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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-20
(45)【発行日】2024-08-28
(54)【発明の名称】対立遺伝子の区分性を高めるＰＣＲ方法及びＰＣＲキット
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/686 20180101AFI20240821BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20240821BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/686 Z ZNA
C12Q1/6876 Z
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2022560843
(86)(22)【出願日】2020-12-11
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-08
(86)【国際出願番号】 KR2020018147
(87)【国際公開番号】W WO2021118288
(87)【国際公開日】2021-06-17
【審査請求日】2022-06-08
(31)【優先権主張番号】10-2019-0164776
(32)【優先日】2019-12-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】510020538
【氏名又は名称】ジェノテック コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】110003579
【氏名又は名称】弁理士法人山崎国際特許事務所
(74)【代理人】
【識別番号】100173978
【弁理士】
【氏名又は名称】朴 志恩
(74)【代理人】
【識別番号】100118647
【弁理士】
【氏名又は名称】赤松 利昭
(74)【代理人】
【識別番号】100123892
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 忠雄
(74)【代理人】
【識別番号】100169993
【弁理士】
【氏名又は名称】今井 千裕
(72)【発明者】
【氏名】キム、ジェ ジョン
(72)【発明者】
【氏名】リム、シ－キュ
(72)【発明者】
【氏名】パク、イン キュン
(72)【発明者】
【氏名】キュン、アヨン
(72)【発明者】
【氏名】イ、ボ ミ
(72)【発明者】
【氏名】リュ、ジョンヒュン
(72)【発明者】
【氏名】チャ、スン ホ
(72)【発明者】
【氏名】ペク、スンウ
【審査官】松村 真里
(56)【参考文献】
【文献】特表２００３－５０４０１８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１４－５０１４９７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１３－０６３０７０（ＪＰ，Ａ）
【文献】BioTechniques，2000年，Vol.28, No.2，p.278-282
【文献】Scientific Reports，2021年，Vol.11，Article number: 19098
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（イ）潜在的突然変異位置を持つ標的ＤＮＡ配列を含む一つ以上の鋳型に対する正方向プライマー及び逆方向プライマー；（ロ）前記鋳型に結合する前記正方向プライマー及び逆方向プライマーからＤＮＡを重合するＤＮＡ重合酵素；及び
（ハ）前記鋳型、正方向プライマー及び逆方向プライマーと相補的でなく、前記ＤＮＡ重合酵素と可逆的な結合が可能であり、部分的に又は全体的に二本鎖を形成する区分性増進オリゴヌクレオチド；を含み、
前記正方向プライマーは、３'末端の第１の塩基が標的ＤＮＡ配列の潜在的な突然変異位置に対応し、
前記区分性増進オリゴヌクレオチドは、Ｔｍ値がＰＣＲ反応のアニーリング温度以上であり、
前記区分性増進オリゴヌクレオチドは、前記正方向プライマー３'末端の第１の塩基が鋳型と相補的であるとき、ＰＣＲ増幅が進行し、前記正方向プライマー３'末端の第１の塩基が鋳型と非相補的であるとき、増幅が抑制される、対立遺伝子間の区分性を高めるデオキシリボオリゴヌクレオチドであり、
前記区分性増進オリゴヌクレオチドは、
（ｉ）ＤＮＡ二本鎖、
（ｉｉ）部分的に又は全体的に二本鎖オリゴヌクレオチドを形成可能な部分的に又は全体的に相補的なデオキシリボオリゴヌクレオチド一本鎖、及び
（ｉｉｉ）部分的に又は完全にヘアピン二本鎖を形成可能なデオキシリボオリゴヌクレオチド
から選ばれる一つ以上である、標的ＤＮＡ配列の突然変異検出用ＰＣＲキット。
【請求項2】
（二）潜在的突然変異位置を持つ標的ＤＮＡ配列を含む一つ以上の鋳型をさらに含む、請求項１に記載の突然変異検出用ＰＣＲキット。
【請求項3】
前記正方向プライマーは、ＡＳ（ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）プライマー又はＡＲＭＳ（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）プライマーである、請求項１に記載の突然変異検出用ＰＣＲキット。
【請求項4】
前記区分性増進オリゴヌクレオチドは、任意の配列である、請求項１に記載の突然変異検出用ＰＣＲキット。
【請求項5】
前記標的ＤＮＡ配列の突然変異は、一塩基多型である、請求項１に記載の突然変異検出用ＰＣＲキット。
【請求項6】
前記ＤＮＡ重合酵素は、耐熱性ＤＮＡ重合酵素である、請求項１に記載の突然変異検出用ＰＣＲキット。
【請求項7】
前記ＤＮＡ重合酵素は、野生型又は変異型ＤＮＡ重合酵素である、請求項６に記載の突然変異検出用ＰＣＲキット。
【請求項8】
前記区分性増進オリゴヌクレオチドは、１０塩基以上１００塩基以下であるか、または１５塩基以上５０塩基以下である、請求項１に記載の突然変異検出用ＰＣＲキット。
【請求項9】
蛍光共鳴エネルギー転移が可能な、レポーターとクエンチャーで修飾されたプローブをさらに含む、請求項１に記載の突然変異検出用ＰＣＲキット。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか一項に記載の突然変異検出用ＰＣＲキットを用いて遺伝子突然変異を検出する方法であって、イ）潜在的突然変異位置を持つ標的ＤＮＡ配列を含む鋳型、前記鋳型に結合する正方向プライマー及び逆方向プライマー、前記正方向プライマーと逆方向プライマーからＤＮＡを重合するＤＮＡ重合酵素、及び前記鋳型、正方向プライマー及び逆方向プライマーと相補的でなく、前記ＤＮＡ重合酵素と可逆的な結合が可能であり、部分的に又は全体的に二本鎖を形成する区分性増進オリゴヌクレオチドを提供する段階；及び
ロ）前記区分性増進オリゴヌクレオチドの存在下に前記ＤＮＡ重合酵素を用いて重合酵素連鎖反応を行う段階；及び
ハ）前記ロ）の反応から増幅曲線を得る段階
を含み、対立遺伝子間の区別性を高めたことを特徴とする、遺伝子突然変異を検出する方法。
【請求項11】
二）前記ハ）から得た増幅曲線から、前記標的ＤＮＡ配列が突然変異を含むか否かを判別する段階：をさらに含む、請求項１０に記載の遺伝子突然変異を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）又は体細胞突然変異（ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ）のようなマイナー対立遺伝子を検出するために多く用いられる重合酵素連鎖反応（ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）の特異度及び敏感度を高めた対立遺伝子検出方法に関する。より詳細には、本発明は、部分的に又は全体的に二本鎖を形成する区分性増進オリゴヌクレオチド（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｂｏｏｓｔｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；以下、本発明の説明及び図面において“ｄｂＯｌｉｇｏ”とも表記する。）を、対立遺伝子を選別的に増幅しようとするＰＣＲ溶液に添加することによって、プライマー３’末端の塩基が鋳型と相補的（３’－ｍａｔｃｈｅｄ）である時にはＰＣＲ増幅への影響がわずかである或いはないが、非相補的（３’－ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ）である時にはＰＣＲ増幅が強く抑制される、ＰＣＲベースの単一塩基変異遺伝子型分析（ＳＮＰ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）及び／又は体細胞突然変異検出（ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）技術に関する。
【背景技術】
【0002】
遺伝病と癌などの疾患に関与する遺伝的変異、すなわち、一塩基多型、付加－欠失などの遺伝的変異を確認することは、治療の予測、治療方法の決定、治療予後及び再発の観察などにおいて非常に重要である。また、このような遺伝的変異の確認又は区別は、農・食品分野において種の育種及び選別、原産地及び品種の判別などにおいて非常に有用である。
【0003】
遺伝的変異は、生命体に生まれつき存在する或いは成長過程中に環境的な又は内生的な原因により発生し得る。人体などの遺伝的変異形態のうち最も一般的なものは一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ）である。以下、発明の説明において、様々な遺伝的変異の代表としてＳＮＰを取り上げる。
【0004】
人を含む生命体が持つＳＮＰの判別に用いられる技術方法のうち最も普遍的で経済的で簡便な方法は、重合酵素を活用した遺伝子増幅技術、すなわち、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）技術であり、特に、ＰＣＲ過程において実時間でその変異量を測定できる技術が定量的実時間ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ；ｑＰＣＲ又は実時間ＰＣＲ）である。
【0005】
核酸の定量的な定性及び定量的な検出手法である実時間ＰＣＲは、保健、農業、食品、環境などの様々な分野で応用されている。１９９０年の初めに開発された実時間ＰＣＲは、技術的限界点を引き続き改善し、より正確で精密な手法へと発展してきている。
【0006】
特に、実時間ＰＣＲを用いた遺伝子判別キットの開発において非特異的信号の発生、そして突然変異と野生型遺伝子配列の低い区分性は、実時間ＰＣＲの最も代表的な技術的限界とされる。
【0007】
特に、癌、感染源である病原体検出などの診断技術としての実時間ＰＣＲ技術の開発には非特異的信号の制御が必須である。非特異的信号によって偽陽性が現れると、検査の信頼度が低下し、特に、極少量の検出が必要な非侵襲性液体生検（ｌｉｑｕｉｄ ｂｉｏｐｓｙ）のような診断技術では、少量の標的変異を正確に診断するために、ＰＣＲ効率性の増大及び特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を高める技術が非常に必要である。ＰＣＲの効率性と特異性を高めるためにＰＣＲ溶液に添加する組成物を開発する、特別なプローブ（ｐｒｏｂｅｓ）又はプライマー（ｐｒｉｍｅｒｓ）を考案する、或いは酵素を改良する、方法が摸索されてきた。
【0008】
ＰＣＲの効率性及び特異性を高めるための方法を例示すれば、下記の通りである。
【0009】
イ．ＰＣＲ溶液添加組成物
【0010】
ＰＣＲ溶液に添加する組成物としては、主に、ＰＣＲの反応性を高めるか、プライマーダイマー（ｐｒｉｍｅｒ ｄｉｍｅｒｓ）の生成、又は使用するプライマーが非特異的標的に結合して生成される非特異的ＰＣＲ産物の生成、又は高いＧＣ比率及び特異高次構造形成などによるＰＣＲ効率の減少を解消する用途の添加組成物が研究されてきた。このような組成物にはＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、ベタイン（ｂｅｔａｉｎｅ）などがある。そして、別名“ＨｏｔＳｔａｒｔ ＰＣＲ”のために、低い温度で進行する反応を遮断し、高温でＰＣＲが進行するようにして非特異的増幅を防ぐ方法が多数報告された。
【0011】
そのうち“ＨｏｔＳｔａｒｔ ＰＣＲ”方法としては、ＤＮＡ重合酵素（ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＤＮＡＰ）特異的単一クローン抗体を添加する方法｛Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９４） １６（６）：１１３４－１１３７｝、ＤＮＡ重合酵素の活性を抑制する一本鎖オリゴヌクレオチドである別名“アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）”を添加する方法｛ＵＳ／００５６９３５０２Ａ（１９９７）；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７１：１００－１１１（１９９７）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｎｏ．３：３０９－３１０（２００３）｝、又はＤＮＡ重合酵素と低い温度で結合能力を有し、ＤＮＡ重合酵素の活性を抑制するが、特定温度以上のＰＣＲ条件では二重螺旋を形成しないためＤＮＡ重合酵素活性を抑制しない二本鎖ヌクレオチドを用いて非特異的ＤＮＡ合成を抑制する方法｛Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２６４（２）：２６８－２７８（１９９６）；ＵＳ８，０４３，８１６ Ｂ２（２０１１）｝が知られている。
【0012】
ロ．酵素の改良
【0013】
非特異的な信号を抑制する又は対立遺伝子の区分性を高めるＰＣＲに容易に使用するためのＤＮＡ重合酵素開発も多数なされている。ＰＣＲ技術には耐熱性ＤＮＡ重合酵素を使用するのが一般である。ＤＮＡ重合酵素は、７つの以上の群（ｆａｍｉｌｙ）に区分されるが、ＰＣＲ技術に用いられる耐熱性重合酵素は、Ａ群に属するＴａｑ ＤＮＡ重合酵素をはじめとする耐熱性細菌由来酵素群と、Ｂ群に属するＰｆｕ ＤＮＡ重合酵素をはじめとする高細菌由来酵素群から主に選択される。
【0014】
そのうち、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素の属する群には、５’→３’ヌクレアーゼ（エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼの両方の活性を有する。フラップエンドヌクレアーゼ又はＦＥＮ１ともいう。）活性が存在するのが一般であり、この活性は、加水分解プローブ（ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ）の分解を用いた特異信号（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｇｎａｌ）の放出に非常に重要である。Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素は、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性がないので、３’最終末端が鋳型ＤＮＡと非相補的であるプライマーを使用するＰＣＲに非常に適する。３’末端が非相補的であるＡＳ（ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）プライマー又はＡＲＭＳ（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）プライマーの場合、プライマー３’塩基（ｂａｓｅ）のマッチ又はミスマッチによって突然変異と野生型又は両対立遺伝子の増幅効率が決定され、比較的良好な臨床的結果を導出する。しかしながら、多くの場合、３’がミスマッチしたプライマーにおいても一部増幅がなされるため、多数の野生型に混入した突然変異検出のための高感度診断においてしはしば判別誤りの原因となる。
【0015】
したがって、酵素の３’末端マッチとミスマッチの区分は、ＳＮＰ又は突然変異判別の特異度を高める上で非常に重要である。これにより、対立形質特異プライマーの３’末端配列の一致と不一致を区別する能力が増大した重合酵素が報告された｛ＰＬｏｓ Ｏｎｅ．９（５）：ｅ９６６４０（２０１４）；ＫＲ １０－２０１７－００８８３７３（２０１７）；ＵＳ ００３４８７９Ａ１（２０１３）；ＷＯ ０８２４４９Ａ２（２０１５）；ＵＳ ９２６７１２０Ｂ２（２０１６）｝。
【0016】
ハ．特別なプローブとプライマーを使用する方法
【0017】
特別なプローブとプライマーは、増幅された標的産物を特異的に検出するためのものであり、特異度の高いプローブを使用する方法が開発された。ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉ又はＳＹＴＯ９のようなＤＮＡ結合蛍光体を実時間ＰＣＲに使用すると、増幅された産物全体が検出されるため、非特異的信号がしばしば発生する問題点がある。このような問題を解決するために、標的配列特異的プローブ（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｂｅｓ）が開発された。開発されたプローブは、種類によってＴａｑＭａｎプローブ（ｄｕａｌ ｌａｂｅｌｌｅｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｐｒｏｂｅ）｛Ｐ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８，７２７６－２８０（１９９１）｝と分子ビーコン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ）｛Ｍｅｔｈｏｄｓ．２５，４６３－７１（２００１）｝、スコルピオンプローブ（ｓｃｏｒｐｉｏｎ ｐｒｏｂｅｓ）｛Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７，８０４－０７（１９９９）｝、ＬＵＸ（ｌｉｇｈｔ ｕｐｏｎ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）プライマー｛Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ．３０，ｅ１３７（２００２）｝、アンプリフルオルプライマー（Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ ｐｒｉｍｅｒｓ）｛ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２６，５５２－５８（１９９９）｝などがある。
【0018】
また、標的変異遺伝子を選択的に増幅するための特異度が高いプライマー又は特殊オリゴヌクレオチドブロッカー（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｂｌｏｃｋｅｒ）を使用する方法などが開発された。
【0019】
特異度の高いプライマーを使用する方法には、３’末端一つの塩基差によって区分されるＡＳ－ＰＣＲ（ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ）をはじめとし、３’末端に一つの変異配列の他に追加の人為的な変異配列を添加するＡＲＭＳ－ＰＣＲ（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ＰＣＲ）のような方法｛Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ．１８．３４９－３５２（２００４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ１７．２５０３－２５１６（１９８９）；Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７．８０４－８０７（１９９９）；Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ７１，２７８－２８２（２０１５）｝があり、最近では、アニーリングの安全性を高めながらもミスマッチ区別を維持するように２つの部分に分離されたプライマーを使用する方法であるＳｅｅｇｅｎｅ社のＤＰＯ（ｄｕａｌ－ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）｛Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６，４５５０－４５５６（２００４）；Ｂｉｏｍｏｌ．Ｄｅｔｅｃｔ．Ｑｕａｎｔｉｆ．１３－７（２０１４）；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９．３１５４－３１６２（２０１１）｝とＳｗｉｆｔ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのｍｙＴプライマー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｗｉｆｔｂｉｏｓｃｉ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／ｍｙｔ－ｐｒｉｍｅｒｓ）が開発された。
【0020】
【0021】
【先行技術文献】
【特許文献】
【0022】
１．日本特許公開公報第２０１１－４１５７２号“核酸合成の感度及び特異性増大のための組成物及び方法”
【0023】
２．米国特許公報第８，０４３，８１６号“温度依存的核酸合成組成物及び方法”
【0024】
３．韓国特許公開公報第１０－２０１３－０１３８７００号“切断可能なオリゴヌクレオチド阻害剤によるＤＮＡポリメラーゼの制御された阻害及び再活性化”
【0025】
【非特許文献】
【0026】
１．Ｋａｚｕｎｏｒｉ Ｉｋｅｂｕｋｕｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｎｏ．３ ３０９－３１０ “Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ Ａｐｔａｍｅｒｓｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｕｓｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ”
【0027】
２．Ｙｕｎ Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９７）２７１，１００－１１１ “Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ ｂｙ ａ Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ａｐｔａｍｅｒ”
【0028】
３．Ｎｉｃｋ Ａ．Ｒｅｊａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６４：５０００－０００（２０１８） “Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ ｏｎ Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ”
【0029】
４．Ｈａｏ－Ｃｈｉｎｇ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１４，５３，２８６５－２８７４ “ＤＮＡ Ｍｉｍｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ”
【0030】
５．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２８：２７８－２８２（Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０００） “Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ－Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｈｏｔ－Ｓｔａｒｔ ＰＣＲ：Ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｏｕｂｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ａｄａｐｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎｎｅａｌｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ”
【0031】
【0032】
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0033】
癌診断などのための臨床試料のうち、生体組織、血液、糞便、唾液などの検体内変異遺伝子の検出には極少量の変異ＤＮＡの他にも多数の野生型ＤＮＡが混入しているため、突然変異ＤＮＡを特異的に検出する方法は非常に難しい。多数の野生型に混入して１％以下の極微に存在する変異を検出できる特異度（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を保障できる必要があり、臨床的適用のためには高い堅固性（ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ）を備えなければならない。特に、野生型配列に対する低い偽陽性及び突然変異配列に対する高い特異度を示す必要がある。このような理由で、癌診断などの高感度診断に適合するように、ＰＣＲ効率性と特異性を高めるためにＰＣＲ溶液添加組成物を開発する、特別なプローブ及び／又はプライマーを考案する、或いは酵素を改良する、方法が摸索されてきた。
【0034】
ＤＭＳＯ、ベタインなどの増幅効率の増大のための試薬、ＤＮＡ重合酵素抑制用単一クローン抗体、室温のような低い温度でＤＮＡ重合酵素活性を抑制するオリゴ核酸、別名アプタマーの添加は、しばしばＤＮＡ増幅効率を増大させ、非特異的ＰＣＲ産物増幅又はプライマーダイマーの形成を抑制する。しかし、それらを添加すると、対立遺伝子の区分性を増大させ難い。
【0035】
対立遺伝子の変異配列による３’ミスマッチの有無によって対立遺伝子を区分できるようにＡＳプライマー又はＡＲＭＳプライマーを使用する場合に対立遺伝子の区分性が向上することから、それを多く採択している。一つの塩基がミスマッチするＡＳプライマーを使用する場合、高いＰＣＲ効率に比べてしばしば対立遺伝子の区分性が低く、２つ以上の塩基がミスマッチしたＡＲＭＳプライマーの場合、ＡＳプライマーの使用に比べて対立遺伝子の区分性は良くなるが、ＰＣＲ増幅効率が低くなるため、検出限界（ＬＯＤ；ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）が頻繁に低下する。
【0036】
また、３’ミスマッチとマッチの区分性を高めた突然変異ＤＮＡ重合酵素を用いて突然変異配列の検出特異度を高めることができる。しかし、突然変異ＤＮＡ重合酵素はしばしば酵素活性が低下し、これによって検出感度も低下する。
【0037】
したがって、効率的に対立遺伝子又は突然変異配列を検出及び診断するために、上記の短所を克服する技術、すなわち、ＰＣＲ効率が低下しなく、ＤＮＡ重合酵素の活性の減少が起きない上にも、使用するプライマー３’末端と鋳型ＤＮＡとのマッチとミスマッチの区分性を高める技術が必要である。
【課題を解決するための手段】
【0038】
本発明の目的は、対立遺伝子に対してプライマーの３’ミスマッチ又はマッチによる区分性を増大させることにより、対立遺伝子又は突然変異のような配列検出の区分性及び／又は特異度を増大させることができるＰＣＲ緩衝液組成物又は該組成物を用いたＰＣＲ方法を提供することである。これを達成するために、本発明者らは、ＰＣＲ緩衝液に二重螺旋を形成するオリゴヌクレオチド、すなわち、区分性増進オリゴヌクレオチド（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｂｏｏｓｔｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；“ｄｂＯｌｉｇｏ”）を含むＰＣＲ緩衝液及びこれを用いたＰＣＲ方法を提示しようとする。
【0039】
通常のＡＳ－ＰＣＲ又はＡＲＭＳ－ＰＣＲを行う際、プライマーの３’末端にミスマッチがあるにもかかわらずＰＣＲ反応が起きる。これは、ＰＣＲ反応に使用されるＤＮＡ重合酵素の３’ミスマッチにもかかわらず、ＤＮＡ重合酵素による次の段階のｄＮＴＰ添加が起き、一応合成されたＤＮＡは、その次のＰＣＲサイクルからはプライマーとの不一致が解消してマッチするので、円滑な合成がなされ、ミスマッチの場合にもＰＣＲがしばしば行われる。
【0040】
したがって、ＰＣＲ反応初期に鋳型に対してプライマー３’末端の塩基がミスマッチした状況でＰＣＲ進行が抑制されてこそ、両遺伝子の区分が極大化し得る。３’ミスマッチにもかかわらずにＰＣＲの進行が頻繁である理由は、効率的なＰＣＲのために過量のＤＮＡ重合酵素（“ＤＮＡＰ”とも略す。）を初期に投入することによって反応の誤りが頻繁に起きることにある。初期の過量のＤＮＡＰの投入により、プライマー（“Ｐ”とも略す。）が３’ミスマッチする鋳型（“Ｔ２”ともいう。）と結合（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）したＤＮＡ（すなわち、Ｐ／Ｔ２）及びＤＮＡＰの基質酵素複合体、すなわち［Ｐ／Ｔ２・ＤＮＡＰ］の濃度が高くなり、頻繁な３’ミスマッチＰＣＲ反応誤りが起きるであろう。初期酵素投入量を減らすことによって頻繁な［ＤＮＡＰ・Ｐ／Ｔ２］複合体形成を減らすことができるが、この場合には指数的に増加するＰＣＲ反応産物の効率的増幅が期待できない。また、汚染防止と自動化のために閉鎖環境（ｃｌｏｓｅｄ ｓｙｓｔｅｍ）を維持しなければならないＰＣＲの特性の上、反応進行過程中には持続してＤＮＡ重合酵素を注入することが非常に難しい。
【0041】
そこで、本発明者らは、ＰＣＲ反応溶液内でＤＮＡ重合酵素を重合反応に適切に使用可能にする組成物を、ＰＣＲ溶液、ＰＣＲキット又はＰＣＲ反応混合物に含める方法に着眼した。
【0042】
ＰＣＲ溶液、ＰＣＲキット又はＰＣＲ反応混合物には、ＤＮＡ重合酵素と可逆的な結合ができる組成物、好ましくは、核酸、タンパク質、その他有機化合物などを加えることができる。より好ましくは、ＰＣＲ反応中にＤＮＡ重合酵素の活性を抑制しない物質が含まれてよい。ＤＮＡ重合酵素と結合可能なタンパク質は、ＤＮＡ構造と類似なタンパク質（ＤＮＡ Ｍｉｍｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５３，２８６５－２８７４（２０１４））であってよく、ＤＮＡ重合酵素と結合可能な核酸としては、二本鎖を形成するオリゴヌクレオチドを挙げることができ、より好ましくは、ＤＮＡ重合酵素に結合し易い二本鎖ＤＮＡが適切である。
【0043】
これに着眼して本発明者らは、ＤＮＡ重合酵素と特定温度、好ましくは、ＰＣＲ反応段階において最も低い温度（アニーリング温度）よりも高いＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を有する二本鎖オリゴヌクレオチド又は二本鎖オリゴヌクレオチド断片又は二本鎖を形成できるオリゴヌクレオチド、すなわち、区分性増進オリゴヌクレオチドをＰＣＲ溶液に含める方法で３’ミスマッチＰＣＲ時増幅を抑制し、これによって対立遺伝子又は突然変異遺伝子と正常遺伝子との区分性を高める方法を発明した。
【0044】
本発明は、
【0045】
（イ）潜在的突然変異位置を持つ標的ＤＮＡ配列を含む一つ以上の鋳型に対する正方向プライマー及び逆方向プライマー；
【0046】
（ロ）前記鋳型に結合する前記正方向プライマー及び逆方向プライマーからＤＮＡを重合するＤＮＡ重合酵素；及び
【0047】
（ハ）前記鋳型、正方向プライマー及び逆方向プライマーと相補的でなく、前記ＤＮＡ重合酵素と可逆的な結合が可能であり、部分的に又は全体的に二本鎖を形成する１種又は２種以上の区分性増進オリゴヌクレオチド；を含む、標的ＤＮＡ配列の突然変異検出用ＰＣＲキットに関する。
【0048】
また、本発明は、（ニ）潜在的突然変異位置を持つ標的ＤＮＡ配列を含む一つ以上の鋳型をさらに含む、突然変異検出用ＰＣＲキットに関する。
【0049】
また、本発明は、前記正方向プライマー３’末端の最初の塩基が標的ＤＮＡ配列の潜在的突然変異位置と対応する突然変異検出用ＰＣＲキットに関する。
【0050】
また、本発明は、前記正方向プライマーがＡＳ（ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）プライマー又はＡＲＭＳ（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）プライマーである突然変異検出用ＰＣＲキットに関する。
【0051】
また、本発明は、前記区分性増進オリゴヌクレオチド（ｄｂＯｌｉｇｏ）がＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド二本鎖、二本鎖オリゴヌクレオチド、又は部分的に又は全体的にＤＮＡ二本鎖を形成できる部分的に又は全体的に相補的なオリゴヌクレオチド一本鎖、部分的に又は全体的にＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド二本鎖を形成できる部分的に又は全体的に相補的なオリゴヌクレオチド一本鎖、部分的に又は全体的に二本鎖オリゴヌクレオチドを形成できる部分的に又は全体的に相補的なオリゴヌクレオチド一本鎖、及び部分的に又は完全にヘアピン二本鎖を形成できるオリゴヌクレオチドから選ばれる一つ以上であることを特徴とする突然変異検出用ＰＣＲキットに関する。前記区分性増進オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応の際にＰＣＲ反応をほとんど阻害しない上に、ＳＮＰ又は体細胞突然変異のような突然変異間の区分性を増進させる。前記区分性増進オリゴヌクレオチドにおいて部分的に又は全体的に二本鎖を形成できる部分的に又は全体的に相補的なオリゴヌクレオチド一本鎖又は一本鎖は、自己相補的（ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）一本鎖であってよく、又は２種以上の部分的又は全体的に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド一本鎖であってよい。
【0052】
また、本発明は、前記区分性増進オリゴヌクレオチドが任意の配列であることを特徴とする突然変異検出用ＰＣＲキットに関する。
【0053】
また、本発明は、標的ＤＮＡ配列の突然変異が一塩基多型であることを特徴とする突然変異検出用ＰＣＲキットに関する。
【0054】
また、本発明は、前記ＤＮＡ重合酵素が耐熱性ＤＮＡ重合酵素である突然変異検出用ＰＣＲキットに関する。
【0055】
また、本発明は、前記ＤＮＡ重合酵素が野生型又は変異型ＤＮＡ重合酵素である突然変異検出用ＰＣＲキットに関する。
【0056】
また、本発明は、区分性増進オリゴヌクレオチドが１０塩基以上１００塩基以下、又は１０塩基以上９０塩基以下、又は１０塩基以上８０塩基以下、又は１０塩基以上７０塩基以下、又は１０塩基以上６０塩基以下、好ましくは、１５塩基以上５０塩基以下、又は１５塩基以上４０塩基以下、又は１５塩基以上３０塩基以下である突然変異検出用ＰＣＲキットに関する。オリゴヌクレオチドが１０塩基未満であるか１００塩基を超える場合には、対立遺伝子の区分性向上効果が大きくない。
【0057】
また、本発明は、区分性増進オリゴヌクレオチドのＴｍ値がＰＣＲ反応のアニーリング温度と同一である又は高い突然変異検出用ＰＣＲキットに関する。区分性増進オリゴヌクレオチドのＴｍ値がアニーリング温度よりも低い場合には、対立遺伝子の区分性向上効果が大きくない。
【0058】
また、本発明は、区分性増進オリゴヌクレオチドのＴｍ値が５０～８５℃である突然変異検出用ＰＣＲキットに関する。オリゴヌクレオチドのＴｍ値が５０～８５℃である場合、対立遺伝子の区分性向上効果に優れる。
【0059】
また、本発明は、前記鋳型に対するプローブとして、蛍光共鳴エネルギー転移が可能なプローブを加える方法、又はＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉのような増幅核酸に結合する物質を添加する方法、又は一般の電気泳動によって増幅産物を確認する方法のいずれか一つを選ぶＰＣＲキット又は方法に関する。
【0060】
また、本発明は、前記鋳型に対するプローブとして、蛍光共鳴エネルギー転移が可能なプローブ、例えば、蛍光共鳴エネルギー転移が可能な、レポーターとクエンチャーで修飾されたプローブをさらに含む突然変異検出用ＰＣＲキットに関する。
【0061】
また、本発明は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉなどのように増幅産物に結合する物質をさらに含む突然変異検出用ＰＣＲキットに関する。
【0062】
また、本発明は、
【0063】
（イ）潜在的突然変異位置を持つ標的ＤＮＡ配列を含む鋳型と、前記鋳型に結合する正方向プライマー及び逆方向プライマーと、前記正方向プライマーと逆方向プライマーからＤＮＡを重合するＤＮＡ重合酵素、及び前記鋳型、正方向プライマー及び逆方向プライマーと相補的でなく、前記ＤＮＡ重合酵素と可逆的な結合が可能であり、重合酵素連鎖反応中にＤＮＡ重合酵素の活性をほとんど抑制しない或いは全く抑制しない区分性増進オリゴヌクレオチド及びＤＮＡ重合酵素を提供する段階；及び
【0064】
（ロ）前記鋳型、前記正方向プライマー、前記逆方向プライマー、前記ＤＮＡ重合酵素及び前記区分性増進オリゴヌクレオチドの存在下に、前記ＤＮＡ重合酵素を用いて重合酵素連鎖反応を行う段階；及び
【0065】
（ハ）前記（ロ）の反応から増幅曲線を得る段階；を含む遺伝子突然変異を検出する方法に関する。
【0066】
また、本発明は、
【0067】
（ニ）前記（ハ）で得た増幅曲線から、前記標的ＤＮＡ配列が突然変異を含むか否かを判別する段階：をさらに含む遺伝子突然変異を検出する方法に関する。
【0068】
また、本発明は、前記（イ）段階又は（ロ）段階で前記鋳型に対するプローブをより提供する、遺伝子突然変異を検出する方法に関する。
【0069】
また、本発明は、前記（イ）段階又は（ロ）段階でＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉのように増幅産物に結合する物質をさらに含む、遺伝子突然変異を検出する方法に関する。
【0070】
また、本発明は、前記正方向プライマー３’末端の最初の塩基が標的ＤＮＡ配列の潜在的突然変異位置と対応する、遺伝子突然変異を検出する方法に関する。
【0071】
また、本発明は、前記正方向プライマーがＡＳ（ａｌｌｅｌｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）プライマー又はＡＲＭＳ（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）プライマーである、遺伝子突然変異を検出する方法に関する。
【0072】
また、本発明は、前記区分性増進オリゴヌクレオチドがＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド二本鎖、二本鎖オリゴヌクレオチド、又は部分的に又は全体的にＤＮＡ二本鎖を形成できる部分的に又は全体的に相補的なオリゴヌクレオチド一本鎖、部分的に又は全体的にＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド二本鎖を形成できる部分的に又は全体的に相補的なオリゴヌクレオチド一本鎖、部分的に又は全体的に二本鎖オリゴヌクレオチドを形成できる部分的に又は全体的に相補的なオリゴヌクレオチド一本鎖、及び部分的に又は完全にヘアピン二本鎖を形成できるオリゴヌクレオチドのうち１種以上であることを特徴とする、遺伝子突然変異を検出する方法に関する。
【0073】
また、本発明は、前記区分性増進オリゴヌクレオチドが任意の配列であることを特徴とする、遺伝子突然変異を検出する方法に関する。
【0074】
また、本発明は、前記突然変異が一塩基多型である、遺伝子突然変異を検出する方法に関する。
【0075】
また、本発明は、前記ＤＮＡ重合酵素が耐熱性ＤＮＡ重合酵素である、遺伝子突然変異を検出する方法に関する。
【0076】
また、本発明は、前記ＤＮＡ重合酵素が野生型又は変異型ＤＮＡ重合酵素である、遺伝子突然変異を検出する方法に関する。ＰＣＲを用いて対立遺伝子の区分性を高めるために、ＤＮＡ重合酵素の一部アミノ酸を置換、欠失及び／又は挿入した変異型ＤＮＡ重合酵素が開発されている。このような変異型ＤＮＡ重合酵素を使用する場合にも、本発明の区分性増進オリゴヌクレオチドを加えると、対立遺伝子の区分性がより向上する。
【0077】
また、本発明は、区分性増進オリゴヌクレオチドが１０塩基以上１００塩基以下、又は１０塩基以上９０塩基以下、又は１０塩基以上８０塩基以下、又は１０塩基以上７０塩基以下、又は１０塩基以上６０塩基以下、好ましくは１５塩基以上５０塩基以下、又は１５塩基以上４０塩基以下、又は１５塩基以上３０塩基以下である、遺伝子突然変異を検出する方法に関する。
【0078】
また、本発明は、区分性増進オリゴヌクレオチドのＴｍ値が重合酵素連鎖反応のアニーリング温度と同一である又は高い、遺伝子突然変異を検出する方法に関する。
【0079】
また、本発明は、区分性増進オリゴヌクレオチドのＴｍ値が５０～８５℃である、遺伝子突然変異を検出する方法に関する。
【0080】
また、本発明は、前記鋳型に対するプローブとして蛍光共鳴エネルギー転移が可能なプロを加える方法、又はＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉのような増幅核酸に結合する物質を添加する方法、又は一般の電気泳動によって増幅産物を確認する方法から一つを選ぶＰＣＲキット又は方法に関する。
【0081】
【発明の効果】
【0082】
本発明のキット又は方法によれば、一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）又は体細胞突然変異（ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ）のようなマイナー対立遺伝子検出に用いられる重合酵素連鎖反応の特異度及び敏感度を顕著に高めることができる。すなわち、区分性増進オリゴヌクレオチドをＰＣＲ溶液に添加した場合に、プライマー３’末端の塩基が鋳型と非相補的である時にはＰＣＲ増幅が抑制され、相補的である時にはＰＣＲ増幅が強化され、区分性増進オリゴヌクレオチドを加えていない時と比較して、特異度及び敏感度が顕著に向上する。
【0083】
本発明の区分性増進オリゴヌクレオチドを付加するＰＣＲキット又は方法は、実時間ＰＣＲの他、一般ＰＣＲにおいても特異度及び敏感度を顕著に向上させる。
【0084】
本発明の区分性増進オリゴヌクレオチドを付加するＰＣＲキット又は方法は、蛍光信号を出す加水分解プローブの他にも、増幅産物を探知できる物質を用いるなどの手段により、相補的又は非相補的変異位置の存在及び増幅の有無を容易に確認できる。
【0085】
したがって、本発明のキット又は方法を用いると、少量多品種が混合された試料中の対立遺伝子検出が容易である。
【0086】
また、本発明のキット又は方法を用いると、微量の突然変異を含む試料中の突然変異遺伝子検出が容易である。
【0087】
【図面の簡単な説明】
【0088】
【図1】区分性増進オリゴヌクレオチド（“ｄｂＯｌｉｇｏ”）添加によるＰＣＲ反応の動力学を示す概念図（Ｉ）、及びｄｂＯｌｉｇｏ添加の有無によって得られたＡＳ－ＰＣＲの増幅曲線（ＩＩ）である。
【0089】
（Ａ），ｄｂＯｌｉｇｏ無添加区ＡＳ－ＰＣＲ；（Ｂ），ｄｂＯｌｉｇｏ添加区ＡＳ－ＰＣＲ
【0090】
Ｋｃａｔ１、Ｋ１及びＫ－１：ｄｂＯｌｉｇｏ無添加区（Ａ）の３’末端マッチプライマー使用時に各表示された段階別酵素の反応定数
【0091】
Ｋｃａｔ１ｄ、Ｋ１ｄ及びＫ－１ｄ：ｄｂＯｌｉｇｏ添加区（Ｂ）の３’末端マッチプライマー使用時に各表示された段階別酵素の反応定数
【0092】
Ｋｃａｔ２、Ｋ２及びＫ－２：ｄｂＯｌｉｇｏ無添加区（Ａ）の３’末端ミスマッチプライマー使用時に各表示された段階別酵素の反応定数
【0093】
Ｋｃａｔ２ｄ，Ｋ２ｄ及びＫ－２ｄ：ｄｂＯｌｉｇｏ添加区（Ｂ）の３’末端ミスマッチプライマー使用時に各表示された段階別酵素の反応定数
【0094】
反応時に添加されたｄｂＯｌｉｇｏは配列番号１４と１５であり、それぞれ２０ｐｍｏｌずつ添加又は無添加（試験番号１）
【0095】
特異増幅比（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ）は２ΔＣｔと計算
【0096】
特異増幅比（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ）＝３’マッチＤＮＡの増幅（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ３’ ｍａｔｃｈｅｄ ＤＮＡ）／３’ミスマッチＤＮＡの増幅（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ３’ ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ ＤＮＡ）
【0097】
【図2】ｄｂＯｌｉｇｏ添加量による対立形質特異的ＰＣＲの区分性を示す増幅曲線である。
【0098】
ｍ，突然変異鋳型（ｍｕｔａｔｅｄ ｔｅｍｐｌａｔｅ）（プライマーの３’末端とマッチする）；
【0099】
ｗ，正常鋳型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｔｅｍｐｌａｔｅ）（プライマーの３’末端とミスマッチする）。
【0100】
添加されたｄｂＯｌｉｇｏは、配列番号１３の配列を有し、添加量はそれぞれ、０、１０、２０、４０、６０、８０ｐｍｏｌである。
【0101】
【図3】改良型ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素と野生型ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素に対するｄｂＯｌｉｇｏの効果を示す増幅曲線である。添加されたｄｂＯｌｉｇｏは配列番号１３の配列を示し、添加量はそれぞれ４０ｐｍｏｌである。
【0102】
Ｗｔ－Ｔａｑ，野生型Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素；Ｍｕｔ－Ｔａｑ，改良型（Ｒ５３６Ｋ突然変異）Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素
【0103】
ｍ，突然変異鋳型（ｍｕｔａｔｅｄ ｔｅｍｐｌａｔｅ）（プライマーの３’末端とマッチする）；
【0104】
ｗ，正常鋳型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｔｅｍｐｌａｔｅ）（プライマーの３’末端とミスマッチする）。
【0105】
【図4】加水分解プローブを使用しないＰＣＲにおいてｄｂＯｌｉｇｏの添加効果を示す増幅曲線と電気泳動写真である。
【0106】
【発明を実施するための形態】
【0107】
特に断らない限り、本明細書で使われる技術的及び科学的用語はいずれも、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使われる命名法は、当該技術分野でよく知られており、一般に用いられるものである。
【0108】
本開示内容は、本開示内容の一部を形成する、添付の図面及び実施例と関連してなされた下記の詳細な説明を参照することによってより容易に理解できよう。本明細書、図面及び特許請求の範囲に使われる用語は、単に特定の実施様態を記載しようとする目的のためのもので、制限しようとする意図を有しないものであることを理解すべきである。本明細書及び添付する特許請求の範囲で使われる単数形態は、内容において明示しない限り、複数対象物をも含む。
【0109】
本発明において別に断りのない限り、本発明の実施は、本発明の属する技術分野で通常知られた分子生物学的方法を利用する。
【0110】
本発明において、“塩基（ｂａｓｅ）”は、プリン、ピリミジン又はそれらの変形された形態を含む天然又は合成塩基、塩基類似体、又は塩基誘導体のことを指し、代表としては、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル又はチミンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【0111】
本発明において“ヌクレオチド”は核酸を構成する単位体分子であり、糖、塩基及びリン酸からなっており、糖は、リボース又はデオキシリボースであり、糖のＣ－１’炭素に塩基が連結され、糖のＣ－５’炭素にリン酸が連結された化合物である。本発明において用語“ヌクレオチド”は、ヌクレオチド類似体を含む。糖は、他の構造類似体に置換又は非置換されてよい。このような化合物などで構成された核酸類似体としては、ホスホロチオアートＤＮＡ、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ホスホロアミダートＤＮＡ、モルフォリノ、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）などを含むことができるが、これに限定されるものではない。
【0112】
本発明において“核酸”、“ポリヌクレオチド”、“オリゴヌクレオチド”、“オリゴマー”又はこれと均等な用語は、デオキシリボ核酸、リボ核酸、ホスホロチオアート含有核酸、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）などのような単量体の組合せのようにヌクレオチド塩基に相応する単量体の重合体を含むことができ、種々の単量体の重合体を含むことができ、それらと類似の構造を形成するポリマー（例えば、モルフォリノ）を含むことができる。
【0113】
本発明において“オリゴヌクレオチド”は、短いポリヌクレオチドを意味する。オリゴヌクレオチドは、約２５０個ヌクレオチド以下、又は約２００個ヌクレオチド以下、又は約１００個ヌクレオチド以下をいう。
【0114】
本発明において“オリゴヌクレオチド”は、構造が変形（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）されたオリゴヌクレオチドを含むことができる。変形とは、塩基の変形（例えば、プリンアナログ、ピリミジンアナログ、反転塩基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｂａｓｅ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ）アナログ、フッ化（ｆｌｕｏｒｏ）アナログなど）、ヌクレオシドの結合領域の（リンカー）の変形（例えば、アミノ（ＮＨ２）リンカー、カルボキシルリンカー、チオール（ＳＨ）リンカーなど）、リン酸基の変形及び／又はオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端又は内部塩基の変形を含むことができ、或いはこのような変形の組合せを含むことができる。
【0115】
本発明において“鋳型”は、“鋳型核酸”を意味し、ＰＣＲ反応において増幅のための鋳型として用いられる核酸をいう。“鋳型”は、天然に存在する或いは天然的に生成されたもの又は合成されたものをいずれも含むことができる。
【0116】
本発明において“標的”は、分析対象となる鋳型の核酸を意味する。
【0117】
一般に、ＰＣＲ緩衝液には、Ｍｇ＋＋、ｄＮＴＰのような必須要素の他に、ＤＭＳＯ、ベタイン、アプタマー又は抗体のような非必須の添加組成物も含まれてよい。
【0118】
本発明では、３’ミスマッチの有無によって両対立遺伝子を区分するプライマー、好ましくはＡＳプライマー又はＡＲＭＳプライマーを使用するＰＣＲにＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド二本鎖、二本鎖オリゴヌクレオチド、又は部分的に又は全体的にＤＮＡ二本鎖を形成できる部分的に又は全体的に相補的なオリゴヌクレオチド一本鎖、部分的に又は全体的にＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド二本鎖を形成できる部分的に又は全体的に相補的なオリゴヌクレオチド一本鎖、部分的に又は全体的に二本鎖オリゴヌクレオチドを形成できる部分的に又は全体的に相補的なオリゴヌクレオチド一本鎖、及び部分的に又は完全にヘアピン二本鎖を形成できるオリゴヌクレオチドのうち１種以上のような区分性増進オリゴヌクレオチドをＰＣＲ緩衝液組成物に添加する方法により、対立遺伝子の区分性（ΔＣｔ又はΔＣｐ、ΔＣｑ）をより高めることができる。
【0119】
また、本発明において、ＰＣＲ反応時に添加される区分性増進オリゴヌクレオチドには、例えば、ソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）又はそれと類似の構造を有する化合物、又は化学的リンカー（例えば、ジスルフィドリンカー、ビスマレイミドリンカーなど）を用いて部分的又は全体的に相補的な配列を有する２種又はそれ以上の一本鎖オリゴヌクレオチドを化学的に結合させる方法又はオリゴヌクレオチドの末端を化学的な方法で連結又は合成してヘアピンループのような構造で一本鎖内に相補的配列を構成する方法などによって二本鎖を形成できるオリゴヌクレオチドを含むことができる。このうち、最も好ましい例は、一本のオリゴヌクレオチド内に相補的配列を構成して二本鎖を容易に形成するものである。部分的に又は全体的に相補的な配列を有する二本の鎖が分離されている場合に比べて、緩衝液内で分散されていない形態の一本のオリゴヌクレオチドが部分的又は全体的に自己相補的配列を有する場合に二本鎖を形成し易いためである。したがって、相補的な２配列が物理的に分離されないように化学的方法又は一本鎖内に相補的配列を存在させる方法によって二本鎖を容易に形成することが、本発明の目的達成においてより有利である。
【0120】
本発明の目的を達成するために、区分性増進オリゴヌクレオチドは、それを構成する塩基の順序、核酸の種類又は長さによって、ＤＮＡ重合酵素に対する結合力に差異があり得るが、本発明では、特定の塩基配列、特定の核酸種類又は特定範囲のオリゴヌクレオチド長に限定されるものではない。
【0121】
二本鎖を形成する相補配列が長すぎる、又はＰＣＲ反応液内の相補オリゴヌクレオチド対が種々ある場合には、ＰＣＲ過程中に二本鎖形成を相互妨害するか或いは非特異的二本鎖形成を引き起こし、本発明の目的を達成できなくなることがある。例えば、ゲノムＤＮＡは、ＰＣＲ過程中に変成されると、塩基配列が長すぎるため正確な二本鎖形成が容易でなく、よって、本発明の目的が達成し難い。したがって、本発明の目的を達成するための二本鎖を形成する相補配列の長さは１０塩基以上が好ましく、１５～５０塩基がより好ましいが、相補配列及び核酸の種類は、特定配列や特定核酸に限定されない。
【0122】
本発明の目的を達成するために、ＰＣＲ反応液組成物に含まれる区分性増進オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応液２０ｕｌ中に０．０１～１，０００ｐｎｏｌ、又は０．１～５００ｐｍｏｌ、又は０．１～４００ｐｍｏｌ、又は０．１～３００ｐｍｏｌ、又は０．１～２００ｐｍｏｌ、又は０．１～１００ｐｍｏｌ、又は１～８０ｐｍｏｌであることが好ましい。しかし、区分性増進オリゴヌクレオチド量は、検出対象遺伝子の配列、試料及びＰＣＲの条件によって変化可能であり、特定の濃度に限定されない。
【0123】
本発明は、ＤＮＡ重合酵素を使用するＰＣＲに適用可能であり、好ましくは、重合酵素Ａ群（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ Ｉ系列）を利用するＰＣＲに適用可能である。この重合酵素は、耐熱性細菌、好ましくは耐熱性真正細菌（ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ）由来のＤＮＡ重合酵素から選択されてよく、より好ましくは、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）種、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）種、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）種、デイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）種、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種などに由来のＤＮＡ重合酵素から選ばれてよい。
【0124】
本発明では、添加される区分性増進オリゴヌクレオチドのうち二本鎖を形成する部位の融点（Ｔｍ）が、一般ＰＣＲのアニーリング温度よりも高いことが、本発明の目的達成に容易である。例えば、ＰＣＲ時のアニーリング温度よりも区分性増進オリゴヌクレオチド二本鎖のＴｍが低いと、区分性増進オリゴヌクレオチドの二本鎖形成が低下するため、ＤＮＡ重合酵素の結合能力が阻害され、本発明の目的が達成し難くなる。したがって、本発明に使用される区分性増進オリゴヌクレオチドは、二本鎖領域のＴｍが一般ＰＣＲのアニーリング温度よりも高くなるように塩基配列を構成することが好ましい。
【0125】
本発明の効果は、図１のような機序によってなされるものと説明されてよい。この機序は、発明をより正確に理解するためのものであり、発明の全部を完壁に説明するものではない。ただし、本発明の機序に関する説明が完全でなくても、それを理由に本発明の効果が否定されてはならない。
【0126】
図１は、プライマーの３’末端が鋳型とマッチする場合（左側、“３’－ｍａｔｃｈｅｄ”と表記）とマッチしない場合（右側、“３’－ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ”と）表記）とに分けて動力学係数を説明する。また、３’－ｍａｔｃｈｅｄと３’－ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄの場合はそれぞれ２通りに分けられるが、（Ａ）は、ＰＣＲ反応時に区分性増進オリゴヌクレオチド（ｄｂＯｌｉｇｏ）を加えていないものを示し、（Ｂ）は、ＰＣＲ反応時にｄｂＯｌｉｇｏを加えたものを示す。“ＤＮＡＰ”は、ＤＮＡ重合酵素を表し、“ｄｂＯｌｉｇｏ”は、配列が特定されていないオリゴヌクレオチドであって、二本鎖状態で加えるか或いは反応液内で二本鎖を形成するものをいう。“Ｋ１”、“Ｋ－１”はそれぞれ、反応時にｄｂＯｌｉｇｏを加えなく、プライマーの３’末端が鋳型とマッチする状態での正方向及び逆方向動力学係数を表し、“Ｋ１ｄ”、“Ｋ－１ｄ”はそれぞれ、反応時にｄｂＯｌｉｇｏを加え、プライマーの３’末端が鋳型とマッチする状態での正方向及び逆方向動力学係数を表す。“Ｋ２”、“Ｋ－２”はそれぞれ、反応時にｄｂＯｌｉｇｏを加えなく、プライマーの３’末端が鋳型とマッチしない状態での正方向及び逆方向動力学係数を表し、“Ｋ２ｄ”、“Ｋ－２ｄ”はそれぞれ、反応時にｄｂＯｌｉｇｏを加え、プライマーの３’末端が鋳型とマッチしない状態での正方向及び逆方向動力学係数を表す。
【0127】
鋳型とプライマー３’とのミスマッチの有無によってＤＮＡ重合酵素（以下、“ＤＮＡＰ”ともいう。）のＤＮＡ合成過程は非常に複雑である。基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）となるプライマー（以下、“Ｐ”とも略す。）と鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）ＤＮＡ（以下、３’がマッチする鋳型ＤＮＡを便宜上“Ｔ１”、３’がミスマッチする鋳型ＤＮＡを便宜上“Ｔ２”という。）の混成体（Ｐ／Ｔ１又はＰ／Ｔ２）、ＤＮＡ重合酵素（ＤＮＡＰ）、ｄＮＴＰｓ、Ｍｇ＋＋、ＰＰｉなどの様々な要素が酵素動力学（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）に関与する。
【0128】
ＤＮＡＰ・Ｐ／Ｔ複合体の形成時に、Ｋｃａｔは、３’マッチ（ＤＮＡＰ・Ｐ／Ｔ１）又は３’ミスマッチ（ＤＮＡＰ・Ｐ／Ｔ２）によって非常に異なって示される。文献報告によれば、ＰＣＲ反応時にプライマーの３’末端が鋳型とマッチする場合に、３’がミスマッチする場合に比べて重合酵素連鎖反応が非常に速く起きる｛Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．６４（５）：８０１－８０９（２０１８）｝。この報告によれば、プライマーの３’末端がミスマッチする場合に比べて３’がマッチする場合に、Ｋｃａｔ／Ｋｍが略１００～１０００倍高い。これは、３’ミスマッチの場合にＫｃａｔが非常に低くなり（約１０倍～約６００倍）、Ｋｍが少し増大（最大で約３倍）したためである。
【0129】
前記文献から類推すると、プライマーの３’末端が鋳型とマッチする場合に、ＤＮＡＰ・Ｐ／Ｔ１複合体の形成後に、高いＫｃａｔ１に基づいて重合反応が終わるまで、酵素の脱離無しに持続してｄＮＴＰｓを使用した重合過程が反復して起きるが、プライマーの３’末端が鋳型とミスマッチである場合に、ＤＮＡＰ・Ｐ／Ｔ２複合体形成は、低いＫｃａｔ２（Ｋｃａｔ１＞＞＞Ｋｃａｔ２）によってＤＮＡ重合酵素の脱離と付着が頻繁になるであろう。
【0130】
本発明において、実時間ＰＣＲ反応時に二本鎖オリゴヌクレオチドを添加したとき、３’マッチの場合と３’ミスマッチの場合に実時間ＰＣＲ反応に顕著な差異が見られる（図１のＩＩ、増幅曲線）。
【0131】
３’マッチの場合、ｄｂＯｌｉｇｏを添加又は無添加したいずれの場合にも類似のＣｔ値を示し、これに照らして、ｄｂＯｌｉｇｏを添加した場合と無添加した場合に反応速度が類似し（Ｋｃａｔ１≒Ｋｃａｔ１ｄ）、ＤＮＡ重合酵素の鋳型ＤＮＡに対する脱離及び付着比（Ｋ－１／Ｋ１≒Ｋ－１ｄ／Ｋ１ｄ）が類似するので、ｄｂＯｌｉｇｏの添加がＰＣＲ反応に大きい影響を与えなかったと推論できる。すなわち、プライマー３’末端が鋳型とマッチする場合には、ｄｂＯｌｉｇｏ添加時にも無添加対照区と類似に高い反応性を示し、これはｄｂＯｌｉｇｏによるＤＮＡ重合酵素活性の変化がほとんどない或いは非常に少ないことを示す。
【0132】
本発明者らは、プライマー３’末端が鋳型とミスマッチする場合に、ｄｂＯｌｉｇｏ添加の有無に関係なく、３’マッチの場合のようにたとえその値がＫｃａｔ１やＫｃａｔ１ｄより低くても、Ｋｃａｔ２とＫｃａｔ２ｄが互いにほとんど類似（Ｋｃａｔ２≒Ｋｃａｔ２ｄ＜＜＜Ｋｃａｔ１≒Ｋｃａｔ１ｄ）すると予測した。しかし、予想とは違い、３’ミスマッチの場合、ｄｂＯｌｉｇｏを添加したとき（図１の３’－ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ（Ｂ））、重合反応が顕著に減少した。その理由は、ＤＮＡＰ・Ｐ／Ｔ２を形成する際に、ｄｂＯｌｉｇｏを加えていない場合に比べてｄｂＯｌｉｇｏを加えた場合に、ＤＮＡ重合酵素の付着反応定数（Ｋ２ｄ）が減少するか、或いは脱離反応定数（Ｋ－２ｄ）の増加が起きたためと推論できる。すなわち、ＰＣＲ反応液にｄｂＯｌｉｇｏを加えることによって鋳型ＤＮＡ又は産物ＤＮＡに対するＤＮＡ重合酵素の脱離及び付着比が大きく変わった（Ｋ－２／Ｋ２＜＜＜Ｋ－２ｄ／Ｋ２ｄ）と推定される。このような反応係数の差異により、ｄｂＯｌｉｇｏを添加したＰＣＲ反応において３’マッチと３’ミスマッチ間の区分性が高くなるものと推論される。
【0133】
その結果、本発明が達成しようとする目的、すなわち、対立遺伝子又は変異遺伝子間の３’マッチの有無によって実時間ＰＣＲ反応において増幅曲線の明確な区分が可能になる。
【0134】
また、３’マッチした鋳型ＤＮＡにおいて実時間ＰＣＲが効率的に進行し、指数的な増幅がなされると、合成されたＤＮＡ増幅産物が新しい鋳型になるので、酵素の基質が急激に増加する。すなわち、ＰＣＲ反応初期には［Ｐ／Ｔ１］≒［Ｐ／Ｔ２］＜＜＜［ｄｂＯｌｉｇｏ］であるが、ＰＣＲ増幅過程が反復して起きると［Ｐ／Ｔ１］が指数的に増加するため、相対的に［ｄｂＯｌｉｇｏ］の［Ｐ／Ｔ１］に対する競争優位効果がなくなり、ＰＣＲ進行がより円滑になるであろう。一方、プライマーの３’末端とミスマッチするＤＮＡ鋳型の場合、［ｄｂＯｌｉｇｏ］の［Ｐ／Ｔ２］に対する優位効果が維持され、ＰＣＲ反応が持続して抑制されるので、増幅曲線においてより区分性が高くなる効果が得られる。
【0135】
発明の実施のための形態
【0136】
以下、具体的な実施例を挙げて発明の構成をより詳細に説明する。ただし、本発明の範囲が実施例の記載に限定されないことは、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者に自明である。
【0137】
上記の説明のように、区分性増進オリゴヌクレオチド（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｂｏｏｓｔｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；ｄｂＯｌｉｇｏ）を添加して対立遺伝子又は変異遺伝子の区分性を高めるＰＣＲを、本発明者らは“ＳＴｅｘＳ（ＳＮＰ Ｔｙｐｉｎｇ ｗｉｔｈ ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）”ＰＣＲと命名した。
【0138】
以下では具体的な例を挙げて本発明の“ＳＴｅｘＳ”ＰＣＲをより詳細に説明する。
【0139】
＜ＰＣＲの条件＞
【0140】
下記の実施例に特に言及がない限り、本発明の実施例に使用したＰＣＲ組成物及び条件は、下記の通りである。
【0141】
ＰＣＲに使用した正常標的鋳型ＤＮＡ又は突然変異標的鋳型ＤＮＡ、正方向プライマー、逆方向プライマー、信号検出用加水分解プローブ（ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｐｒｏｂｅ）は、表１の通りである。
【0142】
このとき、正方向プライマーは、各標的遺伝子ＥＧＦＲ ｃ．２３６９Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ｔ７９０Ｍ）；ＥＧＦＲ ｃ．２５７３Ｔ＞Ｇ（ｐ．Ｌ８５８Ｒ）とＢＲＡＦ ｃ．１７９９ｒｃ．Ａ＞Ｔ（ｐ．Ｖ６００Ｅ）突然変異の変異検出のために、正方向プライマー３’末端塩基が変異遺伝子とマッチし、正方向プライマー３’末端の１塩基が正常遺伝子とミスマッチするように設計したＡＳプライマーである。
【0143】
酵素は、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素（ＧｅｎｏＴｅｃｈ）を２単位（０．０５～０．０８ｕＭ）使用し、緩衝溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ９．０、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、６０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４）を全体積２０ｕｌとなるようにして行い、ＡＢＩ ７５００ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、９５℃、５分反応後に、９５℃で３０秒、５５℃で４０秒、を４５回反復して反応を行った。全ての試験は３回反復した平均値を摘示した。
【0144】
ＰＣＲ時に、区分性増進を確認するために様々なタイプのｄｂＯｌｉｇｏ、すなわち、一本鎖ＤＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ；ＳＤ）、相補的な配列の二本鎖ＤＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ；ＤＤ）、相補的な配列を持つ一本鎖ＤＮＡ（ｈａｉｒｐｉｎ ＤＮＡ；ＨＤ）を、試験によって１～８０ｐｍｏｌ添加した（表２、３、４）。
【0145】
鋳型ＤＮＡは、配列番号４４、４５、４６、４７、４８、４９配列を人工合成してｐＴＯＰ Ｂｌｕｎｔ Ｖ２（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ，Ｋｏｒｅａ）に挿入して作製して大腸菌に形質転換後に、培養して適切な制限酵素に切断した後、精製されたプラスミドＤＮＡを定量して使用した。
【0146】
【表1】
【0147】
＜実施例１＞ｄｂＯｌｉｇｏの添加による３’－ミスマッチ区分性増大
【0148】
ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍの区分のためのＡＳプライマー（正方向プライマー：配列番号１、逆方向プライマー：配列番号７）を用いたＰＣＲによる区分性ΔＣｔ１（ΔＣｔ１＝突然変異遺伝子のＣｔ－正常遺伝子のＣｔ）は、１．４８～２．１６と非常に低かった（表２の試験番号１～６）。
【0149】
ＰＣＲ反応時に、ｄｂＯｌｉｇｏとして、任意の配列で合成した相補的配列の二本鎖ＤＮＡ（ＤＤ）を２０ｐｍｏｌとなるように添加したとき（試験番号１（配列番号１４／１５）、試験番号２（配列番号１７／１８、１９／２０、１４／１５、２１／２２、２３／２４、２５／２６））、ΔＣｔ２（ΔＣｔ２＝ｄｂＯｌｉｇｏ添加時の突然変異遺伝子のＣｔ－ｄｂＯｌｉｇｏ添加時の正常遺伝子のＣｔ）が３．０４～６．７９、ΔΔＣｔ（ΔΔＣｔ＝ΔＣｔ２－ΔＣｔ１）が１．５６～４．５６と、区分性が大きく向上した（表２の試験番号１、２、図１のＩＩ；試験番号１）。
【0150】
これに対し、前記ＤＤ型の一本の鎖と配列が同一である一本鎖ＤＮＡ（ＳＤ）を２０～４０ｐｍｏｌ添加した試験区の場合（試験番号４（配列番号２５、配列番号２６））、ΔＣｔ２が２．２８～２．８２、ΔΔＣｔが０．２０～０．７４であって、相補的な二本鎖ＤＮＡ（ＤＤ）添加区［試験番号４（配列番号２５／２６）］のΔＣｔ２＝５．６６、ΔΔＣｔ＝３．５８に比べて、区分性向上効果がわずかであった（表２）。これは、区分性増進オリゴヌクレオチド（ｄｂＯｌｉｇｏ）が区分性増大に非常に重要であることを示す結果である。
【0151】
また、一本の鎖内に相補的塩基配列を持って二本鎖を形成するヘアピンＤＮＡ（ＨＤ）を添加した試験はいずれも、２．４６～５．９９のΔＣｔ２と０．３０～３．５１のΔΔＣｔが確認され、ＤＤと同様に高い区分性向上効果を示した（試験番号１（配列番号１６）、試験番号５（配列番号１６、２７、１３、２８、２９、３０、３１））（表２）。
【0152】
【表2】
【0153】
＊ｄｂＯｌｉｇｏ ｔｙｐｅ：ＳＤ，一本鎖ＤＮＡ；ＤＤ，二本鎖ＤＮＡ；ＨＤ，ヘアピン構造ＤＮＡ、＊＊Ｄｕｐｌｅｘ ｎｏ：二本鎖を形成する塩基数、＊＊＊Ｔｍ：二本鎖オリゴヌクレオチドの融点、
【0154】
＃ ΔＣｔ１：ｄｂＯｌｉｇｏを加えていない場合のΔＣｔ値、
【0155】
＃＃ ΔＣｔ２：ｄｂＯｌｉｇｏを加えた場合のΔＣｔ値
【0156】
＜実施例２＞ｄｂＯｌｉｇｏの濃度別添加による３’－ミスマッチ区分性
【0157】
区分性増進オリゴヌクレオチド（ｄｂＯｌｉｇｏ）の添加量による区分性を試験した（表２（試験番号３、試験番号６））。ｄｂＯｌｉｇｏ添加時に、ＨＤ型がＤＤ型に比べて反復的な試験による偏差が少ないので、ＰＣＲ区分性が安定していることが見られ、両方の場合とも１０～８０ｐｍｏｌであって、ＰＣＲ溶液に添加した時、添加量が多いほど区分性が向上したし、ΔＣｔ２は最大で１５．０７、ΔΔＣｔは１３．５と示された（表２；試験番号３（配列番号２５／２６）と試験番号６（配列番号１３））（図２）。
【0158】
＜実施例３＞ｄｂＯｌｉｇｏの二本鎖長さ又はＴｍによる３’－ミスマッチ区分性
【0159】
二本鎖を形成するｄｂＯｌｉｇｏの二本鎖長さ又は融点（Ｔｍ）と３’－ミスマッチ区分性増大との連関性を確認した（表２（試験番号２、試験番号５））。
【0160】
ＤＤ型において二本鎖形成長さを２０から３０塩基対へと、そしてＴｍを６４℃から７４℃へと増大させる場合に、区分性がΔＣｔ２＝３．０４（ΔΔＣｔ＝１．５６）からΔＣｔ２＝５．７０（ΔΔＣｔ＝４．２２）へと向上した（表２；試験番号２（配列番号、１７／１８、１９／２０、１４／１５、２１／２２、２３／２４、２５／２６））。
【0161】
ＨＤ型においても類似に、二本鎖を形成する塩基長さが２４塩基から１２塩基へと減少するほど（これによって、Ｔｍも６８℃から４７℃へと低くなる）（表２；試験番号５（配列番号１６、２７、１３、２８、２９、３０、３１））区分性が減少して、ΔＣｔ２が２．４６、ΔΔＣｔが０．３０と低くなった。これは、ＰＣＲ時のアニーリング温度である５５℃よりも顕著にＴｍ（４７℃）が低い二本鎖ＤＮＡ（配列番号３１）において区分性増大効果が急減した。
【0162】
両結果は、Ｔｍ値の高い二本鎖オリゴヌクレオチド又は二本鎖を形成する塩基対数が多い二本鎖オリゴヌクレオチドをｄｂＯｌｉｇｏとして添加時に区分性が増大し、その逆の場合に、区分性増大効果が低くなることを示す。
【0163】
＜実施例４＞ヘアピン構造ｄｂＯｌｉｇｏの配列による区分性
【0164】
ＨＤ型において非相補的領域、すなわち、二本鎖を形成しない中間配列の配列種類を任意に変化させた場合に、ｄｂＯｌｉｇｏのヌクレオチドの種類によってΔＣｔ２＝６．１２（ΔΔＣｔ＝３．８５）～ΔＣｔ２＝７．４２（ΔΔＣｔ＝５．１５）であって、あまり影響を受けなかった（表３；試験番号７（配列番号１３、３２、３３、３４、３５））。
【0165】
また、ＨＤ型において非相補的領域の数を増加させた場合に、例えば、アデニン塩基を３個から１０個に増加させた場合に、非相補的配列の増加によって区分性が部分的に少し減少したが、ｄｂＯｌｉｇｏを無添加した対照区に比べて区分性は依然として高かった（表３；試験番号８（配列番号３６、３７、３８、３９））。
【0166】
また、ｄｂＯｌｉｇｏの相補的配列の種類を変化させた場合に、ΔＣｔ２＝４．００（ΔΔＣｔ＝１．６０）～ΔＣｔ２＝６．０４（ΔΔＣｔ＝３．６４）と、差異があった。ポリＡ／Ｔ又はポリＧ／Ｃのような極端な重複配列においても、たとえ向上効果は大きくないが、区分性向上効果が見られたし、ｄｂＯｌｉｇｏの相補的配列によって区分性の効率が異なり得ることを確認した（表３；試験番号９（配列番号１３、４０、４１、４２、４３））。
【0167】
【表3】
【0168】
＊ｄｂＯｌｉｇｏ ｔｙｐｅ：ＨＤ，ヘアピン構造ＤＮＡ、＊＊Ｄｕｐｌｅｘ ｎｏ：二本鎖を形成する塩基数、
【0169】
＊＊＊Ｔｍ：二本鎖オリゴヌクレオチドの融点、
【0170】
＃ ΔＣｔ１：ｄｂＯｌｉｇｏを加えていない場合のΔＣｔ値、
【0171】
＃＃ ΔＣｔ２：ｄｂＯｌｉｇｏを加えた場合のΔＣｔ値
【0172】
＜実施例５＞ｄｂＯｌｉｇｏ添加時に鋳型濃度による３’－ミスマッチ区分性
【0173】
ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ変異検出に、鋳型ＤＮＡ量を１×１０４～１×１０７と異ならせて試験したとき（表４；試験番号１０）、ｄｂＯｌｉｇｏ無添加対照区のΔＣｔ１は１．１５～１．５０であって、あまり大きくなかったが、添加試験区のΔＣｔ２は７．５３～８．８３（ΔΔＣｔは６．３８～７．３３）と非常に大きく、鋳型ＤＮＡ量によって区分性程度に大きな差異はなかった。この結果は、様々な濃度の鋳型ＤＮＡを使用する試験区においても３’－ミスマッチ区分性を容易に向上させることができることを提示する。
【0174】
＜実施例６＞ＡＲＭＳ ＰＣＲにおけるｄｂＯｌｉｇｏの添加による３’－ミスマッチ区分性
【0175】
ＡＲＭＳ ＰＣＲもプライマーの３’－ミスマッチの区分性を高めるように考案された技術である。したがって、ＡＲＭＳプライマーを用いるＰＣＲに二本鎖オリゴヌクレオチドを添加した時の区分性を確認してみた（表4,試験番号１１）。３種類のＡＲＭＳプライマー（配列番号２、３、４）ともＡＳプライマー（配列番号１）に比べて高いΔＣｔ１（６．５０～７．６７）を示したが、ｄｂＯｌｉｇｏ（配列番号１３）を添加したとき、ΔＣｔ２が１０．０６～１０．５７と確認されたし、反応時に二本鎖オリゴヌクレオチドを添加すると、さらに区分性が向上する効果（ΔΔＣｔが２．３９～３．２４）を示した。すなわち、この結果は、ＡＳ ＰＣＲの他にＡＲＭＳ ＰＣＲにおいても、二本鎖オリゴヌクレオチドが３’－ミスマッチの区分性を向上させることができることを示す。
【0176】
＜実施例７＞ｄｂＯｌｉｇｏの添加時に標的遺伝子変異の塩基種類による３’－ミスマッチ区分性
【0177】
生命体内のＳＮＰには多種の塩基のミスマッチがある。上記の実施例１～６は、Ｔ７９０Ｍ、すなわちＣとＴ塩基を区分する試験（鋳型ＤＮＡ配列番号４４、４５）を対象に、ｄｂＯｌｉｇｏの添加による３’－ミスマッチ区分性を確認した。本実施例では、Ｃ／Ｔ塩基区分の他、さらに、ＥＧＦＲ Ｌ８５８ＲのＴとＧ塩基区分（鋳型ＤＮＡ配列番号４６、４７）とＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ（ｒｃ）のＡとＴ塩基区分（鋳型ＤＮＡ配列番号４８、４９）のための実時間ＰＣＲにおいて二本鎖オリゴヌクレオチドを付加し、適切なＡＳプライマーを使用して区分性が向上するかを試験した。鋳型ＤＮＡの配列又は３’末端塩基の種類によってΔＣｔ１に差異があった（Ｔ７９０Ｍ，２．２０；Ｌ８５８Ｒ，８．１４；Ｖ６００Ｅ，６．７５）が、二本鎖オリゴヌクレオチドを加えたΔＣｔ２は、Ｔ７９０Ｍ，４．４８；Ｌ８５８Ｒ，１０．４５；Ｖ６００Ｅ，１１．４３と、ΔΔＣｔは、Ｔ７９０Ｍ，２．２８；Ｌ８５８Ｒ，２．３１；Ｖ６００Ｅ，４．６８と示された。すなわち、対象遺伝子の配列又は３’ミスマッチ塩基の種類によって部分的な区分性程度の差異はあるが、二本鎖オリゴヌクレオチドを添加することによって区分性が向上することは、全ての試験区から確認された（表４、試験番号１２）。
【0178】
＜実施例８＞ｄｂＯｌｉｇｏ添加時にＤＮＡ重合酵素種類による３’－ミスマッチ区分性
【0179】
ＰＣＲの３’－ミスマッチ区分性を高めるために、改良された酵素が使用されてよい。本実施例では、３’－ミスマッチ区分性を高めるものと知られた変異（Ｒ５３６Ｋ）Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素を使用して３’－ミスマッチ区分性向上を試験した（表４、試験番号１３；図３）。突然変異Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素（Ｍｕｔ Ｔａｑ（Ｒ５３６Ｋ））を使用した場合に、野生型Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素（Ｗｔ－Ｔａｑ）のΔＣｔ１＝２．７８と比べて少し増加したΔＣｔ１＝３．５３を示し、また、ｄｂＯｌｉｇｏ添加時に、ΔＣｔ２＝８．２１、ΔΔＣｔ＝４．６８を示した。これは、たとえ突然変異Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素によって３’－ミスマッチ区分性が一部増大するが、ｄｂＯｌｉｇｏの添加によって３’－ミスマッチ区分がより向上することを示す。特に、改良されていない野生型重合酵素の場合も、ｄｂＯｌｉｇｏ無添加区のΔＣｔ１＝２．７８から、添加試験区ΔＣｔ２＝７．５６（ΔΔＣｔ＝４．７８）へと、区分性が大きく向上した。これは、酵素の改良無しにもｄｂＯｌｉｇｏ添加だけで高いレベルの３’－ミスマッチ区分性を示す結果である（図３）。また、このような結果は、野生型重合酵素か改良型重合酵素かに関係なく、実時間ＰＣＲ反応時に二本鎖オリゴヌクレオチドを使用する場合、区分性か高められることを示唆する。
【0180】
【表4】
【0181】
＊ｄｂＯｌｉｇｏ ｔｙｐｅ：ＨＤ，ヘアピン構造ＤＮＡ、＊＊Ｄｕｐｌｅｘ ｎｏ：二本鎖を形成する塩基数、
【0182】
＊＊＊Ｔｍ：二本鎖オリゴヌクレオチドの融点、
【0183】
＃ ΔＣｔ１：ｄｂＯｌｉｇｏを加えていない場合のΔＣｔ値
【0184】
＃＃ ΔＣｔ２：ｄｂＯｌｉｇｏを加えた場合のΔＣｔ値
【0185】
＜実施例９＞加水分解プローブを使用しないＰＣＲにｄｂＯｌｉｇｏ添加
【0186】
加水分解プローブを使用しない条件でも、二本鎖オリゴヌクレオチドの３’－ミスマッチ区分性向上効果が見られるかを確認しようとした。加水分解プローブを添加しなく、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを添加して鋳型としてＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ（ｒｃ）の鋳型ＤＮＡ（配列番号４８、４９）を使用し、二本鎖オリゴヌクレオチド（配列番号１３）２０ｐｍｏｌを添加してＣＦＸ９６TM Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いてＰＣＲを行った。その結果、加水分解プローブを使用しない条件でも、ｄｂＯｌｉｇｏ添加によって３’－ミスマッチ区分性が向上した（図４の増幅曲線）。これに加え、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを添加していない一般ＰＣＲを行った後、アガロースゲル電気泳動によってＰＣＲ産物を直接確認した結果も、ｄｂＯｌｉｇｏ添加時に明確に区分性が向上した（図４の電気泳動写真）。
【0187】
【表5】
【0188】
【0189】
【産業上の利用可能性】
【0190】
本発明の区分性増進オリゴヌクレオチドを付加するＰＣＲキット又は方法は、実時間ＰＣＲの他に一般ＰＣＲにおいても、特異度及び敏感度を顕著に向上させ、相補的又は非相補的変異位置の存在及び増幅の有無を容易に確認することができるので、少量多品種が混合された試料中の対立遺伝子検出が容易であり、これによって、微量の突然変異を含む試料中の突然変異遺伝子検出が容易であり、農産物、水産物、畜産物などの遺伝子検査や医学分野の診断などに幅広く利用可能である。
【0191】
【配列目録フリーテキスト】
【0192】
電子ファイルとして添付
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】