特許 7541550 ＭＨＣ細胞受容体の標的化破壊

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-08-20

(45)【発行日】2024-08-28

(54)【発明の名称】ＭＨＣ細胞受容体の標的化破壊

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20240821BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240821BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20240821BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240821BHJP

   C12N 5/0775 20100101ALI20240821BHJP

   C12N 5/0789 20100101ALI20240821BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20240821BHJP

   C12N 5/078 20100101ALI20240821BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240821BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20240821BHJP

   A61K 35/545 20150101ALI20240821BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240821BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 110

C12N5/10 ZNA

C12N15/86 Z

C12N15/63 Z

C12N5/0775

C12N5/0789

C12N5/0783

C12N5/078

A61K35/17

A61K35/28

A61K35/545

A61P35/00

【請求項の数】 13

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2022101756

(22)【出願日】2022-06-24

(62)【分割の表示】P 2020202691の分割

【原出願日】2016-12-15

(65)【公開番号】P2022121533

(43)【公開日】2022-08-19

【審査請求日】2022-06-24

(31)【優先権主張番号】62/269,410

(32)【優先日】2015-12-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/305,097

(32)【優先日】2016-03-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/329,439

(32)【優先日】2016-04-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】508241200

【氏名又は名称】サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ゲイリー ケー． リー

(72)【発明者】

【氏名】デイビッド パッション

(72)【発明者】

【氏名】レイ ジャン

【審査官】市島 洋介

(56)【参考文献】

【文献】Cell Stem Cell，2014年，Vol. 15，pp.643-652

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＤＮＡ結合ドメインとＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系とを含む融合分子であって、
前記ＤＮＡ結合ドメインが、Ｂ２Ｍ遺伝子のエクソン１又はエクソン２に結合し、前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号１０５～１０７もしくは１１０～１１１のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む、融合分子。

【請求項2】

請求項１に記載の融合分子をコードするポリヌクレオチド。

【請求項3】

ウイルスベクター、プラスミド、又はｍＲＮＡである、請求項２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項4】

請求項１に記載の融合分子を含む単離細胞。

【請求項5】

請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む単離細胞。

【請求項6】

請求項４の前記細胞に由来する単離細胞であって、ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子の発現が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子のエクソン１又はエクソン２のＧＧＣＣＴＴＡ、ＴＣＡＡＡＴ、ＴＣＡＡＡＴＴ、ＴＴＡＣＴＧＡ及び／又はＡＡＴＴＧＡＡ内における挿入及び／又は欠失によって、前記細胞において部分的にもしくは完全に不活性化される、単離細胞。

【請求項7】

不活性化Ｔ細胞受容体遺伝子、ＰＤ１及び／又はＣＴＬＡ４遺伝子をさらに含む、請求項６に記載の単離細胞。

【請求項8】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする導入遺伝子、抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）、及び／又は工学技術で作製されたＴＣＲをコードする導入遺伝子をさらに含む、請求項６に記載の単離細胞。

【請求項9】

前記細胞が、リンパ球細胞、幹細胞、又は前駆細胞である、請求項６に記載の単離細胞。

【請求項10】

前記細胞が、Ｔ細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）又は造血幹細胞（ＨＳＣ）である、請求項９に記載の細胞。

【請求項11】

請求項６の単離細胞を含む、細胞の単離された集団。

【請求項12】

請求項１１に記載の細胞の単離された集団を含む、医薬組成物。

【請求項13】

がんを有する被験体においてがんを処置または予防するための請求項１２に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、２０１５年１２月１８日に出願された米国仮出願第６２／２６９，４１０号、２０１６年３月８日に出願された米国仮出願第６２／３０５，０９７号および２０１６年４月２９日に出願された米国仮出願第６２／３２９，４３９号の利益を主張し、これらの開示は、その全体が本明細書において参考として援用される。

【0002】

技術分野
本開示は、リンパ球および幹細胞を含むヒト細胞のゲノム改変の分野にある。

【背景技術】

【0003】

背景
遺伝子治療は、ヒト治療学の新しい時代の莫大な潜在性を秘める。これらの方法論は、標準医療行為によって対処可能ではなかった状態のための処置を可能にする。遺伝子治療は、遺伝子座の破壊もしくは補正、および導入遺伝子に融合させた特異的外因性プロモーターによって、またはゲノムへの挿入部位で見出される内因性プロモーターによって調節することができる発現可能な導入遺伝子の挿入などの、ゲノム編集技術の多くの変形を含むことができる。

【0004】

導入遺伝子の送達および挿入は、この技術のいかなる真の実施のために解決されなければならない障害物の例である。例えば、様々な遺伝子送達方法が治療的使用のために潜在的に利用可能であるが、全ては安全性、耐久性と発現レベルとの間の実質的なトレードオフを伴う。エピソームとして導入遺伝子を提供する方法（例えば、基本アデノウイルス（Ａｄ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびプラスミドをベースとした系）は一般的に安全であり、高い初期の発現レベルを得ることができるが、これらの方法は堅牢なエピソーム複製を欠き、そのことは有糸分裂が活発な組織における発現の持続時間を制限する可能性がある。対照的に、所望の導入遺伝子のランダムな組込みをもたらす送達方法（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）の組込み）はより永続的な発現を提供するが、ランダムな挿入の非標的化的性質のために、レシピエント細胞における調節されない成長を引き起こすことがあり、ランダムに組み込まれた導入遺伝子カセットの近くでのオンコジーンの活性化を通して悪性疾患をもたらすおそれがある。さらに、導入遺伝子の組込みが、複製によって駆動される喪失を回避するとしても、それは導入遺伝子に融合した外因性プロモーターの最終的なサイレンシングを防止しない。時間がたつと、そのようなサイレンシングは、大多数の非特異的挿入事象の導入遺伝子発現の低減をもたらす。さらに、導入遺伝子の組込みがあらゆる標的細胞において起こることは稀であり、そのことは、所望の治療効果を達成するために目的の導入遺伝子の十分に高い発現レベルを達成することを困難にする可能性がある。

【0005】

近年、選択されたゲノム遺伝子座への挿入を偏らせるための部位特異的ヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクタードメインヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、特異的切断をガイドするための工学技術で作製された（engineered）ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ ＲＮＡ（「シングルガイドＲＮＡ」）によるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系およびＣｆｐ１／ＣＲＩＳＰＲ系など）による切断を使用する、導入遺伝子組込みのための新しい戦略が開発された。例えば、米国特許第９，２５５，２５０号；９，０４５，７６３号；９，００５，９７３号；８，９５６，８２８号；８，９４５，８６８号；８，７０３，４８９号；８，５８６，５２６号；６，５３４，２６１号；６，５９９，６９２号；６，５０３，７１７号；６，６８９，５５８号；７，０６７，３１７号；７，２６２，０５４号；７，８８８，１２１号；７，９７２，８５４号；７，９１４，７９６号；７，９５１，９２５号；８，１１０，３７９号；８，４０９，８６１号；米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号；２００５０２０８４８９号；２００５００２６１５７号；２００５００６４４７４号；２００６００６３２３１号；２００８０１５９９９６号；２０１０００２１８２６４号；２０１２００１７２９０号；２０１１０２６５１９８号；２０１３０１３７１０４号；２０１３０１２２５９１号；２０１３０１７７９８３号；および２０１３０１７７９６０号；および２０１５００５６７０５号を参照のこと。さらに、標的化ヌクレアーゼはアルゴノート系に基づいて開発されており（例えば、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから、「ＴｔＡｇｏ」として公知、Swartsら（２０１４年）Nature ５０７巻（７４９１号）：２５８～２６１頁を参照のこと）、それは、ゲノム編集および遺伝子治療における使用のための可能性も有し得る。古典的な組込みアプローチと比較して、導入遺伝子組込みへのこのヌクレアーゼ媒介アプローチは、改善された導入遺伝子発現、安全性の増加および発現の持続性の見込みを提供するが、その理由は、それが、遺伝子サイレンシングまたは近くのオンコジーンの活性化のリスクが最小限であるために、正確な導入遺伝子の配置を可能にするからである。

【0006】

Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、Ｔ細胞の選択的活性化の必須の部分である。抗体にある程度の類似性を有して、ＴＣＲの抗原認識部分は、ヘテロダイマーを形成するように共集合する、２本鎖、αおよびβから典型的には作製されている。抗体類似性は、ＴＣＲアルファおよびベータ複合体をコードする単一の遺伝子が組み立てられている様式にある。ＴＣＲアルファ（ＴＣＲα）およびベータ（ＴＣＲβ）鎖は、それぞれ２つの領域、Ｃ末端定常領域およびＮ末端可変領域で構成されている。ＴＣＲアルファおよびベータ鎖をコードするゲノム遺伝子座は、ＴＣＲα遺伝子がＶおよびＪセグメントを含む、その一方でβ鎖遺伝子座がＶおよびＪセグメントに加えてＤセグメントを含むという点で、抗体をコードしている遺伝子座に類似している。ＴＣＲβ遺伝子座について、選択プロセスの間から選択される２つの異なる定常領域がさらにある。Ｔ細胞発生の間に種々のセグメントは、各Ｔ細胞がアルファおよびベータ鎖中に相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる固有のＴＣＲ可変部分を含むように組み換え、身体は、それらの固有のＣＤＲのために抗原提示細胞によって示される固有の抗原と相互作用することが可能であるＴ細胞の大きなレパートリーを有する。ＴＣＲαまたはβ遺伝子再編成が生じると、第２の対応するＴＣＲαまたはＴＣＲβの発現は、各Ｔ細胞が「抗原受容体対立遺伝子排除」と呼ばれるプロセスにおいて１つの固有のＴＣＲ構造だけを発現するように抑制される（Bradyら、（２０１０年）J Immunol １８５巻：３８０１～３８０８頁を参照）。

【0007】

Ｔ細胞活性化の間にＴＣＲは、抗原提示細胞の主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）上にペプチドとして示される抗原と相互作用する。ＴＣＲによる抗原ＭＨＣ複合体の認識は、Ｔ細胞刺激をもたらし、それは次にヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋）および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＤ８＋）の両方のメモリーおよびエフェクターリンパ球中での分化をもたらす。次いでこれらの細胞は、ある特定の抗原に反応することが可能である活性化亜集団を全Ｔ細胞集団内にもたらすようにクローンの様式で拡張することができる。

【0008】

ＭＨＣタンパク質は、２つのクラス、ＩおよびＩＩがある。クラスＩ ＭＨＣタンパク質は、２つのタンパク質、ＭＨＣ１クラスＩ遺伝子によってコードされる膜貫通タンパク質であるα鎖、およびＭＨＣ遺伝子クラスター内には存在しない遺伝子によってコードされる小さな細胞外タンパク質であるβ２ミクログロブリン鎖（Ｂ２Ｍと称されることもある）のヘテロダイマーである。α鎖は、３つの球状ドメイン内にフォールドし、β２ミクログロブリン鎖が会合すると、球状構造複合体は抗体複合体に類似している。外来ペプチドは、最も可変性でもある２つの最もＮ末端側のドメイン上に存在する。クラスＩＩ ＭＨＣタンパク質もヘテロダイマーであるが、しかしヘテロダイマーは、ＭＨＣ複合体内の遺伝子によってコードされる２つの膜貫通タンパク質を含む。クラスＩ ＭＨＣ：抗原複合体は、細胞傷害性Ｔ細胞と相互作用する一方で、クラスＩＩ ＭＨＣは、ヘルパーＴ細胞に抗原を提示する。さらに、クラスＩ ＭＨＣタンパク質は、ほとんど全ての核形成された細胞および血小板（およびマウスでは赤血球）において発現される傾向がある一方で、クラスＩＩ ＭＨＣタンパク質は、より選択的に発現される。典型的には、クラスＩＩ ＭＨＣタンパク質は、Ｂ細胞、一部のマクロファージおよび単球、ランゲルハンス細胞ならびに樹状細胞で発現される。

【0009】

ヒトにおいてクラスＩ ＨＬＡ遺伝子クラスターは、３つの主要な遺伝子座、Ｂ、ＣおよびＡ、ならびにいくつかのマイナーな遺伝子座（Ｅ、ＧおよびＦを含み、第６染色体上のＨＬＡ領域に全て見出される）を含む。クラスＩＩ ＨＬＡクラスターも３つの主要な遺伝子座、ＤＰ、ＤＱおよびＤＲを含み、クラスＩおよびクラスＩＩの両方の遺伝子クラスターは、その集団内でクラスＩおよびＩＩの両方の遺伝子のいくつかの異なる対立遺伝子があるという点で、多形性である。ＨＬＡ機能において同様に役割を果たすいくつかのアクセサリータンパク質もある。β－２ミクログロブリンはシャペロン（Ｂ２Ｍによってコードされ、第１５染色体に配置されている）として機能し、細胞表面上に発現されるＨＬＡ Ａ、ＢまたはＣタンパク質を安定化し、クラスＩ構造上に溝を示す抗原も安定化する。通常それは、血清および尿中で少量見出される。

【0010】

ＨＬＡは、移植片拒絶において主要な役割を果たす。移植拒絶の急性期は、約１～３週間以内に生じる場合があり、通常、ドナークラスＩおよびクラスＩＩ ＨＬＡ分子への宿主系の感作によるドナー組織への宿主Ｔリンパ球の作用を含む。多くの場合、誘発抗原はクラスＩ ＨＬＡである。最良の成功のために、ドナーはＨＬＡについて分類され、患者レシピエントに可能な限り完全に適合される。しかし、高いパーセンテージのＨＬＡ同一性を共有する可能性があるファミリーメンバー間での提供でさえ、しばしば成功しない。したがって、レシピエント内で移植組織を保つために、患者はしばしば拒絶を予防するための徹底的な免疫抑制療法に供されなければならない。そのような治療は、克服することに患者が困難さを有する場合がある日和見感染のために合併症および顕著な病的状態をもたらす場合がある。クラスＩまたはＩＩ遺伝子の制御は、一部の腫瘍の存在下で破壊される場合があり、そのような破壊は、患者の予後に因果関係を有する場合がある。例えば、Ｂ２Ｍ発現の低減は、転移性結腸直腸がんにおいて見出された（Shroutら、（２００８年）Br J Canc ９８巻：１９９９頁）。Ｂ２ＭがＭＨＣクラスＩ複合体の安定化に重要な役割を有することから、ある特定の固形がんにおけるＢ２Ｍの減少は、Ｔ細胞駆動免疫監視からの免疫エスケープの機構であると仮定された。Ｂ２Ｍ発現の低下は、正常なＩＦＮガンマＢ２Ｍ発現制御の抑制および／または遺伝ノックアウトをもたらすＢ２Ｍコード配列中の特異的変異の結果であると示されている（Shroutら、同書）。混乱させることに、Ｂ２Ｍの増加は、一部の種類のがんとも関連している。尿中のＢ２Ｍレベルの増加は、前立腺、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）および非ホジキンリンパ腫を含むいくつかのがんの予後因子として役立つ。

【0011】

養子細胞療法（ＡＣＴ）は、送達された細胞が患者のがんを攻撃し、除去するように腫瘍特異的免疫細胞を患者に送達することに基づくがん治療の発展途上の形態である。ＡＣＴは、患者自身の腫瘍塊から単離され、患者に戻して再注入するためにｅｘ ｖｉｖｏで拡張されたＴ細胞である腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の使用を伴い得る。このアプローチは、転移性メラノーマを処置することにおいて有望であり、ある研究では＞５０％の長期奏効率が観察された（例えば、Rosenbergら、（２０１１年）Clin Canc Res １７巻（１３号）：４５５０頁を参照）。ＴＩＬは、それらが腫瘍上に存在する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有する患者自身の細胞の混合セットであることから、細胞の有望な供給源である（Wuら（２０１２年）Cancer J １８巻（２号）：１６０頁）。他のアプローチは、患者の血液から単離されたＴ細胞を何らかの方法で腫瘍に応答性であるように工学技術で作製される（are engineered）ように編集することを含む（Kalosら、（２０１１年）Sci Transl Med ３巻（９５号）：９５ｒａ７３）。

【0012】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、免疫細胞が細胞表面上に発現される特異的分子標的を標的とするように設計された分子である。それらの最も基本的な形態では、それらは、細胞に導入された受容体であり、その受容体は、特異性ドメインがその標的と相互作用した場合に細胞が活性化するように、細胞の外側に発現される特異性ドメインを細胞の内側のシグナル伝達経路にカップリングさせる。しばしばＣＡＲは、ｓｃＦｖまたは一部の種類の受容体などの抗原特異的ドメインが、ＩＴＡＭおよび他の共刺激ドメインなどのシグナル伝達ドメインに融合されている、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の機能的ドメインを模倣することから作製されている。次にこれらの構築物は、ｅｘ ｖｉｖｏでＴ細胞に導入され、Ｔ細胞が標的抗原を発現する細胞の存在下で活性化されるようにし、Ｔ細胞が患者に再導入された場合に、非ＭＨＣ依存性様式での活性化Ｔ細胞による標的細胞への攻撃をもたらす（Chicaybamら（２０１１年）Int Rev Immunol ３０巻：２９４～３１１頁、Kalos、同書を参照）。それにより、工学技術で作製されたＴＣＲまたはＣＡＲを用いてｅｘ ｖｉｖｏで変更されたＴ細胞を使用する養子細胞療法は、いくつかの種類の疾患のための非常に有望な臨床アプローチである。例えば、標的化されるがんおよびそれらの抗原には、濾胞性リンパ腫（ＣＤ２０またはＧＤ２）、神経芽細胞腫（ＣＤ１７１）、非ホジキンリンパ腫（ＣＤ１９およびＣＤ２０）、リンパ腫（ＣＤ１９）、神経膠芽腫（ＩＬ１３Ｒα２）、慢性リンパ性白血病またはＣＬＬならびに急性リンパ性白血病またはＡＬＬ（両方ともＣＤ１９）が含まれる。ウイルス特異的ＣＡＲもＨＩＶなどのウイルスを有する細胞を攻撃するために開発された。例えば臨床試験は、ＨＩＶの処置のためにＧｐ１００に特異的なＣＡＲを使用して開始された（Chicaybam、同書）。

【0013】

ＡＣＴＲ（抗体結合Ｔ細胞受容体）は、外因性に供給された抗体に結合可能である工学技術で作製されたＴ細胞構成成分である。ＡＣＴＲ構成成分への抗体の結合は、抗体によって認識される抗原と相互作用するようにＴ細胞を備えさせ、抗原に遭遇すると、ＡＣＴＲを含むＴ細胞は、抗原と相互作用するようになる（米国特許出願公開第２０１５０１３９９４３号を参照）。
しかし養子細胞療法の欠点の１つは、移植された細胞の潜在的拒絶を回避するために細胞産物の供給源が患者特異的（自己）でなければならないことである。このことがこの拒絶を回避するために研究者に患者自身のＴ細胞を編集する方法を開発させた。例えば、患者のＴ細胞または造血幹細胞は、工学技術で作製されたＣＡＲ、ＡＣＴＲおよび／またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の付加によりｅｘ ｖｉｖｏで操作することができ、次にＰＤ１および／またはＣＴＬＡ４などのＴ細胞チェックポイントインヒビターをノックアウトするために工学技術で作製されたヌクレアーゼによりさらに処置することができる（ＰＣＴ公開ＷＯ２０１４／０５９１７３を参照）。より大きな患者集団へのこの技術の応用のために、細胞（同種）の汎用性集団を開発することは有利である。さらにＴＣＲのノックアウトは、患者に導入されても移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）応答を開始することができない細胞をもたらす。
したがって、ＭＨＣ遺伝子発現を改変（例えば、Ｂ２Ｍをノックアウト）し、および／またはＴ細胞でのＴＣＲ発現をノックアウトするために使用することができる方法および組成物の必要性がまだある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0014】

【文献】米国特許第９，２５５，２５０号明細書

【文献】米国特許第９，０４５，７６３号明細書

【文献】米国特許第９，００５，９７３号明細書

【文献】米国特許第８，９５６，８２８号明細書

【文献】米国特許第８，９４５，８６８号明細書

【文献】米国特許第８，７０３，４８９号明細書

【文献】米国特許第８，５８６，５２６号明細書

【文献】米国特許第６，５３４，２６１号明細書

【文献】米国特許第６，５９９，６９２号明細書

【文献】米国特許第６，５０３，７１７号明細書

【文献】米国特許第６，６８９，５５８号明細書

【文献】米国特許第７，０６７，３１７号明細書

【文献】米国特許第７，２６２，０５４号明細書

【文献】米国特許第７，８８８，１２１号明細書

【文献】米国特許第７，９７２，８５４号明細書

【文献】米国特許第７，９１４，７９６号明細書

【文献】米国特許第７，９５１，９２５号明細書

【文献】米国特許第８，１１０，３７９号明細書

【文献】米国特許第８，４０９，８６１号明細書

【文献】米国特許出願公開第２００３／０２３２４１０号明細書

【文献】米国特許出願公開第２００５／０２０８４８９号明細書

【文献】米国特許出願公開第２００５／００２６１５７号明細書

【文献】米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号明細書

【文献】米国特許出願公開第２００６／００６３２３１号明細書

【文献】米国特許出願公開第２００８／０１５９９９６号明細書

【文献】米国特許出願公開第２０１０／００２１８２６４号明細書

【文献】米国特許出願公開第２０１２／００１７２９０号明細書

【文献】米国特許出願公開第２０１１／０２６５１９８号明細書

【文献】米国特許出願公開第２０１３／０１３７１０４号明細書

【文献】米国特許出願公開第２０１３／０１２２５９１号明細書

【文献】米国特許出願公開第２０１３／０１７７９８３号明細書

【文献】米国特許出願公開第２０１３／０１７７９６０号明細書

【文献】米国特許出願公開第２０１５／００５６７０５号明細書

【文献】米国特許出願公開第２０１５／０１３９９４３号明細書

【非特許文献】

【0015】

【文献】Swartsら（２０１４年）Nature ５０７巻（７４９１号）：２５８～２６１頁

【文献】Bradyら、（２０１０年）J Immunol １８５巻：３８０１～３８０８頁

【文献】Shroutら、（２００８年）Br J Canc ９８巻：１９９９頁

【文献】Rosenbergら、（２０１１年）Clin Canc Res １７巻（１３号）：４５５０頁

【文献】Wuら（２０１２年）Cancer J １８巻（２号）：１６０頁

【文献】Kalosら、（２０１１年）Sci Transl Med ３巻（９５号）：９５ｒａ７３

【文献】Chicaybamら（２０１１年）Int Rev Immunol ３０巻：２９４～３１１頁

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0016】

概要
本明細書で、Ｂ２Ｍ遺伝子の部分的なまたは完全な不活性化または破壊のための組成物および方法、ならびに内因性ＴＣＲおよび／またはＢ２Ｍの破壊後もしくは破壊と同時のＴリンパ球における外因性ＴＣＲ、ＣＡＲまたはＡＣＴＲ導入遺伝子の導入および所望のレベルでの発現のための組成物および方法が開示される。さらに、本明細書で、ＨＬＡクラスＩヌルＴ細胞、幹細胞、組織または生物全体、例えばその表面に１つまたは複数のＨＬＡ受容体を発現しない細胞、を産生するためにＢ２Ｍ遺伝子を欠失させる（不活性化する）または抑制するための方法および組成物が提供される。ある特定の実施形態ではＨＬＡヌル細胞または組織は、移植における使用のために有利であるヒト細胞または組織である。好ましい実施形態ではＨＬＣヌルＴ細胞は、養子Ｔ細胞療法における使用のために調製される。

【0017】

一態様では本明細書で、ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子の発現がＢ２Ｍ遺伝子のエクソン１またはエクソン２の改変によってモジュレートされる、単離細胞（例えば、リンパ系細胞、幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ、胚性幹細胞、ＭＳＣまたはＨＳＣ）または前駆細胞を含む哺乳動物細胞などの真核細胞）が、記載される。ある特定の実施形態では改変は、配列番号６～４８および／または１３７～２０５の１つもしくは複数に示される配列；配列番号６～４８または１３７～２０５のいずれかの側（隣接ゲノム配列）の１～５塩基対内、１～１０塩基対内もしくは１～２０塩基対内；またはＧＧＣＣＴＴＡ、ＴＣＡＡＡＴ、ＴＣＡＡＡＴＴ、ＴＴＡＣＴＧＡおよび／またはＡＡＴＴＧＡＡ内にある。改変は、機能的ドメイン（例えば、転写制御ドメイン、ヌクレアーゼドメイン）およびＤＮＡ結合ドメインを含む外因性融合分子によってであってよく：（ｉ）配列番号６～４８および／または１３７～２０５のいずれかに示す標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメインおよび、転写因子がＢ２Ｍ遺伝子発現を改変する転写制御ドメインを含む外因性転写因子を含む細胞、ならびに／あるいは（ｉｉ）配列番号６～４８および／または１３７～２０５の１つまたは複数の中；配列番号６～４８および／または１３７～２０５のいずれかの側（隣接ゲノム配列）の１～５塩基対内、１～１０塩基対内もしくは１～２０塩基対内；またはＧＧＣＣＴＴＡ、ＴＣＡＡＡＴ、ＴＣＡＡＡＴＴ、ＴＴＡＣＴＧＡおよび／またはＡＡＴＴＧＡＡ内に挿入ならびに／もしくは欠失を含む細胞を限定されずに含む。細胞は、さらなる改変、例えば不活性化Ｔ細胞受容体遺伝子、ＰＤ１および／またはＣＴＬＡ４遺伝子および／またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする導入遺伝子（a transgene a transgene）、抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）をコードする導入遺伝子および／または抗体をコードする導入遺伝子を含むことができる。本明細書に記載される任意の細胞を含む医薬組成物ならびに被験体における障害（例えば、がん）の処置のためにｅｘ ｖｉｖｏ治療での細胞および医薬組成物を使用する方法も提供される。

【0018】

したがって一態様では、本明細書でＢ２Ｍ遺伝子の発現がモジュレート（例えば、活性化、抑制または不活性化）される細胞が記載される。好ましい実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子のエクソン１またはエクソン２は、モジュレートされる。モジュレーションは、Ｂ２Ｍ遺伝子に結合し、Ｂ２Ｍ発現を制御する外因性分子（例えば、ＤＮＡ結合ドメインおよび、転写活性化または抑制ドメインを含む工学技術で作製された転写因子）によって、ならびに／またはＢ２Ｍ遺伝子の配列改変（例えば、Ｂ２Ｍ遺伝子を切断し、挿入および／または欠失によって遺伝子配列を改変するヌクレアーゼを使用すること）を介してであってよい。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のさらなる遺伝子の発現もモジュレートされる（例えば、ＴＣＲＡ遺伝子などのＴＣＲ遺伝子）。一部の実施形態では、クラスＩ ＨＬＡ複合体が不安定化されるようなＢ２Ｍ遺伝子のノックアウトを引き起こす工学技術で作製されたヌクレアーゼを含む細胞が記載される。好ましい実施形態では、クラスＩ ＨＬＡの不安定化は、細胞の表面上でのクラスＩ ＨＬＡ複合体顕著な減少を生じる。他の実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子の発現がモジュレートされるように外因性分子、例えば工学技術で作製された転写因子（ＴＦ）を含む細胞が記載される。一部の実施形態では、細胞はＴ細胞である。Ｂ２Ｍ遺伝子の発現がモジュレートされる細胞がさらに記載され、ここで細胞は少なくとも（a least）１つの外因性導入遺伝子もしくは少なくとも１つの内因性遺伝子のさらなるノックアウトまたはこれらの組合せを含むようにさらに工学技術で作製される。外因性導入遺伝子は、ＴＣＲ遺伝子に組み込まれてよく（例えば、ＴＣＲ遺伝子がノックアウトされる場合）、Ｂ２Ｍ遺伝子に組み込まれてよく、および／またはセーフハーバー遺伝子座などの非ＴＣＲ、非Ｂ２Ｍ遺伝子座に組み込まれてよい。一部の場合では外因性導入遺伝子は、ＡＣＴＲ、工学技術で作製されたＴＣＲおよび／またはＣＡＲをコードする。導入遺伝子構築物は、ＨＤＲまたはＮＨＥＪによって駆動されるプロセスによって挿入することができる。一部の態様ではＢ２Ｍ発現がモジュレートされている細胞は、それらの細胞表面上の重要なクラスＩ ＨＬＡを欠いており、少なくとも外因性ＡＣＴＲおよび／または外因性ＣＡＲをさらに含む。Ｂ２Ｍモジュレーターを含む一部の細胞は、１つまたは複数のチェックポイントインヒビター遺伝子のノックアウトをさらに含む。一部の実施形態では、チェックポイントインヒビターはＰＤ１である。他の実施形態ではチェックポイントインヒビターはＣＴＬＡ４である。さらなる態様では、Ｂ２Ｍモジュレート細胞は、ＰＤ１ノックアウトおよびＣＴＬＡ４ノックアウトを含む。一部の実施形態では、細胞はＴＣＲ遺伝子でさらに改変されている。一部の実施形態ではモジュレートされるＴＣＲ遺伝子は、ＴＣＲβ（ＴＣＲＢ）をコードする遺伝子である。一部の実施形態ではこれは、この遺伝子（ＴＣＲβ定常領域、またはＴＲＢＣ）の定常領域の標的化切断を介して達成される。ある特定の実施形態ではモジュレートされるＴＣＲ遺伝子は、ＴＣＲα（ＴＣＲＡ）をコードする遺伝子である。さらなる実施形態では挿入は、ＴＣＲα遺伝子の定常領域（本明細書で「ＴＲＡＣ」配列と呼ばれる）の標的化切断を含む、ＴＣＲ遺伝子の定常領域の標的化切断を介して達成される。一部の実施形態ではＢ２Ｍ遺伝子改変細胞は、ＴＣＲ遺伝子、ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ遺伝子もしくはＴＡＰ遺伝子またはこれらの任意の組合せでさらに改変される。他の実施形態では、ＨＬＡクラスＩＩ、ＣＴＩＩＡのための制御因子も改変される。

【0019】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子への改変（例えば、エクソン１またはエクソン２の改変）（例えば、欠失および／または挿入、Ｂ２Ｍを抑制するための工学技術で作製されたＴＦの結合）を含む。ある特定の実施形態では改変は、配列番号６～４８および／または１３７～２０５の改変であり、これらの配列のいずれかの中、および／またはＢ２Ｍ遺伝子中のこれらの配列に隣接する遺伝子（ゲノム）配列の１～５０塩基対（１～５、１～１０または１～２０塩基対などのこれらの間の任意の値を含む）の中の１つまたは複数のヌクレオチドへの結合、切断、挿入および／または欠失による改変を含む。ある特定の実施形態では細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子内（例えば、エクソン１および／またはエクソン２、図１を参照）の以下の配列：ＧＧＣＣＴＴＡ、ＴＣＡＡＡＴＴ、ＴＣＡＡＡＴ、ＴＴＡＣＴＧＡおよび／またはＡＡＴＴＧＡＡ、の１つまたは複数の中の改変（それへの結合、切断、挿入および／または欠失）を含む。ある特定の実施形態では改変は、Ｂ２Ｍ発現がモジュレート、例えば抑制または活性化されるような、本明細書に記載される工学技術で作製されたＴＦの結合を含む。他の実施形態では改変は、ヌクレアーゼ（複数可）結合（標的）および／または切断部位（複数可）でのまたはその近くでの遺伝子改変（ヌクレオチド配列の変更）であり、切断および／もしくは結合部位の上流、下流ならびに／またはその部位（複数可）の１つもしくは複数の塩基対を含む１～３００（またはこれらの間の任意の数の塩基対）塩基対内の配列への改変；結合および／もしくは切断部位（複数可）のいずれかの側を含むならびに／または該いずれかの側の１～１００塩基対（またはこれらの間の任意の数の塩基対）内の改変；結合および／もしくは切断部位（複数可）のいずれかの側（例えば、１から５、１から１０、１から２０またはそれより多い塩基対）を含むならびに／または該いずれかの側の１から５０塩基対（またはこれらの間の任意の数の塩基対）内の改変；ならびに／またはヌクレアーゼ結合部位および／または切断部位内の１つまたは複数の塩基対への改変、を限定されずに含む。ある特定の実施形態では改変は、配列番号６～４８または１３７～２０５のいずれかの周囲のＢ２Ｍ遺伝子配列においてまたはその近くにおいて（例えば、１～３００、１～５０、１～２０、１～１０もしくは１～５またはより多くの）塩基対またはそれらの間の任意の数の塩基対）である。ある特定の実施形態では改変は、配列番号６から４８もしくは１３７から２０５に示す配列の１つまたは複数の内の、あるいはＢ２Ｍ遺伝子のＧＧＣＣＴＴＡ、ＴＣＡＡＡＴＴ、ＴＣＡＡＡＴ、ＴＴＡＣＴＧＡおよび／またはＡＡＴＴＧＡＡ（例えば、エクソン１および／またはエクソン２）内のＢ２Ｍ遺伝子の改変、例えばこれらの配列の１つまたは複数への１つもしくは複数の塩基対の改変を含む。ある特定の実施形態ではヌクレアーゼ媒介遺伝子改変は、対合した標的部位間である（二量体が標的を切断するために使用される場合）。ヌクレアーゼ媒介遺伝子改変は、任意の長さの非コード配列および／もしくは任意の長さの導入遺伝子の挿入、ならびに／または１塩基対から１０００ｋｂ超（または１～１００塩基対、１～５０塩基対、１～３０塩基対、１～２０、１～１０もしくは１～５塩基対を限定されずに含む、これらの間の任意の値）の欠失を含む、任意の数の塩基対の挿入および／もしくは欠失を含むことができる。

【0020】

本発明の改変細胞は、リンパ系細胞（例えば、Ｔ細胞）、幹／前駆細胞（例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞（例えばヒトＥＳ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または造血幹細胞（ＨＳＣ）であってよい。幹細胞は、全能性または多能性（例えば、多能性骨髄性またはリンパ球系幹細胞であるＨＳＣなど、部分的に分化している）であってよい。他の実施形態では、本発明は、ＨＬＡ発現についてヌル表現型を有する細胞を産生するための方法を提供する。本明細書に記載されるいずれの改変幹細胞（Ｂ２Ｍ遺伝子座で改変された）は、次に本明細書に記載される幹細胞由来の分化した（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ）細胞を生成するために分化されてよい。本明細書に記載されるいずれかの改変幹細胞は、目的の他の遺伝子（例えばＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４など）にさらなる改変を含むことができる。

【0021】

別の態様では、本明細書に記載される組成物（改変細胞）および方法は、例えば障害の処置または予防または改善において使用することができる。典型的には方法は、（ａ）ヌクレアーゼ（例えばＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ）もしくは工学技術で作製されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ ＲＮＡを用いるＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＣｆｐ１／ＣＲＩＳＰＲなどのヌクレアーゼ系を使用して、またはＢ２Ｍ遺伝子が不活性化されるもしくはダウンモジュレートされるように工学技術で作製された転写因子（例えばＺＦＮ－ＴＦ、ＴＡＬＥ－ＴＦ、Ｃｆｐ１－ＴＦまたはＣａｓ９－ＴＦ）を使用して、単離細胞（例えばＴ細胞またはリンパ球）中の内因性Ｂ２Ｍ遺伝子を切断するまたは下方制御すること；ならびに（ｂ）細胞を被験体に導入し、それにより障害を処置することまたは予防することを含む。

【0022】

一部の実施形態では、ＴＣＲα（ＴＣＲＡ）および／またはＴＣＲβ（ＴＣＲＢ）をコードする遺伝子もまた不活性化されるまたはダウンモジュレートされる。一部の実施形態では不活性化は、本遺伝子の定常領域（ＴＣＲβ定常領域、またはＴＲＢＣ）の標的化切断を介して達成される。好ましい実施形態では、ＴＣＲα（ＴＣＲＡ）をコードする遺伝子は、不活性化またはダウンモジュレートされる。さらに好ましい実施形態では、障害は、がんまたは感染性疾患である。さらに好ましい実施形態では不活性化は、本遺伝子の定常領域（ＴＣＲα定常領域、ＴＲＡＣと略される）の標的化切断を介して達成される。

【0023】

転写因子および／またはヌクレアーゼ（複数可）は、ｍＲＮＡとして、タンパク質形態でおよび／またはヌクレアーゼ（複数可）をコードするＤＮＡ配列として細胞に導入することができる。ある特定の実施形態では、被験体に導入される単離細胞は、さらなるゲノム改変、例えば、組み込まれた外因性配列（切断されたＢ２Ｍ、ＴＣＲ遺伝子または他の遺伝子、例えばセーフハーバー遺伝子もしくは遺伝子座に）および／またはさらなる遺伝子、例えば１つもしくは複数のＨＬＡおよび／またはＴＡＰ遺伝子の不活性化（例えば、ヌクレアーゼ媒介）をさらに含む。外因性配列は、ベクター（例えばＡｄ、ＡＡＶ、ＬＶ）を介して、または電気穿孔などの技法を使用することによって導入することができる。一部の実施形態ではタンパク質は、細胞圧縮（ｃｅｌｌ ｓｑｕｅｅｚｉｎｇ）によって細胞に導入される（Kollmannspergerら（２０１６年）Nat Comm ７巻、10372頁 doi:10.1038/ncomms10372を参照）。一部の態様では組成物は、単離細胞断片および／または分化した（部分的にまたは完全に）細胞を含んでよい。

【0024】

一部の態様では成熟細胞は、細胞療法、例えば養子細胞移入のために使用することができる。他の実施形態では、Ｔ細胞移植における使用のための細胞は、目的の別の遺伝子改変を含有する。一態様ではＴ細胞は、がんマーカーに特異的な、挿入されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含有する。さらなる態様では挿入されたＣＡＲは、Ｂ細胞悪性腫瘍に特徴的なＣＤ１９マーカーに対して特異的である。そのような細胞は、適合するＨＬＡを有さない患者を処置するための治療用組成物において有用であり、そのため、それを必要とする任意の患者のための「既製の」治療剤として使用可能である。

【0025】

別の態様ではＢ２Ｍモジュレート（改変）Ｔ細胞は、挿入された抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）ドナー配列を含有する。一部の実施形態ではＡＣＴＲドナー配列は、ヌクレアーゼ誘導切断に続いてＢ２ＭまたはＴＣＲ遺伝子の発現を妨害するようにその遺伝子に挿入される。他の実施形態ではドナー配列は、ＡＡＶＳ１、ＨＰＲＴ、アルブミンおよびＣＣＲ５遺伝子などの「セーフハーバー」遺伝子座に挿入される。一部の実施形態ではＡＣＴＲ配列は、ＡＣＴＲドナー配列が工学技術で作製されたヌクレアーゼの切断部位に隣接する配列に相同性を有する隣接相同アームを含む、標的化組み込みを介して挿入される。一部の実施形態ではＡＣＴＲドナー配列は、プロモーターおよび／または他の転写制御配列をさらに含む。他の実施形態では、ＡＣＴＲドナー配列はプロモーターを欠いている。一部の実施形態ではＡＣＴＲドナーは、ＴＣＲβコード遺伝子（ＴＣＲＢ）に挿入される。一部の実施形態では、挿入は、この遺伝子（ＴＣＲβ定常領域またはＴＲＢＣ）の定常領域の標的化切断を介して達成される。好ましい実施形態では、ＡＣＴＲドナーはＴＣＲαコード遺伝子（ＴＣＲＡ）に挿入される。さらに好ましい実施形態では、挿入はこの遺伝子の定常領域（ＴＣＲα定常領域、ＴＲＡＣと省略される）の標的化切断を介して達成される。一部の実施形態ではドナーは、ＴＣＲＡ中のエクソン配列に挿入され、一方、他のものではドナーは、ＴＣＲＡ中のイントロン配列に挿入される。一部の実施形態ではＴＣＲモジュレート細胞は、ＣＡＲをさらに含む。なおさらなる実施形態ではＢ２Ｍモジュレート細胞は、ＨＬＡ遺伝子またはチェックポイントインヒビター遺伝子でさらにモジュレートされる。

【0026】

本明細書に記載される改変細胞（例えば、不活性化Ｂ２Ｍ遺伝子を有するＴ細胞または幹細胞）を含む医薬組成物、または本明細書に記載される１つもしくは複数のＢ２Ｍ結合分子（例えば、工学技術で作製された転写因子および／またはヌクレアーゼ）を含む医薬組成物も提供される。ある特定の実施形態では医薬組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。改変細胞、Ｂ２Ｍ結合分子（またはこれらの分子をコードするポリヌクレオチド）および／またはこれらの細胞もしくは分子を含む医薬組成物は、当技術分野において公知の方法を介して、例えば静脈内注入、肝動脈などの特定の血管への注入を通じて、また直接組織注射（例えば筋肉）を通じて被験体に導入される。一部の実施形態では被験体は、組成物を用いて処置または改善させることができる疾患または状態を有する成人である。他の実施形態では被験体は、組成物が疾患または状態（例えば、がん、移植片対宿主病など）を予防、処置または改善させるために投与される小児被験体である。

【0027】

一部の態様では、組成物（ＡＣＴＲを含むＢ２Ｍモジュレート細胞）は、外因性抗体をさらに含む。米国特許出願第１５／３５７，７７２号を参照。一部の態様では抗体は、ＡＣＴＲを含むＴ細胞を備えて状態を予防または処置するために有用である。一部の実施形態では抗体は、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ－７２、ＣＡＩＸ、ＰＳＭＡ、葉酸結合抗体、ＣＤ１９、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ３、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、αＶβ３およびα５β１インテグリン、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＴＬＡ４およびエナシン（enascin）などの腫瘍細胞に関連するまたはがん関連プロセスに関連する抗原を認識する（Scottら（２０１２年）Nat Rev Cancer １２巻：２７８頁）。他の実施形態では抗体は、ＨＩＶ、ＨＣＶなどのような感染性疾患に関連する抗原を認識する。

【0028】

別の態様では、本明細書でＢ２Ｍ遺伝子中の標的部位に結合するＢ２Ｍ ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥおよびｓｇＲＮＡ）が提供される。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、表１の１つの行に示す順序で認識ヘリックス領域を有するＺＦＰ；表２の１つの行に示すＲＶＤを有するＴＡＬエフェクタードメインＤＮＡ結合タンパク質；および／または表２Ａの１つの行に示すｓｇＲＮＡ、を含む。これらのＤＮＡ結合タンパク質は、Ｂ２Ｍ発現をモジュレートする工学技術で作製された転写因子を形成するように転写制御ドメインと会合することができる。代替的に、これらのＤＮＡ結合タンパク質は、Ｂ２Ｍ遺伝子に結合し切断する、工学技術で作製されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮおよび／または、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を形成するように、１つまたは複数のヌクレアーゼドメインと会合し得る。ある特定の実施形態では、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、ヒトＢ２Ｍ遺伝子中の標的部位に結合する。転写因子またはヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ｓｇＲＮＡ）は、配列番号６～４８または１３７～２０５のいずれかの９、１０、１１ １２またはそれより多い（例えば、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれより多い）ヌクレオチドを含むＢ２Ｍ遺伝子の標的部位に結合することができる。ジンクフィンガータンパク質は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれより多いジンクフィンガーを含む場合があり、各ジンクフィンガーは標的遺伝子中の標的サブサイトと特異的に接触する認識ヘリックスを有する。ある特定の実施形態では、例えば表１に示す通り、ジンクフィンガータンパク質は、４つまたは５つまたは６つのフィンガー（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５およびＦ６と呼ばれ、Ｎ末端からＣ末端にＦ１からＦ４またはＦ５またはＦ６の順）を含む。他の実施形態では、単一ガイドＲＮＡまたはＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインは、配列番号６～４８または１３７～２０５のいずれかに示される標的部位（または配列番号６～４８のいずれかの中の１２もしくはそれより多い塩基対）に結合することができる。例示的ｓｇＲＮＡ標的部位は、配列番号１６～４８に示され、例示的ＴＡＬＥＮ結合部位は、表２Ｂ（配列番号１３７～２０５）に示される。さらなるＴＡＬＥＮは、米国特許第８，５８６，５２６号および第９，４５８，２０５号に記載されるカノニカルなまたは非カノニカルなＲＶＤを使用して、本明細書に記載される部位を標的化するように設計することができる。本明細書に記載されるヌクレアーゼ（ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはｓｇＲＮＡ ＤＮＡ結合ドメインを含む）は、配列番号６～４８または１３７～２０５のいずれかを含むＢ２Ｍ遺伝子内に遺伝子改変を作製することが可能であり、これらの配列（配列番号６～４８または１３７～２０５）のいずれかの中の改変（挿入および／または欠失）ならびに／または配列番号６～４８もしくは１３７～２０５に示される標的部位配列に隣接するＢ２Ｍ遺伝子配列への改変、例えば以下の配列：ＧＧＣＣＴＴＡ、ＴＣＡＡＡＴＴ、ＴＣＡＡＡＴ、ＴＴＡＣＴＧＡおよび／またはＡＡＴＴＧＡＡの１つまたは複数の中のＢ２Ｍ遺伝子のエクソン１／またはエクソン２内の改変を含む。

【0029】

Ｂ２Ｍ遺伝子のエクソン１もしくはエクソン２に結合するＤＮＡ結合ドメインおよび転写制御ドメインまたはヌクレアーゼドメインを含む融合分子であって、ＤＮＡ結合ドメインが表１の１つの行に示すジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、表２Ｂの１つの行に示すＴＡＬＥエフェクタータンパク質または表２Ａの１つの行に示す単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む、融合分子も提供される。

【0030】

本明細書に記載されるいずれのタンパク質も、切断ドメインおよび／または切断半ドメイン（例えば、野生型または工学技術で作製されたＦｏｋＩ切断半ドメイン）をさらに含むことができる。それにより、本明細書に記載されるいずれのヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）においても、ヌクレアーゼドメインは、野生型ヌクレアーゼドメインまたはヌクレアーゼ半ドメイン（例えば、ＦｏｋＩ切断半ドメイン）を含むことができる。他の実施形態ではヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ）は、工学技術で作製されたヌクレアーゼドメインまたは半ドメイン、例えば偏性ヘテロダイマー（obligate heterodimer）を形成する、工学技術で作製されたＦｏｋＩ切断半ドメインを含む。例えば米国特許出願公開第２００８０１３１９６２号を参照。

【0031】

別の態様では本開示は、本明細書に記載されるタンパク質、融合分子および／またはその構成成分のいずれかをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｓｇＲＮＡまたは他のＤＮＡ結合ドメイン）を提供する。ポリヌクレオチドは、ウイルスベクター、非ウイルスベクター（例えば、プラスミド）の一部またはｍＲＮＡ形態であってよい。本明細書に記載されるいずれのポリヌクレオチドも、Ｂ２Ｍ、ＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ遺伝子への標的化挿入のための配列（ドナー、相同アームまたはパッチ配列）を含むことができる。さらに別の態様では、本明細書に記載されるいずれかのポリヌクレオチドを含む遺伝子送達ベクターが提供される。ある特定の実施形態ではベクターは、アデノウイルスベクター（例えば、Ａｄ５／Ｆ３５ベクター）または、組み込み適格性または組み込み欠損レンチウイルスベクターを含むレンチウイルスベクター（ＬＶ）またはアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）である。したがって同様に本明細書で、ヌクレアーゼ（例えばＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ）および／またはヌクレアーゼ系（ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＴｔａｇｏ）をコードする配列および／または標的遺伝子への標的化組み込みのためのドナー配列を含むウイルスベクターも提供される。一部の実施形態では、ドナー配列およびヌクレアーゼをコードする配列は、異なるベクター上にある。他の実施形態ではヌクレアーゼは、ポリペプチドとして供給される。好ましい実施形態ではポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。一部の態様では、ｍＲＮＡは化学改変されてもよい（例えば、Kormannら、（２０１１年）Nature Biotechnology ２９巻（２号）：１５４～１５７頁を参照のこと）。他の態様では、ｍＲＮＡは、ＡＲＣＡキャップを含むことができる（米国特許第７，０７４，５９６号および第８，１５３，７７３号を参照のこと）。一部の態様ではｍＲＮＡは、酵素的改変によって導入されたｃａｐを含むことができる。酵素によって導入されたｃａｐは、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１またはＣａｐ２を含む場合がある（例えばSmietanskiら、（２０１４年）Nature Communications ５巻：３００４頁を参照）。さらなる態様ではｍＲＮＡは、化学的改変によってキャッピングすることができる。さらなる実施形態では、ｍＲＮＡは、未改変のおよび改変されたヌクレオチドの混合物を含むことができる（米国特許出願公開第２０１２－０１９５９３６号を参照のこと）。なおさらなる実施形態では、ｍＲＮＡは、ＷＰＲＥエレメントを含むことができる（米国特許出願第１５／１４１，３３３号を参照のこと）。一部の実施形態ではｍＲＮＡは、２本鎖である（例えばKarikoら（２０１１年）Nucl Acid Res ３９巻:ｅ１４２頁を参照）。

【0032】

さらに別の態様では本開示で、本明細書に記載されるタンパク質、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターのいずれかを含む単離細胞が提供される。ある特定の実施形態では細胞は、幹／前駆細胞、またはＴ細胞（例えば、ＣＤ４^＋Ｔ細胞）からなる群から選択される。なおさらなる態様では本開示で、本明細書に記載されるタンパク質、ポリヌクレオチドおよび／もしくはベクターのいずれかを含む細胞または細胞株に由来する細胞または細胞株、すなわちＢ２Ｍが１つもしくは複数のＺＦＮによって不活性化されている、および／または、ドナーポリヌクレオチド（例えばＡＣＴＲ、工学技術で作製されたＴＣＲおよび／またはＣＡＲ）が細胞のゲノムに安定に組み込まれている細胞に由来する（例えば、培養物中）細胞もしくは細胞株が提供される。それにより本明細書に記載される細胞の子孫は、それら自体で本明細書に記載されるタンパク質、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターを含まなくてよいが、これらの細胞では、少なくとも１つのＢ２Ｍ遺伝子が不活性化されているおよび／またはドナーポリヌクレオチドがゲノムに組み込まれているおよび／または発現される。

【0033】

別の態様では本明細書に、本明細書に記載される細胞に１つもしくは複数のタンパク質、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターを導入することによって細胞中のＢ２Ｍ遺伝子を不活性化する方法が記載される。本明細書に記載される方法のいずれにおいてもヌクレアーゼは、標的化変異誘発、細胞性ＤＮＡ配列の欠失を誘導することができる、および／または所定の染色体の遺伝子座での標的化組換えを促進することができる。それによりある特定の実施形態ではヌクレアーゼは、標的遺伝子から１つもしくは複数のヌクレオチドを欠失させるかまたは標的遺伝子に１つもしくは複数のヌクレオチドを挿入する。一部の実施形態ではＢ２Ｍ遺伝子は、ヌクレアーゼ切断、続く非相同末端結合によって不活性化される。他の実施形態では、標的遺伝子中のゲノム配列は、例えば本明細書に記載されるヌクレアーゼ（または前記ヌクレアーゼをコードするベクター）および、ヌクレアーゼによる標的化切断に続いて遺伝子に挿入される「ドナー」配列を使用して置き換えられる。ドナー配列は、ヌクレアーゼベクターに存在することができ、別々のベクター（例えば、ＡＡＶ、ＡｄまたはＬＶベクター）に存在することができ、または異なる核酸送達機構を使用して細胞に導入することができる。

【0034】

さらに、本明細書に記載されるいずれの方法もｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｅｘ ｖｉｖｏで実施することができる。ある特定の実施形態では、方法は、例えばＴ細胞を改変して、それらを、被験体（例えば、がんを有する被験体）を処置する同種異系の状況（allogenic setting）における治療剤として有用にするために、ｅｘ ｖｉｖｏで実施される。処置および／または予防することができるがんの非限定的例には、肺癌、膵臓がん、肝がん、骨がん、乳がん、結腸直腸がん、白血病、卵巣がん、リンパ腫、脳がんなどが含まれる。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子の発現が該Ｂ２Ｍ遺伝子のエクソン１またはエクソン２の改変によってモジュレートされる、単離細胞。
（項目２）
前記改変が配列番号６～４８または１３７から２０５のいずれかに示される標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメインおよび機能的ドメインを含む外因性融合分子によって作製される、項目１に記載の細胞。
（項目３）
配列番号６～４８もしくは１３７から２０５の１つまたは複数の中；配列番号６～４８もしくは１３７から２０５のいずれかの側（隣接ゲノム配列）の１～１０塩基対の中；またはＧＧＣＣＴＴＡ、ＴＣＡＡＡＴ、ＴＣＡＡＡＴＴ、ＴＴＡＣＴＧＡおよび／もしくはＡＡＴＴＧＡＡの中に、挿入および／または欠失を含む、項目１に記載の細胞。
（項目４）
不活性Ｔ細胞受容体遺伝子、ＰＤ１および／またはＣＴＬＡ４遺伝子をさらに含む、項目１から３のいずれかに記載の細胞。
（項目５）
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする導入遺伝子、抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）をコードする導入遺伝子および／または工学技術で作製されたＴＣＲをコードする導入遺伝子をさらに含む、項目１から４のいずれかに記載の細胞。
（項目６）
リンパ系細胞、幹細胞または前駆細胞である、項目１から５のいずれかに記載の細胞。
（項目７）
Ｔ細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または造血幹細胞（ＨＳＣ）である、項目６に記載の細胞。
（項目８）
項目１から７のいずれかに記載の細胞を含む、医薬組成物。
（項目９）
Ｂ２Ｍ遺伝子のエクソン１もしくはエクソン２に結合するＤＮＡ結合ドメインと、転写制御ドメインまたはヌクレアーゼドメインとを含む融合分子であって、該ＤＮＡ結合ドメインが表１の１つの行に示すジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、表２Ｂの１つの行に示すＴＡＬＥエフェクタータンパク質または表２Ａの１つの行に示す単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む、融合分子。
（項目１０）
項目９に記載の前記融合分子をコードする、ポリヌクレオチド。
（項目１１）
ウイルスベクター、プラスミドまたはｍＲＮＡである、項目１０に記載のポリヌクレオチド。
（項目１２）
項目１から７のいずれかに記載の細胞または項目８に記載の医薬組成物をがんを有する被験体に導入することを含む、がんを処置または予防する方法。
（項目１３）
項目１から７のいずれかに記載の細胞、項目８に記載の医薬組成物または項目９に記載の融合分子または項目１０に記載のポリヌクレオチドの、がんを有する被験体の処置のための使用。

【図面の簡単な説明】

【0035】

【図1】図１は、ヌクレアーゼによって標的化されるＢ２Ｍ遺伝子のエクソン１およびエクソン２の配列（配列番号１および２）の図である。四角は、ＺＦＮ結合（標的）部位に隣接されている５つの異なる切断領域（Ａ（ＧＧＣＣＴＴＡ）、Ｃ（ＴＣＡＡＡＴＴ）、Ｄ（ＴＣＡＡＡＴ）、Ｅ（ＴＴＡＣＴＧＡ）およびＧ（ＡＡＴＴＧＡＡ））を示す。

【0036】

【図2A】図２Ａおよび図２Ｂは、ヌクレアーゼ活性を示す。図２Ａは、図１に示される、Ｂ２Ｍ部位Ａ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＧに特異的なＺＦＮを２または６μｇの用量で用いて処理したＴ細胞中の各部位での遺伝子改変のパーセントを示す棒グラフである。図２Ｂは、Ｋ５６２細胞におけるＢ２Ｍ遺伝子に対するＴＡＬＥＮ活性を示す。

【図2B】図２Ａおよび図２Ｂは、ヌクレアーゼ活性を示す。図２Ａは、図１に示される、Ｂ２Ｍ部位Ａ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＧに特異的なＺＦＮを２または６μｇの用量で用いて処理したＴ細胞中の各部位での遺伝子改変のパーセントを示す棒グラフである。図２Ｂは、Ｋ５６２細胞におけるＢ２Ｍ遺伝子に対するＴＡＬＥＮ活性を示す。

【0037】

【図3】図３は、ＦＡＣＳ分析によって分析された、Ｂ２Ｍ特異的ＺＦＮ対を用いる処理後のＨＬＡ陰性Ｔ細胞のパーセントを示す。

【0038】

【図4A-4C】図４Ａから４Ｅは、Ｂ２ＭおよびＴＣＲＡ特異的ＺＦＮの両方を用いた細胞の処理からのＦＡＣＳ結果を示す。図４Ａは、ＺＦＮ未処理の結果を示す。図４ＢはＴＣＲＡ特異的ＺＦＮ単独後の結果（ＣＤ３シグナルの９６％ノックアウト）を示し、図４ＣはＢ２Ｍ特異的ＺＦＮ単独後の結果（ＨＬＡシグナルの９２％ノックアウト）を示す。図４Ｄは、ダブルノックアウト（ＨＬＡマーキングおよびＣＤ３マーキングの両方の減少を生じる）を有する細胞の位置を示す例示である。図４Ｅは、ＴＣＲＡ特異的ＺＦＮおよびＣＤ３特異的ＺＦＮの両方を用いた細胞の処理後の結果を示し、８２％の細胞でのダブルノックアウトを実証している。

【図4D-4E】図４Ａから４Ｅは、Ｂ２ＭおよびＴＣＲＡ特異的ＺＦＮの両方を用いた細胞の処理からのＦＡＣＳ結果を示す。図４Ａは、ＺＦＮ未処理の結果を示す。図４ＢはＴＣＲＡ特異的ＺＦＮ単独後の結果（ＣＤ３シグナルの９６％ノックアウト）を示し、図４ＣはＢ２Ｍ特異的ＺＦＮ単独後の結果（ＨＬＡシグナルの９２％ノックアウト）を示す。図４Ｄは、ダブルノックアウト（ＨＬＡマーキングおよびＣＤ３マーキングの両方の減少を生じる）を有する細胞の位置を示す例示である。図４Ｅは、ＴＣＲＡ特異的ＺＦＮおよびＣＤ３特異的ＺＦＮの両方を用いた細胞の処理後の結果を示し、８２％の細胞でのダブルノックアウトを実証している。

【0039】

【図5】図５は、ＴＲＡＣ（ＴＣＲＡ）およびＢ２Ｍ二重ノックアウトならびにＴＲＡＣ（ＴＣＲＡ）またはＢ２Ｍ遺伝子座のいずれかへのドナーの標的化組み込みからの結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0040】

詳細な説明
本明細書で、細胞表面上にＨＬＡクラスＩをもはや含まないようにＢ２Ｍ遺伝子の発現がモジュレートされている細胞を生成するための組成物および方法が開示される。この様式で改変された細胞は、Ｂ２Ｍ発現の欠如がＨＬＡベースの免疫応答を予防または低減することから治療剤、例えば移植片として使用することができる。さらに目的の他の遺伝子は、Ｂ２Ｍ遺伝子が操作されている細胞に挿入することができる、および／または目的の他の遺伝子をノックアウトすることができる。

【0041】

一般
本明細書に開示される方法の実施、ならびに組成物の調製および使用は、別途指示がない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡおよび当技術分野の範囲内である関連分野における従来の技術を用いる。これらの技術は、文献において詳細に説明される。例えば、Sambrookら、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、１９８９年および第３版、２００１年；Ausubelら、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、John Wiley & Sons、New York、１９８７年および定期の最新版；シリーズMETHODS IN ENZYMOLOGY、Academic Press、San Diego；Wolffe、CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION、第３版、Academic Press、San Diego、１９９８年；METHODS IN ENZYMOLOGY、第３０４巻、「Chromatin」（P.M. WassarmanおよびA. P. Wolffe編）、Academic Press、San Diego、１９９９年；およびMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY、第１１９巻、「Chromatin Protocols」（P.B. Becker編）、Humana Press、Totowa、１９９９年を参照のこと。

【0042】

定義
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は互換的に使用され、直鎖状または環状の立体配座の、および一本鎖または二本鎖の形のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関して制限するものと解釈されるべきでない。これらの用語は、天然のヌクレオチドならびに塩基、糖および／またはリン酸部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）が修飾されるヌクレオチドの公知の類似体を包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対合特異性を有する；すなわち、Ａの類似体はＴと塩基対合する。

【0043】

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は互換的に用いられて、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語は、１つまたは複数のアミノ酸が対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体または改変誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。

【0044】

「結合」は、巨大分子の間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的、非共有結合的相互作用を指す。結合相互作用が全体として配列特異的である限り、該結合相互作用の全ての構成成分が配列特異的である（例えば、ＤＮＡ骨格中のリン酸残基と接触する）必要があるわけではない。そのような相互作用は、１０^－６Ｍ^－１またはそれより低い解離定数（Ｋ_ｄ）によって一般的に特徴付けられる。「親和性」は、結合の強さを指す。結合親和性の増加はより低いＫ_ｄと相関する。「非特異的結合」は、目的の任意の分子（例えば工学技術で作製されたヌクレアーゼ）と巨大分子（例えばＤＮＡ）との間に生じる標的配列に依存しない非共有結合的相互作用を指す。

【0045】

「ＤＮＡ結合分子」は、ＤＮＡに結合することができる分子である。そのようなＤＮＡ結合分子は、ポリペプチド、タンパク質のドメイン、より大きなタンパク質内のドメインまたはポリヌクレオチドであってよい。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡであり、一方他の実施形態では、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合分子はヌクレアーゼのタンパク質ドメイン（例えばＦｏｋＩドメイン）であり、一方他の実施形態では、ＤＮＡ結合分子はＲＮＡガイドヌクレアーゼのガイドＲＮＡ構成成分（例えばＣａｓ９またはＣｆｐ１）である。

【0046】

「結合性タンパク質」は、別の分子に非共有結合で結合することができるタンパク質である。結合性タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合性タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合性タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合性タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合性タンパク質の場合、それはそれ自体に結合することができ（ホモダイマー、ホモトリマーなどを形成する）、および／またはそれは1つまたは複数の異なるタンパク質の１つまたは複数の分子に結合することができる。結合性タンパク質は、１つより多いタイプの結合活性を有することができる。例えば、ジンクフィンガータンパク質はＤＮＡ結合活性、ＲＮＡ結合活性およびタンパク質結合活性を有する。

【0047】

「ジンクフィンガーＤＮＡ結合性タンパク質」（または、結合ドメイン）は、その構造が亜鉛イオンの配位を通して安定する結合ドメインの中のアミノ酸配列の領域である、１つまたは複数のジンクフィンガーを通して配列特異的な様式でＤＮＡに結合するタンパク質、またはより大きなタンパク質の中のドメインである。用語ジンクフィンガーＤＮＡ結合性タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰとしてしばしば略される。
「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つまたは複数のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復ドメインは、それぞれ反復可変性二残基（ｒｅｐｅａｔ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｉｒｅｓｉｄｕｅ）（ＲＶＤ）を含み、そのコグネイト標的ＤＮＡ配列へのＴＡＬＥの結合に関与する。単一の「反復単位」（「反復」とも呼ばれる）は、長さが一般的に３３～３５アミノ酸であり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質の中の他のＴＡＬＥ反復配列と少なくとも一部の配列相同性を示す。ＴＡＬＥタンパク質は、反復単位内のカノニカルなまたは非カノニカルなＲＶＤを使用して標的部位に結合するように設計することができる。例えば、その全体が本明細書に参考として援用される、米国特許第８，５８６，５２６号および第９，４５８，２０５号を参照。

【0048】

ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、例えば、天然に存在するジンクフィンガータンパク質の認識ヘリックス領域の工学技術（１つまたは複数のアミノ酸を変更）を介して、またはＤＮＡ結合（反復可変性二残基またはＲＶＤ領域）に関与するアミノ酸の工学技術によって、所定のヌクレオチド配列に結合するように「工学技術で作製する」ことができる。したがって、工学技術で作製されたジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥタンパク質は、天然に存在しないタンパク質である。ジンクフィンガータンパク質およびＴＡＬＥを工学技術で作製するための方法の非限定的例は、設計および選択である。設計されたタンパク質は、その設計／組成が合理的基準から主に生じる、天然に存在しないタンパク質である。設計のための合理的基準には、既存のＺＦＰまたはＴＡＬＥ設計（カノニカルなおよび非カノニカルなＲＶＤ）および結合データの情報を保存するデータベース中の情報を処理するための、置換規則およびコンピュータ化アルゴリズムの適用が含まれる。例えば、米国特許第９，４５８，２０５号、第８，５８６，５２６号、第６，１４０，０８１号、第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号を参照、ＷＯ９８／５３０５８、ＷＯ９８／５３０５９、ＷＯ９８／５３０６０、ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６も参照。

【0049】

「選択された」ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥタンパク質またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、天然には見出されず、その産生がファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択などの実験プロセスから主に生じる。例えば、Ｕ．Ｓ．５，７８９，５３８；Ｕ．Ｓ．５，９２５，５２３；Ｕ．Ｓ．６，００７，９８８；Ｕ．Ｓ．６，０１３，４５３；Ｕ．Ｓ．６，２００，７５９；ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０；ＷＯ０１／８８１９７およびＷＯ０２／０９９０８４を参照のこと。

【0050】

「ＴｔＡｇｏ」は、遺伝子サイレンシングに関与すると考えられている原核生物のアルゴノートタンパク質である。ＴｔＡｇｏは、細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来である。例えばSwartsら、同書、G. Shengら、（２０１３年）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. １１１巻、６５２頁）を参照。「ＴｔＡｇｏ系」は、例えばＴｔＡｇｏ酵素による切断のためのガイドＤＮＡを含む要求される構成成分の全てである。

【0051】

「組換え」は、２つのポリヌクレオチドの間での遺伝情報の交換のプロセスを指す。この開示のために、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、相同組換え修復機構による細胞中の二本鎖切断の修復の間に起こるそのような交換の特殊化した形態を指す。このプロセスはヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経たもの）の鋳型修復に「ドナー」分子を使用し、「非交叉遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として様々に公知であるが、その理由は、それがドナーから標的への遺伝情報の伝達をもたらすからである。いかなる特定の理論にも束縛されることを望むことなく、そのような伝達は、切断された標的とドナーとの間で形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／または、ドナーが標的の一部になる遺伝情報を再合成するために使用される「合成依存性鎖アニーリング」、および／または関連したプロセスに関与することができる。そのような特殊化したＨＲは標的分子の配列の変更をしばしばもたらし、そのため、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全体が標的ポリヌクレオチドに組み入れられる。

【0052】

本開示の方法では、本明細書に記載される１つまたは複数の標的化ヌクレアーゼは、所定部位（例えば、目的の遺伝子または遺伝子座）の標的配列（例えば、細胞クロマチン）において二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせ、切断領域のヌクレオチド配列と相同性を有する「ドナー」ポリヌクレオチドを、細胞に導入することができる。ＤＳＢの存在により、ドナー配列の組込みを促進することが示された。任意選択で構築物は、切断の領域におけるヌクレオチド配列に相同性を有する。ドナー配列は物理的に組み込まれてもよいし、または代わりに、ドナーポリヌクレオチドを、相同組換えによる切断の修復のための鋳型として使用し、細胞クロマチンへのドナーの場合のようにヌクレオチド配列の全部または一部の導入をもたらす。したがって、細胞クロマチン中の第１の配列を改変することができ、ある特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドに存在する配列へと変換することができる。したがって、用語「置き換える」または「置き換え」の使用は、１つのヌクレオチド配列の、別のものによる置き換え（すなわち、情報の意味での配列の置き換え）を表し、１つのポリヌクレオチドの、別のものによる物理的または化学的置き換えを必ずしも必要とするものではないことを理解することができる。

【0053】

本明細書に記載される方法のいずれでも、細胞の中のさらなる標的部位のさらなる二本鎖切断のために、ジンクフィンガータンパク質のさらなる対を使用することができる。

【0054】

細胞クロマチン中の目的領域における配列の標的化組換えおよび／または置き換えおよび／または変更のための方法のある特定の実施形態では、染色体配列は、外因性「ドナー」ヌクレオチド配列による相同組換えによって変更される。切断の領域に相同性の配列が存在するならば、そのような相同組換えは細胞クロマチン中の二本鎖切断の存在によって刺激される。

【0055】

本明細書に記載される方法のいずれでも、第１のヌクレオチド配列（「ドナー配列」）は、目的領域のゲノム配列に相同的であるが同一でない配列を含有することができ、それによって相同組換えを刺激して、目的領域の中に同一でない配列を挿入することができる。したがって、ある特定の実施形態では、目的領域の配列に相同性であるドナー配列の部分は、置き換えられたゲノム配列と約８０から９９％（または、その間の任意の整数）の間の配列同一性を呈示する。他の実施形態では、例えば、１００個の連続した塩基対にわたってドナー配列とゲノム配列との間で１ヌクレオチドだけが異なる場合は、ドナー配列とゲノム配列との間の相同性は９９％より高い。ある特定の場合には、新しい配列が目的領域に導入されるように、ドナー配列の非相同部分は、目的領域に存在しない配列を含有することができる。これらの場合には、非相同配列は、目的領域の配列に相同性または同一である、５０～１，０００塩基対（または、その間の任意の整数値）または１，０００を超える任意数の塩基対の配列に一般的に隣接する。他の実施形態では、ドナー配列は第１の配列に非相同性であり、非相同組換え機構によってゲノムに挿入されている。

【0056】

本明細書に記載される方法のいずれも、目的の遺伝子（複数可）の発現を破壊するドナー配列の標的化組込みによる、細胞における１つまたは複数の標的配列の部分的または完全な不活性化のために使用することができる。部分的または完全に不活性化された遺伝子を有する細胞株も、提供される。

【0057】

さらに、本明細書に記載される標的化組込みの方法は、１つまたは複数の外因性配列を組み込むために使用することもできる。外因性核酸配列は、例えば、１つまたは複数の遺伝子もしくはｃＤＮＡ分子、または任意のタイプのコード配列もしくは非コード配列、ならびに１つまたは複数の調節エレメント（例えば、プロモーター）を含むことができる。さらに、外因性核酸配列は、１つまたは複数のＲＮＡ分子（例えば、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）など）を産生することができる。

【0058】

「切断」は、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の切断を指す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を限定されずに含む、様々な方法によって開始することができる。一本鎖切断および二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は２つの異なる一本鎖切断事象の結果として起こり得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの産生をもたらし得る。ある特定の実施形態では、標的化二本鎖ＤＮＡ切断のために融合ポリペプチドが使用される。

【0059】

「切断半ドメイン」は、第２のポリペプチド（同一のまたは異なる）と共に、切断活性（好ましくは二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。用語「第１および第２の切断半ドメイン」、「＋および－切断半ドメイン」ならびに「右および左切断半ドメイン」は互換的に使用されて、二量体化する切断半ドメインの対を指す。

【0060】

「工学技術で作製された切断半ドメイン」は、別の切断半ドメイン（例えば、別の工学技術で作製された切断半ドメイン）と絶対ヘテロダイマー（obligate heterodimer）を形成するように改変された切断半ドメインである。参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第７，８８８，１２１号；第７，９１４，７９６号；第８，０３４，５９８号；第８，６２３，６１８号および米国特許出願公開第２０１１／０２０１０５５号も参照されたい。

【0061】

用語「配列」は、任意の長さのヌクレオチド配列を指し、それはＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく；直鎖状、環状または分枝状であってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれかであってもよい。用語「ドナー配列」は、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば２から１０，０００ヌクレオチド（または、その間のもしくはその上の任意の整数値）の間の長さ、好ましくは約１００から１，０００ヌクレオチド（または、その間の任意の整数）の間の長さ、より好ましくは約２００から５００ヌクレオチドの間の長さであってよい。

【0062】

「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造物である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびにヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。大多数の真核生物の細胞クロマチンはヌクレオソームの形で存在し、ここで、ヌクレオソームコアはヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４の各々２つを含む八量体に会合した概ね１５０塩基対のＤＮＡを含み；リンカーＤＮＡ（生物体によって様々な長さの）がヌクレオソームコアの間に延びる。ヒストンＨ１の分子は、リンカーＤＮＡに一般的に会合している。本開示のために、用語「クロマチン」は、原核生物および真核生物の両方の、全てのタイプの細胞核タンパク質の包含を意味するものである。細胞クロマチンには、染色体およびエピソームの両方のクロマチンが含まれる。

【0063】

「染色体」は、細胞のゲノムの全体または一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、細胞のゲノムを含む全ての染色体の集合である、その核型によってしばしば特徴付けられる。細胞のゲノムは、１つまたは複数の染色体を含むことができる。

【0064】

「エピソーム」は、複製する核酸、核タンパク質複合体、または細胞の染色体核型の一部でない核酸を含む他の構造物である。エピソームの例には、プラスミドおよびある特定のウイルスゲノムが含まれる。

【0065】

「標的部位」または「標的配列」は、結合のための十分な条件が存在することを条件に、結合性分子が結合する核酸の一部を規定する核酸配列である。例えば、配列５’ＧＡＡＴＴＣ３’は、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼのための標的部位である。

【0066】

「外因性」分子は、細胞に通常は存在しないが、１つまたは複数の遺伝的方法、生化学的方法または他の方法によって細胞に導入することができる分子である。「細胞における正常な存在」は、細胞の特定の発達段階および環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発達の間だけに存在する分子は、成体の筋細胞に関しては外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、非熱ショック細胞に関しては外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全の内因性分子の機能バージョンまたは正常機能内因性分子の機能不全バージョンを含むことができる。

【0067】

外因性分子は、とりわけ、小分子、例えばコンビナトリアル化学プロセスによって生成されるもの、または巨大分子、例えばタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記の分子の任意の改変誘導体、または上記の分子の１つまたは複数を含む任意の複合体であってよい。核酸にはＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、一本鎖または二本鎖であってよく、直鎖状、分枝状または環状であってよく、任意の長さであってよい。例えば、米国特許第８，７０３，４８９号および第９，２５５，２５９号を参照されたい。核酸には、二重鎖を形成することが可能な核酸ならびに三重鎖形成核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質には、ＤＮＡ結合性タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合性タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、脱アセチル化酵素、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ギラーゼおよびヘリカーゼが限定されずに含まれる。

【0068】

外因性分子は、内因性分子と同じ種類の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であってよい。例えば、外因性核酸は、細胞に導入される感染性のウイルスゲノム、プラスミドもしくはエピソーム、または細胞に通常は存在しない染色体を含むことができる。細胞への外因性分子の導入のための方法は当業者に公知であり、脂質媒介伝達（すなわち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介伝達およびウイルスベクター媒介伝達が限定されずに含まれる。外因性分子は内因性分子と同じ種類の分子であってもよいが、細胞が由来する種と異なる種に由来してもよい。例えば、マウスまたはハムスターに本来由来する細胞株に、ヒト核酸配列を導入することができる。

【0069】

対照的に、「内因性」分子は、特定の環境条件下で特定の発達段階の特定の細胞に通常存在するものである。例えば、内因性の核酸は、染色体、ミトコンドリアのゲノム、クロロプラストもしくは他のオルガネラ、または天然に存在するエピソーム核酸を含むことができる。さらなる内因性分子には、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を含めることができる。

【0070】

「融合」分子は、２つまたはそれより多いサブユニット分子が、好ましくは共有結合で連結される分子である。サブユニット分子は、同じ化学的タイプの分子であってよいか、または異なる化学的タイプの分子であってよい。第１のタイプの融合分子の例には、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと１つまたは複数の活性化ドメインとの間の融合物）および融合核酸（例えば、上に記載の融合タンパク質をコードする核酸）が限定されずに含まれる。第２のタイプの融合分子の例には、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合物、および副溝バインダーと核酸との間の融合物が限定されずに含まれる。用語には、ポリヌクレオチド構成成分が機能的分子を形成するようにポリペプチド構成成分と会合する系（例えば、単一ガイドＲＮＡが遺伝子発現をモジュレートするために機能的ドメインと会合するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）も含まれる。

【0071】

細胞における融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質の送達から、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞への送達によって生じることができ、ここで、ポリヌクレオチドは転写され、転写物は翻訳されて融合タンパク質を生成する。細胞におけるタンパク質の発現において、トランススプライシング、ポリペプチド切断およびポリペプチドライゲーションが関与することもできる。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの送達の方法は、本開示の他の場所で提示される。

【0072】

本開示のために、「遺伝子」は、遺伝子生成物（下を参照のこと）をコードするＤＮＡ領域、ならびに、そのような調節配列がコード配列および／または転写配列に隣接しているか否かを問わず、遺伝子生成物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を含む。したがって、遺伝子は、必ずしも限定されずに、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えばリボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位、エンハンサー、サイレンサー、インシュレータ、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位および遺伝子座調節領域を含む。

【0073】

「セーフハーバー」遺伝子座は、遺伝子を宿主細胞へのいかなる有害作用もなしに挿入することができるゲノム内の遺伝子座である。最も有益なのは、挿入された遺伝子配列の発現が付近の遺伝子からのいかなるリードスルー発現によっても攪乱されないセーフハーバー遺伝子座である。ヌクレアーゼ（複数可）によって標的化されるセーフハーバー遺伝子座の非限定的例には、ＣＣＲ５、ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ１、Ｒｏｓａおよびアルブミンが含まれる。例えば、米国特許第８，７７１，９８５号；同第８，１１０，３７９号；同第７，９５１，９２５号；米国特許出願公開第２０１００２１８２６４号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号；同第２０１３０１７７９６０号；同第２０１５００５６７０５号および同第２０１５０１５９１７２号）を参照されたい。

【0074】

「遺伝子発現」は、遺伝子に含まれる情報の遺伝子生成物への変換を指す。遺伝子生成物は、遺伝子の直接転写生成物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造的ＲＮＡまたは任意の他のタイプのＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって生成されるタンパク質であってよい。遺伝子生成物には、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化および編集などのプロセスによって改変されるＲＮＡ、ならびに、例えばメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリストイル化およびグリコシル化によって改変されるタンパク質も含まれる。

【0075】

遺伝子発現の「モジュレーション」または「改変」は、遺伝子の活性の変化を指す。発現のモジュレーションには、外因性分子（例えば、工学技術で作製された転写因子）の結合を介した遺伝子の改変によるものを含む遺伝子活性化および遺伝子抑制を限定されずに含めることができる。モジュレーションは、ゲノム編集（例えば、切断、変更、不活性化、ランダム変異）を介した遺伝子配列の改変によっても達成することができる。遺伝子不活性化は、本明細書に記載される改変されていない細胞と比較したときの、遺伝子発現のいかなる低減も指す。したがって、遺伝子不活性化は部分的であるか、または完全であってもよい。

【0076】

「目的領域」は、外因性分子を結合させることが望ましい、例えば、遺伝子または遺伝子の中のもしくはそれに隣接した非コード配列などの細胞クロマチンの任意の領域である。結合は、標的化ＤＮＡ切断および／または標的化組換えのためであってもよい。目的領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞小器官ゲノム（例えば、ミトコンドリア、クロロプラスト）、または、例えば感染性ウイルスゲノムに存在することができる。目的領域は、遺伝子のコード領域の中、例えばリーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロンなどの転写された非コード領域の中、または、コード領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域の中にあってもよい。目的領域は、単一のヌクレオチド対と同じくらい小さくてもよく、または最高２，０００ヌクレオチド対の長さ、または任意の整数値のヌクレオチド対であってもよい。

【0077】

「真核生物」細胞には、真菌細胞（酵母など）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が限定されずに含まれる。

【0078】

用語「作用的連結」および「作用的に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結する」（または、「作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結する」）は、２つまたはそれより多い構成成分（配列エレメントなど）の並置に関して互換的に使用され、ここで、構成成分は、両構成成分が正常に機能して、構成成分の少なくとも１つが他の構成成分の少なくとも１つにおいて発現する機能を媒介することができるということを可能にするように配置される。例証として、プロモーターなどの転写調節配列は、その転写調節配列が１つまたは複数の転写調節因子の存在または不在に応答してコード配列の転写のレベルを調節するならば、コード配列に作用的に連結されている。転写調節配列はコード配列と一般的にｃｉｓで作用的に連結するが、それと直接的に隣接する必要がない。例えば、たとえそれらが近接していなくても、エンハンサーはコード配列に作用的に連結している転写調節配列である。

【0079】

融合ポリペプチドに関して、用語「作用的に連結する」は、構成成分の各々が、そのように連結していない場合にそれがするだろうものと同じ機能を、他の構成成分と連結して実行するという事実を指すことができる。例えば、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ）が活性化ドメインに融合している融合ポリペプチドに関して、融合ポリペプチドにおいて、ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができ、活性化ドメインが遺伝子発現を上方調節することができるならば、ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは作用的に連結している。ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合している融合ポリペプチドの場合は、融合ポリペプチドにおいて、ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができ、切断ドメインが標的部位の近くでＤＮＡを切断することができるならば、ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインは作用的に連結している。同様に、ＤＮＡ結合ドメインが活性化または抑制ドメインに融合されている融合ポリペプチドに関して、ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化または抑制ドメインは、融合ポリペプチドにおいてＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合でき、一方活性化ドメインが遺伝子発現を上方制御することができるまたは抑制ドメインが遺伝子発現を下方制御することができる場合に、機能的連結（operative linkage）している。

【0080】

タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」は、その配列が完全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一でないが、完全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能を保持する、タンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は対応する天然分子より多くの、より少ないまたは同じ数の残基を保有することができ、および／または１つまたは複数のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含有することができる。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、当技術分野で周知である。同様に、タンパク質機能を決定するための方法は、周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合性機能は、例えば、フィルター結合性、電気泳動移動性－シフトまたは免疫沈降アッセイによって決定することができる。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動によって試験することができる。上記、Ausubelらを参照のこと。別のタンパク質と相互作用するタンパク質の能力は、例えば、共免疫沈降、２ハイブリッドアッセイまたは遺伝子的および生化学的の両方の相補性によって決定することができる。例えば、Fieldsら（１９８９年）Nature ３４０巻：２４５～２４６頁；米国特許第５，５８５，２４５号およびＰＣＴ ＷＯ９８／４４３５０を参照のこと。

【0081】

「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に移すことが可能である。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、「発現構築物」、「発現カセット」および「遺伝子導入ベクター」は、目的の遺伝子の発現に誘導することが可能であり、遺伝子配列を標的細胞に移すことができる任意の核酸構築物を意味する。したがって、本用語は、クローニングおよび発現ビヒクルならびに組込みベクターを含む。

【0082】

「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」は、好ましくはルーチンのアッセイにおいてとは限らないが、容易に測定されるタンパク質生成物を産生する任意の配列を指す。適するレポーター遺伝子には、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、着色または蛍光性または発光性のタンパク質（例えば、緑色蛍光性タンパク質、強化された緑色蛍光性タンパク質、赤色蛍光性タンパク質、ルシフェラーゼ）をコードする配列、ならびに強化された細胞増殖および／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）が限定されずに含まれる。エピトープタグには、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡまたは任意の検出可能なアミノ酸配列の１つまたは複数のコピーが含まれる。「発現タグ」には、目的の遺伝子の発現をモニタリングするために所望の遺伝子配列に作動可能に連結することができるレポーターをコードする配列が含まれる。

【0083】

用語「被験体」および「患者」は、互換的に用いられ、ヒト患者および非ヒト霊長類、ならびにウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウスなどの実験動物、ならびに他の動物などの哺乳動物を指す。したがって本明細書において使用される用語「被験体」または「患者」は、本発明の発現カセットを投与することができる任意の哺乳動物患者または被験体を意味する。本発明の被験体は、障害を有する被験体または障害を発症するリスクがある被験体を含む。

【0084】

本明細書において使用される用語「処置する」または「処置」は、症状の重症度および／または頻度の低減、症状および／または根底にある原因の除去、症状の出現および／またはそれらの根底にある原因の予防、ならび損傷の改善または治療を指す。がんおよび移植片対宿主病は、本明細書に記載される組成物および方法を使用して処置することができる状態の非限定的例である。それにより「処置する」および「処置」には：
（ｉ）哺乳動物において、具体的にはそのような哺乳動物が状態になりやすい素因を有するが、それを有するとしてまだ診断されていない場合に、疾患または状態の出現を予防すること；
（ｉｉ）疾患または状態を抑制すること、すなわちその発症を抑止すること；
（ｉｉｉ）疾患もしくは状態を緩和すること、すなわち疾患もしくは状態の退縮をもたらすこと；または
（ｉｖ）疾患もしくは状態から生じる症状を緩和すること、すなわち根底にある疾患もしくは状態に対処すること無く疼痛を緩和すること
が含まれる。

【0085】

本明細書において使用される、用語「疾患」および「状態」は、互換的に使用することができる、または特定の疾病もしくは状態が公知の原因因子を有さず（そのため病因がまだ解明されていない）、したがってそれはまだ疾患としてではなく、望ましくない状態または症候群としてのみ認識されていて、ある程度の具体的な症状のセットが臨床医によって同定されているという点では、異なっていてよい。

【0086】

「医薬組成物」は、哺乳動物、例えばヒトへの生物学的に活性な化合物の送達のために当技術分野において一般に許容される本発明の化合物および媒体の製剤を指す。そのためのそのような媒体には、全ての薬学的に許容されるキャリア、希釈剤または賦形剤が含まれる。

【0087】

「有効量」または「治療有効量」は、哺乳動物、好ましくはヒトに投与された場合に、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて処置をもたらすために十分である本発明の化合物の量を指す。「治療有効量」を構成する本発明の組成物の量は、化合物、状態およびその重症度、投与の様式ならびに処置される哺乳動物の年齢に応じて変化するが、当業者自身の知識および本開示を考慮して当業者によって日常的に決定することができる。

【0088】

ＤＮＡ結合ドメイン
本明細書で、ＨＬＡ遺伝子またはＨＬＡ制御因子（Ｂ２Ｍ遺伝子を含む）を含む任意の遺伝子中の標的部位に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む組成物が記載される。任意のＤＮＡ結合ドメインは、本明細書で開示される組成物および方法において使用することができ、限定されずにジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼのＤＮＡ結合部分（ｓｇＲＮＡ）またはメガヌクレアーゼ由来ＤＮＡ結合ドメインが含まれる。ＤＮＡ結合ドメインは、限定されずに、配列番号６～４８のいずれかに示す１２またはそれより多いヌクレオチドの標的配列を含む、遺伝子内の任意の標的配列に結合することができる。

【0089】

ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、選択された標的部位に結合するように工学技術で作製されている点で、天然に存在しない。例えば、Beerliら（２００２年）Nature Biotechnol.２０巻：１３５～１４１頁；Paboら（２００１年）Ann. Rev. Biochem.７０巻：３１３～３４０頁；Isalanら（２００１年）Nature Biotechnol.１９巻：６５６～６６０頁；Segalら（２００１年）Curr. Opin. Biotechnol.１２巻：６３２～６３７頁；Chooら（２０００年）Curr. Opin. Struct. Biol.１０巻：４１１～４１６頁；米国特許第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０３０，２１５号；同第６，７９４，１３６号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，０７０，９３４号；同第７，３６１，６３５号；同第７，２５３，２７３号；および米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号；同第２００７／０２１８５２８号；同第２００５／０２６７０６１号（すべて本明細書にその全体が参考として援用される）を参照のこと。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２／００６０２３０号に開示されているジンクフィンガータンパク質を含む（例えば、表１）。

【0090】

工学技術で作製されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して、新規の結合特異性を有することができる。工学技術で作製する方法には、合理的なデザインおよび種々のタイプの選択が限定されずに含まれる。合理的なデザインには、例えば、三つ組（または、四つ組）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが含まれ、ここで、各三つ組または四つ組ヌクレオチド配列は、特定の三つ組または四つ組配列に結合するジンクフィンガーの１つまたは複数のアミノ酸配列と会合している。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号を参照のこと。

【0091】

ファージディスプレイおよび２ハイブリッド系を含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号；５，９２５，５２３号；６，００７，９８８号；６，０１３，４５３号；６，４１０，２４８号；６，１４０，４６６号；６，２００，７５９号；および６，２４２，５６８号；ならびにＷＯ９８／３７１８６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／８８１９７およびＧＢ２，３３８，２３７に開示されている。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインの結合特異性の増強が、例えば、米国特許第６，７９４，１３６号に記載されている。

【0092】

さらに、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質は、例えば長さが５またはそれより多くのアミノ酸のリンカーを含む、任意の適するリンカー配列を使用して一緒に連結することができる。長さが６またはそれより多くのアミノ酸の例示的なリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号；６，９０３，１８５号；および７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質には、タンパク質の個々のジンクフィンガーの間の適するリンカーの任意の組合せを含めることができる。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば米国特許第６，７９４，１３６号に記載されている。

【0093】

標的部位；ＺＦＰの選択および融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は、当業者に公知であり、米国特許第６，１４０，０８１号、第５，７８９，５３８号、第６，４５３，２４２号、第６，５３４，２６１号、第５，９２５，５２３号、第６，００７，９８８号、第６，０１３，４５３号、第６，２００，７５９号、ＷＯ９５／１９４３１、ＷＯ９６／０６１６６、ＷＯ９８／５３０５７、ＷＯ９８／５４３１１、ＷＯ００／２７８７８、ＷＯ０１／６０９７０、ＷＯ０１／８８１９７、ＷＯ０２／０９９０８４、ＷＯ９８／５３０５８、ＷＯ９８／５３０５９、ＷＯ９８／５３０６０、ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６に詳細に記載されている。

【0094】

さらに、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質は、例えば５またはそれより多いアミノ酸長のリンカーを含む、任意の適するリンカー配列を使用して一緒に連結することができる。６またはそれより多いアミノ酸長の例示的なリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号、第６，９０３，１８５号および第７，１５３，９４９号も参照。本明細書に記載されるタンパク質には、そのタンパク質の個々のジンクフィンガーの間の適するリンカーの任意の組合せを含めることができる。

【0095】

ある特定の実施形態ではＤＮＡ結合ドメインは、Ｂ２Ｍ遺伝子またはＢ２Ｍ制御遺伝子中の標的部位に結合し（配列特異的様式で）、Ｂ２Ｍ遺伝子の発現をモジュレートする工学技術で作製されたジンクフィンガータンパク質である。一部の実施形態ではジンクフィンガータンパク質は、Ｂ２Ｍ中の標的部位に結合するが、一方他の実施形態ではジンクフィンガーは、Ｂ２Ｍ中の標的部位に結合する。

【0096】

通常ＺＦＰは、少なくとも３つのフィンガーを含む。ある特定のＺＦＰは、４つ、５つまたは６つのフィンガーを含む。３つのフィンガーを含むＺＦＰは、９または１０ヌクレオチドを含む標的部位を典型的には認識し；４つのフィンガーを含むＺＦＰは、１２から１４ヌクレオチドを含む標的部位を典型的には認識し；一方６つのフィンガーを有するＺＦＰは、１８から２１ヌクレオチドを含む標的部位を認識することができる。ＺＦＰは、転写活性化または抑制ドメインであってよい１つまたは複数の制御ドメインを含む融合タンパク質であってもよい。

【0097】

一部の実施形態ではＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ由来であってよい。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼ（例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩおよびＩ－ＴｅｖＩＩＩ）の認識配列が公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Belfortら（１９９７年）Nucleic Acids Res.２５巻：３３７９～３３８８頁；Dujonら（１９８９年）Gene ８２巻：１１５～１１８頁；Perlerら（１９９４年）Nucleic Acids Res.２２巻、１１２５～１１２７頁；Jasin（１９９６年）Trends Genet.１２巻：２２４～２２８頁；Gimbleら（１９９６年）J. Mol. Biol.２６３巻：１６３～１８０頁；Argastら（１９９８年）J. Mol. Biol.２８０巻：３４５～３５３頁およびNew England Biolabsカタログも参照。さらに、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然の標的部位に結合するように工学技術で作製することができる。例えば、Chevalierら（２００２年）Molec. Cell １０巻：８９５～９０５頁；Epinatら（２００３年）Nucleic Acids Res.３１巻：２９５２～２９６２頁；Ashworthら（２００６年）Nature ４４１巻：６５６～６５９頁；Paquesら（２００７年）Current Gene Therapy ７巻：４９～６６頁；米国特許出願公開第２００７０１１７１２８号を参照のこと。

【0098】

他の実施形態ではＤＮＡ結合ドメインは、植物病原体Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ（Bochら、（２００９年）Science ３２６巻：１５０９～１５１２頁ならびにMoscouおよびBogdanove、（２００９年）Science ３２６巻：１５０１頁を参照）ならびにＲａｌｓｔｏｎｉａ（Heuerら（２００７年）Applied and Environmental Microbiology ７３巻（１３号）：４３７９～４３８４頁を参照）；米国特許出願第２０１１０３０１０７３号および第２０１１０１４５９４０号由来のものに類似するＴＡＬエフェクター由来の工学技術で作製されたドメインを含む。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属の植物病原細菌は、重要な作物植物における多くの疾患を引き起こすことが公知である。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓの病原性は、植物細胞に２５を超える異なるエフェクタータンパク質を注入する、保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。植物転写活性化因子を模倣して植物トランスクリプトームを操作する、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、これらの注入されるタンパク質の１つである（Kayら（２００７年）Science ３１８巻：６４８～６５１頁を参照のこと）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最も良く特徴付けられたＴＡＬＥの１つは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｇｒｉｓ ｐｖ．ＶｅｓｉｃａｔｏｒｉａからのＡｖｒＢｓ３である（Bonasら（１９８９年）Mol Gen Genet ２１８巻：１２７～１３６頁およびＷＯ２０１００７９４３０を参照のこと）。ＴＡＬＥはタンデムリピートの集中型ドメイン（centralized domain）を含有し、各リピートは概ね３４アミノ酸を含有し、それらはこれらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性にとって重要である。さらに、それらは核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（レビューについては、Schornack Sら（２００６年）J Plant Physiol １６３巻（３号）：２５６～２７２頁を参照のこと）。さらに、植物病原細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍでは、Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ生物型（biovar）１菌株ＧＭＩ１０００および生物型４菌株ＲＳ１０００において、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリーに相同性である、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と呼ばれる２つの遺伝子が見出された（Heuerら（２００７年）Appl and Envir Micro ７３巻（１３号）：４３７９～４３８４頁を参照のこと）。これらの遺伝子はヌクレオチド配列がお互いと９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７の反復配列ドメインにおける１，５７５ｂｐが欠失している点で異なる。しかし、両遺伝子生成物は、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。

【0099】

これらのＴＡＬエフェクターの特異性は、タンデムリピートに見出される配列に依存する。反復配列は概ね１０２塩基対を含み、そのリピートはお互いと典型的にはに９１～１００％相同である（Bonasら、同上）。そのリピートの多型は通常１２位および１３位に位置し、１２位および１３位の超可変二残基（hypervariable diresidues）（リピート可変二残基またはＲＶＤ領域）の同一性とＴＡＬエフェクターの標的配列の中の近接したヌクレオチドの同一性の間に１対１の対応があるようである（MoscouおよびBogdanove、（２００９年）Science ３２６巻：１５０１頁およびBochら（２００９年）Science ３２６巻：１５０９～１５１２頁を参照のこと）。実験的に、１２位および１３位のＨＤ配列（リピート可変二残基またはＲＶＤ領域）がシトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡ、Ｃ、ＧまたはＴに、ＮＮがＡまたはＧに結合し、ＩＮＧがＴに結合するように、これらのＴＡＬエフェクターのＤＮＡ認識のための天然のコードを決定した。これらのＤＮＡ結合リピートは、新しい配列と相互作用して、植物細胞中の非内因性レポーター遺伝子の発現を活性化することができる人工転写因子を作製するために、新しい組合せおよび多数のリピートを有するタンパク質に組み立てられた（Bochら、同上）。非定型ＲＶＤを伴うＴＡＬＥＮを包含する、ＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ融合物（ＴＡＬＥＮ）を得るために、工学技術で作製されたＴＡＬタンパク質をＦｏｋＩ切断半ドメインに連結した。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照のこと。

【0100】

一部の実施形態ではＴＡＬＥＮは、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）切断ドメインまたは切断半ドメインを含む。他の実施形態ではＴＡＬＥヌクレアーゼは、メガＴＡＬである。これらのメガＴＡＬヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよびメガヌクレアーゼ切断ドメインを含む融合タンパク質である。メガヌクレアーゼ切断ドメインは、単量体として活性であり、活性のために二量体化を必要としない（Boisselら、（２０１３年）Nucl Acid Res：１～１３頁、doi: 10.1093/nar/gkt1224を参照）。

【0101】

なおさらなる実施形態では、ヌクレアーゼは、コンパクトなＴＡＬＥＮを含む。これらは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインをＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに連結する単鎖融合タンパク質である。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインがＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに関してどこに配置されるかに応じて、融合タンパク質は、ＴＡＬＥ領域によって局在化されたニッカーゼとして作用することができるか、または二本鎖切断を引き起こすことができる（Beurdeleyら（２０１３年）Nat Comm：１～８頁、DOI: 10.1038/ncomms2782を参照）。さらに、ヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ結合機能性も示すことができる。任意のＴＡＬＥＮを、１つまたは複数のメガＴＡＬＥを含むさらなるＴＡＬＥＮ（例えば、１つまたは複数のＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮまたはＦｏｋＩ－ＴＡＬＥＮ）と組み合わせて使用することができる。

【0102】

さらに、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、例えば５またはそれより多くのアミノ酸長のリンカーを含む、任意の適するリンカー配列を使用して一緒に連結することができる。６またはそれより多くのアミノ酸長の例示的なリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号、第６，９０３，１８５号；および第７，１５３，９４９号も参照。本明細書に記載されるタンパク質には、そのタンパク質の個々のジンクフィンガーの間の適するリンカーの任意の組合せを含めることができる。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば米国特許第６，７９４，１３６号に記載されている。

【0103】

ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡに結合するシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を包含する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の一部である。例えば、米国特許第８，６９７，３５９号ならびに米国特許出願公開第２０１５００５６７０５号および２０１５０１５９１７２号を参照のこと。その系のＲＮＡ構成成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（クラスター化規則的散在性ショートパリンドロームリピート）遺伝子座、およびタンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Jansenら、２００２年、Mol. Microbiol.４３巻：１５６５～１５７５頁；Makarovaら、２００２年、Nucleic Acids Res.３０巻：４８２～４９６頁；Makarovaら、２００６年、Biol. Direct １巻：７頁；Haftら、２００５年、PLoS Comput. Biol.１巻：ｅ６０頁）が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の遺伝子配列を構成する。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子の組合せ、ならびにＣＲＩＳＰＲ媒介核酸切断の特異性をプログラムすることが可能な非コードＲＮＡエレメントを含有する。

【0104】

ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは最も良く特徴付けられた系の１つであり、４つの逐次的ステップで標的化ＤＮＡ二本鎖切断を実行する。先ず、２つの非コードＲＮＡ、プレｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡはプレｃｒＲＮＡの反復配列領域（repeat region）にハイブリダイズし、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのプレｃｒＲＮＡのプロセシングを媒介する。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーとプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡの上のプロトスペーサーとの間のワトソン－クリック塩基対合を介して、機能的ドメイン（例えば、Ｃａｓなどのヌクレアーゼ）を標的ＤＮＡに誘導する、これは、標的認識のためのさらなる要件である。最後に、プロトスペーサーの中で二本鎖切断を引き起こすために、Ｃａｓ９は標的ＤＮＡの切断を媒介する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３つのステップで構成される：（ｉ）「適応」と呼ばれるプロセスにおける、将来の攻撃を防止するためのＣＲＩＳＰＲアレイへのエイリアンＤＮＡ配列の挿入、（ｉｉ）関連するタンパク質の発現、ならびにアレイの発現およびプロセシング、続いて（ｉｉｉ）エイリアン核酸に対するＲＮＡ媒介干渉。したがって、細菌細胞では、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のいくつかはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然の機能に関与し、エイリアンＤＮＡなどの挿入などの機能における役割を果たしている。

【0105】

ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質の「機能的誘導体」であってよい。天然配列ポリペプチドの「機能的誘導体」は、天然配列のポリペプチドと共通した定性的生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」には、天然配列の断片、ならびに天然配列ポリペプチドの誘導体およびその断片が限定されずに含まれるが、ただし、それらは対応する天然配列ポリペプチドと共通する生物学的活性を有する。本明細書で企図される生物学的活性は、ＤＮＡ基質を断片に加水分解する機能的誘導体の能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、共有結合性改変および誘導体Ｃａｓタンパク質などのその融合物を包含する。Ｃａｓポリペプチドの適する誘導体またはその断片には、Ｃａｓタンパク質の変異体、融合物、共有結合性改変またはそれらの断片が限定されずに含まれる。Ｃａｓタンパク質またはその断片、ならびにＣａｓタンパク質の誘導体またはその断片を含むＣａｓタンパク質は、細胞から得ることができるか、または化学的に合成するか、もしくはこれらの２つの手順の組合せによって得ることができる。細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞、または、Ｃａｓタンパク質を天然に産生し、内因性Ｃａｓタンパク質をより高い発現レベルで産生するように遺伝子操作されているか、または、内因性Ｃａｓと同じであるか異なるＣａｓをコードする、外因的に導入される核酸からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作されている細胞であってよい。一部の場合には、細胞はＣａｓタンパク質を天然に産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作される。一部の実施形態ではＣａｓタンパク質は、ＡＡＶベクターを介した送達のための小さなＣａｓ９オルソログである（Ranら（２０１５年）Nature ５１０巻、１８６頁）。

【0106】

一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＴｔＡｇｏ系の一部である（Swartsら、同上；Shengら、同上を参照のこと）。真核生物では、遺伝子サイレンシングはアルゴノート（Ａｇｏ）ファミリーのタンパク質によって媒介される。このパラダイムでは、Ａｇｏは小さい（１９～３１ｎｔ）ＲＮＡに結合する。このタンパク質－ＲＮＡサイレンシング複合体は、小ＲＮＡと標的の間のワトソン－クリック型塩基対を通して標的ＲＮＡを認識し、標的ＲＮＡをエンドヌクレアーゼ的分解で（endonucleolytically）切断する（Vogel（２０１４年）Science ３４４巻：９７２～９７３頁）。対照的に、原核生物のＡｇｏタンパク質は小さい一本鎖ＤＮＡ断片に結合し、外来の（しばしばウイルスの）ＤＮＡを検出し、除去する機能をおそらく果たす（Yuanら、（２００５年）Mol. Cell １９巻、４０５頁；Olovnikovら、（２０１３年）Mol. Cell ５１巻、５９４頁；Swartsら、同上）。例示的な原核生物Ａｇｏタンパク質には、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓおよびＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのものが含まれる。

【0107】

最も良く特徴付けられた原核生物Ａｇｏタンパク質の１つは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのものである（ＴｔＡｇｏ；Swartsら、同上）。ＴｔＡｇｏは、５’リン酸基で１５ｎｔまたは１３～２５ｎｔの一本鎖ＤＮＡ断片と会合する。ＴｔＡｇｏに結合するこの「ガイドＤＮＡ」は、タンパク質－ＤＮＡ複合体がＤＮＡの第三者分子中のワトソン－クリック相補的ＤＮＡ配列に結合するように誘導する役目をする。これらのガイドＤＮＡ中の配列情報が標的ＤＮＡの同定を可能にしたら、ＴｔＡｇｏ－ガイドＤＮＡ複合体は標的ＤＮＡを切断する。そのような機構は、その標的ＤＮＡに結合する間、ＴｔＡｇｏ－ガイドＤＮＡ複合体の構造によっても支持される（G. Shengら、同上）。Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓからのＡｇｏ（ＲｓＡｇｏ）は、類似の特性を有する（Olivnikovら、同上）。

【0108】

任意のＤＮＡ配列の外因性ガイドＤＮＡを、ＴｔＡｇｏタンパク質にロードすることができる（Swartsら、同上）。ＴｔＡｇｏ切断の特異性はガイドＤＮＡによって方向づけられるので、外因性の、調査者によって指定されたガイドＤＮＡで形成されるＴｔＡｇｏ－ＤＮＡ複合体は、したがって、ＴｔＡｇｏ標的ＤＮＡ切断を相補的な調査者によって指定された標的ＤＮＡに導く。この様に、ＤＮＡにおいて標的化二本鎖切断を生じさせることができる。ＴｔＡｇｏ－ガイドＤＮＡ系（または、他の生物体からのオルソログのＡｇｏ－ガイドＤＮＡ系）の使用は、細胞の中でゲノムＤＮＡの標的化切断を可能にする。そのような切断は、一本鎖または二本鎖であってよい。哺乳動物のゲノムＤＮＡの切断のために、哺乳動物細胞での発現のために最適化されるバージョンのＴｔＡｇｏコドンを使用するのが好ましいであろう。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏで形成されるＴｔＡｇｏ－ＤＮＡ複合体で細胞を処理することが好ましい場合があり、ここで、ＴｔＡｇｏタンパク質は細胞貫通性ペプチドに融合される。さらに、３７℃で改善された活性を有するように変異誘発を通して変更された、ＴｔＡｇｏタンパク質のバージョンを使用することが好ましい場合がある。Ａｇｏ－ＲＮＡ媒介ＤＮＡ切断は、遺伝子ノックアウト、標的化遺伝子付加、遺伝子補正、ＤＮＡ切断の活用のための当技術分野で標準の技術を使用した標的化遺伝子欠失を含む転帰の一式（a panopoly of outcomes）に影響をもたらすために使用できた。

【0109】

したがって任意のＤＮＡ結合ドメインを使用することができる。

【0110】

融合分子
本明細書に記載されるＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ、単一ガイドＲＮＡなどのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成成分）を含み異種制御（機能的）ドメイン（またはその機能性断片）と会合する融合分子も提供される。共通ドメインには、例えば、転写因子ドメイン（活性化因子、抑制因子、共活性化因子、共抑制因子）、サイレンサー、オンコジーン（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバーなど）；ＤＮＡ修復酵素およびそれらの関連因子およびモディファイヤー；ＤＮＡ再編成酵素およびそれらの関連因子およびモディファイヤー；クロマチン関連タンパク質およびそれらのモディファイヤー（例えばキナーゼ、アセチラーゼおよび脱アセチル化酵素）；ならびにＤＮＡ改変酵素（例えば、メチル基転移酵素、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）およびそれらの関連因子およびモディファイヤーが含まれる。そのような融合分子には、本明細書に記載されるＤＮＡ結合ドメインを含む転写因子および転写制御ドメインならびにＤＮＡ結合ドメインを含むヌクレアーゼおよび１つまたは複数のヌクレアーゼドメインが含まれる。

【0111】

活性化を達成するために適するドメイン（転写活性化ドメイン）には、ＨＳＶ ＶＰ１６活性化ドメイン（例えばHagmannら、J. Virol. ７１巻、５９５２～５９６２頁（１９９７年）を参照）核内ホルモン受容体（例えばTorchiaら、Curr. Opin. Cell. Biol. １０巻：３７３～３８３頁（１９９８年）を参照）；核内因子カッパＢのｐ６５サブユニット（Bitko & Barik、J. Virol. ７２巻：５６１０～５６１８頁（１９９８年）およびDoyle & Hunt、Neuroreport ８巻：２９３７～２９４２頁（１９９７年））、Liuら、Cancer Gene Ther. ５巻：３～２８頁（１９９８年））、またはＶＰ６４などの人工キメラ機能的ドメイン（Beerliら、（１９９８年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９５巻：１４６２３～３３頁）、およびデグロン（Molinariら、（１９９９年）EMBO J. １８巻、６４３９～６４４７頁）が含まれる。さらなる例示的活性化ドメインには、Ｏｃｔ １、Ｏｃｔ－２Ａ、Ｓｐ１、ＡＰ－２およびＣＴＦ１（Seipelら、EMBO J. １１巻、４９６１～４９６８頁（１９９２年）ならびにｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１ ＰｖＡＬＦ、ＡｔＨＤ２ＡおよびＥＲＦ－２が含まれる。例えばRobyrら（２０００年）Mol. Endocrinol. １４巻：３２９～３４７頁、Collingwoodら（１９９９年）J. Mol. Endocrinol. ２３巻：２５５～２７５頁、Leoら（２０００年）Gene ２４５巻：１～１１頁、Manteuffel-Cymborowska （１９９９年）Acta Biochim. Pol. ４６巻：７７～８９頁、McKennaら（１９９９年）J. Steroid Biochem. Mol. Biol. ６９巻：３～１２頁、Malikら（２０００年）Trends Biochem. Sci. ２５巻：２７７～２８３頁およびLemonら（１９９９年）Curr. Opin. Genet. Dev. ９巻：４９９～５０４頁を参照。さらなる例示的活性化ドメインには、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ－１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ－５、－６、－７および－８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ－ＲＰ／ＧＰならびにＴＲＡＢ１が限定されずに含まれる。例えばOgawaら（２０００年）Gene ２４５巻：２１～２９頁、Okanamiら（１９９６年）Genes Cells １巻：８７～９９頁、Goffら（１９９１年）Genes Dev. ５巻：２９８～３０９頁、Choら（１９９９年）Plant Mol. Biol. ４０巻：４１９～４２９頁、Ulmasonら（１９９９年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９６巻：５８４４～５８４９頁、Sprenger-Hausselsら（２０００年）Plant J. ２２巻：１～８頁、Gongら（１９９９年）Plant Mol. Biol. ４１巻：３３～４４頁およびHoboら（１９９９年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９６巻：１５，３４８～１５，３５３頁を参照。

【0112】

ＤＮＡ結合ドメインと機能的ドメインとの間の融合タンパク質（またはそれをコードする核酸）形成において、活性化ドメインまたは活性化ドメインと相互作用する分子のいずれかが機能的ドメインとして好適であることは、当業者に明らかである。本質的に、活性化複合体および／または活性化活性（例えば、ヒストンアセチル化など）を標的遺伝子にリクルートすることが可能な任意の分子は、融合タンパク質の活性化ドメインとして有用である。融合分子での機能的ドメインとしての使用のために適する、インシュレータードメイン、局在性ドメインならびに、ＩＳＷＩ含有ドメインなどのクロマチンリモデリングタンパク質および／またはメチル結合ドメインタンパク質は、例えば米国特許第７，０５３，２６４号において記載されている。

【0113】

例示的抑制ドメインには、ＫＲＡＢ Ａ／Ｂ、ＫＯＸ、ＴＧＦベータ誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ－ｅｒｂＡ、ＳＩＤ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えばＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、ＲｂおよびＭｅＣＰ２が限定されずに含まれる。例えばBirdら（１９９９年）Cell ９９巻：４５１～４５４頁、Tylerら（１９９９年）Cell ９９巻：４４３～４４６頁、Knoepflerら（１９９９年）Cell ９９巻：４４７～４５０頁およびRobertsonら（２０００年）Nature Genet. ２５巻：３３８～３４２頁を参照。さらなる例示的抑制ドメインには、ＲＯＭ２およびＡｔＨＤ２Ａが限定されずに含まれる。例えばChemら（１９９６年）Plant Cell ８巻：３０５～３２１頁およびWuら（２０００年）Plant J. ２２巻：１９～２７頁を参照。

【0114】

融合分子は、当業者に周知であるクローニングおよび生化学的コンジュゲーションの方法によって構築される。融合分子は、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ｓｇＲＮＡ）および機能的ドメイン（例えば、転写活性化または抑制ドメイン）を含む。融合分子は、核局在化シグナル（例えばＳＶ４０中型Ｔ抗原（SV40 medium T-antigen）由来のものなど）およびエピトープタグ（例えばＦＬＡＧおよびヘマグルチニンなど）も任意選択で含む。融合タンパク質（およびそれらをコードする核酸）は、翻訳リーディングフレームが融合物の構成成分内で保存されるように設計される。

【0115】

一方が機能的ドメイン（またはその機能性断片）と、他方が非タンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、抗生物質、干渉物質、副溝バインダー、核酸）のポリペプチド構成成分の間の融合は、当業者に公知の生化学コンジュゲーションの方法によって構築される。例えばthe Pierce Chemical Company (Rockford、IL) Catalogueを参照。副溝バインダーとポリペプチドとの間の融合を作製するための方法および組成物が、記載されている。Mappら（２０００年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９７巻：３９３０～３９３５頁。さらにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の単一ガイドＲＮＡは、活性転写制御因子およびヌクレアーゼを形成するように機能的ドメインと会合する。

【0116】

ある特定の実施形態では標的部位は、細胞性クロマチンの到達可能な領域中に存在する。到達可能領域は、例えば米国特許第７，２１７，５０９号および第７，９２３，５４２号に記載の通り決定することができる。標的部位が細胞性クロマチンの到達可能領域に存在しない場合、１つまたは複数の到達可能領域を、米国特許第７，７８５，７９２号および第８，０７１，３７０号に記載の通り生成することができる。さらなる実施形態では融合分子のＤＮＡ結合ドメインは、その標的部位が到達可能領域中にあるかどうかに関わらず、細胞性クロマチンに結合することができる。例えばそのようなＤＮＡ結合ドメインは、リンカーＤＮＡおよび／またはヌクレオソームＤＮＡに結合可能である。この種類の「先駆」ＤＮＡ結合ドメインの例は、ある特定のステロイド受容体において、および肝細胞核因子３（ＨＮＦ３）において見出される（Cordingleyら（１９８７年）Cell ４８巻：２６１～２７０頁、Pinaら（１９９０年）Cell ６０巻：７１９～７３１頁およびCirilloら（１９９８年）EMBO J. １７巻：２４４～２５４頁）。

【0117】

融合分子は、当業者に公知である通り薬学的に許容されるキャリアを用いて製剤化することができる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第１７版、１９８５年ならびに米国特許第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号を参照。

【0118】

融合分子の機能的構成成分／ドメインは、融合分子がそのＤＮＡ結合ドメインを介して標的配列に結合すると、遺伝子の転写に影響を与えることが可能である種々の異なる構成成分のいずれかから選択することができる。それにより機能的構成成分には、活性化因子、抑制因子、共活性化因子、共抑制因子およびサイレンサーなどの種々の転写因子ドメインが限定されずに含まれる。

【0119】

さらなる例示的機能的ドメインは、例えば米国特許第６，５３４，２６１号および第６，９３３，１１３号に開示されている。

【0120】

外因性小分子またはリガンドによって制御される機能的ドメインはまた、選択することができる。例えばＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（登録商標）技術を用いることができ、ここで機能的ドメインは、外部ＲｈｅｏＣｈｅｍ（商標）リガンド（例えばＵＳ２００９０１３６４６５を参照）の存在下でその活性なコンフォーメーションだけを想定する。したがってＺＦＰは、調節可能な機能的ドメインに作動可能に連結でき、生じたＺＦＰ－ＴＦの活性は、外部リガンドによって調節される。

【0121】

ヌクレアーゼ
ある特定の実施形態では融合分子は、切断（ヌクレアーゼ）ドメインと会合しているＤＮＡ結合ドメインを含む。そのように遺伝子改変は、ヌクレアーゼ、例えば工学技術で作製されたヌクレアーゼを使用して達成することができる。工学技術で作製されるヌクレアーゼ技術は、天然に存在するＤＮＡ結合タンパク質の工学技術に基づいている。例えば、目的に合わせたＤＮＡ結合特異性を有するホーミングエンドヌクレアーゼの工学技術は記載されている。Chamesら（２００５年）Nucleic Acids Res ３３巻（２０号）:ｅ１７８頁、Arnouldら（２００６年）J. Mol. Biol. ３５５巻：４４３～４５８頁。さらに、ＺＦＰの工学技術も記載されている。例えば米国特許第６，５３４，２６１号、第６，６０７，８８２号、第６，８２４，９７８号、第６，９７９，５３９号、第６，９３３，１１３号、第７，１６３，８２４号および第７，０１３，２１９号を参照。

【0122】

さらにＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥは、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ－その工学技術で作製された（ＺＦＰまたはＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインを通じてその所期の核酸標的を認識することができ、ヌクレアーゼ活性を介してＤＮＡ結合部位近くでＤＮＡが切断されるようにする機能的実体、を作り出すようにヌクレアーゼドメインに融合することができる。

【0123】

したがって本明細書に記載される方法および組成物は、広範に適用可能であり、目的の任意のヌクレアーゼを含むことができる。ヌクレアーゼの非限定的例には、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮおよびジンクフィンガーヌクレアーゼが含まれる。ヌクレアーゼは、異種ＤＮＡ結合および切断ドメイン（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、異種切断ドメインを含むメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）を含むことができる、または代替的に、天然に存在するヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、選択された標的部位に結合するように変更することができる（例えば、コグネイト結合部位とは異なる部位に結合するように工学技術で作製されたメガヌクレアーゼ）。

【0124】

本明細書に記載されるいずれのヌクレアーゼでも、ヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮとも呼ばれる、工学技術で作製されたＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼドメイン（例えば、エンドヌクレアーゼおよび／またはメガヌクレアーゼドメイン）を含むことができる。使用者が選択した標的配列との堅牢な、部位特異的相互作用のためにこれらのＴＡＬＥＮタンパク質を工学技術で作製するための方法および組成物は公開されている（米国特許第８，５８６，５２６号を参照）。一部の実施形態ではＴＡＬＥＮは、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）切断ドメインまたは切断半ドメインを含む。他の実施形態ではＴＡＬＥヌクレアーゼは、メガＴＡＬである。これらのメガＴＡＬヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよびメガヌクレアーゼ切断ドメインを含む融合タンパク質である。メガヌクレアーゼ切断ドメインは、単量体として活性であり、活性のために二量体化を必要としない（Boisselら、（２０１３年）Nucl Acid Res：１～１３頁、doi: 10.1093/nar/gkt1224を参照）。さらにヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ結合機能性を示すこともできる。

【0125】

なおさらなる実施形態では、ヌクレアーゼは、コンパクトなＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮ）を含む。これらは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインをＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに連結する単鎖融合タンパク質である。融合タンパク質は、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインがＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに関してどこに配置されるかに応じて、ＴＡＬＥ領域によって局在化されたニッカーゼとして作用することができるか、または二本鎖切断を引き起こすことができる（Beurdeleyら（２０１３年）Nat Comm：１～８頁、DOI: 10.1038/ncomms2782を参照）。任意のＴＡＬＥＮを、さらなるＴＡＬＥＮ（例えば、１つもしくは複数のメガＴＡＬによる１つもしくは複数のＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮまたはＦｏｋＩ－ＴＡＬＥＮ））または他のＤＮＡ切断酵素と組み合わせて使用することができる。

【0126】

ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）または切断活性を示すその一部を含む。天然に存在するメガヌクレアーゼは１５～４０塩基対の切断部位を認識し、４つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ－ＣｙｓｔボックスファミリーおよびＨＮＨファミリーに一般的に分類される。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼには、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩおよびＩ－ＴｅｖＩＩＩが含まれる。それらの認識配列は公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Belfortら（１９９７年）Nucleic Acids Res.２５巻：３３７９～３３８８頁；Dujonら（１９８９年）Gene ８２巻：１１５～１１８頁；Perlerら（１９９４年）Nucleic Acids Res.２２巻、１１２５～１１２７頁；Jasin（１９９６年）Trends Genet.１２巻：２２４～２２８頁；Gimbleら（１９９６年）J. Mol. Biol.２６３巻：１６３～１８０頁；Argastら（１９９８年）J. Mol. Biol.２８０巻：３４５～３５３頁およびNew England Biolabsカタログも参照。

【0127】

天然に存在するメガヌクレアーゼ由来、主にＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー由来のＤＮＡ結合ドメインは、植物、酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、哺乳動物細胞およびマウスにおける部位特異的ゲノム改変を促進するために使用されているが、このアプローチは、メガヌクレアーゼ認識配列を保存するいずれかの相同性遺伝子の改変（Monetら（１９９９年）、Biochem. Biophysics. Res. Common. ２５５巻：８８～９３頁）または認識配列が導入される工学技術で作製される前のゲノムへの改変（Routeら（１９９４年）、Mol. Cell. Biol. １４巻：８０９６～１０６頁、Chiltonら（２００３年）、Plant Physiology. １３３巻：９５６～６５頁、Puchtaら（１９９６年）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９３巻：５０５５～６０頁、Rongら（２００２年）、Genes Dev. １６巻：１５６８～８１頁、Goubleら（２００６年）、J. Gene Med. ８巻（５号）：６１６～６２２頁）に限定されている。したがって、医学的にまたは生物工学的に関連する部位で新規結合特異性を示すメガヌクレアーゼを工学技術で作製する試みがなされている（Porteusら（２００５年）、Nat. Biotechnol. ２３巻：９６７～７３頁、Sussmanら（２００４年）、J. Mol. Biol. ３４２巻：３１～４１頁、Epinatら（２００３年）、Nucleic Acids Res. ３１巻：２９５２～６２頁、Chevalierら（２００２年）Molec. Cell １０巻：８９５～９０５頁、Epinatら（２００３年）Nucleic Acids Res. ３１巻：２９５２～２９６２頁、Ashworthら（２００６年）Nature ４４１巻：６５６～６５９頁、Paquesら（２００７年）Current Gene Therapy ７巻：４９～６６頁、米国特許出願公開第２００７０１１７１２８号、第２００６０２０６９４９号、第２００６０１５３８２６号、第２００６００７８５５２号および第２００４０００２０９２）。さらに、メガヌクレアーゼ由来の天然に存在するまたは工学技術で作製されたＤＮＡ結合ドメインは、異種ヌクレアーゼ由来の切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩ）と作動可能に連結することができる、および／またはメガヌクレアーゼ由来の切断ドメインは異種ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ）と作動可能に連結することができる。

【0128】

他の実施形態では、ヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインヌクレアーゼ融合物（ＴＡＬＥＮ）である。ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮは、選り抜きの遺伝子中の標的部位に結合するように工学技術で作製されたＤＮＡ結合ドメイン（ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン）および切断ドメインまたは切断半ドメイン（例えば、本明細書に記載される制限および／またはメガヌクレアーゼ由来）を含む。

【0129】

上で詳述されているように、ジンクフィンガー結合ドメインおよびＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、選り抜きの配列に結合するように工学技術で作製することができる。例えばBeerliら（２００２年）Nature Biotechnol. ２０巻：１３５～１４１頁、Paboら（２００１年）Ann. Rev. Biochem. ７０巻：３１３～３４０頁、Isalanら（２００１年）Nature Biotechnol. １９巻：６５６～６６０頁、Segalら（２００１年）Curr. Opin. Biotechnol. １２巻：６３２～６３７頁、Chooら（２０００年）Curr. Opin. Struct. Biol. １０巻：４１１～４１６頁を参照。工学技術で作製されたジンクフィンガー結合ドメインまたはＴＡＬＥタンパク質は、天然に存在するタンパク質と比較して、新規の結合特異性を有することができる。工学技術方法には、合理的な設計および様々な種類の選択が限定されずに含まれる。合理的な設計には、例えば、トリプレット（または、クアドルプレット）ヌクレオチド配列および個々の、ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが含まれ、ここで、各トリプレットまたはクアドルプレットヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクアドルプレット配列に結合するジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ反復単位の１つまたは複数のアミノ酸配列と会合している。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号を参照。

【0130】

標的部位の選択；および融合タンパク質（および、それをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は当業者に公知であり、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれている、米国特許第７，８８８，１２１号および第８，４０９，８６１号に詳細に記載されている。

【0131】

さらに、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメイン、ＴＡＬＥおよび／またはマルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質は、例えば５またはそれより多くのアミノ酸長のリンカーを含む、任意の適するリンカー配列を使用して一緒に連結することができる。長さが６またはそれより多くのアミノ酸の例示的なリンカー配列については、例えば、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号を参照のこと。本明細書に記載されるタンパク質には、タンパク質の個々のジンクフィンガーの間の適するリンカーの任意の組合せを含めることができる。米国特許第８，７７２，４５３号も参照されたい。

【0132】

それによりＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよび／またはメガヌクレアーゼなどのヌクレアーゼは、任意のＤＮＡ結合ドメインおよび任意のヌクレアーゼ（切断）ドメイン（切断ドメイン、切断半ドメイン）を含むことができる。上記したように、切断ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインに対して異種であってもよく、例として、ジンクフィンガーもしくはＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインとヌクレアーゼ由来切断ドメイン、またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインと異なるヌクレアーゼ由来の切断ドメインである。異種切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインを誘導することができる例示的なエンドヌクレアーゼとしては、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、２００２～２００３年のカタログ、New England Biolabs、Beverly、MA；およびBelfortら（１９９７年）Nucleic Acids Res.２５巻：３３７９～３３８８頁を参照のこと。ＤＮＡを切断するさらなる酵素は公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；リョクトウヌクレアーゼ；膵臓のＤＮアーゼＩ；ミクロコッカルヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Linnら（編）Nucleases、Cold Spring Harbor Laboratory Press、１９９３年も参照）。これらの酵素の１つまたは複数（または、それらの機能的断片）は、切断ドメインおよび切断半ドメインの供給源として使用することができる。

【0133】

同様に、上記のように、切断活性のために二量体化を必要とする切断半ドメインは、任意のヌクレアーゼまたはその部分に由来することができる。一般に、２つの融合タンパク質が切断半ドメインを含む場合は、該２つの融合タンパク質が切断のために必要とされる。あるいは、２つの切断半ドメインを含む単一のタンパク質を使用することができる。２つの切断半ドメインは同じエンドヌクレアーゼ（または、その機能的断片）に由来することができ、または、各切断半ドメインは異なるエンドヌクレアーゼ（または、その機能的断片）に由来することができる。さらに、２つの融合タンパク質のそれらのそれぞれの標的部位への結合が、切断半ドメインを、お互いとの空間配向に置き、切断半ドメインが、例えば二量体化によって機能的切断ドメインを形成することを可能にするように、２つの融合タンパク質のための標的部位が、好ましくはお互いに関して配置される。したがって、ある特定の実施形態では、標的部位の近端は、５～８ヌクレオチドまたは１５～１８ヌクレオチド分離している。しかし、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの標的部位の間に介入することができる（例えば、２から５０ヌクレオチド対、またはそれより多い）。一般に、切断部位は標的部位の間にあるが、切断部位から１～５０塩基対の間（または、１～５、１～１０および１～２０塩基対を含むその間の任意の値）、１～１００塩基対の間（または、その間の任意の値）、１００～５００塩基対の間（または、その間の任意の値）、５００～１０００塩基対の間（または、その間の任意の値）またはさらには１ｋｂ超を含む、切断部位から１またはそれより大きいキロベース離れて存在することができる。

【0134】

制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多くの種に存在し、ＤＮＡ（認識部位で）に配列特異的に結合すること、および結合部位またはその近くでＤＮＡを切断することが可能である。ある特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から離れた部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素Ｆｏｋ Ｉは、１本の鎖の上のその認識部位から９ヌクレオチドの位置、および他の鎖の上のその認識部位から１３ヌクレオチドの位置で、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；第５，４３６，１５０号および第５，４８７，９９４号；ならびにLiら（１９９２年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８９巻：４２７５～４２７９頁；Liら（１９９３年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９０巻：２７６４～２７６８頁；Kimら（１９９４ａ）Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９１巻：８８３～８８７頁；Kimら（１９９４ｂ）J. Biol. Chem.２６９巻：３１，９７８～３１，９８２頁を参照のこと。したがって、一実施形態では、融合タンパク質は、工学技術で作製されてもされなくてもよい、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素からの切断ドメイン（または、切断半ドメイン）、および１つまたは複数のジンクフィンガー結合ドメインを含む。

【0135】

その切断ドメインは結合ドメインと分離できる例示的なＩＩＳ型制限酵素は、Ｆｏｋ Ｉである。この特定の酵素は、ダイマーとして活性である。Bitinaiteら（１９９８年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９５巻：１０，５７０～１０，５７５頁。したがって、本開示のために、開示される融合タンパク質で使用されるＦｏｋ Ｉ酵素の部分は、切断半ドメインと考えられる。したがって、ジンクフィンガー－Ｆｏｋ Ｉ融合物を使用した標的化二本鎖切断および／または細胞配列の標的化置き換えのために、各々Ｆｏｋ Ｉ切断半ドメインを含む２つの融合タンパク質を、触媒活性切断ドメインを再構成するために使用することができる。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ切断半ドメインを含有する単一のポリペプチド分子を使用することもできる。ジンクフィンガー－ＦｏｋＩ融合物を使用した標的化切断および標的化配列変更のパラメータは、この開示の他の場所で提供される。

【0136】

切断ドメインまたは切断半ドメインは、切断活性を保持する、または多量体化（例えば、二量体化）して機能的切断ドメインを形成する能力を保持するタンパク質の任意の部分であってよい。

【0137】

例示的なＩＩＳ型制限酵素は、その全体が本明細書に組み入れられる、国際公開ＷＯ０７／０１４２７５に記載される。さらなる制限酵素も分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを含有し、これらは本開示によって企図される。例えば、Robertsら（２００３年）Nucleic Acids Res.３１巻：４１８～４２０頁を参照のこと。

【0138】

ある特定の実施形態では、切断ドメインは、例えば、その全ての開示は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第７，９１４，７９６号；同第８，０３４，５９８号および同第８，６２３，６１８号ならびに米国特許出願公開第２０１１０２０１０５５号に記載される通り、ホモ二量体化を最小にするかまたは防止する１つまたは複数の工学技術で作製された切断半ドメイン（二量体化ドメイン変異体とも呼ばれる）を含む。Ｆｏｋ Ｉの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７および５３８位のアミノ酸残基は、全て、Ｆｏｋ Ｉ切断半ドメインの二量体化に影響を与えるための標的である。

【0139】

絶対ヘテロダイマーを形成するＦｏｋ Ｉの例示的な工学技術で作製された切断半ドメインは、第１の切断半ドメインがＦｏｋ Ｉの４９０および５３８位のアミノ酸残基の変異を含み、第２の切断半ドメインがアミノ酸残基４８６および４９９の変異を含む対を含む。

【0140】

したがって、一実施形態では、４９０での変異はＧｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換え；５３８での変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換え；４８６での変異はＧｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）で置き換え；４９９位での変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換える。具体的には、本明細書に記載される工学技術で作製された切断半ドメインは、１つの切断半ドメインの４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）を変異させて、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と呼ばれる工学技術で作製された切断半ドメインを産生すること、ならびに、別の切断半ドメインの４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を変異させて、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と呼ばれる工学技術で作製された切断半ドメインを産生することによって調製された。本明細書に記載される工学技術で作製された切断半ドメインは、異常な切断を最小にするかまたは無効にする絶対ヘテロダイマー変異体である。例えば、その開示は全ての目的のために参照によりその全体が組み込まれる、米国特許第７，９１４，７９６号および同第８，０３４，５９８号を参照のこと。特定の実施形態では、工学技術で作製された切断半ドメインは、（野生型ＦｏｋＩに対して番号付けされる）４８６位、４９９位および４９６位における変異、例えば、４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基で、４９９位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基で、および４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換える変異（それぞれ、「ＥＬＤ」ドメインおよび「ＥＬＥ」ドメインとも呼ばれる）を含む。他の実施形態では、工学技術で作製された切断半ドメインは、４９０位、５３８位および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対して番号付けされる）における変異；例えば、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、５３８位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、および、５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える変異（それぞれ、「ＫＫＫ」ドメインおよび「ＫＫＲ」ドメインとも呼ばれる）を含む。他の実施形態では、工学技術で作製された切断半ドメインは、４９０位および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対して番号付けされる）における変異、例えば、４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、および、５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える変異（それぞれ、「ＫＩＫ」ドメインおよび「ＫＩＲ」ドメインとも呼ばれる）を含む。例えば、その開示は全ての目的のために参照によりその全体が組み込まれる、米国特許第７，９１４，７９６号；第８，０３４，５９８号および第８，６２３，６１８号を参照のこと。他の実施形態では、工学技術で作製された切断半ドメインは、「Ｓｈａｒｋｅｙ」および／または「Ｓｈａｒｋｅｙ」変異を含む（Guoら、（２０１０年）J. Mol. Biol.４００巻（１号）：９６～１０７頁を参照のこと）。

【0141】

あるいは、ヌクレアーゼを、いわゆる「スプリット酵素」技術を使用して核酸標的部位にｉｎ ｖｉｖｏで組み立てることができる（例えば、米国特許出願公開第２００９００６８１６４号を参照のこと）。そのようなスプリット酵素の構成成分は、別個の発現構築物の上で発現させることができるか、または１つのオープンリーディングフレームの中に連結させることもでき、ここで、個々の構成成分は、例えば、自己切断２ＡペプチドまたはＩＲＥＳ配列によって分離される。構成成分は、個々のジンクフィンガー結合ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであってよい。

【0142】

ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮおよび／またはＴＡＬＥＮ）は、使用前に、例えば米国特許第８，５６３，３１４号に記載されるとおりに、酵母をベースとした染色体系において、活性についてスクリーニングすることができる。

【0143】

ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含む。系のＲＮＡ構成成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列）遺伝子座、およびタンパク質をコードするＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Jansenら、２００２年、Mol. Microbiol.４３巻：１５６５～１５７５頁；Makarovaら、２００２年、Nucleic Acids Res.３０巻：４８２～４９６頁；Makarovaら、２００６年、Biol. Direct １巻：７頁；Haftら、２００５年、PLoS Comput. Biol.１巻：ｅ６０頁）が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の遺伝子配列を構成する。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子の組合せ、ならびにＣＲＩＳＰＲ媒介核酸切断の特異性をプログラムすることが可能な非コードＲＮＡエレメントを含有する。

【0144】

ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは最も良く特徴付けられた系の１つであり、４つの逐次的ステップで標的化ＤＮＡ二本鎖切断を実行する。先ず、２つの非コードＲＮＡ、プレｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡはプレｃｒＲＮＡのリピート領域にハイブリダイズし、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのプレｃｒＲＮＡのプロセシングを媒介する。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーとプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間のワトソン－クリック塩基対合を通して、Ｃａｓ９を標的ＤＮＡに向けるが、これは、標的認識のためのさらなる要件である。最後に、Ｃａｓ９は標的ＤＮＡの切断を媒介して、プロトスペーサー内に二本鎖切断を生じさせる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３つのステップで構成される：（ｉ）「適応」と呼ばれるプロセスにおける、将来の攻撃を防止するためのＣＲＩＳＰＲアレイへのエイリアンＤＮＡ配列の挿入、（ｉｉ）関連するタンパク質の発現、ならびにアレイの発現およびプロセシング、続いて（ｉｉｉ）エイリアン核酸に対するＲＮＡ媒介干渉。したがって、細菌細胞では、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のいくつかはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然の機能に関与し、エイリアンＤＮＡの挿入などの機能における役割を果たすなどである。

【0145】

一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１系が使用される。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｓｐｐにおいて同定されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１系は、ヒト細胞において堅牢なＤＮＡ干渉を媒介するクラス２ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。機能は保存されているが、Ｃｐｆ１とＣａｓ９とは、それらのガイドＲＮＡおよび基質特異性を含む多くの態様において異なっている（Fagerlundら、（２０１５年）Genom Bio １６巻：２５１頁を参照）。Ｃａｓ９とＣｐｆ１タンパク質との間の主な差異は、Ｃｐｆ１がｔｒａｃｒＲＮＡを利用せず、そのためｃｒＲＮＡのみを必要とすることである。ＦｎＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡは、４２～４４ヌクレオチド長（１９ヌクレオチド反復および２３～２５ヌクレオチドスペーサー）であり、二次構造を保持する配列変化を許容する単一のステムループを含有する。さらにＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９によって必要とされる工学技術で作製されたｓｇＲＮＡより約１００ヌクレオチド超有意に短く、ＦｎＣｐｆｌについてのＰＡＭ要件は置換鎖（displaced strand）上の５’－ＴＴＮ－３’および５’－ＣＴＡ－３’である。Ｃａｓ９およびＣｐｆ１の両方は、標的ＤＮＡ中に二重鎖切断を作製するが、Ｃａｓ９はガイドＲＮＡのシード配列内に平滑末端切断を作製するためにそのＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメインを使用する一方で、Ｃｐｆ１はシードの外側に互い違いの切断を産生するためにＲｕｖＣ様ドメインを使用する。Ｃｐｆ１が重要なシード領域から離れて、互い違いの切断を作製することから、ＮＨＥＪは標的部位を破壊せず、したがってＣｐｆ１が、所望のＨＤＲ組換え事象が生じるまで同じ部位を切断し続けることができることを確実にする。それにより、本明細書に記載される方法および組成物において、用語「Ｃａｓ」がＣａｓ９およびＣｐｆ１タンパク質の両方を含むことが理解される。それにより、本明細書において使用される「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム」は、ヌクレアーゼおよび／または転写因子システムの両方を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムの両方を指す。

【0146】

ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質の「機能的誘導体」であってよい。天然配列ポリペプチドの「機能的誘導体」は、天然配列ポリペプチドと共通した定性的生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」には、天然配列の断片、天然配列ポリペプチドの誘導体およびその断片が限定されずに含まれるが、ただし、それらは対応する天然配列ポリペプチドと共通する生物学的活性を有する。本明細書で企図される生物学的活性は、ＤＮＡ基質を断片に加水分解する機能的誘導体の能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、共有結合性改変物およびその融合物を包含する。Ｃａｓポリペプチドの適する誘導体またはその断片には、Ｃａｓタンパク質の変異体、融合物、共有結合性改変物またはその断片が限定されずに含まれる。Ｃａｓタンパク質またはその断片、ならびにＣａｓタンパク質の誘導体またはその断片を含むＣａｓタンパク質は、細胞から、または化学して得ることができるか、あるいはこれらの２つの手順を組み合わせて得ることができる。細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞、または、Ｃａｓタンパク質を天然に産生し、内因性Ｃａｓタンパク質をより高い発現レベルで産生するように遺伝子操作されているか、もしくは、内因性Ｃａｓと同じであるかまたは異なるＣａｓをコードする、外因的に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作されている細胞であってよい。一部の場合には、細胞はＣａｓタンパク質を天然に産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作される。

【0147】

ＴＣＲ遺伝子および他の遺伝子を標的化する例示的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系は、例えば米国特許出願公開第２０１５００５６７０５号に開示されている。

【0148】

ヌクレアーゼ（複数可）は、標的部位で１つまたは複数の２本鎖および／または１本鎖切断を作製することができる。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、触媒として不活性な切断ドメインを含む（例えば、ＦｏｋＩおよび／またはＣａｓタンパク質）。例えば、米国特許第９，２００，２６６号、第８，７０３，４８９号およびGuillingerら（２０１４年）Nature Biotech. ３２巻（６号）：５７７～５８２頁を参照。触媒として不活性な切断ドメインは、触媒として活性なドメインと組み合わせて１本鎖切断を作製するためのニッカーゼとして作用することができる。したがって、２つのニッカーゼは特異的領域において２本鎖切断を作製するために組み合わせて使用することができる。さらなるニッカーゼも、当技術分野において公知であり、例えばMcCafferyら（２０１６年）Nucleic Acids Res. ４４巻（２号）:ｅ１１頁. doi: 10.1093/nar/gkv878. Epub 2015 Oct 19において公知である。

【0149】

送達
タンパク質（例えば、転写因子、ヌクレアーゼ、ＴＣＲおよびＣＡＲ分子）、ポリヌクレオチドならびに／または本明細書に記載されるタンパク質および／もしくポリヌクレオチドを含む組成物は、例えばタンパク質および／またはｍＲＮＡ構成成分の注射によってを含む任意の適する手段によって標的細胞に送達することができる。

【0150】

適する細胞には、真核および原核細胞ならびに／または細胞株が限定されずに含まれる。そのような細胞またはそのような細胞から生成された細胞株の非限定的例は、Ｔ細胞、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＤＧ４４、ＣＨＯ－ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ－ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８－Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０－Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ２９３－Ｈ、ＨＥＫ２９３－Ｔ）およびｐｅｒＣ６細胞、ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）などの昆虫細胞、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓなどの真菌細胞を含む。ある特定の実施形態では細胞株は、ＣＨＯ－Ｋ１、ＭＤＣＫまたはＨＥＫ２９３細胞株である。適する細胞は、例として、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、造血幹細胞、ニューロン幹細胞および間葉系幹細胞などの幹細胞も含む。

【0151】

本明細書に記載されるＤＮＡ結合ドメインを含むタンパク質を送達する方法は、例えば、その全ての開示は参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第６，４５３，２４２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，６０７，８８２号；同第６，６８９，５５８号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９３３，１１３号；同第６，９７９，５３９号；同第７，０１３，２１９号；および同第７，１６３，８２４号に記載される。

【0152】

ＤＮＡ結合ドメインおよび本明細書に記載されるこれらのＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質も、１つまたは複数のＤＮＡ結合タンパク質をコードする配列を含有するベクターを使用して送達することができる。さらに、さらなる核酸（例えば、ドナー）もこれらのベクターを介して送達することができる。プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターなどを限定されずに含む、任意のベクター系を使用することができる。参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる、米国特許第６，５３４，２６１号；同第６，６０７，８８２号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９３３，１１３号；同第６，９７９，５３９号；同第７，０１３，２１９号；および同第７，１６３，８２４号も参照。さらに、これらのベクターのいずれもが１つもしくは複数のＤＮＡ結合タンパク質コード配列および／またはさらなる核酸を必要に応じて含むことができることは明らかである。それにより、本明細書に記載される１つまたは複数のＤＮＡ結合タンパク質、および必要に応じてさらなるＤＮＡが細胞に導入される場合、それらは同じベクター上でまたは異なるベクター上で運ばれ得る。複数のベクターが使用される場合、各ベクターは１つまたは複数のＤＮＡ結合タンパク質をコードする配列および所望のさらなる核酸を含むことができる。

【0153】

従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子移行法は、工学技術で作製されたＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸を細胞（例えば、哺乳動物細胞）および標的組織に導入するために、ならびに所望のさらなるヌクレオチド配列を共導入するために使用することができる。そのような方法は、核酸（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質および／またはドナーをコードする）を細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏ投与するために使用できる。ある特定の実施形態では、核酸は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療用途のために投与される。非ウイルス性のベクター送達系には、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、およびリポソーム、脂質ナノ粒子またはポロキサマーなどの送達ビヒクルと複合体を形成した核酸が含まれる。ウイルスベクター送達系にはＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスが含まれ、それらは、細胞への送達後にエピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有する。遺伝子治療手順のレビューについては、Anderson、Science ２５６巻：８０８～８１３頁（１９９２年）；NabelおよびFelgner、TIBTECH １１巻：２１１～２１７頁（１９９３年）；MitaniおよびCaskey、TIBTECH １１巻：１６２～１６６頁（１９９３年）；Dillon、TIBTECH １１巻：１６７～１７５頁（１９９３年）；Miller、Nature ３５７巻：４５５～４６０頁（１９９２年）；Van Brunt、Biotechnology ６巻（１０号）：１１４９～１１５４頁（１９８８年）；Vigne、Restorative Neurology and Neuroscience ８巻：３５～３６頁（１９９５年）；KremerおよびPerricaudet、British Medical Bulletin ５１巻（１号）：３１～４４頁（１９９５年）；Haddadaら、Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Boehm（編）（１９９５年）；およびYuら、Gene Therapy １巻：１３～２６頁（１９９４年）を参照のこと。

【0154】

核酸の非ウイルス性の送達方法には、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ビロソーム、リポソーム、脂質ナノ粒子、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、ｍＲＮＡ、人工ビリオンおよび作用物質によって強化されたＤＮＡの取込みが含まれる。例えばＳｏｎｉｔｒｏｎ ２０００システム（Ｒｉｃｈ－Ｍａｒ）を使用するソノポレーションを、核酸の送達のために使用することもできる。好ましい実施形態では、１つまたは複数の核酸は、ｍＲＮＡとして送達される。同様に好ましいのは、翻訳効率の増加のためおよび／またはｍＲＮＡ安定性のためのキャッピングされたｍＲＮＡの使用である。特に好ましいのは、ＡＲＣＡ（抗リバースキャップ類似物）キャップまたはそのバリアントである。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，０７４，５９６号および第８，１５３，７７３号を参照。

【0155】

さらなる例示的な核酸送達系には、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．によって提供されるものが含まれる、（例えば、ＵＳ６００８３３６を参照のこと）。リポフェクションは、例えば、ＵＳ５，０４９，３８６；ＵＳ４，９４６，７８７；およびＵＳ４，８９７，３５５に記載され、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションのために適するカチオン性および中性脂質には、Ｆｅｌｇｎｅｒ、ＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４のものが含まれる。送達は、細胞に対して（ｅｘ ｖｉｖｏ投与）、または標的組織に対して（ｉｎ ｖｉｖｏ投与）であり得る。

【0156】

免疫脂質複合体などの標的化リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Crystal、Science ２７０巻：４０４～４１０頁（１９９５年）；Blaeseら、Cancer Gene Ther.２巻：２９１～２９７頁（１９９５年）；Behrら、Bioconjugate Chem.５巻：３８２～３８９頁（１９９４年）；Remyら、Bioconjugate Chem.５巻：６４７～６５４頁（１９９４年）；Gaoら、Gene Therapy ２巻：７１０～７２２頁（１９９５年）；Ahmadら、Cancer Res.５２巻：４８１７～４８２０頁（１９９２年）；米国特許第４，１８６，１８３号、４，２１７，３４４号、４，２３５，８７１号、４，２６１，９７５号、４，４８５，０５４号、４，５０１，７２８号、４，７７４，０８５号、４，８３７，０２８号および４，９４６，７８７号を参照のこと）。

【0157】

送達のさらなる方法には、送達する核酸をＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）にパッケージすることの使用が含まれる。これらのＥＤＶは、二重特異的抗体の１つのアームが標的組織への特異性を有し、他方がＥＤＶへの特異性を有する二重特異的抗体を使用して、標的組織に特異的に送達される。抗体はＥＤＶを標的細胞表面に運び、次に、ＥＤＶはエンドサイトーシスによって細胞に運ばれる。細胞に入ると、内容物は放出される（MacDiarmidら（２００９年）Nature Biotechnology ２７巻（７号）：６４３頁を参照されたい）。

【0158】

所望により、工学技術で作製されたＤＮＡ結合タンパク質、および／またはドナー（例えば、ＣＡＲまたはＡＣＴＲ）をコードする核酸の送達のための、ＲＮＡウイルスベースのまたはＤＮＡウイルスベースの系の使用は、体内の特異的細胞にウイルスを向かわせて、核にウイルスのペイロードを輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者に直接的に（ｉｎ ｖｉｖｏで）投与することができるか、または、それらは細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで処置するために使用することができ、改変された細胞は患者に（ｅｘ ｖｉｖｏで）投与される。核酸の送達のための従来のウイルスベースの系には、遺伝子導入のためのレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、ワクシニアベクターおよび単純ヘルペスウイルスベクターが限定されずに含まれる。宿主ゲノムへの組込みは、レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス遺伝子導入方法で可能であり、挿入される導入遺伝子の長期発現をしばしばもたらす。さらに、多くの異なる細胞型および標的組織において、高い形質導入効率が観察された。

【0159】

外来のエンベロープタンパク質を組み込み、標的細胞の潜在的標的集団を拡張することによって、レトロウイルスの向性を変更することができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入または感染させ、高いウイルス力価を一般的にもたらすことができるレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最高６～１０ｋｂの外来配列のためのパッケージング能力を有するシス作用性ロングターミナルリピートで構成される。ベクターの複製およびパッケージングのために最小限のシス作用性ＬＴＲが十分であり、それらは次に、恒久的導入遺伝子発現を提供するために標的細胞の中に治療的遺伝子を組み込むために使用される。広く使用されているレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に基づくものおよびそれらの組合せが含まれる（例えば、Buchscherら、J. Virol.６６巻：２７３１～２７３９頁（１９９２年）；Johannら、J. Virol.６６巻：１６３５～１６４０頁（１９９２年）；Sommerfeltら、Virol.１７６巻：５８～５９頁（１９９０年）；Wilsonら、J. Virol.６３巻：２３７４～２３７８頁（１９８９年）；Millerら、J. Virol.６５巻：２２２０～２２２４頁（１９９１年）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照のこと）。

【0160】

一過性の発現が好まれる適用では、アデノウイルスをベースにした系を使用することができる。アデノウイルスをベースにしたベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターで、高い力価および高レベルの発現が得られた。このベクターは、比較的単純な系において大量に産生することができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターは、例えば、核酸およびペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生において、ならびにｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏの遺伝子治療手順のために、標的核酸で細胞を形質導入するためにも使用される（例えば、Westら、Virology １６０巻：３８～４７頁（１９８７年）；米国特許第４，７９７，３６８号；ＷＯ９３／２４６４１；Kotin、Human Gene Therapy ５巻：７９３～８０１頁（１９９４年）；Muzyczka、J. Clin. Invest.９４巻：１３５１頁（１９９４年）を参照のこと。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Tratschinら、Mol. Cell. Biol.５巻：３２５１～３２６０頁（１９８５年）；Tratschinら、Mol. Cell. Biol.４巻：２０７２～２０８１頁（１９８４年）；HermonatおよびMuzyczka、PNAS USA ８１巻：６４６６～６４７０頁（１９８４年）；およびSamulskiら、J. Virol.６３巻：０３８２２～３８２８頁（１９８９年）を含む、いくつかの刊行物に記載されている。

【0161】

臨床試験での遺伝子導入のために少なくとも６つのウイルスベクターアプローチが今日利用でき、それらは、形質導入剤を生成するためにヘルパー細胞株に挿入された遺伝子による欠損ベクターの補完を含むアプローチを利用する。

【0162】

ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ－Ｓは、臨床試験で使用されたレトロウイルスベクターの例である（Dunbarら、Blood ８５巻：３０４８～３０５頁（１９９５年）；Kohnら、Nat. Med.１巻：１０１７～１０２頁（１９９５年）；Malechら、PNAS USA ９４巻：２２ １２１３３～１２１３８頁（１９９７年））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療治験で使用された最初の治療的ベクターであった。（Blaeseら、Science ２７０巻：４７５～４８０頁（１９９５年））。ＭＦＧ－Ｓパッケージベクターで、５０％またはそれより高い形質導入効率が観察された。（Ellemら、Immunol Immunother.４４巻（１号）：１０～２０頁（１９９７年）；Dranoffら、Hum. Gene Ther.１巻：１１１～２頁（１９９７年）。

【0163】

組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損非病原性パルボウイルスアデノ随伴２型ウイルスに基づく有望な代替遺伝子送達系である。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶ １４５ｂｐ逆方向末端反復だけを保持するプラスミドに由来する。形質導入細胞のゲノムへの組込みに起因する効率的な遺伝子導入および安定した導入遺伝子送達は、このベクター系の鍵となる特徴である。（Wagnerら、Lancet ３５１巻：９１１７ １７０２～３頁（１９９８年）、Kearnsら、Gene Ther.９巻：７４８～５５頁（１９９６年））。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０ならびにＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６などの偽型化ＡＡＶを含む他のＡＡＶ血清型を、本発明に従って使用することもできる。

【0164】

複製欠損組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高い力価で産生することができ、いくつかの異なる細胞型を容易に感染させることができる。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ Ｅ１ａ、Ｅ１ｂおよび／またはＥ３遺伝子を置き換えるように工学技術で作製され、その後、複製欠損ベクターは欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞において増殖する。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓および筋肉において見出されるものなどの非分裂、分化細胞を含む、複数の種類の組織をｉｎ ｖｉｖｏで形質導入させることができる。従来のＡｄベクターは、大きな運搬能力を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用例は、筋肉内注射による抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド治療を含んだ（Stermanら、Hum. Gene Ther.７巻：１０８３～９頁（１９９８年））。臨床試験における遺伝子導入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例には、Roseneckerら、Infection ２４巻：１ ５～１０頁（１９９６年）；Stermanら、Hum. Gene Ther.９巻：７号、１０８３～１０８９頁（１９９８年）；Welshら、Hum. Gene Ther.２巻：２０５～１８頁（１９９５年）；Alvarezら、Hum. Gene Ther.５巻：５９７～６１３頁（１９９７年）；Topfら、Gene Ther.５巻：５０７～５１３頁（１９９８年）；Stermanら、Hum. Gene Ther.７巻：１０８３～１０８９頁（１９９８年）が含まれる。

【0165】

パッケージング細胞は、宿主細胞を感染させることが可能であるウイルス粒子を形成するために使用される。そのような細胞には、アデノウイルスおよびＡＡＶをパッケージする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が含まれる。遺伝子治療で使用されるウイルスベクターは、ウイルス粒子に核酸ベクターをパッケージするプロデューサー細胞株によって通常生成される。ベクターは、パッケージングおよび以降の宿主への組込み（適用可能な場合）のために必要とされる最小限のウイルス配列を一般的に含有し、他のウイルス配列は発現させるタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられる。欠落しているウイルスの機能は、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子治療で使用されるＡＡＶベクターは、宿主ゲノムへのパッケージングおよび組込みのために必要であるＡＡＶゲノムからの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を一般的に所有するだけである。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠いているヘルパープラスミドを含有する細胞株にパッケージされる。細胞株は、ヘルパーとしてアデノウイルスにも感染する。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如に起因して、有意な量でパッケージされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶより感受性である熱処理によって低減することができる。さらに、ＡＡＶは、バキュロウイルス系を使用して製造することができる（例えば米国特許第６，７２３，５５１号および第７，２７１，００２号を参照）。

【0166】

２９３またはバキュロウイルス系からのＡＡＶ粒子の精製は、典型的にはウイルスを産生する細胞の成長、続く細胞上清からのウイルス粒子の回収または、細胞を溶解することおよび粗溶解物からウイルスを回収することを含む。次にＡＡＶは、イオン交換クロマトグラフィー（例えば米国特許第７，４１９，８１７号および第６，９８９，２６４号を参照）、イオン交換クロマトグラフィーならびにＣｓＣｌ密度遠心分離（例えばＰＣＴ公開ＷＯ２０１１０９４１９８Ａ１０）、免疫親和性クロマトグラフィー（例えばＷＯ２０１６１２８４０８）またはＡＶＢセファロース（例えばＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する精製を含む、当技術分野において公知の方法によって精製される。

【0167】

多くの遺伝子治療適用では、遺伝子治療ベクターが特定の組織型に高度の特異性で送達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターは、ウイルスの外部表面のウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現することによって所与の細胞型に対して特異性を有するように改変することができる。リガンドは、目的の細胞型に存在することが公知である受容体に親和性を有するように選択される。例えば、Hanら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９２巻：９７４７～９７５１頁（１９９５年））は、モロニーマウス白血病ウイルスは、ｇｐ７０に融合したヒトヘレグリンを発現するように改変することができること、および組換えウイルスは、ヒト上皮増殖因子受容体を発現するある特定のヒト乳がん細胞を感染させることを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質を発現する、他のウイルス－標的細胞対に拡張することができる。例えば、繊維状ファージは、選択される事実上いかなる細胞受容体に特異的結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示するように、工学技術で作製することができる。上の記載はウイルスベクターに主に適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用することができる。そのようなベクターは、特異的標的細胞による取込みを有利にする、特異的取込み配列を含有するように工学技術で作製することができる。

【0168】

遺伝子治療ベクターは、下記のように、一般的に全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下または頭蓋内注入）または局所適用による、個々の患者への投与によってｉｎ ｖｉｖｏで送達することができる。あるいは、ベクターは、細胞に、例えば個々の患者から外植される細胞（例えば、リンパ球、骨髄吸引物、組織生検）、または汎用性ドナー造血幹細胞にｅｘ ｖｉｖｏで送達することができ、続いて、通常ベクターを取り込んだ細胞の選択の後に、細胞を患者に再移植することができる。

【0169】

診断、研究、移植のための、または遺伝子治療のためのｅｘ ｖｉｖｏ細胞トランスフェクション（例えば、宿主生物へのトランスフェクトした細胞の再注入を介して）は、当業者に周知である。好ましい実施形態では、細胞は、被験体生物から単離され、ＤＮＡ結合タンパク質核酸（DNA-binding proteins nucleic acid）（遺伝子またはｃＤＮＡ）を用いてトランスフェクトされ、被験体生物（例えば、患者）に再注入されて戻される。ｅｘ ｖｉｖｏトランスフェクションに適する種々の細胞型は、当業者に周知である（例えば、Freshneyら、Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique（第３版、１９９４年））および患者から細胞をどのように単離および培養するかについての考察について、それに引用される参考文献を参照）。

【0170】

一実施形態では、幹細胞は、細胞トランスフェクションおよび遺伝子治療のためにｅｘ ｖｉｖｏ手順で使用される。幹細胞を使用する有利な点は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで幹細胞は他の細胞型に分化できること、または哺乳動物（細胞のドナーなど）に導入することができ、そこで幹細胞が骨髄中で生着することである。ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αなどのサイトカインを使用して臨床に重要な免疫細胞型にＣＤ３４＋細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させるための方法は公知である（Inabaら、J. Exp. Med. １７６巻：１６９３～１７０２頁（１９９２年）を参照）。

【0171】

幹細胞は、形質導入および分化のために公知の方法を使用して単離される。例えば、幹細胞は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（ｐａｎＢ細胞）、ＧＲ－１（顆粒球）ならびにＩａｄ（分化した抗原提示細胞）などの不必要な細胞に結合する抗体を用いて骨髄細胞をパニングすることによって骨髄細胞から単離される（Inabaら、J. Exp. Med. １７６巻：１６９３～１７０２頁（１９９２年）を参照）。

【0172】

改変された幹細胞はまた、一部の実施形態において使用することができる。例えば、アポトーシスに対して抵抗性にされたニューロン幹細胞は、幹細胞が本発明のＺＦＰ ＴＦも含有する場合、治療用組成物として使用することができる。アポトーシへの抵抗性は、幹細胞において、例えば、ＢＡＸ－特異的ＺＦＮまたはＢＡＫ－特異的ＺＦＮを使用して（米国特許出願第１２／４５６，０４３号を参照）、または、カスパーゼ中で破壊されているもの、例えば再度カスパーゼ６特異的ＺＦＮを使用して、ＢＡＸおよび／またはＢＡＫをノックアウトすることによって生じさせることができる。これらの細胞を、ＴＣＲを制御することが公知であるＺＦＰ ＴＦを用いてトランスフェクトすることができる。

【0173】

治療用ＤＮＡ結合タンパク質（またはこれらのタンパク質をコードする核酸）を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）は、ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞の形質導入のために生物に直接投与することもできる。代替的に、裸のＤＮＡを投与することができる。投与は、分子を導入して血液または組織細胞と最終的に接触させるために通常使用される、注射、注入、局所適用およびエレクトロポレーションを限定されずに含む経路のいずれかによる。そのような核酸を投与する好適な方法は、当業者に利用可能であり、周知であり、特定の組成物を投与するために２つ以上の経路を使用することができるが、特定の経路が別の経路より速く（immediate）、より有効な反応をしばしば提供することができる。

【0174】

ＤＮＡの造血幹細胞への導入のための方法は、例えば米国特許第５，９２８，６３８号に開示されている。造血幹細胞、例えばＣＤ３４＋細胞への導入遺伝子の導入のために有用なベクターには、３５型アデノウイルスが含まれる。

【0175】

免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）への導入遺伝子の導入のために適切なベクターには、非組込み型のレンチウイルスベクターが含まれる。例えば、Oryら（１９９６年）Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９３巻：１１３８２～１１３８８頁；Dullら（１９９８年）J. Virol.７２巻：８４６３～８４７１頁；Zufferyら（１９９８年）J. Virol.７２巻：９８７３～９８８０頁；Follenziら（２０００年）Nature Genetics ２５巻：２１７～２２２頁を参照のこと。

【0176】

薬学的に許容されるキャリアは、一部において、投与される特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。したがって、下記のように、医薬組成物の多様な、適する製剤が利用可能である（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第１７版、１９８９年を参照のこと）。

【0177】

上記したように、開示された方法および組成物は、限定されずに、原核細胞、真菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞ならびに、Ｔ細胞および任意の種類の幹細胞を含むヒト細胞を含む、任意の種類の細胞において使用することができる。タンパク質発現のために適する細胞株は当業者に公知であり、限定されずにＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＤＧ４４、ＣＨＯ－ＤＵＸＢ１１）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８－Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０－Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ２９３－Ｈ、ＨＥＫ２９３－Ｔ）、ｐｅｒＣ６、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）などの昆虫細胞、ならびにＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓなどの真菌細胞を含む。これらの細胞株の後代、バリアントおよび派生物も使用することができる。

【0178】

応用
開示される組成物および方法は、限定されずに、Ｂ２Ｍモジュレーションが望ましい治療用および研究用応用を含む、Ｂ２Ｍ発現および／または機能性をモジュレートすることが望ましい任意の応用のために使用することができる。例えば、開示される組成物は、養子細胞療法のために１つもしくは複数の外因性ＣＡＲ、外因性ＴＣＲ、外因性ＡＣＴＲまたは他のがん特異的受容体分子を発現し、それによりがんを処置および／または予防するように改変されたＴ細胞において、内因性Ｂ２Ｍの発現を破壊するためにｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｅｘ ｖｉｖｏ（細胞治療）で使用することができる。さらにそのような状況において、細胞内でのＢ２Ｍ発現のモジュレーションは、健康な、非標的化組織との不必要な交差反応（すなわち移植片対宿主応答）の危険を除去または実質的に低減することができる。

【0179】

方法および組成物は、幹細胞組成物も含み、ここで幹細胞内のＢ２Ｍ遺伝子は、モジュレートされ（改変され）、細胞は、ＡＣＴＲおよび／もしくはＣＡＲならびに／または単離されたもしくは工学技術で作製されたＴＣＲをさらに含む。例えば、Ｂ２Ｍノックアウトまたはノックダウンモジュレートされた同種異系造血幹細胞は、骨髄アブレーション後にＨＬＡ適合患者に導入することができる。これらの変更されたＨＳＣは、患者での再定着を可能にするが、潜在的ＧｖＨＤを生じない。導入された細胞は、根底にある疾患を処置するための続く治療の間に役立つ他の変更（例えば、化学療法耐性）も有することができる。ＨＬＡヌル細胞は、外傷患者での緊急治療室の場所における「既製の」治療としての用途も有する。

【0180】

本発明の方法および組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏモデル、例えばＢ２Ｍおよび／またはＨＬＡならびに関連障害の動物モデルの設計および実行のためにも有用であり、これらの障害の研究を可能にする。

【0181】

本明細書で指摘される全ての特許、特許出願および公開は、参照によりそれらの全体が本明細書によって組み込まれる。

【0182】

理解の明快性のために開示は例証および例として多少詳細に提供されたが、本開示の精神または範囲から逸脱せずに様々な変更および改変を実施することができることは当業者に明らかである。したがって、前述の開示および以下の実施例は限定するものと解釈されるべきでない。

【実施例】

【0183】

（実施例１）
Ｂ２Ｍ特異的ヌクレアーゼの設計
Ｂ２Ｍ特異的ＺＦＮをＢ２Ｍ遺伝子での二本鎖切断の部位特異的導入を可能にするために構築した。ＺＦＮをUrnovら（２００５年）Nature ４３５巻（７０４２号）：６４６～６５１頁、Lombardoら（２００７年）Nat Biotechnol. Nov；２５巻（１１号）：１２９８～３０６頁および米国特許出願公開第２００８－０１３１９６２号、第２０１５－０１６４９５号、第２０１４－０１２０６２２号、第２０１４－０３０１９９０号および米国特許第８，９５６，８２８号に本質的に記載の通り設計した。ＺＦＮ対は、Ｂ２Ｍ遺伝子の定常領域中の異なる部位を標的とした（図１を参照）。例示的ＺＦＮ対に対する認識ヘリックスならびに標的配列を下の表１に示す。Ｂ２Ｍジンクフィンガー設計の標的部位を第１カラムに示す。ＺＦＰ認識ヘリックスによって標的化される標的部位中のヌクレオチドを大文字で示し；非標的化ヌクレオチドを小文字で示す。ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインとＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインとを繋ぐために使用されるリンカーも示す（米国特許出願公開第２０１５０１３２２６９号を参照）。例えばドメインリンカーＬ０のアミノ酸配列は、ＤＮＡ結合ドメイン－ＱＬＶＫＳ－ＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン（配列番号３）である。同様にドメインリンカーＮ７ａについてのアミノ酸配列は、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン－ＳＧＴＰＨＥＶＧＶＹＴＬ－ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号４）であり、Ｎ６ａはＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン－ＳＧＡＱＧＳＴＬＤＦ－ＤＮＡ結合ドメイン（配列番号５）である。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【0184】

全てのＺＦＮを検査し、それらの標的部位に結合することを見出し、ヌクレアーゼとして活性であることを見出した。

【0185】

Ｂ２Ｍ遺伝子を標的にするために、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系のためのガイドＲＮＡも構築した。下の表２Ａに、Ｂ２Ｍ遺伝子中の標的配列ならびにガイドＲＮＡ配列が示される。全てのガイドＲＮＡをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系で検査し、活性であることを見出す。一部のガイド配列の５’末端での小文字「ｇ」は、ＰＡＭ配列において役割を果たす付加されたＧヌクレオチドを示している。

【表2A-1】

【表2A-2】

【0186】

ＴＡＬＥＮは、Ｂ２Ｍ遺伝子座を標的化するために作製され、下の表２Ｂに示されている。全てのＴＡＬＥＮを、Ｋ５６２細胞において検査し、活性であることを見出した（表２Ｃおよび図２Ｂを参照）。

【表2B-1】

【表2B-2】

【表2B-3】

【表2B-4】

【表2B-5】

【0187】

表２ＢからのＴＡＬＥＮを、反応一回につき各ＴＡＬＥＮの２５、１００または４００ｎｇのいずれかの３つの異なる濃度で検査した。検査した全てのＴＡＬＥＮは、それらの標的部位に結合することが見出され、ヌクレアーゼとして活性であることが見出された；例示的データを表２Ｃおよび図２Ｂに示す。

【表2C-1】

【表2C-2】

【0188】

したがって、本明細書に記載されるヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはｓｇＲＮＡ ＤＮＡ結合ドメインを含むヌクレアーゼ）は、それらの標的部位に結合し、Ｂ２Ｍ遺伝子を切断し、それにより配列番号６～４８もしくは１３７～２０５のいずれかを含むＢ２Ｍ遺伝子内に、これらの配列（配列番号６～４８もしくは１３７～２０５）のいずれかの中の改変（挿入および／または欠失）；これらの遺伝子配列の１～５０（例えば、１から１０）塩基対内の改変；対合した標的部位（二量体について）の標的部位間の改変；および／または以下の配列：ＧＧＣＣＴＴＡ、ＴＣＡＡＡＴＴ、ＴＣＡＡＡＴ、ＴＴＡＣＴＧＡおよび／またはＡＡＴＴＧＡＡの１つもしくは複数の中の改変（図１を参照）が挙げられる、遺伝子改変を作製する。

【0189】

さらに、ＤＮＡ結合ドメイン（ＺＦＰ、ＴＡＬＥおよびｓｇＲＮＡ）はまた、全てそれらの標的部位に結合し、１つまたは複数の転写制御ドメインと会合するときに、活性な工学技術で作製転写因子へと組み立てられる。

【0190】

（実施例２）
Ｔ細胞におけるＢ２Ｍ特異的ＺＦＮ活性
Ｂ２Ｍ特異的ＺＦＮ対をヌクレアーゼ活性についてヒトＴ細胞において検査した。ＺＦＮをコードするｍＲＮＡを精製Ｔ細胞にトランスフェクトした。簡潔には、Ｔ細胞を白血球フェレーシス産物から得て、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＣｌｉｎｉＭＡＣＳシステム（ＣＤ４およびＣＤ８二重選択）を使用して精製した。次いで、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を製造者のプロトコールに従って使用して、これらの細胞を活性化した。活性化３日後、細胞を２種の用量のｍＲＮＡ（２つのＺＦＮの合計で２または６μｇ）を用いてＢＴＸ９６ウェルエレクトロポレーター（ＢＴＸ）を使用して、標準的プロトコールに従ってトランスフェクトした。次いでさらに７日間、活性化後合計１０日間細胞を拡張させた。細胞を７日目に取り出し、ディープシークエンシング（Ｍｉｓｅｑ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して標的Ｂ２Ｍ改変について、ならびに１０日目にＨＬＡ－Ａ、－Ｂおよび－Ｃ染色を使用してＦＡＣｓ分析で分析した。

【0191】

Ｂ２Ｍ特異的ＺＦＮ対は、Ｔ細胞において全て活性であり、６μｇおよび２μｇ ｍＲＮＡ用量についてそれぞれ平均８９％および８３％をもたらした（図２を参照）。使用した対および位置（図１に示す）を下の表３に列挙する。

【表3】

【0192】

同様にＺＦＮを用いて処理したＴ細胞は、ＨＬＡ Ａ、ＢおよびＣの発現を喪失し、ここでＦＡＣＳ分析は、６μｇおよび２μｇ ｍＲＮＡ用量でそれぞれ平均８１％および６７％のＨＬＡ陰性Ｔ細胞を示した（図３を参照）。

【0193】

（実施例３）
Ｂ２Ｍに対するガイドＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性
これらの実験において、Ｃａｓ９はｐＶＡＸプラスミドに供給され、ｓｇＲＮＡはＵ６プロモーターの調節下でプラスミドに供給された。プラスミドは各々１００ｎｇまたは各々４００ｎｇのいずれかで混合し、一回の操作につき２ｅ５細胞と混合した。細胞を、Ａｍａｘａ系を使用してトランスフェクトした。簡潔には、Ａｍａｘａトランスフェクションキットを使用し、標準のＡｍａｘａシャトルプロトコールを使用して核酸をトランスフェクトした。トランスフェクションの後、細胞を室温で１０分の間静止させ、その後予め温めたＲＰＭＩに再懸濁した。次に、細胞を、３７℃の標準条件で成長させた。トランスフェクションの７日後にゲノムＤＮＡを単離し、ＭｉＳｅｑ分析にかけた。

【0194】

下に示すデータ（表４）は、２つの用量のガイドＲＮＡで検出されたインデル（挿入および欠失）のパーセントを示しており、さまざまなガイドＲＮＡが標的化部位での切断を誘導することを示していた。数字は、２回の実験の平均を表している。全てのガイドは活性であった。

【表4】

【0195】

（実施例４）
初代Ｔ細胞におけるＢ２ＭおよびＴＣＲのダブルノックアウト
本明細書に記載されるＢ２Ｍ対をＴＣＲＡに特異的なＺＦＮとの組合せでも検査した（下の表５および米国仮特許出願第６２／２６９，３６５号および第６２／３０６，５００号を参照）。細胞を実施例２に記載の通りに得て、処理した。ＺＦＮ対をコードするｍＲＮＡ（Ｂ２ＭについてＳＢＳ番号５７０１７／ＳＢＳ番号５７３２７およびＴＣＲＡについてＳＢＳ番号５５２５４／ＳＢＳ番号５５２４８）をＭａｘｃｙｔｅ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを製造者の指示に従って使用して細胞に電気穿孔した。簡潔には、Ｔ細胞を０日目に活性化し、ＺＦＮコードｍＲＮＡを用いて３日目に処理し、細胞密度は３ｅ７細胞／ｍＬであった。電気穿孔には、電気穿孔後、一晩の３０℃低温ショックが続いた。４日目に細胞をカウントし、生存率についてアッセイし、０．５ｅ６細胞／ｍＬに希釈し、３７℃に移した。７日目に、細胞をカウントし、再びアッセイし、０．５ｅ６細胞／ｍＬに再希釈した。１０日目および１４日目に、細胞の一部をＦＡＣＳおよびＭｉＳｅｑディープシークエンシングのために採取した。

【表5】

【0196】

細胞を４つの群：ＺＦＮなしの対照、ＴＣＲＡ ＺＦＮのみ、Ｂ２Ｍ ＺＦＮのみおよびＴＣＲＡ ＺＦＮ＋Ｂ２Ｍ ＺＦＮに分けた。ＦＡＣＳ分析によって、ＴＣＲＡ単独に対するＺＦＮ（１８０μｇ／μＬ ＺＦＮ ｍＲＮＡ）またはＢ２Ｍ単独（１８０μｇ／μＬのＺＦＮ ｍＲＮＡ）のセットは、高率の切断をもたらした（ＴＣＲＡ ＺＦＮについて９６％ ＣＤ３マーキング、およびＢ２Ｍ ＺＦＮについてＨＬＡマーキングの９２％ノックアウト（図４））。細胞を両方の種類のＺＦＮ対（両方とも１８０μｇ／μＬ）を用いて処理すると、８２％の細胞がＣＤ３およびＨＬＡマーキングの両方を失った。

【0197】

同様の細胞の群を、種々の量の示した通りのＴＣＲＡ特異的ＺＦＮ（６０～２５０ｕｇ／ｕＬ）に加えて６０ｕｇ／ｍＬのＢ２Ｍ ＺＦＮを用いて処理し、１０日目および１４日目にＭｉＳｅｑディープシークエンシング（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）およびＦＡＣｓ分析にかけ、結果は下の表６に示す。結果は、ＮＨＥＪ媒介挿入および欠失によって検出される高率のダブルノックアウトがこれらのＺＦＮで観察されたことを示す。

【表6】

【0198】

したがって、このデータは、標的もしくはその付近での、ならびに／または本明細書中に記載されたヌクレアーゼの標的配列および／または切断部位の１～５０（例えば、１～１０）塩基対（対合した標的部位間を含む）内（ＳＢＳ＃５５２５４／ＳＢＳ＃５５２４８ ＴＣＲＡ特異的対についての２つの標的配列の間のＢ２Ｍ配列ＴＣＡＡＡＴ（図１中の部位Ｄ）およびＴＣＲＡ配列ＣＣＴＴＣを含む）での、Ｂ２ＭおよびＴＣＲＡのダブルノックアウトが、両方の遺伝子を不活性化したことを実証する。

【0199】

（実施例５）
標的化組み込みによるＢ２ＭおよびＴＣＲＡのダブルノックアウト
この実験ではＴＣＲＡ特異的ＺＦＮ対は、ＴＣＲＡ特異的ＺＦＮ標的部位間に配列ＴＴＧＡＡＡを含む、ＳＢＳ番号５５２６６／ＳＢＳ番号５３８５３であり（表５）、Ｂ２Ｍ対は、Ｂ２Ｍ特異的ＺＦＮ標的部位間に配列ＴＣＡＡＡＴを含む、ＳＢＳ番号５７３３２／ＳＢＳ番号５７３２７（表１）であった。

【0200】

簡潔には、Ｔ細胞（ＡＣ－ＴＣ－００６）を解凍し、Ｘ－ｖｉｖｏ１５ Ｔ細胞培養培地中でＣＤ３／２８ ｄｙｎａｂｅａｄ（１：３、細胞：ビーズ比）を用いて活性化した（０日目）。培養２日後（２日目）、ＡＡＶドナー（ＧＦＰ導入遺伝子およびＴＣＲＡまたはＢ２Ｍ遺伝子に対する相同アームを含む）を、ドナーを含まない対照群はまた維持されていることを除いて、細胞培養物に加えた。翌日（３日目）、ＴＣＲＡおよびＢ２Ｍ ＺＦＮを、ｍＲＮＡ送達を介して以下の５群において付加した：
（ａ）群１（ＴＣＲＡおよびＢ２Ｍ ＺＦＮのみ、ドナーなし）：ＴＣＲＡ １２０ｕｇ／ｍＬ：Ｂ２Ｍのみ６０ｕｇ／ｍＬ；
（ｂ）群２（ＴＣＲＡおよびＢ２Ｍ ＺＦＮならびにＴＣＲＡ相同アームを有するドナー）：ＴＣＲＡ １２０ｕｇ／ｍＬ；Ｂ２Ｍ ６０ｕｇ／ｍＬおよびＡＡＶ（ＴＣＲＡ－ｈＰＧＫ－ｅＧＦＰ－Ｃｌｏｎｅ Ｅ２）１Ｅ５ｖｇ／細胞；
（ｃ）群３（ＴＣＲＡおよびＢ２Ｍ ＺＦＮならびにＴＣＲＡ相同アームを有するドナー）：ＴＣＲＡ １２０ｕｇ／ｍＬ；Ｂ２Ｍ ６０ｕｇ／ｍＬ；およびＡＡＶ（ＴＣＲＡ－ｈＰＧＫ－ｅＧＦＰ－Ｃｌｏｎｅ Ｅ２）３Ｅ４ｖｇ／細胞；
（ｄ）群４（ＴＣＲＡおよびＢ２Ｍ ＺＦＮならびにＢ２Ｍ相同アームを有するドナー）：ＴＣＲＡ １２０ｕｇ／ｍＬ；Ｂ２Ｍ ６０ｕｇ／ｍＬおよびＡＡＶ（ｐＡＡＶ Ｂ２Ｍ－ｓｉｔｅ Ｄ－ｈＰＧＫ ＧＦＰ）１Ｅ５ｖｇ／細胞
（ｅ）群５（ＴＣＲＡおよびＢ２Ｍ ＺＦＮならびにＢ２Ｍ相同アームを有するドナー）：ＴＣＲＡ １２０ｕｇ／ｍＬ；Ｂ２Ｍ ６０ｕｇ／ｍＬおよびＡＡＶ（ｐＡＡＶ Ｂ２Ｍ－ｓｉｔｅ Ｄ－ｈＰＧＫ ＧＦＰ）３Ｅ４ｖｇ／細胞。
全ての実験は、３ｅ７細胞／ｍｌの細胞密度で米国特許出願第１５／３４７，１８２号に記載のプロトコール（超低温ショック（ｅｘｔｒｅｍｅ ｃｏｌｄ ｓｈｏｃｋ））を使用して実施し、電気穿孔後に、３０℃、一晩の低温ショックのために培養した。

【0201】

翌日（４日目）、細胞を０．５ｅ６細胞／ｍｌに希釈し、３７℃での培養に移した。３日後（７日目）、細胞を０．５ｅ６細胞／ｍｌに再度希釈した。さらに３日および７日培養後（それぞれ１０日目および１４日目）、細胞をＦＡＣＳおよびＭｉＳｅｑ分析のために採取した（０．５ｅ６細胞／ｍｌに希釈）。

【0202】

図５に示す通り、ＧＦＰ発現は、標的組み込みが成功したこと、およびヌクレアーゼ部位内（またはヌクレアーゼ標的部位の１から５０塩基対内、例えばＴＴＧＡＡＡおよびＴＣＡＡＡＴ内、ならびに／または対合した標的部位間）に、Ｂ２ＭおよびＴＣＲＡ改変（挿入および／または欠失）を含む遺伝子改変細胞が得られたことを示した。

【0203】

実験は、ＣＡＲを発現する二重Ｂ２Ｍ／ＴＣＲＡノックアウトを作製するためにＣＡＲ導入遺伝子がＢ２Ｍおよび／またはＴＣＲＡ遺伝子座に組み込まれているものでも実施される。

【0204】

本明細書で言及される全ての特許、特許出願および公開は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。

【0205】

理解の明快性のために開示は例証および例として多少詳細に提供されたが、本開示の精神または範囲から逸脱せずに様々な変更および改変を実施することができることは当業者に明らかである。したがって、上記の記載および実施例は限定するものと解釈されるべきでない。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4A-4C】

【図4D-4E】

【図5】

【配列表】

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