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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-21
(45)【発行日】2024-08-29
(54)【発明の名称】脳オルガノイドの製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/079 20100101AFI20240822BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20240822BHJP
【ＦＩ】
C12N5/079
C12Q1/02
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2021530619
(86)(22)【出願日】2020-06-30
(86)【国際出願番号】 JP2020025605
(87)【国際公開番号】W WO2021006107
(87)【国際公開日】2021-01-14
【審査請求日】2023-04-21
(31)【優先権主張番号】P 2019126266
(32)【優先日】2019-07-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】598121341
【氏名又は名称】慶應義塾
(74)【代理人】
【識別番号】100165179
【弁理士】
【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100175824
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100152272
【弁理士】
【氏名又は名称】川越 雄一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100181722
【弁理士】
【氏名又は名称】春田 洋孝
(72)【発明者】
【氏名】石井 弘子
(72)【発明者】
【氏名】岡野 栄之
【審査官】松田 芳子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１９－５０２４０７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１９－５００８８８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５３１０１１（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１９／０３３４６４６（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１９／０２３６９３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０２０／１００４８１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Mol. Psychiatry，2018年，vol.23，p.2363-2374
【文献】Frontiers in Pharmacology，2020年03月31日，vol.11, article 396
【文献】Cell，2016年，vol.165, p.1238-1254
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ５／００
Ｃ１２Ｑ １／０２
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
アルツハイマー病関連遺伝子に変異を有する多能性幹細胞を１００ｎｇ／ｍＬ未満のＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－２（ＦＧＦ２）の存在下で培養する工程（ａ’）と、
前記多能性幹細胞から、１～３μＭのｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＭＰ）阻害剤及び１～３μＭのｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β （ＴＧＦ－β）阻害剤の存在下で胚葉体を形成する工程（ａ）と、
工程（ａ）の後の前記胚葉体を細胞外マトリックスに包埋して１～５μＭのＳＭＡＤ阻害剤及び１～５μＭのｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３β（ＧＳＫ３β）阻害剤の存在下で三次元培養し、オルガノイドを形成する工程（ｂ）と、
工程（ｂ）の後の前記オルガノイドを前記細胞外マトリックスから取り出して培地中で撹拌培養する工程（ｃ）とを含み、
前記工程（ｃ）の少なくとも一部を５～５０ｎｇ／ｍＬのＬｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ （ＬＩＦ）の存在下で行う、
アミロイド斑を有する脳オルガノイドの製造方法。
【請求項2】
前記工程（ｃ）の少なくとも一部を２０体積％超の酸素の存在下で行う、請求項１に記載の製造方法。
【請求項3】
前記工程（ｃ）を１００日間以上行う、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項4】
前記多能性幹細胞の培養をフィーダーフリーで行う、請求項１～３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項5】
前記アルツハイマー病関連遺伝子が、Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ １（ＰＳ１）遺伝子、Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ ２（ＰＳ２）遺伝子又はβ－ａｍｙｌｏｉｄｐｒｅｃｕｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＰＰ）遺伝子である、請求項１～４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載の製造方法により製造された、直径が２０μｍより大きいアミロイド斑を有することを特徴とする脳オルガノイド。
【請求項7】
脳オルガノイドの断面において、当該断面の総面積に対する、前記アミロイド斑１つあたりの面積の割合の平均が０．１％以上である、請求項６に記載の脳オルガノイド。
【請求項8】
前記アミロイド斑の数が脳オルガノイド１個当たり２個以上である、請求項６又は７に記載の脳オルガノイド。
【請求項9】
アミロイドβ４０の発現量に対するアミロイドβ４２の発現量のモル比（アミロイドβ４２の発現量／アミロイドβ４０の発現量）が０．１５以上である、請求項６～８のいずれか一項に記載の脳オルガノイド。
【請求項10】
被験物質の存在下で、請求項６～９のいずれか一項に記載の脳オルガノイドを培養する工程と、前記脳オルガノイドのアミロイド斑の大きさを測定する工程とを含み、
前記アミロイド斑の大きさが縮小したことが、前記被験物質がアルツハイマー病の治療薬であることを示す、アルツハイマー病の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項11】
アルツハイマー病関連遺伝子に変異を有する多能性幹細胞を１００ｎｇ／ｍＬ未満のＦＧＦ２の存在下で培養する工程（ａ’）と、
前記多能性幹細胞から、１～３μＭのＢＭＰ阻害剤及び１～３μＭのＴＧＦ－β阻害剤の存在下で胚葉体を形成する工程（ａ）と、
工程（ａ）の後の前記胚葉体を細胞外マトリックスに包埋して１～５μＭのＳＭＡＤ阻害剤及び１～５μＭのＧＳＫ３β阻害剤の存在下で三次元培養し、オルガノイドを形成する工程（ｂ）と、
工程（ｂ）の後の前記オルガノイドを前記細胞外マトリックスから取り出して、培地中で撹拌培養し、脳オルガノイドを得る工程であって、少なくとも一部を被験物質の存在下で行う工程（ｃ）と、
工程（ｃ）を１００日間以上行った後に前記脳オルガノイドのアミロイド斑の大きさを測定する工程（ｄ）とを含み、
工程（ｃ）の少なくとも一部を５～５０ｎｇ／ｍＬのＬＩＦの存在下で行い、
工程（ｄ）において、前記アミロイド斑の大きさが対照と比較して縮小したことが、前記被験物質がアルツハイマー病の予防薬であることを示す、アルツハイマー病の予防薬のスクリーニング方法。
【請求項12】
アルツハイマー病関連遺伝子に変異を有する多能性幹細胞を１００ｎｇ／ｍＬ未満のＦＧＦ２の存在下で培養する工程（ａ’）と、
前記多能性幹細胞から、１～３μＭのＢＭＰ阻害剤及び１～３μＭのＴＧＦ－β阻害剤の存在下で胚葉体を形成する工程（ａ）と、
工程（ａ）の後の前記胚葉体を細胞外マトリックスに包埋して１～５μＭのＳＭＡＤ阻害剤及び１～５μＭのＧＳＫ３β阻害剤の存在下で三次元培養し、オルガノイドを形成する工程（ｂ）と、
工程（ｂ）の後の前記オルガノイドを前記細胞外マトリックスから取り出して、培地中で撹拌培養し、脳オルガノイドを得る工程であって、少なくとも一部を被験物質の存在下で行う工程（ｃ）と、
工程（ｃ）の前記脳オルガノイドによるアミロイドβ４０及びアミロイドβ４２の発現量を定量する工程（ｄ’）とを含み、
工程（ｃ）の少なくとも一部を５～５０ｎｇ／ｍＬのＬＩＦの存在下で行い、
工程（ｄ’）において、アミロイドβ４０の発現量に対するアミロイドβ４２の発現量の比が対照と比較して低下したことが、前記被験物質がアルツハイマー病の予防薬又は治療薬であることを示す、アルツハイマー病の予防薬又は治療薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、脳オルガノイドの製造方法に関する。より詳細には、本発明は、アミロイド斑を有する脳オルガノイドの製造方法、アミロイド斑を有する脳オルガノイド、アルツハイマー病の予防薬又は治療薬のスクリーニング方法に関する。本願は、２０１９年７月５日に、日本に出願された特願２０１９－１２６２６６号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【0002】
オルガノイドとは、細胞が集積して形成された小型の臓器であり、生体内の臓器と類似した構造及び機能を有している。近年、多能性幹細胞から様々なオルガノイドを作製する研究が盛んに行われており、例えば、脳オルガノイド、腸オルガノイド、肝臓オルガノイド、腎臓オルガノイド等が作製されている。
【0003】
ところで、アルツハイマー病は不可逆的な進行性の脳疾患である。アルツハイマー病患者の脳には、アミロイド斑と呼ばれる特徴的な構造が認められ、アミロイド斑の構成成分はアミロイドβペプチドと呼ばれるペプチドであることが知られている。アミロイドβペプチドは、β－ａｍｙｌｏｉｄｐｒｅｃｕｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＰＰ）と呼ばれる前駆体タンパク質が切断されて生成される、長さ３６～４３個のアミノ酸からなるペプチドである。
【0004】
アルツハイマー病の治療薬の開発のために、アルツハイマー病モデルマウスが開発されている。しかしながら、ヒトとマウスの脳では構造が異なっており、アルツハイマー病モデルマウスで得られた知見がヒトに適用できない場合がある。そこで、より忠実にアルツハイマー病の病態を再現することができ、インビトロで使用可能なヒト脳オルガノイドが求められている。例えば、非特許文献１には、アルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞からアミロイド斑を有する脳オルガノイドを作製したことが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【文献】Gonzalez C., et al., Modeling amyloid beta and tau pathology in human cerebral organoids., Mol Psychiatry, 23 (12), 2363-2374, 2018.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
しかしながら、非特許文献１に記載された脳オルガノイドの作製方法には、アミロイド斑の形成効率に改良の余地がある。そこで、本発明は、アミロイド斑を有する脳オルガノイドを効率よく形成する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は以下の態様を含む。
［１］アルツハイマー病関連遺伝子に変異を有する多能性幹細胞から、ＳＭＡＤ阻害剤の存在下で胚葉体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ Ｂｏｄｙ，ＥＢ）を形成する工程（ａ）と、工程（ａ）の後の前記胚葉体を細胞外マトリックスに包埋してＳＭＡＤ阻害剤及びｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３β（ＧＳＫ３β）阻害剤の存在下で三次元培養し、オルガノイドを形成する工程（ｂ）と、工程（ｂ）の後の前記オルガノイドを前記細胞外マトリックスから取り出して培地中で撹拌培養する工程（ｃ）とを含み、前記工程（ｃ）の少なくとも一部をＬｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ （ＬＩＦ）の存在下で行う、アミロイド斑を有する脳オルガノイドの製造方法。
［２］前記工程（ｃ）の少なくとも一部を２０体積％超の酸素の存在下で行う、［１］に記載の製造方法。
［３］前記工程（ｃ）を１００日間以上行う、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］前記工程（ａ）の前に、前記多能性幹細胞を１００ｎｇ／ｍＬ未満のＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－２（ＦＧＦ２）の存在下で培養する工程を更に含む、［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］前記多能性幹細胞の培養をフィーダーフリーで行う、［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］前記アルツハイマー病関連遺伝子が、Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ １（ＰＳ１）遺伝子、Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ ２（ＰＳ２）遺伝子又はβ－ａｍｙｌｏｉｄｐｒｅｃｕｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＰＰ）遺伝子である、［１］～［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］直径が２０μｍより大きいアミロイド斑を有する脳オルガノイド。
［８］脳オルガノイドの断面において、当該断面の総面積に対する、前記アミロイド斑１つあたりの面積の割合の平均が０．１％以上である、［７］に記載の脳オルガノイド。
［９］前記アミロイド斑の数が脳オルガノイド１個当たり２個以上である、［７］又は［８］に記載の脳オルガノイド。
［１０］アミロイドβ４０の発現量に対するアミロイドβ４２の発現量のモル比（アミロイドβ４２の発現量／アミロイドβ４０の発現量）が０．１５以上である、［７］～［９］のいずれかに記載の脳オルガノイド。
［１１］［１］～［６］のいずれかに記載の製造方法により製造された、［７］～［１０］のいずれかに記載の脳オルガノイド。
［１２］被験物質の存在下で、［７］～［１０］のいずれかに記載の脳オルガノイドを培養する工程と、前記脳オルガノイドのアミロイド斑の大きさを測定する工程とを含み、前記アミロイド斑の大きさが縮小したことが、前記被験物質がアルツハイマー病の治療薬であることを示す、アルツハイマー病の治療薬のスクリーニング方法。
［１３］アルツハイマー病関連遺伝子に変異を有する多能性幹細胞から、ＳＭＡＤ阻害剤の存在下で胚葉体を形成する工程（ａ）と、工程（ａ）の後の前記胚葉体を細胞外マトリックスに包埋してＳＭＡＤ阻害剤及びＧＳＫ３β阻害剤の存在下で三次元培養し、オルガノイドを形成する工程（ｂ）と、工程（ｂ）の後の前記オルガノイドを前記細胞外マトリックスから取り出して、培地中で撹拌培養し、脳オルガノイドを得る工程であって、少なくとも一部を被験物質の存在下で行う工程（ｃ）と、工程（ｃ）を１００日間以上行った後に前記脳オルガノイドのアミロイド斑の大きさを測定する工程（ｄ）とを含み、工程（ｄ）において、前記アミロイド斑の大きさが対照と比較して縮小したことが、前記被験物質がアルツハイマー病の予防薬であることを示す、アルツハイマー病の予防薬のスクリーニング方法。
［１４］アルツハイマー病関連遺伝子に変異を有する多能性幹細胞から、ＳＭＡＤ阻害剤の存在下で胚葉体を形成する工程（ａ）と、工程（ａ）の後の前記胚葉体を細胞外マトリックスに包埋してＳＭＡＤ阻害剤及びＧＳＫ３β阻害剤の存在下で三次元培養し、オルガノイドを形成する工程（ｂ）と、工程（ｂ）の後の前記オルガノイドを前記細胞外マトリックスから取り出して、培地中で撹拌培養し、脳オルガノイドを得る工程であって、少なくとも一部を被験物質の存在下で行う工程（ｃ）と、工程（ｃ）の前記脳オルガノイドによるアミロイドβ４０及びアミロイドβ４２の発現量を定量する工程（ｄ’）とを含み、工程（ｄ’）において、アミロイドβ４０の発現量に対するアミロイドβ４２の発現量の比が対照と比較して低下したことが、前記被験物質がアルツハイマー病の予防薬又は治療薬であることを示す、アルツハイマー病の予防薬又は治療薬のスクリーニング方法。
［１］アルツハイマー病関連遺伝子に変異を有する多能性幹細胞から、ＳＭＡＤ阻害剤の存在下で胚葉体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ Ｂｏｄｙ，ＥＢ）を形成する工程（ａ）と、工程（ａ）の後の前記胚葉体を細胞外マトリックスに包埋してＳＭＡＤ阻害剤及びｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３β（ＧＳＫ３β）阻害剤の存在下で三次元培養し、オルガノイドを形成する工程（ｂ）と、工程（ｂ）の後の前記オルガノイドを前記細胞外マトリックスから取り出して培地中で撹拌培養する工程（ｃ）とを含み、前記工程（ｃ）の少なくとも一部をＬｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ （ＬＩＦ）の存在下で行う、アミロイド斑を有する脳オルガノイドの製造方法。
［２］前記工程（ｃ）の少なくとも一部を２０体積％超の酸素の存在下で行う、［１］に記載の製造方法。
［３］前記工程（ｃ）を１００日間以上行う、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］前記工程（ａ）の前に、前記多能性幹細胞を１００ｎｇ／ｍＬ未満のＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－２（ＦＧＦ２）の存在下で培養する工程を更に含む、［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］前記多能性幹細胞の培養をフィーダーフリーで行う、［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］前記アルツハイマー病関連遺伝子が、Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ １（ＰＳ１）遺伝子、Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ ２（ＰＳ２）遺伝子又はβ－ａｍｙｌｏｉｄｐｒｅｃｕｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＰＰ）遺伝子である、［１］～［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］直径が２０μｍより大きいアミロイド斑を有する脳オルガノイド。
［８］脳オルガノイドの断面において、当該断面の総面積に対する、前記アミロイド斑１つあたりの面積の割合の平均が０．１％以上である、［７］に記載の脳オルガノイド。
［９］前記アミロイド斑の数が脳オルガノイド１個当たり２個以上である、［７］又は［８］に記載の脳オルガノイド。
［１０］アミロイドβ４０の発現量に対するアミロイドβ４２の発現量のモル比（アミロイドβ４２の発現量／アミロイドβ４０の発現量）が０．１５以上である、［７］～［９］のいずれかに記載の脳オルガノイド。
［１１］［１］～［６］のいずれかに記載の製造方法により製造された、［７］～［１０］のいずれかに記載の脳オルガノイド。
［１２］被験物質の存在下で、［７］～［１０］のいずれかに記載の脳オルガノイドを培養する工程と、前記脳オルガノイドのアミロイド斑の大きさを測定する工程とを含み、前記アミロイド斑の大きさが縮小したことが、前記被験物質がアルツハイマー病の治療薬であることを示す、アルツハイマー病の治療薬のスクリーニング方法。
［１３］アルツハイマー病関連遺伝子に変異を有する多能性幹細胞から、ＳＭＡＤ阻害剤の存在下で胚葉体を形成する工程（ａ）と、工程（ａ）の後の前記胚葉体を細胞外マトリックスに包埋してＳＭＡＤ阻害剤及びＧＳＫ３β阻害剤の存在下で三次元培養し、オルガノイドを形成する工程（ｂ）と、工程（ｂ）の後の前記オルガノイドを前記細胞外マトリックスから取り出して、培地中で撹拌培養し、脳オルガノイドを得る工程であって、少なくとも一部を被験物質の存在下で行う工程（ｃ）と、工程（ｃ）を１００日間以上行った後に前記脳オルガノイドのアミロイド斑の大きさを測定する工程（ｄ）とを含み、工程（ｄ）において、前記アミロイド斑の大きさが対照と比較して縮小したことが、前記被験物質がアルツハイマー病の予防薬であることを示す、アルツハイマー病の予防薬のスクリーニング方法。
［１４］アルツハイマー病関連遺伝子に変異を有する多能性幹細胞から、ＳＭＡＤ阻害剤の存在下で胚葉体を形成する工程（ａ）と、工程（ａ）の後の前記胚葉体を細胞外マトリックスに包埋してＳＭＡＤ阻害剤及びＧＳＫ３β阻害剤の存在下で三次元培養し、オルガノイドを形成する工程（ｂ）と、工程（ｂ）の後の前記オルガノイドを前記細胞外マトリックスから取り出して、培地中で撹拌培養し、脳オルガノイドを得る工程であって、少なくとも一部を被験物質の存在下で行う工程（ｃ）と、工程（ｃ）の前記脳オルガノイドによるアミロイドβ４０及びアミロイドβ４２の発現量を定量する工程（ｄ’）とを含み、工程（ｄ’）において、アミロイドβ４０の発現量に対するアミロイドβ４２の発現量の比が対照と比較して低下したことが、前記被験物質がアルツハイマー病の予防薬又は治療薬であることを示す、アルツハイマー病の予防薬又は治療薬のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【0008】
本発明によれば、アミロイド斑を有する脳オルガノイドを効率よく形成する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】実験例１における脳オルガノイド作製のスケジュールを示す図である。
【図2】（ａ）及び（ｂ）は、実験例２において、ヒト脳オルガノイドにおけるアミロイド斑を検出した結果を示す顕微鏡写真である。
【図3】実験例２において、ヒト脳オルガノイドの断面の総面積に対する直径２０μｍ以上のアミロイド斑１つあたりの面積の割合（％）を示すグラフである。
【図4】（ａ）～（ｅ）は、実験例３において、ヒト脳組織及びヒト脳オルガノイドにおけるアミロイド斑を検出した結果を示す顕微鏡写真である。
【図5】（ａ）は、実験例４において、脳オルガノイドによるアミロイドβ４０（Ａβ４０）の発現量を定量した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例４において、脳オルガノイドによるアミロイドβ４２（Ａβ４２）の発現量を定量した結果を示すグラフである。（ｃ）は、（ａ）及び（ｂ）の結果に基づいて、脳オルガノイドのアミロイドβ４０の発現量に対するアミロイドβ４２の発現量のモル比（アミロイドβ４２の発現量／アミロイドβ４０の発現量）を算出した結果を示すグラフである。
【図6】（ａ）は、実験例５において、１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２の存在下で培養したｉＰＳ細胞を用いて分化誘導した脳オルガノイドの写真である。（ｂ）は、実験例５において、１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２の存在下で培養したｉＰＳ細胞を用いて分化誘導した脳オルガノイドの写真である。
【図7】（ａ）～（ｃ）は、実験例６において、脳オルガノイドにおけるタウタンパク質及びβＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎの免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図9】（ａ）～（ｃ）は、実験例６において、脳オルガノイドをＭＣ１抗体で免疫染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図10】（ａ）～（ｃ）は、実験例６において、脳オルガノイドにおけるＭＡＰ２及びＧＦＡＰの免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図11】（ａ）～（ｃ）は、実験例６において、脳オルガノイドをＢＴＡ－１で染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図12】（ａ）～（ｃ）は、実験例６において、脳オルガノイドにおけるタウタンパク質及びリン酸化タウタンパク質をウエスタンブロッティングにより検出した結果を示す写真である。（ｄ）は、（ｂ）及び（ｃ）に基づいて、全タウタンパク質に対するリン酸化タウタンパク質の割合を算出した結果を示すグラフである。
【図13】（ａ）及び（ｂ）は、実験例６において、脳オルガノイドにおけるタウタンパク質及びＨｕＣ／Ｄの免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図14】（ａ）は、実験例６において、脳オルガノイドにおけるタウタンパク質及びＣＴＩＰ２の免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。（ｂ）は、（ａ）の染色画像を拡大したものである。
【図15】（ａ）～（ｃ）は、実験例６において、脳オルガノイドにおけるタウタンパク質及びＳｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎの免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図16】（ａ）～（ｃ）は、実験例６において、脳オルガノイドにおけるタウタンパク質及びｇａｍｍａＨ２Ａ．Ｘの免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図17】（ａ）及び（ｂ）は、実験例６において、脳オルガノイドにおけるタウタンパク質及びＢＮＩＰ３の免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図18】（ａ）～（ｃ）は、実験例７において、脳オルガノイドにおけるリン酸化タウタンパク質、ＨｕＣ／Ｄ及びＧＦＡＰの免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図19】（ａ）～（ｃ）は、実験例８において、脳オルガノイドをＭＣ１抗体、抗ＨｕＣ／Ｄ抗体及び抗ＧＦＡＰ抗体で免疫染色した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【0010】
［アミロイド斑を有する脳オルガノイドの製造方法］
１実施形態において、本発明は、アルツハイマー病関連遺伝子に変異を有する多能性幹細胞を、ＳＭＡＤ阻害剤の存在下で胚葉体を形成する工程（ａ）と、工程（ａ）の後の前記胚葉体を細胞外マトリックスに包埋してＳＭＡＤ阻害剤及びｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３β（ＧＳＫ３β）阻害剤の存在下で三次元培養し、オルガノイドを形成する工程（ｂ）と、工程（ｂ）の後の前記オルガノイドを前記細胞外マトリックスから取り出して培地中で撹拌培養する工程（ｃ）とを含み、前記工程（ｃ）の少なくとも一部をＬｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ （ＬＩＦ）の存在下で行う、アミロイド斑を有する脳オルガノイドの製造方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、アルツハイマー病関連遺伝子に変異を有する多能性幹細胞を、ＳＭＡＤ阻害剤の存在下で胚葉体を形成する工程（ａ）と、工程（ａ）の後の前記胚葉体を細胞外マトリックスに包埋してＳＭＡＤ阻害剤及びｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３β（ＧＳＫ３β）阻害剤の存在下で三次元培養し、オルガノイドを形成する工程（ｂ）と、工程（ｂ）の後の前記オルガノイドを前記細胞外マトリックスから取り出して培地中で撹拌培養する工程（ｃ）とを含み、前記工程（ｃ）の少なくとも一部をＬｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ （ＬＩＦ）の存在下で行う、アミロイド斑を有する脳オルガノイドの製造方法を提供する。
【0011】
実施例において後述するように、本実施形態の製造方法により、アミロイド斑を有する脳オルガノイドを効率よく形成することができる。
【0012】
本明細書において、多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等が挙げられる。多能性幹細胞はヒトの細胞であることが好ましい。また、アルツハイマー病関連遺伝子としては、Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ １（ＰＳ１）遺伝子、Ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ ２（ＰＳ２）遺伝子、β－ａｍｙｌｏｉｄｐｒｅｃｕｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＰＰ）遺伝子等が挙げられる。
【0013】
ヒトＰＳ１遺伝子のゲノムＤＮＡのＮＣＢＩアクセッション番号はＮＣ＿００００１４．９である。ヒトＰＳ２遺伝子のゲノムＤＮＡのＮＣＢＩアクセッション番号はＮＣ＿０００００１．１１である。ヒトＡＰＰ遺伝子のゲノムＤＮＡのＮＣＢＩアクセッション番号はＮＣ＿００００２１．９である。
【0014】
アルツハイマー病関連遺伝子に変異を有する多能性幹細胞としては、これらのアルツハイマー病関連遺伝子に、アルツハイマー病の発症につながる変異を有した多能性幹細胞が挙げられる。
【0015】
アルツハイマー病の発症につながる変異としては、例えば、ＰＳ１遺伝子において、ＰＳ１タンパク質の第２４６番目のアミノ酸に、アラニンからグルタミン酸へのアミノ酸変異（Ａ２４６Ｅ）を生じる遺伝子変異、ＰＳ２遺伝子において、ＰＳ２タンパク質の第１４１番目のアミノ酸に、アスパラギンからイソロイシンへのアミノ酸変異（Ｎ１４１Ｉ）を生じる遺伝子変異、ＡＰＰ遺伝子の重複等が挙げられるがこれらに限定されない。
【0016】
アルツハイマー病の発症につながる変異は、ゲノム編集等により、人工的に導入した変異であってもよい。あるいは、アルツハイマー病患者由来の細胞から作製した多能性幹細胞を、アルツハイマー病関連遺伝子に変異を有する多能性幹細胞として用いてもよい。
【0017】
以下、本実施形態の製造方法の各工程について説明する。まず、工程（ａ）において、多能性幹細胞をＳＭＡＤ阻害剤の存在下で胚葉体を形成する。工程（ａ）は約７日間行うことが好ましい。本工程により、多能性幹細胞を神経系細胞に分化誘導させることができる。ＳＭＡＤ阻害剤としては、ＢＭＰ阻害剤及びＴＧＦ－β阻害剤を併用することが好ましい。
【0018】
ＢＭＰ阻害剤としては、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（ＣＡＳ番号：８６６４０５－６４－３）、ＤＭＨ１（ＣＡＳ番号：１２０６７１１－１６－１）、ＬＤＮ－１９３１８９（ＣＡＳ番号：１０６２３６８－２４－４）等を使用することができる。これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。ＢＭＰ阻害剤の培地への添加量は、例えば、１～３μＭ程度が挙げられる。
【0019】
また、ＴＧＦ－β阻害剤としては、Ａ８３－０１（ＣＡＳ番号：９０９９１０－４３－６）、ＳＢ－４３１５４２（ＣＡＳ番号：３０１８３６－４１－９）、ＲｅｐＳｏｘ（ＣＡＳ番号：４４６８５９－３３－２）等を使用することができる。これらは１種類を単独で用いてもよく、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。ＴＧＦ－β阻害剤の培地への添加量は、例えば、１～３μＭ程度が挙げられる。
【0020】
本実施形態の製造方法では、全工程を、フィーダー細胞を使用せず、フィーダーフリーで行うことが好ましい。すなわち、アルツハイマー病関連遺伝子に変異を有する多能性幹細胞はフィーダーフリーで培養されたものであることが好ましく、工程（ａ）～（ｃ）もフィーダーフリーで行うことが好ましい。これにより、培養操作が簡便になり、また、フィーダー細胞が脳オルガノイドに混入することを防止することができる。
【0021】
工程（ａ）の前に、多能性幹細胞を１００ｎｇ／ｍＬ未満のＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－２（ＦＧＦ２）の存在下で培養する工程を更に行ってもよい。ＦＧＦ２の培地への添加量は、１００ｎｇ／ｍＬ未満が好ましく、例えば５０ｎｇ／ｍＬであってもよく、例えば１０ｎｇ／ｍＬであってもよい。
【0022】
ＦＧＦ２はヒト由来であってもよく、マウス由来であってもよいが、ヒト由来であることが好ましい。
【0023】
多能性幹細胞をフィーダーフリーで培養する場合、培地にＦＧＦ２を１００ｎｇ／ｍＬ添加することが通常である。これに対し、発明者らは、ＦＧＦ２の培地への添加量を減少させることにより、アミロイド斑を有する脳オルガノイドの製造効率が上昇することを明らかにした。
【0024】
ＦＧＦ２の添加量が低すぎると、多能性幹細胞が分化してしまう場合がある。また、ＦＧＦ２の添加量が多すぎると、神経上皮様構造が得られにくくなる傾向にある。
【0025】
また、例えば、ＦＧＦ２の培地への添加量を１０ｎｇ／ｍＬとした場合、３週間程度以上培養を続けると多能性幹細胞の維持が困難になる。このため、多能性幹細胞をフィーダーフリー且つ１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２の存在下で培養する場合、培養時間は４週間以下とすることが好ましい。
【0026】
続いて、工程（ｂ）において、工程（ａ）の後の胚葉体を細胞外マトリックスに包埋してＳＭＡＤ阻害剤及びｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３β（ＧＳＫ３β）阻害剤の存在下で三次元培養し、オルガノイドを形成する。ここで、胚葉体は分散せずに細胞外マトリックスに包埋することが好ましい。胚葉体の分散方法は特に限定されず、物理的方法、酵素処理法等が挙げられるが、細胞を傷つけない観点から酵素処理法が好ましい。酵素処理法に用いられる酵素としては、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、トリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼＩ等を用いることができる。工程（ｂ）は約７日間行うことが好ましい。
【0027】
細胞外マトリックスとしては、例えば、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン等が挙げられる。細胞外マトリックスとして、例えば、マトリゲル（コーニング社製）等の市販のものを利用してもよい。
【0028】
ＳＭＡＤ阻害剤としては、上述したＴＧＦ－β阻害剤を用いることが好ましい。ＳＭＡＤ阻害剤は工程（ｂ）では１種類を単独で用いてもよく、工程（ａ）では２種類以上を組み合わせて用いる。ＳＭＡＤ阻害剤の培地への添加量は、例えば、１～５μＭ程度が挙げられる。なかでも、工程（ｂ）ではＳＢ－４３１５４２を用いることが好ましい。
【0029】
ＧＳＫ３β阻害剤としては、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳ番号：２５２９１７－０６－９）、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（ＣＡＳ番号：１４２２７３－２０－９）、６－Ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３’－ｏｘｉｍｅ（ＣＡＳ番号：０２９－１６２４１）等が挙げられる。ＧＳＫ３β阻害剤の培地への添加量は、例えば、１～５μＭ程度が挙げられる。なかでも、ＣＨＩＲ９９０２１を用いることが好ましい。
【0030】
続いて、工程（ｃ）において、工程（ｂ）の後のオルガノイドを細胞外マトリックスから取り出して培地中で撹拌培養する。撹拌培養は、バイオリアクターを用いて行うことが好ましい。バイオリアクターとしては、市販のものを使用することができる。
【0031】
工程（ｃ）は１００日間以上行うことが好ましい。実施例において後述するように、工程（ｃ）を開始してから７０日目の脳オルガノイドを解析した結果、アミロイド斑の形成が認められなかったのに対し、工程（ｃ）を１００日間以上行った脳オルガノイドを解析したところ、多数のアミロイド斑の形成が確認された。
【0032】
工程（ｃ）の少なくとも一部において、培地にＬｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ （ＬＩＦ）を添加することが好ましい。ＬＩＦの添加量は、例えば、５～５０ｎｇ／ｍＬ程度が挙げられる。培地へのＬＩＦの添加は、工程（ｃ）の一部のみで行ってもよいし、工程（ｃ）の全部で行ってもよい。ＬＩＦはヒト由来であってもよく、マウス由来であってもよいが、ヒト由来であることが好ましい。発明者らは、撹拌培養をＬＩＦの存在下で行うことにより、アミロイド斑を有する脳オルガノイドの製造効率が上昇することを明らかにした。
【0033】
工程（ｃ）の少なくとも一部を２０体積％超の酸素の存在下で行うことが好ましい。２０体積％超の酸素とは、通常の空気中の酸素濃度（約２０体積％）よりも高い酸素濃度である。工程（ｃ）における酸素の濃度は、２０体積％超であることが好ましく、例えば３０体積％であってもよく、例えば４０体積％であってもよく、例えば５０体積％であってもよい。発明者らは、撹拌培養を通常より高い酸素濃度下で行うことにより、アミロイド斑を有する脳オルガノイドの製造効率が上昇することを明らかにした。
【0034】
酸素濃度を高くする期間は、例えば、工程（ｃ）の開始後約７日目から培養終了までの期間であってもよく、工程（ｃ）の開始後約１４日目から培養終了までの期間であってもよく、工程（ｃ）の開始後約２１日目から培養終了までの期間であってもよい。
【0035】
［アミロイド斑を有する脳オルガノイド］
１実施形態において、本発明は、直径が２０μｍ以上のアミロイド斑を有する脳オルガノイドを提供する。本実施形態の脳オルガノイドにおいて、アミロイド斑の直径は２０μｍ超であってもよく、２５μｍ以上であってもよく、３０μｍ以上であってもよく、３５μｍ以上であってもよく、４０μｍ以上であってもよい。アミロイド斑の直径は、組織切片を抗アミロイドβ抗体で免疫染色し、アミロイド斑の断面形状を顕微鏡観察することにより測定することができる。アミロイド斑の断面形状が真円でない場合には、アミロイド斑の断面形状と同面積の真円を想定し、その直径をアミロイド班の直径としてもよい。
１実施形態において、本発明は、直径が２０μｍ以上のアミロイド斑を有する脳オルガノイドを提供する。本実施形態の脳オルガノイドにおいて、アミロイド斑の直径は２０μｍ超であってもよく、２５μｍ以上であってもよく、３０μｍ以上であってもよく、３５μｍ以上であってもよく、４０μｍ以上であってもよい。アミロイド斑の直径は、組織切片を抗アミロイドβ抗体で免疫染色し、アミロイド斑の断面形状を顕微鏡観察することにより測定することができる。アミロイド斑の断面形状が真円でない場合には、アミロイド斑の断面形状と同面積の真円を想定し、その直径をアミロイド班の直径としてもよい。
【0036】
本実施形態の脳オルガノイドはヒト由来であることが好ましい。従来、アミロイド斑を有するヒト脳オルガノイドを効率よく作製することは困難であった。これに対し、本実施形態の脳オルガノイドは、効率よく作製することができるため、アルツハイマー病の発症機序を研究したり、予防方法・治療方法を研究するためのモデルとして有用である。本実施形態の脳オルガノイドは、上述した製造方法により製造することができる。
【0037】
本実施形態の脳オルガノイドは、脳オルガノイドの断面において、当該断面の総面積に対する、直径２０μｍ以上のアミロイド斑１つあたりの面積が占める割合の平均が０．１％以上であることが好ましい。
【0038】
本実施形態の脳オルガノイドにおいて、直径２０μｍ以上のアミロイド斑の数は脳オルガノイド１個当たり２個以上であることが好ましい。
【0039】
また、本実施形態の脳オルガノイドは、アミロイドβ４０の発現量に対するアミロイドβ４２の発現量のモル比（アミロイドβ４２の発現量／アミロイドβ４０の発現量）が０．１５以上であることが好ましい。アミロイドβ４０のアミノ酸配列を配列番号１に示し、アミロイドβ４２のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【0040】
アミロイドβ４０の発現量に対するアミロイドβ４２の発現量のモル比は、０．１６以上であることがより好ましく、０．１８以上であることが更に好ましく、０．２以上であることが特に好ましい。
【0041】
上述したいずれかの特徴を有する脳オルガノイドは、アルツハイマー病の病態を反映していると考えられるため、アルツハイマー病のモデルとして有用である。
【0042】
後述するように、本実施形態の脳オルガノイドは、アルツハイマー病の治療薬のスクリーニングに用いることができる。したがって、一実施形態において、本発明は、アミロイド斑を有する脳オルガノイドを含む、アルツハイマー病の治療薬のスクリーニング用キットを提供する。アミロイド斑を有する脳オルガノイドについては、上述したものと同様である。
【0043】
［アルツハイマー病の治療薬のスクリーニング方法］
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で、上述した、アミロイド斑を有する脳オルガノイドを培養する工程と、前記脳オルガノイドのアミロイド斑の大きさを測定する工程とを含み、前記アミロイド斑の大きさが縮小したことが、前記被験物質がアルツハイマー病の治療薬であることを示す、アルツハイマー病の治療薬のスクリーニング方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、被験物質の存在下で、上述した、アミロイド斑を有する脳オルガノイドを培養する工程と、前記脳オルガノイドのアミロイド斑の大きさを測定する工程とを含み、前記アミロイド斑の大きさが縮小したことが、前記被験物質がアルツハイマー病の治療薬であることを示す、アルツハイマー病の治療薬のスクリーニング方法を提供する。
【0044】
被験物質としては特に制限されず、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、代謝物ライブラリ等が挙げられる。
【0045】
アミロイド斑の大きさの測定は、例えば、脳オルガノイドを、抗アミロイドβ抗体を用いた免疫染色に供し、得られた染色画像に基づいて行うことができる。あるいは、脳オルガノイドを、２－（４’－メチルアミノフェニル）ベンゾチアゾール（ＢＴＡ－１）等のアミロイド斑を染色することができる試薬で染色し、得られた染色画像に基づいて行うことができる。
【0046】
被験物質の存在下において、脳オルガノイドのアミロイド斑の大きさが縮小した場合、当該被験物質は、アルツハイマー病の治療薬であるということができる。
【0047】
例えば、被験物質の存在下における脳オルガノイドのアミロイド斑の大きさが、被験物質の非存在下における脳オルガノイドのアミロイド斑の大きさと比較して縮小した場合、当該被験物質は、アルツハイマー病の治療薬であるということができる。
【0048】
あるいは、被験物質の投与後における脳オルガノイドのアミロイド斑の大きさが、被験物質の投与前における脳オルガノイドのアミロイド斑の大きさと比較して縮小した場合、当該被験物質は、アルツハイマー病の治療薬であるということができる。
【0049】
本実施形態のスクリーニング方法により、アルツハイマー病の治療薬をスクリーニングすることができる。本実施形態のスクリーニングにより得られるアルツハイマー病の治療薬は、形成されたアミロイド斑を縮小又は消失させる薬物であるということができる。
【0050】
［アルツハイマー病の予防薬のスクリーニング方法］
１実施形態において、本発明は、アルツハイマー病関連遺伝子に変異を有する多能性幹細胞から、ＳＭＡＤ阻害剤の存在下で胚葉体を形成する工程（ａ）と、工程（ａ）の後の前記胚葉体を細胞外マトリックスに包埋してＳＭＡＤ阻害剤及びＧＳＫ３β阻害剤の存在下で三次元培養し、オルガノイドを形成する工程（ｂ）と、工程（ｂ）の後の前記オルガノイドを前記細胞外マトリックスから取り出して、培地中で撹拌培養し、脳オルガノイドを得る工程であって、少なくとも一部を被験物質の存在下で行う工程（ｃ）と、工程（ｃ）を１００日間以上行った後に前記脳オルガノイドのアミロイド斑の大きさを測定する工程（ｄ）と、を含み、工程（ｄ）において、前記アミロイド斑の大きさが対照と比較して縮小したことが、前記被験物質がアルツハイマー病の予防薬であることを示す、アルツハイマー病の予防薬のスクリーニング方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、アルツハイマー病関連遺伝子に変異を有する多能性幹細胞から、ＳＭＡＤ阻害剤の存在下で胚葉体を形成する工程（ａ）と、工程（ａ）の後の前記胚葉体を細胞外マトリックスに包埋してＳＭＡＤ阻害剤及びＧＳＫ３β阻害剤の存在下で三次元培養し、オルガノイドを形成する工程（ｂ）と、工程（ｂ）の後の前記オルガノイドを前記細胞外マトリックスから取り出して、培地中で撹拌培養し、脳オルガノイドを得る工程であって、少なくとも一部を被験物質の存在下で行う工程（ｃ）と、工程（ｃ）を１００日間以上行った後に前記脳オルガノイドのアミロイド斑の大きさを測定する工程（ｄ）と、を含み、工程（ｄ）において、前記アミロイド斑の大きさが対照と比較して縮小したことが、前記被験物質がアルツハイマー病の予防薬であることを示す、アルツハイマー病の予防薬のスクリーニング方法を提供する。
【0051】
本実施形態のスクリーニング方法において、工程（ａ）及び（ｂ）は、上述した、アミロイド斑を有する脳オルガノイドの製造方法における工程（ａ）及び（ｂ）と同様である。本実施形態のスクリーニング方法において、工程（ｃ）は、上述した、アミロイド斑を有する脳オルガノイドの製造方法における工程（ｃ）と同様であるが、工程（ｃ）の少なくとも一部を被験物質の存在下で行う点において、上述した製造方法と異なっている。
【0052】
被験物質としては、アルツハイマー病の治療薬のスクリーニング方法において上述したものと同様である。
【0053】
本実施形態のスクリーニング方法においては、工程（ｄ）で脳オルガノイドのアミロイド斑の大きさを測定する。アミロイド斑の大きさは、アルツハイマー病の治療薬のスクリーニング方法において上述したものと同様にして測定することができる。
【0054】
工程（ｄ）において、被験物質の存在下で培養した脳オルガノイドのアミロイド斑の大きさが対照と比較して縮小した場合、当該被験物質がアルツハイマー病の予防薬であるということができる。ここで、対照としては、被験物質の非存在下で培養した脳オルガノイド等が挙げられる。
【0055】
本実施形態のスクリーニング方法により、アルツハイマー病の予防薬をスクリーニングすることができる。本実施形態のスクリーニングにより得られるアルツハイマー病の予防薬は、アミロイド斑の形成前に投与することにより、アミロイド斑の形成を抑制又は防止する薬物であるということができる。
【0056】
［アルツハイマー病の予防薬又は治療薬のスクリーニング方法］
１実施形態において、本発明は、アルツハイマー病関連遺伝子に変異を有する多能性幹細胞から、ＳＭＡＤ阻害剤の存在下で胚葉体を形成する工程（ａ）と、工程（ａ）の後の前記胚葉体を細胞外マトリックスに包埋してＳＭＡＤ阻害剤及びＧＳＫ３β阻害剤の存在下で三次元培養し、オルガノイドを形成する工程（ｂ）と、工程（ｂ）の後の前記オルガノイドを前記細胞外マトリックスから取り出して、培地中で撹拌培養し、脳オルガノイドを得る工程であって、少なくとも一部を被験物質の存在下で行う工程（ｃ）と、工程（ｃ）の前記脳オルガノイドによるアミロイドβ４０及びアミロイドβ４２の発現量を定量する工程（ｄ’）とを含み、工程（ｄ’）において、アミロイドβ４０の発現量に対するアミロイドβ４２の発現量の比が対照と比較して低下したことが、前記被験物質がアルツハイマー病の予防薬又は治療薬であることを示す、アルツハイマー病の予防薬又は治療薬のスクリーニング方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、アルツハイマー病関連遺伝子に変異を有する多能性幹細胞から、ＳＭＡＤ阻害剤の存在下で胚葉体を形成する工程（ａ）と、工程（ａ）の後の前記胚葉体を細胞外マトリックスに包埋してＳＭＡＤ阻害剤及びＧＳＫ３β阻害剤の存在下で三次元培養し、オルガノイドを形成する工程（ｂ）と、工程（ｂ）の後の前記オルガノイドを前記細胞外マトリックスから取り出して、培地中で撹拌培養し、脳オルガノイドを得る工程であって、少なくとも一部を被験物質の存在下で行う工程（ｃ）と、工程（ｃ）の前記脳オルガノイドによるアミロイドβ４０及びアミロイドβ４２の発現量を定量する工程（ｄ’）とを含み、工程（ｄ’）において、アミロイドβ４０の発現量に対するアミロイドβ４２の発現量の比が対照と比較して低下したことが、前記被験物質がアルツハイマー病の予防薬又は治療薬であることを示す、アルツハイマー病の予防薬又は治療薬のスクリーニング方法を提供する。
【0057】
本実施形態のスクリーニング方法において、工程（ａ）～（ｃ）は、上述した、アルツハイマー病の予防薬のスクリーニング方法における工程（ａ）～（ｃ）と同様である。また、被験物質としては、アルツハイマー病の治療薬のスクリーニング方法において上述したものと同様である。
【0058】
本実施形態のスクリーニング方法においては、工程（ｄ’）で脳オルガノイドによるアミロイドβ４０及びアミロイドβ４２の発現量を定量する。アミロイドβ４０及びアミロイドβ４２の発現量は、例えば、実施例において後述するものと同様のＥＬＩＳＡ法等により定量すればよい。具体的には、測定対象となる脳オルガノイドを、チューブやマイクロプレートのウェル等に移して、２４～４８時間程度培養し、培地中に分泌されたアミロイドβ４０及びアミロイドβ４２を測定してもよい。
【0059】
工程（ｄ’）において、被験物質の存在下で培養した脳オルガノイドによるアミロイドβ４０の発現量とアミロイドβ４２の発現量の比が、対照と比較して低下した場合、当該被験物質はアルツハイマー病の予防薬又は治療薬であるということができる。ここで、対照としては、被験物質の非存在下で培養した脳オルガノイド等が挙げられる。
【0060】
工程（ｄ’）において、アミロイドβ４０の発現量とアミロイドβ４２の発現量の比は、例えばモル比であってもよい。例えば、被験物質の投与により、モル比（アミロイドβ４２の発現量／アミロイドβ４０の発現量）が０．２未満、例えば０．１５未満に低下した場合、当該被験物質は、アルツハイマー病の予防薬又は治療薬であるということができる。すなわち、本実施形態のスクリーニング方法により、アルツハイマー病の予防薬又は治療薬をスクリーニングすることができる。
【実施例】
【0061】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0062】
［実験例１］
（脳オルガノイドの作製１）
多能性幹細胞を培養し、脳オルガノイドを作製した。多能性幹細胞としては、野生型のヒトｉＰＳ細胞株である、４１４Ｃ２、２０１Ｂ７、ＲＰＣ７７１、野生型のヒトＥＳ細胞株であるＫｈＥＳ１、アルツハイマー病患者由来のヒトｉＰＳ細胞株である、ＰＳ１－２、ＰＳ２－２を使用した。
（脳オルガノイドの作製１）
多能性幹細胞を培養し、脳オルガノイドを作製した。多能性幹細胞としては、野生型のヒトｉＰＳ細胞株である、４１４Ｃ２、２０１Ｂ７、ＲＰＣ７７１、野生型のヒトＥＳ細胞株であるＫｈＥＳ１、アルツハイマー病患者由来のヒトｉＰＳ細胞株である、ＰＳ１－２、ＰＳ２－２を使用した。
【0063】
ＰＳ１－２細胞は、ＰＳ１遺伝子が、ＰＳ１タンパク質の第２４６番目のアミノ酸に、アラニンからグルタミン酸へのアミノ酸変異（Ａ２４６Ｅ）を生じる遺伝子変異を有することが明らかにされている。また、ＰＳ２－２細胞は、ＰＳ２遺伝子が、ＰＳ２タンパク質の第１４１番目のアミノ酸に、アスパラギンからイソロイシンへのアミノ酸変異（Ｎ１４１Ｉ）を生じる遺伝子変異を有することが明らかにされている。
【0064】
図１は、脳オルガノイド作製のスケジュールを示す図である。各多能性幹細胞の培養は、フィーダー細胞を使用しないフィーダーフリーで行った。まず、各細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２を含む培地中で１～３週間培養した。
【0065】
続いて、培養０日目（Ｄａｙ０）において、単一細胞に解離させた各細胞を、２μＭ Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（シグマ社）及び２μＭ Ａ８３－０１（トクリス社）、１０μＭ Ｙ２７６３２（ナカライテスク社）を含み、ＦＧＦ２を含まないｉＰＳ培地（ｉＰＳ Ｍｅｄｉｕｍ）で懸濁し、９６ウェルプレートに播種した。培養１日目（Ｄａｙ１）に、上記の培地からＹ２７６３２を除いた培地を同量追加した。培養３日目（Ｄａｙ３）に半量の培地を交換した。図１中、「Ｄｏｒｓｏ」はＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎを示し、「Ａ８３」はＡ８３－０１を示す。
【0066】
続いて、培養５～６日目（Ｄａｙ５～６）に、培地の半量を誘導培地（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ）に交換した。誘導培地の組成は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＧｌｕｔａＭＡＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、１μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（セラジェンテクノロジー社）、１μＭ ＳＢ－４３１５４２（セラジェンテクノロジー社）、１×Ｎ２サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、１×ＮＥＡＡ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、１×ペニシリン・ストレプトマイシンであった。図１中、「ＣＨＩＲ」はＣＨＩＲ９９０２１を示し、「ＳＢ」はＳＢ－４３１５４２を示す。
【0067】
続いて、培養７日目（Ｄａｙ７）に、各細胞をマトリゲル（ＢＤバイオサイエンス社）に包埋し、誘導培地中で更に６日間培養した。培地は１日置きに半量を交換した。
【0068】
続いて、培養１４日目（Ｄａｙ１４）に、５ｍＬピペットを用いてピペッティングすることにより、マトリゲルを機械的に解離して形成されたオルガノイドを取り出した。続いて、オルガノイドを分化培地（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）に懸濁し、バイオリアクター（エイブル社）に入れて撹拌培養した。分化培地の組成は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＧｌｕｔａＭＡＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、１×Ｎ２サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、１×Ｂ２７サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、２．５μｇ／ｍＬインスリン（シグマ社）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、１×ＮＥＡＡ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、１×ペニシリン・ストレプトマイシン、１０ｎｇ／ｍＬ ＬＩＦ（メルクミリポア社）であった。培地は２～３日置きに交換した。図１中、「Ｎ２」はＮ２サプリメントを示し、「Ｂ２７」はＢ２７サプリメントを示す。
【0069】
培養２８日目（Ｄａｙ２８）から、インキュベーター内の酸素濃度を４０体積％に設定した。
【0070】
培養７１日目（Ｄａｙ７１）から、分化培地を成熟培地（Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）に交換し、撹拌培養を続けた。成熟培地の組成は、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｐｌｕｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、１×Ｂ２７サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、２０ｎｇ／ｍＬ ＢＤＮＦ（ペプロテック社）、２０ｎｇ／ｍＬ ＧＤＮＦ（ペプロテック社）、０．５ｍＭ ｃＡＭＰ（シグマ社）、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、０．２ｍＭアスコルビン酸（シグマ社）、１×Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、１０ｎｇ／ｍＬ ＬＩＦ（メルクミリポア社）であった。培地は２～３日置きに交換した。
【0071】
［実験例２］
（アミロイド斑の検出１）
実験例１で作製した脳オルガノイドにおけるアミロイド斑を検出した。培養１２０日目（Ｄａｙ１２０、撹拌培養を開始してから１０６日目）に、各脳オルガノイドを取り出し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。続いて、固定したオルガノイドを樹脂に包埋し、凍結切片を作製した。
（アミロイド斑の検出１）
実験例１で作製した脳オルガノイドにおけるアミロイド斑を検出した。培養１２０日目（Ｄａｙ１２０、撹拌培養を開始してから１０６日目）に、各脳オルガノイドを取り出し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。続いて、固定したオルガノイドを樹脂に包埋し、凍結切片を作製した。
【0072】
続いて、各凍結切片を抗アミロイドβ抗体（クローン６Ｅ１０、バイオレジェンド社）で免疫染色し、アミロイド斑を検出した。図２（ａ）は、野生型のヒトｉＰＳ細胞株である、４１４Ｃ２から作製した培養１２０日目の脳オルガノイドの結果を示す代表的な写真である。また、図２（ｂ）は、アルツハイマー病患者由来のヒトｉＰＳ細胞株である、ＰＳ１－２から作製した培養１２０日目の脳オルガノイドの結果を示す代表的な写真である。図２（ｂ）中、矢印は直径２０μｍ以上のアミロイド斑を示す。
【0073】
その結果、アルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞から作製した脳オルガノイドでは、再現性よくアミロイド斑が検出されたことが明らかとなった。
【0074】
図３は、各多能性幹細胞から作製した培養１２０日目の脳オルガノイドの切片（断面）において、当該断面の総面積に対する、直径２０μｍ以上のアミロイド斑１つあたりの面積の割合（％）を示すグラフである。４１４Ｃ２、ＫｈＥＳ１、ＰＳ１－２、ＰＳ２－２由来の脳オルガノイドについては３個のオルガノイドを解析した。また、２０１Ｂ７、ＲＰＣ７７１由来の脳オルガノイドについては２個のオルガノイドを解析した。図３中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は対照のｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞由来の脳オルガノイドであることを示し、「ＡＤ」はアルツハイマー病患者由来のｉＰＳ細胞由来の脳オルガノイドであることを示す。また、「＊」は、マン・ホイットニーの検定の結果、ｐ＜０．０５で有意差が存在したことを示す。
【0075】
その結果、ＰＳ１－２、ＰＳ２－２由来の脳オルガノイドの断面において、当該断面の総面積に対する、直径２０μｍ以上のアミロイド斑１つあたりの面積の割合の平均は０．１％以上であった。
【0076】
なお、培養８４日目（Ｄａｙ８４、撹拌培養を開始してから７０日目）に、同様の検討を行った結果、いずれの細胞由来の脳オルガノイドにおいてもアミロイド斑は検出されなかった。したがって、アミロイド斑を形成させるためには、撹拌培養を開始してから１００日間程度以上の培養が必要であることが明らかとなった。
【0077】
［実験例３］
（アミロイド斑の検出２）
抗アミロイドβ抗体の代わりに２－（４’－メチルアミノフェニル）ベンゾチアゾール（ＢＴＡ－１、シグマ社）を用いて、実験例１で作製した脳オルガノイドにおけるアミロイド斑を検出した。ＢＴＡ－１は、チオフラビン－Ｔの誘導体であり、アミロイドβペプチドの沈着物に対して、チオフラビン－Ｔの約５０倍の高い親和性を示す化合物である。
（アミロイド斑の検出２）
抗アミロイドβ抗体の代わりに２－（４’－メチルアミノフェニル）ベンゾチアゾール（ＢＴＡ－１、シグマ社）を用いて、実験例１で作製した脳オルガノイドにおけるアミロイド斑を検出した。ＢＴＡ－１は、チオフラビン－Ｔの誘導体であり、アミロイドβペプチドの沈着物に対して、チオフラビン－Ｔの約５０倍の高い親和性を示す化合物である。
【0078】
培養１２０日目（Ｄａｙ１２０、撹拌培養を開始してから１０６日目）に、各脳オルガノイドを取り出し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。続いて、固定したオルガノイドを樹脂に包埋し、凍結切片を作製した。
【0079】
続いて、各凍結切片をＢＴＡ－１で染色し、アミロイド斑を検出した。また、比較のために、対照のヒト脳組織切片（２６歳）及びアルツハイマー病患者の脳組織切片（７３歳）についても同様にＢＴＡ－１で染色した。
【0080】
図４（ａ）は対照（２６歳）のヒト脳組織の結果を示す代表的な写真である。図４（ｂ）はアルツハイマー病患者（７３歳）の脳組織の結果を示す代表的な写真である。図４（ｃ）は、野生型のヒトｉＰＳ細胞株である、４１４Ｃ２から作製した培養１２０日目の脳オルガノイドの結果を示す代表的な写真である。図４（ｄ）は、アルツハイマー病患者由来のヒトｉＰＳ細胞株である、ＰＳ１－２から作製した培養１２０日目の脳オルガノイドの結果を示す代表的な写真である。図４（ｅ）は、アルツハイマー病患者由来のヒトｉＰＳ細胞株である、ＰＳ２－２から作製した培養１２０日目の脳オルガノイドの結果を示す代表的な写真である。
【0081】
その結果、対照（２６歳）のヒト脳組織、４１４Ｃ２由来の脳オルガノイドには、アミロイド斑は検出されなかった。これに対し、アルツハイマー病患者（７３歳）の脳組織、ＰＳ１－２から作製した培養１２０日目の脳オルガノイド、ＰＳ２－２から作製した培養１２０日目の脳オルガノイドには、アミロイド斑が検出された。
【0082】
［実験例４］
（アミロイドβ４０、アミロイドβ４２の発現量の定量）
実験例１と同様にして作製した脳オルガノイドの培養１２０日目（Ｄａｙ１２０、撹拌培養を開始してから１０６日目）の培養上清中に分泌されたアミロイドβ４０ペプチド及びアミロイドβ４２ペプチドを、それぞれ市販のキット（富士フィルム和光純薬）を使用して、ＥＬＩＳＡ法により定量した。
（アミロイドβ４０、アミロイドβ４２の発現量の定量）
実験例１と同様にして作製した脳オルガノイドの培養１２０日目（Ｄａｙ１２０、撹拌培養を開始してから１０６日目）の培養上清中に分泌されたアミロイドβ４０ペプチド及びアミロイドβ４２ペプチドを、それぞれ市販のキット（富士フィルム和光純薬）を使用して、ＥＬＩＳＡ法により定量した。
【0083】
具体的には、培養１１８日目（Ｄａｙ１１８、撹拌培養を開始してから１０４日目）の脳オルガノイドを４８ウェルプレートの１ウェルに１個ずつ移し、更に２日間培養した。脳オルガノイドとしては、野生型のヒトｉＰＳ細胞株である、４１４Ｃ２、野生型のヒトＥＳ細胞株であるＫｈＥＳ１、アルツハイマー病患者由来のヒトｉＰＳ細胞株である、ＰＳ１－２、ＰＳ２－２から作製した脳オルガノイドを使用した。
【0084】
続いて、培養１２０日目（Ｄａｙ１２０、撹拌培養を開始してから１０６日目）の培養上清中に分泌されたアミロイドβ４０ペプチド及びアミロイドβ４２ペプチドを、それぞれ定量した。
【0085】
図５（ａ）はアミロイドβ４０（Ａβ４０）の定量結果を示すグラフである。また、図５（ｂ）はアミロイドβ４２（Ａβ４２）の定量結果を示すグラフである。また、図５（ｃ）は図５（ａ）及び（ｂ）の結果に基づいて、各脳オルガノイドのアミロイドβ４０の発現量に対するアミロイドβ４２の発現量のモル比（アミロイドβ４２の発現量／アミロイドβ４０の発現量）を算出した結果を示すグラフである。図５（ｃ）中、「＊」は、対応のないＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定の結果、ｐ＜０．０５で有意差が存在したことを示す。
【0086】
その結果、アルツハイマー病患者由来のヒトｉＰＳ細胞株（ＰＳ１－２、ＰＳ２－２）から作製した脳オルガノイドにおける、アミロイドβ４０の発現量に対するアミロイドβ４２の発現量のモル比（アミロイドβ４２の発現量／アミロイドβ４０の発現量）は、対照の脳オルガノイド（４１４Ｃ２、ＫｈＥＳ１）と比較して有意に高いことが明らかとなった。アミロイドβ４０の発現量に対するアミロイドβ４２の発現量のモル比が高いと、アミロイド斑を形成しやすいといわれており、本実験例の結果はこれを支持するものである。
【0087】
［実験例５］
（脳オルガノイドの作製２）
アルツハイマー病患者由来のヒトｉＰＳ細胞株である、ＰＳ１－２、ＰＳ２－２から脳オルガノイドを作製した。培養１日目（Ｄａｙ１）の前に、各細胞を１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２の存在下で１～３週間培養した点以外は実験例１と同様にして脳オルガノイドを作製した。
（脳オルガノイドの作製２）
アルツハイマー病患者由来のヒトｉＰＳ細胞株である、ＰＳ１－２、ＰＳ２－２から脳オルガノイドを作製した。培養１日目（Ｄａｙ１）の前に、各細胞を１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２の存在下で１～３週間培養した点以外は実験例１と同様にして脳オルガノイドを作製した。
【0088】
その結果、１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２の存在下で培養したｉＰＳ細胞を分化誘導すると、１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２の存在下で培養したｉＰＳ細胞を分化誘導した場合と比較して、マトリゲル包埋した後の神経上皮様構造の形成効率が低くなることが明らかとなった。図６（ａ）は１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２の存在下で培養したｉＰＳ細胞を用いて分化誘導を行った、培養１４日目（Ｄａｙ１４）の脳オルガノイドの写真である。図６（ｂ）は、１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２の存在下で培養したｉＰＳ細胞を用いて分化誘導を行なった、培養１４日目（Ｄａｙ１４）の脳オルガノイドの写真である。その結果、図６（ａ）と比較して、図６（ｂ）において、より明瞭な神経上皮様構造が確認された。
【0089】
［実験例６］
（タウタンパク質の表現型の検討）
アルツハイマー病の特徴的な病理変化として、老人斑の沈着と神経原線維変化（Ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅ、ＮＦＴ）、脳萎縮が知られている。ＮＦＴはタウの不溶性凝集体が細胞内に蓄積したものであるため、アルツハイマー病患者由来のヒトｉＰＳ細胞株から作製した脳オルガノイド（ＰＳ１－２、ＰＳ２－２）におけるタウのタンパク質の表現型を免疫染色により解析した。
（タウタンパク質の表現型の検討）
アルツハイマー病の特徴的な病理変化として、老人斑の沈着と神経原線維変化（Ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅ、ＮＦＴ）、脳萎縮が知られている。ＮＦＴはタウの不溶性凝集体が細胞内に蓄積したものであるため、アルツハイマー病患者由来のヒトｉＰＳ細胞株から作製した脳オルガノイド（ＰＳ１－２、ＰＳ２－２）におけるタウのタンパク質の表現型を免疫染色により解析した。
【0090】
《タウタンパク質及びβＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎの免疫染色》
実験例１と同様にして作製した脳オルガノイドを、培養８４日目（Ｄａｙ８４、撹拌培養を開始してから７０日目）に、４％パラホルムアルデヒドで固定した。続いて、固定したオルガノイドをＯ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（ケニス社）に包埋し、凍結切片を作製した。
実験例１と同様にして作製した脳オルガノイドを、培養８４日目（Ｄａｙ８４、撹拌培養を開始してから７０日目）に、４％パラホルムアルデヒドで固定した。続いて、固定したオルガノイドをＯ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（ケニス社）に包埋し、凍結切片を作製した。
【0091】
続いて、各凍結切片を抗タウ抗体（富士フィルム和光純薬工業株式会社、ＤＡＫＯ社）で免疫染色した。また、幼若神経細胞のマーカーであるβＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎの免疫染色も行った。また、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で核の染色も行った。
【0092】
図７（ａ）～（ｃ）は、免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図７（ａ）は、対照として、野生型のヒトｉＰＳ細胞株である、４１４Ｃ２から作製した培養８４日目の脳オルガノイドの結果を示す代表的な写真である。また、図７（ｂ）は、アルツハイマー病患者由来のヒトｉＰＳ細胞株である、ＰＳ１－２から作製した培養８４日目の脳オルガノイドの結果を示す代表的な写真である。また、図７（ｃ）は、アルツハイマー病患者由来のヒトｉＰＳ細胞株である、ＰＳ２－２から作製した培養８４日目の脳オルガノイドの結果を示す代表的な写真である。スケールバーは１００μｍである。また、図７（ａ）～（ｃ）中、「ｉｎｎｅｒ」はオルガノイドの中心部を示し、「ｏｕｔｅｒ」はオルガノイドの外縁部を示す。
【0093】
また、図８（ａ）及び（ｂ）は、図７（ｂ）及び（ｃ）において、オルガノイドの中心部におけるタウタンパク質の染色画像を拡大したものである。スケールバーは２０μｍである。図８（ａ）はＰＳ１－２から作製した脳オルガノイドの結果であり、図８（ｂ）はＰＳ２－２から作製した脳オルガノイドの結果である。
【0094】
その結果、Ｄａｙ８４の脳オルガノイドにおいて、対照（４１４Ｃ２）から作製した脳オルガノイドではオルガノイド全体で一様にタウタンパク質の発現が観察されたのに対し、ＰＳ１－２、ＰＳ２－２から作製した脳オルガノイドでは、脳オルガノイドの内部でタウタンパク質が細胞体に蓄積していることが明らかとなった。
【0095】
《ＭＣ１抗体による免疫染色》
続いて、アルツハイマー病で観察されるタウタンパク質の早期の立体構造変化を認識するＭＣ１抗体（Ｄｒ． Ｐｅｔｅｒ Ｄａｖｉｅｓより供与頂いた。）で免疫染色を行った。また、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で核の染色も行った。図９（ａ）～（ｃ）は、オルガノイドの中心部の免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図９（ａ）は、対照として、野生型のヒトｉＰＳ細胞株である、４１４Ｃ２から作製した培養８４日目の脳オルガノイドの結果を示す代表的な写真である。また、図９（ｂ）は、アルツハイマー病患者由来のヒトｉＰＳ細胞株である、ＰＳ１－２から作製した培養８４日目の脳オルガノイドの結果を示す代表的な写真である。また、図９（ｃ）は、アルツハイマー病患者由来のヒトｉＰＳ細胞株である、ＰＳ２－２から作製した培養８４日目の脳オルガノイドの結果を示す代表的な写真である。スケールバーは２０μｍである。
続いて、アルツハイマー病で観察されるタウタンパク質の早期の立体構造変化を認識するＭＣ１抗体（Ｄｒ． Ｐｅｔｅｒ Ｄａｖｉｅｓより供与頂いた。）で免疫染色を行った。また、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で核の染色も行った。図９（ａ）～（ｃ）は、オルガノイドの中心部の免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図９（ａ）は、対照として、野生型のヒトｉＰＳ細胞株である、４１４Ｃ２から作製した培養８４日目の脳オルガノイドの結果を示す代表的な写真である。また、図９（ｂ）は、アルツハイマー病患者由来のヒトｉＰＳ細胞株である、ＰＳ１－２から作製した培養８４日目の脳オルガノイドの結果を示す代表的な写真である。また、図９（ｃ）は、アルツハイマー病患者由来のヒトｉＰＳ細胞株である、ＰＳ２－２から作製した培養８４日目の脳オルガノイドの結果を示す代表的な写真である。スケールバーは２０μｍである。
【0096】
その結果、ＰＳ１－２、ＰＳ２－２から作製した脳オルガノイドの内部でタウタンパク質の蓄積が観察された細胞は、ＭＣ１抗体により染色されることが明らかとなった。この結果は、これらの細胞では蓄積したタウタンパク質の立体構造変化が起こっていることを示す。
【0097】
《ＭＡＰ２及びＧＦＡＰの免疫染色》
続いて、成熟した神経細胞のマーカーであるＭＡＰ２の免疫染色を行った。また、アストロサイトのマーカーであるＧＦＡＰの免疫染色も行った。また、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で核の染色も行った。
続いて、成熟した神経細胞のマーカーであるＭＡＰ２の免疫染色を行った。また、アストロサイトのマーカーであるＧＦＡＰの免疫染色も行った。また、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で核の染色も行った。
【0098】
図１０（ａ）～（ｃ）は、免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１０（ａ）は、対照として、野生型のヒトｉＰＳ細胞株である、４１４Ｃ２から作製した培養８４日目の脳オルガノイドの結果を示す代表的な写真である。また、図１０（ｂ）は、アルツハイマー病患者由来のヒトｉＰＳ細胞株である、ＰＳ１－２から作製した培養８４日目の脳オルガノイドの結果を示す代表的な写真である。また、図１０（ｃ）は、アルツハイマー病患者由来のヒトｉＰＳ細胞株である、ＰＳ２－２から作製した培養８４日目の脳オルガノイドの結果を示す代表的な写真である。スケールバーは２０μｍである。
【0099】
その結果、脳オルガノイド内部の神経細胞では、成熟した神経細胞のマーカーであるＭＡＰ２が細胞体に蓄積していることが明らかとなった。
【0100】
《ＢＴＡ－１による染色》
続いて、チオフラビン－Ｔの誘導体であるＢＴＡ－１（シグマ社）を用いて、ＰＳ２－２から作製した培養８４日目の脳オルガノイドの凍結切片を染色した。また、比較のために、健常者の脳の組織切片及びアルツハイマー病患者の脳の組織切片もＢＴＡ－１で染色した。
続いて、チオフラビン－Ｔの誘導体であるＢＴＡ－１（シグマ社）を用いて、ＰＳ２－２から作製した培養８４日目の脳オルガノイドの凍結切片を染色した。また、比較のために、健常者の脳の組織切片及びアルツハイマー病患者の脳の組織切片もＢＴＡ－１で染色した。
【0101】
図１１（ａ）～（ｃ）は、染色結果を示す蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは５０μｍである。図１１（ａ）は健常者の脳の代表的な結果であり、図１１（ｂ）はアルツハイマー病患者の脳の代表的な結果であり、図１１（ｃ）はＰＳ２－２から作製した培養８４日目の脳オルガノイドの代表的な結果である。
【0102】
その結果、ＰＳ２－２から作製した培養８４日目の脳オルガノイドは、アルツハイマー病患者の脳と同様にＢＴＡ－１で染色されることが明らかとなった。
【0103】
《タウタンパク質及びリン酸化タウタンパク質のウエスタンブロッティング》
続いて、ＰＳ１－２から作製した培養８４日目の脳オルガノイドの抽出物をウエスタンブロッティングにより解析し、タウタンパク質及びリン酸化タウタンパク質を検出した。また、対照として、野生型のヒトｉＰＳ細胞株である、４１４Ｃ２から作製した培養８４日目の脳オルガノイドの抽出物を同様にして解析した。
続いて、ＰＳ１－２から作製した培養８４日目の脳オルガノイドの抽出物をウエスタンブロッティングにより解析し、タウタンパク質及びリン酸化タウタンパク質を検出した。また、対照として、野生型のヒトｉＰＳ細胞株である、４１４Ｃ２から作製した培養８４日目の脳オルガノイドの抽出物を同様にして解析した。
【0104】
図１２（ａ）～（ｃ）は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図１２（ａ）は、図１２（ｂ）及び（ｃ）をマージした結果である。図１２（ｂ）は全タウタンパク質を検出した結果である。図１２（ｃ）はリン酸化タウタンパク質を検出した結果である。また、図１２（ｄ）は、図１２（ｂ）及び（ｃ）に基づいて、全タウタンパク質に対するリン酸化タウタンパク質の割合を算出した結果を示すグラフである。
【0105】
その結果、アルツハイマー病患者由来のヒトｉＰＳ細胞株である、ＰＳ１－２から作製した培養８４日目の脳オルガノイドでは、対照と比較して、全タウタンパク質中のリン酸化タウタンパク質の割合が高いことが明らかとなった。
【0106】
《ＨｕＣ／Ｄ及びＣＴＩＰ２の免疫染色》
続いて、培養８４日目の脳オルガノイドの中心部で見られる、タウタンパク質が細胞質に蓄積している細胞について、神経細胞マーカーであるＨｕＣ／Ｄと、神経細胞の層マーカーであるＣＴＩＰ２を免疫染色した。
続いて、培養８４日目の脳オルガノイドの中心部で見られる、タウタンパク質が細胞質に蓄積している細胞について、神経細胞マーカーであるＨｕＣ／Ｄと、神経細胞の層マーカーであるＣＴＩＰ２を免疫染色した。
【0107】
図１３（ａ）及び（ｂ）は、タウタンパク質及びＨｕＣ／Ｄの免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。対照として、野生型のヒトｉＰＳ細胞株である、４１４Ｃ２から作製した培養８４日目の脳オルガノイドについても同様に免疫染色を行った。スケールバーは２０μｍである。
【0108】
また、図１４（ａ）は、ＰＳ１－２から作製した培養８４日目の脳オルガノイドにおけるタウタンパク質及びＣＴＩＰ２の免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１４（ａ）中、「ｉｎｎｅｒ」はオルガノイドの中心部を示し、「ｏｕｔｅｒ」はオルガノイドの外縁部を示す。スケールバーは１００μｍである。また、図１４（ｂ）は、それぞれ、図１４（ａ）におけるオルガノイドの中心部の染色画像を拡大したものである。スケールバーは２０μｍである。
【0109】
その結果、第５層神経細胞のマーカーであるＣＴＩＰ２陽性の細胞は、脳オルガノイドの中心部で観察され、その一部では細胞質へのタウタンパク質の蓄積が見られた。この結果から、第５層神経細胞の一部において、細胞質へのタウタンパク質の蓄積が見られることが明らかとなった。
【0110】
《タウタンパク質及びＳｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎの免疫染色》
続いて、アルツハイマー病患者由来のヒトｉＰＳ細胞株である、ＰＳ２－２から作製した培養８４日目の脳オルガノイドにおけるタウタンパク質及びＳｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎの免疫染色を行った。
続いて、アルツハイマー病患者由来のヒトｉＰＳ細胞株である、ＰＳ２－２から作製した培養８４日目の脳オルガノイドにおけるタウタンパク質及びＳｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎの免疫染色を行った。
【0111】
図１５（ａ）～（ｃ）は、免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１５（ａ）中、「ｉｎｎｅｒ」はオルガノイドの中心部を示し、「ｏｕｔｅｒ」はオルガノイドの外縁部を示す。スケールバーは１００μｍである。また、図１５（ｂ）は、図１５（ａ）のオルガノイドの外縁部の染色画像を拡大したものである。スケールバーは１０μｍである。また、図１５（ｃ）は、図１５（ａ）のオルガノイドの中心部の染色画像を拡大したものである。スケールバーは１０μｍである。
【0112】
その結果、脳オルガノイドの外縁部と中心部で、Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎが検出された。顕微鏡写真を拡大すると、外縁部では神経突起に沿って多くのｐｕｎｃｔａが観察されたが、中心部では、Ｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎが凝集したような染色像が得られた。脳オルガノイドの中心部ではタウタンパク質が神経細胞の細胞質に溜まり、神経突起の形成に異常が生じ、行き場を失ったＳｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎが凝集したものと考えられた。
【0113】
《タウタンパク質及びｇａｍｍａＨ２Ａ．Ｘの免疫染色》
続いて、アルツハイマー病患者由来のヒトｉＰＳ細胞株である、ＰＳ２－２から作製した培養８４日目の脳オルガノイドにおけるタウタンパク質及び老化マーカーであるｇａｍｍａＨ２Ａ．Ｘの免疫染色を行った。
続いて、アルツハイマー病患者由来のヒトｉＰＳ細胞株である、ＰＳ２－２から作製した培養８４日目の脳オルガノイドにおけるタウタンパク質及び老化マーカーであるｇａｍｍａＨ２Ａ．Ｘの免疫染色を行った。
【0114】
図１６（ａ）～（ｃ）は、免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１６（ａ）中、「ｉｎｎｅｒ」はオルガノイドの中心部を示し、「ｏｕｔｅｒ」はオルガノイドの外縁部を示す。スケールバーは１００μｍである。また、図１６（ｂ）は、図１６（ａ）のオルガノイドの外縁部の染色画像を拡大したものである。スケールバーは１０μｍである。また、図１６（ｃ）は、図１６（ａ）のオルガノイドの中心部の染色画像を拡大したものである。スケールバーは１０μｍである。
【0115】
その結果、脳オルガノイドの中心部でｇａｍｍａＨ２Ａ．Ｘが検出された。顕微鏡写真を拡大すると、外縁部にはｇａｍｍａＨ２Ａ．Ｘがほとんど存在しないが、中心部のタウタンパク質が蓄積した神経細胞でｇａｍｍａＨ２Ａ．Ｘが検出された。この結果は、脳オルガノイドの中心部の細胞で細胞老化現象が起きている可能性を示す。
【0116】
《タウタンパク質及びＢＮＩＰ３の免疫染色》
続いて、アルツハイマー病患者由来のヒトｉＰＳ細胞株である、ＰＳ２－２から作製した培養８４日目の脳オルガノイドにおけるタウタンパク質及び低酸素マーカーであるＢＮＩＰ３の免疫染色を行った。
続いて、アルツハイマー病患者由来のヒトｉＰＳ細胞株である、ＰＳ２－２から作製した培養８４日目の脳オルガノイドにおけるタウタンパク質及び低酸素マーカーであるＢＮＩＰ３の免疫染色を行った。
【0117】
図１７（ａ）及び（ｂ）は、免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１７（ａ）中、「ｉｎｎｅｒ」はオルガノイドの中心部を示し、「ｏｕｔｅｒ」はオルガノイドの外縁部を示す。スケールバーは１００μｍである。また、図１６（ｂ）は、図１６（ａ）のオルガノイドの中心部の染色画像を拡大したものである。スケールバーは５μｍである。
【0118】
その結果、脳オルガノイドの中心部でＢＮＩＰ３が検出され、低酸素状態となっていることが示唆された。顕微鏡写真を拡大すると、タウタンパク質が蓄積した細胞の一部で、ＢＮＩＰ３の発現が見られた。ＢＮＩＰ３はミトコンドリア外膜に存在し、ミトコンドリア オートファジー（マイトファジー）への関与が報告されている。したがって、これらの細胞ではミトコンドリアの集積や異常が起きている可能性が示唆された。
【0119】
［実験例７］
（リン酸化タウタンパク質の検出）
実験例１で作製した脳オルガノイドにおけるリン酸化タウタンパク質を検出した。培養１２０日目（Ｄａｙ１２０、撹拌培養を開始してから１０６日目）に、各脳オルガノイドを取り出し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。続いて、固定したオルガノイドをＯ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（ケニス社）に包埋し、凍結切片を作製した。
（リン酸化タウタンパク質の検出）
実験例１で作製した脳オルガノイドにおけるリン酸化タウタンパク質を検出した。培養１２０日目（Ｄａｙ１２０、撹拌培養を開始してから１０６日目）に、各脳オルガノイドを取り出し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。続いて、固定したオルガノイドをＯ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（ケニス社）に包埋し、凍結切片を作製した。
【0120】
続いて、各凍結切片を抗リン酸化タウ抗体（クローンＡＴ８、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で免疫染色し、リン酸化タウタンパク質を検出した。また、神経細胞マーカーであるＨｕＣ／Ｄ、アストロサイトマーカーであるＧＦＡＰの免疫染色も行った。また、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で核の染色も行った。
【0121】
図１８（ａ）～（ｃ）は、免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１８（ａ）は、野生型のヒトｉＰＳ細胞株である、４１４Ｃ２から作製した培養１２０日目の脳オルガノイドの結果を示す代表的な写真である。また、図１８（ｂ）は、アルツハイマー病患者由来のヒトｉＰＳ細胞株である、ＰＳ１－２から作製した培養１２０日目の脳オルガノイドの結果を示す代表的な写真である。また、図１８（ｃ）は、アルツハイマー病患者由来のヒトｉＰＳ細胞株である、ＰＳ２－２から作製した培養１２０日目の脳オルガノイドの結果を示す代表的な写真である。スケールバーは５０μｍである。その結果、各脳オルガノイドにおいてリン酸化タウタンパク質の存在が観察された。
【0122】
［実験例８］
（立体構造が変化したタウタンパク質の存在の検討）
実験例１で作製した脳オルガノイドにおける、立体構造が変化したタウタンパク質を検出した。培養１２０日目（Ｄａｙ１２０、撹拌培養を開始してから１０６日目）に、各脳オルガノイドを取り出し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。続いて、固定したオルガノイドをＯ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（ケニス社）に包埋し、凍結切片を作製した。
（立体構造が変化したタウタンパク質の存在の検討）
実験例１で作製した脳オルガノイドにおける、立体構造が変化したタウタンパク質を検出した。培養１２０日目（Ｄａｙ１２０、撹拌培養を開始してから１０６日目）に、各脳オルガノイドを取り出し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。続いて、固定したオルガノイドをＯ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（ケニス社）に包埋し、凍結切片を作製した。
【0123】
続いて、各凍結切片を立体構造が変化したタウタンパク質を認識することが知られているＭＣ１抗体（Ｄｒ． Ｐｅｔｅｒ Ｄａｖｉｅｓより供与頂いた。）で免疫染色した。また、神経細胞マーカーであるＨｕＣ／Ｄ、アストロサイトマーカーであるＧＦＡＰの免疫染色も行った。また、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で核の染色も行った。
【0124】
図１９（ａ）～（ｃ）は、免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１９（ａ）は、対照として、野生型のヒトｉＰＳ細胞株である、４１４Ｃ２から作製した培養１２０日目の脳オルガノイドの結果を示す代表的な写真である。また、図１９（ｂ）は、アルツハイマー病患者由来のヒトｉＰＳ細胞株である、ＰＳ１－２から作製した培養１２０日目の脳オルガノイドの結果を示す代表的な写真である。また、図１９（ｃ）は、アルツハイマー病患者由来のヒトｉＰＳ細胞株である、ＰＳ２－２から作製した培養１２０日目の脳オルガノイドの結果を示す代表的な写真である。スケールバーは５０μｍである。
【0125】
その結果、アルツハイマー病患者由来のヒトｉＰＳ細胞株である、ＰＳ１－２、ＰＳ２－２由来の脳オルガノイド中のアストロサイトにおいて、立体構造が変化したタウタンパク質の存在を示すＭＣ１陽性細胞が、対照である４１４Ｃ２由来の脳オルガノイドよりも多く観察された。
【産業上の利用可能性】
【0126】
本発明によれば、アミロイド斑を有する脳オルガノイドを効率よく形成する技術を提供することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【配列表】