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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-19
(45)【発行日】2024-08-27
(54)【発明の名称】ペプチド－ＭＨＣ ＣＯＭＰＡＣＴ
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20240820BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240820BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240820BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240820BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240820BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240820BHJP
C40B 40/08 20060101ALI20240820BHJP
C40B 40/02 20060101ALI20240820BHJP
C40B 40/10 20060101ALI20240820BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20240820BHJP
C07K 14/74 20060101ALN20240820BHJP
C12P 21/00 20060101ALN20240820BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C40B40/08
C40B40/02
C40B40/10
C12N5/0783
C07K14/74
C12P21/00 C
【請求項の数】
17
(21)【出願番号】P 2020554413
(86)(22)【出願日】2019-04-02
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-08-19
(86)【国際出願番号】 US2019025415
(87)【国際公開番号】W WO2019195310
(87)【国際公開日】2019-10-10
【審査請求日】2022-03-30
(31)【優先権主張番号】62/651,639
(32)【優先日】2018-04-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】520032608
【氏名又は名称】パクト ファーマ インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＰＡＣＴ ＰＨＡＲＭＡ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】ベトゥーン， マイケル ティー．
(72)【発明者】
【氏名】ジャコビー， カイル マーティン
(72)【発明者】
【氏名】パオ， シアオイェン ロバート
(72)【発明者】
【氏名】ダルマス， オリヴィエ
(72)【発明者】
【氏名】パン， チョン
(72)【発明者】
【氏名】センニノ， バーバラ
(72)【発明者】
【氏名】フランズソフ， アレックス
(72)【発明者】
【氏名】ポン， ソンミン
【審査官】中野 あい
(56)【参考文献】
【文献】米国特許第０８８９５０２０（ＵＳ，Ｂ２）
【文献】国際公開第２０１５／１５３９６９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】豪国特許出願公開第２００７２０３６０７（ＡＵ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
５’から３’の方向に、３つのフレーム内に終止コドンを含む配列挿入物、ベータ２ミクログロブリン（β２Ｍ）配列、および多重組織適合性複合体（ＭＨＣ）対立遺伝子配列を含む、ポリヌクレオチド分子。
【請求項2】
配列挿入物は、第１のユニバーサル標的配列、および／または第２のユニバーサル標的配列の側部に位置する、請求項１に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項3】
ａ）ＭＨＣ対立遺伝子が哺乳動物ＭＨＣ対立遺伝子である、および／または、ｂ）β２Ｍ対立遺伝子が、哺乳動物β２Ｍ対立遺伝子である、
請求項１または２に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項4】
ａ）ＭＨＣ対立遺伝子がヒトＭＨＣ対立遺伝子である、
ｂ）ＭＨＣ対立遺伝子がクラスＩ ＨＬＡ対立遺伝子である、
ｃ）ＭＨＣ対立遺伝子が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃからなる群から選択される、
ｄ）ＭＨＣ対立遺伝子が、ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊６８：０１、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２６：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊６８：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３９：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４６：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５０：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０７、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４１：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０５、ＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０１：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２およびＨＬＡ－Ｃ＊１７：０１からなる群から選択される、
ｅ）ＭＨＣ対立遺伝子が、配列番号１０９～１７４からなる群から選択される配列を含む、
ｆ）β２Ｍ対立遺伝子がヒトβ２Ｍ対立遺伝子である、および／または
ｇ）β２Ｍ対立遺伝子が、配列番号１０６に示される配列を含む、
請求項３に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項5】
ａ）第１のユニバーサル標的配列が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー標的配列を含む；ｂ）第１のユニバーサル標的配列が制限酵素切断部位を含む；
ｃ）第１のユニバーサル標的配列がシグナル配列を含む；
ｄ）第１のユニバーサル標的配列が、配列番号３に示される配列を含む；
ｅ）第２のユニバーサル標的配列が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー標的配列を含む；
ｆ）第２のユニバーサル標的配列が制限酵素切断部位を含む；
ｇ）第２のユニバーサル標的配列がシグナル配列を含む；
ｈ）第２のユニバーサル標的配列が、配列番号４に示される配列を含む；および／または、
ｉ）第２のユニバーサル標的配列が第１のリンカー配列をさらに含む、
請求項１から４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項6】
ポリヌクレオチド配列の３’末端が、（ｉ）第１の親和性タグ配列；
（ｉｉ）プロテアーゼ切断部位配列；および／または、
（ｉｉｉ）第２の親和性タグ配列
を含む精製クラスター配列をさらに含む、
請求項１から５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項7】
ａ）β２Ｍ配列とＭＨＣ対立遺伝子配列との間に位置する第２のリンカー配列；および／または、ｂ）ＭＨＣ対立遺伝子配列と第１の親和性タグとの間の第３のリンカー配列；
ｃ）第１のユニバーサル標的の５’末端に連結されたプロモーター配列；および／または、
ｄ）ポリアデニル化（ポリＡ）配列
をさらに含む、
請求項１から６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項8】
ａ）シグナル配列が、ヒト成長ホルモンシグナル配列、ｈＩＧ１カッパ軽鎖シグナル配列、ベータ２ミクログロブリンシグナル配列、またはＩＬ２シグナル配列を含むポリペプチドをコードする；
ｂ）シグナル配列が、ヒト成長ホルモンシグナル配列を含むポリペプチドをコードする；
ｃ）第１のリンカー配列が、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１６、および配列番号１８からなる群から選択される配列を含む；
ｄ）第１の親和性タグ配列が、ＡｖｉＴａｇ、ストレプトアビジン－タグ、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ６）－タグ、ＦＬＡＧ－タグ、ＨＡ－タグ、およびＭｙｃ－タグからなる群から選択される；
ｅ）プロテアーゼ切断部位配列が、ＴＥＶ切断部位配列、トロンビン切断部位配列、第Ｘａ因子切断部位配列、エンテロペプチダーゼ切断部位配列、およびライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位配列からなる群から選択される；
ｆ）第２の親和性タグ配列が、ＡｖｉＴａｇ、ストレプトアビジン－タグ、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ６）－タグ、ＦＬＡＧ－タグ、ＨＡ－タグ、およびＭｙｃ－タグからなる群から選択される；
ｇ）第２のユニバーサル標的配列が第１のリンカー配列を含む；
ｈ）第２のリンカー配列が、配列番号１０または配列番号２０に示される配列を含む；
ｉ）第３のリンカー配列が、配列番号１２または配列番号２２に示される配列を含む；
ｊ）プロモーター配列が、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、およびＳＶ４０プロモーターからなる群から選択される；
ｋ）プロモーター配列が、ＣＭＶプロモーターである；
ｌ）ポリＡ配列が、ｂＧＨポリＡ配列、ＳＶ４０ポリＡ配列、ｈＧＨポリＡ配列、およびｒｂＧｌｏｂポリＡ配列からなる群から選択される；および／または
ｍ）ポリＡ配列が、ｂＧＨポリＡ配列である、
請求項７に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項9】
請求項１から８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド分子を含む発現コンストラクト。
【請求項10】
プラスミドまたはウイルスベクターを含む、請求項９に記載の発現コンストラクト。
【請求項11】
請求項１から８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド分子または請求項９または１０に記載の発現コンストラクトを含む宿主細胞。
【請求項12】
ａ）宿主細胞が哺乳動物細胞である；
ｂ）宿主細胞がヒト細胞である；
ｃ）宿主細胞が幹細胞、腫瘍細胞、不死化細胞、および胎児細胞からなる群から選択される；
ｄ）宿主細胞が原核細胞である；
ｅ）宿主細胞が大腸菌（Escherichia coli）細胞である；または
ｆ）宿主細胞がＢｉｒＡタンパク質またはその断片を発現する細胞である、
請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項13】
ポリヌクレオチドが細胞ゲノムに組み込まれている、またはポリヌクレオチドが染色体外である、請求項１１または１２に記載の宿主細胞。
【請求項14】
請求項１から８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド分子、請求項９もしくは１０に記載の発現コンストラクト、または請求項１１から１３のいずれか一項に記載の宿主細胞を含むライブラリー。
【請求項15】
ａ）ライブラリーが、約２０～約５００個の異なるポリヌクレオチド分子、発現コンストラクト、または宿主細胞を含む；および／または
ｂ）ライブラリーが、少なくとも６６個の異なるポリヌクレオチド分子、発現コンストラクト、または宿主細胞を含む、
請求項１４に記載のライブラリー。
【請求項16】
請求項１から８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド分子、請求項９もしくは１０に記載の発現コンストラクト、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の宿主細胞、または請求項１４もしくは１５に記載のライブラリー、および使用説明書を含むキット。
【請求項17】
抗原特異的Ｔ細胞を単離するための方法であって、ａ．請求項１から８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド分子、請求項９もしくは１０に記載の発現コンストラクト、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の宿主細胞、または請求項１４もしくは１５に記載のライブラリーに、抗原ペプチドをコードするヌクレオチドを挿入すること；
ｂ．ステップａのポリヌクレオチド分子からポリペプチド分子を発現させること；
ｃ．粒子がそれぞれステップｂのポリペプチドを含む、複数の粒子を用意すること；
ｄ．１つ以上のＴ細胞を含むことが分かっているかまたは疑われる試料を提供すること；
ｅ．ステップｂのポリペプチドまたはステップｃの粒子を試料と接触させることであって、粒子に結合したポリペプチドに単一のＴ細胞が結合するのに十分な条件を提供することを含む、接触させること；ならびに
ｆ．粒子と結合した単一のＴ細胞を単離すること
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１８年４月２日に出願された米国仮出願第６２／６５１，６３９号の利益を主張し、これは、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１８年４月２日に出願された米国仮出願第６２／６５１，６３９号の利益を主張し、これは、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０ＸＸ年ＸＸ月に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、ＸＸＸＸＸＵＳ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称であり、サイズはＸ，ＸＸＸ，ＸＸＸバイトである。
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０ＸＸ年ＸＸ月に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、ＸＸＸＸＸＵＳ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称であり、サイズはＸ，ＸＸＸ，ＸＸＸバイトである。
【背景技術】
【0003】
Ｔ細胞は、適応免疫の主要なメディエーターである。各Ｔ細胞の固有のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の特異性によって指示され、Ｔ細胞は、自己免疫を調節し、Ｂ細胞と先天性エフェクターの活性化を助け、正確に標的化された方法で感染細胞およびがん性細胞を直接死滅させる。各ＴＣＲは、標的細胞上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子によって提示されるリガンドを認識する。関連するペプチド－ＭＨＣ複合体リガンドの同定は、腫瘍および病原体に対する免疫応答の理解において役割を果たす。ＭＨＣ複合体リガンドはまた、自己抗原および食餌性抗原に対する応答を理解するのに有用である。この理解により、標的抗原に対する免疫応答を開始、増幅、または弱める臨床的に有益な免疫療法（例えば、ＴＣＲ遺伝子導入およびワクチン）が可能になる。
【0004】
突然変異した「ネオエピトープ」は、がんに対する内因性および操作された免疫応答の重要な標的である。ネオエピトープ反応性ＴＩＬは、内因性レパートリーに存在し、養子免疫伝達時に腫瘍を退縮させる。同様に、腫瘍突然変異負荷は、ＣＴＬＡ－４またはＰＤ－１ブロックの臨床的有効性を予測し、これらのチェックポイント阻害戦略は、ネオエピトープ反応性Ｔ細胞を解放することによって腫瘍縮小に影響することを示唆している。ネオエピトープは腫瘍細胞の体細胞突然変異に起因するため、中枢性免疫寛容を誘導するために胸腺上皮細胞によって一般的には提示されない。したがって、これらのネオエピトープで指向されるＴ細胞応答は、腫瘍特異的であり、おそらく高親和性であり、患者特異的（すなわち、プライベート）である。臨床的観点からは、これは機会および挑戦である：ネオエピトープは免疫療法の優れた標的であるが、ＴＣＲ単離法は、臨床的に有用なスケールでの治療応用を可能にするために十分に高いスループットであるべきである。
【0005】
基礎研究とトランスレーショナル研究の両方のための迅速であり、強固なＴＣＲリガンド発見技術に対する満たされていないニーズが存在する。ペプチド－ＭＨＣ多量体は、それらのＴＣＲの抗原特異性に従ってＴ細胞の選別を可能にし、これは遺伝子治療のための腫瘍特異的ＴＣＲを単離する重要な工程である。典型的な現在のペプチド－ＭＨＣ生成プロトコールは、目的とするペプチドリガンド（複数可）の固相合成から開始する。並行して、ユニバーサルなβ２－ミクログロブリンおよび関連するＭＨＣクラスＩ分子を大腸菌（Escherichia coli）で異種発現させ、ミスフォールドされた封入体が生じる。各ペプチドは、β２Ｍおよび関連するＭＨＣ Ｉ分子を含有するリフォールディング反応に添加される。最後に、正確にリフォールドする三元複合体の一部を精製し、ペプチド－ＭＨＣ多量体生成に使用するために製剤化することができる。Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒおよび同僚は、多くの異なるペプチドリガンドを有する特定のＭＨＣ分子の並行生成を容易にするために、条件付きリガンドとして特定のＭＨＣ分子に結合する光開裂性ペプチドを考案した。単一のリフォールディング反応を行い、条件付きリガンドに結合したＭＨＣ分子を生成する。ＵＶ光に曝露した場合、条件付きリガンドを切断し、過剰に存在する所望のペプチドと交換する。このような交換反応の多くは並行して行うことができ、その特定のＭＨＣ対立遺伝子のためのｐＭＨＣライブラリーの構築を可能にする。それにもかかわらず、この最先端技術には困難な限界がある。第１に、大腸菌封入体で発現されるＭＨＣ分子の生成、精製、およびリフォールディングは困難であり、適切にフォールドされたペプチド－ＭＨＣ複合体は低い収率で生成される。第２に、市販のペプチド合成の検査所要時間（週）は、患者特異的なネオエピトープに指向された個別化オンデマンドＴＣＲ遺伝子治療の状況において最適な時間スケールと調和しない。第３に、多くの予測されるリガンドは、ペプチドの生物物理学的特性（例え、疎水性）がその合成または交換を妨げるため、この手法を通じてＴ細胞をスクリーニングするために用いることができない。第４に、交換効率は一般的に低い（予測されるＨＬＡ結合ペプチドの大部分について、交換効率が５０％未満である）。適切にフォールディングされた交換ＭＨＣとミスフォールドされた非リガンド型ＭＨＣの混合物は、低シグナル対ノイズの多量体染色をもたらす。この問題は、多重化されたペプチド－ＭＨＣ試薬プールでＴ細胞をスクリーニングする場合に悪化する。第５に、各新規ＭＨＣ対立遺伝子の条付きリガンドの設計および妥当性検証は、困難であり、頑強ではない作業である。ＭＨＣ遺伝子座はヒトゲノム中で最も多重な対立遺伝子座であるため、これは多様なＭＨＣハプロタイプの患者全体にわたってネオエピトープ標的遺伝子治療を行う上で大きな障害となる。まとめると、これらの限界は、この分野における新規技術の必要性を強調する。本明細書には、これらの制限に対処するペプチド－ＭＨＣ多量体を生成するための種々の組成物および方法が開示される。
【発明の概要】
【0006】
本明細書に記載される方法および組成物は、免疫応答によって標的化された抗原の迅速な同定およびＴ細胞の単離、したがって、その応答を媒介するＴＣＲ配列を可能にする。この迅速な同定は、感染症、腫瘍免疫、自己免疫、および免疫療法の分野における研究および医薬品開発の目標である。組成物は、医薬品開発のための抗原特異的Ｔ細胞およびそれらのコードされたＭＨＣ Ｉ制限ＴＣＲを同定し、単離するために適用することができる。抗原特異的Ｔ細胞の同定および特徴付けはまた、（治療前および治療後の）処置の状況における免疫応答および疾患の診断、モニタリングおよび予後にも適用され得る。ｃｏｍＰＡＣＴ手法はまた、ＭＨＣ ＩＩ制限Ｔ細胞応答の標的を同定するために適用され得る。このような応答は自己免疫疾患の中心であり、がん免疫療法の重要な構成要素として浮上してきている。さらに、本明細書に記載された方法で生成された哺乳動物細胞発現データからのｃｏｍＰＡＣＴタンパク質分泌の効率は、適切なタンパク質フォールディングの代理メトリックとして、したがって、そのコグネイトＭＨＣ分子に対する各ネオエピトープリガンドの親和性として潜在的に有用である。次に、この技術により、あまり十分に研究されていないＭＨＣ対立遺伝子に対するＭＨＣ結合アルゴリズムを改良し、ネオエピトープワクチンなどの他の標的免疫療法を改善する独自の能力が得られる可能性がある。したがって、本明細書に開示される組成物は、ヒトの健康に広く適用され、明確な市販の可能性を有する。
【0007】
一態様では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド分子は、５’から３’の方向に、（ｉ）第１のユニバーサル標的配列、（ｉｉ）抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）第１のユニバーサル標的配列とは異なる第２のユニバーサル標的配列、（ｉｖ）ベータ２ミクログロブリン（β２Ｍ）配列、および（ｖ）多重組織適合性複合体（ＭＨＣ）対立遺伝子配列を含む。一実施形態では、ポリヌクレオチド分子は、５’から３’の方向に、（ｉ）プロモーター配列、（ｉｉ）配列番号３に示される配列を含む第１のユニバーサル標的配列、（ｉｉｉ）抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、抗原ペプチドが腫瘍ネオ抗原であるヌクレオチド配列、（ｉｖ）配列番号４に示される配列を含む第２のユニバーサル標的配列、（ｖ）配列番号１０６に示される配列を含むβ２Ｍ配列、（ｖｉ）配列番号１０９～１７４に示される配列からなる群から選択される配列を含むＭＨＣ対立遺伝子配列、（ｖｉｉ）配列番号２９に示される配列を含む第１の親和性タグ配列、（ｖｉｉ）配列番号３１に示される配列を含むプロテアーゼ切断部位配列、および（ｉｘ）配列番号３５に示される配列を含む第２の親和性タグ配列を含む。
【0008】
一実施形態では、抗原ペプチドは、腫瘍抗原、ネオ抗原、腫瘍ネオ抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、ホスホ抗原、および微生物抗原からなる群から選択される。別の実施形態では、抗原ペプチドは、ネオ抗原である。
【0009】
一部の実施形態では、ネオ抗原は、１つ以上の体細胞突然変異を同定するために、対象からの腫瘍配列決定データを分析することによって選択される。一実施形態では、分析は、インシリコ予測アルゴリズムを用いて行われる。別の実施形態では、予測アルゴリズムは、ネオ抗原とＭＨＣ対立遺伝子との間の結合を予測するためのＭＨＣ結合アルゴリズムをさらに含む。
【0010】
一部の実施形態では、ＭＨＣ対立遺伝子は、哺乳動物ＭＨＣ対立遺伝子である。一部の実施形態では、ＭＨＣ対立遺伝子は、ヒトＭＨＣ対立遺伝子である。一部の実施形態では、ＭＨＣ対立遺伝子はクラスＩ ＨＬＡ対立遺伝子である。他の実施形態では、ＨＬＡ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃ対立遺伝子を含む。ＨＬＡ対立遺伝子は、対象のＨＬＡ対立遺伝子である。
【0011】
一部の実施形態では、ＨＬＡ対立遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊６８：０１、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２６：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊６８：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３９：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４６：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５０：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０７、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４１：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０５、ＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０１：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２、およびＨＬＡ－Ｃ＊１７：０１からなる群から選択される。
【0012】
一部の実施形態では、ＨＬＡ対立遺伝子は、配列番号１０９～１７４からなる群から選択される配列を含む。
【0013】
一部の実施形態では、β２Ｍ対立遺伝子は、哺乳動物β２Ｍ対立遺伝子である。一部の実施形態では、β２Ｍ対立遺伝子はヒトβ２Ｍ対立遺伝子である。一部の実施形態では、β２Ｍ対立遺伝子は、配列番号１０６に示される配列を含む。
【0014】
一部の実施形態では、抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、２０～６０、２０～３０、２５～３５、２０～４５、３０～４５、４０～６０、または４５～６０ヌクレオチド長である。一実施形態では、抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、２０～３０ヌクレオチド長である。
【0015】
一部の実施形態では、第１のユニバーサル標的配列は、４～５０、４～１５、１５～４０、１５～３５、１５～３０、２０～４０、２５～４０、または３０～４０ヌクレオチド長である。一実施形態では、第１のユニバーサル標的配列は、２５～３５ヌクレオチド長である。別の実施形態では、第１のユニバーサル標的配列は、少なくとも約１５ヌクレオチド長である。別の実施形態では、第１のユニバーサル標的配列は、４～６ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、第２のユニバーサル標的配列は、４～５０、４～１５、１５～４０、１５～３５、１５～３０、２０～４０、２５～４０、または３０～４０ヌクレオチド長である。一実施形態では、第２のユニバーサル標的配列は、２５～３５ヌクレオチド長である。別の実施形態では、第２のユニバーサル標的配列は、少なくとも約１５ヌクレオチド長である。別の実施形態では、第２のユニバーサル標的配列は、４～６ヌクレオチド長である。
【0016】
一部の実施形態では、第１および第２のユニバーサル標的配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー標的配列を含む。他の実施形態では、第１および第２のユニバーサル標的配列は、制限酵素切断部位を含む。
【0017】
一部の実施形態では、第１のユニバーサル標的の配列は、配列番号３に示される配列を含む。一部の実施形態では、第２のユニバーサル標的の配列は、配列番号４に示される配列を含む。
【0018】
一部の実施形態では、第１のユニバーサル標的配列は、シグナル配列をさらに含む。一部の実施形態では、シグナル配列は、ヒト成長ホルモンシグナル配列、ｈＩＧ１カッパ軽鎖シグナル配列、ベータ２ミクログロブリンシグナル配列、またはＩＬ２シグナル配列を含むシグナル配列をコードする。一部の実施形態では、シグナル配列は、配列番号１、２４、２６、または２８に示される配列を含む配列を含む。一実施形態では、シグナル配列はヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）をコードする。一部の実施形態では、シグナル配列は、配列番号１に示される配列を含む。一実施形態では、シグナル配列は、４０～９０、４０～６０、４５～７０、５０～８０、６０～９０、５５～７０、６０～８０、または７０～８０ヌクレオチド長である。
【0019】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列の３’末端は、さらに、５’から３’の方向に、（ｉ）第１の親和性タグ配列、（ｉｉ）プロテアーゼ切断部位配列、および（ｉｉｉ）第２の親和性タグ配列を含む精製クラスター配列を含む。一部の実施形態では、第１および第２の親和性タグは、ＡｖｉＴａｇ、ストレプトアビジン－タグ、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ６）－タグ、ＦＬＡＧ－タグ、ＨＡ－タグ、およびＭｙｃ－タグからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の親和性タグは、配列番号２９に示される配列を含む配列を含み、第２の親和性タグは、配列番号３３に示される配列を含む配列を含む。
【0020】
一部の実施形態では、プロテアーゼ切断部位配列は、ＴＥＶ切断部位配列、トロンビン切断部位配列、第Ｘａ因子切断部位配列、エンテロペプチダーゼ切断部位配列、およびライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位配列からなる群から選択される。一実施形態では、プロテアーゼ切断部位配列は、配列番号３１に示されるＴＥＶ切断部位配列を含む。一部の実施形態では、第１の親和性タグ配列はＡｖｉＴａｇペプチドをコードし、プロテアーゼ切断部位配列はＴＥＶ切断部位をコードし、第２の親和性タグはＨｉｓ６ペプチドをコードする。一実施形態では、第１の親和性タグ配列は配列番号２９に示される配列を含み、プロテアーゼ切断部位は配列番号３１に示される配列を含み、第２の親和性タグは配列番号３３に示される配列を含む。
【0021】
一部の実施形態では、第２のユニバーサル標的配列は、第１のリンカー配列をさらに含む。一実施形態では、第１のリンカー配列は、配列番号１０、１４、１６、または１８に示される配列を含む。
【0022】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、β２Ｍ配列とＭＨＣ対立遺伝子配列との間に第２のリンカー配列をさらに含む。一実施形態では、第２のリンカー配列は、配列番号１０または２０に示される配列を含む。
【0023】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＭＨＣ対立遺伝子配列と第１の親和性タグとの間に第３のリンカー配列をさらに含む。一実施形態では、第３のリンカー配列は、配列番号１２または２２に示される配列を含む。
【0024】
ポリヌクレオチド配列の５’末端は、第１のユニバーサル標的の５’末端に連結されたプロモーター配列をさらに含み得る。一部の実施形態では、プロモーター配列は、ＣＭＶ、ＥＦ１α、またはＳＶ４０プロモーターである。一実施形態では、プロモーター配列はＣＭＶプロモーターである。一実施形態では、プロモーター配列はＣＭＶプロモーター配列である。
【0025】
ポリヌクレオチド配列の３’末端は、ポリＡ配列をさらに含むことができる。一部の実施形態では、ポリＡ配列は、ＳＶ４０、ｈＧＨ、ＢＨＧ、またはｒｂＧｌｏｂポリＡ配列である。一実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号１７９に示されるｂＧＨポリＡ配列を含む。
【0026】
一実施形態では、ポリヌクレオチド分子は、５’から３’の方向に、（ｉ）プロモーター配列、（ｉｉ）第１のユニバーサル標的配列、（ｉｉｉ）抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列、（ｉｖ）第１のユニバーサル標的配列とは異なる第２のユニバーサル標的配列、（ｖ）β２Ｍ配列、（ｖ）ＭＨＣ対立遺伝子配列、（ｖｉ）第１の親和性タグ配列、（ｖｉｉ）プロテアーゼ切断部位配列、および（ｖｉｉ）第２の親和性タグ配列を含む。
【0027】
別の態様では、本明細書には、本明細書に開示されるポリヌクレオチド分子を含む発現コンストラクトが記載される。一実施形態では、発現コンストラクトは、プラスミドまたはウイルスベクターを含む。
【0028】
別の態様では、本明細書には、前述されるように、ポリヌクレオチド分子または発現コンストラクトを含む宿主細胞が記載される。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞ゲノムに組み込まれている。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは染色体外である。一部の実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞はヒト細胞である。一実施形態では、細胞は、幹細胞、腫瘍細胞、不死化細胞、または胎児細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は原核細胞である。一部の実施形態では、細胞は大腸菌細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ＢｉｒＡタンパク質またはその断片を発現する。
【0029】
さらに別の態様では、本明細書には、本明細書に記載されるポリヌクレオチド分子または発現コンストラクトを含むライブラリーであって、ライブラリーが、２つ以上の異なるポリヌクレオチド分子を含み、各々異なるポリヌクレオチド分子が、（ｉ）第１のユニバーサル配列、（ｉｉ）抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ヌクレオチド配列が、２つ以上のポリヌクレオチド分子の各々に対して同一でないヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）第２のユニバーサル標的配列、（ｉｖ）β２Ｍ配列、および（ｖ）ＭＨＣ対立遺伝子配列を含む、ライブラリーが記載される。一実施形態では、ＭＨＣ対立遺伝子配列は、２つ以上のポリヌクレオチド分子の各々に対して同一でない。別の実施形態では、ライブラリーは、２０～５００個の異なるポリヌクレオチド分子を含む。一部の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも６６個の異なるポリヌクレオチド分子を含む。
【0030】
一部の実施形態では、ライブラリーは、少なくともＨＬＡ－Ａ＊０１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊６８：０１、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２６：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊６８：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３９：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４６：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５０：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０７、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４１：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０５、ＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０１：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２、およびＨＬＡ－Ｃ＊１７：０１対立遺伝子を含む。一部の実施形態では、ライブラリーは、配列番号１０９～１７４に示される少なくとも配列を含む。
【0031】
別の態様では、本明細書には、アミノ末端からカルボキシル末端の方向に、（ｉ）第１のユニバーサル標的ペプチド、（ｉｉ）抗原ペプチド、（ｉｉｉ）第１のユニバーサル標的ペプチドとは異なる第２のユニバーサル標的ペプチド、（ｉｖ）β２Ｍペプチド、および（ｖ）ＭＨＣペプチドを含むポリペプチドが記載される。一部の実施形態では、抗原ペプチドは、腫瘍抗原、ネオ抗原、腫瘍ネオ抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、ホスホ抗原、および微生物抗原からなる群から選択される。一実施形態では、抗原ペプチドはネオ抗原である。
【0032】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、５’から３’の方向に、（ｉ）配列番号２に示される配列を含むプロモーターペプチド、（ｉｉ）第１のユニバーサル標的ペプチド、（ｉｉｉ）抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、抗原ペプチドが腫瘍ネオ抗原であるヌクレオチド配列、（ｉｖ）配列番号１５または１７に示される配列を含む第２のユニバーサル標的ペプチド、（ｖ）配列番号１０５に示される配列を含むβ２Ｍペプチド、（ｖｉ）配列番号３８～１０３に示される配列を含むＭＨＣペプチド、（ｖｉｉ）配列番号３０に示される配列を含む第１の親和性ペプチド、（ｖｉｉｉ）配列番号３２に示される配列を含むプロテアーゼ切断部位ペプチド、および（ｉｘ）配列番号３６に示される配列を含む第２の親和性ペプチドを含む。
【0033】
一部の実施形態では、ネオ抗原は、１つ以上の体細胞突然変異を同定するために、対象からの腫瘍配列決定データを分析することによって選択される。一実施形態では、分析は、インシリコ予測アルゴリズムを用いて行われる。別の実施形態では、予測アルゴリズムは、ネオ抗原とＭＨＣペプチドとの間の結合を予測するためのＭＨＣ結合アルゴリズムをさらに含む。
【0034】
一実施形態では、抗原ペプチドは、７～１５アミノ酸、７～１０、８～９、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５アミノ酸長である。
【0035】
一部の実施形態では、ＭＨＣペプチドは、哺乳動物ＭＨＣペプチドである。一部の実施形態では、ＭＨＣペプチドは、ヒトＭＨＣペプチドである。一部の実施形態では、ＭＨＣペプチドは、クラスＩ ＨＬＡペプチドである。他の実施形態では、ＨＬＡペプチドは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃペプチドを含む。一実施形態では、ＨＬＡペプチドは、対象のＨＬＡペプチドである。一実施形態では、ＨＬＡペプチドは、Ｙ８４ＡまたはＹ８４Ｃ突然変異を含む。
【0036】
一部の実施形態では、β２Ｍペプチドは、哺乳動物β２Ｍペプチドである。一部の実施形態では、β２Ｍペプチドはヒトβ２Ｍペプチドである。一部の実施形態では、β２Ｍペプチドは、配列番号１０５に示される配列を含む。別の実施形態では、β２ＭペプチドはＳ８８Ｃ突然変異を含む。一部の実施形態では、β２Ｍペプチドは、アミノ酸８８におけるＳ８８Ｃ突然変異を含む、配列番号１０７に示される配列を含む。
【0037】
一部の実施形態では、ＨＬＡペプチドは、ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊６８：０１、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２６：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊６８：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３９：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４６：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５０：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０７、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４１：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０５、ＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０１：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２、またはＨＬＡ－Ｃ＊１７：０１を含む。一部の実施形態では、ＨＬＡペプチドは、配列番号３８～１０３からなる群から選択される配列を含む。
【0038】
一部の実施形態では、第１のユニバーサル標的ペプチドは、シグナルペプチドをさらに含む。一実施形態では、シグナル配列は、１５～４５、１５～３０、２０～４５、２０～３０、または３０～４５アミノ酸長である。一実施形態では、シグナルペプチドはヒト成長ホルモンを含む。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、ヒト成長ホルモンシグナルペプチド、ｈＩＧ１カッパ軽鎖シグナルペプチド、ベータ２ミクログロブリンシグナルペプチド、またはＩＬ２シグナルペプチドを含む。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号２、２３、２５、または２７に示される配列を含む配列を含む。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号２に示されるヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）シグナルペプチド配列を含む。一実施形態では、第２のユニバーサル標的ペプチドは、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを含む。一実施形態では第２のユニバーサル標的ペプチドは、配列番号１５または１７に示される配列を含む。
【0039】
一部の実施形態では、ポリペプチドのカルボキシル末端は、アミノ末端からカルボキシル末端の方向に、（ｉ）第１の親和性ペプチド、（ｉｉ）プロテアーゼ切断部位、および（ｉｉｉ）第２の親和性ペプチドを含む精製クラスターをさらに含み得る。一部の実施形態では、第１および第２の親和性ペプチドは、ＡｖｉＴａｇ、ストレプ－タグ、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ６）－タグ、ＦＬＡＧ－タグ、ＨＡ－タグ、および／またはＭｙｃ－タグからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の親和性ペプチドは配列番号３０を含む配列を含み、第２の親和性ペプチドは配列番号３４を含む配列を含む。
【0040】
一部の実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、ＴＥＶ切断部位、トロンビン切断部位、第Ｘａ因子切断部位、エンテロペプチダーゼ切断部位、またはライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位である。一部の実施形態では、精製クラスターは、ＡｖｉＴａｇエピトープ、ＴＥＶ切断部位、およびＨｉｓ６エピトープを含む。一部の実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、配列番号３２に示されるＴＥＶ切断部位配列を含む。一部の実施形態では、精製クラスターは、配列番号３０に示されるＡｖｉＴａｇペプチド配列、配列番号３２に示されるＴＥＶ切断部位配列、および配列番号３４または３６に示されるＨｉｓ６ペプチド配列を含む。一部の実施形態では、精製クラスターは、配列番号３４に示されるＨｉｓ６ペプチド配列の２コピー以上を含む。一部の実施形態では、精製クラスターは、配列番号３７に示される配列を含む。
【0041】
一部の実施形態では、第２のユニバーサル標的ペプチドは、配列番号９、１１、１５、または１７に示される配列を含むリンカーをさらに含む。
【0042】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、β２Ｍ配列とＭＨＣ対立遺伝子配列との間に第２のリンカー配列を含む。一部の実施形態では、第２のリンカー配列は、配列番号９または１９に示される配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＭＨＣ対立遺伝子配列と第１の親和性タグとの間に第３のリンカー配列をさらに含む。一部の実施形態では、第３のリンカー配列は、配列番号１３または２１に示される配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ビオチン化される。
【0043】
一実施形態では、ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端の方向に、（ｉ）第１のユニバーサル標的ペプチド、（ｉｉ）抗原ペプチド、（ｉｉｉ）第２のユニバーサル標的ペプチド、（ｉｖ）β２Ｍペプチド、（ｖ）ＭＨＣペプチド、（ｖｉ）第１の親和性タグペプチド、（ｖｉｉ）プロテアーゼ切断部位、および（ｖｉｉ）第２の親和性タグペプチドを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ビオチン化される。
【0044】
別の態様では、本明細書には、２つ以上の異なるポリペプチド分子を含むライブラリーが開示され、異なるポリペプチド分子は、（ｉ）第１のユニバーサル標的ペプチド、（ｉｉ）抗原ペプチドが２つ以上のポリペプチド分子の各々に対して同一でない抗原ペプチド、（ｉｉｉ）第１のユニバーサル標的ペプチドとは異なる第２のユニバーサル標的ペプチド、（ｉｖ）β２Ｍペプチド、および（ｖ）ＭＨＣペプチドを含む。一実施形態では、ＭＨＣペプチドは、２つ以上のポリペプチド分子の各々に対して同一でない。別の実施形態では、ライブラリーは、２０～５００個の異なるポリペプチド分子を含む。一部の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも６６個の異なるポリペプチドを含む。
【0045】
一部の実施形態では、ライブラリーは、ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊６８：０１、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２６：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊６８：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３９：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４６：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５０：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０７、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４１：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０５、ＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０１：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２、およびＨＬＡ－Ｃ＊１７：０１ポリペプチドを含む。
【0046】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、粒子に結合され、粒子は、表面、ナノ粒子、ビーズ、またはポリマーである。一実施形態では、ポリペプチドは、リンカーを介して粒子に結合される。一実施形態では、粒子はナノ粒子であり、ナノ粒子は磁性ナノ粒子またはポリスチレンナノ粒子である。一実施形態では、磁性ナノ粒子は、磁性酸化鉄を含む。別の実施形態では、ビーズは、アガロースビーズまたはセファロースビーズである。一部の実施形態では、粒子に結合したポリペプチドは、フルオロフォアをさらに含む。一実施形態では、フルオロフォアは、リンカーの有無にかかわらず、粒子に結合している。
【0047】
一部の実施形態では、ポリペプチドのライブラリーは、粒子に結合しており、ライブラリーは、２つ以上の異なるポリペプチド分子を含み、抗原ペプチドは、２つ以上のポリペプチド分子の各々に対して同一でなく、各々異なるポリペプチドは、粒子に結合される。一実施形態では、ＭＨＣペプチドは、２つ以上のポリペプチド分子の各々に対して同一でない。一実施形態では、ライブラリーは、各々異なるポリペプチドの同一性と作動可能に関連付けられた固有の定義されたバーコード配列をさらに含む。別の実施形態では、ライブラリーは、２０～５００個の異なるポリペプチドを含む。別の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも６６個の異なるポリペプチドを含む。
【0048】
別の態様では、本明細書に記載されるキットは、上記の実施形態のいずれかの組成物および使用説明書を含むキットである。
【0049】
別の態様では、本明細書には、ポリヌクレオチド分子を製造する方法が開示され、（ａ）５’から３’の方向に、（ｉ）制限酵素認識部位を含む第１のユニバーサル標的配列、（ｉｉ）第１の標的配列と同一でない制限酵素認識部位を含む第２のユニバーサル標的配列、（ｉｉｉ）β２Ｍ配列、および（ｉｖ）ＭＨＣ対立遺伝子配列を含む第１のポリヌクレオチド配列を得る工程；（ｂ）５’から３’の方向に、（ｉ）第１のユニバーサル標的配列の一部、（ｉｉ）抗原ペプチドをコードする配列、および（ｉｉｉ）第２のユニバーサル標的配列の一部を含む第２のポリヌクレオチドを得る工程；（ｃ）５’から３’の方向に、（ｉ）第２のユニバーサル標的配列の一部分の逆相補配列、（ｉｉ）抗原ペプチドをコードする配列の逆相補配列、および（ｉｉｉ）第１のユニバーサル標的配列の一部の逆相補配列を含む第３のポリヌクレオチドを得る工程；（ｄ）相補配列がアニールするように第２および第３のポリヌクレオチドを一緒に混合する工程；（ｅ）第１のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも１つの制限酵素で制限消化を行う工程；ならびに（ｆ）消化された第１のポリヌクレオチドおよびアニールした第２および第３のポリヌクレオチドをＤＮＡライゲーション反応試薬と一緒に混合することによって第１および第２のポリヌクレオチドを一緒にライゲーションする工程を含む。
【0050】
一部の実施形態では、本方法は、相補配列アニーリング後に、第２および第３のポリヌクレオチドの５’ヌクレオチドをリン酸化することをさらに含み、リン酸化は、第１または第２および第３のポリヌクレオチドを酵素とともにインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、酵素は、Ｔ４キナーゼである。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドは発現コンストラクトである。一部の実施形態では、製造されたポリヌクレオチドを発現コンストラクトに挿入することを含む。
【0051】
一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、プロモーター配列をさらに含む。一実施形態では、プロモーター配列は、ＣＭＶ、ＥＦ１α、またはＳＶ４０プロモーターである。
【0052】
別の実施形態では、第２のポリヌクレオチド配列の３’末端は、５’から３’の方向に、（ｉ）第１の親和性タグ配列、（ｉｉ）プロテアーゼ切断部位配列、および（ｉｉｉ）第２の親和性タグ配列を含む精製クラスター配列をさらに含む。
【0053】
一実施形態では、第２のポリヌクレオチド配列の３’末端は、ポリＡ配列をさらに含む。
【0054】
一部の実施形態では、第３および第４のポリヌクレオチド配列を得る工程は、対象から腫瘍配列決定データの予測データセットを得ることをさらに含む。一実施形態では、第３および第４のポリヌクレオチド配列を得る工程は、腫瘍配列決定データから抗原ペプチドをコードする配列を予測することをさらに含む。別の実施形態では、第３および第４のポリヌクレオチド配列を得る工程は、予測配列に基づいて抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成することをさらに含む。
【0055】
一部の実施形態では、本方法は、２つ以上の異なるポリヌクレオチド分子を含むライブラリーを製造することをさらに含み、異なるポリヌクレオチド分子は、（ｉ）第１のユニバーサル標的配列、（ｉｉ）抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、抗原ペプチドは、２つ以上のポリペプチド分子の各々に対して同一でないヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）第１のユニバーサル標的配列とは異なる第２のユニバーサル標的配列、（ｉｖ）β２Ｍペプチド、および（ｖ）ＭＨＣ対立遺伝子配列を含む。一実施形態では、ＭＨＣ対立遺伝子は、２つ以上のポリヌクレオチド分子の各々に対して同一でない。別の実施形態では、ライブラリーは、４０～５００個の異なるポリヌクレオチド分子を含む。
【0056】
一部の実施形態では、本方法は、製造されたポリヌクレオチドを発現コンストラクトに挿入することをさらに含む。一実施形態では、本方法は、異なるポリヌクレオチド分子を含む２つ以上の発現コンストラクトを含むライブラリーを製造することをさらに含み、異なるポリヌクレオチド分子は、（ｉ）第１のユニバーサル標的配列、（ｉｉ）抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ヌクレオチド配列が２つ以上のポリヌクレオチド分子の各々に対して同一でないヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）第１のユニバーサル標的配列とは異なる第２のユニバーサル標的配列、（ｉｖ）β２Ｍ配列、および（ｖ）ＭＨＣ対立遺伝子配列を含む。一実施形態では、ＭＨＣ対立遺伝子は、２つ以上のポリヌクレオチド分子の各々に対して同一でない。別の実施形態では、ライブラリーは、２０～５００個の異なる発現コンストラクトを含む。一部の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも６６個の異なるポリヌクレオチド分子を含む。一部の実施形態では、ＭＨＣ対立遺伝子は、配列番号１０９～１７４からなる群に示される配列から選択される。
【0057】
一部の実施形態では、本方法は、ポリヌクレオチド分子からポリタンパク質分子を発現させることをさらに含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞にトランスフェクトまたは形質導入される。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞ゲノムに組み込まれる。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞内で染色体外に残る。一部の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。一実施形態では、細胞は、幹細胞、腫瘍細胞、不死化細胞、または胎児細胞である。一部の実施形態では、細胞は、原核細胞である。一部の実施形態では、細胞は、大腸菌細胞である。
【0058】
一実施形態では、本方法は、ポリタンパク質の発現を定量することをさらに含む。一部の実施形態では、発現および非発現ポリタンパク質配列は、本方法の抗原ペプチド予測分析工程を改良するために使用される。一実施形態では、本方法は、ポリタンパク質をビオチン化することをさらに含む。
【0059】
一部の実施形態では、本方法は、ポリタンパク質を精製することを含む。精製工程は、アフィニティークロマトグラフィーを含み得る。一実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーは、支持体、キレート剤および二価金属を含む固定化されている金属アフィニティークロマトグラフィーを含む。アフィニティークロマトグラフィー用のキレート剤は、ニトロロ三酢酸（ＮＴＡ）またはイミニ二酢酸（ＩＤＡ）であり得る。一部の実施形態では、二価金属は、ニッケル（Ｎｉ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、および鉄（Ｆｅ）からなる群から選択される。一実施形態では、キレート剤はＮＴＡであり、二価金属はＮｉである。他の実施形態では、支持体は、アガロースビーズ、セファロースビーズ、および磁気ビーズからなる群から選択される。一部の実施形態では、本方法は、精製ポリタンパク質のビオチン化レベルを定量することをさらに含む。
【0060】
一部の実施形態では、本方法は、粒子にポリペプチドを結合させることをさらに含み、粒子は、表面、ナノ粒子、ビーズ、またはポリマーである。一実施形態では、ポリペプチドは、リンカーを介して粒子に結合される。一実施形態では、粒子はナノ粒子であり、ナノ粒子は磁性ナノ粒子またはポリスチレンナノ粒子である。一実施形態では、磁性ナノ粒子は、磁性酸化鉄を含む。別の実施形態では、ビーズは、アガロースビーズまたはセファロースビーズである。一部の実施形態では、粒子に結合したポリペプチドは、フルオロフォアをさらに含む。一実施形態では、フルオロフォアは、リンカーの有無にかかわらず、粒子に結合している。
【0061】
別の実施形態では、本方法は、少なくとも１つの粒子に結合した２つ以上の異なるポリタンパク質を含むライブラリーを生成することをさらに含み、異なるポリペプチドは、（ｉ）第１のユニバーサル標的ペプチド、（ｉｉ）抗原ペプチドが２つ以上のポリペプチド分子の各々に対して同一でない抗原ペプチド、（ｉｉｉ）第１のユニバーサル標的ペプチドとは異なる第２のユニバーサル標的ペプチド、（ｉｖ）β２Ｍペプチド、および（ｖ）ＭＨＣペプチドを含む。一実施形態では、ＭＨＣペプチドは、２つ以上のポリペプチド分子の各々に対して同一でない。別の実施形態では、ライブラリーは、２０～５００個の異なる単一ポリタンパク質を含む。別の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも６６個の異なる単一のポリタンパク質を含む。別の実施形態では、ＭＨＣペプチドは、配列番号３９～１０４からなる群に示される配列から選択される。
【0062】
別の態様では、本明細書には、ポリヌクレオチド分子を製造する方法が開示され、（ａ）５’から３’の方向に、（ｉ）制限酵素認識部位を含む第１のユニバーサル標的配列、（ｉｉ）第１の標的配列と同一でない制限酵素認識部位を含む第２のユニバーサル標的配列、（ｉｉｉ）β２Ｍ配列、および（ｉｖ）ＭＨＣ対立遺伝子配列を含む第１のポリヌクレオチド配列を得る工程；（ｂ）５’から３’の方向に、（ｉ）第１のユニバーサル標的配列、（ｉｉ）抗原ペプチドをコードする配列、および（ｉｉｉ）第２のユニバーサル標的配列を含む第２のポリヌクレオチド配列を得る工程；（ｃ）第１のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも１つの制限酵素で制限消化を行う工程；（ｄ）第２のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも１つの制限酵素で制限消化を行う工程；ならびに（ｅ）消化された第１および第２のポリヌクレオチドをＤＮＡライゲーション反応試薬と一緒に混合することによって第１および第２のポリヌクレオチドを一緒にライゲーションする工程を含む。
【0063】
別の態様では、本明細書には、ポリヌクレオチド分子を製造する方法が記載され、（ａ）第１のユニバーサル標的配列を含む第１のポリヌクレオチド配列を得る工程；（ｂ）５’から３’の方向に、（ｉ）第２のユニバーサル標的配列、（ｉｉ）β２Ｍ配列、および（ｉｉｉ）ＭＨＣ対立遺伝子配列を含む第２のポリヌクレオチド配列を得る工程；（ｃ）５’から３’の方向に、抗原ペプチドをコードする配列および第２のユニバーサル標的配列を含む第３のポリヌクレオチド配列を得る工程；（ｄ）５’から３’の方向に、抗原ペプチドの逆相補配列および第１のユニバーサル標的配列の逆相補配列を含む第４のポリヌクレオチド配列を得る工程；（ｅ）第１、第２、第３、および第４のポリヌクレオチドを溶液中で組み合わせる工程；（ｆ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試薬を添加する工程；ならびに（ｇ）ＰＣＲ反応を行う工程であって、第２および第３のポリヌクレオチド中の第２のユニバーサル標的配列の相補領域が互いにアニーリングし、第１および第４のポリヌクレオチド中の第１のユニバーサル標的配列の相補領域が互いにアニーリングし；アニーリングした配列は、ＰＣＲ伸長および増幅反応のためのプライミング配列を提供する工程を含む。
【0064】
また、本明細書には、抗原特異的Ｔ細胞を単離するための方法が開示され、（ａ）アミノ末端からカルボキシル末端の方向に、（ｉ）第１のユニバーサル標的ペプチド、（ｉｉ）抗原ペプチド、（ｉｉｉ）第１のユニバーサル標的ペプチドとは異なる第２のユニバーサル標的ペプチド、（ｉｖ）β２Ｍペプチド、および（ｖ）ＭＨＣペプチドを含むポリペプチドであって、ポリペプチドが１つの粒子に連結されているポリペプチドを提供する工程；（ｂ）１つ以上のＴ細胞を含むことが分かっているかまたは疑われる試料を提供する工程；（ｃ）ポリペプチドを試料と接触させる工程であって、単一のＴ細胞が粒子に結合したポリペプチドに結合するのに十分な条件を提供することを含む工程；ならびに（ｄ）粒子と結合した単一のＴ細胞を単離する工程を含む。
【0065】
開示された組成物および方法のこれらおよび他の特徴、態様、および利点は、以下の説明、および添付の図面に関してよりよく理解される。
【図面の簡単な説明】
【0066】
【図1】例示的なｃｏｍＰＡＣＴミニ遺伝子の設計を示す図である。ＳＳは任意のシグナル配列を指し；ＵＳ１は第１のユニバーサル標的部位を指し；ネオ抗原は抗原ペプチド配列部位を指し；ＵＳ２は第２のユニバーサル標的部位を指し；Ｌ１は任意の第１のリンカー配列を指し；β２Ｍはβ－２－ミクログロブリンドメイン配列を指し；Ｌ２は任意の第２のリンカー配列を指し；ＭＨＣ重鎖はＭＨＣ重鎖対立遺伝子を指し；Ｌ３は任意の第３のリンカー配列を指し；精製クラスターはビオチン化配列、プロテアーゼ切断部位、および親和性タグ配列を有する任意の精製クラスターを指す。
【図2】選択されたＭＨＣ対立遺伝子と複合体化された抗原ペプチドリガンドのライブラリーを迅速にアセンブルさせるための例示的なモジュール式の既製プラットフォームの略図を示す。
【図3】ＭＨＣ鋳型中のダミー挿入物を選択されたネオエピトープ配列に置換するための例示的な制限消化クローニング反応の略図である。ダミー挿入物（下線、太字）は、異なるフレームに４つの終止コドン、および切断されていない鋳型または再ライゲーションされた鋳型を破壊するための固有の制限酵素認識部位を含有する。挿入物の両側の制限酵素認識部位をボックスに示す。
【図4】ＭＨＣ鋳型に選択されたネオエピトープ配列を挿入するための例示的な制限消化クローニング反応の略図である。ネオエピトープ配列（下線、太字）は、２つの異なる制限酵素認識部位（枠囲み）に隣接したプライマーとして合成される。３’制限酵素認識部位の逆相補配列を有するユニバーサルプライマーをＰＣＲ反応に使用して、ネオエピトープ配列の二本鎖プライマーダイマーを形成する。ネオエピトープとＭＣＨ鋳型ベクターの両方の制限消化は、選択されたネオエピトープ配列をＭＨＣ鋳型配列に挿入するライゲーション反応を可能にする。ライゲーション反応は大腸菌に形質転換され、形質転換された大腸菌から調製されたプラスミドは、哺乳動物生成細胞トランスフェクション反応に使用される。
【図5】ＭＨＣ鋳型に選択されたネオエピトープ配列を挿入する制限消化クローニング反応の例示的な代替形態の略図である。２つの相補的ＮｅｏＥをコードするプライマーを５’および３’制限酵素認識部位の一部とともに合成する。これらのプライマーをアニーリングし、制限消化からの突出部をシミュレートする。次に、事前に切断されたベクター（突出末端に５’リン酸基を厳密に保持している）を、アニールしたＮｅｏＥ挿入物とライゲーションし、ライゲーション産物をプラスミド生成のために大腸菌に形質転換する。
【図6】ＭＨＣ鋳型に選択されたネオエピトープ配列を挿入するための例示的なＰＣＲベースの方法の略図である。２つの相補的ＮｅｏＥをコードするプライマーである、ＭＨＣ鋳型中の第２のユニバーサル部位のための３’配列を有するフォワードプライマー；およびＭＨＣ鋳型中の第１のユニバーサル部位の相補配列のための３’配列を有するリバースプライマーを合成する。これらのプライマーを、第１のユニバーサル配列部位を有するＭＨＣ鋳型の５’断片、および第２のユニバーサル部位とｃｏｍＰＡＣＴミニ遺伝子の残りを有するＭＨＣ鋳型の第２の断片と混合する。第１のＰＣＲ増幅サイクルは、２つのヌクレオチド断片を生成する。一方の断片は、下流のネオエピトープを有する第１のユニバーサル部位領域をコードし、他方は、ネオエピトープ、続くｃｏｍＰＡＣＴ遺伝子の残りをコードする。これらの２つの断片は、固有のネオエピトープ配列で重なり合い、次にアセンブルし、完全なアセンブルを増幅し、トランスフェクションのためにクリーンアップする。
【図7】７日間の時間経過にわたってｃｏｍＰＡＣＴ遺伝子（Ｎｅｏ１２）がトランスフェクトされた３０ｍＬの哺乳動物細胞における総タンパク質発現、およびＨｉｓ－タグを検出するＮＴＡ－ＨＲＰ試薬を用いたウエスタンブロットを示す図である。
【図8】Ｎｅｏ１２ ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質のＮｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー精製のゲルを示す図である。Ｐｒｅはクルード溶解物を表し、ＦＴはフロースルーを表し、Ｗは洗浄を表し、Ｅは溶出を表す。
【図9】精製されたＮｅｏ１２タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィースペクトルを示す図である。主要なピークは、Ｎｅｏ１２タンパク質であり、微小ピークは、ビオチン化工程で付加されたＡＴＰである。
【図11】８つの異なるＮｅｏＥ ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質のクルードタンパク質および精製タンパク質を示す図であり、各々は異なる抗原配列を有する。
【図13A-B】図１３Ａは、プラスミドから生成されたＮｅｏＥ ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質（プラスミド）と比較して、図６に記載されるＰＣＲアセンブリ法を用いて生成されたＮｅｏＥ ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質（線形アンプリコン）を示す図である。図１３Ｂは、ＰＣＲアセンブリ法によって生成された線形アンプリコンのＤＮＡゲルを示す図である。各レーンは、異なるネオエピトープ配列を有するｃｏｍＰＡＣＴミニ遺伝子を含有する。
【図14】ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質の完全なビオチン化を試験するためのストレプトアビジンビーズプルダウンアッセイを示す図である。
【図15】ストレプトアビジン－ＨＲＰを用いてウエスタンブロットを介して可視化した、クルード細胞溶解物中の異なるｃｏｍＰＡＣＴタンパク質のビオチン化を示す図である。
【図16A-C】大腸菌におけるＢｉｒＡ酵素（１６Ｂおよび１６Ｃ）およびＴＥＶプロテアーゼ（１６Ａ）の生成および精製を示す図である。
【図17】ＢｉｒＡを用いたｃｏｍＰＡＣＴタンパク質のビオチン化（レーン２）、およびＴＥＶプロテアーゼを用いたＨｉｓ６タグの切断（レーン３）を示す図である。未処置のｃｏｍＰＡＣＴタンパク質をレーン１に示す。
【図18】Ｖ５発現に基づいてＢｉｒＡおよびＶ５で形質導入された細胞の細胞選別を示す図である。
【図19】多量体化ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質を用いたＴ細胞の抗原特異的捕捉を示す図である。
【図20】Ｓ８８Ｃβ２Ｍ ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質を用いたｃｏｍＰＡＣＴ ＮＴＡｍｅｒ生成を示す図である。
【図21】Ｃｙ５のＳ８８Ｃ ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質モノマーへのカップリングを示す図である。
【図22A-B】図２２Ａは、ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドを製造するためのクローニング戦略の例示的な略図を示す。図２２Ｂは、８２４個の個々のｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドから得られた配列検証統計を提供する図である。
【図23】ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質の代表的な選択のためのタンパク質発現および精製を示す図である。
【図24】ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドおよびタンパク質を製造するためのワークフローの例示的な略図を提供する。
【図25】ＢｉｒＡを用いたＥＢＶおよびＭＡＲＴ－１ ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質のビオチン化を示す図である。
【図26A-B】ｃｏｍＰＡＣＴ ＨＬＡレパートリーサイズに対する米国の上位ＨＬＡ Ｉ対立遺伝子によってカバーされる患者のパーセントを示す図である。
【図27A】ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質の代表的な選択のためのｃｏｍＰＡＣＴタンパク質の単分散性、収率、および発現を示す図である。
【図27B】ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質の代表的な選択のためのｃｏｍＰＡＣＴタンパク質の単分散性、収率、および発現を示す図である。
【図27C】ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質の代表的な選択のためのｃｏｍＰＡＣＴタンパク質の単分散性、収率、および発現を示す図である。
【図28A-C】Ｃｙ５およびＨｉｓタグで修飾されたｎｅｏ１２ ｃｏｍＰＡＣＴ分子が、ｎｅｏ１２ ＴＣＲ編集Ｔ細胞に結合することを示す図である。
【図29A-D】Ｎｅｏ１２ ＮＴＡｍｅｒが抗原特異的な様式でＴ細胞に結合し、イミダゾールの存在がＮＴＡｍｅｒの結合を妨げることを示す図である。
【図30A-D】ＭＡＲＴ－１ ＮＴＡｍｅｒが抗原特異的な様式でＴ細胞に結合することを示す図である。
【図31A-C】Ｆ５ ＴＣＲ編集Ｔ細胞が、イミダゾールによるＮＴＡｍｅｒ破壊後に急速なＣｙ５シグナル減衰を示すことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0067】
定義
特許請求の範囲および明細書において使用される用語は、別段の規定がない限り、下記のように定義される。
特許請求の範囲および明細書において使用される用語は、別段の規定がない限り、下記のように定義される。
【0068】
本明細書に開示される組成物および方法の実施形態は、コグネイトＴ細胞とペアリングすることができる組換え抗原－ＭＨＣ複合体を含む。本明細書で使用される場合、「抗原－ＭＨＣ」、「抗原－ＭＨＣ複合体」、「組換え抗原－ＭＨＣ複合体」、「ペプチドＭＨＣ」、および「ｐ／ＭＨＣ」は、ＭＨＣの抗原結合溝内のペプチドとの主要組織適合性複合体を指すために互換的に使用される。
【0069】
本明細書で使用される場合、「抗原」は、患者特異的なネオ抗原を含む任意の抗原を含む。「抗原ペプチド」とは、ＭＨＣ分子に結合することができるペプチドまたはペプチド断片を指す。「ネオ抗原」とは、ネオ抗原またはネオ抗原の提示を、その対応する野生型抗原とは異なるようにする、少なくとも１つの変更、例えば、ポリペプチド配列における突然変異、差異が翻訳後修飾である、または発現レベルにおける差異を有する抗原を指す。「腫瘍ネオ抗原」とは、腫瘍またはがん、例えば、患者の腫瘍に由来するネオ抗原を指す。
【0070】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」とは、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、またはｍＲＮＡを指すことができる。当業者は、例えば、ポリヌクレオチドが使用されている状況に基づいて、どの形態が参照されているかを理解することができる。
【0071】
用語「ｉｎ ｖｉｖｏ」とは、細胞を含む、生存生物において起こるプロセスを指す。
【0072】
用語「哺乳動物」とは、本明細書で使用される場合、ヒトと非ヒトの両方を含み、限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ウシ、ウマ、およびブタを含む。
【0073】
用語「同一性」パーセントとは、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列との関連で、以下に記載される配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮまたは当業者に利用可能な他のアルゴリズム）のうちの１つを用いて、または目視検査によって測定した場合、最大一致のために比較および整列された場合に同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する２つ以上の配列またはサブ配列を指す。用途に応じて、「同一性」パーセントは、比較される配列の領域、例えば、機能ドメインにわたって存在することができるか、または、あるいは比較されるべき２つの配列の完全長にわたって存在することができる。
【0074】
配列比較のためには、典型的には、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じてサブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次に、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列（複数可）の配列同一性パーセントを計算する。
【0075】
比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２巻：４８２頁（１９８１年）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８巻：４４３頁（１９７０年）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５巻：２４４４頁（１９８８年）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムによるコンピュータによる実行（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）によって、または目視検査（一般的には、下記Ａｕｓｕｂｅｌらを参照されたい）によって行うことができる。
【0076】
配列同一性パーセントおよび配列類似性を決定するために適切なアルゴリズムの一例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３～４１０頁（１９９０年）に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公開されている。
【0077】
明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、文脈が明確に別段の指示をしない限り、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、複数の参照を含むことに留意されたい。
【0078】
他の解釈規約
本明細書中に列挙された範囲は、列挙されたエンドポイントを含めて、その範囲内の全ての値についての簡略化であると理解される。例えば、１～５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、および５０からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、または部分的範囲を含むと理解される。例えば、１～５０の部分的範囲は、２～４０、５～２５、および１０～２０を含むことができる。
本明細書中に列挙された範囲は、列挙されたエンドポイントを含めて、その範囲内の全ての値についての簡略化であると理解される。例えば、１～５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、および５０からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、または部分的範囲を含むと理解される。例えば、１～５０の部分的範囲は、２～４０、５～２５、および１０～２０を含むことができる。
【0079】
ヌクレオチドおよびペプチド組成物
Ｔ細胞媒介性免疫は、細胞表面に主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）中の抗原を提示するそれらの細胞において死を誘導することができる抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の活性化によって特徴付けられる。抗原を負荷されたＭＨＣ複合体を提示するこれらの細胞には、ウイルス感染細胞、細胞内細菌を有する細胞、タンパク質の細胞外供給源を内在化したまたは貪食した細胞、および腫瘍抗原を提示するがん細胞が含まれる。
Ｔ細胞媒介性免疫は、細胞表面に主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）中の抗原を提示するそれらの細胞において死を誘導することができる抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の活性化によって特徴付けられる。抗原を負荷されたＭＨＣ複合体を提示するこれらの細胞には、ウイルス感染細胞、細胞内細菌を有する細胞、タンパク質の細胞外供給源を内在化したまたは貪食した細胞、および腫瘍抗原を提示するがん細胞が含まれる。
【0080】
天然クラスＩ ＭＨＣ重鎖は、約３５０個のアミノ酸を含み；天然β２－ミクログロブリンは、約１００個のアミノ酸を含み；クラスＩ抗原ペプチドは典型的には約７～約１５個のアミノ酸の長さを有する。クラスＩ重鎖は、ヒトではＨＬＡ－Ａ、－Ｂおよび－Ｃ、マウスではＨ－２Ｋ、Ｄ、およびＬと呼ばれる主要組織適合性複合体の遺伝子によってコードされる。クラスＩ重鎖およびβ２－ミクログロブリンは、別々に異なる染色体上にコードされる。抗原ペプチドは、通常、例えば、ウイルス、細菌、またはがん細胞などのタンパク質源からの細胞によって処理される。ヒトにおけるＨＬＡ－Ａ、－Ｂおよび－Ｃ ＭＨＣ遺伝子、ならびにマウスのＨ－２Ｋ、ＤおよびＬ ＭＨＣ遺伝子によってコードされるポリペプチドについて、多様な変異体が同定されている。
【0081】
本明細書に開示される方法の実施形態は、選択された抗原（例えば、ネオ抗原）が、β２－ミクログロブリン（β２Ｍ）およびＭＨＣ重鎖を含むＭＨＣ複合体に連結される単一分子を製造する方法に関する。異なるＭＨＣ重鎖をβ２Ｍ分子に連結させて、様々な数のＭＨＣ鋳型を形成することができる。抗原挿入部位に隣接するユニバーサル標的配列を利用することにより、制限消化またはＰＣＲベースのアセンブリを介して抗原をＭＨＣ鋳型に挿入する本明細書に開示される方法は、例えば、所与の患者に個別化することができるハイスループット法において、異なる抗原－ＭＨＣ複合体のライブラリーを構築する能力をもたらす。これらの例示的な複合体は、用語「ｃｏｍＰＡＣＴｓ」に含まれ、次に、例えば、患者特異的なネオ抗原を標的とする患者特異的なＴ細胞集団の単離および同定に使用するために、粒子、バーコード粒子、または表面に連結することができる。抗原－ＭＨＣ複合体を連結する方法およびこのような複合体の使用は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１８年３月８日出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２１６１１に開示されている。
【0082】
ペプチド－ＭＨＣ複合体
簡単に述べれば、本明細書で使用される場合、「ｃｏｍＰＡＣＴｓ」とは、ユニバーサル標的配列、抗原ペプチド、第２のユニバーサル標的配列、β２－ミクログロブリン、ならびにＭＨＣディスプレイ部分を形成する、例えばα１、α２、およびα３ドメインを含むＭＨＣクラスＩ重鎖を含む単一のポリペプチド融合体を指す。ＭＨＣディスプレイ部分は、組換えＭＨＣ分子を含むことができる。ある実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴは、各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国出願公開第２００９／０１１７１５３号および米国出願公開第２００８／０２１９９４７号に記載されるジスルフィドトラップを含むことができる。ｃｏｍＰＡＣＴによって形成される抗原－ＭＨＣ複合体は、コグネイトＴＣＲ分子によって認識することができるように抗原の提示をもたらす。一部の実施形態では、ＭＨＣ複合体は、ＣＤ８陽性（ＣＤ８＋）Ｔ「キラー」細胞とペアリングするＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣ Ｉ）複合体であり得る。一部の実施形態では、ＭＨＣ複合体は、ＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）Ｔ細胞とペアリングするＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣ ＩＩ）複合体であり得る。各ｃｏｍＰＡＣＴにコードされるＭＨＣ対立遺伝子は、他のＭＨＣ ＩまたはＩＩ対立遺伝子と容易に交換することができ、任意のＭＨＣハプロタイプの患者からのＴ細胞の抗原性調査を可能にする。
簡単に述べれば、本明細書で使用される場合、「ｃｏｍＰＡＣＴｓ」とは、ユニバーサル標的配列、抗原ペプチド、第２のユニバーサル標的配列、β２－ミクログロブリン、ならびにＭＨＣディスプレイ部分を形成する、例えばα１、α２、およびα３ドメインを含むＭＨＣクラスＩ重鎖を含む単一のポリペプチド融合体を指す。ＭＨＣディスプレイ部分は、組換えＭＨＣ分子を含むことができる。ある実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴは、各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国出願公開第２００９／０１１７１５３号および米国出願公開第２００８／０２１９９４７号に記載されるジスルフィドトラップを含むことができる。ｃｏｍＰＡＣＴによって形成される抗原－ＭＨＣ複合体は、コグネイトＴＣＲ分子によって認識することができるように抗原の提示をもたらす。一部の実施形態では、ＭＨＣ複合体は、ＣＤ８陽性（ＣＤ８＋）Ｔ「キラー」細胞とペアリングするＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣ Ｉ）複合体であり得る。一部の実施形態では、ＭＨＣ複合体は、ＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）Ｔ細胞とペアリングするＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣ ＩＩ）複合体であり得る。各ｃｏｍＰＡＣＴにコードされるＭＨＣ対立遺伝子は、他のＭＨＣ ＩまたはＩＩ対立遺伝子と容易に交換することができ、任意のＭＨＣハプロタイプの患者からのＴ細胞の抗原性調査を可能にする。
【0083】
一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴのＭＨＣクラスＩ重鎖配列は、プロリン以外の非芳香族アミノ酸でのｔｙｒ－８４の置換などの１つ以上のアミノ酸の置換、付加、および／または欠失を含むことができる。これらの実施形態では、アミノ酸置換は、ロイシン、イソロイシン、バリン、セリン、スレオニン、アラニン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、アルギニン、セリンもしくはグリシンなどの標準遺伝コードによりコードされるアミノ酸であり得、または修飾されたもしくは異常なアミノ酸であり得る。一実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴのＭＨＣクラスＩ重鎖配列は、チロシン－８４からアラニンへの置換を含む。別の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴのＭＨＣクラスＩ重鎖配列は、チロシン－８４からシステインへの置換を含む。
【0084】
一部の実施形態では、ＭＨＣ対立遺伝子は膜貫通ドメインを欠損している。一部の実施形態では、ＭＨＣ対立遺伝子は細胞質ドメインを欠損している。一部の実施形態では、ＭＨＣ対立遺伝子は、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠損している。一部の実施形態では、ＨＬＡ対立遺伝子は膜貫通ドメインを欠損している。一部の実施形態では、ＨＬＡ対立遺伝子は細胞質ドメインを欠損している。一部の実施形態では、ＨＬＡ対立遺伝子は、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠損している。
【0085】
任意のＭＨＣまたはＨＬＡ対立遺伝子は、本明細書に記載されるｃｏｍＰＡＣＴにおいて使用され得る。例示的なＨＬＡ対立遺伝子は、限定されないが、ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊６８：０１、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２６：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊６８：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３９：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４６：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５０：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０７、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４１：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０５、ＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０１：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２、およびＨＬＡ－Ｃ＊１７：０１を含む。当該技術分野において公知である任意の他の適切なＨＬＡ対立遺伝子は、本明細書に記載されるｃｏｍＰＡＣＴにおいて使用することができる。
【0086】
β２－ミクログロブリン（β２Ｍ）は、組換えβ２Ｍ分子を含み得る。一部の実施形態では、β２Ｍ配列は、上記されるように、１つ以上のアミノ酸置換、付加、および／または欠失を含むことができる。一実施形態では、この置換は、セリン－８８からシステインへの置換を含む。
【0087】
ｈＧＨシグナル配列、ダミーネオ抗原挿入物、ＨＬＡ＊Ａ０２：０１対立遺伝子、ＡｖｉＴａｇペプチド、ＴＥＶ切断部位、および連接されたＨｉｓタグを有する例示的なｃｏｍＰＡＣＴタンパク質のためのアミノ酸およびヌクレオチド配列を下記の表１に示す。
【0088】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド分子は、５’から３’の方向に、（ｉ）プロモーター配列、（ｉｉ）配列番号３に示される配列を含む第１のユニバーサル標的配列、（ｉｉｉ）抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、抗原ペプチドが腫瘍ネオ抗原であるヌクレオチド配列、（ｉｖ）配列番号４に示される配列を含む第２のユニバーサル標的配列、（ｖ）配列番号１０６に示される配列を含むβ２Ｍ配列、（ｖｉ）配列番号１０９～１７４に示される配列からなる群から選択される配列を含むＭＨＣ対立遺伝子配列、（ｖｉｉ）配列番号２９に示される配列を含む第１の親和性タグ配列、（ｖｉｉｉ）配列番号３１に示される配列を含むプロテアーゼ切断部位配列、および（ｉｘ）配列番号３５に示される配列を含む第２の親和性タグ配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド分子は、５’から３’の方向に、（ｉ）プロモーター配列、（ｉｉ）配列番号３に示される配列を含む第１のユニバーサル標的配列、（ｉｉｉ）抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、抗原ペプチドは腫瘍ネオ抗原であるヌクレオチド配列、（ｉｖ）配列番号４に示される配列を含む第２のユニバーサル標的配列、（ｖ）配列番号１０６に示される配列を含むβ２Ｍ配列、（ｖｉ）配列番号１０９～１７４に示される配列からなる群から選択される配列を含むＭＨＣ対立遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド分子は、５’から３’の方向に、（ｉ）プロモーター配列、（ｉｉ）配列番号３に示される配列を含む第１のユニバーサル標的配列、（ｉｉｉ）抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、抗原ペプチドは腫瘍ネオ抗原であるヌクレオチド配列、（ｉｖ）配列番号４に示される配列を含む第２のユニバーサル標的配列、（ｖ）β２Ｍ配列、（ｖｉ）配列番号１０９～１７４に示される配列からなる群から選択される配列を含むＭＨＣ対立遺伝子配列、（ｖｉｉ）第１の親和性タグ配列、（ｖｉｉｉ）プロテアーゼ切断部位配列、および（ｉｘ）第２の親和性タグを含む。
【0089】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、５’から３’の方向に、（ｉ）配列番号２に示される配列を含むプロモーターペプチド、（ｉｉ）第１のユニバーサル標的ペプチド、（ｉｉｉ）抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、抗原ペプチドは腫瘍ネオ抗原であるヌクレオチド配列、（ｉｖ）第２のユニバーサル標的ペプチド、（ｖ）配列番号１０５に示される配列を含むβ２Ｍペプチド、および（ｖｉ）配列番号３８～１０３に示される配列を含むＭＨＣペプチドを含む。
【0090】
ユニバーサル配列
抗原ペプチドは、一般的に、ユニバーサルな標的配列またはそれらの一部に隣接する。これらの配列は、ポリヌクレオチドＭＨＣ鋳型中にヌクレオチドをコードする抗原ペプチドを置換または挿入するための迅速なハイスループット法を可能にする。ユニバーサル配列は、制限消化ベースのクローニングのための制限酵素認識部位を含み得る。例示的な制限酵素認識部位は、限定されないが、ＮｏｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｌｐＩ、ＢｓｐＥＩ、ＢｓｔＢＩ、Ｘｂａｌ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＡｐａＩ、ＮｏｔＩ、およびそれらの任意の組合せを含む。ある態様では、１つ以上のユニバーサル標的配列は、操作される遺伝物質中に存在せず、例えば、標的外効果を減少もしくは排除し、および／または特異性を増加させる。
抗原ペプチドは、一般的に、ユニバーサルな標的配列またはそれらの一部に隣接する。これらの配列は、ポリヌクレオチドＭＨＣ鋳型中にヌクレオチドをコードする抗原ペプチドを置換または挿入するための迅速なハイスループット法を可能にする。ユニバーサル配列は、制限消化ベースのクローニングのための制限酵素認識部位を含み得る。例示的な制限酵素認識部位は、限定されないが、ＮｏｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｌｐＩ、ＢｓｐＥＩ、ＢｓｔＢＩ、Ｘｂａｌ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＡｐａＩ、ＮｏｔＩ、およびそれらの任意の組合せを含む。ある態様では、１つ以上のユニバーサル標的配列は、操作される遺伝物質中に存在せず、例えば、標的外効果を減少もしくは排除し、および／または特異性を増加させる。
【0091】
ユニバーサル標的配列は、４～１００、４～１５、１５～４０、１５～３５、１５～３０、２０～４０、２５～４０、３０～４０、１５～７５、５０～１００、５０～７５、７５～１００、２５～５０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、または９０～１００ヌクレオチド長であり得る。ユニバーサル配列は、少なくとも４、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、または少なくとも１００ヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態では、ユニバーサル標的配列は、４～８ヌクレオチド、例えば、４、５、６、７、または８ヌクレオチド長である。他の実施形態では、ユニバーサル標的配列は、２５～３５ヌクレオチド、例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５ヌクレオチド長である。他の実施形態では、ユニバーサル標的配列は、３５～７５ヌクレオチド長であり、例えば、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、または７５ヌクレオチドである。他の実施形態では、ユニバーサル標的配列は、少なくとも約１５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、同一でない少なくとも２つのユニバーサル標的配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、同一である少なくとも２つのユニバーサル標的配列を含む。
【0092】
例示的なユニバーサル標的配列を表２に示す。
【0093】
一部の実施形態では、ユニバーサル標的配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー標的配列またはプライマー結合部位を含む。当該技術分野において公知であるユニバーサルプライマー配列は、本明細書に開示される組成物および方法において使用することができ、または配列は、前述のユニバーサルプライマー配列とは異なることができる。
【0094】
一部の実施形態では、第１および／または第２のユニバーサル標的配列は、制限酵素切断部位を含む。
【0095】
リンカー
様々な実施形態では、ｃｏｍａＰＡＣＴは、抗原ペプチドセグメントとβ２－ミクログロブリンセグメントとの間に介在する第１の可撓性リンカーを含むことができる。このようなリンカーは、抗原ペプチドセグメントのカルボキシル末端からβ２－ミクログロブリンセグメントのアミノ末端まで、またはその逆で伸長し、接続することができる。理論に制限されることなく、ｃｏｍＰＡＣＴが発現された場合、連結されたペプチドリガンドは結合溝にフォールドされ、機能的ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質を生じることができる。種々の実施形態では、このリンカーは、少なくとも約４個のアミノ酸から最大約２０個までのアミノ酸、例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸を含むことができる。
様々な実施形態では、ｃｏｍａＰＡＣＴは、抗原ペプチドセグメントとβ２－ミクログロブリンセグメントとの間に介在する第１の可撓性リンカーを含むことができる。このようなリンカーは、抗原ペプチドセグメントのカルボキシル末端からβ２－ミクログロブリンセグメントのアミノ末端まで、またはその逆で伸長し、接続することができる。理論に制限されることなく、ｃｏｍＰＡＣＴが発現された場合、連結されたペプチドリガンドは結合溝にフォールドされ、機能的ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質を生じることができる。種々の実施形態では、このリンカーは、少なくとも約４個のアミノ酸から最大約２０個までのアミノ酸、例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸を含むことができる。
【0096】
様々な実施形態では、ｃｏｍａ ＰＡＣＴは、β２－ミクログロブリンセグメントとＭＨＣ重鎖セグメントとの間に介在する第２の可撓性リンカーを含むことができる。このようなリンカーは、β２－ミクログロブリンセグメントのカルボキシル末端から重鎖セグメントのアミノ末端まで、またはその逆で伸長し、接続することができる。理論に制限されることなく、ｃｏｍＰＡＣＴを発現させた場合、β２－ミクログロブリンおよび重鎖は結合溝にフォールドされ、Ｔ細胞拡大の促進に機能し得る分子を生じることができる。種々の実施形態では、このリンカーは、少なくとも約４個のアミノ酸から最大約２０個までのアミノ酸、例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸を含むことができる。
【0097】
様々な実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴは、ＭＨＣ重鎖セグメントと精製クラスターとの間に介在する第３の可撓性リンカーを含むことができる。このようなリンカーは、重鎖セグメントのカルボキシル末端から精製クラスターのアミノ末端まで伸長し、接続することができ、またはその逆も可能である。
【0098】
当該技術分野において公知である任意の適切な可撓性リンカー配列を使用することができる。このようなリンカー配列は、限定されないが、ＧＳ、ＳＧ、ＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）、ＧＧＧＳ（Ｇ３Ｓ）、ＧＳＧＧＳ、 またはＧＣＧＧＳ配列モチーフの１つ以上の反復単位を含むグリシン－セリン配列を含む。リンカー配列モチーフの複数の連続した単位を使用することができる。一部の実施形態では、可撓性リンカー配列は、適切なリンカー配列の１、２、３、４、５、６、７、８、または１０個の反復単位を含む。
【0099】
リンカーはまた、システイン残基がジスルフィドトラップを形成するように、リンカー配列とＭＨＣ対立遺伝子配列との間のジスルフィド結合のためのシステイン残基を含むことができる。一部の実施形態では、リンカー配列または第２のユニバーサル標的ペプチドは、システイン残基を含む。一部の実施形態では、リンカー配列または第２のユニバーサル標的ペプチドは、ＭＨＣ対立遺伝子とジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含む。
【0100】
シグナル配列
種々の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、シグナル配列、例えば、ポリヌクレオチドの場合にはシグナルペプチドをコードするシグナル配列を含み得る。シグナル配列は、分泌シグナル配列であり得る。分泌シグナル配列は、哺乳動物細胞の翻訳タンパク質を分泌経路を介して指向し、翻訳されたタンパク質が細胞の品質制御を受けることを確実にする。分泌シグナルを取り込むことにより、ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質が細胞培地に分泌され、その結果、それらが均一に十分にフォールドされ、培地または清澄な上清からより容易に単離されることを確実にすることができる。
種々の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、シグナル配列、例えば、ポリヌクレオチドの場合にはシグナルペプチドをコードするシグナル配列を含み得る。シグナル配列は、分泌シグナル配列であり得る。分泌シグナル配列は、哺乳動物細胞の翻訳タンパク質を分泌経路を介して指向し、翻訳されたタンパク質が細胞の品質制御を受けることを確実にする。分泌シグナルを取り込むことにより、ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質が細胞培地に分泌され、その結果、それらが均一に十分にフォールドされ、培地または清澄な上清からより容易に単離されることを確実にすることができる。
【0101】
一実施形態では、シグナル配列は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）からのシグナル配列である。別の実施形態では、シグナル配列は、ｈＩＧ１カッパ軽鎖、β２ミクログロブリン（β２Ｍ）、またはＩＬ２シグナル配列からのシグナル配列である。β２Ｍ（例えば、ヒトβ２Ｍ）からのシグナル配列、または当該技術分野において公知である任意の他の真核生物もしくは原核生物シグナル配列を含む、さらなるシグナル配列を使用することもできる。
【0102】
シグナル配列は、１０～１００、１０～２０、１０～５０、１０～４０、２０～４０、２０～６０、４０～９０、４０～６０、４５～７０、５０～８０、６０～９０、５５～７０、６０～８０、７０～８０、５０～１００、６０～１００、７０～１００、８０～１００、または９０～１００ヌクレオチド長であり得る。シグナルペプチドは、３～３３アミノ酸、３～１０アミノ酸、１０～３０アミノ酸、１０～２０アミノ酸、１５～３０アミノ酸、または２０～３０アミノ酸長であり得る。
【0103】
例示的なシグナル配列を表３に示す。
【0104】
一部の実施形態では、シグナル配列は、配列番号１、２４、２６、または２８に示される配列を含む配列を含む。一部の実施形態では、シグナル配列は、配列番号２、２３、２５、または２７に示される配列を含む配列を含む。一実施形態では、シグナル配列は、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）シグナル配列をコードする。別の実施形態では、シグナル配列は、配列番号１に示される配列を含む。別の実施形態では、シグナル配列は、配列番号２に示される配列を含む。
【0105】
プロモーター
ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチド組成物は、例えば、宿主細胞によって翻訳され得るｍＲＮＡ転写物の転写のためのプロモーターをさらに含み得る。プロモーターは、起源が原核生物または真核生物（例えば、哺乳動物）であり得る。ＥＦ１α、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、またはＳＶ４０などの、細胞における遺伝子転写のための任意の適切なプロモーターを使用することができる。一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドは、ＣＭＶプロモーターを含む。
ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチド組成物は、例えば、宿主細胞によって翻訳され得るｍＲＮＡ転写物の転写のためのプロモーターをさらに含み得る。プロモーターは、起源が原核生物または真核生物（例えば、哺乳動物）であり得る。ＥＦ１α、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、またはＳＶ４０などの、細胞における遺伝子転写のための任意の適切なプロモーターを使用することができる。一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドは、ＣＭＶプロモーターを含む。
【0106】
種々の実施形態では、ポリヌクレオチド配列の５’末端は、第１のユニバーサル標的の５’末端に連結されたプロモーター配列をさらに含む。一部の実施形態では、プロモーター配列は、ＣＭＶ、ＥＦ１α、およびＳＶ４０プロモーターからなる群から選択される。一実施形態では、プロモーター配列は、ＣＭＶプロモーター配列である。一実施形態では、プロモーター配列は、配列番号３７に示される配列を含む配列を含む。
【0107】
親和性タグ
ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチド組成物は、親和性タグまたはペプチドをコードする少なくとも１つの配列をさらに含み得る。一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドは、少なくとも２つの親和性タグまたはペプチド配列を含む。
ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチド組成物は、親和性タグまたはペプチドをコードする少なくとも１つの配列をさらに含み得る。一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドは、少なくとも２つの親和性タグまたはペプチド配列を含む。
【0108】
任意の適切な親和性タグまたはペプチドをｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドまたはポリペプチドに使用することができる。このようなペプチドには、限定されないが、ＡｖｉＴａｇ、ストレプトアビジン－タグ、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ６）－タグ、ＦＬＡＧ－タグ、ＨＡ－タグ、およびＭｙｃ－タグが含まれる。ポリヌクレオチドｃｏｍＰＡＣＴ遺伝子中の配列は、典型的には、ｃｏｍＰＡＣＴポリペプチド中のペプチドに翻訳される。これらのエピトープは、発現されたｃｏｍＰＡＣＴポリペプチドのアフィニティークロマトグラフィー精製または定量に用いることができる。例えば、Ｈｉｓ６タグを用いて、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーによりｃｏｍＰＡＣＴタンパク質を精製することができる。一部の実施形態では、Ｈｓ６タグは、任意選択的なリンカー配列を有する、複数のＨｉｓ６単位を含む、連接されたＨｉｓ６タグであり得る。第１および第２の親和性タグは、同一であり、すなわち、両方がＨｉｓ６タグであり、もしくは両方がＨＡタグであり得、またはそれらは、異なるタグであり、すなわち、ストレプトアビジンタグおよびＨｉｓ６タグであり得る。
【0109】
さらに、ＡｖｉＴａｇは、ＢｉｒＡ酵素によって認識されるビオチン化部位をコードする。このペプチド配列をタンパク質に含めることにより、ＢｉｒＡによる酵素的修飾を介した配列のビオチン化が可能になる。したがって、ＡｖｉＴａｇ配列およびＨｉｓ６タグを含むｃｏｍＰＡＣＴポリペプチドをビオチン化し、Ｈｉｓ６タグを介してＮｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、精製されたたタンパク質の純度または量をストレプトアビジンまたは他のアビジン試薬を用いて、ビオチン可視化により評価することができる。
【0110】
一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドは、ＡｖｉＴａｇ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴポリペプチドは、ＡｖｉＴａｇペプチドを含む。一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドは、Ｈｉｓ６配列を含む。一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴポリペプチドは、Ｈｉｓ６ペプチドを含む。一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴポリペプチドは、連接されたＨｉｓ６ペプチドを含む。一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドは、ＡｖｉＴａｇ配列およびＨｉｓ６配列を含む。一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドは、ＡｖｉＴａｇ配列および連接されたＨｉｓ６配列を含む。一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴポリペプチドは、ＡｖｉＴａｇペプチドおよびＨｉｓ６ペプチドを含む。一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴポリペプチドは、ＡｖｉＴａｇペプチドおよび連接されたＨｉｓ６ペプチドを含む。
【0111】
一部の実施形態では、第１および第２の親和性タグは、ＡｖｉＴａｇ、ストレプトアビジン－タグ、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ６）－タグ、ＦＬＡＧ－タグ、ＨＡ－タグ、およびＭｙｃ－タグからなる群から選択される。
【0112】
一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドはＦＬＡＧ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴポリペプチドはＦＬＡＧペプチドを含む。一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドはＨＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴポリペプチドはＨＡペプチドを含む。一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドはＭｙｃ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴポリペプチドはＭｙｃペプチドを含む。一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドはストレプトアビジン配列を含む。一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴポリペプチドはストレプトアビジンペプチドを含む。一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドはＡｖｉＴａｇ配列およびＦＬＡＧ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴポリペプチドはＡｖｉＴａｇペプチドおよびＦＬＡＧペプチドを含む。一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドはＡｖｉＴａｇ配列およびＨＡ配列を含む。一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴポリペプチドはＡｖｉＴａｇペプチドおよびＨＡペプチドを含む。一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドはＡｖｉＴａｇ配列およびストレプトアビジン配列を含む。一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴポリペプチドはＡｖｉＴａｇペプチドおよびストレプトアビジンペプチドを含む。
【0113】
一部の実施形態では、第１の親和性タグ配列はＡｖｉＴａｇペプチドをコードし、プロテアーゼ切断部位配列はＴＥＶ切断部位をコードし、第２の親和性タグはＦＬＡＧペプチドをコードする。一部の実施形態では、精製クラスターは、ＡｖｉＴａｇペプチド、ＴＥＶ切断部位、およびＦＬＡＧペプチドを含む。一部の実施形態では、第１の親和性タグ配列はＡｖｉＴａｇペプチドをコードし、プロテアーゼ切断部位配列はＴＥＶ切断部位をコードし、第２の親和性タグはＨＡペプチドをコードする。一部の実施形態では、精製クラスターは、ＡｖｉＴａｇペプチド、ＴＥＶ切断部位、およびＨＡエピトープを含む。一部の実施形態では、第１の親和性タグ配列はＡｖｉＴａｇペプチドをコードし、プロテアーゼ切断部位配列はＴＥＶ切断部位をコードし、第２の親和性タグはＭｙｃペプチドをコードする。一部の実施形態では、精製クラスターは、ＡｖｉＴａｇペプチド、ＴＥＶ切断部位、およびＭｙｃペプチドを含む。一部の実施形態では、第１の親和性タグ配列はＡｖｉＴａｇペプチドをコードし、プロテアーゼ切断部位配列はＴＥＶ切断部位をコードし、第２の親和性タグはストレプトアビジンペプチドをコードする。一部の実施形態では、精製クラスターは、ＡｖｉＴａｇペプチド、ＴＥＶ切断部位、およびストレプトアビジンペプチドを含む。
【0114】
一部の実施形態では、第１の親和性タグ配列はＨｉｓペプチドをコードする。一部の実施形態では、第１の親和性タグ配列はＦＬＡＧペプチドをコードする。一部の実施形態では、第１の親和性タグ配列はＨＡペプチドをコードする。一部の実施形態では、第１の親和性タグ配列はＭｙｃペプチドをコードする。一部の実施形態では、第１の親和性タグ配列はストレプトアビジンペプチドをコードする。一部の実施形態では、精製クラスターはＨｉｓペプチドを含む。一部の実施形態では、精製クラスターはＦＬＡＧペプチドを含む。一部の実施形態では、精製クラスターはＨＡペプチドを含む。一部の実施形態では、精製クラスターはＭｙｃペプチドを含む。一部の実施形態では、精製クラスターはストレプトアビジンペプチドを含む。
【0115】
プロテアーゼ切断部位
ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチド組成物は、プロテアーゼ切断部位、例えば、精製クラスターをコードする配列をさらに含み得る。この切断部位は、第１の親和性タグ配列と第２の親和性タグ配列との間にコードされ得、ｃｏｍＰＡＣＴが発現され、精製のラウンドが終了した後、ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質からの第２の親和性タグの切断を可能にする。当該技術分野において公知である任意の適切なプロテアーゼ切断部位を使用することができ、限定されないが、特に、ＴＥＶ、トロンビン、第Ｘａ因子、エンテロペプチダーゼ、およびライノウイルス３Ｃプロテアーゼによって認識される切断部位を含む。
ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチド組成物は、プロテアーゼ切断部位、例えば、精製クラスターをコードする配列をさらに含み得る。この切断部位は、第１の親和性タグ配列と第２の親和性タグ配列との間にコードされ得、ｃｏｍＰＡＣＴが発現され、精製のラウンドが終了した後、ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質からの第２の親和性タグの切断を可能にする。当該技術分野において公知である任意の適切なプロテアーゼ切断部位を使用することができ、限定されないが、特に、ＴＥＶ、トロンビン、第Ｘａ因子、エンテロペプチダーゼ、およびライノウイルス３Ｃプロテアーゼによって認識される切断部位を含む。
【0116】
一実施形態では、プロテアーゼ切断部位配列は、ＴＥＶ切断部位配列、トロンビン切断部位配列、第Ｘａ因子切断部位配列、エンテロペプチダーゼ切断部位配列、および／またはライノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位配列である。一実施形態では、プロテアーゼ切断部位ヌクレオチド配列は、ＴＥＶ切断部位をコードする。別の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴポリペプチドは、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位であるＥＮＬＹＦＱＧを含む。一実施形態では、プロテアーゼ切断部位ヌクレオチド配列は、第Ｘａ因子切断部位をコードする。一実施形態では、プロテアーゼ切断部位ヌクレオチド配列は、ライノウイルス３Ｃ切断部位をコードする。一実施形態では、プロテアーゼ切断部位ヌクレオチド配列は、エンテロペプチダーゼ切断部位をコードする。一実施形態では、プロテアーゼ切断部位ヌクレオチド配列は、トロンビン切断部位をコードする。
【0117】
一部の実施形態では、第１の親和性タグ配列はＡｖｉＴａｇペプチドをコードし、プロテアーゼ切断部位配列はＴＥＶ切断部位をコードし、第２の親和性タグはＨｉｓ６ペプチドをコードする。一部の実施形態では、精製クラスターは、ＡｖｉＴａｇエピトープ、ＴＥＶ切断部位、およびＨｉｓ６エピトープを含む。一部の実施形態では、第１の親和性タグ配列はＡｖｉＴａｇペプチドをコードし、プロテアーゼ切断部位配列はトロンビン切断部位をコードし、第２の親和性タグはＨｉｓ６ペプチドをコードする。一部の実施形態では、精製クラスターは、ＡｖｉＴａｇエピトープ、トロンビン切断部位、およびＨｉｓ６エピトープを含む。一部の実施形態では、第１の親和性タグ配列はＡｖｉＴａｇペプチドをコードし、プロテアーゼ切断部位配列は第Ｘａ因子切断部位をコードし、第２の親和性タグはＨｉｓ６ペプチドをコードする。一部の実施形態では、精製クラスターは、ＡｖｉＴａｇエピトープ、第Ｘａ因子切断部位、およびＨｉｓ６エピトープを含む。一部の実施形態では、第１の親和性タグ配列はＡｖｉＴａｇペプチドをコードし、プロテアーゼ切断部位配列はエンテロペプチダーゼ切断部位をコードし、第２の親和性タグはＨｉｓ６ペプチドをコードする。一部の実施形態では、精製クラスターは、ＡｖｉＴａｇエピトープ、エンテロペプチダーゼ切断部位、およびＨｉｓ６エピトープを含む。一部の実施形態では、第１の親和性タグ配列はＡｖｉＴａｇペプチドをコードし、プロテアーゼ切断部位配列はライノウイルス３Ｃ切断部位をコードし、第２の親和性タグはＨｉｓ６ペプチドをコードする。一部の実施形態では、精製クラスターは、ＡｖｉＴａｇエピトープ、ライノウイルス３Ｃ切断部位、およびＨｉｓ６エピトープを含む。
【0118】
ＰｏｌｙＡテール
ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチド組成物は、ポリアデニル化（ポリＡ）テールをさらに含むことができる。哺乳動物、真核生物、または原核生物のポリＡ配列モチーフを使用することができる。この配列は、ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドが、宿主細胞への直接トランスフェクションのためにＰＣＲを介してアセンブルされる場合に含まれ得る（例えば、発現コンストラクトまたはベクターとの関連でない）。任意の適切なポリＡテールおよび配列モチーフは、限定されないが、ＳＶ４０、ｈＧＨ、ｂＧＨ、およびｒｂＧｌｏｂ配列を含むｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドにおいて使用され得る。このような配列には、ＲＮＡ配列モチーフ：ＡＡＵＡＡが含まれる。一実施形態では、ポリＡ配列は、ｂＧＨポリＡ配列を含む。一実施形態では、ポリＡ配列は、ｂＧＨポリＡ配列、ＳＶ４０ポリＡ配列、ｈＧＨポリＡ配列、およびｒｂＧｌｏｂポリＡ配列から選択される。一実施形態では、ポリＡ配列は、ＳＶ４０ポリＡ配列を含む。一実施形態では、ポリＡ配列は、ｈＧＨポリＡ配列を含む。一実施形態では、ポリＡ配列は、ｒｂＧｌｏｂポリＡ配列を含む。
ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチド組成物は、ポリアデニル化（ポリＡ）テールをさらに含むことができる。哺乳動物、真核生物、または原核生物のポリＡ配列モチーフを使用することができる。この配列は、ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドが、宿主細胞への直接トランスフェクションのためにＰＣＲを介してアセンブルされる場合に含まれ得る（例えば、発現コンストラクトまたはベクターとの関連でない）。任意の適切なポリＡテールおよび配列モチーフは、限定されないが、ＳＶ４０、ｈＧＨ、ｂＧＨ、およびｒｂＧｌｏｂ配列を含むｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドにおいて使用され得る。このような配列には、ＲＮＡ配列モチーフ：ＡＡＵＡＡが含まれる。一実施形態では、ポリＡ配列は、ｂＧＨポリＡ配列を含む。一実施形態では、ポリＡ配列は、ｂＧＨポリＡ配列、ＳＶ４０ポリＡ配列、ｈＧＨポリＡ配列、およびｒｂＧｌｏｂポリＡ配列から選択される。一実施形態では、ポリＡ配列は、ＳＶ４０ポリＡ配列を含む。一実施形態では、ポリＡ配列は、ｈＧＨポリＡ配列を含む。一実施形態では、ポリＡ配列は、ｒｂＧｌｏｂポリＡ配列を含む。
【0119】
抗原配列
抗原配列は、５～１００、５～１０、１０～２０、１０～３０、１０～４０、１０～５０、１０～６０、１０～７０、１０～８０、１０～９０、１０～１００、２０～１００、３０～１００、４０～１００、５０～１００、６０～１００、７０～１００、８０～１００、９０～１００、２０～４０、２０～５０、２０～６０、２０～７０、２０～８０、２０～１９、２０～１００、２０～３０、２５～３５、２０～４５、３０～４５、３０～５０、３０～６０、３０～７０、３０～８０、３０～９０、３０～１００、４０～５０、４０～６０、４５～６０、４０～７０、４０～８０、４０～９０、４０～１００、５０～６０、５０～７０、５０～８０、５０～９０、５０～１００、６０～７０、６０～８０、６０～９０、６０～１００、７０～８０、８０～９０、８０～１００、または９０～１００ヌクレオチド長であり得る。抗原配列は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ヌクレオチド長であり得る。抗原ペプチドは、３～５０、３～１０、５～１５、７～１５、５～２０、７～２０、１０～１５、１０～２０、１５～２０、２０～２５、２０～３０、２５～３５、３０～４０、または４０～５０アミノ酸長であり得る。抗原ペプチドは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸長であり得る。抗原ペプチドは、腫瘍抗原、ネオ抗原、腫瘍ネオ抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、ホスホ抗原、または微生物抗原を含み得る。一実施形態では、抗原ペプチドはネオ抗原である。抗原ペプチドは、１つ以上の体細胞突然変異を有する抗原を選択するために、患者データから選択され得る。抗原ペプチドの予測には、予測アルゴリズム、および抗原ペプチドまたはネオ抗原とＨＭＣ対立遺伝子との結合の予測が含まれ得る。抗原ペプチドの予測については、以下でさらに検討議される。
抗原配列は、５～１００、５～１０、１０～２０、１０～３０、１０～４０、１０～５０、１０～６０、１０～７０、１０～８０、１０～９０、１０～１００、２０～１００、３０～１００、４０～１００、５０～１００、６０～１００、７０～１００、８０～１００、９０～１００、２０～４０、２０～５０、２０～６０、２０～７０、２０～８０、２０～１９、２０～１００、２０～３０、２５～３５、２０～４５、３０～４５、３０～５０、３０～６０、３０～７０、３０～８０、３０～９０、３０～１００、４０～５０、４０～６０、４５～６０、４０～７０、４０～８０、４０～９０、４０～１００、５０～６０、５０～７０、５０～８０、５０～９０、５０～１００、６０～７０、６０～８０、６０～９０、６０～１００、７０～８０、８０～９０、８０～１００、または９０～１００ヌクレオチド長であり得る。抗原配列は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ヌクレオチド長であり得る。抗原ペプチドは、３～５０、３～１０、５～１５、７～１５、５～２０、７～２０、１０～１５、１０～２０、１５～２０、２０～２５、２０～３０、２５～３５、３０～４０、または４０～５０アミノ酸長であり得る。抗原ペプチドは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸長であり得る。抗原ペプチドは、腫瘍抗原、ネオ抗原、腫瘍ネオ抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、ホスホ抗原、または微生物抗原を含み得る。一実施形態では、抗原ペプチドはネオ抗原である。抗原ペプチドは、１つ以上の体細胞突然変異を有する抗原を選択するために、患者データから選択され得る。抗原ペプチドの予測には、予測アルゴリズム、および抗原ペプチドまたはネオ抗原とＨＭＣ対立遺伝子との結合の予測が含まれ得る。抗原ペプチドの予測については、以下でさらに検討議される。
【0120】
一部の実施形態では、抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、２０～６０、２０～３０、２５～３５、２０～４５、３０～４５、４０～６０、または４５～６０ヌクレオチド長である。他の実施形態では、抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、２０～３０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、抗原ペプチドは、７～１０、８～９、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５アミノ酸長である。一部の実施形態では、抗原ペプチドは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または２０アミノ酸長である。
【0121】
ビオチン化
本明細書に記載されるｃｏｍＰＡＣＴタンパク質は、さらに、任意の適切な方法によってビオチン化され得る。このような方法の１つは、ＢｉｒＡビオチン－タンパク質リガーゼを利用し、市販されている。ＡｖｔｉＴａｇ配列（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）として公知である特異的アミノ酸配列は、目的とするタンパク質にコードされている。ＢｉｒＡリガーゼ、ｄ－ビオチンおよびＡＴＰは、目的とするタンパク質を含有する反応混合物に添加される。ＢｉｒＡは、ビオチンをＡｖｉＴａｇ配列のリジンに共有結合によってライゲーションさせ、それにより、目的とするタンパク質をビオチン化する。次に、新たにビオチン化されたタンパク質を精製し、下流の用途に使用することができる。タンパク質をビオチン化する、当該技術分野において公知である他の方法もまた利用することができる。
本明細書に記載されるｃｏｍＰＡＣＴタンパク質は、さらに、任意の適切な方法によってビオチン化され得る。このような方法の１つは、ＢｉｒＡビオチン－タンパク質リガーゼを利用し、市販されている。ＡｖｔｉＴａｇ配列（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）として公知である特異的アミノ酸配列は、目的とするタンパク質にコードされている。ＢｉｒＡリガーゼ、ｄ－ビオチンおよびＡＴＰは、目的とするタンパク質を含有する反応混合物に添加される。ＢｉｒＡは、ビオチンをＡｖｉＴａｇ配列のリジンに共有結合によってライゲーションさせ、それにより、目的とするタンパク質をビオチン化する。次に、新たにビオチン化されたタンパク質を精製し、下流の用途に使用することができる。タンパク質をビオチン化する、当該技術分野において公知である他の方法もまた利用することができる。
【0122】
一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質は、精製されたＢｉｒＡタンパク質によるタンパク質精製後にビオチン化される。一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質は、精製されたＢｉｒＡタンパク質によるタンパク質精製の間、細胞溶解物中でビオチン化される。精製されたＢｉｒＡおよび精製されたまたは部分的に精製されたｃｏｍＰＡＣＴタンパク質を用いるこのような方法は、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」ビオチン化と呼ばれる。一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質は、細胞内でのタンパク質生成中、細胞質内で細胞発現されたＢｉｒＡタンパク質によって、細胞表面でビオチン化されるか、または細胞培養培地中に分泌される。細胞発現されたＢｉｒＡおよび未精製のｃｏｍＰＡＣＴタンパク質を用いるこのような方法は、「ｉｎ ｖｉｖｏ」ビオチン化と呼ばれる。
【0123】
発現コンストラクトおよびベクター
ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチド分子は、例えば、プラスミドおよびタンパク質生成のために、発現コンストラクトまたはベクターに挿入することができる。発現コンストラクトまたはベクターは、プラスミドまたはウイルスベクターであり得る。当該技術分野において公知である任意の適切な発現コンストラクトまたはベクターを使用することができ、細菌発現プラスミド、例えば、大腸菌または枯草菌（Bacillus subtilis）プラスミド；真核生物発現ベクター、例えば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）発現ベクター；またはウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター、ワクシニアベクター、もしくはバキュロウイルスベクターが含まれる。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨＥＫ２９３、Ｅｘｐｉ２９３、または任意の他の適切な哺乳動物細胞株などの培養された哺乳動物細胞株において使用するための哺乳動物発現ベクターもまた意図される。さらに、発現コンストラクトまたはベクターは、ヌクレオチドバーコードを含み得る。ヌクレオチドバーコードは、各発現コンストラクトまたはベクターに対して固有であり得る。一部の実施形態では、シグナル配列、ベータ－２－ミクログロブリン、およびＭＨＣ対立遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、非コードまたはダミー抗原挿入物を有する発現コンストラクトまたはベクターにライゲーションすることができる。次に、この非コード抗原挿入物は、制限消化などの適切なクローニング技術によって除去され得、所望の抗原配列をライゲーションまたは任意の他の適切なクローニング技術を介して挿入することができる。
ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチド分子は、例えば、プラスミドおよびタンパク質生成のために、発現コンストラクトまたはベクターに挿入することができる。発現コンストラクトまたはベクターは、プラスミドまたはウイルスベクターであり得る。当該技術分野において公知である任意の適切な発現コンストラクトまたはベクターを使用することができ、細菌発現プラスミド、例えば、大腸菌または枯草菌（Bacillus subtilis）プラスミド；真核生物発現ベクター、例えば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）発現ベクター；またはウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター、ワクシニアベクター、もしくはバキュロウイルスベクターが含まれる。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨＥＫ２９３、Ｅｘｐｉ２９３、または任意の他の適切な哺乳動物細胞株などの培養された哺乳動物細胞株において使用するための哺乳動物発現ベクターもまた意図される。さらに、発現コンストラクトまたはベクターは、ヌクレオチドバーコードを含み得る。ヌクレオチドバーコードは、各発現コンストラクトまたはベクターに対して固有であり得る。一部の実施形態では、シグナル配列、ベータ－２－ミクログロブリン、およびＭＨＣ対立遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、非コードまたはダミー抗原挿入物を有する発現コンストラクトまたはベクターにライゲーションすることができる。次に、この非コード抗原挿入物は、制限消化などの適切なクローニング技術によって除去され得、所望の抗原配列をライゲーションまたは任意の他の適切なクローニング技術を介して挿入することができる。
【0124】
一部の実施形態では、本明細書では、異なるＭＨＣ対立遺伝子をコードする２つ以上の異なるベクターを含むライブラリーが提供される。
【0125】
宿主細胞
別の態様では、本明細書では、本明細書に記載されるポリヌクレオチド分子または発現コンストラクトを含む宿主細胞が提供される。宿主細胞は、当該技術分野において公知である任意の適切な宿主細胞であり得、限定されないが、細菌細胞、例えば、大腸菌または枯草菌、または真核生物の宿主細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨＥＫ２９３、Ｅｘｐｉ２９３、ＨｅＬａ、昆虫細胞株、例えば、Ｓｆ９もしくはＳｆ１２、または酵母細胞、例えば、ピキア・パストリスが含まれる。宿主細胞はまた、ビオチン化酵素ＢｉｒＡを安定に発現することができる。宿主細胞は、初代細胞または不死化細胞であり得る。
別の態様では、本明細書では、本明細書に記載されるポリヌクレオチド分子または発現コンストラクトを含む宿主細胞が提供される。宿主細胞は、当該技術分野において公知である任意の適切な宿主細胞であり得、限定されないが、細菌細胞、例えば、大腸菌または枯草菌、または真核生物の宿主細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨＥＫ２９３、Ｅｘｐｉ２９３、ＨｅＬａ、昆虫細胞株、例えば、Ｓｆ９もしくはＳｆ１２、または酵母細胞、例えば、ピキア・パストリスが含まれる。宿主細胞はまた、ビオチン化酵素ＢｉｒＡを安定に発現することができる。宿主細胞は、初代細胞または不死化細胞であり得る。
【0126】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは細胞ゲノムに組み込まれる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは染色体外である。一部の実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、細胞はヒト細胞である。一部の実施形態では、細胞は、幹細胞、腫瘍細胞、不死化細胞、および胎児細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、宿主細胞は原核細胞である。一部の実施形態では、細胞は大腸菌細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ＢｉｒＡタンパク質またはその断片を発現する。
【0127】
ライブラリー
２つ以上の異なるｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチド分子、ポリペプチド分子、または粒子に結合したポリペプチド分子を含むライブラリーも考慮される。ライブラリーは、２～１０００分子を含み得る。一部の実施形態では、ライブラリーは、２～９００、２～８００、２～７００、２～６００、２～５００、２～４８０、２～４００、２～３００、２～２００、２～１００、２～５０、２～６６、２～４８、２～３０、２～２０、２～１９、１０～１０００、１０～９００、１０～８００、１０～７００、１０～６００、１０～５００、１０～４８０、１０～４００、１０～３００、１０～２００、１０～１００、１０～５０、１０～６６、１０～４８、１０～３０、１０～２０、２０～１０００、２０～９００、２０～８００、２０～７００、２０～６００、２０～５００、２０～４８０、２０～４００、２０～３００、２０～２００、２０～１００、２０～５０、２０～５０、２０～６６、２０～４８、２０～３０、３０～１０００、３０～９００、３０～８００、３０～７００、３０～６００、３０～５００、３０～４８０、３０～４００、３０～３００、３０～２００、３０～１００、３０～５０、３０～５０、３０～６６、３０～４８、３０～４０、４０～１０００、４０～９００、４０～８００、４０～７００、４０～６００、４０～５００、４０～４８０、４０～４００、４０～３００、４０～２００、４０～１００、４０～６０、４０～５０、４０～６６、４０～４８、５０～１０００、５０～９００、５０～８００、５０～７００、５０～６００、５０～５００、５０～４８０、５０～４００、５０～３００、５０～２００、５０～１００、５０～６０、５０～６６、６０～１０００、６０～９００、６０～８００、６０～７００、６０～６００、６０～５００、６０～４８０、６０～４００、６０～３００、６０～２００、６０～１００、７０～１０００、７０～９００、７０～８００、７０～７００、７０～６００、７０～５００、７０～４８０、７０～４００、７０～３００、７０～２００、７０～１００、７０～８０、７０～９０、８０～１０００、８０～９００、８０～８００、８０～７００、８０～６００、８０～５００、８０～４８０、８０～４００、８０～３００、８０～２００、８０～１００個のポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子を含む。一部の実施形態では、ライブラリーは、２～１９、４８～４８０、４８～６６、６６～４８０、２２０～２４０、４０～６０、４８～６６、５０～７０、または６０～８０個のポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子を含む。一部の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、４８、５０、５５、６０、６５、６６、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、６００、５６２、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、または１０００個のｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子を含む。一部の実施形態では、ライブラリーは、２、１０、１５、２０、２４、４８、６６、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００個のｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子を含む。分子は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または粒子に結合したポリペプチドであり得る。一部の実施形態では、２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子は、異なる抗原ペプチド配列を有する。一部の実施形態では、２つ以上の分子は、異なる抗原ペプチド配列および異なるＭＨＣ分子を有する。
２つ以上の異なるｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチド分子、ポリペプチド分子、または粒子に結合したポリペプチド分子を含むライブラリーも考慮される。ライブラリーは、２～１０００分子を含み得る。一部の実施形態では、ライブラリーは、２～９００、２～８００、２～７００、２～６００、２～５００、２～４８０、２～４００、２～３００、２～２００、２～１００、２～５０、２～６６、２～４８、２～３０、２～２０、２～１９、１０～１０００、１０～９００、１０～８００、１０～７００、１０～６００、１０～５００、１０～４８０、１０～４００、１０～３００、１０～２００、１０～１００、１０～５０、１０～６６、１０～４８、１０～３０、１０～２０、２０～１０００、２０～９００、２０～８００、２０～７００、２０～６００、２０～５００、２０～４８０、２０～４００、２０～３００、２０～２００、２０～１００、２０～５０、２０～５０、２０～６６、２０～４８、２０～３０、３０～１０００、３０～９００、３０～８００、３０～７００、３０～６００、３０～５００、３０～４８０、３０～４００、３０～３００、３０～２００、３０～１００、３０～５０、３０～５０、３０～６６、３０～４８、３０～４０、４０～１０００、４０～９００、４０～８００、４０～７００、４０～６００、４０～５００、４０～４８０、４０～４００、４０～３００、４０～２００、４０～１００、４０～６０、４０～５０、４０～６６、４０～４８、５０～１０００、５０～９００、５０～８００、５０～７００、５０～６００、５０～５００、５０～４８０、５０～４００、５０～３００、５０～２００、５０～１００、５０～６０、５０～６６、６０～１０００、６０～９００、６０～８００、６０～７００、６０～６００、６０～５００、６０～４８０、６０～４００、６０～３００、６０～２００、６０～１００、７０～１０００、７０～９００、７０～８００、７０～７００、７０～６００、７０～５００、７０～４８０、７０～４００、７０～３００、７０～２００、７０～１００、７０～８０、７０～９０、８０～１０００、８０～９００、８０～８００、８０～７００、８０～６００、８０～５００、８０～４８０、８０～４００、８０～３００、８０～２００、８０～１００個のポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子を含む。一部の実施形態では、ライブラリーは、２～１９、４８～４８０、４８～６６、６６～４８０、２２０～２４０、４０～６０、４８～６６、５０～７０、または６０～８０個のポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子を含む。一部の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、４８、５０、５５、６０、６５、６６、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、６００、５６２、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、または１０００個のｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子を含む。一部の実施形態では、ライブラリーは、２、１０、１５、２０、２４、４８、６６、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００個のｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子を含む。分子は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または粒子に結合したポリペプチドであり得る。一部の実施形態では、２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子は、異なる抗原ペプチド配列を有する。一部の実施形態では、２つ以上の分子は、異なる抗原ペプチド配列および異なるＭＨＣ分子を有する。
【0128】
一部の実施形態では、ライブラリーは、２つ以上の異なるポリヌクレオチド分子を含み、各々異なるポリヌクレオチド分子は、（ｉ）第１のユニバーサル配列、（ｉｉ）抗原ペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、２つ以上のポリヌクレオチド分子の各々に対して同一でないヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）第２のユニバーサル標的配列、（ｉｖ）β２Ｍ配列、および（ｖ）ＭＨＣ対立遺伝子配列を含む。一部の実施形態では、ＭＨＣ対立遺伝子配列は、２つ以上のポリヌクレオチド分子の各々に対して同一でない。
【0129】
一実施形態では、ライブラリーは、ＨＬＡ－Ａ＊０１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊６８：０１、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２６：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊６８：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３９：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４６：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５０：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０７、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４１：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０５、ＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０１：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２、およびＨＬＡ－Ｃ＊１７：０１対立遺伝子のうちの少なくとも２つ以上を含む。一実施形態では、ライブラリーは、少なくともＨＬＡ－Ａ＊０１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０２、ＨＬＡ－Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊６８：０１、ＨＬＡ－Ａ＊１１：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２３：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ－Ａ＊３３：０３、ＨＬＡ－Ａ＊２５：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２６：０１、ＨＬＡ－Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ－Ａ＊６８：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊３９：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４６：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５０：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４０：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊１３：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊１５：０７、ＨＬＡ－Ｂ＊２７：０５、ＨＬＡ－Ｂ＊３５：０３、ＨＬＡ－Ｂ＊３７：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊３８：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊４１：０２、ＨＬＡ－Ｂ＊４４：０５、ＨＬＡ－Ｂ＊４９：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５２：０１、ＨＬＡ－Ｂ＊５５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０１：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０７：０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ－Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ－Ｃ＊１５：０２、およびＨＬＡ－Ｃ＊１７：０１対立遺伝子を含む。
【0130】
一部の実施形態では、ライブラリーは、２つ以上の異なるポリペプチド分子を含み、抗原ペプチドは、２つ以上のポリペプチド分子の各々に対して同一でなく、各々異なるポリペプチドは、粒子に結合される。一部の実施形態では、ライブラリーは、各々異なるポリペプチドの同一性と作動可能に関連付けられた固有の定義されたバーコード配列をさらに含む。
【0131】
実施形態は、定義されたバーコード配列を含むバーコード化されたポリヌクレオチドを含むことができる。バーコード化されたポリヌクレオチドは、Ｔ細胞単離後に同定するための固有な抗原特異的配列を提供するポリヌクレオチドであり得る。したがって、各々の固有のｃｏｍＰＡＣＴは、固有に定義されたバーコード配列を有する粒子に結合される。これにより、所与の抗原と、その対に固有の所与のバーコードとの間に作動可能な関連性が可能となる。
【0132】
バーコード化されたポリヌクレオチドは、ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡであり得る。バーコードを含むポリヌクレオチドは、その５’末端で修飾されて、粒子への結合のための結合部分を含むことができる。例えば、バーコード配列を含むポリヌクレオチドは、デキストランなどの粒子に結合したストレプトアビジン－コアに結合するためにビオチン分子にコンジュゲートされる。しかしながら、任意の適切な結合部分は、粒子へのポリヌクレオチドの結合のために使用することができる。本明細書に記載され、当業者によって理解されるように、適切な結合部分対は当該技術分野において公知である。結合部分の非限定的な例としては、チオール、マレイミド、アダマンタン、シクロデキストリン、アミン、カルボキシ、アジド、およびアルキンが挙げられる。
【0133】
粒子
本明細書で使用される場合、「ナノ粒子」または代替的に「粒子」とは、特異的に選別または単離することができ、他の実体を結合させることができる基質を指す。一部の実施形態では、ナノ粒子は、例えば、磁石を使用した単離のために磁性である。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、磁性酸化鉄を含む。磁性粒子の例としては、限定されないが、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）が挙げられる。一部の実施形態では、ナノ粒子は、例えば、重力によって単離するためのポリスチレン粒子である。他の実施形態では、粒子は、表面、ビーズ、またはポリマーであり得る。ビーズの例としては、限定されないが、アガロースビーズおよびセファロースビーズが挙げられる。特定の実施形態では、粒子またはナノ粒子は、蛍光性であり得、または直接的もしくは間接的にフルオロフォアに結合され得る。
本明細書で使用される場合、「ナノ粒子」または代替的に「粒子」とは、特異的に選別または単離することができ、他の実体を結合させることができる基質を指す。一部の実施形態では、ナノ粒子は、例えば、磁石を使用した単離のために磁性である。一部の実施形態では、磁性ナノ粒子は、磁性酸化鉄を含む。磁性粒子の例としては、限定されないが、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）が挙げられる。一部の実施形態では、ナノ粒子は、例えば、重力によって単離するためのポリスチレン粒子である。他の実施形態では、粒子は、表面、ビーズ、またはポリマーであり得る。ビーズの例としては、限定されないが、アガロースビーズおよびセファロースビーズが挙げられる。特定の実施形態では、粒子またはナノ粒子は、蛍光性であり得、または直接的もしくは間接的にフルオロフォアに結合され得る。
【0134】
ある実施形態によれば、ナノ粒子は、さらなる分子を結合させるための結合部分を用いて修飾される。ナノ粒子の修飾は、ポリヌクレオチドに結合した対応するコグネイト（例えば、相補的）結合部分とペアリングし得る（例えば、共有結合によって結合し得る）結合部分を含む。結合部分の任意の適切な対を用いて、ナノ粒子およびポリヌクレオチド検出タグを結合のために修飾することができる。結合部分対の非限定的な例としては、ストレプトアビジン／ビオチン系、チオール基（例えば、システイン）とマレイミド、アダマンタンとシクロデキストリン、アミノ基とカルボキシ基、およびアジド基とアルキン（alkynl）基が挙げられる。一部の実施形態では、結合部分は、切断部分を含むことができる。他の実施形態では、相補的コグネイト結合部分に結合した結合部分は、可逆的であり得、例えば、還元性チオール基であり得る。例示的な実施形態では、修飾されたナノ粒子は、１μｍナノ粒子（例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）ＭｙＯｎｅ（商標）ストレプトアビジンＴ１ビーズ）などのストレプトアビジンを被覆した磁性ナノ粒子であり、ポリヌクレオチドは、修飾されたナノ粒子への結合のためにビオチン化され得る。
【0135】
粒子は、ビオチン化されたデキストランまたはストレプトアビジンを被覆したデキストランなどのデキストランであり得る。修飾されたデキストランは、Ｂｅｔｈｕｎｅら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６２巻：１２３～１３０頁、２０１７年３月および米国特許出願公開第２０１５／０３２９６１７号にさらに詳細に記載され、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ビオチン化されたｃｏｍＰＡＣＴは、ストレプトアビジンを被覆したデキストランに結合させることができる。
【0136】
ｃｏｍＰＡＣＴはまた、ストレプトアビジンコアに結合した１、２、３、または４個のビオチン化されたｃｏｍＰＡＣＴタンパク質を含む四量体にアセンブルさせることができる。四量体はまた、ストレプトアビジンコアに結合したフィコエリトリン（ＰＥ）またはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）などのフルオロフォアを含むことができる。ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ四量体は、当該技術分野において周知である。ＭＨＣクラスＩ四量体は、Ｂｕｒｒｏｗ ＳＲら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０００年１２月１日、１６５巻（１１号）６２２９～６２３４頁にさらに詳細に記載され、ＭＨＣクラスＩＩ四量体は、Ｎｅｐｏｍ ＧＴ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０１２年３月１５日、１８８巻（６号）２４７７～２４８２頁にさらに詳細に記載され、これら両者はそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0137】
ＣｏｍＰＡＣＴタンパク質はまた、多量体にアセンブルされ得る。一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質多量体は、ダイマー、三量体、四量体、五量体、六量体、または高次多量体であり得る。一部の実施形態では、多量体は、少なくとも２つ以上のｃｏｍＰＡＣＴタンパク質を含むことができる。一部の実施形態では、多量体は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のｃｏｍＰＡＣＴタンパク質を含むことができる。
【0138】
生成方法
抗原予測
ｃｏｍＰＡＣＴを製造するために、初期工程の１つは、患者の腫瘍特異的抗原（例えば、ネオ抗原）の同定を含むことができる。次に、この方法によって生成された組成物は、Ｔ細胞媒介性免疫プロセス、例えば、患者特異的がん免疫療法において利用することができる。患者の推定ネオ抗原（腫瘍または病原体）を同定するために、インシリコ予測アルゴリズムプログラムを利用して、全ゲノム、全エキソーム、またはトランスクリプトーム配列決定データを含む腫瘍、ウイルス、または細菌の配列決定データを分析して、推定上発現されたネオ抗原に対応する１つ以上の突然変異を同定することができる。さらに、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）タイピングは、患者の腫瘍または血液試料から決定することができ、このＨＬＡ情報は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるＦｒｉｔｓｃｈら、２０１４年、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．、２巻：５２２～５２９頁によって検証されるように、ＭＨＣ結合の予測アルゴリズムにおける同定された推定ネオ抗原ペプチド配列とともに利用することができる。ヒト集団において共通に見出されるＨＬＡはまた、ネオ抗原予測アルゴリズムに含めることができ、例えば、白色人種ではＨＬＡ－Ａ＊０２、２４、０１；ＨＬＡ－Ｂ＊３５、４４、５１；ＤＲＢ１＊１１、１３、０７；アフリカ系ブラジル人ではＨＬＡ－Ａ＊０２、０３、３０；ＨＬＡ－Ｂ＊３５、１５、４４；ＤＲＢ１＊１３、１１、０３；およびアジア人ではＨＬＡ－Ａ＊２４、０２、２６；ＨＬＡ－Ｂ＊４０、５１、５２；ＤＲＢ１＊０４、１５、０９である。ＨＬＡ対立遺伝子の特異的なペアリングもまた使用することができる。ヒト集団において見出される共通の対立遺伝子は、Ｂａｒｄｉら（Ｒｅｖ Ｂｒａｓ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｈｅｍｏｔｅｒ．２０１２年；３４巻（１号）：２５～３０頁）にさらに記載されている。
抗原予測
ｃｏｍＰＡＣＴを製造するために、初期工程の１つは、患者の腫瘍特異的抗原（例えば、ネオ抗原）の同定を含むことができる。次に、この方法によって生成された組成物は、Ｔ細胞媒介性免疫プロセス、例えば、患者特異的がん免疫療法において利用することができる。患者の推定ネオ抗原（腫瘍または病原体）を同定するために、インシリコ予測アルゴリズムプログラムを利用して、全ゲノム、全エキソーム、またはトランスクリプトーム配列決定データを含む腫瘍、ウイルス、または細菌の配列決定データを分析して、推定上発現されたネオ抗原に対応する１つ以上の突然変異を同定することができる。さらに、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）タイピングは、患者の腫瘍または血液試料から決定することができ、このＨＬＡ情報は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるＦｒｉｔｓｃｈら、２０１４年、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．、２巻：５２２～５２９頁によって検証されるように、ＭＨＣ結合の予測アルゴリズムにおける同定された推定ネオ抗原ペプチド配列とともに利用することができる。ヒト集団において共通に見出されるＨＬＡはまた、ネオ抗原予測アルゴリズムに含めることができ、例えば、白色人種ではＨＬＡ－Ａ＊０２、２４、０１；ＨＬＡ－Ｂ＊３５、４４、５１；ＤＲＢ１＊１１、１３、０７；アフリカ系ブラジル人ではＨＬＡ－Ａ＊０２、０３、３０；ＨＬＡ－Ｂ＊３５、１５、４４；ＤＲＢ１＊１３、１１、０３；およびアジア人ではＨＬＡ－Ａ＊２４、０２、２６；ＨＬＡ－Ｂ＊４０、５１、５２；ＤＲＢ１＊０４、１５、０９である。ＨＬＡ対立遺伝子の特異的なペアリングもまた使用することができる。ヒト集団において見出される共通の対立遺伝子は、Ｂａｒｄｉら（Ｒｅｖ Ｂｒａｓ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｈｅｍｏｔｅｒ．２０１２年；３４巻（１号）：２５～３０頁）にさらに記載されている。
【0139】
ネオ抗原を同定する方法のさらなる例には、配列決定と質量分析およびＭＨＣ提示予測（例えば、米国出願公開第２０１７／０１９９９６１号）とを組み合わせること、ならびに配列決定とＭＨＣ結合親和性予測（例えば、発行された米国特許第９，１１５，４０２号）とを組み合わせることが含まれる。さらに、患者試料中にネオ抗原特異的Ｔ細胞が存在するかどうかを同定するために有用な方法は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１７／０００３２８８号およびＰＣＴ／ＵＳ１７／５９５９８号に記載されるような、本明細書に記載される方法と組み合わせて使用することができる。これらの分析は、コグネイト抗原特異的Ｔ細胞をスクリーニングするための常套方法を用いて容易に合成することができる患者の候補ネオ抗原ペプチドのランク付けされたリストをもたらす。
【0140】
プライマーアニーリングおよび制限消化アセンブリ
一般的に、ｃｏｍａＰＡＣＴポリヌクレオチドの調製は、本明細書に開示される手順によって、ならびに認識された組換えＤＮＡ技術、例えば、プラスミドＤＮＡの調製、制限酵素によるＤＮＡの切断、ＤＮＡのライゲーション、宿主の形質転換またはトランスフェクション、宿主の培養、ならびに発現された融合複合体の単離および精製によって達成することができる。このような手順は、一般的に公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）などの標準的な文献に開示されている。
一般的に、ｃｏｍａＰＡＣＴポリヌクレオチドの調製は、本明細書に開示される手順によって、ならびに認識された組換えＤＮＡ技術、例えば、プラスミドＤＮＡの調製、制限酵素によるＤＮＡの切断、ＤＮＡのライゲーション、宿主の形質転換またはトランスフェクション、宿主の培養、ならびに発現された融合複合体の単離および精製によって達成することができる。このような手順は、一般的に公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）などの標準的な文献に開示されている。
【0141】
一部の態様では、ＭＨＣクラスＩ重鎖をコードするＤＮＡは、例えば、ヒトリンパ芽球様細胞などの適切な細胞株から得ることができる。種々の形状において、クラスＩ重鎖をコードする遺伝子またはｃＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または当該技術分野において公知である他の手段によって増幅することができる。一部の態様では、ＰＣＲ産物はまた、リンカーをコードする配列、および／またはこのような配列をライゲーションするための１つ以上の制限酵素部位を含むことができる。
【0142】
一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドをコードするベクターは、ＭＨＣ重鎖およびβ２－ミクログロブリンをコードする配列を、抗原ペプチドをコードする配列にライゲーションすることによって調製することができる。抗原ペプチドをコードするＤＮＡは、天然源からＤＮＡを単離することによって、または公知の合成方法、例えば、リン酸トリエステル法によって得ることができる。例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ （Ｍ．Ｇａｉｔ、編集、１９８４年）を参照されたい。合成オリゴヌクレオチドはまた、市販の自動化オリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いて調製することができる。本明細書において検討されるユニバーサル標的配列をコードするＤＮＡ配列は、シグナル配列をコードする配列と抗原ペプチドをコードする配列との間に介在され得、第２のユニバーサル標的配列は、抗原ペプチドセグメントをコードする配列とβ２－ミクログロブリンセグメントをコードする配列との間に介在され得る。一部の実施形態では、セグメントは、リガーゼを用いて連結され得る。一部の実施形態では、抗原ペプチドをコードする配列は、適切なポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化され得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドキナーゼは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼである。限定されないが、Ｔ７ポリヌクレオチドキナーゼとしても公知であるＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含む、当該技術分野において公知である任意の適切なポリヌクレオチドキナーゼを使用することができる。
【0143】
ＰＣＲアセンブリ
一部の態様では、ｃｏｍＰＡＣＴは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を介してアセンブルすることができる。制限消化法と同様に、ＭＨＣ重鎖およびβ２－ミクログロブリンをコードするＤＮＡを適切な供給源から得ることができる。選択されたシグナル配列をコードする第２のＤＮＡ断片もまた、適切な供給源から得ることができる。両方のＤＮＡ断片は、異なるユニバーサル標的配列を有し得、その結果、１つのユニバーサル配列に対するプライマーは、第２のユニバーサル配列とアニーリングしない。選択された抗原ペプチドをコードする２つの配列を合成することができる；５’末端に抗原配列、および３’末端にＭＨＣ ＤＮＡ断片上のユニバーサルプライマー配列の相補配列を有する１つのフォワードプライマー；ならびに５’末端に選択された抗原配列の逆相補配列、および３’末端にシグナル配列断片からのユニバーサルプライマーの逆相補配列を有する１つの逆プライマー。シグナル配列断片の５’末端およびＭＨＣ対立遺伝子断片の３’末端のための４つすべてのＤＮＡ断片およびプライマーとのＰＣＲ反応は、３’末端にシグナル配列および５’末端に抗原配列を有する断片、ならびに３’末端に抗原配列および３’末端にＭＨＣ対立遺伝子を有する断片の２つのＤＮＡ断片の増幅をもたらす。さらなるＰＣＲ増幅サイクルは、オーバーラップする抗原ペプチド配列をアニーリングさせ、単一の全長ＤＮＡ断片をもたらすことを可能にする。一部の実施形態では、シグナルペプチド断片は、プロモーター配列をさらに含む。一部の実施形態では、ＭＨＣ断片は、精製クラスターおよび／またはポリＡテールをさらに含む。
一部の態様では、ｃｏｍＰＡＣＴは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を介してアセンブルすることができる。制限消化法と同様に、ＭＨＣ重鎖およびβ２－ミクログロブリンをコードするＤＮＡを適切な供給源から得ることができる。選択されたシグナル配列をコードする第２のＤＮＡ断片もまた、適切な供給源から得ることができる。両方のＤＮＡ断片は、異なるユニバーサル標的配列を有し得、その結果、１つのユニバーサル配列に対するプライマーは、第２のユニバーサル配列とアニーリングしない。選択された抗原ペプチドをコードする２つの配列を合成することができる；５’末端に抗原配列、および３’末端にＭＨＣ ＤＮＡ断片上のユニバーサルプライマー配列の相補配列を有する１つのフォワードプライマー；ならびに５’末端に選択された抗原配列の逆相補配列、および３’末端にシグナル配列断片からのユニバーサルプライマーの逆相補配列を有する１つの逆プライマー。シグナル配列断片の５’末端およびＭＨＣ対立遺伝子断片の３’末端のための４つすべてのＤＮＡ断片およびプライマーとのＰＣＲ反応は、３’末端にシグナル配列および５’末端に抗原配列を有する断片、ならびに３’末端に抗原配列および３’末端にＭＨＣ対立遺伝子を有する断片の２つのＤＮＡ断片の増幅をもたらす。さらなるＰＣＲ増幅サイクルは、オーバーラップする抗原ペプチド配列をアニーリングさせ、単一の全長ＤＮＡ断片をもたらすことを可能にする。一部の実施形態では、シグナルペプチド断片は、プロモーター配列をさらに含む。一部の実施形態では、ＭＨＣ断片は、精製クラスターおよび／またはポリＡテールをさらに含む。
【0144】
宿主細胞のトランスフェクション、形質導入、および遺伝子改変
ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドは、限定されないが、トランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーション、リポフェクション、ソノポレーション、機械的破壊、またはウイルスベクターを含む、公知の適切な方法を介して宿主細胞に挿入することができる。例示的なトランスフェクション試薬は、限定されないが、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、またはＦｕｇｅｎｅを含む。いくつかの例において、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅは、哺乳動物細胞にｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドをトランスフェクトするために使用される。
ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドは、限定されないが、トランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーション、リポフェクション、ソノポレーション、機械的破壊、またはウイルスベクターを含む、公知の適切な方法を介して宿主細胞に挿入することができる。例示的なトランスフェクション試薬は、限定されないが、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、またはＦｕｇｅｎｅを含む。いくつかの例において、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅは、哺乳動物細胞にｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドをトランスフェクトするために使用される。
【0145】
ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドは、宿主細胞において一過性または安定して発現され得る。一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドは、宿主ゲノムに組み込まれる。他の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドは染色体外に残る。当該技術分野において公知である任意の適切な遺伝子編集技術を採用して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥＮヌクレアーゼを含むｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドを用いて宿主細胞を修飾することもできる。
【0146】
発現
ｃｏｍＰＡＣＴポリタンパク質を発現させるために、多数の戦略を用いることができる。例えば、ｃｏｍＰＡＣＴは、制限酵素およびリガーゼの使用による（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）を参照されたい）などの公知の方法によって、適切なベクターに組み込むことができる。ベクターは、クローニングプロトコールに関連する因子に基づいて選択することができる。例えば、ベクターは、採用される宿主に対して適合性であり、適切なレプリコンを有することができる。適切な宿主細胞は、真核細胞および原核細胞を含み、容易に形質転換し、培養培地中で迅速な増殖を示す細胞であり得る。宿主細胞の例としては、大腸菌および枯草菌などの原核生物、ならびに動物細胞および酵母などの真核生物、例えば、哺乳動物細胞およびヒト細胞が含まれる。ｃｏｍＰＡＣＴを発現するための宿主として用いることができる哺乳動物細胞の非限定的な例としては、Ｊ５５８、ＮＳＯ、ＳＰ２－Ｏ、２９３Ｔ、Ｅｘｐｉ２９３、およびＣＨＯが挙げられる。可能な宿主の他の例には、Ｓｆ９またはＳｆ１２などの昆虫細胞が含まれ、これらは、従来の培養条件を用いて増殖することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）を参照されたい。様々な実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴポリペプチドを発現する細胞は、公知の方法を用いて同定することができる。例えば、ｃｏｍＰＡＣＴポリペプチドの発現は、ｃｏｍＰＡＣＴのＭＨＣ重鎖部分に対する抗体プローブ、またはＨｉｓ６などの親和性タグに対する抗体、またはｃｏｍＰＡＣＴがビオチン化されている場合はストレプトアビジン試薬を用いたＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットによって決定することができる。
ｃｏｍＰＡＣＴポリタンパク質を発現させるために、多数の戦略を用いることができる。例えば、ｃｏｍＰＡＣＴは、制限酵素およびリガーゼの使用による（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）を参照されたい）などの公知の方法によって、適切なベクターに組み込むことができる。ベクターは、クローニングプロトコールに関連する因子に基づいて選択することができる。例えば、ベクターは、採用される宿主に対して適合性であり、適切なレプリコンを有することができる。適切な宿主細胞は、真核細胞および原核細胞を含み、容易に形質転換し、培養培地中で迅速な増殖を示す細胞であり得る。宿主細胞の例としては、大腸菌および枯草菌などの原核生物、ならびに動物細胞および酵母などの真核生物、例えば、哺乳動物細胞およびヒト細胞が含まれる。ｃｏｍＰＡＣＴを発現するための宿主として用いることができる哺乳動物細胞の非限定的な例としては、Ｊ５５８、ＮＳＯ、ＳＰ２－Ｏ、２９３Ｔ、Ｅｘｐｉ２９３、およびＣＨＯが挙げられる。可能な宿主の他の例には、Ｓｆ９またはＳｆ１２などの昆虫細胞が含まれ、これらは、従来の培養条件を用いて増殖することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）を参照されたい。様々な実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴポリペプチドを発現する細胞は、公知の方法を用いて同定することができる。例えば、ｃｏｍＰＡＣＴポリペプチドの発現は、ｃｏｍＰＡＣＴのＭＨＣ重鎖部分に対する抗体プローブ、またはＨｉｓ６などの親和性タグに対する抗体、またはｃｏｍＰＡＣＴがビオチン化されている場合はストレプトアビジン試薬を用いたＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットによって決定することができる。
【0147】
一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴは哺乳動物細胞において発現される。大腸菌細胞ではなく、哺乳動物細胞においてタンパク質を発現することの利点は多種多様である。大腸菌細胞で発現されるタンパク質は、リポ多糖（ＬＰＳ）から注意深く精製される必要がある。哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現は、精製されたタンパク質のＬＰＳ汚染をもたらさない。さらに、哺乳動物細胞は、ジスルフィド結合の適切な形成を含め、適切なフォールドに必要とされる正しい翻訳後修飾を有するタンパク質を生成するため、哺乳動物細胞は、哺乳動物タンパク質を適切にフォールドする可能性が高い。さらに、哺乳動物細胞は、小胞体またはゴルジ体におけるタンパク質のフォールドを補助するために、正しいシャペロンタンパク質を提供する。これは、大腸菌細胞において発現されるタンパク質と比較して、均一に十分にフォールドされたタンパク質の精製の増加をもたらす。
【0148】
ｃｏｍＰＡＣＴは、実質的にＬＰＳを含まないことができる。ｃｏｍＰＡＣＴは、ＬＰＳを含まないことができ、例えば、ｃｏｍＰＡＣＴは、当該技術分野において公知であるＬＰＳ検出方法を用いて測定した場合、検出可能なＬＰＳを有していないことができる。ｃｏｍＰＡＣＴはグリコシル化され得る。ｃｏｍＰＡＣＴは、真核細胞または哺乳動物細胞における発現を介して、例えば、グリコシル化などの１つ以上の翻訳後修飾を介して修飾することができる。ｃｏｍＰＡＣＴは、１つ以上の翻訳後修飾を含むことができる。ｃｏｍＰＡＣＴは、（１）ＬＰＳを実質的に含まないかまたはＬＰＳを含まない；および（２）グリコシル化され得る。
【0149】
例示的なＣｏｍＰＡＣＴワークフロープロセス
図２４は、ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質のアセンブリおよび発現の例示的な概略図を示す。所望のネオ抗原ペプチド配列をコードするセンスおよびアンチセンスオリゴを合成し、アニーリングして、５’および３’末端に突出部を有する二本鎖オリゴを形成し、次に、β２Ｍ遺伝子およびＭＨＣ対立遺伝子を含むプラスミドにライゲーションすることができる。完全なｃｏｍＰＡＣＴオリゴを二本鎖アンプリコンに増幅し、タンパク質発現および任意のビオチン化のために細胞にトランスフェクトすることができる。ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを介して評価することができる。次に、ＣｏｍＰＡＣＴを大腸菌におけるプラスミド生成のスケールアップのために選択することができる。タンパク質生成細胞に選択されたプラスミドをトランスフェクトし、ｃｏｍＰＡＣＴｓを機能的アッセイに使用するために生成細胞から精製する。
図２４は、ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質のアセンブリおよび発現の例示的な概略図を示す。所望のネオ抗原ペプチド配列をコードするセンスおよびアンチセンスオリゴを合成し、アニーリングして、５’および３’末端に突出部を有する二本鎖オリゴを形成し、次に、β２Ｍ遺伝子およびＭＨＣ対立遺伝子を含むプラスミドにライゲーションすることができる。完全なｃｏｍＰＡＣＴオリゴを二本鎖アンプリコンに増幅し、タンパク質発現および任意のビオチン化のために細胞にトランスフェクトすることができる。ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを介して評価することができる。次に、ＣｏｍＰＡＣＴを大腸菌におけるプラスミド生成のスケールアップのために選択することができる。タンパク質生成細胞に選択されたプラスミドをトランスフェクトし、ｃｏｍＰＡＣＴｓを機能的アッセイに使用するために生成細胞から精製する。
【0150】
精製（クロマトグラフィー）
発現されたｃｏｍＰＡＣＴポリペプチドは、公知の方法によって単離および精製することができる。例えば、Ｈｉｓ６親和性タグを含むｃｏｍＰＡＣＴは、一般的に公知であり、開示されている手順によって、Ｎｉ－ＮＴＡカラム上のアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。さらに、ヒトＨＬＡ配列を含有するｃｏｍＰＡＣＴは、一般的に公知であり、開示されている手順によって、モノクローナル抗体－セファロースカラム上のアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
発現されたｃｏｍＰＡＣＴポリペプチドは、公知の方法によって単離および精製することができる。例えば、Ｈｉｓ６親和性タグを含むｃｏｍＰＡＣＴは、一般的に公知であり、開示されている手順によって、Ｎｉ－ＮＴＡカラム上のアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。さらに、ヒトＨＬＡ配列を含有するｃｏｍＰＡＣＴは、一般的に公知であり、開示されている手順によって、モノクローナル抗体－セファロースカラム上のアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
【0151】
Ｔ細胞の単離
別の態様では、本明細書では、抗原特異的Ｔ細胞を単離する方法が提供され、本方法は、（ａ）アミノ末端からカルボキシル末端の方向に、（ｉ）第１のユニバーサル標的ペプチド、（ｉｉ）抗原ペプチド、（ｉｉｉ）第１のユニバーサル標的ペプチドとは異なる第２のユニバーサル標的ペプチド、（ｉｖ）β２Ｍペプチド、および（ｖ）ＭＨＣペプチドを含むポリペプチドであって、ポリペプチドが１つの粒子に連結されているポリペプチドを提供する工程；（ｂ）１つ以上のＴ細胞を含むことが分かっているかまたは疑われる試料を提供する工程；（ｃ）ポリペプチドを試料と接触させる工程であって、単一のＴ細胞が粒子に結合したポリペプチドに結合するのに十分な条件を提供することを含む工程；ならびに（ｄ）粒子と結合した単一のＴ細胞を単離する工程を含む。
別の態様では、本明細書では、抗原特異的Ｔ細胞を単離する方法が提供され、本方法は、（ａ）アミノ末端からカルボキシル末端の方向に、（ｉ）第１のユニバーサル標的ペプチド、（ｉｉ）抗原ペプチド、（ｉｉｉ）第１のユニバーサル標的ペプチドとは異なる第２のユニバーサル標的ペプチド、（ｉｖ）β２Ｍペプチド、および（ｖ）ＭＨＣペプチドを含むポリペプチドであって、ポリペプチドが１つの粒子に連結されているポリペプチドを提供する工程；（ｂ）１つ以上のＴ細胞を含むことが分かっているかまたは疑われる試料を提供する工程；（ｃ）ポリペプチドを試料と接触させる工程であって、単一のＴ細胞が粒子に結合したポリペプチドに結合するのに十分な条件を提供することを含む工程；ならびに（ｄ）粒子と結合した単一のＴ細胞を単離する工程を含む。
【0152】
本明細書に記載されるｃｏｍＰＡＣＴを用いた患者由来および抗原特異的Ｔ細胞の単離および同定は、患者由来のＴ細胞とのｃｏｍＰＡＣＴタンパク質をインキュベーションすることを含むことができる。一部の実施形態では、少なくとも２つのｃｏｍＰＡＣＴを含むライブラリーを患者由来のＴ細胞とともにインキュベートすることができる。Ｔ細胞は、血液、リンパ節、または腫瘍などの組織から出発する標準的な方法を用いて調製することができる。
【0153】
患者由来のＴ細胞は、患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）から単離することができる。例えば、ＣＤ４＋とＣＤ８＋ Ｔ細胞の両方は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて選別されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋単一陽性細胞の生集団を用いて、抗ＣＤ４および抗ＣＤ８蛍光性抗体によりＰＢＭＣまたはＴＩＬＳから標識および選別されて、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞のみを単離することができる。一部の実施形態では、ＣＤ４とＣＤ８の両方に対して陽性であるＴ細胞は、抗ＣＤ３蛍光性抗体、次にＦＡＣＳを用いて単離することができる。当業者は、使用されるｃｏｍＰＡＣＴタンパク質のタイプまたは複数のタイプについて単離するためにＴ細胞のタイプを決定することができる。
【0154】
ｃｏｍＰＡＣＴまたはｃｏｍＰＡＣＴライブラリーをＴ細胞懸濁液とともにインキュベートすることにより、粒子に結合した抗原を種々のＴ細胞受容体に完全におよび徹底的に曝露することができる。この方法は、細胞の揺動または回転を含み得る。一部の実施形態では、ｃｏｍＰＡＣＴは粒子と結合する。
【0155】
ｃｏｍＰＡＣＴまたはｃｏｍＰＡＣＴライブラリーおよびＴ細胞をインキュベートした後、結合したｃｏｍＰＡＣＴ－Ｔ細胞複合体を選択的に分別または選択的に回収する。Ｔ細胞は、同一のｃｏｍＰＡＣＴライブラリーエレメントの多数の同一コピーに結合する可能性が高く、これらの相互作用に基づいて分別することができる。例えば、ｃｏｍＰＡＣＴがフルオロフォアを含むか、またはフルオロフォアを有する粒子に結合している場合、単一細胞選別を含む蛍光性関連細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて、Ｔ細胞を選択的に単離することができる。ｃｏｍＰＡＣＴを磁性粒子に結合させた場合、懸濁液に磁石を適用することにより、抗原とペアリングしたＴ細胞と複合化された粒子を分別し、対を形成していないＴ細胞を除去することができる。あるいは、粒子がポリスチレン粒子である場合、ペアリングしていないＴ細胞は、重力（例えば、遠心分離）によって分別され得る。ペアリングしていないＴ細胞を除去した後、一部の実施形態では、分別された結合粒子を少なくとも１回洗浄して、非特異的に結合したＴ細胞を除去する。
【0156】
ＣｏｍＰＡＣＴに結合したＴ細胞はまた、ＦＡＣＳによってマルチウェルプレートなどの個々の回収容器に分別することができる。個々の回収容器は、単一細胞反応器であり得る。例えば、下流の処理および分析に使用される成分を各単一細胞反応器に添加することができる。ｃｏｍＰＡＣＴに結合したＴ細胞は、ＦＡＣＳによってバルク回収容器に分別することができる（例えば、単離されたすべてのＴ細胞は同じ容器に回収される）。
【0157】
ＣｏｍＰＡＣＴに結合したＴ細胞はまた、微小流体デバイス（すなわち、「液滴発生器」）を生成する液滴を用いて、液滴中で個別に単離することができる。単一細胞をカプセル化するために使用される液滴発生デバイスは、当業者に公知であり、例えば、米国出願公開第２００６／００７９５８３号、米国出願公開第２００６／００７９５８４号、米国出願公開第２０１０／００２１９８４号、米国出願公開第２０１５／０３７６６０９号、米国出願公開第２００９／０２３５９９０号、および米国出願公開第２００４／０１８０３４６号に記載される。
【0158】
ｃｏｍＰＡＣＴに結合したＴ細胞を単一細胞反応器に単離した後（例えば、個々のウェルまたは液滴中で単離した）、ｃｏｍＰＡＣＴに結合したＴ細胞の核酸をさらに下流分析のために処理することができる。具体的には、発現されたＴＣＲαおよびＴＣＲβ ｍＲＮＡ転写物は、最初に逆転写によりｃＤＮＡに変換することができ、ｃＤＮＡは、限定されないが、合成技術による配列決定（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を含む、当業者に公知である次世代シークエンシング（ＮＧＳ）法のために増幅される。
【実施例】
【0159】
実施例１：制限酵素消化クローニングによるｃｏｍＰＡＣＴミニ遺伝子の設計およびクローニング
制限酵素消化のためのｃｏｍＰＡＣＴミニ遺伝子の構造：
ｃｏｍＰＡＣＴミニ遺伝子の基本的な例示的な成分は、タンパク質の分泌を指向するシグナル配列、制限酵素認識部位またはプライマー結合部位などのユニバーサル標的配列、抗原ペプチド（またはネオ抗原、ＮｅｏＥ）、第２のユニバーサル標的部位、不変β２Ｍ、ＭＨＣ対立遺伝子の細胞外ドメイン、ならびに酵素的修飾（例えば、ビオチン化）および親和性タグを介したｃｏｍＰＡＣＴの精製を可能にする精製クラスターである。クラスターはまた、プロテアーゼ切断部位、およびペプチド成分間のリンカー配列を含み得る。ミニ遺伝子はまた、ジスルフィドトラップとして作用するシステイン突然変異を含み得る。ｃｏｍＰＡＣＴミニ遺伝子の略図を図１に示す。ＭＨＣ重鎖配列の上流および下流のさらなる制限酵素認識部位を用いて、他のＭＨＣ対立遺伝子を挿入して、異なるＭＨＣ鋳型を構築し、ＭＨＣ鋳型のライブラリーを構築することができる（図２）。シグナル配列、ユニバーサル標的配列、不変β２Ｍ、およびＭＨＣ対立遺伝子の細胞外ドメインをコードするＤＮＡ断片は、ベースＭＨＣ鋳型である。
制限酵素消化のためのｃｏｍＰＡＣＴミニ遺伝子の構造：
ｃｏｍＰＡＣＴミニ遺伝子の基本的な例示的な成分は、タンパク質の分泌を指向するシグナル配列、制限酵素認識部位またはプライマー結合部位などのユニバーサル標的配列、抗原ペプチド（またはネオ抗原、ＮｅｏＥ）、第２のユニバーサル標的部位、不変β２Ｍ、ＭＨＣ対立遺伝子の細胞外ドメイン、ならびに酵素的修飾（例えば、ビオチン化）および親和性タグを介したｃｏｍＰＡＣＴの精製を可能にする精製クラスターである。クラスターはまた、プロテアーゼ切断部位、およびペプチド成分間のリンカー配列を含み得る。ミニ遺伝子はまた、ジスルフィドトラップとして作用するシステイン突然変異を含み得る。ｃｏｍＰＡＣＴミニ遺伝子の略図を図１に示す。ＭＨＣ重鎖配列の上流および下流のさらなる制限酵素認識部位を用いて、他のＭＨＣ対立遺伝子を挿入して、異なるＭＨＣ鋳型を構築し、ＭＨＣ鋳型のライブラリーを構築することができる（図２）。シグナル配列、ユニバーサル標的配列、不変β２Ｍ、およびＭＨＣ対立遺伝子の細胞外ドメインをコードするＤＮＡ断片は、ベースＭＨＣ鋳型である。
【0160】
制限消化クローニング法のために、各々のｃｏｍＰＡＣＴ ＤＮＡコンストラクトは、３つのフレーム内に終止コドン、および切断されていないかまたは再ライゲーションされた鋳型の破壊のための固有の制限酵素認識部位を含有するダミー抗原配列挿入物を有するベースＭＨＣ鋳型であり（図３）、そのＭＨＣ対立遺伝子と複合体化された抗原ペプチドのライブラリーを迅速にアセンブルするための既製プラットフォームの一部として使用することができる。また、ＭＨＣ対立遺伝子は、抗原ペプチドのＭＨＣタンパク質とのフォールディングを改良するかまたはその結合を増加させるために、修飾または突然変異（例えば、Ｙ８４ＡまたはＹ８４Ｃ）され得る。さらに、β２Ｍタンパク質はまた突然変異（例えば、Ｓ８８Ｃ）され、チオール色素と結合させることができる。
【0161】
この実施例では、以下の構造：５’末端のＮｏｔＩ制限酵素認識部位；表３に示されるヒト成長ホルモンｈＧＨからのシグナル配列；表２に示される抗原ペプチド領域の上流の制限酵素認識部位Ｂｌｐ１および抗原ペプチド配列の下流のＢａｍＨＩ制限酵素認識部位；主にグリシンおよびセリン残基のリンカー配列（すなわち、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカー）；β２Ｍ配列；ＢｓｐＩ制限酵素認識部位を有する第２のＧｌｙ－Ｓｅｒリンカー配列；ＭＨＣ重鎖；ＢｓｔＢＩ制限酵素認識部位を有する第３のＧｌｙ－Ｓｅｒリンカー配列；ならびにＡｖｉＴａｇ配列、ＴＥＶ切断部位、および連接されたヒスチジンタグを有する精製クラスターを有するｃｏｍＰＡＣＴミニ遺伝子が示される。
【0162】
ｃｏｍＰＡＣＴミニ遺伝子の制限消化クローニングおよびアセンブリ
制限消化を介してネオ抗原を挿入する３つの異なる方法を本明細書に記載する。第１では、図４の略図として示されるように、抗原ペプチド（ＮｅｏＥ）をコードするプライマーは、５’末端の第１の制限酵素認識部位（この実施例ではＢｌｐＩ）および３’末端の第２の制限酵素認識部位（この実施例ではＢａｍＨＩ）に及ぶ。このプライマーは、第２の制限酵素認識部位をコードするユニバーサルリバースプライマーを増幅し、約７０ｂｐのプライマーダイマーを生させる。
制限消化を介してネオ抗原を挿入する３つの異なる方法を本明細書に記載する。第１では、図４の略図として示されるように、抗原ペプチド（ＮｅｏＥ）をコードするプライマーは、５’末端の第１の制限酵素認識部位（この実施例ではＢｌｐＩ）および３’末端の第２の制限酵素認識部位（この実施例ではＢａｍＨＩ）に及ぶ。このプライマーは、第２の制限酵素認識部位をコードするユニバーサルリバースプライマーを増幅し、約７０ｂｐのプライマーダイマーを生させる。
【0163】
第２の方法では、抗原ペプチドをコードするプライマーは、第２の制限酵素認識部位を５’末端として広げ、これは抗原の逆相補配列である。このプライマーは、シグナル配列をコードする鋳型ＤＮＡから逆方向にプライムする。最初の制限酵素認識部位配列に広げるフォワードプライマーとペアリングして、この反応により７０ ｂｐの産物、または抗原部位のより上流の制限酵素認識部位に広げるフォワードプライマーを用いる場合は約１４０ｂｐの産物が生じる。
【0164】
第１および第２の方法の両方において、挿入物を市販のカラムで洗浄し、適切な制限酵素で消化し、市販のカラムで再度洗浄し、次に、ベクター中で予め消化されたＭＨＣ鋳型でライゲーションする。ライゲーション反応は大腸菌に形質転換され、形質転換された大腸菌から調製されたプラスミドは、哺乳動物生成細胞トランスフェクション反応に使用される。
【0165】
実施例２：プライマーアニーリングを介したｃｏｍＰＡＣＴミニ遺伝子の設計およびクローニング
ＭＨＣ鋳型ベクターライゲーションに関する第３の変形において、ＰＣＲおよび制限消化は、２つの逆相補的ネオ抗原をコードするプライマーをアニーリングすることによってバイパスされた。これらのプライマーは、制限消化からの突出部をシミュレートする相補配列で開始および終結する５’および３’末端を有するように設計された（図５）。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰとインキュベートして５’末端をリン酸化した（図２２Ａ）。これらのプライマーが互いにアニールした場合、二本鎖オリゴヌクレオチド配列が形成され、それは制限酵素で消化されたかのように突出ヌクレオチドを有する。リン酸化されたネオ抗原挿入物を、ベクター中の事前に切断されたＭＨＣ鋳型中にライゲーションした。ｃｏｍＰＡＣＴミニ遺伝子は、実施例１に記載されたものと同じ構造を有した。次に、ライゲーション生成物を、挟まれたユニバーサルプライマーを用いて線形ｃｏｍＰＡＣＴアンプリコンのＰＣＲ増幅に使用して、完全なｃｏｍＰＡＣＴ遺伝子を増幅し、配列を決定した。この方法を用いて独自のネオ抗原配列を有する８２４個のｃｏｍＰＡＣＴを作製し、生成されたｃｏｍＰＡＣＴの９９％より多くが正しいネオ抗原配列を有していた（図２２Ｂ）。
ＭＨＣ鋳型ベクターライゲーションに関する第３の変形において、ＰＣＲおよび制限消化は、２つの逆相補的ネオ抗原をコードするプライマーをアニーリングすることによってバイパスされた。これらのプライマーは、制限消化からの突出部をシミュレートする相補配列で開始および終結する５’および３’末端を有するように設計された（図５）。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰとインキュベートして５’末端をリン酸化した（図２２Ａ）。これらのプライマーが互いにアニールした場合、二本鎖オリゴヌクレオチド配列が形成され、それは制限酵素で消化されたかのように突出ヌクレオチドを有する。リン酸化されたネオ抗原挿入物を、ベクター中の事前に切断されたＭＨＣ鋳型中にライゲーションした。ｃｏｍＰＡＣＴミニ遺伝子は、実施例１に記載されたものと同じ構造を有した。次に、ライゲーション生成物を、挟まれたユニバーサルプライマーを用いて線形ｃｏｍＰＡＣＴアンプリコンのＰＣＲ増幅に使用して、完全なｃｏｍＰＡＣＴ遺伝子を増幅し、配列を決定した。この方法を用いて独自のネオ抗原配列を有する８２４個のｃｏｍＰＡＣＴを作製し、生成されたｃｏｍＰＡＣＴの９９％より多くが正しいネオ抗原配列を有していた（図２２Ｂ）。
【0166】
次に、大腸菌をライゲーション生成物プラスミドで形質転換し、アンピシリンを含有する選択寒天プレート上に播種した。個々のコロニーを抽出し、プラスミド精製のために一晩増殖させ、完全な遺伝子検証のために配列決定した。塩基配列の確認後、プラスミドロットを保管し、大量に増殖させた。
【0167】
あるいは、事前に切断されたＭＨＣ鋳型ベクターがその突出末端に５’リン酸基を保持している場合、Ｔ４キナーゼは使用されない。次に、アニーリングした抗原挿入物を、切断されたＭＨＣベクターとライゲーションし、ライゲーション生成物をプラスミド生成のために大腸菌に形質転換させることができる。
【0168】
実施例３：ＰＣＲアセンブリを介したｃｏｍＰＡＣＴミニ遺伝子の設計およびクローニング
ＰＣＲアセンブリのためのｃｏｍＰＡＣＴミニ遺伝子の構造：
ネオ抗原を挿入する第４の方法もまた使用され得る。この方法では、上流プロモーターおよび下流のポリアデニル化シグナルに挟まれたＭＨＣ鋳型に、ポリメラーゼ連鎖反応を介してネオ抗原を挿入し、２．５ｋｂのミニ遺伝子を形成する。ＰＣＲアセンブリ反応の略図を図６に示す。
ＰＣＲアセンブリのためのｃｏｍＰＡＣＴミニ遺伝子の構造：
ネオ抗原を挿入する第４の方法もまた使用され得る。この方法では、上流プロモーターおよび下流のポリアデニル化シグナルに挟まれたＭＨＣ鋳型に、ポリメラーゼ連鎖反応を介してネオ抗原を挿入し、２．５ｋｂのミニ遺伝子を形成する。ＰＣＲアセンブリ反応の略図を図６に示す。
【0169】
この実施例では、以下の構造：５’末端のプロモーター；第１のユニバーサル標的配列を有するシグナル配列；抗原ペプチド；主にグリシンおよびセリン残基を有するリンカー配列（すなわち、ＧｌｙＳｅｒリンカー）を有する第２のユニバーサル標的配列；β２Ｍ配列；第２のＧｌｙ－Ｓｅｒリンカー配列；ＭＨＣ重鎖対立遺伝子；第３のＧｌｙ－Ｓｅｒリンカー配列；精製クラスター；およびポリＡ配列を有するｃｏｍＰＡＣＴミニ遺伝子が示される。この方法では、ユニバーサル標的配列は同じでない。
【0170】
ｃｏｍＰＡＣＴミニ遺伝子のＰＣＲアセンブリ：
この方法では、選択されたネオ抗原配列を有する２つのプライマー（＜６０ｎｔ）を合成する。第１のプライマーは、５’末端にネオ抗原配列を有し、続いて３’末端に第２のユニバーサル標的配列のストレッチを有する。第２のプライマーは、５’末端にネオ抗原配列の逆相補配列を有し、３’末端に第１のユニバーサル配列の逆相補配列を有する。これらのプライマーは、プロモーター領域、シグナル配列および第１のユニバーサル標的配列をコードするＤＮＡ断片、ならびに第２のユニバーサル標的配列、β２Ｍ配列、ＭＨＣ対立遺伝子、精製クラスターおよびポリＡ配列をコードする別のＤＮＡ断片と混合される。各々の抗原ペプチドプライマーはその相補配列にアニーリングし、ＰＣＲ反応を行い、プロモーター断片またはＭＨＣ対立遺伝子断片のいずれかにネオ抗原配列を増幅する。ここで新たに合成されたこれら２つの断片は、各々、ネオ抗原配列を有する。さらなるＰＣＲ反応は、プロモーター配列の５’末端およびポリＡ配列の３’末端のプライマーとともに、ネオ抗原配列を互いにアニールさせ、完全長の線形ｃｏｍＰＡＣＴアンプリコンのアセンブリをプライムすることを可能にする。
この方法では、選択されたネオ抗原配列を有する２つのプライマー（＜６０ｎｔ）を合成する。第１のプライマーは、５’末端にネオ抗原配列を有し、続いて３’末端に第２のユニバーサル標的配列のストレッチを有する。第２のプライマーは、５’末端にネオ抗原配列の逆相補配列を有し、３’末端に第１のユニバーサル配列の逆相補配列を有する。これらのプライマーは、プロモーター領域、シグナル配列および第１のユニバーサル標的配列をコードするＤＮＡ断片、ならびに第２のユニバーサル標的配列、β２Ｍ配列、ＭＨＣ対立遺伝子、精製クラスターおよびポリＡ配列をコードする別のＤＮＡ断片と混合される。各々の抗原ペプチドプライマーはその相補配列にアニーリングし、ＰＣＲ反応を行い、プロモーター断片またはＭＨＣ対立遺伝子断片のいずれかにネオ抗原配列を増幅する。ここで新たに合成されたこれら２つの断片は、各々、ネオ抗原配列を有する。さらなるＰＣＲ反応は、プロモーター配列の５’末端およびポリＡ配列の３’末端のプライマーとともに、ネオ抗原配列を互いにアニールさせ、完全長の線形ｃｏｍＰＡＣＴアンプリコンのアセンブリをプライムすることを可能にする。
【0171】
次に、完全にアセンブルされた線形ｃｏｍＰＡＣＴポリヌクレオチドを、哺乳動物生成細胞への直接トランスフェクションのためにクリーンアップし、大腸菌およびプラスミド生成を完全に用いて工程を迂回する。
【0172】
実施例４：プラスミドからのｃｏｍＰＡＣＴタンパク質の発現および精製
タンパク質の発現
ネオ抗原１２（ｎｅｏ１２）をＨＬＡ－Ａ２鋳型配列にライゲーションし、ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素認識部位の制限消化および前述されるライゲーションを介して発現プラスミド（ｐＰＡＣＴ００１０）に挿入した。
タンパク質の発現
ネオ抗原１２（ｎｅｏ１２）をＨＬＡ－Ａ２鋳型配列にライゲーションし、ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素認識部位の制限消化および前述されるライゲーションを介して発現プラスミド（ｐＰＡＣＴ００１０）に挿入した。
【0173】
３０ｍＬ振盪フラスコ体積中のＥｘｐｉ２９３哺乳動物生成細胞に、－１日目にＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクション試薬とともにインキュベートしたｐＰＡＣＴ００１０をトランスフェクトした。Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクションキットに含まれるエンハンサーを０日目に添加した。１日目～７日目に細胞上清から試料を回収し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを介して分泌タンパク質について評価し、Ｓａｆｅｓｔａｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて総タンパク質染色を行った。分泌されたｃｏｍＰＡＣＴタンパク質のレベルは３日目まで増加し、その時点でタンパク質分泌は横ばいになった（図７）。分泌されたｃｏｍＰＡＣＴタンパク質は、その見かけの分子量（＝５３ｋＤａ）により最初に同定され、Ｈｉｓ６親和性タグを検出するためにＮＴＡ－ＨＲＰを用いたウエスタンブロットにより確認された。
【0174】
タンパク質の精製
７日目に回収したＮｅｏ１２ ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質を、Ｈｉｓ６親和性タグの結合を介してＮｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳａｆｅｓｔａｉｎを介して、試料を総タンパク質についてアッセイした。アフィニティーカラムのフロースルー（ＦＴ）画分におけるｃｏｍＰＡＣＴタンパク質の欠如は、Ｈｉｓ６タグが発現および精製中に切断されないことを確認した（図８）。精製収量は４００ｍｇ／Ｌ培養容量を超えた。
７日目に回収したＮｅｏ１２ ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質を、Ｈｉｓ６親和性タグの結合を介してＮｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳａｆｅｓｔａｉｎを介して、試料を総タンパク質についてアッセイした。アフィニティーカラムのフロースルー（ＦＴ）画分におけるｃｏｍＰＡＣＴタンパク質の欠如は、Ｈｉｓ６タグが発現および精製中に切断されないことを確認した（図８）。精製収量は４００ｍｇ／Ｌ培養容量を超えた。
【0175】
Ｎｅｏ１２ ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質をビオチン化し（下記の実施例６において検討される）、さらにサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。単一の主要ピークが観察され、このタンパク質は適切にフォールディングされ、単量体であり、凝集はほとんどないことが示唆された（図９）。２番目のピークは、ＢｉｒＡ触媒ビオチン化反応のために添加されたＡＴＰである。
【0176】
生成量の最適化および並行生成
ｃｏｍＰＡＣＴｓの生成を、振盪フラスコ中の培養容量３０ｍＬから９６ディープウェル振盪ブロック中の０．７ｍＬに縮小した。Ｅｘｐｉ２９３哺乳動物生成細胞にｐＰＡＣＴ００１０プラスミドを含有するプラスミドＤＮＡをトランスフェクトし、分泌されたＮｅｏ１２ ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質を前述のように精製した。精製Ｎｅｏ１２ ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質４３７ｍｇ／Ｌを、３０ｍＬ精製実験からの４００ｍｇ／Ｌ超の前述の収率と比較して、０．７ｍＬウェル体積から回収した（図１０）。０．７ｍＬの実験からのタンパク質収率は、３００μｇ超のタンパク質に対応し、または典型的なフローサイトメトリー実験に一般的に必要とされるものより約１０００倍高い。
ｃｏｍＰＡＣＴｓの生成を、振盪フラスコ中の培養容量３０ｍＬから９６ディープウェル振盪ブロック中の０．７ｍＬに縮小した。Ｅｘｐｉ２９３哺乳動物生成細胞にｐＰＡＣＴ００１０プラスミドを含有するプラスミドＤＮＡをトランスフェクトし、分泌されたＮｅｏ１２ ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質を前述のように精製した。精製Ｎｅｏ１２ ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質４３７ｍｇ／Ｌを、３０ｍＬ精製実験からの４００ｍｇ／Ｌ超の前述の収率と比較して、０．７ｍＬウェル体積から回収した（図１０）。０．７ｍＬの実験からのタンパク質収率は、３００μｇ超のタンパク質に対応し、または典型的なフローサイトメトリー実験に一般的に必要とされるものより約１０００倍高い。
【0177】
次に、複数のｃｏｍＰＡＣＴコンストラクトの並行発現を評価した。異なるネオ抗原（ネオ抗原１０、１５、６４、６５、６６、６７、８０、８３）を有する８種類の異なるｃｏｍＰＡＣＴコンストラクトを、中間処理アッセイとして３０ｍＬ振盪フラスコに発現させた（図１１）。各々のｃｏｍＰＡＣＴコンストラクトを前述のように細胞にトランスフェクトし、ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質を発現させ、細胞上清に分泌させた。発現したタンパク質を、前述のように精製し、濃縮し、標準化した。クルード上清および濃縮タンパク質の試料を、前述のように、総タンパク質についてアッセイした。ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質をサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した（図１２）。２～２０ｍｇのタンパク質を含む単一ピークが各タンパク質に対して見られ、またｃｏｍＰＡＣＴタンパク質が適切にフォールディングされ、単量体であることを示唆した。
【0178】
実施例５：線形アンプリコンからのｃｏｍＰＡＣＴタンパク質の発現および精製
前の実施例では、ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質は、哺乳動物生成細胞にトランスフェクトされたプラスミドから発現された。別の手法として、プロモーター配列およびポリＡ配列に隣接するｎｅｏ１２ ｃｏｍＰＡＣＴミニ遺伝子（ＨＬＡ－Ａ２鋳型配列を有するミニ遺伝子にアセンブルされたネオ抗原１２）の線形アンプリコンを、９６ディープウェルプレート中の０．７ｍＬの生成細胞にトランスフェクトした。対照として、ｐＰＡＣＴ００１０プラスミドもまた別々の生成細胞にトランスフェクトした。両試料からのタンパク質を発現させ、精製し、前述のように総タンパク質についてアッセイした。同様のレベルの発現タンパク質が線形アンプリコンとプラスミドの両方によって生成され（図１３Ａ）、ｃｏｍＰＡＣＴミニ遺伝子によってコードされるタンパク質はプラスミド中間体を使用することなく生成できることが示唆された。生成細胞の直接トランスフェクションのために、異なるネオエピトープ配列を有する複数の異なるｃｏｍＰＡＣＴミニ遺伝子が作製された（図１３Ｂ）。
前の実施例では、ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質は、哺乳動物生成細胞にトランスフェクトされたプラスミドから発現された。別の手法として、プロモーター配列およびポリＡ配列に隣接するｎｅｏ１２ ｃｏｍＰＡＣＴミニ遺伝子（ＨＬＡ－Ａ２鋳型配列を有するミニ遺伝子にアセンブルされたネオ抗原１２）の線形アンプリコンを、９６ディープウェルプレート中の０．７ｍＬの生成細胞にトランスフェクトした。対照として、ｐＰＡＣＴ００１０プラスミドもまた別々の生成細胞にトランスフェクトした。両試料からのタンパク質を発現させ、精製し、前述のように総タンパク質についてアッセイした。同様のレベルの発現タンパク質が線形アンプリコンとプラスミドの両方によって生成され（図１３Ａ）、ｃｏｍＰＡＣＴミニ遺伝子によってコードされるタンパク質はプラスミド中間体を使用することなく生成できることが示唆された。生成細胞の直接トランスフェクションのために、異なるネオエピトープ配列を有する複数の異なるｃｏｍＰＡＣＴミニ遺伝子が作製された（図１３Ｂ）。
【0179】
異なるＨＬＡ対立遺伝子を有する追加のｃｏｍＰＡＣＴを、実施例２に記載されるアニーリングおよびリン酸化ワークフローを用いて作製した。線形アンプリコンを、挟まれたＰＣＲおよびユニバーサルプライマーを用いて発現ベクターから誘導し、ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質生成のためにＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。図２３は、アニーリングクローニングワークフローを用いて作製された代表的なｃｏｍＰＡＣＴタンパク質のタンパク質ゲルを示す。ＣｏｍＰＡＣＴタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で泳動させ、Ｓａｆｅｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で染色した。
【0180】
実施例６：ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質のビオチン化
単離したＢｉｒＡ酵素によるｃｏｍＰＡＣＴｓのｉｎ ｖｉｔｒｏでのビオチン化
ｃｏｍＰＡＣＴ精製クラスターは、ビオチン化のためのＢｉｒＡ認識配列（Ａｖｉｔａｇ）を含む。精製されたｃｏｍＰＡＣＴタンパク質はビオチン化されていない（ＢｉｒＡ処理なし）か、または市販のＢｉｒＡタンパク質で製造業者の指示に従ってビオチン化された（ＢｉｒＡ処理済み）。一晩のＢｉｒＡ酵素処理後、試料を２種類の磁性ストレプトアビジンビーズ（Ｃ１およびＴ１）に結合させ、インキュベートして、ビオチン化タンパク質をストレプトアビジンビーズに結合させた。上清（ＳＮ）およびビーズ（「ペレット」、Ｐ）をＳＤＳ－ＰＡＧＥを介して分別した。試料を、ＮＴＡ－ＨＲＰを用いたウエスタンブロットを介して、セーフステインを用いて総タンパク質およびｃｏｍＰＡＣＴタンパク質の存在についてアッセイした（図１４）。未処理試料では、ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質が主にＳＮ画分に認められ、ビオチン化されていないことが確認された。ビオチン化試料では、ビオチン化タンパク質とＣ１ストレプトアビジンビーズとの間の相互作用が最も完全であったが、ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質は、Ｃ１とＴ１ストレプトアビジンビーズの両方のペレット試料中に見出された。ビオチン化されたｃｏｍＰＡＣＴタンパク質は、Ｃ１ストレプトアビジンビーズ除去上清中でウエスタンブロットを介して検出されなかったことから、ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質の約１００％がビオチン化されていることが示唆された。
単離したＢｉｒＡ酵素によるｃｏｍＰＡＣＴｓのｉｎ ｖｉｔｒｏでのビオチン化
ｃｏｍＰＡＣＴ精製クラスターは、ビオチン化のためのＢｉｒＡ認識配列（Ａｖｉｔａｇ）を含む。精製されたｃｏｍＰＡＣＴタンパク質はビオチン化されていない（ＢｉｒＡ処理なし）か、または市販のＢｉｒＡタンパク質で製造業者の指示に従ってビオチン化された（ＢｉｒＡ処理済み）。一晩のＢｉｒＡ酵素処理後、試料を２種類の磁性ストレプトアビジンビーズ（Ｃ１およびＴ１）に結合させ、インキュベートして、ビオチン化タンパク質をストレプトアビジンビーズに結合させた。上清（ＳＮ）およびビーズ（「ペレット」、Ｐ）をＳＤＳ－ＰＡＧＥを介して分別した。試料を、ＮＴＡ－ＨＲＰを用いたウエスタンブロットを介して、セーフステインを用いて総タンパク質およびｃｏｍＰＡＣＴタンパク質の存在についてアッセイした（図１４）。未処理試料では、ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質が主にＳＮ画分に認められ、ビオチン化されていないことが確認された。ビオチン化試料では、ビオチン化タンパク質とＣ１ストレプトアビジンビーズとの間の相互作用が最も完全であったが、ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質は、Ｃ１とＴ１ストレプトアビジンビーズの両方のペレット試料中に見出された。ビオチン化されたｃｏｍＰＡＣＴタンパク質は、Ｃ１ストレプトアビジンビーズ除去上清中でウエスタンブロットを介して検出されなかったことから、ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質の約１００％がビオチン化されていることが示唆された。
【0181】
ＣｏｍＰＡＣＴタンパク質はまた、精製前に、清澄化された上清中でビオチン化され得る。複数のｃｏｍＰＡＣＴタンパク質を前述のように生成細胞で発現させた。細胞培養上清を回収し、遠心分離により清澄化した。清澄化された上清を、製造業者の指示に従って市販のＢｉｒＡタンパク質で処理し、次に、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを介して精製し、ビオチン化をウエスタンブロットを介して評価した（図１５）。試験したすべてのｃｏｍＰＡＣＴタンパク質をこの方法を用いてビオチン化し、清澄化された細胞上清中のｃｏｍＰＡＣＴタンパク質のビオチン化が有効であることを示した。
【0182】
ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質のハイスループットビオチン化用に十分なＢｉｒＡを生成するために、Ｈｉｓ６タグを有するＢｉｒＡタンパク質を大腸菌細胞で発現させた。このＨｉｓ６タグ化ＢｉｒＡを、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製し（図１６Ｂ）、ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質をビオチン化するために使用することができる。ＴＥＶ切断可能なＨｉｓ６タグを有する第２バージョンのＢｉｒＡ－Ｈｉｓ６もまた発現させ、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した（図１６Ｃ）。このＢｉｒＡ－ＴＥＶ－Ｈｉｓ６タンパク質は、Ｎｉ－ＮＴＡを介して精製することができ、Ｈｉｓ６タグはＴＥＶ切断を介して除去され、次にタグがないＢｉｒＡはビオチン化されたｃｏｍＰＡＣＴタンパク質に使用される。ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質のビオチン化後、タグがないＢｉｒＡタンパク質は、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。さらに、ビオチン化されたｃｏｍＰＡＣＴタンパク質生成に使用するために、ＢｉｒＡ－ＴＥＶ－Ｈｉｓ６（図１６Ａ）とともに使用するためにＴＥＶプロテアーゼを大腸菌において異種的に発現させた。
【0183】
ビオチン化後のｃｏｍＰＡＣＴタンパク質上のＨｉｓ６タグの切断もまた評価し、その結果を図１７に示した。ＣｏｍＰＡＣＴタンパク質をＢｉｒＡで処理または未処理して、前述のようにそれらをビオチン化した（図１７のレーン１および２）。ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質の３番目の試料をＢｉｒＡで処理し、次にＴＥＶで処理して、タンパク質上に存在するＨｉｓ６タグを切断した（レーン３）。試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥを介して分別し、総タンパク質をＳａｆｅｓｔａｉｎを介して評価した。３つ全ての試料は、等量のｃｏｍＰＡＣＴタンパク質を有した。ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質のビオチン化およびＨｉｓ６タグの切断を、ビオチンシグナルのためのＳＡ－ＨＲＰ試薬およびＨｉｓ６タグのためのＮＴＡ－ＨＲＰ試薬を用いてウエスタンブロットにより評価した。ビオチン化されていない試料はビオチンシグナルを示さなかったが、Ｈｉｓ６シグナルを有し、ビオチン化された試料および未脱離の試料は両方のシグナルを有した。ビオチン化およびＴＥＶ切断試料はビオチンシグナルのみを有し、Ｈｉｓ６タグがｃｏｍＰＡＣＴタンパク質から成功裏に切断されたことを示した。
【0184】
ＢｉｒＡを発現する細胞におけるｃｏｍＰＡＣＴのｉｎ ｖｉｖｏビオチン化
ｃｏｍＰＡＣＴｓをビオチン化するための第３の手法は、精製前にＥｘｐｉ２９３生成細胞においてＢｉｒＡを発現させ、ｉｎ ｖｉｖｏでｃｏｍＰＡＣＴｓをビオチン化することである。Ｅｘｐｉ２９３細胞をレンチウイルスベクターで形質導入して、細胞表面形質導入マーカーとして作用するＶ５に隣接するＢｉｒＡを共発現させた。Ｖ５＋について選別された形質導入細胞もまたＢｉｒＡを発現する（図１８）。これらの細胞は、ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質精製の前にｉｎ ｖｉｖｏでビオチン化されたｃｏｍＰＡＣＴを生成するために使用することができる。２つの細胞株を作製し、培地にＢｉｒＡを分泌するか（Ｅｘｐｉ２９３ｖ０２２３）、または細胞表面にＢｉｒＡを発現する（Ｅｘｐｉ２９３ｖ０２６３）。小胞体（ＥＲ）保持配列ＫＤＥＬに隣接するＢｉｒＡを発現する３番目の細胞株もまた作製した。
ｃｏｍＰＡＣＴｓをビオチン化するための第３の手法は、精製前にＥｘｐｉ２９３生成細胞においてＢｉｒＡを発現させ、ｉｎ ｖｉｖｏでｃｏｍＰＡＣＴｓをビオチン化することである。Ｅｘｐｉ２９３細胞をレンチウイルスベクターで形質導入して、細胞表面形質導入マーカーとして作用するＶ５に隣接するＢｉｒＡを共発現させた。Ｖ５＋について選別された形質導入細胞もまたＢｉｒＡを発現する（図１８）。これらの細胞は、ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質精製の前にｉｎ ｖｉｖｏでビオチン化されたｃｏｍＰＡＣＴを生成するために使用することができる。２つの細胞株を作製し、培地にＢｉｒＡを分泌するか（Ｅｘｐｉ２９３ｖ０２２３）、または細胞表面にＢｉｒＡを発現する（Ｅｘｐｉ２９３ｖ０２６３）。小胞体（ＥＲ）保持配列ＫＤＥＬに隣接するＢｉｒＡを発現する３番目の細胞株もまた作製した。
【0185】
ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでのビオチン化手法下でビオチン標識効率を評価するために、ストレプトアビジンプルダウンアッセイを行った。ＣｏｍＰＡＣＴタンパク質（ＥＢＶまたはＭＡＲＴ－１）は、分類された培地をＢｉｒＡ酵素および適切な反応成分（酵素的、ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で処理するか、またはＣｏｍＰＡＣＴをＢｉｒＡ（ｉｎ ｖｉｖｏ）と共発現させることによってビオチン化され、ストレプトアビジン被覆ビーズの濃度を増加させながらインキュベートした。ストレプトアビジン（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で被覆した磁気ビーズを、２０μｇのｃｏｍＰＡＣＴタンパク質試料に添加し、３０分間、室温でインキュベートした。磁気ビーズを磁化によりチューブまたはウェルの底部で分離し、上清のタンパク質含有量をＳＤＳ－ＰＡＧＥによりアッセイした。図２５は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの結果を示す。ほぼ完全なビオチン化が、精製中にＢｉｒＡ酵素を添加することによって（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）、またはＢｉｒＡ酵素とｃｏｍＰＡＣＴタンパク質を共発現することによって達成することができる（ｉｎ ｖｉｖｏ）。ストレプトアビジンビーズを欠損する試料は、上清中にかなりの量のビオチン化タンパク質を有していたが、増加量のストレプトアビジンビーズを添加すると、上清からほとんどすべてのタンパク質が除去され、ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質のビオチン化が示された。
【0186】
実施例７：ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質を用いた抗原特異的Ｔ細胞染色および親和性評価
ｃｏｍＰＡＣＴを用いた抗原特異的Ｔ細胞染色と従来のペプチド－ＭＨＣを比較するために、公表されたプロトコールに従ってｃｏｍＰＡＣＴデキストラマーを調製した（Ｂｅｔｈｕｎｅ，Ｍ．Ｔ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６２巻、１２３～１３０頁、ｄｏｉ：１０．２１４４／０００１１４５２５（２０１７））。Ｔ細胞を操作してＡ２／ｎｅｏ１２特異的ＴＣＲを発現させ、ＨＬＡ－Ａ２／ｎｅｏ１２ペプチド－ＭＨＣデキストラマーまたはＨＬＡ－Ａ２／ｎｅｏ１２ペプチドｃｏｍＰＡＣＴデキストラマーのいずれかで染色した。ｃｏｍＰＡＣＴのデキストラマーによる染色は、ペプチド－ＭＨＣのデキストラマーと少なくとも同程度の効率であった（図１９）。このデータは、ｃｏｍＰＡＣＴデキストラマーがＴＣＲ配列決定のための抗原特異的Ｔ細胞の選別に使用できることを示唆する。
ｃｏｍＰＡＣＴを用いた抗原特異的Ｔ細胞染色と従来のペプチド－ＭＨＣを比較するために、公表されたプロトコールに従ってｃｏｍＰＡＣＴデキストラマーを調製した（Ｂｅｔｈｕｎｅ，Ｍ．Ｔ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６２巻、１２３～１３０頁、ｄｏｉ：１０．２１４４／０００１１４５２５（２０１７））。Ｔ細胞を操作してＡ２／ｎｅｏ１２特異的ＴＣＲを発現させ、ＨＬＡ－Ａ２／ｎｅｏ１２ペプチド－ＭＨＣデキストラマーまたはＨＬＡ－Ａ２／ｎｅｏ１２ペプチドｃｏｍＰＡＣＴデキストラマーのいずれかで染色した。ｃｏｍＰＡＣＴのデキストラマーによる染色は、ペプチド－ＭＨＣのデキストラマーと少なくとも同程度の効率であった（図１９）。このデータは、ｃｏｍＰＡＣＴデキストラマーがＴＣＲ配列決定のための抗原特異的Ｔ細胞の選別に使用できることを示唆する。
【0187】
実施例８：機能的Ｔ細胞アッセイ
ＮＴＡｍｅｒ結合アッセイ
材料および方法
Ｔ細胞の抗原特異的捕捉を超えて、ｃｏｍＰＡＣＴのモジュラー設計および容易な生成は、機能的Ｔ細胞アッセイにおけるそれらの使用を容易にする。例えば、β２Ｍの突然変異バージョン（Ｓ８８Ｃ）の取り込みは、ｃｏｍＰＡＣＴをマレイミド－色素コンジュゲートで標識し、ＮＴＡｍｅｒとしてアセンブリさせ、ＴＣＲ－ｃｏｍＰＡＣＴ結合の速度論的パラメータを測定するために使用することができる。例えば、ＮＴＡｍｅｒを用いて、生細胞における一価ＴＣＲ－ＭＨＣ Ｉ結合事象を解決することができる。ＣＤ８の結合および免疫シナプスにおける複数のＴＣＲ－ＭＨＣ Ｉ相互作用により、Ｔ細胞と抗原提示細胞との間の長期間の接触が可能になる。蛍光性色素コンジュゲート－ＣｏｍＰＡＣＴ ＮＴＡｍｅｒを細胞とともにインキュベートして、ｃｏｍＰＡＣＴとＴＣＲとの結合を可能にする。ＮＴＡｍｅｒのＮｉ－ＰＥ粒子成分を、イミダゾールの添加によりｃｏｍＰＡＣＴから解離し、蛍光性ｃｏｍＰＡＣＴの放出を経時的に測定する。
ＮＴＡｍｅｒ結合アッセイ
材料および方法
Ｔ細胞の抗原特異的捕捉を超えて、ｃｏｍＰＡＣＴのモジュラー設計および容易な生成は、機能的Ｔ細胞アッセイにおけるそれらの使用を容易にする。例えば、β２Ｍの突然変異バージョン（Ｓ８８Ｃ）の取り込みは、ｃｏｍＰＡＣＴをマレイミド－色素コンジュゲートで標識し、ＮＴＡｍｅｒとしてアセンブリさせ、ＴＣＲ－ｃｏｍＰＡＣＴ結合の速度論的パラメータを測定するために使用することができる。例えば、ＮＴＡｍｅｒを用いて、生細胞における一価ＴＣＲ－ＭＨＣ Ｉ結合事象を解決することができる。ＣＤ８の結合および免疫シナプスにおける複数のＴＣＲ－ＭＨＣ Ｉ相互作用により、Ｔ細胞と抗原提示細胞との間の長期間の接触が可能になる。蛍光性色素コンジュゲート－ＣｏｍＰＡＣＴ ＮＴＡｍｅｒを細胞とともにインキュベートして、ｃｏｍＰＡＣＴとＴＣＲとの結合を可能にする。ＮＴＡｍｅｒのＮｉ－ＰＥ粒子成分を、イミダゾールの添加によりｃｏｍＰＡＣＴから解離し、蛍光性ｃｏｍＰＡＣＴの放出を経時的に測定する。
【0188】
色素コンジュゲーション
Ｓ８８Ｃ突然変異体ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質を構築し、約１５０ｍｇ／Ｌで発現させた。これらの突然変異体ｃｏｍＰＡＣＴｓは、突然変異していないｃｏｍＰＡＣＴと同様の純度および溶出プロファイルを示した（図２０）。Ｃｙ５などの他の色素もまたＳ８８Ｃ ｃｏｍＰＡＣＴにコンジュベートさせることができる。ｃｏｍＰＡＣＴ８８Ｃ－ＨｉｓＴａｇモノマーは、Ｔｒｉｓ（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）で還元され、マレイミド－Ｃｙ５とカップリングされて、ｃｏｍＰＡＣＴ８８ｃ－Ｃｙ５標識モノマーを生じた。図２１は、Ｃｙ５で標識されたｃｏｍＰＡＣＴのＡ２８０、Ａ２６０、およびＡ６５０の定量化を示す。ｃｏｍＰＡＣＴに対する色素の比率は６７％であった。
Ｓ８８Ｃ突然変異体ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質を構築し、約１５０ｍｇ／Ｌで発現させた。これらの突然変異体ｃｏｍＰＡＣＴｓは、突然変異していないｃｏｍＰＡＣＴと同様の純度および溶出プロファイルを示した（図２０）。Ｃｙ５などの他の色素もまたＳ８８Ｃ ｃｏｍＰＡＣＴにコンジュベートさせることができる。ｃｏｍＰＡＣＴ８８Ｃ－ＨｉｓＴａｇモノマーは、Ｔｒｉｓ（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）で還元され、マレイミド－Ｃｙ５とカップリングされて、ｃｏｍＰＡＣＴ８８ｃ－Ｃｙ５標識モノマーを生じた。図２１は、Ｃｙ５で標識されたｃｏｍＰＡＣＴのＡ２８０、Ａ２６０、およびＡ６５０の定量化を示す。ｃｏｍＰＡＣＴに対する色素の比率は６７％であった。
【0189】
ＮＴＡｍｅｒアセンブリ
ビオチン化されたｃｏｍＰＡＣＴは、ビオチン－ＮＴＡにニッケル（Ｎｉ）を付加し（ビオチン－ＮｉＮＴＡ）、次にビオチン－ＮｉＮＴＡおよびＰＥ－ストレプトアビジン（ＳＡ）を用いてｃｏｍＰＡＣＴ－Ｃｙ５をアセンブルさせることにより、ＰＥ－ビオチン－ＮＴＡビーズに結合した。ビオチン－ＮｉＮＴＡを、５ｍｇのビオチン－ＮＴＡを１ｍＬのニッケル負荷溶液（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５中の５０ｍＭのＮｉＳＯ４）と混合してＮｉ２＋ＮＴＡ－ビオチン（７ｎＭ）を得た。溶液をＨＢＳで希釈して、７０μＭのＮｉ２＋ＮＴＡ－ビオチン溶液を得た。Ｎｉ２＋ＮＴＡ－ビオチン溶液をＳＡ－ＰＥ（３００ｋＤａ）と５回添加して組み合わせ、各添加の間は５分間であった。次に、２０μＭのＣｙ５－Ｓ８８Ｃ ｃｏｍＰＡＣＴをＮＴＡｍｅｒコアに添加し、１０分間、室温で暗所にてインキュベートし、４℃で保存した。Ｎｅｏ１２とＭＡＲＴ１ ｃｏｍＰＡＣＴの両方を作製し、ＮＴＡｍｅｒｓにアセンブルした。ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質上のＨｉｓタグは、それ自身がＰＥ－ストレプトアビジンに結合するＮｉＮＴＡに結合する。各々のＮＴＡｍｅｒは、フルオロフォアを有するストレプトアビジンコアに結合したｃｏｍＰＡＣＴモノマーの複数コピーを含む。ＮＴＡｍｅｒのアセンブリは、Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２０１１年１２月２日、２８６巻（４８号）４１７２３～４１７３５頁、およびＳｃｈｍｉｄｔら、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０１３年７月３０日 ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１３．００２１８でさらに検討され、これらはいずれもそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ビオチン化されたｃｏｍＰＡＣＴは、ビオチン－ＮＴＡにニッケル（Ｎｉ）を付加し（ビオチン－ＮｉＮＴＡ）、次にビオチン－ＮｉＮＴＡおよびＰＥ－ストレプトアビジン（ＳＡ）を用いてｃｏｍＰＡＣＴ－Ｃｙ５をアセンブルさせることにより、ＰＥ－ビオチン－ＮＴＡビーズに結合した。ビオチン－ＮｉＮＴＡを、５ｍｇのビオチン－ＮＴＡを１ｍＬのニッケル負荷溶液（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５中の５０ｍＭのＮｉＳＯ４）と混合してＮｉ２＋ＮＴＡ－ビオチン（７ｎＭ）を得た。溶液をＨＢＳで希釈して、７０μＭのＮｉ２＋ＮＴＡ－ビオチン溶液を得た。Ｎｉ２＋ＮＴＡ－ビオチン溶液をＳＡ－ＰＥ（３００ｋＤａ）と５回添加して組み合わせ、各添加の間は５分間であった。次に、２０μＭのＣｙ５－Ｓ８８Ｃ ｃｏｍＰＡＣＴをＮＴＡｍｅｒコアに添加し、１０分間、室温で暗所にてインキュベートし、４℃で保存した。Ｎｅｏ１２とＭＡＲＴ１ ｃｏｍＰＡＣＴの両方を作製し、ＮＴＡｍｅｒｓにアセンブルした。ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質上のＨｉｓタグは、それ自身がＰＥ－ストレプトアビジンに結合するＮｉＮＴＡに結合する。各々のＮＴＡｍｅｒは、フルオロフォアを有するストレプトアビジンコアに結合したｃｏｍＰＡＣＴモノマーの複数コピーを含む。ＮＴＡｍｅｒのアセンブリは、Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２０１１年１２月２日、２８６巻（４８号）４１７２３～４１７３５頁、およびＳｃｈｍｉｄｔら、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０１３年７月３０日 ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１３．００２１８でさらに検討され、これらはいずれもそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0190】
ビオチン化Ｎｅｏ１２およびＭＡＲＴ１ ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質はまた、ＰＥ標識された四量体およびデキストラマーにアセンブルされた。ペプチド結合リフォールドしたＭＨＣ Ｉ分子はまた、ｎｅｏ１２抗原ペプチドとともに、対照としてＰＥ標識デキストラマーにアセンブルされた。ペプチド－ＭＨＣタンパク質を四量体およびデキストラマーにアセンブルさせる方法は、当該技術分野において一般的に公知である。
【0191】
Ｔ細胞結合
Ｎｅｏ１２またはＭＡＲＴ１ネオ抗原（ｎｅｏｇａｎｔｉｇｅｎ）に結合するＴＣＲを発現する遺伝子編集Ｔ細胞を、１～２×１０６細胞／ｍＬの密度で１×染色緩衝液（ＢＤウシ血清アルブミン染色緩衝液、ＢＤ５５４６５７）に再懸濁した。細胞を、アッセイの間、４℃に維持した。ＮＴＡｍｅｒを、１：５０～１：４００（ｖ：ｖ希釈）の種々の濃度で、染色緩衝液中のＴ細胞に添加し、１５分間、４℃で暗所にてインキュベートして、多量体化したＮＴＡｍｅｒがＴ細胞に結合できるようにした。Ｔ細胞を１×染色緩衝液で２回洗浄して、結合していないＮＴＡｍｅｒを除去し、染色緩衝液に再懸濁した。多量体化ＮＴＡｍｅｒを破壊し、Ｃｙ５シグナル減衰をモニターするために、イミダゾール破壊緩衝液（１．４５２ｇのイミダゾールおよび５０ｍＬの１×Ｈａｎｋ緩衝生理食塩水）を添加し、混合し、試料をフローサイトメーターを介して評価してＣｙ５シグナル減衰をモニターした。種々の細胞マーカーの検出のためのさらなる抗体染色を、１５分間、４℃で暗所にてＴ細胞をインキュベートし、１×染色緩衝液中で２回細胞を洗浄することにより行った。次に、ＩＣ固定緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＩＣ固定緩衝液、００－８２２２－４９）を用いてＴ細胞を固定した。
Ｎｅｏ１２またはＭＡＲＴ１ネオ抗原（ｎｅｏｇａｎｔｉｇｅｎ）に結合するＴＣＲを発現する遺伝子編集Ｔ細胞を、１～２×１０６細胞／ｍＬの密度で１×染色緩衝液（ＢＤウシ血清アルブミン染色緩衝液、ＢＤ５５４６５７）に再懸濁した。細胞を、アッセイの間、４℃に維持した。ＮＴＡｍｅｒを、１：５０～１：４００（ｖ：ｖ希釈）の種々の濃度で、染色緩衝液中のＴ細胞に添加し、１５分間、４℃で暗所にてインキュベートして、多量体化したＮＴＡｍｅｒがＴ細胞に結合できるようにした。Ｔ細胞を１×染色緩衝液で２回洗浄して、結合していないＮＴＡｍｅｒを除去し、染色緩衝液に再懸濁した。多量体化ＮＴＡｍｅｒを破壊し、Ｃｙ５シグナル減衰をモニターするために、イミダゾール破壊緩衝液（１．４５２ｇのイミダゾールおよび５０ｍＬの１×Ｈａｎｋ緩衝生理食塩水）を添加し、混合し、試料をフローサイトメーターを介して評価してＣｙ５シグナル減衰をモニターした。種々の細胞マーカーの検出のためのさらなる抗体染色を、１５分間、４℃で暗所にてＴ細胞をインキュベートし、１×染色緩衝液中で２回細胞を洗浄することにより行った。次に、ＩＣ固定緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＩＣ固定緩衝液、００－８２２２－４９）を用いてＴ細胞を固定した。
【0192】
結果
最初に、ビオチン化されたｃｏｍＰＡＣＴ－Ｃｙ５ ＮＴＡｍｅｒがコグネイトＴＣＲに結合する能力を評価した。Ｎｅｏ１２ペプチド結合リフォールドしたＭＨＣ Ｉ分子、ｎｅｏ１２ ｃｏｍＰＡＣＴ分子、またはｎｅｏ１２ ＮＴＡｍｅｒを、デキストラマーにアセンブルさせ、ｎｅｏ１２ ＴＣＲを発現するＴ細胞とともにインキュベートした。各デキストラマー分子の細胞への結合を決定した。図２８Ａは、ｎｅｏ１２ ＴＣＲを発現する遺伝子編集Ｔ細胞が、ｎｅｏ１２ペプチド結合リフォールドしたＭＨＣ Ｉ分子デキストラマー（下のプロット、ｘ軸はデキストラマーＰＥシグナルである）に特異的結合を示し、この結合は、それらの表面でＣＤ３を発現するＴ細胞集団（上のプロット、ｘ軸はＰＥ－Ｃｙ３シグナルである）に対応することを示す。図２８Ｂは、ｎｅｏ１２ ＴＣＲを発現する遺伝子編集Ｔ細胞が、ｎｅｏ１２ ｃｏｍＰＡＣＴ分子のデキストラマー（下のプロット、ｘ軸はデキストラマーＰＥシグナである）に特異的結合を示し、この結合は、それらの表面でＣＤ３を発現するＴ細胞集団（上のプロット、ｘ軸はＰＥ－Ｃｙ３シグナルである）に対応することを示す。図２８Ｃは、ｎｅｏ１２ ＴＣＲを発現する遺伝子編集Ｔ細胞が、ｎｅｏ１２ ｃｏｍＰＡＣＴ ＮＴＡｍｅｒデキストラマー（下のプロット、ｘ軸はデキストラマーＰＥシグナルである）に特異的結合を示し、この結合は、それらの表面でＣＤ３を発現するＴ細胞集団（上のプロット、ｘ軸はＰＥ－Ｃｙ３シグナルである）に対応することを示す。
最初に、ビオチン化されたｃｏｍＰＡＣＴ－Ｃｙ５ ＮＴＡｍｅｒがコグネイトＴＣＲに結合する能力を評価した。Ｎｅｏ１２ペプチド結合リフォールドしたＭＨＣ Ｉ分子、ｎｅｏ１２ ｃｏｍＰＡＣＴ分子、またはｎｅｏ１２ ＮＴＡｍｅｒを、デキストラマーにアセンブルさせ、ｎｅｏ１２ ＴＣＲを発現するＴ細胞とともにインキュベートした。各デキストラマー分子の細胞への結合を決定した。図２８Ａは、ｎｅｏ１２ ＴＣＲを発現する遺伝子編集Ｔ細胞が、ｎｅｏ１２ペプチド結合リフォールドしたＭＨＣ Ｉ分子デキストラマー（下のプロット、ｘ軸はデキストラマーＰＥシグナルである）に特異的結合を示し、この結合は、それらの表面でＣＤ３を発現するＴ細胞集団（上のプロット、ｘ軸はＰＥ－Ｃｙ３シグナルである）に対応することを示す。図２８Ｂは、ｎｅｏ１２ ＴＣＲを発現する遺伝子編集Ｔ細胞が、ｎｅｏ１２ ｃｏｍＰＡＣＴ分子のデキストラマー（下のプロット、ｘ軸はデキストラマーＰＥシグナである）に特異的結合を示し、この結合は、それらの表面でＣＤ３を発現するＴ細胞集団（上のプロット、ｘ軸はＰＥ－Ｃｙ３シグナルである）に対応することを示す。図２８Ｃは、ｎｅｏ１２ ＴＣＲを発現する遺伝子編集Ｔ細胞が、ｎｅｏ１２ ｃｏｍＰＡＣＴ ＮＴＡｍｅｒデキストラマー（下のプロット、ｘ軸はデキストラマーＰＥシグナルである）に特異的結合を示し、この結合は、それらの表面でＣＤ３を発現するＴ細胞集団（上のプロット、ｘ軸はＰＥ－Ｃｙ３シグナルである）に対応することを示す。
【0193】
次に、ビオチン化されたｃｏｍＰＡＣＴ－Ｃｙ５ ＮＴＡｍｅｒが抗原特異的にＴＣＲに結合する能力を確認した。Ｎｅｏ１２またはＦ５ ＴＣＲ Ｔ細胞をＮＴＡｍｅｒとｎｅｏ１２抗原とともにインキュベートした。Ｆ５ ＴＣＲ Ｔ細胞を陰性対照として使用した。Ｎｅｏ１２ ＴＣＲ Ｔ細胞をまた、ｎｅｏ１２ ｃｏｍＰＡＣＴタンパク質で構成されるデキストラマーとともにインキュベートした。次に、結合したＴ細胞を、記載されるようにイミダゾールとともにインキュベートし、ＮＴＡｍｅｒおよびデキストラマーの結合を、前述のように評価した。イミダゾールの添加は、ｎｅｏ１２－ＣｏｍＰＡＣＴ ＮＴＡｍｅｒのｎｅｏ１２ Ｔ細胞に結合する能力を阻害した（図２９Ａ～Ｃ）。Ｎｅｏ１２ ＴＣＲ Ｔ細胞は、ｎｅｏ１２ ＮＴＡｍｅｒ試薬に特異的結合を示した（図２９Ａ、ＮＴＡｍｅｒ Ｃｙ５シグナルはｙ軸である）。ｎｅｏ１２－ＣｏｍＰＡＣＴ ＮＴＡｍｅｒはＮｅｏ１２ Ｔ細胞に特異的であり、Ｆ５ ＴＣＲを発現するＴ細胞には結合しなかった（図２９Ｂ）。Ｎｅｏ１２ ｃｏｍＰＡＣＴのデキストラマーはまたｎｅｏ１２ ＴＣＲ Ｔ細胞に結合した（図２９Ｄ）。Ｎｅｏ１２ ＴＣＲ Ｔ細胞は、イミダゾールの存在下でインキュベートした場合、ｎｅｏ１２ ＮＴＡｍｅｒ試薬との結合を示さなかった（図２９Ｃ）。これは、Ｓ８８Ｃ修飾されたｃｏｍＰＡＣＴ分子からのＣｙ５シグナルを観察するための多量体化試薬の必要性を実証した。
【0194】
また、ＭＡＲＴ－１ ＮＴＡｍｅｒを用いて、Ｆ５ ＴＣＲを発現するように編集されたＴ細胞の抗原特異的結合を示した（図３０Ａ－Ｄ）。図３０Ａは、ＭＡＲＴ－１ ｃｏｍＰＡＣＴデキストラマーのＦ５ ＴＣＲ Ｔ細胞への結合を示す。図３０Ｂは、ＭＡＲＴ－１ ｃｏｍＰＡＣＴデキストラマーのＭ１Ｗ ＴＣＲ Ｔ細胞への結合を示す。図３０Ｃは、ＭＡＲＴ－１ ｃｏｍＰＡＣＴ ＮＴＡｍｅｒのＦ５ ＴＣＲ Ｔ細胞への結合を示す。図３０Ｄは、ＭＡＲＴ－１ ｃｏｍＰＡＣＴ ＮＴＡｍｅｒｓのＭ１Ｗ ＴＣＲ Ｔ細胞への結合を示す。Ｍ１Ｗ Ｔ細胞へのＭＡＲＴ－１ ｃｏｍＰＡＣＴ ＮＴＡｍｅｒの低レベルの結合は、コグネイト抗原：ＭＨＣ Ｉタンパク質に対するＭ１Ｗ ＴＣＲの低い親和性に起因する可能性がある。
【0195】
単量体ＴＣＲ：ｐＭＨＣ－Ｃｙ５の解離は、同じペプチド：ＭＨＣ Ｉ複合体（ＨＬＡ：Ａ０２＋ＭＡＲＴ－１）に対する異なるＴＣＲ：ＭＨＣ Ｉ結合親和性を有する２つのＴＣＲ、ＭＡＲＴ－１ Ｆ５およびＭ１ＷのＣｙ５シグナル減衰を測定することにより評価された。Ｆ５ ＴＣＲを発現するＴ細胞へのＭＡＲＴ１ ＮＴＡｍｅｒの結合は、ＮＴＡｍｅｒ破壊を誘導するイミダゾールの不存在下で経時的に安定であった（図３１Ａ）。しかしながら、多量体化ＭＡＲＴ－１ ＮＴＡｍｅｒをイミダゾールで破壊すると、単量体ＭＡＲＴ－１ ｃｏｍＰＡＣＴ分子がＦ５ ＴＣＲに時間依存的に解離した（図３１Ｂ）。図３１Ｃは、図３１Ｂからの時間データのサブセットを視覚的に拡大したものを示す。
【0196】
結論として、Ｎｅｏ１２およびＦ５ Ｔ細胞は、ＮＴＡｍｅｒと同等のｃｏｍＰＡＣＴ デキストラマーとの間で類似した結合レベルを示し、ｃｏｍＰＡＣＴ ＮＴＡｍｅｒは、抗原特異的な様式でネオ抗原Ｔ細胞と結合することができる。Ｎｅｏ１２およびＦ５ Ｔ細胞は、ｎｅｏ１２とＭＡＲＴ－１ ｃｏｍＰＡＣＴの両方について、ＮＴＡｍｅｒとｃｏｍＰＡＣＴデキストラマーとの間で同様の結合レベルを実証する。さらに、ＮＴＡｍｅｒ複合体は、イミダゾール添加によって破壊され得、一価ＴＣＲ：ＭＨＣ Ｉ乖離速度は、生きたＴ細胞上のｃｏｍＰＡＣＴ－Ｃｙ５シグナルの減衰によって測定され得る。この減衰は、数十秒の時間スケールで起こる。
【0197】
実施例９：ｃｏｍＰＡＣＴライブラリー生成
米国のヒト集団におけるＨＬＡ対立遺伝子の多様性は、対立遺伝子頻度ネットデータベース（ｗｗｗ．ａｌｌｅｌｅｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ．ｎｅｔ）からバイオインフォマティクスにより分析され、対象ＨＬＡ頻度の高いカバレッジをもたらすＨＬＡレパートリーに含めるべき対立遺伝子の最適数を同定した。９７３６個の対立遺伝子を分析した。図２６Ａは、ＨＬＡ Ａ、Ｂ、およびＣ遺伝子座の各々からの１つまたは両方の対立遺伝子が６６個のＨＬＡ対立遺伝子のライブラリーによってカバーされる患者のパーセンテージの分析を示す。実線は１個の対立遺伝子がカバーされていることを示し、点線は両方の対立遺伝子がカバーされていることを示す。６６個の対立遺伝子は、全集団の９５％を超える患者あたり６つのＨＬＡ対立遺伝子のうちの少なくとも４つのカバレッジ、および集団の８０％を超える６つの対立遺伝子のうちの６つの対立遺伝子のカバレッジを可能にする（図２６Ｂ）。最も頻度の高いＨＬＡ－Ｉ対立遺伝子はＨＬＡ－Ａ０２：０１であり、米国における有病率は約５０％である。したがって、本明細書に最初に示されたＨＬＡライブラリーは、グローバルであり、多様な集団のための個別化されたｎｅｏＴＣＲ－Ｔ細胞療法の広範な実施のための最も潜在的可能性を可能にする。
米国のヒト集団におけるＨＬＡ対立遺伝子の多様性は、対立遺伝子頻度ネットデータベース（ｗｗｗ．ａｌｌｅｌｅｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ．ｎｅｔ）からバイオインフォマティクスにより分析され、対象ＨＬＡ頻度の高いカバレッジをもたらすＨＬＡレパートリーに含めるべき対立遺伝子の最適数を同定した。９７３６個の対立遺伝子を分析した。図２６Ａは、ＨＬＡ Ａ、Ｂ、およびＣ遺伝子座の各々からの１つまたは両方の対立遺伝子が６６個のＨＬＡ対立遺伝子のライブラリーによってカバーされる患者のパーセンテージの分析を示す。実線は１個の対立遺伝子がカバーされていることを示し、点線は両方の対立遺伝子がカバーされていることを示す。６６個の対立遺伝子は、全集団の９５％を超える患者あたり６つのＨＬＡ対立遺伝子のうちの少なくとも４つのカバレッジ、および集団の８０％を超える６つの対立遺伝子のうちの６つの対立遺伝子のカバレッジを可能にする（図２６Ｂ）。最も頻度の高いＨＬＡ－Ｉ対立遺伝子はＨＬＡ－Ａ０２：０１であり、米国における有病率は約５０％である。したがって、本明細書に最初に示されたＨＬＡライブラリーは、グローバルであり、多様な集団のための個別化されたｎｅｏＴＣＲ－Ｔ細胞療法の広範な実施のための最も潜在的可能性を可能にする。
【0198】
次に、異なるネオエピトープおよび選択されたＨＬＡ対立遺伝子を有するｃｏｍＰＡＣＴタンパク質のライブラリーを作製した。ネオエピトープ候補は、Ｉｍｍｕｎｅ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇ）から選択された。レパートリー中の６６個のＨＬＡ－Ｉ対立遺伝子の各々についての完全な配列がＩＭＧＴデータベースから得られ、Ｙ８４Ｃ突然変異を含むように修飾された。すべてのクローンを配列検証し、データベースおよび試薬インベントリーに保管した。１０個のネオエピトープペプチドをＩＥＤＢデータベースから選択し、３６個のＨＬＡ対立遺伝子のパネルに挿入した。選択されたネオエピトープおよびＨＬＡ対立遺伝子のＣｏｍＰＡＣＴを発現させ、製造者の指示に従ってＡｇｉｌｅｎｔ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＨＰＬＣシステム（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）に接続したサイズ排除クロマトグラフィーカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｓｅｃ Ｂｉｏ ３００）を介して精製した。結果を図２７Ａ～Ｃに示す。ｃｏｍＰＡＣＴｓを単分散ポリペプチドとして精製し、単量体ピークの曲線下面積を全クロマトグラム下面積で割った値を測定することによりＳＥＣ－ＨＰＬＣにより評価した（図２７Ａおよび２７Ｂ）。ほとんどのｃｏｍＰＡＣＴは高力価で発現した（図２７Ｃ）。記載されている各ＨＬＡ対立遺伝子について少なくとも１つのｃｏｍＰＡＣＴタンパク質を精製し、ＨＰＬＣを介して特徴付けた。これは、ｃｏｍＰＡＣＴプラットフォームは頑強であり、多くの対立遺伝子に感受性があることを示す。
【0199】
本発明を、好ましい実施形態および種々の代替の実施形態を参照して、特に示し、説明したが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、その中で形態および詳細の種々の変更を行うことができることは、当業者には理解される。
【0200】
本明細書の本文中で引用された全ての参考資料、発行された特許および特許出願は、全ての目的のために、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13A-B】
【図14】
【図15】
【図16A-C】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22A-B】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26A-B】
【図27A】
【図27B】
【図27C】
【図28A-C】
【図29A-D】
【図30A-D】
【図31A-C】
【配列表】