特許 7541482 安定化ＲＳＶ Ｆタンパク質およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-08-20

(45)【発行日】2024-08-28

(54)【発明の名称】安定化ＲＳＶ Ｆタンパク質およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/08 20060101AFI20240821BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20240821BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20240821BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240821BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20240821BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20240821BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20240821BHJP

   A61K 47/10 20170101ALI20240821BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20240821BHJP

   A61K 47/12 20060101ALI20240821BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20240821BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20240821BHJP

   C12N 15/40 20060101ALN20240821BHJP

【ＦＩ】

C07K14/08

A61K39/12

A61P31/14

A61P37/04

A61K9/10

A61K47/02

A61K47/18

A61K47/10

A61K47/24

A61K47/12

A61K47/28

A61K39/39

C12N15/40 ZNA

【請求項の数】 25

(21)【出願番号】P 2020540744

(86)(22)【出願日】2019-01-24

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-05-06

(86)【国際出願番号】 US2019014873

(87)【国際公開番号】W WO2019147749

(87)【国際公開日】2019-08-01

【審査請求日】2022-01-21

(31)【優先権主張番号】62/623,184

(32)【優先日】2018-01-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】522242018

【氏名又は名称】メルク・シャープ・アンド・ドーム・エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉 道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】100143823

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 英彦

(74)【代理人】

【識別番号】100183519

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻田 芳恵

(74)【代理人】

【識別番号】100196483

【弁理士】

【氏名又は名称】川嵜 洋祐

(74)【代理人】

【識別番号】100160749

【弁理士】

【氏名又は名称】飯野 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100160255

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100182132

【弁理士】

【氏名又は名称】河野 隆

(74)【代理人】

【識別番号】100172683

【弁理士】

【氏名又は名称】綾 聡平

(74)【代理人】

【識別番号】100219265

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 崇大

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山 康文

(74)【代理人】

【識別番号】100203035

【弁理士】

【氏名又は名称】五味渕 琢也

(74)【代理人】

【識別番号】100202267

【弁理士】

【氏名又は名称】森山 正浩

(72)【発明者】

【氏名】チャン，ラン

(72)【発明者】

【氏名】フリードマン，アーサー

(72)【発明者】

【氏名】デュール，エベラール

(72)【発明者】

【氏名】ベット，アンドリュー

【審査官】市島 洋介

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１７／１７２８９０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１５／１３０５８４（ＷＯ，Ａ２）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

３つの組換えＲＳＶ Ｆペプチドを含む、組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質三量体であって、
ここで、該組換えＦペプチドは、配列番号：２６又は２７のいずれかで規定されるアミノ酸配列からなる、
組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質三量体。

【請求項2】

請求項１記載の組換えＲＳＶ Ｆタンパク質三量体及び薬学的に許容される担体を含むＲＳＶ免疫原性組成物。

【請求項3】

組換えＲＳＶ Ｆ三量体または組換えＲＳＶ Ｆペプチドに対する抗原特異的免疫応答を生成するための有効量で製剤化された、請求項２記載の免疫原性組成物。

【請求項4】

アジュバントで製剤化された、請求項２～３のいずれか１項記載の免疫原性組成物。

【請求項5】

アジュバントがアルミニウムアジュバントである、請求項４記載の免疫原性組成物。

【請求項6】

アルミニウムアジュバントが無定形ヒドロキシリン酸アルミニウム硫酸塩またはヒドロキシリン酸アルミニウムの水性懸濁液である、請求項５記載の免疫原性組成物。

【請求項7】

１以上のカチオン性脂質およびポリ（エチレングリコール）－脂質（ＰＥＧ脂質）を含む脂質ナノ粒子を更に含む、請求項２～６のいずれか１項記載の免疫原性組成物。

【請求項8】

前記の１以上のカチオン性脂質が、イオン化可能なカチオン性脂質である、請求項７記載の免疫原性組成物。

【請求項9】

イオン化可能なカチオン性脂質が、
ＤＬｉｎＤＭＡ；ＤｌｉｎＫＣ２ＤＭＡ；ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ；ＣＬｉｎＤＭＡ；Ｓ－オクチルＣＬｉｎＤＭＡ；
（２Ｓ）－１－｛７－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］ヘプチルオキシ｝－３－［（４Ｚ）－デカ－４－エン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン；
（２Ｒ）－１－｛４－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］ブトキシ｝－３－［（４Ｚ）－デカ－４－エン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン；
１－［（２Ｒ）－１－｛４－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］ブトキシ｝－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－イル］グアニジン；
１－［（２Ｒ）－１－｛７－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］ヘプチルオキシ｝－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン；
１－［（２Ｒ）－１－｛４－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］ブトキシ｝－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン；
（２Ｓ）－１－（｛６－［（３β））－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］ヘキシル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン；
（３β）－３－［６－｛［（２Ｓ）－３－［（９Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イルオキシ］－２－（ピロリジン－１－イル）プロピル］オキシ｝ヘキシル）オキシ］コレスタ－５－エン；
（２Ｒ）－１－｛４－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］ブトキシ｝－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン；
（２Ｒ）－１－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（ペンチルオキシ）プロパン－２－アミン；
（２Ｒ）－１－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－３－（ヘプチルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン；
（２Ｒ）－１－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（２Ｚ）－ペンタ－２－エン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン；
（２Ｓ）－１－ブトキシ－３－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン；
（２Ｓ－１－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－３－［２，２，３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，９，９－ヘキサデカフルオロノニル）オキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン；
２－アミノ－２－｛［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］メチル｝プロパン－１，３－ジオール；
２－アミノ－３－（（９－（（（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ）－１０，１３－ジメチル－１７－（６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）ノニル）オキシ）－２－（（（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）オキシ）メチル）プロパン－１－オール；
２－アミノ－３－（（６－（（（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ）－１０，１３－ジメチル－１７－（６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）ヘキシル）オキシ）－２－（（（（Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イル）オキシ）メチル）プロパン－１－オール；
（２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－２０，２３－ジエン－１０－アミン；
（１７Ｚ，２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘキサコサ－１７，２０－ジエン－９－アミン；
（１６Ｚ，１９Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタコサ－１６，１９－ジエン－８－アミン；
（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルドコサ－１３，１６－ジエン－５－アミン；
（１２Ｚ，１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘニコサ－１２，１５－ジエン－４－アミン；
（１４Ｚ，１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリコサ－１４，１７－ジエン－６－アミン；
（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルテトラコサ－１５，１８－ジエン－７－アミン；
（１８Ｚ，２１Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－１８，２１－ジエン－１０－アミン；
（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルテトラコサ－１５，１８－ジエン－５－アミン；
（１４Ｚ，１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリコサ－１４，１７－ジエン－４－アミン；
（１９Ｚ，２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルオクタコサ－１９，２２－ジエン－９－アミン；
（１８Ｚ，２１Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－１８，２１－ジエン－８－アミン；
（１７Ｚ，２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘキサコサ－１７，２０－ジエン－７－アミン；
（１６Ｚ，１９Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタコサ－１６，１９－ジエン－６－アミン；
（２２Ｚ，２５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘントリアコンタ－２２，２５－ジエン－１０－アミン；
（２１Ｚ，２４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリアコンタ－２１，２４－ジエン－９－アミン；
（１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－１８－エン－１０－アミン；
（１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘキサコサ－１７－エン－９－アミン；
（１９Ｚ，２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルオクタコサ－１９，２２－ジエン－７－アミン；
Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサン－１０－アミン；
（２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ－エチル－Ｎ－メチルノナコサ－２０，２３－ジエン－１０－アミン；
１－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－１－ノニルイコサ－１１，１４－ジエン－１－イル］ピロリジン；
（２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－２０－エン－１０－アミン；
（１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－１５－エン－１０－アミン；
（１４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－１４－エン－１０－アミン；
（１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－１７－エン－１０－アミン；
（２４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリトリアコンタ－２４－エン－１０－アミン；
（２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－２０－エン－１０－アミン；
（２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘントリアコンタ－２２－エン－１０－アミン；
（１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタコサ－１６－エン－８－アミン；
（１２Ｚ，１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２－ノニルヘニコサ－１２，１５－ジエン－１－アミン；
（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニルドコサ－１３，１６－ジエン－１－アミン；
Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘプタデカン－８－アミン；
１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－ヘキシルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナデカン－１０－アミン；
Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ノナデカン－１０－アミン；
Ｎ，Ｎ－ジメチル－２１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘニコサン－１０－アミン；
Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｓ）－２－｛［（１Ｒ，２Ｒ）－２－ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］ノナデカン－１０－アミン；
Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘキサデカン－８－アミン；
Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｒ，２Ｓ）－２－ウンデシルシクロプロピル］テトラデカン－５－アミン；
Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－｛７－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘプチル｝ドデカン－１－アミン；
１－［（１Ｒ，２Ｓ）－２－ヘプチルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルオクタデカン－９－アミン；
１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－デシルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタデカン－６－アミン；
Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ペンタデカン－８－アミン；および
（１１Ｅ，２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－１１，２０，２３－トリエン－１０－アミン；
またはそれらの薬学的に許容される塩または前記のいずれかの立体異性体
から選択される、請求項８記載の免疫原性組成物。

【請求項10】

イオン化可能なカチオン性脂質が、（２Ｓ）－１－（｛６－［（３β））－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］ヘキシル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニルドコサ－１３，１６－ジエン－１－アミン；およびＮ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘプタデカン－８－アミン、またはそれらの薬学的に許容される塩または前記のいずれかの立体異性体からなる群から選択される、請求項９記載の免疫原性組成物。

【請求項11】

３０～７５モル％のイオン化可能なカチオン性脂質および０．１～２０モル％のＰＥＧ脂質を含む、請求項１０記載の免疫原性組成物。

【請求項12】

リン脂質、リン脂質誘導体、脂肪酸、及び、ステロール、または、それらの組合せから選択される１以上の非カチオン性脂質を更に含む、請求項７～１１のいずれか１項記載の免疫原性組成物。

【請求項13】

ステロールがコレステロール、スチグマステロールまたはスチグマスタノールである、請求項１２記載の免疫原性組成物。

【請求項14】

リン脂質が、ホスファチジルセリン、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジパルミトレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１、２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジエイコセノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリンおよび１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）から選択される、請求項１２記載の免疫原性組成物。

【請求項15】

ＰＥＧ－脂質が、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＧ）、ＰＥＧ－ジパルメトレイル、ＰＥＧ－ジオレイル、ＰＥＧ－ジステアリル、ＰＥＧ－ジアシルグリカミド（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＤＰＰＥ）またはＰＥＧ－１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－アミン（ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ）である、請求項７～１４のいずれか１項記載の免疫原性組成物。

【請求項16】

２０～９９．８モル％のイオン化可能なカチオン性脂質、０．１～６５モル％の非カチオン性脂質および０．１～２０モル％のＰＥＧ－脂質を含む、請求項１２～１５のいずれか１項記載の免疫原性組成物。

【請求項17】

非カチオン性脂質がコレステロールとＤＳＰＣとの混合物を含む、請求項１６記載の免疫原性組成物。

【請求項18】

（２Ｓ）－１－（｛６－［（３β））－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］ヘキシル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン、（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニルドコサ－１３，１６－ジエン－１－アミンおよびＮ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘプタデカン－８－アミンからなる群から選択される３４～５９モル％のイオン化可能なカチオン性脂質、３０～４８モル％のコレステロール、１０～２４％のＤＳＰＣおよび１～２モル％のＰＥＧ－ＤＭＧを含む、請求項１２記載の免疫原性組成物。

【請求項19】

対象におけるＲＳＶ Ｆタンパク質に対する免疫応答を生成させるための、請求項１記載のＲＳＶ Ｆタンパク質三量体又は請求項２記載のＲＳＶ免疫原性組成物。

【請求項20】

対象が、ＲＳＶ Ｆタンパク質三量体またはＲＳＶ免疫原性組成物の単一用量を投与される、請求項１９記載のＲＳＶ Ｆタンパク質三量体又はＲＳＶ免疫原性組成物。

【請求項21】

対象が、ＲＳＶ Ｆタンパク質三量体またはＲＳＶ免疫原性組成物の、少なくとも１つのブースター用量を投与される、請求項１９記載のＲＳＶ Ｆタンパク質三量体又はＲＳＶ免疫原性組成物。

【請求項22】

対象が、ＲＳＶ Ｆタンパク質三量体またはＲＳＶ免疫原性組成物を皮内注射または筋肉内注射により投与される、請求項１９～２１のいずれか１項記載のＲＳＶ Ｆタンパク質三量体又はＲＳＶ免疫原性組成物。

【請求項23】

対象がＲＳＶウイルスに曝露されているか、対象がＲＳＶウイルスに感染しているか、または、対象がＲＶＳウイルスによる感染のリスクを有する、請求項１９～２２のいずれか１項記載のＲＳＶ Ｆタンパク質三量体又はＲＳＶ免疫原性組成物。

【請求項24】

対象においてＲＳＶ Ｆタンパク質免疫応答を誘導する方法における使用のための、請求項１記載のＲＳＶ Ｆタンパク質三量体または請求項２～１８のいずれか１項記載のＲＳＶ免疫原性組成物であって、
該方法が、対象に抗原特異的免疫応答を生成させるのに有効な量のＲＳＶ Ｆタンパク質三量体またはＲＳＶ免疫原性組成物を対象に投与することを含む、ＲＳＶ Ｆタンパク質三量体またはＲＳＶ免疫原性組成物。

【請求項25】

対象においてＲＳＶ Ｆタンパク質免疫応答を誘導する方法において使用するための医薬の製造における、請求項１記載のＲＳＶ Ｆタンパク質三量体または請求項２～１８のいずれか１項記載のＲＳＶ免疫原性組成物の使用であって、
該方法が、対象に抗原特異的免疫応答を生成させるのに有効な量のＲＳＶ Ｆタンパク質三量体またはＲＳＶ免疫原性組成物を対象に投与することを含む、使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、安定なＲＳＶ Ｆタンパク質およびそれを含有する免疫原性組成物、ならびに、ＲＳＶ Ｆタンパク質を含む免疫原性組成物および組成物の使用方法に関する。

【0002】

関連出願に対する相互参照
本出願は２０１８年１月２９日付け出願の米国仮特許出願第６２／６２３，１８４号（その内容の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）の利益を主張するものである。

【0003】

電子的に提出された配列表に対する言及
本出願の配列表は、ファイル名「２４５６６ＷＯＰＣＴ－ＳＥＱＬＩＳＴ－１８ＪＡＮ２０１９．ＴＸＴ」、作成日２０１９年１月１８日およびサイズ１６７ｋｂを有するＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出されたこの配列表は本明細書の一部であり、その全体を参照により本明細書に組み入れることとする。

【背景技術】

【0004】

呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）はニューモウイルス科のメンバーである。ＲＳＶ感染は、幼児および高齢者（６５歳以上）の両方における下気道感染の主要原因である。現在、利用可能な認可されたワクチンは存在せず、治療選択肢は限られている。

【0005】

ＲＳＶのエンベロープは３つの表面糖タンパク質、すなわち、Ｆ、ＧおよびＳＨを含有する。ＧおよびＦタンパク質は防御抗原であり、中和抗体の標的である。しかし、Ｆタンパク質は、ＲＳＶ株および型（ＡおよびＢ）の間でより保存されている。ＲＳＶ Ｆは、準安定融合前形態から非常に安定な融合後形態へと、構造的に再編成するＩ型ウイルス融合タンパク質である。中和モノクローナル抗体の標的はＦタンパク質の融合後コンホメーション上に存在するが、中和Ａｂ応答は主に、ＲＳＶに自然感染した人々におけるＦタンパク質融合前コンホメーションを標的とする（Ｍａｇｒｏ Ｍら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ；１０９（８）：３０８９－９４，２０１２；Ｎｇｗｕｔａ ＪＯら，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１５；７（３０９）：３０９ｒａ１６２）。したがって、融合前コンホメーションにおいて安定化された操作されたＲＳＶ Ｆタンパク質は、ＲＳＶ Ｆワクチン抗原を開発するための魅力的な戦略である。例えば、「ＤＳ－Ｃａｖ１」置換（１５５Ｃ、２９０Ｃ、１９０Ｆおよび２０７Ｌ）を含む組換えＲＳＶ Ｆ三量体は、融合後Ｆに基づくＲＳＶ免疫原に関して観察される応答よりも大きい、動物モデルおける中和免疫応答を誘発することが既に示されている（ＭｃＬｅｌｌａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４２：５９２－５９８，２０１３）。関心のある融合前形態においてより一層安定である新規ＲＳＶ抗原を本明細書に記載する。

【発明の概要】

【0006】

発明の概括
本開示は、９８～１４６位におけるＲＳＶ Ｆ野生型アミノ酸の欠失をそれぞれが含む３つの組換えＲＳＶ Ｆペプチドと、ＲＳＶ Ｆ野生型アミノ酸の９７位と１４７位との間の８～１４アミノ酸のリンカーとを含む組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆ三量体を提供し、ここで、該組換えＦペプチドは、融合前コンホメーションにおける組換えＲＳＶ Ｆ三量体を安定化させる以下の修飾を含む：（ｉ）１９０Ｆおよび２０７Ｌアミノ酸置換、（ｉｉ）１５５Ｃおよび２９０Ｃアミノ酸置換、ならびに、以下の（ａ）～（ｆ）の１つ（またはそれ以上）：（ａ）４８６Ｃおよび４９０Ｃアミノ酸置換；（ｂ）１８０Ｃおよび１８６Ｃアミノ酸置換；（ｃ）４８６Ｃおよび４８９Ｃアミノ酸置換；（ｄ）５１２Ｃおよび５１３Ｃアミノ酸置換；（ｅ）５０５Ｃアミノ酸置換；および（ｆ）ＲＳＶ Ｆ野生型アミノ酸４８２～５１３の欠失。１つの実施形態においては、各ＲＳＶ Ｆペプチドは、ＲＳＶ Ｆ野生型膜貫通ドメインと細胞質ドメインとの欠失をＣ末端に更に含む（例えば、Ｃ末端にＲＳＶ Ｆ野生型アミノ酸５２５～５７４の欠失を含む）。もう１つの実施形態においては、各ＲＳＶ Ｆペプチドは、ＲＳＶ Ｆ野生型アミノ酸５１４～５７４の欠失を含む。

【0007】

組換えＲＳＶ Ｆ三量体の１つの実施形態においては、組換えＦペプチドのそれぞれは、各ペプチドのＣ末端にフォールドン（ｆｏｌｄｏｎ）配列を更に含む。もう１つの実施形態においては、フォールドンドメインの配列は該ペプチドのＣ末端から始まり、ＲＳＶ Ｆ野生型膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに取って代わる（例えば、フォールドンドメインは、ＲＳＶ Ｆ野生型アミノ酸５２５～５７４に取って代わる）。もう１つの実施形態においては、フォールドンドメインの配列は、野生型ＲＳＶ Ｆのアミノ酸５１３位の後から始まる（すなわち、フォールドン配列は野生型ＲＳＶ－Ｆのアミノ酸５１４～５７４に取って代わる）。もう１つの実施形態においては、ＲＳＶ Ｆペプチドが野生型ＲＳＶ Ｆのアミノ酸４８２～５１３の追加の欠失を含有する場合、フォールドンドメインの配列は、野生型ＲＳＶ Ｆのアミノ酸４８１位の後から始まる（例えば、配列番号４４を参照されたい）。幾つかの実施形態においては、フォールドン配列は配列番号８を含む。

【0008】

ＲＳＶ Ｆ三量体の１つの実施形態においては、組換えＦペプチドはそれぞれ、１９０Ｆおよび２０７Ｌアミノ酸置換、１５５Ｃおよび２９０Ｃアミノ酸置換、４８６Ｃおよび４９０Ｃアミノ酸置換、ならびに野生型ＲＳＶ Ｆのアミノ酸５１４～５７４の欠失を含む。１つの実施形態においては、各組換えＦペプチドは、１５５Ｃおよび２９０Ｃアミノ酸置換により導入されたシステインの間の非天然のペプチド内ジスルフィド結合を更に含む。もう１つの実施形態においては、ＲＳＶ Ｆ三量体は、４８６Ｃおよび４９０Ｃアミノ酸置換により導入されたシステインの間の１以上の非天然のペプチド間ジスルフィド結合を含む。もう１つの実施形態においては、組換えＲＳＶ ＦペプチドのＣ末端はそれぞれ、フォールドンドメインの配列を含む。もう１つの実施形態においては、フォールドンドメインの配列は配列番号８を含む。

【0009】

ＲＳＶ Ｆ三量体の１つの実施形態においては、組換えＦペプチドはそれぞれ、１９０Ｆおよび２０７Ｌアミノ酸置換、１５５Ｃおよび２９０Ｃアミノ酸置換、１８０Ｃおよび１８６Ｃアミノ酸置換、ならびに野生型ＲＳＶ Ｆのアミノ酸５１４～５７４の欠失を含む。１つの実施形態においては、各組換えＲＳＶ Ｆペプチドは、１５５Ｃおよび２９０Ｃアミノ酸置換により導入されたシステインの間の非天然のペプチド内ジスルフィド結合および／または１９０Ｃおよび１８６Ｃアミノ酸置換により導入されたシステインの間の非天然のペプチド内ジスルフィド結合を更に含む。もう１つの実施形態においては、組換えＲＳＶ ＦペプチドのＣ末端はそれぞれ、フォールドンドメインの配列を含む。もう１つの実施形態においては、フォールドンドメインの配列は配列番号８を含む。

【0010】

組換えＲＳＶ Ｆ三量体の１つの実施形態においては、組換えＦペプチドはそれぞれ、１９０Ｆおよび２０７Ｌアミノ酸置換、１５５Ｃおよび２９０Ｃアミノ酸置換、４８６Ｃおよび４８９Ｃアミノ酸置換、ならびに野生型ＲＳＶ Ｆのアミノ酸５１４～５７４の欠失を含む。１つの実施形態においては、各組換えＲＳＶ Ｆペプチドは、１５５Ｃおよび２９０Ｃアミノ酸置換により導入されたシステインの間の非天然のペプチド内ジスルフィド結合を更に含む。もう１つの実施形態においては、ＲＳＶ Ｆ三量体は、４８６Ｃおよび４８９Ｃアミノ酸置換により導入されたシステインの間の非天然のペプチド間ジスルフィド結合を含む。もう１つの実施形態においては、組換えＲＳＶ ＦペプチドのＣ末端はそれぞれ、フォールドンドメインの配列を含む。もう１つの実施形態においては、フォールドンドメインの配列は配列番号８を含む。

【0011】

ＲＳＶ三量体の１つの実施形態においては、組換えＦペプチドはそれぞれ、１９０Ｆおよび２０７Ｌアミノ酸置換、１５５Ｃおよび２９０Ｃアミノ酸置換、５１２Ｃおよび５１３Ｃアミノ酸置換、ならびに野生型ＲＳＶ Ｆのアミノ酸５１４～５７４の欠失を含む。１つの実施形態においては、各組換えＲＳＶ Ｆペプチドは、１５５Ｃおよび２９０Ｃアミノ酸置換により導入されたシステインの間の非天然のペプチド内ジスルフィド結合を更に含む。もう１つの実施形態においては、ＲＳＶ Ｆ三量体は、５１２Ｃおよび５１３Ｃアミノ酸置換により導入されたシステインの間の非天然のペプチド間ジスルフィド結合を含む。もう１つの実施形態においては、組換えＲＳＶ ＦペプチドのＣ末端はそれぞれ、フォールドンドメインの配列を含む。もう１つの実施形態においては、フォールドンドメインの配列は配列番号８を含む。

【0012】

組換えＲＳＶ Ｆ三量体の１つの実施形態においては、組換えＦペプチドはそれぞれ、１９０Ｆおよび２０７Ｌアミノ酸置換、１５５Ｃおよび２９０Ｃアミノ酸置換、５０５Ｃアミノ酸置換、ならびに野生型ＲＳＶ Ｆのアミノ酸５１４～５７４の欠失を含む。もう１つの実施形態においては、各組換えＲＳＶ Ｆペプチドは、１５５Ｃおよび２９０Ｃアミノ酸置換により導入されたシステインの間の非天然のペプチド内ジスルフィド結合を更に含む。もう１つの実施形態においては、組換えＲＳＶ ＦペプチドのＣ末端はそれぞれ、フォールドンドメインの配列を含む。もう１つの実施形態においては、フォールドンドメインの配列は配列番号８を含む。

【0013】

組換えＲＳＶ Ｆ三量体の１つの実施形態においては、組換えＦペプチドはそれぞれ、１９０Ｆおよび２０７Ｌアミノ酸置換、１５５Ｃおよび２９０Ｃアミノ酸置換、ならびに野生型ＲＳＶ Ｆのアミノ酸４８２～５１３の欠失、ならびに野生型ＲＳＶ Ｆのアミノ酸５１４～５７４の欠失を含む。１つの実施形態においては、各組換えＲＳＶ Ｆペプチドは、１５５Ｃおよび２９０Ｃアミノ酸置換により導入されたシステインの間の非天然のペプチド内ジスルフィド結合を更に含む。もう１つの実施形態においては、組換えＲＳＶ ＦペプチドのＣ末端はそれぞれ、フォールドンドメインの配列を含む。もう１つの実施形態においては、フォールドンドメインの配列は配列番号８を含む。

【0014】

１つの実施形態においては、リンカーは、８、１０、１２または１４アミノ酸長である。１つの実施形態においては、リンカーは、配列番号４６に示されているアミノ酸配列を含む。もう１つの実施形態においては、リンカーは、配列番号１、２、３または４のいずれかに示されているアミノ酸配列を有する。

【0015】

１つの実施形態においては、ＲＳＶ Ｆ三量体の組換えＦペプチドはそれぞれ、配列番号２２に示されている成熟アミノ酸配列を含む、実質的にそれからなる、またはそれからなる。１つの実施形態においては、ＲＳＶ Ｆ三量体の組換えＦペプチドはそれぞれ、配列番号２４に示されている成熟アミノ酸配列を含む、実質的にそれからなる、またはそれからなる。１つの実施形態においては、ＲＳＶ Ｆ三量体の組換えＦペプチドはそれぞれ、配列番号２６に示されている成熟アミノ酸配列を含む、実質的にそれからなる、またはそれからなる。１つの実施形態においては、ＲＳＶ Ｆ三量体の組換えＦペプチドはそれぞれ、配列番号２８に示されている成熟アミノ酸配列を含む、実質的にそれからなる、またはそれからなる。１つの実施形態においては、ＲＳＶ Ｆ三量体の組換えＦペプチドはそれぞれ、配列番号３０に示されている成熟アミノ酸配列を含む、実質的にそれからなる、またはそれからなる。１つの実施形態においては、ＲＳＶ Ｆ三量体の組換えＦペプチドはそれぞれ、配列番号４４に示されている成熟アミノ酸配列を含む、実質的にそれからなる、またはそれからなる。

【0016】

本開示はまた、９８～１４６位におけるＲＳＶ Ｆ野生型アミノ酸の欠失をそれぞれが含む３つの組換えＲＳＶ Ｆペプチドと、ＲＳＶ Ｆ野生型アミノ酸の９７位と１４７位との間の８～１４アミノ酸のリンカーとを含む組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆ三量体を含むＲＳＶ免疫原性組成物を提供し、ここで、該組換えＦペプチドは、融合前コンホメーションにおける組換えＲＳＶ Ｆ三量体を安定化させる以下の修飾を含む：（ｉ）１９０Ｆおよび２０７Ｌアミノ酸置換、（ｉｉ）１５５Ｃおよび２９０Ｃアミノ酸置換、ならびに、以下の（ａ）～（ｆ）の１つ（またはそれ以上）：（ａ）４８６Ｃおよび４９０Ｃアミノ酸置換；（ｂ）１８０Ｃおよび１８６Ｃアミノ酸置換；（ｃ）４８６Ｃおよび４８９Ｃアミノ酸置換；（ｄ）５１２Ｃおよび５１３Ｃアミノ酸置換；（ｅ）５０５Ｃアミノ酸置換；および（ｆ）ＲＳＶ Ｆ野生型アミノ酸４８２～５１３の欠失。１つの実施形態においては、各ＲＳＶ Ｆペプチドは、Ｃ末端に、ＲＳＶ Ｆ野生型膜貫通ドメインの欠失および細胞質ドメインの欠失を更に含む（例えば、Ｃ末端にＲＳＶ Ｆ野生型アミノ酸５２５～５７４の欠失を含む）。もう１つの実施形態においては、各ＲＳＶ Ｆペプチドは、ＲＳＶ Ｆ野生型アミノ酸５１４～５７４の欠失を含む。

【0017】

免疫原性組成物の１つの実施形態においては、組換えＦペプチドのそれぞれは各ペプチドのＣ末端にフォールドン配列を更に含む。もう１つの実施形態においては、フォールドンドメインの配列は、野生型ＲＳＶ Ｆのアミノ酸５１３位の後から始まる（すなわち、フォールドン配列は野生型ＲＳＶ－Ｆのアミノ酸５１４～５７４に取って代わる）。もう１つの実施形態においては、ＲＳＶ Ｆペプチドが野生型ＲＳＶ Ｆのアミノ酸４８２～５１３の追加の欠失を含有する場合、フォールドンドメインの配列は野生型ＲＳＶ Ｆのアミノ酸４８１位の後から始まる（例えば、配列番号４４を参照されたい）。幾つかの実施形態においては、フォールドン配列は配列番号８を含む。

【0018】

免疫原性組成物の１つの実施形態においては、ＲＳＶ Ｆ三量体は、本明細書に記載されているＲＳＶ三量体のいずれかである。免疫原性組成物のもう１つの実施形態においては、ＲＳＶ Ｆ三量体の組換えＦペプチドはそれぞれ、配列番号２２、２４、２６、２８、３０および４４のいずれかに示されている成熟アミノ酸配列を含む、実質的にそれらからなる、またはそれらからなる。

【0019】

本開示はまた、９８～１４６位のＲＳＶ Ｆ野生型アミノ酸の欠失と、ＲＳＶ Ｆ野生型の９７位と１４７位との間の８～１４アミノ酸のリンカーと、融合前コンホメーションにおけるそのような組換えＲＳＶペプチドの３つを含有する組換えＲＳＶ Ｆ三量体を安定化させるための追加的修飾とを含むＲＳＶペプチドを提供する。該一本鎖ＲＳＶペプチドにおけるそのような追加的修飾は、（ｉ）１９０Ｆおよび２０７Ｌアミノ酸置換、（ｉｉ）１５５Ｃおよび２９０Ｃアミノ酸置換、ならびに、以下の（ａ）～（ｆ）の１つ（またはそれ以上）を含む：（ａ）４８６Ｃおよび４９０Ｃアミノ酸置換；（ｂ）１８０Ｃおよび１８６Ｃアミノ酸置換；（ｃ）４８６Ｃおよび４８９Ｃアミノ酸置換；（ｄ）５１２Ｃおよび５１３Ｃアミノ酸置換；（ｅ）５０５Ｃアミノ酸置換；および（ｆ）ＲＳＶ Ｆ野生型アミノ酸４８２～５１３の欠失。１つの実施形態においては、ＲＳＶ Ｆペプチドは、Ｃ末端に、ＲＳＶ Ｆ野生型膜貫通ドメインの欠失および細胞質ドメインの欠失を更に含む（例えば、Ｃ末端にＲＳＶ Ｆ野生型アミノ酸５２５～５７４の欠失を含む）。もう１つの実施形態においては、ＲＳＶ ＦペプチドはＲＳＶ Ｆ野生型アミノ酸５１４～５７４の欠失を含む。

【0020】

１つの実施形態においては、ＲＳＶ ＦペプチドはＣ末端にフォールドン配列を更に含む。もう１つの実施形態においては、フォールドンドメインの配列は野生型ＲＳＶ Ｆのアミノ酸５１３位の後から始まる（すなわち、フォールドン配列は野生型ＲＳＶ－Ｆのアミノ酸５１４～５７４に取って代わる）。もう１つの実施形態においては、ＲＳＶ Ｆペプチドが野生型ＲＳＶ Ｆのアミノ酸４８２～５１３の追加の欠失を含有する場合、フォールドンドメインの配列は野生型ＲＳＶ Ｆのアミノ酸４８２位の後から始まる（例えば、配列番号４４を参照されたい）。幾つかの実施形態においては、フォールドン配列は配列番号８を含む。

【0021】

１つの実施形態においては、ＲＳＶ Ｆペプチドは１９０Ｆおよび２０７Ｌアミノ酸置換、１５５Ｃおよび２９０Ｃアミノ酸置換、４８６Ｃおよび４９０Ｃアミノ酸置換、ならびに野生型ＲＳＶ Ｆのアミノ酸５１４～５７４の欠失を含む。１つの実施形態においては、ＲＳＶ Ｆペプチドは、１５５Ｃおよび２９０Ｃアミノ酸置換により導入されたシステインの間の非天然のペプチド内ジスルフィド結合を更に含む。もう１つの実施形態においては、ＲＳＶ ＦペプチドのＣ末端はフォールドンドメインの配列を含む。もう１つの実施形態においては、フォールドンドメインの配列は配列番号８を含む。

【0022】

１つの実施形態においては、ＲＳＶ Ｆペプチドは、１９０Ｆおよび２０７Ｌアミノ酸置換、１５５Ｃおよび２９０Ｃアミノ酸置換、１８０Ｃおよび１８６Ｃアミノ酸置換、ならびに野生型ＲＳＶ Ｆのアミノ酸５１４～５７４の欠失を含む。１つの実施形態においては、ＲＳＶ Ｆペプチドは、１５５Ｃおよび２９０Ｃアミノ酸置換により導入されたシステインの間の非天然のペプチド内ジスルフィド結合ならびに／または１９０Ｃおよび１８６Ｃアミノ酸置換により導入されたシステインの間の非天然のペプチド内ジスルフィド結合を更に含む。もう１つの実施形態においては、ＲＳＶ ＦペプチドのＣ末端はフォールドンドメインの配列を含む。もう１つの実施形態においては、フォールドンドメインの配列は配列番号８を含む。

【0023】

１つの実施形態においては、ＲＳＶ Ｆペプチドは、１９０Ｆおよび２０７Ｌアミノ酸置換、１５５Ｃおよび２９０Ｃアミノ酸置換、４８６Ｃおよび４８９Ｃアミノ酸置換、ならびに野生型ＲＳＶ Ｆのアミノ酸５１４～５７４の欠失を含む。１つの実施形態においては、ＲＳＶ Ｆペプチドは、１５５Ｃおよび２９０Ｃアミノ酸置換により導入されたシステインの間の非天然のペプチド内ジスルフィド結合を更に含む。もう１つの実施形態においては、ＲＳＶ ＦペプチドのＣ末端はフォールドンドメインの配列を含む。もう１つの実施形態においては、フォールドンドメインの配列は配列番号８を含む。

【0024】

１つの実施形態においては、ＲＳＶ Ｆペプチドは、１９０Ｆおよび２０７Ｌアミノ酸置換、１５５Ｃおよび２９０Ｃアミノ酸置換、５１２Ｃおよび５１３Ｃアミノ酸置換、ならびに野生型ＲＳＶ Ｆのアミノ酸５１４～５７４の欠失を含む。１つの実施形態においては、ＲＳＶ Ｆペプチドは、１５５Ｃおよび２９０Ｃアミノ酸置換により導入されたシステインの間の非天然のペプチド内ジスルフィド結合を更に含む。もう１つの実施形態においては、ＲＳＶ ＦペプチドのＣ末端はフォールドンドメインの配列を含む。もう１つの実施形態においては、フォールドンドメインの配列は配列番号８を含む。

【0025】

１つの実施形態においては、ＲＳＶ Ｆペプチドは、１９０Ｆおよび２０７Ｌアミノ酸置換、１５５Ｃおよび２９０Ｃアミノ酸置換、５０５Ｃアミノ酸置換、ならびに野生型ＲＳＶ Ｆのアミノ酸５１４～５７４の欠失を含む。もう１つの実施形態においては、ＲＳＶ Ｆペプチドは、１５５Ｃおよび２９０Ｃアミノ酸置換により導入されたシステインの間の非天然のペプチド内ジスルフィド結合を更に含む。もう１つの実施形態においては、ＲＳＶ ＦペプチドのＣ末端はフォールドンドメインの配列を含む。もう１つの実施形態においては、フォールドンドメインの配列は配列番号８を含む。

【0026】

１つの実施形態においては、ＲＳＶ Ｆペプチドは、１９０Ｆおよび２０７Ｌアミノ酸置換、１５５Ｃおよび２９０Ｃアミノ酸置換、ならびに野生型ＲＳＶ Ｆのアミノ酸４８２～５１３の欠失、ならびに野生型ＲＳＶ Ｆのアミノ酸５１４～５７４の欠失を含む。１つの実施形態においては、ＲＳＶ Ｆペプチドは、１５５Ｃおよび２９０Ｃアミノ酸置換により導入されたシステインの間の非天然のペプチド内ジスルフィド結合を更に含む。もう１つの実施形態においては、ＲＳＶ ＦペプチドのＣ末端はそれぞれ、フォールドンドメインの配列を含む。もう１つの実施形態においては、フォールドンドメインの配列は配列番号８を含む。

【0027】

１つの実施形態においては、リンカーは、８、１０、１２または１４アミノ酸長である。１つの実施形態においては、リンカーは、配列番号４６に示されているアミノ酸配列を含む。もう１つの実施形態においては、リンカーは、配列番号１、２、３または４のいずれかに示されているアミノ酸配列を有する。

【0028】

１つの実施形態においては、ＲＳＶ Ｆペプチドは、配列番号２２に示されている成熟アミノ酸配列を含む、実質的にそれからなる、またはそれからなる。１つの実施形態においては、ＲＳＶ Ｆペプチドは、配列番号２４に示されている成熟アミノ酸配列を含む、実質的にそれからなる、またはそれからなる。１つの実施形態においては、ＲＳＶ Ｆペプチドは、配列番号２６に示されている成熟アミノ酸配列を含む、実質的にそれからなる、またはそれからなる。１つの実施形態においては、ＲＳＶ Ｆペプチドは、配列番号２８に示されている成熟アミノ酸配列を含む、実質的にそれからなる、またはそれからなる。１つの実施形態においては、ＲＳＶ Ｆペプチドは、配列番号３０に示されている成熟アミノ酸配列を含む、実質的にそれからなる、またはそれからなる。１つの実施形態においては、ＲＳＶ Ｆペプチドは、配列番号４４に示されている成熟アミノ酸配列を含む、実質的にそれからなる、またはそれからなる。

【0029】

１つの実施形態においては、ＲＳＶペプチドは、組換え法により産生された場合、本明細書に記載されているＲＳＶ Ｆ三量体を形成する。

【0030】

本開示はまた、本明細書に記載されている一本鎖ＲＳＶペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。１つの実施形態においては、単離された核酸分子はＤＮＡ分子である。本開示は更に、該核酸分子を含むベクターを提供する。

【0031】

本開示はまた、本明細書に記載されている組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆ三量体の製造方法を提供し、該方法は、（ｉ）それぞれ前記に記載されている核酸分子またはベクターを発現させること、および（ｉｉ）それから産生された組換えＲＳＶ Ｆ三量体を精製することを含む。

【0032】

本開示はまた、本明細書に記載されているＲＳＶ Ｆ三量体に対する、または本明細書に記載されているＲＳＶ Ｆペプチドに対する全長抗体および抗体誘導体を含む抗体分子を提供する。

【0033】

幾つかの実施形態においては、免疫原性組成物はアジュバントと共に製剤化（処方）される。１つの実施形態においては、アジュバントはアルミニウムアジュバントである。幾つかの実施形態においては、アルミニウムアジュバントはＭＡＡまたはＭＡＰＡである。

【0034】

幾つかの実施形態においては、それぞれ本明細書に記載されている組換えＲＳＶ Ｆ三量体またはＲＳＶ Ｆペプチドは、カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロールおよび非カチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と共に製剤化される。

【0035】

本開示の幾つかの実施形態は、本明細書に記載されている免疫原性組成物のいずれか、または本明細書に記載されている組換えＲＳＶ Ｆ三量体を、ＲＳＶ Ｆ特異的免疫応答を生成するのに有効な量で対象に投与することを含む、対象におけるＲＳＶ Ｆ特異的免疫応答方法を提供する。幾つかの実施形態においては、抗原特異的免疫応答はＴ細胞応答またはＢ細胞応答を含む。

【0036】

幾つかの実施形態においては、該方法は、本明細書に記載されているＲＳＶ Ｆ三量体または免疫原性組成物の単一用量（ブースター用量無し）を対象に投与することを含む。もう１つの実施形態においては、該方法は、本明細書に記載されているＲＳＶ Ｆ三量体または免疫原性組成物の第２（ブースター）用量を対象に投与することを更に含む。もう１つの実施形態においては、該方法は、ＲＳＶ Ｆ三量体またはＲＳＶ免疫原性組成物の、少なくとも１つのブースター用量を投与することを更に含む。追加の用量を投与してもよい。

【0037】

幾つかの実施形態においては、ＲＳＶ免疫原性組成物またはＲＳＶ Ｆ三量体は、皮内注射、筋肉内注射または鼻腔内投与により対象に投与される。幾つかの実施形態においては、ＲＳＶワクチンは筋肉内注射により対象に投与される。

【0038】

幾つかの実施形態においては、ＲＳＶ Ｆ三量体または免疫原性組成物は、最大１または２年間、ＲＳＶに対して対象を免疫化する。幾つかの実施形態においては、ＲＳＶ Ｆ三量体または免疫原性組成物は、２年より長く、３年より長く、４年より長く、または５～１０年間、ＲＳＶに対して対象を免疫化する。１つの実施形態においては、免疫原性組成物はワクチンとして毎年投与される。

【0039】

幾つかの実施形態においては、対象は約５歳以下である。例えば、対象は約１～約５歳（例えば、約１、２、３、４または５歳）、または約６ヶ月～約１歳（例えば、約６、７、８、９、１０、１１または１２か月）でありうる。幾つかの実施形態においては、対象は約１２ヶ月以下（例えば、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２か月または１か月）である。幾つかの実施形態においては、対象は約６か月以下である。

【0040】

幾つかの実施形態においては、対象は満期（例えば、約３７～４２週間）で生まれた。幾つかの実施形態においては、対象は、例えば妊娠の約３６週以下（例えば、約３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６または２５週）で早産で生まれた。例えば、対象が妊娠の約３２週以下で生まれた場合も可能である。幾つかの実施形態においては、対象は妊娠の約３２週～約３６週に早産で生まれた。そのような対象において、ワクチンは後年に、例えば約６か月～約５歳以上の年齢で投与されうる。

【0041】

幾つかの実施形態においては、対象は約２０歳～約５０歳（例えば、約２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０歳）の若年成人である。

【0042】

幾つかの実施形態においては、対象は約５０～６０歳、６０歳、約７０歳以上、８０歳以上、９０歳以上（例えば、約６０、６５、７０、７５、８０、８５または９０歳）の高齢対象である。幾つかの実施形態においては、対象は免疫無防備状態である（例えば、免疫障害または自己免疫障害を有する）。

【0043】

幾つかの実施形態においては、対象は、ＲＳＶ免疫原性組成物が投与される際に妊娠している。幾つかの実施形態においては、対象は、慢性肺疾患、例えば慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または喘息を有する。

【0044】

幾つかの実施形態においては、対象はＲＳＶに曝露されており、またはＲＳＶに感染しており、またはＲＳＶによる感染のリスクを有する。

【0045】

本開示の種々の実施形態の詳細は以下の説明に記載されている。本開示の他の特徴、目的および利点は本明細書および特許請求の範囲から明らかであろう。

【0046】

詳細な説明
ＲＳＶ Ｆタンパク質は、ＲＳＶ－ＡおよびＲＳＶ－Ｂ抗原亜群間を含む臨床分離株間でよく保存されているＩ型融合糖タンパク質である。Ｆタンパク質は、融合前状態とより安定な融合後状態との間で移行し、それにより標的細胞への侵入が促進される。ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質は、最初はＦ_０前駆体タンパク質として合成される。ＲＳＶ Ｆ_０は三量体へとフォールディングし、これは、Ｆ１およびＦ２サブユニットを含む成熟融合前タンパク質へのフューリン切断により活性化される（Ｂｏｌｔ，ら，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．，６８：２５，２０００）。融合前コンホメーションにおいて安定化されたＲＳＶ Ｆタンパク質は、融合後コンホメーションにおいて安定化されたＲＳＶ Ｆタンパク質で観察されるものより大きな中和免疫応答を動物モデルにおいて生成する（ＭｃＬｅｌｌａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４２：５９２－５９８，２０１３）。したがって、安定化された融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質は、ＲＳＶワクチンに配合するための良好な候補である。「ＤＳ－Ｃａｖ１」置換を含む、融合前コンホメーションにおいて安定化された可溶性ＲＳＶエクトドメインは既に作製されている。ＷＯ ２０１４／１６０４６３Ａ１およびＷＯ ２０１７／１７２８９０Ａ１（これらのそれぞれの内容を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。

【0047】

融合前安定化ＲＳＶ Ｆ構築物ＤＳ－Ｃａｖ１は、４℃での長期保存時にコンホメーション変化を受け、中間構造を形成することが既に示されている（Ｆｌｙｎｎ ＪＡら，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２０１６；１１（１０）：ｅ０１６４７８９）。４℃以上での長期安定性は、ＲＳＶ Ｆサブユニットワクチン抗原にとって望ましい特性である。融合前コンホメーションにおけるＲＳＶ Ｆ三量体の安定性を更に改善するための、構造に基づく追加的な修飾が本明細書に記載されている。そのような構築物は、ＤＳ－Ｃａｖ１と比較して増強した４℃での安定性を有する一方で、免疫原性を保持している。

【0048】

本明細書中でそれぞれ用いる「ＲＳＶ融合タンパク質」および「ＲＳＶ Ｆタンパク質」は、ウイルスおよび細胞膜の融合を促進するＲＳＶエンベロープ糖タンパク質を意味する。天然においては、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、Ｆ_０と称される単一ポリペプチド前駆体へと合成され、これは、小胞体への局在化を導くシグナルペプチドを含み、小胞体においてシグナルペプチドが切断される。残りのＦ_０残基はオリゴマー化して三量体を形成し、２つの保存されたフューリン切断配列においてプロテアーゼによりタンパク質分解プロセシングされて、２つのジスルフィド結合断片、すなわち、Ｆ_１およびＦ_２を生成する。天然においては、３つのＦ_２－Ｆ_１ペプチドが三量体へとオリゴマー化して成熟Ｆタンパク質を形成し、これは融合前コンホメーションをとり、これは準安定性であり、融合後コンホメーションへのコンホメーション変化を受けうる。

【0049】

「ＲＳＶ Ｆ膜貫通ドメイン」は、野生型ＲＳＶ Ｆの膜貫通ドメイン（すなわち、配列番号１０のアミノ酸５２５～５５０）に対応する。

【0050】

「ＲＳＶ Ｆ細胞質ドメイン」または「ＲＳＶ Ｆ細胞質尾部」は、野生型ＲＳＶ Ｆの細胞質テール部ドメイン（すなわち、配列番号１０のアミノ酸５５１～５７４）に対応する。

【0051】

本明細書中で用いる「Ｄ２５」または「Ｄ２５抗体」は、融合前ＲＳＶ Ｆペプチドに特異的に結合する中和抗体を意味する。この抗体は米国特許出願公開番号ＵＳ ２０１０／０２３９５９３（その全内容を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。

【0052】

「一本鎖ＲＳＶ変異体」は、一本鎖ＲＳＶ変異体が細胞内で産生された場合にＦ_０ペプチドが別々のＦ_１鎖およびＦ_２鎖へと切断されないように、フューリン切断部位を含まないように修飾されているＲＳＶ Ｆタンパク質である。一本鎖ＲＳＶ変異体の非限定的な例は、一本鎖ＲＳＶ変異体が生成されるように、柔軟性リンカーによりＦ_１ペプチドの９７～１４７位に連結されたＦ_２ポリペプチドの９７位を含む。

【0053】

本明細書中でそれぞれ用いる「ＤＳ－Ｃａｖ１」、「ＤＳ－Ｃａｖ１置換」は、置換（例えば、Ｓ１５５ＣおよびＳ２９０Ｃ置換）により導入されるシステインの間の非天然のジスルフィド結合を導入する「ＤＳ」置換である１５５Ｃおよび２９０Ｃと、１９０Ｆおよび２０７Ｌキャビティ充填アミノ酸置換（例えば、Ｓ１９０ＦおよびＶ２０７Ｌ）を含む「Ｃａｖ１」置換とを含有する、ＲＳＶ Ｆタンパク質への遺伝的修飾を意味する。ＤＳ－Ｃａｖ１は、ＷＯ ２０１４／１６０４６３（その全内容を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。

【0054】

本明細書中でそれぞれ用いる「フォールドンドメイン」または「フォールドン」は、三量体構造を天然で形成するアミノ酸配列を含むＴ４フィブリチン三量体化ドメインを意味する。幾つかの例においては、ＲＳＶ Ｆタンパク質の配列は、フォールドンドメインを含有するように修飾されている。他の例においては、一本鎖ＲＳＶ変異体はフォールドンドメインを含有する。フォールドン三量体化ドメインの一例は、配列番号８に示されているアミノ酸配列を含む。

【0055】

本明細書中で用いる「シグナルペプチド」または「シグナル配列」は、新たに合成された分泌性または膜タンパク質を膜へと及び膜を越えて導いて真核生物および原核生物の両方におけるほとんどのタンパク質の分泌経路進入を普遍的に制御する短いアミノ酸配列である。小胞体プロセシングは成熟タンパク質を生成し、この場合、前駆体タンパク質からシグナルペプチドが切断される。本明細書中で言及する「成熟アミノ酸配列」は、シグナルペプチドを含有しない。一本鎖ＲＳＶ変異体の成熟アミノ酸配列はシグナルペプチドを含有しない。また、３つの成熟一本鎖ＲＳＶ変異体からなるＲＳＶ三量体は、シグナルペプチド配列を含有しない。

【0056】

ポリペプチドに言及する場合に本明細書中で用いる「置換」、「アミノ酸置換」または「置換変異体」なる語は、天然または出発配列における少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、異なるアミノ酸が同じ位置のその部位に挿入されることを意味する。置換は、分子内の１つだけのアミノ酸が置換されている単一置換であってもよく、あるいは、同じ分子内で２以上（例えば、３、４または５個）のアミノ酸が置換されている複数置換であってもよい。例えば、本明細書中で用いる、ＲＳＶ Ｆタンパク質または一本鎖ＲＳＶ Ｆ変異体における「１５５Ｃ」置換に対する言及は、１５５位にシステイン残基を有する一本鎖ＲＳＶ Ｆタンパク質に関するものであり、該システイン残基はＲＳＶ Ｆタンパク質における１５５位の対応する天然残基に取って代わっている。参考として示すと、配列番号１０は該置換の位置に関する参照配列である。例えば、「Ｓ１５５Ｃ」置換は、配列番号１０の１５５位におけるＳの、Ｃによる置換である。

【0057】

「単離された」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおいては、それらが産生される細胞または細胞培養物からの他の生物学的分子が少なくとも部分的に除去されている。そのような生物学的分子には、他の核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、または細胞破片および増殖培地のような他の物質が含まれる。それにおいては更に、発現系成分、例えば宿主細胞からの生物学的分子またはその増殖培地が少なくとも部分的に除去されていてもよい。一般に、「単離された」なる語は、そのような生物学的分子の完全な非存在を意味するものではなく、また、水、バッファーまたは塩の非存在を意味するものでもなく、また、該ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む医薬製剤の成分に関するものでもない。

【0058】

「ポリペプチド変異体」は、そのアミノ酸配列において天然配列または参照配列と異なる分子である。アミノ酸配列変異体は、天然配列または参照配列と比較して、アミノ酸配列内のある位置において、置換、欠失、挿入または前記の任意の２つまたは３つの組合せを有しうる。通常、変異体は天然配列または参照配列に対して少なくとも５０％の同一性を有する。幾つかの実施形態においては、変異体は、天然配列または参照配列に対して少なくとも８０％の同一性または少なくとも９０％の同一性を有する。

【0059】

「類似体」は、１以上のアミノ酸変化、例えば、親または開始ポリペプチドの特性の１以上を尚も維持する、アミノ酸残基の置換、付加または欠失において異なるポリペプチド変異体を含むと意図される。

【0060】

本開示は、変異体および誘導体を含む、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに基づく幾つかのタイプの組成物を提供する。これらには、例えば、置換、挿入、欠失および共有結合変異体および誘導体が含まれる。「誘導体」なる語は「変異体」なる語と同義であり、参照分子または出発分子と比較していずれかの様態で修飾および／または改変された分子を一般に意味する。

【0061】

したがって、参照配列、特に本明細書に開示されているポリペプチド配列に関連して置換、挿入および／または付加、欠失および共有結合修飾を含有するペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本開示の範囲内に含まれる。例えば、配列タグ、または、アミノ酸例えば１以上のリジンが、ペプチド配列に（例えば、Ｎ末端またはＣ末端において）付加されうる。配列タグは、ペプチドの検出、精製または局在化のために使用されうる。リジンは、ペプチドの溶解度を増加させるため、またはビオチン化を可能にするために使用されうる。あるいは、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ末端領域およびアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基は、トランケート化（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）配列を得るために、所望により欠失されうる。あるいは、配列の用途に応じて、例えば、可溶性である又は固体支持体に連結されている、より大きな配列の一部としての該配列の発現においては、あるアミノ酸（例えば、Ｃ末端残基またはＮ末端残基）が欠失されうる。

【0062】

本明細書中で用いる「保存的アミノ酸置換」なる語は、配列内に通常存在するアミノ酸が、類似したサイズ、電荷または極性の別のアミノ酸で置換されることを意味する。保存的置換の例には、無極性（疎水性）残基、例えばイソロイシン、バリンおよびロイシンの、別の無極性残基による置換が含まれる。同様に、保存的置換の例には、極性（親水性）残基同士の置換、例えばアルギニンとリジンとの置換、グルタミンとアスパラギンとの置換、およびグリシンとセリンとの置換が含まれる。また、塩基性残基、例えばリジン、アルギニンまたはヒスチジンの、別の塩基性残基による置換、あるいは酸性残基、例えばアスパラギン酸またはグルタミン酸の、別の酸性残基による置換が、保存的置換の追加的な例である。非保存的置換の例には、無極性（疎水性）アミノ酸残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニンの、極性（親水性）残基、例えばシステイン、グルタミン、グルタミン酸もしくはリジンによる置換、および／または無極性残基の、極性残基による置換が含まれる。

【0063】

ポリペプチドに言及する場合に本明細書中で用いる「ドメイン」なる語は、１以上の特定可能な構造的または機能的特徴または特性（例えば、結合能、タンパク質－タンパク質相互作用のための部位として機能する）を有するポリペプチドのモチーフを意味する。

【0064】

ポリペプチドに言及する場合に本明細書中で用いる「部位」なる語は、それが、アミノ酸に基づく実施形態に関するものである場合には、「アミノ酸残基」および「アミノ酸側鎖」と同義で用いられる。ポリヌクレオチドに言及する場合に本明細書中で用いる「部位」なる語は、それが、ヌクレオチドに基づく実施形態に関するものである場合には、「ヌクレオチド」と同義で用いられる。部位は、ポリペプチドに基づく又はポリヌクレオチドに基づく分子において修飾、操作、改変、誘導体化または変異体化されうる、ペプチドもしくはポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける位置を表す。

【0065】

ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに言及する場合に本明細書中で用いる“ｔｅｒｍｉｎｉ”または“ｔｅｒｍｉｎｕｓ”なる語は、それぞれポリペプチドまたはポリヌクレオチドの末端を意味する。そのような末端はポリペプチドまたはポリヌクレオチドの最初または最後の部位のみに限定されるものではなく、末端領域内の追加的なアミノ酸またはヌクレオチドを含みうる。ポリペプチドに基づく分子は、Ｎ末端［遊離アミノ基（ＮＨ２）を含有するアミノ酸で終結するもの］およびＣ末端［遊離カルボキシル基（ＣＯＯＨ）を有するアミノ酸で終結するもの］の両方を有するものとして特徴づけられうる。タンパク質は、幾つかの場合においては、ジスルフィド結合または非共有結合力（多量体、オリゴマー）により結合された複数のポリペプチド鎖から構成される。これらのタンパク質は、複数のＮ末端およびＣ末端を有する。あるいは、ポリペプチドの末端は、場合に応じて、有機コンジュゲートのような非ポリペプチドに基づく部分で開始または終結するように修飾されうる。

【0066】

当業者に認識されるとおり、タンパク質断片、機能的タンパク質ドメインおよび相同タンパク質も、関心のあるポリペプチドの範囲内であるとみなされる。例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００アミノ酸の長さ、または１００アミノ酸より長い長さを有する、参照タンパク質の任意のタンパク質断片（参照ポリペプチド配列より少なくとも１つのアミノ酸残基だけ短いが、それ以外は同一であるポリペプチド配列を意味する）を、本発明において提供する。もう１つの例においては、本明細書に記載されている配列のいずれかに対して４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である、２０、３０、４０、５０または１００個の（連続的）アミノ酸の伸長を含む任意のタンパク質が、本開示に従い使用されうる。幾つかの実施形態においては、ポリペプチドは、本発明で提供される又は本明細書中で参照される配列のいずれかに示されているとおり、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上の変異を含む。もう１つの例においては、本明細書に記載されている配列のいずれかに対して少なくとも８０％、９０％、９５％または１００％同一である２０、３０、４０、５０または１００アミノ酸の伸長を含む任意のタンパク質であって、本明細書に記載されている配列のいずれかに対して８０％、７５％、７０％、６５％～６０％未満の同一性を有する５、１０、１５、２０、２５または３０アミノ酸の伸長を有するものが、本開示に従い使用されうる。

【0067】

本開示のポリペプチドまたはポリヌクレオチド分子は、参照分子（例えば、参照ポリペプチドまたは参照ポリヌクレオチド）、例えば当技術分野で記載されている分子（例えば、操作もしくは設計された分子または野生型分子）に対してある程度の配列類似性または同一性を有しうる。当技術分野で公知のとおり、「同一性」なる語は、配列を比較することにより決定される２以上のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列の間の関係を意味する。当技術分野においては、同一性はまた、２以上のアミノ酸残基または核酸残基の伸長の間のマッチ（一致）の数により決定される２つの配列の間の配列関連性の度合を意味する。同一性は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（例えば、「アルゴリズム」）により対処されるギャップアラインメント（存在する場合）を伴う２以上の配列の小さいほうの配列間の同一マッチの割合を示す。関連ペプチドの同一性は公知方法によって容易に計算されうる。「％同一性」は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列に適用される場合には、配列をアライメントさせ（必要に応じて）ギャップを導入して最大同一性を得た後、第２の配列のアミノ酸配列または核酸配列における残基と同一である候補アミノ酸または核酸配列における残基（アミノ酸残基または核酸残基）の百分率として定義される。アラインメントのための方法およびコンピュータプログラムは当技術分野でよく知られている。同一性は％同一性の計算に基づくが、計算において導入されたギャップおよびペナルティゆえに値が異なりうる。一般に、個々のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、本明細書に記載されており当業者に公知の配列アライメントプログラムおよびパラメーターによる測定で、その個々の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％かつ１００％未満の配列同一性を有する。アライメントのためのそのようなツールには、ＢＬＡＳＴスイート（Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）．“Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）のものが含まれる。もう１つの一般的なローカルアライメント技術はスミス－ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．（１９８１）“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７）に基づく。動的プログラミングに基づく一般的なグローバルアライメント技術としては、ニードルマン－ブンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）“Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）が挙げられる。より近年、ニードルマン－ブンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズムを含む他の最適グローバルアライメント法より速くヌクレオチドおよびタンパク質配列のグローバルアライメントを生成するとされる高速最適グローバル配列アライメントアルゴリズム（Ｆａｓｔ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）（ＦＯＧＳＡＡ）が開発された。他のツールは、本明細書中に、特に後記の「同一性」の定義において記載されている。

【0068】

本明細書中で用いる「相同性」なる語は、ポリマー性分子間、例えば核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的関連性を意味する。マッチ残基のアラインメントにより決定される類似性または同一性の閾値レベルを共有するポリマー性分子［例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）および／またはポリペプチド分子］は相同と称される。相同性は、分子間の関係を示す定性的用語であり、定量的な類似性または同一性に基づきうる。類似性または同一性は、２つの比較配列間の配列マッチの度合を定める定量的用語である。幾つかの実施形態においては、ポリマー性分子が互いに「相同」であるとみなされるのは、それらの配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一または類似である場合である。「相同」なる語は、必然的に、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列）間の比較に関するものである。２つのポリヌクレオチド配列が相同であるとみなされるのは、それらがコードするポリペプチドが、少なくとも２０アミノ酸の少なくとも１つの伸長に関して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または更には９９％である場合である。幾つかの実施形態においては、相同ポリヌクレオチド配列は、少なくとも４～５個のユニーク（一意的）に特定されるアミノ酸の伸長をコードする能力により特徴づけられる。６０ヌクレオチド長未満のポリヌクレオチド配列に関しては、相同性は、少なくとも４～５個のユニークに特定されるアミノ酸の伸長をコードする能力により決定される。２つのタンパク質配列が相同とみなされるのは、それらのタンパク質が、少なくとも２０アミノ酸の少なくとも１つの伸長に関して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％同一である場合である。

【0069】

相同性は、比較される配列が進化において共通起源から分岐したことを意味する。「ホモログ」なる語は、共通の祖先配列からの系統により第２のアミノ酸配列または核酸配列に関連する第１のアミノ酸配列または核酸配列［例えば、遺伝子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）またはタンパク質配列］を意味する。「ホモログ」なる語は、種分化の事象により分離された遺伝子および／またはタンパク質の間の関係、あるいは遺伝子重複の事象により分離された遺伝子および／またはタンパク質の間の関係に適用されうる。「オルソログ」は、種分化により共通祖先遺伝子（またはタンパク質）から進化した、異なる種における遺伝子（またはタンパク質）である。典型的には、オルソログは進化の過程において同じ機能を保有する。「パラログ」は、ゲノム内の重複により関連する遺伝子（またはタンパク質）である。オルソログは進化の過程において同じ機能を保有するが、パラログは、たとえこれが元の機能に関連しているとしても、新たな機能を進化させる。

【0070】

「同一性」なる語は、ポリマー性分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を意味する。２つのポリ核酸配列の％同一性の計算は、例えば、最適な比較目的で２つの配列をアライメントすることにより行われうる（例えば、最適なアライメントのために、第１核酸配列および第２核酸配列の一方または両方においてギャップが導入可能であり、非同一配列は比較目的には無視されうる）。ある実施形態においては、比較目的でアライメント（整列）される配列の長さは参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％である。ついで対応ヌクレオチド位置のヌクレオチドが比較される。第１配列内の位置が第２配列内の対応位置と同じヌクレオチドにより占有されている場合、それらの分子はその位置において同一である。２つの配列間の％同一性は、それらの配列により共有される同一位置の数の関数であり、この場合、ギャップの数および各ギャップ（これはそれらの２つの配列の最適アライメントのために導入される必要がある）の長さが考慮される。２つの配列間の配列の比較および％同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成されうる。例えば、２つの核酸配列間の％同一性は、例えば以下のものに記載されている方法を用いて決定されうる：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；ならびにＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１（それらのそれぞれを参照により本明細書に組み入れることとする）。例えば、２つの核酸配列間の％同一性は、ＰＡＭ１２０重み残基表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＭｅｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，１９８９，４：１１－１７）のアルゴリズムを使用して決定されうる。あるいは、２つの核酸配列間の％同一性は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムを使用して決定されうる。配列間の％同一性を決定するために一般に使用される方法には、Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）（これを参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている方法が含まれるが、これらに限定されるものではない。同一性を決定するための技術は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにおいてコード化されている。２つの配列間の相同性を決定するための例示的なコンピュータソフトウェアには、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２，３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０））が含まれるが、これらに限定されるものではない。

【0071】

脂質ナノ粒子
本明細書中で用いる「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」は、リポソームまたは小胞（これらに限定されるものではない）を含む、生成物を送達するために使用されうる任意の脂質組成物を意味し、ここで、水性体積部分は、両親媒性脂質二重層（例えば、単一；単層または複数；多層）により被包され、あるいは、他の実施形態においては、該脂質は、予防用生成物または脂質凝集体もしくはミセルを含む内部物質を被覆し、ここで、該脂質被包治療用生成物は、比較的無秩序な脂質混合物内に含有される。特に示されていない限り、脂質ナノ粒子は抗原性ポリペプチドを内部に取り込んでいる必要はなく、同じ製剤（処方）において、生成物を送達するために使用されうる。

【0072】

本明細書中で用いる「ポリアミン」は、２以上のアミノ基を有する化合物を意味する。具体例には、プトレシン、カダベリン、スペルミジンおよびスペルミンが含まれる。

【0073】

特に示されていない限り、モル％は全脂質に対するモルパーセントを意味する。一般に、本発明の組成物のＬＮＰは、１以上のカチオン性脂質（イオン化可能なカチオン性脂質を含む）および１以上のポリ（エチレングリコール）－脂質（ＰＥＧ－脂質）からなる。ある実施形態においては、ＬＮＰは、１以上の非カチオン性脂質を更に含む。１以上の非カチオン性脂質は、リン脂質、リン脂質誘導体、ステロール、脂肪酸またはそれらの組合せを含みうる。

【0074】

ＬＮＰに適したカチオン性脂質およびイオン化可能なカチオン性脂質は、本明細書に記載されている。イオン化可能なカチオン性脂質はそれらの脂質頭部基の弱塩基性により特徴づけられ、これは脂質の表面電荷にｐＨ依存的に影響を及ぼして、それらを酸性ｐＨにおいては正荷電状態にするが、生理的ｐＨにおいては電荷中性に近い状態にする。カチオン性脂質は、それらの頭部基上の一価または多価カチオン電荷により特徴づけられ、これはそれらを中性ｐＨにおいて正荷電状態にする。ある実施形態においては、カチオン性およびイオン化可能脂質は、親水性生物活性分子と複合体形成して、二相水性／有機系の有機相に分配する疎水性複合体を生成しうる。生物活性分子との疎水性複合体を形成させるために、一価カチオン性脂質および多価カチオン性脂質の両方が使用されうると想定される。

【0075】

幾つかの実施形態においては、ＬＮＰの形成に使用されるカチオン性およびイオン化可能カチオン性脂質には以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）；Ｎ－（２，３ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎトリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）；Ｎ，ＮジステアリルＮ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）；Ｎ－（２，３ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＰ」）；１，２ビス（オレオイルオキシ）－３－（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）；３－（Ｎ－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（「ＤＣ－Ｃｈｏｌ」；ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン（「ＤＨＧＳ」）およびＮ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）。加えて、本発明において使用されうるカチオン性脂質および他の成分の多数の市販調製物が入手可能である。これらには、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（ＤＯＴＭＡおよび１，２ジオレオイル－ｓｎ－３－ホスホエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）を含む、ＧＩＢＣＯＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡから商業的に入手可能なカチオン性脂質ナノ粒子）、およびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）［ＧＩＢＣＯＢＲＬから商業的に入手可能なＮ－（１－（２，３ジオレイルオキシ）プロピル）Ｎ－（２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムトリフルオロアセタート（「ＤＯＳＰＡ」）および（「ＤＯＰＥ」）］が含まれる。以下の脂質はカチオン性であり、生理的ｐＨ未満で正電荷を有する：ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、ＤＭＤＭＡ、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、４－（２，２－ジオクタ－９，１２－ジエニル－［１，３］ジオキソラン－４－イルメチル）－ジメチルアミン、ＤＬｉｎＫＤＭＡ（ＷＯ ２００９／１３２１３１ Ａ１）、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ（ＷＯ２０１０／０４２８７７）、ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ３－ＤＭＡ（ＷＯ２０１０／１４６７４０および／またはＷＯ２０１０／１０５２０９）、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル ４－（ジメチルアミノ）ブタノアート（Ｊａｙａｒａｍａｎら，２０１２，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．５１：８５２９－８５３３）、２－｛４－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］ブトキシ｝－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエンリロキシル］プロパン－１－アミン）（ＣＬｉｎＤＭＡ）など。本発明での使用に適した他のカチオン性脂質には、例えば、米国特許第５，２０８，０３６号、第５，２６４，６１８号、第５，２７９，８３３号および第５，２８３，１８５号、ならびに米国特許出願公開第２００８／００８５８７０号および２００８／００５７０８０号に記載されているカチオン性脂質が含まれる。本発明での使用に適した他のカチオン性脂質には、例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１１／０７６８０７の表６（１１２～１３９ページ）に開示されている脂質Ｅ０００１～Ｅ０１１８またはＥ０１１９～Ｅ０１８０が含まれる（前記国際特許出願公開はこれらのカチオン性脂質の製造方法および使用方法も開示している）。

【0076】

幾つかの実施形態においては、カチオン性脂質は以下のいずれかを含む：ＤＬｉｎＤＭＡ；ＤｌｉｎＫＣ２ＤＭＡ；ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ；ＣＬｉｎＤＭＡ；Ｓ－オクチルＣＬｉｎＤＭＡ；
（２Ｓ）－１－｛７－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］ヘプチルオキシ｝－３－［（４Ｚ）－デカ－４－エン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン；
（２Ｒ）－１－｛４－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］ブトキシ｝－３－［（４Ｚ）－デカ－４－エン－１－イルオキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン；
１－［（２Ｒ）－１－｛４－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］ブトキシ｝－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－イル］グアニジン；
１－［（２Ｒ）－１－｛７－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］ヘプチルオキシ｝－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン；
１－［（２Ｒ）－１－｛４－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］ブトキシ｝－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン；
（２Ｓ）－１－（｛６－［（３β））－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］ヘキシル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン；
（３β）－３－［６－｛［（２Ｓ）－３－［（９Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イルオキシ］－２－（ピロリジン－１－イル）プロピル］オキシ｝ヘキシル）オキシ］コレスタ－５－エン；
（２Ｒ）－１－｛４－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］ブトキシ｝－３－（オクチルオキシ）プロパン－２－アミン；
（２Ｒ）－１－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－（ペンチルオキシ）プロパン－２－アミン；
（２Ｒ）－１－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－３－（ヘプチルオキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン；
（２Ｒ）－１－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（２Ｚ）－ペンタ－２－エン－１－イルオキシ］プロパン－２－アミン；
（２Ｓ）－１－ブトキシ－３－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン；
（２Ｓ－１－（｛８－［（３β）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－３－［２，２，３，３，４，４，５，５，６，６，７，７，８，８，９，９－ヘキサデカフルオロノニル）オキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－２－アミン；
２－アミノ－２－｛［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］メチル｝プロパン－１，３－ジオール；
２－アミノ－３－（（９－（（（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ）－１０，１３－ジメチル－１７－（６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）ノニル）オキシ）－２－（（（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）オキシ）メチル）プロパン－１－オール；
２－アミノ－３－（（６－（（（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ）－１０，１３－ジメチル－１７－（６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）ヘキシル）オキシ）－２－（（（（Ｚ）－オクタデカ－９－エン－１－イル）オキシ）メチル）プロパン－１－オール；
（２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－２０，２３－ジエン－１０－アミン；
（１７Ｚ，２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘキサコサ－１７，２０－ジエン－９－アミン；
（１６Ｚ，１９Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタコサ－１６，１９－ジエン－８－アミン；
（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルドコサ－１３，１６－ジエン－５－アミン；
（１２Ｚ，１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘニコサ－１２，１５－ジエン－４－アミン；
（１４Ｚ，１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリコサ－１４，１７－ジエン－６－アミン；
（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルテトラコサ－１５，１８－ジエン－７－アミン；
（１８Ｚ，２１Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－１８，２１－ジエン－１０－アミン；
（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルテトラコサ－１５，１８－ジエン－５－アミン；
（１４Ｚ，１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリコサ－１４，１７－ジエン－４－アミン；
（１９Ｚ，２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルオクタコサ－１９，２２－ジエン－９－アミン；
（１８Ｚ，２１Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－１８，２１－ジエン－８－アミン；
（１７Ｚ，２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘキサコサ－１７，２０－ジエン－７－アミン；
（１６Ｚ，１９Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタコサ－１６，１９－ジエン－６－アミン；
（２２Ｚ，２５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘントリアコンタ－２２，２５－ジエン－１０－アミン；
（２１Ｚ，２４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリアコンタ－２１，２４－ジエン－９－アミン；
（１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－１８－エン－１０－アミン；
（１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘキサコサ－１７－エン－９－アミン；
（１９Ｚ，２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルオクタコサ－１９，２２－ジエン－７－アミン；
Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサン－１０－アミン；
（２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ－エチル－Ｎ－メチルノナコサ－２０，２３－ジエン－１０－アミン；
１－［（１１Ｚ，１４Ｚ）－１－ノニルイコサ－１１，１４－ジエン－１－イル］ピロリジン；
（２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－２０－エン－１０－アミン；
（１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘプタコサ－１５－エン－１０－アミン；
（１４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－１４－エン－１０－アミン；
（１７Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－１７－エン－１０－アミン；
（２４Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルトリトリアコンタ－２４－エン－１０－アミン；
（２０Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－２０－エン－１０－アミン；
（２２Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルヘントリアコンタ－２２－エン－１０－アミン；
（１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタコサ－１６－エン－８－アミン；
（１２Ｚ，１５Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２－ノニルヘニコサ－１２，１５－ジエン－１－アミン；
（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニルドコサ－１３，１６－ジエン－１－アミン；
Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘプタデカン－８－アミン；
１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－ヘキシルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナデカン－１０－アミン；
Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ノナデカン－１０－アミン；
Ｎ，Ｎ－ジメチル－２１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘニコサン－１０－アミン；
Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｓ）－２－｛［（１Ｒ，２Ｒ）－２－ペンチルシクロプロピル］メチル｝シクロプロピル］ノナデカン－１０－アミン；
Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘキサデカン－８－アミン；
Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｒ，２Ｓ）－２－ウンデシルシクロプロピル］テトラデカン－５－アミン；
Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－｛７－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘプチル｝ドデカン－１－アミン；
１－［（１Ｒ，２Ｓ）－２－ヘプチルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルオクタデカン－９－アミン；
１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－デシルシクロプロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルペンタデカン－６－アミン；
Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ペンタデカン－８－アミン；および
（１１Ｅ，２０Ｚ，２３Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチルノナコサ－１１，２０，２３－トリエン－１０－アミン；
またはその薬学的に許容される塩または前記のいずれかの立体異性体。

【0077】

本発明のこの実施形態のある態様においては、ＬＮＰは以下のイオン化可能カチオン性脂質の１以上を含む：ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤｌｉｎＫＣ２ＤＭＡ ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＣＬｉｎＤＭＡまたはＳ－オクチル ＣＬｉｎＤＭＡ（国際特許出願公開番号ＷＯ２０１０／０２１８６５を参照されたい）。本発明のこの実施形態の他の態様においては、ＬＮＰは以下のイオン化可能およびカチオン性脂質の１以上を含み：（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニルドコサ－１３，１６－ジエン－１－アミンまたはＮ，Ｎ－ジメチル－１－［（１Ｓ，２Ｒ）－２－オクチルシクロプロピル］ヘキサデカン－８－アミン、それらのそれぞれは、ＷＯ ２０１２／０４０１８４として公開されているＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５２３２３８に記載されている（その全内容を参照により本明細書に組み入れることとする）。

【0078】

本発明のこの実施形態のある態様においては、イオン化可能およびカチオン性脂質は、ＷＯ ２０１７／０４９２４５（その全内容を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている脂質を含みうる。

【0079】

本発明のこの実施形態のある態様においては、ＬＮＰは、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１１／０２２４６０ Ａ１に記載されている１以上のイオン化可能カチオン性脂質、またはその任意の薬学的に許容される塩、または該化合物またはその塩のいずれかの立体異性体を含む。

【0080】

同じ構成の構造が特定の原子または基の空間的配置に関して異なる場合、それらは立体異性体であり、それらの相互関係を分析する上で重要な考慮事項は形態上のものである。２つの立体異性体間の関係が目的物とその重ね合わせ不能鏡像との関係である場合、２つの構造はエナンチオマー（鏡像異性）的であり、各構造はキラルであると言われる。立体異性体には、ジアステレオマー、シス－トランス異性体およびコンホメーション（配座）異性体も含まれる。ジアステレオ異性体はキラルまたはアキラルであることが可能であり、互いの鏡像ではない。シス－トランス異性体は特定の平面に対する原子の位置においてのみ異なり、この場合、これらの原子は剛構造の一部であり、あるいは剛構造の一部であるかのようにみなされる。コンホメーション異性体は形式上の単結合の周りの回転により相互変換されうる異性体である。そのようなコンホメーション異性体の例には、椅子配座よび舟配座を有するシクロヘキサンコンホメーション；炭水化物；ねじれ配座、重なり配座およびゴーシュ配座を有する線状アルカンコンホメーションなどが含まれる。Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５，２８４９（１９７０）を参照されたい。

【0081】

多数の有機化合物は、平面偏光の平面を回転させる能力を有する光学活性形態で存在する。光学活性化合物を記述する際には、そのキラル中心に関する分子の絶対配置を示すために、接頭辞ＤおよびＬ、またはＲおよびＳが用いられる。接頭辞ｄおよびｌ、または（＋）および（－）は、化合物による平面偏光の回転の符号を示すために用いられる。（－）は、化合物が左旋性であることを意味する。（＋）またはｄの接頭辞が付された化合物は右旋性である。与えられた化学構造に関して、エナンチオマーは、それらが互いの重ね合わせ不能鏡像であることを除き、同一である。エナンチオマーの混合物は、しばしば、エナンチオマー混合物と称される。エナンチオマーの５０：５０混合物はラセミ混合物と称される。本明細書に記載されているカチオン性脂質の多くは１以上のキラル中心を有する可能性があり、したがって、種々のエナンチオマー形態で存在しうる。所望により、キラル炭素がアスタリスク（＊）で示されうる。本発明の式においてキラル炭素への結合が直線として描かれている場合、キラル炭素の（Ｒ）配置および（Ｓ）配置の両方、したがって両方のエナンチオマーおよびそれらの混合物が式に含まれると理解される。当技術分野で用いられているとおり、キラル炭素に関する絶対配置を指定することが望まれる場合には、キラル炭素への結合の一方はくさび（平面の上の原子への結合）として表示可能であり、もう一方は一連の又はくさび形の短い平行線（平面の下の原子への結合）として表示可能である。キラル炭素に（Ｒ）または（Ｓ）配置を割り当てるために、Ｃａｈｎ－Ｉｎｇｌｏｄ－Ｐｒｅｌｏｇ系が用いられうる。

【0082】

本発明のカチオン性脂質が１つのキラル中心を含有する場合、該化合物は２つのエナンチオマー形態で存在し、本発明は、両方のエナンチオマーおよびエナンチオマー混合物、例えばラセミ混合物と称される特定の５０：５０混合物を含む。エナンチオマーは、当業者に公知の方法、例えば、結晶化により分離されうるジアステレオ異性体塩の形成（Ｄａｖｉｄ ＫｏｚｍａによるＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｖｉａ Ｄｉａｓｔｅｒｅｏｍｅｒｉｃ Ｓａｌｔ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，２００１）を参照されたい）；例えば結晶化、気－液または液体クロマトグラフィーにより分離されうるジアステレオ異性誘導体または複合体の形成；１つのエナンチオマーとエナンチオマー特異的試薬との選択的反応、例えば酵素的エステル化；あるいはキラル環境における、例えばキラル担体、例えば結合キラルリガンドを含有するシリカ上、またはキラル溶媒の存在下での気－液または液体クロマトグラフィーにより分割されうる。前記の分離方法の１つによって所望のエナンチオマーが別の化学物質に変換される場合、所望のエナンチオマーを遊離させるために更なる工程が必要であると理解されるであろう。あるいは、光学活性試薬、基質、触媒もしくは溶媒を使用する不斉合成により、または一方のエナンチオマーを不斉変換により他方に変換することにより、特定のエナンチオマーが合成されうる。

【0083】

本明細書に記載されているカチオン性脂質のキラル炭素における特定の絶対配置の表示は、該化合物の表示エナンチオマー形態がエナンチオマー過剰（ｅｅ）である、または換言すれば他のエナンチオマーを実質的に含有しないことを意味すると理解される。例えば、該化合物の「Ｒ」形態は該化合物の「Ｓ」形態を実質的に含有せず、したがって、「Ｓ」形態のエナンチオマー過剰である。逆に、該化合物の「Ｓ」形態は、該化合物の「Ｒ」形態を実質的に含有せず、したがって、「Ｒ」形態のエナンチオマー過剰である。本明細書中で用いるエナンチオマー過剰は、５０％を超える特定のエナンチオマーの存在である。特定の絶対配置が示されている特定の実施形態においては、示されている化合物のエナンチオマー過剰率は少なくとも約９０％である。

【0084】

本明細書に記載されているカチオン性脂質が２以上のキラル炭素を有する場合、それは、２個を超える光学異性体を有することが可能であり、ジアステレオ異性形態で存在しうる。例えば、２個のキラル炭素が存在する場合、該化合物は最大４個の光学異性体と２つのペアのエナンチオマー（（Ｓ，Ｓ）／（Ｒ，Ｒ）および（Ｒ，Ｓ）／（Ｓ，Ｒ））とを有しうる。エナンチオマーのペア（例えば、（Ｓ，Ｓ）／（Ｒ，Ｒ））は互いの鏡像立体異性体である。鏡像ではない立体異性体（例えば、（Ｓ，Ｓ）および（Ｒ，Ｓ））はジアステレオマーである。ジアステレオ異性体のペアは、当業者に公知の方法、例えばクロマトグラフィーまたは結晶化により分離可能であり、各ペアにおける個々のエナンチオマーは前記のとおりに分離可能である。本明細書に記載されているＬＮＰは、そのようなカチオン性脂質の各ジアステレオ異性体およびそれらの混合物を含む。

【0085】

ＬＮＰはまた、本明細書に記載されているカチオン性脂質の２以上の任意の組合せを含みうる。ある態様においては、カチオン性脂質は、典型的には、該粒子内に存在する全脂質の約０．１～約９９．９モル％を含みうる。ある態様においては、カチオン性脂質は約８０～約９９．９％モル％を含みうる。他の態様においては、カチオン性脂質は、該粒子内に存在する全脂質の約２％～約７０％、約５％～約５０％、約１０％～約４５％、約２０％～約９９．８％、約３０％～約７０％、約３４％～約５９％、約２０％～約４０％、または約３０％～約４０％（モル％）を含む。

【0086】

本明細書に記載されているＬＮＰは非カチオン性脂質を更に含むことが可能であり、これは、安定な複合体を生成しうる任意の種々の中性無荷電の、両性イオン性またはアニオン性脂質でありうる。それらは好ましくは中性であるが、それらは負荷電でありうる。本発明において有用な非カチオン性脂質の例には、リン脂質関連物質、例えば天然リン脂質、合成リン脂質誘導体、脂肪酸、ステロール、およびそれらの組合せが含まれる。天然リン脂質には、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）およびホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジン酸（ホスファチダート）（ＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン、モノアシル－ホスファチジルコリン（リゾＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、Ｎ－アシル－ＰＥ、ホスホイノシチド、およびホスホスフィンゴ脂質が含まれる。リン脂質誘導体には、ホスファチジン酸（ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＡ）、ホスファチジルコリン（ＤＤＰＣ、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＥＰＣ）、ホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＳＰＧ、ＰＯＰＧ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ、ＤＰＰＥ、ＤＰＰＥ ＤＯＰＥ）、およびホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）が含まれる。脂肪酸には、Ｃ１４：０、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、リノール酸（Ｃ１８：２）、リノレン酸（Ｃ１８：３）、およびアラキドン酸（Ｃ２０：４）、Ｃ２０：０、Ｃ２２：０、およびレチシンが含まれる。

【0087】

本明細書に記載されているＬＮＰのある実施形態においては、非カチオン性脂質はレシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスファート、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）およびジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン ４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシラート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）から選択される。非カチオン性脂質には、ステロール、例えばコレステロール、スチグマステロールまたはスチグマスタノールも含まれる。コレステロールは当技術分野で公知である。米国特許出願公開番号ＵＳ ２００６／０２４０５５４およびＵＳ ２００８／００２００５８を参照されたい。ある実施形態においては、ＬＮＰはリン脂質とステロールとの組合せを含む。

【0088】

非カチオン性脂質は、存在する場合には、ＬＮＰ内に存在する全脂質に対するモルパーセントとして表された場合、典型的には、約０．１％～約６５％、約２％～約６５％、約１０％～約６５％、または約２５％～約６５％を含む。本明細書に記載されているＬＮＰは、二重層安定化成分として役立ちうるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質コンジュゲート（「ＰＥＧ－脂質」）を更に含む。ＰＥＧ脂質の脂質成分は、天然リン脂質、合成リン脂質誘導体、脂肪酸、ステロールおよびそれらの組合せを含む、前記の任意の非カチオン性脂質でありうる。本明細書に記載されているＬＮＰのある実施形態においては、ＰＥＧ－脂質には、例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ ０５／０２６３７２に記載されているジアルキルオキシプロピルに結合したＰＥＧ（ＰＥＧ－ＤＡＡ）、米国特許公開第２００３００７７８２９号および第２００５００８６８９号に記載されているジアシルグリセロールに結合したＰＥＧ（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）に結合したＰＥＧ（ＰＥＧ－ＰＥ）、または１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセリドに結合したＰＥＧ（ＰＥＧ－ＤＳＧ）、またはそれらの任意の混合物（例えば、米国特許第５，８８５，６１３号を参照されたい）が含まれる。

【0089】

１つの実施形態においては、ＰＥＧ－ＤＡＧコンジュゲートは、ジラウリルグリセロール（Ｃ１２）－ＰＥＧコンジュゲート、ＰＥＧジミリスチルグリセロール（Ｃ１４）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール（Ｃ１６）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド（Ｃ１２）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド（Ｃ１４）コンジュゲート、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド（Ｃ１６）コンジュゲート、またはＰＥＧ－ジステリルグリカミド（Ｃ１８）である。他のジアシルグリセロールもＰＥＧ－ＤＡＧコンジュゲートにおいて使用されうると当業者は容易に理解するであろう。

【0090】

ある実施形態においては、ＰＥＧ－脂質には、ＰＥＧ－ジミリストルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＧ）、ＰＥＧ－ジパルメトレイル、ＰＥＧ－ジオレイル、ＰＥＧ－ジステアリル、ＰＥＧ－ジアシルグリカミド（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＤＰＰＥ）、およびＰＥＧ－１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－アミン（ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。

【0091】

ある実施形態においては、ＰＥＧ－脂質は、ジミリストイルグリセロールに結合したＰＥＧ（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、例えば、Ａｂｒａｍｓら，２０１０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １８（１）：１７１ならびに米国特許出願公開番号ＵＳ ２００６／０２４０５５４およびＵＳ ２００８／００２００５８に記載されているもの、例えば、２ＫＰＥＧ／ＰＥＧ２００－ＤＭＧを含む。

【0092】

ある実施形態においては、ＰＥＧ－ＤＡＧ、ＰＥＧ－コレステロール、ＰＥＧ－ＤＭＢのようなＰＥＧ－脂質は、約５００ダルトン～約１０，０００ダルトン、約７５０ダルトン～約５，０００ダルトン、約１，０００ダルトン～約５，０００ダルトン、約１，５００ダルトン～約３，０００ダルトンの範囲、または約２，０００ダルトンの平均分子量を有するポリエチレングリコールを含む。ある実施形態においては、ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ２０００またはＰＥＧ５０００を含む。

【0093】

前記の脂質のいずれかにおけるアシル基は、好ましくは、約Ｃ１０～約Ｃ２４の炭素鎖を有する脂肪酸に由来するアシル基である。１つの実施形態においては、アシル基は、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイルまたはオレオイルである。

【0094】

ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、典型的には、前記粒子内に存在する全脂質に対するモル％として表される、約０．１％～約１５％、約０．５％～約２０％、約１．５％～約１８％、約４％～約１５％、約５％～約１２％、約１％～約４％、または約２％を含む。

【0095】

本発明のある実施形態においては、ＬＮＰは、１以上のカチオン性脂質、コレステロール、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）を含む。

【0096】

本発明のある実施形態においては、ＬＮＰは、１以上のカチオン性脂質、コレステロール、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、および１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）を含む。

【0097】

本発明のある実施形態においては、ＬＮＰは、以下のモル比の範囲内で構築された脂質化合物を含む：
カチオン性脂質（２０～９９．８モル％）；
非カチオン性脂質（０．１～６５モル％）；および
ＰＥＧ－ＤＭＧ（０．１～２０モル％）。

【0098】

本発明のある実施形態においては、ＬＮＰは、以下のモル比の範囲内で構築された脂質化合物を含む：
カチオン性脂質（３０～７０モル％）；
非カチオン性脂質（２０～６５モル％）；および
ＰＥＧ－ＤＭＧ（１～１５モル％）。

【0099】

この実施形態のある態様においては、非カチオン性脂質はコレステロールである。例示的なＬＮＰは、およそ以下のモル比、すなわち、５８／３０／１０でカチオン性脂質／コレステロール／ＰＥＧ－ＤＭＧを含みうる。

【0100】

この実施形態のある態様においては、非カチオン性脂質は、コレステロールおよびＤＳＰＣである。例示的なＬＮＰは、およそ以下のモル比、すなわち、５９／３０／１０／１；５８／３０／１０／２；４３／４１／１５／１；４２／４１／１５／２；４０／４８／１０／２；３９／４１／１９／１；３８／４１／１９／２；３４／４１／２４／１；および３３／４１／２４／２で、カチオン性脂質／コレステロール／ＤＳＰＣ／ＰＥＧ－ＤＭＧを含みうる。

【0101】

ＬＮＰの製造
ＬＮＰは、限定容量混合装置、例えば、限定された容量Ｔミキサー、マルチ・インレット・ボルテックス・ミキサー（ＭＩＶＭ）またはマイクロフルイディクス混合装置（後記のとおり）を使用して、エタノールに溶解した脂質成分を水溶液と微量混合することを要する急速沈殿法により形成されうる。該脂質溶液は、エタノール中に、１以上のカチオン性脂質、１以上の非カチオン性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）、ＰＥＧ－ＤＭＧ、および所望によりコレステロールを、特定のモル比で含む。該水溶液はクエン酸ナトリウムまたは酢酸ナトリウム緩衝塩溶液からなり、２～６、好ましくは３．５～５．５の範囲のｐＨを有する。それらの２つの溶液を、２５℃～４５℃、好ましくは３０℃～４０℃、の範囲の温度に加熱し、ついで限定容量ミキサー中で混合し、それによりＬＮＰを瞬間生成させる。限定された容量Ｔミキサーを使用する場合、Ｔミキサーは０．２５～１．０ｍｍの内径（ＩＤ）範囲を有する。該アルコール溶液および水溶液を、１０～６００ｍＬ／分の全流量で、プログラム可能なシリンジポンプを使用してＴミキサーの注入口に供給する。該アルコール溶液および水溶液を、１：１～１：３ ｖｏｌ：ｖｏｌの範囲の比で、１：１．１～１：２．３を目標として、限定された容量ミキサー内で混合する。この混合段階で用いるエタノール体積分率、試薬溶液流量およびｔーミキサーチューブＩＤの組合せは、ＬＮＰの粒径を３０～３００ｎｍに制御する効果を有する。得られたＬＮＰ懸濁液を、連続的多段インライン混合プロセスで、６～８の範囲の、より高いｐＨのバッファー中に２回希釈する。最初の希釈では、該ＬＮＰ懸濁液を、１：１～１：３ ｖｏｌ：ｖｏｌの範囲の混合比で、１：２ ｖｏｌ：ｖｏｌの混合比を目標として、より高いｐＨ（ｐＨ６～７．５）の緩衝溶液と混合する。この緩衝溶液は１５～４０℃の範囲の温度であり、目標温度は３０～４０℃である。得られたＬＮＰ懸濁液を更に、１：１～１：３ ｖｏｌ：ｖｏｌの範囲の混合比で、１：２ ｖｏｌ：ｖｏｌの混合比を目標として、より高いｐＨ（例えば、６～８）の緩衝溶液と混合する。この後者の緩衝溶液は１５～４０℃の範囲の温度であり、目標温度は１６～２５である。該混合ＬＮＰを、アニオン交換濾過工程前に、３０分～２時間維持する。インキュベーション時間中の温度は１５～４０℃の範囲であり、目標温度は３０～４０℃である。インキュベーション後、該ＬＮＰ懸濁液を、アニオン交換分離工程を含む０．８μｍフィルターで濾過する。このプロセスは、１ｍｍ ＩＤ～５ｍｍ ＩＤの範囲のチューブＩＤおよび１０～２０００ｍＬ／分の流量を用いる。ＬＮＰを限外濾過法により濃縮しダイアフィルトレーションし、ここで、アルコールを除去し、バッファーを、最終バッファー溶液、例えばリン酸緩衝食塩水、または凍結保存に適したバッファー系（例えば、スクロース、トレハロースまたはそれらの組合せを含有するもの）と交換する。該限外濾過法は接線流濾過形態（ＴＦＦ）を用いる。このプロセスは、３０～５００ＫＤの範囲（目標値１００ＫＤ）の膜公称分子量カットオフを用いる。該膜形態は、中空糸またはフラットシートカセットでありうる。適切な分子量カットオフを用いるＴＦＦ法は、ＬＮＰを保持液中に保持し、濾液または透過液は、アルコールおよび最終バッファー廃棄物を含有する。ＴＦＦ法は、２０～３０ｍｇ／ｍＬの脂質濃度までの初期濃度を用いる複数工程法である。濃縮後、ＬＮＰ懸濁液を最終バッファー（例えば、ｐＨ７～８のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７～８の１４０ｍＭ ＮａＣｌまたは１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、７０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７～８の５重量％ スクロース）に対して５～２０容量にわたって透析濾過（ダイアフィルトレーション）してアルコールを除去し、バッファー交換を行う。ついで該物質を限外濾過により更に１～３倍に濃縮する。ＬＮＰ製造方法の最終工程は、無菌条件下で適切な容器内に濃縮ＬＮＰ溶液を滅菌濾過することである。滅菌濾過は、ＬＮＰ溶液をプレフィルター（Ａｃｒｏｐａｋ ５００ ＰＥＳ ０．４５／０．８μｍカプセル）およびバイオバーデン低減フィルター（Ａｃｒｏｐａｋ ５００ ＰＥＳ ０．２／０．８μｍカプセル）に通過させることにより達成される。濾過後、バイアル入りのＬＮＰ生成物を、適切な保存条件下（２℃～８℃、または凍結製剤の場合は－２０℃）で保存する。

【0102】

幾つかの実施形態においては、本発明で提供する組成物のＬＮＰは、１０００ｎｍ未満の平均幾何学的直径を有する。幾つかの実施形態においては、ＬＮＰは５０ｎｍ超かつ５００ｎｍ未満の平均幾何学的直径を有する。幾つかの実施形態においては、ＬＮＰの集団の平均幾何学的直径は、約６０ｎｍ、７５ｎｍ、１００ｎｍ、１２５ｎｍ、１５０ｎｍ、１７５ｎｍ、２００ｎｍ、２２５ｎｍ、２５０ｎｍ、２７５ｎｍ、３００ｎｍ、３２５ｎｍ、３５０ｎｍ、３７５ｎｍ、４００ｎｍ、４２５ｎｍ、４５０ｎｍまたは４７５ｎｍである。幾つかの実施形態においては、平均幾何学的直径は、１００～４００ｎｍ、１００～３００ｎｍ、１００～２５０ｎｍ、または１００～２００ｎｍである。幾つかの実施形態においては、平均幾何学的直径は、６０～４００ｎｍ、６０～３５０ｎｍ、６０～３００ｎｍ、６０～２５０ｎｍ、または６０～２００ｎｍである。幾つかの実施形態においては、平均幾何学的直径は７５～２５０ｎｍである。幾つかの実施形態においては、ＬＮＰの集団のＬＮＰの３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上が５００ｎｍ未満の直径を有する。幾つかの実施形態においては、ＬＮＰの集団のＬＮＰの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上が、５０ｎｍ超かつ５００ｎｍ未満の直径を有する。幾つかの実施形態においては、ＬＮＰの集団のＬＮＰの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上が、約６０ｎｍ、７５ｎｍ、１００ｎｍ、１２５ｎｍ、１５０ｎｍ、１７５ｎｍ、２００ｎｍ、２２５ｎｍ、２５０ｎｍ、２７５ｎｍ、３００ｎｍ、３２５ｎｍ、３５０ｎｍ、３７５ｎｍ、４００ｎｍ、４２５ｎｍ、４５０ｎｍまたは４７５ｎｍの直径を有する。幾つかの実施形態においては、ＬＮＰの集団のＬＮＰの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上が、１００～４００ｎｍ、１００～３００ｎｍ、１００～２５０ｎｍまたは１００～２００ｎｍの直径を有する。幾つかの実施形態においては、ＬＮＰの集団のＬＮＰの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上が、６０～４００ｎｍ、６０～３５０ｎｍ、６０～３００ｎｍ、６０～２５０ｎｍまたは６０～２００ｎｍの直径を有する。

【0103】

特定の実施形態においては、ＬＮＰのサイズは、約１～１０００ｎｍの範囲、好ましくは約１０～５００ｎｍの範囲、より好ましくは約１００～３００ｎｍの範囲、好ましくは１００ｎｍである。

【0104】

核酸／ポリヌクレオチド
本開示のＤＮＡは、幾つかの実施形態においては、コドン最適化されている。コドン最適化方法は当技術分野で公知であり、本明細書に記載されているとおりに用いられうる。幾つかの実施形態においては、コドン最適化は、標的生物および宿主生物におけるコドン使用頻度を合致させて適切なフォールディングを確保するために；ｍＲＮＡの安定性が増強し、または二次構造が減少するようにＧＣ含有量を偏らせるために；遺伝子の構築または発現を損ないうる縦列反復コドンまたは塩基伸長を最小限に抑えるために；転写および翻訳制御領域を個別修飾（カストマイズ）するために；タンパク質輸送配列を挿入または除去するために；コード化タンパク質における翻訳後修飾部位（例えば、グリコシル化部位）を除去／付加するために；タンパク質ドメインを付加、除去またはシャッフルするために；制限部位を挿入し、または欠失させるために；リボソーム結合部位およびｍＲＮＡ分解部位を修飾するために；タンパク質の種々のドメインが適切にフォールディングすることが可能になるように翻訳率を調節するために；あるいはポリヌクレオチド内の問題のある二次構造を減少させまたは排除するために、用いられうる。コドン最適化ツール、アルゴリズムおよびサービスは当技術分野で公知であり、非限定的な例には、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ ＣＡ）、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からのサービスおよび／または独自の方法が含まれる。幾つかの実施形態においては、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列は、最適化アルゴリズムを使用して最適化される。

【0105】

幾つかの実施形態においては、コドン最適化配列は、天然に存在するまたは野生型の配列に対して９５％未満の配列同一性、９０％未満の配列同一性、８５％未満の配列同一性、８０％未満の配列同一性または７５％未満の配列同一性を有する。

【0106】

幾つかの実施形態においては、コドン最適化配列は、天然に存在するまたは野生型の配列に対して６５％～８５％（例えば、約６７％～約８５％、または約６７％～約８０％）の配列同一性を有する。幾つかの実施形態においては、コドン最適化配列は、天然に存在するまたは野生型の配列に対して６５％～７５％または約８０％の配列同一性を有する。

【0107】

治療方法
本発明は、ヒトおよび他の哺乳動物におけるＲＳＶの予防および／または治療のための組成物（例えば、医薬組成物）、方法、キットおよび試薬を提供する。ＲＳＶウイルスワクチンは、治療用または予防用物質として使用されうる。それらは、感染症を予防および／または治療するために医薬において使用されうる。例示的な態様においては、本開示のＲＳＶ免疫原性組成物は、ＲＳＶウイルスからの予防的防御をもたらすためのワクチンとして使用される。ＲＳＶウイルスからの予防的防御は、本開示のＲＳＶワクチンの投与の後で達成されうる。ワクチンは１回、２回、３回、４回またはそれ以上投与されうる。治療応答を得るために感染個体にワクチンを投与することが可能であるが、これはそれほど望ましくはない。投与は相応に調整される必要がありうる。

【0108】

幾つかの実施形態においては、本開示のＲＳＶ免疫原性組成物は、対象におけるＲＳＶ感染を予防する方法として使用可能であり、該方法は、本発明で提供される少なくとも１つのＲＳＶ免疫原性組成物を該対象に投与することを含む。幾つかの実施形態においては、本開示のＲＳＶ免疫原性組成物は、対象におけるＲＳＶ感染を治療する方法として使用可能であり、該方法は、本発明で提供される少なくとも１つのＲＳＶ免疫原性組成物を該対象に投与することを含む。幾つかの実施形態においては、本開示のＲＳＶ免疫原性組成物は、対象におけるＲＳＶの発生頻度を低下させる方法として使用可能であり、該方法は、本発明で提供される少なくとも１つのＲＳＶ免疫原性組成物を該対象に投与することを含む。幾つかの実施形態においては、本開示のＲＳＶ免疫原性組成物は、ＲＳＶに感染している第１対象から、ＲＳＶに感染していない第２対象へのＲＳＶの拡散を抑制する方法として使用可能であり、該方法は、該第１対象および該第２対象の少なくとも１つに、本明細書で提供される少なくとも１つのＲＳＶ免疫原性組成物を投与することを含む。

【0109】

本発明の幾つかの態様においては、ＲＳＶに対する対象における免疫応答を誘発する方法を提供する。該方法は、本明細書に記載されているＲＳＶ免疫原性組成物を対象に投与し、それにより、ＲＳＶに特異的な免疫応答を対象において誘導することを含む。

【0110】

予防的有効量は、臨床的に許容されるレベルの、該ウイルスによる感染を予防する治療的有効量である。幾つかの実施形態においては、治療的有効量は、ワクチンの添付文書に記載されている用量である。

【0111】

治療用組成物および予防用組成物
本発明では、例えばヒトおよび他の哺乳動物におけるＲＳＶの予防、治療または診断のための組成物（例えば、医薬組成物）、方法、キットおよび試薬が提供する。ワクチンを包含するＲＳＶ免疫原性組成物は、治療用または予防用物質として使用されうる。それらは、感染症を予防および／または治療するために医薬において使用されうる。幾つかの実施形態においては、本開示によるＲＳＶ免疫原性組成物は、ＲＳＶの治療に使用されうる。

【0112】

ＲＳＶワクチンを包含するＲＳＶ免疫原性組成物は、潜伏期の感染初期もしくは症状の発症後の活発な感染中にまたは健常個体に能動免疫化法の一部として、予防用または治療用に投与されうる。幾つかの実施形態においては、細胞、組織または対象に投与される本開示のワクチンの量は、免疫予防に有効な量でありうる。

【0113】

ＲＳＶワクチンを包含するＲＳＶ免疫原性組成物は、他の予防用または治療用化合物と共に投与されうる。非限定的な例として、予防用または治療用化合物は、アジュバントまたはブースターでありうる。ワクチンのような予防用組成物に言及する場合に本明細書中で用いる「ブースター」なる語は、予防用（ワクチン）組成物の追加的投与を意味する。ブースター（またはブースターワクチン）は、予防用組成物の、より早い投与の後で投与されうる。予防用組成物の初回投与とブースターとの間の投与の時間は、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日、３６時間、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、１０日、２週間、３週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１年、１８か月、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１１年、１２年、１３年、１４年、１５年、１６年、１７年、１８年、１９年、２０年、２５年、３０年、３５年、４０年、４５年、５０年、５５年、６０年、６５年、７０年、７５年、８０年、８５年、９０年、９５年または９９年以上でありうるが、これらに限定されるものではない。幾つかの実施形態においては、予防用組成物の初回投与とブースターとの間の投与の時間は、１週間、２週間、３週間、１か月、２か月、３か月、６か月または１年であるが、これらに限定されるものではない。

【0114】

幾つかの実施形態においては、ＲＳＶワクチンを包含するＲＳＶ免疫原性組成物は、当技術分野で公知の不活化ワクチンの投与と同様に、筋肉内、皮内または鼻腔内に投与されうる。幾つかの実施形態においては、ＲＳＶワクチンを包含するＲＳＶ免疫原性組成物は筋肉内に投与される。

【0115】

ＲＳＶワクチンを包含するＲＳＶ免疫原性組成物は、感染の流行または満たされていない医学上の需要の程度もしくはレベルに応じて、種々の状況において使用されうる。ワクチンは、商業的に入手可能な抗ウイルス剤／組成物より遥かに大きな抗体価を生成し、早く応答を生成する点で、優れた特性を有する。

【0116】

本発明は、所望により１以上の薬学的に許容される賦形剤と組合されていてもよい、ＲＳＶ免疫原性組成物を包含する医薬組成物を提供する。

【0117】

ＲＳＶワクチンを包含するＲＳＶ免疫原性組成物は、単独でまたは１以上の他の成分と組合されて、製剤化または投与されうる。例えば、そのような組成物は、アジュバント（これに限定されるものではない）を包含する他の成分を含みうる。

【0118】

幾つかの実施形態においては、ＲＳＶ免疫原性組成物はアジュバントを含まない（それらはアジュバント非含有物である）。

【0119】

アルミニウムは、主にＴＨ２応答を刺激することにより、共投与抗原に対する免疫応答を刺激することが古くから示されている。本発明で提供される組成物のアルミニウムアジュバントは、アルミニウム沈殿物の形態ではないことが好ましい。アルミニウム沈殿ワクチンは標的抗原に対する免疫応答を増強しうるが、非常に不均一な製剤であることが示されており、一貫性のない結果を示している（Ｌｉｎｄｂｌａｄ Ｅ．Ｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８２：４９７－５０５（２００４）を参照されたい）。これとは対照的に、アルミニウム吸着ワクチンは、標準化された方法で実施可能であり、これは、ヒトへの投与のためのワクチン製剤の必須の特徴である。更に、アルミニウムアジュバント上への所望の抗原の物理的吸着は、おそらく部分的には注射部位からのより遅い除去を可能にすることにより、または抗原提示細胞による抗原のより効率的な取り込みを可能にすることにより、アジュバント機能において重要な役割を果たすと考えられている。

【0120】

本発明のアルミニウムアジュバントは、水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）_３）、リン酸アルミニウム（ＡｌＰＯ_４）、ヒドロキシリン酸アルミニウム、無定形ヒドロキシリン酸アルミニウム硫酸塩（ＡＡＨＳ）、または、いわゆる「ミョウバン」（ＫＡ１（Ｓ０４）－１２Ｈ２０）の形態でありうる［Ｋｌｅｉｎら，Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｌｕｍｉｎｉｕｍ ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｂｙ （２７）Ａ１ ＭＡＳ ＮＭＲ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８９（３）：３１１－２１（２０００）を参照されたい］。本出願で提供される本発明の例示的な実施形態においては、アルミニウムアジュバントは、ヒドロキシリン酸アルミニウムまたはＡＡＨＳである。アルミニウムアジュバント中のアルミニウムに対するホスファートの比率は０～１．３の範囲でありうる。本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、アルミニウムに対するホスファートの比率は、０．１～０．７０の範囲内である。特に好ましい実施形態においては、アルミニウムに対するホスファートの比率は、０．２～０．５０の範囲内である。ＭＡＰＡはヒドロキシリン酸アルミニウムの水性懸濁液である。ＭＡＰＡは、塩化アルミニウムとリン酸ナトリウムとを１：１の体積比で混合してヒドロキシリン酸アルミニウムを沈殿させることにより製造される。混合処理後、物質を、高剪断ミキサーでサイズを減少させて、２～８μｍの範囲の目標凝集体粒子サイズを得る。ついで生成物を生理食塩水に対してダイアフィルトレーションし、蒸気滅菌する。例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１３／０７８１０２を参照されたい。

【0121】

本発明の幾つかの実施形態においては、アルミニウムアジュバントはＡＡＨＳ［本明細書においてはＭｅｒｃｋ（メルク）アルミニウムアジュバント（ＭＡＡ）と互換的に呼称される］の形態である。ＭＡＡは中性ｐＨでゼロの電荷を有し、一方、ＡＩＯＨは正味の正電荷を有し、ＡＩＰＯ_４は、典型的には、中性ｐＨで正味の負電荷を有する。

【0122】

当業者は、標的化抗原性ポリペプチドに対する免疫応答を増強するのに安全かつ有効なアルミニウムアジュバントの最適用量を決定しうるであろう。アルミニウムの安全性プロファイル、およびＦＤＡ認可ワクチンに含まれるアルミニウムの量の考察は、Ｂａｙｌｏｒら，Ｖａｃｃｉｎｅ ２０：Ｓ１８－Ｓ２３（２００２）を参照されたい。一般に、アルミニウムアジュバントの有効かつ安全な用量は、１５０～６００μｇ／用量（３００～１２００μｇ／ｍｌの濃度）で変動する。本発明の製剤および組成物の特定の実施形態においては、ワクチンの用量当たり２００～３００μｇのアルミニウムアジュバントが存在する。本発明の製剤および組成物の代替的実施形態においては、ワクチンの用量当たり３００～５００μｇのアルミニウムアジュバントが存在する。

【0123】

ＲＳＶワクチンを包含するＲＳＶ免疫原性組成物は、１以上の薬学的に許容される賦形剤と組合せて製剤化（処方）または投与されうる。幾つかの実施形態においては、該組成物は、少なくとも１つの追加的な活性物質、例えば治療用活性物質、予防用活性物質または両方の組合せを含む。該組成物は無菌、発熱物質非含有、または無菌かつ発熱物質非含有でありうる。ワクチン組成物のような医薬物質の製剤および／または製造における一般的な考慮事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）において見いだされうる。幾つかの実施形態においては、ＲＳＶワクチンを包含するＲＳＶ免疫原性組成物は、ヒト、ヒト患者または対象に投与される。

【0124】

本明細書に記載されているＲＳＶ免疫原性組成物の製剤は、薬理学の分野で公知のまたは今後開発される任意の方法により製造されうる。一般に、そのような製造方法は、有効成分（例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）を賦形剤および／または１以上の他の補助成分と一緒にし、ついで、必要および／または所望に応じて、生成物を、所望の単一または複数用量単位に分割、成形および／または包装する工程を含む。

【0125】

本開示による医薬組成物における有効成分、薬学的に許容される賦形剤および／または任意の追加的成分の相対量は、治療される対象の本質、サイズおよび／または症状に応じて、そして更には該組成物が投与される経路に応じて変動するであろう。例えば、該組成物は、０．１％～１００％、例えば０．５～５０％、１～３０％、５～８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の有効成分を含みうる。

【0126】

ワクチン投与方法
ＲＳＶワクチンを包含するＲＳＶ免疫原性組成物は、治療的に有効な結果をもたらす任意の経路により投与されうる。これらには、皮内、筋肉内、鼻腔内および／または皮下投与が含まれるが、これらに限定されるものではない。本開示は、組成物を、それを要する対象に投与することを含む方法を提供する。必要とされる厳密な量は、対象の種、年齢および全身状態、疾患の重症度、個々の組成物、その投与様式、その活性様態などに応じて、対象によって異なる。ＲＳＶ免疫原性組成物は、典型的には、投与の容易さおよび投与量の均一性のために投与単位形態として製剤化される。しかし、ワクチン組成物の１日の合計使用量は、妥当な医学的判断の範囲内で主治医により決定されうると理解されるであろう。具体的な患者に対する具体的な治療的有効量、予防的有効量または適切なイメージング投与レベルは、治療される障害および障害の重症度；使用される具体的な化合物の活性；使用される具体的な組成物；患者の年齢、体重、全身健康状態、性別および食事；使用される具体的な化合物の投与時間、投与経路および排泄速度；治療期間；使用される具体的な化合物と組合せて又は同時に使用される薬物；ならびに医学分野でよく知られている同様の要素を含む種々の要因に依存するであろう。

【0127】

幾つかの実施形態においては、ＲＳＶ免疫原性組成物は、所望の治療効果、診断効果、予防効果またはイメージング効果を得るために、１日当たり、１週間当たり、１か月当たりなどに１回以上、対象の体重当たり０．０００１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ～０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．００５ｍｇ／ｋｇ～０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ～０．００５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ～０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～４０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇを送達するのに十分な投与量レベルで投与されうる。例示的な実施形態においては、ＲＳＶ免疫原性組成物ワクチン組成物は、０．０００５ｍｇ／ｋｇ～０．０１ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０００５ｍｇ／ｋｇ～約０．００７５ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０００５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ、約０．００２ｍｇ／ｋｇ、約０．００３ｍｇ／ｋｇ、約０．００４ｍｇ／ｋｇまたは約０．００５ｍｇ／ｋｇを送達するのに十分な投与量レベルで投与されうる。

【0128】

幾つかの実施形態においては、ＲＳＶ免疫原性組成物は、０．０２５ｍｇ／ｋｇ～０．２５０ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ～０．５００ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ～０．７５０ｍｇ／ｋｇ、または０．０２５ｍｇ／ｋｇ～１．０ｍｇ／ｋｇを送達するのに十分な投与量レベルで１回または２回（またはそれ以上）投与されうる。

【0129】

本明細書に記載されているＲＳＶ免疫原性医薬組成物は、本明細書に記載されている剤形、例えば、鼻腔内、気管内または注射可能（例えば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、皮内、心臓内、腹腔内、鼻腔内および皮下）剤形に製剤化されうる。

【0130】

本発明は、その適用において、以下の説明に記載されている又は図面に例示されている構成の詳細および成分の配置に限定されるものではない。本発明は他の実施形態が可能であり、種々の方法で実施または実行されうる。また、本明細書において用いられている表現および用語は説明を目的としたものであり、限定的であるとみなされるべきではない。本明細書における「包含する」、「含む」または「有する」、「含有する」、「伴う」およびそれらの変化形の使用は、その後に挙げてある項目およびその均等物ならびに追加的な項目を包含することを意味する。

【0131】

図面の簡潔な説明
前記および他の目的、特徴および利点は、添付図面に例示されている本発明の特定の実施形態の以下の説明から明らかであろう。添付図面においては、同様の参照文字は種々の図面の全てにおいて同じ部分を示す。図面は必ずしも縮尺通りではなく、本発明の種々の実施形態の原理を例示することに重点が置かれている。

【図面の簡単な説明】

【0132】

【図1】図１Ａおよび１Ｂは、ＬＺＦ４０（８アミノ酸リンカーを含有するＤＳ－Ｃａｖ１）の新たに回収されたトランスフェクション後第７日の細胞培養上清（ｓｕｐｅ）（図１Ａ）、または、４℃で８日間保存されたもの（図１Ｂ）の、Ｄ２５およびＳｙｎａｇｉｓ（シナジス）（登録商標）（パリビズマブ）モノクローナル抗体への結合を示す。

【図2】図２Ａ～２Ｆは、ＬＺＦ５５（Ｆ５５）、ＬＺＦ５６（Ｆ５６）およびＬＺＦ５７（Ｆ５７）（それぞれ１０、１２または１４アミノ酸リンカーを含有するＤＳ－Ｃａｖ１；それぞれ図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃ）の新たに回収されたトランスフェクション後第３日の細胞培養上清（ｓｕｐｅ）、または、４℃で７日間保存されたもの（それぞれ図２Ｄ、２Ｅおよび２Ｆ）の、Ｄ２５およびＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）（パリビズマブ）への結合を示す。

【図3】図３は、ＤＳ－Ｃａｖ１と比較した、一本鎖ＲＳＶ変異体ＬＺＦ５５、ＬＺＦ５６およびＬＺＦ５７の抗ＲＳＶ Ｆ血清でのウエスタンブロットの結果を示す。

【図4】図４Ａ～４Ｃは、ＥＬＩＳＡにより測定された、ＤＳ－Ｃａｖ１（図４Ａ）、ＬＺＦ５７（図４Ｂ）またはＬＺＦ１１１（図４Ｃ）の新たに回収された細胞培養上清の、Ｄ２５および４Ｄ７モノクローナル抗体への結合を示す。図４Ｄは、還元（Ｒ）または非還元（ＮＲ）条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析された精製ＤＳ－Ｃａｖ１、Ｆ５７およびＦ１１１を示す。

【図5】図５Ａおよび５Ｂは、それぞれ、ＬＺＦ１１１およびＤＳ－Ｃａｖ１のＣＤスペクトルを示す。

【図6】図６は、分離された３Ｄ構造を有するタンパク質の、ＣＤスペクトルで訓練されたニューラルネットワークを使用するＤＳ－Ｃａｖ１およびＬＺＦ１１１のＣＤスペクトル（１８５ｎｍ～２６０ｎｍ）の再構築による二次構造分析を示す。

【図7】図７は、示差走査蛍光分析（ＤＳＦ）により分析された精製ＬＺＦ１１１およびＤＳ－Ｃａｖ１の熱安定性を示す。

【図8】図８Ａ～８Ｅは、ＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいてＤ２５、４Ｄ７およびＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）（パリビズマブ）への結合により評価された、凍結状態または４℃で１か月間（図８Ａ～８Ｃ）、２か月間（図８Ｄ）または３か月間（図８Ｅ）保存された精製ＤＳ－Ｃａｖ１タンパク質またはＬＺＦ１１１の長期安定性を示す。

【図9】図９Ａおよび９Ｂは融合前Ｆタンパク質に対するＰＤ２マウス血清のＥＤ１０ ＥＬＩＳＡ力価（図９Ａ）およびＲＳＶ ロング（Ｌｏｎｇ）株に対するＰＤ２マウス血清の血清中和力価（図９Ｂ）を示す。水平の破線は検出限界を示す。データは、ＬＺＦ１１１が、種々の用量で、ＤＳ－Ｃａｖ１と比較して類似したレベルの中和抗体を誘導したことを示している。

【図10】図１０はＬＺＦ１１１（上）、ＤＳ－Ｃａｖ１（中央）およびＬＺＦ５７（下）の概要図を示す。

【図11】図１１は、ｍＲＮＡワクチンおよび対照製剤によりコットンラットにおいて誘導された、ＲＳＶ Ａに対する血清中和抗体価［ＮＴ_５０（個別）およびＧＭＴ（９５％信頼区間を有するもの）］を示す。

【図12】図１２は、第５６日（４週ＰＤ２）に測定されたＤ２５（部位φ）、パリビズマブ（部位ＩＩ）および４Ｄ７（部位Ｉ）に対する血清抗体競合ＥＬＩＳＡ力価［ＩＴ_５０（個別）およびＧＭＴ（９５％信頼区間を有するもの）］を示す。

【図13】図１３は、コットンラットをＲＳＶ Ａでチャレンジした後の肺および鼻におけるＲＳＶ含有量を示す。

【図14】図１４は、ｍＲＮＡワクチンおよび対照製剤によりアフリカミドリザルにおいて誘導された、ＲＳＶ Ａに対する血清中和抗体価［ＮＴ_５０（個別）およびＧＭＴ（９５％信頼区間を有するもの）］を示す。

【図15】図１５は、第１０週（２週ＰＤ３）に測定されたＤ２５（部位φ）、パリビズマブ（部位ＩＩ）および４Ｄ７（部位Ｉ）に対する血清抗体競合ＥＬＩＳＡ力価［ＩＴ_５０（個別）およびＧＭＴ（９５％信頼区間を有するもの）］を示す。

【図16】図１６Ａ～１６ＣはＡＧＭのチャレンジの後の気管支肺胞（ＢＡＬ）液中のＲＳＶ含有量を示す。図１６Ａは高用量免疫化である。図１６Ｂは低用量免疫化である。図１６Ｃは曲線下面積を示す。

【図17】図１７Ａ～１７ＣはＡＧＭのチャレンジの後の鼻スワブにおけるＲＳＶ含有量を示す。図１７Ａは高用量免疫化である。図１７Ｂは低用量免疫化である。図１７Ｃは曲線下面積を示す。

【図18】図１８は、ｍＲＮＡワクチンおよび対照製剤によりアフリカミドリザルにおいて生じた、ＲＳＶ Ａに対する血清中和抗体価［ＮＴ_５０（個別）およびＧＭＴ（９５％信頼区間を有するもの）］を示す。

【図19】図１９は、第１０週（２週ＰＤ３）に測定されたＤ２５（部位φ）、パリビズマブ（部位ＩＩ）および４Ｄ７（部位Ｉ）に対する血清抗体競合ＥＬＩＳＡ力価［ＩＴ_５０（個別）およびＧＭＴ（９５％信頼区間を有するもの）］を示す。

【0133】

実施例
実施例１：ペプチドリンカーにより連結されたＦ_１断片およびＦ_２断片を有する一本鎖変異体の作製
野生型ＲＳＶ Ｆポリペプチドは翻訳後に宿主フューリンプロテアーゼによりＦ_１断片およびＦ_２断片へと切断される。フューリンにより切断されずに、単一ポリペプチドとして残存する一本鎖ＲＳＶ変異体を評価するために、ＷＴ ＲＳＶのアミノ酸９８～１４６（このアミノ酸はフューリン切断部位、ｐ２７ペプチド、および融合ペプチドの一部を含む）を、融合前安定化ＤＳ－Ｃａｖ１変異（Ｓ１５５Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、Ｖ２０７ＬおよびＳ２９０Ｃ）のバックグラウンドにおいて、種々の長さ（８～１４アミノ酸）の柔軟アミノ酸リンカーで置換した（ＭｃＬｅｌｌａｎら，２０１３）。これらの変異体においては、Ｔ４ファージフィブリチン三量体化ドメイン（フォールドン）をＲＳＶ ＦエクトドメインのＣ末端に付加し、それに続いてプロテアーゼ切断部位および精製タグを付加した。変異ＲＳＶ Ｆ配列を、哺乳類コドン使用頻度にいてコドン最適化し、発現ベクター内にクローニングし、Ｅｘｐｉ２９３浮遊細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内に一過性にトランスフェクトした。細胞培養上清をプラスミドトランスフェクション後の第３日～第７日に回収し、ＲＳＶ Ｆに対する種々の抗体へのこれらの変異体の結合を評価した。簡潔に説明すると、９６ウェルＮｉ－ＮＴＡ被覆プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を細胞培養上清で室温で１時間コーティング（被覆）した。非結合部位をＰＢＳ中の２％（ｖ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の添加および室温で１時間のインキュベーションによりブロッキングした。プレートを、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（トゥイーン）（商標）２０（ポリソルベート２０）を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）で洗浄し、抗体［Ｄ２５またはＳｙｎａｇｉｓ（登録商標）（パリビズマブ）］の系列希釈物と共に室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ－Ｔで再び洗浄し、１：２，０００に希釈されたヤギ抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ結合二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と共に室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔでの更なる洗浄およびｄｄＨ_２Ｏでの手短なすすぎの後、Ｓｕｐｅｒ ＡｑｕａＢｌｕｅ ＥＬＩＳＡ基質（ｅＢｉｏｓｉｅｎｃｅ）を加え、プレートを直ちに４０５ｎｍで５分間読取った。各ウェルのｍＯＤ／分を計算した。

【0134】

図１Ａおよび１Ｂは、構築物４０ａ（８アミノ酸リンカーを含有するＤＳ－Ｃａｖ１）の新たに回収されたトランスフェクション後第７日の細胞培養上清（図１Ａ）または４℃で８日間保存されたもの（図１Ｂ）の、Ｄ２５およびＳｙｎａｇｉｓ（シナジス）（登録商標）（パリビズマブ）モノクローナル抗体への結合を示す。ＬＺＦ４０ａ変異体は低い融合前特異的ｍＡｂ Ｄ２５結合を示した。パリビズマブ（これは融合前Ｆと融合後Ｆとの両方と反応する）への結合は高かった。このことは、該変異体が良好に発現されたことを示唆している。図２Ａおよび２Ｂは、ＬＺＦ５５ａ、ＬＺＦ５６ａおよびＬＺＦ５７ａ（それぞれ１０、１２または１４アミノ酸リンカーを含有するＤＳ－Ｃａｖ１；それぞれ図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ）の新たに回収されたトランスフェクション後第３日の細胞培養上清または４℃で７日間保存されたもの（それぞれ図２Ｄ、２Ｅおよび２Ｆ）の、Ｄ２５およびパリビズマブへの結合を示す。パリビズマブへの反応性に基づけば、これらの３つの変異体の全ては良好に発現された。これらの変異体のうち、ＬＺＦ５７ａ（１４アミノ酸リンカーを含有するＤＳ－Ｃａｖ１）が最高の融合前特異的ｍＡｂ Ｄ２５結合を示し、４℃で７日間の保存の後にＤ２５結合を保持した。

【0135】

ＥＬＩＳＡに加えて、トランスフェクション後の種々の時点で回収された細胞培養上清を、抗ＲＳＶ Ｆ血清を使用するウエスタンブロットで分析した。上清を、還元剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともにＳＤＳローディングバッファーで処理し、ゲル電気泳動に適用し、ついでニトロセルロース膜（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上にエレクトロトランスファーした。１×ＴＢＳＴ（Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水＋トゥイーン）中で調製されたブロッティング等級ブロッカー（ＢｉｏＲａｄ）中で該膜を４℃で一晩ブロッキングした。該膜を、野生型ＲＳＶ Ｆタンパク質の外部ドメインに対するポリクローナルモルモット血清（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）と共にインキュベートし、ついでＡＰ結合ヤギ抗モルモットＩｇＧ二次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共にインキュベートした。一本鎖ＲＳＶ変異体ＬＺＦ５５ａ、ＬＺＦ５６ａおよびＬＺＦ５７ａは、元のＤＳ－Ｃａｖ１と比較して有意に改善された発現レベルを示した（図３）。ＤＳ－Ｃａｖ１はゲル上で２つのバンドとして現れ：上のバンドは未切断Ｆタンパク質を表し、下のバンドはフューリン切断Ｆ_１断片を表す。一本鎖ＲＳＶ変異体ＬＺＦ５５、ＬＺＦ５６およびＬＺＦ５７は、未切断Ｆに相当する単一の優勢なバンドとしてゲル上に現れた。

【0136】

実施例２：追加的な安定化変異
モノクローナル抗体４Ｄ７はＲＳＶ融合後Ｆタンパク質上の抗原部位Ｉと反応し、融合前Ｆ構造の安定性の評価に使用されうる（Ｆｌｙｎｎら，２０１６）。ＤＳ－Ｃａｖ１または構築物ＬＺＦ５７ａの新たに回収された細胞培養上清を、Ｄ２５および４Ｄ７結合に関してＥＬＩＳＡにより評価した（図４Ｃ）。構築物ＬＺＦ５７ａはＤ２５結合を保持しており、その融合前コンホメーションを示しているが、元のＤＳ－Ｃａｖ１構築物と比較して増強した４Ｄ７結合を示しているようであり、このことは、一本鎖リンカーが導入された場合に微妙なコンホメーション変化が存在しうることを示唆している。ＬＺＦ５７ａ一本鎖ＲＳＶ変異体構築物を更に安定化させるために、ジスルフィド結合変異、キャビティ充填変異および／または融合後不安定化変異を有する変異体を作製するために、構造に基づく設計を行った。特に、融合前Ｆタンパク質の結晶構造に基づくジスルフィド変異体Ｄ４８６Ｃ／Ｄ４８９Ｃのモデルは、３．８オングストローム内の分子間ジスルフィド結合が融合前コンホメーションを更に安定化させるのに役立ちうることを示唆した（データ非表示）。選択された変異をＬＺＦ５７ａ変異と組合せ、前記のとおりに融合前特異的ｍＡｂ Ｄ２５および４Ｄ７で評価した。変異体ＬＺＦ １１１ａ（これは、Ｄ４８６Ｃ／Ｄ４８９Ｃ変異を有するＬＺＦ５７ａに対応する）は、構築物ＬＺＦ５７ａと比較して低減した４Ｄ７結合を示した。このことは、それが、より融合前に類似したコンホメーションをとりうることを示唆している（図４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄ）。図１０はＬＺＦ１１１およびＬＺＦ５７構築物の概要を示す。

【0137】

ＬＺＦ１１１変異体を更に特徴づけるために、ＲＳＶ Ｆタンパク質（ＤＳ－Ｃａｖ１およびＬＺＦ１１１ａ）を、既に記載されているもの（ＭｃＬｅｌｌａｎ ２０１３）から採用された変法で培養上清から精製した。簡潔に説明すると、Ｎｉ－セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）クロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してｈｉｓタグ付きタンパク質を精製した。トロンビンでの一晩消化によりタグを除去した。イミダゾール濃度を減少させるために、透析中に消化を行った。共溶出汚染物質および未切断Ｆタンパク質を除去するために、サンプルを第２のＮｉ－セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）クロマトグラフィーにかけた。Ｆタンパク質をゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により更に精製し、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌのバッファー中で保存した。ジスルフィド結合形成を評価するために、還元条件下および非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行った（図４Ｄ）。簡潔に説明すると、精製タンパク質サンプルを還元剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の存在下または非存在下でＳＤＳローディングバッファーで処理し、９５℃で２～３分間加熱し、ＮｕＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ゲル電気泳動に適用した。ゲルをゲルコードブルー染色溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）で染色し、水で脱染した。還元条件下では、予想通り、ＤＳ－Ｃａｖ１は、切断Ｆ１断片およびＦ２断片を表す２本のバンドとしてゲル上に現れた。非還元条件下では、ＤＳ－Ｃａｖ１は、主に、５０ｋＤａ近くのバンドとして現れ、これは、天然ジスルフィド結合により連結された１つの切断Ｆ_１断片および１つのＦ_２断片を表す。予想どおり、一本鎖ＲＳＶ変異体ＬＺＦ５７は、どちらの条件下でも、主に未切断単量体Ｆ_０バンドとしてゲル上に現れた。還元条件下および非還元条件下のＬＺＦ５７の移動度の変化は、見掛け分子量の増加を招き、還元条件下の緻密性の喪失により引き起こされる可能性が高い。一本鎖ＲＳＶ変異体ＬＺＦ１１１も、還元条件下、主に未切断単量体Ｆ０バンドとしてゲル上で現れた。非還元条件下では、単量体形態および二量体形態に合致する２つの亜優勢（サブドミナント）バンドが５０ｋＤａおよび１００ｋＤａに存在するが、ＬＺＦ１１１の優勢（ドミナント）バンドは１５０ｋＤａ近くにシフトし、これは三量体の分子量に合致する。Ｄ４８６Ｃ／Ｄ４８９Ｃ変異はＬＺＦ５７構築物とＬＺＦ１１１構築物との間の唯一の差異であったため、このデータは、設計された分子間ジスルフィド結合が実際にＬＺＦ１１１分子の大部分において形成されることを示唆した。

【0138】

実施例３：ＬＺＦ１１１安定性試験
精製ＲＳＶ Ｆタンパク質の二次構造を分析するために、円偏光二色性（「ＣＤ」）スペクトルをＣｈｉｒａｓｃａｎ分光計（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ ＬｔＤ，ＵＫ）で得た。Ｚｅｂａスピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４中にバッファー交換し、ついで１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４中に１：２希釈して、３．９μＭおよび４．４μＭの、それぞれＤｓＣａｖ－１およびＬＺＦ１１１の最終タンパク質濃度を得た後、サンプルを分析した。光路長０．５ｍｍの石英キュベットを使用して、未希釈状態でＣＤスペクトルを記録した。温度制御を２０℃に設定した。帯域幅を１ｎｍに設定した。１時点当たり５秒のサンプリング時間で１ｎｍ間隔で１８５ｎｍと２６０ｎｍとの間のデータ点を得た。サンプルおよびバッファーのスペクトルは、それぞれ３回の技術的反復（ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）を適用して、温度平衡化の１０分後に得た。平均バッファースペクトルをサンプルスペクトルから差し引いた。得られたデータ点を、Ｏｒｉｇｉｎ Ｐｒｏ ７．５ ＳＲ７ソフトウェアパッケージ（Ｏｒｉｇｉｎ Ｌａｂ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用してＳａｖｉｔｚｋｙ－Ｇｏｌａｙアルゴリズム（多項式次数２、左右に２つのデータ点）で平滑化した。ＤＳ－Ｃａｖ１とＬＺＦ １１１とのＣＤスペクトルはほぼ同じであった（図５Ａおよび５Ｂ）。分離された３Ｄ構造を有するタンパク質のＣＤスペクトルでトレーニングされたニューラルネットワーク［ソフトウェアＣＤＮＮ：円二色性神経ネットワーク（Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ）］を使用するＤＳ－Ｃａｖ１およびＬＺＦ１１１のＣＤスペクトル（１８５ｎｍ～２６０ｎｍ）の再構築により、二次構造を更に分析し（図６）、これは、ＬＺＦ１１１の修飾が融合前Ｆタンパク質の二次構造における有意な変化をもたらさなかったことを示している。

【0139】

ＤＳ－Ｃａｖ１およびＬＺＦ１１１タンパク質を使用して、それらの安定性を評価するために、示差走査蛍光分析（ＤＳＦ）分析を行った。５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）中のＤＳ－Ｃａｖ１タンパク質（０．２７～３５μＭ）の溶液を系列希釈により調製した。Ｃａｒｙ温度コントローラー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ）を備えたＣａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光光度計を使用して、３ｍＭ×３ｍｍの光路長を有する微小石英キュベット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）内のそれぞれ８５μＬのタンパク質サンプルの蛍光シグナルを検出した。固有タンパク質蛍光を３３０ｎｍおよび３５０ｎｍで記録した。スリット幅１０ｎｍで励起波長を２８０ｎｍに設定した。発光スリット幅を２．５ｎｍに設定した。蛍光シグナルを最大にするために、光電子増倍管電圧を各測定前に５００Ｖ～８００Ｖの値に調節した。２０℃から９５℃までの増分０．５℃の１℃／分の温度勾配を用いて、熱アンフォールディング実験を行った。サンプルを開始温度で１分間平衡化し、蛍光シグナルを各データ点に関して１．５秒間平均化した。マルチセルホルダーは最大４個のサンプルの同時分析を可能にした。温度の関数として蛍光強度の融解曲線を得るために、Ｏｒｉｇｉｎ Ｐｒｏ（登録商標）７．５ ＳＲ７を使用して更なる処理を行うために生データをエクスポートした。融解曲線を平滑化し（多項式次数＝１、点の数＝１２）、３５０ｎｍと３３０ｎｍとの間の比率の１次導関数のピーク中心を融解温度（Ｔｍ）として使用した。異なるタンパク質サンプルまたはタンパク質濃度の比較を助けるために、データを最高シグナル強度により正規化した。ＤＳ－Ｃａｖ１は２つの移行中点（６０．８５±１．９８℃および８０．７±０．９３℃）を有し、これらは、同じサンプル型に関して分析された全タンパク質濃度から得られた平均として示された（Ｆｌｙｎｎら，２０１６）（図７）。ＬＺＦ１１１に関しては、示されているＴｍ（約８１℃）は、１５μＭの単一濃度から得られた（図７）。約６０．８５℃の低いほうのＴｍの非存在、および約８１℃の高いほうのＴｍのより狭いピークは、ＬＺＦ１１１がＤＳ－ＣＡＶ１と比較して改善された安定性を有することを示唆した。

【0140】

４℃以上での長期安定性は、サブユニットワクチン抗原にとって望ましい特性である。ＤＳ－Ｃａｖ１の長期安定性を評価するために、本発明者らは、Ｄ２５および４Ｄ７を使用する抗体結合アッセイ、ならびに生物物理学的分析を既に用いている。ＤＳ－Ｃａｖ１は４℃での長期保存時にコンホメーション変化を受けて、４Ｄ７への結合能を獲得する代替的構造をとっていることを本発明者らのデータは示した（Ｆｌｙｎｎら，２０１６）。ＬＺＦ１１１の長期安定性を評価するために、精製ＤＳ－Ｃａｖ１タンパク質または構築物ＬＺＦ１１１を凍結状態または４℃で１、２または３か月間保存し、ＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて、Ｄ２５、４Ｄ７およびパリビズマブを使用して評価した。簡潔に説明すると、精製タンパク質をＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈し、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ）上で４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳ中の２％（ｖ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）添加および室温で１時間のインキュベーションにより、未結合部位をブロッキングした。プレートを、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ポリソルベート２０）を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ－Ｔ）で洗浄し、抗体（Ｄ２５またはパリビズマブ）の系列希釈物で室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ－Ｔで再び洗浄し、１：２，０００に希釈されたヤギ抗ヒト（Ｄ２５およびパリビズマブ用）または抗マウス（４Ｄ７用）ＩｇＧ ＨＲＰ結合二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と共に室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔでの更なる洗浄およびｄｄＨ_２Ｏでの手短なすすぎの後、Ｓｕｐｅｒ ＡｑｕａＢｌｕｅ ＥＬＩＳＡ基質（ｅＢｉｏｓｉｅｎｃｅ）を加え、プレートを直ちに４０５ｎｍで５分間読取った。各ウェルのｍＯＤ／分を計算した。図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃが示すところによると、４℃で１か月の保存の後、Ｄ２５およびパリビズマブの関連性は両方の構築物に関して維持されていたが、ＤＳ－Ｃａｖ１では４Ｄ７結合の有意な増強が検出されたが、改善されたＬＺＦ１１１では検出されなかった。更に、ＬＺＦ１１１では４℃で２か月および３か月の保存の後も４Ｄ７結合の増強は観察されず（図８Ｄおよび８Ｅ）、このことは、ＬＺＦ１１１の長期安定性がＤＳ－Ｃａｖ１より優れていることを示唆している。

【0141】

実施例４：免疫原性試験
ＤＳ－Ｃａｖ１およびＬＺＦ１１１サブユニットワクチンの免疫原性を比較するために、マウス免疫原性試験を設計した。試験した動物は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した雌ＢＡＬＢ／ｃマウスであった。１群当たり１０匹のマウスをアルミニウムアジュバントの存在下の３つの異なる用量（２μｇ、０．４μｇおよび０．２μｇ）の精製ＤＳ－Ｃａｖ１またはＬＺＦ１１１ａタンパク質で第０週および第３週に２回免疫化した。各免疫化の２週後に血液を採集し、血清を分析した。融合前Ｆタンパク質に対する結合抗体価を評価するため、イムロン（ｉｍｍｕｌｏｎ）１２ＨＢマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ）を２μｇ／ｍｌの精製組換えＲＳＶ Ｆタンパク質ＤＳ－ＣＡＶ１でコーティング（被覆）し、４℃で一晩インキュベートした。ついで該プレートを洗浄し、３％ 脱脂乳を含有するＰＢＳ－Ｔ（ブロッキングバッファー）で室温で１時間ブロッキングした。試験サンプルをブロッキングバッファー中で系列４倍希釈し（１：５０希釈から開始）、該ＲＳＶ Ｆ被覆プレートに移し、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔでの３回の洗浄の後、ブロッキングバッファー中で１：３，０００希釈されたＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を該プレートに加え、更に１時間インキュベートした。該プレートを再び洗浄し、ＳｕｐｅｒＢｌｕ Ｔｕｒｂｏ ＴＭＢ（Ｖｉｒｏｌａｂｓ）で暗所で現像した。反応を５分後に停止させ、ＶｅｒｓａＭａｘ ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で４５０ｎｍの吸光度を読取った。最大シグナルの１０％を示す血清サンプルの有効希釈度を示すＥＤ１０ ＥＬＩＳＡ力価をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７ソフトウェアにおいて４パラメーター曲線フィットにより決定した。図９Ａは用量２投与後血清の融合前Ｆタンパク質に対するＥＤ１０ ＥＬＩＳＡ力価を示す。下の水平破線は検出限界を示す。データは、ＬＺＦ１１１が、種々の用量で、ＤＳ－Ｃａｖ１と比較して類似した抗融合前Ｆ抗体レベルを誘導したことを示している。

【0142】

試験前に補体を不活性化するために５６℃で３０分間処理されたマウス血清に対して、中和アッセイも行った。２％ ＦＢＳを含有するＥＭＥＭ中で、１：４希釈から開始する血清サンプルの２倍系列希釈液を調製した。希釈血清を９６ウェルプレートに二重に加え、１００μｌの総体積中のＲＳＶロング（Ｌｏｎｇ）株（１００ ｐｆｕ／ｍＬ）と混合した。ウイルスおよび血清サンプルの混合物を、５％ ＣＯ_２の存在下、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ウェル当たり１．５×１０^４ 細胞の濃度のＨｅｐ－２細胞を添加した。該プレートを、５％ ＣＯ_２の存在下、３７℃で３日間インキュベートした。ついで該細胞を洗浄し、８０％ アセトンで１５分間固定した。ついでＲＳＶ感染細胞を免疫染色した。簡潔に説明すると、ＲＳＶ Ｆ－およびＮ－特異的モノクローナル抗体を、該固定細胞を含有する試験プレートに加え、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧを加え、１時間インキュベートした。該プレートを再び洗浄し、二重チャネル近赤外線検出（ＮＩＤ）系で現像した。ＲＳＶ特異的シグナルを検出するための赤外線色素－ストレプトアビジンおよびアッセイ正規化用の２つの細胞染料を９６ウェルプレートに加え、暗所で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、暗所で２０分間乾燥させ、細胞正規化用の７００チャネルレーザーおよびＲＳＶ特異的シグナルの検出用の８００チャネルレーザーを使用するＬｉｃｏｒ Ａｅｒｉｕｓ１自動イメージングシステム（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）で読取った。８００／７００比を計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７ソフトウェアにおいて４パラメーター曲線フィットにより血清中和力価（ＩＣ５０）を決定した。ＲＳＶロング（Ｌｏｎｇ）株に対するＰＤ２血清の血清中和力価を図９Ｂに示す。下の水平破線は検出限界を示す。データは、ＬＺＦ１１１が、種々の用量において、ＤＳ－Ｃａｖ１と比較して類似したレベルの中和抗体を誘導することを示した。

【0143】

実施例５：コットンラット免疫原性試験
この実施例においては、コットンラットＲＳＶチャレンジモデルにおけるｍＲＮＡ／ＬＮＰワクチンの免疫原性および有効性を試験するためのアッセイを行った。より詳細には、雌シグモドン・ヒスピダス（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ ｈｉｓｐｉｄｕｓ）コットンラットを使用し、６～７週齢で免疫化を開始した。使用したｍＲＮＡワクチンは、脂質ナノ粒子において作製し製剤化した。この試験において評価したｍＲＮＡワクチンには、以下のものが含まれた：
ＭＲＫ－０４膜結合ＤＳ－Ｃａｖ１（安定化融合前Ｆタンパク質）、
ＭＲＫ－０４ ｎｏｐｏｌｙ（ノポリ）Ａ ３ｍｕｔ膜結合ＤＳ－Ｃａｖ１（安定化融合前Ｆタンパク質）、
ｍＶＲＣ－１（ｖ２）膜結合一本鎖ｓｃ９ ｍＤＳ－Ｃａｖ１，Ａ１４９Ｃ，Ｙ４５８Ｃ（安定化融合前Ｆタンパク質）、
ｍＬＺＦ－１１１膜結合一本鎖ｍＤＳ－Ｃａｖ１，Ｄ４８６Ｃ，Ｄ４８９Ｃ（安定化融合前Ｆタンパク質）。

【0144】

８匹のコットンラットの群を、各大腿四頭筋内への５０μＬによる送達で、１００μＬのワクチンで筋肉内に免疫化した。該群に以下のワクチンを接種した。

【表1】

【0145】

実験の第０日および第２８日に該動物を免疫化した。第２８日および第５６日に、血液を各動物から採取し、血清学的アッセイに使用した。第５６日に、コットンラットを１×１０^５．５ ＰＦＵ ＲＳＶ Ａ２で鼻腔内チャレンジした。接種の４日後、ＣＯ_２吸入により動物を犠死させ、肺（左葉）および鼻甲介を取り出し、ウェットアイス（ｗｅｔ ｉｃｅ）上にＳＰＧを含有する１０容量のハンクス平衡塩溶液（Ｌｏｎｚａ）中でホモジナイズ（均質化）した。サンプルを２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により清澄化し、アリコート化し、瞬間凍結し、直ちに－７０℃で凍結保存した。

【0146】

ＲＳＶ中和アッセイ：
各動物からのコットンラット血清を、ＲＳＶ－Ａ（Ｌｏｎｇ株）の中和に関して以下の手順で評価した。

【0147】

１．全ての血清サンプルを、５６℃に設定されたドライバスインキュベーター内に３０分間配置することにより熱不活性化した。ついでサンプルおよび対照血清をウイルス希釈液（ＥＭＥＭ中の２％ ＦＢＳ）中で１：３希釈し、二重のサンプルをアッセイプレートに加え、系列希釈した。

【0148】

２．ＲＳＶ－Ｌｏｎｇストックウイルスを冷凍庫から取り出し、３７℃の水浴内で素早く解凍した。ウイルスをウイルス希釈液中で２０００ ｐｆｕ／ｍＬに希釈した。

【0149】

３．「ウイルス非含有」対照として使用した１つの列の細胞を除く、９６ウェルプレートの各ウェルに、５０μＬの希釈ウイルスを加えた。

【0150】

４．ＨＥｐ－２細胞をトリプシン処理し、洗浄し、ウイルス希釈液に１．５×１０^５細胞／ｍｌで再懸濁させ、該懸濁細胞の１００ｍＬを９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。ついで該プレートを５％ ＣＯ_２、３７℃で７２時間インキュベートした。

【0151】

５．７２時間のインキュベーションの後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに溶解した８０％ アセトンを使用して１６～２４℃で１０～２０分間固定した。固定剤を除去し、プレートを風乾させた。

【0152】

６．ついでプレートをＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎで十分に洗浄した。検出用モノクローナル抗体１４３－Ｆ３－１ Ｂ８および３４Ｃ９をアッセイ希釈液（１％ ＢＳＡ－ＰＢＳ－０．１％ Ｔｗｅｅｎ）中で２．５μｇ／ｍＬに希釈し、該希釈抗体の５０μＬを９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。ついでプレートを、加湿チャンバー内で振とう装置（ロッカー）上で１６～２４℃で６０～７５分間インキュベートした。

【0153】

７．インキュベーション後、プレートを十分に洗浄した。

【0154】

８．ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧをアッセイ希釈液中で１：２００希釈し、９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。前記のとおりにプレートをインキュベートし、洗浄した。

【0155】

９．ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷストレプトアビジン（１：１０００の最終希釈）、Ｓａｐｐｈｉｒｅ ７００（１：１０００希釈）および５ｍＭ ＤＲＡＱ５溶液（１：１０，０００希釈）のカクテルをアッセイ希釈液中で調製し、該カクテルの５０ｍＬを９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。前記のとおりにプレートを暗所でインキュベートし、洗浄し、風乾させた。

【0156】

１０．ついでアエリウス・イメージャー（Ａｅｒｉｕｓ Ｉｍａｇｅｒ）を使用してプレートを読取った。ついでＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍにおいて４パラメーター曲線フィットを用いて血清中和力価を計算した。

【0157】

用量１投与後（第２８日）および用量２投与後（第５６日）に決定された力価を図１１に示す。中和力価は全てのｍＲＮＡワクチンに対して用量依存的に誘導されることが判明した。全てのｍＲＮＡワクチンは、評価用量には無関係に、第２用量投与後に力価の増加をもたらした。ｍＶＲＣ－１（ｖ２）およびｍＬＺＦ１１１の両方はＭＲＫ－０４およびＭＲＫ－０４ ｎｏｐｏｌｙＡ ３ｍｕｔより高い力価を誘導し、５倍低い用量で、より優れたまたは類似した血清中和力価を示した。

【0158】

競合ａｌｐｈａＬＩＳＡ（アルファライザ）
中和抗体に対するＲＳＶ Ｆタンパク質上の特定のエピトープに対する免疫応答を特徴づけした。抗原部位ＩＩは、リスクを有する乳幼児におけるＲＳＶの下気道感染の予防のために開発されたモノクローナル抗体であるパリビズマブに対する結合部位である。抗原部位φは、ＲＳＶの自然感染により誘導される、より強力な中和抗体に対する結合部位である。また、本発明者らは、融合前コンホメーションにおいては提示されないエピトープである部位Ｉを標的化する抗体（４Ｄ７）を生成させている。したがって、Ｄ２５とは対照的に、４Ｄ７競合抗体の誘導は融合後（ｐｏｓｔ－Ｆ）様タンパク質のインビボ生成を示唆している。ｍＲＮＡに基づく種々のワクチンに対する抗原部位φ、抗原部位Ｉおよび抗原部位ＩＩ応答を特徴づけるために、競合ａｌｐｈａＬＩＳＡを開発した。

【0159】

競合抗体価を測定するために、ＨｉＢｌｏｃｋバッファー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）中で系列希釈された１０μｌのサンプルを３８４ウェルａｌｐｈａＬＩＳＡプレート内に配置する。希釈サンプルを、融合前安定化ＲＳＶ Ｆタンパク質（ＤＳ－Ｃａｖ１）または融合後ＲＳＶ Ｆタンパク質（ＲＳＶ Ｆ ｗｔ）に予め結合された５μｌのＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズ（１００μｇ／ｍｌ）と混合する。室温で３０分間のインキュベーションの後、１０μｌのビオチン化Ｄ２５、パリビズマブ、または、４Ｄ７抗体（Ｈｉｂｌｏｃｋバッファー中で希釈されたもの）を各ウェルに加える。更に３０分間のインキュベーションの後、ＨｉＢｌｏｃｋバッファー中の２５μｌのストレプトアビジンドナービーズ（２０μｇ／ｍｌ）を各ウェルに加え、暗所で３０分間インキュベートする。ついでプレートをＥｎＶｉｓｉｏｎ Ａｌｐｈａリーダー（６１５ｎｍで検出）で読取る。

【0160】

第５６日（４週ＰＤ２）に測定されたパリビズマブ、Ｄ２５および４Ｄ７の競合抗体力価を図１２に示す。ｍＶＲＣ－１（ｖ２）はより低いレベルの４Ｄ７融合後Ｆ競合抗体を誘導するが、Ｄ２５融合前力価およびパリビズマブ力価は影響を受けないことを、該競合データは示した。この異なる競合プロファイルは、ｍＶＲＣ－１（ｖ２）ｍＲＮＡがＭＲＫ－０４ ｎｏｐｏｌｙＡ ３ｍｕｔおよびｍＬＺＦ－１１１より多くの融合前安定化タンパク質を発現することと相関している。

【0161】

Ｃ．コットンラットチャレンジの結果
コットンラットの肺および鼻ホモジネートにおけるＲＳＶ力価を測定するための手順を以下に示す。肺および鼻ホモジネートを遠心分離により清澄化し、ＥＭＥＭ中で１：１０および１：１００希釈した。コンフルエントＨＥｐ－２単層にウェル当たり５０μｌを二重に感染させ、この場合、未希釈（ニート）サンプルから開始し、ついで希釈ホモジネートを２４ウェルプレートにおいて使用した。５％ ＣＯ_２インキュベーターにおける３７℃で１時間のインキュベーションの後、ウェルを０．７５％ メチルセルロース培地で覆い（オーバーレイし）、プレートを３７℃のインキュベーター内に戻した。４日間のインキュベーションの後、該オーバーレイを除去し、細胞を０．１％ クリスタルバイオレット染色液で１時間固定し、ついで洗浄し、風乾させた。プラークを計数し、ウイルス力価を組織１グラム当たりのプラーク形成単位として表した。

【0162】

ワクチン媒介性防御を評価するために、チャレンジの５日後に肺および鼻においてウイルス力価を測定した。肺においては全てのｍＲＮＡワクチンが完全な防御を達成したが、鼻においてはｍＶＲＣ－１（ｖ２）およびｍＬＺＦ１１１が防御の改善を示し、これらは、５倍低い用量で、ＭＲＫ－０４およびＭＲＫ－０４ ｎｏｐｏｌｙＡ ３ｍｕｔと比較して優れたまたは類似した効果を示した（図１３）。

【0163】

実施例６：アフリカミドリザルの免疫原性および有効性
この実施例においては、アフリカミドリザルＲＳＶチャレンジモデルにおけるｍＲＮＡ／ＬＮＰワクチンの免疫原性および有効性を試験するためのアッセイを行った。

【0164】

より詳細には、中和抗体価によりＲＳＶ陰性であることが確認された、１．６～２．６５ｋｇの範囲の体重を有する雄および雌の成体アフリカミドリザルを使用した。使用したｍＲＮＡワクチンは、脂質ナノ粒子において作製し製剤化した。この試験において評価したｍＲＮＡワクチンには、以下のものが含まれた：
ＭＲＫ－０４ ｎｏｐｏｌｙ（ノポリ）Ａ ３ｍｕｔ膜結合ＤＳ－Ｃａｖ１（安定化融合前Ｆタンパク質）、
ｍＶＲＣ－１（ｖ２）膜結合一本鎖ｓｃ９ ｍＤＳ－Ｃａｖ１，Ａ１４９Ｃ，Ｙ４５８Ｃ（安定化融合前Ｆタンパク質）、
ｍＬＺＦ－１１１膜結合一本鎖ｍＤＳ－Ｃａｖ１，Ｄ４８６Ｃ，Ｄ４８９Ｃ（安定化融合前Ｆタンパク質）。

【0165】

４頭のアフリカミドリザルの群を、５００μＬのワクチンで１つの三角筋に筋肉内に免疫化した。表１に示すように、該群に以下のワクチンを接種した。

【表2】

【0166】

実験の第０日、第２８日および第５６日に該動物を免疫化した。第０日、第１４日、第２８日、第４２日、第５６日および第７０日に、血液を各動物から採取し、血清学的アッセイに使用した。第７０日に、アフリカミドリザルを１×１０^５．５ ＰＦＵ ＲＳＶ Ａ２で鼻腔内チャレンジした。チャレンジ後第１日～第１４日に鼻咽頭スワブを集め、チャレンジ後第３日、第５日、第７日、第９日、第１２日および第１４日に肺洗浄サンプルを集めて、ウイルス複製を試験した。

【0167】

Ａ．ＲＳＶ中和アッセイ：
各動物からのサル血清を、前記のとおりに、ＲＳＶ－Ａ（Ｌｏｎｇ株）の中和に関して評価した。用量１投与後および用量２投与後に決定されたＮＴ_５０力価を図１４に示す。各用量投与後、ｍＲＮＡワクチンが投与された全ての群において、力価が増加することが認められた。第１０週（用量３投与の２週間後）にｍＲＮＡワクチンで得られたＧＭＴは、試験された用量およびｍＲＮＡに応じて、ＲＳＶ Ａ２が投与された動物より１～２桁高かった。ｍＶＲＣ－１（ｖ２）免疫化動物からの血清サンプルは最高の中和力価を示し、ＭＲＫ－０４ ｎｏｐｏｌｙＡ ３ｍｕｔと比較して５倍高い効力を示した。

【0168】

Ｂ．競合ＥＬＩＳＡ
前記のとおりにｍＲＮＡに基づく種々のワクチンに対する抗原部位φ、抗原部位Ｉおよび抗原部位ＩＩの応答を特徴づけるために、パリビズマブ、Ｄ２５および４Ｄ７に関して競合ＥＬＩＳＡ力価を決定した。

【0169】

第１０週（２週ＰＤ３）に測定されたパリビズマブ、Ｄ２５および４Ｄ７の競合抗体力価を図１５に示す。ｍＶＲＣ－１（ｖ２）はより低いレベルの４Ｄ７融合後Ｆ競合抗体を誘導するが、一方で、Ｄ２５融合前力価およびパリビズマブ力価は影響を受けないことを、該競合データは示した。この異なる競合プロファイルは、ｍＶＲＣ－１（ｖ２）ｍＲＮＡがＭＲＫ－０４ ｎｏｐｏｌｙＡ ３ｍｕｔおよびｍＬＺＦ－１１１より多くの融合前安定化タンパク質を発現することと相関している。

【0170】

Ｃ．アフリカミドリザルチャレンジの結果
前記のように、ワクチンの有効性を評価するために、ワクチン接種後第７０日にアフリカミドリザルを１×１０^５．５ ＰＦＵ ＲＳＶ Ａ２で鼻腔内チャレンジし、チャレンジ後に鼻咽頭スワブおよび肺洗浄サンプルを集めて、ウイルスの存在に関して試験した。

【0171】

アフリカミドリザル肺洗浄液サンプルにおけるＲＳＶ力価を測定するために、ウイルス力価を測定するためのウイルスプラークアッセイの手順を以下のとおりに行った。簡潔に説明すると、サンプルを希釈し、コンフルエントＨＥｐ－２細胞単層を含有する２４ウェルプレートに二重に加えた。プレートを３７℃で１時間インキュベートした。１時間のインキュベーションの後、サンプル接種物を吸引し、０．７５％ メチルセルロースを含有する１ｍｌのオーバーレイを加えた。プレートを３７℃で５日間インキュベートした。５日間のインキュベーションの後、細胞を固定し、クリスタルバイオレット／グルタルアルデヒド溶液で染色した。プラークを計数し、力価をｐｆｕ／ｍｌとして表した。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液におけるウイルス含量の分析（図１６Ａ～１６Ｃ）は、ｍＶＲＣ－１（Ｖ２）（２５μｇ）のみが肺における完全な防御をもたらし、より低い用量（５μｇ）で最良の防御をもたらすことを示した。

【0172】

アフリカミドリザル鼻咽頭スワブにおけるＲＳＶ力価を測定するために、ＲＳＶ Ａを検出するためのＲＳＶ ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイを以下のとおりに行った。

【0173】

１）装置および材料：
Ａ．装置
１．Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｍｘ３００５ＰリアルタイムＰＣＲシステムおよびＭｘＰｒｏソフトウェア
２．Ｊｏｕａｎ ＧＲ４２２遠心分離機または同等物
３．Ｊｏｕａｎプレートキャリアまたは同等物
Ｂ．試薬
１．Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ（登録商標）プローブＲｔ－ＰＣＲキット（１０００）カタログ番号２０４４４５
２．水、分子生物学等級ＤＮＡアーゼ非含有かつプロテアーゼ非含有、５プライム（Ｐｒｉｍｅ）、カタログ番号２９００１３６
３．ＴＥバッファー、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ １ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐｈ ８．０）、Ｆｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ、カタログ番号ＢＰ２４７３－１００
４．ウイルスプライマー：ＲＳＶ Ａフォワードプライマーおよびリバースプライマー、Ｓｉｇｍａ特製、ＨＰＬＣ精製。プライマーストックは分子等級の水中で１００μＭに再構成され、－２０℃で保存される。
５．ＲＳＶ二重標識プローブ、Ｓｉｇｍａ特製、ＨＰＬＣ精製。プローブストックはＴＥバッファー中で１００μＭに再構成され、遮光状態で－２０℃で保存される。
６．ＲＳＶ Ａ標準は社内で作製し、－２０℃で保存した。アッセイ用標準は、ＲＳＶ ＡのＮ遺伝子に対するプライマーペアを設計することにより作製した。ＲＳＶ Ａ標準の生成物の長さは８８５ｂｐである。ＱＩＡＧＥＮ ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲを使用して、この標準を作製した。

【0174】

【表3】

【0175】

７．Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ウイルス全核酸精製キット（製品番号ＡＳ１１５０）

【0176】

Ｃ．サプライ
１．Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ光学キャップ８×ストリップ、カタログ番号４０１４２５
２．Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｍｘ３０００Ｐ ９６ウェルプレート、スカート（ｓｋｉｒｔｅｄ）、カタログ番号４０１３３４
３．ＡＲＴフィルター付きピペットチップ

【0177】

２）ＲＴ－ＰＣＲ反応および準備
Ａ．完全マスターミックス（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）の調製
１．最終的な反応体積が５０μＬになるように以下の設定に従い完全マスターミックスを調製する。以下の表はウェル当たりの体積である。最終的なプライマー濃度は３００ｎＭであり、最終的なプローブ濃度は２００ｎＭである。

【表4】

【0178】

２．各ウェルに４５μＬの完全マスターミックスを加える。プレートをプレートカバーで覆い、アルミホイルで包んで光から保護する。

【0179】

Ｂ．検量線の作成
１．標準を－２０℃から取り出す。
２．標準を、１０倍希釈を用いて、１ｅ６コピー／５μＬ～１コピー／５μＬの最終濃度に希釈する。

【0180】

Ｃ．サンプルの調製
１．Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ウイルス全核酸精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、製品番号ＡＳ１１５０）を使用して、ＲＴ－ＰＣＲ反応のために鼻咽頭スワブおよび肺洗浄液サンプルを調製する。
２．製造業者のプロトコルに従い２００μＬのサンプルを抽出し、ＰＣＲ反応に使用される５０μＬ中に溶出する。

【0181】

Ｄ．サンプルの添加
１．適切なウェルに５μＬの抽出サンプルを加える。サンプルの添加の後、標準曲線を加える前に、サンプルウェルを注意深くキャップで覆う。
２．適切なウェルに５μＬの希釈標準を加え、キャップで覆う。
３．鋳型非含有対照（ＮＴＣ）ウェルに５μＬの分子等級の水を加える。
４．プレートをアルミホイルで包み、プレートを遠心分離機に移す。
５．プレートを１００ｒｐｍで２分間回転させて、ウェルの側面上に存在しうるサンプルまたはマスターミックスを引き落とす。
６．プレートをアルミホイルで包み、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ装置に移す。

【0182】

Ｅ．サーモサイクラー：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＭＸ ３００５Ｐ
１．プレートをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｍｘ３００５Ｐ内に配置し、熱プロファイル条件を以下のとおりに設定する。

【表5】

【0183】

２．Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｍｘ３００５ｐソフトウェアを使用して、結果を分析する。

【0184】

鼻サンプルにおいて検出された平均ＲＮＡコピー数を図１７Ａ～１７Ｃに示す。ｍＲＮＡに基づく全てのワクチンの防御効果は鼻においてはそれほど明白ではなかったが、この場合も再び、ｍＶＲＣ－１（ｖ２）は、ＭＲＫ－０４ ｎｏｐｏｌｙＡ ３ｍｕｔより５倍高い効力を示した。

【0185】

実施例６：ＲＳＶを経験したアフリカミドリザルにおける免疫原性
ＬＮＰ中で製剤化されたｍＲＮＡワクチンの免疫原性を、ＲＳＶを経験したアフリカミドリザルにおいて試験した。

【0186】

ＥＬＩＳＡおよび中和抗体価によりＲＳＶ血清陽性であることが確認された、２．８５～４．６５ｋｇの範囲の体重を有するいずれかの性別（ｎ＝４または５／群）の健常成体アフリカミドリザルを、試験のために選択した。この試験のために選択された動物の集団は以前の研究でＲＳＶに実験的に感染しており、全ての群が試験開始時に類似した群ＧＭＴを有するように、それらの試験前ＲＳＶ中和力価に基づいて試験群全体に分配した。ＲＳＶを経験した動物は、血清陽性ヒト成人において予想されうる応答を反映しうるワクチン接種に対する免疫記憶想起応答のモデルとなるが、この場合に注意すべきは、ＲＳＶ曝露後のＡＧＭにおける抗体応答が、融合後Ｆタンパク質エピトープに対してヒト免疫レパートリーより傾向していることである。

【0187】

単一ワクチン用量を、筋肉内（ＩＭ）経路で第０週に各動物に投与した。ＰＢＳのみの投与を受ける対照群も試験計画に含めた。表２に記載されているとおりにワクチンを投与した。ワクチン接種後、接種部位における何らかの変化またはワクチンに対する有害反応を示しうる活動または食習慣における他の変化に関して動物を毎日観察したが、何も認められなかった。ＲＳＶ中和抗体価、ならびに、パリビズマブ（部位ＩＩ）、Ｄ２５（部位φ）および４Ｄ７（部位Ｉ）競合抗体価の評価のために、血清サンプルを収集した。

【0188】

【表6】

【0189】

前記の方法を用いて、ベースライン及びワクチン接種の２週間後に収集された血清サンプルにおいて個々の動物のＮＴ_５０力価を測定し、結果を図１８に示す。ＲＳＶ Ｆに結合する血清抗体のレベルの増加（融合前ＲＳＶ Ｆと融合後ＲＳＶ Ｆとの両方；データ非表示）および血清中和抗体レベルの増加により示されるとおり、全てのワクチンは高免疫原性であることが判明した。ｍＶＲＣ－１（ｖ２）は中和力価における最高の上昇（最高用量で１００倍超）を誘発し、ＭＲＫ－０４ ｎｏｐｏｌｙＡ ３ｍｕｔと比較して５倍低い用量で類似した効力を示した。同様に、ｍＬＺＦ－１１１も、ＭＲＫ－０４ ｎｏｐｏｌｙＡ ３ｍｕｔと比較して増強した効力を示した。ＰＢＳ対照群においては力価の増加は観察されなかった。

【0190】

ワクチン接種動物における応答の増強の質を評価するために、パリビズマブ（部位ＩＩ）、Ｄ２５（部位φ）および４Ｄ７（部位Ｉ）競合抗体価を、ワクチン接種の２週間後に収集された血清において測定した（図１９）。前記のとおり、抗原部位ＩＩは、Ｆタンパク質の融合前と融合後との両方のコンホメーションに見られる中和エピトープであり、サイトφは融合前特異的中和エピトープであり、４Ｄ７は融合後特異的エピトープである。融合後コンホメーションに対するベースライン免疫傾向ゆえに、ＲＳＶを経験したＡＧＭは、免疫化前に、検出可能なＤ２５競合抗体価を有さない。しかし、３つのｍＲＮＡ抗原は全て、高いＤ２５競合抗体価を誘導し、このことは、ＡＧＭが、免疫化により増強されうるＲＳＶ感染後の抗原部位φ免疫応答を増強することを示している。ｍＶＲＣ－１（ｖ２）免疫化後のＤ２５競合抗体価の上昇が最も高く（４５０倍超）、この場合も再び、ＭＲＫ－０４ ｎｏｐｏｌｙＡ ３ｍｕｔの５倍低い用量で類似した効力を示した。ナイーブ動物（コットンラットおよびＡＧＭ）とは対照的に、ｍＶＲＣ－１（ｖ２）群におけるＲＳＶを経験したＡＧＭでは、４Ｄ７／融合後Ｆ特異的抗体の高い上昇が観察され、このことは、ベースライン抗体プールが免疫化後のエピトープ特異的抗体プロファイルの結果を決定しうることを示している。ヒトにおける自然ＲＳＶ感染からのＢ細胞記憶プールは、融合前コンホメーションに強く傾向していると考えられるため、本発明者らは、ヒトにおけるｍＶＲＣ－１（ｖ２）免疫化が、より強力な中和活性を有することが知られているこれらのエピトープに対する抗体を優先的に上昇させて、ＭＲＫ－０４ ｎｏｐｏｌｙＡ ３ｍｕｔと比較して増強した効力をもたらすと推測している。

【0191】

【表7】

【0192】

当業者は、本明細書に記載されている開示の特定の実施形態の多数の均等物を認識し、または単なる通常の実験を用いて確認することが可能であろう。そのような均等物は以下の特許請求の範囲に含まれると意図される。

【0193】

本明細書に開示されている特許文献を含む全ての参考文献の全体を参照により本明細書に組み入れることとする。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図17A】

【図17B】

【図17C】

【図18】

【図19】

【配列表】

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