用量ではより損傷があるようである。
【図43】上網膜下注射後の網膜位置による３つの群のＯＣＴ分析を示す。ここでも、図８（ミルトロンを含むベクターのデータ）と比較して、低用量および高用量で見られる利点はなく、より損傷があるようである。ベクター＝ＡＡＶ．ＲＨＯｐ．Ｅｘ／Ｉｎｔ．ＲＨＯ．ＷＰＲＥ
【図44】暗順応ＥＲＧ分析を示す図である。ＥＲＧは網膜からの電気信号を測定し、ａ波は光受容体からのものであり、ｂ波は内側網膜からのものである。低用量ではわずかな利益が見られるが、高用量および偽はわずかな有害作用を有するようである。
【図45】明順応ＥＲＧ分析を示す図である。錐体光受容体からのシグナルを表す。低用量ではわずかな利益が見られるが、高用量および偽は有害作用を有するようであり、高用量群はより多くの有害作用を有するようである。
【図46】ＡＡＶ．ＲＨＯｐ．Ｅｘ／Ｉｎｔ．ＲＨＯ．ＷＰＲＥ．の送達後の１カ月の暗および明順応ＥＲＧ分析を示す図である。
【図47】ＷＰＲＥを含まない新たなＡＡＶベクターを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0018】
配列の説明
配列番号１、２は、ヒトロドプシンＣＤＳおよびアミノ酸配列を示す。
配列番号３～９は、ミルトロン１～７のロドプシン遺伝子における標的配列を示す。
配列番号１０～１６は、ミルトロン１～７のポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号１７～２３は、ミルトロン１～７のガイド鎖配列を示す。
配列番号２４、２５は、ミルトロン３、５に耐性である改変標的配列を示す。
配列番号２６は、ｅＧＦＰ ＣＤＳに由来する５’、３’および介在するＥＳＥリッチ配列を有するミルトロン３および５を示す。
配列番号２７は、ベクターＡＡＶ２／８Ｙ７３３Ｆ．ＲＨＯｐ．Ｅｘ／Ｉｎｔ．Ｍ３／Ｍ５．ＲＨＯＭ３／５Ｒ．ＷＰＲＥの５’ＵＴＲ配列を示す。
配列番号２８は、ベクターＡＡＶ２／８Ｙ７３３Ｆ．ＲＨＯｐ．Ｅｘ／Ｉｎｔ．Ｍ３／Ｍ５．ＲＨＯＭ３／５Ｒ．ＷＰＲＥのＩＴＲおよび介在導入遺伝子配列を示す。
配列番号２９は、ＷＰＲＥ配列を示す。
配列番号３０は、ＢｓｔＢ１制限部位および隣接する３’’Ｇ’を示す。
配列番号３１は、ベクターＡＡＶ２／８Ｙ７３３Ｆ．ＲＨＯｐ．Ｅｘ／Ｉｎｔ．Ｍ３／Ｍ５．ＲＨＯＭ３／５Ｒ．ＷＰＲＥのポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号３２および３３は、ＡＡｖ２フォワードおよびリバースＩＴＲ配列を示す。
配列番号３４は、ヒトロドプシンプロモーターの配列を示す。
配列番号３５、３６は、ｅＧＦＰ ＣＤＳおよびアミノ酸配列を示す。
配列番号３７、３８は、ＥＳＥリッチ５’および３’隣接配列を示す。
配列番号３９は、ミルトロンを含まない５’ＵＴＲ配列を示す。
配列番号４０は、ＥＳＥリッチ配列を示す。
配列番号４１～４７は、ミルトロン１～７のフォワードオリゴヌクレオチド配列を示す。
配列番号４８～５４は、ミルトロン１～７のリバースオリゴヌクレオチド配列を示す。
配列番号５５～５７は、ミルトロンＭ５Ｍのミルトロン、フォワードオリゴヌクレオチドおよびリバースオリゴヌクレオチド配列を示す。
配列番号５８～６０は、ミルトロンＭ２Ｕ－Ｍ２のミルトロン、フォワードオリゴヌクレオチドおよびリバースオリゴヌクレオチド配列を示す。
配列番号６１～６３は、ミルトロンＳｃｒ－Ｍ２のミルトロン、フォワードオリゴヌクレオチドおよびリバースオリゴヌクレオチド配列を示す。
配列番号６４は、ベクターＡＡＶ２／８Ｙ７３３Ｆ．ＲＨＯｐ．Ｅｘ／Ｉｎｔ．Ｍ３／Ｍ５．ＲＨＯＭ３／５Ｒのポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号６５は、ベクターＡＡＶ２／８Ｙ７３３Ｆ．ＲＨＯｐ．Ｅｘ／Ｉｎｔ．Ｍ３／Ｍ５Ｍ．ＲＨＯＭ３／５Ｒのポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号１、２は、ヒトロドプシンＣＤＳおよびアミノ酸配列を示す。
配列番号３～９は、ミルトロン１～７のロドプシン遺伝子における標的配列を示す。
配列番号１０～１６は、ミルトロン１～７のポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号１７～２３は、ミルトロン１～７のガイド鎖配列を示す。
配列番号２４、２５は、ミルトロン３、５に耐性である改変標的配列を示す。
配列番号２６は、ｅＧＦＰ ＣＤＳに由来する５’、３’および介在するＥＳＥリッチ配列を有するミルトロン３および５を示す。
配列番号２７は、ベクターＡＡＶ２／８Ｙ７３３Ｆ．ＲＨＯｐ．Ｅｘ／Ｉｎｔ．Ｍ３／Ｍ５．ＲＨＯＭ３／５Ｒ．ＷＰＲＥの５’ＵＴＲ配列を示す。
配列番号２８は、ベクターＡＡＶ２／８Ｙ７３３Ｆ．ＲＨＯｐ．Ｅｘ／Ｉｎｔ．Ｍ３／Ｍ５．ＲＨＯＭ３／５Ｒ．ＷＰＲＥのＩＴＲおよび介在導入遺伝子配列を示す。
配列番号２９は、ＷＰＲＥ配列を示す。
配列番号３０は、ＢｓｔＢ１制限部位および隣接する３’’Ｇ’を示す。
配列番号３１は、ベクターＡＡＶ２／８Ｙ７３３Ｆ．ＲＨＯｐ．Ｅｘ／Ｉｎｔ．Ｍ３／Ｍ５．ＲＨＯＭ３／５Ｒ．ＷＰＲＥのポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号３２および３３は、ＡＡｖ２フォワードおよびリバースＩＴＲ配列を示す。
配列番号３４は、ヒトロドプシンプロモーターの配列を示す。
配列番号３５、３６は、ｅＧＦＰ ＣＤＳおよびアミノ酸配列を示す。
配列番号３７、３８は、ＥＳＥリッチ５’および３’隣接配列を示す。
配列番号３９は、ミルトロンを含まない５’ＵＴＲ配列を示す。
配列番号４０は、ＥＳＥリッチ配列を示す。
配列番号４１～４７は、ミルトロン１～７のフォワードオリゴヌクレオチド配列を示す。
配列番号４８～５４は、ミルトロン１～７のリバースオリゴヌクレオチド配列を示す。
配列番号５５～５７は、ミルトロンＭ５Ｍのミルトロン、フォワードオリゴヌクレオチドおよびリバースオリゴヌクレオチド配列を示す。
配列番号５８～６０は、ミルトロンＭ２Ｕ－Ｍ２のミルトロン、フォワードオリゴヌクレオチドおよびリバースオリゴヌクレオチド配列を示す。
配列番号６１～６３は、ミルトロンＳｃｒ－Ｍ２のミルトロン、フォワードオリゴヌクレオチドおよびリバースオリゴヌクレオチド配列を示す。
配列番号６４は、ベクターＡＡＶ２／８Ｙ７３３Ｆ．ＲＨＯｐ．Ｅｘ／Ｉｎｔ．Ｍ３／Ｍ５．ＲＨＯＭ３／５Ｒのポリヌクレオチド配列を示す。
配列番号６５は、ベクターＡＡＶ２／８Ｙ７３３Ｆ．ＲＨＯｐ．Ｅｘ／Ｉｎｔ．Ｍ３／Ｍ５Ｍ．ＲＨＯＭ３／５Ｒのポリヌクレオチド配列を示す。
【0019】
詳細な説明
ミルトロン
ミルトロンは、スプライシングされ、マイクロＲＮＡとして機能するヘアピンイントロンである。ミルトロンは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のプロセスを介して標的ｍＲＮＡの遺伝子発現を阻害し得る。本明細書で言及される「ミルトロン」という用語は、５’および３’スプライス部位がヘアピンの基部近くに位置する古典的なミルトロン、およびスプライシング後にエキソヌクレアーゼ消化によってさらに処理され得る５’または３’テールのミルトロンを含む。
ミルトロン
ミルトロンは、スプライシングされ、マイクロＲＮＡとして機能するヘアピンイントロンである。ミルトロンは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のプロセスを介して標的ｍＲＮＡの遺伝子発現を阻害し得る。本明細書で言及される「ミルトロン」という用語は、５’および３’スプライス部位がヘアピンの基部近くに位置する古典的なミルトロン、およびスプライシング後にエキソヌクレアーゼ消化によってさらに処理され得る５’または３’テールのミルトロンを含む。
【0020】
人工ミルトロンを設計する際に考慮され得る考慮事項は、以前に、例えばＳｅｏｗら、（ＲＮＡ（２０１２）１８：１３２８－１３３７）およびＫｏｃｋら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１５））に説明されている。
【0021】
各ミルトロンは、スプライスドナーモチーフ（「ＧＴ」）で始まり、スプライスアクセプターモチーフ（「ＡＧ」）で終わる。ヘアピンのステムは、ガイド鎖および相補的なパッセンジャー鎖を含む。ガイド鎖は、相補的ワトソン・クリック塩基対合によって標的ｍＲＮＡ配列を認識するように設計されている。例えばＳｃｈｗａｒｚら（２００３、Ｃｅｌｌ １１５（２）：１９９－２０８）に記載されているように、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）による正しい鎖選択を容易にするために、パッセンジャー鎖におけるヘアピンの基部にミスマッチが導入され得る。有効性を維持するために、ガイド鎖は標的配列を補完する。
【0022】
ガイド鎖は、典型的には、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１ヌクレオチド長であってもよく、最大２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれを超えるヌクレオチド長であってもよい。いくつかの場合において、ガイド鎖は、１８～２３ヌクレオチド長または２１ヌクレオチド長である。ガイド鎖は、いくつかの場合において、５’スプライスドナーモチーフからの２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ヌクレオチド未満であってもよい。ガイド鎖および／またはパッセンジャー鎖は、位置２１にＴまたはより典型的にはＡを含んでもよい。ガイド鎖および／またはパッセンジャー鎖は、Ａ位置５を含んでもよい。ガイド鎖および／またはパッセンジャー鎖は、最後の５ヌクレオチドに３つ以上のＡまたはＴを含んでもよい。ガイド鎖および／またはパッセンジャー鎖は、位置１５にＡ、ＣまたはＴを含んでもよい。ガイド鎖および／またはパッセンジャー鎖は、Ａ位置８を含んでもよい。
【0023】
ガイド鎖とパッセンジャー鎖との間には、ヘアピンループがある。ヘアピンループは、典型的には、５、６、７、８または９～９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５またはそれを超えるヌクレオチド長であってもよい。いくつかの場合において、ヘアピンループは、８～１２ヌクレオチド長である。いくつかの場合において、ヘアピンループは、９ヌクレオチド長であり、および／または配列ＴＴＣＡＡＧＡＧＡ（配列番号Ｘ）を含む。
【0024】
ラリアット分岐点は、ヘアピンループ（古典的なおよび５’テールミルトロン）内、またはヘアピン構造の３’末端付近、典型的にはヘアピン（３’テールミルトロン）の末端の５’または３’の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５ヌクレオチド以内に位置する。３’テールミルトロンでは、ヘアピンは、いくつかの場合において、ラリアット分岐点の３ヌクレオチド以内、２ヌクレオチド以内、または１ヌクレオチド以内で終了し得る。
【0025】
ヘアピンの下流には、ポリピリミジントラクトおよびＡＧスプライスアクセプターモチーフがある。ポリピリミジントラクトは、典型的には、少なくとも６個の中断されていないポリピリミジンを含み得る。さらに、ポリピリミジントラクトは、典型的には、最大で１つのプリン中断を有する少なくとも１０個のポリピリミジンのストレッチ、または最大で２つのプリン中断を有する少なくとも１３個のポリピリミジンのストレッチ、または最大で３つのプリン中断を有する少なくとも１６個のポリピリミジンのストレッチを含み得る。
【0026】
分子レベルでは、ミルトロンに基づく遺伝子治療戦略は、以前になされた他の遺伝子ノックダウンまたは「ブロックおよび置換」アプローチを超える次のようないくつかの利点を提供する。
ａ．スプライシング後に放出されるミルトロンは、スプライスドナーおよびアクセプターｍＲＮＡ配列によって正確に定義され、これは、得られた短いヘアピンＲＮＡが、ＰｏｌＩＩＩクラスプロモーターからの異常なｍｉＲＮＡプロセシング後に生じ得るより少ないオフターゲット効果に関連する可能性が高いことを意味する。
ｂ．ミルトロン処理はＤｒｏｓｈａ非依存性であり、これはｍｉＲＮＡ経路の飽和に関連する毒性の可能性を低減し得る。
ｃ．イントロン配列として、ミルトロンは、同じＰｏｌＩＩプロモーター下で「硬化」導入遺伝子転写物と共に共発現され得る。これは、「ブロック」および「置換」の完全な一致を可能にし、異なるプロモーターまたはベクターが他の研究者によって採用される処置、戦略のノックダウンおよび置換アームに使用される場合に生じ得る不均衡を回避する。確かに、別個のプロモーターを使用すると、置換転写物を駆動するプロモーターが時間と共にサイレンシングされる場合、実際に疾患プロセスを悪化させる可能性がある。
ａ．スプライシング後に放出されるミルトロンは、スプライスドナーおよびアクセプターｍＲＮＡ配列によって正確に定義され、これは、得られた短いヘアピンＲＮＡが、ＰｏｌＩＩＩクラスプロモーターからの異常なｍｉＲＮＡプロセシング後に生じ得るより少ないオフターゲット効果に関連する可能性が高いことを意味する。
ｂ．ミルトロン処理はＤｒｏｓｈａ非依存性であり、これはｍｉＲＮＡ経路の飽和に関連する毒性の可能性を低減し得る。
ｃ．イントロン配列として、ミルトロンは、同じＰｏｌＩＩプロモーター下で「硬化」導入遺伝子転写物と共に共発現され得る。これは、「ブロック」および「置換」の完全な一致を可能にし、異なるプロモーターまたはベクターが他の研究者によって採用される処置、戦略のノックダウンおよび置換アームに使用される場合に生じ得る不均衡を回避する。確かに、別個のプロモーターを使用すると、置換転写物を駆動するプロモーターが時間と共にサイレンシングされる場合、実際に疾患プロセスを悪化させる可能性がある。
【0027】
ブロックおよび置換
本発明は、網膜で発現される遺伝子の発現をノックダウンするためのミルトロンを含む遺伝子治療ベクターの設計、製造および使用に関する。そのような遺伝子は、本明細書では「標的遺伝子」または「ミルトロンによって標的化される遺伝子」と呼ばれることがある。ミルトロンは、ミルトロンのガイド鎖のポリヌクレオチド配列が標的遺伝子に存在するポリヌクレオチド配列を補完する（したがって「認識する」）場合、標的遺伝子の発現をノックダウンすることができる。ミルトロンのガイド鎖を補完する標的遺伝子内のポリヌクレオチド配列は、本明細書では「標的配列」と呼ばれることがある。標的遺伝子は、対象の網膜で発現される任意の遺伝子であってもよく、対象は、単独で、または他の治療手段、例えば以下に考察されるような導入遺伝子の共発現と組み合わせて、網膜での遺伝子の発現の低減から治療上の利益を受ける。
本発明は、網膜で発現される遺伝子の発現をノックダウンするためのミルトロンを含む遺伝子治療ベクターの設計、製造および使用に関する。そのような遺伝子は、本明細書では「標的遺伝子」または「ミルトロンによって標的化される遺伝子」と呼ばれることがある。ミルトロンは、ミルトロンのガイド鎖のポリヌクレオチド配列が標的遺伝子に存在するポリヌクレオチド配列を補完する（したがって「認識する」）場合、標的遺伝子の発現をノックダウンすることができる。ミルトロンのガイド鎖を補完する標的遺伝子内のポリヌクレオチド配列は、本明細書では「標的配列」と呼ばれることがある。標的遺伝子は、対象の網膜で発現される任意の遺伝子であってもよく、対象は、単独で、または他の治療手段、例えば以下に考察されるような導入遺伝子の共発現と組み合わせて、網膜での遺伝子の発現の低減から治療上の利益を受ける。
【0028】
本発明によるいくつかの場合において、標的遺伝子はロドプシンである。ロドプシンは、網膜の桿体光受容体細胞で発現される感光性受容体タンパク質である。ヒトロドプシンのＣＤＳは、配列番号１のポリヌクレオチド配列を有し得、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトロドプシンタンパク質をコードし得る。したがって、ロドプシンノックダウンのための本発明によるミルトロンは、配列番号１の配列内に含まれる配列または機能的ロドプシンタンパク質をコードするその任意の変異体もしくはホモログを補完する上記の任意の適切なガイド鎖配列を含み得る。いくつかの場合において、ミルトロンガイド鎖は、配列番号３～９のいずれか１つから選択されるロドプシンポリヌクレオチド配列、または配列番号３～９のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を補完し得る。本発明によるいくつかの場合において、ミルトロンは、配列番号１０～１６のいずれか１つのポリヌクレオチド配列および／または配列番号１７～２３のいずれか１つのポリヌクレオチド配列を含む、もしくはそれからなるガイド鎖配列を有する、ならびに／あるいは配列番号３～９から選択されるポリヌクレオチド配列を含む標的配列を補完する。
【0029】
いくつかの場合において、ベクターは、網膜におけるタンパク質の発現のための遺伝子をさらに含む。この遺伝子は、本明細書では「導入遺伝子」と呼ばれることがある。導入遺伝子は、単独で、またはミルトロンの同時発現等の他の治療手段と組み合わせて、網膜での発現が対象に治療上の利益を提供する任意の遺伝子であってもよい。
【0030】
いくつかの場合において、導入遺伝子は、ミルトロンによって標的化される遺伝子の変異体である。したがって、ミルトロンがロドプシンノックダウンのためのものである場合、導入遺伝子は変異体ロドプシン遺伝子であってもよい。そのようなベクターは、ミルトロンを使用して網膜におけるタンパク質の発現をノックダウンすると共に、それを変異体タンパク質の発現で置き換えるために使用され得る。これは、「ブロックおよび置換」処理または「ブロックおよび置換」ベクターの使用と呼ばれることがある。変異体遺伝子は、ミルトロンによるノックダウンに耐性であるかまたは「硬化」するように選択される。典型的には、変異体遺伝子は、ミルトロンガイド鎖によって、典型的には標的配列中の１個以上、いくつかの場合においては２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以上のヌクレオチドの置換によって認識されるポリヌクレオチド標的配列中の標的遺伝子とは異なる。例えば、導入遺伝子において、１つ以上のコドンは、同じアミノ酸をコードする代替コドンを有するミルトロンによって認識される標的配列中のコドンと比較して置換され得る。理想的には、「稀少」コドンは回避される。導入遺伝子は、ガイド鎖が変異体遺伝子内のいかなる配列も補完しないため、ミルトロンによるノックダウンの標的とはならない。
【0031】
いくつかの場合において、本発明によれば、導入遺伝子は、機能的ロドプシンをコードするが、配列番号１７～２３から選択されるいずれか１つのポリヌクレオチド配列に相補的な配列を含まない、または配列番号１７～２３から選択される２つ以上のポリヌクレオチド配列のいずれかの特定の組み合わせを含まない、または配列番号３～９から選択されるいずれか１つのポリヌクレオチド配列を含まない、または配列番号３～９から選択される２つ以上のポリヌクレオチド配列のいずれかの特定の組み合わせを含まない変異体ロドプシン遺伝子である。いくつかの場合において、ロドプシン導入遺伝子は、配列番号２４のポリヌクレオチド配列および／または配列番号２５のポリヌクレオチド配列を含む。
【0032】
複数のミルトロンを含むベクター
本発明者らは、両方ともロドプシンを発現するための同じ導入遺伝子の５’ＵＴＲからの、単一のベクターにおける２つの独立して機能的なミルトロンの送達の成功を実証した。
本発明者らは、両方ともロドプシンを発現するための同じ導入遺伝子の５’ＵＴＲからの、単一のベクターにおける２つの独立して機能的なミルトロンの送達の成功を実証した。
【0033】
同じベクターに複数の機能的ミルトロンを有すること、または同じ導入遺伝子に埋め込むことが望ましい場合がある理由はいくつかある。第１に、本発明者らは、同じベクターから発現された複数のミルトロンの標的遺伝子ノックダウンに対する効果が相加的であることを実証した。ミルトロンガイド鎖は、標的遺伝子内の同じまたは異なる配列を認識し得る。それにより、複数のミルトロンを使用すると、標的遺伝子に対するノックダウン効果が増大またはより強固になり得る。
【0034】
第２に、同じ標的遺伝子内の異なる配列を認識する複数のミルトロンを含めることにより、処置を必要とする対象において発現される標的遺伝子の任意の部分における突然変異によって引き起こされる疾患を処置するためにベクターを使用できることを確実にすることができる。例えばロドプシン遺伝子には有意な突然変異不均一性が存在するため、戦略としての標的化抑制のみでは普遍的に成功する可能性は低い。しかしながら、遺伝子治療ベクターに２つ以上のミルトロンが含まれる場合、そのベクターは、ミルトロンの１つの標的配列内に突然変異を偶然有する対象においてさえ、標的遺伝子の発現をノックダウンするのに少なくとも部分的に有効である可能性が高い。
【0035】
第３に、同じベクターを使用して複数の標的遺伝子の発現をノックダウンするために、複数のミルトロンを使用することができる。これは、いくつかの異なる遺伝子が関与する複雑な疾患の治療に特に有用である可能性が高い。
【0036】
第４に、例えばミルトロンの相対的効力を比較するために、実験目的で単一のベクターに複数のミルトロンを含めることが有用となり得る。
【0037】
したがって、本発明によるいくつかの場合において、プラスミドまたはベクターは、同じミルトロンの２つ以上のコピー、または同じ標的配列を補完する２つ以上のミルトロン、または同じもしくは２つ以上の異なる標的遺伝子内の異なる標的配列を補完する２つ以上の異なるミルトロンを含み得る。
【0038】
いくつかの場合において、２つ以上のミルトロンはそれぞれ、ミルトロンとの同時発現のために導入遺伝子の５’ＵＴＲに埋め込まれ得る。１つ以上の、またはそれぞれのミルトロンは、上記のＥＳＥを含むポリヌクレオチド配列に隣接していてもよい。
【0039】
いくつかの場合において、プラスミドまたはベクターは、配列番号１７～２３から選択される１つ以上のガイド鎖ポリヌクレオチド配列を有する２つ以上のミルトロン、または配列番号３～９から選択される１つ以上の標的ポリヌクレオチド配列を補完するガイド鎖を有する２つ以上のミルトロン、または配列番号１０～１６から選択される１つ以上のポリヌクレオチド配列を有する２つ以上のミルトロンを含む。標的遺伝子はロドプシンであってもよい。
【0040】
いくつかの場合において、プラスミドまたはベクターは、配列番号１９のポリヌクレオチド配列を含むかもしくはそれからなるガイド鎖ポリヌクレオチド配列を有するミルトロン、および配列番号２１のポリヌクレオチド配列を含むかもしくはそれからなるガイド鎖ポリヌクレオチド配列を有するミルトロンを；または配列番号５のポリヌクレオチド配列を含むかもしくはそれからなるポリヌクレオチド配列を補完するガイド鎖を有するミルトロン、および配列番号７のポリヌクレオチド配列を含むかもしくはそれからなるポリヌクレオチド配列を補完するガイド鎖を有するミルトロンを；または配列番号１２のポリヌクレオチド配列を有するミルトロン、および配列番号１４のポリヌクレオチド配列を有するミルトロンを含む。
【0041】
いくつかの場合において、プラスミドまたはベクターは、配列番号２６のポリヌクレオチド、または配列番号２６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９５％もしくは９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むが、ただし、その配列は上記で定義したようなミルトロンまたはガイド鎖および／またはＥＳＥモチーフを含むことを条件とする。いくつかの場合において、プラスミドまたはベクターは、配列番号２７のポリヌクレオチド配列、または配列番号２７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９５％もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含むか、またはそれらからなる５’ＵＴＲを有する導入遺伝子を含むが、ただし、その配列はミルトロンまたはガイド鎖および／またはＥＳＥモチーフまたは配列番号２６の配列を含むことを条件とする。いくつかの場合において、プラスミドまたはベクターは、配列番号２８から選択されるポリヌクレオチド配列、または、ＷＰＲＥ配列（配列番号２９）が欠失されている、および／もしくは配列番号１４のミルトロン（ミルトロンＭ５Ｈ）が配列番号４９を含むミルトロン（ミルトロンＭ５Ｍ）によって置き換えられている、配列番号２８の変異体を含む。いくつかの場合において、プラスミドまたはベクターは、配列番号３１のポリヌクレオチド配列、または、ＷＰＲＥ配列（配列番号２９）が欠失されている、および／もしくは配列番号１４のミルトロン（ミルトロンＭ５Ｈ）が配列番号４９を含むミルトロン（ミルトロンＭ５Ｍ）によって置き換えられている、配列番号３１の変異体を含むか、またはそれらからなる。
【0042】
ベクター
いくつかの実施形態において、本発明は、プラスミド、ベクター、または遺伝子治療ベクターに関する。遺伝子治療ベクターは、遺伝子治療での使用に適した任意のベクター、すなわち、患者の網膜の標的細胞、例えば光受容細胞または網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞への核酸ポリマーの治療的送達に適した任意のベクターである。ベクターは任意の種類のものであってもよく、例えばプラスミドベクターまたはミニサークルＤＮＡであってもよい。典型的には、ベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターは、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、またはアデノウイルスに由来し得る。
いくつかの実施形態において、本発明は、プラスミド、ベクター、または遺伝子治療ベクターに関する。遺伝子治療ベクターは、遺伝子治療での使用に適した任意のベクター、すなわち、患者の網膜の標的細胞、例えば光受容細胞または網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞への核酸ポリマーの治療的送達に適した任意のベクターである。ベクターは任意の種類のものであってもよく、例えばプラスミドベクターまたはミニサークルＤＮＡであってもよい。典型的には、ベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターは、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、またはアデノウイルスに由来し得る。
【0043】
ＡＡＶ由来ベクター
ベクターは、ＡＡＶゲノムまたはその誘導体を含み得る。ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶウイルス粒子の産生に必要な機能をコードするポリヌクレオチド配列である。これらの機能には、ＡＡＶゲノムのＡＡＶウイルス粒子へのカプシド化を含む、宿主細胞におけるＡＡＶの複製およびパッケージングのサイクルで作動するものが含まれる。天然に存在するＡＡＶウイルスは複製欠損であり、複製およびパッケージングサイクルの完了のためにトランスでのヘルパー機能の提供に依存する。したがって、本発明のベクターのＡＡＶゲノムは、典型的には複製欠損である。
ベクターは、ＡＡＶゲノムまたはその誘導体を含み得る。ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶウイルス粒子の産生に必要な機能をコードするポリヌクレオチド配列である。これらの機能には、ＡＡＶゲノムのＡＡＶウイルス粒子へのカプシド化を含む、宿主細胞におけるＡＡＶの複製およびパッケージングのサイクルで作動するものが含まれる。天然に存在するＡＡＶウイルスは複製欠損であり、複製およびパッケージングサイクルの完了のためにトランスでのヘルパー機能の提供に依存する。したがって、本発明のベクターのＡＡＶゲノムは、典型的には複製欠損である。
【0044】
ＡＡＶゲノムは、一本鎖形態、正もしくは負のいずれかのセンス、または二本鎖形態であってもよい。二本鎖形態の使用は、標的細胞におけるＤＮＡ複製ステップのバイパスを可能にし、したがって導入遺伝子発現を加速することができる。
【0045】
典型的には、天然由来ＡＡＶのＡＡＶゲノムは、少なくとも１つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。ＩＴＲ配列は、シスで機能的な複製起点を提供するように作用し、細胞のゲノムからのベクターの組み込みおよび切除を可能にする。ＡＡＶゲノムはまた、ＡＡＶウイルス粒子のパッケージング機能をコードするｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子等のパッケージング遺伝子を含み得る。ｒｅｐ遺伝子は、タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０またはそれらの変異体の１つ以上をコードする。ｃａｐ遺伝子は、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３等の１つ以上のカプシドタンパク質またはその変異体をコードする。これらのタンパク質は、ＡＡＶウイルス粒子のカプシドを構成する。カプシド変異体を以下で考察する。
【0046】
プロモーターは、各パッケージング遺伝子に作動可能に連結され得る。そのようなプロモーターの具体例としては、ｐ５、ｐ１９およびｐ４０プロモーターが挙げられる（Ｌａｕｇｈｌｉｎら、１９７９、ＰＮＡＳ、７６：５５６７～５５７１）。例えば、ｐ５およびｐ１９プロモーターは、一般にｒｅｐ遺伝子を発現するために使用され、ｐ４０プロモーターは、一般にｃａｐ遺伝子を発現するために使用される。
【0047】
ＡＡＶゲノムは、任意の天然由来の血清型またはＡＡＶの単離物またはクレードに由来し得る。したがって、ＡＡＶゲノムは、天然に存在するＡＡＶウイルスの全ゲノムであり得る。当業者に知られているように、自然界で発生するＡＡＶウイルスは、様々な生物系に従って分類され得る。
【0048】
一般に、ＡＡＶウイルスは、それらの血清型に関して言及される。血清型は、カプシド表面抗原の発現のプロファイルのために、他の変異亜種と区別するために使用することができる特有の反応性を有するＡＡＶの変異亜種に対応する。典型的には、特定のＡＡＶ血清型を有するウイルスは、任意の他のＡＡＶ血清型に特異的な中和抗体と効率的に交差反応しない。ＡＡＶ血清型には、霊長類の脳から同定されたＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびＡＡＶ１１、また組換え血清型、例えばＲｅｃ２およびＲｅｃ３も含まれる。本発明における使用のためのＡＡＶのゲノム血清型は、例えばＡＡＶ２であってもよい。ＡＡＶ血清型の総説は、Ｃｈｏｉら（Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００５；５（３）；２９９－３１０）およびＷｕら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．２００６；１４（３）、３１６－３２７）に見出すことができる。
【0049】
本発明における使用のためのＩＴＲ配列、ｒｅｐまたはｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶゲノムの配列またはＡＡＶゲノムの要素の配列は、ＡＡＶ全ゲノム配列についての以下のアクセッション番号に由来し得る：アデノ随伴ウイルス１ ＮＣ＿００２０７７、ＡＦ０６３４９７；アデノ随伴ウイルス２ ＮＣ＿００１４０１；アデノ随伴ウイルス３ ＮＣ＿００１７２９；アデノ随伴ウイルス３Ｂ ＮＣ＿００１８６３；アデノ随伴ウイルス４ ＮＣ＿００１８２９；アデノ随伴ウイルス５ Ｙ１８０６５、ＡＦ０８５７１６；アデノ随伴ウイルス６ ＮＣ＿００１８６２；鳥類ＡＡＶ ＡＴＣＣ ＶＲ－８６５ ＡＹ１８６１９８、ＡＹ６２９５８３、ＮＣ＿００４８２８；鳥類ＡＡＶ株ＤＡ－１ ＮＣ＿００６２６３、ＡＹ６２９５８３；ウシＡＡＶ ＮＣ＿００５８８９、ＡＹ３８８６１７。
【0050】
ＡＡＶウイルスは、クレードまたはクローンの観点からも言及され得る。これは、天然由来のＡＡＶウイルスの系統的関係を指し、典型的には、共通の祖先に遡ることができ、そのすべての子孫を含むＡＡＶウイルスの系統的群を指す。さらに、ＡＡＶウイルスは、特定の分離株、すなわち自然界で見出される特定のＡＡＶウイルスの遺伝的分離株に関して言及され得る。遺伝的分離株という用語は、他の天然に存在するＡＡＶウイルスとの限られた遺伝子混合を受けたＡＡＶウイルスの集団を表し、それによって遺伝的レベルで認識可能に異なる集団を定義する。
【0051】
本発明で使用され得るＡＡＶのクレードおよび分離株の例には、以下が含まれる：
クレードＡ：ＡＡＶ１ ＮＣ＿００２０７７、ＡＦ０６３４９７、ＡＡＶ６ ＮＣ＿００１８６２、Ｈｕ．４８ ＡＹ５３０６１１、Ｈｕ ４３ ＡＹ５３０６０６、Ｈｕ ４４ ＡＹ５３０６０７、Ｈｕ ４６ ＡＹ５３０６０９
クレードＢ：Ｈｕ．１９ ＡＹ５３０５８４、Ｈｕ．２０ ＡＹ５３０５８６、Ｈｕ ２３ ＡＹ５３０５８９、Ｈｕ２２ ＡＹ５３０５８８、Ｈｕ２４ ＡＹ５３０５９０、Ｈｕ２１ ＡＹ５３０５８７、Ｈｕ２７ ＡＹ５３０５９２、Ｈｕ２８ ＡＹ５３０５９３、Ｈｕ ２９ ＡＹ５３０５９４、Ｈｕ６３ ＡＹ５３０６２４、Ｈｕ６４ ＡＹ５３０６２５、Ｈｕ１３ ＡＹ５３０５７８、Ｈｕ５６ ＡＹ５３０６１８、Ｈｕ５７ ＡＹ５３０６１９、Ｈｕ４９ ＡＹ５３０６１２、Ｈｕ５８ ＡＹ５３０６２０、Ｈｕ３４ ＡＹ５３０５９８、Ｈｕ３５ ＡＹ５３０５９９、ＡＡＶ２ ＮＣ＿００１４０１、Ｈｕ４５ ＡＹ５３０６０８、Ｈｕ４７ ＡＹ５３０６１０、Ｈｕ５１ ＡＹ５３０６１３、Ｈｕ５２ ＡＹ５３０６１４、Ｈｕ Ｔ４１ ＡＹ６９５３７８、Ｈｕ Ｓ１７ ＡＹ６９５３７６、Ｈｕ Ｔ８８ ＡＹ６９５３７５、Ｈｕ Ｔ７１ ＡＹ６９５３７４、Ｈｕ Ｔ７０ ＡＹ６９５３７３、Ｈｕ Ｔ４０ ＡＹ６９５３７２、Ｈｕ Ｔ３２ ＡＹ６９５３７１、Ｈｕ Ｔ１７ ＡＹ６９５３７０、Ｈｕ ＬＧ１５ ＡＹ６９５３７７、
クレードＣ：Ｈｕ９ ＡＹ５３０６２９、Ｈｕ１０ ＡＹ５３０５７６、Ｈｕ１１ ＡＹ５３０５７７、Ｈｕ５３ ＡＹ５３０６１５、Ｈｕ５５ ＡＹ５３０６１７、Ｈｕ５４ ＡＹ５３０６１６、Ｈｕ７ ＡＹ５３０６２８、Ｈｕ１８ ＡＹ５３０５８３、Ｈｕ１５ ＡＹ５３０５８０、Ｈｕ１６ ＡＹ５３０５８１、Ｈｕ２５ ＡＹ５３０５９１、Ｈｕ６０ ＡＹ５３０６２２、Ｃｈ５ ＡＹ２４３０２１、Ｈｕ３ ＡＹ５３０５９５、Ｈｕ１ ＡＹ５３０５７５、Ｈｕ４ ＡＹ５３０６０２ Ｈｕ２、ＡＹ５３０５８５、Ｈｕ６１ ＡＹ５３０６２３
クレードＤ：Ｒｈ６２ ＡＹ５３０５７３、Ｒｈ４８ ＡＹ５３０５６１、Ｒｈ５４ ＡＹ５３０５６７、Ｒｈ５５ ＡＹ５３０５６８、Ｃｙ２ ＡＹ２４３０２０、ＡＡＶ７ ＡＦ５１３８５１、Ｒｈ３５ ＡＹ２４３０００、Ｒｈ３７ ＡＹ２４２９９８、Ｒｈ３６ ＡＹ２４２９９９、Ｃｙ６ ＡＹ２４３０１６、Ｃｙ４ ＡＹ２４３０１８、Ｃｙ３ ＡＹ２４３０１９、Ｃｙ５ ＡＹ２４３０１７、Ｒｈ１３ ＡＹ２４３０１３
クレードＥ：Ｒｈ３８ ＡＹ５３０５５８、Ｈｕ６６ ＡＹ５３０６２６、Ｈｕ４２ ＡＹ５３０６０５、Ｈｕ６７ ＡＹ５３０６２７、Ｈｕ４０ ＡＹ５３０６０３、Ｈｕ４１ ＡＹ５３０６０４、Ｈｕ３７ ＡＹ５３０６００、Ｒｈ４０ ＡＹ５３０５５９、Ｒｈ２ ＡＹ２４３００７、Ｂｂ１ ＡＹ２４３０２３、Ｂｂ２ ＡＹ２４３０２２、Ｒｈ１０ ＡＹ２４３０１５、Ｈｕ１７ ＡＹ５３０５８２、Ｈｕ６ ＡＹ５３０６２１、Ｒｈ２５ ＡＹ５３０５５７、Ｐｉ２ ＡＹ５３０５５４、Ｐｉ１ ＡＹ５３０５５３、Ｐｉ３ ＡＹ５３０５５５、Ｒｈ５７ ＡＹ５３０５６９、Ｒｈ５０ ＡＹ５３０５６３、Ｒｈ４９ ＡＹ５３０５６２、Ｈｕ３９ ＡＹ５３０６０１、Ｒｈ５８ ＡＹ５３０５７０、Ｒｈ６１ ＡＹ５３０５７２、Ｒｈ５２ ＡＹ５３０５６５、Ｒｈ５３ ＡＹ５３０５６６、Ｒｈ５１ ＡＹ５３０５６４、Ｒｈ６４ ＡＹ５３０５７４、Ｒｈ４３ ＡＹ５３０５６０、ＡＡＶ８ ＡＦ５１３８５２、Ｒｈ８ ＡＹ２４２９９７、Ｒｈ１ ＡＹ５３０５５６
クレードＦ：Ｈｕ１４（ＡＡＶ９）ＡＹ５３０５７９、Ｈｕ３１ ＡＹ５３０５９６、Ｈｕ３２ ＡＹ５３０５９７、クローナル分離株ＡＡＶ５ Ｙ１８０６５、ＡＦ０８５７１６、ＡＡＶ ３ ＮＣ＿００１７２９、ＡＡＶ ３Ｂ ＮＣ＿００１８６３、ＡＡＶ４ ＮＣ＿００１８２９、Ｒｈ３４ ＡＹ２４３００１、Ｒｈ３３ ＡＹ２４３００２、Ｒｈ３２ ＡＹ２４３００３／
クレードＡ：ＡＡＶ１ ＮＣ＿００２０７７、ＡＦ０６３４９７、ＡＡＶ６ ＮＣ＿００１８６２、Ｈｕ．４８ ＡＹ５３０６１１、Ｈｕ ４３ ＡＹ５３０６０６、Ｈｕ ４４ ＡＹ５３０６０７、Ｈｕ ４６ ＡＹ５３０６０９
クレードＢ：Ｈｕ．１９ ＡＹ５３０５８４、Ｈｕ．２０ ＡＹ５３０５８６、Ｈｕ ２３ ＡＹ５３０５８９、Ｈｕ２２ ＡＹ５３０５８８、Ｈｕ２４ ＡＹ５３０５９０、Ｈｕ２１ ＡＹ５３０５８７、Ｈｕ２７ ＡＹ５３０５９２、Ｈｕ２８ ＡＹ５３０５９３、Ｈｕ ２９ ＡＹ５３０５９４、Ｈｕ６３ ＡＹ５３０６２４、Ｈｕ６４ ＡＹ５３０６２５、Ｈｕ１３ ＡＹ５３０５７８、Ｈｕ５６ ＡＹ５３０６１８、Ｈｕ５７ ＡＹ５３０６１９、Ｈｕ４９ ＡＹ５３０６１２、Ｈｕ５８ ＡＹ５３０６２０、Ｈｕ３４ ＡＹ５３０５９８、Ｈｕ３５ ＡＹ５３０５９９、ＡＡＶ２ ＮＣ＿００１４０１、Ｈｕ４５ ＡＹ５３０６０８、Ｈｕ４７ ＡＹ５３０６１０、Ｈｕ５１ ＡＹ５３０６１３、Ｈｕ５２ ＡＹ５３０６１４、Ｈｕ Ｔ４１ ＡＹ６９５３７８、Ｈｕ Ｓ１７ ＡＹ６９５３７６、Ｈｕ Ｔ８８ ＡＹ６９５３７５、Ｈｕ Ｔ７１ ＡＹ６９５３７４、Ｈｕ Ｔ７０ ＡＹ６９５３７３、Ｈｕ Ｔ４０ ＡＹ６９５３７２、Ｈｕ Ｔ３２ ＡＹ６９５３７１、Ｈｕ Ｔ１７ ＡＹ６９５３７０、Ｈｕ ＬＧ１５ ＡＹ６９５３７７、
クレードＣ：Ｈｕ９ ＡＹ５３０６２９、Ｈｕ１０ ＡＹ５３０５７６、Ｈｕ１１ ＡＹ５３０５７７、Ｈｕ５３ ＡＹ５３０６１５、Ｈｕ５５ ＡＹ５３０６１７、Ｈｕ５４ ＡＹ５３０６１６、Ｈｕ７ ＡＹ５３０６２８、Ｈｕ１８ ＡＹ５３０５８３、Ｈｕ１５ ＡＹ５３０５８０、Ｈｕ１６ ＡＹ５３０５８１、Ｈｕ２５ ＡＹ５３０５９１、Ｈｕ６０ ＡＹ５３０６２２、Ｃｈ５ ＡＹ２４３０２１、Ｈｕ３ ＡＹ５３０５９５、Ｈｕ１ ＡＹ５３０５７５、Ｈｕ４ ＡＹ５３０６０２ Ｈｕ２、ＡＹ５３０５８５、Ｈｕ６１ ＡＹ５３０６２３
クレードＤ：Ｒｈ６２ ＡＹ５３０５７３、Ｒｈ４８ ＡＹ５３０５６１、Ｒｈ５４ ＡＹ５３０５６７、Ｒｈ５５ ＡＹ５３０５６８、Ｃｙ２ ＡＹ２４３０２０、ＡＡＶ７ ＡＦ５１３８５１、Ｒｈ３５ ＡＹ２４３０００、Ｒｈ３７ ＡＹ２４２９９８、Ｒｈ３６ ＡＹ２４２９９９、Ｃｙ６ ＡＹ２４３０１６、Ｃｙ４ ＡＹ２４３０１８、Ｃｙ３ ＡＹ２４３０１９、Ｃｙ５ ＡＹ２４３０１７、Ｒｈ１３ ＡＹ２４３０１３
クレードＥ：Ｒｈ３８ ＡＹ５３０５５８、Ｈｕ６６ ＡＹ５３０６２６、Ｈｕ４２ ＡＹ５３０６０５、Ｈｕ６７ ＡＹ５３０６２７、Ｈｕ４０ ＡＹ５３０６０３、Ｈｕ４１ ＡＹ５３０６０４、Ｈｕ３７ ＡＹ５３０６００、Ｒｈ４０ ＡＹ５３０５５９、Ｒｈ２ ＡＹ２４３００７、Ｂｂ１ ＡＹ２４３０２３、Ｂｂ２ ＡＹ２４３０２２、Ｒｈ１０ ＡＹ２４３０１５、Ｈｕ１７ ＡＹ５３０５８２、Ｈｕ６ ＡＹ５３０６２１、Ｒｈ２５ ＡＹ５３０５５７、Ｐｉ２ ＡＹ５３０５５４、Ｐｉ１ ＡＹ５３０５５３、Ｐｉ３ ＡＹ５３０５５５、Ｒｈ５７ ＡＹ５３０５６９、Ｒｈ５０ ＡＹ５３０５６３、Ｒｈ４９ ＡＹ５３０５６２、Ｈｕ３９ ＡＹ５３０６０１、Ｒｈ５８ ＡＹ５３０５７０、Ｒｈ６１ ＡＹ５３０５７２、Ｒｈ５２ ＡＹ５３０５６５、Ｒｈ５３ ＡＹ５３０５６６、Ｒｈ５１ ＡＹ５３０５６４、Ｒｈ６４ ＡＹ５３０５７４、Ｒｈ４３ ＡＹ５３０５６０、ＡＡＶ８ ＡＦ５１３８５２、Ｒｈ８ ＡＹ２４２９９７、Ｒｈ１ ＡＹ５３０５５６
クレードＦ：Ｈｕ１４（ＡＡＶ９）ＡＹ５３０５７９、Ｈｕ３１ ＡＹ５３０５９６、Ｈｕ３２ ＡＹ５３０５９７、クローナル分離株ＡＡＶ５ Ｙ１８０６５、ＡＦ０８５７１６、ＡＡＶ ３ ＮＣ＿００１７２９、ＡＡＶ ３Ｂ ＮＣ＿００１８６３、ＡＡＶ４ ＮＣ＿００１８２９、Ｒｈ３４ ＡＹ２４３００１、Ｒｈ３３ ＡＹ２４３００２、Ｒｈ３２ ＡＹ２４３００３／
【0052】
当業者は、その共通の一般知識に基づいて、本発明で使用するためのＡＡＶの適切な血清型、クレード、クローンまたは分離株を選択することができる。しかしながら、本発明は、まだ同定または特徴付けられていない可能性がある他の血清型のＡＡＶゲノムの使用も包含することを理解されたい。
【0053】
本発明で使用されるＡＡＶゲノムは、天然に存在するＡＡＶウイルスの全ゲノムであってもよい。しかしながら、そのようなベクターは原則として患者に投与され得るが、これは実際にはまれにしか行われない。代わりに、患者への投与を目的としてＡＡＶゲノムが誘導体化され得る。そのような誘導体化は当技術分野で標準的であり、本発明は、ＡＡＶゲノムの任意の公知の誘導体、および当技術分野で公知の技術を適用することによって生成され得る誘導体の使用を包含する。ＡＡＶゲノムおよびＡＡＶカプシドの誘導体化（後述）は、ＣｏｕｒａおよびＮａｒｄｉ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ、２００７、４：９９）、ならびに上記のＣｈｏｉらおよびＷｕらに概説されている。
【0054】
ＡＡＶゲノムの誘導体には、本発明に従ってインビボでベクターからミルトロンの発現を可能にする任意の切断型または改変型のＡＡＶゲノムが含まれる。典型的には、最小のウイルス配列を含むが上記機能を保持するようにＡＡＶゲノムを有意に短縮することが可能である。このようにしてＡＡＶゲノムのサイズを低減することにより、ベクター内に１つまたは複数の導入遺伝子およびミルトロンまたは調節エレメント等の他の配列エレメントを組み込む際の柔軟性を高めることが可能になる。それはまた、宿主細胞ゲノムへのベクターの組み込みの可能性を低減し、野生型ウイルスとのベクターの組換えのリスクを低減し、標的細胞におけるウイルス遺伝子タンパク質に対する細胞免疫応答の誘発を回避し得る。
【0055】
典型的には、誘導体は、少なくとも１つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）または２つ以上のＩＴＲを含む。ＩＴＲの１つまたは複数は、異なる血清型を有するＡＡＶゲノムに由来してもよく、またはキメラもしくは変異ＩＴＲであってもよい。例示的な変異ＩＴＲは、ｔｒｓ（末端解離部位）の欠失を有するものである。この欠失は、ゲノムの継続的な複製を可能にして、コード配列および相補配列の両方を含む一本鎖ゲノム、すなわち自己相補的ＡＡＶゲノムを生成する。これは、標的細胞におけるＤＮＡ複製のバイパスを可能にし、したがって、導入遺伝子発現の加速を可能にする。
【0056】
１つ以上のＩＴＲは、いずれかの末端においてミルトロンおよび／または導入遺伝子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に隣接し得る。１つ以上のＩＴＲの包含は、例えば、宿主細胞ＤＮＡポリメラーゼの作用による一本鎖ベクターＤＮＡの二本鎖ＤＮＡへの変換後の、宿主細胞の核における本発明のベクターのコンカテマー形成を補助し得る。そのようなエピソーマルコンカテマーの形成は、宿主細胞の寿命の間にベクターコンストラクトを保護し、それによってインビボでの導入遺伝子の長期発現を可能にする。ＩＴＲ配列は、例えば、配列番号３２および３３の配列またはその変異体を有するＡＡＶ２の配列であってもよい。
【0057】
いくつかの実施形態では、ＩＴＲ要素は、誘導体中の天然ＡＡＶゲノムから保持された配列のみであってもよい。そのような誘導体は、天然ゲノムまたは天然ゲノムの任意の他の配列のｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子を含まない。
【0058】
したがって、本発明の誘導体では、以下の部分を除去することができる：１つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、複製（ｒｅｐ）およびカプシド（ｃａｐ）遺伝子。しかしながら、いくつかの実施形態において、誘導体は、ＡＡＶゲノムの１つ以上のｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子または他のウイルス配列をさらに含み得る。天然に存在するＡＡＶウイルスは、ヒト１９番染色体上の特定の部位で高い頻度で組み込まれ、無視できる頻度のランダムな組み込みを示し、その結果、ベクターにおける組み込み能力の保持は、治療状況において許容され得る。
【0059】
誘導体は、キメラ、シャッフルまたはカプシド改変誘導体であってもよい。キメラ、シャッフルまたはカプシド改変された誘導体は、典型的には、ウイルスベクターに１つ以上の所望の官能基を提供するように選択される。したがって、これらの誘導体は、天然に存在するＡＡＶゲノム、例えばＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９を含むＡＡＶウイルスベクターと比較して、遺伝子送達の効率の増加、免疫原性の減少（体液性もしくは細胞性）、指向性範囲の変化および／または特定の細胞型の標的化の改善を示し得る。遺伝子送達の効率の増加は、細胞表面での受容体または共受容体結合の改善、内在化の改善、細胞内および核内への輸送の改善、ウイルス粒子の脱殻の改善、ならびに一本鎖ゲノムから二本鎖形態への変換の改善によって達成され得る。効率の向上はまた、ベクター用量が必要とされない組織への投与によって希釈されないように、特定の細胞集団の指向性範囲または標的化の変化に関連し得る。
【0060】
本発明はさらに、天然ＡＡＶゲノムの配列とは異なる順序および構成のＡＡＶゲノムの配列の提供を包含する。本発明はまた、１つ以上のＡＡＶ配列または遺伝子を別のウイルス由来の配列または２つ以上のウイルス由来の配列で構成されるキメラ遺伝子で置き換えることを包含する。そのようなキメラ遺伝子は、異なるウイルス種の２つ以上の関連ウイルスタンパク質由来の配列で構成され得る。
【0061】
ＡＡＶカプシドコート
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムまたはその誘導体を含むベクターは、カプシドコートを有してもよい。そのようなカプシド化ベクターは、ＡＡＶウイルス粒子と呼ばれることがある。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムまたはその誘導体を含むベクターは、カプシドコートを有してもよい。そのようなカプシド化ベクターは、ＡＡＶウイルス粒子と呼ばれることがある。
【0062】
本発明のＡＡＶベクターまたは粒子は、１つの血清型、例えばＡＡＶ２のＩＴＲを有するＡＡＶゲノムまたは誘導体が異なる血清型、例えばＡＡＶ８のカプシドにパッケージングされている、トランスカプシド化形態を含む。本発明のＡＡＶベクターまたは粒子はまた、２つ以上の異なる血清型に由来する未改変カプシドタンパク質の混合物がウイルスコートを構成するモザイク形態も含む。コートはまた、改変カプシドタンパク質または変異体を含んでもよい。本発明は、同じベクターまたはＡＶＶウイルス粒子内のＡＡＶの異なる血清型、クレード、クローンまたは単離体からのカプシドタンパク質配列の提供、すなわちシュードタイピングを包含する。
【0063】
ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶウイルスの感染の組織特異性（または指向性）を決定し得る。したがって、本発明における使用のためのＡＡＶカプシド血清型は、標的細胞、例えば網膜の光受容細胞またはＲＰＥ細胞、例えばＡＡＶ８の感染に対する天然の指向性または高い感染効率を有するものであってもよい。さらに、カプシドタンパク質の１つまたは複数は、キメラカプシドタンパク質、シャッフルされたカプシドタンパク質、または改変された変異カプシドタンパク質等のカプシドタンパク質の変異体であってもよい。
【0064】
キメラカプシドタンパク質には、天然に存在するＡＡＶ血清型の２つ以上のカプシドコード配列間の組換えによって生成されるものが含まれる。これは、例えば、１つの血清型の非感染性カプシド配列を異なる血清型のカプシド配列と同時トランスフェクトし、指向性選択を使用して所望の特性を有するカプシド配列を選択するマーカーレスキュー手法によって行うことができる。異なる血清型のカプシド配列は、新規キメラカプシドタンパク質を産生するための細胞内の相同組換えによって変更することができる。
【0065】
キメラカプシドタンパク質には、２つ以上のカプシドタンパク質の間、例えば異なる血清型の２つ以上のカプシドタンパク質の間に特定のカプシドタンパク質ドメイン、表面ループまたは特定のアミノ酸残基を移入するようにカプシドタンパク質配列を操作することによって生成されるものも含まれる。
【0066】
シャッフルされたカプシドタンパク質またはキメラカプシドタンパク質はまた、ＤＮＡシャッフルまたはエラープローンＰＣＲによって生成され得る。ハイブリッドＡＡＶキャプシド遺伝子は、関連するＡＡＶ遺伝子、例えば複数の異なる血清型のキャプシドタンパク質をコードするものの配列をランダムに断片化し、次いでその後、自己プライミングポリメラーゼ反応で断片を再構築することによって作製することができ、これは配列相同性の領域で交差を引き起こす可能性もある。いくつかの血清型のカプシド遺伝子をシャッフルすることによってこのようにして作製されたハイブリッドＡＡＶ遺伝子のライブラリをスクリーニングして、所望の機能性を有するウイルスクローンを同定することができる。同様に、エラープローンＰＣＲを使用して、ＡＡＶカプシド遺伝子をランダムに突然変異させ、所望の特性について選択され得る変異体の多様なライブラリを作製することができる。
【0067】
カプシド遺伝子の配列はまた、天然の野生型配列に対して特異的な欠失、置換または挿入を導入するように遺伝子改変され得る。特に、カプシド遺伝子は、カプシドコード配列のオープンリーディングフレーム内、またはカプシドコード配列のＮ末端および／もしくはＣ末端に、無関係のタンパク質またはペプチドの配列を挿入することによって改変され得る。
【0068】
無関係のタンパク質またはペプチドは、有利には、特定の細胞型に対するリガンドとして作用するものであってもよい。それにより、標的細胞への改善された結合が付与され得るか、または特定の標的細胞集団、例えば網膜の光受容細胞もしくはＲＰＥ細胞に対するベクターの標的化もしくは標的化の特異性が改善され得る。代替として、無関係のタンパク質は、産生プロセス、すなわちエピトープまたは親和性タグの一部としてウイルス粒子の精製を補助するものであってもよい。挿入部位は、典型的には、ウイルス粒子の他の機能、例えばウイルス粒子の内在化、輸送を妨げないように選択される。当業者は、共通した一般知識に基づいて挿入に適した部位を特定することができる。特定の部位は、上記のＣｈｏｉらに開示されている。ＡＡＶベクターまたは粒子はまた、カプシド表面に吸着されたリガンドを有する化学修飾形態を含む。例えば、そのようなリガンドは、特定の細胞表面受容体を標的化するための抗体を含み得る。
【0069】
ＡＡＶ由来ベクターに関する説明の関連するセクションは、以下でさらに説明するような他の供給源から誘導されたベクターの場合にも適用される。
【0070】
レトロウイルス由来ベクター
ベクターは、レトロウイルスゲノムまたはその誘導体を含み得る。レトロウイルスゲノムの誘導体には、本発明に従うインビボでのベクターからのミルトロンの発現を可能にする任意の切断型または改変型のレトロウイルスゲノムが含まれる。
ベクターは、レトロウイルスゲノムまたはその誘導体を含み得る。レトロウイルスゲノムの誘導体には、本発明に従うインビボでのベクターからのミルトロンの発現を可能にする任意の切断型または改変型のレトロウイルスゲノムが含まれる。
【0071】
ＡＡＶ由来ベクターと同様に、レトロウイルス由来ベクターは、典型的には、パッケージングおよびその後の宿主への組み込みに必要な最小限のウイルス配列を含むレトロウイルスゲノムの誘導体を含む。レトロウイルス由来ベクターの場合、１つ以上の長い末端反復配列（ＬＴＲ）が、永続的な導入遺伝子発現をもたらすためのベクターの複製およびパッケージング、ならびにその後の標的細胞への組み込みに必要な最小要素である。しかしながら、他の要素もまた存在してもよい。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来ベクターは、典型的には、宿主細胞ゲノムへの組み込みに必要なＨＩＶ ５’ＬＴＲ、ウイルスＲＮＡのビリオンへのパッケージングに必要なＰｓｉシグナル、導入遺伝子のプロモーター、および３’ＬＴＲを含む。他の適切なレトロウイルスベクターは、例えば、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、およびそれらの組み合わせに由来し得る。
【0072】
レトロウイルス由来ベクターの指向性は、ウイルスエンベロープタンパク質によって決定される。適切な細胞、例えば網膜の光受容細胞またはＲＰＥ細胞の標的化は、標的細胞のリガンドをウイルスエンベロープに組み込むことによって強化され得る。
【0073】
アデノウイルス由来ベクター
ベクターは、アデノウイルスゲノムまたはその誘導体を含み得る。アデノウイルスゲノムの誘導体には、本発明に従うインビボでのベクターからのミルトロンの発現を可能にする任意の切断型または改変型のアデノウイルスゲノムが含まれる。
ベクターは、アデノウイルスゲノムまたはその誘導体を含み得る。アデノウイルスゲノムの誘導体には、本発明に従うインビボでのベクターからのミルトロンの発現を可能にする任意の切断型または改変型のアデノウイルスゲノムが含まれる。
【0074】
多数のヒトアデノウイルス血清型が同定されており、それらは核酸比較、繊維タンパク質特性、および生物学的特性に基づいて６つの亜属（Ａ～Ｆ）に分類される。例えば、Ａ群は血清型１２および３１を含み、Ｂ群は血清型３および７を含み、Ｃ群は血清型２および５を含み、Ｄ群は血清型８および３０を含み、Ｅ群は血清型４を含み、Ｆ群は血清型４０および４１を含む。
【0075】
アデノウイルスビリオンのコアは、線状二本鎖ＤＮＡゲノムならびに関連タンパク質Ｖ、ＶＩＩ、Ｘ（ｍｕ）、ＩＶａ２および末端タンパク質（ＴＰ）を含有する。異なるアデノウイルスのゲノム構成は保存されており、ゲノムの末端が最初に転写される（前初期遺伝子Ｅ１およびＥ４は直鎖状ゲノムの両端に位置する）タイミング機能を有することが提案されている。Ｅ１およびＥ４の初期転写は、ゲノムの中央領域の開口をもたらし、中央領域の転写を可能にする。
【0076】
アデノウイルスゲノムは、典型的には、８つのＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写単位、すなわち、５つの初期単位、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ－Ｅ２Ｂ、Ｅ３およびＥ４；ならびに２つの遅延早期単位ＩＸおよびＩＶａ２；ならびに主要後期転写単位を含む。主要後期転写単位は、選択的スプライシング部位の使用に基づいてＬ１～Ｌ５領域にさらに細分化される。転写単位は、類似の機能のタンパク質を発現することが多い。例えば、Ｅ１Ａ単位は、細胞感染時の転写の活性化およびＳ期の誘導に関与する２つのタンパク質をコードし、Ｅ１Ｂ転写単位は、細胞アポトーシスを阻害する２つのタンパク質をコードし、Ｅ３転写単位は、免疫応答の回避に関与し、主要後期転写単位は、カプシドの構築に必要な構造タンパク質をコードする。
【0077】
異種ミルトロンおよび／または導入遺伝子配列は、例えば、初期転写単位ならびにヘキソン、ペントンおよび繊維等の様々な構造タンパク質のコード領域において、アデノウイルスゲノムに挿入され得る。複製欠損アデノウイルスベクターを作製するために、アデノウイルスゲノム（例えばＥ１領域において）に欠失が形成されてもいてもよく、これは一般にヒト対象への投与にとってより安全であると考えられている。
【0078】
本発明において、アデノウイルスは、導入遺伝子を標的細胞に送達するのに適した任意のアデノウイルスまたは誘導体であってもよい。アデノウイルスは、任意の血清型であってもよいが、典型的にはＡｄ５またはＡｄ２である。本発明のアデノウイルス由来ベクターは、任意のアデノウイルス血清型のゲノムの全部または一部、ならびにそれらの組み合わせ（すなわちハイブリッドゲノム）を含み得る。
【0079】
本発明において使用されるアデノウイルスベクターは、複製不能または複製可能のいずれかであってもよい。そのようなベクターは周知である。例えば、複製不能ベクターでは、Ｅ１領域を欠失させ、異種導入遺伝子の発現を駆動する外因性プロモーターを有する発現カセットで置き換えてもよい。通常、Ｅ３領域もまた削除される。Ｅ３の欠失は、Ｅ１領域へのより大きな挿入を可能にする。そのようなベクターは、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂタンパク質を保持および発現するＨＥＫ２９３細胞等の適切な細胞株で増殖させることができる。他のベクターもまたＥ４領域を欠き、いくつかのベクターはさらにＥ２領域を欠く。Ｅ２およびＥ４ベクターは、Ｅ１、Ｅ４およびＥ２欠失を補完する細胞株上で増殖させなければならない。
【0080】
ベクターはまた、ほとんどまたはすべてのアデノウイルス遺伝子を欠くが、逆方向末端反復配列ならびにゲノムがパッケージングされ複製されるために必要とされるパッケージング配列等のシス作用配列を保持するヘルパー依存性ベクターであってもよい。これらのベクターは、ベクターストックから排除されなければならないヘルパーアデノウイルスの存在下で増殖される。この場合もやはり、そのようなシステムは当技術分野において周知である。
【0081】
カプシドは、７つの構造タンパク質：ＩＩ（ヘキソン）、ＩＩＩ（ペントン）、ＩＩＩａ、ＩＶ（繊維）、ＶＩ、ＶＩＩ、およびＩＸで構成される。カプシドは２５２個のカプソメアを含み、そのうちの２４０個はヘキソンカプソメアであり、１２個はペントンカプソメアである。ヘキソンカプソメアは、ヘキソンタンパク質の三量体であり、カプシドのタンパク質の約７５％を構成する。ペントンカプソメアは、ペントンタンパク質の五量体であり、ビリオンの１２個の頂点のそれぞれに位置する。各ペントンカプソマーは、６つの隣接するヘキサンカプソマーおよび繊維に結合している。繊維は、通常、繊維タンパク質の三量体であり、ペントンカプソマーから突出している。ヘキソンタンパク質、およびより少ない程度ではあるが繊維タンパク質は、アデノウイルスの主要な抗原決定基を含み、また血清型特異性を決定する。
【0082】
アデノウイルス由来ベクターは、ミルトロンおよび／または導入遺伝子の一過性発現が好ましい場合、本発明における使用に特に適している。
【0083】
単純ヘルペスウイルス由来ベクター
ベクターは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ゲノムまたはその誘導体を含み得る。ＨＳＶゲノムの誘導体には、本発明に従ってインビボでベクターからミルトロンの発現を可能にする任意の切断型または改変型のＨＳＶゲノムが含まれる。
ベクターは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ゲノムまたはその誘導体を含み得る。ＨＳＶゲノムの誘導体には、本発明に従ってインビボでベクターからミルトロンの発現を可能にする任意の切断型または改変型のＨＳＶゲノムが含まれる。
【0084】
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、ヒト末梢感覚ニューロンの生涯潜伏感染を自然に確立する。組換えＨＳＶベクターは、複製できないように遺伝子改変されているが、インビトロおよびインビボでニューロンにおいて潜在的様状態を確立する。
【0085】
プロモーターおよび他の調節エレメント
プラスミドまたはベクターにおいて、ミルトロンおよび／または導入遺伝子をコードする核酸は、典型的にはプロモーターに作動可能に連結される。当技術分野で周知の任意の適切なプロモーターが使用され得る。プロモーターは、構成的であってもよく、すなわち、任意の宿主細胞バックグラウンドにおいて作動可能であってもよい。プロモーターは、例えば、遍在性ＣＡＧプロモーターであってもよい。代替として、プロモーターは、特定の標的細胞型の発現を駆動する細胞特異的プロモーターであってもよい。例えば、いくつかの実施形態では、標的細胞は網膜の桿体光受容細胞である。いくつかの場合において、プロモーターは、配列番号３４の配列を有し得るヒトロドプシンプロモーター、またはその機能的変異体であってもよい。これにより、ロドプシンの発現をノックダウンするためのミルトロンおよび／または置換ロドプシン遺伝子等のウイルス送達遺伝子産物が、桿体光受容体細胞においてのみ発現されることが保証される。
プラスミドまたはベクターにおいて、ミルトロンおよび／または導入遺伝子をコードする核酸は、典型的にはプロモーターに作動可能に連結される。当技術分野で周知の任意の適切なプロモーターが使用され得る。プロモーターは、構成的であってもよく、すなわち、任意の宿主細胞バックグラウンドにおいて作動可能であってもよい。プロモーターは、例えば、遍在性ＣＡＧプロモーターであってもよい。代替として、プロモーターは、特定の標的細胞型の発現を駆動する細胞特異的プロモーターであってもよい。例えば、いくつかの実施形態では、標的細胞は網膜の桿体光受容細胞である。いくつかの場合において、プロモーターは、配列番号３４の配列を有し得るヒトロドプシンプロモーター、またはその機能的変異体であってもよい。これにより、ロドプシンの発現をノックダウンするためのミルトロンおよび／または置換ロドプシン遺伝子等のウイルス送達遺伝子産物が、桿体光受容体細胞においてのみ発現されることが保証される。
【0086】
１つ以上の他の調節エレメント、例えばエンハンサー、調節後エレメントおよびポリアデニル化部位もまた、プロモーターに加えて存在し得る。導入遺伝子および／またはミルトロンに作動可能に連結された調節配列は、例えば転写、プロセシング、ｍＲＮＡの核外輸送または安定性を促進または調節することによって、導入遺伝子の発現を促進または制御する任意の配列である。「作動可能に連結された」という用語は、記載された成分が意図された方法で機能することを可能にする関係にある並置を指す。ミルトロンまたは導入遺伝子に「作動可能に連結された」制御配列（例えばプロモーター）は、ミルトロンまたは導入遺伝子の発現が制御配列と適合する条件下で達成されるように連結される。
【0087】
ベクターの調製
本発明のベクターは、遺伝子治療のためのベクターを提供するための当技術分野で公知の標準的な手段によって調製され得る。したがって、十分に確立されたパブリックドメインのトランスフェクション、パッケージングおよび精製方法を使用して、適切なベクターを調製することができる。
本発明のベクターは、遺伝子治療のためのベクターを提供するための当技術分野で公知の標準的な手段によって調製され得る。したがって、十分に確立されたパブリックドメインのトランスフェクション、パッケージングおよび精製方法を使用して、適切なベクターを調製することができる。
【0088】
遺伝子治療に使用されるウイルスベクターは、典型的には、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージングする細胞株を作製することによって生成される。ベクターは、典型的には、上記に例示したように、パッケージングおよびその後の宿主への組み込みに必要な最小限のウイルス配列を含み、他のウイルス配列は欠失され、ミルトロンまたは導入遺伝子等のポリヌクレオチドを発現させるための発現カセットの能力を残す。欠損したウイルス機能は、典型的には、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。
【0089】
パッケージング細胞は、典型的には、宿主細胞に感染することができるウイルス粒子を形成するために使用される。パッケージング細胞は、当技術分野で公知の任意の適切な細胞型であり得る。パッケージング細胞は、典型的には、ヒト細胞またはヒト由来細胞である。適切な細胞には、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞またはＨＥＫ２９３由来細胞クローン（例えばアデノウイルス由来ベクターをパッケージングするため）、ＨｅＬａ細胞（例えばＨＩＶまたは他のレンチウイルス由来ベクターをパッケージングするため）、およびψ２細胞またはＰＡ３１７細胞（例えばレトロウイルス由来ベクターをパッケージングするため）が含まれる。
【0090】
本発明のＡＡＶ由来ベクターは、ミルトロンまたは導入遺伝子等の遺伝子治療のための要素に加えて、天然に存在するＡＡＶウイルスの全ゲノムを含み得る。しかしながら、一般に、誘導体化ゲノム、例えば、少なくとも１つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を有するが、ｒｅｐまたはｃａｐ等のＡＡＶ遺伝子を欠いていてもよい誘導体が使用される。
【0091】
そのような実施形態において、誘導体化ゲノムのＡＡＶウイルス粒子へのアセンブリを提供するために、ＡＡＶおよび／またはヘルパーウイルス機能を提供する追加の遺伝子コンストラクトが、誘導体化ゲノムと組み合わせて宿主細胞に提供される。これらのさらなるコンストラクトは、典型的には、構造的なＡＡＶカプシドタンパク質（すなわちｃａｐ、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）をコードする遺伝子、およびｒｅｐ等のＡＡＶの生活環に必要とされる他の機能をコードする遺伝子を含有する。追加のコンストラクト上に提供される構造的カプシドタンパク質の選択は、パッケージングされたウイルスベクターの血清型を決定する。
【0092】
ＡＡＶウイルスは複製不能であるため、典型的には、ヘルパーウイルス機能、好ましくはアデノウイルスヘルパー機能もまた、ＡＡＶ複製を可能にするために１つ以上の追加のコンストラクト上に提供される。
【0093】
追加のコンストラクトは、宿主細胞中のプラスミドもしくは他のエピソームエレメントとして提供されてもよく、または代替として１つ以上のコンストラクトが宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。
【0094】
ミルトロン挿入
ミルトロンを発現するためのプラスミドまたはベクターを設計および／またはクローニングする場合、通常、ミルトロンからのスプライシングの効率および精度を最大化することが有益である。プラスミド、ベクターまたは導入遺伝子にミルトロンを挿入する場所を選択する場合、以下を考慮することができる。
ミルトロンを発現するためのプラスミドまたはベクターを設計および／またはクローニングする場合、通常、ミルトロンからのスプライシングの効率および精度を最大化することが有益である。プラスミド、ベクターまたは導入遺伝子にミルトロンを挿入する場所を選択する場合、以下を考慮することができる。
【0095】
スプライシングを容易にするために、エキソンスプライスエンハンサーモチーフ（ＥＳＥ）が豊富な位置を選択することが有益である。ＥＳＥについては以下でさらに論じる。５’エクソンの末端の「ＭＡＧ」（「Ｍ」＝「Ａ」または「Ｃ」）モチーフおよび３’エクソンの始めの「Ｇ」は、通常、イントロンが認識されるために必要である（ならびにイントロン／ミルトロン自体の中のスプライスドナーおよびアクセプターモチーフ）。したがって、適切な挿入部位は、ミルトロンとの同時発現のための導入遺伝子の５’ＵＴＲ等の関連配列のＥＳＥリッチ領域内の「ＭＡＧＧ」モチーフを検索することによって識別することができる。
【0096】
ミルトロンは、適切な制限酵素、またはオーバーラップ伸長ＰＣＲ等の当技術分野で公知の他の適切な代替アプローチを使用して、選択された部位にクローニングされ得る。特に有利なのは、配列の適切な領域内のＢｓｔＢ１制限部位を特定することである。配列「ＴＴＣＧＡＡＧ」を提供するために、ＢｓｔＢ１制限部位の後に「Ｇ」残基が続くことが好ましい。最後の３つの塩基「ＡＡＧ」は、「ＭＡＧ」モチーフを提供する。スプライスドナーモチーフ「ＧＴ」で始まるミルトロンは、すぐ下流に挿入される。
【0097】
レポーター遺伝子ＣＤＳをＢｓｔＢ１で切断することによって作製されたものを補完する適切な「粘着末端」を有するミルトロンは、例えば、５’および３’末端に配列オーバーハングを有する相補的オリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって作製することができる。フォワードオリゴヌクレオチドは、所望のミルトロンの配列と比較して５’の「ＣＧＡＡＧ」モチーフを有し、それに対応して３’末端の「ＣＧＡＡＧ」モチーフを省略する。これは、挿入されるとミルトロンの３’末端にあるように設計された「ＡＧ」スプライスアクセプターモチーフを含む。逆オリゴヌクレオチドは、所望のミルトロンの逆相補体と比較して５’末端の「ＣＴＴ」モチーフを省略し、それに対応して３’末端に追加の「ＣＴＴ」を含む。このアプローチをとることにより、ミルトロンがスプライシングされたときに遺伝子（例えばレポーター遺伝子）が再形成されるように、ＢｓｔＢ１制限部位にミルトロンを挿入することができる。
【0098】
他の適切な制限酵素を使用して、同様のアプローチを原則として適用することができる。適切な制限酵素はまた、新規位置、例えば導入遺伝子の５’ＵＴＲ、レシピエントプラスミドまたはベクターへの移入のために、ドナープラスミドまたはベクターからミルトロンを含む遺伝子の適切な断片を切除するために使用され得る。他の場合では、断片は、例えばＰＣＲ増幅によって増幅され得る。代替として、当技術分野で周知の任意の他の適切なクローニング方法が使用されてもよい。
【0099】
５’ＵＴＲおよびエキソンスプライスエンハンサー（ＥＳＥ）
エキソンスプライスエンハンサー（ＥＳＥ）は、イントロンからの正確で効率的なスプライシングを誘導または増強することができることが当技術分野で公知のエクソン内のある特定の６塩基ＤＮＡ配列モチーフである。当技術分野では、ミルトロンからの効率的なスプライシングを促進するためにＥＳＥが豊富な導入遺伝子のコード領域内のミルトロンの挿入部位を選択することが提案されている。
エキソンスプライスエンハンサー（ＥＳＥ）は、イントロンからの正確で効率的なスプライシングを誘導または増強することができることが当技術分野で公知のエクソン内のある特定の６塩基ＤＮＡ配列モチーフである。当技術分野では、ミルトロンからの効率的なスプライシングを促進するためにＥＳＥが豊富な導入遺伝子のコード領域内のミルトロンの挿入部位を選択することが提案されている。
【0100】
本発明によれば、ミルトロンと共発現するために、導入遺伝子の５’ＵＴＲ内にミルトロンを配置することが有利である。本発明者らは、導入遺伝子開始コドンの上流にミルトロンを配置することによって、導入遺伝子の発現は、そのミルトロンがＣＤＳに位置する場合よりも妨害されないはずであると推論した。導入遺伝子ＣＤＳが中断されないため、突然変異タンパク質産生のリスクはない（代替開始コドンとして作用し得るＡＴＧモチーフが５’ＵＴＲに導入されないことを条件とする）。５’ＵＴＲにおけるミルトロンの位置はまた、ミルトロンが３’ＵＴＲに位置する場合に起こり得るトランスジェニック転写物のナンセンス媒介性分解を増加させないはずである。
【0101】
さらに、本発明者らは、５’ＵＴＲにミルトロンを配置することによって、以前に提案されたようにＣＤＳ中に天然に生じるＥＳＥ、または導入遺伝子の発現を妨害することなくＣＤＳ中に代替コドンを使用して操作することができる可能性があるＥＳＥに頼る必要がなくなることを認識した。代わりに、以下に記載されるような追加のＥＳＥを５’ＵＴＲに導入して、効率的なミルトロンスプライシングを促進または維持することができる。導入遺伝子の５’ＵＴＲは、ミルトロンと、１つ以上のＥＳＥを含み、５’ＵＴＲの非改変連続配列の一部ではない１つ以上の追加または外因性配列との両方の挿入によって改変され得る。しかしながら、追加のまたは外因性の配列は、典型的には、代替的な翻訳開始部位として作用し得るいかなる「ＡＴＧ」モチーフも含まない。
【0102】
追加の配列は、改変５’ＵＴＲ内のミルトロンの上流および／または下流であってもよい。５’ＵＴＲおよび／またはさらなる配列もしくは外因性配列は、（少なくとも）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれを超えるＥＳＥを含み得る。１つ以上のＥＳＥは、完全に、スプライスドナーモチーフの６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、８０または１００ヌクレオチド５’またはミルトロンのスプライスアクセプターモチーフの３’内にあってもよい。ＥＳＥは、ＲＥＳＣＵＥ－ＥＳＥオンラインツール（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｓ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｂｕｒｇｅｌａｂ／ｒｅｓｃｕｅ－ｅｓｅ／）を使用して識別することができる。ＥＳＥは、表１の配列のいずれか１つを有し得る。
【0103】
【表1】
【0104】
場合によっては、本発明によれば、１つまたは複数のミルトロンは、ミルトロンとの同時発現のために導入遺伝子の５’ＵＴＲに位置し、ｅＧＦＰ（増強された緑色蛍光タンパク質）レポーター遺伝子のＣＤＳの断片によって５’および／または３’末端に隣接し得る。ｅＧＦＰ ＣＤＳは、配列番号３５のポリヌクレオチド配列を有し得るか、またはその変異体、例えば蛍光タンパク質をコードする変異体であってもよい。いくつかの場合において、断片は、配列番号３５と整列させたｅＧＦＰ配列の位置３４６におけるミルトロン末端の５’である。いくつかの場合において、断片はミルトロンの３’であり、配列番号３５と整列させたｅＧＦＰ配列の位置３４７で開始する。断片は、断片の長さにわたって配列番号３５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る。
【0105】
いくつかの場合において、断片は、配列番号３５と整列させたｅＧＦＰ配列中の以下の位置のいずれか、または最初の１、２、３、４、５、６、７もしくは８つすべてに、および／あるいはミルトロンのスプライスドナーモチーフに対して以下の位置にＥＳＥを含む：
位置３４０～３４５および／または１ヌクレオチド上流、任意選択でＴＴＣＧＡＡモチーフ；
位置３３４～３３９および／または７ヌクレオチド上流、任意選択でＧＴＣＡＡＧモチーフ；
位置３３０～３３５および／または１１ヌクレオチド上流、任意選択でＴＧＡＡＧＴモチーフ；
位置３２９～３３４および／または１２ヌクレオチド上流、任意選択でＣＴＧＡＡＧモチーフ；
位置３１７～３２２および／または２４ヌクレオチド上流、任意選択でＡＣＡＡＧＡモチーフ；
位置３１６～３２１および／または２５ヌクレオチド上流、任意選択でＴＴＣＧＡＡモチーフ；
位置３１４～３１９および／または２７ヌクレオチド上流、任意選択でＴＴＣＧＡＡモチーフ；
位置３１３～３１８および／または２８ヌクレオチド上流、任意選択でＴＴＣＧＡＡモチーフ。
位置３４０～３４５および／または１ヌクレオチド上流、任意選択でＴＴＣＧＡＡモチーフ；
位置３３４～３３９および／または７ヌクレオチド上流、任意選択でＧＴＣＡＡＧモチーフ；
位置３３０～３３５および／または１１ヌクレオチド上流、任意選択でＴＧＡＡＧＴモチーフ；
位置３２９～３３４および／または１２ヌクレオチド上流、任意選択でＣＴＧＡＡＧモチーフ；
位置３１７～３２２および／または２４ヌクレオチド上流、任意選択でＡＣＡＡＧＡモチーフ；
位置３１６～３２１および／または２５ヌクレオチド上流、任意選択でＴＴＣＧＡＡモチーフ；
位置３１４～３１９および／または２７ヌクレオチド上流、任意選択でＴＴＣＧＡＡモチーフ；
位置３１３～３１８および／または２８ヌクレオチド上流、任意選択でＴＴＣＧＡＡモチーフ。
【0106】
いくつかの場合において、断片は、配列番号３５と整列させたｅＧＦＰ配列中の以下の位置のいずれかまたは最初の１、２、３、４もしくは５つすべてに、および／あるいはミルトロンのスプライスアクセプターモチーフに対して以下の位置にＥＳＥを含む：
位置３７３～３７８および／または２７ヌクレオチド下流、任意選択でＣＴＧＡＡＧモチーフ；
位置３７４～３７９および／または２８ヌクレオチド下流、任意選択でＴＧＡＡＧＧモチーフ；
位置３９１～３９６および／または４６ヌクレオチド下流、任意選択でＡＡＧＧＡＧモチーフ；
位置３２９～３３４および／または４７ヌクレオチド下流、任意選択でＧＡＧＧＡＴモチーフ；
位置３１７～３２２および／または４８ヌクレオチド下流、任意選択でＧＧＡＧＧＡモチーフ。
位置３７３～３７８および／または２７ヌクレオチド下流、任意選択でＣＴＧＡＡＧモチーフ；
位置３７４～３７９および／または２８ヌクレオチド下流、任意選択でＴＧＡＡＧＧモチーフ；
位置３９１～３９６および／または４６ヌクレオチド下流、任意選択でＡＡＧＧＡＧモチーフ；
位置３２９～３３４および／または４７ヌクレオチド下流、任意選択でＧＡＧＧＡＴモチーフ；
位置３１７～３２２および／または４８ヌクレオチド下流、任意選択でＧＧＡＧＧＡモチーフ。
【0107】
いくつかの場合において、ミルトロンは、配列番号３７のポリヌクレオチド配列、または配列番号３７と少なくとも８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる配列に５’末端において隣接する。いくつかの場合において、ミルトロンは、配列番号３８のヌクレオチド配列、または配列番号３８と少なくとも８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含むかまたはそれからなる配列に３’末端において隣接する。
【0108】
いくつかの場合において、ミルトロン、または２つ以上のミルトロン、および任意選択で２つ以上のミルトロン間の任意の介在配列は、配列番号３９のポリヌクレオチド配列と整列させた５’ＵＴＲ配列の位置４２３と４２４との間に埋め込まれる。埋め込まれたミルトロンおよび任意の介在配列を除く５’ＵＴＲ配列は、配列番号３９のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る。５’ＵＴＲにおける任意の２つのミルトロン間の配列は、配列番号４０のポリヌクレオチド配列、または配列番号４０のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を有し得る。配列は、上述の位置に１つ以上のＥＳＥを含むことができる。
【0109】
いくつかの場合において、本発明によれば、標的遺伝子はロドプシンであり、ベクターは配列番号２６のポリヌクレオチド配列、または配列番号２６のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。配列は、本明細書で論じられるミルトロンおよび他の配列要素の任意の適切な組み合わせを含み得る。配列は、配列中のミルトロンとの同時発現のために導入遺伝子の５’ＵＴＲに位置してもよい。
【0110】
導入遺伝子は、例えば本明細書で論じられる変異体ロドプシン遺伝子のいずれか等、ミルトロンによるノックダウンに耐性のロドプシンの「硬化」バージョンをコードし得る。５’ＵＴＲは、配列番号２７の配列、または５’ＵＴＲの完全な配列、もしくは配列番号１２および１４のミルトロンを除く５’ＵＴＲ、もしくは配列番号２６のポリヌクレオチド配列からなる配列の一部を除く５’ＵＴＲにわたって配列番号２７のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、または配列番号３９のポリヌクレオチド配列と整列させた５’ＵＴＲ配列の位置４２３と４２４との間に挿入された少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは９９．５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を有し得る。いくつかの場合において、ベクターは、配列番号３１、６４または６５のいずれか１つのポリヌクレオチド配列を含む。
【0111】
本明細書のいずれかの箇所で言及される相同性または配列同一性は、既知の方法を使用して測定することができる。例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を計算するために使用することができるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（例えばそのデフォルト設定で使用される）（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２、３８７～３９５）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０－３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ，Ｆら（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３－１０に記載のように相同性を計算するために、または配列を並べるために使用され得る（典型的にはそのデフォルト設定で）。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公的に入手可能である。
【0112】
本明細書で使用される「断片」または「レポーター遺伝子のコード領域の断片」という用語は、アミノ酸のストリングまたは参照ポリペプチドと比較して典型的には長さが短く、共通部分にわたって参照ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を指す。本開示によるそのような断片は、適切な場合には、それが構成成分であるより大きなポリペプチドに含まれ得る。本明細書で言及される断片は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４１アミノ酸長から、４１、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００またはそれ以上のアミノ酸長までであってもよい。
【0113】
治療方法および医学的使用
本発明は、網膜疾患を処置するための方法およびそのような方法で使用するためのベクターに関する。この方法は、遺伝子治療の方法であってもよい。「遺伝子治療」という用語は、患者の細胞への核酸ポリマーの治療的送達を意味する。遺伝子治療のいくつかの場合において、対象にとって治療的であるタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子のコピーが、対象の細胞に導入される。細胞に導入するためのそのような遺伝子は、本明細書では導入遺伝子と呼ばれることがある。いくつかの場合において、遺伝子治療は、健常個体では通常発現されるが、対象では喪失または欠損している１つ以上の遺伝子を細胞に導入する。遺伝子治療の他の場合では、核酸ポリマーを導入して、対象における遺伝子の発現をノックダウンする、すなわち遺伝子産物の発現を低減することができる。本発明によれば、遺伝子治療は、網膜の細胞で発現される遺伝子の発現をノックダウンすることができるミルトロンを発現するベクターの投与を含む。ミルトロンによるノックダウンの標的となる遺伝子は、本明細書では内因性遺伝子または標的遺伝子と呼ばれることがある。
本発明は、網膜疾患を処置するための方法およびそのような方法で使用するためのベクターに関する。この方法は、遺伝子治療の方法であってもよい。「遺伝子治療」という用語は、患者の細胞への核酸ポリマーの治療的送達を意味する。遺伝子治療のいくつかの場合において、対象にとって治療的であるタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子のコピーが、対象の細胞に導入される。細胞に導入するためのそのような遺伝子は、本明細書では導入遺伝子と呼ばれることがある。いくつかの場合において、遺伝子治療は、健常個体では通常発現されるが、対象では喪失または欠損している１つ以上の遺伝子を細胞に導入する。遺伝子治療の他の場合では、核酸ポリマーを導入して、対象における遺伝子の発現をノックダウンする、すなわち遺伝子産物の発現を低減することができる。本発明によれば、遺伝子治療は、網膜の細胞で発現される遺伝子の発現をノックダウンすることができるミルトロンを発現するベクターの投与を含む。ミルトロンによるノックダウンの標的となる遺伝子は、本明細書では内因性遺伝子または標的遺伝子と呼ばれることがある。
【0114】
網膜疾患は、網膜の細胞における遺伝子の発現または過剰発現によって引き起こされるかまたはそれによって悪化する任意の疾患、状態または障害であってもよい。いくつかの場合において、疾患は、野生型の健康な遺伝子と比較して、遺伝子の突然変異によって引き起こされ得る。疾患は、対象における遺伝子の２つのコピーのうちの１つにおける突然変異が、対象が疾患に罹患するのに、または疾患が増悪するのに十分であり得る優性遺伝（または常染色体優性）であってもよい。他の場合では、疾患は劣性遺伝性（または常染色体劣性）であってもよく、この場合、対象は、罹患するのに、または疾患が増悪するのに遺伝子の両方のコピーに突然変異を有さなければならない。いくつかの場合において、疾患は、単一の遺伝子における突然変異によって引き起こされるか、または主に引き起こされるもしくは誘発される。他の場合では、本発明は、おそらくは生活様式または環境的要因と組み合わせて、複数の遺伝子が関与し得る複雑な遺伝性疾患を治療するために使用され得る。
【0115】
本発明の方法に従って処置され得る網膜疾患の例としては、網膜色素変性症、常染色体優性シュタルガルト様黄斑ジストロフィー、常染色体優性および常染色体劣性ベスト病、パターンジストロフィー、ドインハニカム型ジストロフィー、常染色体優性ドルーゼン、進行性二焦点性網脈絡膜萎縮、ソルスビー眼底ジストロフィーおよび加齢黄斑変性が挙げられる。いくつかの場合において、網膜疾患は、網膜の光受容細胞または桿体光受容細胞における遺伝子の発現または過剰発現によって引き起こされるかまたはそれによって悪化する疾患、状態または障害である。いくつかの場合において、ミルトロンおよび／または導入遺伝子によるノックダウンの標的となる遺伝子は、ロドプシンである。いくつかの場合において、網膜疾患は、優性または劣性網膜色素変性である。
【0116】
対象は、ヒトまたは非ヒト動物であってもよい。非ヒト動物には、げっ歯類（マウスおよびラットを含む）、ならびにウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリ、両生類、爬虫類等を含む他の一般的な実験動物、家畜および農業動物が含まれるが、これらに限定されない。
【0117】
医薬組成物および投与様式
本発明の１つ以上のベクターは、医薬組成物に製剤化され得る。これらの組成物は、ベクターに加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤または当業者に周知の他の材料を含んでもよい。そのような材料は非毒性であるべきであり、有効成分の有効性を妨げるべきではない。適切な組成物および投与方法の例は、ＥｓｓｅｋｕおよびＡｄｅｙｅｙｅ（２０１１）、ならびにＶａｎｄｅｎ Ｍｏｏｔｅｒ Ｇ．（２００６）に記載されている。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路に従って当業者によって決定され得る。技術およびプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２０版、２０００、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ出版に見出すことができる。
本発明の１つ以上のベクターは、医薬組成物に製剤化され得る。これらの組成物は、ベクターに加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤または当業者に周知の他の材料を含んでもよい。そのような材料は非毒性であるべきであり、有効成分の有効性を妨げるべきではない。適切な組成物および投与方法の例は、ＥｓｓｅｋｕおよびＡｄｅｙｅｙｅ（２０１１）、ならびにＶａｎｄｅｎ Ｍｏｏｔｅｒ Ｇ．（２００６）に記載されている。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路に従って当業者によって決定され得る。技術およびプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２０版、２０００、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ出版に見出すことができる。
【0118】
本発明のベクターは、標的細胞の形質導入を可能にする任意の適切な経路および手段によって投与され得る。標的細胞は、光受容細胞、桿体光受容細胞、またはＲＰＥ細胞等の網膜の細胞である。典型的には、送達は網膜下または硝子体内である。ベクターは、例えば網膜下注射によって、網膜の下に外科的に送達され得る。
【0119】
投与量および投与計画は、組成物の投与を担当する医師の通常の技能の範囲内で決定され得る。本発明のベクターの用量は、様々なパラメータに従って、特に処置される患者の年齢、体重および状態；投与経路；ならびに必要なレジメンに従って決定され得る。医師は、任意の特定の患者に必要な投与経路および投与量を決定することができる。
【0120】
投与は、典型的には「予防有効量」または「治療有効量」（ただし場合によっては予防が治療とみなされ得るが）であり、これは個体への利益を示すのに十分である。例えば、治療有効量の本発明のベクターまたは本発明による有効な処置方法は、ミルトロンの標的遺伝子の発現の低減、および場合によっては網膜の標的細胞における導入遺伝子の発現ももたらし得る。処置は、臨床的応答をもたらす、または個体に臨床的利益を示す、例えば、疾患を治癒する、疾患もしくは状態もしくは１つ以上の症状の発症もしくは進行を予防もしくは遅延させる、１つ以上の症状を改善もしくは緩和する、寛解を誘導もしくは延長する、またはぶり返しもしくは再発を遅延させるのに十分である。いくつかの場合において、処置は、対象の視力を改善するのに十分であり、これはいくつかの場合において対象の視力の経時的な低下の遅延、低減または防止を含み得る。より具体的には、処置は、いくつかの場合において、低照度状態のそのような患者の視力を改善し得る。
【0121】
本発明の１つ以上のベクターの典型的な単回用量は、１０８もしくは１０９～１０１５もしくは１０１４もしくは１０１３もしくは１０１２もしくは１０１０ウイルスゲノム（ｖｇ）、またはその任意の範囲、例えば１０９～１０１３ｖｇであってもよい。範囲の下端の用量は、典型的には網膜への直接投与に使用され、範囲の上端の用量は、典型的には全身投与に必要とされる。
【0122】
一本鎖ＤＮＡ分子を含む単一のＡＡＶカプシドは、単一のウイルスゲノム（ｖｇ）である。ｖｇは、当技術分野で周知の任意の適切な方法、例えばリアルタイムＰＣＲによって定量することができる。１つまたは複数のベクターは、好ましくは１回だけ投与され、使用されるベクターに応じて、標的遺伝子の永続的または一時的なノックダウンをもたらすが、例えばその後数年間および／または異なる血清型による反復投与が考慮され得る。
【0123】
本発明の組成物は、単独で、または他の治療用組成物もしくは処置と組み合わせて投与され得る。
【0124】
例
例１－ロドプシンをインビボで発現させるための導入遺伝子カセットの設計
ＡＡＶ２／８Ｙ７３３Ｆベクターを発現する４つのヒトロドプシンを設計し、製造した（図１）。４つすべてが、ヒトロドプシンプロモーター（ＲＨＯｐ；配列番号３４）の下流にヒトロドプシンｃＤＮＡ配列（ＲＨＯ；配列番号１）を含有していた：
１．ＡＡＶ－ｓｓＲＨＯ（ＡＡＶ２／８Ｙ７３３Ｆ．ＲＨＯｐ．ＲＨＯ）：ヒトロドプシンプロモーターの制御下でヒトロドプシンＣＤＳを含有する一本鎖ＡＡＶゲノム。
２．ＡＡＶ－ＷＰＲＥ（ＡＡＶ２／８Ｙ７３３Ｆ．ＲＨＯｐ．ＲＨＯ．ＷＰＲＥ）：ＡＡＶ－ｓｓＲＨＯに関してであるが、３’ウッドチャック肝炎転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）配列（配列番号２９）が追加されている。この配列は、マウスおよびヒトにおける網膜遺伝子治療後の導入遺伝子発現を改善することが示されている（Ｐａｔｒｉｃｉｏら（２０１７）、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ６：１９８－２０８）。
３．ＡＡＶ－Ｅｘ／Ｉｎｔ（ＡＡＶ２／８Ｙ７３３Ｆ．ＲＨＯｐ．Ｅｘ／Ｉｎｔ．ＲＨＯ．ＷＰＲＥ）：ＡＡＶ－ＷＰＲＥに関してであるが、ニワトリベータ－アクチン遺伝子の第１のエクソンおよびイントロンが、ＲＨＯｐ配列とＫｏｚａｋコンセンサスとの間に位置するウサギベータ－グロビン遺伝子由来のスプライスアクセプターと共に追加されている。
４．ＡＡＶ－ｓｃＲＨＯ（ｓｃＡＡＶ２／８Ｙ７３３Ｆ．ＲＨＯｐ．ＲＨＯ）：ＡＡＶ－ｓｓＲＨＯの自己相補的（ｓｃ）バージョン。自己相補的ベクターは、ＡＡＶ形質導入のプロセスにおいて律速であると考えられるステップである細胞内第２鎖合成を迂回するため、ベクター効率の増加をもたらす。ｓｃベクターの１つの主な欠点は、それらの一本鎖（ｓｓ）対応物の事実上半分のパッケージング能力を有することである。このベクターは能力に非常に近いため、自己相補性は、上記のベクター２および３に含まれる追加のエレメントの代替でなければならない。
例１－ロドプシンをインビボで発現させるための導入遺伝子カセットの設計
ＡＡＶ２／８Ｙ７３３Ｆベクターを発現する４つのヒトロドプシンを設計し、製造した（図１）。４つすべてが、ヒトロドプシンプロモーター（ＲＨＯｐ；配列番号３４）の下流にヒトロドプシンｃＤＮＡ配列（ＲＨＯ；配列番号１）を含有していた：
１．ＡＡＶ－ｓｓＲＨＯ（ＡＡＶ２／８Ｙ７３３Ｆ．ＲＨＯｐ．ＲＨＯ）：ヒトロドプシンプロモーターの制御下でヒトロドプシンＣＤＳを含有する一本鎖ＡＡＶゲノム。
２．ＡＡＶ－ＷＰＲＥ（ＡＡＶ２／８Ｙ７３３Ｆ．ＲＨＯｐ．ＲＨＯ．ＷＰＲＥ）：ＡＡＶ－ｓｓＲＨＯに関してであるが、３’ウッドチャック肝炎転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）配列（配列番号２９）が追加されている。この配列は、マウスおよびヒトにおける網膜遺伝子治療後の導入遺伝子発現を改善することが示されている（Ｐａｔｒｉｃｉｏら（２０１７）、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ６：１９８－２０８）。
３．ＡＡＶ－Ｅｘ／Ｉｎｔ（ＡＡＶ２／８Ｙ７３３Ｆ．ＲＨＯｐ．Ｅｘ／Ｉｎｔ．ＲＨＯ．ＷＰＲＥ）：ＡＡＶ－ＷＰＲＥに関してであるが、ニワトリベータ－アクチン遺伝子の第１のエクソンおよびイントロンが、ＲＨＯｐ配列とＫｏｚａｋコンセンサスとの間に位置するウサギベータ－グロビン遺伝子由来のスプライスアクセプターと共に追加されている。
４．ＡＡＶ－ｓｃＲＨＯ（ｓｃＡＡＶ２／８Ｙ７３３Ｆ．ＲＨＯｐ．ＲＨＯ）：ＡＡＶ－ｓｓＲＨＯの自己相補的（ｓｃ）バージョン。自己相補的ベクターは、ＡＡＶ形質導入のプロセスにおいて律速であると考えられるステップである細胞内第２鎖合成を迂回するため、ベクター効率の増加をもたらす。ｓｃベクターの１つの主な欠点は、それらの一本鎖（ｓｓ）対応物の事実上半分のパッケージング能力を有することである。このベクターは能力に非常に近いため、自己相補性は、上記のベクター２および３に含まれる追加のエレメントの代替でなければならない。
【0125】
例２－ロドプシン発現カセットのエクスビボ検証
４つのウイルスを、出生後日（ＰＮＤ）３のＮｒｌ．ＧＦＰ／Ｒｈｏ－／－マウスからの解離網膜細胞を使用してエクスビボで検証した。これらの動物は、ロドプシンにホモ接合ヌル突然変異を有し、神経網膜ロイシンジッパー（Ｎｒｌ）プロモーター下でＧＦＰを発現する。したがって、桿体細胞は蛍光標識された緑色であり、天然ロドプシンを発現しない。４つすべてのウイルスによる形質導入およびＲＨＯタンパク質の免疫蛍光染色後に、ロドプシン発現のレスキューが認められた（図２Ａ）。ＲＮＡはまた、解離した形質導入ＰＮＤ３網膜細胞から抽出し、ｃＤＮＡに変換した。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析は、他の３つのウイルスで形質導入されたものと比較して、ＡＡＶ－ｓｃＲＨＯ形質導入細胞のロドプシン転写物の数の４倍の増加を明らかにした（図２Ｂ）。
４つのウイルスを、出生後日（ＰＮＤ）３のＮｒｌ．ＧＦＰ／Ｒｈｏ－／－マウスからの解離網膜細胞を使用してエクスビボで検証した。これらの動物は、ロドプシンにホモ接合ヌル突然変異を有し、神経網膜ロイシンジッパー（Ｎｒｌ）プロモーター下でＧＦＰを発現する。したがって、桿体細胞は蛍光標識された緑色であり、天然ロドプシンを発現しない。４つすべてのウイルスによる形質導入およびＲＨＯタンパク質の免疫蛍光染色後に、ロドプシン発現のレスキューが認められた（図２Ａ）。ＲＮＡはまた、解離した形質導入ＰＮＤ３網膜細胞から抽出し、ｃＤＮＡに変換した。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析は、他の３つのウイルスで形質導入されたものと比較して、ＡＡＶ－ｓｃＲＨＯ形質導入細胞のロドプシン転写物の数の４倍の増加を明らかにした（図２Ｂ）。
【0126】
例３－ロドプシン発現カセットのインビボ検証
続いて、４つのベクターのインビボ比較を行った。１．５μｌ中の各ウイルスの２×１０９ゲノムコピー（ｇｃ）の網膜下注射をＮｒｌ．ＧＦＰ／Ｒｈｏ－／－マウスで行った。４週間後、生存マウスをスペクトル領域光干渉断層法（ＳＤ－ＯＣＴ）に供し、そこから平均光受容体層（ＰＲＬ）の厚さを計算した。次いで、マウスを屠殺し、眼を摘出した。いくつかは免疫組織化学のために固定、包埋および切片化し、他のいくつかはロドプシンタンパク質レベルのウエスタンブロット分析のために処理した。図３Ａは、ロドプシンについて染色されたそのようなマウスからの網膜凍結切片を示す。４つすべてのウイルスは、マウス網膜におけるヒトロドプシンタンパク質発現を駆動することができた。形質導入された桿体は、形質導入されていない眼には存在しなかったロドプシンが充填された外側セグメントを生成した。ロドプシン発現は、野生型状態を模倣し、プロモーター特異性を確定するこの層に限定された。ロドプシン発現は、ＡＡＶ－Ｅｘ／Ｉｎｔ注射眼およびＡＡＶ－ｓｃＲＨＯ注射眼において最も大きく現れた。注射動物からのＳＤ－ＯＣＴ画像の分析により、これらの２つのベクターが最大平均光受容体層（ＰＲＬ）厚さをもたらすことが確認された（ＡＡＶ－ＲＨＯおよびＡＡＶ－ＷＰＲＥに対する各々についてｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡホルム－シダック多重比較検定；図３Ｂ）。同様に、これらの２つのベクターは、ウエスタンブロットバンドデンシトメトリーによって測定されるように、ロドプシンタンパク質発現の最大レベルをもたらした（図４）。
続いて、４つのベクターのインビボ比較を行った。１．５μｌ中の各ウイルスの２×１０９ゲノムコピー（ｇｃ）の網膜下注射をＮｒｌ．ＧＦＰ／Ｒｈｏ－／－マウスで行った。４週間後、生存マウスをスペクトル領域光干渉断層法（ＳＤ－ＯＣＴ）に供し、そこから平均光受容体層（ＰＲＬ）の厚さを計算した。次いで、マウスを屠殺し、眼を摘出した。いくつかは免疫組織化学のために固定、包埋および切片化し、他のいくつかはロドプシンタンパク質レベルのウエスタンブロット分析のために処理した。図３Ａは、ロドプシンについて染色されたそのようなマウスからの網膜凍結切片を示す。４つすべてのウイルスは、マウス網膜におけるヒトロドプシンタンパク質発現を駆動することができた。形質導入された桿体は、形質導入されていない眼には存在しなかったロドプシンが充填された外側セグメントを生成した。ロドプシン発現は、野生型状態を模倣し、プロモーター特異性を確定するこの層に限定された。ロドプシン発現は、ＡＡＶ－Ｅｘ／Ｉｎｔ注射眼およびＡＡＶ－ｓｃＲＨＯ注射眼において最も大きく現れた。注射動物からのＳＤ－ＯＣＴ画像の分析により、これらの２つのベクターが最大平均光受容体層（ＰＲＬ）厚さをもたらすことが確認された（ＡＡＶ－ＲＨＯおよびＡＡＶ－ＷＰＲＥに対する各々についてｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡホルム－シダック多重比較検定；図３Ｂ）。同様に、これらの２つのベクターは、ウエスタンブロットバンドデンシトメトリーによって測定されるように、ロドプシンタンパク質発現の最大レベルをもたらした（図４）。
【0127】
まとめると、上記のデータは、ＷＰＲＥおよびニワトリベータ－アクチン／ウサギベータ－グロビンエクソン－イントロン－エクソン配列の付加により、自己相補的ベクターに関連するものと同様のレベルの桿体特異的導入遺伝子発現が達成され得ることを示唆している。最適化された一本鎖コンストラクトの利点は、ｍｉＲＮＡ抑制エレメント（例えばミルトロン）のさらなる包含を可能にするように、さらなるパッケージング能力が維持されることである。
【0128】
例４－ロドプシン単独の過剰発現は網膜変性を低減しない
次に、ロドプシンのみの過剰発現が、ロドプシン優性網膜炎色素変性のマウスモデルにおける変性表現型をレスキューするのに十分であるかどうかを確立することが重要であった。Ｐ２３Ｈロドプシンノックインマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をこれおよびその後のベクター試験のために使用したが、これは、これが利用可能な最も生物学的に関連するマウスモデルを表すためである。ホモ接合ＲｈｏＰ２３Ｈ／Ｐ２３Ｈマウスをホモ接合Ｎｒｌ．ＧＦＰマウスと交配し、両方の対立遺伝子についてヘテロ接合性の子孫を作製した。これらのマウス（経時的に変性するＧＦＰで標識された桿体を有する）を、すべてのさらなる試験に使用したが、これらは以降で単に「Ｐ２３Ｈ」マウスと呼ばれる。
次に、ロドプシンのみの過剰発現が、ロドプシン優性網膜炎色素変性のマウスモデルにおける変性表現型をレスキューするのに十分であるかどうかを確立することが重要であった。Ｐ２３Ｈロドプシンノックインマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をこれおよびその後のベクター試験のために使用したが、これは、これが利用可能な最も生物学的に関連するマウスモデルを表すためである。ホモ接合ＲｈｏＰ２３Ｈ／Ｐ２３Ｈマウスをホモ接合Ｎｒｌ．ＧＦＰマウスと交配し、両方の対立遺伝子についてヘテロ接合性の子孫を作製した。これらのマウス（経時的に変性するＧＦＰで標識された桿体を有する）を、すべてのさらなる試験に使用したが、これらは以降で単に「Ｐ２３Ｈ」マウスと呼ばれる。
【0129】
ロドプシン過剰発現が達成可能であるかどうかを試験するために、Ｐ２３Ｈマウスに、上記で開発された２つの最も成功したロドプシン補充ベクター、ＡＡＶ－ｓｃＲＨＯおよびＡＡＶ－Ｅｘ／Ｉｎｔを注射した。１．５μｌ中２×１０９ゲノムコピーの網膜下注射を、３週齢のＰ２３Ｈマウスの右眼に行った（各ベクターについてｎ＝６）。４週間後、網膜を採取し、ウエスタンブロットによるバンドデンシトメトリーによって、注射した右眼と注射していない左眼との間でロドプシン発現を比較した。これは、両方のベクターについて約５０％のロドプシンの過剰発現を示した（図５）。
【0130】
次に、ロドプシン過剰発現単独がＰ２３Ｈマウスの網膜変性を遅らせるのに十分であるかどうかを確立するためのパイロット研究を行った。このように、Ｐ２３Ｈマウスの新たなコホートに、２×１０８ｇｃ（「低用量」）もしくは２×１０９（「中用量」）の用量のＡＡＶ－ｓｃＲＨＯ、または２×１０９（「中用量」）もしくは２×１０１０ｇｃ（「高用量」）の用量のＡＡＶ－Ｅｘ／Ｉｎｔのいずれかを片側注射した。注射から１ヶ月後および３ヶ月後に行われた網膜電図検査は、これらの処置が網膜変性の速度に影響を及ぼさないことを示した（図６）。
【0131】
例５－ロドプシン発現をノックダウンするためのミルトロンの設計
インビボで「ブロックおよび置換」パラダイムの「置換」アームを最適化した後、ロドプシンをノックダウンすることができるコンストラクトを設計および製造するための実験室研究を行った。Ｍ１～Ｍ７、配列番号１０～１６と命名した７つのミルトロンを設計した。各ミルトロンを、ヒトおよび／またはマウスロドプシン遺伝子を標的とするように操作した。
インビボで「ブロックおよび置換」パラダイムの「置換」アームを最適化した後、ロドプシンをノックダウンすることができるコンストラクトを設計および製造するための実験室研究を行った。Ｍ１～Ｍ７、配列番号１０～１６と命名した７つのミルトロンを設計した。各ミルトロンを、ヒトおよび／またはマウスロドプシン遺伝子を標的とするように操作した。
【0132】
相補的オリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって、二本鎖ミルトロンを操作した。フォワードオリゴヌクレオチドは、一般構造５’－Ｐ－ＣＧＡＡＧ－（短縮ミルトロン配列）を有し、式中、Ｐはリン酸基を表し、短縮ミルトロン配列は、７６ｂｐミルトロン設計から３’ＣＧＡＡＧモチーフ（配列番号４１～４７）を引いたものを表す。逆方向オリゴヌクレオチドは、一般構造５’－Ｐ－（短縮逆方向ミルトロン配列）－ＣＴＴを有し、短縮逆方向ミルトロン配列は、７６ｂｐミルトロン配列から５’ＣＴＴモチーフ配列番号４８～５４を引いたものの逆相補体を表す。オリゴヌクレオチドは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＫによって製造され、受領時に１０μＭの濃度に再構成された。１０μｌの順方向溶液および１０μｌの逆方向溶液を完全に混合し、ＰＣＲサーモサイクラー（Ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ、Ｌａｂｎｅｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）を使用して９５℃の温度に加熱した。次いで、効率的なアニーリングを容易にするために、試料を３０分間にわたって室温まで段階的にゆっくり冷却した。
【0133】
得られた二本鎖ミルトロン配列（設計により既にＢｓｔＢ１粘着末端を有していた）を、ＢｓｔＢ１／エビアルカリホスファターゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＵＫ）処理ＣＡＧ．ｅＧＦＰ．ＷＰＲＥプラスミドにそれぞれ個別にライゲーションした（図７）。コンストラクト内のｅＧＦＰコード領域（配列番号３５）のヌクレオチド３４６と３４７との間のミルトロンの正しい配向が、市販のサンガーシーケンシング（Ｓｏｕｒｃｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＫ）によって確認された。
【0134】
例６－正確なミルトロンスプライシングの定量
例５に記載の各プラスミドを、個々にＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。いずれの場合も、スプライシングの失敗はミルトロン部位の下流のＧＦＰ ＣＤＳのフレームシフトをもたらすため、緑色蛍光はミルトロンからの成功した正確なスプライシングを示した。このようにして、各ミルトロン設計の正確なスプライシングの程度をインビトロで容易に確立することができ、定量的蛍光アッセイ（ＧＦＰトランスフェクト細胞溶解物の蛍光プレート読み取り値をＧＦＰトランスフェクト細胞溶解物の蛍光プレート読み取り値に対して正規化）を使用して測定した（図８および図９Ａ）。
例５に記載の各プラスミドを、個々にＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。いずれの場合も、スプライシングの失敗はミルトロン部位の下流のＧＦＰ ＣＤＳのフレームシフトをもたらすため、緑色蛍光はミルトロンからの成功した正確なスプライシングを示した。このようにして、各ミルトロン設計の正確なスプライシングの程度をインビトロで容易に確立することができ、定量的蛍光アッセイ（ＧＦＰトランスフェクト細胞溶解物の蛍光プレート読み取り値をＧＦＰトランスフェクト細胞溶解物の蛍光プレート読み取り値に対して正規化）を使用して測定した（図８および図９Ａ）。
【0135】
例７－ミルトロンスプライス変異体の決定
ＧＦＰ－ミルトロンコンストラクトのスプライス変異体もまた決定した。ＧＦＰ－ミルトロントランスフェクト細胞からのＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写した。隣接ＧＦＰ配列に対する一連のミルトロン貫通プライマーを使用して、スプライシングされた領域を増幅した。得られたＰＣＲ産物を電気泳動によって２％アガロースゲルに流した。得られた各バンドは、異なるスプライス生成物に対応していた。バンドデンシトメトリーによって決定された正確にスプライシングされた生成物の割合は、上記で概説した蛍光スプライスアッセイによって予測されたものに対応していた（図９Ｂおよび図９Ｃ）。
ＧＦＰ－ミルトロンコンストラクトのスプライス変異体もまた決定した。ＧＦＰ－ミルトロントランスフェクト細胞からのＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写した。隣接ＧＦＰ配列に対する一連のミルトロン貫通プライマーを使用して、スプライシングされた領域を増幅した。得られたＰＣＲ産物を電気泳動によって２％アガロースゲルに流した。得られた各バンドは、異なるスプライス生成物に対応していた。バンドデンシトメトリーによって決定された正確にスプライシングされた生成物の割合は、上記で概説した蛍光スプライスアッセイによって予測されたものに対応していた（図９Ｂおよび図９Ｃ）。
【0136】
例８－ミルトロン媒介ノックダウンのインビトロ決定：３’ＵＴＲにおける標的配列
製造業者の説明書に従って、ＰｓｉＣＨＥＣＫ２ベクター系（いずれもＰｒｏｍｅｇａ）と組み合わせたＤｕａｌ Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイを使用して、７つすべてのミルトロンに対するロドプシンノックダウン効率をインビトロで決定した。簡潔には、ＰｓｉＣＨＥＣＫ２プラスミドは、独立してユビキタスプロモーターの制御下にある２つのルシフェラーゼ遺伝子（ウミシイタケおよびホタル）を含む。各ルシフェラーゼは、ルミノメーター（Ｄｕａｌ Ｇｌｏアッセイ）で定量することができる光を生成する反応を順次触媒する（図１０）。ウミシイタケルシフェラーゼは、その終止コドンと、ロドプシンコード配列がクローニングされたポリＡ配列との間に位置する多重クローニング部位を有する。ＨＥＫ２９３細胞をこのベクターおよび各ＧＦＰ－ミルトロンプラスミドで同時トランスフェクトした。有効なミルトロンは、その標的配列を切断し、ウミシイタケルシフェラーゼ転写物を脱アデニル化し、ウミシイタケルミネセンスシグナルを減少させると予想される。しかしながら、ミルトロンは、アッセイにおいて内部トランスフェクション対照として作用するホタルシグナルに影響を及ぼすべきではない。このようにして、ミルトロンのないＧＦＰ対照読み取り値に対して正規化される相対ルシフェラーゼ比（ウミシイタケ：ホタル）により、ミルトロン媒介ノックダウン効率が定量される。７つすべてのミルトロン設計を、ヒトおよびマウスロドプシンの両方についてＰｓｉＣＨＥＣＫ２ベクターに対して試験した。ミルトロンＭ１～４およびＭ６のガイド鎖は、マウスおよびヒトロドプシンｍＲＮＡの両方について完全なアンチセンス一致であった。２つの種の標的ヌクレオチド配列の対応する違いに従って２１個のガイド鎖ヌクレオチドのうちの２つが異なる、別個のヒトおよびマウスバージョンのミルトロン５（「Ｍ５Ｈ」および「Ｍ５Ｍ」と命名、配列番号５５；フォワードオリゴ：配列番号５６；リバースオリゴ：配列番号５７）をクローニングした。ミルトロン７は、ヒトロドプシン配列との完全なアンチセンスマッチであったが、マウスにおいて対応する標的との単一ヌクレオチドのミスマッチを有していた。結果を図１１に示す。ミルトロン２、３および５は、４０～７０％のロドプシンの有意なノックダウンを誘導した。Ｍ５ＨおよびＭ５Ｍは、それらの対応する種のロドプシンを標的とする場合にのみ有効であったことに留意されたい。
製造業者の説明書に従って、ＰｓｉＣＨＥＣＫ２ベクター系（いずれもＰｒｏｍｅｇａ）と組み合わせたＤｕａｌ Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイを使用して、７つすべてのミルトロンに対するロドプシンノックダウン効率をインビトロで決定した。簡潔には、ＰｓｉＣＨＥＣＫ２プラスミドは、独立してユビキタスプロモーターの制御下にある２つのルシフェラーゼ遺伝子（ウミシイタケおよびホタル）を含む。各ルシフェラーゼは、ルミノメーター（Ｄｕａｌ Ｇｌｏアッセイ）で定量することができる光を生成する反応を順次触媒する（図１０）。ウミシイタケルシフェラーゼは、その終止コドンと、ロドプシンコード配列がクローニングされたポリＡ配列との間に位置する多重クローニング部位を有する。ＨＥＫ２９３細胞をこのベクターおよび各ＧＦＰ－ミルトロンプラスミドで同時トランスフェクトした。有効なミルトロンは、その標的配列を切断し、ウミシイタケルシフェラーゼ転写物を脱アデニル化し、ウミシイタケルミネセンスシグナルを減少させると予想される。しかしながら、ミルトロンは、アッセイにおいて内部トランスフェクション対照として作用するホタルシグナルに影響を及ぼすべきではない。このようにして、ミルトロンのないＧＦＰ対照読み取り値に対して正規化される相対ルシフェラーゼ比（ウミシイタケ：ホタル）により、ミルトロン媒介ノックダウン効率が定量される。７つすべてのミルトロン設計を、ヒトおよびマウスロドプシンの両方についてＰｓｉＣＨＥＣＫ２ベクターに対して試験した。ミルトロンＭ１～４およびＭ６のガイド鎖は、マウスおよびヒトロドプシンｍＲＮＡの両方について完全なアンチセンス一致であった。２つの種の標的ヌクレオチド配列の対応する違いに従って２１個のガイド鎖ヌクレオチドのうちの２つが異なる、別個のヒトおよびマウスバージョンのミルトロン５（「Ｍ５Ｈ」および「Ｍ５Ｍ」と命名、配列番号５５；フォワードオリゴ：配列番号５６；リバースオリゴ：配列番号５７）をクローニングした。ミルトロン７は、ヒトロドプシン配列との完全なアンチセンスマッチであったが、マウスにおいて対応する標的との単一ヌクレオチドのミスマッチを有していた。結果を図１１に示す。ミルトロン２、３および５は、４０～７０％のロドプシンの有意なノックダウンを誘導した。Ｍ５ＨおよびＭ５Ｍは、それらの対応する種のロドプシンを標的とする場合にのみ有効であったことに留意されたい。
【0137】
例９－スプライシングおよび特異的アンチセンス配列の両方がミルトロン誘導ＲＮＡノックダウンに必要である
ミルトロン媒介ロドプシンノックダウンに対する正確なスプライシングおよび特異的アンチセンス配列の必要性を、ミルトロン２（Ｍ２）の２つの代替バージョンをクローニングすることによって調べた。１つ目は、いわゆるスプライス不可能なバージョン（Ｍ２Ｕ、配列番号５８；フォワードオリゴ：配列番号５９；リバースオリゴ：配列番号６０）であった。Ｍ２およびＭ２Ｕは、Ｍ２Ｕのアデニンヌクレオチドの代わりに用いた第１のヌクレオチド（カノニカルスプライスドナー部位の１位における「Ｇ」）を除いてすべて同一であった。２つ目は、スプライシングに関与すると予測されなかったガイド鎖のヌクレオチド（７～２１位）をランダムに並べ替えた「スクランブル」バージョン（Ｍ２Ｓ、配列番号６１；フォワードオリゴ：配列番号６２；リバースオリゴ：配列番号６３）であった。図１２は、Ｍ２ＵがＧＦＰからスプライシングされず（緑色蛍光の欠如によって示される）、ロドプシンノックダウンを媒介することができなかったことを示す。Ｍ２ＳはＭ２と同程度にスプライシングされたが、それもロドプシンノックダウンを誘導しなかった。したがって、スプライシングおよび特異的アンチセンス配列の両方が、ミルトロン誘導ＲＮＡノックダウンに必要である。
ミルトロン媒介ロドプシンノックダウンに対する正確なスプライシングおよび特異的アンチセンス配列の必要性を、ミルトロン２（Ｍ２）の２つの代替バージョンをクローニングすることによって調べた。１つ目は、いわゆるスプライス不可能なバージョン（Ｍ２Ｕ、配列番号５８；フォワードオリゴ：配列番号５９；リバースオリゴ：配列番号６０）であった。Ｍ２およびＭ２Ｕは、Ｍ２Ｕのアデニンヌクレオチドの代わりに用いた第１のヌクレオチド（カノニカルスプライスドナー部位の１位における「Ｇ」）を除いてすべて同一であった。２つ目は、スプライシングに関与すると予測されなかったガイド鎖のヌクレオチド（７～２１位）をランダムに並べ替えた「スクランブル」バージョン（Ｍ２Ｓ、配列番号６１；フォワードオリゴ：配列番号６２；リバースオリゴ：配列番号６３）であった。図１２は、Ｍ２ＵがＧＦＰからスプライシングされず（緑色蛍光の欠如によって示される）、ロドプシンノックダウンを媒介することができなかったことを示す。Ｍ２ＳはＭ２と同程度にスプライシングされたが、それもロドプシンノックダウンを誘導しなかった。したがって、スプライシングおよび特異的アンチセンス配列の両方が、ミルトロン誘導ＲＮＡノックダウンに必要である。
【0138】
例１０－ミルトロン効力に対する標的配列状況の影響
ミルトロン効力に対する標的配列状況の影響を調べるために、２５ｂｐの上流および下流ＤＮＡを有する２１ｂｐのミルトロン３（Ｍ３）標的配列を含むヒトロドプシン標的の「短い」バージョンを、ＰｓｉＣＨＥＣＫ２ベクターの多重クローニング部位にクローニングした。このコンストラクトに対するＭ３有効性を、全長配列に対して測定したものと比較した（図１３）。興味深いことに、Ｍ３は、より短い隣接配列を有するＲＨＯ標的に対して有意により効果的であった。したがって、標的部位の状況は、ミルトロンの効力に有意な影響を及ぼし得る。これはおそらく、転写物標的部位へのＲＩＳＣのアクセスを様々に許容または制限し得るｍＲＮＡ二次構造の局所的差異に起因し、同一の標的配列を有するミルトロンについてヒト標的とマウス標的との間で観察される差異を説明し得る（図１１を参照されたい）。
ミルトロン効力に対する標的配列状況の影響を調べるために、２５ｂｐの上流および下流ＤＮＡを有する２１ｂｐのミルトロン３（Ｍ３）標的配列を含むヒトロドプシン標的の「短い」バージョンを、ＰｓｉＣＨＥＣＫ２ベクターの多重クローニング部位にクローニングした。このコンストラクトに対するＭ３有効性を、全長配列に対して測定したものと比較した（図１３）。興味深いことに、Ｍ３は、より短い隣接配列を有するＲＨＯ標的に対して有意により効果的であった。したがって、標的部位の状況は、ミルトロンの効力に有意な影響を及ぼし得る。これはおそらく、転写物標的部位へのＲＩＳＣのアクセスを様々に許容または制限し得るｍＲＮＡ二次構造の局所的差異に起因し、同一の標的配列を有するミルトロンについてヒト標的とマウス標的との間で観察される差異を説明し得る（図１１を参照されたい）。
【0139】
例１１－ミルトロン媒介ノックダウンのインビトロ決定：コード領域内の標的配列
Ｄｕａｌ Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイは、ウミシイタケルシフェラーゼの３’ＵＴＲにクローニングされた目的の遺伝子を標的とするＲＮＡｉエフェクターの有効性を定量する。能動的に翻訳されているＣＤＳ内に標的部位が位置する場合、ｍＲＮＡ切断がインビボで同じ程度に起こるとは限らない。実際、コード配列を標的とする天然ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ切断よりも翻訳阻害を介してその効果を発揮し得ると考えられており、そのようなｍｉＲＮＡは、標的タンパク質レベルに対してより小さい影響を有するようである。
Ｄｕａｌ Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイは、ウミシイタケルシフェラーゼの３’ＵＴＲにクローニングされた目的の遺伝子を標的とするＲＮＡｉエフェクターの有効性を定量する。能動的に翻訳されているＣＤＳ内に標的部位が位置する場合、ｍＲＮＡ切断がインビボで同じ程度に起こるとは限らない。実際、コード配列を標的とする天然ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ切断よりも翻訳阻害を介してその効果を発揮し得ると考えられており、そのようなｍｉＲＮＡは、標的タンパク質レベルに対してより小さい影響を有するようである。
【0140】
翻訳配列に対するミルトロンの有効性を調べるために、ヒトロドプシン遺伝子をＰｓｉＣＨＥＣＫ２ベクターにクローニングして、ルシフェラーゼがＡＰＶＡＴリンクペプチドを介してロドプシンの細胞質Ｃ末端にタグ化されたＲＨＯ－ウミシイタケルシフェラーゼ融合タンパク質を作製した。このアプローチの有効性は、まず、ロドプシン－ＡＰＶＡＴ－ＧＦＰ配列をＣＡＧ／ＷＰＲＥプラスミド骨格にクローニングすることによって確立された。これを使用してＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、その後、タンパク質の細胞外Ｎ末端を標的とする４Ｄ２抗ロドプシン抗体を使用して免疫染色した。共焦点蛍光顕微鏡法により、ＲＨＯ－ＧＦＰ融合タンパク質が原形質膜に局在していることが明らかになり、このタンパク質は蛍光の二重環として見える（図１４）。次いで、ＨＥＫ２９３細胞を、ＲＨＯ－ウミシイタケルシフェラーゼ融合ＰｓｉＣＨＥＣＫ２プラスミドでトランスフェクトし、ロドプシンおよびルシフェラーゼについて染色した。２つの抗体からの蛍光の原形質膜への共局在化。対照的に、ＰｓｃｉＣＨＥＣＫ２－ＲＨＯ（ヒトロドプシン配列がウミシイタケルシフェラーゼ３’ＵＴＲの多重クローニング部位にクローニングされている）でトランスフェクトした細胞の染色は、サイトゾル内のルシフェラーゼ局在化を示し、ロドプシンシグナルは示さなかった（図１５）。
【0141】
ＲＨＯ－Ｌｕｃ．ＰｓｉＣＨＥＣＫ２内のミルトロン標的配列が確かにタンパク質に翻訳されることが確認されたため、プラスミドを使用して、さらなるＤｕａｌ Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイでミルトロン１～７を試験した。この融合アッセイの結果は、融合アッセイを使用して試験した場合に非効果的であると思われるミルトロン２の結果を除いて、すべての場合において標準的なアッセイの結果に匹敵した（図１６）。
【0142】
これは、ＲＮＡｉの有効性が、いくつかのエフェクターについて、３’ＵＴＲではなくＣＤＳが標的化される場合に異なり得るという仮説を裏付けている。このアッセイは、ミルトロン３および５が、下流のインビボ適用のための７つの候補設計のうちで最も効果的である可能性が高いことを示唆した。我々の知る限りでは、デュアルルシフェラーゼアッセイが融合ベクターに適用されたのはこれが初めてである。このアプローチは、コード配列を標的とするように設計されたすべてのＲＮＡ干渉エフェクターのインビトロ試験に有用となり得る。
【0143】
例１２－オフターゲット相同配列のＢＬＡＳＴ検索
ミルトロンを網膜色素変性患者の処置に使用する場合、形質導入された桿体内のオフターゲット効果が最小限であることが重要である。Ｍ５ＨおよびＭ５Ｍについて上に提示されたデータは、ミルトロンの標的配列の小さな違いが十分に許容されない可能性があることを示唆している。
ミルトロンを網膜色素変性患者の処置に使用する場合、形質導入された桿体内のオフターゲット効果が最小限であることが重要である。Ｍ５ＨおよびＭ５Ｍについて上に提示されたデータは、ミルトロンの標的配列の小さな違いが十分に許容されない可能性があることを示唆している。
【0144】
これをさらに調査するために、３つの最も有効なミルトロン（２、３、５）の２１ｂｐ標的配列を、マウスおよびヒトトランスクリプトーム内の相同性についてＢＬＡＳＴ検索（ｗｗｗ．ｅｎｄｅｍｂｌ．ｏｒｇ）に供した。１０未満のＥ値（入力配列と対象配列との間の整列が偶然によるものである計算された確率）とのすべての一致を検討した（表２）。最長一致は、ＧＰＴ２ ＣＤＳ内の１８ｂｐ相補配列（１つの内部ミスマッチを有する）であった（Ｅ値＝５．５）。ヒトトランスクリプトーム内のいくつかの１４ｂｐの整列もまた、Ｍ３ガイド配列とＳＥＣ１４Ｌ２遺伝子の３’－ＵＴＲとの間の一致を含むミルトロン３および５Ｈについて同定された（Ｅ値＝５．５）。ＳＥＣ１４Ｌ２のナンセンス変異は、稀な形態の劣性網膜色素変性、ＲＰ４１／シュタルガルト病４型に関連しているため、この潜在的な標的を（ＧＴＰ２と共に）さらに調査した。これらの予測配列がＭ３の真のオフターゲットである程度を定量するために、それぞれの標的配列を（上流および下流の隣接ＤＮＡの２５ｂｐと共に）ＰｓｉＣＨＥＣＫ２ベクターの多重クローニング部位にライゲーションした。ミルトロン３に対して行ったその後のＤｕａｌ Ｇｌｏアッセイは、ＧＰＴ２およびＳＥＣ１４Ｌ２のｍＲＮＡレベルがミルトロンの影響を受けないことを示唆していた（図１７）。
【0145】
【表2】
【0146】
例１３－レポーター遺伝子の５’ＵＴＲにおけるミルトロンおよびＥＳＥの挿入
ミルトロン２、３および５を、ＣＡＧ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥプラスミドの５’－ＵＴＲにクローニングした。本発明者らは、以下のように、ミルトロンのすぐ上流および下流にエキソンスプライスエンハンサー（ＥＳＥ）モチーフを含む追加の配列も含めることによって、ミルトロンの効率的なスプライシングを促進しようとした。
ミルトロン２、３および５を、ＣＡＧ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥプラスミドの５’－ＵＴＲにクローニングした。本発明者らは、以下のように、ミルトロンのすぐ上流および下流にエキソンスプライスエンハンサー（ＥＳＥ）モチーフを含む追加の配列も含めることによって、ミルトロンの効率的なスプライシングを促進しようとした。
【0147】
ＥＳＥは、ＲＥＳＣＵＥ－ＥＳＥ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｓ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｂｕｒｇｅｌａｂ／ｒｅｓｃｕｅ－ｅｓｅ／）を使用して、ｅＧＦＰ ＣＤＳのミルトロン挿入部位（ＢｓｔＢ１制限部位の１ヌクレオチド下流）の配列５’（配列番号３７）および３’（配列番号３８）で同定された（図１８）。これらの配列は、上記のように、ミルトロンスプライシングの精度および効率を決定するために使用されるレポータープラスミドのミルトロンに隣接する配列に有利に対応する。これは、ミルトロンおよび追加のＥＳＥの両方を５’ＵＴＲに導入するプロセスを単純化し、レポーターコンストラクト（例５に記載のプラスミド）において既に達成されたスプライシング精度および効率を維持するのに役立つ。オンラインソフトウェア（Ｓｐｌｉｃｅｐｏｒｔ、ｈｔｔｐ：／／ｓｐｌｉｃｅｐｏｒｔ．ｃｂｃｂ．ｕｍｄ．ｅｄｕ）を使用してコンピュータスプライス分析を実施し、ミルトロン挿入部位の周りの最適な５’および３’隣接部長さを特定した（表３）。次の５’または３’ＡＴＧモチーフ（そうでなければ潜在的な翻訳開始部位として作用し得る）まで（ただしそれらを除く）の最も長い５’および３’隣接配列を、新たなコンストラクト内のイントロンに隣接するように選択した。全配列（５’隣接－ミルトロン－３’隣接）をレポーターコンストラクトから増幅し、ＥｃｏＲＶ平滑末端制限部位（ＧＡＴ｜ＡＴＣ）で、導入遺伝子の５’－ＵＴＲ内の制限部位にクローニングした。これは、コンストラクトが挿入されると、ＥｃｏＲＶ制限部位が３’末端で再形成されるため、この目的にとって理想的である。これにより、複数の同様のコンストラクト（同じまたは異なるミルトロンを含む）をタンデムに連続して挿入することができる（以下の例１５を参照されたい）。
【表3】
【0148】
「置換」導入遺伝子の５’ＵＴＲに「ノックダウン」ミルトロンを配置することには、いくつかの潜在的な利点がある。ミルトロンは導入遺伝子開始コドンの上流にあるため、導入遺伝子の発現は、ミルトロンがＣＤＳ内のイントロンとして位置する場合よりも妨害されにくい可能性がある。導入遺伝子ＣＤＳが中断されないため、突然変異タンパク質産生のリスクはない（代替開始コドンとして作用し得るＡＴＧモチーフが５’ＵＴＲに導入されないことを条件とする）。５’ＵＴＲにおけるミルトロンの位置はまた、ミルトロンが３’ＵＴＲに位置する場合に起こり得るトランスジェニック転写物のナンセンス媒介性分解を増加させないはずである。さらに、５’ＵＴＲ内にミルトロンを配置することにより、導入遺伝子の発現を妨害することなく、ミルトロンからの効率的で正確なスプライシングを促進するために、ミルトロンに隣接して、ＥＳＥを含む追加の配列を挿入することが可能になる。
【0149】
例１４－５’ＵＴＲのミルトロンはＣＤＳのミルトロンよりも有効である
Ｍ２－ＵＴＲ、Ｍ３－ＵＴＲおよびＭ５－ＵＴＲとして知られている新たなコンストラクトを、二重ルシフェラーゼアッセイを使用したロドプシンノックダウンのための、および上記の蛍光アッセイによる下流の遺伝子発現のためのミルトロンのないＧＦＰプラスミドと比較した（図１９）。ミルトロンは、ヒトおよびマウスロドプシン標的の両方について、ＧＦＰコード配列内にネストされている場合よりも５’－ＵＴＲに位置する場合の方が有効であることが見出された（図２０）。トランスフェクト細胞由来のｃＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲスプライス分析を上記のように行った。その後のゲルに対して行われたバンドデンシトメトリーにより、それらのＣＤＳネスト型対応物のものと比較した場合、転写物のより大きな割合が５’ＵＴＲミルトロンに対して正しくスプライシングされたことが明らかになった（図２１）。最も低いバンドが実際に正しくスプライシングされたｍＲＮＡを表すことの確認は、抽出されたＤＮＡのサンガー配列決定によって達成された（図２２）。
Ｍ２－ＵＴＲ、Ｍ３－ＵＴＲおよびＭ５－ＵＴＲとして知られている新たなコンストラクトを、二重ルシフェラーゼアッセイを使用したロドプシンノックダウンのための、および上記の蛍光アッセイによる下流の遺伝子発現のためのミルトロンのないＧＦＰプラスミドと比較した（図１９）。ミルトロンは、ヒトおよびマウスロドプシン標的の両方について、ＧＦＰコード配列内にネストされている場合よりも５’－ＵＴＲに位置する場合の方が有効であることが見出された（図２０）。トランスフェクト細胞由来のｃＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲスプライス分析を上記のように行った。その後のゲルに対して行われたバンドデンシトメトリーにより、それらのＣＤＳネスト型対応物のものと比較した場合、転写物のより大きな割合が５’ＵＴＲミルトロンに対して正しくスプライシングされたことが明らかになった（図２１）。最も低いバンドが実際に正しくスプライシングされたｍＲＮＡを表すことの確認は、抽出されたＤＮＡのサンガー配列決定によって達成された（図２２）。
【0150】
例１５－タンデムの２つのミルトロンは発現をより効率的にノックダウンする：３’ＵＴＲにおける標的配列
補充転写物の５’－ＵＴＲからスプライシングされたときにミルトロンが依然として有効であることが確立されたため、５’－ＵＴＲ内のタンデムの複数のミルトロンの効果を調べた。以下のプラスミドをクローニングした：
１．Ｍ３／Ｍ３－ＵＴＲ：ＣＡＧ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥプラスミドの５’－ＵＴＲにクローニングされた、それぞれ上記の独自のＥＳＥ隣接配列を有する直列のＭ３の２つのコピー。
２．Ｍ３／Ｍ５－ＵＴＲ：ＣＡＧ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥプラスミドの５’－ＵＴＲにクローニングされた、それぞれ上記の独自のＥＳＥ隣接配列を有する直列のＭ３の１つのコピーおよびＭ５の１つのコピー。
補充転写物の５’－ＵＴＲからスプライシングされたときにミルトロンが依然として有効であることが確立されたため、５’－ＵＴＲ内のタンデムの複数のミルトロンの効果を調べた。以下のプラスミドをクローニングした：
１．Ｍ３／Ｍ３－ＵＴＲ：ＣＡＧ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥプラスミドの５’－ＵＴＲにクローニングされた、それぞれ上記の独自のＥＳＥ隣接配列を有する直列のＭ３の２つのコピー。
２．Ｍ３／Ｍ５－ＵＴＲ：ＣＡＧ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥプラスミドの５’－ＵＴＲにクローニングされた、それぞれ上記の独自のＥＳＥ隣接配列を有する直列のＭ３の１つのコピーおよびＭ５の１つのコピー。
【0151】
二重ルシフェラーゼアッセイを使用した単一５’－ＵＴＲミルトロンに対するヒトおよびマウスロドプシンのノックダウンの比較は、両方の場合においてタンデムコンストラクトの優れた有効性を示した（図２３）。ＰＣＲスプライス分析およびサンガー配列決定により、タンデムミルトロンが独立して正確にスプライシングされることが確認された（図２４および図２５）。
【0152】
例１６－標的配列がＣＤＳにある場合、タンデムの二つのミルトロンは有効のままである
試験された５’ＵＴＲミルトロンは、上記のＲＨＯ－ルシフェラーゼ融合タンパク質に対するものである場合、すべて有効のままであった（図２６）。興味深いことに、このアッセイでは、標準的な二重ルシフェラーゼアッセイを使用して測定した場合よりも、Ｍ２－ＵＴＲの効力は低く、Ｍ３／Ｍ３－ＵＴＲの効力は高かった。
試験された５’ＵＴＲミルトロンは、上記のＲＨＯ－ルシフェラーゼ融合タンパク質に対するものである場合、すべて有効のままであった（図２６）。興味深いことに、このアッセイでは、標準的な二重ルシフェラーゼアッセイを使用して測定した場合よりも、Ｍ２－ＵＴＲの効力は低く、Ｍ３／Ｍ３－ＵＴＲの効力は高かった。
【0153】
例１７－タンデムの２つのミルトロンはレポーター遺伝子発現をわずかに低下させる
すべての５’ＵＴＲミルトロンに対して、下流の遺伝子発現に対するそれらの影響を解明するために蛍光アッセイを実施した。図２７は、これらのプラスミドでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の代表的な画像を、これらの細胞からのタンパク質溶解物に対して行われた定量的蛍光アッセイの結果と共に示す。要約すると、単一の５’ＵＴＲミルトロンは最終的なタンパク質レベルに悪影響を及ぼさなかったが、タンデムミルトロンは、レポーター遺伝子発現のわずかであるが有意な低減をもたらした（Ｍ３／Ｍ３およびＭ３／Ｍ５についてそれぞれ２３％および２４％の低減）。
すべての５’ＵＴＲミルトロンに対して、下流の遺伝子発現に対するそれらの影響を解明するために蛍光アッセイを実施した。図２７は、これらのプラスミドでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の代表的な画像を、これらの細胞からのタンパク質溶解物に対して行われた定量的蛍光アッセイの結果と共に示す。要約すると、単一の５’ＵＴＲミルトロンは最終的なタンパク質レベルに悪影響を及ぼさなかったが、タンデムミルトロンは、レポーター遺伝子発現のわずかであるが有意な低減をもたらした（Ｍ３／Ｍ３およびＭ３／Ｍ５についてそれぞれ２３％および２４％の低減）。
【0154】
図２８は、ヒトおよびマウスロドプシンの両方に対するＭ３－ＵＴＲ、Ｍ５Ｈ－ＵＴＲ、Ｍ５Ｍ－ＵＴＲ、Ｍ３／Ｍ３－ＵＴＲ、Ｍ３／Ｍ５Ｈ－ＵＴＲおよびＭ３／Ｍ５Ｍのノックダウン効果を示す。Ｍ３単独は両方の種において有効であるが、ノックダウン効果はマウス転写物に対して有意により大きい。このため、Ｍ３とＭ５Ｈとの組み合わせが両方の種において同様のレベルの効率的なノックダウン（＞７５％）を達成したため、この組み合わせをブロックおよび置換ベクターのために選択した（赤色矢印）。
【0155】
例１８－「置換」ロドプシンの遺伝子設計
効果的な「ブロックおよび置換」ベクターのために、ＡＡＶコンストラクトに含まれるヒトロドプシンのＣＤＳは、共発現ミルトロンに対して耐性でなければならない。これを達成するために、ミルトロン３および５の標的部位を構成するコドンを、可能な場合は同じアミノ酸をコードする代替配列に変更した（「稀少」コドンを回避した）。得られるｍＲＮＡ配列は、これらのミルトロンに相補的ではなく、分解を受けないはずであるが、それにもかかわらず正常なヒトロドプシンタンパク質の翻訳をもたらすはずである。
効果的な「ブロックおよび置換」ベクターのために、ＡＡＶコンストラクトに含まれるヒトロドプシンのＣＤＳは、共発現ミルトロンに対して耐性でなければならない。これを達成するために、ミルトロン３および５の標的部位を構成するコドンを、可能な場合は同じアミノ酸をコードする代替配列に変更した（「稀少」コドンを回避した）。得られるｍＲＮＡ配列は、これらのミルトロンに相補的ではなく、分解を受けないはずであるが、それにもかかわらず正常なヒトロドプシンタンパク質の翻訳をもたらすはずである。
【0156】
これを試験するために、Ｍ３（ＲＨＯＭ３Ｒ）、Ｍ５（ＲＨＯＭ５Ｒ）および両方（ＲＨＯＭ３／５Ｒ）に耐性のヒトロドプシンのコドン改変バージョンを、ｐｓｉＣＨＥＣＫ２ベクターの多重クローニング部位に個別にクローニングした。次いで、対応するミルトロンによる分解に対するこれらの転写物の耐性を、Ｄｕａｌ Ｇｌｏアッセイによって確立した（図２９）。各ガイド鎖によって補完されるＲＨＯ（配列番号１）の標的配列および「置換」ロドプシン遺伝子における対応する配列は以下の通りである
ＲＨＯ内のＭ３標的部位（ヌクレオチド１５３～１７３）：ＣＴＴＣＣＣＣＡＴＣＡＡＣＴＴＣＣＴＣＡＣ（配列番号５）
ＲＨＯＭ３／５Ｒ内のＭ３標的部位（ヌクレオチド１５３～１７３）：ＡＴＴＴＣＣＡＡＴＴＡＡＴＴＴＴＣＴＧＡＣ（配列番号２４）
ＲＨＯ内のＭ５標的部位（ヌクレオチド５９８～６１８）：ＡＴＣＴＡＣＡＴＧＴＴＣＧＴＧＧＴＣＣＡＣ（配列番号７）
ＲＨＯＭ３／５ＲのＭ５標的部位（ヌクレオチド５９８～６１８）：ＡＡＴＧＡＡＴＣＣＴＴＣＧＴＧＡＴＴＴＡＴ（配列番号２５）
ＲＨＯ内のＭ３標的部位（ヌクレオチド１５３～１７３）：ＣＴＴＣＣＣＣＡＴＣＡＡＣＴＴＣＣＴＣＡＣ（配列番号５）
ＲＨＯＭ３／５Ｒ内のＭ３標的部位（ヌクレオチド１５３～１７３）：ＡＴＴＴＣＣＡＡＴＴＡＡＴＴＴＴＣＴＧＡＣ（配列番号２４）
ＲＨＯ内のＭ５標的部位（ヌクレオチド５９８～６１８）：ＡＴＣＴＡＣＡＴＧＴＴＣＧＴＧＧＴＣＣＡＣ（配列番号７）
ＲＨＯＭ３／５ＲのＭ５標的部位（ヌクレオチド５９８～６１８）：ＡＡＴＧＡＡＴＣＣＴＴＣＧＴＧＡＴＴＴＡＴ（配列番号２５）
【0157】
例２０－ＲＨＯＭ３／５Ｒ ＣＤＲはＨＥＫ２９３細胞において正常に発現する
ＲＨＯＭ３／５Ｒ ＣＤＳが正常なロドプシンタンパク質を発現することを確認するために、３’ＷＰＲＥ（ＣＡＧ．ＲＨＯＭ３／５Ｒ．ＷＰＲＥ）を用いてＣＡＧプロモーターの制御下でプラスミドに配列をクローニングした。次いで、このプラスミドを使用してＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、その後、３つの異なる抗体を使用する免疫細胞化学によってロドプシンについて染色した。ＣＡＧ．ＲＨＯ．ＷＰＲＥプラスミドでトランスフェクトした細胞と比較して、これらの細胞では染色の差は観察されず、両方のバージョンが原形質膜に輸送された（図３０）。
ＲＨＯＭ３／５Ｒ ＣＤＳが正常なロドプシンタンパク質を発現することを確認するために、３’ＷＰＲＥ（ＣＡＧ．ＲＨＯＭ３／５Ｒ．ＷＰＲＥ）を用いてＣＡＧプロモーターの制御下でプラスミドに配列をクローニングした。次いで、このプラスミドを使用してＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトし、その後、３つの異なる抗体を使用する免疫細胞化学によってロドプシンについて染色した。ＣＡＧ．ＲＨＯ．ＷＰＲＥプラスミドでトランスフェクトした細胞と比較して、これらの細胞では染色の差は観察されず、両方のバージョンが原形質膜に輸送された（図３０）。
【0158】
例２１－ＲＨＯＭ３／５Ｒ ＣＤＳはインビボで正常に発現および機能する
インビボでのＲＨＯＭ３／５Ｒの適切な発現および機能を試験するために、総体積１．５μｌ中２×１０９ｇｃのベクターを１０Ｎｒｌ．ＧＦＰ／Ｒｈｏ－／－マウスの右眼の網膜下に注射した。４週間後、暗順応網膜電図検査（ＥＲＧ）を行い、その後、動物を屠殺し、眼の凍結切片を免疫組織化学（ＩＨＣ）によってロドプシンについて染色した。注入された右眼および注入されていない左眼について暗順応強度応答曲線（ＩＲＣ）を構築し、網膜電図の桿体由来の応答のレスキューを確認した（図３１）。網膜切片のＩＨＣにより、注射されていない眼には存在しなかった外側セグメントの存在が明らかとなった。これらにロドプシンを充填した。異所性ロドプシン発現（すなわち外側セグメントの外側）はいずれの場合も特定されなかった（図３２）。したがって、ミルトロン３および５の両方に耐性であるｍＲＮＡ転写物から翻訳されたロドプシンタンパク質は、桿体の外側セグメントに移動し、暗順応光応答を駆動することができる。
インビボでのＲＨＯＭ３／５Ｒの適切な発現および機能を試験するために、総体積１．５μｌ中２×１０９ｇｃのベクターを１０Ｎｒｌ．ＧＦＰ／Ｒｈｏ－／－マウスの右眼の網膜下に注射した。４週間後、暗順応網膜電図検査（ＥＲＧ）を行い、その後、動物を屠殺し、眼の凍結切片を免疫組織化学（ＩＨＣ）によってロドプシンについて染色した。注入された右眼および注入されていない左眼について暗順応強度応答曲線（ＩＲＣ）を構築し、網膜電図の桿体由来の応答のレスキューを確認した（図３１）。網膜切片のＩＨＣにより、注射されていない眼には存在しなかった外側セグメントの存在が明らかとなった。これらにロドプシンを充填した。異所性ロドプシン発現（すなわち外側セグメントの外側）はいずれの場合も特定されなかった（図３２）。したがって、ミルトロン３および５の両方に耐性であるｍＲＮＡ転写物から翻訳されたロドプシンタンパク質は、桿体の外側セグメントに移動し、暗順応光応答を駆動することができる。
【0159】
例２２－ベクター「ＡＡＶ－Ｍ３／５．ＲＨＯ」の設計および製造
ＡＡＶ２／８Ｙ７３３Ｆ．ＲＨＯｐ．Ｅｘ／Ｉｎｔ．Ｍ３／Ｍ５．ＲＨＯＭ３／５Ｒ．ＷＰＲＥ（以降でＡＡＶ－Ｍ３／５．ＲＨＯと呼ばれる）（配列番号３１）を、上に概説したエレメントからクローニングした導入遺伝子プラスミドを使用して製造したが、これは以下を含む：
－ＡＡＶゲノム：ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ血清型２に由来する逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列に隣接している。
－カプシド：使用されるカプシドは、この処置の標的細胞型である光受容体の素因を有するＡＡＶ血清型８に由来する。使用される特定の変異体は、ウイルス形質導入後に遺伝子発現を増加させることが示されているＹ７３３Ｆ変異体である４、５。
－ＲＨＯｐ：ＡＡＶゲノムは、ヒトロドプシンプロモーターを使用する。これにより、ウイルス送達された遺伝子産物が、桿体光受容体細胞においてのみ発現されることが保証される。
－Ｅｘ／Ｉｎｔ：ウサギベータ－グロビン遺伝子からのスプライスアクセプターと共にニワトリベータ－アクチン遺伝子の第１のエクソンおよびイントロンは、ＲＨＯプロモーターの３’に含まれる。上記のように実験的に、これはプロモーター細胞特異性を維持しながら下流の導入遺伝子発現を改善することが示された。
－Ｍ３／Ｍ５：ヒトロドプシンｍＲＮＡ転写物の異なる領域を標的とするように設計された２つの３’テールのミルトロン（「ミルトロン３」および「ミルトロン５」）；
－２つのミルトロンに隣接し、それらの間にある増強された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）遺伝子に由来するエキソンスプライスエンハンサー（ＥＳＥ）を含むＤＮＡ配列。
－コザックコンセンサス配列。
－ＲＨＯＭ３／５Ｒ：ヒトロドプシンコード配列（ＣＤＳ）。上記のように、転写産物がミルトロン媒介性ノックダウンに耐性であるが、それでもなお同じ機能性タンパク質をコードするように、代替コドンを使用して、ミルトロン３および５の２１塩基対の標的領域を改変した。
－ＷＰＲＥ：ＲＨＯ終止コドンの下流にウッドチャック肝炎転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）が含まれる。この配列は、マウスおよびヒトにおける網膜遺伝子治療後の導入遺伝子発現を改善することが示されている。
－ウシ成長ホルモンポリＡシグナル。
ＡＡＶ２／８Ｙ７３３Ｆ．ＲＨＯｐ．Ｅｘ／Ｉｎｔ．Ｍ３／Ｍ５．ＲＨＯＭ３／５Ｒ．ＷＰＲＥ（以降でＡＡＶ－Ｍ３／５．ＲＨＯと呼ばれる）（配列番号３１）を、上に概説したエレメントからクローニングした導入遺伝子プラスミドを使用して製造したが、これは以下を含む：
－ＡＡＶゲノム：ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ血清型２に由来する逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列に隣接している。
－カプシド：使用されるカプシドは、この処置の標的細胞型である光受容体の素因を有するＡＡＶ血清型８に由来する。使用される特定の変異体は、ウイルス形質導入後に遺伝子発現を増加させることが示されているＹ７３３Ｆ変異体である４、５。
－ＲＨＯｐ：ＡＡＶゲノムは、ヒトロドプシンプロモーターを使用する。これにより、ウイルス送達された遺伝子産物が、桿体光受容体細胞においてのみ発現されることが保証される。
－Ｅｘ／Ｉｎｔ：ウサギベータ－グロビン遺伝子からのスプライスアクセプターと共にニワトリベータ－アクチン遺伝子の第１のエクソンおよびイントロンは、ＲＨＯプロモーターの３’に含まれる。上記のように実験的に、これはプロモーター細胞特異性を維持しながら下流の導入遺伝子発現を改善することが示された。
－Ｍ３／Ｍ５：ヒトロドプシンｍＲＮＡ転写物の異なる領域を標的とするように設計された２つの３’テールのミルトロン（「ミルトロン３」および「ミルトロン５」）；
－２つのミルトロンに隣接し、それらの間にある増強された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）遺伝子に由来するエキソンスプライスエンハンサー（ＥＳＥ）を含むＤＮＡ配列。
－コザックコンセンサス配列。
－ＲＨＯＭ３／５Ｒ：ヒトロドプシンコード配列（ＣＤＳ）。上記のように、転写産物がミルトロン媒介性ノックダウンに耐性であるが、それでもなお同じ機能性タンパク質をコードするように、代替コドンを使用して、ミルトロン３および５の２１塩基対の標的領域を改変した。
－ＷＰＲＥ：ＲＨＯ終止コドンの下流にウッドチャック肝炎転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）が含まれる。この配列は、マウスおよびヒトにおける網膜遺伝子治療後の導入遺伝子発現を改善することが示されている。
－ウシ成長ホルモンポリＡシグナル。
【0160】
ＡＡＶ－Ｍ３／５．ＲＨＯの概略図を図３３に示す。
【0161】
例２３－インビボ実験設計
ロドプシン突然変異によって引き起こされるＲＰの処置としてのＡＡＶ－Ｍ３／５．ＲＨＯの有効性を評価するために、ベクターをＰ２３Ｈマウスで試験した。ベクターを、１．５μｌ中２×１０８ｇｃの「低用量」（ｎ＝１７）または２×１０９ｇｃの「高用量」で３週齢マウスの右眼に網膜下送達した。左眼には注射せず、内部対照として機能させた。２つのさらなる群のマウスに、ＡＡＶ－Ｍ３／５．ＲＨＯと同一であるが、ミルトロンおよび付随するＥＳＥに富む隣接配列がなく、ＲＨＯコドン修飾がないベクターＡＡＶ－Ｅｘ／Ｉｎｔ（上記参照）を同様に注射した。
ロドプシン突然変異によって引き起こされるＲＰの処置としてのＡＡＶ－Ｍ３／５．ＲＨＯの有効性を評価するために、ベクターをＰ２３Ｈマウスで試験した。ベクターを、１．５μｌ中２×１０８ｇｃの「低用量」（ｎ＝１７）または２×１０９ｇｃの「高用量」で３週齢マウスの右眼に網膜下送達した。左眼には注射せず、内部対照として機能させた。２つのさらなる群のマウスに、ＡＡＶ－Ｍ３／５．ＲＨＯと同一であるが、ミルトロンおよび付随するＥＳＥに富む隣接配列がなく、ＲＨＯコドン修飾がないベクターＡＡＶ－Ｅｘ／Ｉｎｔ（上記参照）を同様に注射した。
【0162】
Ｐ２３Ｈマウスの別個の群（ｎ＝１２）に対して、右眼に１．５μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の偽網膜下注射を行った。ここでも、左眼には注射しなかった。すべての場合において、注射は上方に送達された。
【0163】
いくつかのマウスの網膜を、ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成およびＲＴ－ｑＰＣＲのために注射から４週間後に抽出した（図３４～図３７）。注射したマウスの網膜溶解物に由来するミルトロン貫通プライマーおよび鋳型ｃＤＮＡを使用したＰＣＲスプライス分析は、インビボで非常に効率的なスプライシングを示した（図３４）。ＲＴ－ｑＰＣＲでは、レスキュー／毒性効果を説明するために、各眼におけるマウスおよびヒトロドプシンをＧＦＰレベル（Ｐ２３Ｈマウスにおいて桿体でのみ発現される遺伝子）に対して正規化した。このデータは、ミルトロン３がインビボでマウスロドプシンのノックダウンを誘導することを実証している。ミルトロンを含まないＡＡＶ－Ｅｘ／Ｉｎｔの送達後、低用量または高用量ではｍＲｈｏの有意な減少は認められなかった。ミルトロン含有ベクターを高用量で送達した場合、総網膜ｍＲｈｏ ｍＲＮＡの３４％ノックダウンが、偽注射した他眼と比較して明らかであった（Ｐ＝０．００２４、二元配置ＡＮＯＶＡシダックの多重比較検定）。低用量では有意なノックダウンは見られなかった（図３５）。低用量では、ＲＨＯ補充は天然レベルに近似する。高用量では、４．６倍の増加が見られ（Ｐ＝０．００１１、二元配置ＡＮＯＶＡシダックの多重比較検定）、過剰発現の程度を示唆している（図３６）。ヒトＲＨＯ発現は、ミルトロン含有ベクターで処置した眼においてｍＲｈｏノックダウンと相関したが、ミルトロン３を含まないＡＡＶでは相関しなかった（図３７）。合わせて、この遺伝子発現分析は、インビボでの人工ミルトロンの機能の最初の実証を表す。
【0164】
残りのマウスについては、網膜の解剖学的構造がこれまでに注射から１、２および３ヶ月後にＳＤ－ＯＣＴによって評価されており、網膜機能が注射から１ヶ月後および３ヶ月後に網膜電図検査（ＥＲＧ）によって評価されている。
【0165】
例２３－ＯＣＴスキャン
１ヶ月目の処置されたＰ２３Ｈマウスの低用量注射右眼および非注射左眼からの代表的なＯＣＴスキャンを図３８に示す。処置された眼には、網膜変性の遅延を示唆するより厚いＰＲＬが存在することに留意されたい（矢印参照）。
１ヶ月目の処置されたＰ２３Ｈマウスの低用量注射右眼および非注射左眼からの代表的なＯＣＴスキャンを図３８に示す。処置された眼には、網膜変性の遅延を示唆するより厚いＰＲＬが存在することに留意されたい（矢印参照）。
【0166】
図３９は、ＡＡＶ注射群および偽注射群の各マウスについて、注射された眼の光受容体層（ＰＲＬ）の厚さを注射されていない対応物の厚さに対して正規化したものを示す。手術の結果として、偽注射動物ではＰＲＬ厚のわずかな低下（ＰＲＬ比＜１）を優位に理解することができる。ＡＡＶ注射群では、この低下は存在せず、水平子午線（鼻側網膜および耳側網膜の両方についてｐ＜０．０００１、二元配置ＡＮＯＶＡ、シダックの多重比較試験）に沿って網膜の厚さの増加（ＰＲＬ比＞１）が明らかであった。
【0167】
【0168】
【0169】
例２６－ＷＰＲＥを含まない新たなベクターの設計および製造
上記の例は、Ｐ２３ＨマウスにおけるＡＡＶ－Ｍ３／５Ｈの利益が低用量を使用して達成されるが、高用量ではある程度の毒性が明らかであったことを実証している。ｍＲＮＡ分析が非常に高いＲＨＯ発現レベル（図３６を参照されたい）、および光受容体に対して毒性であることが知られているこのタンパク質の過剰発現を示したことを考えると、これが原因である可能性が高い。この毒性はミルトロンのないベクターでも見られたため、ミルトロン発現が原因である可能性は低い。
上記の例は、Ｐ２３ＨマウスにおけるＡＡＶ－Ｍ３／５Ｈの利益が低用量を使用して達成されるが、高用量ではある程度の毒性が明らかであったことを実証している。ｍＲＮＡ分析が非常に高いＲＨＯ発現レベル（図３６を参照されたい）、および光受容体に対して毒性であることが知られているこのタンパク質の過剰発現を示したことを考えると、これが原因である可能性が高い。この毒性はミルトロンのないベクターでも見られたため、ミルトロン発現が原因である可能性は低い。
【0170】
ＲＨＯ発現をより生理学的なレベルまで低減するはずのＷＰＲＥなしで、２つのベクターを製造した。２つのベクターの概略図を、図４７に示す。ベクターＡＡＶ２／８Ｙ７３３Ｆ．ＲＨＯｐ．Ｅｘ／Ｉｎｔ．Ｍ３／Ｍ５Ｈ．ＲＨＯＭ３／５Ｒ（「ＡＡＶ－Ｍ３／５Ｈ」）は、ＡＡＶ２／８Ｙ７３３Ｆ．ＲＨＯｐ．Ｅｘ／Ｉｎｔ．Ｍ３／Ｍ５．ＲＨＯＭ３／５Ｒ．ＷＰＲＥ（ＡＡＶ－Ｍ３／５．ＲＨＯ）と同じ２つのミルトロンを含むのに対して、ＡＡＶ２／８Ｙ７３３Ｆ．ＲＨＯｐ．Ｅｘ／Ｉｎｔ．Ｍ３／Ｍ５Ｍ．ＲＨＯＭ３／５Ｒ（「ＡＡＶ－Ｍ３／５Ｍ」）は、ヒトＲＨＯに対するミルトロン５をマウスＲＨＯに対するミルトロン５に置き換えている。これにより、インビボで１つまたは２つの活性ミルトロンを有することの違いを評価することが可能になる。
【配列表フリーテキスト】
【0171】
配列表３ ＜２２３＞ミルトロン１の標的配列
配列表４ ＜２２３＞ミルトロン２の標的配列
配列表５ ＜２２３＞ミルトロン３の標的配列
配列表６ ＜２２３＞ミルトロン４の標的配列
配列表７ ＜２２３＞ミルトロン５Ｈの標的配列
配列表８ ＜２２３＞ミルトロン６の標的配列
配列表９ ＜２２３＞ミルトロン７の標的配列
配列表１０ ＜２２３＞ミルトロン１
配列表１１ ＜２２３＞ミルトロン２
配列表１２ ＜２２３＞ミルトロン３
配列表１３ ＜２２３＞ミルトロン４
配列表１４ ＜２２３＞ミルトロン５Ｈ
配列表１５ ＜２２３＞ミルトロン６
配列表１６ ＜２２３＞ミルトロン７
配列表１７ ＜２２３＞ミルトロン１のガイド鎖配列
配列表１８ ＜２２３＞ミルトロン２のガイド鎖配列
配列表１９ ＜２２３＞ミルトロン３のガイド鎖配列
配列表２０ ＜２２３＞ミルトロン４のガイド鎖配列
配列表２１ ＜２２３＞ミルトロン５のガイド鎖配列
配列表２２ ＜２２３＞ミルトロン６のガイド鎖配列
配列表２３ ＜２２３＞ミルトロン７のガイド鎖配列
配列表２４ ＜２２３＞ミルトロン３の改変標的配列
配列表２５ ＜２２３＞ミルトロン５Ｈの改変標的配列
配列表２６ ＜２２３＞５’ＵＴＲ挿入（ｅＧＦＰ－Ｍ３－ｅＧＦＰ－Ｍ５－ｅＧＦＰ）
配列表２７ ＜２２３＞ミルトロンおよび追加のＥＳＥリッチ配列を有する５’ＵＴＲ
配列表２８ ＜２２３＞ＡＡＶ配列
配列表３０ ＜２２３＞ＢｓｔＢ１制限部位および隣接する下流側の「Ｇ」
配列表３１ ＜２２３＞遺伝子治療ベクター
配列表３２ ＜２２３＞フォワードＩＴＲ
配列表３３ ＜２２３＞リバースＩＴＲ
配列表３４ ＜２２３＞フォワードＩＴＲヒトロドプシンプロモーター
配列表３６ ＜２２３＞ｅＧＦＰアミノ酸
配列表３７ ＜２２３＞５’ＥＳＥリッチ配列
配列表３８ ＜２２３＞３’ＥＳＥリッチ配列
配列表３９ ＜２２３＞ミルトロンおよび追加のＥＳＥリッチ配列を有さない５’ＵＴＲ
配列表４０ ＜２２３＞タンデムミルトロン間のＥＳＥリッチ配列
配列表４１ ＜２２３＞ミルトロン１フォワードオリゴヌクレオチド
配列表４２ ＜２２３＞ミルトロン２フォワードオリゴヌクレオチド
配列表４３ ＜２２３＞ミルトロン３フォワードオリゴヌクレオチド
配列表４４ ＜２２３＞ミルトロン４フォワードオリゴヌクレオチド
配列表４５ ＜２２３＞ミルトロン５Ｈフォワードオリゴヌクレオチド
配列表４６ ＜２２３＞ミルトロン６フォワードオリゴヌクレオチド
配列表４７ ＜２２３＞ミルトロン７フォワードオリゴヌクレオチド
配列表４８ ＜２２３＞ミルトロン１リバースオリゴヌクレオチド
配列表４９ ＜２２３＞ミルトロン２リバースオリゴヌクレオチド
配列表５０ ＜２２３＞ミルトロン３リバースオリゴヌクレオチド
配列表５１ ＜２２３＞ミルトロン４リバースオリゴヌクレオチド
配列表５２ ＜２２３＞ミルトロン５Ｈリバースオリゴヌクレオチド
配列表５３ ＜２２３＞ミルトロン６リバースオリゴヌクレオチド
配列表５４ ＜２２３＞ミルトロン７リバースオリゴヌクレオチド
配列表５５ ＜２２３＞ミルトロン５Ｍ
配列表５６ ＜２２３＞ミルトロン５Ｍフォワードオリゴヌクレオチド
配列表５７ ＜２２３＞ミルトロン５Ｍリバースオリゴヌクレオチド
配列表５８ ＜２２３＞ミルトロンＭ２Ｕ－Ｍ２
配列表５９ ＜２２３＞ミルトロンＭ２Ｕ－Ｍ２フォワードオリゴヌクレオチド
配列表６０ ＜２２３＞ミルトロンＭ２Ｕ－Ｍ２リバースオリゴヌクレオチド
配列表６１ ＜２２３＞ミルトロンＳｃｒ－Ｍ２
配列表６２ ＜２２３＞ミルトロンＳｃｒ－Ｍ２フォワードオリゴヌクレオチド
配列表６３ ＜２２３＞ミルトロンＳｃｒ－Ｍ２リバースオリゴヌクレオチド
配列表６４ ＜２２３＞ベクターＡＡＶ２／８Ｙ７３３Ｆ．ＲＨＯｐ．Ｅｘ／Ｉｎｔ．Ｍ３／Ｍ５．ＲＨＯＭ３／５Ｒ
配列表６５ ＜２２３＞ＡＡＶ２／８Ｙ７３３Ｆ．ＲＨＯｐ．Ｅｘ／Ｉｎｔ．Ｍ３／Ｍ５Ｍ．ＲＨＯＭ３／５Ｒ
配列表４ ＜２２３＞ミルトロン２の標的配列
配列表５ ＜２２３＞ミルトロン３の標的配列
配列表６ ＜２２３＞ミルトロン４の標的配列
配列表７ ＜２２３＞ミルトロン５Ｈの標的配列
配列表８ ＜２２３＞ミルトロン６の標的配列
配列表９ ＜２２３＞ミルトロン７の標的配列
配列表１０ ＜２２３＞ミルトロン１
配列表１１ ＜２２３＞ミルトロン２
配列表１２ ＜２２３＞ミルトロン３
配列表１３ ＜２２３＞ミルトロン４
配列表１４ ＜２２３＞ミルトロン５Ｈ
配列表１５ ＜２２３＞ミルトロン６
配列表１６ ＜２２３＞ミルトロン７
配列表１７ ＜２２３＞ミルトロン１のガイド鎖配列
配列表１８ ＜２２３＞ミルトロン２のガイド鎖配列
配列表１９ ＜２２３＞ミルトロン３のガイド鎖配列
配列表２０ ＜２２３＞ミルトロン４のガイド鎖配列
配列表２１ ＜２２３＞ミルトロン５のガイド鎖配列
配列表２２ ＜２２３＞ミルトロン６のガイド鎖配列
配列表２３ ＜２２３＞ミルトロン７のガイド鎖配列
配列表２４ ＜２２３＞ミルトロン３の改変標的配列
配列表２５ ＜２２３＞ミルトロン５Ｈの改変標的配列
配列表２６ ＜２２３＞５’ＵＴＲ挿入（ｅＧＦＰ－Ｍ３－ｅＧＦＰ－Ｍ５－ｅＧＦＰ）
配列表２７ ＜２２３＞ミルトロンおよび追加のＥＳＥリッチ配列を有する５’ＵＴＲ
配列表２８ ＜２２３＞ＡＡＶ配列
配列表３０ ＜２２３＞ＢｓｔＢ１制限部位および隣接する下流側の「Ｇ」
配列表３１ ＜２２３＞遺伝子治療ベクター
配列表３２ ＜２２３＞フォワードＩＴＲ
配列表３３ ＜２２３＞リバースＩＴＲ
配列表３４ ＜２２３＞フォワードＩＴＲヒトロドプシンプロモーター
配列表３６ ＜２２３＞ｅＧＦＰアミノ酸
配列表３７ ＜２２３＞５’ＥＳＥリッチ配列
配列表３８ ＜２２３＞３’ＥＳＥリッチ配列
配列表３９ ＜２２３＞ミルトロンおよび追加のＥＳＥリッチ配列を有さない５’ＵＴＲ
配列表４０ ＜２２３＞タンデムミルトロン間のＥＳＥリッチ配列
配列表４１ ＜２２３＞ミルトロン１フォワードオリゴヌクレオチド
配列表４２ ＜２２３＞ミルトロン２フォワードオリゴヌクレオチド
配列表４３ ＜２２３＞ミルトロン３フォワードオリゴヌクレオチド
配列表４４ ＜２２３＞ミルトロン４フォワードオリゴヌクレオチド
配列表４５ ＜２２３＞ミルトロン５Ｈフォワードオリゴヌクレオチド
配列表４６ ＜２２３＞ミルトロン６フォワードオリゴヌクレオチド
配列表４７ ＜２２３＞ミルトロン７フォワードオリゴヌクレオチド
配列表４８ ＜２２３＞ミルトロン１リバースオリゴヌクレオチド
配列表４９ ＜２２３＞ミルトロン２リバースオリゴヌクレオチド
配列表５０ ＜２２３＞ミルトロン３リバースオリゴヌクレオチド
配列表５１ ＜２２３＞ミルトロン４リバースオリゴヌクレオチド
配列表５２ ＜２２３＞ミルトロン５Ｈリバースオリゴヌクレオチド
配列表５３ ＜２２３＞ミルトロン６リバースオリゴヌクレオチド
配列表５４ ＜２２３＞ミルトロン７リバースオリゴヌクレオチド
配列表５５ ＜２２３＞ミルトロン５Ｍ
配列表５６ ＜２２３＞ミルトロン５Ｍフォワードオリゴヌクレオチド
配列表５７ ＜２２３＞ミルトロン５Ｍリバースオリゴヌクレオチド
配列表５８ ＜２２３＞ミルトロンＭ２Ｕ－Ｍ２
配列表５９ ＜２２３＞ミルトロンＭ２Ｕ－Ｍ２フォワードオリゴヌクレオチド
配列表６０ ＜２２３＞ミルトロンＭ２Ｕ－Ｍ２リバースオリゴヌクレオチド
配列表６１ ＜２２３＞ミルトロンＳｃｒ－Ｍ２
配列表６２ ＜２２３＞ミルトロンＳｃｒ－Ｍ２フォワードオリゴヌクレオチド
配列表６３ ＜２２３＞ミルトロンＳｃｒ－Ｍ２リバースオリゴヌクレオチド
配列表６４ ＜２２３＞ベクターＡＡＶ２／８Ｙ７３３Ｆ．ＲＨＯｐ．Ｅｘ／Ｉｎｔ．Ｍ３／Ｍ５．ＲＨＯＭ３／５Ｒ
配列表６５ ＜２２３＞ＡＡＶ２／８Ｙ７３３Ｆ．ＲＨＯｐ．Ｅｘ／Ｉｎｔ．Ｍ３／Ｍ５Ｍ．ＲＨＯＭ３／５Ｒ
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18A】
【図18B】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【配列表】