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特許7541709タンパク質結合部位情報取得装置、タンパク質結合部位情報取得装置の作動方法及びプログラム
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-21
(45)【発行日】2024-08-29
(54)【発明の名称】タンパク質結合部位情報取得装置、タンパク質結合部位情報取得装置の作動方法及びプログラム
(51)【国際特許分類】
C12M 1/00 20060101AFI20240822BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20240822BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240822BHJP
G16B 30/00 20190101ALI20240822BHJP
C07K 16/00 20060101ALN20240822BHJP
【ＦＩ】
C12M1/00 A ZNA
C12M1/34 Z
G01N33/53 D
G16B30/00
C07K16/00
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2020048625
(22)【出願日】2020-03-19
(65)【公開番号】P2021145604
(43)【公開日】2021-09-27
【審査請求日】2023-03-08
(73)【特許権者】
【識別番号】519248656
【氏名又は名称】株式会社ＣＵＢＩＣＳｔａｒｓ
(74)【代理人】
【識別番号】100095407
【弁理士】
【氏名又は名称】木村 満
(74)【代理人】
【識別番号】100168114
【弁理士】
【氏名又は名称】山中 生太
(74)【代理人】
【識別番号】100132883
【弁理士】
【氏名又は名称】森川 泰司
(74)【代理人】
【識別番号】100111464
【弁理士】
【氏名又は名称】齋藤 悦子
(72)【発明者】
【氏名】上田 泰己
(72)【発明者】
【氏名】松本 桂彦
(72)【発明者】
【氏名】原田 頌子
【審査官】林 康子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１８／１８１６５６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１１／１２９３７９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１９／０８４２４９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／１６８９９９（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｍ １／００
Ｃ０７Ｋ
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗原の部分配列と複数のランダムなアミノ酸配列との間の類似度の分布を示す第１の情報と、ランダムな塩基配列を有するＤＮＡライブラリに含まれるＤＮＡから転写及び翻訳を介して前記ＤＮＡに対応付けられて生成するペプチドを前記抗原に結合する抗体に結合させて前記ＤＮＡとともに回収することを繰り返して収束した、前記抗体に結合するペプチドのアミノ酸配列と前記部分配列との間の類似度の分布を示す第２の情報と、の比較に基づいて、前記抗原における前記抗体のエピトープのアミノ酸配列に関する情報を取得する取得部を備える、タンパク質結合部位情報取得装置。
【請求項2】
前記取得部は、前記第１の情報が示す前記類似度の分布と前記第２の情報が示す前記類似度の分布との距離を算出し、前記エピトープに対する前記抗体の結合の特異性を評価する、
請求項１に記載のタンパク質結合部位情報取得装置。
【請求項3】
前記取得部は、前記第１の情報と、前記抗体に結合するペプチドのアミノ酸配列と前記部分配列との間の類似度と、の比較によって選抜したペプチドのアミノ酸配列に基づいて前記エピトープのアミノ酸配列を予測する、
請求項１又は２に記載のタンパク質結合部位情報取得装置。
【請求項4】
取得部を備えるタンパク質結合部位情報取得装置の作動方法であって、前記取得部は、
抗原の部分配列と複数のランダムなアミノ酸配列との間の類似度の分布を示す第１の情報と、ランダムな塩基配列を有するＤＮＡライブラリに含まれるＤＮＡから転写及び翻訳を介して前記ＤＮＡに対応付けられて生成するペプチドを前記抗原に結合する抗体に結合させて前記ＤＮＡとともに回収することを繰り返して収束した、前記抗体に結合するペプチドのアミノ酸配列と前記部分配列との間の類似度の分布を示す第２の情報と、の比較に基づいて、前記抗原における前記抗体のエピトープのアミノ酸配列に関する情報を取得する、
タンパク質結合部位情報取得装置の作動方法。
【請求項5】
コンピュータを、抗原の部分配列と複数のランダムなアミノ酸配列との間の類似度の分布を示す第１の情報を参照する手段、
前記第１の情報と、ランダムな塩基配列を有するＤＮＡライブラリに含まれるＤＮＡから転写及び翻訳を介して前記ＤＮＡに対応付けられて生成するペプチドを前記抗原に結合する抗体に結合させて前記ＤＮＡとともに回収することを繰り返して収束した、前記抗体に結合するペプチドのアミノ酸配列と前記部分配列との間の類似度の分布を示す第２の情報と、を比較する手段、
前記比較に基づいて前記抗原における前記抗体のエピトープのアミノ酸配列に関する情報を取得する手段、として機能させる、
プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、タンパク質結合部位情報取得装置、タンパク質結合部位情報取得装置の作動方法及びプログラムに関する。
【背景技術】
【0002】
抗体は、抗原に対する高い特異性と結合能を有するため、基礎研究において免疫染色法、ＥＬＩＳＡ法及びウェスタンブロット法等に利用される。抗体は、病理診断用組織染色抗体及び抗体医薬品として医療でも幅広く活用されている。抗体を使用する際、抗体の抗原認識能力を最大限に発揮するためには、抗原における抗体結合部位（エピトープ）のアミノ酸配列を把握したうえで、科学的な根拠に基づき最適な反応条件を決定することが重要である。
【0003】
エピトープ解析法としては、Ｘ線結晶構造解析及び水素重水素交換質量分析等がある。これらはタンパク構造を保持した十分量の抗原－抗体複合体を得なければならず、時間と費用とを要する。より簡便なエピトープ同定法として、ペプチドアレイを利用したエピトープマッピング解析がある。しかし、エピトープマッピング解析では、構築できるライブラリサイズが約１００～１０００種類程度と限られてしまうため、抗原タンパク質及びそのアミノ酸配列が既知でなければ採用し難い。
【0004】
４００万個以上の市販の抗体が現存する中、上述のエピトープ解析法及びエピトープマッピング解析はこの規模に対応可能なスループットを持ち合わせていない。よって、現状ではほとんどの抗体のエピトープ情報が不明か、タンパク質全長配列又は数十～数百アミノ酸配列までの同定に留まっている。このため、科学的根拠に基づく抗原抗体反応プロトコルが統一化されておらず、同じ抗原に抗体を結合させても、研究室によって染色結果が異なるという問題が生じている。特に病理診断においてこの問題は致命的であり、患者の健康状態を正確に判断できないことが問題視されている。
【0005】
ペプチドアレイと比較してペプチドセレクション法は、１０８を超えるライブラリサイズを準備できるため、抗原タンパク質が未知でもエピトープの同定が可能である。ペプチドセレクションとは、ランダム配列を持つＤＮＡライブラリを転写及び翻訳することで構築されたペプチドライブラリから、標的に結合するペプチドだけを獲得し、その配列を同定するシステムである。このシステムの重要な特徴として、獲得するペプチドの遺伝子情報が、細胞、ファージ、リボソーム又はピューロマイシンを介して保存されるという点がある。保存された遺伝情報の転写、翻訳及び標的への結合と回収という一連の流れが繰り返されることにより、標的に強く結合するペプチドの遺伝情報のみに収束する。
【0006】
エピトープ解析法への応用において、ペプチドセレクションは、抗原が完全に未知の場合でも抗体があればエピトープ解析が可能である点、またライブラリサイズの大きさゆえに、得られる結果が単なる配列情報のみならず、収束したアミノ酸配列の量比から、抗原認識にエピトープのどのアミノ酸残基が特に重要か（抗体の認識様式）を知ることができる点で有用である。例えば、非特許文献１には、リボソームディスプレイ法がエピトープのアミノ酸配列の決定に応用できることが記載されている。
【0007】
一方、特許文献１には、コンピュータを用いたエピトープ予測方法が開示されている。当該エピトープ予測方法では、学習対象タンパク質と当該学習対象タンパク質から検出されているエピトープとの関係を学習用データとして用いた学習モデルの出力結果に基づいて予測対象であるタンパク質におけるエピトープの候補を取得する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【文献】特開２０１９－１７９３５６号公報
【非特許文献】
【0009】
【文献】ＬＡＲＲＹ Ｃ．ＭＡＴＴＨＥＡＫＩＳ、外２名、「Ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｏｌｙｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｒｏｍ ｖｅｒｙ ｌａｒｇｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９４年、９１、ｐ．９０２２－９０２６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
上記の特許文献１に開示されたエピトープ予測方法では、学習モデルの構築に、抗原ペプチドに関する情報としてタンパク質内におけるペプチドの位置、ペプチドに含まれるアミノ酸配列、各アミノ酸の疎水性指標及びαへリックスに関する情報等のスコア、並びにエピトープであるか否かを示す情報が必要となる。上述のように、ほとんどの抗体のエピトープ情報が不明か、タンパク質全長配列又は数十～数百アミノ酸配列までの同定に留まっている現状に鑑みて、学習用データを十分に収集できず、学習モデルによる予測の精度が高いとは言えない。
【0011】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、抗原における抗体のエピトープのアミノ酸配列に関する情報を高い精度で得ることができるタンパク質結合部位情報取得装置、タンパク質結合部位情報取得装置の作動方法及びプログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明の第１の観点に係るタンパク質結合部位情報取得装置は、
抗原の部分配列と複数のランダムなアミノ酸配列との間の類似度の分布を示す第１の情報と、ランダムな塩基配列を有するＤＮＡライブラリに含まれるＤＮＡから転写及び翻訳を介して前記ＤＮＡに対応付けられて生成するペプチドを前記抗原に結合する抗体に結合させて前記ＤＮＡとともに回収することを繰り返して収束した、前記抗体に結合するペプチドのアミノ酸配列と前記部分配列との間の類似度の分布を示す第２の情報と、の比較に基づいて、前記抗原における前記抗体のエピトープのアミノ酸配列に関する情報を取得する取得部を備える。
抗原の部分配列と複数のランダムなアミノ酸配列との間の類似度の分布を示す第１の情報と、ランダムな塩基配列を有するＤＮＡライブラリに含まれるＤＮＡから転写及び翻訳を介して前記ＤＮＡに対応付けられて生成するペプチドを前記抗原に結合する抗体に結合させて前記ＤＮＡとともに回収することを繰り返して収束した、前記抗体に結合するペプチドのアミノ酸配列と前記部分配列との間の類似度の分布を示す第２の情報と、の比較に基づいて、前記抗原における前記抗体のエピトープのアミノ酸配列に関する情報を取得する取得部を備える。
【0013】
この場合、前記取得部は、
前記第１の情報が示す前記類似度の分布と前記第２の情報が示す前記類似度の分布との距離を算出し、前記エピトープに対する前記抗体の結合の特異性を評価する、
こととしてもよい。
前記第１の情報が示す前記類似度の分布と前記第２の情報が示す前記類似度の分布との距離を算出し、前記エピトープに対する前記抗体の結合の特異性を評価する、
こととしてもよい。
【0014】
また、前記取得部は、
前記第１の情報と、前記抗体に結合するペプチドのアミノ酸配列と前記部分配列との間の類似度と、の比較によって選抜したペプチドのアミノ酸配列に基づいて前記エピトープのアミノ酸配列を予測する、
こととしてもよい。
前記第１の情報と、前記抗体に結合するペプチドのアミノ酸配列と前記部分配列との間の類似度と、の比較によって選抜したペプチドのアミノ酸配列に基づいて前記エピトープのアミノ酸配列を予測する、
こととしてもよい。
【0016】
本発明の第２の観点に係るタンパク質結合部位情報取得装置の作動方法は、
取得部を備えるタンパク質結合部位情報取得装置の作動方法であって、
前記取得部は、
抗原の部分配列と複数のランダムなアミノ酸配列との間の類似度の分布を示す第１の情報と、ランダムな塩基配列を有するＤＮＡライブラリに含まれるＤＮＡから転写及び翻訳を介して前記ＤＮＡに対応付けられて生成するペプチドを前記抗原に結合する抗体に結合させて前記ＤＮＡとともに回収することを繰り返して収束した、前記抗体に結合するペプチドのアミノ酸配列と前記部分配列との間の類似度の分布を示す第２の情報と、の比較に基づいて、前記抗原における前記抗体のエピトープのアミノ酸配列に関する情報を取得する。
取得部を備えるタンパク質結合部位情報取得装置の作動方法であって、
前記取得部は、
抗原の部分配列と複数のランダムなアミノ酸配列との間の類似度の分布を示す第１の情報と、ランダムな塩基配列を有するＤＮＡライブラリに含まれるＤＮＡから転写及び翻訳を介して前記ＤＮＡに対応付けられて生成するペプチドを前記抗原に結合する抗体に結合させて前記ＤＮＡとともに回収することを繰り返して収束した、前記抗体に結合するペプチドのアミノ酸配列と前記部分配列との間の類似度の分布を示す第２の情報と、の比較に基づいて、前記抗原における前記抗体のエピトープのアミノ酸配列に関する情報を取得する。
【0017】
本発明の第３の観点に係るプログラムは、
コンピュータを、
抗原の部分配列と複数のランダムなアミノ酸配列との間の類似度の分布を示す第１の情報を参照する手段、
前記第１の情報と、ランダムな塩基配列を有するＤＮＡライブラリに含まれるＤＮＡから転写及び翻訳を介して前記ＤＮＡに対応付けられて生成するペプチドを前記抗原に結合する抗体に結合させて前記ＤＮＡとともに回収することを繰り返して収束した、前記抗体に結合するペプチドのアミノ酸配列と前記部分配列との間の類似度の分布を示す第２の情報と、を比較する手段、
前記比較に基づいて前記抗原における前記抗体のエピトープのアミノ酸配列に関する情報を取得する手段、として機能させる。
コンピュータを、
抗原の部分配列と複数のランダムなアミノ酸配列との間の類似度の分布を示す第１の情報を参照する手段、
前記第１の情報と、ランダムな塩基配列を有するＤＮＡライブラリに含まれるＤＮＡから転写及び翻訳を介して前記ＤＮＡに対応付けられて生成するペプチドを前記抗原に結合する抗体に結合させて前記ＤＮＡとともに回収することを繰り返して収束した、前記抗体に結合するペプチドのアミノ酸配列と前記部分配列との間の類似度の分布を示す第２の情報と、を比較する手段、
前記比較に基づいて前記抗原における前記抗体のエピトープのアミノ酸配列に関する情報を取得する手段、として機能させる。
【発明の効果】
【0018】
本発明によれば、抗原における抗体のエピトープのアミノ酸配列に関する情報を高い精度で得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】（Ａ）は本発明の実施の形態に係るタンパク質結合部位情報取得装置のハードウエア構成を示すブロック図である。（Ｂ）はタンパク質結合部位情報取得装置の機能を示すブロック図である。
【図2】タンパク質に含まれる部分配列と、複数のランダムなアミノ酸配列との間の類似度の算出を示す図である。
【図3】部分配列に対するランダムなアミノ酸配列の類似度の確率の分布を示す図である。
【図4】部分配列に対してランダムなアミノ酸配列が所定の類似度以上になる確率を示す図である。
【図5】タンパク質に含まれるすべての部分配列と、ランダムなアミノ酸配列との間の類似度の算出を示す図である。
【図6】図４に示す部分配列に対してランダムなアミノ酸配列が所定の類似度以上になる確率の分布とともに、部分配列に対してペプチドセレクションで収束したアミノ酸配列が所定の類似度以上になる確率の分布を示した図である。
【図7】確率の分布間の距離を算出するための式を例示する図である。
【図8】アライメントされた部分配列におけるアミノ酸の位置ごとのアミノ酸の出現頻度を示す図である。
【図10】（Ａ）はｃ－ｆｏｓのアミノ酸配列を示す図である。（Ｂ）は５種類の抗ｃ－ｆｏｓ抗体に対して収束したペプチドから作成したモチーフを示す図である。
【図11】（Ａ）はＮｅｕｒｏｎａｌ Ｎｕｃｌｅｉ（ＮｅｕＮ）のアミノ酸配列を示す図である。（Ｂ）は抗ＮｅｕＮ抗体に対して収束したペプチドから作成したモチーフを示す図である。
【図12】（Ａ）はチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）のアミノ酸配列を示す図である。（Ｂ）は抗ＴＨ抗体に対して収束したペプチドから作成したモチーフを示す図である。
【図13】（Ａ）はｃ－ｆｏｓのアミノ酸配列を示す図である。（Ｂ）は抗ｃ－ｆｏｓポリクローナル抗体に対して収束したペプチドから作成したモチーフを示す図である。
【図14】（Ａ）はドパミントランスポーター（ＤＡＴ）のアミノ酸配列を示す図である。（Ｂ）は抗ＤＡＴポリクローナル抗体に対して収束したペプチドから作成したモチーフを示す図である。
【図15】（Ａ）はｃ－ｆｏｓのアミノ酸配列を示す図である。（Ｂ）はエピトープ解析によって各抗体のクローンに関して得られたモチーフ及び変異体ｃ－ｆｏｓタンパク質において置換したアミノ酸の位置を示す図である。
【図16】野生型及び変異体ｃ－ｆｏｓタンパク質と抗体との相互作用についてＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）法で検討した結果を示す図である。
【図17】変異体ｃ－ｆｏｓタンパク質において置換したアミノ酸の位置を示す図である。
【図18】ＤＥＣＯＤＥ法で得た分子認識様式の妥当性をＥＬＩＳＡ法で検討した結果を示す図である。
【図19】抗ｃ－ｆｏｓ抗体に関して、類似度が高かった上位１００種類のタンパク質の類似度を示す図である。
【図20】自己免疫疾患を誘導したマウスの血漿中の抗体群をＤＥＣＯＤＥ法で解析して得られたモチーフを示す図である。
【図21】（Ａ）は自己免疫疾患を誘導したマウスの血漿中の抗体群をＤＥＣＯＤＥ法で解析して得られたアミノ酸配列から算出された部分配列のスコアの上位を示す図である。（Ｂ）は自己免疫疾患を誘導していないマウスの血漿中の抗体群をＤＥＣＯＤＥ法で解析して得られたアミノ酸配列から算出された部分配列のスコアの上位を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0020】
本発明に係る実施の形態について説明する。なお、本発明は下記の実施の形態によって限定されるものではない。
【0021】
（実施の形態）
本実施の形態に係るタンパク質結合部位情報取得装置（以下、単に「情報取得装置」ともいう）１００について説明する。情報取得装置１００は、ペプチドセレクションで得られたデータを解析するための装置である。ペプチドセレクションとは、ランダムな塩基配列を有するＤＮＡライブラリを転写及び翻訳することで構築されたペプチドライブラリから、被験物質に結合するペプチドを獲得し、獲得したペプチドのアミノ酸配列を同定するシステムである。ペプチドセレクションでは、獲得するペプチドの遺伝子情報が所定の手段で保存される。保存された遺伝情報の転写、翻訳、被験物質への結合及び回収という一連の流れが繰り返されることで、被験物質に結合するペプチドをコードする遺伝子情報を収束させることができる。
本実施の形態に係るタンパク質結合部位情報取得装置（以下、単に「情報取得装置」ともいう）１００について説明する。情報取得装置１００は、ペプチドセレクションで得られたデータを解析するための装置である。ペプチドセレクションとは、ランダムな塩基配列を有するＤＮＡライブラリを転写及び翻訳することで構築されたペプチドライブラリから、被験物質に結合するペプチドを獲得し、獲得したペプチドのアミノ酸配列を同定するシステムである。ペプチドセレクションでは、獲得するペプチドの遺伝子情報が所定の手段で保存される。保存された遺伝情報の転写、翻訳、被験物質への結合及び回収という一連の流れが繰り返されることで、被験物質に結合するペプチドをコードする遺伝子情報を収束させることができる。
【0022】
情報取得装置１００は、任意の公知のペプチドセレクションで得られたデータに適用可能である。ペプチドセレクションは、例えば、細胞表面提示法、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法及びｍＲＮＡディスプレイ法である。細胞表面提示法は、細胞を介して産生されたペプチドを細胞の表面に提示させることで細胞内部に遺伝情報を保存する。ファージディスプレイ法は、微生物を宿主とするファージの表面にペプチドを提示させてファージＤＮＡに遺伝情報を保存する。無細胞タンパク質合成系を利用したリボソームディスプレイ法及びｍＲＮＡディスプレイ法では、それぞれリボソーム及びピューロマイシンを介して遺伝情報が保存される。
【0023】
情報取得装置１００による解析に好ましいペプチドセレクションは、ｍＲＮＡディスプレイ法である。ｍＲＮＡディスプレイ法の中でも、ＤＥＣＯＤＥ法（国際公開第２０１８／１６８９９９号）が特に好ましい。ＤＥＣＯＤＥ法では、（ｉ）ＤＮＡから転写反応によって、ＲＮＡ分子を取得する。当該ＤＮＡは、プロモーター領域及びプロモーター領域の下流にペプチドをコードする領域を含み、かつアンチセンス鎖の５’末端側に少なくとも１個の２’－修飾ヌクレオシド誘導体を含む。続いて、（ｉｉ）ＲＮＡの３’末端に、スプリントポリヌクレオチドを用いて、ピューロマイシン等のペプチド受容分子を結合する。そして、（ｉｉｉ）ペプチド受容分子が結合しているＲＮＡを翻訳することによって、ＲＮＡとＲＮＡにコードされているペプチドとがペプチド受容分子を介して連結しているＲＮＡとペプチドとの複合体を合成する。さらに、（ｉｖ）ＲＮＡとペプチドとの複合体から複合体を選抜する。
【0024】
工程（ｉｖ）では、ペプチドを介して被験物質に結合する複合体が選抜される。工程（ｉ）～（ｉｖ）を繰り返すことで、被験物質に結合するペプチドをコードする遺伝子情報、すなわちＤＮＡをＤＮＡライブラリから濃縮できる。
【0025】
ペプチドセレクションで得られたＤＮＡの塩基配列が変換されたアミノ酸配列が被験物質に結合するペプチドのアミノ酸配列である。次世代シーケンサー等によって、ペプチドセレクションで得られたＤＮＡに関して、１万～数十億リード数、数百万～数億リード数、数十万～数千万リード数又は数十万～数百万リード数で塩基配列を決定することで、当該塩基配列がコードするアミノ酸配列が収集される。本実施の形態に係る情報取得装置１００は、上述のようにペプチドセレクションで得られた多数のアミノ酸配列を解析する。
【0026】
図１（Ａ）に示すように、情報取得装置１００は、記憶部１０、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）２０、入力装置３０、表示装置４０及びＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）５０が、バス６０で接続された構成を有する。
【0027】
記憶部１０は、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）、ＨＤＤ（Ｈａｒｄ Ｄｉｓｋ Ｄｒｉｖｅ）及びフラッシュメモリ等の不揮発性の記憶媒体を備える。記憶部１０は、各種データ及びソフトウェアプログラムの他、基準データ１１、タンパク質のアミノ酸配列データ１２及び情報取得プログラム１３を記憶している。各種データには、アミノ酸間の類似性の程度を示す値を定義したテーブルが含まれる。ソフトウェアプログラムには、マルチプルアライメント用ソフトウェア及びクラスタリング用ソフトウェアが含まれる。
【0028】
記憶部１０が記憶しているデータには、タンパク質の部分配列と複数のランダムなアミノ酸配列との間の類似度の分布を示す基準データ（第１の情報）１１が含まれる。タンパク質の部分配列とは、タンパク質のアミノ酸配列の一部である。タンパク質の部分配列は、タンパク質のアミノ酸配列が格納されたデータベース、例えばＵｎｉＰｒｏｔ及びＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）等から取得できる。アミノ酸配列のデータベースは、各種生物のゲノムＤＮＡの塩基配列をアミノ酸に変換することで取得してもよい。被験物質に結合するペプチドの探索空間を確保するために、より多くのタンパク質が網羅されているデータベースを用いるのが好ましい。
【0029】
タンパク質の部分配列は、２アミノ酸以上の任意の長さである。部分配列の長さを１２アミノ酸とすると、例えば、部分配列は、タンパク質のＮ末端のアミノ酸から１２個のアミノ酸からなる部分配列、タンパク質のＮ末端から２番目のアミノ酸から１２個のアミノ酸からなる部分配列、のようにタンパク質のＮ末端からＣ末端側に１アミノ酸ずつ移動させて得られる部分配列である。１００個のアミノ酸からなるタンパク質において、１２個のアミノ酸からなる部分配列は８９個となる。
【0030】
ランダムなアミノ酸配列は、無作為に選んだアミノ酸を含むアミノ酸配列である。被験物質が抗体の場合、エピトープのアミノ酸配列の長さは１２アミノ酸程度である。よって、被験物質が抗体の場合には、ランダムなアミノ酸配列として、１２個又は８個の任意のアミノ酸からなる複数のアミノ酸配列を用いるのが好ましい。アミノ酸配列の長さは１２アミノ酸の場合、ランダムなアミノ酸配列のパターンは２０１２個である。
【0031】
ランダムなアミノ酸配列は無作為に選んだ塩基を並べたランダムな塩基配列を変換した複数のアミノ酸配列であってもよい。アミノ酸配列の長さが１２アミノ酸の場合、上記の転写反応に供されるＤＮＡにおけるペプチドをコードする領域は、３個の任意の塩基“Ｎ”で構成されるトリプレット“ＮＮＮ”が１２回繰り返されている。ランダムな塩基配列は、トリプレットのうち、１又は２個の塩基の選択肢を限定してもよい。この場合、ＤＮＡにおけるペプチドをコードする領域は、例えば、Ｇ（グアニン）及びＴ（チミン）から選ばれる塩基“Ｋ”としてトリプレット“ＮＮＫ”が１２回繰り返された塩基配列となる。
【0032】
アミノ酸配列間の類似度は、公知の任意の方法で評価できる。例えば、類似度は、アミノ酸間の類似性の程度を示す値を定義したＢＬＯＳＵＭ、ＰＡＭ及びＷＡＣ等のテーブルに基づいて算出される。テーブルを使用する場合、負の値を０として、進化におけるアミノ酸置換の生じにくさを考慮しなくてもよい。テーブルは、アミノ酸の性質等によって類似度を任意に定義したテーブルであってもよい。
【0033】
ランダムなアミノ酸配列の長さを１２アミノ酸として、基準データの作成方法について例示する。図２に示すように、タンパク質のデータベースのエントリであるタンパク質Ａ（その一部のアミノ酸配列を配列番号１に示す）の一部である部分配列ａ１～ａ５・・・を含む部分配列ａと、ランダムなアミノ酸配列ｒ１～ｒ５（配列番号２～６、なお、アミノ酸配列ｒ２中のＸａａはセレノシステイン（Ｕ）である）・・・を含むアミノ酸配列Ｒとの間の類似度を算出する。類似度の算出では、テーブルを参照し、アミノ酸配列ｒ１を構成する１２個のアミノ酸それぞれについて、当該アミノ酸に対応する位置にある部分配列ａ１のアミノ酸との類似性の値を求める。１２個のアミノ酸に関する類似性の値の和を部分配列ａ１とアミノ酸配列ｒ１の類似度とする。アミノ酸配列ｒ１と同様に、部分配列ａ１に対するアミノ酸配列ｒ２～ｒ５の類似度を求める。
【0034】
部分配列ａ１に対するアミノ酸配列Ｒの類似度をヒストグラムとし、全体の和が１になるように規格化すると、図３に示すように部分配列ａ１に対するランダムなアミノ酸配列Ｒの類似度の確率の分布が得られる。図３に示す分布に基づいて所定の類似度以上になる確率を算出すると、図４に示す分布が得られる。
【0035】
図５に示すように、タンパク質Ａにおいて部分配列ａ１（配列番号７）からそのＮ末端がＣ末端側に１アミノ酸ずつ移動した部分配列ａ２（配列番号８）、ａ３（配列番号９）、ａ４（配列番号１０）及びａ５（配列番号１１）に対しても同様にアミノ酸配列Ｒの類似度が所定の類似度以上になる確率を求める。タンパク質のデータベースに格納されたすべてのタンパク質に含まれるすべての部分配列ａについて、ランダムなアミノ酸配列Ｒが所定の類似度以上になる確率が類似度の分布を示す基準データとなる。
【0036】
図１（Ａ）に戻って、タンパク質のアミノ酸配列データ１２は、上述のタンパク質のデータベースに格納されているタンパク質のアミノ酸配列を含むデータ又はゲノムＤＮＡ配列データベースの塩基配列を変換したアミノ酸配列を含むデータである。アミノ酸配列は、タンパク質ごとに全長で記憶されていてもよいし、所定のアミノ酸数、例えば１２アミノ酸の長さの部分配列ａとして記憶されていてもよい。アミノ酸配列データ１２には、アミノ酸配列とともに当該アミノ酸配列に関連付けられたタンパク質の情報が含まれる。アミノ酸配列が部分配列ａの場合、アミノ酸配列データ１２は、部分配列ａに関連付けられた当該部分配列ａを含むタンパク質の情報及び当該タンパク質における部分配列ａの位置に関する情報（例えば、タンパク質ＡのＮ末端からｎ番目のアミノ酸が部分配列ａのＮ末端のアミノ酸に該当する場合のｎ）を含む。
【0037】
ＲＡＭ２０はＣＰＵ５０のメインメモリとして機能し、ＣＰＵ５０による情報取得プログラム１３の実行に際し、情報取得プログラム１３がＲＡＭ２０に展開される。ＲＡＭ２０には、入力装置３０から入力されたデータが一時的に記憶される。
【0038】
入力装置３０は、使用者が情報取得装置１００にデータを入力するためのハードウエアである。入力装置３０は、使用者によって入力された、ペプチドセレクションで得られたアミノ酸配列ｙ１～ｙ５・・・を含むアミノ酸配列ＹをＣＰＵ５０に入力する。アミノ酸配列Ｙは、転写及び翻訳を介して核酸から核酸に対応付けられて生成するペプチドを被験物質に結合させて核酸とともに回収することを繰り返して収束した、被験物質に結合するペプチドのアミノ酸配列である。被験物質を抗体としたＤＥＣＯＤＥ法の場合、約１０万～２０万のリード数で決定された塩基配列それぞれを変換したアミノ酸配列Ｙが得られる。同一のアミノ酸配列を除外すると、アミノ酸配列Ｙは、例えば約１万～数万種類となる。ＣＰＵ５０は、記憶部１０にペプチドセレクションで得られたアミノ酸配列Ｙを記憶させる。
【0039】
表示装置４０は、ＣＰＵ５０によるデータ解析の結果を出力するためのディスプレイである。ＣＰＵ５０は、記憶部１０に記憶された情報取得プログラム１３をＲＡＭ２０に読み出して、情報取得プログラム１３を実行することにより、以下に説明する機能を実現する。
【0040】
図１（Ｂ）は、ＣＰＵ５０が実現する機能を示すブロック図である。情報取得プログラム１３は、ＣＰＵ５０に取得部１及び出力部２としての機能を実現させる。
【0041】
取得部１は、基準データと、アミノ酸配列Ｙとタンパク質の部分配列ａとの間の類似度の分布を示す解析対象データ（第２の情報）と、の比較に基づいて、タンパク質における被験物質の結合部位に関する情報を取得する。
【0042】
取得部１は、上述の基準データと同様の方法で解析対象データを得る。取得部１は、図２におけるアミノ酸配列ｒ１～ｒ５をアミノ酸配列ｙ１～ｙ５として、タンパク質Ａに含まれる部分配列ａ１に対するアミノ酸配列ｙ１～ｙ５との間の類似度を算出し、部分配列ａ１に対するアミノ酸配列ｙ１～ｙ５の類似度が所定の類似度以上になる確率を算出する。取得部１は、部分配列ａ２、ａ３、ａ４及びａ５に対しても同様にアミノ酸配列ｙ１～ｙ５の類似度が所定の類似度以上になる確率を求める。
【0043】
図６は、図４に示す部分配列ａ１に対してランダムなアミノ酸配列Ｒが所定の類似度以上になる確率の分布に、部分配列ａ１に対してアミノ酸配列Ｙが所定の類似度以上になる確率の分布を重ねて表示した図である。タンパク質における被験物質の結合部位に対応する部分配列ａでは、部分配列ａと類似度の高いアミノ酸配列Ｙが多く得られるため、基準データよりも類似度の高い方にまで確率が分布する。取得部１は、基準データと解析対象データの分布間距離をスコアとして算出する。基準データとの距離が大きい、すなわちスコアが高い部分配列ａほど、被験物質が結合しやすいと言える。当該スコアによって、結合部位に対する被験物質の結合の特異性が評価できる。
【0044】
分布間の距離は、公知の方法で算出できる。類似度をＸ、Ｐ（ｘ）をアミノ酸配列Ｙが所定の類似度以上になる確率の分布、Ｑ（ｘ）をランダムなアミノ酸配列Ｒが所定の類似度以上になる確率の分布とすると、例えば図７に列挙する式それぞれで、あるいはこれらを組み合わせてスコアを計算する。なお、ここでいう“距離”は必ずしも数学的な距離である必要はない。
【0045】
取得部１は、すべてのタンパク質に含まれるすべての部分配列ａの基準データと解析対象データとを比較し、スコアの高い部分配列ａを取得する。取得する部分配列ａは、最もスコアが高い部分配列ａであってもよいし、スコアの上位から複数個の部分配列ａであってもよい。取得部１は、アミノ酸配列データ１２を参照し、取得した部分配列ａを含むタンパク質の情報及び当該タンパク質における部分配列ａの位置に関する情報等を被験物質の結合部位に関する情報として取得する。
【0046】
被験物質がモノクローナル抗体の場合、取得部１は、最大のスコアであった部分配列ａを有するタンパク質の情報を取得する。被験物質がポリクローナル抗体の場合、取得部１は、取得した部分配列ａを含むタンパク質の情報とともに、当該タンパク質における複数の部分配列ａの位置に関する情報を取得する。
【0047】
取得部１は、タンパク質における被験物質の結合部位に関する情報として結合部位のアミノ酸配列を予測する。例えば、取得部１は、スコアの上位から複数個の部分配列ａをアミノ酸配列の類似性に基づいてクラスタリングし、クラスターごとにマルチプルアライメントを作成する。取得部１は、アライメントされた部分配列ａの各位置において最も高い収束率を示したアミノ酸を当該位置のアミノ酸とする。図８は、アライメントされた部分配列ａにおけるアミノ酸の位置と当該位置におけるアミノ酸の出現頻度とが対応づけられたテーブルを示す。図８に示すように、取得部１は、アライメントされた部分配列ａの各位置におけるアミノ酸の出現頻度の高いアミノ酸を当該位置のアミノ酸としてアミノ酸配列を予測してもよい。なお、取得部１は、収束率が所定の値よりも低い位置をブランクとしてアミノ酸配列を予測してもよい。
【0048】
また、取得部１は、基準データと、アミノ酸配列Ｙとタンパク質の部分配列との間の類似度と、の比較によって抽出したペプチドのアミノ酸配列に基づいて結合部位のアミノ酸配列を予測する。この場合、基準データには、部分配列ａに対するランダムなアミノ酸配列Ｒの類似度の確率の分布（図４）において、確率が所定の値ｋより小さい類似度の範囲で最小の類似度Ｓが含まれる。記憶部１０は、あらかじめ基準データ１１として、タンパク質のデータベースに格納されたすべてのタンパク質に含まれるすべての部分配列ａそれぞれに対応付けられた類似度Ｓを記憶している。
【0049】
取得部１は、アミノ酸配列Ｙとタンパク質の部分配列ａとの間の類似度を算出する。取得部１は、記憶部１０を参照し、当該部分配列ａに対応付けられた類似度Ｓ以上のアミノ酸配列Ｙを記憶部１０に記憶させる。取得部１は、類似度Ｓ以上のアミノ酸配列Ｙについてマルチプルアライメントを作成し、上述のようにアミノ酸配列を予測する。なお、マルチプルアライメントの前にアミノ酸配列Ｙをクラスタリングして、クラスターごとにマルチプルアライメントを作成してもよい。なお、取得部１は、マルチプルアライメントを行わず、特定の部分配列のみで類似度Ｓ以上又は確率がｋ以下のアミノ酸配列Ｙをクラスタリングしてもよい。
【0050】
取得部１は、被験物質の結合部位に関する情報を出力部２に入力する。出力部２は、被験物質の結合部位に関する情報を表示装置４０に表示する。
【0051】
続いて、情報取得装置１００による情報取得処理を図９に示すフローチャートを参照して説明する。
【0052】
取得部１は、ユーザによって解析対象データが入力装置３０を介して入力されるのを待つ（ステップＳ１；Ｎｏ）。解析対象データが入力されると（ステップＳ１；Ｙｅｓ）、取得部１は、記憶部１０を参照し、解析対象データと基準データとを比較してスコアを算出し、スコアの高い部分配列ａを取得する（ステップＳ２）。取得部１は、アミノ酸配列データ１２を参照し、取得した部分配列ａを含むタンパク質の情報及び当該タンパク質における部分配列ａの位置に関する情報を含む被験物質の結合部位に関する情報を取得する（ステップＳ３）。出力部２は、被験物質の結合部位に関する情報を、表示装置４０に表示する（ステップＳ４）。そして、取得部１は情報取得処理を終了する。
【0053】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る情報取得装置１００は、タンパク質の部分配列ａと複数のランダムなアミノ酸配列Ｒとの間の類似度の分布を示す基準データと、ペプチドセレクションで収束した被験物質に結合するペプチドのアミノ酸配列Ｙと部分配列ａとの間の類似度の分布と、の比較によってタンパク質における被験物質の結合部位に関する情報を取得する。これにより、結合部位に対する被験物質の結合の特異性を評価できるため、タンパク質における被験物質の結合部位に関する情報を高い精度で得ることができる。
【0054】
また、情報取得装置１００は、被験物質に結合するペプチドのアミノ酸配列Ｙと部分配列ａとの間の類似度を基準データと比較することで選抜したペプチドのアミノ酸配列に基づいて結合部位のアミノ酸配列を予測することとした。こうすることで、結合部位のアミノ酸配列の予測精度を高めることができる。情報取得装置１００は、図８に例示される、スコアの高い部分配列ａの各位置のアミノ酸の出現頻度のテーブルを用いることで、被験物質の結合部位の特異性を予測することができる。
【0055】
本実施に形態では、タンパク質の部分配列ａに対してランダムなアミノ酸配列Ｒが所定の類似度以上になる確率を類似度の分布として用いたが、類似度の分布はこれに限らない。タンパク質の部分配列ａと複数のアミノ酸配列Ｒとの間の類似度の分布は、タンパク質の部分配列ａに対してアミノ酸配列Ｒの類似度の平均値、最頻値又は中央値であってもよい。
【0056】
なお、結合部位に関する情報をより正確に得るために、ペプチドセレクションで収束した被験物質に結合するペプチドのアミノ酸配列Ｙと部分配列ａとの間の類似度にノイズ除去処理を加えてもよい。ノイズ除去処理は、公知のものが適用でき、例えば平均フィルタ等である。
【0057】
また、上記の確率の値ｋ及び類似度Ｓは、解析に応じて適宜設定される。アミノ酸配列間の類似度の算出に使用するテーブル、スコアによる部分配列ａの順位の付け方等も、解析対象の生物種等に応じて設定される。タンパク質のデータベースは１つの生物種に限らず、複数の生物種のタンパク質のデータベースを用いてもよい。複数の生物種由来のタンパク質のデータベースを用いることで被験物質としての抗体の種間の交差性を予測することができる。
【0058】
また、情報取得装置１００は、血清、血漿、血液、リンパ液及び髄液等のサンプルに含まれる抗体等の成分を被験物質として実施したペプチドセレクションで得られたペプチドのアミノ酸配列Ｙの解析にも適している。例えば、免疫を惹起したヒトの血清に含まれる抗体を被験物質とすることで血清中の複数種の抗体に対する抗原を同定し、さらに抗原における被験物質の結合部位に関する情報を網羅的に収集できる。なお、被験物質は、化合物、アプタマー、核酸、ペプチド及びタンパク質等、タンパク質に結合し得るものであれば特に限定されない。また、情報取得装置１００は、血清、血漿、血液、リンパ液及び髄液等のサンプルに含まれるあらゆる成分を被験物質として実施したペプチドセレクションで得られたペプチドのアミノ酸配列Ｙを解析してもよい。
【0059】
なお、マルチプルアライメント用ソフトウェアとしては、累進法、反復改善法及び動的計画法等を利用した公知の種々のソフトウェアが使用できる。マルチプルアライメント用ソフトウェアは、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、ＭＵＳＣＬＥ、Ｔ－Ｃｏｆｆｅｅ、Ｐａｒａｌｌｅｌ ＰＲＲＮ、ＭｕｌｔＡｌｉｎ、ＭＳＡ、Ｍａｔｃｈ－Ｂｏｘ、ＤＩＡＬＩＧＮ及びＡｌｉＢｅｅ等である。クラスタリング用ソフトウェアについても最短距離法、最長距離法、群平均法、最小分散法、重心法、重み付き平均法、メジアン法及びＫ－ｍｅａｎｓ法等の公知の方法を使用したソフトウェアが使用できる。
【0060】
なお、上述の基準データ１１、タンパク質のアミノ酸配列データ１２、情報取得プログラム１３及びその他のソフトウェアプログラムは、ＣＤ－ＲＯＭ（Ｃｏｍｐａｃｔ Ｄｉｓｃ Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）、ＤＶＤ（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｄｉｓｃ）、光磁気ディスク（Ｍａｇｎｅｔｏ－Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｉｓｃ）、ＵＳＢ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｓｅｒｉａｌ Ｂｕｓ）メモリ、メモリカード及びＨＤＤ等のコンピュータ読み取り可能な記録媒体に格納して配布することが可能である。そして、情報取得プログラム１３及びその他のソフトウェアプログラムを特定の又は汎用のコンピュータにインストールすることによって、当該コンピュータを情報取得装置１００として機能させることが可能である。また、基準データ１１、タンパク質のアミノ酸配列データ１２、情報取得プログラム１３及びその他のソフトウェアプログラムをインターネット上の他のサーバが有する記憶装置に格納しておき、当該サーバから基準データ１１、タンパク質のアミノ酸配列データ１２、情報取得プログラム１３及びその他のソフトウェアプログラムがダウンロードされるようにしてもよい。
【実施例】
【0061】
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は当該実施例によって限定されるものではない。
【0062】
（実施例１：ＤＥＣＯＤＥ法によるエピトープのモチーフの予測）
（ライブラリの構築）
次のようにＤＥＣＯＤＥ法を行った。抗体の抗原認識は、約５アミノ酸と言われており、直鎖のアミノ酸配列の場合、１０アミノ酸程度に収まることが多いため、１２アミノ酸がランダム化されるように、テンプレートＤＮＡライブラリを作成した。なお、コドンをＮＮＫ（Ｇ／Ｔ）とランダム化し、ＤＮＡテンプレートではランダムシーケンス中にＳＴＯＰコドンがＵＡＧ（Ａｍｂｅｒ）のみとなるよう設計した。セレクションの１ラウンド目におけるライブラリサイズが１．５×１０１３となるよう、５００μＬスケールのＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅ中に、０．０５μＭのテンプレートＤＮＡライブラリが含まれるよう調整した。テンプレートＤＮＡの塩基配列は、CCTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG(NNK)nTGCGGCAGCGGCAGCGGCAGCTACTTTGATCCGCCGACCで、ｎ＝１２とした。なお、ＮはＡ、Ｔ、Ｇ及びＣのいずれかであって、ＫはＴ又はＧである。ｎ＝１でＫがＴの場合のテンプレートＤＮＡの塩基配列を配列番号１２に示す。
（ライブラリの構築）
次のようにＤＥＣＯＤＥ法を行った。抗体の抗原認識は、約５アミノ酸と言われており、直鎖のアミノ酸配列の場合、１０アミノ酸程度に収まることが多いため、１２アミノ酸がランダム化されるように、テンプレートＤＮＡライブラリを作成した。なお、コドンをＮＮＫ（Ｇ／Ｔ）とランダム化し、ＤＮＡテンプレートではランダムシーケンス中にＳＴＯＰコドンがＵＡＧ（Ａｍｂｅｒ）のみとなるよう設計した。セレクションの１ラウンド目におけるライブラリサイズが１．５×１０１３となるよう、５００μＬスケールのＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅ中に、０．０５μＭのテンプレートＤＮＡライブラリが含まれるよう調整した。テンプレートＤＮＡの塩基配列は、CCTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG(NNK)nTGCGGCAGCGGCAGCGGCAGCTACTTTGATCCGCCGACCで、ｎ＝１２とした。なお、ＮはＡ、Ｔ、Ｇ及びＣのいずれかであって、ＫはＴ又はＧである。ｎ＝１でＫがＴの場合のテンプレートＤＮＡの塩基配列を配列番号１２に示す。
【0063】
本セレクションシステムが安定し機能しているかどうかを検討するために、固定配列を用いてセレクションを行い、ペプチド回収効率を確認することが求められる。そこで、抗ＦＬＡＧ抗体特異的に結合する固定配列ペプチドｍｃ１’をポジティブコントロールとして用い、本セレクションシステムが機能しているかどうかラウンドごとに確認した。ＤＥＣＯＤＥ法では抗ＦＬＡＧ抗体に対してｍｃ１’をスクリーニングする場合、回収されたｃＤＮＡ－ペプチド量をｑＰＣＲで測定すると、ＣＴ値は安定して約１０となった。テンプレートｍｃ１’の塩基配列は、CCTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAGTACTCCCCAACCGACTGCAAGAAGGACTACAAGGACGACGACGACAAGTGCGGCAGCGGCAGCGGCAGCTAGGACGGGGGGCGGAAA（配列番号１３）である。
【0064】
（テンプレートＤＮＡの増幅）
表１に示す５００μＬスケールのＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅを調製し、テンプレートＤＮＡライブラリを増幅させた。調製したＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅをサーマルサイクラーにて９５℃で３分間インキュベートした後、９５℃（１０秒間）、５８℃（１０秒間）、７５℃（３０秒間）の温度変化を４サイクル繰り返すことでテンプレートＤＮＡを増幅した。なお、フォワードプライマー（Ｐ１）の塩基配列は、CCTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG（配列番号１４）である。リバースプライマー（Ｐ２（抗原）ＯＭｅ）の塩基配列は、ggTCGGCGGATCAAAGTAG（配列番号１５）である。
表１に示す５００μＬスケールのＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅを調製し、テンプレートＤＮＡライブラリを増幅させた。調製したＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅをサーマルサイクラーにて９５℃で３分間インキュベートした後、９５℃（１０秒間）、５８℃（１０秒間）、７５℃（３０秒間）の温度変化を４サイクル繰り返すことでテンプレートＤＮＡを増幅した。なお、フォワードプライマー（Ｐ１）の塩基配列は、CCTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG（配列番号１４）である。リバースプライマー（Ｐ２（抗原）ＯＭｅ）の塩基配列は、ggTCGGCGGATCAAAGTAG（配列番号１５）である。
【0065】
【表1】
【0066】
（テンプレートＤＮＡライブラリの転写及びＰｕ－ＤＮＡの連結）
５００μＬのＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ用バッファーと５００μＬのテンプレートＤＮＡとを混合し、１０００μＬスケールのＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅを調製し、増幅したＤＮＡライブラリを５０ｍＵ／ｕＬ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（５μＬ）で転写した。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ用バッファー（ＴＣ ｍｉｘ）の組成は、終濃度４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ、５ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭ ＮＴＰｓである。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅを３７℃で４０分間、転写反応させた後、７２℃で５分間放置し、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを失活させた。得られた転写産物を７Ｍ 尿素を含む１０％アクリルアミドゲルで電気泳動（１８０Ｖ、４０分間）し、ｍＲＮＡライブラリが産生されたことを確認した。
５００μＬのＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ用バッファーと５００μＬのテンプレートＤＮＡとを混合し、１０００μＬスケールのＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅを調製し、増幅したＤＮＡライブラリを５０ｍＵ／ｕＬ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（５μＬ）で転写した。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ用バッファー（ＴＣ ｍｉｘ）の組成は、終濃度４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ、５ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭ ＮＴＰｓである。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅを３７℃で４０分間、転写反応させた後、７２℃で５分間放置し、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを失活させた。得られた転写産物を７Ｍ 尿素を含む１０％アクリルアミドゲルで電気泳動（１８０Ｖ、４０分間）し、ｍＲＮＡライブラリが産生されたことを確認した。
【0067】
続いて、終濃度５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ及び１ｍＭ ＡＴＰのバッファー条件下で、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔを５μＭ Ｐｕ－ＤＮＡ（5’-[PHO]CTCCCGCCCCCCGTCC[SpC18]5CC[Puromycin]、５’末端からスペーサーまでの塩基配列を配列番号１６に示す）、５μＭ スプリントＤＮＡ（5’-GGGCGGGAGGGTCGGCGGATCAA（配列番号１７））と混合し、５００μＬスケールのＬｉｇａｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅとした。Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅを９５℃で１分間温めた後、７５℃で３０秒間放置し、一定勾配１℃／１５秒間で２５℃まで温度を下げてｍＲＮＡ、Ｐｕ－ＤＮＡ 、Ｓｐｌｉｎｔ ＤＮＡの三者をアニーリングした。そこへ、３５ＵのＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅを加え、３７℃で１時間、連結反応を促進させた後、４℃で放置した。得られた転写産物を７Ｍ 尿素を含む１０％アクリルアミドゲルで電気泳動（１８０Ｖ、４０分間）し、ｍＲＮＡライブラリがＰｕ－ＤＮＡと連結したことを確認した。得られたＰｕ－ＤＮＡ連結ｍＲＮＡライブラリを、ＲＮＡ精製試薬キットＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ（商標） ＸＰで精製し、濃度を決定した。
【0068】
（カスタムＰＵＲＥ ｓｙｓｔｅｍｕによる無細胞翻訳）
Ｐｕ－ＤＮＡ連結ｍＲＮＡライブラリを無細胞翻訳系（ＰＵＲＥ ｓｙｓｔｅｍ）により翻訳し、ペプチドライブラリを獲得した。２．４μＬの０．６μＭ ｌｉｇａｔｅｄ ｓａｍｐｌｅ、０．５μＬのＳｏｌｕｔｉｏｎ Ｂ、６μＬのＳｏｌｕｔｉｏｎ Ａ及び３μＬのＳｔｏｃｋ ｂｕｆｆｅｒを加えて１１．９μＬのＰＵＲＥ ｍｉｘｔｕｒｅを調製した。ＰＵＲＥ ｍｉｘｔｕｒｅを３７℃で１時間反応させた。
Ｐｕ－ＤＮＡ連結ｍＲＮＡライブラリを無細胞翻訳系（ＰＵＲＥ ｓｙｓｔｅｍ）により翻訳し、ペプチドライブラリを獲得した。２．４μＬの０．６μＭ ｌｉｇａｔｅｄ ｓａｍｐｌｅ、０．５μＬのＳｏｌｕｔｉｏｎ Ｂ、６μＬのＳｏｌｕｔｉｏｎ Ａ及び３μＬのＳｔｏｃｋ ｂｕｆｆｅｒを加えて１１．９μＬのＰＵＲＥ ｍｉｘｔｕｒｅを調製した。ＰＵＲＥ ｍｉｘｔｕｒｅを３７℃で１時間反応させた。
【0069】
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂの組成を表２に示す。なお、Ｓｔｏｃｋ ｂｕｆｆｅｒの組成は、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ及び３０％グリセロールである。
【表2】
【0070】
ｆａｃｔｏｒ ｍｉｘの組成を表３に示す。
【表3】
【0071】
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａの組成を表４に示す。
【表4】
【0072】
ＮＴＰ ｃｒａｔｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｍｉｘｔｕｒｅの組成を表５に示す。
【表5】
【0073】
ＰＵＲＥ ｂｕｆｆｅｒの組成を表６に示す。
【表6】
【0074】
（Ｔａｇ抗体固定化ビーズの調製）
Ｔａｇ抗体はセレクションの１周目及び３周目はｐｒｏｔｅｉｎ Ｇビーズに、２周目はｐｒｏｔｅｉｎ Ａビーズに固定化させた。これらのビーズは使用前に５００μＬのｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ及び０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で洗浄した。ビーズ ２．５μＬに対して、ＩｇＧ抗体を１μＬ加え、３０分間振とうしてビーズとＩｇＧ抗体とを結合させた。
Ｔａｇ抗体はセレクションの１周目及び３周目はｐｒｏｔｅｉｎ Ｇビーズに、２周目はｐｒｏｔｅｉｎ Ａビーズに固定化させた。これらのビーズは使用前に５００μＬのｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ及び０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で洗浄した。ビーズ ２．５μＬに対して、ＩｇＧ抗体を１μＬ加え、３０分間振とうしてビーズとＩｇＧ抗体とを結合させた。
【0075】
（Ｔａｇ抗体固定化ビーズへのペプチドライブラリの結合反応）
Ｔａｇ抗体固定化ビーズに対して、翻訳後産物１１．９μＬとｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０及び１０ｍＭ ＥＤＴＡ）２５μＬを加え、３０分間振とうして、ペプチドライブラリをＴａｇ抗体固定化ビーズに結合させた（ポジティブセレクション）。上清を除いてビーズを回収し、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで１０回洗ってＩｇＧに特異的に結合するペプチドライブラリを得た。
Ｔａｇ抗体固定化ビーズに対して、翻訳後産物１１．９μＬとｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０及び１０ｍＭ ＥＤＴＡ）２５μＬを加え、３０分間振とうして、ペプチドライブラリをＴａｇ抗体固定化ビーズに結合させた（ポジティブセレクション）。上清を除いてビーズを回収し、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで１０回洗ってＩｇＧに特異的に結合するペプチドライブラリを得た。
【0076】
（逆転写）
ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇビーズ又はｐｒｏｔｅｉｎ Ａビーズ上に存在するｍＲＮＡをＰｒｏｔｏ ＳｃｒｉｐｔＩＩ ＲＴａｓｅにより逆転写しｃＤＮＡとした。最終的に４４．５μＬスケールの逆転写反応となるように、ビーズに対し、４０μＬのＲＴ ｍｉｘ、４．２５μＬのＲＴ（－）（５０ｍＭ ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び７５ｍＭ ＫＣｌ）及び０．２５μＬのＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ ＩＩを混合し、３７℃で４０分間、逆転写反応をさせた。ＲＴ ｍｉｘは、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１０ｍＭ ＤＴＴ及び０．２μＭ ＲＴ－Ｐｒｉｍｅｒ（Ｐ２＿ｖｅｒ２、GGTCGGCGGATCAAAGTAGCTGCCGCTGCCGCTGCCGCA（配列番号１８））を含むＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ ｂｕｆｆｅｒである。
ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇビーズ又はｐｒｏｔｅｉｎ Ａビーズ上に存在するｍＲＮＡをＰｒｏｔｏ ＳｃｒｉｐｔＩＩ ＲＴａｓｅにより逆転写しｃＤＮＡとした。最終的に４４．５μＬスケールの逆転写反応となるように、ビーズに対し、４０μＬのＲＴ ｍｉｘ、４．２５μＬのＲＴ（－）（５０ｍＭ ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び７５ｍＭ ＫＣｌ）及び０．２５μＬのＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ ＩＩを混合し、３７℃で４０分間、逆転写反応をさせた。ＲＴ ｍｉｘは、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１０ｍＭ ＤＴＴ及び０．２μＭ ＲＴ－Ｐｒｉｍｅｒ（Ｐ２＿ｖｅｒ２、GGTCGGCGGATCAAAGTAGCTGCCGCTGCCGCTGCCGCA（配列番号１８））を含むＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ ｂｕｆｆｅｒである。
【0077】
（溶出）
リン酸バッファー１０μＬにて、Ｔａｇ抗体を９５℃で３分間保持し、ペプチドライブラリを抽出した。溶出後上清を回収し、２０μＬのｕｌｔｒａｐｕｒｅ ｗａｔｅｒでビーズを洗って、その上清をさらに回収した。
リン酸バッファー１０μＬにて、Ｔａｇ抗体を９５℃で３分間保持し、ペプチドライブラリを抽出した。溶出後上清を回収し、２０μＬのｕｌｔｒａｐｕｒｅ ｗａｔｅｒでビーズを洗って、その上清をさらに回収した。
【0078】
（ｑＰＣＲによる回収されたｃＤＮＡ量の定量）
回収されたペプチドに連結したｃＤＮＡを、ｑＰＣＲで定量し、次のラウンドにおけるＰＣＲ増幅の最適なサイクルを決定した。表７に示すｑＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅを３８４ウェルの各ウェルに７μＬ分注し、０．５μＬのｃＤＮＡを各ウェルに添加した。プレートを９５℃で３分間インキュベートした後、９５℃で１分間の後、９５℃（１０秒間）及び６０℃（３０秒間）の２ステップを４０サイクル繰り返して反応させ、ｃＤＮＡを増幅した。リバースプライマー（Ｐ２（抗原））の塩基配列はGGTCGGCGGATCAAAGTAGCTGCCGCTGCCGCTGCCGCA（配列番号１９）である。
回収されたペプチドに連結したｃＤＮＡを、ｑＰＣＲで定量し、次のラウンドにおけるＰＣＲ増幅の最適なサイクルを決定した。表７に示すｑＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅを３８４ウェルの各ウェルに７μＬ分注し、０．５μＬのｃＤＮＡを各ウェルに添加した。プレートを９５℃で３分間インキュベートした後、９５℃で１分間の後、９５℃（１０秒間）及び６０℃（３０秒間）の２ステップを４０サイクル繰り返して反応させ、ｃＤＮＡを増幅した。リバースプライマー（Ｐ２（抗原））の塩基配列はGGTCGGCGGATCAAAGTAGCTGCCGCTGCCGCTGCCGCA（配列番号１９）である。
【0079】
【表7】
【0080】
（回収されたＤＮＡのＰＣＲによる増幅）
表８に示すＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅに増幅したテンプレートＤＮＡ２０μＬを添加し、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによりｃＤＮＡライブラリを増幅させた。調整したＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅをサーマルサイクラーにおいて９５℃で３分間インキュベートした後、９５℃、５８℃、７５℃の温度変化をｑＰＣＲで決定したサイクル繰り返すことでテンプレートＤＮＡを増幅した。１％アガロースゲルで泳動して増幅を確認することで、最適サイクル数（Ｎ）を決定した。決定したＰＣＲ条件で増幅したテンプレートＤＮＡライブラリを１％アガロースゲルで泳動して確認した。十分な増幅を確認後、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ（商標） ＸＰで精製した。
表８に示すＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅに増幅したテンプレートＤＮＡ２０μＬを添加し、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによりｃＤＮＡライブラリを増幅させた。調整したＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅをサーマルサイクラーにおいて９５℃で３分間インキュベートした後、９５℃、５８℃、７５℃の温度変化をｑＰＣＲで決定したサイクル繰り返すことでテンプレートＤＮＡを増幅した。１％アガロースゲルで泳動して増幅を確認することで、最適サイクル数（Ｎ）を決定した。決定したＰＣＲ条件で増幅したテンプレートＤＮＡライブラリを１％アガロースゲルで泳動して確認した。十分な増幅を確認後、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ（商標） ＸＰで精製した。
【0081】
【表8】
【0082】
（２ラウンド目の転写）
１０μＬスケールのＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅを調製し、増幅したＤＮＡライブラリ０．１μＭを５０ｍＵ／ｕＬ Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで転写した。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅには５ｍＭ ＮＴＰｓ、５μＭ ＤＴＴ、２０μＭ ＭｇＣｌ２を加えた。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅを３７℃で１時間、転写反応させた後、７５℃で５分間放置し、Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを失活させた。
１０μＬスケールのＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅを調製し、増幅したＤＮＡライブラリ０．１μＭを５０ｍＵ／ｕＬ Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで転写した。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅには５ｍＭ ＮＴＰｓ、５μＭ ＤＴＴ、２０μＭ ＭｇＣｌ２を加えた。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅを３７℃で１時間、転写反応させた後、７５℃で５分間放置し、Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを失活させた。
【0083】
（２ラウンド目のｍＲＮＡとＰｕ－ＤＮＡ連結）
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ産物５μＭに１ｍＭ ＡＴＰｓ、１０μＭ Ｐｕ－ＤＮＡ、１０μＭ スプリントＤＮＡを混合し、１×ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ で８μＬスケールのＬｉｇａｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅを調製した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅを９５℃で１分間温めた後、一定勾配で１５分間かけて２５℃まで温度を下げ、ｍＲＮＡ、Ｐｕ－ＤＮＡ及びＳｐｌｉｔ ＤＮＡをアニーリングした。Ｔ４ ｌｉｇａｓｅを加え、３７℃で１時間反応させた。
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ産物５μＭに１ｍＭ ＡＴＰｓ、１０μＭ Ｐｕ－ＤＮＡ、１０μＭ スプリントＤＮＡを混合し、１×ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ で８μＬスケールのＬｉｇａｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅを調製した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅを９５℃で１分間温めた後、一定勾配で１５分間かけて２５℃まで温度を下げ、ｍＲＮＡ、Ｐｕ－ＤＮＡ及びＳｐｌｉｔ ＤＮＡをアニーリングした。Ｔ４ ｌｉｇａｓｅを加え、３７℃で１時間反応させた。
【0084】
研究用抗体１６１種類（モノクローナル抗体が１４４種類、ポリクローナル抗体が１７種類）それぞれを上記のビーズに固定化して、本実施例に係るＤＥＣＯＤＥ法を実行した。ＤＥＣＯＤＥ法でスクリーニングしたペプチドのｃＤＮＡについて、次世代シーケンサーであるＨｉＳｅｑ３０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）で１抗体につき１００万リードほど塩基配列を決定した。得られた塩基配列をアミノ酸に変換し、プログラミングソフトｊａｖａを使用しアミノ酸配列についてクラスタリングを行った。置換スコア関数にはＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスを用いた。ただし、本研究では進化的なアミノ酸置換の生じにくさを考慮しないため、負の値は０とした行列を使った。得られたクラスターについて、シーケンスアラインメント用ソフトウェアであるＣｌｕｓｔａｌ Ｘでアラインメントを作製したのち、Ｗｅｂｌｏｇｏでモチーフを作成した。
【0085】
（結果）
各ラウンドで回収したｃＤＮＡ－ペプチド複合体量をｑＰＣＲで定量したところ、ほとんどの抗体で３ラウンド目に収束がみられた。
各ラウンドで回収したｃＤＮＡ－ペプチド複合体量をｑＰＣＲで定量したところ、ほとんどの抗体で３ラウンド目に収束がみられた。
【0086】
図１０（Ａ）はｃ－ｆｏｓのアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。モノクローナル抗体に関して、抗ｃ－ｆｏｓ抗体５種類に対して収束したペプチドの中で、最も収束率の高かったモチーフを図１０（Ｂ）に示す。各抗ｃ－ｆｏｓ抗体について得られたモチーフは、図１０（Ａ）に示すようにｃ－ｆｏｓの一部に一致していた。
【0087】
図１１（Ａ）はＮｅｕＮのアミノ酸配列（配列番号２１）を示す。図１１（Ｂ）は抗ＮｅｕＮ抗体に対して収束したペプチドから作成したモチーフを示す。抗ＮｅｕＮ抗体について得られたモチーフは、図１１（Ａ）に示すようにＮｅｕＮの一部に一致していた。図１２（Ａ）はＴＨのアミノ酸配列（配列番号２２）を示す図である。図１２（Ｂ）は抗ＴＨ抗体に対して収束したペプチドから作成したモチーフを示す。抗ＴＨ抗体について得られたモチーフは、図１２（Ａ）に示すようにＴＨの一部に一致していた。
【0088】
上記のように本実施例で得られたいずれのモチーフも、標的タンパク質上の一部の配列と一致した。アミノ酸配列の量比から、抗体の抗原認識に、エピトープのどのアミノ酸残基が特に重要かを予測することができた。また、図１０（Ｂ）に示すように、ｃ－ｆｏｓを標的とする抗体の同一のクローンＣ１について独立のＤＥＣＯＤＥ法で再現性良く同じモチーフを獲得することができた。
【0089】
ポリクローナル抗体に関して、抗ｃ－ｆｏｓ抗体（シグマ社製）及び抗ＤＡＴ抗体（シグマ社製）に対して収束したペプチドについて作成したモチーフをそれぞれ図１３及び図１４に示す。図１３（Ｂ）に示すように、得られたモチーフは主に４種類のクラスターに分類された。いずれのモチーフも、図１３（Ａ）に示すｃ－ｆｏｓタンパク質配列上の一部と一致した。また、２つの独立した解析において、同じ抗ｃ－ｆｏｓ抗体について再現性良く同じモチーフが獲得された。
【0090】
図１４（Ｂ）に示すように抗ＤＡＴ抗体でも特異的なモチーフが得られた。得られたモチーフは主に２種類のクラスターに分類された。いずれのモチーフも、ＤＡＴタンパク質配列（配列番号２３）上の一部と一致した（図１４（Ａ）参照）。抗ＤＡＴ抗体においても２つの独立した解析において、同じ抗ＤＡＴ抗体で再現性良く同じモチーフが獲得された。
【0091】
（実施例２：ＤＥＣＯＤＥ法の精度に関するＥＬＩＳＡ法による評価）
ＤＥＣＯＤＥ法で得たモチーフが、実際に抗体が認識するエピトープであるかを、ＥＬＩＳＡ法で実証した。以下ではｃ－Ｆｏｓタンパク質を認識する、クローンが異なる５種類の抗ｃ－ｆｏｓ抗体（モノクローナル抗体Ｃ１、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ５及びポリクローナル抗体Ｃ７）を利用して抗原抗体反応を検証した。
ＤＥＣＯＤＥ法で得たモチーフが、実際に抗体が認識するエピトープであるかを、ＥＬＩＳＡ法で実証した。以下ではｃ－Ｆｏｓタンパク質を認識する、クローンが異なる５種類の抗ｃ－ｆｏｓ抗体（モノクローナル抗体Ｃ１、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ５及びポリクローナル抗体Ｃ７）を利用して抗原抗体反応を検証した。
【0092】
野生型ｃ－ｆｏｓタンパク質（全長）の遺伝子がクローニングされたｐＭＵ２プラスミドに、各種変異プライマーをＰｒｉｍｅＳｔａｒ ｍａｘで導入した。作製したｃ－ｆｏｓタンパク質変異体及び野生型ｃ－ｆｏｓタンパク質のベクターを、ＨＥＫ２９３Ｔへ形質転換して発現させた。発現後、細胞を破砕しライセートを回収した。
【0093】
各種変異体ｃ－ｆｏｓタンパク質及び野生型ｃ－ｆｏｓタンパク質を発現させたＨＥＫ２９３Ｔのライセートを３８４プレートに固定化した。１２．５μＬ／ｗｅｌｌで１時間振とうさせ、一晩４℃で保存した。次に、ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｏｎｅを１／５希釈して１２０μＬ／ｗｅｌｌで満たし、一時間室温で静置した。ＴＰＢＳ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０ ＰＢＳ）で３回洗ったのち、系列希釈した各抗ｃ－ｆｏｓ抗体（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ７）を１次抗体としてｃ－ｆｏｓタンパク質に結合させた。室温で１時間振とうして結合反応を行い、ＴＰＢＳで３回洗浄した。その後、１／１０００希釈したＨｏｒｓｅ Ｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識二次抗体（ｍｏｕｓｅ、ｒａｂｂｉｔ、ｇｏａｔ）を加え、室温で１時間振とうして結合反応を行った。二次抗体との結合反応後、ＴＰＢＳで１２回洗浄した。ＥＬＩＳＡ ＰＯＤ 基質 ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）発色基質溶液を２５μＬ添加し、十分発色させ、０．１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を５０μＬ添加して反応を停止させた。マイクロプレートリーダーで吸光度（４５０ｎｍ）を測定した。
【0094】
ＨＥＫ２９３Ｔのライセートごとｃ－ｆｏｓタンパク質を固定化したため、ｃ－ｆｏｓタンパク質を発現させていないＨＥＫ２９３Ｔのライセートにおける吸光度をブランクとして差し引いた。プレートに固定化したＨＥＫ２９３Ｔのライセート中の各変異体及び野生型ｃ－ｆｏｓタンパク質の発現量の違いを補正するために、抗ｃ－ｆｏｓ抗体（Ｃ２、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ７）による抗原抗体反応の吸光度は抗ｃ－ｆｏｓ抗体（Ｃ１）の飽和時の吸光度で、抗ｃ－ｆｏｓ抗体（Ｃ１）の吸光度は抗ｃ－ｆｏｓ抗体（Ｃ２）の飽和時の吸光度で割った値を正規化した吸光度とした。各抗体濃度に対する正規化した吸光度をプロットし、飽和曲線を作製した。下記のミカエリスメンテン式に対して、最小二乗法により測定値を近似し、正規化した吸光度の最大値（Ａｂｓ．ｍａｘ）とＫｍ値とを算出した。
正規化した吸光度＝Ａｂｓ．ｍａｘ×ｎＭ／（ｎＭ＋Ｋｍ）
正規化した吸光度＝Ａｂｓ．ｍａｘ×ｎＭ／（ｎＭ＋Ｋｍ）
【0095】
（結果）
図１５（Ａ）はｃ－ｆｏｓのアミノ酸配列を示す。エピトープ解析によって各抗体のクローンに関して得られたモチーフ及び変異体ｃ－ｆｏｓタンパク質において置換したアミノ酸の位置を図１５（Ｂ）に示す。変異体ｃ－ｆｏｓタンパク質では、抗原認識に重要と予測されるアミノ酸を置換している。抗原抗体相互作用について、野生型と変異体とを比較したＥＬＩＳＡの結果を図１６に示す。モノクローナル抗体Ｃ１、Ｃ２及びＣ４はそれぞれに対応する変異体への結合が野生型と比較して顕著に低下した。モノクローナル抗体Ｃ５及びポリクローナル抗体Ｃ７は野生型に対して弱く結合したものの、それぞれのエピトープ変異体に対してはまったく結合がみられなかった。これらの結果はＤＥＣＯＤＥ法で得たペプチドが、実際の抗体認識部位であったことを示す。
図１５（Ａ）はｃ－ｆｏｓのアミノ酸配列を示す。エピトープ解析によって各抗体のクローンに関して得られたモチーフ及び変異体ｃ－ｆｏｓタンパク質において置換したアミノ酸の位置を図１５（Ｂ）に示す。変異体ｃ－ｆｏｓタンパク質では、抗原認識に重要と予測されるアミノ酸を置換している。抗原抗体相互作用について、野生型と変異体とを比較したＥＬＩＳＡの結果を図１６に示す。モノクローナル抗体Ｃ１、Ｃ２及びＣ４はそれぞれに対応する変異体への結合が野生型と比較して顕著に低下した。モノクローナル抗体Ｃ５及びポリクローナル抗体Ｃ７は野生型に対して弱く結合したものの、それぞれのエピトープ変異体に対してはまったく結合がみられなかった。これらの結果はＤＥＣＯＤＥ法で得たペプチドが、実際の抗体認識部位であったことを示す。
【0096】
抗ｃ－ｆｏｓ抗体（Ｃ１）に対してエピトープ解析で得た分子認識様式（抗体が認識する際のエピトープのアミノ酸の重要度）について、実際の抗原抗体反応が一致するかどうかをＥＬＩＳＡ法で検証した。ｃ－ｆｏｓ抗体のエピトープとして同定された図１０（Ｂ）に示すエピトープ１について、変異体ｃ－ｆｏｓタンパク質において置換したアミノ酸の位置を図１７に示す。抗原抗体相互作用について、野生型と変異体とを比較したＥＬＩＳＡの結果を図１８に示す。変異体Ｄ２７１Ａ、Ｆ２７２Ａ、Ｌ２７３Ａ、Ｆ２７４Ａは野生型と比較して抗ｃ－ｆｏｓ抗体の結合が顕著に低下した。アミノ酸Ｆ２７２、Ｆ２７４を芳香族アミノ酸（Ｙ、Ｗ）に置換した場合、抗ｃ－ｆｏｓ抗体の結合が回復した。変異体Ｐ２７５Ａ、Ａ２７６Ｇ、Ｒ２７９Ａ及びＰ２８０Ａに関しては、野生型と比較して抗ｃ－ｆｏｓ抗体の結合がやや低下したが、変異体Ｓ２７７Ａ、Ｓ２７８Ａ及びＳ２８１Ａの結合に変化は見られなかった。これらの結果より、ＤＥＣＯＤＥ法で得た分子認識様式が、実際の抗原抗体反応と一致することが示された。
【0097】
（実施例３：抗ｃ－ｆｏｓ抗体の交差反応性の評価）
クローンが異なる８種類の抗ｃ－Ｆｏｓ抗体（モノクローナル抗体Ｃ１、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ５及びＣ８、並びにポリクローナル抗体Ｃ３、Ｃ６及びＣ７に関して交差反応性を評価した。ＤＥＣＯＤＥ法において収束したペプチドのアミノ酸配列と、約２００００種類のヒトタンパク質との間の類似度を算出した。類似度の算出には、負の値は０とした置換スコア関数ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスを使用した。
クローンが異なる８種類の抗ｃ－Ｆｏｓ抗体（モノクローナル抗体Ｃ１、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ５及びＣ８、並びにポリクローナル抗体Ｃ３、Ｃ６及びＣ７に関して交差反応性を評価した。ＤＥＣＯＤＥ法において収束したペプチドのアミノ酸配列と、約２００００種類のヒトタンパク質との間の類似度を算出した。類似度の算出には、負の値は０とした置換スコア関数ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスを使用した。
【0098】
（結果）
図１９は、各抗体について類似度が高かった上位１００種類のタンパク質の類似度を示す。図１９における矢印は、標的タンパク質、すなわちｃ－ｆｏｓを示す。モノクローナル抗体Ｃ１及びＣ２並びにポリクローナル抗体Ｃ３及びＣ７ではｃ－ｆｏｓに対する類似度が最大であった。モノクローナル抗体Ｃ４、及びＣ５のｃ－ｆｏｓに対する類似度が１位ではなく、特異性が低いことが予想された。モノクローナル抗体Ｃ８及びポリクローナル抗体Ｃ６のｃ－ｆｏｓに対する類似度は１００位以下であった。Ｃ１に関しては独立したエピトープ解析で再現性良くｃ－ｆｏｓに対する類似度が最大となった。
図１９は、各抗体について類似度が高かった上位１００種類のタンパク質の類似度を示す。図１９における矢印は、標的タンパク質、すなわちｃ－ｆｏｓを示す。モノクローナル抗体Ｃ１及びＣ２並びにポリクローナル抗体Ｃ３及びＣ７ではｃ－ｆｏｓに対する類似度が最大であった。モノクローナル抗体Ｃ４、及びＣ５のｃ－ｆｏｓに対する類似度が１位ではなく、特異性が低いことが予想された。モノクローナル抗体Ｃ８及びポリクローナル抗体Ｃ６のｃ－ｆｏｓに対する類似度は１００位以下であった。Ｃ１に関しては独立したエピトープ解析で再現性良くｃ－ｆｏｓに対する類似度が最大となった。
【0099】
（実施例４：実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルマウスの血漿のＤＥＣＯＤＥ解析）
１０週齢のＣ５７Ｂ６マウスに、Ｍｙｅｌｉｎ－ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＯＧ）の一部であるＭＯＧ３５－５５ペプチド（MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK（配列番号２４））を、１０週齢のＣ５７Ｂ６マウスに完全フロイントアジュバントを用いて免疫した。免疫後２０～２２日に全血を回収し、等量のＰＢＳと混和し、フィコールを用いて血漿成分を分離した。血漿１００μＬを１００μＬのＰｒｏｔｅｉｎＧ磁気ビーズ（ｄｙｎａｂｅａｄｓ）に４℃で１時間結合させた。これを５００μＬの洗浄バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌ及び０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）で５回洗浄し、ＥＡＥマウス抗体が固定化された磁気ビーズを得た。ｎ＝８とした上述のテンプレートＤＮＡを含むテンプレートＤＮＡライブラリに対して、当該磁気ビーズを用いて実施例１と同様にＤＥＣＯＤＥ法を５ラウンド行い、ＨｉＳｅｑ２５００を用いてシングルリード８０ベースでシーケンシングを行った。
１０週齢のＣ５７Ｂ６マウスに、Ｍｙｅｌｉｎ－ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＯＧ）の一部であるＭＯＧ３５－５５ペプチド（MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK（配列番号２４））を、１０週齢のＣ５７Ｂ６マウスに完全フロイントアジュバントを用いて免疫した。免疫後２０～２２日に全血を回収し、等量のＰＢＳと混和し、フィコールを用いて血漿成分を分離した。血漿１００μＬを１００μＬのＰｒｏｔｅｉｎＧ磁気ビーズ（ｄｙｎａｂｅａｄｓ）に４℃で１時間結合させた。これを５００μＬの洗浄バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌ及び０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）で５回洗浄し、ＥＡＥマウス抗体が固定化された磁気ビーズを得た。ｎ＝８とした上述のテンプレートＤＮＡを含むテンプレートＤＮＡライブラリに対して、当該磁気ビーズを用いて実施例１と同様にＤＥＣＯＤＥ法を５ラウンド行い、ＨｉＳｅｑ２５００を用いてシングルリード８０ベースでシーケンシングを行った。
【0100】
得られた塩基配列を変換したアミノ酸配列についてマルチプルアライメントを行った。また、マウスタンパク質の部分配列について、基準データと得られたアミノ酸配列群とを比較してスコアを算出した。
【0101】
（結果）
マルチプルアライメントの結果に基づいて、図２０に示すように、ＭＯＧ３５－５５ペプチドの一部と相同性の高いモチーフが得られた。図２１（Ａ）に示すように、規格化されたスコアの上位１４０位と３９９位にＭＯＧ３５の部分配列が検出された。一方、図２１（Ｂ）に示すように、ＭＯＧ３５－５５ペプチドを免疫していないマウス血漿からはＭＯＧの部分配列は検出されなかった。
マルチプルアライメントの結果に基づいて、図２０に示すように、ＭＯＧ３５－５５ペプチドの一部と相同性の高いモチーフが得られた。図２１（Ａ）に示すように、規格化されたスコアの上位１４０位と３９９位にＭＯＧ３５の部分配列が検出された。一方、図２１（Ｂ）に示すように、ＭＯＧ３５－５５ペプチドを免疫していないマウス血漿からはＭＯＧの部分配列は検出されなかった。
【0102】
本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等な発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
【産業上の利用可能性】
【0103】
本発明は、タンパク質における被験物質の結合部位に関する情報、特に抗体のエピトープの予測に好適である。
【符号の説明】
【0104】
１ 取得部、２ 出力部、１０ 記憶部、１１ 基準データ、１２ タンパク質のアミノ酸配列データ、１３ 情報取得プログラム、２０ ＲＡＭ、３０ 入力装置、４０ 表示装置、５０ ＣＰＵ、６０ バス、１００ タンパク質結合部位情報取得装置
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【配列表】