特許 7541998 血流依存性血管拡張反応を増強することによって内皮機能を改善するために使用するための組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-08-21

(45)【発行日】2024-08-29

(54)【発明の名称】血流依存性血管拡張反応を増強することによって内皮機能を改善するために使用するための組成物

(51)【国際特許分類】

   A23L 33/105 20160101AFI20240822BHJP

   A23F 5/02 20060101ALI20240822BHJP

   A23F 5/24 20060101ALI20240822BHJP

   A61K 36/74 20060101ALI20240822BHJP

   A61K 31/192 20060101ALI20240822BHJP

   A61P 9/08 20060101ALI20240822BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240822BHJP

   A61K 131/00 20060101ALN20240822BHJP

【ＦＩ】

A23L33/105 ZNA

A23F5/02

A23F5/24

A61K36/74

A61K31/192

A61P9/08

A61P43/00 121

A61K131:00

【請求項の数】 15

(21)【出願番号】P 2021558754

(86)(22)【出願日】2020-04-08

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-06-06

(86)【国際出願番号】 EP2020060092

(87)【国際公開番号】W WO2020208108

(87)【国際公開日】2020-10-15

【審査請求日】2023-04-06

(31)【優先権主張番号】19168455.4

(32)【優先日】2019-04-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】590002013

【氏名又は名称】ソシエテ・デ・プロデュイ・ネスレ・エス・アー

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100140453

【弁理士】

【氏名又は名称】戸津 洋介

(72)【発明者】

【氏名】アクティス ゴレッタ， ルーカス

(72)【発明者】

【氏名】ベル‐リリッド， ラシッド

【審査官】戸来 幸男

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１１－５１８５６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１１－５２０４２９（ＪＰ，Ａ）

【文献】Int. J. Food Sci. Nutri.，2019年03月25日，vol.70, no.7，pp.901-908

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ２３Ｌ ３３／００－３３／２９

Ａ２３Ｆ ５／００－５／５０

Ａ６１Ｐ ９／００－９／１４

ＦＳＴＡ／ＣＡｐｌｕｓ／ＡＧＲＩＣＯＬＡ／ＢＩＯＳＩＳ／

ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

Ｇｏｏｇｌｅ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象において測定される血流依存性血管拡張反応（ＦＭＤ）の変化によって測定されるものとして、健康な対象における心血流を改善し、心血管疾患のリスクを低減する方法で使用するための、エステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物（ＨＤＧＣＥ）を含む組成物であって、前記対象には、１００～４００ｍｇ／日の量の有効量の前記組成物が投与される、組成物。

【請求項2】

前記組成物が、機能性食品製品の形態である、請求項１に記載の使用のための組成物。

【請求項3】

前記組成物が、少なくとも２：１よりも大きい、コーヒー酸：フェルラ酸の比を含む、請求項１又は２に記載の使用のための組成物。

【請求項4】

前記組成物が、３：１～１０：１の範囲の、コーヒー酸：フェルラ酸の比を有する、請求項３に記載の使用のための組成物。

【請求項5】

前記組成物が、３０～８０ｍｇのコーヒー酸とフェルラ酸との総含有量を有し、前記組成物が、熱処理された組成物である、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項6】

前記組成物が、３５～６０ｍｇのコーヒー酸とフェルラ酸との総含有量を有し、前記組成物が、熱処理された組成物である、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項7】

前記組成物が、液体飲料組成物である、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項8】

前記対象が、ＨＤＧＣＥの投与に加えて、少なくとも２００ｋｃａｌの食事を更に補充される、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項9】

前記対象が、ヒトである、請求項１～８のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項10】

前記心血管疾患が、内皮機能不全である、請求項１～９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

【請求項11】

（ｉ）コーヒー生豆抽出物を、水、蒸気、有機溶媒、超臨界ＣＯ_２及び／又はこれらの混合物と接触させることによって、脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物を調製する工程と、
（ｉｉｉ）前記得られた脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物を、４～７の範囲のｐＨ及び２０～５０℃の範囲の温度で、１～６時間の範囲のインキュベーション時間で、エステラーゼ酵素と接触させる工程と、
（ｉｖ）前記酵素処理されたコーヒー生豆抽出物を、８０～１２０℃の範囲の温度で１～３０分間加熱して、前記酵素を不活性化させ、前記抽出物を低温殺菌する工程と、
を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物を調製するための方法。

【請求項12】

前記工程（ｉ）と前記工程（ｉｉｉ）との間に、（ｉｉ）前記脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物を乾燥させる工程を更に含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記乾燥工程（ｉｉ）が、噴霧乾燥又は凍結乾燥である、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記工程（ｉｖ）の後に、（ｖ）前記抽出物を乾燥させて、前記エステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物（ＨＤＧＣＥ）を得る工程を更に含む、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記エステラーゼ酵素が、１ｍＬの水又は緩衝液中に溶解されたコーヒー生豆抽出物２００ｍｇあたり１～２０Ｕ範囲のＷ／Ｗ濃度のクロロゲネートエステラーゼである、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、対象における血流依存性血管拡張反応を増強することによって内皮機能などの心血管エンドポイントを改善する方法で使用するための、エステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物（ＨＤＧＣＥ）を含む組成物であって、対象は、１００～４００ｍｇ／日の量の有効量のＨＤＧＣＥを投与される、組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

クロロゲン酸は、トランス－ケイ皮酸とキナ酸との間に形成されるエステルのファミリーである。クロロゲン酸は、主に、キナ酸と、様々な位置に結合したフェノール基（例えば、コーヒー酸、フェルラ酸、クマリン酸、メトキシケイ皮酸のフェノール基）とのモノ及びジ－エステルとしてコーヒー中に天然に存在する。

【0003】

米国特許第８，４８１，０２８号は、カフェオイルキナ酸及びジエステル（例えば、３－カフェオイルキナ酸及びジエステル、４－カフェオイルキナ酸及びジエステル、又は５－カフェオイルキナ酸及びジエステル）並びに／又はフェルロイルキナ酸及びジエステル（例えば、３－フェルロイルキナ酸及びジエステル、４－フェルロイルキナ酸及びジエステル、又は５－フェルロイルキナ酸及びジエステル）を加水分解することができる微生物及び／又は酵素を使用して、加水分解されたクロロゲン酸を得て、コーヒー酸及びフェルラ酸をそれぞれ生成する方法を記載している。

【0004】

内皮とは、血管及びリンパ管の内面を裏打ちし、内腔の循環血又はリンパ液と、血管壁の内皮以外の部分との間に界面を形成する細胞を指す。内皮は多くの血管機能を調節し、血流の仕組み及び凝固の調節において重要な役割を果たす。健康な内皮を有する健康な動脈では、血流が増加した場合に血管は弛緩することができる。内皮機能障害を有する対象は、心血管疾患をより発症しやすいこと（例えば、内皮の損傷は、アテローム性動脈硬化プラーク、並びに脳血管疾患につながる可能性がある）が観察されている。血管機能不全は、血管内の血流依存性血管拡張反応（ＦＭＤ）を測定することによって監視することができる。

【0005】

Ｍｉｌｌｓら（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ３６（２０１７）１５２０－１５２９）は、コーヒーがクロロゲン酸及びその代謝産物により誘導する調節により、ヒトの血管機能が改善されることを報告している。この論文では、著者らは、４５０ｍｇ及び９００ｍｇの高純度５－ＣＱＡが、２４人の対象において有意な効果を示さなかったことを報告している。

【0006】

コーヒー及び／又はコーヒー成分を用いて内皮機能不全マーカーを評価する研究は数少ない。興味深いことにこれらの研究のほとんどは、血管の健康に有益な効果を示している。Ｍｉｌｌｓらによって実証されたとおり（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ３６（２０１７）１５２０－１５２９）、観察された効果は、低クロロゲン酸レベルのコーヒーではなく高クロロゲン酸レベルで最も顕著である。

【0007】

最近の研究（Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｂｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ ４２（３）（２０１６）２５９－６７）では、様々な焙煎条件によりコーヒーを投与した後のヒトにおけるコーヒーのクロロゲン酸及びフェノール酸の吸収及び代謝について、詳細な報告がなされている。更に、腸管吸収の重要性を評価する目的で、酵素加水分解後に高レベルの遊離フェノール酸を含有する未焙煎のコーヒーも試験飲料として使用されている。酵素により加水分解した未焙煎コーヒーは、固定したラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（Ｌａ１，ＮＣＣ５３３））エステラーゼ酵素を有するビーズを含有するカラムに、未焙煎コーヒーの抽出物を通すことによって製造した。

【0008】

本発明の目的は、最先端技術を改善し、対象における血流依存性血管拡張反応を増強することによって、内皮機能などの心血管エンドポイントを改善するための、新規でより良好な栄養学的解決策を提供することである。

【0009】

［発明の概要］
したがって、本発明の第１の態様によれば、血管機能の改善により、結果として心臓疾患及び脳血管疾患を改善する方法であって、有効量のエステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物（ＨＤＧＣＥ）組成物を対象に投与する工程を含み、前記組成物の前記有効量は、加水分解されたコーヒー生豆抽出物の量が１００～４００ｍｇ／日となる量である、方法が提供される。但し、本態様が、本発明の最も広い態様である必要はなく、また実際に唯一の態様である必要もない。

【0010】

一実施形態では、組成物は、少なくとも２：１を超えるコーヒー酸：フェルラ酸の比を含む。別の実施形態では、組成物は、３：１～１０：１の範囲にあるコーヒー酸：フェルラ酸の比を含む。

【0011】

本発明者らは、驚くべきことに、ＨＤＧＣＥ（１７３．１ｍｇのＨＤＧＣＥ用量）を含む組成物の摂取により、プラセボ処置と比較して、１時間（ｐ値＝０．０３６）及び６時間（ｐ値＝０．０１７６０８）の時点でＦＭＤが有意に増加することを見出した。これらの時点におけるＦＭＤの増加は、ＦＭＤの１％単位よりも高かった。内皮機能不全の改善（血流依存性血管拡張反応の値の１％）により、心血管イベントのリスクが１３％低下することが判明している（Ｉｎａｂａ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓ Ｉｍａｇｉｎｇ ２６：６２１－６４０）。

【0012】

一態様では、本発明は、対象において測定される血流依存性血管拡張反応（ＦＭＤ）の変化によって測定されるものとして、健康な対象における心血流を改善し、心血管疾患のリスクを低減する方法で使用するための、エステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物（ＨＤＧＣＥ）を含む組成物であって、対象には１００～４００ｍｇ／日の量の有効量の組成物が投与される、組成物に関する。

【0013】

なお更なる態様では、本発明は、エステラーゼ処理された脱カフェイン処理後コーヒー抽出物（ＨＤＧＣＥ）を含む組成物を調製するための方法であって、
コーヒー生豆抽出物を水、蒸気、有機溶媒、超臨界ＣＯ_２、及び／又はこれらの混合物と接触させることによって、脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物を調製する工程と、
任意選択的に、脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物を乾燥させる、好ましくは噴霧乾燥又は凍結乾燥させる工程と、
得られた脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物を、ｐＨ４～７及び２０～５０℃の範囲の温度で、１～６時間の範囲のインキュベーション時間にわたり、エステラーゼ酵素と接触させる工程であって、前記エステラーゼ酵素が、好ましくは１ｍＬの水又は緩衝液に溶解した、好ましくはコーヒー生豆抽出物２００ｍｇあたり１～２０Ｕ範囲のＷ／Ｗ濃度の好ましくはクロロゲネートエステラーゼである、接触させる工程と、
上記の酵素処理したコーヒー生豆抽出物を、８０～１２０℃の範囲の温度で１～３０分間加熱して、酵素を不活性化させ、抽出物を低温殺菌する工程と、
任意選択的に、抽出物を乾燥させて、エステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物（ＨＤＧＣＥ）を得る工程と、を含む、ＨＤＧＣＥを製造するための方法に関する。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】約３４ＫＤａの分子量（Ｍｗ）を有するラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）由来の精製エステラーゼを示す。

【図2】ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）エステラーゼ活性に対するｐＨの影響を示す。

【図3】ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）エステラーゼ活性に対するｐＨの影響を示す。

【図4】ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）エステラーゼの基質特異性を示す。４－ニトロフェニルブチレート（黒丸）、４－ニトロフェニルアセテート（黒ひし形）、４－ニトロフェニルデカノエート（黒三角）、４－ニトロフェニルテトラデカノエート（黒四角）、４－ニトロフェニルドデカノエート（横棒）。

【図5】時間経過に対応させて、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）エステラーゼ（１６．５Ｕ／ｍＬ）による、脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物（２００ｇ／Ｌ）からの、ＣＱＡｓ（黒丸）、ＦＱＡｓ（黒四角）、及びジ－ＣＱＡｓ（横棒）の変換速度（Ｋｉｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、並びにコーヒー酸（黒三角）及びフェルラ酸（黒ひし形）の形成を示す。反応体積は１ｍＬとした。反応は２連で実施した。

【発明を実施するための形態】

【0015】

心血管疾患という用語は、例えば、冠動脈疾患（冠動脈性心疾患及び虚血性心疾患としても知られる）、末梢動脈疾患（例えば、末梢内皮機能不全）、腎動脈狭窄、及び大動脈瘤、アテローム性動脈硬化性プラーク形成を含み得る。心臓、例えば、心筋症、高血圧性心疾患、心不全、肺性心、不整脈、心内膜炎を伴う多くの心血管疾患も存在する。最も一般的に関与する構造は、心臓弁、炎症性心臓肥大、心筋炎、ある特定の薬物療法、毒素、及び自己免疫疾患、好酸球性心筋炎、心臓弁膜症、先天性心疾患、及びリウマチ性心疾患である。好ましくは、心血管疾患は、アテローム性動脈硬化性プラーク形成、冠動脈疾患、及び内皮機能不全から選択され、好ましくは内皮機能不全である。より好ましくは、心血管疾患は、内皮機能不全であり、好ましくは末梢内皮機能不全である。

【0016】

脳血管疾患は、脳の血管及び脳循環に影響を及ぼす様々な医学的状態を含む。脳に酸素及び栄養素を供給する動脈は、これらの障害において損傷又は変形していることが多い。脳血管疾患の最も一般的な症状は、虚血性脳卒中又はミニ脳卒中であり、出血性脳卒中である場合もある。高血圧症（高血圧）は、血管の構造を変化させ、アテローム性動脈硬化症を引き起こす可能性があるため、脳卒中及び脳血管疾患の最も重要な原因となるリスク因子である。アテローム性動脈硬化症は、脳内の血管を狭くし、脳灌流の減少をもたらす。脳卒中に関与する他のリスク因子としては、喫煙及び糖尿病が挙げられる。脳動脈が狭窄すると、虚血性脳卒中となる恐れがある他、血圧の上昇が継続すると、血管が断裂して出血性脳卒中につながる場合がある。好ましくは、脳血管疾患は、虚血性脳卒中、ミニ脳卒中、及び出血性脳卒中から選択される。

【0017】

「機能性食品製品」という用語は、加水分解処理後コーヒー生豆抽出物の量を１００～４００ｍｇの範囲にしてＨＤＧＣＥ組成物を含む、飲料又は食品組成物を意味する。食品組成物は、チョコレート又は麦芽ベースの組成物などの粉末形態であり得る。食品組成物はまた、ＨＤＧＣＥを含むシリアルバーなどのスナックでもあり得る。

【0018】

用語「エステラーゼ処理された」は、脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物を、精製されたクロロゲネートエステラーゼ又はこのようなエステラーゼを含有する微生物と共にインキュベーションすることを指す。例えば、クロロゲネートエステラーゼは、米国特許第８，４８１，０２８号、又は、例えば、Ｂｅｌ－Ｒｈｌｉｄ ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｔｒａｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｆｆｅｏｙｌ ｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄｓ ｆｒｏｍ ｇｒｅｅｎ ｃｏｆｆｅｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｂｙ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ ＮＣＣ ５３３（２０１３）：ＡＭＢ ｅｘｐｒｅｓｓ ｖｏｌ ３：２８に記載されている。

【0019】

エステラーゼは、水との、加水分解と呼ばれる化学反応により、エステルを酸及びアルコールへと分解する加水分解酵素である。インキュベーション時間は、脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物中に存在するクロロゲン酸全体の少なくとも８０％で加水分解が達成されるよう、酵素の濃度を参照して２０～５０℃の範囲の温度で３０分～６時間とすることができる。一実施形態では、エステラーゼは、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）由来である。

【0020】

用語「脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物／脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物」は、例えば、熱湯により、又は当業者に良く知られている有機溶媒若しくは超臨界ＣＯ_２を用いた抽出により脱カフェイン処理したコーヒー生豆を指す。カフェイン含有量は５％Ｗ／Ｗ未満であり、２～３％Ｗ／Ｗであり得る。

【0021】

用語「１００～４００ｍｇ／日の量」は、乾燥重量１００～４００ｍｇの、エステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物を指し、この量の抽出物は、例えば、水に溶解させることができ、あるいは摂取可能な食品製品に、例えば、シリアル、可溶性コーヒー、チョコレート、若しくは食事を補完するもの（ｆｏｏｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）、例えば、対象による摂取に適したカプセル若しくは錠剤に、組み込むことができる。一実施形態では、エステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物は、乾燥重量で１００～４００ｍｇの量が、約２００ｍＬの水に溶解される。

【0022】

用語「血流依存性血管拡張反応の変化によって測定される」は、プラセボを投与した対象（ＨＤＧＣＥを有しない組成物を投与した対象）と、活性組成物を投与した対象（１００～４００ｍｇ／日のＨＤＧＣＥを含む組成物）との間のデルタＦＭＤ値の変化を指している。一実施形態では、その変化は、ｐ値０．０２未満で少なくとも１％である。

【0023】

一実施形態では、当該ＨＤＧＣＥ組成物中のコーヒー酸とフェルラ酸との総含有量は、３０～８０ｍｇであり、組成物は熱処理後の組成物であってもよい。別の実施形態では、当該ＨＤＧＣＥ組成物中のコーヒー酸とフェルラ酸との総含有量は、３５～６０ｍｇであり、組成物は熱処理後の組成物であってもよい。

【0024】

本発明により使用するための組成物は、任意の好適なフォーマットであってよく、例えば、組成物は、液体組成物の形態、飲料の形態、例えば、液体飲料、シェイクドリンク、栄養組成物又は置換用流動食の形態であり得る。

【0025】

食品の衛生リスクを管理する重要な方法は、食物病原体又は腐敗生物が潜んでいる可能性のある食用組成物を熱処理することである。このような熱処理の良く知られている例には、例えば食用材料を、７０℃に２分間、又は７５℃に２６秒間、又は８０℃に５秒間加熱する低温殺菌、並びに例えば、食用材料を１３５℃超に少なくとも２秒間加熱する超高温（ＵＨＴ）処理がある。

【0026】

本発明により使用するための組成物は、個体に対し１日あたり乾燥重量で１００ｍｇ～４００ｍｇのＨＤＧＣＥを提供する１日用量で投与することができる。この用量は、少なくとも中期間の間、所望の効果を確実に提供するのに十分な１日用量であるべきである。一実施形態では、対象は、組成物が投与されるときに空腹である。

【0027】

本発明の更なる態様は、血流依存性血管拡張反応（ＦＭＤ）を増加させるための、１００～４００ｍｇ／日の量でＨＤＧＣＥを含む組成物の非治療的な使用であり、コーヒー酸及びフェルラ酸の量は、コーヒー酸：フェルラ酸の比が少なくとも２：１を超える、例えば、少なくとも３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１又は１０：１を超えるものである。

【0028】

一実施形態では、当該対象は、ＨＤＧＣＥの投与に加えて、少なくとも２００ｋｃａｌの食事を更に補充される。

【0029】

一実施形態では、対象は、ヒト対象である。一実施形態では、対象は、健康なヒト対象である。

【0030】

コーヒー抽出物
コーヒー抽出物を製造するための数多くの方法が、例えば、欧州特許第０９１６２６７号により既知である。コーヒー抽出物は、例えば、ピュア（ｐｕｒｅ）な可溶性コーヒーであってもよい。ピュアな可溶性コーヒー製品は容易に入手可能であり、ピュアな可溶性コーヒー製品を製造するための多くの方法が、当該技術分野において、例えば、欧州特許第１０６９３０号により既知である。

【0031】

本発明の別の態様は、（ｉ）コーヒー生豆抽出物を水、蒸気、有機溶媒、超臨界ＣＯ_２、及び／又はこれらの混合物と接触させることによって、脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物を調製する工程と、（ｉｉ）任意選択的に、脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物を乾燥させる工程と、（ｉｉｉ）得られた脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物を、エステラーゼ酵素と、４～７の範囲のｐＨ及び２０～５０℃の範囲の温度で、１～６時間の範囲のインキュベーション時間にわたり接触させる工程と、（ｉｖ）上記の酵素処理されたコーヒー生豆抽出物を、８０～１２０℃の範囲の温度で１～３０分間加熱して、酵素を不活性化させ、抽出物を低温殺菌する工程と、（ｖ）任意選択的に、抽出物を乾燥させて、エステラーゼ処理した脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物（ＨＤＧＣＥ）を得る工程と、を含む、ＨＤＧＣＥ組成物を調製するための方法を提供する。一実施形態では、乾燥工程（ｉｉ）は、噴霧乾燥又は凍結乾燥である。別の実施形態では、エステラーゼ酵素は、好ましくは１ｍＬの水又は緩衝液中に溶解された、好ましくはコーヒー生豆抽出物２００ｍｇあたり１～２０Ｕ範囲のＷ／Ｗ濃度の好ましくはクロロゲネートエステラーゼである。

【0032】

当業者であれば、本明細書に開示される本発明の全ての特徴を自由に組み合わせることができることを理解されたい。特に、組成物の治療的使用について記載された特徴を非治療的使用と組み合わせることができ、逆もまた同様である。更に、本発明の異なる実施形態について記載された特徴を組み合わせてもよい。本発明の更なる利点及び特徴は、図面及び実施例から明らかである。
実施例

【0033】

実施例１
ラクトバチルス・ジョンソニイ（ＮＣＣ ５３３）からのエステラーゼの精製、特性評価及びクローニング
ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）の全細胞においてエステラーゼ活性があることが確認された。酵素を精製し、特性評価した。遺伝子にアノテーションを行った（ＬＪ－１２２８、遺伝子＝１１５８６０１ １１５９３４７ 逆転写産物（Ｒｅｖｅｒｓｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔ）＝アルファ／ベータ加水分解酵素、以下の配列を参照されたい）。次に、この遺伝子を食品グレードの大腸菌において過剰発現させ、ＨＰＬＣによって酵素を精製した（ＨＩＣカラム ＴＳＫゲル フェニル－５ＰＷ、ＮａＰＯ_４（５０ｍＭ）ｐＨ７．０＋１ｍＭ ＥＤＴＡ中の１～０ｍｏｌ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４／Ｌの直線勾配。流量０．８ｍＬ／分）。

【0034】

ＤＮＡ配列／ヌクレオチド配列
Ａｔｇｇａｇａｃｔａｃａａｔｔａａａｃｇｔｇａｔｇｇｔｃｔａａａｃｔｔａｃａｔｇｇｔｔｔａｃｔｔｇａａｇｇａａｃｃｇａｔａａｇａｔｔｇａａａａｔｇａｔａｃｇａｔｔｇｃｔａｔｔｔｔａａｔｇｃａｔｇｇｔｔｔｔａａａｇｇｔｇａｔｔｔｇｇｇｔｔａｔｇａｔｇａｃａｇｃａａｇａｔｔｔｔｇｔａｔｇｃｔｃｔｃｔｃｔｃａｃｔａｃｔｔａａａｔｇａｔｃａａｇｇｃｃｔｃｃｃａａｃａａｔｔｃｇｔｔｔｔｇａｃｔｔｔｇａｔｇｇａｔｇｃｇｇａａａａａｇｔｇａｔｇｇｔａａａｔｔｔｇａａｇａｔａｔｇａｃｔｇｔｃｔａｔａｇｃｇａａａｔｃｃｔａｇａｔｇｇｇａｔａａａａａｔａｔｔａｇａｔｔａｔｇｔｔｃｇｔａａｔａｃｔｇｔｔａａｇｇｃａａａａｃａｔａｔｃｔａｔｔｔａｇｔｇｇｇａｃａｃｔｃｃｃａａｇｇｔｇｇａｇｔａｇｔａｇｃｇｔｃａａｔｇｃｔｇｇｃｔｇｇａｔａｔｔａｔｃｇａｇａｔｇｔｔａｔｔｇａａａａａｔｔｇｇｃｔｔｔａｃｔｃｔｃｔｃｃｔｇｃａｇｃａａｃｔｃｔｔａａｇｔｃｔｇａｔｇｃｔｔｔａｇａｔｇｇａｇｔｔｔｇｔｃａｇｇｇｔａｇｔａｃｔｔａｔｇａｔｃｃａａｃｇｃａｔａｔｃｃｃｔｇａａａｃｔｇｔｃａａｔｇｔｔａｇｔｇｇｃｔｔｔｇａａｇｔａｇｇａｇｇａｇｃｔｔａｃｔｔｔａｇａａｃｇｇｃｔｃａａｔｔａｔｔｇｃｃｔａｔｔｔａｔｃａａａｃａｇｃｇｇａａｃａｔｔａｔａａｔａｇｇｇａａａｃｔｔｔａｔｔｇａｔｔｃａｔｇｇｃｔｔａｇｃａｇａｔａａａｇｔｃｇｔｇｔｃａｃｃｔａａｔｇｃｔｔｃａａｇａａａａｔｔｔｃａｔａｃａｃｔｔｔｔｇｃｃｔａａａａｇｔｇａｇｃｔｃｃａｔｔｔａａｔｔｃｃａｇａｔｇａｇｇｇｔｃａｃａｔｇｔｔｔａａｃｇｇａａａａａａｔａｇａｃｃｔｇａａｇｔａｔｔａａａａｔｔａｇｔｔｇｇｔｇａｇｔｔｔｔｔａａｔａａａａｔａａ
アミノ酸配列
１ ｍｅｔｔｉｋｒｄｇｌ ｎｌｈｇｌｌｅｇｔｄ ｋｉｅｎｄｔｉａｉｌ ｍｈｇｆｋｇｄｌｄｙ ｄｄｓｋｉｌｙａｌｓ ｈｙｌｎｄｑｇｌｐｔ
６１ ｉｒｆｄｆｄｇｃｇｋ ｓｄｇｋｆｅｄｍｔｖ ｙｓｅｉｌｄｇｉｋｉ ｌｄｙｖｒｎｔｖｋａ ｋ
１２１ ｙｙｒｄｖｉｅｋｌａ ｌｌｓｐａａｔｌｋｓ ｄａｌｄｇｖｃｑｇｓ ｔｙｄｐｔｈｉｐｅｔ ｖｎｖｓｇｆｅｖｇｇ ａｙｆｒｔａｑｌｌｐ
１８１ ｉｙｑｔａｅｈｙｎｒ ｅｔｌｌｉｈｇｌａｄ ｋｖｖｓｐｎａｓｒｋ ｆｈｔｌｌｐｋｓｅｌ ｈｌｉｐｄｅｇｈｍｆ ｎｇｋｎｒｐｅｖｌｋ
２４１ ｌｖｇｅｆｌｉｋ

【0035】

ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）エステラーゼの最適ｐＨの特定
最適ｐＨは、グリシン緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液及び水を使用して決定した。基質には５－ＣＱＡを使用した（５０μｍｏｌ／ｍＬ）。図２に見ることができるように、酵素の最適ｐＨは４．０～６．０であった。この反応は、精製したエステラーゼ（０．０１Ｕ／ｍｇ基質）を使用して３７℃で３０分間実施した。

【0036】

ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）エステラーゼの最適温度の特定
最適温度は、１０℃～９０℃の様々な温度で、基質として５－ＣＱＡ（５０μｍｏｌ／ｍＬ）を使用して決定した。図３に見ることができるように、酵素の最適温度は３０℃～４０℃であった。反応は、精製されたエステラーゼ（０．０１Ｕ／ｍｇ基質）を使用してｐＨ５．０で３０分間実施した。

【0037】

基質特異性
様々な４－ニトロフェニル誘導体を使用して、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）エステラーゼの基質特異性を試験した。図４に見ることができるように、４－ニトロフェニルブチレートが最良の基質である一方で、４－ニトロフェニルドデカノエートの変換は観察されなかった。反応は、ｐＨ６．０のリン酸ナトリウム緩衝液で３７℃で１０分間実施した。基質は０．２ｍＭの濃度で使用し、酵素は基質１ｍｇ当たり０．０１Ｕで使用した。測定は３０秒ごとにモニターした。吸光度は４１０ｎｍに設定した。

【0038】

脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物の、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）エステラーゼによる処理
反応速度論：実験室規模での試験
２００ｍｇ／ｍＬの脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物（ＤＧＣＥ）に対して、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）エステラーゼを様々な濃度（１．６５、３．３、４．９５、８．２５及び１６．２５Ｕ／ｍＬ）で使用して、反応速度試験を実施した。反応は、ｐＨ４．５及び３７℃で１ｍＬの体積で実施した。結果を以下の表に要約する。各化合物の濃度はｍｇ／ｍＬ単位である。

【0039】

【表1】

【0040】

【表2】

【0041】

【表3】

【0042】

【表4】

【0043】

【表5】

【0044】

時間経過と反応速度との対応
脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物（２００ｍｇ／ｍＬ）に対して、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）エステラーゼを、１６．２５Ｕ／ｍＬの濃度で使用して反応速度試験を実施した。反応は、１ｍＬの反応体積でｐＨ４．５及び３７℃で実施した。反応速度試験は１、２、３及び４時間実施した。各化合物の濃度はｍｇ／ｍＬ単位である。

【0045】

酵素濃度と反応速度との対応
脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物（２００ｍｇ／ｍＬ）に対して、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）エステラーゼを様々な濃度（５、１０、１５、２５及び５０μＬ／ｍＬがそれぞれ１．６５、３．３、４．９５、８．２５及び１６．５Ｕ／ｍＬに対応）で使用して反応速度試験を実施した。反応は、１ｍＬの体積でｐＨ４．５及び３７℃で実施した（図５を参照されたい）。反応時間は４時間とした。各化合物の濃度はｍｇ／ｍＬ単位である。

【0046】

パイロットプラント試験
脱カフェイン処理したコーヒー生豆抽出物の、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）エステラーゼによる処理
脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物（１．７６Ｋｇ）を、撹拌下で水（８．８Ｋｇ）に溶解した。次に、ｐＨを、塩酸（ＨＣｌ、０．３６Ｋｇ）を添加することによって、ｐＨ４．５に調整した。この溶液に、０．０２４ｋｇの酵素（ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）由来のエストラーゼ）を２回に分けて添加した。すなわち、Ｔ＝０ｈの時点で０．０１６ｋｇの酵素を添加し、及び３時間反応させた後に０．００８ｋｇの酵素を添加した。反応を３７℃で６時間行った。次に、混合物を９８℃で１０分間加熱して、酵素を不活性化した。遠心分離（５０００ｇで２分）及び濾過（０．４５μｍ）後に、混合物を凍結乾燥した。得られた粉末を、臨床試験に使用する飲料の調製に使用した。

【0047】

ＵＰＬＣ分析
試料の分析には、焙煎豆又は生豆のいずれかから抽出された、コーヒー抽出液及びピュアな可溶性コーヒー中の、コーヒー酸、クロロゲン酸異性体（５－ＣＱＡ、４－ＣＱＡ、３－ＣＱＡ、４－ＦＱＡ、５－ＦＱＡ、３，４－ジＣＱＡ、３，５－ジＣＱＡ及び４，５－ジＣＱＡ）及びカフェインを定量的に測定することができる方法を使用した。試料を１５℃で５分間遠心分離した（５０００ｇ）。得られた上清１００μＬを９００μＬのメタノール／水（８０：２０）に加え、分析前に０．２μｍで濾過した。分析は、ポンプ、脱気システム、５μＬを超える注入ループを有する試料インジェクタ、フォトダイオードアレイ検出器（波長３２５ｎｍ及び２７５ｎｍ）及び適切なデータソフトウェアを備えたＵＰＬＣで行った。分子の分離は、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｓｈｉｅｌｄ ＲＰ １８カラム、１．７μｍ、２．１ｘ１００ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ）で行った。移動相Ａは、０．１％リン酸を添加した５％アセトニトリル水溶液とし、移動相Ｂは、０．１％リン酸を添加した１００％アセトニトリルとした。流量０．４ｍＬ／分、カラム温度３５℃、注入量２μＬとした。

【0048】

臨床試験
主要目的
本試験は、健康なボランティアに、フェノール酸に富む加水分解された脱カフェイン処理後コーヒー生豆を経口投与することにより、内皮機能の改善における有効性を調べることを主要目的とした。内皮機能は、反応性充血時の上腕動脈の内径の、ベースラインからの変化率（％ＦＭＤ）として定義される。

【0049】

主要評価項目（Ｐｒｉｍａｒｙ ｅｎｄｐｏｉｎｔ）
主要結果（ｐｒｉｍａｒｙ ｏｕｔｃｏｍｅ）は、処置後の任意の時点におけるＦＭＤ（％）のベースライン（すなわち、投与前）からの平均変化とした。上腕動脈径のベースラインからの変化率（％）として応答を計算した。

【0050】

ＨＤＧＣＥの試験設計

【数1】

【0051】

本試験は、２０人の健康な被験者における、加水分解処理後コーヒー生豆抽出物の、プラセボ対照、二重盲検、ランダム化、単一施設、クロスオーバー試験とした。被験者は、各群（ｇｒｏｕｐ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に無作為に割り付けられた。試験は１つの施設で実施し、４日間（非連続）の処置期間を含んだ。

【0052】

統計的分析
主要評価項目では、主に、ベースラインより後の各時点における、様々な用量のフェノール酸と対照との間のピークにおけるＦＭＤのベースライン平均からの変化の差を分析した。１％の差を臨床的に関連があるものとみなし、ｐ値０．０５未満を統計的に有意であるものとみなした。

【0053】

組成物の説明
フェノール酸及び約２％のカフェインを含有している加水分解処理後コーヒー生豆抽出物を、試験に使用した。この試験では、フェノール酸に富むコーヒー抽出物を１日あたりに１回用量のみ対象に与えた。脱カフェイン処理後コーヒー生豆抽出物、マルトデキストリン及びアロマを湿式混合し、次いで凍結乾燥して、最終プレミックスの均質性を確保した。

【0054】

プラセボは、マルトデキストリン及びアロマのみを含有している。マルトデキストリン及びアロマの量は、これらの成分が試験結果に対して何らかの潜在的な作用を示すことを回避するために、４つの群間で同量とした。

【0055】

以下の表は、凍結乾燥後の４つの治験薬の組成を示す（乾燥後の残留水２％を考慮している）。

【0056】

【表6】

治験薬又は対応するプラセボの各用量を、投与直前に、不透明なコップ中の２００ｍＬのミネラルウォーターに入れて蓋をし、室温で溶解させた。治験薬は、朝の空腹状態の時に投与された。

【0057】

被験者の内訳
２３人の対象をスクリーニングし、そのうちの３人は、組み入れ基準違反及び／又は除外基準違反によってスクリーニングに不適格であるとした。試験に登録された残り２０人の対象全てにおいて、全４回の訪問を継続した。

【0058】

最大の解析対象集団（ＦＡＳと呼ぶ、又は治療企図解析に関してはＩＴＴと呼ぶ）
最大の解析対象集団には、無作為化した全ての対象を含めた。このデータセットの被験者の総数は２０人であった。その中で１９人の対象のみが、一次分析に利用可能なデータを有した。

【0059】

【表7】

【0060】

【表8】

【0061】

内皮機能不全の結果

【表9】

【0062】

【表10】

【0063】

【表11】

【0064】

【表12】

【0065】

ｐ値は、様々な用量のｉＡＵＣとプラセボのｉＡＵＣとの比較に関するものである。いずれの用量も、プラセボと統計的に異なることが見出されなかった。これは、観察された極めて高い変動性に起因している可能性がある。

【0066】

本発明者らは、１７３．１ｍｇのＨＤＧＣＥ用量が、プラセボ処置と比較して、１時間（ｐ値＝０．０３６）及び６時間（ｐ値＝０．０１７６０８）の時点においてＦＭＤの有意な増加を示したことを見出した。これらの時点でのＦＭＤの増加は、ＦＭＤの１％単位よりも高かった。内皮機能不全の改善（血流依存性血管拡張反応値において１％）により、心血管イベントのリスクが１３％低下することが判明した（Ｉｎａｂａ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓ Ｉｍａｇｉｎｇ ２６：６２１－６４０）。

【0067】

結論
１７３．１ｍｇのＨＤＧＣＥ（用量４０）とプラセボとの間で、１時間及び６時間の時点において、統計的有意性が観察された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

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