特許 7541508 操作された標的特異的な塩基エディター

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-08-20

(45)【発行日】2024-08-28

(54)【発明の名称】操作された標的特異的な塩基エディター

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20240821BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240821BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20240821BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240821BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 100

C12N5/10

C12N15/11 Z ZNA

C12N15/63 Z

C12N15/09 110

【請求項の数】 17

(21)【出願番号】P 2021510000

(86)(22)【出願日】2019-08-20

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-12-27

(86)【国際出願番号】 US2019047172

(87)【国際公開番号】W WO2020041249

(87)【国際公開日】2020-02-27

【審査請求日】2022-08-19

(31)【優先権主張番号】62/721,903

(32)【優先日】2018-08-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/753,696

(32)【優先日】2018-10-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/817,153

(32)【優先日】2019-03-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/867,565

(32)【優先日】2019-06-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】508241200

【氏名又は名称】サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(72)【発明者】

【氏名】フリードリック・ファウザー

(72)【発明者】

【氏名】ジェフリー・シー・ミラー

(72)【発明者】

【氏名】エドワード・リバー

【審査官】山▲崎▼ 真奈

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１８／１１９２４３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１７／２０９８０９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１８／２１８２０６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１６／０１７７２７８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１８／２１８１６６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１０／００４７８０５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１８／１１９３５９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１８／１１９３５４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１７／０７０６３３（ＷＯ，Ａ２）

【文献】国際公開第２０１５／１３３５５４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１８／０３９４３８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１７／０９０７６１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１７／０１９８２６８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２００９／００６８１６４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特表２００９－５３２０５３（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＤＮＡ中のアデニンまたはシトシン塩基を編集するためのシステムを発現するための１つまたは複数の発現ベクターであって、該システムが、
アデノシンまたはシチジンデアミナーゼの第１の不活性なドメインおよび第１のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ＤＮＡ結合ドメインを含む第１の融合タンパク質、
デアミナーゼの第２の不活性なドメイン、第２のＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメイン、および触媒的に活性または不活性なニッカーゼドメインを含む第２の融合タンパク質、および
触媒的に活性または不活性なニッカーゼドメインおよび第３のＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインを含む第３の融合タンパク質
を含み、
デアミナーゼの第１および第２の不活性なドメインは、二量体化して活性なデアミナーゼを形成し、かつ
第２および第３の融合タンパク質は、触媒的に活性および不活性なニッカーゼドメインの二量体化を介して活性なニッカーゼを形成する、１つまたは複数の発現ベクター。

【請求項2】

第２の融合タンパク質が、触媒的に活性なニッカーゼドメインを含み、かつ
第３の融合タンパク質が、触媒的に不活性なニッカーゼドメインを含む、
請求項１に記載の１つまたは複数の発現ベクター。

【請求項3】

システムが、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）をさらに含む、請求項１に記載の１つまたは複数の発現ベクター。

【請求項4】

ＵＧＩが、融合タンパク質のＮまたはＣ末端にある、請求項３に記載の１つまたは複数の発現ベクター。

【請求項5】

発現ベクターが、ウイルスベクター、プラスミドベクター、またはｍＲＮＡベクターである、請求項１～４のいずれか一項に記載の１つまたは複数の発現ベクター。

【請求項6】

発現ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項５に記載の１つまたは複数の発現ベクター。

【請求項7】

ＤＮＡ中の塩基を編集する際の使用のためのキットであって、請求項１～６のいずれか一項に記載の１つまたは複数の発現ベクターを含む、キット。

【請求項8】

請求項７に記載のキットであって、１つまたは複数の発現ベクターが、１つまたは複数のプラスミド、ウイルス、またはｍＲＮＡベクターである、キット。

【請求項9】

請求項１～６のいずれかに記載の１つまたは複数の発現ベクターを含む細胞。

【請求項10】

細胞におけるＤＮＡ中の塩基を編集する際の使用のための、請求項１～６のいずれか一項に記載の１つまたは複数の発現ベクター。

【請求項11】

編集が、
（ｉ）シトシン塩基をウラシル塩基に編集することであって、ウラシル塩基は、ＤＮＡ複製中にチミン塩基で置き換えられてもよい、編集すること；または
（ｉｉ）アデニン塩基をヒポキサンチン塩基に編集することであって、ヒポキサンチン塩基は、複製中にグアニン塩基で置き換えられてもよい、編集すること
を含む、請求項１０に記載の使用のための１つまたは複数の発現ベクター。

【請求項12】

細胞における編集が、
（ｉ）Ｃ：Ｇ塩基対を、Ｔ：Ａ塩基対に変更すること；
（ｉｉ）Ａ：Ｔ塩基対を、Ｇ：Ｃ塩基対に変更すること；
（ｉｉｉ）停止コドンの導入；および／または
（ｉｖ）スプライシング配列を編集する、もしくは作り出すこと
をもたらす、請求項１０または１１に記載の使用のための１つまたは複数の発現ベクター。

【請求項13】

編集が、疾患突然変異を修正する、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の使用のための１つまたは複数の発現ベクター。

【請求項14】

エクソンが編集される、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の使用のための１つまたは複数の発現ベクター。

【請求項15】

塩基が、細胞における染色体または染色体外エピソーム中にある、請求項１０～１４のいずれか一項に記載の使用のための１つまたは複数の発現ベクター。

【請求項16】

細胞が、編集を必要とする細胞であるかまたは編集を必要とする対象から得られる、請求項１０～１５のいずれか一項に記載の使用のための１つまたは複数の発現ベクター。

【請求項17】

疾患を処置することを必要とする対象において疾患を処置する際の使用のための、請求項９に記載の細胞であって、細胞が対象に投与される、細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年８月２３日に出願された米国仮出願第６２／７２１，９０３号；２０１８年１０月３１日に出願された米国仮出願第６２／７５３，６９６号；２０１９年３月１２日に出願された米国仮出願第６２／８１７，１５３号；および２０１９年６月２７日に出願された米国仮出願第６２／８６７，５６５号の利益を主張し、これらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、これは、その全体が参照により組み入れられる。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１９年８月２０日に作成され、８３２５－０１８０－Ｓ１８０－ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、２２５，５０７バイトのサイズである。

【0003】

本開示は、ポリペプチドおよびゲノム工学の分野に属する。

【背景技術】

【0004】

人工ヌクレアーゼ、例えば操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＲＮＡガイドヌクレアーゼとも称される操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ ＲＮＡ（「単一ガイドＲＮＡ」）を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、および／またはアルゴノートシステムをベースとしたヌクレアーゼのような転写活性化因子は、医学、生物工学および農業の分野に革命をもたらすものである。これらの分子ツールは、生物において、これまで不可能であったレベルまでゲノムを遺伝子操作（例えば編集）することを可能にするものである。人工ヌクレアーゼは、切断の後、細胞が、エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、またはカット部位に隣接する領域との相同性を有する基質ＤＮＡの存在下における相同組換え修復（ＨＤＲ）を介した基質ＤＮＡの挿入のいずれかによって破断を「修正」させるように、ＤＮＡを切断することが可能である。これらのプロセスはどちらも、ＤＮＡにおける二本鎖破断（ＤＳＢ）から始まる。

【0005】

一部の場合において、操作されたヌクレアーゼは、場合によって、遺伝学的に編集された細胞の染色体における複数のＤＳＢの誘発に起因して起こる可能性がある不要な結果（例えば転移、転位および欠失）を引き起こす可能性がある。ヌクレアーゼ処理の後、例えば、転移、転位および欠失を含む染色体再編成のいくつかの証拠が観察されており（Kosicki, et al. (2018) Nat Biotechnol 36:765およびShin, et al. (2017) Nat Comm doi:10.1038/ncomms15646）、ごく最近、一部の細胞において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用するアポトーシスを引き起こす切断後のｐ５３経路の誘発の懸念が示されている（Ihry, et al. (2018) Nat Med 24:939-946 および Haapaniemi, et al. (2018) Nat Med 24:927-930）。またＨＤＲは、典型的に、ほとんどの真核生物において極めて非効率的でもあり、これが遺伝子修正を難しくしている（Eid, et al. (2018) Biochem J 475:1955-1964）。

【0006】

加えて、Ｃａｓ９塩基エディター、例えばＡＩＤ－ｄＣａｓ９、ＡＰＯＢＥＣ－ｄＣａｓ９（例えばＡＰＯＢＥＣ３ＧまたはＡＰＯＢＥＣ１）、ＢＥ２、ＢＥ３およびＢＥ４（例えば、Komor, et al. (2016) Nature 533:420-424; Komor, et al. (2017) Science Advances 3(8), eaao4774; Kim, et al. (2017) Nat Biotechnol 35(4):371-376を参照）は、特異性の欠如を示す可能性があり（Kim, et al. (2019) Nat Biotechnol 10.1038/s41587-019-0050-1; Zuo, et al. (2019) Science DOI:10.1126/science.aav9973を参照）、これが、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）およびエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）での治療的な適用を含む様々な目的にとってそれらを不適切にしている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

したがって、二本鎖破断を誘発させずに高い特異性を有するゲノム（塩基）の編集を達成する必要が未だある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本開示は、標的ＤＮＡ（例えば、編集されるゲノム）中に二本鎖のカットを生じさせない（例えば、単一の塩基の）編集を含む、細胞中のＤＮＡを選択的に編集する方法および組成物（例えば、塩基エディター）を提供する。このような塩基エディターは、Ｃ：ＧをＴ：Ａに変更するシトシン塩基エディター（ＣＢＥ）、またはＡ：ＴをＧ：Ｃに変更するアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）であり得る。さらに、二本鎖破断が誘発されないため、内因性標的中に遊離のＤＮＡ末端がなく、転移は起こらない。本明細書に記載される塩基エディターは、遺伝子ノックアウト（例えばシトシン塩基エディターを使用して、例えば正規のコドンを停止コドンに変更すること、および／またはシトシンまたはアデニン塩基エディターのいずれかを使用して、スプライスアクセプター部位を突然変異させること）；遺伝子の制御エレメント（例えば、プロモーター領域）に突然変異を導入すること（例えば、突然変異を活性化または抑制すること）；疾患の原因となる突然変異（例えば点突然変異）を修正すること（元に戻すこと）；および／または治療上の利益をもたらす突然変異を誘発させることに使用することができる。本明細書に記載される塩基エディターは、ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの形態での塩基編集のために提供することができる（インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）もしくはエクスビボでの使用のために細胞に、またはインビボで対象に）。他の利点の中でも、本発明の塩基エディターは、（１）結合部位の追加のＤＮＡ結合ドメイン／長さにより、特異性を増加させることができ、ＰＡＭ要件の低減により、精度または標的化密度を増加させることができ；（２）ＰＡＭの制限を拡大して（緩めて）、現状で標的化可能ではない部位の標的化を可能にし；（３）性能が不十分なＰＡＭ部位における編集効率を増加させることができ；および／または（４）ＺＦＰが固定されていない試薬で標的化可能な標的部位における効率を改善することができ、それゆえに、より低い用量を維持し、次いで、より低いオフターゲット活性ももたらす。

【0009】

したがって、少なくとも１つの機能性ドメイン（例えば、ＤＮＡ不安定化分子、例えばニッカーゼ、タンパク質および／またはヌクレオチド）および少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガータンパク質）を含む塩基編集組成物が本明細書に記載される。特定の実施形態において、塩基編集組成物は、ＤＮＡ中のアデニン（Ａ）またはシチジン（Ｃ）塩基を編集し、ここで組成物は、（１）少なくとも１つのジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ＤＮＡ結合ドメイン；（２）少なくとも１つのＤＮＡ不安定化分子；および（３）少なくとも１つのアデニンまたはシトシンデアミナーゼを含み、ここで組成物は、ＤＮＡ中に二本鎖のカットを作製しない。

【0010】

本明細書に記載される組成物において、あらゆるＤＮＡ不安定化分子を、あらゆる組合せで使用することができ、ＤＮＡ不安定化分子としては、これらに限定されないが、Ｃａｓ９ニッカーゼ、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）に作動可能に連結したＣａｓ９タンパク質（例えば、ｄＣａｓ）、あらゆるＲＮＡプログラム可能システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼニッカーゼ（ＺＦＮニッカーゼ）、ＴＡＬＥＮニッカーゼ、表Ａに示されるものなどの１つまたは複数のタンパク質、および／または１つまたは複数の（ｏｎｅ ｍｏｒｅ）ヌクレオチド（例えば、１つまたは複数のペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）および／または架橋された核酸（ＢＮＡ））が挙げられる。特定の実施形態において、塩基編集組成物は、１つより多くのＤＮＡ不安定化分子、例えば１つまたは複数のタンパク質（例えば、表Ａ、ニッカーゼなど）および／または１つまたは複数のヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、組成物は、ＺＦＮニッカーゼ、ならびに１つまたは複数の追加のタンパク質および／またはヌクレオチドであるＤＮＡ不安定化分子（例えば、表Ａの１つまたは複数のタンパク質、および／または本明細書に記載される１つまたは複数のヌクレオチド）を含む。特定の態様において、塩基編集組成物は、Ｃａｓ９タンパク質を含まないが、他のＣａｓタンパク質（例えば非Ｃａｓ９ ＲＮＡプログラム可能システム）を含んでいてもよい。特定の実施形態において、ＤＮＡ不安定化分子は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）ニッカーゼを含む。

【0011】

塩基編集組成物の少なくとも１つのジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ＤＮＡ結合ドメインは、塩基編集組成物の他の成分の１つまたは複数に、例えば、ＤＮＡ不安定化分子の１つまたは複数に（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ、ｄＣａｓ９などに）、および／または少なくとも１つのアデニンまたはシトシンデアミナーゼに、作動可能に連結されていてもよい。特定の実施形態において、少なくとも１つのＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインは、アデニンまたはシトシンデアミナーゼに作動可能に連結されている。他の実施形態において、塩基編集組成物は、第１および第２のＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインを含み、第１のＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ９ニッカーゼに作動可能に連結されている。ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインは、３、４、５、６個またはそれより多くのフィンガーを含んでいてもよく、編集しようとする標的化された塩基のどちらかの側（５’または３’）で標的部位に結合していてもよい。特定の実施形態において、ＺＦＰは、標的化された塩基のどちらかの側の１から１００（またはそれらの間のあらゆる数の）ヌクレオチドである標的部位に結合する。他の実施形態において、ＺＦＰは、標的化された塩基のどちらかの側の１から５０（またはそれらの間のあらゆる数の）ヌクレオチドである標的部位に結合する。

【0012】

野生型および／または進化したドメインを含むあらゆるアデニンまたはシトシンデアミナーゼを、本明細書に記載される組成物において使用することができる。特定の実施形態において、アデニンまたはシトシンデアミナーゼは、二量体化して活性なアデニンまたはシトシンデアミナーゼを形成する第１および第２の不活性ドメインで構成されている。特定の実施形態において、アデニンまたはシトシンデアミナーゼの第１の不活性ドメインは、Ｃａｓ９ニッカーゼに作動可能に連結されており、アデニンまたはシトシンデアミナーゼの第２の不活性ドメインは、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインに作動可能に連結されている。よりさらなる実施形態において、アデニンまたはシトシンデアミナーゼおよびＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインはどちらも、Ｃａｓ９ニッカーゼに作動可能に連結されている。他の実施形態において、塩基エディターは、第１および第２のＺＦＰ ＤＮＡ－ドメインを含み、第１のＺＦＰは、Ｃａｓ９ニッカーゼに作動可能に連結されており、第２のＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインは、アデニンまたはシトシンデアミナーゼに作動可能に連結されている。

【0013】

本明細書に記載される１つまたは複数の塩基編集組成物をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドも提供される。ポリヌクレオチドは、ウイルス（例えば、ＡＡＶ、Ａｄなど）および／または非ウイルス（例えば、プラスミド、ｍＲＮＡなど）ベクターで運搬され得る。さらに、本明細書に記載される１つもしくは複数の組成物および／または１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む細胞または細胞の集団、ならびにこのような細胞の後代であって、細胞は、編集された塩基を含む、細胞または細胞の集団も提供される。

【0014】

また、本明細書に記載される組成物および／またはポリヌクレオチドの１つまたは複数を使用して、標的ＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ二本鎖内因性遺伝子または染色体外（エピソーム）の配列）における塩基を編集する方法も提供される。特定の実施形態において、本方法は、（ｉ）シチジン塩基（「Ｃ」）を、ウラシル塩基（「Ｕ」）に編集することであって、Ｕは、ＤＮＡ複製中にチミジン塩基（「Ｔ」）で置き換えられてもよい、編集すること；（ｉｉ）アデニン塩基（「Ａ」）を、イノシン（「Ｉ」）に編集することであって、Ｉは、複製中にグアニン塩基（「Ｇ」）で置き換えられてもよい、編集すること；および／または（ｉｉｉ）ＣＡもしくはＡＣジヌクレオチドを、ＵＩもしくはＩＵに編集することを含む。他の実施形態において、細胞における編集は、（ｉ）Ｃ：Ｇ塩基対を、Ｔ：Ａ塩基対に変更すること；（ｉｉ）Ｃ：Ｇ塩基対を、Ｇ：Ｃ塩基対に変更すること；（ｉｉｉ）Ａ：Ｔ塩基対を、Ｇ：Ｃ塩基対に変更すること；（ｉｖ）停止コドンの導入；および／または（ｖ）スプライシング配列を編集する、もしくは作り出すことをもたらす。本方法は、あらゆる疾患突然変異（例えば、点突然変異）を修正する、例えばエクソンまたはイントロンにおいて修正するのに使用することができる。細胞または対象における染色体または染色体外エピソーム中のＤＮＡが編集される。本方法は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで実行され得る。

【0015】

一態様において、ＤＮＡ編集組成物（例えば、塩基編集組成物、本明細書では塩基編集複合体とも言及される）を含む組成物およびシステムが本明細書に記載される。ＤＮＡ編集複合体は、少なくとも１つの機能性ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含む。特定の実施形態において、ＤＮＡ編集組成物複合体は、ＤＮＡ結合ドメインに加えて、少なくとも１つのＤＮＡ不安定化分子、例えば二本鎖ＤＮＡ中に一本鎖のカットを生じさせるニッカーゼドメイン（例えば、ＤＮＡ－ニッカーゼ）を含む融合分子を含む。他の実施形態において、ＤＮＡ編集組成物（複合体）は、複数の（２つまたはそれより多くの）融合分子を含み、例えば、第１のＤＮＡ結合ドメインおよびニッカーゼドメインを有する、ニッカーゼを含む第１の触媒的に活性な融合分子、ならびに第２のＤＮＡ結合ドメインおよび適宜１つまたは複数の追加の融合分子を含む第２の触媒的に不活性な融合分子を含み、それぞれ、本明細書に記載される追加のＤＮＡ結合ドメインおよび１つまたは複数の機能性ドメインを含む。特定の実施形態において、塩基エディターは、図１Ａ～１Ｄのいずれかで示される組成物を含む。特定の実施形態において、第１および第２（および適宜追加のＤＮＡ結合ドメイン）の結合は、例えば、触媒的に活性な、および触媒的に不活性な融合分子が二量体化するとき、塩基の編集をもたらす。一部の実施形態において、適宜の追加のＤＮＡ結合ドメインは、二本鎖ＤＮＡに結合し、一方で他の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、一本鎖ＤＮＡに結合する。一部の実施形態において、ＤＮＡニッカーゼは、ＺＦＮニッカーゼ、ＴＡＬＥＮニッカーゼまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼであり、これらにおいて、少なくとも１つの機能性（ニッカーゼ）ドメインは、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムとの使用のためのｓｇＲＮＡ）に作動可能に連結されている。一部の実施形態において、ＤＮＡニッカーゼ（例えば、融合分子）は、ニッカーゼドメインとＤＮＡ結合ドメインとの間にリンカー配列を含む。ニッカーゼドメインは、融合分子のＮまたはＣ末端側（ＤＮＡ結合ドメインに対してＮおよび／またはＣ末端）を含む、ＤＮＡ結合ドメインのどちらの側に配置されていてもよい。一部の実施形態において、リンカーは、大きいリンカーライブラリー（＞１０ｅ８個のメンバー）からの細菌の選択システムにより選択される。一部の実施形態において、リンカーは、４から２２アミノ酸残基の範囲である。一部の実施形態において、リンカーは、ＤＮＡ結合ドメインに対する機能性ドメイン（例えばニッカーゼドメイン）の特異的な配置（例えば、ニッカーゼドメインを、ＤＮＡ結合ドメインのＮまたはＣ末端側に連結すること）を可能にする。一部の例において、リンカーは、Paschon, et al. (2019) Nat Commun. 10 :1133に開示された方法を使用して選択される。塩基エディター（またはその成分）をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド（例えば、コンストラクト）も提供される。

【0016】

本明細書に記載されるＤＮＡ編集複合体は、これらに限定されないが、１つまたは複数のアデニンデアミナーゼドメイン、１つまたは複数のシチジンデアミナーゼ、および／または１つまたは複数のウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤などの、１つまたは複数の機能性ドメインを含む。１つまたは複数の機能性ドメインは、本明細書に記載されるＤＮＡ編集複合体の触媒的に活性な、および／または触媒的に不活性な融合分子中に含まれていてもよい。一部の実施形態において、シチジンデアミナーゼは、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集複合体１（ＡＰＯＢＥＣ１）ドメインである。一部の実施形態において、シチジンデアミナーゼは、活性化誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ）である。一部の実施形態において、デアミナーゼは、アデニンデアミナーゼである。一部の実施形態において、アデニンデアミナーゼは、野生型または突然変異した（進化した）ＴａｄＡ（ｔＲＮＡアデニンデアミナーゼ（Gaudelli, et al. (2017) Nature 551 :464-471を参照）である。一部の実施形態において、アデニンデアミナーゼは、ＡＢＥ７．８、ＡＢＥ７．９またはＡＢＥ７．１０（Gaudelli、同書中）またはＡＢＥｍａｘ（Koblan, et al. (2018) Nat Biotechnol. 36(9) :843-846）である。一部の実施形態において、デアミナーゼ（アデニンまたはシチジン）機能性ドメインは、作動可能に連結したジンクフィンガーを含む２つのポリペプチド（例えば、スプリット酵素（ｓｐｌｉｔ ｅｎｚｙｍｅ））からアセンブルされるか、またはスプリット酵素の１つの部分に作動可能に連結した１つまたは複数のＺＦＰ、およびスプリット酵素の他方の成分に作動可能に連結したＣａｓ９ニッカーゼからアセンブルされる（例えば、図１Ｂを参照）。一部の実施形態において、デアミナーゼのアセンブリーは、ポリペプチドがアセンブリー可能になる配置になるように、作動可能に連結したジンクフィンガーをＤＮＡ標的に結合させることによって駆動される。一部の実施形態において、塩基エディターは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）をさらに含む。

【0017】

一態様において、塩基エディターは、ＣＲＩＳＰＲシステム、例えばＣａｓ９（例えば、天然に存在するおよび／または操作されたＣａｓ９）タンパク質（例えば、ニッカーゼ）または非Ｃａｓ９タンパク質由来の、ＤＮＡ巻き戻し（ＤＮＡ不安定化とも称される）システムを含む。特定の実施形態において、塩基エディターは、は、ＺＦＰが、Ｃａｓ９タンパク質（例えば、野生型または操作されたニッカーゼ）のあらゆる成分にあらゆる方向で作動可能に連結されていてもよいジンクフィンガータンパク質ＤＮＡ結合ドメインをさらに含むＣａｓ９塩基エディターであり、例えば、Ｃａｓ９タンパク質に作動可能に連結したＺＦＰ（ＺＦＰアンカー）、Ｃａｓ９ニッカーゼのｓｇＲＮＡまたはデアミナーゼ（ｄｅａｍｉｍａｓｅ）を含む塩基エディター（野生型または操作された（進化した）ＡＢＥまたはＣＢＥ）である。特定の実施形態において、ＺＦＰは、塩基エディターのＣａｓ９ドメインに作動可能に連結されている。特定の実施形態において、塩基エディターは、図３のＣａｓ９塩基エディターに示される成分を含む。

【0018】

別の態様において、塩基エディターは、Ｃａｓ９タンパク質由来のＤＮＡ巻き戻し（ＤＮＡ不安定化）エレメントを含まない（「Ｃａｓ９非含有」とも称される）。特定の実施形態において、本発明のＣａｓ９非含有塩基エディターは、ＺＦＰ－デアミナーゼ融合タンパク質およびＺＦＮニッカーゼを含み、さらに、１つまたは複数のＤＮＡ不安定化因子を含んでいてもよい。特定の実施形態において、ＤＮＡ不安定化因子は、タンパク質（例えば、表Ａで示されるような）またはオリゴヌクレオチド（例えば、１つまたは複数のＰＮＡ、ＬＮＡおよび／またはＢＮＡ）である。１つまたは複数の非Ｃａｓ９ ＤＮＡ不安定化（巻き戻し）因子（例えば、表Ａのタンパク質、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＢＮＡなど）は、塩基エディターのあらゆる成分に作動可能に連結されていてもよく、例えば、ＺＦＰ－デアミナーゼ融合タンパク質のいずれかの成分および／またはＺＦＮニッカーゼの成分のいずれかに作動可能に連結されていてもよい。一部の実施形態において、塩基エディターは、１つまたは複数のタンパク質および１つまたは複数のヌクレオチドＤＮＡ不安定化（巻き戻し）因子を含む。よりさらなる実施形態において、本明細書に記載されるＣａｓ９非含有塩基エディターは、ＣＲＩＳＰＲシステム由来の１つまたは複数のタンパク質を含み、このようなタンパク質は、Ｃａｓ９ではないが、ＤＮＡ不安定化（巻き戻し）特性を有する。

【0019】

特定の実施形態において、塩基エディターは、１つまたは複数のヌクレオチド配列、例えば、１つまたは複数のＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）および／または架橋された核酸（ＢＮＡ）を含み、これらは、標的部位に塩基エディターのための一本鎖ＤＮＡ基質を提供するのに使用することができる。これは、例えば二重鎖侵入、三重鎖侵入またはテールクランプによって促進することができる（Quijano, et al. (2017) Yale J. Biol and Med. 90:583-598; Pellestor and Paulasova (2004) European J. Human Genetics 12:694-700; Schleifman, et al. (2011) Chem & Bio. 18:1189-1198）。塩基エディターの１つまたは複数のヌクレオチド配列の構造は、標的配列の組成に応じて、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡおよび／またはＬＮＡおよび／またはＬＮＡおよび／またはＢＮＡ塩基の長さ、数および配置；ホスホロチオエート結合；これらのオリゴヌクレオチドの他の一般的な修飾において様々であると予想される。

【0020】

特定の実施形態において、塩基エディターは、１つまたは複数のＰＮＡ、例えば、結合の強化、溶解性の増加およびデリバリーの改善のためのミニＰＥＧ置換およびガンマ位を含有するガンマＰＮＡを含む（Bahal, et al. (2014) Current Gene Ther. 14(5):331-342）。特定の実施形態において、ＰＮＡは、８－アミノ－２，６－ジオキサオクタン酸リンカーを示す１つまたは複数のＯ、および／または１つまたは複数のシトシン（Ｃ）もしくはプソイドイソシトシン残基を含む。１つまたは複数のリシン（Ｌｙｓ）残基は、ＰＮＡ中に含まれていてもよく、例えば、ＰＮＡ配列のＮおよび／またはＣ末端に含まれていてもよい。特定の実施形態において、１、２、３、４、５個またはそれより多くのＬｙｓ残基が、ＰＮＡの一方または両方の末端に含まれる。特定の実施形態において、２つまたはそれより多くのＰＮＡが、塩基エディター中で、例えば互いに同じまたは逆の方向で使用される。特定の実施形態において、ＰＮＡは、図８Ｂから８Ｅで示されるような１つまたは複数のＰＮＡ、例えば、これらに限定されないが、構造：Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＯＯＯ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｃ；Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＯＯＯ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｃ；Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＯＯＯ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｃ；Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＯＯＯ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｃ；および／またはＮ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｃなどの１つまたは複数のＰＮＡを含み、式中、Ｏは、８－アミノ－２，６－ジオキサオクタン酸リンカーを示し、Ｃは、シトシンを示す。ＰＮＡ配列のＮおよび／またはＣ末端におけるＬｙｓ残基は適宜であり、シトシンが、プソイドイソシトシンで置換されていてもよい。

【0021】

他の実施形態において、塩基エディターは、１つまたは複数のＬＮＡを含む。ＬＮＡは、性能の改善のために、スタッキングリンカー（ｓｔａｃｋｉｎｇ ｌｉｎｋｅｒ）および２’－グリシルアミノ－ＬＮＡを含んでいてもよい（Geny, et al. (2016) Nucleic Acids Res. 44(5):2007-2019）。特定の実施形態において、ＬＮＡは、１つまたは複数のホスホロチオエート結合を含み、これらは１つまたは複数のＬＮＡ残基および／またはＤＮＡ残基の間に含まれていてもよい。他の実施形態において、ＬＮＡは、１つまたは複数のコレステロール－ＴＥＧを含み、これは、細胞への取り込みを増加させることができる。特定の実施形態において、塩基エディターは、図８Ｆまたは８Ｇで示されるように、１つまたは複数のＬＮＡを含み、例えば、これらに限定されないが、５’－ＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｔｃｔｃｔｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎｎＮｎｎＮｎｎＮｎｎＮｎ－３’（配列番号１）；５’－Ｎ＊ｎ＊ＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｔｃｔｃｔｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎｎＮｎｎＮｎｎＮｎｎ＊Ｎ＊ｎ－３’（配列番号６９）；および／または５’－ＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｔｃｔｃｔｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎｎＮｎｎＮｎｎＮｎｎＮｎ－Ｃｈｏｌ－ＴＥＧ－３’（配列番号７０）構造を有する１つまたは複数のＬＮＡを含み、式中、ＬＮＡヌクレオチドは、大文字で示され；ＤＮＡヌクレオチドは、小文字で示され；「＊」は、ホスホロチオエート結合を示し；Ｃｈｏｌ－ＴＥＧは、細胞への取り込みの増加のための３’コレステロール－ＴＥＧを示す。

【0022】

本明細書に記載される塩基編集組成物の成分は、あらゆる組合せで含まれていてもよく（１つまたは複数のニッカーゼドメイン、１つまたは複数のＤＮＡ結合ドメイン、１つまたは複数の機能性ドメインなど）、これらの成分は、互いにあらゆる順番で配置されていてもよい。一部の実施形態において、ＵＧＩ、シチジンおよび／またはアデニンデアミナーゼは、触媒的に不活性な融合分子のＤＮＡ結合ドメインのＮ末端であるか、および／またはＤＮＡ編集複合体の触媒的に活性な融合分子のニッカーゼドメインに対するＮ末端である。一部の実施形態において、シチジンおよび／またはアデニンデアミナーゼおよび／またはＵＧＩは、触媒的に不活性な融合分子のＤＮＡ結合ドメインのＣ末端であるか、および／または触媒的に活性な融合分子のニッカーゼドメインに対するＣ末端である。一部の実施形態において、１つまたは複数のＵＧＩ、シチジンおよび／またはアデニンデアミナーゼは、ＤＮＡ結合ドメインとニッカーゼドメイン（触媒的に活性なドメイン中の）との間に配置される。一部の実施形態において、融合分子は、シチジンデアミナーゼおよびアデニンデアミナーゼドメインまたはＵＧＩを含み、ＵＧＩ、シチジンおよびアデニンデアミナーゼは、互いにＤＮＡ結合ドメインに対して、および／またはニッカーゼドメインに対して、あらゆる方式で配置される（例えば、両方とも、あらゆる順番で触媒的に不活性な融合分子のＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端に、両方とも、あらゆる順番で触媒的に不活性な融合分子のＤＮＡ結合ドメインに対してＣ末端に、一方が、触媒的に不活性な融合分子のＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端に、一方が、触媒的に不活性な融合分子のＤＮＡ結合ドメインに対してＣ末端に、触媒的に活性な融合分子のニッカーゼドメインおよび／またはＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端に、触媒的に活性な融合分子のニッカーゼドメインおよび／またはＤＮＡ結合ドメインに対してＣ末端に、一方が、触媒的に活性な融合分子のニッカーゼドメインおよび／またはＤＮＡ結合ドメインに対してＣ末端に、一方が、触媒的に活性な融合分子のニッカーゼドメインおよび／またはＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端に、触媒的に活性な融合分子のニッカーゼドメインとＤＮＡ結合ドメインとの間に、など）。塩基編集組成物の１つまたは複数の融合分子の立体配置の非限定的な例は、添付の図面および実施例に示される。一部の実施形態において、ＵＧＩ、シチジンおよび／またはアデニンデアミナーゼドメインは、当業界において公知のリンカーを使用して、ＤＮＡ編集複合体の他のメンバーに連結されている。塩基エディターまたはその成分をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドも提供される。

【0023】

よりさらなる態様において、ＤＮＡ編集複合体は、少なくとも１つのウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（例えばＵＧＩ）ドメインを含む１つまたは複数の機能性ドメインを含む。ＵＧＩドメインは、ＤＮＡ編集複合体が機能できるようなあらゆる方式でＤＮＡ編集複合体に取り込まれる。一部の実施形態において、塩基編集複合体は、バクテリオファージＧａｍタンパク質を含む。一部の実施形態において、塩基編集複合体は、デアミナーゼ、ニッカーゼ、ＵＧＩおよび／またはＧＡＭタンパク質を含む。一部の実施形態において、塩基編集複合体の成分は、１、２つまたはそれより多くの融合タンパク質をコードする１、２つまたはそれより多くの遺伝子発現コンストラクト中に提供される。一部の実施形態において、１つまたは複数のウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤ドメインは、上述される、および当業界において公知のリンカーを使用して、複合体の他のメンバーに連結されている。一部の実施形態において、リンカーは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤を、複合体の他のメンバーに連結するのに使用され、リンカーは、Paschon, et al. (2019) Nat Commun. 10 :1133に開示された方法を使用して同定される。

【0024】

一部の実施形態において、ＤＮＡ編集（塩基編集）複合体は、二本鎖ＤＮＡヘリックスを開くことにおいて補助となる分子をさらに含む。一部の実施形態において、このような分子は、酵素を含む。一部の実施形態において、酵素は、ヘリカーゼ（例えば、ＲｅｃＱヘリカーゼ（ＷＲＮ、ＢＬＭ、ＲｅｃＱＬ４およびＲｅｃＱ５（Mo, et al. (2018) Cancer Lett. 413:1-10), DNA2 (Jia, et al. (2017) DNA Repair (Amst). 59:9-19を参照）、および他のあらゆる真核生物ヘリカーゼ、例えば、ＦＡＮＣＪ、ＸＰＤ、ＸＰＢ、ＲＴＥＬ１、およびＰＩＦ１など（Brosh (2013) Nat Rev Canc 13(8):542-558)）である。一部の実施形態において、酵素は、細菌および／またはウイルスヘリカーゼである。例示的なウイルスヘリカーゼとしては、ミオウイルス科のウイルスによってコードされたもの（例えばｇｐ４１、Ｄｄａ、ＵｖｓＷ、遺伝子α、およびＢａｎ）；ポドウイルス科（Ｐｏｄｐｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスによってコードされたもの（例えば４Ｂ）；シホウイルス科、バキュロウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポリオーマウイルス科、パピローマウイルス科（Ｐａｌｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）およびポックスウイルス科によってコードされたもの（例えば、Ｇ４０Ｐ、ｐ１４３、ＵＬ５、ＵＬ９、ＴＡＧ、Ｅ１、ＮＰＨ－Ｉ、ＮＰＨ－ＩＩ、Ａ１８Ｒ、およびＶＥＴＦ）、または当業界において公知の他のあらゆるウイルスヘリカーゼ（例えばFrickおよびLam (2006) Curr Pharm Des 12(11):1315-1338を参照）が挙げられる。一部の実施形態において、ヘリカーゼ酵素は、細菌酵素である。例示的な細菌ヘリカーゼとしては、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＳＦ４ ＤｎａＢ様ヘリカーゼ、または細菌における大腸菌（Ｅ ｃｏｌｉ）およびＨ．ピロリ（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ）などの細菌ＲｅｃＢＣＤ複合体の一部であるＲｅｃＢおよびＲｅｃＤヘリカーゼ（Shadrick, et al. (2013) J. Biomol Screen 18(7) :761-781）が挙げられる。一部の実施形態において、単量体のヘリカーゼ活性をもたらす多量体ヘリカーゼの操作されたまたは進化した変異体が使用される（例えばBrendza, et al. (2005) PNAS 102(29):10076-70081を参照）。一部の実施形態において、分子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、ガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態において、複合体は、そのヌクレアーゼドメインにおいて触媒的に欠陥のあるＣａｓ酵素を含む。一部の実施形態において、複合体は、そのヌクレアーゼドメイン（例えばニッカーゼ）の１つにおいて触媒的に欠陥のあるＣａｓ酵素を含む。一部の実施形態において、Ｃａｓ酵素は、そのＰＡＭ認識において欠陥がある（Anders, et al. (2014) Nature 513(7519):569-573）。一部の実施形態において、Ｃａｓ酵素は、天然ＰＡＭ配列と比較して、緩い（拡大された）ＰＡＭ要件を有する（例えばNishimasu, et al. (2018) Science 361:1259-1262を参照）。特定の実施形態において、本明細書に記載されるＣａｓ塩基エディターは、ＳｐＣａｓ９のＮＧＧ ＰＡＭ配列と比較して、緩い（拡大された）ＰＡＭ要件を示す。一部の実施形態において、分子は、ヘリックスを不安定化する特性を有する。例示的なヘリックスを不安定化する分子としては、単純疱疹ウイルスＩ型由来のＩＣＰ８（Boehmer and Lehman (1993) J Virol 67(2):711-715）、Ｐｕｒアルファ（Darbinian, et al. (2001) J Cell Biochem 80(4):589-95）、およびウシ胸腺ＤＮＡヘリックス不安定化タンパク質（Kohwi-Shigematsu, et al. (1978) Proc Natl Acad Sci USA 75(10):4689-93）が挙げられる。一部の実施形態において、分子は、転写および／またはＤループ形成／安定化に関与する。このクラスの例示的な分子としては、Ｒａｄ５１、Ｒａｄ５２、ＲＰＡ１、ＲＰＡ２およびＲＰＡ３、Ｅｘｏ１、ＢＬＭ、ならびにＨＭＧＢ１およびＨＭＧＢ２が挙げられる。利用可能な他のタンパク質としては、Ｂｏｖｉｎ ＲＯＡ１および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲｅｃＡまたは大腸菌ｒａｄ５１が挙げられる。ＤＮＡヘリックス不安定化因子として作用し得る他のタンパク質ドメインとしては、Ｃａｓ９由来のＲｅｃＩおよびＲｅｃＩＩドメインまたはそれ自体ＲｅｃＩＩドメイン、ならびにＣａｓ９由来の他のあらゆるヘリックス不安定化領域が挙げられる。表Ａに、本明細書に記載される塩基エディターでの使用に好適なタンパク質ドメインの他の非限定的な例を示す。

【0025】

一部の実施形態において、分子は、核酸、例えば、これらに限定されないが、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＢＮＡなどである。一部の実施形態において、核酸は、標的化された編集部分に近い領域に対して相同性を有するＤＮＡである。一部の実施形態において、核酸は、標的化された編集部分に近い領域に対する相同性を有するＲＮＡである。一部の実施形態において、ＲＮＡは、改変されている。一部の実施形態において、融合分子は、融合分子の１つまたは複数のドメインの間にアミノ酸リンカー配列を含む。一部の実施形態において、二本鎖ＤＮＡヘリックスを開くことにおける補助に使用される分子は、上述したリンカーを使用して、ＤＮＡ編集複合体の他のメンバーに連結されている。一部の実施形態において、二本鎖ＤＮＡヘリックスを開くことにおける補助に使用される分子は、ＤＮＡ編集複合体の他のメンバーに連結されており、公知の方法を使用して同定される。

【0026】

特定の実施形態において、核酸は、ＰＮＡ、例えば、８－アミノ－２，６－ジオキサオクタン酸リンカーを示す１つまたは複数のＯ、および／または１つまたは複数のシトシン（Ｃ）もしくはプソイドイソシトシン残基を含むＰＮＡを含む。１つまたは複数のリシン（Ｌｙｓ）残基は、ＰＮＡ中に含まれていてもよく、例えば、ＰＮＡ配列のＮおよび／またはＣ末端に含まれていてもよい。特定の実施形態において、１、２、３、４、５個またはそれより多くのＬｙｓ残基が、ＰＮＡの一方または両方の末端に含まれる。特定の実施形態において、２つまたはそれより多くのＰＮＡが、塩基エディター中で、例えば互いに同じまたは逆の方向で使用される。特定の実施形態において、１つまたは複数のＰＮＡは、Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＯＯＯ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｃ；Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＯＯＯ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｃ；Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＯＯＯ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｃ；Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＯＯＯ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｃ；および／またはＮ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｃ（ＰＮＡ＃５）を含み、式中、Ｏは、８－アミノ－２，６－ジオキサオクタン酸リンカーを示し、Ｃは、シトシンを示す。ＰＮＡ配列のＮおよび／またはＣ末端におけるＬｙｓ残基は適宜であり、シトシンが、プソイドイソシトシンで置換されていてもよい。図８Ｂから８Ｅも参照されたい。

【0027】

他の実施形態において、塩基エディターは、１つまたは複数のＬＮＡを含む。ＬＮＡは、性能の改善のために、スタッキングリンカーおよび２’－グリシルアミノ－ＬＮＡを含んでいてもよい（Geny, et al. (2016) Nucleic Acids Res. 44(5):2007-2019。特定の実施形態において、ＬＮＡは、１つまたは複数のホスホロチオエート結合を含み、これらは１つまたは複数のＬＮＡ残基および／またはＤＮＡ残基の間に含まれていてもよい。他の実施形態において、ＬＮＡは、１つまたは複数のコレステロール－ＴＥＧを含み、これは、細胞への取り込みを増加させることができる。特定の実施形態において、１つまたは複数のＬＮＡは、５’－ＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｔｃｔｃｔｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎｎＮｎｎＮｎｎＮｎｎＮｎ－３’（配列番号１）；５’－Ｎ＊ｎ＊ＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｔｃｔｃｔｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎｎＮｎｎＮｎｎＮｎｎ＊Ｎ＊ｎ－３’（配列番号６９）；および／または５’－ＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｔｃｔｃｔｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎｎＮｎｎＮｎｎＮｎｎＮｎ－Ｃｈｏｌ－ＴＥＧ－３’（配列番号７０）を含み、式中、ＬＮＡヌクレオチドは、大文字で示され；ＤＮＡヌクレオチドは、小文字で示され；「＊」は、ホスホロチオエート結合を示し；「Ｃｈｏｌ－ＴＥＧ」は、細胞への取り込みの増加のための３’コレステロール－ＴＥＧを示す。図８Ｆおよび８Ｇも参照されたい。

【0028】

これらの分子は全て、本明細書に記載される塩基編集システムに取り込まれていてもよいし、編集効率を増加させる、オフターゲットの塩基編集を減少させる、塩基編集ウィンドウを調整する、または核酸塩基の標的化されるタイプを変更するように作用し得る。

【0029】

一部の実施形態において、本明細書に記載される機能性ドメインは、単一の融合分子中に含まれる。代替として、複数の機能性ドメインを含むＤＮＡ編集複合体は、あらゆる方式で別々の融合分子に分離していてもよい。一部の実施形態において、１つの融合分子は、ＤＮＡ結合ドメイン、シチジンおよび／またはアデニンデアミナーゼならびにＵＧＩを含み、一方で第２の融合分子は、ニッカーゼまたはハーフニッカーゼドメインを含む。一部の実施形態において、１つの融合分子は、デアミナーゼドメインに融合したＤＮＡ結合ドメインに融合した、触媒的に不活性な（死んでいる）ＦｏｋＩドメインを含み、第２の融合タンパク質は、ハーフＦｏｋＩニッカーゼタンパク質、ＤＮＡ結合ドメインおよびＵＧＩドメインを含む。一部の実施形態において、１つの融合タンパク質は、ＵＧＩドメインに融合したデアミナーゼドメインに融合した触媒的に不活性な（死んでいる）ＦｏｋＩドメインを含み、一方で第２の融合分子は、機能性ニッカーゼタンパク質を含む。一部の実施形態において、本明細書で開示される１つまたは複数の融合タンパク質は、機能することができる融合分子内のドメインのあらゆる順番で融合している。一部の実施形態において、ニッカーゼドメインは、Ｃａｓニッカーゼドメインであり、一部の実施形態において、ニッカーゼドメインは、ＴＡＬＥＮニッカーゼドメインである。一部の実施形態において、機能性ドメインの１つまたは複数は、上述したリンカーを使用して、複合体の１つまたは複数の他のメンバーに連結されている。一部の実施形態において、１つまたは複数の機能性ドメインは、Paschon, et al. (2019) Nat Commun. 10:1133で開示された方法を使用して同定されたリンカーを使用して、複合体の１つまたは複数の他のメンバーに連結されている。

【0030】

本明細書に記載される塩基エディターは、１つまたは複数のポリヌクレオチドによってコードされていてもよい。１つまたは複数のポリヌクレオチドは、ウイルスベクター（ＡＡＶ、Ａｄなど）、非ウイルスベクター（プラスミド、ｍＲＮＡなど）またはそれらの組合せで運搬することができる。特定の実施形態において、１つのポリヌクレオチドは、塩基エディターの全ての成分を含み、一方で他の実施形態において、塩基エディターの成分は、２つまたはそれより多くのポリヌクレオチドによって運搬される（例えば、スプリット酵素および／またはＺＦＰを運搬する別々のポリヌクレオチド）。

【0031】

別の態様において、本明細書に記載される１つまたは複数のＤＮＡ編集複合体を使用するＤＮＡ分子の編集方法（例えば、遺伝子編集方法）が本明細書に記載される。記載される方法は、ＤＮＡ分子が編集されるように、１つまたは複数のＤＮＡ編集複合体を細胞に導入する。細胞は、単離されていてもよいし、または生きている対象中にあってもよい（例えば、対象への静脈内または他の投与を介して）。一部の実施形態において、ＤＮＡ分子は、細胞中の染色体または染色体外エピソームである。一部の実施形態において、染色体または染色体外エピソームは、シチジン塩基（「Ｃ」）を含み、これは、本明細書で開示される融合タンパク質によってウラシル塩基（「Ｕ」）に脱アミノ化される。一部の実施形態において、Ｕは、ＤＮＡ複製中にチミジン塩基（「Ｔ」）で置き換えられる。一部の実施形態において、染色体または染色体外エピソームは、アデニン塩基（「Ａ」）を含み、これは、本明細書で開示される融合タンパク質によってイノシン（「Ｉ」）塩基に脱アミノ化される。一部の実施形態において、Ｉは、複製中に、グアニン塩基（「Ｇ」）で置き換えられる。一部の実施形態において、染色体または染色体外エピソームは、アデニンおよびシチジン塩基を含み、これは、ＣＡまたはＡＣジヌクレオチドが、ＵＩまたはＩＵジヌクレオチドに脱アミノ化されるように、本明細書で開示されるデアミナーゼによって脱アミノ化される（例示的なシステムについて、図１）。

【0032】

一部の実施形態において、ニッカーゼドメインは、ＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメイン由来である（米国特許第５，４３６，１５０号；８，７０３，４８９号；９，２００，２６６号；および９，６３１，１８６号を参照）。一部の実施形態において、ＦｏｋＩニッカーゼは、親ＦｏｋＩニッカーゼと比較して、１つまたは複数の突然変異を含む。本明細書に記載される突然変異としては、これらに限定されないが、切断ドメインの電荷を変更する突然変異、例えば正電荷を有する残基の正電荷を有さない残基への突然変異（例えば、ＫおよびＲ残基の突然変異（例えば、Ｓに突然変異した）；Ｎ残基への突然変異（例えば、Ｄへの）、およびＱ残基への突然変異（例えば、Ｅへの）；分子モデリングに基づいてＤＮＡ主鎖に近いと予測され、ＦｏｋＩホモログにおいて変化を示す残基への突然変異；ならびに／または他の残基における突然変異（例えば、米国特許第８，６２３，６１８号およびGuo, et al. (2010) J. Mol. Biol. 400(1):96-107）が挙げられる。ニッカーゼは、ＺＦＮニッカーゼ、ＴＡＬＥＮニッカーゼおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、例えばＣａｓニッカーゼであり得る。

【0033】

一部の実施形態において、塩基エディターは、ＦｏｋＩまたはＦｏｋＩホモログ由来である切断ドメインを含むＤＮＡ結合ドメイン（例えば、操作されたニッカーゼドメイン）を含み、配列番号５で示される野生型全長ＦｏｋＩに対して番号付けされた、アミノ酸残基４１６、４１８、４２２、４４７、４４８、４７６、４７９、４８１および／もしくは５２５、またはＦｏｋＩホモログにおける対応する残基の１つまたは複数に突然変異を含む。一部の実施形態において、ＦｏｋＩ由来の切断ハーフドメインは、アミノ酸残基４１４～４２６、４４３～４５０、４６７～４８８、５０１～５０２、および／または５２１～５３１の１つまたは複数、例えば、３８７、３９３、３９４、３９８、４００、４１６、４１８、４２２、４２７、４３４、４３９、４４１、４４２、４４４、４４６、４４８、４７２、４７３、４７６、４７８、４７９、４８０、４８１、４８７、４９５、４９７、５０６、５１６、５２３、５２５、５２７、５２９、５３４、５５９、５６９、５７０、および／または５７１の１つまたは複数などに突然変異を含む。突然変異は、対応する配置におけるＦｏｋＩに相同な天然の制限酵素に見出される残基への突然変異を含み得る。一部の実施形態において、突然変異は、置換であり、例えば、野生型残基の、あらゆる異なるアミノ酸での、例えばアラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）またはスレオニン（Ｔ）での置換である。一部の実施形態において、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインは、４１６、４１８、４２２、４７６、４４７、４７９、４８１および／または５２５の１つまたは複数における突然変異を含む（野生型、配列番号５に対して番号付けされる）。ヌクレアーゼドメインはまた、４１８位、４３２位、４４１位、４４８位、４７６位、４８１位、４８３位、４８６位、４８７位、４９０位、４９６位、４９９位、５２３位、５２７位、５３７位、５３８位および５５９位における１つまたは複数の突然変異、例えば、これらに限定されないが、ＥＬＤ、ＫＫＲ、ＥＬＥ、ＫＫＳなどを含んでいてもよい。例えば、米国特許第８，６２３，６１８号を参照されたい。一部の実施形態において、切断ドメインは、残基４１９、４２０、４２５、４４６、４４７、４７０、４７１、４７２、４７５、４７８、４８０、４９２、５００、５０２、５２１、５２３、５２６、５３０、５３６、５４０、５４５、５７３および／または５７４の１つまたは複数における突然変異を含む。特定の実施形態において、本明細書に記載される変異型切断ドメインは、ヌクレアーゼ二量体化に関与する残基への突然変異（二量体化ドメインの突然変異）、および１つまたは複数の追加の突然変異；例えば、リン酸接触残基への追加の突然変異：例えば、二量体化突然変異体（例えばＥＬＤ、ＫＫＲ、ＥＬＥ、ＫＫＳなど）と、例えばリン酸接触に参加する可能性があるアミノ酸残基における、二量体化ドメインの外側のアミノ酸配置における１、２、３、４、５、６個またはそれより多くの突然変異との組合せを含む。一部の実施形態において、４１６位、４１８位、４２２位、４４７位、４４８位、４７６位、４７９位、４８１位および／または５２５位における突然変異は、正電荷を有するアミノ酸の、電荷を有さない、または負電荷を有するアミノ酸での置き換えを含む。他の実施形態において、４４６位、４７２位および／または４７８位（および適宜、例えば二量体化または触媒ドメインにおける追加の残基）における突然変異が作製される。一部の実施形態において、突然変異は、Ｉ４７９Ｑおよび／またはＱ４８１Ａ突然変異を含む。

【0034】

一部の実施形態において、操作された切断ハーフドメインは、本明細書に記載される突然変異に加えて、二量体化ドメインにおける突然変異、例えば、アミノ酸残基４９０、５３７、５３８、４９９、４９６および４８６を含む。一部の実施形態において、本発明は、操作された切断ハーフドメインが、本明細書に記載される１つまたは複数の突然変異に加えて、４８６位における野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基がＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換えられ、４９９位における野生型Ｉｌｅ（Ｉ）残基がＬｅｕ（Ｌ）残基で置き換えられ、４９６位における野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基がＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換えられている（「ＥＬＤ」または「ＥＬＥ」）ポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。一部の実施形態において、操作されたニッカーゼハーフドメインは、野生型ＦｏｋＩまたはＦｏｋＩホモログの切断ハーフドメイン由来であり、アミノ酸残基４１６、４１８、４２２、４４７、４４８、４７６、４７９、４８１または５２５における１つまたは複数の突然変異に加えて、野生型ＦｏｋＩ（配列番号５）に対して番号付けされたアミノ酸残基４９０、５３８および５３７における突然変異を含む。一部の実施形態において、本発明は、操作されたニッカーゼハーフドメインが、本明細書に記載される１つまたは複数の突然変異に加えて、４９０位における野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換えられ、５３８位における野生型Ｉｌｅ（Ｉ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換えられ、５３７位における野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換えられている（「ＫＫＫ」または「ＫＫＲ」）ポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する（参照により本明細書に組み入れられる米国特許第８，９６２，２８１号を参照）（米国特許公開第２０１８／００８７０７２号を参照）。

【0035】

一部の実施形態において、人工ヌクレアーゼを生産する、本明細書に記載されるＤＮＡ結合ドメインおよび操作されたＦｏｋＩまたはそのホモログの切断ハーフドメインを含む融合分子が提供される。一部の実施形態において、融合分子のＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガー結合ドメイン（例えば、操作されたジンクフィンガー結合ドメイン、ＺＦＰ）である。一部の実施形態において、ジンクフィンガーの１つまたは複数は、上記のPaschon, et al.で開示された方法を使用して同定されたリンカーを使用して、一緒に連結されている。一部の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン（ＴＡＬＥ）である。一部の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡ結合分子（例えばガイドＲＮＡ）および触媒的に不活性なＣａｓまたはＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａとしても公知）タンパク質（例えばｄＣａｓ９またはｄＣｐｆ１）を含む。一部の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、触媒的に不活性なＣａｓ（ｄＣａｓ）タンパク質に融合したＺＦＰを含む。一部の実施形態において、ＺＦＰ－ｄＣａｓ融合タンパク質は、ＰＡＭの特異性を変更するための突然変異を含む。一部の実施形態において、ＺＦＰ－ｄＣａｓタンパク質は、ＤＮＡ配列に特異的に結合するのに、ＰＡＭ認識に依存しない。一部の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ｄＣａｓタンパク質に融合したＴＡＬＥを含む。一部の実施形態において、ＴＡＬＥ－ｄＣａｓ融合タンパク質は、ＰＡＭの特異性を変更するための突然変異を含む。一部の実施形態において、ＴＡＬＥ－ｄＣａｓタンパク質は、ＤＮＡ配列に特異的に結合するのに、ＰＡＭ認識に依存しない。上記実施形態のいずれかにおいて、操作されたＦｏｋＩまたはそのホモログにＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはガイドＲＮＡおよびＣａｓシステム）を連結するのに使用されるリンカーは、当業界において公知の方法を使用して同定される。例えば、Paschon, et al. (2019) Nat Commun. 10:1133を参照されたい。

【0036】

一部の実施形態において、ＤＮＡ編集複合体は、二本鎖ＤＮＡにおける特異的なＤＮＡ塩基を編集する。一部の実施形態において、編集は、細胞内のＤＮＡ分子中になされる。一部の実施形態において、ＤＮＡは、細胞中の染色体にある。一部の実施形態において、編集は、Ｃ：Ｇ塩基対からＴ：Ａ塩基対への変更をもたらす。一部の実施形態において、編集は、Ｃ：Ｇ塩基対からＧ：Ｃ塩基対への変更をもたらす。一部の実施形態において、編集は、Ａ：Ｔ塩基対からＧ：Ｃ塩基対への変更をもたらす。一部の実施形態において、編集は、エクソン中で行われる。一部の実施形態において、編集は、停止コドン（例えばＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）の導入をもたらす。一部の実施形態において、塩基の編集は、標的化された遺伝子の遺伝子発現のノックアウトをもたらす。一部の実施形態において、編集は、スプライシング配列（例えば、Ｕ２スプライス配列であって、５’コンセンサス配列は、Ｇ Ｔ Ａ／Ｇ Ａ／Ｃ／Ｔ Ｇ Ｔ／Ｇ／Ａ／Ｃ Ａ／Ｇ／Ｔ／Ｃ（Ｔ／Ｃ／Ｇ／Ａ）_３（配列番号７３）であり、３’コンセンサス配列は、（Ｔ／Ｃ）_１０Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ Ｃ／Ｔ Ａ Ｇ（配列番号７４）である、スプライス配列；およびＵ１２スプライス配列であって、５’コンセンサス配列は、Ｇ／Ａ Ｔ Ａ Ｔ Ｃ Ｔ Ｔ／Ｃであり、３’コンセンサス配列は、（Ｔ／Ｇ／Ａ／Ｇ）_２Ｔ／Ａ／Ｃ／Ｇ（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）_２Ｃ／Ｔ Ａ Ｇ／Ｃである、スプライス配列、Turunen, et al. (2013) Wiley Interdiscip Rev RNA. 4(1):61-76を参照）をコードする配列中で行われる。一部の実施形態において、新しいスプライシング配列が作り出される。一部の実施形態において、スプライシング配列は、それがスプライシング配列として機能しなくなるように変更される。一部の実施形態において、スプライシング配列の変更は、エクソンスキッピングを引き起こす。一部の実施形態において、配列は、まれなコドンが作り出されるように変更される。一部の実施形態において、塩基を編集することは、疾患に関連する遺伝子が修正されるように、ＤＮＡ配列における点突然変異の修正をもたらす。疾患の処置および／または防止のための塩基編集の非限定的な例としては、Ｖ６１７Ｆバージョンが発現されなくなるようなＪＡＫ２の編集（それによって制御不能な血液細胞生産を引き起こすこの遺伝子の活性化を低減させる）；他のがん遺伝子、例えばＢＣＲ／ＡＢＬをノックアウトまたは抑制するための塩基編集；Ａ１ＡＴの塩基編集などが挙げられる。処置され得る例示的な疾患としては、鎌状赤血球症、血友病、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、テイ－サックス病、色盲、ファブリー病、フリードライヒ運動失調症、前立腺がんなどが挙げられる。

【0037】

一部の実施形態において、本明細書で開示される塩基編集複合体は、ＲＮＡ分子に作用する。一部の実施形態において、塩基エディターは、ＲＮＡ特異的なデアミナーゼ、例えばＡＤＡＲ２（２型ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ）を利用する（Cox, et al. (2017) Science 358(6366):1019-1027を参照）。

【0038】

組成物のいずれか（塩基編集組成物および／またはこれらの組成物をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド）を含む細胞、ならびに、本明細書で開示される方法および組成物によって改変された、これらの細胞に由来する細胞も本明細書で開示される。一部の実施形態において、細胞は、細菌細胞または真核細胞である。一部の実施形態において、細胞は、塩基エディター複合体および塩基エディター複合体によって誘導されたＤＮＡまたはＲＮＡ改変を含む。改変された細胞、および改変された細胞由来のあらゆる細胞は、本開示の塩基エディター複合体を一時的に含むが、必ずしもそれを超えて含んでいなくてもよく、ただしこのような塩基エディター複合体によって媒介されたゲノム改変は維持される。

【0039】

さらに別の態様において、目的の領域における細胞クロマチンの標的化された編集のための方法；感染を処置する方法；および／または疾患を処置する方法が本明細書で開示される。これらの方法は、インビトロ、エクスビボもしくはインビボで、またはそれらの組合せで実施されてもよい。本方法は、細胞中の予め決定された目的の領域で、本明細書に記載される塩基編集複合体（例えば融合ポリペプチドおよび適宜１つまたは複数の融合ポリペプチドが本明細書で開示される操作されたニッカーゼを含むあらゆる関連する核酸）を発現させることによって、細胞クロマチンを編集することを含む。特定の実施形態において、オンターゲット部位の標的化された編集は、細胞の、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％で見出される。

【0040】

本明細書で開示される塩基編集複合体は、目的の領域における細胞クロマチンの標的化された編集のための方法において使用することができる。細胞としては、培養細胞、細胞株、生物中の細胞、細胞および／またはその後代が処置後に生物に戻されることになる場合における、処置のために生物から除去された細胞、および生物から取り出され、本発明の融合分子を使用して改変され、次いで処置方法（細胞療法）において生物に戻される細胞が挙げられる。細胞クロマチンにおける目的の領域は、例えば、ゲノム配列またはそれらの部分であってもよい。

【0041】

融合分子は、例えば、融合分子をポリペプチドとして細胞にデリバリーすることによって細胞中で発現させてもよいし、または融合分子をコードするポリヌクレオチドを細胞にデリバリーすることによって細胞中で発現させてもよく、その場合、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの場合、転写され、翻訳されて、融合分子が生成する。さらに、ポリヌクレオチドが融合分子をコードするｍＲＮＡである場合、細胞にｍＲＮＡがデリバリーされた後、ｍＲＮＡが翻訳されて、融合分子が生成する。

【0042】

本発明の他の態様において、塩基編集特異性を増加させるための方法および組成物が提供される。一部の実施形態において、オフターゲット編集活性を減少させることによって全体的なオンターゲット編集特異性を増加させるための方法が提供される。一部の実施形態において、塩基編集に関連するインデル形成を減少させるための方法が提供される。一部の実施形態において、操作された塩基編集複合体の操作されたニッカーゼ成分（ニッカーゼパートナー、例えば、触媒的に不活性なＺＦＮパートナー、およびＺＦＮニッカーゼを形成する触媒的に活性なＺＦＮパートナー）は、細胞と接触させるために使用され、この場合、複合体の各ニッカーゼパートナーは、１：１以外の他のパートナーに対する比率で示される。一部の実施形態において、２つのパートナーの比率は、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：８、１：９、１：１０もしくは１：２０の比率、またはそれらの間のあらゆる値で示される。他の実施形態において、２つのパートナーの比率は、１：３０より大きい。一部の態様において、各パートナーは、ｍＲＮＡとして細胞にデリバリーされるか、またはウイルスまたは非ウイルスベクター中でデリバリーされ、その場合、様々な量の各パートナーをコードするｍＲＮＡまたはベクターがデリバリーされる。さらなる実施形態において、ヌクレアーゼ複合体の各パートナーは、単一のウイルスまたは非ウイルスベクターに含まれていてもよいが、一方のパートナーが、他方より高い、またはより低い値で発現されるように計画的に発現され、最終的に、１：１以外の切断ハーフドメインの比率で細胞にデリバリーされる。一部の実施形態において、各切断ハーフドメインは、異なるプロモーターを使用して、異なる発現効率で発現される。一部の実施形態において、２つの切断ドメインは、ウイルスまたは非ウイルスベクターを使用して細胞にデリバリーされ、その場合、両方とも同じオープンリーディングフレームから発現されるが、２つのパートナーの比率が、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：８、１：９、１：１０もしくは１：２０の比率、またはそれらの間のあらゆる値になるように、３’パートナーがより低い割合で発現される結果をもたらす配列（例えば自己切断２Ａ配列またはＩＲＥＳ）で、２つのパートナーをコードする遺伝子が分離される。他の実施形態において、２つのパートナーは、１：１と異なるように選択された比率で配置される。

【0043】

別の態様において、本明細書に記載される１つまたは複数の塩基エディターを使用して生産された細胞の集団が本明細書に記載される。特定の実施形態において、細胞の５％～２０％（またはそれらの間のあらゆる値）より多く、好ましくは２０％より多く、さらにより好ましくは５０％より多く、より一層好ましくは８０％から１００％の間が、標的化された塩基への改変を含む（例えば、塩基が編集された細胞である）。よりさらなる実施形態において、編集された細胞は、オフターゲット編集（ゲノム中のどこかでの意図されない編集）および／またはバイスタンダー（意図される標的塩基のどちらかの側におけるごく近位における、例えば１～２０（またはそれらの間のあらゆる値の）ヌクレオチドにおける編集事象、例えば、Ｃａｓ９のプロトスペーサー領域内での編集事象）の突然変異をほとんどまたは全く示さない。本明細書に記載される塩基が編集された細胞の単離された集団は、対象におけるエクスビボでの疾患の処置のために使用でき、および／またはエクスビボでの処置として使用する前に、エクスビボでさらに操作されてもよい（例えば、本明細書に記載される塩基編集のさらなるラウンドを介して）。加えて、塩基編集は、インビボで疾患関連の突然変異を修正した後に対象において疾患または状態が処置されるように、インビボで実行してもよい。

【0044】

一部の実施形態において、ニッカーゼパートナーは、追加の活性ドメインに融合されている。一部の実施形態において、追加のドメインとしては、１つまたは複数のデアミナーゼから選択される１つまたは複数の例示的なドメイン（例えばＡ特異的またはＣ特異的）、ＵＧＩドメイン、ヘリカーゼ、およびＧＡＭドメインが挙げられる。別の態様において、本明細書に記載される塩基編集複合体、または本明細書に記載される１つもしくは複数の塩基編集複合体タンパク質をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド；補助的な試薬；ならびに適宜説明書および好適な容器を含むキットが本明細書に記載される。

【0045】

当業者であれば、これらのおよび他の態様は、総じて開示を考慮すれば容易に理解されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0046】

図１Ａ～１Ｄは、例示的なＤＮＡ編集システムおよび複合体を描写する概略図である。図１Ａは、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ｓｇＲＮＡ）を含む１つの触媒的に不活性な（「Ｘ」によって示される）融合分子、およびＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ｓｇＲＮＡ）も含む１つの触媒的に活性なニッカーゼ融合分子（はさみによって示される）を含むシステムを示す。触媒的に活性な、および不活性な融合分子は、ＤＮＡ結合ドメインがそれらそれぞれの標的部位に結合すると二量体化し、結合の後、標的ＤＮＡを編集する（例えば、塩基を編集する）。また図１Ａは、２つのＵＧＩドメインを含む複合体も示す。図１Ｂは、塩基を編集するための、さらなる例示的なＣａｓ９およびＣａｓ９非含有システムを示す。上のパネルは、いずれかのアデノシンまたはシトシンデアミナーゼドメインの成分の二量体化を介して機能する塩基エディターを示す。図１Ｂの下のパネルは、本明細書に記載されるＡＢＥおよびＣＢＥ塩基エディターの様々な実施形態を示す。図１Ｃは、ＺＦＰアンカーに連結されていてもよい、Ｃａｓ９ ＤＮＡ不安定化分子（例えば、ｓｇＲＮＡに作動可能に連結したｄＣａｓ９を含むＲＮＡプログラム可能システム）；ＺＦＰ－デアミナーゼ融合タンパク質；およびＺＦＮニッカーゼを含む、本明細書に記載される塩基エディターの別の実施形態を示す。特定の実施形態において、ＺＦＮニッカーゼは存在せず、ＤＮＡ不安定化分子は、いずれかのＲＮＡプログラム可能分子を含む。この概略図は、Ｃａｓ９ニッカーゼの、ＺＦＰ－デアミナーゼ融合タンパク質とは逆側におけるＺＦＮニッカーゼを示すが、ＺＦＮニッカーゼおよびＺＦＰ－デアミナーゼはどちらも、Ｃａｓ９ニッカーゼに対して３’または５’であり得ることは明らかであろう。図１Ｄは、さらなるＣａｓ９非含有（非Ｃａｓ９とも称される）塩基編集システムを示す。三角形は、ニッキングが起こる場所を示し、「ＰＮＡ」は、ペプチド核酸を指し、「ＬＮＡ」は、ロックド核酸を指し、「ＢＮＡ」は、架橋された核酸を指す。これらの塩基エディターにおけるヌクレオチド（例えば、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）および／または架橋された核酸（ＢＮＡ））は、標的部位に塩基エディターのための一本鎖ＤＮＡ基質を提供することができる。

【0047】

図２は、例示的なアデニン塩基エディターによって標的化されたＤＮＡを示す概略図である。この図面は、上にアライメントされた野生型ｍＲＮＡプロトスペーサーおよびＰＡＭを有するＡ１ＡＴ Ｚ突然変異に近いＤＮＡ配列を示す（配列番号７８）。プロトスペーサーの右に、数種の異なるＺＦＰのＤＮＡ標的が示される。示した通り、ＰＡＭ配列を必要とするＡＢＥの場合、塩基編集のための標的（塩基編集ウィンドウとも称される）は、典型的にはＰＡＭ配列から１３～１６ヌクレオチドであり、３、４、５、６、７個またはそれより多くのヌクレオチドのサイズであってもよい（図では、４ヌクレオチドの塩基編集ウィンドウが示される）（配列番号７７）。

【0048】

図３Ａおよび３Ｂは、例示的なＺＦＰ塩基エディターを描写する概略図である。図３Ａは、例示的なＺＦＰアデニン塩基エディターを示す。上のパネルは、示された成分を有する例示的なエディターを示す。中央のパネルは、２つの大腸菌ｔＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ｔａｄＡ）を使用する例示的なＡＢＥを示し、一方は、野生型配列であり、他方は、進化した配列である（Gaudelli, et al. (2017) Nature 551(7681):464-471)）。ＴａｄＡドメインは、示されるリンカーを使用して、互いに、さらにＳＰＣａｓ９配列に結合されている（配列番号２）。使用されるＳｐＣａｓ９は、公知の緩いＰＡＭ要件を有するＶＲＶＲＦＲＲ変異体である（Nishimasu, et al. (2018) Science 361 :1259-1262を参照）。次いでＣａｓ９配列は、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインに連結され、使用されるリンカー（配列番号３）は、２つのＮＬＳ配列および３つのＨＡタグを含んでいてもよい。Ｃａｓ９ＶＲはまた、Ｃａｓ９ＮＧとも称される。図３Ｂは、本明細書に記載される例示的なＣａｓ９およびＣａｓ９非含有塩基エディターを示す。以下の略語が使用される：「ＴａｄＡ」は、野生型アデニンデアミナーゼドメインを指し；ＴａｄＡ＊は、進化した（操作された）アデニンデアミナーゼドメインを指し；「７．８」「７．９」「７．１０」および「ＭＡＸ」は、Gaudelli, et al. (2017) Nature 551(7681):464-471) and Koblan, et al. (2018) Nat Biotechnol. 36(9):843-846に記載される進化した（操作された）アデニンデアミナーゼドメインを指し；「ＳｐＣａｓ９［ＰＡＭｓ：ＮＧＧ］」は、Jinek, et al. (2012) Science 337(6096):816-21に記載される化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９を指し；「ＳｐＸＣａｓ９－３．７［ＰＡＭｓ：ＮＧＮ，ＧＡＡ＆ＧＡＴ］」は、Hu, et al. (2018) Nature 556(7699):57-63に記載される広範なＰＡＭ適合性を有するＳｐＣａｓ９変異体を指し；「ＳｐＣａｓ９－ＮＧ［ＰＡＭｓ：ＮＧＮ；ＮＡＮインビトロ］」は、Nishimasu, et al. (2018) Science 361(6408):1259-1262に記載される緩いＰＡＭ要件を有するＳｐＣａｓ９変異体を指し；「ＳｃＣａｓ９［ＰＡＭｓ： ＴＧＴ，．．．］」は、Chatterjee, et al. (2018) Sci Adv 4(10):eaau0766. doi: 10.1126/sciadv.aau0766に記載される最小のＰＡＭの特異性を有するＳｐＣａｓ９オーソログを指し；「ＣＡＳ９なし」は、このドメインが存在しないこと（Ｃａｓ９非含有塩基エディター）を意味する；「５Ｆ ＺＦＰ」は、５本のフィンガーを有するＺＦＰを指し；「６Ｆ ＺＦＰ」は、６本のフィンガーを有するＺＦＰを指し；「＞６Ｆ ＺＦＰ」は、６本より多くのフィンガーを有するＺＦＰを指し；「ＺＦＰ ＲＱ」および「（．．．）」は、Miller, et al. (2019) Nature Biotechnology 37(8):945-952に記載される改変されたＺＦＰを指す。

【0049】

図４は、アデニン塩基エディターによって標的化するために分析される編集ウィンドウ（配列番号４）内にあるアデニン塩基を描写する概略図である。

【0050】

図５Ａ～５Ｆは、例示的なシチジン塩基エディターコンストラクトを描写する概略図である。図５Ａおよび５Ｂは、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインに連結され、さらに、ＣヌクレオチドをＵに脱アミノ化することが可能なＡＰＯＢＥＣ１（図５Ａ）またはＡＩＤ（図５Ｂ）シチジン酵素のいずれかをコードする配列に連結された、２つのＵＧＩタンパク質をコードする配列を含む塩基エディターコンストラクトを示す。図５Ｃおよび５Ｄは、図５Ａおよび５ＢのコンストラクトのＵＧＩドメインが欠如した２つのシチジン塩基エディターコンストラクトを描写する。図５Ｅおよび５Ｆは、ＦｏｋＩニッカーゼをコードする配列を利用する２つのコンストラクトを描写する。これらのコンストラクトは、シチジン塩基エディターをコードする配列がＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインに連結され、次いでこれが触媒的に不活性なＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに連結されている対として使用することができる。第２のコンストラクト（図５Ｆ）は、触媒的に活性なＦｏｋＩヌクレアーゼドメインをコードする配列に連結された、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインに連結された２つのＵＧＩドメインをコードする配列を含む。この対は、活性な塩基エディターが作製されるようにどのような形で構築されてもよく、活性な、および不活性なＦｏｋＩドメインは、２つのパートナーコンストラクトのどちらにあってもよく、ＵＧＩ配列およびシチジン塩基エディター配列は、どちらのパートナーにあってもよい。

【0051】

図６Ａおよび６Ｂは、２つの例示的なアデニン塩基エディターを描写する。図６Ａは、２つのＴａｄＡドメイン、すなわち１つの野生型ものおよび１つの進化したものをコードし、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインに連結された配列を含むコンストラクトを示す。図６Ｂで示されるように、一部のバリエーションにおいて、このコンストラクトは、触媒的に不活性なＦｏｋＩドメインをさらに含む。

【0052】

図７Ａ～７Ｃは、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ標的の塩基編集を例示する。図７Ａは、左側に、野生型ＤＮＡ二本鎖配列（配列番号３０）を示し、その上にコードされたバリン（Ｖ）を示す。中央の配列は、突然変異したＤＮＡ二本鎖配列（配列番号３１）を示し、その上に突然変異フェニルアラニン（Ｆ）を示す。右に２つの可能性のある塩基編集の結果（配列番号３２および３３）を示し、編集されたヌクレオチドを太字で示し、その上にセリン（Ｓ）またはプロリン（Ｐ）のいずれかへの変更を示す。図７Ｂは、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ突然変異を取り囲むＤＮＡ配列（配列番号３４）を示し、２つの最も近いＰＡＭ部位を示す。図７Ｂは、タンパク質配列を配列番号７９として開示する。図７Ｃは、Ｖ６１７Ｆ突然変異を有さないＫ５６２細胞における示された塩基エディターを用いた例示的な結果を示す。塩基編集ウィンドウ内の他のＡ：Ｔ対を使用して、試験された塩基エディターの活性を評価した。ＡＢＥｍａｘ－Ｃａｓ９ＮＧは、ＡＢＥｍａｘに融合したＣａｓ９ＮＧニッカーゼを示す。ＡＢＥｍａｘ－Ｃａｓ９を７つの異なるＺＦＰ（ＺＦＰ２、ＺＦＰ４、ＺＦＰ６およびＺＦＰ７が示される）で固定した。図７Ｃは、左側の３つの異なるＰＡＭ部位（ＡＡＴ、ＴＡＡ、ＡＡＡ；図７Ｂを参照）に関する結果を示す。ここで、ＡＢＥｍａｘ発現コンストラクトの両方、ならびに対応するｓｇＲＮＡは、プラスミドＤＮＡ（各６００ｎｇ）として供給された。ＺＦＰを固定したＡＢＥｍａｘ－Ｃａｓ９ＮＧコンストラクトは、全ての３つのＰＡＭ部位で増加した効率を示す（ＡＡＴおよびＡＡＡ ＰＡＭ部位の場合、およそ２倍；ＴＡＡ ＰＡＭ部位の場合、およそ１２倍）。ＡＡＴおよびＴＡＡ ＰＡＭ部位のための塩基エディターはまた、より高い用量（８００ｎｇのプラスミドＤＮＡ）でも試験したところ、類似の結果を示す。ＺＦＰ６は、ＡＡＴ ＰＡＭ部位に対しておよそ２．５倍高い活性をもたらし、ＺＦＰ２は、ＴＡＡ ＰＡＭ部位に対しておよそ１７倍高い活性をもたらす。

【0053】

図８Ａ～８Ｇは、ヌクレオチド（例えば、図１Ｄで示されるように、標的部位に塩基エディターのための一本鎖ＤＮＡ基質を提供するのに使用される、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）および／または架橋された核酸（ＢＮＡ））を含む例示的な塩基エディターを示す概略図である。図８Ａは、塩基エディターのヌクレオチドを含有する一本鎖基質と接触する前（左側）およびその後（右側）における編集しようとする標的化された塩基（「Ｘ」）を描写する。図８Ｂは、本明細書に記載される塩基エディターでの使用のための例示的なＰＮＡ（ＰＮＡ＃１）を描写し、ＰＮＡは、構造：Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＯＯＯ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｃを有する。図８Ｃは、本明細書に記載される例示的なＰＮＡ（ＰＮＡ＃２）または塩基エディターにおける使用を描写し、ＰＮＡは、構造：Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＯＯＯ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｃを有する。図８Ｄは、塩基エディターが２つのＰＮＡを含む例示的な実施形態を描写し、互いに逆方向で、ＰＮＡ＃３は、構造Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＯＯＯ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｃを有し、ＰＮＡ＃４は、構造Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＯＯＯ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｃを有する。図８Ｅは、ＰＮＡが構造Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｃ（ＰＮＡ＃５）を含む例示的な実施形態を描写する。図８Ｂ～８Ｅにおいて、Ｏは、８－アミノ－２，６－ジオキサオクタン酸リンカーを示し、Ｃは、シトシンを示す。ＰＮＡ配列のＮおよび／またはＣ末端におけるＬｙｓ残基は適宜であり、シトシンが、プソイドイソシトシンで置換されていてもよい。図８Ｆおよび８Ｇは、ＬＮＡを含む塩基エディターの例示的な実施形態を描写する。図８Ｆは、例示的なＬＮＡ（ＬＮＡ＃１）（配列番号８０）を示す。例示的なＬＮＡ＃１配列は、ＬＮＡ＃１ａ：５’－ＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｔｃｔｃｔｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎｎＮｎｎＮｎｎＮｎｎＮｎ－３’（配列番号１）；ＬＮＡ＃１ｂ：５’－Ｎ＊ｎ＊ＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｔｃｔｃｔｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎｎＮｎｎＮｎｎＮｎｎ＊Ｎ＊ｎ－３’（配列番号６９）；およびＬＮＡ＃１ｃ：５’－ＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｔｃｔｃｔｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎｎＮｎｎＮｎｎＮｎｎＮｎ－Ｃｈｏｌ－ＴＥＧ－３’（配列番号７０）を含む。図８Ｇは、塩基エディターが互いに逆方向に示される２つのＬＮＡを含む例示的な実施形態を示す（ＬＮＡ＃２：５’－ＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎｔｃｔｃｔＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎ－３’（配列番号７１）およびＬＮＡ＃３：５’－ＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎｔｃｔｃｔＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎ－３’（配列番号７２））。図８Ｆおよび８Ｇにおいて、ＬＮＡヌクレオチドは、大文字で示され；ＤＮＡヌクレオチドは、小文字で示され；「＊」は、ホスホロチオエート結合を示し；「Ｃｈｏｌ－ＴＥＧ」は、細胞への取り込みの増加のための３’コレステロール－ＴＥＧを示す。

【発明を実施するための形態】

【0054】

人工ヌクレアーゼ、例えば操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＲＮＡガイドヌクレアーゼとも称される操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ ＲＮＡ（「単一ガイドＲＮＡ」）を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、および／またはアルゴノートシステムをベースとしたヌクレアーゼのような転写活性化因子は、医学、生物工学および農業の分野に革命をもたらすものである。これらの分子ツールは、生物において、これまで不可能であったレベルまでゲノムを遺伝子操作（例えば編集）することを可能にするものである。人工ヌクレアーゼは、切断の後、細胞が、エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、またはカット部位に隣接する領域との相同性を有する基質ＤＮＡの存在下における相同組換え修復（ＨＤＲ）を介した基質ＤＮＡの挿入のいずれかによって破断を「修正」させるように、ＤＮＡを切断することが可能である。これらのプロセスはどちらも、ＤＮＡにおける二本鎖破断（ＤＳＢ）から始まる。

【0055】

遺伝学的改変のために二本鎖のカットを使用しない、塩基を編集するための組成物（システム）および方法が本明細書に記載される。塩基を編集することは、編集された塩基の修復を回避するためのＤＮＡ修復機構の操作と共に、ＤＮＡ鎖中の、ＤＮＡ塩基の部位特異的な改変に関与する特異的な塩基の同一性を変更することに本質的に頼る。これは、一般的に、一本鎖ＤＮＡが存在する領域が生じるようにＤＮＡ二重らせんを開くためのシステムを使用することによって達成される。次に、塩基それ自体は、塩基を改変する酵素、例えばデアミナーゼによって、ヌクレオシド構造を変更するような作用を受ける。例えば、活性化誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ）およびアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素触媒ポリペプチド様ファミリータンパク質（ＡＰＯＢＥＣ）は、抗体の多様化およびレトロウイルスに対する自然免疫にとって重要なシチジンデアミナーゼである。これらの酵素は、ＤＮＡにおいてシチジン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）に変換する。ウラシル修復の前にＤＮＡ複製が起こる場合、複製機構は、ウラシルをチミン（Ｔ）として処理することになり、これは、Ｃ：ＧからＴ：Ａ塩基対への変換をもたらし（Yang, et al. (2016) Nat Commun doi 10.1038/ncomms13330）、したがってこのシステムは、ＣからＴへの点突然変異を生成するのに使用することができる。

【0056】

いずれの本明細書に記載される塩基エディターも、これらに限定されないが、遺伝子ノックアウト（例えば、正規のコドンの代わりに停止コドンを生産するための塩基の変更；スプライスアクセプター部位における塩基の変更）；遺伝子発現を活性化または抑制するための遺伝子の制御（プロモーター）領域における突然変異の導入；および／または点突然変異を元に戻すことによる疾患の原因となる突然変異の修正などのあらゆる使用のための、標的化された塩基編集に使用することができる。塩基エディターおよび／または塩基エディターによって作製された標的化された変更を含む細胞および細胞株（ただし塩基エディターそれ自体をすでに含んでいない）も提供される。

【0057】

本発明の塩基エディターは、現在使用される塩基エディターと比較して予想外に優れた編集効率および／または特異性を提供する。

【0058】

概説
本方法の実施、ならびに、本明細書で開示される組成物の調製および使用は、別段の指定がない限り、当業界の技術範囲内の、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算機化学、細胞培養、組換えＤＮＡおよび関連分野における従来の技術を採用する。これらの技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987および定期的な改訂版; METHODS IN ENZYMOLOGYのシリーズ, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999;ならびにMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999を参照されたい。

【0059】

定義
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」は、同義的に使用され、一本鎖または二本鎖の形態のいずれかの、直鎖状または環状のコンフォメーションでの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関する限定として解釈されないものとする。この用語は、天然ヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに、塩基、糖および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート主鎖）において改変されたヌクレオチドを包含し得る。一般的に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対合特異性を有し、すなわち、Ａのアナログは、Ｔと塩基対合すると予想される。

【0060】

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、同義的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語はまた、１つまたは複数のアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的アナログまたは改変された誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。

【0061】

「結合」は、巨大分子間の（例えば、タンパク質と核酸との間の）配列特異的な、非共有結合の相互作用を指す。全体としての相互作用が配列特異的である限り、結合相互作用の全ての成分が、配列特異的である（例えば、ＤＮＡ主鎖中のリン酸残基と接触する）必要はない。このような相互作用は、一般的に、１０^－６Ｍ^－１またはそれ未満の解離定数（Ｋ_ｄ）を特徴とする。「親和性」は、結合の強度を指し、結合親和性の増加は、より低いＫ_ｄと相関する。「非特異的な結合」は、目的のあらゆる分子（例えば操作されたヌクレアーゼ）とオンターゲット配列に依存しない巨大分子（例えばＤＮＡ）との間で起こる非共有結合の相互作用を指す。

【0062】

「結合タンパク質」は、別の分子と非共有結合によって結合できるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合、それは、それ自体に結合することができ（それによりホモ二量体、ホモ三量体などを形成する）、および／または異なる１つまたは複数のタンパク質の１つまたは複数の分子に結合することができる。結合タンパク質は、１つより多くのタイプの結合活性を有していてもよい。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合およびタンパク質結合活性を有する。ＲＮＡガイドヌクレアーゼシステムの場合において、ＲＮＡガイドは、ヌクレアーゼ成分（Ｃａｓ９またはＣｆｐ１）にとって異種であり、その両方が操作されていてもよい。

【0063】

「ＤＮＡ結合分子」は、ＤＮＡに結合することができる分子である。このようなＤＮＡ結合分子は、ポリペプチド、タンパク質のドメイン、より大きいタンパク質またはポリヌクレオチド内のドメインであり得る。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであり、一方で他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。一部の実施形態において、ＤＮＡ結合分子は、ヌクレアーゼのタンパク質ドメイン（例えばＦｏｋＩドメイン）であり、一方で他の実施形態において、ＤＮＡ結合分子は、ＲＮＡガイドヌクレアーゼのガイドＲＮＡ成分（例えばＣａｓ９またはＣｐｆ１）である。ＤＮＡ結合分子は、配列特異的な方式で、例えば、１つまたは複数のジンクフィンガーを介して、またはジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）またはＴＡＬＥのＲＶＤの１つまたは複数のＺＦＰ認識ヘリックス領域との相互作用を介してＤＮＡと結合する、タンパク質、またはより大きいタンパク質内のドメインを含んでいてもよい。ＤＮＡ結合分子としてはまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）および／またはＴｔａｇｏシステムのＤＮＡ結合ドメインも挙げられる。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語はしばしば、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略記される。

【0064】

「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、亜鉛イオンの配位を介してその構造が安定化されている結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１つまたは複数のジンクフィンガーを介して、配列特異的な方式でＤＮＡと結合するタンパク質またはより大きいタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語はしばしば、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略記される。

【0065】

「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つまたは複数のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復ドメインは、その同種の標的ＤＮＡ配列へのＴＡＬＥの結合に関与する。単一の「反復単位」（「反復」とも称される）は、典型的には３３～３５アミノ酸の長さであり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列と少なくとも部分的な配列相同性を示す。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。

【0066】

ＤＮＡ結合ドメインは、例えば、天然に存在するジンクフィンガータンパク質の認識ヘリックス領域の操作（１つまたは複数のアミノ酸を変更すること）を介して、またはＤＮＡ結合に関与するアミノ酸（「反復可変二残基」またはＲＶＤ領域）の操作によって、予め決定されたヌクレオチド配列に結合するように「操作」されていてもよい。それゆえに、操作されたジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥタンパク質は、天然に存在しないタンパク質である。ジンクフィンガータンパク質およびＴＡＬＥを操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたタンパク質は、その設計／組成物が主として合理的な基準に起因する天然に存在しないタンパク質である。設計のための合理的な基準としては、置換規則の適用、および既存のＺＦＰまたはＴＡＬＥ設計および結合データのデータベースに保存されている情報における情報を処理するためのコンピューター化されたアルゴリズムが挙げられる。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号；６，１４０，０８１号；６，４５３，２４２号；および６，５３４，２６１号を参照されたい；また国際特許公開ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６；およびＷＯ０３／０１６４９６も参照されたい。

【0067】

「選択された」ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥタンパク質またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、天然に見出されないものであり、その生産は、主として実験的なプロセス、例えばファージディスプレイ、相互作用トラップ、合理的設計またはハイブリッド選択に起因する。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号；５，９２５，５２３号；６，００７，９８８号；６，０１３，４５３号；および６，２００，７５９号；ならびに国際特許公開ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０；ＷＯ０１／８８１９７；およびＷＯ０２／０９９０８４を参照されたい。

【0068】

「ＴｔＡｇｏ」は、遺伝子サイレンシングに関与すると考えられる原核生物アルゴノートタンパク質である。ＴｔＡｇｏは、細菌サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来である。例えば、Swarts, et al. (2014) Nature 507(7491):258-261; Swarts, et al. (2012) PLoS One 7(4):e35888; G. Sheng, et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 652）を参照されたい。「ＴｔＡｇｏシステム」は全て、例えばＴｔＡｇｏ酵素による切断のためのガイドＤＮＡなどの必要な成分である。

【0069】

「切断」は、ＤＮＡ分子の共有結合の主鎖の破断を指す。切断は、これらに限定されないが、リン酸ジエステル結合の酵素による、または化学的な加水分解などの様々な方法によって開始することができる。一本鎖切断および二本鎖切断のどちらも可能であり、二本鎖切断は、２つの別個の一本鎖切断事象の結果として起こり得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または互い違いの末端のいずれかの生産をもたらし得る。特定の実施形態において、融合ポリペプチドは、標的化された二本鎖ＤＮＡ切断のために使用される。

【0070】

「切断ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一であるか、または異なるかのいずれか）と共に切断活性（好ましくは二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。用語「第１および第２の切断ハーフドメイン」、「＋および－の切断ハーフドメイン」および「右および左の切断ハーフドメイン」は、同義的に使用され、二量体化する切断ハーフドメインの対を指す。用語「切断ドメイン」は、用語「切断ハーフドメイン」と同義的に使用される。用語「ＦｏｋＩ切断ドメイン」は、配列番号５で示されるＦｏｋＩ配列、ならびに、あらゆるＦｏｋＩホモログを含む。

【0071】

「操作された切断ハーフドメイン」は、別の切断ハーフドメイン（例えば、別の操作された切断ハーフドメイン）と必須のヘテロ二量体を形成するように改変された切断ハーフドメインである。

【0072】

用語「編集」は、本明細書で使用される場合、ヌクレオチド塩基が、同じ配置における最初の（例えば、野生型）塩基と比較して改変されるプロセスを指す。必然的に、塩基編集（例えば、標的化された点突然変異）は、編集されたＤＮＡから転写されたあらゆるｍＲＮＡにおいて変更を再現することになる。アデニンおよびシチジンデアミナーゼは、それらそれぞれのヌクレオチド標的からアミノ基を除去し、それらをそれぞれイノシンおよびウリジンに変換する。ＤＮＡ修復または複製の間、ポリメラーゼ酵素によって、イノシンはグアニンとして認識され、ウリジンはチミンとして認識され、結果として、編集された二本鎖ＤＮＡにおいて、Ａ：Ｔ塩基対のＧ：Ｃ塩基対への、またはＣ：Ｇ塩基対のＴ：Ａ塩基対への変換が生じる。「塩基編集ウィンドウ」は、本明細書に記載される塩基エディターによる編集に供されるあらゆる塩基を指し、これは、編集システムのいずれの成分からあらゆる距離にあってもよく、典型的には塩基編集システムの少なくとも１つの成分が標的ＤＮＡに結合した後に接近可能な領域内である。ＰＡＭ配列（例えば、Ｃａｓ９含有エディター）を必要とする塩基エディターは、典型的に、ＰＡＭ配列から１３～１６個またはそれより多くのヌクレオチドであり得る、３、４、５、６、７個またはそれより多くのヌクレオチドの塩基編集ウィンドウを有する。本明細書に記載される塩基エディターは、これらに限定されないが、遺伝子ノックアウト（例えば、正規のコドンの代わりに停止コドンを生産するための塩基の変更；スプライスアクセプター部位における塩基の変更）；遺伝子発現を活性化または抑制するための遺伝子の制御（プロモーター）領域における突然変異の導入；および／または点突然変異を元に戻すことによる疾患の原因となる突然変異の修正などのあらゆる使用のための、標的化された塩基編集に使用することができる。塩基エディターおよび／または塩基エディターによって作製された標的化された変更を含む細胞株（ただし塩基エディターそれ自体をすでに含んでいない）。

【0073】

用語「配列」は、あらゆる長さのヌクレオチド配列を指し、これは、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよいし、直鎖状、環状または分岐状であってもよいし、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。用語「導入遺伝子」は、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。導入遺伝子は、例えば、２から１００，０００，０００ヌクレオチドの間の長さのあらゆる長さ、（またはそれらの間またはそれを超える範囲のあらゆる整数値）、好ましくは約１００から１００，０００の間のヌクレオチドの長さ（またはそれらの間のあらゆる整数）、より好ましくは約２０００から２０，０００ヌクレオチドの長さ（またはそれらの間のあらゆる値）、より一層好ましくは約５から１５ｋｂの間（またはそれらの間のあらゆる値）を有していてもよい。

【0074】

「染色体」は、細胞のゲノムの全部または一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムはしばしば、その核型によって特徴付けられ、核型とは、細胞のゲノムを含む全ての染色体のコレクションである。細胞のゲノムは、１つまたは複数の染色体を含んでいてもよい。

【0075】

「エピソーム」は、細胞の染色体核型の一部ではない、複製する核酸、核タンパク質複合体、または核酸を含む他の構造である。エピソームの例としては、プラスミド、ミニサークルおよび特定のウイルスゲノムが挙げられる。本明細書に記載される肝臓特異的なコンストラクトは、エピソームによって維持されてもよいし、または代替として、細胞に安定して統合されていてもよい。

【0076】

「外因性」分子は、細胞中に通常存在しないが、１つまたは複数の遺伝学的な、生化学的な、または他の方法によって細胞に導入され得る分子である。「細胞中に通常存在すること」は、細胞の特定の発生段階および環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生中にのみ存在する分子は、成体の筋肉細胞に関して外因性分子である。同様に、ヒートショックにより誘導された分子は、ヒートショックを受けていない細胞に関して外因性分子である。外因性分子は、例えば、正常に機能しない内因性分子の機能性バージョン、または正常に機能する内因性分子の正常に機能しないバージョンを含み得る。

【0077】

外因性分子は、数ある中でも、コンビナトリアルケミストリープロセスによって生成したものなどの小分子であってもよいし、またはタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、上記の分子のあらゆる改変された誘導体、もしくは上記の分子の１つまたは複数を含むあらゆる複合体などの巨大分子であってもよい。核酸としては、ＤＮＡおよびＲＮＡが挙げられ、これらは、一本鎖または二本鎖であってもよいし、直鎖状、分岐状または環状であってもよいし、あらゆる長さを有していてもよい。核酸としては、二重鎖を形成することが可能なもの、ならびに、三重鎖を形成する核酸が挙げられる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質としては、これらに限定されないが、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチン再構成因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、リガーゼ、デユビキチナーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼが挙げられる。

【0078】

外因性分子は、内因性分子と同じタイプの分子であってもよく、例えば、外因性タンパク質または核酸である。例えば、外因性核酸は、細胞に導入された、感染性のウイルスゲノム、プラスミドもしくはエピソーム、または通常細胞中に存在しない染色体を含んでいてもよい。細胞への外因性分子の導入のための方法は当業者公知であり、その例としては、これらに限定されないが、脂質媒介移行（すなわち、中性およびカチオン脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注射、細胞融合、粒子衝撃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介移行およびウイルスベクター媒介移行が挙げられる。外因性分子はまた、内因性分子と同じタイプであるが、細胞の由来となる種と異なる種由来の分子であってもよい。例えば、ヒト核酸配列は、初めにマウスまたはハムスターから誘導された細胞株に導入されてもよい。外因性分子の植物細胞への導入のための方法は当業者公知であり、その例としては、これらに限定されないが、プロトプラスト形質転換、炭化ケイ素（例えば、ＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標））、アグロバクテリウム媒介形質転換、脂質媒介移行（すなわち、中性およびカチオン脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注射、細胞融合、粒子衝撃（例えば、「ジーンガン」を使用するもの）、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介移行およびウイルスベクター媒介移行が挙げられる。

【0079】

それに対して、「内因性」分子は、特定の環境条件下で、特定の発生段階で、特定の細胞中に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体または他のオルガネラのゲノム、または天然に存在するエピソームの核酸を含み得る。追加の内因性分子としては、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を挙げることができる。

【0080】

本明細書で使用される場合、用語「外因性核酸の生成物」は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド生成物の両方、例えば、転写生成物（ＲＮＡなどのポリヌクレオチド）および翻訳生成物（ポリペプチド）を含む。

【0081】

「融合」分子は、２つまたはそれより多くのサブユニット分子が、好ましくは共有結合で連結されている分子である。サブユニット分子は、同じ化学的タイプの分子であってもよいし、または異なる化学的タイプの分子であってもよい。融合分子の例としては、これらに限定されないが、融合タンパク質（例えば、タンパク質ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとの融合体）、切断ドメインと作動的に会合したポリヌクレオチドＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ｓｇＲＮＡ）と、融合核酸（例えば、融合タンパク質をコードする核酸）との融合体が挙げられる。

【0082】

細胞中での融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質のデリバリーに起因していてもよいし、または細胞への融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドのデリバリーによってもよく、この場合、ポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳されて、融合タンパク質が生成する。また、トランススプライシング、ポリペプチド切断およびポリペプチドライゲーションが、細胞中におけるタンパク質の発現に関与していてもよい。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチドデリバリーのための方法は、本開示の他所で提示される。

【0083】

「スプリット酵素」は、２つまたはそれより多くの不活性なポリペプチド鎖に分割され、次いで機能できる酵素に再アセンブルした酵素である。スプリット酵素の活性タンパク質へのアセンブリーはしばしば、近接していることによって促進され、そこで各不活性ポリペプチド鎖が、不活性な鎖を物理的に一緒にすることが可能な他の分子に融合することにより、それらがアセンブル可能になり、フラグメント化のエントロピー消費を克服する。融合した分子は、相互作用がスプリット酵素を構成するポリペプチドのアセンブリーを引き起こすように、互いに相互作用する他のタンパク質、または互いに相互作用するか、もしくは共通のリガンドと相互作用するかのいずれかのあらゆるタイプの分子であり得る。例えばShekhawat and Ghosh (2011) Curr Opin Chem Biol 15(6):789-797を参照されたい。

【0084】

本開示の目的のための「遺伝子」は、遺伝子生成物をコードするＤＮＡ領域（下記を参照）、ならびに、遺伝子生成物の生産を調節する全てのＤＮＡ領域を含み、このような調節配列は、コード配列および／または転写される配列に隣接していてもよいし、そうでなくてもよい。したがって、遺伝子は、これらに限定されないが、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えばリボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位および遺伝子座調節領域を含む。

【0085】

「遺伝子発現」は、遺伝子に含有される情報の遺伝子生成物への変換を指す。遺伝子生成物は、遺伝子（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造的なＲＮＡまたは他のあらゆるタイプのＲＮＡ）の直接の転写生成物、またはｍＲＮＡの翻訳によって生産されたタンパク質であり得る。遺伝子生成物としてはまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集などのプロセスによって改変されたＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ－リボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化によって改変されたタンパク質も挙げられる。

【0086】

遺伝子発現の「モジュレーション」は、遺伝子の活性における変更を指す。発現のモジュレーションとしては、これらに限定されないが、遺伝子活性化および遺伝子抑制を挙げることができる。ゲノム編集（例えば、切断、変更、不活性化、ランダム突然変異）は、発現をモジュレートするのに使用することができる。遺伝子不活性化は、本明細書に記載されるＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含まない細胞と比較した、遺伝子発現におけるあらゆる低減を指す。したがって、遺伝子不活性化は、部分的であってもよいし、または完全であってもよい。

【0087】

「目的の領域」は、外因性分子と結合することが望ましい、細胞クロマチンのあらゆる領域、例えば、遺伝子、または遺伝子内の、もしくはそれに隣接する非コード配列などである。結合は、標的化されたＤＮＡの切断および／または標的化された組換えの目的のためであり得る。目的の領域は、例えば、染色体、エピソーム、オルガネラのゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、または感染性のウイルスゲノム中に存在していてもよい。目的の領域は、遺伝子のコード領域内、転写された非コード領域内、例えば、リーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロンなどの中、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかにおける転写されなかった領域内であってもよい。目的の領域は、単一のヌクレオチド対ほどの小さい領域であってもよいし、または長さが最大２，０００ヌクレオチドの対、またはあらゆる整数値のヌクレオチド対であってもよい。

【0088】

「真核」細胞としては、これらに限定されないが、真菌細胞（例えば酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）、例えば幹細胞（多能性および複能性）などが挙げられる。

【0089】

用語「作動的な連結」および「作動的に連結した」（または「作動可能に連結した」）は、２つまたはそれより多くの成分（例えば配列エレメント）の並置に対して同義的に使用され、この場合、これらの成分が、両方の成分が正常に機能し、成分の少なくとも１つが、他の成分の少なくとも１つにおいて発揮する機能を媒介することが可能になるように整列されている。例証として、転写調節配列、例えばプロモーターは、転写調節配列が、１つまたは複数の転写調節因子の存在または非存在に応答してコード配列の転写のレベルを制御する場合、コード配列に作動的に連結している。転写調節配列は、一般的に、コード配列とシスで作動的に連結しているが、必ずしもそれと直接隣接していなくてもよい。例えば、エンハンサーは、それらが連続していないとしても、コード配列に作動的に連結した転写調節配列である。

【0090】

タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能性フラグメント」は、その配列が全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能を保持するタンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能性フラグメントは、対応する天然分子より多い、より少ない、またはそれと同じ数の残基を有していてもよく、および／または１つまたは複数のアミノ酸またはヌクレオチド置換を含有していてもよい。核酸またはタンパク質の機能を決定するための方法（例えば、コードする機能、別の核酸にハイブリダイズする能力、酵素活性のアッセイ）は、当業界において周知である。

【0091】

ポリヌクレオチド「ベクター」または「コンストラクト」は、遺伝子配列を標的細胞に移行させることが可能である。典型的には、「ベクターコンストラクト」、「発現ベクター」、「発現コンストラクト」、「発現カセット」、および「遺伝子移入ベクター」は、目的の遺伝子の発現を指示することが可能であり、遺伝子配列を標的細胞に移行させることができるあらゆる核酸コンストラクトを意味する。したがって、この用語は、クローニング、および発現媒体、ならびに組み込み型ベクターを含む。

【0092】

用語「対象」および「患者」は、同義的に使用され、ヒト患者および非ヒト霊長類などの哺乳動物、ならびに、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、および他の動物などの実験動物を指す。したがって、用語「対象」または「患者」は、本明細書で使用される場合、本発明の発現カセットを投与することができるあらゆる哺乳類患者または対象を意味する。本発明の対象は、障害を有する対象を含む。

【0093】

本明細書で使用される用語「処置すること」および「処置」は、症状の重症度および／または頻度における低減、症状および／または根本的な原因の排除、症状および／またはそれらの根本的な原因の出現の防止、ならびにダメージの改善もしくは回復を指す。がん、単一遺伝子疾患および移植片対宿主病は、本明細書に記載される組成物および方法を使用して処置され得る状態の非限定的な例である。

【0094】

「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主としてＤＮＡ、ならびにヒストンおよび非ヒストンである染色体タンパク質などのタンパク質を含む。真核細胞クロマチンの大部分が、ヌクレオソームの形態で存在し、それにおいて、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４のそれぞれを２つずつ含む八量体と会合するおよそ１５０塩基対のＤＮＡを含み、リンカーＤＮＡ（生物に応じて様々な長さを有する）が、ヌクレオソームコアの間で伸長する。ヒストンＨ１の分子は、一般的に、リンカーＤＮＡと会合する。本開示の目的のために、用語「クロマチン」は、原核性および真核性の両方の全てのタイプの細胞核タンパク質を包含することを意味する。細胞クロマチンは、染色体クロマチンとエピソームクロマチンの両方を含む。

【0095】

「接近可能な領域」は、核酸中に存在する標的部位が標的部位を認識する外因性分子と結合することができる細胞クロマチン中の部位である。いかなる特定の理論にも縛られることは望まないが、接近可能な領域は、ヌクレオソーム構造にパッケージングされない領域であると考えられる。接近可能な領域の別個の構造は、化学的および酵素的なプローブ、例えば、ヌクレアーゼに対するその感受性によって検出できることが多い。

【0096】

「標的部位」または「標的配列」は、結合にとって十分な条件が存在するという条件で結合分子が結合すると予想される核酸の部分を定義する核酸配列である。例えば、配列５’－ＧＡＡＴＴＣ－３’は、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼのための標的部位である。「意図した」または「オンターゲット」配列は、結合する分子が結合することを意図される配列であり、「意図されない」または「オフターゲット」配列は、意図した標的ではない、結合する分子が結合するあらゆる配列を含む。

【0097】

用語「ＤＮＡ不安定化分子」および「ＤＮＡ巻き戻し分子」は、同義的に使用され、塩基エディターによって標的化された塩基の接近しやすさを増加させること（例えば、露出させることによって）に役立つあらゆる分子（例えば、タンパク質、ヌクレオチド、小分子など）を指す。この用語は、これらに限定されないが、ニッカーゼ、オリゴヌクレオチド（ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＢＮＡなど）、ＲＮＡプログラム可能システム（例えば、ｓｇＲＮＡに作動可能に連結したＣａｓタンパク質）、および他のタンパク質（例えば、表Ａ）を含む。

【0098】

塩基エディター
本明細書に記載される塩基編集組成物（システム）は、二本鎖破断を誘発させずに個々のＤＮＡ塩基対の同一性を直接変更することができる。したがって、塩基エディターは、標的細胞に対するＤＮＡ修復経路の選好に依存しない。さらに、標的ＤＮＡ中に二本鎖破断が生じないため、遊離のＤＮＡ末端がなく、したがって転移が起こらない。

【0099】

本明細書に記載される塩基エディターは、Ｃ：Ｇ対をＴ：Ａ対に変更するシトシン塩基エディター（ＣＢＥ）であってもよいし、またはＡ：Ｔ対をＧ：Ｃ対に変更するアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）であってもよい。これらの塩基エディターは、例えば、正規のコドンを停止コドンに変えることによって（例えば、シトシン塩基エディターを使用して）、および／またはシトシンまたはアデニン塩基エディターのいずれかを使用してスプライスアクセプター部位を突然変異させることによって、不活性化（遺伝子ノックアウト）に使用することができる。加えて、本明細書に記載される塩基エディターは、遺伝子の発現を活性化または抑制するために、遺伝子の制御（例えば、プロモーター領域）を変更することに使用することができる。さらに、塩基編集は、突然変異、特に疾患の原因となる突然変異を修正するのに使用することができる。

【0100】

第１のＡＰＯＢＥＣ－ｄＣａｓ９塩基エディターの開発に続いて、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＧＩ）が付加されたＢＥ２と呼ばれる第２の塩基エディターを開発した。塩基除去修復は、Ｇ：Ｕミスマッチに対する細胞の一次応答であり、ウラシルＮ－グリコシラーゼ（ＵＮＧ）によるウラシルの切り出しによって開始される。ＵＮＧによって切り出したものから編集されたＧ：Ｕ中間体を保護する目的で、８３アミノ酸のウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）を、触媒的に死んでいるＣａｓ９（ｄＣａｓ９）のＣ末端に直接付加したところ、効率の増加がもたらされた（Komor, et al. (2017) Science Advances 3(8):eaao4774）。塩基エディターの初期バージョンにおいて、典型的には、ＤＮＡ複製機構を使用して、編集された塩基と逆側のヌクレオチド塩基の最終的な変換が行われるように、死んでいるＣａｓ９が使用された。加えて、Ｃａｓニッカーゼは、編集された塩基を含む鎖の逆側の鎖にニックを作り出すために使用されてきた。ニックが作り出されることにより、ニック下流の領域が切り出され、テンプレートとして編集された鎖を使用して置き換えられるように、ＤＮＡ修復機構が引き付けられる。シチジン塩基エディターＢＥ３は、ニッカーゼであるＣａｓ、Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａを使用したところ、これも効率を増加させた（Kim, et al. (2017) Nat Biotechnol 35(4):371-376）。さらに別の変異体において、ＢＥ４システムは、より一層大きい効率のために、複合体のＮおよびＣ末端の両方に２つのＵＧＩドメインを使用している。別のシチジンデアミナーゼシステムは、ニッカーゼＣａｓ９と組み合わせて、活性化によって誘導されたシチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）に頼る（「標的－ＡＩＤ」）。

【0101】

塩基エディターがＤＮＡと相互作用する場合、Ｃａｓベースのエディターは、相互作用するのにＰＡＭ配列を必要とし、次いで、活性のためのウィンドウ（塩基編集ウィンドウ）は、典型的には、ＰＡＭ配列の５’末端から１３～１６塩基である（図２も参照）。上述した異なる編集システムの活性ウィンドウは、様々である。標的－ＡＩＤシステムは、ＰＡＭ配列から遠く離れた塩基を編集し、一方でＢＥ４システムは、ＰＡＭにより近い塩基を編集する。塩基エディターはまた、Ｃｐｆ１ ＣＲＩＳＰＲシステムに基づいて構築されてきた（Eid, et al.、同書中）。加えて、塩基エディターのＢＥ４の立体配置は、化膿性連鎖球菌と黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来ＣＲＩＳＰＲシステム（それぞれＢＥ４およびＳａＢＥ４）の両方を使用して開発された。それゆえに、Ｃａｓ９塩基編集システムは、標的部位から適切に間隔を開けたＰＡＭ配列の利用可能性（距離は、ベースのエディターの効率および／または特異性に顕著に影響を与える可能性があるため）、および／または塩基編集ウィンドウからのＰＡＭ配列の距離（図２Ａで示されるように、標的塩基（例えば、Ａ）とＮＧＧ ＰＡＭの５’末端との間の１３～１６塩基）によって限定される。

【0102】

したがって、本発明より前、Ｃａｓ９塩基エディターは、ゲノム規模でのオフターゲット作用、ならびにバイスタンダー作用（標的化された塩基付近での意図されない編集）を誘発することが公知であった。例えば、Zuo, et al. (2019) Science 364(6437):289-292; Jin, et al. (2019) Science 364(6437):292-295; Gruenewald, et al. (2019) Nature 569(7756):433-437を参照されたい。

【0103】

追加の塩基エディターの立体配置は、バクテリオファージＭｕ由来のＧＡＭタンパク質の使用を含んでいる。一部の場合において、一部のタイプの塩基編集の結果として、インデル（挿入および欠失）が観察されている。一部の塩基エディターは、Ｕと逆側の鎖にニックを入れるため、ＵＮＧによるグリコシド結合の切断、それに続くＡＰリアーゼによる得られたアプリンまたはアピリミジン部位のプロセシングは、二本鎖ＤＮＡ破断（ＤＳＢ）をもたらす可能性があり、その結果としてインデル形成が生じる可能性がある。バクテリオファージＭｕのＧａｍタンパク質は、ＤＳＢの末端に結合し、それを分解から保護することから、ＤＳＢの遊離末端との結合にＧａｍを使用することは、塩基編集のプロセス中におけるインデル形成を低減することができる（Komor, et al. (2016) Nature 533:420-424; Komor, et al. (2017) Science Advances 3(8)）。シチジンデアミナーゼエディターに加えて、アデニン塩基をイノシンに変換する合成アデノシンデアミナーゼ（アデニン塩基エディター：「ＡＢＥ」、Gaudelli, et al. (2017) Nature 551(7681):464-471を参照）を用いて塩基エディターが開発されている。イノシンは、シチジンと塩基対合して、その後グアニンに修正されてもよく、それによって、ＡがＧに、またはＡ：ＴがＧ：Ｃに変換される。

【0104】

上述したように、本明細書に記載される塩基エディターは、ＤＮＡの一本鎖領域内の標的化された塩基を露出させるためにＤＮＡヘリックスを「開く」分子をさらに含んでいてもよい。これを達成できる一般的に公知の分子としては、これらに限定されないが、ＤＮＡヘリカーゼ、ヘリックスを不安定化する分子、および細菌ＤｎａＡタンパク質、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、三重鎖を形成するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが挙げられる。

【0105】

特定の実施形態において、塩基エディターは、編集のためにＤＮＡヘリックスを巻き戻して（開いて）標的化された塩基を露出させることにおいて補助となるタンパク質ドメインを含む。表Ａに好適なタンパク質の非限定的な例を示す。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【表1-6】

【表1-7】

【表1-8】

【表1-9】

【表1-10】

【表1-11】

【0106】

特定の実施形態において、塩基エディター（例えば、Ｃａｓ非含有塩基エディター）は、１つまたは複数のＤＮＡオリゴヌクレオチド、１つまたは複数のＲＮＡオリゴヌクレオチドおよび／または１つまたは複数の合成オリゴヌクレオチド、例えば１つまたは複数のペプチド核酸（ＰＮＡ）、１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ）および／または１つまたは複数の架橋された核酸（ＢＮＡ）などを含む。例えば、図１Ｄを参照されたい。例えば、ＰＮＡに関しては、Nielsen, et al. (1991) Science 254:1497-1500 and Bahal, et al. (2014) Curr Gene Ther. 14(5):331-342；ＬＮＡに関しては、Moreno, et al. (2013) Nucleic Acid Res. 41(5):3257-3273およびGeny, et al. (2016) Nucleic Acid Res. 44(5):2007-2019；およびＢＮＡに関しては、Rahman, et al. (2007) Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 26(10-12):1625-1628を参照されたい。

【0107】

特定の実施形態において、本発明のＣａｓ９非含有塩基エディターは、ＺＦＰ－デアミナーゼ融合タンパク質およびＺＦＮニッカーゼを含み、さらに、１つまたは複数のＤＮＡ不安定化因子を含んでいてもよい。特定の実施形態において、ＤＮＡ不安定化因子は、タンパク質（例えば、表Ａで示されるような）またはオリゴヌクレオチド（例えば、ＬＮＡ、ＰＮＡまたはＢＮＡ）である。他の実施形態において、Ｃａｓ９非含有塩基エディターは、あらゆるＣａｓ９の等価体、例えばＣａｓ１２ａ（全長または短縮化されたＣａｓ１２タンパク質を含む）を含む、ＤＮＡを不安定化する（巻き戻す）特性を有する非Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲタンパク質を含む。他の実施形態において、Ｃａｓ９非含有塩基エディターは、ＣＲＩＳＰＲシステム由来のいかなるエレメントも含まない。１つまたは複数の非Ｃａｓ９ ＤＮＡ不安定化（巻き戻し）因子（例えば、表Ａのタンパク質、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＢＮＡなど）は、塩基エディターのあらゆる成分に作動可能に連結されていてもよく、例えば、ＺＦＰ－デアミナーゼ融合タンパク質のいずれかの成分および／またはＺＦＮニッカーゼの成分のいずれかに作動可能に連結されていてもよい。

【0108】

特定の実施形態において、塩基エディターは、１つまたは複数のヌクレオチド配列、例えば１つまたは複数のＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）および／または架橋された核酸（ＢＮＡ）を含み、これらは、標的部位に塩基エディターのための一本鎖ＤＮＡ基質を提供するのに使用することができる。これは、例えば二重鎖侵入、三重鎖侵入またはテールクランプによって促進することができる（Quijano, et al. (2017) Yale J. Biol and Med. 90:583-598; Pellestor and Paulasova (2004) European J. Human Genetics 12:694-700; Schleifman, et al. (2011) Chem & Bio. 18:1189-1198。塩基エディターの１つまたは複数のヌクレオチド配列の構造は、標的配列の組成に応じて、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡおよび／またはＬＮＡおよび／またはＬＮＡおよび／またはＢＮＡ塩基の長さ、数および配置；ホスホロチオエート結合；これらのオリゴヌクレオチドの他の一般的な修飾において様々であると予想される。

【0109】

特定の実施形態において、塩基エディターは、１つまたは複数のＰＮＡ、例えば結合の強化、溶解性の増加およびデリバリーの改善のためのミニＰＥＧ置換およびガンマ位を含有するガンマＰＮＡを含む（Bahal, et al. (2014) Current Gene Ther. 14(5):331-342）。特定の実施形態において、ＰＮＡは、８－アミノ－２，６－ジオキサオクタン酸リンカーを示す１つまたは複数のＯ、および／または１つまたは複数のシトシン（Ｃ）もしくはプソイドイソシトシン残基を含む。１つまたは複数のリシン（Ｌｙｓ）残基は、ＰＮＡ中に含まれていてもよく、例えば、ＰＮＡ配列のＮおよび／またはＣ末端に含まれていてもよい。特定の実施形態において、１、２、３、４、５個またはそれより多くのＬｙｓ残基が、ＰＮＡの一方または両方の末端に含まれる。特定の実施形態において、２つまたはそれより多くのＰＮＡが、塩基エディター中で、例えば互いに同じまたは逆の方向で使用される。特定の実施形態において、１つまたは複数のＰＮＡは、構造：Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＯＯＯ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｃ；Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＯＯＯ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｃ；Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＯＯＯ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｃ；Ｎ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－ＯＯＯ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｃ；および／またはＮ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｃを有し、式中、Ｏは、８－アミノ－２，６－ジオキサオクタン酸リンカーを示し、Ｃは、シトシンを示す。ＰＮＡ配列のＮおよび／またはＣ末端におけるＬｙｓ残基は適宜であり、シトシンが、プソイドイソシトシンで置換されていてもよい。特定の実施形態において、１つまたは複数のＰＮＡは、図８Ｂから８Ｅで示されるような１つまたは複数のＰＮＡを含む。

【0110】

他の実施形態において、塩基エディターは、１つまたは複数のＬＮＡを含む。ＬＮＡは、性能の改善のために、スタッキングリンカーおよび２’－グリシルアミノ－ＬＮＡを含んでいてもよい（Geny, et al. (2016) Nucleic Acids Res. 44(5):2007-2019。特定の実施形態において、ＬＮＡは、１つまたは複数のホスホロチオエート結合を含み、これらは１つまたは複数のＬＮＡ残基および／またはＤＮＡ残基の間に含まれていてもよい。他の実施形態において、ＬＮＡは、１つまたは複数のコレステロール－ＴＥＧを含み、これは、細胞への取り込みを増加させることができる。特定の実施形態において、１つまたは複数のＬＮＡは、以下の構造：５’－ＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｔｃｔｃｔｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎｎＮｎｎＮｎｎＮｎｎＮｎ－３’（配列番号１）；５’－Ｎ＊ｎ＊ＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｔｃｔｃｔｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎｎＮｎｎＮｎｎＮｎｎ＊Ｎ＊ｎ－３’（配列番号６９）；および／または５’－ＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｔｃｔｃｔｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎＮｎｎＮｎｎＮｎｎＮｎｎＮｎ－Ｃｈｏｌ－ＴＥＧ－３’（配列番号７０）を有し、式中、ＬＮＡヌクレオチドは、大文字で示され；ＤＮＡヌクレオチドは、小文字で示され；「＊」は、ホスホロチオエート結合を示し；「Ｃｈｏｌ－ＴＥＧ」は、細胞への取り込みの増加のための３’コレステロール－ＴＥＧを示す（例えば、Bijsterbosch, et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28:2717-2725; Bijsterbosch, et al. (2002) J. Pharmacol. Exp. Ther. 302:619-626; Manoharan (2002) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 12:103-28; M. Manoharan (2004) Curr Opin Chem Biol. 8:570-9を参照）。特定の実施形態において、塩基エディターは、図８Ｆまたは図８Ｇで示されるように、１つまたは複数のＬＮＡを含む。

【0111】

１つまたは複数のＤＮＡ不安定化因子は、塩基エディター（例えば、ＡＢＥおよび／またはＣＢＥ）および／またはニッカーゼから独立して提供されてもよいし、および／またはそれと共に提供されてもよい。特定の実施形態において、ＤＮＡ不安定化因子は、あらゆる方向で（例えば、Ｎおよび／またはＣ末端に）、ＺＦＰおよび／またはＺＦＮニッカーゼに融合されている。ＤＮＡ不安定化因子は、塩基エディター標的部位の１ｋｂのウィンドウ以内で結合していてもよい。

【0112】

特定の実施形態において、塩基エディター（例えば、Ｃａｓ９アデニンまたはシトシン塩基エディター）、および塩基エディター付近の標的部位（ＲＡＮＧＥ）に特異的に結合する１つまたは複数の追加のＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、追加のｓｇＲＮＡ）を含む塩基編集システムが本明細書に記載される。特定の実施形態において、Ｃａｓ９を含有する塩基編集システムは、Ｃａｓ９ニッカーゼと、Ｃａｓ９ニッカーゼを固定すること、および／または塩基エディターの１つまたは複数の成分を他の成分に対して位置決定することにより特異性および／または塩基編集効率を増加させるのに役立つ１つまたは複数のＤＮＡ結合分子（例えば、ＺＦＰ）とを含む。１つまたは複数のＤＮＡ結合分子（例えば、ＺＦＰアンカー）は、典型的に、塩基エディター（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ９非含有塩基エディター）および／または標的化された塩基の１～５０（またはそれらの間のあらゆる値の）ヌクレオチド以内の標的部位に結合する。ＤＮＡ結合分子は、塩基エディターおよび／または標的化された塩基の５’および／または３’に結合することができる。特定の実施形態において、本明細書に記載されるＣａｓ９塩基エディターは、さらに２つのＺＦＰドメイン、例えば、デアミナーゼドメインまたはその成分に作動可能に連結したＺＦＰドメイン、およびＺＦＰアンカードメインを含む。例えば、図１Ｂを参照されたい。特定の実施形態において、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインは、塩基エディターの標的部位の５’に結合しており、塩基エディターが結合する鎖と同一の鎖で結合してもよいし、または異なる鎖で結合してもよい。例えば、１つまたは複数の追加のＺＦＰアンカーが使用されており、システムの塩基エディターの標的部位の５’に、塩基エディターが結合する鎖と同じ鎖において、特異的に結合する例示的な実施形態について、図１Ｂ、右下の概略図；図３；および図７Ａを参照されたい。１つまたは複数のＺＦＰアンカーの包含は、塩基エディターの効率および／または特異性を増加させることができ、例えば、一部のケースにおいて、ＺＦＰアンカーを含まない塩基エディターと比較して、２倍から５倍（またはそれらの間のあらゆる値）、１０倍から１００倍（またはそれらの間のあらゆる値）、または１００倍より多く増加させることができる。

【0113】

他の実施形態において、（１）Ｃａｓ９ニッカーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼの触媒的に不活性な単量体を含む）；（２）Ｃａｓ９ニッカーゼに対して標的部位の５’または３’に特異的に結合するアンカーＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ）；および（３）アデノシンデアミナーゼの触媒的に不活性な単量体、およびＣａｓ９ニッカーゼに対する標的部位の５’または３’に結合するＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ）を含む、非Ｃａｓ９ニッカーゼ（例えば、ＺＦＰ－ニッカーゼ）を含む塩基編集システムが本明細書に記載される。Ａデアミナーゼの二量体化のとき、Ｃａｓ９ニッカーゼおよび非Ｃａｓ９ニッカーゼ（例えば、ＺＦＮニッカーゼ）の単量体が二量体化して、機能性デアミナーゼを形成する。アンカーＤＮＡ結合ドメインおよび非Ｃａｓ９ニッカーゼは、標的の同一もしくは異なる鎖で、および／またはＣａｓ９ニッカーゼの同じ（５’または３’）側もしくは異なる（一方は５’およびもう一方は３’）側で結合していてもよい。特定の実施形態において、アンカーＤＮＡ結合ドメインおよび非Ｃａｓ９ニッカーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼの逆側における逆の鎖に結合する。例えば、図１Ｂ、上の概略図を参照されたい。

【0114】

他の実施形態において、（１）Ｃａｓ９ニッカーゼ；（２）Ｃａｓ９ニッカーゼに対する標的部位の５’または３’に特異的に結合する適宜のアンカーＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ）；および（３）ＡまたはＣデアミナーゼを含む非Ｃａｓ９ニッカーゼ（例えば、ＺＦＰ－ニッカーゼ）を含む塩基編集システムが本明細書に記載される。アンカーＤＮＡ結合ドメインおよび非Ｃａｓ９ニッカーゼは、標的の同一または異なる鎖で、および／またはＣａｓ９ニッカーゼの同じ（５’または３’）側もしくは異なる（一方は５’およびもう一方は３’）側で結合していてもよい。特定の実施形態において、アンカーＤＮＡ結合ドメインおよび非Ｃａｓ９ニッカーゼ塩基エディターは、Ｃａｓ９ニッカーゼの逆側における逆の鎖に結合する。例えば、図１Ｂ、下の中央の概略図を参照されたい。

【0115】

他の実施形態において、（１）ｓｇＲＮＡに作動可能に連結したＣａｓ９タンパク質（例えば、ｄＣａｓ９）；（２）Ｃａｓ９ニッカーゼに対する標的部位の５’または３’に特異的に結合する適宜のアンカーＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰアンカー）；（３）ＡまたはＣデアミナーゼに作動可能に連結したＺＦＰを含む融合タンパク質であって、Ｃａｓ９タンパク質に対して３’または５’である、融合タンパク質；および（４）Ｃａｓ９タンパク質および／またはＺＦＰの３’または５’と結合するＺＦＮニッカーゼを含む塩基編集システムが本明細書に記載される。アンカーＤＮＡ結合ドメインおよび非Ｃａｓ９タンパク質は、標的の同一または異なる鎖で、および／またはＣａｓ９タンパク質の同じ（５’または３’）側または異なる（一方は５’およびもう一方は３’）側で結合していてもよい。特定の実施形態において、ＺＦＰ－デアミナーゼ融合タンパク質のＺＦＰおよび適宜のアンカーＺＦＰは、逆の鎖に結合する。例えば、図１Ｃを参照されたい。さらなる実施形態において、塩基エディターは、ＺＦＮニッカーゼを含まない。

【0116】

本明細書に記載されるＣａｓ９塩基エディターは、ｓｇＲＮＡを含む塩基エディターに利用可能なＰＡＭ配列を拡大すること（緩めること）などの、効率的で標的化された塩基編集のために使用できるＰＡＭ配列に関して、驚くべき、かつ予想外の利点を提供する。

【0117】

Ｃａｓ９塩基エディターを含まない（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼまたはＣａｓ９タンパク質を欠如した）塩基エディター（ＡＢＥまたはＣＢＥ）も本明細書に記載される。例えば、図１Ａ～図１Ｄを参照されたい。

【0118】

特定の実施形態において、塩基エディターは、（１）非Ｃａｓ９ニッカーゼ、例えば、対のヌクレアーゼドメインの１つが触媒的に不活性であるＺＦＮの対（ヌクレアーゼドメインに作動可能に連結したＺＦＰ）を含むＺＦＮニッカーゼ（例えば、米国特許第８，７０３，４８９号；９，２００，２６６号；９，６３１，１８６号；および１０，１１３，２０７号を参照）；および（２）ＡまたはＣデアミナーゼに作動可能に連結したＺＦＰを含むＺＦＰ塩基エディターを含む。例えば、図１Ｂ、左下の概略図を参照されたい。

【0119】

他の実施形態において、塩基エディターは、あらゆるＲＮＡプログラム可能分子を含むＤＮＡ不安定化分子を含む。特定の実施形態において、ＤＮＡ不安定化分子は、Ｃａｓ９タンパク質（例えば、ｄＣａｓ９）およびｓｇＲＮＡを含むＲＮＡプログラム可能分子を含む。他の実施形態において、ＲＮＡプログラム可能分子は、Ｃａｓ９タンパク質（例えば、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａとしても公知）、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２（Ｃａｓ１３ａとしても公知）、Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ４、ＣａｓＸおよびＣａｓＹ）；ならびにアデノシンまたはシトシンデアミナーゼではない。塩基エディターは、少なくとも１つのＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、アデノシンまたはシトシンデアミナーゼに作動可能に連結したＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメイン；ＤＮＡ不安定化分子のどちらかの側のＺＦＰアンカー；および／またはＺＦＮニッカーゼのあらゆる組合せ）をさらに含んでいてもよい。

【0120】

他の実施形態において、Ｃａｓ９非含有塩基エディターは、ＺＦＮニッカーゼ、およびＡＢＥまたはＣＢＥ（例えばＺＦＰに作動可能に連結した）、および標的塩基を接近可能にする（例えば、ＤＮＡを巻き戻す）１つまたは複数のＤＮＡ不安定化分子を含む。例えば、図１Ｄを参照されたい。ＤＮＡを不安定化する（巻き戻す）分子の非限定的な例としては、表Ａで示されるタンパク質ドメイン、ならびに図８で示されるＬＮＡおよび／またはＰＮＡなどの核酸が挙げられる。ＺＦＮニッカーゼは、触媒的に活性な、および／もしくは触媒的に不活性なＦｏｋＩドメインにおける１つもしくは複数の突然変異、ならびに／またはＺＦＰ主鎖への１つもしくは複数の突然変異を含み得る。例えば、米国特許公開第２０１８／００８７０７２号を参照されたい。特定の実施形態において、本明細書に記載される塩基エディターは、Ｃａｓ９非含有であってもよいが、非Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲタンパク質を含み得る。

【0121】

Ｃａｓ９非含有（例えば、ＺＦＰ）塩基エディターのいずれかは、例えば、ＤＮＡのさらなる巻き戻しが、標的の接近しやすさを増加させることによって塩基エディターの機能を増大させる場合、１つまたは複数の追加のＤＮＡ不安定化因子（例えば、ＤＮＡヘリカーゼ、ヘリックスを不安定化する分子、および細菌ＤｎａＡタンパク質、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、オリゴヌクレオチドなど）をさらに含んでいてもよい（または補充していてもよい）。１つまたは複数のＤＮＡ不安定化因子は、ニッカーゼおよび／またはＡもしくはＣデアミナーゼを含有する分子と会合していてもよい。特定の実施形態において、ＤＮＡ不安定化因子（例えば、ＤＮＡオリゴ）は、図１Ｄに描写されるように、ＺＦＮニッカーゼと会合している。

【0122】

他の実施形態において、（１）少なくとも１つのＤＮＡ不安定化分子（例えば、非Ｃａｓ９タンパク質）；（２）ＤＮＡ不安定化分子に対する標的部位の５’または３’に特異的に結合する適宜のＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＮアンカー）；および（３）ＡまたはＣデアミナーゼに作動可能に連結したＺＦＰを含む融合タンパク質であって、ＤＮＡ不安定化分子に対して３’または５’にある、融合タンパク質を含む塩基編集システムが本明細書に記載される。

【0123】

Ｃａｓ９非含有塩基エディターは、これらに限定されないが、（ｉ）本発明者らが９９％またはそれより高い切断効率で（オフターゲット作用無しで）ＺＦＮを構築することができるような、Ｃａｓ９に依存しないオフターゲット作用；（ｉｉ）ＺＦＰはヒトゲノム中の本質的にあらゆる配列を標的化できるため、ＰＡＭの制限が排除されること；（ｉｉｉ）現行のＣａｓ９塩基エディターで一般的に見られるバイスタンダー突然変異（例えば、標的ウィンドウ内の）が低減および／または排除されること；および／または（ｉｖ）コンストラクトサイズを低減させたことにより、ＡＡＶデリバリー（インビボでの機能性であることが公知の）が容易になることなどの、Ｃａｓ９塩基エディターを超える数々の驚くべき予想外の利点を提供する。

【0124】

したがって、ｃａｓ９非含有塩基エディターは、これらに限定されないが、標的特異性；多角性；バイスタンダー突然変異の制御または排除；およびデリバリーの容易さなどの、従来のＣａｓ９塩基エディターを超える顕著な利点を提供する。標的特異性に関して、オフターゲット作用をほとんどまたは全く起こさずに、編集において９９％効率的なＣａｓ９非含有ＺＦＰ塩基エディターを設計することができ、それに対してＣａｓ９塩基エディターは、より高い割合のオフターゲット作用を示す。同様に、非Ｃａｓ９ ＺＦＰ塩基エディターは、Ｃａｓ９塩基エディターで見られるようなバイスタンダー突然変異を制御（低減）するかまたは排除する。さらに、非Ｃａｓ９ ＺＦＰ塩基エディターのための標的部位の選択は、ＰＡＭ要件によって限定されるのに対し、Ｃａｓ９非含有ＺＦＰ塩基エディターは、本質的にあらゆる標的配列を標的化することができる。加えて、非Ｃａｓ９塩基エディターのコンストラクトサイズの低減により、それらはＡＡＶベクターを使用してデリバリーでき、それによって治療的な（インビボでの）使用を大きく発展させることができる。

【0125】

特定の実施形態において、本明細書に記載される塩基エディター（塩基編集システム）は、（１）塩基編集ウィンドウ内の、および／または（２）塩基編集ウィンドウと介在するＰＡＭ配列の５’末端との間の塩基内の変更しようとする単一の塩基（標的塩基）を含む。図２も参照されたい。ＤＮＡ編集ウィンドウを開くことにより、塩基エディターによって起こり得る改変のために、他の非標的塩基（アデニンおよび／またはシトシン）が開いたままになる。これは、標的は、ＰＡＭ配列の５’末端から１３～１６ヌクレオチド離れていてもよいが、介在するヌクレオチド、および／または塩基編集ウィンドウ中に存在する標的化された塩基（例えば、アデニンまたはシトシン）も変更される可能性があることを意味する。このような非標的突然変異は、「バイスタンダー」突然変異とも称され、塩基編集プロセスにおいて望ましくない場合がある。いくつかの状況において、バイスタンダー突然変異は、編集ウィンドウ中に標的化され得る塩基（アデニン塩基エディターの場合、アデニン、またはシチジン塩基エディターの場合、シチジン）を含まないＰＡＭ配列を選択することによって回避することができる。ＰＡＭ配列の選択の代替として、および／またはそれに加えて、本発明は、ＺＦＮニッカーゼ機能性ドメインと対合したＺＦＰアンカーを含む本明細書に記載される塩基エディターを使用することによってバイスタンダー突然変異を低減または排除することで、ＰＡＭ要件を排除し、使用者がエディターをあらゆる最適な場所に配置することを可能にする。

【0126】

一部の実施形態において、様々な融合タンパク質を含む複合体（システム）が本明細書で開示される。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、融合タンパク質のＤＮＡへの結合特異性を増加させるために、代替のＤＮＡ結合ドメインに融合していてもよい（Bolukbashi, et al. (2015) Nat Methods 12(12):1150-1156を参照）。例えば、ＺＦＰ、ＴｔＡｇｏおよびＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、ｄＣａｓに融合していてもよい。一部の実施形態において、ｄＣａｓは、ＰＡＭの特異性を変更するため（Gao, et al. (2017) Nature Biotechnology 35:789-792; Virginijus Siksnys (2016) Mol Cell 61:793を参照）、またはＰＡＭ認識の要件を変更するための突然変異を含む。一部の実施形態において、塩基エディターは、Ｃａｓヌクレアーゼを欠如している。

【0127】

このアプローチのための可能性がある標的は多くある。処置され得る例示的な疾患に関与する遺伝子の編集による、疾患の処置および／または防止のための塩基編集の非限定的な例としては、鎌状赤血球症、血友病、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、テイ－サックス病、色盲、ファブリー病、フリードライヒ運動失調症、前立腺がんなどが挙げられる。

【0128】

したがって、本明細書に記載される塩基編集システムは、あらゆる疾患関連遺伝子の発現を変更するのに使用することができる。特定の実施形態において、遺伝子は、がんに関連するものであり、例えば、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ突然変異である。この突然変異は、骨髄増殖性新生物の拡張において重要な役割を果たす。ＪＡＫ２は、膜結合受容体により、転写因子のＳＴＡＴファミリーのリン酸化を介してサイトカインおよび増殖因子シグナルに変換される。Ｖ６１７Ｆ突然変異は、構成的チロシンリン酸化活性を引き起こし、サイトカイン過敏症（James, et al. (2005) Nature 434:1144-1148）およびサイトカインの非存在下で細胞の増殖を駆動する能力（Zhao, et al. (2005) J. Biol Chem 280 (24):22788-22792）を促進する。一部のＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ障害（例えば原発性骨髄線維症）の場合、唯一の治療法は造血細胞移植であるが、現在のアプローチは、疾患の再発や移植片対宿主病を伴うことが多い（Byrne, et al. (2018) Ther Avd Hematol 9(9) :251-259）。突然変異を除去するための対象の造血幹細胞／前駆細胞（ＨＳＣ／ＰＣ）の編集は、これらの疾患の処置を成功させる可能性がある。

【0129】

特定の実施形態において、塩基は、アルファ－１抗トリプシン（ＳＥＲＰＩＮＡ遺伝子座内の）を標的化する。Ａ１ＡＴタンパク質における常染色体劣性欠損を引き起こす遺伝子座における突然変異は、肝臓疾患と肺疾患の両方に関連する。ＰｉＺ突然変異は、北欧系の人において最も一般的な欠損対立遺伝子の１つであり、Ａ１ＡＴタンパク質の生産はわずか約１０～２０％である。この突然変異は、アミノ酸３４２位におけるグルタミンのリシンでの置換を生じるエクソン５における単一の突然変異によって引き起こされ、ＤＮＡ中の１０９６位におけるＧは、突然変異した遺伝子配列中ではＡである（Fregonese and Stolk (2008) Orphanet J Rare Dis 3:16に総論されている）。

【0130】

ＤＮＡ結合分子／ドメイン
あらゆる目的の遺伝子または遺伝子座における標的部位に特異的に結合する１つまたは複数のＤＮＡ結合分子／ドメインを含む組成物が本明細書に記載される。あらゆるＤＮＡ結合分子／ドメイン、これらに限定されないが、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼのＤＮＡと結合する部分（ガイドまたはｓｇＲＮＡ）、および／またはメガヌクレアーゼ由来のＤＮＡ結合ドメインなどが、本明細書で開示される組成物および方法において使用することができる。

【0131】

特定の実施形態において、本明細書に記載される塩基エディターは、ジンクフィンガータンパク質であるＤＮＡ結合ドメインを含む。好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、選択された標的部位に結合するように操作されているという点で、天然に存在しない。例えば、全て参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる、Beerli, et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo, et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan, et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal, et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo, et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416；米国特許第６，４５３，２４２号；６，５３４，２６１号；６，５９９，６９２号；６，５０３，７１７号；６，６８９，５５８号；７，０３０，２１５号；６，７９４，１３６号；７，０６７，３１７号；７，２６２，０５４号；７，０７０，９３４号；７，３６１，６３５号；および７，２５３，２７３号；ならびに米国特許公報第２００５／００６４４７４号；２００７／０２１８５２８号；および２００５／０２６７０６１号を参照されたい。特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許公開第２０１２／００６０２３０号に開示されたジンクフィンガータンパク質を含む。

【0132】

操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して、新規の結合特異性を有していてもよい。操作方法としては、これらに限定されないが、合理的設計および様々な種類の選択が挙げられる。合理的設計は、例えば、三つ組み（または四つ組み）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することを含み、それにおいて、各三つ組みまたは四つ組みヌクレオチド配列は、特定の三つ組みまたは四つ組み配列と結合するジンクフィンガーの１つまたは複数のアミノ酸配列に関連する。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる米国特許第６，４５３，２４２号および６，５３４，２６１号を参照されたい。

【0133】

例示的な選択方法は、ファージディスプレイおよび２ハイブリッドシステムなどが挙げられ、これらは、米国特許第５，７８９，５３８号；５，９２５，５２３号；６，００７，９８８号；６，０１３，４５３号；６，４１０，２４８号；６，１４０，４６６号；６，２００，７５９号；および６，２４２，５６８号；ならびに国際特許公開ＷＯ９８／３７１８６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ００／２７８７８；およびＷＯ０１／８８１９７およびＧＢ２，３３８，２３７に開示されている。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに関する結合特異性の強化は、例えば、米国特許第６，７９４，１３６号に記載されている。

【0134】

加えて、これらの、および他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／または複数のフィンガーを有するジンクフィンガータンパク質は、あらゆる好適なリンカー配列、例えば５個またはそれより多くのアミノ酸の長さを有するリンカーなどを使用して一緒に連結されていてもよい。６個またはそれより多くのアミノ酸の長さを有する例示的なリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号；６，９０３，１８５号；および７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガーの間に、好適なリンカーのあらゆる組合せを含んでいてもよい。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに関する結合特異性の強化は、例えば、米国特許第６，７９４，１３６号に記載されている。

【0135】

標的部位の選択；融合タンパク質の設計および構築のためのＺＦＰおよび方法（およびそれをコードするポリヌクレオチド）は当業者公知であり、米国特許第６，１４０，０８１号；５，７８９，５３８号；６，４５３，２４２号；６，５３４，２６１号；５，９２５，５２３号；６，００７，９８８号；６，０１３，４５３号；および６，２００，７５９号；ならびに国際特許公開ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０；ＷＯ０１／８８１９７；ＷＯ０２／０９９０８４；ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６；およびＷＯ０３／０１６４９６で詳細に説明されている。

【0136】

加えて、これらの、および他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／または複数のフィンガーを有するジンクフィンガータンパク質は、あらゆる好適なリンカー配列、例えば５個またはそれより多くのアミノ酸の長さを有するリンカーなどを使用して一緒に連結されていてもよい。６個またはそれより多くのアミノ酸の長さを有する例示的なリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号；６，９０３，１８５号；および７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガーの間に、好適なリンカーのあらゆる組合せを含んでいてもよい。

【0137】

通常、ＺＦＰは、少なくとも３本のフィンガーを含む。ＺＦＰのうち特定のものは、４本、５本、６本またはそれより多くのフィンガーを含む。３本のフィンガーを含むＺＦＰは、典型的には、９または１０ヌクレオチドを含む標的部位を認識し；４本のフィンガーを含むＺＦＰは、典型的には、１２から１４ヌクレオチドを含む標的部位を認識し；一方で６本のフィンガーを有するＺＦＰは、１８から２１ヌクレオチドを含む標的部位を認識することができる。ＺＦＰはまた、１つまたは複数の調節ドメインを含む融合タンパク質であってもよく、このようなドメインは、転写活性化または抑制ドメインであってもよい。

【0138】

一部の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ由来であってもよい。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列、例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩおよびＩ－ＴｅｖＩＩＩが公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Belfort, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon, et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler, et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble, et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast, et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓのカタログも参照されたい。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然の標的部位と結合するように操作されていてもよい。例えば、Chevalier, et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat, et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth, et al. (2006) Nature 441:656-659; Paeques, et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66；米国特許公開第２００７／０１１７１２８号を参照されたい。

【0139】

特定の実施形態において、本明細書に記載される突然変異切断ドメインと共に使用されるジンクフィンガータンパク質は、主鎖領域（例えば、－１から６に番号付けされる７アミノ酸の認識ヘリックス領域の外側の領域）に、例えば－１４位、－９位および／または－５位の１つまたは複数において、１つまたは複数の突然変異（置換、欠失、および／または挿入）を含む。１つまたは複数のこれらの位置における野生型残基は、欠失していてもよいし、いずれかのアミノ酸残基で置き換えられていてもよいし、および／または１つまたは複数の追加の残基を含んでいてもよい。一部の実施形態において、－５位におけるＡｒｇ（Ｒ）は、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｐ（Ｎ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、またはＡｌａ（Ａ）に変更されている。他の実施形態において、（－９）位におけるＡｒｇ（Ｒ）は、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ａｓｐ（Ｎ）、またはＧｌｕ（Ｅ）で置き換えられている。さらなる実施形態において、（－１４）位におけるＡｒｇ（Ｒ）は、Ｓｅｒ（Ｓ）またはＧｌｎ（Ｑ）で置き換えられている。他の実施形態において、融合ポリペプチドは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインにおける突然変異を含んでいてもよく、この場合、（－５）、（－９）および／または（－１４）位におけるアミノ酸が、上記で列挙したアミノ酸のいずれかにあらゆる組合せで変更されている。

【0140】

他の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、植物病原体のキサントモナス属由来のもの（Boch, et al. (2009) Science 326:1509-1512およびMoscou and Bogdanove (2009) Science 326:1501を参照）およびラルストニア属由来のもの（Heuer, et al. (2007) Applied and Environmental Microbiology 73(13):4379-4384を参照）；米国特許公報第２０１１／０３０１０７３号および２０１１／０１４５９４０号に類似した、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター（ＴＡＬＥ）由来の操作されたドメインを含む。キサントモナス属の植物病原菌は、重要な穀物植物において多くの疾患を引き起こすことがわかっている。キサントモナス属の病原性は、植物細胞に２５種より多くの異なるエフェクタータンパク質を注入する保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの注入されたタンパク質の中でも特に、植物転写活性化因子を模擬し、植物トランスクリプトームを操作する転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）が挙げられる（Kay, et al. (2007) Science 318:648-651を参照）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最もよく特徴付けられたＴＡＬＥの１つは、キサントモナス・カンペストリスｐｖ．ベシカトリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｇｒｉｓ ｐｖ． Ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ）由来のＡｖｒＢｓ３である（Bonas, et al. (1989) Mol Gen Genet 218 :127-136および国際特許公開ＷＯ２０１０／０７９４３０号を参照）。ＴＡＬＥは、タンデム反復の集中したドメインを含有し、各反復は、およそ３４アミノ酸を含有し、これらは、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性にとって主要である。加えて、それらは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（総論に関して、Schornack S., et al. (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272を参照）。加えて、植物病原細菌であるラルストニア・ソラナセラム（Ralstonia solanacearum）において、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と名付けられた２つの遺伝子は、Ｒ．ソラナセラムｂｉｏｖａｒ１株ＧＭＩ１０００およびｂｉｏｖａｒ４株ＲＳ１０００において、キサントモナス属のＡｖｒＢｓ３ファミリーに相同であることが見出されている（Heuer, et al. (2007) Appl and Envir Micro 73(13):4379-4384を参照）。これらの遺伝子は、ヌクレオチド配列において互いに９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７の反復ドメインにおける１，５７５塩基対の欠失の点で異なる。しかしながら、両方の遺伝子生成物は、キサントモナス属のＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。

【0141】

これらのＴＡＬエフェクターの特異性は、タンデム反復に見出される配列に依存する。繰り返された配列は、およそ１０２塩基対を含み、反復は、典型的には、互いに９１～１００％相同である（Bonas, et al., ibid）。反復の多型は、通常、１２位および１３位に配置され、１２位および１３位における高度可変二残基（反復可変二残基またはＲＶＤ領域）の同一性と、ＴＡＬ－エフェクターの標的配列における連続するヌクレオチドの同一性との間に１対１の対応があると考えられる（Moscou and Bogdanove (2009) Science 326:1501 and Boch, et al. (2009) Science 326:1509-1512を参照）。実験的には、これらのＴＡＬ－エフェクターのＤＮＡ認識のための天然のコードは、１２位および１３位におけるＨＤ配列（反復可変二残基またはＲＶＤ）がシトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡ、Ｃ、ＧまたはＴに結合し、ＮＮがＡまたはＧに結合し、ＩＮＧがＴに結合すると決定されている。これらのＤＮＡ結合反復は、新しい配列と相互作用し、植物細胞中で非内因性レポーター遺伝子の発現を活性化することができる人工転写因子が生じるように、新しい組合せおよび多数の反復と共にタンパク質にアセンブルされている（Boch, et al., ibid）。操作されたＴＡＬタンパク質は、不規則なＲＶＤを有するＴＡＬＥＮを含むＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ融合体（ＴＡＬＥＮ）が生じるように、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインに連結されている。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。

【0142】

一部の実施形態において、ＴＡＬＥＮは、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む。他の実施形態において、ＴＡＬＥ－ヌクレアーゼは、メガＴＡＬである。これらのメガＴＡＬヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよびメガヌクレアーゼ切断ドメインを含む融合タンパク質である。メガヌクレアーゼ切断ドメインは、単量体として活性であり、活性のために二量体化を必要としない。（Boissel et al. (2013) Nucl Acid Res: 1-13, doi: 10.1093/nar/gkt1224を参照）。

【0143】

よりさらなる実施形態において、ヌクレアーゼは、コンパクトなＴＡＬＥＮを含む。これらは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインをＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに連結させる単鎖融合タンパク質である。融合タンパク質は、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインがＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに対してどこに配置されているかに応じて、ＴＡＬＥ領域によって局所化されたニッカーゼとして作用する場合があるか、または二本鎖破断を作り出すことができるかのいずれかである（Beurdeley, et al. (2013) Nat Comm: 1-8 DOI:10.1038/ncomms2782を参照）。加えて、ヌクレアーゼドメインはまた、ＤＮＡに結合する機能も示し得る。いずれのＴＡＬＥＮも、１つまたは複数のメガＴＡＬＥと共に、追加のＴＡＬＥＮ（例えば、１つまたは複数のＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮまたはＦｏｋＩ－ＴＡＬＥＮ））と組み合わせて使用することができる。

【0144】

加えて、これらの、および他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／もしくは複数のフィンガーを有するジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、あらゆる好適なリンカー配列、例えば５個またはそれより多くのアミノ酸の長さを有するリンカーなどを使用して一緒に連結されていてもよい。長さが６個またはそれより多くのアミノ酸の例示的なリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号；６，９０３，１８５号；および７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガーの間に、好適なリンカーのあらゆる組合せを含んでいてもよい。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに関する結合特異性の強化は、例えば、米国特許第６，７９４，１３６号に記載されている。

【0145】

特定の実施形態において、塩基エディターは、ＤＮＡに結合する単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）ＤＮＡ結合分子を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムの一部であるＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、米国特許第８，６９７，３５９号ならびに米国特許公報第２０１５／００５６７０５号および２０１５／０１５９１７２号を参照されたい。システムのＲＮＡ成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ；クラスター化された等間隔にスペーサーが入った短鎖反復回文配列）遺伝子座、およびタンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ；ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Jansen, et al. (2002) Mol. Microbiol. 43:1565-1575; Makarova, et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30:482-496; Makarova, et al. (2006) Biol. Direct 1:7; Haft, et al. (2005) PLoS Comput. Biol. 1:e60）が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムの遺伝子配列を構成する。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子、ならびに、ＣＲＩＳＰＲ媒介核酸切断の特異性をプログラミングすることが可能な非コードＲＮＡエレメントの組合せを含有する。

【0146】

一部の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ＴｔＡｇｏシステムの一部である（Swarts, et al. (2014) Nature 507(7491):258-261; Swarts, et al. (2012) PLoS One 7(4):e35888; Sheng, et al., ibidを参照）。真核生物において、遺伝子サイレンシングは、アルゴノート（Ａｇｏ）ファミリーのタンパク質によって媒介される。このパラダイムにおいて、Ａｇｏは、小さい（１９～３１ｎｔの）ＲＮＡに結合する。このタンパク質－ＲＮＡサイレンシング複合体は、小さいＲＮＡと標的とのワトソン－クリック塩基対合を介して標的ＲＮＡを認識し、ヌクレオチド鎖切断によって標的ＲＮＡを切断する（Vogel (2014) Science 344:972-973）。対照的に、原核生物Ａｇｏタンパク質は、小さい一本鎖ＤＮＡフラグメントに結合し、外来（しばしばウイルス）ＤＮＡを検出して、それを除去するように機能する可能性がある（Yuan, et al. (2005) Mol. Cell 19:405; Olovnikov, et al. (2013) Mol. Cell 51, 594; Swarts, et al. (2014) Nature 507(7491):258-261; Swarts, et al. (2012) PLoS One 7(4):e35888）。例示的な原核生物Ａｇｏタンパク質としては、アクウィフェクス・アエオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、およびサーマス・サーモフィルス由来のものが挙げられる。

【0147】

最もよく特徴付けられた原核生物Ａｇｏタンパク質の１つは、Ｔ．サーモフィルス由来のもの（ＴｔＡｇｏ；Swarts, et al. (2014) Nature 507(7491):258-261; Swarts, et al. (2012) PLoS One 7(4):e35888）である。ＴｔＡｇｏは、１５ｎｔまたは１３～２５ｎｔの一本鎖ＤＮＡフラグメントのいずれかと５’リン酸基で会合する。このＴｔＡｇｏと結合した「ガイドＤＮＡ」は、タンパク質－ＤＮＡ複合体を、ＤＮＡの第３者の分子におけるワトソン－クリック相補的ＤＮＡ配列と結合するように方向付けるのに役立つ。これらのガイドＤＮＡにおける配列情報による標的ＤＮＡの同定が可能になったら、ＴｔＡｇｏ－ガイドＤＮＡ複合体は、標的ＤＮＡを切断する。このようなメカニズムはまた、その標的ＤＮＡに結合したままで、ＴｔＡｇｏ－ガイドＤＮＡ複合体の構造によって支持される（G.Sheng, et al., ibid）。ロドバクター・スフェロイデス由来のＡｇｏ（ＲｓＡｇｏ）は、類似の特性を有する（Olovnikov, et al., ibid）。

【0148】

任意のＤＮＡ配列の外因性ガイドＤＮＡは、ＴｔＡｇｏタンパク質にローディングすることができる（Swarts, et al. (2014) Nature 507(7491):258-261; Swarts, et al. (2012) PLoS One 7(4):e35888）。ＴｔＡｇｏ切断の特異性はガイドＤＮＡによって方向付けられるため、外因性の研究者によって特定されたガイドＤＮＡと共に形成されたＴｔＡｇｏ－ＤＮＡ複合体は、それゆえに、ＴｔＡｇｏ標的ＤＮＡ切断を、相補的な研究者によって特定された標的ＤＮＡに方向付けると予想される。このようにして、ＤＮＡ中に標的化された二本鎖破断を作り出すことができる。ＴｔＡｇｏ－ガイドＤＮＡシステム（または他の生物由来のオーソロガスなＡｇｏ－ガイドＤＮＡシステム）の使用は、細胞内のゲノムＤＮＡの標的化された切断を可能にする。このような切断は、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。哺乳類ゲノムＤＮＡの切断の場合、哺乳類細胞における発現のためにコドンが最適化されたＴｔＡｇｏのバージョンを使用することが好ましいと予想される。さらに、細胞を、インビトロで形成されたＴｔＡｇｏ－ＤＮＡ複合体で処理することが好ましい場合があり、この場合、ＴｔＡｇｏタンパク質は、細胞透過性ペプチドに融合されている。さらに、３７℃で改善された活性を有するように変異誘発を介して変更されたＴｔＡｇｏタンパク質のバージョンを使用することが好ましい場合がある。Ａｇｏ－ＲＮＡ媒介ＤＮＡ切断は、ＤＮＡ破断の活用に関する分野において標準的な技術を使用して、遺伝子ノックアウト、標的化された遺伝子付加、遺伝子修正、標的化された遺伝子欠失を含む様々な結果に影響を与えるために使用することができる。

【0149】

したがって、どのようなＤＮＡ結合分子／ドメインを使用してもよい。特定の実施形態において、本明細書に記載される塩基エディターは、ｓｇＲＮＡ ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼの一部として）を含み、１つまたは複数のＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメイン（「ＺＦＰアンカー」と称される）を含んでいてもよい、Ｃａｓ９塩基エディターであり、ＺＦＰは、塩基の編集効率および／または特異性を増加させることができる。図１Ｂおよび図３に、ＺＦＰアンカーを含むＣａｓ９塩基エディターの非限定的な例を示す。

【0150】

融合分子
本明細書に記載されるＤＮＡ編集複合体は、本明細書に記載されるＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ成分、例えば単一ガイドＲＮＡ）および異種（機能性）ドメイン（またはその機能性フラグメント）を含む１つまたは複数の融合分子を含んでいてもよく、これらも提供される。

【0151】

共通のドメインとしては、例えば、転写因子ドメイン（活性化因子、リプレッサー、共活性化因子、コリプレッサー）、サイレンサー、腫瘍遺伝子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバーなど）；ＤＮＡ修復酵素ならびにその関連因子および調節剤；ヘリカーゼ、二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ再編成酵素ならびにその関連因子および調節剤；クロマチン関連タンパク質およびその調節剤（例えばキナーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラーゼ）；ならびにＤＮＡ改変酵素（例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、デアミナーゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）ならびにその関連因子および調節剤が挙げられる。ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ切断ドメインの融合に関する詳細について、米国特許公報第２００５／００６４４７４号；２００６／０１８８９８７号；および２００７／０２１８５２８号が、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。

【0152】

融合分子は、当業者に周知であるクローニングおよび生化学的なコンジュゲーションの方法によって構築される。融合分子は、ＤＮＡ結合ドメインおよび機能性ドメイン（例えば、ヘリカーゼおよび／またはデアミナーゼおよび／またはＧＵＩおよび／またはＧＡＭ）を含む。融合分子はまた、核局在化シグナル（例えば、ＳＶ４０中型Ｔ抗原由来のものなど）およびエピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧおよびヘマグルチニンなど）を含んでいてもよい。融合タンパク質（およびそれをコードする核酸）は、融合体の成分の中でも翻訳リーディングフレームが保存されるように設計される。

【0153】

一方において機能性ドメイン（またはその機能性フラグメント）のポリペプチド成分と、他方において非タンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、抗生物質、インターカレーター、副溝結合剤、核酸）との融合体は、当業者公知の生化学的なコンジュゲーション方法によって構築される。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）のカタログを参照されたい。副溝結合剤とポリペプチドとの融合体を作製するための方法および組成物が記載されている。Mapp, et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3930-3935。さらに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの単一ガイドＲＮＡは、機能性ドメインと会合して、活性な転写調節因子およびヌクレアーゼを形成する。

【0154】

特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインのための標的部位は、細胞クロマチンの接近可能な領域中に存在する。接近可能な領域は、例えば、米国特許第７，２１７，５０９号および７，９２３，５４２号に記載されるようにして決定することができる。細胞クロマチンの接近可能な領域に標的部位が存在しない場合、米国特許第７，７８５，７９２号および８，０７１，３７０号に記載されるように、１つまたは複数の接近可能な領域を生成することができる。追加の実施形態において、融合分子のＤＮＡ結合ドメインは、その標的部位が接近可能な領域中にあるかまたはそうではないかに関係なく、細胞クロマチンに結合することが可能である。例えば、このようなＤＮＡ結合ドメインは、リンカーＤＮＡおよび／またはヌクレオソームＤＮＡに結合することが可能である。このタイプの「パイオニア」ＤＮＡ結合ドメインの例は、特定のステロイド受容体および肝細胞核内因子３（ＨＮＦ３）に見出される（Cordingley, et al. (1987) Cell 48:261-270; Pina, et al. (1990) Cell 60:719-731; およびCirillo, et al. (1998) EMBO J. 17:244-254）。

【0155】

融合分子は、当業者公知のように、医薬的に許容される担体と共に製剤化することができる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1985；ならびに米国特許第６，４５３，２４２号および６，５３４，２６１号を参照されたい。

【0156】

融合分子の機能性成分／ドメインは、融合分子がそのＤＮＡ結合ドメインを介して標的配列に結合したら、遺伝子の配列に影響を与えることが可能な様々な成分のいずれかから選択することができる。したがって、機能性成分としては、これらに限定されないが、様々なデアミナーゼ、ＵＧＩ、ＧＡＭ、ヘリカーゼなどが挙げられる。特定の実施形態において、機能性ドメインは、１つまたは複数のシチジンデアミナーゼ（例えば、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集複合体１（ＡＰＯＢＥＣ１）ドメインおよび／または活性化誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ））を含む。他の実施形態において、機能性ドメインは、１つまたは複数のアデニンデアミナーゼ（例えば、突然変異したＴａｄＡ（ｔＲＮＡアデニンデアミナーゼ（Gaudelli, et al. (2017) Nature 551:464-471を参照））を含む。よりさらなる実施形態において、機能性ドメインは、少なくとも１つのウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（例えばＵＧＩ）ドメインを含む。一部の実施形態において、塩基編集複合体は、デアミナーゼ、ニッカーゼ、ＵＧＩおよび／またはＧＡＭタンパク質を含む。機能性ドメインは、ＤＮＡ結合ドメイン（および／または触媒的に活性な融合分子中に含まれる場合、ニッカーゼ）に対して、これらに限定されないが、Ｎ末端に（複数の機能性ドメインが存在する場合、あらゆる順番で）、Ｃ末端に（複数の機能性ドメインが存在する場合、あらゆる順番で）などのあらゆる方式で配置されていてもよい。

【0157】

一部の実施形態において、ＤＮＡ編集（塩基編集）複合体は、二本鎖ＤＮＡヘリックスを開くこと、またはそれを不安定化することにおいて補助する分子をさらに含む。一部の実施形態において、このような分子は、酵素を含む。一部の実施形態において、酵素は、ヘリカーゼ（例えば、ＲｅｃＱヘリカーゼ（ＷＲＮ、ＢＬＭ、ＲｅｃＱＬ４およびＲｅｃＱ５（Mo, et al. (2018) Cancer Lett. 413:1-10を参照）、ＤＮＡ２（Jia, et al. (2017) DNA Repair (Amst). 59:9-19）および他のあらゆる真核生物ヘリカーゼ、例えば、ＦＡＮＣＪ、ＸＰＤ、ＸＰＢ、ＲＴＥＬ１、およびＰＩＦ１など（Brosh (2013) Nat Rev Canc 13(8):542-558）。一部の実施形態において、酵素は、細菌および／またはウイルスヘリカーゼである。例示的なウイルスヘリカーゼとしては、ミオウイルス科のウイルスによってコードされたもの（例えばｇｐ４１、Ｄｄａ、ＵｖｓＷ、遺伝子α、およびＢａｎ）；ポドウイルス科のウイルスによってコードされたもの（例えば４Ｂ）；シホウイルス科、バキュロウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポリオーマウイルス科、パピローマウイルス科およびポックスウイルス科によってコードされたもの（例えば、Ｇ４０Ｐ、ｐ１４３、ＵＬ５、ＵＬ９、ＴＡＧ、Ｅ１、ＮＰＨ－Ｉ、ＮＰＨ－ＩＩ、Ａ１８Ｒ、およびＶＥＴＦ）、または当業界において公知の他のあらゆるウイルスヘリカーゼ（例えばFrick and Lam (2006) Curr Pharm Des 12(11):1315-1338を参照）が挙げられる。一部の実施形態において、ヘリカーゼ酵素は、細菌酵素である。例示的な細菌ヘリカーゼとしては、緑膿菌ＳＦ４ ＤｎａＢ様ヘリカーゼ、または細菌における大腸菌およびＨ．ピロリなどの細菌ＲｅｃＢＣＤ複合体の一部であるＲｅｃＢおよびＲｅｃＤヘリカーゼ（Shadrick, et al. (2013) J. Biomol Screen 18(7):761-781）が挙げられる。一部の実施形態において、分子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、ガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態において、複合体は、ヌクレアーゼドメインの１つに触媒的に欠陥のあるＣａｓ酵素を含む。一部の実施形態において、Ｃａｓ酵素は、そのＰＡＭ認識において欠陥がある（Anders, et al. (2014) Nature 513(7519):569-573）。一部の実施形態において、分子は、ヘリックスを不安定化する特性を有する。例示的なヘリックスを不安定化する分子としては、単純疱疹ウイルスＩ型由来のＩＣＰ８（Boehmer and Lehman (1993) J Virol 67(2):711-715）、Ｐｕｒアルファ（Darbinian, et al. (2001) J Cell Biochem 80(4):589-95）、およびウシ胸腺ＤＮＡヘリックス不安定化タンパク質（Kohwi-Shigematsu, et al. (1978) Proc Natl Acad Sci USA 75(10):4689-93）が挙げられる。一部の実施形態において、分子は、核酸である。一部の実施形態において、核酸は、標的化された編集部分に近い領域に対して相同性を有するＤＮＡである。一部の実施形態において、核酸は、標的化された編集部分に近い領域に対する相同性を有するＲＮＡである。一部の実施形態において、ＲＮＡは、改変されている。一部の実施形態において、融合分子は、融合分子の１つまたは複数のドメインの間にアミノ酸リンカー配列を含む。

【0158】

本明細書に記載されるＤＮＡ編集複合体は、１、２、３、４個またはそれより多くの本明細書に記載される融合分子を含んでいてもよい。特定の実施形態において、ＤＮＡ編集複合体は、２個の融合分子を含み、触媒的に活性なニッカーゼである（触媒的に活性な）第１の融合分子は、ＤＮＡ結合ドメインおよびニッカーゼドメインを含み、第２の触媒的に不活性な融合分子は、ＤＮＡ結合ドメインおよび１つまたは複数の機能性ドメイン（シチジンデアミナーゼ、アデニンデアミナーゼ、および／またはＵＧＩなど）を含む。典型的には、融合分子は、２つの融合分子が二量体化してＤＮＡ編集を実行するように、２つのＤＮＡ結合ドメインが標的部位に結合するという点で、「パートナー」である。他の実施形態において、ＤＮＡ編集複合体は、３個またはそれより多くの融合分子を含み、触媒的に活性なニッカーゼである第１の融合分子は、ＤＮＡ結合ドメインおよびニッカーゼドメインを含み；第２の触媒的に不活性な融合分子は、ＤＮＡ結合ドメインを含み（例えば、パートナーであり、第１の融合分子と二量体化する）；第３の融合分子は、本明細書に記載されるＤＮＡ結合ドメインおよび１つまたは複数の機能性ドメインを含む。

【0159】

ニッカーゼドメイン
特定の実施形態において、融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび切断（ヌクレアーゼ）ドメイン、好ましくはニッカーゼドメインを含む。したがって、遺伝子編集は、ヌクレアーゼ、例えば操作されたニッカーゼを使用して達成することができる。操作されたヌクレアーゼ技術は、天然に存在するＤＮＡ結合タンパク質を操作することに基づく。例えば、適合させたＤＮＡ結合特異性を有するホーミングエンドヌクレアーゼの操作が記載されている。Chames, et al. (2005) Nucleic Acids Res 33(20):e178; Arnould, et al. (2006) J. Mol. Biol. 355:443-458。加えて、ＺＦＰの操作も記載されている。例えば、米国特許第６，５３４，２６１号；６，６０７，８８２号；６，８２４，９７８号；６，９７９，５３９号；６，９３３，１１３号；７，１６３，８２４号；および７，０１３，２１９号を参照されたい。

【0160】

加えて、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ、すなわち、その操作された（ＺＦＰまたはＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインを介して、その意図した核酸標的を認識して、ヌクレアーゼ活性を介してＤＮＡ結合部位付近でＤＮＡのカットをもたらすことができる機能性実体を作り出すように、ＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥは、ヌクレアーゼドメインに融合されている。例えば、Kim, et al. (1996) Proc Nat'l Acad Sci USA 93(3):1156-1160を参照されたい。ごく最近、このようなヌクレアーゼは、様々な生物におけるゲノム改変に使用されてきた。例えば、米国特許第９，２５５，２５０号；９，２００，２６６号；９，０４５，７６３号；９，００５，９７３号；８，９５６，８２８号；８，９４５，８６８号；８，７０３，４８９号；８，５８６，５２６号；６，５３４，２６１号；６，５９９，６９２号；６，５０３，７１７号；６，６８９，５５８号；７，０６７，３１７号；７，２６２，０５４号；７，８８８，１２１号；７，９７２，８５４号；７，９１４，７９６号；７，９５１，９２５号；８，１１０，３７９号；８，４０９，８６１号；米国特許公報第２００３／０２３２４１０号；２００５／０２０８４８９号；２００５／００２６１５７号；２００５／００６４４７４号；２００６／００６３２３１号；２００８／０１５９９９６号；２０１０／００２１８２６４号；２０１２／００１７２９０号；２０１１／０２６５１９８号；２０１３／０１３７１０４号；２０１３／０１２２５９１号；２０１３／０１７７９８３号；２０１３／０１７７９６０号；および２０１５／００５６７０５号を参照されたい。

【0161】

したがって、本明細書に記載される方法および組成物は、広く適用することができ、あらゆる目的のヌクレアーゼを含んでいてもよい。ヌクレアーゼの非限定的な例としては、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮおよびジンクフィンガーヌクレアーゼが挙げられる。ヌクレアーゼは、異種ＤＮＡ結合および切断ドメイン（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ；異種切断ドメインを有するメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）を含んでいてもよいし、または代替として、天然に存在するヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、選択された標的部位に結合するように変更されていてもよい（例えば、同種の結合部位と異なる部位に結合するように操作されたメガヌクレアーゼ）。

【0162】

本明細書に記載されるヌクレアーゼのいずれかにおいて、ヌクレアーゼは、操作されたＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン、およびＴＡＬＥＮとも称されるヌクレアーゼドメイン（例えば、エンドヌクレアーゼおよび／またはメガヌクレアーゼドメイン）を含んでいてもよい。使用者が選んだ標的配列とのロバストな部位特異的な相互作用のためのこれらのＴＡＬＥＮタンパク質を操作するための方法および組成物が公開されている（米国特許第８，５８６，５２６号を参照）。一部の実施形態において、ＴＡＬＥＮは、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む。他の実施形態において、ＴＡＬＥ－ヌクレアーゼは、メガＴＡＬである。これらのメガＴＡＬヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよびメガヌクレアーゼ切断ドメインを含む融合タンパク質である。メガヌクレアーゼ切断ドメインは、単量体として活性であり、活性のために二量体化を必要としない。（Boissel, et al. (2013) Nucl Acid Res 1-13, doi:10.1093/nar/gkt1224を参照）。加えて、ヌクレアーゼドメインはまた、ＤＮＡに結合する機能も示し得る。

【0163】

よりさらなる実施形態において、ヌクレアーゼは、コンパクトなＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮ）を含む。これらは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインをＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに連結させる単鎖融合タンパク質である。融合タンパク質は、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインがＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに対してどこに配置されているかに応じて、ＴＡＬＥ領域によって局所化されたニッカーゼとして作用する場合があるか、または二本鎖破断を作り出すことができるかのいずれかである（Beurdeley, et al. (2013) Nat Comm:1-8 DOI:10.1038/ncomms2782を参照）。いずれのＴＡＬＥＮも、１つまたは複数のメガＴＡＬまたは他のＤＮＡ切断酵素と共に、追加のＴＡＬＥＮ（例えば、１つまたは複数のＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮまたはＦｏｋＩ－ＴＡＬＥＮ））と組み合わせて使用することができる。

【0164】

特定の実施形態において、ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）またはその切断活性を示す部分を含む。天然に存在するメガヌクレアーゼは、１５～４０塩基対の切断部位を認識し、一般的に４つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー（配列番号７５として開示される「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ」）、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ－ＣｙｓｔボックスファミリーおよびＨＮＨファミリーにグループ分けされる。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼとしては、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩおよびＩ－ＴｅｖＩＩＩが挙げられる。それらの認識配列は公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Belfort, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon, et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler, et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble, et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast, et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓのカタログも参照されたい。

【0165】

天然に存在するメガヌクレアーゼ由来の、主としてＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー（配列番号７５として開示される「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ」）由来のＤＮＡ結合ドメインは、植物、酵母、ショウジョウバエ、哺乳類細胞およびマウスにおける部位特異的なゲノム改変を促進するのに使用されてきたが、このアプローチは、メガヌクレアーゼ認識配列を保存する相同遺伝子（Monet, et al. (1999) Biochem. Biophysics. Res. Common 255:88-93）または認識配列が導入された予備操作されたゲノム（Route, et al. (1994) Mol. Cell. Biol. 14:8096-106; Chilton, et al. (2003) Plant Physiology 133:956-65; Puchta, et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5055-60; Rong, et al. (2002) Genes Dev. 16:1568-81; Gouble, et al. (2006) J. Gene Med. 8(5):616-622）のいずれかの改変に限定されてきた。したがって、医学的または生物工学的に重要な部位で新規の結合特異性を示すようにメガヌクレアーゼを操作する試みがなされてきた（Porteus, et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23:967-73; Sussman, et al. (2004) J. Mol. Biol. 342:31-41; Epinat, et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-62; Chevalier, et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat, et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth, et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques, et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66；米国特許公報第２００７／０１１７１２８号；２００６／０２０６９４９号；２００６／０１５３８２６号；２００６／００７８５５２号；および２００４／０００２０９２号）。加えて、メガヌクレアーゼ由来の、天然に存在する、または操作されたＤＮＡ結合ドメインは、異種ヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）由来の切断ドメインと作動可能に連結していてもよく、および／またはメガヌクレアーゼ由来の切断ドメインは、異種ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ）と作動可能に連結していてもよい。

【0166】

他の実施形態において、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン－ヌクレアーゼ融合体（ＴＡＬＥＮ）である。ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮは、選択された遺伝子中の標的部位に結合するように操作されたＤＮＡ結合ドメイン（ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン）、および切断ドメインまたは切断ハーフドメイン（例えば、本明細書に記載される制限および／またはメガヌクレアーゼ由来の）を含む。

【0167】

上記で詳述したように、ジンクフィンガー結合ドメインおよびＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、選択された配列に結合するように操作されていてもよい。例えば、Beerli, et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo, et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan, et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal, et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo, et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416を参照されたい。操作されたジンクフィンガー結合ドメインまたはＴＡＬＥタンパク質は、天然に存在するタンパク質と比較して、新規の結合特異性を有していてもよい。操作方法としては、これらに限定されないが、合理的設計および様々な種類の選択が挙げられる。合理的設計は、例えば、三つ組み（または四つ組み）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーまたはＴＡＬＥアミノ酸配列を含むデータベースを使用することを含み、それにおいて、各三つ組みまたは四つ組みヌクレオチド配列は、特定の三つ組みまたは四つ組み配列と結合するジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ反復単位の１つまたは複数のアミノ酸配列に関連する。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる米国特許第６，４５３，２４２号および６，５３４，２６１号を参照されたい。

【0168】

標的部位の選択；ならびに融合タンパク質の設計および構築のための方法（およびそれをコードするポリヌクレオチド）は当業者公知であり、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる米国特許第７，８８８，１２１号および８，４０９，８６１号で詳細に説明されている。

【0169】

加えて、これらの、および他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメイン、ＴＡＬＥおよび／または複数のフィンガーを有するジンクフィンガータンパク質は、あらゆる好適なリンカー配列、例えば５個またはそれより多くのアミノ酸の長さを有するリンカーなどを使用して一緒に連結されていてもよい。６個またはそれより多くのアミノ酸の長さを有する例示的なリンカー配列については、例えば、米国特許第６，４７９，６２６号；６，９０３，１８５号；および７，１５３，９４９号を参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガーの間に、好適なリンカーのあらゆる組合せを含んでいてもよい。米国特許第８，７７２，４５３号も参照されたい。

【0170】

したがって、ヌクレアーゼ、例えばＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよび／またはメガヌクレアーゼは、あらゆるＤＮＡ結合ドメインおよびあらゆるヌクレアーゼ（切断）ドメイン（切断ドメイン、切断ハーフドメイン）を含んでいてもよい。上述したように、切断ドメインは、ＤＮＡ結合ドメイン、例えばジンクフィンガーまたはＴＡＬ－エフェクターＤＮＡ結合ドメインにとって異種であってもよいし、ヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン由来の切断ドメインであってもよいし、異なるヌクレアーゼ由来の切断ドメインであってもよい。異種切断ドメインは、あらゆるエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインの由来となり得る例示的なエンドヌクレアーゼとしては、これらに限定されないが、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられる。例えば、２００２～２００３年のカタログ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ；およびBelfort, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388を参照されたい。ＤＮＡを切断する追加の酵素が公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；マングビーンヌクレアーゼ；膵臓ＤＮアーゼＩ；小球菌ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Linn, et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993も参照）。これらの酵素（またはそれらの機能性フラグメント）の１つまたは複数は、切断ドメインおよび切断ハーフドメインの供給源として使用することができる。

【0171】

同様に、切断ハーフドメインは、切断活性のために二量体化を必要とする上記のようなあらゆるヌクレアーゼまたはそれらの部分由来であってもよい。一般的に、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、２つの融合タンパク質が切断のために必要である。代替として、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質を使用してもよい。２つの切断ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはそれらの機能性フラグメント）由来であってもよいし、または各切断ハーフドメインが、異なるエンドヌクレアーゼ（またはそれらの機能性フラグメント）由来であってもよい。加えて、好ましくは、２つの融合タンパク質がそれらそれぞれの標的部位に結合することで、切断ハーフドメインが、例えば二量体化することによって機能性切断ドメインを形成することが可能になる空間的な方向に切断ハーフドメインが互いに置かれるように、２つの融合タンパク質のための標的部位が互いに配置される。したがって、特定の実施形態において、標的部位の付近のエッジは、５～１０ヌクレオチド、または１５～１８ヌクレオチドで分離されている。しかしながら、あらゆる整数値のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの標的部位の間に介在していてもよい（例えば、２から５０ヌクレオチド対またはそれより多く）。一般的に、切断の部位は、標的部位間にある。

【0172】

制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在しており、ＤＮＡに配列特異的に結合し（認識部位で）、結合部位で、またはその付近でＤＮＡを切断することが可能である。特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から離れた部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合および切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素であるＦｏｋＩは、一方の鎖において、その認識部位から９ヌクレオチドの位置で、他方の鎖において、その認識部位から１３ヌクレオチドの位置でＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；５，４３６，１５０号；および５，４８７，９９４号；ならびにLi, et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim, et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim, et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982を参照されたい。したがって、一実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素由来の切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）、および１つまたは複数のジンクフィンガー結合ドメインを含み、これらは、操作されていてもよいし、または操作されていなくてもよい。

【0173】

切断ドメインが結合ドメインから分離可能な例示的なＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Bitinaite, et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10,570-10,575。したがって、本開示の目的のために、開示された融合タンパク質で使用されるＦｏｋＩ酵素の部分は、切断ハーフドメインとみなされる。したがって、ジンクフィンガー－ＦｏｋＩ融合体を使用する、標的化された二本鎖切断および／または標的化された細胞配列の置き換えのために、それぞれＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質を、触媒的に活性な切断ドメイン再編成するために使用することができる。代替として、ジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含有する単一のポリペプチド分子も使用することができる。本開示の他所に、ジンクフィンガー－ＦｏｋＩ融合体を使用する標的化された切断および標的化された配列変更のためのパラメーターが提供される。

【0174】

切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持する、または多量体化（例えば、二量体化）して機能性切断ドメインを形成する能力を保持するタンパク質のあらゆる部分であり得る。

【0175】

例示的なＩＩＳ型制限酵素は、その全体が本明細書に組み入れられる国際特許公開ＷＯ０７／０１４２７５号に記載されている。追加の制限酵素はまた、分離可能な結合および切断ドメインも含有し、これらは本開示により企図される。例えば、Roberts, et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420を参照されたい。

【0176】

特定の実施形態において、切断ドメインは、ＦｏｋＩ切断ドメインである。全長ＦｏｋＩ配列を以下に示す。切断ドメインは、イタリックと下線で示され（全長タンパク質の３８４位から５７９位）、ホロタンパク質配列は後述される（配列番号５）：

【化1】

【0177】

ＦｏｋＩ由来の切断ハーフドメインは、配列番号５で示されるアミノ酸残基の１つまたは複数における突然変異を含んでいてもよい。突然変異としては、置換（野生型アミノ酸残基の異なる残基での置換）、挿入（１つまたは複数のアミノ酸残基の挿入）および／または欠失（１つまたは複数のアミノ酸残基の欠失）が挙げられる。特定の実施形態において、残基４１４～４２６、４４３～４５０、４６７～４８８、５０１～５０２、および／または５２１～５３１の１つまたは複数（配列番号５に対して番号付けされる）は、Miller, et al. (2007) Nat Biotechnol 25:778-784に記載されるその標的部位に結合したＺＦＮの分子モデルでは、これらの残基はＤＮＡ主鎖の近くに位置するため、突然変異している。特定の実施形態において、４１６位、４２２位、４４７位、４４８位、および／または５２５位における１つまたは複数の残基が突然変異している。特定の実施形態において、突然変異は、あらゆる異なる残基での、例えばアラニン（Ａ）残基、システイン（Ｃ）残基、アスパラギン酸（Ｄ）残基、グルタミン酸（Ｅ）残基、ヒスチジン（Ｈ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基、グリシン（Ｇ）残基、アスパラギン（Ｎ）残基、セリン（Ｓ）残基またはスレオニン（Ｔ）残基での、野生型残基の置換を含む。他の実施形態において、４１６位、４１８位、４２２位、４４６位、４４８位、４７６位、４７９位、４８０位、４８１位、および／または５２５位の１つまたは複数における野生型残基が、他のあらゆる残基で置き換えられており、例えば、これらに限定されないが、Ｒ４１６Ｄ、Ｒ４１６Ｅ、Ｓ４１８Ｅ、Ｓ４１８Ｄ、Ｒ４２２Ｈ、Ｓ４４６Ｄ、Ｋ４４８Ａ、Ｎ４７６Ｄ、Ｉ４７９Ｑ、Ｉ４７９Ｔ、Ｇ４８０Ｄ、Ｑ４８１Ａ、Ｑ４８１Ｅ、Ｋ５２５Ｓ、Ｋ５２５Ａ、Ｎ５２７Ｄ、Ｒ４１６Ｅ＋Ｒ４２２Ｈ、Ｒ４１６Ｄ＋Ｒ４２２Ｈ、Ｒ４１６Ｅ＋Ｋ４４８Ａ、Ｒ４１６Ｄ＋Ｒ４２２Ｈ、Ｋ４４８Ａ＋Ｉ４７９Ｑ、Ｋ４４８Ａ＋Ｑ４８１Ａ、Ｋ４４８Ａ＋Ｋ５２５Ａなどが挙げられる。

【0178】

特定の実施形態において、切断ドメインは、例えば、これらの全ての開示が参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる米国特許第７，９１４，７９６号；８，０３４，５９８号；および８，６２３，６１８号；ならびに米国特許公開第２０１１／０２０１０５５号に記載されるように、ホモ二量体化を最小化するかまたは防止する１つまたは複数の操作された切断ハーフドメイン（二量体化ドメイン突然変異体とも称される）を含む。ＦｏｋＩの４４６位、４４７位、４７９位、４８３位、４８４位、４８６位、４８７位、４９０位、４９１位、４９６位、４９８位、４９９位、５００位、５３１位、５３４位、５３７位、および５３８位におけるアミノ酸残基（配列番号５に対して番号付けされる）は全て、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインの二量体化に影響を及ぼすための標的である。突然変異としては、ＦｏｋＩに相同な天然の制限酵素に見出される残基への突然変異を挙げることができる。好ましい実施形態において、４１６位、４２２位、４４７位、４４８位および／または５２５位における突然変異（配列番号５に対して番号付けされる）は、正電荷を有するアミノ酸の、電荷を有さない、または負電荷を有するアミノ酸での置き換えを含む。別の実施形態において、操作された切断ハーフドメインは、全ての配列番号５に対して番号付けされた、１つまたは複数のアミノ酸残基４１６、４２２、４４７、４４８、または５２５における突然変異に加えて、アミノ酸残基４９９、４９６および４８６における突然変異を含む。

【0179】

あらゆるニッカーゼドメインが、本明細書に記載されるＤＮＡ編集複合体において使用することができる。ニッカーゼは、触媒ドメインに突然変異を含むことにより、ヌクレアーゼが完全な二本鎖破断を作製できないようにするが、その代わりに二本鎖ＤＮＡの部分的な切断である「ニッキング」を引き起こす。標的にニックを入れるのに２つまたはそれより多くの切断ドメインが必要な実施形態において、典型的には、切断ドメイン（例えば、切断ハーフドメイン）の少なくとも１つは、その触媒ドメインに１つまたは複数の（one more）突然変異を含み、それによりヌクレアーゼは不活性になる（例えば、触媒的に不活性なハーフドメイン）。ニッカーゼを生産するための触媒的に不活性な切断ドメインとしては、これらに限定されないが、突然変異したＦｏｋＩおよび／またはｄＣａｓタンパク質が挙げられる。例えば、米国特許第９，５２２，９３６号；９，６３１，１８６号；９，２００，２６６号；および８，７０３，４８９号、ならびにGuillinger, et al. (2014) Nature Biotech. 32(6):577-582; Cho, et al. (2014) Genome Res. 24(1):132-141を参照されたい。これらの触媒的に不活性な切断ドメインは、触媒的に活性なドメインと組み合わせて、一本鎖のカットを作製するためのニッカーゼとして作用し得る。追加のニッカーゼも当業界において公知であり、例えば、McCaffery, et al. (2016) Nucleic Acids Res. 44(2):e11. doi:10.1093/nar/gkv878. Epub 2015 Oct 19である。

【0180】

特定の実施形態において、ニッカーゼは、触媒的に不活性なＦｏｋＩ切断ドメインを含むヌクレアーゼニッカーゼ、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）ニッカーゼまたはＴＡＬ－エフェクタードメイン（ＴＡＬＥＮ）ニッカーゼを含む。ＦｏｋＩの触媒ドメインにおいて突然変異され得るアミノ酸の非限定的な例としては、アミノ酸残基４５０、４６７および／または４６９（野生型に対して決定した場合）が挙げられる。特定の実施形態において、１つまたは複数の点突然変異は、切断ハーフドメインの触媒活性が不活性化されるように、必須のヘテロ二量体の１つのメンバーの触媒ドメイン中になされる。例えば、４５０位が、ＤからＮに突然変異されていてもよいし、４６７位が、ＤからＡに突然変異されていてもよいし、４６９位が、ＫからＡに突然変異されていてもよい。他のアミノ酸が、これらのまたは他の配置で置換されていてもよい。例えば、米国特許第９，５２２，９３６号；９，６３１，１８６号；８，７０３，４８９号および９，２００，２６６号ならびにGuillinger, et al. (2014) Nature Biotech. 32(6):577-582; Cho, et al. (2014) Genome Res. 24(1):132-141を参照されたい。触媒的に不活性な切断ドメインは、触媒的に活性なドメインと組み合わせて、ニッカーゼとして作用して、一本鎖のカット作製することができる。追加のニッカーゼも当業界において公知であり、例えば、McCaffery, et al. (2016) Nucleic Acids Res. 44(2):e11. doi:10.1093/nar/gkv878. Epub 2015 Oct 19である。あらゆるヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ）は、二本鎖のカット作製するヌクレアーゼ中の切断ドメインの代わりに、一本鎖のカットを作製する切断ドメインを使用することによってニッカーゼになることができる。

【0181】

ＦｏｋＩドメインはまた、１つまたは複数の追加の突然変異を含んでいてもよい。特定の実施形態において、本明細書に記載される組成物は、例えば、米国特許第７，９１４，７９６号；８，０３４，５９８号；８，９６１，２８１号；および８，６２３，６１８号；米国特許公報第２００８／０１３１９６２号および２０１２／００４０３９８号に記載されるように、必須のヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの操作された切断ハーフドメインを含む。したがって、好ましい一実施形態において、本発明は、操作された切断ハーフドメインが、４１６位、４２２位、４４７位、４４８位、または５２５位における１つまたは複数の突然変異（配列番号５に対して番号付けされる）に加えて、４８６位における野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基がＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換えられ、４９９位における野生型Ｉｌｅ（Ｉ）残基がＬｅｕ（Ｌ）残基で置き換えられ、４９６位における野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基がＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換えられている（「ＥＬＤ」または「ＥＬＥ」）ポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。別の実施形態において、操作された切断ハーフドメインは、野生型ＦｏｋＩ切断ハーフドメイン由来であり、アミノ酸残基４１６、４２２、４４７、４４８、または５２５における１つまたは複数の突然変異に加えて、野生型ＦｏｋＩ（配列番号５）に対して番号付けされた、アミノ酸残基４９０、５３８および５３７における突然変異を含む。好ましい実施形態において、本発明は、操作された切断ハーフドメインが、４１６位、４２２位、４４７位、４４８位、または５２５位における１つまたは複数の突然変異に加えて、４９０位における野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換えられ、５３８位における野生型Ｉｌｅ（Ｉ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換えられ、５３７位における野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換えられている（「ＫＫＫ」または「ＫＫＲ」）ポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する（参照により本明細書に組み入れられるＵ．Ｓ．８，９６２，２８１を参照）。例えば、これらの開示があらゆる目的のために参照によりその全体が開示に組み入れられる米国特許第７，９１４，７９６号；８，０３４，５９８号；および８，６２３，６１８号を参照されたい。他の実施形態において、操作された切断ハーフドメインは、「Ｓｈａｒｋｅｙ」および／または「Ｓｈａｒｋｅｙ突然変異」を含む（Guo, et al. (2010) J. Mol. Biol. 400(1):96-107を参照）。

【0182】

他の実施形態において、本明細書に記載されるニッカーゼは、操作された切断ハーフドメインを含み、これは、野生型ＦｏｋＩ切断ハーフドメイン由来であり、アミノ酸残基４１６、４２２、４４７、４４８、または５２５における１つまたは複数の突然変異に加えて、野生型ＦｏｋＩまたはＦｏｋＩホモログに対して番号付けされた、アミノ酸残基４９０、および５３８における突然変異を含む。好ましい実施形態において、本発明は、操作された切断ハーフドメインが、４１６位、４２２位、４４７位、４４８位、または５２５位における１つまたは複数の突然変異に加えて、４９０位における野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換えられ、５３８位における野生型Ｉｌｅ（Ｉ）残基がＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換えられている（「ＫＫ」）ポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。他の好ましい実施形態において、本記載は、操作された切断ハーフドメインが、４１６位、４２２位、４４７位、４４８位、または５２５位における１つまたは複数の突然変異に加えて、４８６位における野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基がＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換えられ、４９９位における野生型Ｉｌｅ（Ｉ）残基がＬｅｕ（Ｌ）残基で置き換えられている（「ＥＬ」）ポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する（参照により本明細書に組み入れられる米国特許第８，０３４，５９８号を参照）。

【0183】

一部の態様において、本記載は、操作された切断ハーフドメインが、ＦｏｋＩ触媒ドメイン中の、３８７位、３９３位、３９４位、３９８位、４００位、４０２位、４１６位、４２２位、４２７位、４３４位、４３９位、４４１位、４４７位、４４８位、４６９位、４８７位、４９５位、４９７位、５０６位、５１６位、５２５位、５２９位、５３４位、５５９位、５６９位、５７０位、５７１位の１つまたは複数における野生型アミノ酸残基が突然変異されているポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。一部の実施形態において、１つまたは複数の突然変異は、野生型アミノ酸を、正電荷を有する残基から中性残基または負電荷を有する残基に変更する。これらの実施形態のいずれかにおいて、記載された突然変異体はまた、１つまたは複数の追加の突然変異を含むＦｏｋＩドメインに作製されていてもよい。好ましい実施形態において、これらの追加の突然変異は、二量体化ドメイン中、例えば４１８位、４３２位、４４１位、４８１位、４８３位、４８６位、４８７位、４９０位、４９６位、４９９位、５２３位、５２７位、５３７位、５３８位および／または５５９位にある。突然変異の非限定的な例としては、あらゆる切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩまたはＦｏｋＩのホモログ）の、３９３位、３９４位、３９８位、４１６位、４２１位、４２２位、４４２位、４４４位、４７２位、４７３位、４７８位、４８０位、５２５位または５３０位における、野生型残基のあらゆるアミノ酸残基での突然変異（例えば、置換）（例えば、Ｋ３９３Ｘ、Ｋ３９４Ｘ、Ｒ３９８Ｘ、Ｒ４１６Ｓ、Ｄ４２１Ｘ、Ｒ４２２Ｘ、Ｋ４４４Ｘ、Ｓ４７２Ｘ、Ｇ４７３Ｘ、Ｓ４７２、Ｐ４７８Ｘ、Ｇ４８０Ｘ、Ｋ５２５Ｘ、およびＡ５３０Ｘ、ここで第１の残基は、野生型を現し、Ｘは、野生型残基と置換されるあらゆるアミノ酸を指す）が挙げられる。一部の実施形態において、Ｘは、Ｅ、Ｄ、Ｈ、Ａ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、ＤまたはＮである。他の例示的な突然変異としては、Ｓ４１８Ｅ、Ｓ４１８Ｄ、Ｓ４４６Ｄ、Ｋ４４８Ａ、Ｉ４７９Ｑ、Ｉ４７９Ｔ、Ｑ４８１Ａ、Ｑ４８１Ｎ、Ｑ４８１Ｅ、Ａ５３０Ｅおよび／またはＡ５３０Ｋが挙げられ、ここでアミノ酸残基は、全長ＦｏｋＩ野生型切断ドメインおよびそのホモログに対して番号付けされている。特定の実施形態において、組合せとしては、４１６と４２２、４１６位における突然変異とＫ４４８Ａ、Ｋ４４８ＡとＩ４７９Ｑ、Ｋ４４８ＡとＱ４８１Ａ、および／またはＫ４４８Ａと５２５位における突然変異を挙げることができる。一実施形態において、４１６位における野生型残基は、Ｇｌｕ（Ｅ）残基で置き換えられていてもよく（Ｒ４１６Ｅ）、４２２位における野生型残基は、Ｈｉｓ（Ｈ）残基で置き換えられ（Ｒ４２２Ｈ）、５２５位における野生型残基は、Ａｌａ（Ａ）残基で置き換えられる。本明細書に記載される切断ドメインはさらに、これらに限定されないが、４３２位、４４１位、４８３位、４８６位、４８７位、４９０位、４９６位、４９９位、５２７位、５３７位、５３８位および／または５５９位などにおける追加の突然変異、例えば、二量体化ドメインの突然変異体（例えば、ＥＬＤ、ＫＫＲ）および／またはニッカーゼの突然変異体（触媒ドメインへの突然変異）を含んでいてもよい。本明細書に記載される突然変異を有する切断ハーフドメインは、当業界で公知のようなヘテロ二量体を形成する。

【0184】

ヌクレアーゼは、インビボで、いわゆる「スプリット酵素」技術を使用して、核酸標的部位でアセンブルが可能である（例えば米国特許公開第２００９／００６８１６４号を参照）。このようなスプリット酵素の成分は、別々の発現コンストラクトで発現されてもよいし、または１つのオープンリーディングフレーム中で連結されていてもよく、その場合、個々の成分は、例えば、自己切断２ＡペプチドまたはＩＲＥＳ配列によって分離されている。成分は、個々のジンクフィンガー結合ドメイン、またはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであり得る。

【0185】

ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮおよび／またはＴＡＬＥＮ）は、使用前に、米国特許第８，５６３，３１４号に記載されるように、例えば酵母ベースの染色体システムにおいて、活性に関してスクリーニングすることができる。

【0186】

ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮニッカーゼに加えて、またはその代わりに、ＤＮＡ編集複合体は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼを含んでいてもよい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼの非限定的な例は、米国特許第９，８４０，７１３号；９，７７０，４８９号；９，５６７，６０４号；８，９３２，８１４号；８，８８９，３５６号；８，６９７，３５９号；８，７７１，９４５号；８，７９５，９６５号；８，８６５，４０６号；８，８７１，４４５号；８，８８９，３５６号；８，８９５，３０８号；８．９０６，６１６号；８，９３２，８１４号；８，９４５，８３９号；８，９４５，８３９号；８，９９９，６４１号；１０，０００，７７２号などに記載されている。

【0187】

システムのＲＮＡ成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された等間隔にスペーサーが入った短鎖反復回文配列）遺伝子座、およびタンパク質をコードするＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Jansen, et al. (2002) Mol. Microbiol. 43:1565-1575; Makarova, et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30: 482-496; Makarova, et al. (2006) Biol. Direct 1:7; Haft, et al. (2005) PLoS Comput. Biol. 1:e60）が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムの遺伝子配列を構成する。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子、ならびに、ＣＲＩＳＰＲ媒介核酸切断の特異性をプログラミングすることが可能な非コードＲＮＡエレメントの組合せを含有する。

【0188】

ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴付けられたシステムの１つであり、４つの逐次工程で標的化されたＤＮＡ二本鎖破断を実行する。第１に、２つの非コードＲＮＡである、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡを、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写させる。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡをｐｒｅ－ｃｒＲＮＡの反復領域にハイブリダイズさせ、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡの、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのプロセシングを媒介させる。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体により、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと、標的認識のための追加の要件であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間でのワトソン－クリック塩基対合を介して、Ｃａｓ９を標的ＤＮＡに方向付ける。最後に、Ｃａｓ９が標的ＤＮＡの切断を媒介して、プロトスペーサー内に二本鎖破断を作り出す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの活性は、３つの工程、すなわち（ｉ）「適合」と呼ばれるプロセスにおける将来的な攻撃を防ぐための、ＣＲＩＳＰＲアレイへの外来（ａｌｉｅｎ）ＤＮＡ配列の挿入、（ｉｉ）関連タンパク質の発現、ならびにアレイの発現およびプロセシング、それに続いて（ｉｉｉ）外来（ａｌｉｅｎ）核酸を用いたＲＮＡ媒介干渉を含む。したがって、細菌細胞において、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のうちいくつかは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの天然の機能に関与しており、外来（ａｌｉｅｎ）ＤＮＡなどの挿入などの機能において役割を果たす。

【0189】

最初に、Ｃａｓは、ガイドＲＮＡのリボース－リン酸主鎖と広範囲に接触して、最初のＤＮＡ照合に必要な１０ｎｔのＲＮＡシード配列を事前に配列する。事前に配列したシード配列に加えて、５’－ＮＧＧ－３’ＰＡＭ認識に関与し、ガイドが欠失したアポ構造において無秩序である、Ｃａｓタンパク質のＰＡＭと相互作用する部位Ｒ１３３３およびＲ１３３５が、標的ＤＮＡとの接触が生じる前に事前に配置されていることから、ｓｇＲＮＡのローディングが、ＣａｓがＤＮＡ認識能を有する構造を形成することを可能にすることを示す。一旦ＣａｓがそのガイドＲＮＡと結合したら、複合体は、すぐに相補的標的ＤＮＡ部位をサーチできる状態になる。標的のサーチおよび認識は、２０ｎｔのスペーサー配列と標的ＤＮＡ中のプロトスペーサーとの間の相補的塩基対合と、それに加えて、標的部位に隣接する保存されたＰＡＭ配列の存在の両方を必要とする。ＰＡＭ配列は、自己および非自己配列間の識別に重要である。単一分子実験により、Ｃａｓは、可能性があるガイドＲＮＡ相補性に関して隣接ＤＮＡを照合する前に、適したＰＡＭ配列のためのプロービングによって標的ＤＮＡのサーチプロセスを開始させることが実証されている。標的認識は、３次元での衝突を介して起こり、それにおいてＣａｓは、適切なＰＡＭ配列を含有しないＤＮＡから急速に解離し、滞留時間は、適したＰＡＭが存在する場合、ガイドＲＮＡと隣接するＤＮＡとの間の相補性に依存する。一旦Ｃａｓが、適切なＰＡＭを有する標的部位を見出したら、それが、ＰＡＭと隣接する核形成部位における局所的なＤＮＡ融解と、それに続くＲＮＡ鎖侵入のきっかけとなり、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドおよびＰＡＭ近位端からＰＡＭ遠位端への置き換えられたＤＮＡ鎖（Ｒ－ループと呼ばれる）を形成する。ＰＡＭ二重鎖は、アルファヘリカル認識（ＲＥＣ）ローブ、保存されたＨＮＨを含有するヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブ、およびスプリットＲｕｖＣヌクレアーゼドメインの間の正電荷を有する溝中に置かれ、ＰＡＭを含有する非標的鎖は、主としてＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）に存在する。ＰＡＭ配列における第１の塩基は、Ｎとして表され、そのカウンターパートと塩基対合したままであるが、Ｃａｓと相互作用しない。保存されたＰＡＭのＧＧジヌクレオチドは、ＣＴＤのβ－ヘアピンに配置された２つのアルギニン残基（Ｒ１３３３およびＲ１３３５）との塩基特異的な水素結合相互作用によって、主溝中で直接読み出される。ＧＧジヌクレオチドとの塩基特異的な接触に加えて、ＣａｓのＣＴＤは、ＰＡＭを含有する非標的ＤＮＡ鎖のデオキシリボース－リン酸主鎖との多数の水素結合相互作用を生じる。しかしながら、ＣａｓとＰＡＭに相補的な標的－鎖ヌクレオチドとの間の直接の接触は観察されていない（Jiang and Doudna (2017) Annual Review of Biophysics 46:505-529）。一部の実施形態において、本発明の方法および組成物において開示されたＣａｓは、ＰＡＭ非依存性である。一部の実施形態において、上記で開示された通りのＲ１３３３およびＲ１３３５の配置は、ＰＡＭ認識を変更するための突然変異を含む（Anders, et al. (2014) Nature 513(7519):569-573）。

【0190】

一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１システムが使用される。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１システムは、フランキセラ属種で同定され、ヒト細胞においてロバストなＤＮＡ干渉を媒介するクラス２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。機能的に保存されているにもかかわらず、Ｃｐｆ１およびＣａｓ９は、それらのガイドＲＮＡおよび基質特異性を含む多くの側面で異なる（Fagerlund, et al. (2015) Genom Bio 16 :251を参照）。Ｃａｓ９とＣｐｆ１タンパク質との主要な差は、Ｃｐｆ１がｔｒａｃｒＲＮＡを利用せず、したがってｃｒＲＮＡのみを必要とすることである。ＦｎＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡは、４２～４４ヌクレオチドの長さ（１９ヌクレオチドの反復および２３～２５ヌクレオチドのスペーサー）であり、単一のステム－ループを含有しており、これが二次構造を保持する配列の変更を許容する。加えて、Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９が必要とする約１００ヌクレオチドの操作されたｓｇＲＮＡより顕著に短く、ＦｎＣｐｆｌのためのＰＡＭ要件は、置き換えられた鎖における５’－ＴＴＮ－３’および５’－ＣＴＡ－３’である。Ｃａｓ９とＣｐｆ１はどちらも標的ＤＮＡ中に二本鎖破断を作製するが、Ｃａｓ９は、そのＲｕｖＣ様およびＨＮＨ様ドメインを使用して、ガイドＲＮＡのシード配列内に平滑末端化されたカットを作製し、それに対してＣｐｆ１は、ＲｕｖＣ様ドメインを使用して、シードの外側に互い違いのカットを生産する。Ｃｐｆ１は重要なシード領域から離れて互い違いのカットを作製するため、ＮＨＥＪは、標的部位を崩壊させないと予想され、それゆえにＣｐｆ１は、所望のＨＤＲ組換え事象が起こるまで同じ部位のカットを確実に継続することができる。したがって、本明細書に記載される方法および組成物において、用語「Ｃａｓ」は、Ｃａｓ９およびＣｆｐ１タンパク質の両方を含むことが理解される。したがって、本明細書で使用されるように、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム」は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｆｐ１システムの両方を指し、両方ともヌクレアーゼ、ニッカーゼおよび／または転写因子システムを含む。

【0191】

一部の実施形態において、他のＣａｓタンパク質を使用してもよい。一部の例示的なＣａｓタンパク質としては、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａとしても公知）、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２（Ｃａｓ１３ａとしても公知）、Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ４、ＣａｓＸおよびＣａｓＹが挙げられ；さらに、操作された、および天然の、それらの変異体（Burstein, et al. (2017) Nature 542:237-241）、例えばＨＦ１／ｓｐＣａｓ９（Kleinstiver, et al. (2016) Nature 529:490-495; Cebrian-Serrano and Davies (2017) Mamm Genome 28(7):247-261）；スプリットＣａｓ９システム（Zetsche, et al. (2015) Nat Biotechnol 33(2):139-142）、インテイン－エクステインシステムベースのトランススプライスＣａｓ９（Troung, et al. (2015) Nucl Acid Res 43(13):6450-8）；ミニ－ＳａＣａｓ９（Ma, et al. (2018) ACS Synth Biol 7(4):978-985）が挙げられる。したがって、本明細書に記載される方法および組成物において、用語「Ｃａｓ」は、天然のものと操作されたものの両方の、全てのＣａｓ変異型タンパク質を含む。したがって、本明細書で使用されるように、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム」は、両方のヌクレアーゼ、ニッカーゼおよび／または転写因子システムを含む、あらゆるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを指す。

【0192】

特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質の「機能性誘導体」であり得る。天然配列のポリペプチドの「機能性誘導体」は、天然配列のポリペプチドに共通する定性的な生物学的特性を有する化合物である。「機能性誘導体」としては、これらに限定されないが、天然配列のフラグメント、ならびに対応する天然配列のポリペプチドに共通する生物学的活性をそれらが有するという条件で、天然配列のポリペプチドの誘導体およびそのフラグメントが挙げられる。本明細書において企図される生物学的活性は、ＤＮＡ基質をフラグメントに加水分解する機能性誘導体の能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列変異体、共有結合の改変体、およびそれらの融合体の両方、例えば派生的なＣａｓタンパク質を包含する。Ｃａｓポリペプチドの好適な誘導体またはそのフラグメントとしては、これらに限定されないが、Ｃａｓタンパク質の突然変異体、融合体、共有結合の改変体またはそれらのフラグメントが挙げられる。Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質またはそのフラグメント、ならびにＣａｓタンパク質の誘導体またはそのフラグメントを含み、これらは、細胞から得てもよいし、もしくは化学的に合成してもよいし、またはこれらの２つの手順の組合せによって得てもよい。細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に生産する細胞であってもよいし、またはＣａｓタンパク質を天然に生産し、より高い発現レベルで内因性Ｃａｓタンパク質を生産するように、または外因的に導入された、内因性Ｃａｓと同一または異なるＣａｓをコードする核酸からＣａｓタンパク質を生産するように遺伝子操作されている細胞であってもよい。一部の場合において、細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に生産せず、Ｃａｓタンパク質を生産するように遺伝子操作されている。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＡＡＶベクターを介したデリバリーのために、小さいＣａｓ９オーソログである（Ran, et al. (2015) Nature 510:186）。

【0193】

デリバリー
本明細書に記載されるＤＮＡ編集複合体（またはその成分分子）は、あらゆる好適な手段によって、例えばタンパク質および／またはｍＲＮＡ成分の注射などによって標的細胞にデリバリーすることができる。デリバリーは、あらゆる好適な手段を介した、単離された細胞へのデリバリーであってもよいし（これを順に、エクスビボでの細胞療法のために生きている対象に投与できる）、または生きている対象へのデリバリーであってもよい。細胞および対象への遺伝子編集分子のデリバリーは当業界において公知である。

【0194】

好適な細胞としては、これらに限定されないが、真核および原核の細胞および／または細胞株が挙げられる。このような細胞から生成した、このような細胞または細胞株の非限定的な例としては、Ｔ細胞、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＤＧ４４、ＣＨＯ－ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ－ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８－Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０－Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ２９３－Ｈ、ＨＥＫ２９３－Ｔ）、およびｐｅｒＣ６細胞、ならびに、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ）などの昆虫細胞、またはサッカロマイセス属、ピチア属およびシゾサッカロマイセス属などの真菌細胞が挙げられる。特定の実施形態において、細胞株は、ＣＨＯ－Ｋ１、ＭＤＣＫまたはＨＥＫ２９３細胞株である。また好適な細胞としては、幹細胞、例えば、一例として、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、造血幹細胞、神経幹細胞および間葉幹細胞も挙げられる。

【0195】

本明細書に記載されるタンパク質をデリバリーする方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号；６，５０３，７１７号；６，５３４，２６１号；６，５９９，６９２号；６，６０７，８８２号；６，６８９，５５８号；６，８２４，９７８号；６，９３３，１１３号；６，９７９，５３９号；７，０１３，２１９号；および７，１６３，８２４号に記載されており、これらの全ての開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。

【0196】

本明細書に記載されるＤＮＡ編集複合体はまた、成分（例えば、融合分子）の１つまたは複数をコードする配列を含有するベクターを使用してデリバリーすることもできる。加えて、追加の核酸（例えば、ドナー）も、これらのベクターを介してデリバリーすることができる。これらに限定されないが、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターなどのあらゆるベクター系を使用することができる。参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第６，５３４，２６１号；６，６０７，８８２号；６，８２４，９７８号；６，９３３，１１３号；６，９７９，５３９号；７，０１３，２１９号；および７，１６３，８２４号も参照されたい。さらに、これらのベクターのいずれもが、１つまたは複数のＤＮＡ結合タンパク質をコードする配列および／または必要に応じて追加の核酸を含んでいてもよいことが明らかであろう。したがって、本明細書に記載される１つまたは複数のＤＮＡ結合タンパク質、さらに、必要に応じて追加のＤＮＡが細胞に導入される場合、それらは、同じベクターで、または異なるベクターで運搬することができる。複数のベクターが使用される場合、各ベクターは、１つまたは複数のＤＮＡ結合タンパク質をコードする配列および要求に応じて追加の核酸を含んでいてもよい。従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子移入方法を使用して、細胞（例えば、哺乳類細胞）および標的組織に操作されたＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸を導入し、要求に応じて追加のヌクレオチド配列を共に導入することができる。このような方法はまた、インビトロで核酸（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質および／またはドナーをコードする）を細胞に投与するにも使用できる。特定の実施形態において、核酸は、インビボまたはエクスビボでの遺伝子治療での使用のために投与される。非ウイルスベクターデリバリー系としては、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、およびリポソームまたはポロキサマーなどの運搬手段と複合体化した核酸が挙げられる。ウイルスベクターデリバリー系としては、細胞へのデリバリー後、エピソームまたは統合されたゲノムのいずれかを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが挙げられる。遺伝子治療手順の総論に関して、Anderson (1992) Science 256:808-813; Nabel & Felgner (1993) TIBTECH 11:211-217; Mitani & Caskey (1993) TIBTECH 11:162-166; Dillon (1993) TIBTECH 11:167-175; Miller (1992) Nature 357:455-460; Van Brunt (1988) Biotechnology 6(10):1149-1154; Vigne (1995) Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36; Kremer & Perricaudet (1995) British Medical Bulletin 51(1):31-44; Haddada, et al, in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Boehm (eds.) (1995);およびYu, et al. (1994) Gene Therapy 1:13-26を参照されたい。

【0197】

核酸の非ウイルスデリバリーの方法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、ｍＲＮＡ、人工ビリオン、およびＤＮＡの薬剤によって強化される取り込みが挙げられる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ ２０００システム（Ｒｉｃｈ－Ｍａｒ）を使用するソノポレーションも、核酸のデリバリーに使用することができる。好ましい実施形態において、１つまたは複数の核酸がｍＲＮＡとしてデリバリーされる。翻訳効率および／またはｍＲＮＡ安定性を増加させるために、キャップされたｍＲＮＡの使用も好ましい。特に好ましくは、ＡＲＣＡ（アンチリバースキャップアナログ（ａｎｔｉ－ｒｅｖｅｒｓｅ ｃａｐ ａｎａｌｏｇ））キャップまたはその変異体である。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第７，０７４，５９６号および８，１５３，７７３号を参照されたい。

【0198】

追加の例示的な核酸デリバリー系としては、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃによって提供されるものが挙げられる（例えば米国特許第６，００８，３３６号を参照）。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号；４，９４６，７８７号；および４，８９７，３５５号）に記載されており、リポフェクション試薬は、商業的に販売されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）、およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性および中性脂肪としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際特許公開ＷＯ９１／１７４２４およびＷＯ９１／１６０２４に記載のものが挙げられる。デリバリーは、細胞へのデリバリー（エクスビボでの投与）または標的組織へのデリバリー（インビボでの投与）であり得る。

【0199】

脂質：核酸複合体の調製、例えば、標的化されたリポソーム、例えばイムノリピド（ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｉｄ）複合体などは当業者に周知である（例えば、Crystal (1995) Science 270:404-410; Blaese, et al. (1995) Cancer Gene Ther. 2:291-297; Behr, et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5:382-389; Remy, et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5:647-654; Gao, et al. (1995) Gene Therapy 2:710-722; Ahmad, et al. (1992) Cancer Res. 52:4817-4820；米国特許第４，１８６，１８３号；４，２１７，３４４号；４，２３５，８７１号；４，２６１，９７５号；４，４８５，０５４号；４，５０１，７２８号；４，７７４，０８５号；４，８３７，０２８号；および４，９４６，７８７を参照）。

【0200】

追加のデリバリーの方法としては、ＥｎＧｅｎｅＩＣデリバリー媒体（ＥｎＧｅｎｅＩＣ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｅｈｉｃｌｅ；ＥＤＶ）へのデリバリーしようとする核酸のパッケージングの使用が挙げられる。これらのＥＤＶは、抗体の一方のアームが標的組織への特異性を有し、他方のアームがＥＤＶへの特異性を有する二重特異性抗体を使用して、標的組織に特異的にデリバリーされる。抗体がＥＤＶを標的細胞表面に運び、次いでＥＤＶはエンドサイトーシスによって細胞に運ばれる。一旦細胞中に入ったら、内容物が放出される（MacDiarmid, et al. (2009) Nature Biotechnology 27(7):643を参照）。

【0201】

操作されたＤＮＡ結合タンパク質、および／またはドナー（例えばＣＡＲまたはＡＣＴＲ）をコードする核酸をデリバリーするためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースのシステムの使用は、要求に応じて、体内でウイルスを特異的な細胞に標的化し、ウイルスペイロードを核にトラフィッキングするために、高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与してもよいし（インビボで）、またはそれらは、インビトロで細胞を処置するのに使用してもよく、改変された細胞が患者に投与される（エクスビボで）。核酸をデリバリーするための従来のウイルスベースのシステムとしては、これらに限定されないが、遺伝子移入のための、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴、ワクシニアおよび単純疱疹ウイルスベクターが挙げられる。宿主ゲノム中の統合は、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスによる遺伝子移入方法を用いて可能であり、しばしばその結果として挿入された導入遺伝子の長期発現が起こる。加えて、高い形質導入効率が、多くの様々な細胞型および標的組織において観察されている。

【0202】

レトロウイルスの親和性は、外来エンベロープタンパク質を取り込むこと、標的細胞の可能な標的集団を拡張することによって変更することができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入するかまたは感染することができるレトロウイルスベクターであり、典型的には、高いウイルス力価を生じる。レトロウイルスの遺伝子移入システムの選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６～１０ｋｂの外来配列のパッケージング能力を有するシス作用性ロングターミナルリピートで構成される。最小限のシス作用性ＬＴＲが、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、次いでこれが、治療遺伝子を標的細胞に統合して、永続的な導入遺伝子発現を提供するのに使用される。広く使用されるレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組合せをベースとするものが挙げられる（例えば、Buchscher, et al. (1992) J. Virol. 66:2731-2739; Johann, et al. (1992) J. Virol. 66:1635-1640; Sommerfelt, et al. (1990) Virol. 176:58-59; Wilson, et al. (1989) J. Virol. 63:2374-2378; Miller, et al. (1991) J. Virol. 65:2220-2224；国際特許公開ＷＯ９４／２６８７７号を参照）。

【0203】

一過性発現が好ましい適用において、アデノウイルスベースのシステムを使用することができる。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。このようなベクターを用いて、高い力価および高いレベルの発現が達成されてきた。このベクターは、比較的単純なシステムで大量に生産することができる。またアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターは、例えば、インビトロでの核酸およびペプチドの生産において、さらに、インビボおよびエクスビボでの遺伝子治療手順のために、細胞を標的核酸で形質導入するのにも使用される（例えば、West, et al. (1987) Virology 160:38-47；米国特許第４，７９７，３６８号；国際特許公開ＷＯ９３／２４６４１号；Kotin (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Muzyczka (1994) J. Clin. Invest. 94:1351を参照。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Tratschin, et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260; Tratschin, et al. (1984) Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081; Hermonat & Muzyczka (1984) PNAS USA 81:6466-6470; and Samulski, et al. (1989) J. Virol. 63:03822-3828などの多数の出版物に記載されている。

【0204】

現在、少なくとも６つのウイルスベクターアプローチが、臨床治験における遺伝子移入のために利用可能であり、これらは、形質導入物質を生成するために、ヘルパー細胞株に挿入された遺伝子によって欠陥のあるベクターを補完することを含むアプローチを利用する。

【0205】

ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ－Ｓは、臨床治験において使用されてきたレトロウイルスベクターの例である（Dunbar, et al. (1995) Blood 85:3048-305; Kohn, et al. (1995) Nat. Med. 1:1017-102; Malech, et al. (1997) PNAS USA 94(22):12133-12138）。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮが遺伝子治験において使用される第１の治療ベクターであった。（Blaese, et al. (1995) Science 270:475-480）。ＭＦＧ－Ｓをパッケージングしたベクターで５０％またはそれより大きい形質導入効率が観察された。（Ellem, et al. (1997) Immunol Immunother. 44(1):10-20; Dranoff, et al. (1997) Hum. Gene Ther. 1:111-2。）

【0206】

組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠陥のある非病原性パルボウイルス２型アデノ随伴ウイルスをベースとした有望な代替遺伝子デリバリー系である。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶ１４５ｂｐ逆方向末端反復のみを保持するプラスミド由来である。形質導入される細胞のゲノムへの統合による効率的な遺伝子移入および安定な導入遺伝子デリバリーが、このベクター系の主要な特徴である。（Wagner, et al. (1998) Lancet 351(9117):1702-3, Kearns, et al. (1996) Gene Ther. 9:748-55）。他のＡＡＶ血清型、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０など、ならびにシュードタイプ化したＡＡＶ、例えばＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６も、本発明に従って使用することができる。複製欠陥性組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）を高い力価で生産でき、これは、多数の異なる細胞型に容易に感染できる。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置き換えるように操作されており、その後、複製欠損型ベクターは、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞中で増殖することができる。Ａｄベクターは、例えば非分裂性の分化細胞、例えば肝臓、腎臓および筋肉に見出されるものなどの、インビボにおいて複数のタイプの組織に形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大きい運搬容量を有する。臨床治験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注射を用いた抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド療法を含む（Sterman et al. (1998) Hum. Gene Ther. 7:1083-1089）。臨床治験における遺伝子移入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例としては、Rosenecker, et al. (1996) Infection 24(1):5-10; Sterman, et al. (1998) Hum. Gene Ther. 9(7):1083-1089; Welsh, et al. (1995) Hum. Gene Ther. 2:205-218; Alvarez, et al. (1997) Hum. Gene Ther. 5:597-613; Topf, et al. (1998) Gene Ther. 5:507-513; Sterman, et al. (1998) Hum. Gene Ther. 7:1083-1089が挙げられる。

【0207】

パッケージング細胞は、宿主細胞に感染することが可能なウイルス粒子を形成するのに使用される。このような細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子治療に使用されるウイルスベクターは、通常、ウイルス粒子に核酸ベクターをパッケージングするプロデューサー細胞株によって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージングとそれに続く宿主への統合（適切な場合）に必要な最小のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現させようとするタンパク質をコードする発現カセットで置き換えられる。失われたウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子治療で使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主ゲノムへの統合に必要なＡＡＶゲノム由来の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを所有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐをコードするがＩＴＲ配列が欠失したヘルパープラスミドを含有する細胞株中にパッケージングされる。細胞株はまた、ヘルパーとしてアデノウイルスでも感染される。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如により顕著な量でパッケージングされない。アデノウイルスでのコンタミネーションは、例えば、アデノウイルスがＡＡＶより高い感受性を有する熱処理によって、低減することができる。

【0208】

多くの遺伝子治療適用において、遺伝子治療用ベクターが、特定の組織タイプに対して高度な特異性でデリバリーされることが望ましい。したがって、ウイルスの外面上のウイルス外殻タンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現することによって、所与の細胞型に対する特異性を有するように、ウイルスベクターを改変してもよい。リガンドは、目的の細胞型に存在することがわかっている受容体に対して親和性を有するように選択される。例えば、Han, et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751は、モロニーマウス白血病ウイルスを、ｇｐ７０に融合したヒトヘレグリンを発現するように改変してもよく、組換えウイルスが、ヒト上皮増殖因子受容体を発現する特定のヒト乳がん細胞に感染することを報告した。この原理は、標的細胞が、受容体を発現し、ウイルスが、細胞表面受容体のリガンドを含む融合タンパク質を発現する他のウイルス標的細胞対にも拡張することができる。例えば、繊維状ファージは、実質的に全ての選択される細胞受容体に対する特異的な結合親和性を有する抗体フラグメント（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示するように操作されていてもよい。上記の説明は主としてウイルスベクターに適用されるが、同じ原理が非ウイルスベクターに適用することができる。このようなベクターは、特異的な標的細胞による取り込みを選好する特異的な取り込み配列を含有するように操作されていてもよい。

【0209】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのためのデリバリー方法は、上述した方法を含んでいてもよい。例えば、動物モデルにおいて、インビトロで転写された、ｍＲＮＡまたは組換えＣａｓタンパク質をコードするＣａｓは、ガラス針を使用してゲノム編集される動物の一細胞期の胎芽に直接注射することができる。インビトロにおいて細胞中でＣａｓおよびガイドＲＮＡを発現させるために、典型的には、それらをコードするプラスミドは、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを介して、細胞にトランスフェクトされる。また組換えＣａｓタンパク質は、インビトロにおいて転写されたガイドＲＮＡと複合体化されていてもよく、その場合、Ｃａｓ－ガイドＲＮＡリボ核タンパク質は、目的の細胞によって取り込まれる（Kim, et al. (2014) Genome Res 24(6):1012）。治療目的のために、ＣａｓおよびガイドＲＮＡは、ウイルスおよび非ウイルス技術の組合せによってデリバリーすることができる。例えば、ＣａｓをコードするｍＲＮＡは、ナノ粒子デリバリーを介してデリバリーしてもよく、一方でガイドＲＮＡおよびあらゆる所望の導入遺伝子または修復テンプレートは、ＡＡＶを介してデリバリーされる（Yin, et al. (2016) Nat Biotechnol 34(3):328）。

【0210】

遺伝子治療用ベクターは、インビボで、個々の患者（対象）への投与によって、典型的には、後述するように、全身投与（例えば、静脈内、腹膜内、筋肉内、真皮下、または頭蓋内への注入）または局所適用によってデリバリーすることができる。代替として、ベクターは、エクスビボで、個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）または万能ドナーの造血幹細胞などの細胞にデリバリーすることができ、それに続いて、細胞は、通常、ベクターを取り込んだ細胞の選択の後、患者に再び埋め込まれる。

【0211】

診断、調査、移植のための、または遺伝子治療（例えば、トランスフェクトされた細胞の宿主生物への再注入を介した）のための、エクスビボでの細胞トランスフェクションは当業者に周知である。好ましい実施形態において、細胞を対象生物から単離し、ＤＮＡ結合タンパク質の核酸（遺伝子またはｃＤＮＡ）でトランスフェクトし、再び対象生物（例えば、患者）に注入し戻す。エクスビボでのトランスフェクションに好適な様々な細胞型は当業者に周知である（例えば、Freshney, et al., Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994)）およびそこで引用されたどのように患者から細胞を単離し培養するかの議論に関する文献を参照）。

【0212】

一実施形態において、細胞のトランスフェクションおよび遺伝子治療のためのエクスビボの手順において、幹細胞が使用される。幹細胞を使用する利点は、幹細胞は、インビトロで他の細胞型に分化させることができること、または幹細胞は、哺乳動物（例えば細胞のドナー）に導入できることであり、その場合、幹細胞は骨髄中に植え付けられる。インビトロで、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αのようなサイトカインを使用してＣＤ３４＋細胞を臨床的に重要な免疫細胞型に分化させるための方法は、公知である（Inaba, et al. (1992) J. Exp. Med. 176:1693-1702を参照）。

【0213】

幹細胞は、公知の方法を使用して形質導入および分化のために単離される。例えば、幹細胞は、不要な細胞、例えばＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（汎Ｂ細胞）、ＧＲ－１（顆粒球）、およびＩａｄ（分化した抗原提示細胞）と結合する抗体で骨髄細胞をパニングすることによって、骨髄細胞から単離される（Inaba, et al. (1992) J. Exp. Med. 176:1693-1702を参照）。

【0214】

一部の実施形態において、改変された幹細胞も使用することができる。例えば、アポトーシスに対して耐性にされた神経幹細胞は、治療用組成物として使用することができ、この場合、幹細胞も本発明のＺＦＰ ＴＦを含有する。アポトーシスに対する耐性は、例えば、幹細胞においてＢＡＸまたはＢＡＫ特異的なＺＦＮを使用してＢＡＸおよび／またはＢＡＫをノックアウトすることによって生じさせてもよいし（米国特許第８，５９７，９１２号を参照）、またはここでも例えばカスパーゼ－６特異的なＺＦＮを使用してカスパーゼにおいて崩壊されているものによって生じさせてもよい。

【0215】

治療用ＤＮＡ結合タンパク質（またはこれらのタンパク質をコードする核酸）を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）はまた、インビボにおける細胞の形質導入のために生物に直接投与することもできる。代替として、裸のＤＮＡを投与することができる。投与は、これらに限定されないが、注射、注入、局所適用およびエレクトロポレーションなどの、血液または組織細胞との最終的な接触部位に分子を導入するために通常使用される経路のいずれかによってなされる。このような核酸の好適な投与方法が利用可能であり、当業者に周知であり、特定の組成物を投与するのに１つより多くの経路を使用できるが、特定の経路が、別の経路より迅速でより有効な反応を提供できることが多い。

【0216】

造血幹細胞へのＤＮＡ導入のための方法は、例えば米国特許第５，９２８，６３８号に開示されている。造血幹細胞、例えばＣＤ３４＋細胞への導入遺伝子の導入に有用なベクターとしては、３５型アデノウイルスが挙げられる。

【0217】

免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）への導入遺伝子の導入に好適なベクターとしては、非組み込み型レンチウイルスベクターが挙げられる。例えば、Ory, et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388; Dull, et al. (1998) J. Virol. 72:8463-8471; Zuffery, et al. (1998) J. Virol. 72:9873-9880; Follenzi, et al. (2000) Nature Genetics 25:217-222を参照されたい。

【0218】

医薬的に許容される担体は、投与される特定の組成物によっても、組成物を投与するのに使用される特定の方法によっても、部分的に決定される。したがって、後述するように、利用可能な医薬組成物の様々な好適な製剤がある（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989を参照）。

【0219】

上述したように、開示された方法および組成物は、これらに限定されないが、原核細胞、真菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳類細胞、ならびにあらゆるタイプのＴ細胞および幹細胞を含むヒト細胞などのあらゆるタイプの細胞で使用することができる。タンパク質発現のための好適な細胞株は当業者公知であり、その例としては、これらに限定されないが、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＤＧ４４、ＣＨＯ－ＤＵＸＢ１１）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８－Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０－Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ２９３－Ｈ、ＨＥＫ２９３－Ｔ）、ｐｅｒＣ６、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ）などの昆虫細胞、ならびにサッカロマイセス属、ピチア属およびシゾサッカロマイセス属などの真菌細胞が挙げられる。これらの細胞株の子孫、変異体および誘導体も使用することができる。

【0220】

適用
疾患の処置および防止における操作されたＤＮＡ塩基エディター複合体の使用は、医学における著しい発展を提供する。本明細書に記載される方法および組成物は、所望の標的部位が確実に一次的な編集場所になるように、これらの新規のツールの特異性を増加させるのに役立つ。

【0221】

本明細書に記載される組成物および方法によって処置および／または防止され得る例示的な遺伝病としては、これらに限定されないが、軟骨形成不全、色覚異常、酸性マルターゼ欠損症、アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＯＭＩＭ番号１０２７００）、副腎白質ジストロトフィー、アイカルディ症候群、アルファ－１抗トリプシン欠損症、アルファ－サラセミア、アンドロゲン不感受性症候群、アペール症候群、不整脈原性右室、異形成、血管拡張性失調症（ａｔａｘｉａ ｔｅｌａｎｇｉｃｔａｓｉａ）、バース症候群、ベータ－サラセミア、青色ゴムまり様母斑症候群、カナバン病、慢性肉芽腫性疾患（ＣＧＤ）、猫鳴き症候群、嚢胞性線維症、ダーカム病、外胚葉異形成、ファンコーニ貧血、進行性骨化性線維形成異常（ｆｉｂｒｏｄｙｓｐｌａｓｉａ ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ）、脆弱Ｘ症候群、ガラクトース血症（ｇａｌａｃｔｏｓｅｍｉｓ）、ゴーシェ病、全身性ガングリオシド沈着症（ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｅｓ）（例えば、ＧＭ１）、ヘモクロマトーシス、ベータ－グロビンの第６コドンにおけるヘモグロビンＣ突然変異（ＨｂＣ）、血友病、ハンチントン病、ハーラー症候群、低ホスファターゼ症、クラインフェルター（Ｋｌｉｎｅｆｌｅｔｅｒ）症候群、クラッベ病、ランガー－ギーディオン症候群、白血球接着不全症（ＬＡＤ、ＯＭＩＭ番号１１６９２０）、白質ジストロフィー、ＱＴ延長症候群、マルファン症候群、メビウス症候群、ムコ多糖沈着症（ＭＰＳ）、爪膝蓋骨症候群、腎性尿崩症（ｎｅｐｈｒｏｇｅｎｉｃ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｉｎｓｉｐｄｉｕｓ）、神経線維腫症、ニーマン－ピック病、骨形成不全症、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、ポルフィリン症、プラダー－ウィリー症候群、早老症、プロテウス症候群、網膜芽細胞腫、レット症候群、ルビンシュタイン－テイビ症候群、サンフイリッポ症候群、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、シュワックマン症候群、鎌状赤血球症（鎌状赤血球貧血）、スミス－マゲニス症候群、スティックラー症候群、テイ－サックス病、血小板減少橈骨欠損（ＴＡＲ）症候群、トリーチャー－コリンズ症候群、トリソミー、結節性硬化症、ターナー症候群、尿素サイクル異常症、フォンヒッペルーリンダウ病、ワーデンブルグ症候群、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウィスコット－アルドリッチ症候群、Ｘ連鎖リンパ増殖症候群（ＸＬＰ、ＯＭＩＭ番号３０８２４０）が挙げられる。

【0222】

標的化されたＤＮＡ塩基編集によって処置することができる追加の例示的な疾患としては、後天性免疫不全症、リソソーム蓄積症（例えば、ゴーシェ病、ＧＭ１、ファブリー病およびテイ－サックス病）、ムコ多糖沈着症（ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃａｈｉｄｏｓｉｓ）（例えばハンター病、ハーラー病）、異常ヘモグロビン症（例えば、鎌状赤血球症、ＨｂＣ、α－サラセミア、β－サラセミア）および血友病が挙げられる。

【0223】

このような方法はまた遺伝病を処置するための宿主における感染（ウイルスまたは細菌）の処置（例えば、ウイルスまたは細菌受容体の発現をブロックすること、それによって宿主生物における感染および／または蔓延を防止することによって）も可能にする。

【0224】

標的化された塩基編集はまた、宿主におけるウイルス感染を処置するのにも使用することができる。加えて、ウイルスのための受容体をコードする遺伝子の標的化された切断は、このような受容体の発現をブロックするのに使用でき、それによって宿主生物におけるウイルス感染および／またはウイルス蔓延を防止する。ウイルス受容体（例えば、ＨＩＶのためのＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４受容体）をコードする遺伝子の標的化変異誘発は、受容体をウイルスに結合できなくするのに使用でき、それによって新しい感染を防止し、既存の感染の蔓延をブロックする。米国特許公開第２００８／０１５９９６号を参照されたい。標的化され得るウイルスまたはウイルス受容体の非限定的な例としては、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、例えばＨＳＶ－１およびＨＳＶ－２、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＨＨＶ６およびＨＨＶ７が挙げられる。ウイルスの肝炎ファミリーとしては、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）およびＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）が挙げられる。他のウイルスまたはその受容体が標的化されてもよく、このようなものとしては、これらに限定されないが、ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルスなど）；カリチウイルス科；トガウイルス科（例えば、風疹ウイルス、デング熱ウイルスなど）；フラビウイルス科；コロナウイルス科；レオウイルス科；ビルナウイルス科；ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、狂犬病ウイルスなど）；フィロウイルス科；パラミクソウイルス科（例えば、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸系発疹ウイルスなど）；オルソミクソウイルス科（例えば、Ａ型、Ｂ型およびＣ型インフルエンザウイルスなど）；ブニヤウイルス科；アレナウイルス科；レトロウイルス科；レンチウイルス科（例えば、ＨＴＬＶ－Ｉ；ＨＴＬＶ－ＩＩ；ＨＩＶ－１（ＨＴＬＶ－ＩＩＩ、ＬＡＶ、ＡＲＶ、ｈＴＬＲなどとしても公知）ＨＩＶ－ＩＩ）；サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、インフルエンザウイルスおよびダニ媒介性脳炎ウイルスなどが挙げられる。これらのおよび他のウイルスの説明に関して、例えばVirology, 3rd Edition (W. K. Joklik ed. 1988); Fundamental Virology, 2nd Edition (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds. 1991)を参照されたい。ＨＩＶのための受容体としては、例えば、ＣＣＲ－５およびＣＸＣＲ－４が挙げられる。上述したように、本明細書に記載される組成物および方法は、遺伝子改変、遺伝子修正、および遺伝子崩壊に使用することができる。

【0225】

本明細書に記載される組成物および方法は、これらに限定されないが、体細胞突然変異の修正；ドミナントネガティブ対立遺伝子の崩壊；病原体の細胞への侵入または増殖性感染に必要な遺伝子の崩壊；組織工学の強化、例えば、機能性組織の分化または形成が促進されるように遺伝子の活性を編集することによる、組織工学の強化；および／または機能性組織の分化または形成が促進されるように、遺伝子活性を崩壊させること；例えば、幹細胞が具体的な系統経路に分化するのを促進するために分化をブロックする遺伝子を編集することによって、分化をブロックまたは誘発することをもたらす編集などの、幹細胞ベースの療法にも適用することができる。この手順のための細胞型としては、これらに限定されないが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、造血幹細胞、および胚性幹細胞が挙げられる。加えて、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を使用することができ、これはまた、患者自身の体細胞からも生成されると予想される。それゆえに、これらの幹細胞またはそれらの誘導体（分化した細胞型または組織）は、その起源または組織適合性に関係なくあらゆる人に植え付けることができる可能性がある。

【0226】

組成物および方法はまた、体細胞療法のためにも使用でき、それによってその生物学的な特性を強化するように改変された細胞のストックの生産が可能になる。このような細胞は、細胞のドナー源や受容者に対するその組織適合性とは関係なく、様々な患者に注入することができる。

【0227】

治療的な適用に加えて、本明細書に記載されるＤＮＡ編集複合体は、作物の操作、細胞株の操作および疾患モデルの構築に使用することができる。必須のヘテロ二量体切断ハーフドメインは、ヌクレアーゼ特性を改善するための直接的な手段を提供する。

【0228】

記載される操作されたＤＮＡ編集複合体は、一度での複数の標的における同時の切断を必要とする遺伝子改変プロトコールにおいても使用することができる。２つの標的における編集は、２つのＤＮＡ編集複合体の細胞発現を必要とすると予想され、好ましくは、各複合体中に、他の複合体中の切断ドメインと相互作用しない（二量体化しない）切断ドメインを含むニッカーゼを使用して達成される。

【実施例】

【0229】

実施例１
ＺＦＰの調製
特異的な標的部位に標的化されたＺＦＰは、本質的に、Urnov, et al. (2005) Nature 435(7042):646-651, Perez, et al. (2008) Nature Biotechnology 26(7): 808-816、ならびに国際特許公開ＷＯ２０１６／１８３２９８およびＷＯ２０１７／１０６５２８に記載された通りに設計され、プラスミドベクターに取り込まれる。米国特許第８，５８６，５２６号および９，８７３，８９４号に記載されるように、特異的な部位へのＴＡＬＥおよびｓｇＲＮＡも開発されている。

【0230】

塩基編集のための１つの例示的な標的は、アルファ－１抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）をコードするＳＥＲＰＩＮＡ遺伝子座である。Ａ１ＡＴタンパク質における常染色体劣性欠損を引き起こす遺伝子座における突然変異は、肝臓疾患と肺疾患の両方に関連する。ＰｉＺ突然変異は、北欧系の人において最も一般的な欠損対立遺伝子の１つであり、Ａ１ＡＴタンパク質の生産はわずか約１０～２０％である。この突然変異は、アミノ酸３４２位におけるグルタミンのリシンでの置換を生じるエクソン５における単一の突然変異によって引き起こされ、ＤＮＡ中の１０９６位におけるＧは、突然変異した遺伝子配列中ではＡである（Fregonese and Stolk (2008) Orphanet J Rare Dis 3:16に総論されている）。

【0231】

別の例示的な標的は、ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ突然変異である。別の突然変異を形成するためのＶ６１７Ｆの編集は、より低いＪＡＫ２の活性化をもたらす可能性がある。例えば、Ｖ６１７Ｌ、Ｖ６１７ＰおよびＶ６１７Ｓ突然変異は、Ｖ６１７Ｆより低い活性化であることが示されている（Dusa, et al. (2008) J Biol Chem 283(19) :12941-12948）。

【0232】

したがって、Ａ１ＡＴにおける突然変異の付近の領域を標的化するいくつかのジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）を作製した（図２を参照）。以下の表１Ａ（Ａ１ＡＴ）および表１Ｂ（ＪＡＫ２）に、ＺＦＰの設計を示す。

【表2-1】

【表2-2】

【表3】

【0233】

いくつかの異なる組合せを含む塩基エディターは、標準的なプロトコールを使用して構築される。異なる組合せは、１つまたは複数のデアミナーゼ、ヘリカーゼ、選択されたＤＮＡ結合ドメイン（ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ｓｇＲＮＡ）、ｄＣａｓ、ニッカーゼ（ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）複合体、ＵＧＩ、ＧＡＭなどを含むエディターを含む。組合せは、逐次的に融合した選択されたドメインを含む複合体を含むか、または組合せは、別々の融合タンパク質として供給される。ドメイン間に、あらゆるリンカーが使用される。

【0234】

組合せは、細胞へのトランスフェクションのため、またはインビトロでのｍＲＮＡの生産において使用するための発現コンストラクトにアセンブルされる。次いでこれらのｍＲＮＡは、当業界において公知の方法（例えば、エレクトロポレーション）で細胞に導入することができる。標的突然変異を含まない細胞は、対照として使用される。

【0235】

実施例２
アデニン塩基エディター
分子のＣ末端側において突然変異したＡ１ＡＴ ＰｉＺ突然変異を標的化したＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインに連結された緩いＰＡＭ要件を有するＣａｓ９変異体（ＳｐＣａｓ９ＶＲＶＲＦＲＲ＿Ｄ１０Ａ；Nishimasu, et al. (2018) Science 361 :1259-1262またはｘＣａｓ９、Hu, et al. (2018) Nature 556 :57-63を参照されたい）を使用してアデニン塩基エディターを構築した。隣接するＤＮＡ領域に結合するように設計された一連のＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメイン（実施例１を参照）を塩基エディターに取り込んだ（図２および７を参照）。３ＨＡペプチドおよび２つのヌクレアーゼ局在化配列（ＮＬＳ）を含むリンカーを使用して、ＺＦＰをＣａｓ９に結合させた。リンカーの配列は、ＧＴＧＧＰＫＫＫＲＫＶＹＰＹＤＶＰＤＹＡＧＹＰＹＤＶＰＤＹＡＧＳＹＰＹＤＶＰＤＹＡＧＳＡＡＰＡＡＫＫＫＫＬＤＦＥＳＥ（配列番号３）であった（Bolukbasi, et al. (2015) Nat Methods 12(12):1150-1156を参照）。次いでＣａｓ９を、Ｎ末端側で２つの大腸菌ＴａｄＡアデニンデアミナーゼ（「ｅｃＴａｄＡ」；Kim, et al. (2006) Biochemistry 45:6407-6416）に連結させた。コンストラクト中において、ＴａｄＡタンパク質の一方は野生型タンパク質であるが、他方は進化したバージョンであった（Gaudelli, et al. (2017) Nature 551 :464）。セリン－グリシンリッチなリンカーは、Ｃａｓ９とＴａｄＡサブユニットとの間に２回使用され、配列：ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳ（配列番号２）を含んでいた。図３Ａに、アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）の概略図を示す。一部の場合において、他のタイプのアデニンデアミナーゼが使用される。例えば、一部のコンストラクトにおいて、ＡＢＥ７．１０デアミナーゼまたはＡＢＥｍａｘアデニンデアミナーゼ（Koblan, et al. (2018) Nat Biotechnol. 36(9) :843-846）が使用される。

【0236】

ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ突然変異を標的化するために、突然変異部位付近のＪＡＫ２遺伝子を標的化するＣａｓ９ＮＧアデニン塩基エディターが、突然変異部位の上流に配置されたＴＡＡまたはＡＡＴまたはＡＡＡ ＰＡＭ部位を使用して作製される（図７Ａ～７Ｃを参照）。ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインは、上述したように塩基エディターに融合され、ＨＳＣ／ＰＣを編集するのに使用される。表１Ｂに、ＺＦＰ配列を示す。フィンガー間に、および／またはＺＦＰと塩基エディターとの間に、あらゆるリンカーを使用することができる。

【0237】

結果は、標的遺伝子座における成功した編集を示す。図７Ａは、アミノ酸配列中のセリン（Ｓ）またはプロリン（Ｐ）への変更を起こすための塩基編集を示す。これらの変異体はどちらも、フェニルアラニン突然変異体（Ｆ）より低い活性化であることが示される（Dusa, et al. (2008) J Biol Chem 283(19) :12941-8を参照）。

【0238】

細胞（例えば、Ｋ５６２細胞）は、塩基エディターを含む発現ベクター（例えばプラスミドまたはウイルスベクター）でトランスフェクトされるか、または細胞は、上述したような塩基エディターをコードするｍＲＮＡを使用してエレクトロポレーションされる。トランスフェクトされた細胞を回収し、ゲノムＤＮＡを単離する。目的のオンターゲットおよびオフターゲットゲノム領域を、当業界において標準的な方法に従って、ＰＣＲ増幅により増幅する。配列を、塩基編集に関して、さらにインデルの存在に関して評価する。

【0239】

アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）を、Ｋ５６２細胞において、上述したようにＡ１ＡＴ遺伝子座で試験した。ここで細胞２００，０００個当たり８００ｎｇの、塩基エディターをコードするプラスミドＤＮＡが使用された。またＺを含まないＫ５６２細胞においても実験を実行し、活性を測定する代わりとして、疾患の原因となる突然変異の近位におけるＡヌクレオチドを使用した。Ａｍａｘａデバイスを使用した（製造元のプロトコールに従って）トランスフェクションの７２時間後、細胞を回収し、Ｍｉｓｅｑ分析（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に供して、起こる可能性があったあらゆる編集を分析した。図４は、複合体の編集ウィンドウ内の標的化可能なＡ塩基を例示し、この場合、これらの配置におけるＧの存在は、Ａ塩基編集が起こったことを示すと予想される。

【0240】

変異型ＺＦＰドメインを含む各コンストラクトの３つの異なるクローンを試験した。以下の表２に結果を示す（用語「Ｃａｓ９ＶＲＶＲＦＲＲ」、「Ｃａｓ９ＶＲ」および「Ｃａｓ９ＮＧ」は同義的に使用されることに留意されたい）：

【表4-1】

【表4-2】

【0241】

「ｓｇＲＮＡ＿ｏｎｌｙ」と標識された行は、ガイドＲＮＡのみを含むものであり、「ＡＢＥ＿Ｃａｓ９ＶＲ＿Ｄ１０Ａ」は、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインが欠失した複合体である。データからわかるように、配置Ａ５におけるアデニンの標的化された編集は、ＺＦＰドメインが欠失した編集複合体と比較して、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインの一部の存在下で増加した。ＺＦＰを含まない天然ＡＢＥ－Ｃａｓ９融合コンストラクトは、約０．５％の塩基編集を起こしたが、ＡＢＥ－Ｃａｓ９－ＺＦＰ融合コンストラクトは、このデータセットにおいて、少なくとも７倍高い塩基編集効率を示した。

【0242】

これらの実験では、ＡＢＥｍａｘまたはＡＢＥ７．１０アデニンデアミナーゼに連結されたｘＣａｓまたはＣａｓ９ＮＧタンパク質を使用して研究がなされた。使用されたガイドＲＮＡは、ＴＧＴ ＰＡＭまたはＡＧＴ ＰＡＭのいずれかであった。結果は、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメイン（ＺＦＰアンカー）が欠失した塩基エディターと比較して、５から１０倍の、またはそれより高い塩基編集効率を示した。

【0243】

ＡＢＥ７．９およびＡＢＥ７．８の使用を含むアデニンデアミナーゼの代替のバージョンを使用して、さらに実験を行ったところ、同等の結果を示した。

【0244】

ＪＡＫ２ Ｖ６１７Ｆ突然変異体の塩基編集のために、実験条件は、Ｖ６１７Ｆ突然変異を含まないＫ５６２細胞において実行された実験を含む上述した条件と同じであったが、活性を測定する代わりとして、疾患の原因となる突然変異の近位におけるＡヌクレオチドを使用した。図７Ｂに、標的化されたＰＡＭ配列を示す。ＡＢＥｍａｘに連結されたｘＣａｓまたはＣａｓ９ＮＧタンパク質の様々な組合せを使用して研究を行った（例えば、図３Ｂを参照）。

【0245】

結果は、ＺＦＰアンカーの存在が、編集を改善し、ＡＡＴおよびＴＡＡ ＰＡＭ配列で活性を示すことなど、ＰＡＭ要件を緩めたことを示した。留意すべきことに、ＴＡＡ ＰＡＭ配列を有する塩基エディターは、ＺＦＰドメイン無しで、この部位において不活性である。例えば、図７Ｃで示される例示的な結果を参照されたい。

【0246】

追加の疾患関連の点突然変異に関する追加の実験が実行され、ＺＦＰアンカードメインの存在下で、より高い塩基編集特異性および／または活性が達成される。さらに、編集しようとする標的化された塩基に応じて、これらに限定されないが、ＮＡＮ（例えば、ＴＡＡ）、ＡＡＴ、ＮＧＧ（ＴＧＧ）、ＮＧＴ（例えば、ＴＧＴまたはＡＧＴ）などのあらゆるＰＡＭ配列を使用することができる。

【0247】

実施例３
シチジン塩基エディター
ＣヌクレオチドをＵに変換するためのシチジン塩基エディターは、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒性ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）タンパク質を使用して構築される（Yang, et al. (2017) J Genet Genomics 44(9):423-437）。特に、シチジン塩基エディターは、シチジンデアミナーゼ、例えばアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒性ポリペプチド１またはＡＰＯＢＥＣ－１を使用して作製される。ＡＩＣＤＡおよびＡＩＤとしても公知の、ＡＩＣＤＡ遺伝子によってコードされた活性化によって誘導されたシチジンデアミナーゼも、本明細書に記載されるシチジンデアミナーゼ塩基エディター中に含まれていてもよい。

【0248】

Ｕ：Ｇヘテロ二重鎖ＤＮＡに対する細胞の修復応答が、ＤＮＡからのＵの除去を触媒し、Ｕ：Ｇ対のＣ：Ｇ対への逆突然変異を用いた塩基除去修復を開始させるウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）の活性をもたらし、塩基編集の効率を減少させると考えられる。したがって、シチジン塩基エディターは、内因性ＵＤＧ活性をブロックするためのエディターに融合したウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）を有していてもよい（Komor, et al. (2016) Nature 533(7603):420-424）。シチジン塩基エディターは、ＡＰＯＢＥＣ１に連結されたＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインまたはＢ細胞特異的活性化によって誘導されたシチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）酵素を使用して構築される（Kescu and Adli (2016) Nat Methods 13(12):983）。シチジン塩基エディターは、ＤＮＡ結合ドメイン、例えばＺＦＰに結合されている。

【0249】

一部の実施形態において、エディターは、ＵＧＩ二量体をさらに含む（図５Ａ～５Ｆを参照）。ＵＧＩ二量体は、リンカー、例えばＬ０（ＬＲＧＳ、配列番号７６）またはＮ７ａ（ＳＧＴＰＨＥＶＧＶＹＴＬ、配列番号２８、米国特許公開第２０１７／０２１８３４９号を参照）を使用して、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインに結合されている。ＡＩＤまたはＡＰＯＢＥＣ１は、リンカー、例えばＬ０またはＳＧＧＧＬＧＳＴ（配列番号２９、Yang, et al. (2016) Nat Commun DOI:10.1038/ncomms13330）などの配列を介して、ＺＦＰに結合されている。

【0250】

シチジン塩基エディターはまた、ＵＧＩドメイン無しでも構築される。一部のエディターは、対として使用されるように構築され、この場合、１つのパートナーは、触媒的に不活性なＦｏｋＩニッカーゼドメインに連結されたＺＦＰに連結されたシチジンエディターを含む。第２のパートナーは、２つのＦｏｋハーフドメインが対合し、ニックを作り出すように作用できるように、活性なＦｏｋドメインを含む。シチジンエディタードメインは、ＵＧＩ二量体アセンブリーのように、どちらかの半分にあってもよい。

【0251】

実施例４
追加の塩基エディター
追加のＡＢＥおよび／またはＣＢＥが構築され、試験される。

【0252】

特に、（１）ＺＦＰアンカーに作動可能に連結していてもよいＣａｓ９ニッカーゼ；および（２）ＡＢＥドメイン（例えば、進化したＡＢＥドメイン）に作動可能に連結したＺＦＰを含むアデニン塩基エディターを使用して実験を実行した。例えば、図１Ｂ、下の中央のパネルを参照されたい。

【0253】

結果から、これらの塩基エディターは、疾患関連の突然変異の標的化された編集において有効であったことが示された。

【0254】

加えて、（１）ＺＦＰアンカーに作動可能に連結していてもよい単一ガイドＲＮＡに作動可能に連結したｄＣａｓ９タンパク質；（２）ＡＢＥドメイン（例えば、進化したＡＢＥドメイン）に作動可能に連結したＺＦＰ；および（３）ＺＦＮニッカーゼを含むＡＢＥ塩基エディターを用いて、実験を実行する。例えば、図１Ｃを参照されたい。

【0255】

結果から、ＺＦＮニッカーゼを含む塩基エディターは、ｄＣａｓ９塩基エディターと比較して塩基編集効率を増加させたことが示される。

【0256】

実施例５
Ｃａｓ９非含有塩基エディター
Ｃａｓ９非含有塩基エディターも構築され、評価される。コンストラクトは、上述したように使用される２つのＴａｄＡドメインを有する塩基エディターを含み、一方は、野生型であってもよく、もう一方は、進化したものであってもよく、これらは、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインに連結されていてもよい。このアセンブリーは、単独で使用されるか、または次いで触媒的に不活性なＦｏｋＩニッカーゼドメインに連結されていてもよい。活性なＦｏｋＩドメインを含む別のベクターと組み合わせて使用される場合、アデニン塩基エディターは、塩基編集の修正を防ぐためにニッキング活性を有する。図１Ｄに、作製された他の非Ｃａｓ塩基エディターを示す。

【0257】

ＤＮＡを不安定化する、または巻き戻す因子を含む非Ｃａｓ塩基エディターも構築され、上記のように試験される。ＤＮＡ不安定化因子は、ＺＦＰおよび／またはＺＦＮニッカーゼのＮまたはＣ末端に融合されるか（図１Ｄを参照）、またはＺＦＰおよび／またはニッカーゼから独立して導入される。

【0258】

特に、図１Ｄに示される塩基エディターを生成する。これらの塩基エディターは、ＺＦＰ－デアミナーゼ融合タンパク質およびＺＦＮニッカーゼを含む。加えて、これらのエディターは、その３’末端または５’末端によってＺＦＮニッカーゼのＺＦＰに連結されていてもよい、ＤＮＡ不安定化因子を含む。

【0259】

特に、１つまたは複数のＣＲＩＳＰＲタンパク質（例えば、非Ｃａｓ９タンパク質））有りまたは無しで、表Ａで示される１つまたは複数のタンパク質ＤＮＡ不安定化因子（例えば、ヘリカーゼ；ＤＳＢ修復中のＤ－ループ形成に関与する因子（例えばＲａｄ５１、Ｒａｄ５２、ＲＰＡ１、ＲＰＡ２、ＲＰＡ３など）；および／またはヘリックス不安定化タンパク質（例えばＩＣＰ８、Ｐｕｒアルファまたはウシ胸腺ＤＮＡヘリックス不安定化タンパク質）を含む塩基エディターが構築される。

【0260】

ＤＮＡ不安定化タンパク質の代替として、またはそれに加えて、１つまたは複数のペプチド核酸（ＰＮＡ）；ロックド核酸（ＬＮＡ）および／または架橋された核酸（ＢＮＡ）を含む塩基エディターが構築される。特に、１つまたは複数のヌクレオチドを含む塩基エディターが構築され、試験される。本明細書に記載されるＰＮＡおよび／またはＬＮＡを含む塩基エディターが構築される（図１Ｄおよび図８も参照）。

【0261】

Ｃａｓ９非含有塩基エディターがそれらの標的部位を編集する結果を示す。

【0262】

本明細書で述べられた全ての特許、特許出願および公報は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

【0263】

理解の明確化の目的で例証および例として開示をいくらか詳細に提供したが、本開示の本質または範囲から逸脱することなく、様々な変更および改変が実施できることは当業者には明らかであろう。したがって、前述の説明および例は、限定として解釈されるべきではない。

【図1A】

【図1B-1】

【図1B-2】

【図1B-3】

【図1C】

【図1D】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8-1】

【図8-2】

【図8-3】

【図8-4】

【配列表】

0007541508000001.app