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特許7541390免疫チェックポイント分子と結合可能な分子が融合したタンパク質およびその用途

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-08-20

(45)【発行日】2024-08-28

(54)【発明の名称】免疫チェックポイント分子と結合可能な分子が融合したタンパク質およびその用途

(51)【国際特許分類】

C07K 19/00 20060101AFI20240821BHJP

C07K 16/28 20060101ALI20240821BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20240821BHJP

A61K 47/64 20170101ALI20240821BHJP

A61K 39/395 20060101ALI20240821BHJP

C12N 15/12 20060101ALN20240821BHJP

C12N 15/62 20060101ALN20240821BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00 ZNA

C07K16/28

A61P35/00

A61K47/64

A61K39/395 T

C12N15/12

C12N15/62 Z

【請求項の数】 17

(21)【出願番号】P 2022525447

(86)(22)【出願日】2020-11-02

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-01-05

(86)【国際出願番号】 KR2020015165

(87)【国際公開番号】W WO2021086159

(87)【国際公開日】2021-05-06

【審査請求日】2022-04-28

(31)【優先権主張番号】10-2019-0138580

(32)【優先日】2019-11-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2020-0144637

(32)【優先日】2020-11-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】519367980

【氏名又は名称】セレメディーカンパニー，リミテッド

【住所又は居所原語表記】Ｈ４３０１，４ｔｈＦｌｏｏｒ，ＢｕｎｄａｎｇＳｅｏｕｌＮａｔｉｏｎａｌＵｎｉｖ．ＨｏｓｐｉｔａｌＨＩＰ，１７２Ｄｏｌｍａ－ｒｏ，Ｂｕｎｄａｎｇ－ｇｕ，Ｓｅｏｎｇｎａｍ－ｓｉ，Ｇｙｅｏｎｇｇｉ－ｄｏ１３６０５ＲｅｐｕｂｌｉｃｏｆＫｏｒｅａ

(74)【代理人】

【識別番号】100137095

【弁理士】

【氏名又は名称】江部武史

(74)【代理人】

【識別番号】100091627

【弁理士】

【氏名又は名称】朝比一夫

(72)【発明者】

【氏名】リ，ジェウォン

(72)【発明者】

【氏名】リ，ボラム

(72)【発明者】

【氏名】ユン，チュルジュ

【審査官】田ノ上拓自

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１９／０２５５１８９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】韓国公開特許第１０－２０１５－００８８５９７（ＫＲ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１９／０２１６９４７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１６／００６０３０７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１９／１６３８７１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】NATURE COMMUNICATIONS, 2019年3月，Vol.10，1121 (p.1-8)，https://doi.org/10.1038/s41467-019-09098-w

【文献】ZHANG, Yu and ORNER, Brendan P.，Self-Assembly in the Ferritin Nano-Cage Protein Superfamily，Int. J. Mol. Sci.，2011年08月22日，Vol.12，p.5406-5421

【文献】KIM, Sooji et al.，Designing Peptide Bunches on Nanocage for Bispecific or Superaffinity Targeting，Biomacromolecules，2016年02月22日，Vol.17，p.1150-1159

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ１／００－１９／００

Ａ６１Ｐ３５／００

Ａ６１Ｋ４７／６２

Ａ６１Ｋ３９／３９５

Ｃ１２Ｎ１５／００－１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

外表面に免疫チェックポイント分子と結合可能な分子が融合したフェリチンタンパク質複合体であって、
前記フェリチンはヒトフェリチン重鎖であり、
前記タンパク質複合体を構成するフェリチン単量体の少なくとも一つが、配列番号１の配列において８１番及び８３番アミノ酸がアラニンで置換されたものである、タンパク質複合体。

【請求項2】

前記免疫チェックポイント分子と結合可能な分子が融合したフェリチン単量体２４個が自己集合してなる、請求項１に記載の球状タンパク質複合体。

【請求項3】

前記免疫チェックポイント分子と結合可能な分子は、フェリチン単量体の隣接するαヘリックスの間の少なくとも一つに融合する、請求項１に記載のタンパク質複合体。

【請求項4】

前記免疫チェックポイント分子と結合可能な分子は、フェリチン単量体のＮ末端またはＣ末端に融合する、請求項１に記載のタンパク質複合体。

【請求項5】

前記免疫チェックポイント分子と結合可能な分子は、フェリチン単量体のＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループまたはＤＥループに融合する、請求項１に記載のタンパク質複合体。

【請求項6】

前記免疫チェックポイント分子と結合可能な分子は、フェリチン単量体のＮ末端とＡヘリックスの間、またはＥヘリックスとＣ末端の間に融合する、請求項１に記載のタンパク質複合体。

【請求項7】

トランスフェリン受容体への結合力（Ｋ）が下記数学式１を満たす、請求項１に記載のタンパク質複合体。

【数1】

（式中、Ｋ＝［Ｐ］［Ｔ］／［ＰＴ］であり、ここで、［Ｐ］は前記タンパク質複合体と前記トランスフェリン受容体との結合反応の平衡状態における前記タンパク質複合体の濃度を示し、［Ｔ］は前記平衡状態における前記トランスフェリン受容体の濃度を示し、［ＰＴ］は、前記平衡状態における前記タンパク質複合体と前記トランスフェリン受容体の複合体の濃度を示す。）

【請求項8】

前記トランスフェリン受容体は、ヒトトランスフェリン受容体である、請求項７に記載のタンパク質複合体。

【請求項9】

前記免疫チェックポイント分子は、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、ＶＩＳＴＡ、４－１ＢＢＬ、ガレクチン９（Galectin－9）、アデノシンＡ２ａ受容体（Adenosine A2a receptor）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＢＴＬＡ、ＯＸ－４０Ｌ、ＣＤ１５５、ＢＣＬ２、ＭＹＣ、ＰＰ２Ａ、ＢＲＤ１、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＢＲＤＴ、ＣＢＰ、Ｅ２Ｆ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭＸ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＭ１Ｄ、ＳＴＡＴ３、ＩＤＨ１、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＳＬＡＭＦ７、４－１ＢＢ、ＯＸ－４０、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＩＣＡＭ－１、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＬＡＩＲ１、２Ｂ４、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ２０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＣＤ５２、ＥＧＦＲファミリー、ＡＸＬ、ＣＳＦ１Ｒ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＥＰＨ受容体ファミリー、ＦＧＦＲファミリー、ＶＥＧＦＲファミリー、ＩＧＦ１Ｒ、ＬＴＫ、ＰＤＧＦＲファミリー、ＲＥＴ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＮＴＲＫ１およびＮＴＲＫ２からなる群より選択されるいずれか一つである、請求項１に記載のタンパク質複合体。

【請求項10】

前記免疫チェックポイント分子と結合可能な分子は、前記免疫チェックポイント分子に対するリガンド、抗体、またはその断片である、請求項１に記載のタンパク質複合体。

【請求項11】

前記タンパク質複合体は、大腸菌生産システムにおいて水溶性画分の割合が４０％以上で存在する、請求項１に記載のタンパク質複合体。

【請求項12】

請求項１～１１のいずれか一項に記載のタンパク質複合体を含む癌の治療または予防用薬学組成物。

【請求項13】

前記癌は、脳癌、頭頸部癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、白血病、肺癌、肝癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、血管腫瘍、扁平細胞癌種、腺癌種、小細胞癌種、黒色腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、肉腫、喉頭癌、耳下腺癌、胆道癌、甲状腺癌、日光角化症、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、腺様嚢胞癌、腺腫、腺扁平上皮癌腫、肛門管癌、肛門癌、肛門直腸癌、星細胞腫、バルトリン腺癌、基底細胞癌腫、胆汁癌、骨癌、骨髄癌、気管支癌、気管支腺癌腫、カルチノイド、胆管癌腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、淡明細胞癌腫、結合組織癌、嚢腺腫、消化器系癌、十二指腸癌、内分泌系癌、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮内膜様腺癌、内皮細胞癌、上衣腫、上皮細胞癌、眼窩癌、局所性結節性過形成、胆嚢癌、幽門洞癌、胃基底部癌、ガストリノーマ、膠芽腫、グルカゴノーマ、心臓癌、血管芽細胞腫、血管内皮腫、血管腫、肝腺腫、肝腺腫症、肝胆道癌、肝細胞癌腫、ホジキン病、回腸癌、インスリノーマ、上皮内新生物、上皮内扁平細胞新生物、肝内胆道癌、浸潤性扁平細胞癌腫、空腸癌、関節癌、骨盤癌、巨細胞癌腫、大腸癌、リンパ腫、悪性中皮腫、髄芽腫、髄質上皮腫、脳膜癌、中皮癌、転移性癌腫、口腔癌、粘表皮癌、多発性骨髄腫、筋肉癌、鼻腔癌、神経系癌、非上皮皮膚癌、非ホジキンリンパ腫、燕麦細胞癌、乏突起膠腫、口腔癌、骨肉腫、漿液性乳頭状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、下垂体腫瘍、形質細胞性腫瘍、偽肉腫、肺芽腫、直腸癌、腎細胞癌腫、呼吸器系癌、網膜芽細胞腫、漿液性癌、副鼻腔癌、皮膚癌、小細胞癌、小腸癌、平滑筋肉腫、軟部組織癌、ソマトスタチノーマ、脊椎癌、扁平細胞癌、線条筋肉癌、中皮細胞下層癌、Ｔ細胞白血病、舌癌、尿管癌、尿道癌、子宮頸癌、子宮体癌、膣癌、ＶＩＰｏｍａ、外陰部癌、高分化癌、およびウィルムス腫瘍からなる群より選択される、請求項１２に記載の癌の治療または予防用薬学組成物。

【請求項14】

疾患抗原エピトープが融合したフェリチン単量体が自己集合してなり、トランスフェリン受容体への結合力（Ｋ）が下記数学式４を満たすタンパク質をさらに含む、請求項１２に記載の癌の治療または予防用薬学組成物。

【数2】

（式中、Ｋ＝［Ｐ］［Ｔ］／［ＰＴ］であり、ここで、［Ｐ］は前記タンパク質と前記トランスフェリン受容体との結合反応の平衡状態における前記タンパク質の濃度を示し、［Ｔ］は前記平衡状態における前記トランスフェリン受容体の濃度を示し、［ＰＴ］は、前記平衡状態における前記タンパク質と前記トランスフェリン受容体の複合体の濃度を示す。）

【請求項15】

前記疾患抗原エピトープは、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ－１、Ｍｅｌｎａ－Ａ、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ｃ２、マンマグロビンＡ（Mammaglobin－A）、プロテイナーゼ３（Proteinase－3）、ムシン１（Mucin－1）、ＨＰＶＥ６、ＬＭＰ２、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、ｈＴＥＲＴ、ＰＡＰ、ＥＲＧ、ＮＡ１７、ＡＬＫ、ＧＭ３、ＥＰｈＡ２、ＮＡ１７－Ａ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、サバイビン（Survivin）、ＡＨ１、ｒａｓ、Ｇ１７ＤＴ、ＭＵＣ１、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、Ｅ７５、ｐ５３、ＰＳＡ、ＨＣＧ、ＰＲＡＭＥ、ＷＴ１、ＵＲＬＣ１０、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、Ｅ７、チロシナーゼ（Tyrosinase）ペプチド、Ｂ１６Ｆ１０、ＥＬ４または新生抗原（neoantigen）である、請求項１２に記載の癌の治療または予防用薬学組成物。

【請求項16】

２種のタンパク質が併用投与されるための、請求項１４に記載の癌の治療または予防用薬学組成物。

【請求項17】

２種のタンパク質が同時、個別または順次投与される、請求項１４に記載の癌の治療または予防用薬学組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、免疫チェックポイント分子と結合可能な分子が融合したタンパク質およびその用途に関する。

【背景技術】

【0002】

現代の医学技術の発展により、治療不可能な病気はほとんどなくなったが、癌は他の病気とは異なり、非常に複雑で難しい治療が求められている。現在、癌の治療に使用されている方法には、大きく分けて手術、放射線治療および化学的治療がある。癌が他の部位に転移せずに局所で増殖する場合では切除治療が可能である。しかし、癌患者の７０％以上において癌転移が発生するため、補助的な治療方法を並行しなければならない。

【0003】

前記補助治療方法の一つとして、高エネルギー放射線を用いて癌細胞を殺す放射線治療法が行われている。前記放射線治療法は、癌細胞への放射線照射によって癌細胞の増殖を抑制し、新たな癌細胞の生成、癌細胞のさらなる分裂を防ぐ。しかし、この方法は、癌細胞だけでなく正常細胞にも影響を与えるという副作用が存在する問題がある。

【0004】

化学的治療法は、手術後に薬物を使用して癌細胞を殺す補助治療法であり、目に見えない癌細胞を殺す目的で行われる。しかし、前記化学的治療法は嘔吐、下痢、脱毛などの副作用が伴う問題がある。

【0005】

これらの副作用を最小限に抑えるために、最近では免疫治療法が注目されている。免疫治療法は、患者の免疫応答を利用して癌を治療する方法であり、癌の予防も図ることができる。癌免疫治療は、ワクチンの原理のように、腫瘍形成の原因となる抗原を投与して癌に特異的な免疫細胞を活性化させた後、活性化した免疫細胞に体内で癌を特異的に攻撃させる治療法である。また、癌にかかっていないとしても、癌に特異的な抗原を体内に投与することにより、不活性化の免疫細胞を癌特異的な記憶免疫細胞に活性化し、癌が発症したときに癌細胞を特異的に攻撃させる。

【0006】

癌免疫治療のためには、免疫細胞が密集しているリンパ節に癌特異的抗原（腫瘍関連抗原（Tumor－associated antigen；TAA）、腫瘍特異抗原（Tumor－specific antigen；TSA））を運ぶことが重要である。特に、腫瘍特異抗原の中でも、肺癌、腎臓癌などの様々な腫瘍種で発見され、主に黒色腫で発見される新生抗原（neo－antigen）は、癌患者個人の潜在的遺伝子の活性またはＤＮＡ部分の変異によって新たに生成される抗原であり、この抗原は患者個人の遺伝情報に基づいて「カスタマイズ型癌ワクチン」を製造する上で非常に重要である。

【0007】

しかし、癌特異的抗原自体のみをリンパ節に運ぶようとする従来の試みはあまり効果的ではなかった。腫瘍抗原自体だけでは腫瘍抗原の長さがやや短く、腫瘍抗原特異免疫細胞を増幅及び活性化するための腫瘍抗原提示効率が顕著に低く、腫瘍抗原特異免疫誘導効率も顕著に低かったためである（非特許文献１）。このような癌特異的抗原の体内送達体としては高分子が多用されている。癌特異的抗原の体内運搬のために高分子の表面に癌抗原を固定させる場合、粒子表面に癌特異的抗原を化学的結合によって露出しなければならない。しかし、粒子表面に癌特異的抗原を高密度で均一に露出させるには限界があるのが実情である。

【0008】

癌免疫治療は従来の抗癌治療方法と比較して、患者の免疫システムを利用するため副作用が少なく、免疫記憶形成によって治療効果が長期間持続でき、腫瘍抗原特異的認識の原理によって一般細胞には影響力が少なくて副作用がほとんどない利点がある。また、最近では再発性または抗癌剤抵抗性を有する癌患者を対象とする臨床の成功事例により、癌免疫治療はサイエンス（Science）誌によってブレークスルー・オブ・ザ・イヤー（Breakthrough of the year）２０１３に選定されるほどの爆発的な注目を浴びている。

【0009】

また、免疫チェックポイント因子であるＰＤ－１（Programmed cell death protein 1）／ＰＤ－Ｌ１（PD1 ligand）中和抗体治療剤の場合は、黒色腫および肺癌で反応率２０－３０％以上の臨床結果が導き出されており、癌免疫治療は、今後数年以内に癌の標準治療として臨床現場で使用される可能性が高い。しかし、免疫チェックポイント因子であるＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ４特異的な免疫活性抑制遮断抗体は、免疫細胞の活性自体を根本的に増強できず、抗体の長い体内残留時間および抗体のＦｃドメイン部分のために発生する自己免疫疾患などの副作用が生じ、動物細胞系の抗体製造および精製による生産コストの増加に加えて、高い消耗量により抗体治療コストが高く、経済面での欠点も存在するのが実情である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明は、免疫チェックポイント分子に結合できる新規なタンパク質を提供することを目的とする。

【0011】

本発明は、免疫チェックポイント分子がＴ細胞を不活性化させないようにして、Ｔ細胞が癌細胞を死滅できるようにする新規なタンパク質を提供することを目的とする。

【0012】

本発明は、前記の新規なタンパク質を含む癌の予防または治療用薬学組成物を提供することを目的とする。

【0013】

本発明は、前記の新規なタンパク質を含む癌の治療方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0014】

本発明は、外表面に免疫チェックポイント分子と結合可能な分子が融合したフェリチンタンパク質を提供する。

【0015】

本発明のタンパク質は、前記免疫チェックポイント分子と結合可能な分子が融合したフェリチン単量体２４個が自己集合してなる球状タンパク質であってもよい。

【0016】

本発明において、前記免疫チェックポイント分子と結合可能な分子は、フェリチン単量体の隣接するαヘリックスの間の少なくとも一つに融合することができる。

【0017】

本発明において、前記免疫チェックポイント分子と結合可能な分子は、フェリチン単量体のＮ末端またはＣ末端に融合することができる。

【0018】

本発明において、前記免疫チェックポイント分子と結合可能な分子は、フェリチン単量体のＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループまたはＤＥループに融合することができる。

【0019】

本発明において、前記免疫チェックポイント分子と結合可能な分子は、フェリチン単量体のＮ末端とＡヘリックスの間、またはＥヘリックスとＣ末端の間に融合することができる。

【0020】

本発明のタンパク質は、ヒトトランスフェリン受容体への結合力が減少するように突然変異したものであってもよい。

【0021】

本発明のタンパク質は、それを構成するフェリチン単量体の少なくとも一つが、配列番号１の配列において１４番、１５番、２２番、８１番または８３番アミノ酸がアラニン、グリシン、バリンまたはロイシンで置換されたものであってもよい。

【0022】

本発明のフェリチンタンパク質は、トランスフェリン受容体への結合力（Ｋ）が下記数学式１を満たすことができる。

【0023】

【数1】

【0024】

（式中、Ｋ＝［Ｐ］［Ｔ］／［ＰＴ］であり、ここで、［Ｐ］は、フェリチンタンパク質とトランスフェリン受容体との結合反応の平衡状態におけるフェリチンタンパク質の濃度を示し、［Ｔ］は、前記平衡状態におけるトランスフェリン受容体の濃度を示し、［ＰＴ］は、前記平衡状態におけるフェリチンタンパク質とトランスフェリン受容体の複合体の濃度を示す。）

【0025】

本発明における前記トランスフェリン受容体への結合力は、ヒトトランスフェリン受容体への結合力であってもよい。

【0026】

本発明において、前記免疫チェックポイント分子は、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、ＶＩＳＴＡ、４－１ＢＢＬ、ガレクチン９（Galectin－9）、アデノシンＡ２ａ受容体（Adenosine A2a receptor）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＢＴＬＡ、ＯＸ－４０Ｌ、ＣＤ１５５、ＢＣＬ２、ＭＹＣ、ＰＰ２Ａ、ＢＲＤ１、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＢＲＤＴ、ＣＢＰ、Ｅ２Ｆ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭＸ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＭ１Ｄ、ＳＴＡＴ３、ＩＤＨ１、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＳＬＡＭＦ７、４－１ＢＢ、ＯＸ－４０、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＩＣＡＭ－１、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＬＡＩＲ１、２Ｂ４、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ２０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＣＤ５２、ＥＧＦＲファミリー、ＡＸＬ、ＣＳＦ１Ｒ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＥＰＨ受容体ファミリー、ＦＧＦＲファミリー、ＶＥＧＦＲファミリー、ＩＧＦ１Ｒ、ＬＴＫ、ＰＤＧＦＲファミリー、ＲＥＴ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＮＴＲＫ１およびＮＴＲＫ２からなる群より選択されるいずれか一つであってもよい。

【0027】

本発明において、前記免疫チェックポイント分子と結合可能な分子は、前記免疫チェックポイント分子に対するリガンド、抗体、またはその断片であってもよい。

【0028】

本発明において、フェリチンはヒトフェリチン重鎖であってもよい。

【0029】

本発明のフェリチンタンパク質は、大腸菌生産システムにおいて４０％以上が水溶性画分として存在してもよい。

【0030】

本発明は、本発明のフェリチンタンパク質を含む癌の治療または予防用薬学組成物を提供する。

【0031】

本発明の薬学組成物は、脳癌、頭頸部癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、白血病、肺癌、肝癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、血管腫瘍、扁平細胞癌種、腺癌種、小細胞癌種、黒色腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、肉腫、喉頭癌、耳下腺癌、胆道癌、甲状腺癌、日光角化症、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、腺様嚢胞癌、腺腫、腺扁平上皮癌腫、肛門管癌、肛門癌、肛門直腸癌、星細胞腫、バルトリン腺癌、基底細胞癌腫、胆汁癌、骨癌、骨髄癌、気管支癌、気管支腺癌腫、カルチノイド、胆管癌腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、淡明細胞癌腫、結合組織癌、嚢腺腫、消化器系癌、十二指腸癌、内分泌系癌、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮内膜様腺癌、内皮細胞癌、上衣腫、上皮細胞癌、眼窩癌、局所性結節性過形成、胆嚢癌、幽門洞癌、胃基底部癌、ガストリノーマ、膠芽腫、グルカゴノーマ、心臓癌、血管芽細胞腫、血管内皮腫、血管腫、肝腺腫、肝腺腫症、肝胆道癌、肝細胞癌腫、ホジキン病、回腸癌、インスリノーマ、上皮内新生物、上皮内扁平細胞新生物、肝内胆道癌、浸潤性扁平細胞癌腫、空腸癌、関節癌、骨盤癌、巨細胞癌腫、大腸癌、リンパ腫、悪性中皮腫、髄芽腫、髄質上皮腫、脳膜癌、中皮癌、転移性癌腫、口腔癌、粘表皮癌、多発性骨髄腫、筋肉癌、鼻腔癌、神経系癌、非上皮皮膚癌、非ホジキンリンパ腫、燕麦細胞癌、乏突起膠腫、口腔癌、骨肉腫、漿液性乳頭状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、下垂体腫瘍、形質細胞性腫瘍、偽肉腫、肺芽腫、直腸癌、腎細胞癌腫、呼吸器系癌、網膜芽細胞腫、漿液性癌、副鼻腔癌、皮膚癌、小細胞癌、小腸癌、平滑筋肉腫、軟部組織癌、ソマトスタチノーマ、脊椎癌、扁平細胞癌、線条筋肉癌、中皮細胞下層癌、Ｔ細胞白血病、舌癌、尿管癌、尿道癌、子宮頸癌、子宮体癌、膣癌、ＶＩＰｏｍａ、外陰部癌、高分化癌、およびウィルムス腫瘍からなる群より選択されるいずれか一つの癌の治療または予防に使用することができる。

【0032】

本発明の薬学組成物は、疾患抗原エピトープが融合したフェリチン単量体が自己集合してなり、トランスフェリン受容体への結合力（Ｋ）が下記数学式４を満たすタンパク質をさらに含むことができる。

【0033】

【数2】

【0034】

（式中、Ｋ＝［Ｐ］［Ｔ］／［ＰＴ］であり、ここで、［Ｐ］は、前記タンパク質と前記トランスフェリン受容体との結合反応の平衡状態における前記タンパク質の濃度を示し、［Ｔ］は、前記平衡状態における前記トランスフェリン受容体の濃度を示し、［ＰＴ］は、前記平衡状態における前記タンパク質と前記トランスフェリン受容体の複合体の濃度を示す。）

【0035】

本発明における疾患抗原エピトープは、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ－１、Ｍｅｌｎａ－Ａ、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ｃ２、マンマグロビンＡ（Mammaglobin－A）、プロテイナーゼ３（Proteinase－3）、ムシン１（Mucin－1）、ＨＰＶＥ６、ＬＭＰ２、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、ｈＴＥＲＴ、ＰＡＰ、ＥＲＧ、ＮＡ１７、ＡＬＫ、ＧＭ３、ＥＰｈＡ２、ＮＡ１７－Ａ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、サバイビン（Survivin）、ＡＨ１、ｒａｓ、Ｇ１７ＤＴ、ＭＵＣ１、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、Ｅ７５、ｐ５３、ＰＳＡ、ＨＣＧ、ＰＲＡＭＥ、ＷＴ１、ＵＲＬＣ１０、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、Ｅ７、チロシナーゼ（Tyrosinase）ペプチド、Ｂ１６Ｆ１０、ＥＬ４または新生抗原（neoantigen）であってもよい。

【0036】

本発明の薬学組成物は、前記２種のタンパク質が併用投与されるためのものであってもよい。

【0037】

本発明の薬学組成物は、２種のタンパク質が同時、個別または順次投与されるものであってもよい。

【図面の簡単な説明】

【0038】

【図1】図１のＡは、腫瘍抗原が発現した本発明のタンパク質を製造するための発現ベクターの模式図を示し、図１のＢは、製造されたタンパク質の構造を示す。

【図2】図２は、本発明により製造されたｇｐ１００－ｈｕＨＦナノ粒子の表面の腫瘍抗原とトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）との結合位置を示す模式図である。

【図3】図３は、本発明のｇｐ１００－ｈｕＨＦタンパク質のＴＥＭ画像およびＤＬＳの結果を示す。

【図4】図４は、本発明のｇｐ１００－ｈｕＨＦタンパク質とトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）との結合能を測定した結果である。

【図5】図５は、ＰＤ－Ｌ１と結合可能なＰＤ１ドメインが挿入された免疫チェックポイント抑制剤（ｈｕＨＦ－ＰＤ１タンパク質）を製造するための発現ベクターの模式図；ｇｐ１００－ｈｕＨＦタンパク質の構造；本発明のｇｐ１００－ｈｕＨＦタンパク質のＴＥＭ画像；本発明のｇｐ１００－ｈｕＨＦタンパク質の直径分布図；および、ｈｕＨＦ－ＰＤ１タンパク質とＰＤ１リガンド（ＰＤ－Ｌ１）、ｈｕＨＦ－ＴＰＰ１（AB loop、CD loop）およびαＰＤ－Ｌ１ＨＣＤＲ３（CD loop、Ｃ末端）との結合能を測定した結果を示す。

【図6】図６は、本発明のタンパク質の樹状細胞による細胞取込（cellular uptake）の結果を示す。

【図7a】図７ａは、ｈｕＨＦタンパク質とｈｕＨＦ－ＰＤ１タンパク質の癌細胞ＣＴ－２６およびＢ１６Ｆ１０に対するターゲティング効率を蛍光画像で比較したものである。

【図7b】図７ｂは、ｈｕＨＦタンパク質とｈｕＨＦ－αＰＤ－Ｌ１ＨＣＤＲ３（CD loop、Ｃ末端）のＣＴ－２６細胞に対するターゲティング効率を蛍光画像で比較したものである。

【図7c】図７ｃは、ｈｕＨＦタンパク質とｈｕＨＦ－ＴＰＰ１、ｈｕＨＦ－ｓｍＰＤ１のＣＴ－２６細胞に対するターゲティング効率を蛍光画像で比較したものである。

【図8】図８は、ｇｐ１００－ｈｕＨＦのリンパ節への送達効率を確認した結果である。

【図9】図９は、ｈｕＨＦ、ＰＤ－Ｌ１抗体およびｈｕＨＦ－ＰＤ１タンパク質の癌細胞ＣＴ－２６に対する癌ターゲティング効率を比較した結果である。相対蛍光強度の各臓器における棒グラフは、左からｈｕＨＦ、α－ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ１－ｈｕＨＦの結果を示す。

【図10】図１０は、ｇｐ１００－ｈｕＨＦタンパク質におけるｇｐ１００の挿入位置による免疫効率を比較した結果である。各グループの棒グラフは、左がｗｉｔｈｏｕｔｇｐ１００、右がｗｉｔｈｇｐ１００の結果である。

【図11】図１１のＡは、ＯＶＡ－ｈｕＨＦタンパク質が抗原提示細胞のＯＶＡペプチド抗原提示を増加させることができるかをＦＡＣＳ（flow cytometry）により確認した結果である。図１１のＢは、前記タンパク質のＤＣ成熟マーカー（maturation marker）の発現程度を確認した結果である。Ｂの各グループの棒グラフは、左からＭＨＣ－ＩＩ、ＣＤ８０、ＣＤ４０、ＣＤ８６の結果を示す。

【図12】図１２は、ｇｐ１００－ｈｕＨＦタンパク質の腫瘍抗原抑制能を確認するための実験方法の模式図と実験結果を示す。

【図13】図１３は、ｈｕＨＦ－ＰＤ１タンパク質のＣＴ２６（大腸癌細胞）とＢ１６Ｆ１０（黒色腫細胞）における腫瘍形成抑制効果を動物モデルで確認するための実験方法の模式図と実験結果を示す。

【図14】図１４は、ｈｕＨＦ－ＰＤ１タンパク質とｇｐ１００－ｈｕＨＦおよびＡＨ１－ｈｕＨＦタンパク質の併用治療効果によるＣＴ２６（大腸癌細胞）とＢ１６Ｆ１０（黒色腫細胞）における腫瘍形成抑制効果を動物モデルで確認するための実験方法の模式図と実験結果を示す。

【図15】図１５のＡは、ＰＤ－Ｌ１抗体とｈｕＨＦ－ＰＤ１タンパク質の癌細胞ＣＴ２６およびＢ１６Ｆ１０におけるＴ細胞媒介細胞死効率を比較したものである。図１５のＢは、ＰＤ－Ｌ１抗体とｈｕＨＦ－ＰＤ１タンパク質の癌細胞ＣＴ２６およびＢ１６Ｆ１０におけるＴ細胞活性反応を比較したものである。図１５のＣは、ＡＨ１－ｈｕＨＦタンパク質、ｇｐ１００－ｈｕＨＦタンパク質、およびｈｕＨＦ－ＰＤ１の併用治療による、各腫瘍抗原に対するＴ細胞活性反応を示す。

【図16】図１６は、従来の抗体治療剤との免疫副作用の誘発を確認した結果である。

【図17】図１７は、ＡＨ１－ｈｕＨＦタンパク質及び／又はｈｕＨＦ－ＰＤ１タンパク質の処理によるＣＴ２６（大腸癌細胞）における腫瘍再発抑制の結果を示す。

【図18】図１８は、ｈｕＨＦ－ＰＤ１タンパク質の腫瘍ｒｅｃｈａｌｌｅｎｇｅ後の腫瘍形成抑制を誘導するためのＴ細胞活性を測定するために、実験群マウスの体内でＴ細胞を抽出して検証した結果である。左から、ＰＢＳ、ＡＨ１－ｈｕＨＦ、α－ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ１－ｈｕＨＦ、ＡＨ１－ｈｕＨＦ＋α－ＰＤ－Ｌ１、ＡＨ１－ｈｕＨＦ＋ＰＤ１－ｈｕＨＦの結果である。

【図19】図１９は、ＮＡ－ｇｐ１００－ｈｕＨＦを製造するためのベクター模式図、およびそのタンパク質の製造を確認したものである。

【図20】図２０は、ＥＣ－ｇｐ１００－ｈｕＨＦを製造するためのベクター模式図、およびそのタンパク質の製造を確認したものである。

【図21】図２１は、Ｄ_ｉｎ－ｇｐ１００－ｈｕＨＦを製造するためのベクター模式図、およびそのタンパク質の製造を確認したものである。

【図22】図２２は、Ｅｉｎ０ｇｐ１００－ｈｕＨＦを製造するためのベクター模式図、およびそのタンパク質の製造を確認したものである。

【図23】図２３は、ｍｓｍＰＤ１－ｈｕＨＦを製造するためのベクター模式図、およびそのタンパク質の製造を確認したものである。

【図24】図２４は、ＰＤ１－ｈｕＨＦの腫瘍抑制能を確認したものである。

【図25】図２５は、ｈｕＨＦ－ＰＤ－Ｌ１－ＴＩＧＩＴデュアルブロッカー（dual blocker）の腫瘍抑制能を評価するためのスケジュールである。

【図26】図２６は、ｈｕＨＦ－ＰＤ－Ｌ１－ＴＩＧＩＴデュアルブロッカーの腫瘍抑制能の評価結果である。

【図27】図２７は、ｈｕＨＦ－ＰＤ－Ｌ１－ＴＩＧＩＴデュアルブロッカーの腫瘍抑制能の評価結果である。

【図28】図２８は、ｈｕＨＦ－α－ＰＤ－Ｌ１ＨＣＤＲ３のフェリチン単量体の結合位置によるターゲティング能を評価したものである。

【図29】図２９は、ｈｕＨＦ－α－ＰＤ－Ｌ１ＨＣＤＲ３のフェリチン単量体の結合位置によるターゲティング能を評価したものである。

【図30】図３０は、ｈｕＨＦ－αＰＤ－Ｌ１ＨＣＤＲ３のベクター模式図およびそのタンパク質の製造および自己集合の有無を確認したものである。

【図31】図３１は、ｈｕＨＦ－αＰＤ１ＨＣＤＲ３のベクター模式図およびそのタンパク質の製造および自己集合の有無を確認したものである。

【図32】図３２は、ｈｕＨＦ－αＣＴＬＡ４ＨＣＤＲ３のベクター模式図およびそのタンパク質の製造および自己集合の有無を確認したものである。

【図33】図３３は、ｈｕＨＦ－αＴＩＧＩＴＨＣＤＲ３のベクター模式図およびそのタンパク質の製造および自己集合の有無を確認したものである。

【図34】図３４は、ｈｕＨＦ－αＬＡＧ３ＨＣＤＲ３のベクター模式図およびそのタンパク質の製造および自己集合の有無を確認したものである。

【図35】図３５は、ｈｕＨＦ－αＴＩＭ３ＨＣＤＲ３のベクター模式図およびそのタンパク質の製造および自己集合の有無を確認したものである。

【図36】図３６は、ｈｕＨＦ－αＰＤ－Ｌ１－αＴＩＧＩＴのベクター模式図およびそのタンパク質の製造および自己集合の有無を確認したものである。

【発明を実施するための形態】

【0039】

本発明は、外表面に免疫チェックポイント分子と結合可能な分子が融合したフェリチンタンパク質（タンパク質Ａ）に関するものである。

【0040】

フェリチン（Ferritin）は、ヒト、動物および微生物由来のフェリチンであってもよい。

【0041】

ヒトフェリチンは、重鎖（heavy chain、21kDa）と軽鎖（light chain、19kDa）で構成され、前記フェリチンを成している単量体の自己集合能によって球状のナノ粒子を形成する特性を示す。フェリチンは、２４個の単量体が集まって球状の立体構造を有する自己集合体を形成することができる。

【0042】

ヒトフェリチンの場合は、外径が約１２ｎｍ、内径が約８ｎｍである。フェリチン単量体の構造は、５つのαヘリックス構造、すなわちＡヘリックス、Ｂヘリックス、Ｃヘリックス、ＤヘリックスおよびＥヘリックスが順次連結された形態であり、ループ（loop）と呼ばれる各々のαヘリックス構造のポリペプチドを連結する非定型ポリペプチド部分を含む。

【0043】

ループは、フェリチンにペプチドまたは小さいタンパク質抗原などが挿入されても構造的に壊れない領域（region）である。ここにペプチドを、クローニングを用いて融合させることにより、フェリチンの単量体にエピトープなどのペプチドが位置するペプチド－フェリチン融合タンパク質単量体を製造することができる。ＡヘリックスとＢヘリックスを連結するループをＡＢループ、ＢヘリックスとＣヘリックスを連結するループをＢＣループ、ＣヘリックスとＤヘリックスを連結するループをＣＤループ、ＤヘリックスとＥヘリックスを連結するループをＤＥループとする。

【0044】

フェリチンの情報はＮＣＢＩに公知になっている（GenBank Accession No．NM_000146、NM_002032など）。

【0045】

フェリチンはフェリチン重鎖であってもよく、具体的にはヒトフェリチン重鎖であってもよい。ヒトフェリチン重鎖は、ヒトに由来する配列番号１のアミノ酸配列で示されるタンパク質であってもよい。本明細書で前記フェリチンは「ヒトフェリチン重鎖」または「ｈｕＨＦ」と混用して用いられる。

【0046】

フェリチンは、その単量体のいくつかが自己集合して、組織的な構造またはパターンを形成する。本発明のフェリチンタンパク質はナノスケールの粒子である。例えば、免疫チェックポイント分子と結合可能な分子が融合したフェリチン単量体２４個が自己集合し、フェリチンタンパク質を形成することができる。

【0047】

本発明のフェリチンタンパク質（タンパク質Ａ）は球状であってもよい。球状の場合、例えばその粒径は８～５０ｎｍであってもよい。より具体的には、８ｎｍ～５０ｎｍ、８ｎｍ～４５ｎｍ、８ｎｍ～４０ｎｍ、８ｎｍ～３５ｎｍ、８ｎｍ～３０ｎｍ、８ｎｍ～２５ｎｍ、８ｎｍ～２０ｎｍ、８ｎｍ～１５ｎｍであってもよい。

【0048】

本発明のフェリチンタンパク質（タンパク質Ａ）は、外表面に免疫チェックポイント分子と結合可能な分子が融合したものである。フェリチンタンパク質の外表面に免疫チェックポイント分子と結合可能な分子が融合していれば、フェリチンタンパク質をなす全てのフェリチン単量体に免疫チェックポイント分子と結合可能な分子が融合している必要はない。

【0049】

例えば、免疫チェックポイント分子と結合可能な分子が融合したフェリチン単量体２４個が自己集合してフェリチンタンパク質（タンパク質Ａ）を形成するとき、２４個のフェリチン単量体のうちの少なくとも１個のフェリチン単量体に免疫チェックポイント分子と結合可能な分子が融合していればよい。フェリチンタンパク質の外表面の免疫チェックポイント分子と結合可能な分子の密度を高めるために、２４個のフェリチン単量体のすべてに免疫チェックポイント分子と結合可能な分子を融合することができる。

【0050】

フェリチンタンパク質（タンパク質Ａ）をなす各フェリチン単量体には、免疫チェックポイント分子と結合可能な分子を１種または２種以上融合することができる。フェリチンタンパク質をなす各フェリチン単量体は、互いに異なる免疫チェックポイント分子と結合可能な分子が融合していてもよい。フェリチンタンパク質をなす各フェリチン単量体は、同じ免疫チェックポイント分子と結合可能な互いに異なる分子が融合していてもよい。

【0051】

免疫チェックポイント分子（Immune checkpoint molecule）は、Ｔ細胞に結合してＴ細胞を不活性化させる役割を果たす。このような免疫チェックポイント分子は、例えば、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、ＶＩＳＴＡ、４－１ＢＢＬ、ガレクチン９（Galectin－9）、アデノシンＡ２ａ受容体（Adenosine A2a receptor）、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＢＴＬＡ、ＯＸ－４０Ｌ、ＣＤ１５５、ＢＣＬ２、ＭＹＣ、ＰＰ２Ａ、ＢＲＤ１、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＢＲＤＴ、ＣＢＰ、Ｅ２Ｆ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭＸ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＭ１Ｄ、ＳＴＡＴ３、ＩＤＨ１、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＳＬＡＭＦ７、４－１ＢＢ、ＯＸ－４０、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＩＣＡＭ－１、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＬＡＩＲ１、２Ｂ４、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ２０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＣＤ５２、ＥＧＦＲファミリー、ＡＸＬ、ＣＳＦ１Ｒ、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＥＰＨ受容体ファミリー、ＦＧＦＲファミリー、ＶＥＧＦＲファミリー、ＩＧＦ１Ｒ、ＬＴＫ、ＰＤＧＦＲファミリー、ＲＥＴ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２などであってもよい。

【0052】

免疫チェックポイント分子と結合可能な分子は、免疫チェックポイント分子に対するリガンド、抗体、またはそれらの断片であってもよい。

【0053】

免疫チェックポイント分子と結合可能な分子は、フェリチンタンパク質の外表面に露出することができれば、フェリチン単量体のどこに融合してもよい。免疫チェックポイント分子と結合可能な分子は、フェリチン単量体の自己集合を阻害しない位置に融合する。

【0054】

免疫チェックポイント分子と結合可能な分子がフェリチン単量体の内部に融合し、フェリチンタンパク質の構造が変化し得る。フェリチン単量体の各構成部分のうち、内側に入り込んだ部分は、免疫チェックポイント分子と結合可能な分子の融合によって外側に突出することができ、逆に、フェリチン単量体の各構成部分のうち、外側に突出していた部分は、免疫チェックポイント分子と結合可能な分子の融合によって内側に入り込むことができる。

【0055】

免疫チェックポイント分子と結合可能な分子は、フェリチンタンパク質（タンパク質Ａ）がヒトトランスフェリン受容体との結合力を減少させるか、またはヒトトランスフェリン受容体との結合力を阻害する位置に融合することが好ましい。

【0056】

免疫チェックポイント分子と結合可能な分子は、その構造、分子量およびアミノ酸の長さを特定の範囲に限定しない。

【0057】

免疫チェックポイント分子と結合可能な分子は、例えば、そのアミノ酸の長さが２５ａａ以下のリガンド、抗体、またはそれらの断片であってもよい。より具体的には、アミノ酸の長さが２５ａａ以下、２４ａａ以下、２３ａａ以下、２２ａａ以下、２１ａａ以下、２０ａａ以下、１９ａａ以下、１８ａａ以下、１７ａａ以下、１６ａａ以下、１５ａａ以下、１４ａａ以下、１３ａａ以下、１２ａａ以下、１１ａａ以下、１０ａａ以下、９ａａ以下、８ａａ以下、７ａａ以下、６ａａ以下、５ａａ以下であってもよい。また、例えば、そのアミノ酸の長さが３ａａ以上、４ａａ以上、５ａａ以上、６ａａ以上、７ａａ以上、８ａａ以上、９ａａ以上、１０ａａ以上であってもよい。

【0058】

免疫チェックポイント分子と結合可能な分子の融合位置は、特定の位置に限定されず、例えば、フェリチン単量体の隣接するαヘリックスの間、Ｎ末端、Ｃ末端、ＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループ、ＤＥループ、Ｎ末端とＡヘリックスの間、ＥヘリックスとＣ末端の間、ヘリックス内部などに融合することができる。

【0059】

本発明のフェリチンタンパク質（タンパク質Ａ）は免疫チェックポイント分子と結合するように設計されているので、トランスフェリン受容体に対しては良好に結合しないことが好ましい。例えば、本発明のフェリチンタンパク質は、トランスフェリン受容体に対して下記数学式１を満たす。

【0060】

【数3】

【0061】

【0062】

前記結合力は、例えば、ヒトトランスフェリン受容体への結合力であってもよい。

【0063】

数学式１のＫの値が、１００ｎＭ以上、１１０ｎＭ以上、１２０ｎＭ以上、１２５ｎＭ以上、１２５ｎＭ超え、１５０ｎＭ以上、２００ｎＭ以上、２１０ｎＭ以上、２２０ｎＭ以上、２３０ｎＭ以上、２４０ｎＭ以上、２５０ｎＭ以上、２６０ｎＭ以上、２７０ｎＭ以上、２８０ｎＭ以上、２９０ｎＭ以上、３００ｎＭ以上、３５０ｎＭ以上、４００ｎＭ以上、４５０ｎＭ以上、５００ｎＭ以上、５５０ｎＭ以上、６００ｎＭ以上、７００ｎＭ以上、８００ｎＭ以上、９００ｎＭ以上、１０００ｎＭ以上である。数学式１のＫの値が大きいほど、トランスフェリン受容体への結合力が減少することを意味する。

【0064】

トランスフェリン受容体への結合力（Ｋ）は、本発明のフェリチンタンパク質（Ａ）とトランスフェリン受容体との結合反応の平衡状態で測定される。平衡状態におけるフェリチンタンパク質の濃度（［Ｐ］）、トランスフェリン受容体の濃度（［Ｔ］）、および本発明のタンパク質とトランスフェリン受容体の複合体の濃度（［ＰＴ］）は、公知の様々な方法で測定できる。

【0065】

トランスフェリン受容体への結合力（Ｋ）は、例えばＭＳＴ（Microscale Thermophoresis）法で測定できる。ＭＳＴ測定装置としては、ＭｏｎｏｌｉｔｈＮＴ．１１５がある。

【0066】

数学式１の濃度は、下記の数学式２および３を利用して得られたものであってもよい。

【0067】

【数4】

【0068】

（式中、［ＰＴ］は、フェリチンタンパク質とトランスフェリン受容体の複合体の反応平衡状態における濃度、Ｐ_０は、フェリチンタンパク質の初期濃度、Ｔ_０は、トランスフェリン受容体の初期濃度、［Ｐ］は、フェリチンタンパク質の反応平衡状態における濃度、［Ｔ］は、トランスフェリン受容体の反応平衡状態における濃度をそれぞれ示す。）

【0069】

【数5】

【0070】

（式中、［ＰＴ］は、フェリチンタンパク質とトランスフェリン受容体の複合体の反応平衡状態における濃度、Ｐ_０は、フェリチンタンパク質の初期濃度、Ｘは、フェリチンタンパク質における、トランスフェリン受容体と複合体をなすタンパク質の割合である。）

【0071】

本発明のフェリチンタンパク質（タンパク質Ａ）は、トランスフェリン受容体への結合力を低くするために、トランスフェリン受容体との結合に関与する部位に免疫チェックポイント分子と結合可能な分子を融合させることができる。例えば、本発明のフェリチンタンパク質のＢＣループおよびＡヘリックスの部分に免疫チェックポイント分子と結合可能な分子が位置するように前記分子を融合させることができる。

【0072】

本発明のフェリチンタンパク質（タンパク質Ａ）は、当該タンパク質をコードする配列を発現する微生物内で製造されるものであってもよい。

【0073】

微生物は、当該分野で公知の微生物を制限なく使用することができる。例えば、大腸菌であってもよく、具体的にはＢＬ２１（ＤＥ３）であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0074】

微生物系でタンパク質を製造する場合には、得られるタンパク質が細胞質に溶解した状態で存在する場合に分離／精製が容易である。多くの場合、製造されたタンパク質が封入体（inclusion body）などで凝集した状態で存在する。本発明のフェリチンタンパク質は、微生物生産システムにおいて細胞質に溶解した割合が高く示される。そのため、分離／精製および利用が容易である。

【0075】

本発明のフェリチンタンパク質（タンパク質Ａ）は、例えば、それを製造する大腸菌システムにおいて、全タンパク質における水溶性画分の割合が４０％以上の状態で製造できる。具体的には、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上であってもよい。その上限は、例えば１００％、９９％、９８％、９７％、９６％などであってもよい。

【0076】

本発明は、以上のフェリチンタンパク質（タンパク質Ａ）を含む癌の予防または治療用薬学組成物を提供する。以上のフェリチンタンパク質に関する全ての説明は、本発明の薬学組成物の有効成分としてのフェリチンタンパク質にそのまま適用される。

【0077】

本発明の薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。本発明で用語「薬学的に許容可能な担体」とは、生物体を非常に刺激せず、投与成分の生物学的活性および特性を阻害しない担体または希釈剤を指す。本発明における「薬学的に許容可能な担体」としては、生理食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝生理食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの成分のうちの１成分又は１成分以上を混合して使用することができる。必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液および静菌剤などの他の通常の添加剤を添加して、組織または臓器に注入するのに適した注射剤の形で製剤化することができる。また、等張性滅菌溶液、または場合によって滅菌水や生理食塩水を添加して注射可能な溶液となり得る乾燥剤（特に凍結乾燥剤）に製剤化することもできる。さらに、標的器官に特異的に作用できるように、標的器官特異的な抗体または他のリガンドを前記担体と結合して使用することができる。

【0078】

また、本発明の組成物は、充填剤、賦形剤、崩壊剤、結合剤または滑沢剤をさらに含むことができる。さらに、本発明の組成物は、哺乳動物に投与された後に活性成分の迅速、持続または遅延放出を提供できるように当業界で公知の方法を使用して製剤化することができる。

【0079】

一実施形態では、前記薬学組成物は注射製剤であってもよく、静脈内投与されるものであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0080】

本発明の用語「有効量」は、目的とする治療すべき特定の疾患の発症または進行を遅らせるか、または完全に増進するのに必要な量を意味する。

【0081】

本発明において、組成物は薬学的有効量で投与することができる。前記薬学組成物の適切な１日総使用量は、適切な医学的判断の範囲内で治療医によって決定され得ることは当業者にとって自明なことである。

【0082】

本発明の目的のために、特定の患者に対する具体的な薬学的有効量は、達成しようとする反応の種類および程度、場合によっては他の製剤が使用されるかどうかを含む具体的な組成物、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食物、投与時間、投与経路、組成物の分泌率、治療期間、具体的な組成物と併用または同時使用される薬物を含む様々な因子および医薬分野でよく知られている類似因子によって異なるように適用することが好ましい。

【0083】

本発明において、前記薬学組成物は、必要に応じて薬物の製造、使用および販売を管轄する行政機関によって指定された方式での、容器に付帯する注意書きを添付してもよい。前記注意書きは、組成物の形またはヒトもしくは獣医的な投与に関する私益機関による認可を示し、例えば処方薬に関する米国食品医薬品局により認可された表示でもよい。

【0084】

癌は、例えば、脳癌、頭頸部癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、白血病、肺癌、肝癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、血管腫瘍、扁平細胞癌種、腺癌種、小細胞癌種、黒色腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、肉腫、喉頭癌、耳下腺癌、胆道癌、甲状腺癌、日光角化症、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、腺様嚢胞癌、腺腫、腺扁平上皮癌腫、肛門管癌、肛門癌、肛門直腸癌、星細胞腫、バルトリン腺癌、基底細胞癌腫、胆汁癌、骨癌、骨髄癌、気管支癌、気管支腺癌腫、カルチノイド、胆管癌腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、淡明細胞癌腫、結合組織癌、嚢腺腫、消化器系癌、十二指腸癌、内分泌系癌、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮内膜様腺癌、内皮細胞癌、上衣腫、上皮細胞癌、眼窩癌、局所性結節性過形成、胆嚢癌、幽門洞癌、胃基底部癌、ガストリノーマ、膠芽腫、グルカゴノーマ、心臓癌、血管芽細胞腫、血管内皮腫、血管腫、肝腺腫、肝腺腫症、肝胆道癌、肝細胞癌腫、ホジキン病、回腸癌、インスリノーマ、上皮内新生物、上皮内扁平細胞新生物、肝内胆道癌、浸潤性扁平細胞癌腫、空腸癌、関節癌、骨盤癌、巨細胞癌腫、大腸癌、リンパ腫、悪性中皮腫、髄芽腫、髄質上皮腫、脳膜癌、中皮癌、転移性癌腫、口腔癌、粘表皮癌、多発性骨髄腫、筋肉癌、鼻腔癌、神経系癌、非上皮皮膚癌、非ホジキンリンパ腫、燕麦細胞癌、乏突起膠腫、口腔癌、骨肉腫、漿液性乳頭状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、下垂体腫瘍、形質細胞性腫瘍、偽肉腫、肺芽腫、直腸癌、腎細胞癌腫、呼吸器系癌、網膜芽細胞腫、漿液性癌、副鼻腔癌、皮膚癌、小細胞癌、小腸癌、平滑筋肉腫、軟部組織癌、ソマトスタチノーマ、脊椎癌、扁平細胞癌、線条筋肉癌、中皮細胞下層癌、Ｔ細胞白血病、舌癌、尿管癌、尿道癌、子宮頸癌、子宮体癌、膣癌、ＶＩＰｏｍａ、外陰部癌、高分化癌、およびウィルムス腫瘍からなる群より選択される癌であってもよい。

【0085】

本発明は、疾患抗原エピトープが融合したフェリチン単量体が自己集合してなり、トランスフェリン受容体への結合力（Ｋ）が下記数学式４を満たすタンパク質（タンパク質Ｂ）をさらに含む、癌の治療または予防用薬学組成物を提供する。

【0086】

【数6】

【0087】

【0088】

前記トランスフェリン受容体への結合力は、ヒトトランスフェリン受容体への結合力であってもよい。

【0089】

前記数学式４で表される結合力は、例えば、数学式１で表される結合力を求める方法と同様の方法で求められたものであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0090】

本発明の疾患抗原エピトープが融合したフェリチンタンパク質（タンパク質Ｂ）は、トランスフェリン受容体への結合力（Ｋ）が７００ｎＭ以下、６００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１５０ｎＭ以下、１２５ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下などであってもよい。数学式４の濃度値が小さいほど、トランスフェリン受容体への結合力が高いことを意味する。例えば、その下限は０．５ｎＭ、１ｎＭ、１．５ｎＭ、２ｎＭ、２．５ｎＭ、３ｎＭ、３．５ｎＭ、４ｎＭ、４．５ｎＭ、５ｎＭなどであってもよいが、これらに限定されるものではない。

【0091】

疾患抗原は、免疫応答によって予防、治療、軽減または改善できるあらゆる疾患の抗原であってもよい。例えば、疾患抗原は、癌細胞、病原体細胞、または病原体に感染した細胞の細胞表面抗原であってもよい。疾患抗原の抗原特異性を決定する特定の部位が疾患抗原エピトープである。

【0092】

疾患は、例えば癌または感染性疾患である。

【0093】

【0094】

感染性疾患は、例えば、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫またはプリオン感染症であってもよい。

【0095】

癌抗原エピトープは、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ－１、Ｍｅｌｎａ－Ａ、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ｃ２、マンマグロビンＡ（Mammaglobin－A）、プロテイナーゼ３（Proteinase－3）、ムシン１（Mucin－1）、ＨＰＶＥ６、ＬＭＰ２、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、ｈＴＥＲＴ、ＰＡＰ、ＥＲＧ、ＮＡ１７、ＡＬＫ、ＧＭ３、ＥＰｈＡ２、ＮＡ１７－Ａ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＡＦＰ、サバイビン（Survivin）、ＡＨ１、ｒａｓ、Ｇ１７ＤＴ、ＭＵＣ１、Ｈｅｒ－２／ｎｅｕ、Ｅ７５、ｐ５３、ＰＳＡ、ＨＣＧ、ＰＲＡＭＥ、ＷＴ１、ＵＲＬＣ１０、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、Ｅ７、チロシナーゼ（Tyrosinase）ペプチド、Ｂ１６Ｆ１０、ＥＬ４または新生抗原（neoantigen）であってもよい。

【0096】

新生抗原は、腫瘍細胞内の体性突然変異によって誘導されて形成される免疫原性ペプチドを意味する。新生抗原は、ＭＨＣ Iと複合体を形成し、腫瘍細胞の表面に移動して抗原エピトープで表され得るが、Ｔ細胞受容体（T－cell receptor，TCR）が新生抗原－ＭＨＣＩ複合体を認識して免疫応答を誘導する。

【0097】

疾患抗原エピトープは、フェリチン単量体に融合できるものであれば、その長さを特定のものに限定しない。

【0098】

疾患抗原エピトープは、フェリチン単量体の自己集合を阻害しないものであれば、その長さを特定のものに限定しない。

【0099】

疾患抗原エピトープは、フェリチン単量体のどこにでも融合できる。疾患抗原エピトープは、フェリチン単量体の自己集合を阻害しない位置に融合される。疾患抗原エピトープは、ヒトトランスフェリン受容体との結合のために、タンパク質の表面に露出するようにフェリチン単量体に融合されることが好ましい。

【0100】

疾患抗原エピトープは、例えば、そのアミノ酸の長さが２５ａａ以下、２４ａａ以下、２３ａａ以下、２２ａａ以下、２１ａａ以下、２０ａａ以下、１９ａａ以下、１８ａａ以下、１７ａａ以下、１６ａａ以下、１５ａａ以下、１４ａａ以下、１３ａａ以下、１２ａａ以下、１１ａａ以下、１０ａａ以下、９ａａ以下、８ａａ以下、７ａａ以下、６ａａ以下、５ａａ以下であってもよい。

【0101】

疾患抗原エピトープは、例えば、そのアミノ酸の長さが３ａａ以上、４ａａ以上、５ａａ以上、６ａａ以上、７ａａ以上、８ａａ以上、９ａａ以上、１０ａａ以上であってもよい。

【0102】

フェリチン単量体に疾患抗原エピトープが融合することにより、フェリチン単量体が自己集合したタンパク質（タンパク質Ｂ）のヒトトランスフェリン受容体との結合力を向上することができる。フェリチン単量体の各構成部分のうち内側に入り込んでいる部分は、疾患抗原エピトープの結合後に外側に突出することができる。

【0103】

疾患抗原エピトープのフェリチン単量体における融合位置は、特定の位置に限定されず、例えば、隣接するαヘリックスの間、Ｎ末端、Ｃ末端、ＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループ、ＤＥループ、Ｎ末端とＡヘリックスの間、ＥヘリックスとＣ末端の間、ヘリックス内部などに融合することができる。

【0104】

疾患抗原エピトープは、隣接するαヘリックスの間の少なくとも一つに融合することができる。また、疾患抗原エピトープは、フェリチン単量体のＮ末端またはＣ末端に融合することができる。また、疾患抗原エピトープは、フェリチン単量体のＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループまたはＤＥループに融合することができる。また、疾患抗原エピトープは、フェリチン単量体のＮ末端とＡヘリックスの間、またはＥヘリックスとＣ末端の間に融合することができる。また、疾患抗原エピトープは、フェリチン単量体の各ヘリックスの少なくとも一つの内部に融合することができる。

【0105】

本発明のタンパク質（タンパク質Ｂ）は、疾患抗原エピトープが融合したフェリチン単量体が自己集合してなるものである。

【0106】

フェリチンは、その単量体のいくつかが集まったとき、それら自身が組織的な構造またはパターンを形成して集合体を形成する自己集合型タンパク質であり、別に操作しなくてもナノスケールのタンパク質の形成が可能である。

【0107】

本発明による疾患抗原エピトープが融合したフェリチン単量体もまた、自己集合タンパク質の形態を成す。例えば、２４個のフェリチン単量体が自己集合して球状の粒子を形成することができる。

【0108】

本発明の疾患抗原エピトープが融合したタンパク質が粒子をなす場合、その粒径は例えば８～５０ｎｍであってもよい。具体的には、８ｎｍ～５０ｎｍ、８ｎｍ～４５ｎｍ、８ｎｍ～４０ｎｍ、８ｎｍ～３５ｎｍ、８ｎｍ～３０ｎｍ、８ｎｍ～２５ｎｍ、８ｎｍ～２０ｎｍ、８ｎｍ～１５ｎｍなどであってもよいが、これらに限定されるものではない。

【0109】

疾患抗原エピトープが融合したフェリチン単量体が自己集合してなり、トランスフェリン受容体に結合するタンパク質（タンパク質Ｂ）は、抗原提示細胞である樹状細胞の表面に存在するトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）と結合する。これにより、融合した抗原エピトープが樹状細胞に流入および提示され、免疫系が当該抗原を認識して免疫応答するようにする。

【0110】

疾患抗原エピトープが融合したフェリチン単量体が自己集合してなり、トランスフェリン受容体に結合するタンパク質（タンパク質Ｂ）は、ヒトフェリチン重鎖タンパク質と疾患抗原エピトープとの間にリンカーペプチドがさらに含まれたものであってもよい。前記リンカーペプチドは、エピトープに柔軟性を付与してタンパク質の表面表出性を高めるための配列であれば制限しないが、例えば配列番号３６～配列番号３８のアミノ酸配列を有するものであってもよい。

【0111】

前記リンカーペプチドは、疾患抗原エピトープ間の適切な空間を確保する長さを有することができる。例えば、リンカーペプチドは、１～２０個、３～１８個、４～１５個、８～１２個のアミノ酸からなるペプチドであってもよい。前記リンカーペプチドの長さ及び／又はアミノ酸の組成を調整することにより、疾患抗原エピトープ間の間隔および配向を調整することができる。

【0112】

本発明の薬学組成物は、前記２種のタンパク質（タンパク質Ａ、Ｂ）を併用投与することができる。

【0113】

併用投与時の投与順序は限定されず、例えば２種のタンパク質を同時投与してもよく、個別または順次投与してもよい。順次投与時には、外表面に免疫チェックポイント分子と結合可能な分子が融合したフェリチンタンパク質を先に投与してもよく、疾患抗原エピトープが融合したフェリチン単量体が自己集合してなるタンパク質を先に投与してもよい。

【0114】

本発明は、以上のフェリチンタンパク質（タンパク質Ａ）を含む癌の治療方法を提供する。以上のフェリチンタンパク質に関する全ての説明は、本発明の癌の治療方法の有効成分としてのフェリチンタンパク質にそのまま適用される。

【0115】

本発明の治療方法は、癌に罹患した対象に本発明のフェリチンタンパク質（タンパク質Ａ）を投与するステップを含む。

【0116】

癌に罹患した個体は、癌に罹患した動物、具体的には癌に罹患した哺乳類であってもよく、より具体的には癌に罹患したヒトであってもよい。

【0117】

【0118】

タンパク質（タンパク質Ａ）は治療上有効量で投与することができる。

【0119】

本発明で用語「投与」とは、いかなる適切な方法で患者に本発明の組成物を導入することを意味する。本発明の組成物の投与経路は、目的の組織に到達できる限り、経口または非経口の様々な経路を介して投与することができる。腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、または直腸内投与することができるが、これらに限定されるものではない。

【0120】

本発明の方法は、前記個体に疾患抗原エピトープが融合したフェリチン単量体が自己集合してなるタンパク質（タンパク質Ｂ）を投与するステップをさらに含むことができる。

【0121】

疾患抗原エピトープは、癌抗原エピトープであってもよく、先に具体的に例示した癌抗原エピトープであってもよい。

【0122】

疾患抗原エピトープが融合したフェリチン単量体が自己集合してなるタンパク質（タンパク質Ｂ）は、免疫チェックポイント分子と結合可能な分子が融合したフェリチンタンパク質と同時または順次投与することができる。

【0123】

順次投与される場合、その順序は限定されず、疾患抗原エピトープが融合したフェリチン単量体が自己集合してなるタンパク質（タンパク質Ｂ）は、免疫チェックポイント分子と結合可能な分子が融合したフェリチンタンパク質（タンパク質Ａ）の投与前または投与後に投与することができる。

【0124】

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明することとする。

【0125】

実施例
１．候補タンパク質を合成するための発現ベクターの製造
ｈｕＨＦは、２４個の単量体で構成された球状タンパク質（１２ｎｍ）であり、各単量体は合計５個のαヘリックスで構成されている。本発明者らは、ｈｕＨＦ単量体の各αヘリックスの間のループ（ＰＤＢ３ＡＪＯシーケンスを基準にｈｕＨＦ５Ｔ～１７６Ｇ中のＡＢループ；４５Ｄ／４６Ｖの間、ＢＣループ；９２Ｄ／９３Ｗ、ＣＤループ；１２６Ｄ／１２７Ｐ、ＤＥループ；１６２Ｅ／１６３Ｓ）とＮ末端およびＣ末端に実際の腫瘍抗原の１つであるｇｐ１００ペプチドを遺伝子クローニングにより挿入することで、ｈｕＨＦの様々な位置にｇｐ１００ペプチドが挿入された送達体を確保した（図１および図２）。本発明者らは、以前の研究（米国登録特許１０，２０６，９８７）において、センチネルリンパ標的効率が最も良いｈｕＨＦナノ粒子の表面構成を癌特異抗原送達ナノ粒子に選定した。

【0126】

そこで、下記表１の候補タンパク質を下記表２のベクター模式図に従ってＰＣＲを行い、タンパク質ｈｕＨＦ、ｈｕＨＦ－ｇｐ１００（ＳＥＱＩＤＮＯ：１；メラノーマ特異抗原）、ＯＶＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）、ＡＨ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）（ＡＢ；４５Ｄ／４６Ｖ、ＢＣ；９２Ｄ／９３Ｗ、ＣＤ；１２６Ｄ／１２７Ｐ、ＤＥ；１６２Ｅ／１６３Ｓ、Ｎ末端、Ｃ末端）、ｈｕＨＦ－ＰＤ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：４；ＰＤ１ドメイン中の活性部位）、ｈｕＨＦ－ＴＰＰ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）（ＡＢ、ＣＤループ）、ｈｕＨＦ－αＰＤ－Ｌ１ＨＣＤＲ３（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）（ＣＤループ、Ｃ末端）およびｈｕＨＦ－ｓｍＰＤ１（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）粒子を作製した。ここで、前記ＯＶＡは免疫特異抗原であり、ＡＨ１は大腸癌細胞の腫瘍特異抗原、ｇｐ１００は黒色腫細胞の腫瘍特異抗原として使用した。製造された全てのプラスミド発現ベクターをアガロースゲルで精製し、完全なＤＮＡシーケンシングによって配列を確認した。

【0127】

具体的には、表３のプライマーセットを用いて、各々の発現ベクターの製造に必要なＰＣＲ産物を順次にプラスミドｐＴ７－７ベクターに挿入し、各々のタンパク質を発現できる発現ベクターを構成した。このとき、下記表４のリンカーペプチドをさらに含むことができる。

【0128】

【表1】

【0129】

【表2】

【0130】

【表3】

【0131】

【表4】

【0132】

２．候補タンパク質の生合成
大腸菌菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）［Ｆ－ｏｍｐＴｈｓｄＳＢ（ｒＢ－ｍＢ－）］を前記で製造された発現ベクターでそれぞれ形質転換し、アンピシリン－抵抗性形質転換体を選択した。形質転換された大腸菌を、５０ｍＬのＬＢ（Luria－Bertani）培地（１００ｍｇのＬ－１アンピシリンを含有）を含有するフラスコ（２５０ｍＬ三角フラスコ、３７℃、１５０ｒｐｍ）で培養した。培地の濁度（Ｏ．Ｄ６００）が約０．５～０．７に達したとき、ＩＰＴＧ（Isopropyl－β－Dthiogalactopyranosid）（１．０ｍＭ）を注入して組換え遺伝子の発現を誘導した。

【0133】

２０℃で１６～１８時間培養した後、培養した大腸菌を４，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して菌体沈殿物を回収し、５ｍｌの破砕溶液（１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５、１０ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁し、超音波破砕機（Branson Ultrasonics Corp.、Danbury、CT、USA）を用いて破砕した。破砕後、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄み液と不溶性凝集体を分離した。分離した上澄み液を後の実験に使用した。

【0134】

３．候補タンパク質の精製及び蛍光物質の付着
前記実施例２で得られた上澄み液を３段階の過程を経て精製した。まず、１）組換えタンパク質に融合したヒスチジンとニッケルの結合を用いたＮｉ２＋－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを行った後、２）組換えタンパク質を濃縮し、バッファー交換によって蛍光物質を付着し、３）最後に、蛍光物質が付着した自己集合タンパク質のみを分離するために、スクロース勾配超遠心分離（ultracentifugation）を行った。各段階の詳細は以下の通りである。

【0135】

１）Ｎｉ^２＋－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー
組換えタンパク質を精製するために、前記と同様の方法で培養された大腸菌を回収し、その細胞ペレットを５ｍＬのライシスバッファー（ｐＨ８．０、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）に再浮遊し、超音波破砕機を用いて細胞を破砕した。破砕した細胞液を１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してその上澄み液のみを分離した後、各組換えタンパク質をＮｉ２＋－ＮＴＡカラム（Qiagen, Hilden, Germany）を用いてそれぞれ分離した（洗浄バッファー：ｐＨ８．０、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭＮａＣｌ、８０ｍＭイミダゾール／溶出バッファー：ｐＨ８．０、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭＮａＣｌ、２００ｍＭイミダゾール）。

【0136】

２）濃縮とバッファー交換および蛍光物質の付着過程
イメージングのために、ｈｕＨＦ－ｇｐ１００粒子とｈｕＨＦ－ＰＤ１粒子は、Ｎｉ２＋－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを経て溶出された３ｍｌの組換えタンパク質を、超遠心ろ過器（Ultracentrifugal filter、Amicon Ultra 100K、Millipore、Billerica、MA）に入れて、カラムの上に１ｍｌの溶液が残るまで５，０００ｇで遠心分離を行った。その後、ＮＩＲ蛍光物質であるｃｙ５．５およびＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアン酸塩）を付着するために、タンパク質粒子を重炭酸ナトリウム（sodium bicarbonate）（０．１Ｍ、ｐＨ８．５）バッファーでバッファー交換を行い、常温で１２時間蛍光物質を付着した。

【0137】

３）スクロース勾配超高速遠心分離
ＰＢＳ（２．７ｍＭＫＣｌ、１３７ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４）バッファーにスクロースを濃度別にそれぞれ添加し、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％のスクロースを含む溶液をそれぞれ準備した。その後、超高速遠心分離用チューブ（ultraclear 13.2ml tube、Beckman）に各濃度別（４５～２０％）のスクロース溶液を濃度の高い溶液から２ｍｌずつ入れた後、準備した自己集合用バッファーに存在する組換えタンパク質溶液を１ｍｌ充填した後、３５，０００ｒｐｍにおいて４℃で１６時間超高速遠心分離を行った（Ultracentrifuge L－90k、Beckman）。遠心分離後、慎重にパイペットを用いて上層（２０－２５％スクロース溶液部分）を、前記２）に記載されているように超遠心ろ過器（Ultracentrifugal filter）とＰＢＳバッファーを用いて組換えタンパク質のバッファーを交換した。

【0138】

４．タンパク質粒子の集合の検証
実施例３で製造した各タンパク質（ｇｐ１００－ｈｕＨＦ－ｌｏｏｐｓ、ｈｕＨＦ－ＰＤ１、ｈｕＨＦ－ＴＰＰ１、ｈｕＨＦ－αＰＤ－Ｌ１ＨＣＤＲ３、ｈｕＨＦ－ｓｍＰＤ１）の精製された組換えタンパク質の構造を分析するために、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）で組換えタンパク質を撮影した。まず、染色していない精製タンパク質のサンプルを、カーボンコートされた銅電子顕微鏡グリッド（grids）に載せて自然乾燥した。タンパク質の染色された画像を得るために、自然乾燥したサンプルを含む電子顕微鏡グリッドを２％（ｗ／ｖ）水性ウラニルアセテート溶液と共に１０分間室温でインキュベートし、蒸留水で３～４回洗浄した。タンパク質の画像をフィリップスＴｅｃｈｎａｉ１２０ｋＶ電子顕微鏡を用いて観察したところ、各々の粒子が球状のナノ粒子を形成することを確認した（図３および図５）。また、ＤＬＳ（dynamic light scattering）測定により、各ｇｐ１００－ｈｕＨＦ－ｌｏｏｐｓ、ｈｕＨＦ－ＰＤ１、ｈｕＨＦ－ＴＰＰ１（ＡＢ、ＣＤループ）、ｈｕＨＦ－αＰＤ－Ｌ１ＨＣＤＲ３（ＣＤループ、Ｃ末端）、ｈｕＨＦ－ｓｍＰＤ１粒子の直径をソルーション中で測定した（図３および図５）。

【0139】

５．ＯＶＡ－ｈｕＨＦ－ｌｏｏｐｓタンパク質とＴｆＲとの結合能の測定およびｈｕＨＦ－ＰＤ１、ｈｕＨＦ－ＴＰＰ１（ＡＢ、ＣＤループ）、ｈｕＨＦ－αＰＤ－Ｌ１ＨＣＤＲ３（ＣＤループ、Ｃ末端）、ｈｕＨＦ－ｓｍＰＤ１タンパク質とＰＤ－Ｌ１の結合能の測定
本発明者らは、ｈｕＨＦ送達体の免疫細胞活性増強効果を証明するために、実施例３で製造した各タンパク質（ｇｐ１００－ｈｕＨＦ－ｌｏｏｐｓ）の精製された組換えタンパク質とＴｆＲ（transferrin receptor）との結合能をＭＳＴ（Microscale Thermophoresis）装置により測定した。その結果、腫瘍抗原を含んでいないｈｕＨＦナノ粒子が最もＴｆＲとの結合能に優れており、ＣＤヘリックスの間に腫瘍抗原が挿入されたＣＤ－ｌｏｏｐ－ｇｐ１００ナノ粒子の結合能がその次に優れていることを確認した。このことから、ＣＤ－ｌｏｏｐ－ｇｐ１００粒子が最もＴｆＲとの結合を阻害しないことを間接的に確認した（図４）。

【0140】

プログラム細胞死タンパク質１（Programmed cell death protein 1、PD－1）は、Ｔ細胞の表面にあるタンパク質であり、癌細胞の表面に発現されるＰＤ－Ｌ１と結合してＴ細胞の活性低下を誘導する。このため、癌細胞の表面に発現されるＰＤ－Ｌ１と結合するＰＤ－１の結合部位が表面表出されたタンパク質を用いてＴ細胞のＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の結合抑制を誘導する場合、Ｔ細胞活性抑制の低下により、抗癌免疫治療の効率増加を期待できる。本発明者らが開発しようとしたＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４抗体作用部位をタンパク質の表面に表出させるより、ＰＤ－Ｌ１と結合するＰＤ－１の結合部位をタンパク質の表面に表出させて自己集合を誘導することが、タンパク質発現量の観点で効率的であると判断し、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１結合部位をｈｕＨＦに合成した（ＰＤ－１シーケンスにおける結合活性部位２２Ｇ－１７０Ｖ）、ＰＤ－Ｌ１ターゲティング能ペプチドＴＰＰ１、ＰＤ－Ｌ１抗体のＨＣＤＲ３シーケンス、ＰＤ－Ｌ１の結合活性部位（スモールＰＤ１ドメイン））。

【0141】

ナノ粒子の遺伝子クローニングを行った後、それを発現し、タンパク質自己集合によって粒子合成を誘導した。これは、ＴＥＭ画像から確認し、実際に合成したｈｕＨＦ－ＰＤ１タンパク質がＰＤ－１リガンド（ＰＤ－Ｌ１）と実際に結合するかを確認するために、実施例３で製造したｈｕＨＦ－ＰＤ１タンパク質とＰＤ－Ｌ１の結合能（binding affinity；Kd）を、ＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。２ｕｇ／ｍｌの濃度でＰＤＬ１組換えタンパク質を９６－ウェルプレートに１６－１８時間バインディングした後、現在使用されている免疫抗体治療剤であるＰＤ－Ｌ１抗体およびｈｕＨＦ－ＰＤ１タンパク質とＰＤ－Ｌ１の結合能を、ラングミュアの式（Langmuir equation）を用いて計算した。

【0142】

結合能の測定結果、ｈｕＨＦ－ＰＤ１と組換えタンパク質ＰＤ－Ｌ１のＫｄの値がＰＤ１－ＰＤＬ１結合アフィニティ文献値である７７０ｎＭよりも高い３２７．５９ｎＭと測定された。これはＰＤ－Ｌ１とＰＤ－Ｌ１抗体のＫｄの値である２５５．１０ｎＭと近似していた。このことから、ＰＤ－１結合ドメインをｈｕＨＦ表面上に表出させて製造したタンパク質がＰＤ－Ｌ１との結合能を有することを確認した（図５）。

【0143】

さらに、実際に合成したｈｕＨＦ－αＰＤ－Ｌ１ＨＣＤＲ３（ＣＤループ、Ｃ末端）タンパク質とＰＤ－Ｌ１との結合能もＥＬＩＳＡ法で測定した。ｈｕＨＦ－αＰＤ－Ｌ１ＨＣＤＲ３（ＣＤループ）粒子は７１．２４ｎＭ、ｈｕＨＦ－αＰＤ－Ｌ１ＨＣＤＲ３（Ｃ末端）粒子は３８．４３ｎＭとそれぞれ測定され、これらのタンパク質もまたＰＤ－Ｌ１との結合能を有することを確認した（図５）。

【0144】

さらに、実際に合成したｈｕＨＦ－ＴＰＰ１（ＡＢ、ＣＤループ）タンパク質がＰＤ－１リガンド（ＰＤ－Ｌ１）と実際に結合するかを確認するために、実施例３で製造したｈｕＨＦ－ＴＰＰ１タンパク質とＰＤ－Ｌ１の結合能（binding affinity；Kd）をＭＳＴ（Microscale Thermophoresis）装置により測定した。

【0145】

測定の結果、ｈｕＨＦ－ＴＰＰ１（ＡＢループ）のＰＤ－Ｌ１とのＫｄの値は７２．１０５ｎＭ、ｈｕＨＦ－ＴＰＰ１（ＣＤループ）のＰＤ－Ｌ１とのＫｄの値は１１５．１６ｎＭ、ｈｕＨＦ－αＰＤ－Ｌ１ＨＣＤＲ３（ＣＤループ）のＫｄの値は７１．２４ｎＭ、ｈｕＨＦ－αＰＤ－Ｌ１ＨＣＤＲ３（Ｃ末端）のＫｄの値は３８．４３ｎＭと測定された（図５）。

【0146】

６．ｇｐ１００－ｈｕＨＦ－ｌｏｏｐｓタンパク質の樹状細胞の取込（uptake）実験とｈｕＨＦ、ｈｕＨＦ－ＰＤ１、ｈｕＨＦ－ＴＰＰ１（ＡＢ、ＣＤループ）、ｈｕＨＦ－αＰＤ－Ｌ１ＨＣＤＲ３（ＣＤループ、Ｃ末端）、ｈｕＨＦ－ｓｍＰＤ１ＰＤＬ１抗体治療剤の大腸癌細胞ターゲティング能の検証
実施例３で製造した蛍光物質が付着したｇｐ１００－ｈｕＨＦ－ｌｏｏｐｓの各タンパク質とｈｕＨＦタンパク質の樹状細胞の取込（uptake）効率を比較した。

【0147】

各ナノ粒子を３００ｎＭで３０分間樹状細胞に反応させた後、蛍光シグナルを共焦点顕微鏡装置（ＬＳＭ７００）により測定した。ＣＤヘリックスの間に腫瘍抗原が挿入されたＣＤ－ｌｏｏｐ－ｇｐ１００タンパク質の結合能がｈｕＨＦ自体のタンパク質の次に優れていることを確認した。このことから、ＣＤ－ｌｏｏｐ－ｇｐ１００タンパク質が最もＴｆＲとの結合を阻害しないことをまた間接的に確認した（図６）。

【0148】

実施例３で製造した蛍光物質が付着したｈｕＨＦ、ｈｕＨＦ－ＰＤ１、ｈｕＨＦ－ＴＰＰ１（ＡＢ、ＣＤループ）、ｈｕＨＦ－αＰＤ－Ｌ１ＨＣＤＲ３（ＣＤループ、Ｃ末端）、ｈｕＨＦ－ｓｍＰＤ１タンパク質のＣＴ２６大腸癌およびＢ１６Ｆ１０黒色腫に対するターゲティング効率を比較するために、ＣＴ２６大腸癌細胞およびＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞に３００ｎＭの濃度でタンパク質を反応させた後、蛍光シグナルを比較して細胞取込（cell uptake）効率を確認した。その結果、図７ａ～図７ｃに示すように、対照群であるｈｕＨＦタンパク質よりもｈｕＨＦ－ＰＤ１（図７ａ）、ｈｕＨＦ－αＰＤ－Ｌ１ＨＣＤＲ３（ＣＤループ、Ｃ末端）（図７ｂ）、ｈｕＨＦ－ＴＰＰ１（ＡＢ、ＣＤループ）（図７ｃ）、ｈｕＨＦ－ｓｍＰＤ１（図７ｃ）タンパク質が癌細胞と結合して蛍光シグナルを示すことを確認した。また、２０分間癌細胞の表面に発現されたＰＤ－Ｌ１をマスキングできるＰＤ－Ｌ１抗体を処理した後、ｈｕＨＦタンパク質、ｈｕＨＦ－ＰＤ１タンパク質、およびｈｕＨＦ－αＰＤ－Ｌ１ＨＣＤＲ３タンパク質、ｈｕＨＦ－ｓｍＰＤ１タンパク質をそれぞれ反応させた場合には両方とも結合しないことを確認した。

【0149】

７．製造されたタンパク質を用いたＮＩＲ画像の解析
前記の実験結果に基づいて、前記実施例３で製造した５つのタンパク質を、蛍光度を合わせて５週齢のヌードマウス（各実験群当たりｎ＝３）に注入した後、ｇｐ１００抗原発現腫瘍を皮下注射法（food pad injection）で注入し、一定期間の間、腫瘍の成長程度を分析して、ｈｕＨＦ－ｇｐ１００ｌｏｏｐタンパク質のすべてがリンパ節へのターゲティング効率が良いのかを確認した。各々の粒子を２０μｌずつマウスの右足に注入し、１時間実験を行った。

【0150】

その結果、図８に示すように、ＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループ、ＤＥループ、Ｎ末端、Ｃ末端に癌特異的抗原ペプチドを挿入した場合、全てのタンパク質においてリンパ節に対するナノ粒子の送達効率が良いことを確認した。癌抗原特異的免疫細胞の活性を最も増強させたｇｐ１００－ｈｕＨＦ（１２６ループ）ナノ粒子を注入した群において、腫瘍成長抑制効果が最も高いことを確認した。

【0151】

また、ｈｕＨＦ－ＰＤ１タンパク質が実際に腫瘍細胞の表面に導出されているＰＤ－Ｌ１と結合するかを確認するために、ｃｙ５．５蛍光物質を付着したｈｕＨＦタンパク質とｈｕＨＦ－ＰＤ１タンパク質をＣＴ－２６大腸癌細胞が成長したマウスに注入して癌ターゲティング効率を比較した。このとき、比較群としては実際に臨床で使用されているＰＤ－Ｌ１抗体治療剤を用いた。マウスに注射してから２日間、体内で粒子が腫瘍にターゲティングされる様子をＣｙ５．５バンドパス発光フィルタ（bandpass emission filter）およびスペシャルＣマウントレンズ（special Cmount lens）またはＩＶＩＳスペクトラムイメージングシステム（IVIS Spectrum imaging system、Caliper Life Sciences、Hopkinton、MA）で観察した（図９；右下のグラフのＹ軸は体内保持時間を示す。）。

【0152】

その結果、図９に示すように、対照群であるｈｕＨＦタンパク質よりもｈｕＨＦ－ＰＤ１タンパク質が、癌細胞ターゲティング効率が良いことが分かった。しかし、前記の結果では、実際の抗体治療剤がｈｕＨＦ－ＰＤ１タンパク質よりも癌ターゲティング効率と体内保持時間が良好に見えたが、これは抗体治療剤の体内保持時間が長すぎて示される結果であり、これは体内免疫副作用の問題と直結する。したがって、本発明によるタンパク質は副作用の効果と副作用の側面においていずれも利点を有することを確認した。

【0153】

８．ＣＤ８＋Ｔ細胞アッセイによる特定のサイトカインの分泌確認実験
実施例１～３の方法でＰＢＳ（バッファー）とｈｕＨＦ－ｇｐ１００ループタンパク質を製造し、Ｃ５７ＢＬ／６に１週に１回ずつ合計３週間ワクチン注入によってリンパ節内の免疫細胞の免疫応答をブースト（boosting）した後、その免疫細胞が集まる脾臓を摘出して粉砕した。粉砕した脾臓内でｇｐ１００メラノーマ特異的抗原により特異的に免疫応答が誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞を抽出した後、インビトロ（in vitro）上で免疫応答を起こすことが知られているｇｐ１００の特定部分抗原ペプチド（KVPRNQDWL）を用いて、Ｔ細胞と反応させてｇｐ１００特異的なサイトカインが分泌されるかどうかをＦＡＣＳ分析により確認した。その結果、１２６－ｇｐ１００－ｈｕＨＦタンパク質を注入したマウスの脾臓から抽出したＣＤ８＋Ｔ細胞からサイトカインが最も多く分泌されることを確認した（図１０）。

【0154】

９．ＭＨＣ－ＯＶＡ発現（presentation）の確認および樹状細胞の表面の共刺激作動因子（co－stimulatory effector）の発現検証実験
実施例１～３の方法でＰＢＳ（バッファー）とｈｕＨＦ－ＯＶＡループタンパク質を製造し、Ｃ５７ＢＬ／６に１週に１回ずつ合計３週間ワクチン注入によってリンパ節内の免疫細胞の免疫応答をブースト（boosting）した後、その免疫細胞が集まる脾臓を摘出して粉砕した。粉砕した脾臓内でＯＶＡ免疫ペプチドがＭＨＣ－Ｉによって表面表出された樹状細胞（ＤＣ）を捕捉する抗体を用いて、樹状細胞の表面にペプチドを最も良好に露出させるタンパク質を確認した。

【0155】

その結果、ＣＤループにＯＶＡペプチドを入れたナノ粒子が、ＭＨＣ－Ｉの上にペプチドの表面表出を最も良好に誘導することを確認した。この結果は、免疫治療を行うに当たり、細胞傷害Ｔ細胞（cytotoxic t cell）の活性を最も効果的にすることができることを反証する結果である。

【0156】

この実験はＦＡＣＳ（flow cytometry）によって行った（図１１Ａ）。

【0157】

また、ｈｕＨＦタンパク質自体が免疫応答の効率増強に影響するかどうかを調べるために、同じ粒子で樹状細胞の表面に表出されるＭＨＣ－ＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現率を比較した。

【0158】

その結果、ＣＤ、ＤＥ、Ｃ末端の順に共刺激作動因子（co－stimulatory effector）が発現することを確認した（図１１Ｂ）。

【0159】

１０．癌成長阻害実験Ｉ（Vaccination；予防）
前記の実験結果に基づいて、ｈｕＨＦ、ｈｕＨＦ－ｇｐ１００ループ（１０μＭ）タンパク質およびＰＢＳバッファーのみのサンプルをそれぞれＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３）に１週間間隔で３回、皮下注射で注入した。その後、１週間免疫応答が起こるように時間を置いた後、各々のマウスにＢ１６Ｆ１０細胞株を植え、癌の成長速度を観察した。

【0160】

癌細胞のサイズは下記式で計算した。

【0161】

【数7】

【0162】

その結果、ｈｕＨＦ－ＣＤ－ｇｐ１００、ｈｕＨＦ－ＤＥ－ｇｐ１００、ｈｕＨＦ－ｇｐ１００－Ｃ末端粒子の順に腫瘍成長抑制効果があることを確認した（図１２）。

【0163】

１１．癌成長阻害実験ＩＩ（治療）
本発明者らは、前記ｈｕＨＦ－ＰＤ１タンパク質が、実際の抗体治療剤であるＰＤ－Ｌ１抗体と比較して、免疫チェックポイント抑制による癌治療効果を有するかどうかを判断するために、一定のサイズの大腸癌腫瘍（ＣＴ２６）が形成されたマウスＢａｌｂ／ｃを用いて、３日間隔でＰＢＳ、ＰＤ－Ｌ１抗体、ｈｕＨＦ－ＰＤ１タンパク質を静脈注射で注入した。観察の結果、ｈｕＨＦ－ＰＤ１タンパク質が抗体治療剤と類似した腫瘍治療効果を示すことを確認した（図１３）。

【0164】

次に、第１タンパク質（ＣＤｌｏｏｐ－ｈｕＨＦ）と第２タンパク質（ｈｕＨＦ－ＰＤ１）が、生体内で実際に腫瘍成長抑制および併用治療時の相乗効果を有するかを確認した。そのために、一定のサイズの腫瘍が形成されたマウスに最も優れた腫瘍成長抑制効果を示したＣＤループに当該癌特異的抗原エピトープ（ｇｐ１００およびＡＨ１）が挿入されたｈｕＨＦ－ＣＤｌｏｏｐ－ｇｐ１００およびｈｕＨＦ－ＣＤｌｏｏｐ－ＡＨ１（１０μＭ）タンパク質をマウスに対して３日間隔で皮下注入法で注入した。それと同時に、ｈｕＨＦ－ＰＤ１（５μＭ）と対照群であるＰＤ－Ｌ１抗体治療剤のサンプルを３日間隔で、静脈注射法で注入した。ｈｕＨＦ－ＣＤｌｏｏｐ－ｇｐ１００タンパク質を用いた実験では、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫が形成されたＣ５７ＢＬ／６マウスを使用した。ｈｕＨＦ－ＣＤｌｏｏｐ－ＡＨ１タンパク質を用いた実験では、ＣＴ２６大腸癌が形成されたＢａｌｂ／ｃマウスを使用した。各実験では実験群当たり５匹を使用し、癌細胞のサイズは下記式で計算した。

【0165】

【数8】

【0166】

ここで、実験群としては１）無処理群（No treat）、２）第１タンパク質処理群（ＡＨ１－ｈｕＨＦおよびｇｐ１００－ｈｕＨＦ）、３）抗体治療剤処理群（α－ＰＤ－Ｌ１）、４）第２タンパク質処理群（ｈｕＨＦ－ＰＤ１）、５）第１タンパク質と抗体治療剤の併用投与群（ＡＨ１－ｈｕＨＦ＋α－ＰＤ－Ｌ１およびｇｐ１００－ｈｕＨＦ＋α－ＰＤ－Ｌ１）、および、６）第１タンパク質と第２タンパク質の併用投与群（ＡＨ１－ｈｕＨＦ＋ｈｕＨＦ－ＰＤ１およびｇｐ１００－ｈｕＨＦ＋ｈｕＨＦ－ＰＤ１）を使用した。

【0167】

実験の結果、本発明による第１タンパク質（ＣＤｌｏｏｐ－ｇｐ１００またはＡＨ１）と第２タンパク質（ｈｕＨＦ－ＰＤ１）を処理した６番実験群で腫瘍治療効果が最も優れていることを確認した。また、各実験群の生存率も測定した（図１４）。

【0168】

１２．癌成長阻害を確認するためのインビトロ免疫実験
本発明者らは、ｈｕＨＦ－ＰＤ１タンパク質が実際の抗体治療剤であるＰＤＬ１抗体と比較して、免疫チェックポイント抑制による癌治療効果があるかどうかを判断するために、ＰＤ－Ｌ１抗体とｈｕＨＦ－ＰＤ１タンパク質の癌細胞との反応時のＴ－細胞の活性反応と癌細胞の死滅効率を比較した。大腸癌および黒色腫の癌細胞にＰＤＬ１抗体とｈｕＨＦ－ＰＤ１タンパク質を処理した後、インビトロでＴ細胞の反応を観察した場合、ｈｕＨＦ－ＰＤ１タンパク質を処理した実験群でＰＤ－Ｌ１抗体を処理した実験群よりもＣＤ８＋細胞から誘導される癌細胞死可能な特異的サイトカインＩＦＮ－γがさらに検出されることを確認し、追加に癌細胞死率もより高いことを確認した。このことから、ｈｕＨＦ－ＰＤ１タンパク質がＰＤ－Ｌ１抗体よりも癌細胞治療効果が良いと予測した（図１５Ａ、Ｂ）。また、実験群１）無処理群（No treat）、２）第１タンパク質処理群（ＡＨ１－ｈｕＨＦおよびｇｐ１００－ｈｕＨＦ）、３）抗体治療剤処理群（α－ＰＤ－Ｌ１）、４）第２タンパク質処理群（ｈｕＨＦ－ＰＤ１）、５）第１タンパク質と抗体治療剤の併用投与群（ＡＨ１－ｈｕＨＦ＋α－ＰＤ－Ｌ１およびｇｐ１００－ｈｕＨＦ＋α－ＰＤ－Ｌ１）、および、６）第１タンパク質と第２タンパク質の併用投与群（ＡＨ１－ｈｕＨＦ＋ｈｕＨＦ－ＰＤ１およびｇｐ１００－ｈｕＨＦ＋ｈｕＨＦ－ＰＤ１）に対するＴ細胞の活性反応も観察した。その結果、腫瘍成長抑制の結果が最も良好であった６番実験群（ＡＨ１－ｈｕＨＦ＋ｈｕＨＦ－ＰＤ１およびｇｐ１００－ｈｕＨＦ＋ｈｕＨＦ－ＰＤ１）においてＴ細胞の活性が最も優れていることをまた確認した（図１５Ｃ）。

【0169】

１３．従来の抗体治療剤と本発明者らが開発した代替治療剤のｈｕＨＦ－ＰＤ１との免疫副作用の比較実験
本発明者らは、ｈｕＨＦ－ＰＤ１タンパク質は、実際の抗体治療剤であるＰＤＬ１抗体と比較して、免疫チェックポイント抑制による癌治療効果を有するとともに、生体内注入時の免疫副作用の誘発程度も減少することを証明した。従来の抗体治療剤の最大の問題は、タンパク質の投入時の体内長期間蓄積による免疫副作用誘発の問題である。この免疫副作用を引き起こす最も代表的なサイトカインはＩＬ－１７と知られている。そこで、本発明者らは実施例１１で説明した１～６番実験群の血液サンプルを用いて、ＩＬ－１７検出テストを行った。

【0170】

その結果、抗体治療剤を用いた実験群である３番と５番でのみＩＬ－１７が検出されることを確認した。このことから、本発明によるタンパク質は、免疫副作用の誘発程度がより低いことを確認した（図１６）。

【0171】

１４．癌成長阻害実験ＩＩＩ（手術後のｒｅｃｈａｌｌｅｎｇｅ）
実施例１１での癌成長阻害実験の結果、第１タンパク質（ＣＤｌｏｏｐ－ｈｕＨＦ）と第２タンパク質（ｈｕＨＦ－ＰＤ１）が生体内で実際に腫瘍成長抑制および併用治療時の相乗効果を有するかを確認した。そこで、前記結果に基づいて、手術後も癌が再発するかどうかを調べるために実験を行った。実験群としては、実施例１１と同様に、１）無処理群（No treat）、２）第１タンパク質処理群（ＡＨ１－ｈｕＨＦ）、３）抗体治療剤処理群（α－ＰＤ－Ｌ１）、４）第２タンパク質処理群（ｈｕＨＦ－ＰＤ１）、５）第１タンパク質と抗体治療剤の併用投与群（ＡＨ１－ｈｕＨＦ＋α－ＰＤ－Ｌ１）、および、６）第１タンパク質と第２タンパク質の併用投与群（ＡＨ１－ｈｕＨＦ＋ｈｕＨＦ－ＰＤ１）を使用した。腫瘍が成長して治療を進行し、腫瘍特異的な免疫細胞が体内に産生されたと判断した３週間後、全ての実験群の腫瘍を手術により除去した。その後、再びＣＴ２６大腸癌細胞を全ての実験群に処理し、癌が発生するかを観察した。

【0172】

その結果、１）無処理群（No treat）では、癌が成長し続けるのに対して、６）第１タンパク質と第２タンパク質の併用投与群（ＡＨ１－ｈｕＨＦ＋ｈｕＨＦ－ＰＤ）では、全てのマウスにおいて癌が成長しないか、または成長して数日で消えることを確認した。

【0173】

この実験では、Ｂａｌｂ／ｃマウスを使用した。各実験では実験群当たり５匹を使用し、癌細胞のサイズは下記式で計算した。

【0174】

【数9】

【0175】

実験の結果、本発明による第１タンパク質（ＣＤループ－ＡＨ１）と第２タンパク質（ｈｕＨＦ－ＰＤ１）を処理した６番実験群の腫瘍治療効果が最も優れていることを確認した（図１７）。

【0176】

また、手術後も癌が転移するかどうかを調べるために実験を行った。実験群としては、実施例１１と同様に、１）無処理群（No treat）、２）第１タンパク質処理群（ＡＨ１－ｈｕＨＦ）、３）抗体治療剤処理群（α－ＰＤ－Ｌ１）、４）第２タンパク質処理群（ｈｕＨＦ－ＰＤ１）、５）第１タンパク質と抗体治療剤の併用投与群（ＡＨ１－ｈｕＨＦ＋α－ＰＤ－Ｌ１）、および、６）第１タンパク質と第２タンパク質の併用投与群（ＡＨ１－ｈｕＨＦ＋ｈｕＨＦ－ＰＤ１）を使用した。腫瘍が成長して治療を進行し、腫瘍特異的な免疫細胞が体内に産生されたと判断した３週間後、全ての実験群の腫瘍を手術により除去した。その後、再びＣＴ２６大腸癌細胞を全ての実験群に静脈注射で処理し、癌が発生するかを観察した。

【0177】

その結果、１）無処理群（No treat）では、癌が成長し続けるのに対して、６）第１タンパク質と第２タンパク質の併用投与群（ＡＨ１－ｈｕＨＦ＋ｈｕＨＦ－ＰＤ１）では、全てのマウスにおいて癌が成長しないか、または成長して数日で消えることを確認した。

【0178】

この実験では、Ｂａｌｂ／ｃマウスを使用した。各実験では実験群当たり５匹を使用した。癌細胞の転移有無に対しては、前記の全ての実験群で使用したマウスの肺を摘出し、癌結節（nodule）を数えて判断した（図１７）。

【0179】

１５．癌成長阻害を確認するためのインビトロ免疫実験ＩＩ
前記実施例１２と同様の方法で当該実験群（１）無処理群（No treat）、２）第１タンパク質処理群（ＡＨ１－ｈｕＨＦおよびｇｐ１００－ｈｕＨＦ）、３）抗体治療剤処理群（α－ＰＤ－Ｌ１）、４）第２タンパク質処理群（ｈｕＨＦ－ＰＤ１）、５）第１タンパク質と抗体治療剤の併用投与群（ＡＨ１－ｈｕＨＦ＋α－ＰＤ－Ｌ１およびｇｐ１００－ｈｕＨＦ＋α－ＰＤ－Ｌ１）、および、６）第１タンパク質と第２タンパク質の併用投与群（ＡＨ１－ｈｕＨＦ＋ｈｕＨＦ－ＰＤ１およびｇｐ１００－ｈｕＨＦ＋ｈｕＨＦ－ＰＤ１）のＴ細胞の活性反応を観察した。

【0180】

その結果、腫瘍ｒｅｃｈａｌｌｅｎｇｅ後も前記実施例１２で腫瘍成長抑制の結果が最も良好であった６番実験群（ＡＨ１－ｈｕＨＦ＋ｈｕＨＦ－ＰＤ１およびｇｐ１００－ｈｕＨＦ＋ｈｕＨＦ－ＰＤ１）でＴ細胞の活性が最も優れていることを再確認した（図１８）。

【0181】

１６．フェリチン単量体の様々な位置に疾患抗原エピトープが融合したタンパク質の製造
フェリチンのＮ末端とＡヘリックスの間にｇｐ１００が融合した構造、ＥヘリックスとＣ末端の間にｇｐ１００が融合した構造、Ｄヘリックスの内部にｇｐ１００が融合した構造、Ｅヘリックスの内部にｇｐ１００が融合した構造を製造した。

【0182】

図１９～２２、表２に示すベクターを実施例１の方法により製造した。このときは、表３のプライマーセットを使用した。

【0183】

タンパク質は実施例２の方法により合成し、後述する実施例１８の方法により溶解性、不溶性部分を確認し、実施例４の方法により、タンパク質が自己集合することを確認した。

【0184】

１７．トランスフェリンへの結合力の測定
製造したタンパク質のトランスフェリンへの結合力Ａを以下の方法により測定した。

【0185】

まず、ヘキサ－Ｈｉｓタグに特異的に結合する染料（RED－tris－NTA 2nd Generation Dye）を５０ｎＭの濃度で１００μｌ準備し、製造したタンパク質を２００ｎＭの濃度で１００μｌ準備し、これらを混合して常温で３０分間インキュベートした。それを遠心分離機で１３，０００ｒｐｍで４℃において１０分間遠心分離して上澄み液を分離し、染料標識されたタンパク質を得た。

【0186】

そして、９．６５μＭトランスフェリン受容体２５μｌを第１のＰＣＲチューブに添加し、第２～第１６のＰＣＲチューブにＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳ＋ｔｗｅｅｎ２０の０．５％）バッファーを１０μｌ添加し、第１のＰＣＲチューブのトランスフェリン１０μｌを第２のＰＣＲチューブに移し、第２のＰＣＲチューブから１０μｌをさらに第３のＰＣＲチューブに移した。このような操作を第１６のＰＣＲチューブまで行い、第２から第１６のＰＣＲチューブまでそれぞれ２０μｌとなるように１／２順次希釈を行った。

【0187】

その後、各々のＰＣＲチューブに前記の染料標識されたタンパク質を１０μｌずつ加え、常温で１時間反応を行った。

【0188】

その後、各チューブの反応液をマイクロスケール熱泳動（Microscale thermophoresis）装置のキャピラリに入れ、レーザーを照射していない状態における蛍光強度（homogeneous fluorescence intensity）Ｆ_coldを得た。そして、マイクロスケール熱泳動装置（Monolith NT．115）は、ＭＳＴパワーを４０％、ＬＥＤパワーを、得られる蛍光強度の値が１０，０００～１５，０００の範囲となるようにセットし、各キャピラリごとに３０秒間レーザーを照射して加熱した状態における蛍光強度Ｆ_hotを得た。

【0189】

その後、各キャピラリでの正規化された蛍光（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）Ｆ_norm（‰）（＝（Ｆ_hot／Ｆ_cold）×１０００）を得て、それから反応平衡状態（steady state）のキャピラリを求め、数学式１で表される濃度を得た。

【0190】

【表5】

【0191】

【表6】

【0192】

【表7】

【0193】

【表8】

【0194】

１８．タンパク質の水溶性画分の割合の測定
ｐＴ７－７ベースの様々な発現ベクターでＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（competent cell）を形質転換（transformation）した。単一コロニーをアンピシリン１００ｍｇ／Ｌが添加されたＬＢ液体培地（５０ｍＬ）に接種し、振とう培養機（shaking incubator）で３７℃、１３０ｒｐｍの条件で培養した。濁度（turbidity／optical density at 600nm）が０．５に達すると、ＩＰＴＧの１ｍＭを投与して標的タンパク質の発現を誘導した。その後、２０℃で１２～１６時間培養した後、培養液中の細胞を遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０分）によってスピンダウン（spun-down）し、細胞ペレットを回収して１０ｍＭＴｒｉｓ－Ｈｃｌ（ｐＨ７．４）バッファーに再浮遊させた。再浮遊された細胞は、ブランソンのソニファイアー（Branson Sonifier、Branson Ultrasonics Corp.、Danbury、CT）を用いて破裂した。音波処理後、溶解性タンパク質を含む上澄み液と不溶性タンパク質を含む凝集体は、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０分）で分離した。分離された溶解性、不溶性タンパク質画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって溶解度を分析した。すなわち、クマシー（Coomassie）で染色された標的タンパク質バンドは、濃度計（densitometer、Duoscan T1200、Bio－Rad、Hercules、CA）でスキャンした後、水溶性画分の割合を定量化した。具体的には、スキャンしたＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル画像を用いて、「ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ」プログラム「ＶｏｌｕｍｅＲｅｃｔ．Ｔｏｏｌ」でバンドの太さとバックグラウンドの値を設定した後、「ＶｏｌｕｍｅＡｎａｌｙｓｉｓＲｅｐｏｒｔ」を用いて、溶解性、不溶性タンパク質画分の合計を１００％に設定し、溶解度を定量化した。

【0195】

【表9】

【0196】

１９．免疫チェックポイント分子に結合する分子の使用
（１）ｈｕＨＦのＣ末端にマウススモールＰＤ１（配列番号８）が融合したタンパク質を製造し、その効能を確認した（図２３）。

【0197】

タンパク質は実施例２の方法により合成し、実施例１９の方法により溶解性、不溶性部分を確認し、実施例４の方法により、タンパク質が自己集合することを確認した。

【0198】

製造されるタンパク質のトランスフェリン受容体への結合力は、実施例１７の方法により測定した。数学式１で表される濃度は４４．６４９±１．３４ｎＭと確認された。

【0199】

タンパク質の腫瘍抑制能は、実施例１１の方法により評価した。

【0200】

具体的には、一定のサイズの大腸癌腫瘍（ＣＴ２６）が形成されたマウスＢａｌｂ／ｃに対して、３日間隔でＰＢＳ、ＰＤ－Ｌ１抗体、ｈｕＨＦ－ＰＤ１、ｈｕＨＦ－ｍｓｍＰＤ１タンパク質を静脈注射で注入した。観察の結果、ｈｕＨＦ－ｍｓｍＰＤ１タンパク質が抗体治療剤と類似した腫瘍治療効果を示すことが確認できた。実験では実験群当たり３匹を使用し、癌細胞のサイズは下記式で計算した。

【0201】

【数10】

【0202】

ここで、実験群としては、１）ＰＢＳ群、２）抗体治療剤処理群（α－ＰＤ－Ｌ１）、３）第１タンパク質処理群（ｈｕＨＦ－ＰＤ１）、４）第２タンパク質処理群（ｈｕＨＦ－ｍｓｍＰＤ１）を使用した。

【0203】

その結果を図２４に示す。

【0204】

前記結果から、免疫チェックポイント分子に結合する分子が融合したフェリチンの使用時の優れた抗癌能を確認できる。

【0205】

（２）ｈｕＨＦのＣ末端にｈｓｍＰＤ１が融合したタンパク質を製造し、その効能を確認した。

【0206】

ｈｕＨＦは、トランスフェリンとの結合部位（ＢＣループに存在）の一部のアミノ酸を置換したものであり、配列番号１の配列において８１、８３番目のアミノ酸がアラニンで置換されたタンパク質を使用した。

【0207】

これは、Ｑ５ＨｏｔＳｔａｒｔＨｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ２ＸＭａｓｔｅｒＭｉｘにフォワードプライマー（配列番号３９）、リバースプライマー（配列番号４０）の１０μＭ、鋳型ＤＮＡ（template DNA）であるｈｕＨＦ－ｈｓｍＰＤ１を混合して遺伝子の突然変異を行って得た。その後、実施例２の方法によりタンパク質を得た。

【0208】

ｈｓｍＰＤ１としては配列番号４１の配列を使用した。

【0209】

製造したタンパク質のｈ－ＰＤ－Ｌ１およびｍ－ＰＤ－Ｌ１への結合力を実施例１７の方法により測定した。ｈ－ＰＤ－Ｌ１への結合力は１３．４１７±１．９７ｎＭ、ｍ－ＰＤ－Ｌ１への結合力は１７７．１４±３．３２ｎＭと確認された。

【0210】

（３）フェリチンに免疫チェックポイント分子ＰＤ－Ｌ１とＴＩＧＩＴに結合する分子が融合したタンパク質を製造し、その効能を確認した。

【0211】

免疫チェックポイント分子に結合する分子としては抗体のＨＣＤＲ３配列を使用した。使用した配列は下記表１０に示す通りである。

【0212】

【表10】

【0213】

【表11】

【0214】

【表12】

【0215】

表１１のベクターを実施例１の方法により製造した。このときは、表１２のプライマーセットを使用した。タンパク質は実施例２の方法により合成した。タンパク質の腫瘍抑制能は、大腸癌細胞株（ＣＴ２６）をＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下接種し、図２５のスケジュールに従ってタンパク質を注射し、実施例１１の方法により評価した（図２６）。

【0216】

具体的には、一定のサイズの大腸癌腫瘍（ＣＴ２６）が形成されたマウスＢａｌｂ／ｃに対して、３日間隔でＰＢＳ、ＰＤ－Ｌ１抗体とＴＩＧＩＴ抗体、ｈｕＨＦ－ＰＤ－Ｌ１－ＴＩＧＩＴデュアルブロッカー（dual blocker）タンパク質を静脈注射で注入した。観察の結果、ｈｕＨＦ－ＰＤ－Ｌ１－ＴＩＧＩＴデュアルブロッカータンパク質が抗体治療剤と類似した腫瘍治療効果を示すことを確認した。実験では実験群当たり４匹を使用し、癌細胞のサイズは下記式で計算した。

【0217】

【数11】

【0218】

ここで、実験群は１）ＰＢＳ群、２）抗体治療剤併用処理群（α－ＰＤ－Ｌ１、α－ＴＩＧＩＴ）、３）タンパク質処理群（ｈｕＨＦ－ＰＤ－Ｌ１－ＴＩＧＩＴデュアルブロッカー）を使用した。

【0219】

また、各処理群ごとに腫瘍組織を摘出して重量を測定し、その結果を図２７に示す。この結果から、ＰＤ－Ｌ１とＴＩＧＩＴに結合する分子が融合したタンパク質の優れた抗癌効果を確認することができる。

【0220】

（４）免疫チェックポイント分子に結合する分子のフェリチン単量体への融合位置による効率の分析
α－ＰＤ－Ｌ１ＨＣＤＲ３がフェリチン単量体の互いに異なる位置に融合したタンパク質を製造し、腫瘍抑制能を確認した。

【0221】

α－ＰＤ－Ｌ１ＨＣＤＲ３がＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループ、ＤＥループ、Ｃ末端に融合したタンパク質を製造した（ＰＤＢ３ＡＪＯシーケンスを基準にｈｕＨＦ５Ｔ～１７６Ｇ中のＡＢループ、４５Ｄ／４６Ｖの間、ＢＣループ；９２Ｄ／９３Ｗ、ＣＤループ；１２６Ｄ／１２７Ｐ、ＤＥループ；１６２Ｅ／１６３Ｓ）。これは、前記表１０の配列を使用した以外は実施例１、２と同様の方法により製造した。

【0222】

製造したタンパク質の大腸癌細胞ターゲティング能を実施例６の方法により確認した。

【0223】

具体的には、ＦＩＴＣ蛍光物質が付着したｈｕＨＦ－αＰＤ－Ｌ１ＨＣＤＲ３（ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥループ、Ｃ末端）タンパク質のＣＴ２６大腸癌に対するターゲティング効率を比較するために、ＣＴ２６大腸癌細胞に３００ｎＭの濃度でタンパク質を反応させた後、蛍光シグナルを比較して細胞取込（cell uptake）効率を確認した。対照群であるｈｕＨＦタンパク質よりも、ｈｕＨＦ－αＰＤ－Ｌ１ＨＣＤＲ３（ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥループ、Ｃ末端）タンパク質の方が、癌細胞と結合して蛍光シグナルを示すことを確認した。

【0224】

結果を図２８に、その相対的な蛍光強度を図２９に示す。

【0225】

その結果、融合部位に関係なく、ｈｕＨＦタンパク質に比べて強いターゲティング能を示すことを確認した。

【0226】

２０．免疫チェックポイント分子に結合する分子としての抗体ＣＤＲの使用
（１）タンパク質製造用発現ベクターの構成
下記表１３の配列を使用し、下記の図２９～３６、表１４のベクター模式図に従ってＰＣＲを行い、ｈｕＨＦ－αＰＤ１ＨＣＤＲ３（Ｃ末端）、ｈｕＨＦ－αＣＴＬＡ４ＨＣＤＲ３（Ｃ末端）、ｈｕＨＦ αＴＩＧＩＴＨＣＤＲ３（Ｃ末端）、ｈｕＨＦ－αＬＡＧ３ＨＣＤＲ３（Ｃ末端）、ｈｕＨＦ－αＴＩＭ３ＨＣＤＲ３（Ｃ末端）、ｈｕＨＦ－αＰＤ－Ｌ１ＨＣＤＲ３（ＡＢループ）－αＴＩＧＩＴＨＣＤＲ３（Ｃ末端）（dual blocker）を製造した。製造した全てのプラスミド発現ベクターをアガロースゲルで精製し、完全なＤＮＡシーケンシングによって配列を確認した。

【0227】

具体的には、表１５のプライマーセットを用いて、各々の発現ベクターの製造に必要なＰＣＲ産物を順次にプラスミドｐＴ７－７ベクターに挿入し、各々のタンパク質ナノ粒子を発現できる発現ベクターを構成した。

【0228】

【表13】