特許 7541292 骨代謝改善組成物およびその製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-08-20

(45)【発行日】2024-08-28

(54)【発明の名称】骨代謝改善組成物およびその製造方法

(51)【国際特許分類】

   A23L 33/105 20160101AFI20240821BHJP

   A61K 31/12 20060101ALI20240821BHJP

   A61K 36/9068 20060101ALI20240821BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240821BHJP

   A61P 19/08 20060101ALI20240821BHJP

【ＦＩ】

A23L33/105

A61K31/12

A61K36/9068

A61P43/00 121

A61P19/08

【請求項の数】 3

(21)【出願番号】P 2020083444

(22)【出願日】2020-05-11

(65)【公開番号】P2021177705

(43)【公開日】2021-11-18

【審査請求日】2023-05-10

(73)【特許権者】

【識別番号】591193037

【氏名又は名称】辻製油株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】304026696

【氏名又は名称】国立大学法人三重大学

(74)【代理人】

【識別番号】100174090

【弁理士】

【氏名又は名称】和気 光

(74)【代理人】

【識別番号】100100251

【弁理士】

【氏名又は名称】和気 操

(74)【代理人】

【識別番号】100205383

【弁理士】

【氏名又は名称】寺本 諭史

(72)【発明者】

【氏名】籠谷 和弘

(72)【発明者】

【氏名】辻 威彦

(72)【発明者】

【氏名】臧 黎清

(72)【発明者】

【氏名】島田 康人

(72)【発明者】

【氏名】西村 訓弘

【審査官】村松 宏紀

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１４－０４３４１６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１５－１９８６６１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００６－０４５２１０（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ２３Ｌ、Ａ６１Ｋ、Ａ６１Ｐ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

８－ジンゲロール、１０－ジンゲロール、１－デヒドロ－６－ジンゲルジオン、および６－ジンゲルジオンのうち、いずれか３種以上の成分を有効成分として含有し、かつ、６－ジンゲロールを含まないことを特徴とする骨代謝改善組成物。

【請求項2】

前記骨代謝改善組成物に含まれる前記３種以上の成分が、ショウガ抽出物由来であることを特徴とする請求項１記載の骨代謝改善組成物。

【請求項3】

骨代謝改善組成物の製造方法であって、
前記骨代謝改善組成物は、ショウガ抽出物由来である、８－ジンゲロール、１０－ジンゲロール、１－デヒドロ－６－ジンゲルジオン、および６－ジンゲルジオンのうち、いずれか３種以上の成分を有効成分として含有し、かつ、６－ジンゲロールを含まず、
前記３種以上の成分は、ノルマルヘキサンを用いてショウガ抽出物を抽出した後、該ショウガ抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによりノルマルヘキサンとアセトンの混合溶媒で溶出して、得られることを特徴とする骨代謝改善組成物の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、骨代謝改善組成物およびその製造方法に関し、特に、ショウガから抽出される骨吸収抑制作用を有する骨代謝改善組成物およびその製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

骨粗鬆症の罹患者は日本国内で１０００万人以上になり、社会的に大きな影響をもたらす問題となっている。人体における骨組織では、絶えず骨形成と骨吸収がなされており、加齢などの原因で骨形成と骨吸収とのバランスが崩れて骨吸収が優勢になり、この状態が長期間続くと骨量が減少して、骨強度の低下によって、骨折のリスクが高くなる骨の障害として定義される骨粗鬆症に至る。骨吸収は破骨細胞によって行なわれ、破骨細胞の分化および活性化が顕著であるほど、骨吸収率は高くなる。一方、骨形成は骨芽細胞によって行なわれ、骨芽細胞の分化および活性化が顕著であるほど、骨形成率は高くなる。そのため、骨形成率を高める骨形成促進作用を有する、および／または、骨吸収率を減少させる骨吸収抑制作用を有する組成物が得られれば、骨粗鬆症に有効である。

【0003】

骨粗鬆症の予防、改善に有効な成分として、哺乳動物の骨、皮部分や魚類の骨、皮、鱗部分などから得ることができるコラーゲンを酵素処理して得られるＨｙｐ－Ｇｌｙの構造を有するジペプチドを必須のジペプチドとして含有するコラーゲンペプチドが知られている（特許文献１）。しかし、コラーゲンペプチドは骨形成促進作用を有するが、骨吸収抑制作用を有しない。
また、骨粗鬆症の予防・改善用組成物として、温州ミカンの果実、果皮、および、じょうのう膜の溶媒抽出物が知られている（特許文献２）。さらに、ショウガ（生姜）の辛味成分である６－ジンゲロールおよび６－ショウガオールを含む、ショウガの抽出物を有効成分とする骨代謝改善組成物（特許文献３）や、スイートバジル、ホーリーバジル、コモンタイム、イタリアンラージリーフ、およびフェンネルからなる群から選択される１種または２種以上の植物の抽出物を有効成分として含有する前駆骨芽細胞分化誘導剤（特許文献４）が知られている。

【0004】

上記骨粗鬆症改善薬の原料として知られる植物のうち、ショウガは、世界中で香辛料および民間薬として広く用いられている。特に、アジアでは生食や漬物用、またカレー粉の原料として用いられ、西洋とアラブ諸国では、乾燥品が調理用やパン・菓子などに用いられる。漢方では生姜（ショウキョウ）と呼ばれ、新陳代謝機能向上の効能があるとされ、嘔吐、鎮痛、食欲増進などに用いられる。

【0005】

国内においても、ショウガは、薬味や菓子の他、風邪予防に効くとして、ショウガ湯などに幅広く使用されている。収穫されたショウガは、青果用として低温で保存されて市場に供給される一方、加工用として搾汁された搾汁液は、飲料などに利用されている。この搾汁後の搾り滓は、廃棄処分されている未利用資源であるため、有効利用が望まれている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【文献】特開２０１０－１０６００３号公報

【文献】特開２００６－８３１５１号公報

【文献】特開２０１４－４３４１６号公報

【文献】特許第６５６０４７１号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

上記特許文献３の骨代謝改善組成物は、ノルマルヘキサンを用いて抽出して得られた、６－ジンゲロールおよび６－ショウガオールを含むショウガ抽出物である。この抽出物には、６－ジンゲロールおよび６－ショウガオール以外にも他の成分が含まれているが、その他の成分の骨代謝改善作用への関与は検討されていない。

【0008】

本発明は、骨粗鬆症の予防および改善をするために、骨吸収抑制作用を有する骨代謝改善組成物の提供を目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明の骨代謝改善組成物は、８－ジンゲロール、１０－ジンゲロール、１－デヒドロ－６－ジンゲルジオン、および６－ジンゲルジオンのうち、いずれか３種以上の成分を有効成分として含有することを特徴とする。

【0010】

上記骨代謝改善組成物に含まれる上記３種以上の成分が、ショウガ抽出物由来であることを特徴とする。

【0011】

上記骨代謝改善組成物は、６－ジンゲロールを含まないことを特徴とする。

【0012】

本発明の骨代謝改善組成物の製造方法は、上記骨代謝改善組成物が、ショウガ抽出物由来である、８－ジンゲロール、１０－ジンゲロール、１－デヒドロ－６－ジンゲルジオン、および６－ジンゲルジオンのうち、いずれか３種以上の成分を有効成分として含有し、上記３種以上の成分は、ノルマルヘキサンを用いてショウガ抽出物を抽出した後、該ショウガ抽出物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、ノルマルヘキサンとアセトンの混合溶媒で溶出して得られることを特徴とする。

【発明の効果】

【0013】

本発明の骨代謝改善組成物は、８－ジンゲロール、１０－ジンゲロール、１－デヒドロ－６－ジンゲルジオン、および６－ジンゲルジオンのうち、いずれか３種以上の成分を有効成分として含有するので、優れた骨吸収抑制作用を示し、骨粗鬆症の予防および改善に有効である。

【0014】

骨代謝改善組成物に含まれる上記３種以上の成分が、ショウガ抽出物由来であるので、人体により安全で、摂取しやすい骨代謝改善組成物が得られる。

【0015】

本発明の骨代謝改善組成物の製造方法は、骨代謝改善組成物が、ショウガ抽出物由来である、８－ジンゲロール、１０－ジンゲロール、１－デヒドロ－６－ジンゲルジオン、および６－ジンゲルジオンのうち、いずれか３種以上の成分を有効成分として含有し、上記３種以上の成分は、ノルマルヘキサンを用いてショウガ抽出物を抽出した後、該ショウガ抽出物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、ノルマルヘキサンとアセトンの混合溶媒で溶出して得られるので、ショウガ抽出物由来の成分の所望の組み合わせを、簡易な操作で得ることができる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】ショウガ搾り滓のノルマルヘキサン抽出物のＨＰＬＣである。

【図2】シリカゲルカラムによる分取手順を示す図である。

【図3】画分Ａおよび画分ＢのＨＰＬＣである。

【図4】画分Ｃおよび画分ＤのＨＰＬＣである。

【図5】画分Ｅおよび画分ＦのＨＰＬＣである。

【図6】画分Ｇおよび画分ＨのＨＰＬＣである。

【図7】画分Ｉおよび画分ＪのＨＰＬＣである。

【図8】各画分のＴＲＡＰ染色像を示す図である。

【図9】ＴＲＡＰ染色した破骨細胞数の結果を示す図である。

【図10】画分Ｆ～画分Ｈに含まれる成分の構造などである。

【図11】細胞毒性の評価結果である。

【図12】ＴＲＡＰ染色像を示す図である。

【図13】ＴＲＡＰ染色像の定量解析結果である。

【図14】ゼブラフィッシュの鱗のＴＲＡＰ染色像である。

【図15】ゼブラフィッシュの鱗のＴＲＡＰ染色像である。

【図16】ＴＲＡＰ染色像の定量解析結果である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本発明者らは、ショウガ抽出物が有する破骨細胞の分化抑制作用を発現する有効成分の探索を行った結果、ショウガ抽出物に含まれる、８－ジンゲロール、１０－ジンゲロール、１－デヒドロ－６－ジンゲルジオン、および６－ジンゲルジオンのうち、いずれか３種以上を含有する場合に、顕著な骨吸収抑制効果を有することを見出した。本発明はこのような知見に基づくものである。

【0018】

以下、本発明の実施の形態を説明する。本発明の骨代謝改善組成物に含有される８－ジンゲロール、１０－ジンゲロール、１－デヒドロ－６－ジンゲルジオン、および６－ジンゲルジオンは、化学合成によって調製することができ、また、天然物から抽出して、シリカゲルカラムなどを用いて精製することによっても調製できる。あるいは、市販品を用いてもよい。

【0019】

上記成分を天然物から抽出する場合には、それらを含有する植物の全体または一部分（例えば、全草、葉、根、根茎、茎、根皮、若しくは花）をそのまま用いて、または簡単に加工処理（例えば、乾燥、切断、若しくは粉末化）したもの（例えば、生薬）を用いて抽出する。

【0020】

本発明では、天然物として、熱帯アジアを原産とするショウガ科の多年草であるショウガ（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）の根茎を用いることができる。
抽出物を得るための原料としては、生鮮ショウガ、乾燥ショウガ、およびこれらの加工品が挙げられる。例えば、飲料などに利用するための搾汁液を搾汁された搾り滓を好ましく利用できる。特に、この搾り滓は未利用資源として廃棄されていたものであり、その有効利用が図れる。

【0021】

ショウガの抽出方法としては、有機溶媒抽出、有機溶媒と水との混合溶媒抽出、超臨界抽出が挙げられる。有機溶媒としては、亜酸化窒素、アセトン、エタノール、エチルメチルケトン、グリセリン、酢酸エチル、酢酸メチル、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、ジクロロメタン、食用油脂、１，１，２－テトラフルオロエタン、１，１，２－トリクロロエテン、二酸化炭素、１－ブタノール、２－ブタノール、ブタン、１－プロパノール、２－プロパノール、プロパン、プロピレングリコール、ノルマルヘキサン、水、メタノールなどが挙げられる。これらの中で抽出溶媒として油脂食品製造への使用が認められているノルマルヘキサンがショウガ搾り滓から後述する低温抽出に用いる溶媒として好ましい。なお、超臨界抽出の溶媒としてはＣＯ_２を例示できる。

【0022】

上記ショウガ抽出物は、固相吸着剤などによって精製されることが好ましい。固相吸着剤としては、シリカゲルが好ましく、一般に市販されているものを用いることができる。また、シリカゲルの平均粒子径は、例えば５μｍ～５００μｍを用いることができる。

【0023】

シリカゲルカラムクロマトグラフィーを行う場合、溶出溶媒には、溶媒同士が分離せず、かつシリカゲルに非可逆的に吸着されない溶媒ならば、いずれも使用できる。溶出溶媒として、例えば、ノルマルヘキサン、アセトン、エタノール、エチルメチルケトン、酢酸エチル、ジエチルエーテル、シクロヘキサンなどを用いることができる。溶出溶媒には１種のみを用いてもよく、また２種以上を混合した混合溶媒として用いてもよい。

【0024】

本発明の骨代謝改善組成物を得るためには、溶出溶媒としてノルマルヘキサンおよびアセトンを用いることが好ましい。具体的には、ノルマルヘキサンのみ（ヘキサン１００％）で所定時間溶出させた後、ノルマルヘキサンとアセトンからなる混合溶媒で所定時間溶出させる。この混合溶媒の割合は体積比で、例えば、ノルマルヘキサン：アセトン＝（９８：２～７０：３０）である。この範囲内において、アセトンの割合を段階的または連続的に増やすグラジエント溶出を行うことが好ましい。この混合溶媒の割合は体積比で、ノルマルヘキサン：アセトン＝（９８：２～８０：２０）であることがより好ましく、（９８：２～８５：１５）であることがさらに好ましい。

【0025】

溶出して得られた各画分を、ノルマルヘキサン－アセトンを展開溶媒として薄層クロマトグラフィーで展開し、類似の画分を合わせることで、８－ジンゲロール、１０－ジンゲロール、１－デヒドロ－６－ジンゲルジオン、および６－ジンゲルジオンのうち、いずれか３種以上を含む画分を得ることができる。この画分を濃縮して溶媒を除去することで、褐色透明な油溶性液体が得られる。

【0026】

本発明の骨代謝改善組成物は、上述のように、ショウガ抽出物からシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって溶出・分離して得られた分画物をそのまま用いることができる。また、適宜な溶媒に希釈して用いてもよく、さらに、吸着素材を用いて粉末状へ加工したり、ペースト状にして用いてもよい。

【0027】

本発明の骨代謝改善組成物は、特定保健用食品や、サプリメント、薬剤などへ適用可能である。また、本発明の骨代謝改善組成物を骨粗鬆症の予防・改善剤などの食品として用いる場合の形態としては、パン類、ケーキ類、麺類、菓子類、ゼリー類、冷凍食品、アイスクリーム類、乳製品、飲料などの各種食品などが挙げられる。
種々の形態の食品を調製するには、本発明の骨代謝改善組成物を単独で、または他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤などと適宜組み合わせて用いることができる。

【実施例】

【0028】

ショウガ原料として、搾汁液を搾汁されたショウガの搾り滓（含水率約７５質量％）を準備した。この搾り滓６０ｋｇを－１０℃以下に冷凍した。この冷凍原料を、体積で約２倍量のノルマルヘキサン（抽出溶媒）を加え、攪拌して破砕を行った後、０℃以下で１５分間浸漬した。その後、ノルマルヘキサン溶液（層）を回収し、これを遠心薄膜濃縮装置および減圧蒸留装置を用いて、室温以下の温度でノルマルヘキサンを除去した。得られたショウガ抽出物は、ショウガをすりおろした後の爽やかな香気と、ショウガ特有の辛み成分とを有する褐色透明な油溶性液体であった。
得られたショウガ抽出物の成分を高速液体クロマトグラフィー（以下、高速液体クロマトグラムを含めて、ＨＰＬＣという）法により分析した。ＨＰＬＣの測定条件は、カラムがＷａｋｏｓｉｌ ｌｌ－５Ｃ１８ φ４．６×２５０ｍｍであり、移動相が含水アセトニトリルであり、３０質量％アセトニトリルから９０質量％アセトニトリルグラジエント（０－２０分）＋９０質量％アセトニトリル（２０－４０分）であり、検出器は２２８ｎｍの紫外吸光度検出器（カラム温度４０℃）を用いた。移動相の流速は０．６ｍＬ／ｍｉｎで分析を行った。
上記ＨＰＬＣの結果を図１に示す。

【0029】

図１において、各ピークのＭＳ、および、標準試料のＨＰＬＣより、Ｐ_ａで示すピークはショウガに含まれる辛み成分の６－ジンゲロールであり、Ｐ_ｂで示すピークはモノテルペンであるネラール、Ｐ_ｃで示すピークはネラールの異性体であるゲラニアール、Ｐ_ｄで示すピークはフェランドレン、Ｐ_ｅで示すピークはファルネセン、Ｐ_ｆで示すピークはジンギベレンであると同定された。この結果より、ピークＰ_ａからピークＰ_ｆの合計ピーク面積から換算すると、これら成分がショウガ抽出物中の成分の大半を占めることが分かった。

【0030】

次に、上記ショウガ抽出物中の各成分を分離するため、シリカゲルオープンカラム（相互理化学硝子製作所製、φ２０×３００ｍｍ）による分取を行った。溶出液としては、最初にヘキサン単独からスタートし、その後、ヘキサンおよびアセトンの混合溶媒に変更し、アセトン比率を徐々に高め混合溶媒の極性を上げていき、最終的にエタノール単独でショウガ抽出物を溶出した。溶出中、１画分あたり３０～２００ｍＬずつを順次採取し、最終的に５２画分を分取した。溶出条件の詳細を図２に示す。

【0031】

上記ショウガ抽出物（ＧＨＥ）をヘキサンにて平衡化したシリカゲルカラムに供した。図２に示すように、ヘキサン単独で溶出させて第１～第１３画分を採取し、ヘキサン：アセトン＝（９８：２）で溶出させて第１４～第２０画分を採取し、ヘキサン：アセトン＝（９３：７）で溶出させて第２１～第３６画分を採取し、ヘキサン：アセトン＝（８８：１２）で溶出させて第３７～第４６画分を採取し、ヘキサン：アセトン＝（８５：１５）で溶出させて第４７～第５０画分を採取し、エタノール：アセトン＝（５０：５０）で溶出させて第５１画分を採取し、エタノール単独で溶出させて第５２画分を採取した。得られた各画分を、薄層クロマトグラフィーのクロマトグラムを基にして、１０画分（画分Ａ～画分Ｊ）に縮分して、濃縮して試験用分画物を得た。

【0032】

図３～図７には、画分Ａ～画分ＪのＨＰＬＣを示す。ＨＰＬＣの測定条件は、カラムがＷａｋｏｓｉｌ ｌｌ－５Ｃ１８ φ４．６×２５０ｍｍであり、移動相が含水アセトニトリルであり、３０質量％アセトニトリルから９０質量％アセトニトリルグラジエント（０－２０分）＋９０質量％アセトニトリル（２０－４０分）であり、検出器は２２８ｎｍの紫外吸光度検出器（カラム温度４０℃）を用いた。移動相の流速は０．６ｍＬ／ｍｉｎで分析を行った。

【0033】

図３および図４に示すように、画分Ａ～画分Ｄには、ジンギベレン、ファルネセン、フェランドレン、ネラール、ゲラニアールなどの低極性のテルペン類化合物が主に含まれていた。

【0034】

図５および図６に示すように、画分Ｅには、８－ジンゲロール（ピークＰ１）が含まれ、画分Ｆおよび画分Ｇには、８－ジンゲロール（ピークＰ１）、１０－ジンゲロール（ピークＰ２）、１－デヒドロ－６－ジンゲルジオン（ピークＰ３）、６－ジンゲルジオン（ピークＰ４）が含まれ、画分Ｈには、８－ジンゲロール（ピークＰ１）、１０－ジンゲロール（ピークＰ２）、１－デヒドロ－６－ジンゲルジオン（ピークＰ３）、６－ジンゲロールが含まれていた。なお、画分Ｆおよび画分Ｇには、６－ジンゲロールは含まれていなかった。

【0035】

図７に示すように、画分Ｉには、６－ジンゲロールが含まれ、画分Ｊには主な成分はほとんど検出されなかった。なお、各画分中の各成分の同定は、標品のＨＰＬＣおよびＭＳと対比することにより行った。画分Ａ～画分Ｊのそれぞれの収率について、表１に示す。

【0036】

【表1】

【0037】

上記で得られたショウガ抽出物（ＧＨＥ）および各分画物（画分Ａ～画分Ｊ）を用いて、破骨細胞分化抑制効果を以下の方法で評価した。
＜破骨細胞の分化抑制効果の評価＞
マウスマクロファージ由来破骨前駆細胞（ＲＡＷ２６４．７）を２４ｗｅｌｌプレートに３×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ播種し、３７℃、５体積％ＣＯ_２存在下、１０質量％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むα－ＭＥＭ培地で培養した。２４時間後、被験試料を添加し、更に２４時間培養した。次いで、ＲＡＮＫＬ１００ｎｇ／ｍｌを培地に加え、６日間分化誘導培養した。その後、分化誘導６日目に酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）染色を行なった。ＴＲＡＰ染色陽性で、かつ１細胞当たりの核の個数が１１個以上の細胞を分化成熟破骨細胞とし、その数を計測した。
被験試料には、陰性対照（コントロール）としての無添加、ショウガ抽出物（２０μｇ／ｍｌ）、分画物Ａ～Ｊ（１０μｇ／ｍｌ）を用いた。試験繰り返し数は３である。

【0038】

各ＴＲＡＰ染色像を図８に、破骨細胞数の結果を図９に、それぞれ示す。図８および図９に示すように、分画物Ｆ～Ｈを添加したサンプルは、分化破骨細胞数が陰性対照と比較して顕著に減少した。この分画物Ｆ～Ｈを添加したサンプルは、それぞれ、ショウガ抽出物と同等以上に分化破骨細胞数が減少した。

【0039】

図１０に示すように、分画物Ｆ～Ｈの各成分に着目すると、分画物Ｆ～Ｈは、８－ジンゲロール、１０－ジンゲロール、１－デヒドロ－６－ジンゲルジオン、および６－ジンゲルジオンのうち、いずれか３種以上の成分を含んでおり、その結果、ショウガ抽出物と同等またはそれ以上の破骨細胞の分化抑制効果を示すことが明らかになった。なお、８－ジンゲロールを主成分とする分画物Ｅや、６－ジンゲロールを主成分とする分画物Ｉは、分化抑制効果を示すものの、その効果は分画物Ｆ～Ｈよりも低いものであった。

【0040】

また、図１のＨＰＬＣチャートに示すように、８－ジンゲロール、１０－ジンゲロール、１－デヒドロ－６－ジンゲルジオン、および６－ジンゲルジオンの各ピークは小さく、ショウガ抽出物中の微量成分である。それにもかかわらず、それら成分を３種以上含有した分画物が、上述のように高い破骨細胞の分化抑制効果を示したことから、これら成分が破骨細胞の分化抑制効果に有効であることが分かる。

【0041】

以上より、８－ジンゲロール、１０－ジンゲロール、１－デヒドロ－６－ジンゲルジオン、および６－ジンゲルジオンのうち、いずれか３種以上の成分を含有する組成物は、骨量を減少させる骨吸収作用を抑制することが確認され、骨粗鬆症の予防および改善に有効であると考えられる。

【0042】

次に、分画物Ｆ～分画物Ｈに共通して存在し、破骨細胞の分化抑制効果に有効と考えられる各成分（８－ジンゲロール、１０－ジンゲロール）、また、同族の６－ジンゲロールについて、破骨細胞分化抑制効果を評価した。破骨細胞分化抑制効果は、上記３つのジンゲロールの細胞毒性をチェックした後に評価した。

【0043】

＜細胞毒性の評価＞
細胞毒性の評価結果を図１１に示す。ＲＡＷ２６４．７細胞を各ジンゲロールで処理した結果、図１１に示すように、いずれの濃度（０．６μＭ、２．５μＭ、１０μＭ）においても細胞増殖の程度に差異はなく、強い細胞毒性は見られなかった。

【0044】

＜破骨細胞の分化抑制効果の評価＞
マウスマクロファージ由来破骨前駆細胞（ＲＡＷ２６４．７）を９６ｗｅｌｌプレートに１×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ播種し、３７℃、５体積％ＣＯ_２存在下、１０質量％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むα－ＭＥＭ培地で培養した。２４時間後、被験試料を添加し、更に２４時間培養した。次いで、ＲＡＮＫＬ１００ｎｇ／ｍｌを培地に加え、６日間分化誘導培養した。その後、分化誘導６日目に酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）染色を行なった。ＴＲＡＰ染色陽性で、かつ１細胞当たりの核の個数が１１個以上の細胞を分化成熟破骨細胞とし、その数を計測した。
被験試料には、陰性対照（コントロール）としての無添加、６－ジンゲロール、８－ジンゲロール、１０－ジンゲロール（それぞれ、０．６、２．５、１０μＭの３水準の濃度）の４種類を用いた。試験繰り返し数は６である。

【0045】

各ＴＲＡＰ染色像を図１２に示す。図１２に示すように、６－ジンゲロールを添加したサンプルは陰性対照と比較して若干の抑制効果が見られ、８－ジンゲロールおよび１０－ジンゲロールを添加したサンプルは、分化破骨細胞の増殖が顕著に抑制された。図１２（ａ）は２００倍での顕微鏡観察画像であり、図１２（ｂ）は２０倍での顕微鏡観察画像である。２００倍の観察画像では、特に１０－ジンゲロールを添加したサンプルにおいて、核を多く有する大きな細胞の出現度合いが少なかった。

【0046】

図１３には、上記ＴＲＡＰ染色像の定量解析結果を示す。２０倍で各ウェル全体を撮影した後に、染色程度の定量評価を行った。図１３（ａ）は、成熟した所定の大きさ以上の破骨細胞の数を示す。図１３（ｂ）は、ＩｍａｇｅＪで解析して定量化したＴＲＡＰ染色された領域の面積を示し、図１３（ｃ）は、染色程度（濃淡）を示す。６－ジンゲロール、８－ジンゲロール、１０－ジンゲロールはそれぞれ、陰性対照（コントロール）に比べ、破骨細胞の数が少なく、ＴＲＡＰ染色された領域の面積も小さくなる傾向を示し、分化破骨細胞の増殖抑制効果が確認された。特に、１０－ジンゲロールは、破骨細胞の数、ＴＲＡＰ染色面積だけでなく、染色程度も小さい値を示すとともに、少ない添加量でも分化破骨細胞の増殖抑制に高い効果を示した。破骨細胞の分化成熟の抑制作用は、ジンゲロールのメチレン基が長くなるほど強まり、特に１０－ジンゲロールの作用が強いことが分かった。

【0047】

また、上記で得られたショウガ抽出物、およびショウガ抽出物が含有する１０－ジンゲロールを用いて、個体動物による骨代謝改善効果を以下の方法で評価した。
＜個体動物試験＞
ゼブラフィッシュ（ＡＢ Ｓｔｒａｉｎ Ｍａｌｅ）を用いて個体動物試験を実施した。ゼブラフィッシュの尾部周辺から予め鱗を除去し、以下の試験１～試験８に示す条件下で、それぞれ８日間飼育を行った。その後、ゼブラフィッシュの尾部周辺に再生した鱗を採取し、パラホルムアルデヒドによる固定化をした後、９日目にＴＲＡＰ染色した。
試験１：無添加
試験２：プレドニゾロン（ステロイド性骨粗鬆症誘発剤）２５μＭ添加
試験３：プレドニゾロン２５μＭ＋アレンドロネート（骨粗鬆症治療薬）３０μＭ添加
試験４：プレドニゾロン２５μＭ＋ショウガ抽出物１ｐｐｍ添加
試験５：プレドニゾロン２５μＭ＋ショウガ抽出物１０ｐｐｍ添加
試験６：プレドニゾロン２５μＭ＋１０－ジンゲロール０．００１ｐｐｍ添加
試験７：プレドニゾロン２５μＭ＋１０－ジンゲロール０．０１ｐｐｍ添加
試験８：プレドニゾロン２５μＭ＋１０－ジンゲロール０．１ｐｐｍ添加

【0048】

試験１は陰性対照として、試験２は陽性対照として試験を実施した。試験繰り返し数は５～６である。各薬剤や被験サンプルは水への暴露で試験を実施した。また、試験４、試験５におけるショウガ抽出物、および試験６～試験８における１０－ジンゲロールは、レシチンを用いたリポソーム製剤として均一に添加を行い、各試験の終濃度は記載の通りである。リポソーム製剤としては、具体的には、ホスファスチジルコリン（ＰＣ７０）を用いたショウガ抽出物１％エマルション、ホスファスチジルコリン（ＰＣ７０）を用いた１０－ジンゲロール０．１％エマルションを事前に調製したものを用いた。ＴＲＡＰ染色後のゼブラフィッシュの鱗（骨組織）を光学顕微鏡にて４０倍の倍率で観察し、鱗の形状および破骨細胞の分化成熟抑制効果（染色の程度）を評価した。

【0049】

図１４に、各ゼブラフィッシュの鱗のＴＲＡＰ染色像を示す。試験２のプレドニゾロンのみのゼブラフィッシュの鱗は、崩壊が見られ、染色の程度も強いことから、破骨細胞が増加していることが確認される。試験３のアレンドロネートを同時に摂取させたゼブラフィッシュの鱗については、試験２に対して染色程度が少なく、破骨細胞の抑制が観察された。
一方、ショウガ抽出物を暴露させたゼブラフィッシュの鱗について（試験４、試験５）は、試験３と同様に染色程度が低下するとともに（破骨細胞の減少）、形状が維持された。この結果は、プレドニゾロンを暴露していない無処理のゼブラフィッシュの鱗と同等程度の良好な状態であった。また、ショウガ抽出物の濃度は１ｐｐｍ、１０ｐｐｍの場合のいずれも、同等の良好な結果を示した。

【0050】

図１５に、１０－ジンゲロールを暴露させたゼブラフィッシュの鱗のＴＲＡＰ染色像を示す。１０－ジンゲロールの濃度が異なる３種の被験サンプル（試験６、試験７、試験８）は、試験４および試験５のショウガ抽出物を暴露させた鱗と同等以下まで染色程度が低下した。この結果は、プレドニゾロンを暴露していない無処理のゼブラフィッシュの鱗よりも良好な状態であった。また、１０－ジンゲロールの濃度は、０．００１ｐｐｍ、０．０１ｐｐｍ、０．１ｐｐｍのいずれの場合も、染色程度は小さく、鱗の形状も保たれており、良好な結果を示した。

【0051】

図１６には、ＴＲＡＰ染色像をＩｍａｇｅＪで解析した定量解析結果を示す。定量化は、染色された部位の面積強度を測定することにより行った。染色程度を表すＩｎｔＤｅｎについて、ステロイド剤であるプレドニゾロン群（試験２）と比較して、試験３～試験８の各群全てにおいてＴＲＡＰ染色の強度が低下し、破骨細胞の活性化抑制効果が確認された。具体的には、陰性対照である試験１対比、約３倍程度のＩｎｔＤｅｎ値を示したプレドニゾロン群（試験２）に対し、アレンドロネート群（試験３）は、試験２よりも小さいＩｎｔＤｅｎ値を示し、一定の改善効果が見られた。それに対し、ショウガ抽出物群である試験４および試験５のＩｎｔＤｅｎ値は、試験１とほぼ同等の値まで低下し、試験３よりも大きな破骨細胞の活性化抑制効果を示した。また、１０－ジンゲロール群の試験６～試験８のＩｎｔＤｅｎ値は、試験４および試験５よりもさらに小さいことを確認した。上記のとおり、ショウガ抽出物および１０－ジンゲロールは、微量でも顕著な効果を示したことから、生体に対しても優れた骨代謝改善効果を発現することが分かった。

【産業上の利用可能性】

【0052】

本発明の骨代謝改善組成物は、特定の成分を含有することにより骨吸収抑制作用を有するので、骨粗鬆症の予防および改善に用いることができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】