知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ 厦▲門▼大学の特許一覧 ▶ 厦門万泰滄海生物技術有限公司の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-23
(45)【発行日】2024-09-02
(54)【発明の名称】分子の細胞内送達のための複合体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20240826BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240826BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240826BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240826BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240826BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240826BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240826BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240826BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20240826BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240826BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20240826BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240826BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20240826BHJP
A61K 47/69 20170101ALI20240826BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20240826BHJP
C12N 9/50 20060101ALN20240826BHJP
C07K 14/11 20060101ALN20240826BHJP
C07K 14/16 20060101ALN20240826BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C07K19/00 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61P1/16
A61P9/10
A61P29/00
A61P25/28
A61K48/00
A61K47/64
A61K47/69
C12N15/113 Z
C12N9/50
C07K14/11
C07K14/16
【請求項の数】
31
(21)【出願番号】P 2022501316
(86)(22)【出願日】2020-07-10
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-24
(86)【国際出願番号】 CN2020101424
(87)【国際公開番号】W WO2021004539
(87)【国際公開日】2021-01-14
【審査請求日】2022-07-22
(31)【優先権主張番号】201910624609.9
(32)【優先日】2019-07-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】504458976
【氏名又は名称】厦▲門▼大学
(73)【特許権者】
【識別番号】520479892
【氏名又は名称】厦門万泰滄海生物技術有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＸＩＡＭＥＮ ＩＮＮＯＶＡＸ ＢＩＯＴＥＣＨ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】110001195
【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】葛 勝 祥
(72)【発明者】
【氏名】于 思 遠
(72)【発明者】
【氏名】楊 ▲ハン▼
(72)【発明者】
【氏名】潘 海 峰
(72)【発明者】
【氏名】任 書 玲
(72)【発明者】
【氏名】李 廷 棟
(72)【発明者】
【氏名】郭 清 順
(72)【発明者】
【氏名】熊 君 輝
(72)【発明者】
【氏名】張 軍
(72)【発明者】
【氏名】夏 寧 邵
【審査官】鳥居 敬司
(56)【参考文献】
【文献】中国特許第１０１４８１４２２（ＣＮ，Ｂ）
【文献】国際公開第２０１６／０５０９３４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１７／１４３０２６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２００５－５２７２１０（ＪＰ，Ａ）
【文献】Adv. Mater., 2018, Vol.30, 1705383
【文献】Journal of Controlled Release, 2011, Vol.151, pp.220-228
【文献】PLOS ONE, 2013, Vol.8, No.7, e70108
【文献】BMC Cancer，2011年，11:61
【文献】Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2016年，Vol.60, No.11，pp.6532-6539
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／６２
Ｃ０７Ｋ １９／００
Ｃ１２Ｎ １５／６３
Ｃ１２Ｎ １／１５
Ｃ１２Ｎ １／１９
Ｃ１２Ｎ １／２１
Ｃ１２Ｎ ５／１０
Ｃ１２Ｐ ２１／０２
Ａ６１Ｐ １／１６
Ａ６１Ｐ ９／１０
Ａ６１Ｐ ２９／００
Ａ６１Ｐ ２５／２８
Ａ６１Ｋ ４８／００
Ａ６１Ｋ ４７／６４
Ａ６１Ｋ ４７／６９
Ａ６１Ｋ ３８／４６
Ｃ１２Ｎ １５／１１３
Ｃ１２Ｎ ９／５０
Ｃ０７Ｋ １４／１１
Ｃ０７Ｋ １４／１６
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞透過性ペプチド、ｐＨ感受性融合ペプチド、およびプロテアーゼ認識配列を含む融合タンパク質であって、前記プロテアーゼ認識配列がフーリン認識配列及びカテプシンＬ認識配列を含む、融合タンパク質。
【請求項2】
前記フーリン認識配列がＲ－Ｘ１－Ｘ２－Ｒ（配列番号１）、Ｒ－Ｒ－Ｘ１－Ｘ２－Ｒ（配列番号２）、配列番号３に示す配列又は配列番号４に示す配列を含み、Ｘ１が任意のアミノ酸であり、Ｘ２がＫまたはＲである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
前記カテプシンＬ認識配列が、配列番号６に示す配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
前記プロテアーゼ認識配列が配列番号４に示す配列および配列番号６に示す配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
前記ｐＨ感受性融合ペプチドがＨＡ２、ＩＮＦ７、ＫＡＬＡ、ＧＡＬＡ、メリチン、およびこれらの任意の組合せから選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項6】
前記ｐＨ感受性融合ペプチドがＩＮＦ７又は配列番号８に示す配列を含む、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項7】
前記細胞透過性ペプチドが、ペネトラチン、Ｔａｔ由来ペプチド、Ｒｅｖ（３４－５０）、ＶＰ２２、トランスポータン、Ｐｅｐ－１、Ｐｅｐ－７、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項8】
前記細胞透過性ペプチドが、Ｔａｔ（４８－６０）若しくはＴａｔ（４７－５７）を含む、又は、配列番号１０に示す配列を含む、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項9】
前記融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端へと、前記ｐＨ感受性融合ペプチド、前記細胞透過性ペプチド、および前記プロテアーゼ認識配列を含むか、または前記融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端へと、前記細胞透過性ペプチド、前記ｐＨ感受性融合ペプチド、および前記プロテアーゼ認識配列を含み、かつ前記プロテアーゼ認識配列が、Ｎ末端からＣ末端へと、前記フーリン認識配列および前記カテプシンＬ認識配列を含むか、またはＮ末端からＣ末端へと、前記カテプシンＬ認識配列および前記フーリン認識配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項10】
前記融合タンパク質が、配列番号１２から１４のいずれか１つに示す配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項11】
前記融合タンパク質が特異的結合配列をさらに含み、前記特異的結合配列は、別の分子がそれに特異的に結合するのを可能にする、請求項１から１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項12】
（ｉ）前記特異的結合配列が、その相補ペプチドとヘテロ二量体を形成することができるロイシンジッパーペプチドを含むか、（ｉｉ）前記特異的結合配列がロイシンジッパーＮＺまたはＣＺを含むか、
（ｉｉｉ）前記特異的結合配列が配列番号４９または５０に示す配列を含むか、あるいは
（ｉｖ）前記特異的結合配列が前記プロテアーゼ認識配列のＣ末端に位置する、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項13】
請求項１から１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質と、カーゴ分子とを含む複合体。
【請求項14】
（ｉ）前記カーゴ分子が、核酸、ペプチドまたはタンパク質、炭水化物、脂質、化学化合物、およびこれらの任意の混合物からなる群から選択されるか、（ｉｉ）前記カーゴ分子が、検出可能な標識を含むか、あるいは
（ｉｉｉ）前記カーゴ分子がエピトープタグ、レポーター遺伝子配列、および／または核移行シグナル（ＮＬＳ）配列を含む、請求項１３に記載の複合体。
【請求項15】
（ｉ）前記融合タンパク質が前記カーゴ分子と融合しており、前記カーゴ分子がペプチドまたはタンパク質であるか、（ｉｉ）前記融合タンパク質が前記カーゴ分子に化学的にカップリングしているか、
（ｉｉｉ）前記融合タンパク質が前記カーゴ分子に非共有結合的に接続しているか、あるいは
（ｉｖ）前記融合タンパク質と前記カーゴ分子が、静電相互作用によってコンジュゲートしている、請求項１３に記載の複合体。
【請求項16】
前記融合タンパク質が請求項１１又は１２に記載の融合タンパク質であり、前記カーゴ分子が、前記融合タンパク質中の前記特異的結合配列に特異的に結合することができるドメインを含む、請求項１３に記載の複合体。
【請求項17】
前記融合タンパク質中の前記特異的結合配列がロイシンジッパーペプチドを含み、前記カーゴ分子が、前記ロイシンジッパーペプチドの相補ペプチドを含み、それにより、前記ロイシンジッパーペプチドと前記相補ペプチドがヘテロ二量体を形成することができる、請求項１６に記載の複合体。
【請求項18】
請求項１から１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質と、カーゴ分子とを含む組成物。
【請求項19】
請求項１１又は１２に記載の融合タンパク質を含み、前記カーゴ分子が、前記融合タンパク質中の前記特異的結合配列に特異的に結合することができるドメインを含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項20】
前記融合タンパク質中の前記特異的結合配列がロイシンジッパーペプチドを含み、前記カーゴ分子が、前記ロイシンジッパーペプチドの相補ペプチドを含み、それにより、前記ロイシンジッパーペプチドと前記相補ペプチドがヘテロ二量体を形成することができる、請求項１９に記載の組成物。
【請求項21】
請求項１から１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質、または、前記融合タンパク質及びカーゴ分子を含む複合体若しくは組成物であって、前記カーゴ分子がペプチド又はタンパク質である、複合体若しくは組成物、
をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項22】
請求項２１に記載の単離された核酸分子を含む、ベクター。
【請求項23】
請求項２１に記載の単離された核酸分子または請求項２２に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項24】
請求項１から１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項１３から１７のいずれか１項に記載の複合体、請求項１８から２０のいずれか１項に記載の組成物、請求項２１に記載の単離された核酸分子、請求項２２に記載のベクター、または請求項２３に記載の宿主細胞と、薬学的に許容される担体および／または添加剤とを含む医薬組成物。
【請求項25】
請求項１３から１７のいずれか１項に記載の複合体を含み、前記カーゴ分子が医薬活性剤または検出可能な標識である、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項26】
医薬の製造における、請求項１から１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質、または前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子、ベクター、もしくは宿主細胞の使用。
【請求項27】
疾患を治療するための医薬の製造における、請求項１３から１７のいずれか１項に記載の複合体、または請求項１８から２０のいずれか１項に記載の組成物の使用であって、前記複合体または前記組成物中に含有される前記カーゴ分子が、前記疾患を治療することができる、使用。
【請求項28】
前記疾患がプログラム細胞壊死に関連する疾患であり、前記カーゴ分子がプロテインホスファターゼ１Ｂを含み、プログラム細胞壊死に関連する前記疾患が、肝損傷、炎症性疾患、虚血－再灌流傷害、および／または神経変性疾患を含む、請求項２７に記載の使用。
【請求項29】
請求項１から１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項１３から１７のいずれか１項に記載の複合体、請求項１８から２０のいずれか１項に記載の組成物、請求項２１に記載の単離された核酸分子、請求項２２に記載のベクター、または請求項２３に記載の宿主細胞を含むキットであって、トランスフェクションおよび／または細胞内送達のための説明書をさらに含む、キット。
【請求項30】
請求項１から１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項１３から１７のいずれか１項に記載の複合体、または請求項１８から２０のいずれか１項に記載の組成物の、インビトロにおける又は非ヒト細胞に対する送達剤としての使用。
【請求項31】
細胞にカーゴ分子を送達するための方法であって、前記細胞を、インビトロで、請求項１３から１７のいずれか１項に記載の複合体と接触させるステップを含み、前記複合体が前記カーゴ分子を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
発明の分野
本発明は、分子生物学の分野に関し、より詳細には、カーゴ分子の細胞内送達のための融合タンパク質および複合体に関する。
本発明は、分子生物学の分野に関し、より詳細には、カーゴ分子の細胞内送達のための融合タンパク質および複合体に関する。
【0002】
発明の背景
選択的浸透性のある障壁である細胞膜は、細胞の生存および機能に必須である。小分子は、細胞の天然のプロセスまたは脂質二重層における直接的な拡散を介して細胞膜を通り抜けることができるが、ほとんどの場合、原形質膜を通る細胞内カーゴ、例えば外因性の活性生体高分子の有効な通路は、依然として、細胞輸送プロセスにおける大きな問題である。したがって、生きている細胞への細胞内カーゴの輸送効率を効果的に改善することができる分子輸送ツールは、生物医学および他の分野におけるその適用において極めて重要である。
選択的浸透性のある障壁である細胞膜は、細胞の生存および機能に必須である。小分子は、細胞の天然のプロセスまたは脂質二重層における直接的な拡散を介して細胞膜を通り抜けることができるが、ほとんどの場合、原形質膜を通る細胞内カーゴ、例えば外因性の活性生体高分子の有効な通路は、依然として、細胞輸送プロセスにおける大きな問題である。したがって、生きている細胞への細胞内カーゴの輸送効率を効果的に改善することができる分子輸送ツールは、生物医学および他の分野におけるその適用において極めて重要である。
【0003】
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、現在、細胞取り込みのプロセスを達成するのに使用される最も一般的で有効な担体のうちの１つである。細胞透過性ペプチドは、典型的には５から３０個のアミノ酸を含有し、化学架橋結合、融合体発現、または非共有結合性の結合によって、生体高分子を、細胞膜を通して細胞内に運ぶことができる。これまでに、天然タンパク質由来または人工合成のＣＰＰが何百も報告され、細胞内カーゴの細胞内送達に使用されており、それらの化学的性質によって３つのカテゴリーに分けられることができる。（１）陽イオン性ＣＰＰ、これは、アルギニン残基およびリジン残基が豊富であり、生理的ｐＨで強い正電荷を有する。（２）両親媒性ＣＰＰ、これは、極性領域と無極性領域を含み、その配列全体に分布するリジンおよびアルギニンに加えて、バリン、ロイシン、イソロイシン、およびアラニンなどの疎水性残基も豊富である。（３）疎水性ＣＰＰ、これは、主に無極性アミノ酸を含む。ＣＰＰは、その強い正電荷または疎水性基を介して、細胞膜表面上の負電荷または疎水性脂質二重層と相互作用する。小分子を運ぶときには、ＣＰＰは、エネルギーを消耗しない様式で、細胞膜を横切り直接的に移動するができ、生体高分子を運ぶときには、ＣＰＰは、基本的には、エネルギー依存的なエンドサイトーシスによって細胞に入る。ＣＰＰ媒介の細胞侵入における用量が低いこと、輸送時間が短いこと、用量が制御可能であること、操作がシンプルなこと、毒性および副作用が小さいことなどの利点により、ＣＰＰは、現在、ポリペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、プラスミド、リポソームおよび金属イオン、小分子蛍光、ナノ粒子などを輸送するのに、インビトロおよびインビボで、広く用いられている。
【0004】
ＣＰＰは、生体高分子を輸送する上での利点を多く有するが、いくつかの限界がまだある。そのうち、解決すべき第１の問題は、その膜横断送達効率が低いことである。現在、細胞内カーゴが細胞内に輸送されるとき、ＣＰＰは、細胞膜表面と相互作用し、次いで、エンドサイトーシスを介して細胞に入ると一般に考えられている。細胞エンドサイトーシスは、そのエンドサイトーシスの機序により、マクロピノサイトーシス、クラスリン媒介エンドサイトーシス、カベオラ／脂質ラフト媒介エンドサイトーシス、およびクラスリン／カベオラ非依存性エンドサイトーシスという４つの主要なタイプに分けることができる。これらの様々なタイプのエンドサイトーシスのすべては、最終的にエンドソームを生み出し、初期エンドソームから後期エンドソームへの成熟には、エンドソーム内ｐＨの漸減が伴い、最終的にエンドソームはリソソームと融合する。リソソームに入る前に、細胞内カーゴがエンドソームから脱出して細胞質に入る必要がある。そうでなければ、細胞内カーゴは、最終的にリソソームに入り、分解され、機能できない。エンドソームからの脱出に成功できるのは、ＣＰＰによって運ばれる生体高分子のわずか１％であり、ＣＰＰによって運ばれる生体高分子のほとんどは、最終的にリソソームに移され、分解されることが、研究により示されている。したがって、細胞内カーゴの脱出は、ＣＰＰの細胞内送達プロセスにおける鍵となる制限因子であり、その効率が全体的な送達効率を決定する。
【0005】
エンドソームからの脱出効率を改善するための主な戦略は、その内容物（送達されることになっている細胞内カーゴを含む）が細胞質に放出されるように、成熟および酸性化のプロセス中にエンドソーム膜の完全性を崩すことである。クロロキン、メチルアミン、および塩化アンモニウムなどの緩衝剤を系に添加して、エンドソームの貫通および破裂を物理的に促進することができると報告されているが、その強い細胞毒性が、その臨床用途の障害となっている。現在、最も有効な方法は、ウイルス、細菌、動物、植物またはヒトに由来するｐＨ感受性融合ペプチドを用いることである。ｐＨ感受性融合ペプチドは、疎水性アミノ酸をある割合で含有し、その立体構造が低ｐＨで激変する。ＣＰＰ媒介エンドサイトーシスの後にエンドソームが成熟および酸性化するプロセス中に、ひとたびｐＨ値が臨界点まで低下したならば、ＣＰＰにカップリングしたｐＨ感受性融合ペプチドが立体構造変化を行い、エンドソーム膜の脂質二重層に結合し、それによって、リン脂質二重層膜の完全性を大きく乱し、それに孔を形成するか、エンドソーム膜を溶解させ、細胞質に送達されることになっている生体高分子を最終的に放出する。現在、最も一般的に用いられているｐＨ感受性融合ペプチドは、インフルエンザウイルス赤血球凝集素抗原（以下ＨＡ２と称する）のステム領域からのペプチド、およびＨＡ２をベースにして人工的に改変されており、それより低い毒性および良好な膜破壊作用を有するＩＮＦ７であり、これらは両方とも、エンドソームから輸送されることになっているタンパク質分子の脱出効率を、それらをＣＰＰおよびタンパク質分子と融合させた後に改善することができる。しかし、ｐＨ感受性融合ペプチドと融合したＣＰＰに媒介された高分子細胞内送達におけるエンドソームからの脱出効率が実際に改善されている一方で、輸送されることになっている高分子のかなりの部分が依然としてエンドソーム内に残っている（例えば、輸送されることになっている高分子として蛍光タンパク質を用いた場合、明らかな点状の分布を見ることができる）。
【0006】
したがって、輸送されることになっている生体高分子の、エンドソームからの効率的な放出を達成する新しい送達系を開発する必要性が依然としてある。
【0007】
概要
多くの実験を行い、探究を繰り返した後、本願の発明者らは、驚くべきことに、送達担体として、ｐＨ感受性ペプチドと特定のプロテアーゼ認識配列の組合せを用いることによって、エンドソームからのカーゴ分子の放出を有意に改善することができ、それによって、カーゴ分子の細胞質送達効率が大幅に向上し、カーゴ分子が、それらの対応する生物学的機能を十分に発揮できることを見出した。これらの新知見に基づき、本発明者らは、高効率の細胞質送達を達成できる担体システムを開発した。
多くの実験を行い、探究を繰り返した後、本願の発明者らは、驚くべきことに、送達担体として、ｐＨ感受性ペプチドと特定のプロテアーゼ認識配列の組合せを用いることによって、エンドソームからのカーゴ分子の放出を有意に改善することができ、それによって、カーゴ分子の細胞質送達効率が大幅に向上し、カーゴ分子が、それらの対応する生物学的機能を十分に発揮できることを見出した。これらの新知見に基づき、本発明者らは、高効率の細胞質送達を達成できる担体システムを開発した。
【0008】
融合タンパク質
したがって、本発明の第１の態様は、細胞透過性ペプチド、ｐＨ感受性融合ペプチド、およびプロテアーゼ認識配列を含み、プロテアーゼがフーリンプロテアーゼ（ｆｕｒｉｎ ｐｒｏｔｅａｓｅ）および／またはリソソームシステインプロテアーゼから選択される、融合タンパク質を提供する。
したがって、本発明の第１の態様は、細胞透過性ペプチド、ｐＨ感受性融合ペプチド、およびプロテアーゼ認識配列を含み、プロテアーゼがフーリンプロテアーゼ（ｆｕｒｉｎ ｐｒｏｔｅａｓｅ）および／またはリソソームシステインプロテアーゼから選択される、融合タンパク質を提供する。
【0009】
一部の実施形態では、フーリン認識配列が、以下の配列：Ｒ－Ｘ１－Ｘ２－Ｒ↓（配列番号１）を含むか、それからなり、配列中、Ｘ１は任意のアミノ酸であり、Ｘ２はＫまたはＲであり、↓は切断部位を示す。
【0010】
あるいくつかの実施形態では、フーリン認識配列が以下の配列：Ｒ－Ｒ－Ｘ１－Ｘ２－Ｒ↓（配列番号２）を含むか、それからなる。
【0011】
あるいくつかの実施形態では、Ｘ１は、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｎ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、およびバリン（Ｖ）から選択される。
【0012】
あるいくつかの実施形態では、フーリン認識配列が以下の配列：ＲＲＨＫＲ↓（配列番号３）を含むか、それからなる。
【0013】
あるいくつかの実施形態では、フーリン認識配列は以下の配列：ＱＳＶＡＳＳＲＲＨＫＲ↓ＦＡＧＶ（配列番号４）を含むか、それからなる。
【0014】
あるいくつかの実施形態では、リソソームシステインプロテアーゼが、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＸ、カテプシンＳ、カテプシンＬ、カテプシンＤ、またはカテプシンＨから選択される。
【0015】
あるいくつかの実施形態では、リソソームシステインプロテアーゼがカテプシンＬである。
【0016】
あるいくつかの実施形態では、カテプシンＬ認識配列は以下の配列：ＮＮＴＨＤＬＶＧＤＶＲＬＡＧＶ（配列番号６）を含むか、それからなる。
【0017】
あるいくつかの実施形態では、プロテアーゼ認識配列がフーリン認識配列およびカテプシンＬ認識配列を含む。あるいくつかの実施形態では、プロテアーゼ認識配列が単鎖ポリペプチドであり、単鎖ポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端へと、フーリン認識配列およびカテプシンＬ認識配列を含むか、またはＮ末端からＣ末端へと、カテプシンＬ認識配列およびフーリン認識配列を含む。
【0018】
あるいくつかの実施形態では、プロテアーゼ認識配列がＲＲＨＫＲ（配列番号３）およびＮＮＴＨＤＬＶＧＤＶＲＬＡＧＶ（配列番号６）を含む。あるいくつかの実施形態では、プロテアーゼ認識配列が配列番号４および配列番号６を含む。
【0019】
本発明において、「ｐＨ感受性融合ペプチド」（ｐＨ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ）および「ｐＨ感受性ペプチド」という用語は、互換的に使用され、エンドソーム膜との融合を促進するように、酸性条件（例えば、ｐＨ＜６．５）下で立体構造変化を行うことができる一種のポリペプチドを指す。ｐＨ感受性ペプチドが細胞によって飲食（エンドサイトーシス）された後、エンドソームが成熟および酸性化するプロセス中に、ひとたびｐＨが臨界点に低下すれば、そのようなペプチドは、立体構造変化を行い、エンドソーム膜の脂質二重層と結合し、その結果、リン脂質二重層膜の完全性が大きく乱されるか、小さな孔を形成するか、エンドソーム膜の溶解を引き起こし、それによって、輸送された生体高分子を細胞質に放出する。そのようなポリペプチドは、当技術分野でよく知られており、例えば、Ｖａｒｋｏｕｈｉ、Ａｍｉｒ Ｋ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １５１巻３号（２０１１）：２２０～２２８ページ；Ｅｒａｚｏ－Ｏｌｉｖｅｒａｓ Ａ、Ｍｕｔｈｕｋｒｉｓｈｎａｎ Ｎ、Ｂａｋｅｒ Ｒら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、２０１２、５巻１１号、１１７７～１２０９ページに記載されており、これらをすべて参照により本明細書に組み込む。
【0020】
本発明の融合タンパク質で使用することができるｐＨ感受性ペプチドは、以下のタンパク質またはポリペプチドから選択するか、以下のタンパク質またはポリペプチドから得ることができる。
ウイルスタンパク質源由来：ＨＡ２（インフルエンザウイルス）およびその変異体ＫＡＬＡ（ＧＡＬＡ）；ペントンベース（アデノウイルスまたはライノウイルス）、ｇｐ４１（ＨＩＶ）、Ｌ２（パピローマウイルス）、エンベロープタンパク質（ウエストナイルウイルス）；
細菌タンパク質源由来：リステリオリジンＯ（ＬＬＯ）、肺炎球菌ニューモリシン（ＰＬＯ）、連鎖球菌ストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素Ａ、滋賀毒素、コレラ毒素；
植物タンパク質源由来：リシン、サポリン、ゲロニン；
ヒト／動物タンパク源由来：ヒトカルシトニン、線維芽細胞成長因子受容体、メリチン；
人工合成ペプチド：（Ｒ－Ａｈｘ－Ｒ）（４）ＡｈｘＢ、ペネトラチン（ｐＡｎｔｐ）、ＥＢ１、ウシプリオンタンパク質（ｂＰｒＰｐ）、スイートアローペプチド（ＳＡＰ）、ポリ（Ｌ－ヒスチジン）、プロリンリッチペプチド（プロリンリッチ）。
ウイルスタンパク質源由来：ＨＡ２（インフルエンザウイルス）およびその変異体ＫＡＬＡ（ＧＡＬＡ）；ペントンベース（アデノウイルスまたはライノウイルス）、ｇｐ４１（ＨＩＶ）、Ｌ２（パピローマウイルス）、エンベロープタンパク質（ウエストナイルウイルス）；
細菌タンパク質源由来：リステリオリジンＯ（ＬＬＯ）、肺炎球菌ニューモリシン（ＰＬＯ）、連鎖球菌ストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素Ａ、滋賀毒素、コレラ毒素；
植物タンパク質源由来：リシン、サポリン、ゲロニン；
ヒト／動物タンパク源由来：ヒトカルシトニン、線維芽細胞成長因子受容体、メリチン；
人工合成ペプチド：（Ｒ－Ａｈｘ－Ｒ）（４）ＡｈｘＢ、ペネトラチン（ｐＡｎｔｐ）、ＥＢ１、ウシプリオンタンパク質（ｂＰｒＰｐ）、スイートアローペプチド（ＳＡＰ）、ポリ（Ｌ－ヒスチジン）、プロリンリッチペプチド（プロリンリッチ）。
【0021】
あるいくつかの実施形態では、ｐＨ感受性融合ペプチドが、インフルエンザウイルスＨＡ２（配列番号３８）またはその変異体、メリチン（配列番号４１）、およびこれらの任意の組合せから選択される。あるいくつかの実施形態では、インフルエンザウイルスＨＡ２の変異体が、ＩＮＦ７（配列番号８）、ＫＡＬＡ（配列番号３９）、またはＧＡＬＡ（配列番号４０）から選択される。
【0022】
あるいくつかの実施形態では、ｐＨ感受性融合ペプチドがＩＮＦ７を含む。あるいくつかの実施形態では、ｐＨ感受性融合ペプチドが、以下の配列：配列番号８を含むか、それからなる。
【0023】
本発明において、「細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）」という用語は、「タンパク質移行ドメイン（ＰＴＤ）、「トロイの木馬ペプチド」、または「伝達ペプチド」などとも呼ばれており、様々な分子（例えば、タンパク質または核酸を含めた様々な高分子）の細胞取り込みを促進することができるポリペプチドを指す。そのようなポリペプチドは、当技術分野でよく知られており、例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ ＫＭら、Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ．２００８ Ｊｕｌ ７、６巻１３号、２２４２～５５ページおよび中国特許出願：ＣＮ１０１４９００８１Ａ（これらをすべて参照により本明細書に組み込む）に記載されているか、当技術分野で知られている方法、例えば、米国特許出願：ＵＳ２００８／０２３４１８３に記載の方法によって得ることができ、これらは参照により本明細書に完全に組み込まれている。
【0024】
本発明の融合タンパク質で使用することができるＣＰＰは、限定されるものではないが、以下のものを含む。陽イオンタイプ：ペネトラチン、ＨＩＶ－ＴＡＴ－４７－５７、３４－５０ ＨＩＶ－１ Ｒｅｖ、ＦＨＶコート－３５－４９、オリゴアルギニン（Ｒ９－Ｒ１２）、ＣＣＭＶ Ｇａｇ－７－２５、Ｓ４１３－ＰＶ、ＶＰ２２、ＢＰ１６、ＤＰＶ３、ＤＰＶ６、ＦＡＨコート、プロタミン１、ヒトｃＪｕｎ、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ－２、Ｉｓｌｅｔ－１、ＨｏｘＡ－１３、ＴＰ１０など；両親媒性タイプ：トランスポータン、トランスポータン１０、Ｐｅｐ－１、ＭＰＧα、ＭＰＧβ、ＣＡＤＹ、Ｐｅｐｆｅｃｔ６、Ｐｅｐｆｅｃｔ１４、Ｐｅｐｆｅｃｔ１５、ＮｉｃｋＦｅｃｔ、Ｈｅｌ、ｓＣ１８、ｐＶＥＣ、ＡＲＦ（１－２２）、ＹＴＡ２、ＰＡＲ１（パルミトイル－ＳＦＬＬＲＮ）、Ｆ２Ｐａｌ１０（パルミトイル－ＳＦＬＬＲＮ）、ＢｐｒＰｐ（１－３０）、ｈＬＦペプチド（１９－４０）、ブフォリン２、クロタミン、アズリンｐ１８、ｈＣＴペプチド（１８－３２）、Ｓ４１３－ＰＶｒｅｖなど；疎水性タイプ：カポジ肉腫線維芽細胞成長因子、メガネカイマン（Ｃａｉｉｍａｎ ｃｒｏｃｏｄｉｌｕｓ）のＩｇ軽鎖のシグナル配列、インテグリンβ３断片、Ｇｒｂ２－ＳＨ２ドメイン、ＨＩＶ－１ ｇｐ４１（１－２３）、ＨＢＶ移行モチーフ、精子－卵融合タンパク質（８９－１１１）、ヒトカルシトニン（９－３２）、Ｐｅｐ－７、Ｃ１０５Ｙ、Ｋ－ＦＧＦなど。
【0025】
加えて、本発明の融合タンパク質で使用されるＣＰＰは、そのポリペプチド配列が、分子の細胞取り込みを促進するその生物活性を依然として保持している限り、上述のポリペプチド配列のいずれかと比較して、約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列から選択することもできる。
【0026】
あるいくつかの実施形態では、細胞透過性ペプチドが、ペネトラチン（配列番号４２）、Ｔａｔ由来ペプチド、Ｒｅｖ（３４－５０）（配列番号４４）、ＶＰ２２（配列番号４５）、トランスポータン（配列番号４６）、Ｐｅｐ－１（配列番号４７）、Ｐｅｐ－７（配列番号４８）、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。あるいくつかの実施形態では、Ｔａｔ由来ペプチドがＴａｔ（４８－６０）（配列番号１０）またはＴａｔ（４７－５７）（配列番号４３）から選択される。
【0027】
あるいくつかの実施形態では、細胞透過性ペプチドが、Ｔａｔ（４８－６０）などのＴａｔ由来ペプチドを含む。あるいくつかの実施形態では、細胞透過性ペプチドが、以下の配列：配列番号１０を含むか、それからなる。
【0028】
一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端へと、ｐＨ感受性融合ペプチド、細胞透過性ペプチド、およびプロテアーゼ認識配列を含む。あるいくつかの実施形態では、融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端へと、ｐＨ感受性融合ペプチド、細胞透過性ペプチド、フーリン認識配列、およびカテプシンＬ認識配列を含む。あるいくつかの実施形態では、融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端へと、ｐＨ感受性融合ペプチド、細胞透過性ペプチド、カテプシンＬ認識配列、およびフーリン認識配列を含む。
【0029】
他の実施形態では、本発明の融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端へと、細胞透過性ペプチド、ｐＨ感受性融合ペプチド、およびプロテアーゼ認識配列を含む。あるいくつかの実施形態では、融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端へと、細胞透過性ペプチド、ｐＨ感受性融合ペプチド、フーリン認識配列、およびカテプシンＬ認識配列を含む。あるいくつかの実施形態では、融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端へと、細胞透過性ペプチド、ｐＨ感受性融合ペプチド、カテプシンＬ認識配列、およびフーリン認識配列を含む。
【0030】
あるいくつかの例示の実施形態では、融合タンパク質が、配列番号１２～１４から選択される配列を含むか、配列番号１２～１４のいずれか１つに示す配列からなる。
【0031】
あるいくつかの実施形態では、融合タンパク質が、そのＮ末端にタンパク質タグをさらに含んでいてもよい。一部の実施形態では、タンパク質タグが可溶化効果を有する。あるいくつかの実施形態では、タンパク質タグがＴｒｘＡ、ＳＵＭＯ、ＮｕｓＡ、ＭＢＰ、ＧＳＴから選択される。
【0032】
本発明の第２の態様は、第１の態様に記載の融合タンパク質を基礎にして特異的結合配列をさらに含む融合タンパク質であって、特異的結合配列が、追加の分子（例えばポリペプチド、タンパク質、または核酸（例えば、ＤＮＡ）など）がそれに特異的に結合するのを可能にする、融合タンパク質も提供する。本明細書で使用する場合、「特異的な結合」または「特異的に結合する」という用語は、ヘテロ二量体を形成する、２個の分子の間のランダムではない結合反応、例えば、抗体（またはその抗原結合性断片）とそれが向けられた抗原（またはエピトープ）の間の反応など、または２つのアミノ酸配列（例えば、２つの逆平行ロイシンジッパードメイン）間の反応を指す。
【0033】
あるいくつかの実施形態では、特異的結合配列がロイシンジッパーペプチドを含み、ロイシンジッパーペプチドがその相補ペプチドとヘテロ二量体を形成することができる。あるいくつかの実施形態では、特異的結合配列がロイシンジッパーＮＺまたはＣＺを含む。ロイシンジッパーＮＺとＣＺは、互いに相補ペプチドであり、この二者の間には強い相互作用があり、それにより、逆平行ロイシンジッパーＮＺおよびＣＺは、ヘテロ二量体を形成することができることが当技術分野で知られている。あるいくつかの実施形態では、ロイシンジッパーＮＺが、配列番号４９に示す配列を含む。あるいくつかの実施形態では、ロイシンジッパーＣＺが、配列番号５０に示す配列を含む。
【0034】
一部の実施形態では、特異的結合配列が、配列番号４９に示す配列を含む。他の実施形態では、特異的結合配列が、配列番号５０に示す配列を含む。
【0035】
あるいくつかの実施形態では、特異的結合配列がプロテアーゼ認識配列のＣ末端に位置する。あるいくつかの実施形態では、融合タンパク質がそのＣ末端に特異的結合配列を含む。
【0036】
あるいくつかの実施形態では、融合タンパク質がそのＮ末端にタンパク質タグをさらに含むことができる。一部の実施形態では、タンパク質タグが可溶化効果を有する。あるいくつかの実施形態では、タンパク質タグがＴｒｘＡ、ＳＵＭＯ、ＮｕｓＡ、ＭＢＰ、ＧＳＴから選択される。
【0037】
融合タンパク質の調製
本発明の融合タンパク質が、当技術分野で知られている様々な方法、例えば、遺伝子操作方法（組換え技術）または化学合成方法（例えば、Ｆｍｏｃ固相法）によって、調製することができる。本発明の融合タンパク質が、その生成方法によって限定されない。
本発明の融合タンパク質が、当技術分野で知られている様々な方法、例えば、遺伝子操作方法（組換え技術）または化学合成方法（例えば、Ｆｍｏｃ固相法）によって、調製することができる。本発明の融合タンパク質が、その生成方法によって限定されない。
【0038】
したがって、別の態様では、本発明が、本発明の第１または第２の態様の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。
【0039】
別の態様では、本発明が、上述の単離された核酸分子を含むベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターなど）を提供する。あるいくつかの実施形態では、ベクターが、例えば、プラスミド、コスミド、ファージなどである。
【0040】
別の態様では、本発明が、上述の単離された核酸分子またはベクターを含む宿主細胞を提供する。そのような宿主細胞は、限定されるものではないが、大腸菌細胞などの原核細胞、ならびに酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、および動物細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えばマウス細胞、ヒト細胞など）などの真核細胞を含む。
【0041】
別の態様では、本発明の第１または第２の態様の融合タンパク質を調製するための方法であって、融合タンパク質の発現を可能にする条件下で上述の宿主細胞を培養するステップと、培養された宿主細胞の培養物から融合タンパク質を回収するステップとを含む方法が提供される。
【0042】
複合体
別の態様では、本発明が、本発明の第１または第２の態様の融合タンパク質およびカーゴ分子（カーゴ）を含む複合体を提供する。カーゴ分子はいかなる分子でもよい。
別の態様では、本発明が、本発明の第１または第２の態様の融合タンパク質およびカーゴ分子（カーゴ）を含む複合体を提供する。カーゴ分子はいかなる分子でもよい。
【0043】
あるいくつかの実施形態では、カーゴ分子が、核酸、ペプチドまたはタンパク質、炭水化物、脂質、化学化合物、およびこれらの任意の混合物からなる群から選択される。
【0044】
あるいくつかの実施形態では、核酸が、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
【0045】
あるいくつかの実施形態では、カーゴ分子が１００００Ｄａ未満、例えば、５０００Ｄａ未満、３０００Ｄａ未満、または１０００Ｄａ未満の分子量を有する。
【0046】
一部の実施形態では、カーゴ分子が、検出可能な標識、例えば、酵素、放射性核種、蛍光色素、化学発光物質、またはビオチンなどを含む。
【0047】
あるいくつかの実施形態では、カーゴ分子がエピトープタグ、レポーター遺伝子配列、および／または核移行シグナル（ＮＬＳ）配列を含む。あるいくつかの実施形態では、カーゴ分子がペプチドまたはタンパク質である。
【0048】
カーゴ分子で使用することができるエピトープタグが、当業者にはよく知られており、その例が、限定されるものではないが、以下のもの：Ｈｉｓ、Ｖ５、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ｍｙｃ、ＶＳＶ－Ｇ、Ｔｒｘなどを含み、当業者は所望の目的に応じて適切なエピトープタグを選択する方法（例えば、精製、検出、または追跡）を知っている。あるいくつかの例示の実施形態では、カーゴ分子がＨｉｓタグを含む。
【0049】
カーゴ分子で使用することができるレポーター遺伝子配列が、当業者によく知られており、その例が、限定されるものではないが、ＧＳＴ、ＨＲＰ、ＣＡＴ、ＧＦＰ、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰなどを含む。
【0050】
カーゴ分子で使用することができる核移行シグナル（ＮＬＳ）配列は、当業者によく知られており、その例は、限定されるものではないが、ＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳを含む。あるいくつかの例示の実施形態では、ＮＬＳ配列が配列番号１５で示される。
【0051】
一部の実施形態では、本発明の融合タンパク質がカーゴ分子と融合しており、カーゴ分子がペプチドまたはタンパク質である。あるいくつかの実施形態では、融合タンパク質が、第１の態様で定義されている通りである。
【0052】
あるいくつかの実施形態では、カーゴ分子が融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合している。あるいくつかの実施形態では、カーゴ分子が融合タンパク質のＣ末端に融合している。
【0053】
一部の実施形態では、本発明の複合体が単鎖ポリペプチドを含み、単鎖ポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端へと、ｐＨ感受性融合ペプチド、細胞透過性ペプチド、プロテアーゼ認識配列、およびカーゴ分子を含む。あるいくつかの実施形態では、単鎖ポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端へと、ｐＨ感受性融合ペプチド、細胞透過性ペプチド、フーリン認識配列、カテプシンＬ認識配列、およびカーゴ分子を含む。あるいくつかの実施形態では、単鎖ポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端へと、ｐＨ感受性融合ペプチド、細胞透過性ペプチド、カテプシンＬ認識配列、フーリン認識配列、およびカーゴ分子を含む。
【0054】
他の実施形態では、本発明の複合体が単鎖ポリペプチドを含み、単鎖ポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端へと、細胞透過性ペプチド、ｐＨ感受性融合ペプチド、プロテアーゼ認識配列、およびカーゴ分子を含む。あるいくつかの実施形態では、単鎖ポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端へと、細胞透過性ペプチド、ｐＨ感受性融合ペプチド、フーリン認識配列、カテプシンＬ認識配列、およびカーゴ分子を含む。あるいくつかの実施形態では、単鎖ポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端へと、細胞透過性ペプチド、ｐＨ感受性融合ペプチド、カテプシンＬ認識配列、フーリン認識配列、およびカーゴ分子を含む。
【0055】
あるいくつかの例示の実施形態では、カーゴ分子が、Ｚｎフィンガータンパク質（例えば、ＺＦＰ９）、プロテインホスファターゼ（例えば、Ｐｐｍ１ｂ）、またはＣａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９）である。「Ｃａｓエフェクタータンパク質」という表現は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのエフェクタータンパク質を指す。あるいくつかの例示の実施形態では、Ｚｎフィンガータンパク質またはＣａｓエフェクタータンパク質がＮＬＳ配列を含む。
【0056】
他の実施形態では、本発明の融合タンパク質がカーゴ分子に化学的にカップリングしている。「化学的にカップリングしている」という用語は、融合タンパク質で含有されている反応性基と、カーゴ分子に含有されている反応性基の間の化学反応で得られる結合であって、反応後、２つの部分が共有結合によって連結される、結合を指す。上記の化学反応（カップリング反応）の前に、別個の反応において、融合タンパク質、カーゴ分子、または両方を、それらがそれぞれ化学物質カップリングに必要な反応性基を含有することができるように、リンカー分子で修飾することができる。融合タンパク質またはカーゴ分子を修飾するのに使用されるリンカー分子の選択は、使用されるカップリング戦略に依存する。あるいくつかの実施形態では、融合タンパク質が、第１の態様で定義されている通りである。
【0057】
あるいくつかの実施形態では、共有結合がジスルフィド結合、リン酸ジエステル結合、ホスホロチオエート結合、アミド結合、アミン結合、チオエーテル結合、エーテル結合、エステル結合、または炭素－炭素結合である。
【0058】
あるいくつかの実施形態では、カーゴ分子が融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端にカップリングしている。あるいくつかの実施形態では、カーゴ分子が、融合タンパク質のＣ末端にカップリングしている。
【0059】
あるいくつかの実施形態では、カーゴ分子が核酸である。
他の実施形態では、本発明の融合タンパク質がカーゴ分子と非共有結合的に接続している。
他の実施形態では、本発明の融合タンパク質がカーゴ分子と非共有結合的に接続している。
【0060】
あるいくつかの実施形態では、融合タンパク質が、静電相互作用を介してカーゴ分子とコンジュゲートしている。あるいくつかの実施形態では、カーゴ分子が核酸である。
【0061】
一部の実施形態では、融合タンパク質が、第２の態様で定義されている通りであり、融合タンパク質が、それが含有する特異的結合配列を介して、カーゴ分子と非共有結合的に接続している。そのような実施形態では、カーゴ分子が、融合タンパク質中の特異的結合配列に特異的に結合することができるドメインを含む。
【0062】
一部の実施形態では、融合タンパク質中の特異的結合配列に特異的に結合することができるドメインがアミノ酸配列である。
【0063】
あるいくつかの実施形態では、カーゴ分子がペプチドまたはタンパク質である。一部の実施形態では、カーゴ分子が、融合タンパク質中の特異的結合配列に特異的に結合することができるアミノ酸配列を、そのＮ末端に含む。
【0064】
あるいくつかの実施形態では、融合タンパク質中の特異的結合配列がロイシンジッパーペプチドを含み、カーゴ分子が、ロイシンジッパーの相補ペプチドを含み、それにより、ロイシンジッパーペプチドと相補ペプチドがヘテロ二量体を形成することができる。
【0065】
あるいくつかの実施形態では、融合タンパク質中の特異的結合配列がロイシンジッパーＮＺ（例えば、配列番号４９に示すもの）を含み、カーゴ分子がロイシンジッパーＣＺ（例えば、配列番号５０に示すもの）を含む。
【0066】
あるいくつかの実施形態では、融合タンパク質中の特異的結合配列がロイシンジッパーＣＺ（例えば、配列番号５０に示すもの）を含み、カーゴ分子がロイシンジッパーＮＺ（例えば、配列番号４９に示すもの）を含む。
【0067】
複合体の調製
本発明の複合体は、当技術分野で知られている様々な方法、例えば、遺伝子操作方法（組換え技術）または化学合成方法（例えば、Ｆｍｏｃ固相法）によって、調製することができる。本発明の複合体は、それが生成される方法によって限定されない。
本発明の複合体は、当技術分野で知られている様々な方法、例えば、遺伝子操作方法（組換え技術）または化学合成方法（例えば、Ｆｍｏｃ固相法）によって、調製することができる。本発明の複合体は、それが生成される方法によって限定されない。
【0068】
一部の実施形態では、複合体が、共に融合している融合タンパク質およびカーゴ分子を含む場合、本発明の複合体を遺伝子操作組み換え技術によって得ることができる。例えば、複合体をコードしているＤＮＡ分子を化学合成またはＰＣＲ増幅によって得ることができる。得られるＤＮＡ分子を発現ベクターに挿入し、次いで、宿主細胞をトランスフェクションすることができる。次いで、トランスフェクションされた宿主細胞を特定の条件下で培養することができ、このようにして、本発明の複合体を発現させることができる。
【0069】
したがって、別の態様では、本発明は、上述の複合体をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。
【0070】
別の態様では、本発明は、上述の単離された核酸分子を含むベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）を提供する。あるいくつかの実施形態では、ベクターが、例えば、プラスミド、コスミド、ファージなどである。
【0071】
別の態様では、本発明は、上述の単離された核酸分子またはベクターを含む宿主細胞を提供する。そのような宿主細胞は、限定されるものではないが、大腸菌細胞などの原核細胞、ならびに酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、および動物細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えばマウス細胞、ヒト細胞など）などの真核細胞を含む。
【0072】
別の態様では、上述の複合体を調製するための方法であって、複合体の発現を可能にする条件下で上述の宿主細胞を培養するステップと、培養された宿主細胞の培養物から複合体を回収するステップとを含む方法が提供される。
【0073】
他の実施形態では、複合体が、化学的にカップリングしている融合タンパク質およびカーゴ分子を含む場合、本発明の複合体は、以下の例示の方法によって得ることができる。すなわち、融合タンパク質をカーゴ分子と、融合タンパク質およびカーゴ分子に含有されている反応性基が化学反応を行って、それにより、２つの部分が共有結合によって接続されることを可能にする条件下で混合することである。一部の実施形態では、この方法がさらに以下を含む。すなわち、融合タンパク質、カーゴ分子、または両方を、それらの各々が上記の化学反応に必要な反応性基を含有するようにリンカー分子で修飾することである。あるいくつかの実施形態では、カーゴ分子が核酸である。
【0074】
他の実施形態では、複合体が、静電相互作用によってコンジュゲートしている融合タンパク質およびカーゴ分子を含む場合、本発明の複合体は、以下の例示の方法によって得ることができる。すなわち、（１）本発明の融合タンパク質をカーゴ分子と混合して、混合物を形成させること；および（２）融合タンパク質とカーゴ分子が複合体を形成するように混合物をインキュベートすることである。あるいくつかの実施形態では、カーゴ分子が核酸である。
【0075】
他の実施形態では、複合体が、共有結合ではない特異的な結合によって接続されている融合タンパク質およびカーゴ分子を含む場合、本発明の複合体は、以下の例示の方法によって得ることができる。すなわち、（１）本発明の第２の態様の融合タンパク質を、融合タンパク質中の特異的結合配列と特異的に結合するドメインを含むカーゴ分子と混合すること、および（２）融合タンパク質とカーゴ分子が複合体を形成するように混合物をインキュベートすることである。あるいくつかの実施形態では、カーゴ分子がポリペプチドまたはタンパク質である。
【0076】
組成物
本発明の融合タンパク質を、非共有結合性の相互作用を介してカーゴ分子と接続させることができる場合、融合タンパク質とカーゴ分子を混合することによって送達複合体を得ることができる。したがって、別の態様では、本発明は、本発明の融合タンパク質およびカーゴ分子を含む組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）も提供する。
本発明の融合タンパク質を、非共有結合性の相互作用を介してカーゴ分子と接続させることができる場合、融合タンパク質とカーゴ分子を混合することによって送達複合体を得ることができる。したがって、別の態様では、本発明は、本発明の融合タンパク質およびカーゴ分子を含む組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）も提供する。
【0077】
あるいくつかの実施形態では、カーゴ分子が、核酸、ペプチドまたはタンパク質、炭水化物、脂質、化学化合物、およびこれらの任意の混合物からなる群から選択される。あるいくつかの実施形態では、核酸が、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。
【0078】
あるいくつかの実施形態では、カーゴ分子が核酸から選択される。
あるいくつかの実施形態では、カーゴ分子がポリペプチドまたはタンパク質である。
あるいくつかの実施形態では、カーゴ分子がポリペプチドまたはタンパク質である。
【0079】
あるいくつかの実施形態では、融合タンパク質が、第２の態様で定義されている通りである。カーゴ分子は、融合タンパク質中の特異的結合配列に特異的に結合することができるドメインを含む。
【0080】
用途および方法
本発明の融合タンパク質は、カーゴ分子をエンドソームから効率的に放出することができ、ひとたびカーゴ分子が細胞質で利用可能になれば、カーゴ分子はそれに関係するいかなる役割も果たすことができる。したがって、本発明の融合タンパク質は、細胞内送達剤として使用することができ、研究ならびに治療および診断用途でさらに用いることができる。
本発明の融合タンパク質は、カーゴ分子をエンドソームから効率的に放出することができ、ひとたびカーゴ分子が細胞質で利用可能になれば、カーゴ分子はそれに関係するいかなる役割も果たすことができる。したがって、本発明の融合タンパク質は、細胞内送達剤として使用することができ、研究ならびに治療および診断用途でさらに用いることができる。
【0081】
したがって、別の態様では、本発明は、本発明の融合タンパク質、複合体、組成物、単離された核酸分子、ベクター、または宿主細胞と、薬学的に許容される担体および／または添加剤とを含む医薬組成物を提供する。
【0082】
あるいくつかの実施形態では、複合体または組成物に含有されているカーゴ分子が医薬活性剤である。
【0083】
あるいくつかの実施形態では、複合体または組成物に含有されているカーゴ分子が検出可能な標識である。標識は、診断、薬物処分（例えば、吸収、分布、代謝、排泄）の研究、治療または薬物の有効性もしくは副作用の研究などに使用することができる。
【0084】
別の態様では、本発明は、医薬の製造における、本発明の融合タンパク質、または融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子、ベクター、もしくは宿主細胞の、送達剤（例えば、細胞内送達剤および／またはトランスフェクション剤）としての使用にも関する。
【0085】
別の態様では、本発明は、疾患を治療するための医薬の製造における、本発明の複合体、または組成物、または複合体もしくは組成物をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子、ベクター、もしくは宿主細胞の使用であって、複合体または組成物に含有されているカーゴ分子が疾患を治療することができる、使用にも関する。
【0086】
あるいくつかの実施形態では、疾患が、プログラム細胞死に関連する疾患であり、カーゴ分子がプロテインホスファターゼ１Ｂを含む。あるいくつかの実施形態では、プログラム細胞死に関連する疾患が、肝損傷（例えば、薬物性肝損傷）、炎症性疾患、虚血－再灌流傷害、および／または神経変性疾患を含む。
【0087】
本発明の融合タンパク質、複合体もしくは組成物、または医薬組成物は、医学分野で知られているいかなる形態であってもよく、例えば、それは、錠剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤（注射液、凍結乾燥粉末剤を含む）、吸入剤、スプレー剤、および他の形態であってもよい。好ましい剤形は、意図されている投与様式および治療用途に依存する。
【0088】
本発明の融合タンパク質、複合体もしくは組成物、または医薬組成物は、限定されるものではないが、経口、直腸、非経口、または局所投与を含めた、当技術分野で知られているいかなる適した方法によって投与してもよい。
【0089】
投与の例示の経路は、経口投与である。経口投与用の液体剤形には、薬学的に許容される乳剤、マイクロエマルジョン剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤などが含まれる。活性成分に加えて、液体剤形は、当技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エタノール、イソプロパノール、酢酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブタンジオール、ジメチルホルムアミド、油（例えば、綿実油、ピーナッツ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの任意の混合物などを含んでもよい。経口投与用の液体剤形は、不活性希釈剤に加えて、補助剤、例えば、湿潤剤、乳化・懸濁剤、甘味料、香料、および芳香剤なども含んでもよい。経口投与用の固体剤形には、カプセル剤、錠剤、丸剤、トローチ剤、散剤、顆粒剤などが含まれる。固体剤形は、活性成分に加えて、薬学的に許容される不活性添加剤または担体、例えば、賦形剤（例えば、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、デンプン、結晶セルロース、ガラクトース、クロスポビドン、および硫酸カルシウム）；結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、およびアラビアゴム）；湿潤剤（例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセリン）；崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム、デンプン、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルデンプンナトリウム）；潤滑剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）；およびこれらの任意の混合物などを含んでもよい。
【0090】
本発明の融合タンパク質、複合体もしくは組成物または医薬組成物は、非経口経路によって投与してもよい。
【0091】
したがって、投与の別の例示の経路は、非経口投与、例えば、皮下注射、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、胸骨内注射、および注入である。非経口投与用の剤形は、注射液、注射用の無菌粉末剤、または注射用の濃縮液を含めた、注射製剤であってもよい。注射剤形は、活性成分に加えて、薬学的に許容される担体、例えば、無菌水、リンゲル液、および生理食塩水などを含んでもよく、薬物の特性にしたがって、適切な添加剤、例えば、抗酸化剤、緩衝剤、および静菌剤なども添加してもよい。
【0092】
投与の別の例示の経路は、局所投与、例えば、経皮投与（例えば、経皮吸収型貼付剤またはイオン泳動装置による投与）、眼内投与、または鼻腔内もしくは吸入投与などである。経皮投与用の剤形は、局所ゲル、スプレー剤、軟膏剤、およびクリーム剤でありうる。局所剤形は、活性成分に加えて、皮膚または他の作用区域を通した活性化合物の吸収または浸透を増強する成分を含んでもよい。
【0093】
投与の別の例示の経路は、直腸投与である。直腸投与用の剤形は、坐剤でありうる。
加えて、薬品分野で知られている他の担体材料および投与方法も使用することができる。本発明の融合タンパク質、複合体もしくは組成物、または医薬組成物は、製剤および投与のための有効な方法など、いかなる既知の製剤プロセスで調製してもよい。
加えて、薬品分野で知られている他の担体材料および投与方法も使用することができる。本発明の融合タンパク質、複合体もしくは組成物、または医薬組成物は、製剤および投与のための有効な方法など、いかなる既知の製剤プロセスで調製してもよい。
【0094】
別の態様では、本発明は、本発明の融合タンパク質、複合体、組成物、単離された核酸分子、ベクター、または宿主細胞を含むキットを提供する。あるいくつかの実施形態では、キットは、トランスフェクションおよび／または細胞内送達のための説明書をさらに含む。あるいくつかの実施形態では、キットは、カーゴ分子（例えば、核酸、ペプチドまたはタンパク質、炭水化物、脂質、化学化合物、およびこれらの任意の混合物）のトランスフェクションおよび／または細胞内送達のために使用される。あるいくつかの実施形態では、細胞が哺乳動物細胞、例えばヒト細胞など、である。
【0095】
別の態様では、本発明は、本発明の融合タンパク質、複合体、組成物、単離された核酸分子、ベクター、または宿主細胞の、送達試薬（例えば、トランスフェクション試薬または細胞内送達試薬）としての使用にも関する。あるいくつかの実施形態では、送達剤は、カーゴ分子（例えば、核酸、ペプチドまたはタンパク質、炭水化物、脂質、化学化合物、およびこれらの任意の混合物）の細胞内送達のために使用される。あるいくつかの実施形態では、細胞が哺乳動物細胞（例えばヒト細胞）である。
【0096】
別の態様では、本発明は、細胞に分子を送達するための方法であって、細胞を本発明の複合体と接触させることを含み、複合体が分子を含む方法を提供する。
あるいくつかの実施形態では、細胞を複合体と接触させることがインビボで行われる。
あるいくつかの実施形態では、細胞を複合体と接触させることがエクスビボで行われる。
あるいくつかの実施形態では、細胞を複合体と接触させることがインビトロで行われる。
あるいくつかの実施形態では、細胞が真核細胞、例えば哺乳動物細胞など、例えばヒト細胞など、である。
あるいくつかの実施形態では、細胞を複合体と接触させることがインビボで行われる。
あるいくつかの実施形態では、細胞を複合体と接触させることがエクスビボで行われる。
あるいくつかの実施形態では、細胞を複合体と接触させることがインビトロで行われる。
あるいくつかの実施形態では、細胞が真核細胞、例えば哺乳動物細胞など、例えばヒト細胞など、である。
【0097】
用語の定義
本発明において、他に明記しない限り、本明細書で使用される科学用語および技術用語は、当業者が通常に理解する意味を有する。また、ここで用いられる細胞培養、生化学、核酸化学、免疫学の実験手順はすべて、当該分野で広く用いられている常套的な工程である。同時に、本発明をよりよく理解する目的で、関連用語の定義および説明を以下に示す。
本発明において、他に明記しない限り、本明細書で使用される科学用語および技術用語は、当業者が通常に理解する意味を有する。また、ここで用いられる細胞培養、生化学、核酸化学、免疫学の実験手順はすべて、当該分野で広く用いられている常套的な工程である。同時に、本発明をよりよく理解する目的で、関連用語の定義および説明を以下に示す。
【0098】
本明細書で使用する場合、「単離された」という用語は、人工の手段で天然の状態から取得されていることを指す。ある「単離された」物質またはコンポーネントが天然に存在する場合、それは、その物質が位置する自然環境が変化しているか、その物質が自然環境から分離されているか、その両方が起こっているということでありうる。例えば、生きている動物に天然に存在する、ある単離されていないポリヌクレオチドまたはポリペプチドについて、この天然の状態から単離された高純度の同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離された」と呼ばれる。「単離された」という用語は、人工または合成の物質の存在を除外しないし、それは、物質の活性に影響を及ぼさない他の不純物質の存在を除外しない。
【0099】
本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドをその中に挿入することができる核酸送達ビヒクルを指す。挿入されているポリヌクレオチドによってコードされているタンパク質をベクターが発現することができる場合、ベクターは、発現ベクターと呼ばれる。形質転換、形質導入、またはトランスフェクションを介して、ベクターが保持する遺伝物質エレメントが宿主細胞内で発現できるように、ベクターを宿主細胞に導入することができる。ベクターは、当業者にはよく知られており、限定されるものではないが、プラスミド；ファージミド；コスミド；人工の染色体、例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）など；ファージ、例えば、ラムダファージまたはＭ１３ファージなど、および動物ウイルスを含む。ベクターとして使用することができる動物ウイルスは、限定されるものではないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポーバウイルス（例えばＳＶ４０）を含む。ベクターは、限定されるものではないが、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメント、およびレポーター遺伝子を含めた、発現を制御する様々なエレメントを含有することができる。加えて、ベクターは、複製起点も含有してもよい。
【0100】
本明細書で使用する場合、「宿主細胞」という用語は、限定されるものではないが、原核細胞、例えば、大腸菌もしくは枯草菌など、真菌細胞、例えば、酵母細胞もしくはアスペルギルス属など、昆虫細胞、例えば、Ｓ２ショウジョウバエ細胞もしくはＳｆ９など、または動物細胞、例えば、線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、もしくはヒト細胞など、を含めた、ベクターを導入することができる細胞を指す。
【0101】
本明細書で使用する場合、「同一性」という用語は、２つのポリペプチドの間または２つの核酸の間の一致の程度を指す。比較用の２つの配列が、ある部位で、同じ単量体サブユニットの塩基またはアミノ酸を有する（例えば、２つのＤＮＡ分子の各々が、ある部位にアデニンを有するか、２つのポリペプチドの各々が、ある部位にリジンを有する）場合、２つの分子はその部位で同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列によって共有されている同一な部位の数を比較用の部位の総数で割った数×１００という関数である。例えば、２つの配列の１０部位のうち、６部位が一致している場合、これらの２つの配列は、６０％の同一性を有する。例えば、ＤＮＡ配列：ＣＴＧＡＣＴとＣＡＧＧＴＴは、５０％の同一性（６部位のうち、３部位が一致している）を共有している。一般に、２つの配列の比較は、最大の同一性を生成するように行われる。そのような整列化は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８巻、４４３～４５３ページ、１９７０）の方法に基づくＡｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）などのコンピュータープログラムを用いて行うことができる。２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、４巻、１１～１７ページ（１９８８））のアルゴリズムを用い、ＰＡＭ１２０重み付き残基表、ギャップ長ペナルティー１２、およびギャップペナルティー４を用いても決定することもできる。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性の百分率は、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重みおよび１、２、３、４、５、または６の長さ重みを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）中のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８巻、４４４～４５３ページ（１９７０））のアルゴリズムで決定することができる。
【0102】
本明細書に含まれる２０種の従来のアミノ酸は、慣習的な様式で表現されている。例えば、参照により本明細書に組み込まれているＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ－Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版、Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、Ｍａｓｓ．（１９９１））参照。本発明において、「ポリペプチド」および「タンパク質」というは、同じ意味を有し、互換的に用いることができる。また、本発明において、アミノ酸は、通常、当技術分野でよく知られている１文字および３文字省略形で表される。例えば、アラニンは、ＡまたはＡｌａで表すことができる。
【0103】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体および／または添加剤」という用語は、対象および活性成分と薬理的および／または生理的に適合性である担体および／または添加剤を指し、これらは、当技術分野でよく知られており（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ編、第１９版、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５参照）、限定されるものではないが、ｐＨ調整剤、界面活性剤、イオン強度増強剤、浸透圧を維持するための薬剤、吸収を遅らせるための薬剤、希釈剤、アジュバント、保存料、安定剤などを含む。例えば、ｐＨ調整剤は、限定されるものではないが、リン酸緩衝剤を含む。界面活性剤は、限定されるものではないが、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ－８０など、を含む。イオン強度増強剤は、限定されるものではないが、塩化ナトリウムを含む。浸透圧を維持するための薬剤は、限定されるものではないが、糖、ＮａＣｌなどを含む。吸収を遅らせるための薬剤は、限定されるものではないが、モノステアリン酸およびゼラチンを含む。希釈剤は、限定されるものではないが、水、水性緩衝剤（例えば、緩衝生理食塩水）、アルコールおよびポリオール（例えば、グリセロール）などを含む。アジュバントは、限定されるものではないが、アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アンモニウム）、フロイントアジュバント（例えば、完全フロイントアジュバント）などを含む。保存料は、限定されるものではないが、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、チメロサール、２－フェノキシエタノール、パラベン、トリクロロ－ｔｅｒｔ－ブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含む。安定剤は、当業者が一般的に理解する意味を有し、薬物中の活性成分の所望の活性（例えば、ＰＳＤ－９５ユビキチン化の阻害活性）を安定化することができ、限定されるものではないが、グルタミン酸ナトリウム、ゼラチン、ＳＰＧＡ、サッカライド（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、ラクトース、デキストラン、またはグルコース）、アミノ酸（例えば、グルタミン酸、グリシン）、タンパク質（例えば、乾燥乳清、アルブミン、またはカゼイン）またはその分解産物（例えば、ラクトアルブミン加水分解物）などを含む。
【0104】
本明細書で使用する場合、「治療」という用語は、有益であるか所望の臨床結果を得るために行われる方法を指す。本発明の目的では、有益であるか所望の臨床結果は、限定されるものではないが、検出可能であるか検出可能でないかを問わず、症状を軽減すること、疾患の範囲を狭めること、病状を安定化する（すなわち悪化させない）こと、疾患の進行を遅延させるか緩徐にすること、および症状を寛解させること（部分的または完全に）を含む。加えて、「治療」は、（治療を受けない場合に）期待される生存時間と比べた生存期間の延長も指すことがある。
【0105】
本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、哺乳動物、例えば、霊長類哺乳動物など、例えば、ヒトなど、を指す。
【0106】
本発明の有益な効果
本発明の送達系は、カーゴ分子がその対応する生物学的機能を完全に発揮することができるように、エンドソームからのカーゴ分子の放出を有意に改善し、それによって、カーゴ分子の細胞質送達効率を大幅に向上させることができる。したがって、本発明の送達系は、細胞の生物学的機序および経路に影響を与える有効な手段を提供し、研究、治療、診断などの多くの分野で用いることができ、広範な用途の見通しおよび臨床価値を有する。
本発明の送達系は、カーゴ分子がその対応する生物学的機能を完全に発揮することができるように、エンドソームからのカーゴ分子の放出を有意に改善し、それによって、カーゴ分子の細胞質送達効率を大幅に向上させることができる。したがって、本発明の送達系は、細胞の生物学的機序および経路に影響を与える有効な手段を提供し、研究、治療、診断などの多くの分野で用いることができ、広範な用途の見通しおよび臨床価値を有する。
【0107】
本発明の実施形態について、添付の図面および例とともに以下に詳細に記載する。しかし、当業者ならば、以下の図面および例は、本発明を説明することのみに用いられており、本発明の範囲を限定しないことを理解するであろう。添付の図面および好ましい実施形態の以下の詳細な説明によれば、本発明の様々な目的および有利な態様は、当業者は明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【0108】
【図1】実施例１におけるエンドソームからの脱出効率を検出するためのスプリットＧＦＰシステムの原理の概略図である。
【図2】実施例１における送達系－ＧＦＰβ１－１０タンパク質複合体の構造の概略図である。
【図3】実施例１における送達系－ＧＦＰβ１－１０複合体のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図4】実施例１における送達系－ＧＦＰβ１－１０複合体のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図5】実施例１におけるＧＦＰβ１－１０による形質導入のための送達系のフローサイトメトリー分析の結果を示す図である。
【図6】実施例１におけるＧＦＰβ１－１０による形質導入のための送達系の蛍光顕微鏡観察の結果を示す図である。
【図7】実施例１におけるＧＦＰβ１－１０の形質導入のための、酵素切断部位に変異を含有する送達系のフローサイトメトリー分析の結果を示す図である。
【図8】実施例１における送達系による形質導入の後における、細胞内の切断されたＧＦＰβ１－１０および切断されていない／完全なＧＦＰβ１－１０の相対比率ならびにそれらの細胞内残留時間のウエスタンブロット検出結果を示す図である。
【図9】実施例１における酵素切断部位に変異を含有している送達系による形質導入の後における、細胞内の切断されたＧＦＰβ１－１０および切断されていない／完全なＧＦＰβ１－１０の相対比率のウエスタンブロット検出結果を示す図である。
【図10】実施例１における酵素切断部位に変異を含有しているが、ｐＨ感受性ペプチドを含有していない送達系による形質導入のフローサイトメトリー分析の結果を示す図である。
【図11】実施例１における酵素切断部位に変異を含有しているが、ｐＨ感受性ペプチドを含有していない送達系による形質導入の後における、細胞内の切断されたＧＦＰβ１－１０および切断されていない／完全なＧＦＰβ１－１０の相対比率のウエスタンブロット検出結果を示す図である。
【図12】実施例２における送達系－ＺＦＰ９複合体の構造の概略図を示す図である。
【図13】実施例２における送達系－ＺＦＰ９複合体のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図14】実施例２におけるＺＦＰ９結合部位を含有する真核生物発現プラスミドのマップを示す図である。
【図15】実施例２における送達系によるＺＦＰ９の形質導入のフローサイトメトリー分析の結果を示す図である。
【図16】実施例２における送達系によるＺＦＰ９の形質導入のフローサイトメトリー分析の結果を示す図である。
【図17】実施例３における送達系－Ｐｐｍ１ｂ複合体の構造の概略図を示す図である。
【図18】実施例３における送達系－Ｐｐｍ１ｂ複合体のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図19】実施例３におけるＴＮＦ－αで誘発された細胞壊死の比率に対する送達系－Ｐｐｍ１ｂ複合体の効果のフローサイトメトリー分析の結果を示す図である。
【図20】実施例４における送達系－Ｃａｓ９複合体の構造の概略図を示す図である。
【図21】実施例４における送達系－Ｃａｓ９複合体のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図22】実施例４におけるＨＥＫ２９３Ｔ－ＲＦＰレポーター細胞の使用による、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の編集効率の検出の原理の概略図を示す図である。
【図23】実施例４におけるＲＦＰレポーターレンチウイルスプラスミドのマップを示す図である。
【図24】実施例４における送達系－Ｃａｓ９複合体の遺伝子編集効率のフローサイトメトリー分析の結果を示す図である。
【図25】実施例５におけるアダプター方法をベースにした送達系の原理を示す図である。
【図26】実施例５におけるアダプター方法をベースにした送達系のための組換えタンパク質のクローン設計を示す図である。
【図27】実施例５におけるアダプター方法をベースにした送達系のための組換えタンパク質の精製結果を示す図である。
【図28】実施例５におけるスプリットＧＦＰエンドソーム脱出システムによるアダプターベースの送達系の送達効果の評価結果を示す図である。
【0109】
配列情報
本発明に関連する一部の配列の情報を下記の表１に示す。
本発明に関連する一部の配列の情報を下記の表１に示す。
【表1】
【実施例】
【0110】
実施例
これより以下の実施例を参照して、本発明を記述するが、実施例は、本発明を限定するのではなく、本発明を説明することを目的としている。
これより以下の実施例を参照して、本発明を記述するが、実施例は、本発明を限定するのではなく、本発明を説明することを目的としている。
【0111】
他に明記しない限り、本発明で使用される分子生物学の実験法およびイムノアッセイの方法は、基本的に、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９、およびＦＭ Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｏｍｐｉｌｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｇｕｉｄｅ、第３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９５に記載の方法を参照して行った。制限酵素は、製品の製造業者が推奨する条件で用いた。当業者は、実施例は、例示により本発明を記述するものであり、本発明によって保護しようとする範囲の限定を意図するものではないことを承知している。
【0112】
以下の実施例に含まれる主な試薬の供給源は、以下の通りである。
クローニングおよび構築に必要とされた材料は、以下の通りだった。ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ、Ｒ０４０Ａ）、ＤＮＡ回収キット（ＴｉａｎＧｅｎ、ＤＰ２１４－０３）、プラスミドミニキット（ＴｉａｎＧｅｎ、ＤＰ１０３－０３）、プラスミドラージスケールキット（ＱＩＡＧＥＮ、１２６６３）、５チューブのＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙプレミックス（ＮＥＢ、Ｅ２６１１Ｌ）、ＤＮＡマーカー（ＴｈｍｅｒｏＦｉｓｈｅｒ、ＳＭ０３３１）、アガロース（Ｂｉｏｗｅｓｔ、ＢＷ－Ｒ０１００）、
クローニングおよび構築に必要とされた材料は、以下の通りだった。ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ、Ｒ０４０Ａ）、ＤＮＡ回収キット（ＴｉａｎＧｅｎ、ＤＰ２１４－０３）、プラスミドミニキット（ＴｉａｎＧｅｎ、ＤＰ１０３－０３）、プラスミドラージスケールキット（ＱＩＡＧＥＮ、１２６６３）、５チューブのＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙプレミックス（ＮＥＢ、Ｅ２６１１Ｌ）、ＤＮＡマーカー（ＴｈｍｅｒｏＦｉｓｈｅｒ、ＳＭ０３３１）、アガロース（Ｂｉｏｗｅｓｔ、ＢＷ－Ｒ０１００）、
【0113】
大規模タンパク質発現に必要とされた材料は、以下の通りだった。ペプトン（ＢｉＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ、Ｔ７２９３－１ＫＧ）、イースト粉末（ＯＸＯＩＤ、ＬＰ００２１Ｂ）、塩化ナトリウム（Ｘｉｌｏｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、１００１１０１２ＡＲ）、ＩＰＴＧ（Ｉｎａｌｃｏ、１７５８－１４００）、
【0114】
タンパク質精製に必要とされた媒体は、以下の通りだった：ＳＰ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＦＡＳＴ ＦＬＯＷ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７－０７２９－０１）、ＮＩ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７－５２６８－０２）、
【0115】
タンパク質の精製と保存に必要とされた試薬は、以下の通りだった。グリセロール／グリセロール／Ｃ３Ｈ８Ｏ３（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ、Ｇ５５１６）、ＫＣｌ（Ｘｉｌｏｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、１００２００７）、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ（Ｘｉｌｏｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、１００１０６７ＡＲ）（ＫＨ２ＰＯ４（Ｘｉｌｏｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、１００２０４８ＡＲ５００）、イミダゾール（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ、Ｖ９００１５３）、Ｔｒｉｓベース（Ｓｅｅｂｉｏ、１８３９９５）、グルコース（Ｘｉｌｏｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、１０６４００８ＡＲ５００）、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２３２２７）；
細胞培養に必要とされた試薬：ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ、１００９９－１３３）、ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、１１９６５０９２）、トリプシン（ＡＭＲＥＳＣＯ、０４５８）；
レンチウイルスのパッケージングおよび感染に必要とされた試薬：レンチウイルスパッケージングプラスミド：ｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ、８４５４）、ｐＲＳＶ－Ｒｅｖ（Ａｄｄｇｅｎｅ、１２２５３）、ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ（Ａｄｄｇｅｎｅ、１２２５１）；Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ、０６３６６２４４００１）、ピューロマイシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、ａｎｔ－ｐｒ－５）、ブラストサイジン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、ａｎｔ－ｂｌ－５ｂ）、ポリブレン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－１３４２２０）；
実験で使用されたＧＦＰβ１－１０、ＺＦＰ９、Ｐｐｍ１ｂ、ｄｓＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、およびＨｉｓｔｏｎｅ－Ｈ３に関係するプラスミドは、すべては、Ｂｉｏｔｅｃｈによって合成された。Ｃａｓ９配列増幅用のプラスミドｐＣａｓＫＰ－ｈｐｈ（Ａｄｄｇｅｎｅ、１１７２３２）；
他の試薬：ＴＮＦ－α（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＦ０９）（ＰＩ（ＴｈｍｅｒｏＦｉｓｈｅｒ、Ｐ３５６６））
細胞培養に必要とされた試薬：ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ、１００９９－１３３）、ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、１１９６５０９２）、トリプシン（ＡＭＲＥＳＣＯ、０４５８）；
レンチウイルスのパッケージングおよび感染に必要とされた試薬：レンチウイルスパッケージングプラスミド：ｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ、８４５４）、ｐＲＳＶ－Ｒｅｖ（Ａｄｄｇｅｎｅ、１２２５３）、ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ（Ａｄｄｇｅｎｅ、１２２５１）；Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ、０６３６６２４４００１）、ピューロマイシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、ａｎｔ－ｐｒ－５）、ブラストサイジン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、ａｎｔ－ｂｌ－５ｂ）、ポリブレン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－１３４２２０）；
実験で使用されたＧＦＰβ１－１０、ＺＦＰ９、Ｐｐｍ１ｂ、ｄｓＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、およびＨｉｓｔｏｎｅ－Ｈ３に関係するプラスミドは、すべては、Ｂｉｏｔｅｃｈによって合成された。Ｃａｓ９配列増幅用のプラスミドｐＣａｓＫＰ－ｈｐｈ（Ａｄｄｇｅｎｅ、１１７２３２）；
他の試薬：ＴＮＦ－α（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＦ０９）（ＰＩ（ＴｈｍｅｒｏＦｉｓｈｅｒ、Ｐ３５６６））
【0116】
細胞系：ＨＥＫ－２９３Ｔ（ヒト腎上皮細胞）、Ｌ９２９（マウス線維芽細胞）。これらは、ＡＴＣＣから購入した。
【0117】
実施例１：送達系のエンドソーム脱出効率のスプリットＧＦＰシステムベースの評価
スプリットＧＦＰシステムでは、ＧＦＰの１１個のβ－プリーツシートが大きな断片（β１－１０）と小さな断片（β１１）に分割され、両者が蛍光活性を失うが、それらが遭遇すると、両者が自発的に結合し、ＧＦＰの蛍光性能を回復することができる。これをベースにして、本発明者らは、ヒストンβ１１を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を構築し、カーゴである核移行シグナル（ＮＬＳ）付きＧＦＰβ１－１０および評価される細胞内送達系を融合タンパク質として発現させ、安定細胞系の形質導入に用いた。送達系によってＧＦＰβ１－１０を形質導入したとき、それは、エンドソームからの脱出に成功し、細胞質または核に入った後にのみ、ＧＦＰβ１１に結合し、完全なＧＦＰを生むことができ、それにより、エンドソーム脱出効率をＧＦＰの比率および相対蛍光強度によって評価することができた（図１）。
スプリットＧＦＰシステムでは、ＧＦＰの１１個のβ－プリーツシートが大きな断片（β１－１０）と小さな断片（β１１）に分割され、両者が蛍光活性を失うが、それらが遭遇すると、両者が自発的に結合し、ＧＦＰの蛍光性能を回復することができる。これをベースにして、本発明者らは、ヒストンβ１１を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を構築し、カーゴである核移行シグナル（ＮＬＳ）付きＧＦＰβ１－１０および評価される細胞内送達系を融合タンパク質として発現させ、安定細胞系の形質導入に用いた。送達系によってＧＦＰβ１－１０を形質導入したとき、それは、エンドソームからの脱出に成功し、細胞質または核に入った後にのみ、ＧＦＰβ１１に結合し、完全なＧＦＰを生むことができ、それにより、エンドソーム脱出効率をＧＦＰの比率および相対蛍光強度によって評価することができた（図１）。
【0118】
１．１送達系－ＧＦＰβ１－１０タンパク質複合体発現ベクターの構築
ＴＡＴ（配列番号１０）、ＩＮＦ７（配列番号８）、プロテアーゼ切断部位（表２）、および核移行シグナル（ＮＬＳ）を含有するカーゴ分子ＧＦＰβ１－１０（配列番号２３）の組換えタンパク質発現ベクターの構築を行った。各組換えタンパク質の構造の概略図を図２に示し、Ｃ末端からＮ末端までのコンポーネントおよびそのアミノ酸配列を下記の表３に示す。構築方法は以下の通りだった。まず、送達系中のＴＡＴ、ＩＮＦ７、Ｎ、Ｎａ、Ｎｂ、Ｎｃ、Ｎｄ、Ｎｅ、Ｎｆ、変異体Ｎ、変異体Ｎｅ、およびカーゴ分子ＧＦＰβ１－１０の核酸配列をＰＣＲ増幅によって得た。これらのパーツを複数ラウンドのＰＣＲによって接続し、ＰＣＲの最終ラウンドで、フォワードプライマーにより、ＮｄｅＩ制限部位とｐＥＴ２１ｂ（＋）中の対応するＮｄｅＩ制限部位の上流のオーバーラップとを断片の５’末端に導入し、リバースプライマーにより、ＢａｍＨＩ制限部位とｐＥＴ－２１ｂ（＋）中の対応するＢａｍＨＩ制限部位の下流のオーバーラップとを断片の３’末端に導入した。ｐＥＴ－２１ｂ（＋）プラスミドをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで二重消化した。ＧＩＢＳＯＮ ａｓｓｅｍｂｌｙによって、オーバーラップのある挿入断片を、消化されたベクターｐＥＴ－２１ｂ（＋）に連結した。
ＴＡＴ（配列番号１０）、ＩＮＦ７（配列番号８）、プロテアーゼ切断部位（表２）、および核移行シグナル（ＮＬＳ）を含有するカーゴ分子ＧＦＰβ１－１０（配列番号２３）の組換えタンパク質発現ベクターの構築を行った。各組換えタンパク質の構造の概略図を図２に示し、Ｃ末端からＮ末端までのコンポーネントおよびそのアミノ酸配列を下記の表３に示す。構築方法は以下の通りだった。まず、送達系中のＴＡＴ、ＩＮＦ７、Ｎ、Ｎａ、Ｎｂ、Ｎｃ、Ｎｄ、Ｎｅ、Ｎｆ、変異体Ｎ、変異体Ｎｅ、およびカーゴ分子ＧＦＰβ１－１０の核酸配列をＰＣＲ増幅によって得た。これらのパーツを複数ラウンドのＰＣＲによって接続し、ＰＣＲの最終ラウンドで、フォワードプライマーにより、ＮｄｅＩ制限部位とｐＥＴ２１ｂ（＋）中の対応するＮｄｅＩ制限部位の上流のオーバーラップとを断片の５’末端に導入し、リバースプライマーにより、ＢａｍＨＩ制限部位とｐＥＴ－２１ｂ（＋）中の対応するＢａｍＨＩ制限部位の下流のオーバーラップとを断片の３’末端に導入した。ｐＥＴ－２１ｂ（＋）プラスミドをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで二重消化した。ＧＩＢＳＯＮ ａｓｓｅｍｂｌｙによって、オーバーラップのある挿入断片を、消化されたベクターｐＥＴ－２１ｂ（＋）に連結した。
【0119】
【表2】
【0120】
【表3】
【0121】
１．２ 送達システム－ＧＦＰβ１－１０複合体の発現および精製：
１．１に記載の発現プラスミドで大腸菌発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。形質転換後のプレートから単一コロニーを採取し、アンピシリン抵抗性を含有する５ｍｌのＬＢ液体培地中に播種し、終夜培養し、次いで、終夜培養された細菌培養物１ｍｌを、アンピシリン抵抗性を含有する５００ｍｌのＬＢ液体培地中に移し、続いて、細菌培養物のＯＤ６００が約０．６になるまで、３７℃、１８０ｒｐｍで培養し、次いで、誘導物質であるＩＰＴＧを、最終濃度０．２ｍＭになるまで添加し、続いて、２５℃で８時間誘導を行った。誘導の後、細菌細胞を、４℃、７０００ｇで１０分間の遠心分離の後、収集した。次いで、タンパク質精製用の平衡緩衝剤（グリセロール５０ｍｌ、ＮａＣｌ ８ｇ、ＫＣｌ ０．２０１ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４ １．４４ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２４ｇが１Ｌの再蒸留水中に溶解している）１０ｍｌに細菌細胞を再懸濁し、超音波で破砕した。次いで、遠心分離によって上清を採取し、タンパク質精製システムのポリヒスチジンタグ付きタンパク質用のタンパク質精製カラム上にロードした。そして、所望のタンパク質を、タンパク質精製システム用の溶離緩衝剤（グリセロール５０ｍｌ、ＮａＣｌ ８ｇ、ＫＣｌ ０．２０１ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４ １．４４ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２４ｇ、イミダゾール１７ｇが１Ｌの再蒸留水中に溶解している）で溶出させた。タンパク質濃度は、分光光度計またはＢＣＡタンパク質アッセイキットで測定することができた。精製した各融合タンパク質を分注し、－２０℃で保存した。各タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を図３～４に示した。
１．１に記載の発現プラスミドで大腸菌発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。形質転換後のプレートから単一コロニーを採取し、アンピシリン抵抗性を含有する５ｍｌのＬＢ液体培地中に播種し、終夜培養し、次いで、終夜培養された細菌培養物１ｍｌを、アンピシリン抵抗性を含有する５００ｍｌのＬＢ液体培地中に移し、続いて、細菌培養物のＯＤ６００が約０．６になるまで、３７℃、１８０ｒｐｍで培養し、次いで、誘導物質であるＩＰＴＧを、最終濃度０．２ｍＭになるまで添加し、続いて、２５℃で８時間誘導を行った。誘導の後、細菌細胞を、４℃、７０００ｇで１０分間の遠心分離の後、収集した。次いで、タンパク質精製用の平衡緩衝剤（グリセロール５０ｍｌ、ＮａＣｌ ８ｇ、ＫＣｌ ０．２０１ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４ １．４４ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２４ｇが１Ｌの再蒸留水中に溶解している）１０ｍｌに細菌細胞を再懸濁し、超音波で破砕した。次いで、遠心分離によって上清を採取し、タンパク質精製システムのポリヒスチジンタグ付きタンパク質用のタンパク質精製カラム上にロードした。そして、所望のタンパク質を、タンパク質精製システム用の溶離緩衝剤（グリセロール５０ｍｌ、ＮａＣｌ ８ｇ、ＫＣｌ ０．２０１ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４ １．４４ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２４ｇ、イミダゾール１７ｇが１Ｌの再蒸留水中に溶解している）で溶出させた。タンパク質濃度は、分光光度計またはＢＣＡタンパク質アッセイキットで測定することができた。精製した各融合タンパク質を分注し、－２０℃で保存した。各タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を図３～４に示した。
【0122】
１．３ ＨＥＫ２９３Ｔ－ＧＦＰβ１１細胞系の構築
１．３．１ ＧＦＰβ１１細胞系用のレンチウイルスプラスミドの構築：
ヒストンＨ３（配列番号２５）のコード配列は、ＰＣＲ増幅によって取得し、ＧＦＰβ１１（配列番号２６）のコード配列は比較的短く、フォワードプライマー中に直接的に設計した。これらのコンポーネントを複数ラウンドのＰＣＲによって連結し、ＰＣＲの最終ラウンドで、フォワードプライマーにより、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位とレンチベクター上の対応するＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の上流のオーバーラップとを断片の５’末端に導入し、リバースプライマーにより、ＢａｍＨＩ制限部位とレンチベクター上の対応するＢａｍＨＩ制限部位の下流のオーバーラップとを断片の３’末端に導入した。このレンチプラスミドをＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＢａｍＨ Ｉで二重消化した。ＧＩＢＳＯＮ ａｓｓｅｍｂｌｙによって、オーバーラップのある挿入断片を、消化されたレンチベクターに連結した。
１．３．１ ＧＦＰβ１１細胞系用のレンチウイルスプラスミドの構築：
ヒストンＨ３（配列番号２５）のコード配列は、ＰＣＲ増幅によって取得し、ＧＦＰβ１１（配列番号２６）のコード配列は比較的短く、フォワードプライマー中に直接的に設計した。これらのコンポーネントを複数ラウンドのＰＣＲによって連結し、ＰＣＲの最終ラウンドで、フォワードプライマーにより、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位とレンチベクター上の対応するＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の上流のオーバーラップとを断片の５’末端に導入し、リバースプライマーにより、ＢａｍＨＩ制限部位とレンチベクター上の対応するＢａｍＨＩ制限部位の下流のオーバーラップとを断片の３’末端に導入した。このレンチプラスミドをＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＢａｍＨ Ｉで二重消化した。ＧＩＢＳＯＮ ａｓｓｅｍｂｌｙによって、オーバーラップのある挿入断片を、消化されたレンチベクターに連結した。
【0123】
１．３．２ 細胞系のレンチウイルスパッケージング、感染、および抵抗性スクリーニング：
ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を６ウェルプレートに播種し、終夜培養し、プラスミドトランスフェクション前に、ウェルあたりの細胞数が確実に約２×１０７／ｍｌとなるようにした。トランスフェクション前に、細胞を無血清ＤＭＥＭ培地に移した。レンチ組換え体プラスミド１．５μｇ、ｐＭＤＬプラスミド０．７５μｇ、ｐＶＳＶ－Ｇプラスミド０．４５μｇ、ｐＲＥＶ０．３μｇ（質量比率５：３：２：１）を無血清ＤＭＥＭ３００μｌに添加し、緩徐に吹き込み撹拌した。Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥトランスフェクション試薬９μｌ（１：３）を添加し、緩徐に吹き込み撹拌し、１５分間室温で静置した。細胞上清を滴下により添加し、８時間後に、培地を１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭに変えることによって培養を続けた。６０時間後に、培養上清を、以降の感染用に採取した。
ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を６ウェルプレートに播種し、終夜培養し、プラスミドトランスフェクション前に、ウェルあたりの細胞数が確実に約２×１０７／ｍｌとなるようにした。トランスフェクション前に、細胞を無血清ＤＭＥＭ培地に移した。レンチ組換え体プラスミド１．５μｇ、ｐＭＤＬプラスミド０．７５μｇ、ｐＶＳＶ－Ｇプラスミド０．４５μｇ、ｐＲＥＶ０．３μｇ（質量比率５：３：２：１）を無血清ＤＭＥＭ３００μｌに添加し、緩徐に吹き込み撹拌した。Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥトランスフェクション試薬９μｌ（１：３）を添加し、緩徐に吹き込み撹拌し、１５分間室温で静置した。細胞上清を滴下により添加し、８時間後に、培地を１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭに変えることによって培養を続けた。６０時間後に、培養上清を、以降の感染用に採取した。
【0124】
ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を１２ウェルプレートに播種し、終夜培養し、レンチウイルス感染前に、ウェルあたりの細胞数が確実に約２×１０６／ｍｌ（５０％密度）となるようにした。最初の細胞培養上清を捨て、続いて、レンチウイルス（ｍｏｉ＝３）３００μｌおよび１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ７００μｌを添加し、ポリブレンを１０μｇ／ｍｌの濃度で添加した。細胞プレートを無菌条件下で２５００ｒｐｍで３０分間遠心処理し、培養を続けた。
【0125】
４８時間のレンチウイルス感染後、細胞を１／３の比率で継代し、抵抗性スクリーニングのために、ピューロマイシンを２．５μｇ／ｍｌの濃度で添加した。スクリーニングで得られた陽性細胞をクローニングし、ＨＥＫ－２９３Ｔ－Ｈｉｔｏｎｅ－ＧＦＰβ１１モノクローナル細胞系を得た。
【0126】
１．４ スプリットＧＦＰシステムによる送達系－ＧＦＰβ１－１０複合体のエンドソーム脱出効率の検出
１．３で得られたＨＥＫ－２９３Ｔ－Ｈｉｔｏｎｅ－ＧＦＰβ１１細胞系を１２ウェルプレートに播種し、終夜培養し、タンパク質処置前に、ウェルあたりの細胞数が確実に約５×１０６／ｍｌとなるようにした。無血清ＤＭＥＭ培地で細胞を３回すすいだ後、１．２で得られた５μＭ送達系－ＧＦＰβ１－１０複合体１００μｌを無血清培地中に添加し、インキュベーションを３時間行った。細胞表面に吸着しており、まだ細胞内に飲食されていなかったタンパク質を除去するために、ヘパリン溶液を用いて３回洗浄を行い、培地を１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ培地に変えた後、培養を続けた。蛍光顕微鏡での観察および緑色蛍光タンパク質の発現のフローサイトメトリー分析を１２ｈに行った。
１．３で得られたＨＥＫ－２９３Ｔ－Ｈｉｔｏｎｅ－ＧＦＰβ１１細胞系を１２ウェルプレートに播種し、終夜培養し、タンパク質処置前に、ウェルあたりの細胞数が確実に約５×１０６／ｍｌとなるようにした。無血清ＤＭＥＭ培地で細胞を３回すすいだ後、１．２で得られた５μＭ送達系－ＧＦＰβ１－１０複合体１００μｌを無血清培地中に添加し、インキュベーションを３時間行った。細胞表面に吸着しており、まだ細胞内に飲食されていなかったタンパク質を除去するために、ヘパリン溶液を用いて３回洗浄を行い、培地を１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ培地に変えた後、培養を続けた。蛍光顕微鏡での観察および緑色蛍光タンパク質の発現のフローサイトメトリー分析を１２ｈに行った。
【0127】
フローサイトメトリー分析の結果を図５に示した。結果は、ＴＡＴをベースにしてｐＨ感受性ペプチドＩＮＦ７を導入した場合に細胞の平均蛍光強度が増したことを示した。このことは、ｐＨ感受性ペプチドがエンドソーム膜を破る効果を有することを証明した。特に、ＴＡＴ－ＩＮＦ７をベースにして、ＣＴＳＬまたはフーリン切断部位を導入した場合に、細胞蛍光強度がさらに増し、中でも、ＣＴＳＬ切断部位Ｎおよびフーリン切断部位Ｎｅが最も著しい効果を示した。蛍光顕微鏡観察を図６に示した。この結果は、上記２箇所の切断部位の組合せ（ＴＩＮＮｅ－ＧＦＰβ１－１０）によって、エンドソーム脱出効率をさらに著しく改善することができたことを示した。
【0128】
変異を含有する送達系－カーゴ分子複合体を得るために、ＮまたはＮｅ切断部位内の重要部位に変異を導入した。ここで，変異体Ｎは、配列番号２１に示す配列を有し、変異体Ｎｅは、配列番号２２に示す配列を有した。変異体送達系－カーゴ分子複合体（Ｍｕｔ）と変異カーゴ分子複合体（ＷＴ）なしの送達系の間でトランスフェクション効率を比較した。結果を図７に示した。切断部位の重要なアミノ酸が変異していると、それが単一の切断部位のみであったか、２つの切断部位の組合せであったかにかかわらず、エンドソーム脱出効率を増強する効果が失われた。上記の結果は、ＣＴＳＬおよびフーリン切断部位が、実際にエンドソームからのカーゴの脱出効率を有意に改善できたことを示した。
【0129】
細胞表面に吸着し、まだ細胞内に飲食されていなかったタンパク質を除去するために、ヘパリン溶液で３回洗浄した後で、形質導入の開始後、様々な時点で細胞を採取した。タンパク質を抽出するために細胞を溶解させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動を行い、次いで、細胞内タンパク質の切断および残留を分析するために、ＧＦＰβ１－１０を認識するモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ３２１４６）を用いて、ウエスタンブロット検出を行った。結果を図８に示した。６時間の前の各時点では、検出された細胞内タンパク質の総量が、様々な群の細胞間で同程度であった。これは、ｐＨ感受性ペプチドおよび切断部位は、カーゴのエンドサイトーシス効率を上げなかったことを示している。切断部位を含有するタンパク質（ＴＩＮ－、ＴＩＮｅ－、ＴＩＮＮｅ－）の切断は、３０分以内に始まり、３時間後にはもはや、切断されたタンパク質の量が増加していなかった。ここで、単一切断部位を有するタンパク質の約４０％が切断されており、一方、２つの切断部位を有するタンパク質の約７０％が切断されていた。それ以降、切断部位のないタンパク質（Ｔ－、ＴＩ－）および切断部位が切断されなかったインタクトなタンパク質は、リソソームに導入され、迅速に分解し始め、対応するバンドは、１２ｈにはほとんど消えていた。一方、切断後にＴＡＴ－ＩＮＦ７から分離されたタンパク質は、残ったままであり、ＴＩＮＮｅ群が最も残っていた。上記の結果は、フローサイトメトリーの結果と一致していた。すなわち、酵素切断の効率が高いほど、より多くの分解されていないＧＦＰβ１－１０－ＮＬＳが細胞内に残り、ＧＦＰβ１－１０－ＮＬＳが核に入り、ＧＦＰβ１１と会合した後に、より多くのインタクトなＧＦＰが形成され、緑色蛍光強度が、より高くなる。
【0130】
さらに、３時間の細胞の形質導入の後、ＮまたはＮｅ切断部位に変異を含有する上記の送達系－カーゴ分子複合体の切断を分析するために、ウエスタンブロットを行った。結果を図９に示した。変異体送達系－カーゴ分子複合体（ＴＩＮｍ－、ＴＩＮＮｅｍ－とＴＩＮＮｅｍ－）の細胞内切断は達成できなかった。したがって、図７に示されているフローサイトメトリー結果とあわせて、変異体送達系－カーゴ分子複合体の送達効率が低い理由は、切断およびその後の脱出が達成できなかったことであったと理解することができた。ＣＴＳＬおよびフーリン切断部位が送達系で重要な役割を果たしていることも、さらに確認された。
【0131】
加えて、ｐＨ感受性ペプチドコンポーネントを欠いた送達系－複合体（ＴＮＮｅ－ＧＦＰβ１－１０－ＮＬＳ）の送達効率もフローサイトメトリーによって検出した。その結果を図１０に示した。本発明者らは、形質導入の１２時間後の平均蛍光強度が、基本的にＴ－ＧＦＰβ１－１０－ＮＬＳのものと同じだったことを見出した。これは、切断部位があったとしても、ｐＨ感受性ペプチドがないと、効率的な送達を達成できなかったことを示している。そして、ウエスタンブロットによって、送達系－複合体の細胞内切断効率には、ｐＨ感受性ペプチドの有無が影響しなかったことが見出された（図１１）。上記の結果をあわせて、本発明者らは、送達系におけるｐＨ感受性ペプチドと特異的切断部位の共存のみが、最終的な高効率送達を達成できたことを確認した。
【0132】
実施例２：Ｚｎフィンガータンパク質ＺＦＰの形質導入における送達系の適用
２．１ 送達系－Ｚｎフィンガータンパク質ＺＦＰ９複合体用の発現ベクターの構築
ＴＡＴ、ＩＮＦ７、プロテアーゼ切断部位、および核移行シグナル（ＮＬＳ）を保持するカーゴ分子ＺＦＰ９（配列番号２７）を含有する組換えタンパク質の発現ベクターを構築した。各組換えタンパク質の構造の概略図を図１２に示し、コンポーネントのアミノ酸配列を下記の表４に示した。構築方法は以下の通りだった。まず、送達系中のＴＡＴ、ＩＮＦ７、プロテアーゼ切断部位、およびカーゴ分子ＺＦＰ９をコードする核酸配列をＰＣＲ増幅によって得た。これらのパーツを、複数ラウンドのＰＣＲによって接続し、ＰＣＲの最終ラウンドで、フォワードプライマーにより、ＮｄｅＩ制限部位とｐＥＴ２１ｂ（＋）中の対応するＮｄｅＩ制限部位の上流のオーバーラップとを断片の５’末端に導入し、リバースプライマーにより、ＢａｍＨＩ制限部位とｐＥＴ－２１ｂ（＋）中の対応するＢａｍＨＩ制限部位の下流のオーバーラップとを断片の３’末端に導入した。ｐＥＴ－２１ｂ（＋）プラスミドをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで二重消化した。ＧＩＢＳＯＮ ａｓｓｅｍｂｌｙによって、オーバーラップのある挿入断片を、消化されたベクターｐＥＴ－２１ｂ（＋）に連結した。
２．１ 送達系－Ｚｎフィンガータンパク質ＺＦＰ９複合体用の発現ベクターの構築
ＴＡＴ、ＩＮＦ７、プロテアーゼ切断部位、および核移行シグナル（ＮＬＳ）を保持するカーゴ分子ＺＦＰ９（配列番号２７）を含有する組換えタンパク質の発現ベクターを構築した。各組換えタンパク質の構造の概略図を図１２に示し、コンポーネントのアミノ酸配列を下記の表４に示した。構築方法は以下の通りだった。まず、送達系中のＴＡＴ、ＩＮＦ７、プロテアーゼ切断部位、およびカーゴ分子ＺＦＰ９をコードする核酸配列をＰＣＲ増幅によって得た。これらのパーツを、複数ラウンドのＰＣＲによって接続し、ＰＣＲの最終ラウンドで、フォワードプライマーにより、ＮｄｅＩ制限部位とｐＥＴ２１ｂ（＋）中の対応するＮｄｅＩ制限部位の上流のオーバーラップとを断片の５’末端に導入し、リバースプライマーにより、ＢａｍＨＩ制限部位とｐＥＴ－２１ｂ（＋）中の対応するＢａｍＨＩ制限部位の下流のオーバーラップとを断片の３’末端に導入した。ｐＥＴ－２１ｂ（＋）プラスミドをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで二重消化した。ＧＩＢＳＯＮ ａｓｓｅｍｂｌｙによって、オーバーラップのある挿入断片を、消化されたベクターｐＥＴ－２１ｂ（＋）に連結した。
【0133】
【表4】
【0134】
２．２ 送達系－ＺＦＰ９複合体の発現および精製
２．１に記載の発現プラスミドで大腸菌発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。形質転換後のプレートから単一コロニーを採取し、アンピシリン抵抗性を含有する５ｍｌのＬＢ液体培地中に播種し、終夜培養し、次いで、終夜培養された細菌培養物１ｍｌを、アンピシリン抵抗性を含有する５００ｍｌのＬＢ液体培地中に移し、続いて、細菌培養物のＯＤ６００が約０．６になるまで、３７℃、１８０ｒｐｍで培養し、次いで、誘導物質であるＩＰＴＧを、最終濃度０．２ｍＭになるまで添加し、続いて、２５℃で８時間誘導を行った。誘導の後、細菌細胞を、４℃、７０００ｇで１０分間の遠心分離の後、収集し、細菌細胞の一部は、タンパク質の誘導発現を検出するために採取した。次いで、細菌細胞をタンパク質精製用の平衡緩衝剤（グリセロール５０ｍｌ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン３．６３４２ｇが１Ｌの再蒸留水中に溶解しており、ｐＨが８．０に調整されている）１０ｍｌで再懸濁し、超音波で破砕した。次いで、遠心分離によって上清を採取し、ＡＫＴＡタンパク質精製システムのスルホプロピル（ＳＰ）陽イオン交換カラムにロードした。次いで、様々な比率の平衡緩衝剤および高塩濃度溶出剤（グリセロール５０ｍｌ、ＮａＣｌ １１６．８８ｇ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン３．６３４２ｇが１Ｌの再蒸留水中に溶解しており、ｐＨが８．０に調整されている）による勾配溶出によって所望のタンパク質を得たタンパク質濃度は、分光光度計またはＢＣＡタンパク質アッセイキットで測定することができた。精製した各融合タンパク質を分注し、－２０℃で保存した。各タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を図１３に示した。
２．１に記載の発現プラスミドで大腸菌発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。形質転換後のプレートから単一コロニーを採取し、アンピシリン抵抗性を含有する５ｍｌのＬＢ液体培地中に播種し、終夜培養し、次いで、終夜培養された細菌培養物１ｍｌを、アンピシリン抵抗性を含有する５００ｍｌのＬＢ液体培地中に移し、続いて、細菌培養物のＯＤ６００が約０．６になるまで、３７℃、１８０ｒｐｍで培養し、次いで、誘導物質であるＩＰＴＧを、最終濃度０．２ｍＭになるまで添加し、続いて、２５℃で８時間誘導を行った。誘導の後、細菌細胞を、４℃、７０００ｇで１０分間の遠心分離の後、収集し、細菌細胞の一部は、タンパク質の誘導発現を検出するために採取した。次いで、細菌細胞をタンパク質精製用の平衡緩衝剤（グリセロール５０ｍｌ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン３．６３４２ｇが１Ｌの再蒸留水中に溶解しており、ｐＨが８．０に調整されている）１０ｍｌで再懸濁し、超音波で破砕した。次いで、遠心分離によって上清を採取し、ＡＫＴＡタンパク質精製システムのスルホプロピル（ＳＰ）陽イオン交換カラムにロードした。次いで、様々な比率の平衡緩衝剤および高塩濃度溶出剤（グリセロール５０ｍｌ、ＮａＣｌ １１６．８８ｇ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン３．６３４２ｇが１Ｌの再蒸留水中に溶解しており、ｐＨが８．０に調整されている）による勾配溶出によって所望のタンパク質を得たタンパク質濃度は、分光光度計またはＢＣＡタンパク質アッセイキットで測定することができた。精製した各融合タンパク質を分注し、－２０℃で保存した。各タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を図１３に示した。
【0135】
２．３ ＺＦＰ９結合部位を含有する真核生物発現プラスミドの構築
青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）のコード配列およびＺＦＰ９結合部位を含有する発現ベクターを構築し、その構造概略図を図１４に示した。青色蛍光タンパク質（配列番号２９）のコード配列およびＺＦＰ９結合部位（６×結合部位）の配列（配列番号３０）をＰＣＲ増幅によって得た。これら２つのパートを２ラウンドのＰＣＲによって連結し、ＰＣＲの第２ラウンドで、フォワードプライマーにより、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位とｐＴＴ５ベクター上の対応するＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の上流のオーバーラップとを断片の５’末端に導入し、リバースプライマーにより、ＢａｍＨＩ制限部位とｐＴＴ５ベクター上の対応するＢａｍＨＩ制限部位の下流のオーバーラップとを断片の３’末端に導入した。ｐＴＴ５プラスミドをＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＢａｍＨ Ｉで二重消化した。ｐＴＴ５－ＢＦＰ－６ＢＳプラスミドを得るために、ＧＩＢＳＯＮ ａｓｓｅｍｂｌｙによって、オーバーラップのある挿入断片を、消化されたｐＴＴ５ベクターに連結した。
青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）のコード配列およびＺＦＰ９結合部位を含有する発現ベクターを構築し、その構造概略図を図１４に示した。青色蛍光タンパク質（配列番号２９）のコード配列およびＺＦＰ９結合部位（６×結合部位）の配列（配列番号３０）をＰＣＲ増幅によって得た。これら２つのパートを２ラウンドのＰＣＲによって連結し、ＰＣＲの第２ラウンドで、フォワードプライマーにより、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位とｐＴＴ５ベクター上の対応するＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の上流のオーバーラップとを断片の５’末端に導入し、リバースプライマーにより、ＢａｍＨＩ制限部位とｐＴＴ５ベクター上の対応するＢａｍＨＩ制限部位の下流のオーバーラップとを断片の３’末端に導入した。ｐＴＴ５プラスミドをＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＢａｍＨ Ｉで二重消化した。ｐＴＴ５－ＢＦＰ－６ＢＳプラスミドを得るために、ＧＩＢＳＯＮ ａｓｓｅｍｂｌｙによって、オーバーラップのある挿入断片を、消化されたｐＴＴ５ベクターに連結した。
【0136】
２．４ 送達系によりＺｎフィンガータンパク質ＺＦＰ９を形質導入する送達効率の検出
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１２ウェルプレートに播種し、終夜培養し、タンパク質処置の前に、ウェルあたりの細胞数が確実に約５×１０６／ｍｌとなるようにした。２．２で得られた送達系－ＺＦＰ９複合体（ＺＦＰ９、Ｔ－ＺＦＰ９、ＴＩ－ＺＦＰ９、ＴＩＮＮｅ－ＺＦＰ９）１００μＬ／５μＭおよび２．３で得られたｐＴＴ５－ＢＦＰ－６ＢＳプラスミド５μｇを、３７℃で３０分間、共にインキュベートし、複合体を完全に形成させた。Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を陽性対照（プラスミド５μｇおよびトランスフェクション試薬１５μｌを混合し、無血清条件下で細胞をトランスフェクションするのに用い、８時間後に、培地を１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭに変えることによって培養を続けた）として用いた。細胞を、無血清ＤＭＥＭ培地で３回ゆすぎ、次いで、複合体を添加し、３時間インキュベートした。細胞表面に吸着し、まだ細胞内に飲食されていなかったタンパク質を除去するために、ヘパリン溶液を用いて３回洗浄を行った。次いで、培地を１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ培地に変えた後、培養を続けた。培地を変えた後の１２ｈ、２４ｈ、３６ｈ、および４８ｈに、青色蛍光タンパク質発現のフローサイトメトリー分析を行った。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１２ウェルプレートに播種し、終夜培養し、タンパク質処置の前に、ウェルあたりの細胞数が確実に約５×１０６／ｍｌとなるようにした。２．２で得られた送達系－ＺＦＰ９複合体（ＺＦＰ９、Ｔ－ＺＦＰ９、ＴＩ－ＺＦＰ９、ＴＩＮＮｅ－ＺＦＰ９）１００μＬ／５μＭおよび２．３で得られたｐＴＴ５－ＢＦＰ－６ＢＳプラスミド５μｇを、３７℃で３０分間、共にインキュベートし、複合体を完全に形成させた。Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を陽性対照（プラスミド５μｇおよびトランスフェクション試薬１５μｌを混合し、無血清条件下で細胞をトランスフェクションするのに用い、８時間後に、培地を１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭに変えることによって培養を続けた）として用いた。細胞を、無血清ＤＭＥＭ培地で３回ゆすぎ、次いで、複合体を添加し、３時間インキュベートした。細胞表面に吸着し、まだ細胞内に飲食されていなかったタンパク質を除去するために、ヘパリン溶液を用いて３回洗浄を行った。次いで、培地を１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ培地に変えた後、培養を続けた。培地を変えた後の１２ｈ、２４ｈ、３６ｈ、および４８ｈに、青色蛍光タンパク質発現のフローサイトメトリー分析を行った。
【0137】
フローサイトメトリー分析の結果を図１５～１６に示した。ＺＦＰ９に結合したプラスミドは、それが核に入ったときのみ、転写プロセスを完了することができた。したがって、ＺＦＰ９がエンドソームから脱出したときのみ、それは、結合しているプラスミドを運んで核に入ることができ、このようにして、転写プロセスにより、青色蛍光タンパク質の発現を開始させることができた。Ｔ－ＺＦＰ９と比較して、ｐＨ感受性ペプチドＩＮＦ７（ＴＩ－ＺＦＰ９）の導入は、青色蛍光比率を約１０％増やすことができた（ｐ＝０．０３５）が、それは依然として低レベルであった。すなわち、ほとんどの複合体は、脱出して、核に入ることができなかった。一方、系にプロテアーゼ切断部位をさらに導入すること（ＴＩＮＮＥ－ＺＦＰ９）によって、青色蛍光細胞の割合を有意に上昇させることができ、Ｒｏｃｈｅのトランスフェクション試薬Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥのものと等しい、約６５％（ｐ＝０．０１８）に４８ｈに達した。ＣＴＳＬならびにフーリン特異的切断部位ＮおよびＮｅの導入は、ＺＦＰ９／ｐＴＴ５－ＢＦＰ－６ＢＳ複合体を保持している送達系が細胞に入るエンドサイトーシスプロセス中に、保持されているＺＦＰ９の脱出プロセスを有意に促進し、より多くの複合体が核に入り転写を完了することができ、次いでＢＦＰ蛍光を発現したと理解することができた。
【0138】
実施例３：プロテインホスファターゼＰｐｍ１ｂの形質導入における送達系の適用
ＴＮＦ－αは、細胞表面受容体に結合して、ＲＩＰ３リン酸化を誘導し、多タンパク質複合体のネクロソームを形成し、ネクロソーム内のリン酸化ＲＩＰ３がＭｌｋｌを動員し、リン酸化し、細胞が壊死プログラムに入る。このプロセスにおいて、細胞内プロテインホスファターゼ１Ｂ（Ｐｐｍ１ｂ）は、ＲＩＰ３を脱リン酸化ことによって、プログラム細胞壊死（ネクロトーシス）を阻害することができる。プログラム細胞壊死は、炎症性疾患、虚血－再灌流傷害、神経変性疾患、および他の疾患の発生と密接な関係があると判明しているという事実に鑑み、Ｐｐｍ１ｂタンパク質は、プログラム細胞壊死に関係する上記の疾患の治療における大きな可能性を示している。
ＴＮＦ－αは、細胞表面受容体に結合して、ＲＩＰ３リン酸化を誘導し、多タンパク質複合体のネクロソームを形成し、ネクロソーム内のリン酸化ＲＩＰ３がＭｌｋｌを動員し、リン酸化し、細胞が壊死プログラムに入る。このプロセスにおいて、細胞内プロテインホスファターゼ１Ｂ（Ｐｐｍ１ｂ）は、ＲＩＰ３を脱リン酸化ことによって、プログラム細胞壊死（ネクロトーシス）を阻害することができる。プログラム細胞壊死は、炎症性疾患、虚血－再灌流傷害、神経変性疾患、および他の疾患の発生と密接な関係があると判明しているという事実に鑑み、Ｐｐｍ１ｂタンパク質は、プログラム細胞壊死に関係する上記の疾患の治療における大きな可能性を示している。
【0139】
３．１ 送達系－Ｐｐｍ１ｂタンパク質複合体用の発現ベクターの構築
ＴＡＴ、ＩＮＦ７、プロテアーゼ切断部位、およびカーゴ分子Ｐｐｍ１ｂ（配列番号３１）を含有する組換えタンパク質用の発現ベクターを構築した。各組換えタンパク質の構造図を図１７に示し、各コンポーネントのアミノ酸配列を下記の表６に示した。構築方法は以下の通りだった。ＴＡＴ、ＩＮＦ７、プロテアーゼ切断部位、およびＰｐｍ１ｂの核酸配列をＰＣＲ増幅によって得た。これらのパーツを、複数ラウンドのＰＣＲによって接続し、ＰＣＲの最終ラウンドで、フォワードプライマーにより、ＮｄｅＩ制限部位とｐＥＴ－２１ｂ（＋）中の対応するＮｄｅＩ制限部位の上流のオーバーラップとを断片の５’末端に導入し、リバースプライマーにより、ＢａｍＨＩ制限部位とｐＥＴ－２１ｂ（＋）中の対応するＢａｍＨＩ制限部位の下流のオーバーラップとを断片の３’末端に導入した。ｐＥＴ－２１ｂ（＋）プラスミドをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで二重消化した。ＧＩＢＳＯＮ ａｓｓｅｍｂｌｙによって、オーバーラップのある挿入断片を、消化されたベクターｐＥＴ－２１ｂ（＋）に連結した。
ＴＡＴ、ＩＮＦ７、プロテアーゼ切断部位、およびカーゴ分子Ｐｐｍ１ｂ（配列番号３１）を含有する組換えタンパク質用の発現ベクターを構築した。各組換えタンパク質の構造図を図１７に示し、各コンポーネントのアミノ酸配列を下記の表６に示した。構築方法は以下の通りだった。ＴＡＴ、ＩＮＦ７、プロテアーゼ切断部位、およびＰｐｍ１ｂの核酸配列をＰＣＲ増幅によって得た。これらのパーツを、複数ラウンドのＰＣＲによって接続し、ＰＣＲの最終ラウンドで、フォワードプライマーにより、ＮｄｅＩ制限部位とｐＥＴ－２１ｂ（＋）中の対応するＮｄｅＩ制限部位の上流のオーバーラップとを断片の５’末端に導入し、リバースプライマーにより、ＢａｍＨＩ制限部位とｐＥＴ－２１ｂ（＋）中の対応するＢａｍＨＩ制限部位の下流のオーバーラップとを断片の３’末端に導入した。ｐＥＴ－２１ｂ（＋）プラスミドをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで二重消化した。ＧＩＢＳＯＮ ａｓｓｅｍｂｌｙによって、オーバーラップのある挿入断片を、消化されたベクターｐＥＴ－２１ｂ（＋）に連結した。
【0140】
【表5】
３．２ 送達系－Ｐｐｍ１ｂ複合体の発現および精製
３．１に記載の発現プラスミドで大腸菌発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。形質転換後のプレートから単一コロニーを採取し、アンピシリン抵抗性を含有する５ｍｌのＬＢ液体培地中に播種し、終夜培養し、次いで、終夜培養された細菌培養物１ｍｌを、アンピシリン抵抗性を含有する５００ｍｌのＬＢ液体培地中に移し、続いて、細菌培養物のＯＤ６００が約０．６になるまで、３７℃、１８０ｒｐｍで培養し、次いで、誘導物質であるＩＰＴＧを、最終濃度０．２ｍＭになるまで添加し、続いて、２５℃で８時間誘導を行った。誘導の後、細菌細胞を、４℃、７０００ｇで１０分間の遠心分離によって収集し、細菌細胞の一部は、タンパク質の誘導発現を検出するために採取した。次いで、細菌細胞をタンパク質精製用の平衡緩衝剤（グリセロール５０ｍｌ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン３．６３４２ｇが１Ｌの再蒸留水中に溶解しており、ｐＨが８．０に調整されている）１０ｍｌ中に再懸濁し、超音波で破砕した。次いで、遠心分離によって上清を採取し、ＡＫＴＡタンパク質精製システムのスルホプロピル（ＳＰ）陽イオン交換カラムにロードした。次いで、様々な比率の平衡緩衝剤および高塩濃度溶出剤（グリセロール５０ｍｌ、ＮａＣｌ １１６．８８ｇ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン３．６３４２ｇが１Ｌの再蒸留水中に溶解しており、ｐＨが８．０に調整されている）による勾配溶出によって所望のタンパク質を得た。タンパク質濃度は、分光光度計またはＢＣＡタンパク質アッセイキットで測定することができた。精製した各融合タンパク質を分注し、－２０℃で保存した。各タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を図１８に示した。
【0141】
３．３ ＴＮＦ－αによって誘導される壊死の比率に対する送達系－Ｐｐｍ１ｂ複合体の効果
Ｌ９２９細胞を１２ウェル細胞培養プレートに播種し、終夜培養し、タンパク質処置の前に、ウェルあたりの細胞数が確実に約２×１０６／ｍｌとなるようにした。細胞を、無血清ＤＭＥＭ培地で３回ゆすぎ、３．２で得られた送達系タンパク質（Ｐｐｍ１ｂ、Ｔ－Ｐｐｍ１ｂ、ＴＩ－Ｐｐｍ１ｂ、ＴＩＮＮｅ－Ｐｐｍ１ｂ）１００μｌ／５μＭをそれぞれ無血清培地に添加し、３時間インキュベートした。次いで、２０ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦ－αおよび２０ｍＭ ｚ－ＶＡＤを含有する１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ１ｍｌを添加し、１０時間インキュベートした。細胞を収集し、ＰＩ染色し、フローサイトメトリー分析を行って、細胞壊死の比率を観察した。レンチウイルスで形質導入したＰｐｍ１ｂ（Ｌｅｎｔｉ－Ｐｐｍ１ｂ）およびレンチウイルス（Ｌｅｎｔｉ－ｖｅｃ）を対照として用い、Ｐｐｍ１ｂ発現配列を有するレンチウイルスおよび対照レンチウイルスのパッケージングを行い、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞上で収集し、Ｐｐｍ１ｂが細胞内で完全に発現されるように２４時間Ｌ９２９細胞を感染させた後に、以降のＴＮＦ－α刺激用に感染Ｌ９２９細胞を再プレーティングした。
Ｌ９２９細胞を１２ウェル細胞培養プレートに播種し、終夜培養し、タンパク質処置の前に、ウェルあたりの細胞数が確実に約２×１０６／ｍｌとなるようにした。細胞を、無血清ＤＭＥＭ培地で３回ゆすぎ、３．２で得られた送達系タンパク質（Ｐｐｍ１ｂ、Ｔ－Ｐｐｍ１ｂ、ＴＩ－Ｐｐｍ１ｂ、ＴＩＮＮｅ－Ｐｐｍ１ｂ）１００μｌ／５μＭをそれぞれ無血清培地に添加し、３時間インキュベートした。次いで、２０ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦ－αおよび２０ｍＭ ｚ－ＶＡＤを含有する１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ１ｍｌを添加し、１０時間インキュベートした。細胞を収集し、ＰＩ染色し、フローサイトメトリー分析を行って、細胞壊死の比率を観察した。レンチウイルスで形質導入したＰｐｍ１ｂ（Ｌｅｎｔｉ－Ｐｐｍ１ｂ）およびレンチウイルス（Ｌｅｎｔｉ－ｖｅｃ）を対照として用い、Ｐｐｍ１ｂ発現配列を有するレンチウイルスおよび対照レンチウイルスのパッケージングを行い、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞上で収集し、Ｐｐｍ１ｂが細胞内で完全に発現されるように２４時間Ｌ９２９細胞を感染させた後に、以降のＴＮＦ－α刺激用に感染Ｌ９２９細胞を再プレーティングした。
【0142】
結果を図１９に示した。ｐＨ感受性ペプチドＩＮＦ７（ＴＩ－Ｐｐｍ１ｂ）の導入は、Ｔ－Ｐｐｍ１ｂと比較して、細胞壊死を少しだけ阻害することができたが、それは依然として低レベルであった。しかし、系にプロテアーゼ切断部位をさらに導入すること（ＴＩＮＮｅ－Ｐｐｍ１ｂ）によって、ＴＩＮＮｅ群は、レンチウイルス群のレベルと同程度の細胞壊死阻害能を有した。細胞壊死率を約２５％まで大幅に低下させることができる。したがって、ＣＴＳＬならびにフーリン特異的切断部位ＮおよびＮｅの導入は、Ｐｐｍ１ｂ複合体を保持している送達系を細胞内に入れるエンドサイトーシスプロセス中に、保持されているＰｐｍ１ｂの脱出プロセスを有意に促進し、より多くのＰｐｍ１ｂが細胞質に入り、ＲＩＰ３のリン酸化プロセスを阻害し、それによって、細胞壊死率を低下させることができた。
【0143】
実施例４：遺伝子編集酵素Ｃａｓ９における送達系の適用
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集システムでは、ｓｇＲＮＡがＣａｓ９タンパク質に結合し、ｓｇＲＮＡは、標的部位を特異的に認識することができ、Ｃａｓ９は、ＤＮＡ二本鎖分子に結合し、切ることができ、非相同末端組換えまたは相同組換え修復を介して標的遺伝子の編集が実現される。このシステムでは、Ｃａｓ９は、その機能を完遂するために、核に入らなければならない。これに基づいて、本発明者らは、真核細胞上で遺伝子編集を達成するように、送達系をＣａｓ９タンパク質と融合させた。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集システムでは、ｓｇＲＮＡがＣａｓ９タンパク質に結合し、ｓｇＲＮＡは、標的部位を特異的に認識することができ、Ｃａｓ９は、ＤＮＡ二本鎖分子に結合し、切ることができ、非相同末端組換えまたは相同組換え修復を介して標的遺伝子の編集が実現される。このシステムでは、Ｃａｓ９は、その機能を完遂するために、核に入らなければならない。これに基づいて、本発明者らは、真核細胞上で遺伝子編集を達成するように、送達系をＣａｓ９タンパク質と融合させた。
【0144】
４．１ 送達系－Ｃａｓ９タンパク質複合体用の発現ベクターの構築
ＴＡＴ、ＩＮＦ７、プロテアーゼ切断部位、および核移行シグナル（ＮＬＳ）を保持するカーゴ分子Ｃａｓ９（配列番号３３）を含有する組換えタンパク質の発現ベクターを構築した。各組換えタンパク質の構造の概略図を図２０に示し、各コンポーネントのアミノ酸配列を下記の表６に示した。構築方法は以下の通りだった。ＴＡＴ、ＩＮＦ７、プロテアーゼ切断部位ＮおよびＮｅ、Ｃａｓ９をコードする核酸配列をＰＣＲ増幅によって得た。これらのパーツを、複数ラウンドのＰＣＲによって接続し、ＰＣＲの最終ラウンドで、フォワードプライマーにより、ＮｄｅＩ制限部位とｐＥＴ－２１ｂ（＋）中の対応するＮｄｅＩ制限部位の上流のオーバーラップとを断片の５’末端に導入し、リバースプライマーにより、ＢａｍＨＩ制限部位とｐＥＴ－２１ｂ（＋）中の対応するＢａｍＨＩ制限部位の下流のオーバーラップとを断片の３’末端に導入した。ｐＥＴ－２１ｂ（＋）プラスミドをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで二重消化した。ＧＩＢＳＯＮ ａｓｓｅｍｂｌｙによって、オーバーラップのある挿入断片を、消化されたベクターｐＥＴ－２１ｂ（＋）に連結した。
ＴＡＴ、ＩＮＦ７、プロテアーゼ切断部位、および核移行シグナル（ＮＬＳ）を保持するカーゴ分子Ｃａｓ９（配列番号３３）を含有する組換えタンパク質の発現ベクターを構築した。各組換えタンパク質の構造の概略図を図２０に示し、各コンポーネントのアミノ酸配列を下記の表６に示した。構築方法は以下の通りだった。ＴＡＴ、ＩＮＦ７、プロテアーゼ切断部位ＮおよびＮｅ、Ｃａｓ９をコードする核酸配列をＰＣＲ増幅によって得た。これらのパーツを、複数ラウンドのＰＣＲによって接続し、ＰＣＲの最終ラウンドで、フォワードプライマーにより、ＮｄｅＩ制限部位とｐＥＴ－２１ｂ（＋）中の対応するＮｄｅＩ制限部位の上流のオーバーラップとを断片の５’末端に導入し、リバースプライマーにより、ＢａｍＨＩ制限部位とｐＥＴ－２１ｂ（＋）中の対応するＢａｍＨＩ制限部位の下流のオーバーラップとを断片の３’末端に導入した。ｐＥＴ－２１ｂ（＋）プラスミドをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで二重消化した。ＧＩＢＳＯＮ ａｓｓｅｍｂｌｙによって、オーバーラップのある挿入断片を、消化されたベクターｐＥＴ－２１ｂ（＋）に連結した。
【0145】
【表6】
【0146】
４．２ 送達系－Ｃａｓ９複合体の発現および精製
ニッケルカラムでの予備精製：４．１に記載の発現プラスミドで大腸菌発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。単一コロニーを形質転換後のプレートから採取し、アンピシリン抵抗性を含有するＬＢ液体培地５ｍｌに播種し、終夜培養した。次いで、終夜培養された細菌培養物１ｍｌを、アンピシリン抵抗性を含有するＬＢ液体培地５００ｍｌに移し、細菌培養物のＯＤ６００が約０．６になるまで、３７℃、１８０ｒｐｍで培養し、誘導物質であるＩＰＴＧを、最終濃度０．２ｍＭになるまで添加し、続いて、２５℃で８時間誘導を行った。誘導の後、７０００ｇ、４℃で１０分間の遠心分離によって細菌細胞を収集した。次いで、細菌細胞をタンパク質精製用の平衡緩衝剤（５％グリセロール、３０ｍＭ ＴＢ８．０、５０ｍＭグリセロール、５００ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭグルコース）１０ｍｌで再懸濁し、超音波で破砕した。次いで、遠心分離によって上清を採取し、タンパク質精製システムのポリヒスチジンタグ付きタンパク質用のタンパク質精製カラム上にロードした。次いで、タンパク質精製システムによって、タンパク質精製システム用の溶離緩衝剤（５％グリセロール、３０ｍＭ ＴＢ８．０、５０ｍＭグリセロール、５００ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭグルコース、２５０ｍＭイミダゾール）で所望のタンパク質を溶出させた。
ニッケルカラムでの予備精製：４．１に記載の発現プラスミドで大腸菌発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。単一コロニーを形質転換後のプレートから採取し、アンピシリン抵抗性を含有するＬＢ液体培地５ｍｌに播種し、終夜培養した。次いで、終夜培養された細菌培養物１ｍｌを、アンピシリン抵抗性を含有するＬＢ液体培地５００ｍｌに移し、細菌培養物のＯＤ６００が約０．６になるまで、３７℃、１８０ｒｐｍで培養し、誘導物質であるＩＰＴＧを、最終濃度０．２ｍＭになるまで添加し、続いて、２５℃で８時間誘導を行った。誘導の後、７０００ｇ、４℃で１０分間の遠心分離によって細菌細胞を収集した。次いで、細菌細胞をタンパク質精製用の平衡緩衝剤（５％グリセロール、３０ｍＭ ＴＢ８．０、５０ｍＭグリセロール、５００ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭグルコース）１０ｍｌで再懸濁し、超音波で破砕した。次いで、遠心分離によって上清を採取し、タンパク質精製システムのポリヒスチジンタグ付きタンパク質用のタンパク質精製カラム上にロードした。次いで、タンパク質精製システムによって、タンパク質精製システム用の溶離緩衝剤（５％グリセロール、３０ｍＭ ＴＢ８．０、５０ｍＭグリセロール、５００ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭグルコース、２５０ｍＭイミダゾール）で所望のタンパク質を溶出させた。
【0147】
陽イオン交換カラム上での最終精製：ニッケルカラム上での予備精製から収集された所望のタンパク質を平衡緩衝剤（３０ｍＭ ＴＢ８．０、５０ｍＭグリセロール、２５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭグルコース、ｐＨが７．２に調整されている）に対して透析し、ＡＫＴＡタンパク質精製システムのスルホプロピル（ＳＰ）陽イオン交換カラムにロードした。次いで、様々な比率の平衡緩衝剤および高塩濃度溶出剤（３０ｍＭ ＴＢ８．０、５０ｍＭグリセロール、２５０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭグルコース、ｐＨが７．２に調整されている）による勾配溶出によって所望のタンパク質を得た。タンパク質濃度は、分光光度計またはＢＣＡタンパク質アッセイキットで測定することができた。精製した各融合タンパク質を分注し、－２０℃で保存した。各タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を図２１に示した。
【0148】
４．３ ＨＥＫ２９３Ｔ－ＲＦＰレポーター細胞系の構築
Ｃａｓ９は、ｓｇＲＮＡに結合することによって、標的部位を特異的に認識することができ、ドナーが提供されていなければ、非相同末端組換えが起こる。したがって、レンチウイルス感染によって、ｓｇＲＮＡ認識部位および読み枠にない２つの赤色蛍光タンパク質遺伝子（ｄｓＲｅｄとｍＣｈｅｒｒｙはＧによって接続されている）がＨＥＫ－２９３Ｔ細胞のゲノムに組み込まれる。そのような場合、Ｃａｓ９が、ｓｇＲＮＡ認識部位でＤＮＡ配列の相同末端組換えの発生を引き起こすと、それにより、読み枠にない赤色蛍光タンパク質遺伝子が読み枠に入って、発現されることになり、これにより、細胞が非蛍光状態から赤色蛍光状態に変わる。それゆえ、遺伝的に操作された酵素であるＣａｓ９の形質導入についての送達系の効率を、赤色蛍光が生じたかどうか、および赤色蛍光細胞の数によって評価することができる（図２２）。
Ｃａｓ９は、ｓｇＲＮＡに結合することによって、標的部位を特異的に認識することができ、ドナーが提供されていなければ、非相同末端組換えが起こる。したがって、レンチウイルス感染によって、ｓｇＲＮＡ認識部位および読み枠にない２つの赤色蛍光タンパク質遺伝子（ｄｓＲｅｄとｍＣｈｅｒｒｙはＧによって接続されている）がＨＥＫ－２９３Ｔ細胞のゲノムに組み込まれる。そのような場合、Ｃａｓ９が、ｓｇＲＮＡ認識部位でＤＮＡ配列の相同末端組換えの発生を引き起こすと、それにより、読み枠にない赤色蛍光タンパク質遺伝子が読み枠に入って、発現されることになり、これにより、細胞が非蛍光状態から赤色蛍光状態に変わる。それゆえ、遺伝的に操作された酵素であるＣａｓ９の形質導入についての送達系の効率を、赤色蛍光が生じたかどうか、および赤色蛍光細胞の数によって評価することができる（図２２）。
【0149】
４．３．１ ＲＦＰ レポーター細胞系用のレンチウイルスプラスミドの構築
ｄｓＲｅｄのコード配列（配列番号３５）およびｍＣｈｅｒｒｙのコード配列（配列番号３６）をＰＣＲ増幅によって得た。ｓｇＲＮＡ認識部位（配列番号３７）のＤＮＡ配列は比較的短く、それゆえ、プライマー中に設計した。これらのコンポーネントを複数ラウンドのＰＣＲによって連結した。ＰＣＲの最終ラウンドで、フォワードプライマーにより、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ制限部位とレンチベクター上の対応するＨｉｎｄ ＩＩＩ制限部位の上流のオーバーラップとを断片の５’末端に導入し、リバースプライマーにより、ＢａｍＨＩ制限部位とレンチベクター上の対応するＢａｍＨＩ制限部位の下流のオーバーラップとを断片の３’末端に導入した。このレンチプラスミドをＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＢａｍＨ Ｉで二重消化した。ＧＩＢＳＯＮ ａｓｓｅｍｂｌｙによって、オーバーラップのある挿入断片を、消化されたレンチベクターに連結した。構築に成功したプラスミドのマップを図２３に示す。
ｄｓＲｅｄのコード配列（配列番号３５）およびｍＣｈｅｒｒｙのコード配列（配列番号３６）をＰＣＲ増幅によって得た。ｓｇＲＮＡ認識部位（配列番号３７）のＤＮＡ配列は比較的短く、それゆえ、プライマー中に設計した。これらのコンポーネントを複数ラウンドのＰＣＲによって連結した。ＰＣＲの最終ラウンドで、フォワードプライマーにより、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ制限部位とレンチベクター上の対応するＨｉｎｄ ＩＩＩ制限部位の上流のオーバーラップとを断片の５’末端に導入し、リバースプライマーにより、ＢａｍＨＩ制限部位とレンチベクター上の対応するＢａｍＨＩ制限部位の下流のオーバーラップとを断片の３’末端に導入した。このレンチプラスミドをＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＢａｍＨ Ｉで二重消化した。ＧＩＢＳＯＮ ａｓｓｅｍｂｌｙによって、オーバーラップのある挿入断片を、消化されたレンチベクターに連結した。構築に成功したプラスミドのマップを図２３に示す。
【0150】
４．３．２ レンチウイルスのパッケージング、感染、および細胞系抵抗性スクリーニング
ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を６ウェルプレートに播種し、終夜培養し、プラスミドトランスフェクション前に、ウェルあたりの細胞数が確実に約２×１０７／ｍｌとなるようにした。トランスフェクションの前に、培地を無血清ＤＭＥＭ培地に交換した。レンチ組換え体プラスミド（ＲＦＰレポーター）１．５μｇ、ｐＭＤＬプラスミド０．７５μｇ、ｐＶＳＶ－Ｇプラスミド０．４５μｇ、ｐＲＥＶプラスミド０．３μｇ（質量比は、５：３：２：１であった）を無血清ＤＭＥＭ３００μｌに添加し、緩徐に十分に吹き込み撹拌し、５分間静置した。次いで、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥトランスフェクション試薬９μｌを添加し、緩徐に十分に吹き込み撹拌し、室温で１５分間静置した。次いで、それを細胞上清に添加した。８時間後に、培地を１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭに変え、その後、培養を続けた。６０時間後に、培養上清を収集し、４℃で保存した。
ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を６ウェルプレートに播種し、終夜培養し、プラスミドトランスフェクション前に、ウェルあたりの細胞数が確実に約２×１０７／ｍｌとなるようにした。トランスフェクションの前に、培地を無血清ＤＭＥＭ培地に交換した。レンチ組換え体プラスミド（ＲＦＰレポーター）１．５μｇ、ｐＭＤＬプラスミド０．７５μｇ、ｐＶＳＶ－Ｇプラスミド０．４５μｇ、ｐＲＥＶプラスミド０．３μｇ（質量比は、５：３：２：１であった）を無血清ＤＭＥＭ３００μｌに添加し、緩徐に十分に吹き込み撹拌し、５分間静置した。次いで、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥトランスフェクション試薬９μｌを添加し、緩徐に十分に吹き込み撹拌し、室温で１５分間静置した。次いで、それを細胞上清に添加した。８時間後に、培地を１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭに変え、その後、培養を続けた。６０時間後に、培養上清を収集し、４℃で保存した。
【0151】
ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を１２ウェルプレートに播種し、終夜培養し、レンチウイルス感染前に、ウェルあたりの細胞数が確実に約２×１０６／ｍｌ（５０％密度）となるようにした。細胞培養上清を捨て、レンチウイルス（Ｍｏｉ＝３）３００μｌ、１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ７００μｌ、および濃度１０μｇ／ｍｌのポリブレンを添加した。続いて、無菌条件下、２５００ｒｐｍで３０分間の遠心分離を行って、次いで、培養を続けた。
【0152】
４８時間のレンチウイルス感染の後、１／３の比率で細胞を継代し、抵抗性スクリーニングを行うために、濃度２．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを添加した。スクリーニングで得られた陽性細胞をクローニングして、ＨＥＫ２９３Ｔ－ＲＦＰレポーターのモノクローナル細胞株を得た。
【0153】
４．３．３ ＧＭ３－ｇＲＮＡ転写プラスミドの構築
ｇＲＮＡの導入は、細胞内でｇＲＮＡに転写されることになる転写プラスミドのトランスフェクションによって行われる。ｇＲＮＡに対応するＤＮＡ配列は、プライマーのアニーリングおよびオーバーラップによって生成される。プライマー設計のプロセスにおいて、ＡｆｌＩＩ制限部位の付着末端が直接的に導入された。ｇＲＮＡクローニングベクターをＡｆｌＩＩ単一酵素消化で処理し、ベクターおよび挿入断片を、それらそれぞれの付着末端を用いて、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結した。
ｇＲＮＡの導入は、細胞内でｇＲＮＡに転写されることになる転写プラスミドのトランスフェクションによって行われる。ｇＲＮＡに対応するＤＮＡ配列は、プライマーのアニーリングおよびオーバーラップによって生成される。プライマー設計のプロセスにおいて、ＡｆｌＩＩ制限部位の付着末端が直接的に導入された。ｇＲＮＡクローニングベクターをＡｆｌＩＩ単一酵素消化で処理し、ベクターおよび挿入断片を、それらそれぞれの付着末端を用いて、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結した。
【0154】
４．４ 送達系－Ｃａｓ９複合体の編集効率の評価
ｇＲＮＡ転写プラスミドのトランスフェクション：ＨＥＫ－２９３Ｔ－ＲＦＰレポーター細胞系を１２ウェルプレートに播種し、終夜培養し、トランスフェクション前に、ウェルあたりの細胞数が確実に約２．５×１０６／ｍｌとなるようにした。トランスフェクションの前に、培地を無血清ＤＭＥＭ培地に交換した。ｇＲＮＡ－ＧＭ３転写プラスミド１μｇを無血清ＤＭＥＭ１００μｌに添加し、緩徐に十分に吹き込み撹拌し、５分間静置した。Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥトランスフェクション試薬３μｌをさらに添加し、十分に吹き込み撹拌し、１５分間静置した。次いで、それを細胞上清に添加した。８時間後に、培地を１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭに変えた。
ｇＲＮＡ転写プラスミドのトランスフェクション：ＨＥＫ－２９３Ｔ－ＲＦＰレポーター細胞系を１２ウェルプレートに播種し、終夜培養し、トランスフェクション前に、ウェルあたりの細胞数が確実に約２．５×１０６／ｍｌとなるようにした。トランスフェクションの前に、培地を無血清ＤＭＥＭ培地に交換した。ｇＲＮＡ－ＧＭ３転写プラスミド１μｇを無血清ＤＭＥＭ１００μｌに添加し、緩徐に十分に吹き込み撹拌し、５分間静置した。Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥトランスフェクション試薬３μｌをさらに添加し、十分に吹き込み撹拌し、１５分間静置した。次いで、それを細胞上清に添加した。８時間後に、培地を１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭに変えた。
【0155】
送達系によるＣａｓ９の形質導入：ｇＲＮＡ転写プラスミドのトランスフェクションの後の１２ｈ（血清含有ＤＭＥＭに変えた後の４ｈ）に、細胞を無血清ＤＭＥＭで３回すすぎ、４．２で得られた５μＭの送達系－Ｃａｓ９複合体を無血清ＤＭＥＭ条件下で添加し、３時間インキュベートした。培地を１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭに変え、培養を続け、赤色蛍光タンパク質発現の観察およびフローサイトメトリー分析を４８ｈに行った。
【0156】
フローサイトメトリーの結果を図２４に示した。Ｔ－Ｃａｓ９の形質導入の後、赤色蛍光細胞の割合は低かった（３．７％）。すなわち、ほとんどのＣａｓ９タンパク質は、脱出し、核に入ることができなかった。ｐＨ感受性ペプチドＩＮＦ７（ＴＩ－Ｃａｓ９）の導入により、赤色蛍光細胞の割合を９％に増やすことができた。さらに、系にプロテアーゼ切断部位をさらに導入すること（ＴＩＮＮＥ－Ｃａｓ９）によって、赤色蛍光タンパク質を発現している細胞の数を有意に増やし、４８時間以内に約１４％に達するようにすることができた。したがって、ＣＴＳＬならびにフーリン特異的切断部位ＮおよびＮｅの導入は、Ｃａｓ９を保持している送達系を細胞内に入れるエンドサイトーシスプロセス中に、保持されているＣａｓ９の脱出プロセスを有意に促進し、核移行シグナルの作用の下、より多くのＣａｓ９が核に入った。細胞内転写によって形成されたＧＭ３ ｓｇＲＮＡに結合した後、Ｃａｓ９は、標的配列を特異的に認識した。この部位の近くで相同末端修復が起こって、それにより、赤色蛍光遺伝子が読み枠に入り、発現されることになる。
【0157】
実施例５：非共有結合性連結に基づく送達系の確立
融合発現に加えて、本発明の融合タンパク質とカーゴの間の接続様式は、強い相互作用を有するヘテロ二量体ロイシンジッパーなど、アダプターペアを呼ばれるタンパク質ドメインを介した非共有結合性の相互作用とすることもできた（図２５）。２つの逆平行ロイシンジッパードメインは、それらの空間構造および電荷分布の相補性により、自発的に合体してオリゴマーを形成することができる。ＮＺとＣＺは、もう一方と合体することができるそのような一対のロイシンジッパーであると報告されている。本発明者らは、本発明の細胞内送達系にＮＺドメインを融合させ（ＴＩＮＮｅ－ＮＺ）、核移行シグナル（ＮＬＳ）付きのＧＦＰβ１－１０にＣＺドメインを融合させ、カーゴ（ＣＺ－ＧＦＰβ１－１０－ＮＬＳ）とした。２種の融合タンパク質を混合し、インキュベートして、両者を合体させ、ヒストン－β１１を安定的に発現しているＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質導入するのに用い、エンドソーム脱出効率をＧＦＰの比率および相対蛍光強度によって評価することができた。したがって、カーゴに融合タンパク質を接続するのにＮＺ－ＣＺアダプターペアを使用することの実現可能性を評価した。
融合発現に加えて、本発明の融合タンパク質とカーゴの間の接続様式は、強い相互作用を有するヘテロ二量体ロイシンジッパーなど、アダプターペアを呼ばれるタンパク質ドメインを介した非共有結合性の相互作用とすることもできた（図２５）。２つの逆平行ロイシンジッパードメインは、それらの空間構造および電荷分布の相補性により、自発的に合体してオリゴマーを形成することができる。ＮＺとＣＺは、もう一方と合体することができるそのような一対のロイシンジッパーであると報告されている。本発明者らは、本発明の細胞内送達系にＮＺドメインを融合させ（ＴＩＮＮｅ－ＮＺ）、核移行シグナル（ＮＬＳ）付きのＧＦＰβ１－１０にＣＺドメインを融合させ、カーゴ（ＣＺ－ＧＦＰβ１－１０－ＮＬＳ）とした。２種の融合タンパク質を混合し、インキュベートして、両者を合体させ、ヒストン－β１１を安定的に発現しているＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質導入するのに用い、エンドソーム脱出効率をＧＦＰの比率および相対蛍光強度によって評価することができた。したがって、カーゴに融合タンパク質を接続するのにＮＺ－ＣＺアダプターペアを使用することの実現可能性を評価した。
【0158】
５．１ 送達系－ＮＺ融合タンパク質およびＣＺ－ＧＦＰβ１－１０融合タンパク質用の発現ベクターの構築
ｐＥＴ３２ａベクターをベースにして、ＴＡＴ、ＩＮＦ７、プロテアーゼ切断部位、およびＮＺドメインを含有する組換えタンパク質用の発現ベクター、ならびにＣＺドメイン、核移行シグナル（ＮＬＳ）付きのカーゴ分子ＧＦＰβ１－１０を含有する組換えタンパク質用の発現ベクターを構築した。ここで、可溶化標識として、ＴｒｘＡを導入した。各組換えタンパク質の構造概略図を図２６に示し、送達系のアミノ酸配列を下の表に示した。構築方法は以下の通りだった。最初に、前述のベクターをテンプレートとして用い、送達系中のＴＡＴ、ＩＮＦ７、Ｎ、Ｎｅ、およびＮＺ配列、ならびにＣＺ配列およびカーゴ分子ｓＧＦＰβ１－１０をコードする核酸配列をＰＣＲ増幅によって得た。ＴｒｘＡ－ＴＩＮＮｅ－ＮＺ用には、ＰＣＲプロセスの最終ラウンドで、フォワードプライマーにより、ＢａｍＨＩ制限部位とｐＥＴ－３２ａ（＋）中の対応するＢａｍＨＩ制限部位の上流のオーバーラップとを断片の５’末端に導入し、リバースプライマーにより、ＨＩｉｎｄＩＩＩ制限部位とｐＥＴ－３２ａ（＋）中の対応するＨＩｉｎｄＩＩＩ制限部位の下流のオーバーラップとを断片の３’末端に導入した。ｐＥＴ－３２ａ（＋）プラスミドをＢａｍＨＩとＨＩｉｎｄＩＩＩで二重消化した。ＧＩＢＳＯＮ ａｓｓｅｍｂｌｙによって、オーバーラップのある挿入断片を、消化されたベクターｐＥＴ－３２ａ（＋）に連結した。ＣＺ－ＧＦＰβ１－１０用には、ＰＣＲプロセスの最終ラウンドで、フォワードプライマーにより、ＮｄｅＩ制限部位とｐＥＴ２１ｂ（＋）中の対応するＮｄｅＩ制限部位の上流のオーバーラップとを断片の５’末端に導入し、リバースプライマーにより、ＢａｍＨＩ制限部位とｐＥＴ－２１ｂ（＋）中の対応するＢａｍＨＩ制限部位の下流のオーバーラップとを断片の３’末端に導入した。ｐＥＴ－２１ｂ（＋）プラスミドをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで二重消化した。ＧＩＢＳＯＮ ａｓｓｅｍｂｌｙによって、オーバーラップのある挿入断片を、消化されたベクターｐＥＴ－２１ｂ（＋）に連結した。
ｐＥＴ３２ａベクターをベースにして、ＴＡＴ、ＩＮＦ７、プロテアーゼ切断部位、およびＮＺドメインを含有する組換えタンパク質用の発現ベクター、ならびにＣＺドメイン、核移行シグナル（ＮＬＳ）付きのカーゴ分子ＧＦＰβ１－１０を含有する組換えタンパク質用の発現ベクターを構築した。ここで、可溶化標識として、ＴｒｘＡを導入した。各組換えタンパク質の構造概略図を図２６に示し、送達系のアミノ酸配列を下の表に示した。構築方法は以下の通りだった。最初に、前述のベクターをテンプレートとして用い、送達系中のＴＡＴ、ＩＮＦ７、Ｎ、Ｎｅ、およびＮＺ配列、ならびにＣＺ配列およびカーゴ分子ｓＧＦＰβ１－１０をコードする核酸配列をＰＣＲ増幅によって得た。ＴｒｘＡ－ＴＩＮＮｅ－ＮＺ用には、ＰＣＲプロセスの最終ラウンドで、フォワードプライマーにより、ＢａｍＨＩ制限部位とｐＥＴ－３２ａ（＋）中の対応するＢａｍＨＩ制限部位の上流のオーバーラップとを断片の５’末端に導入し、リバースプライマーにより、ＨＩｉｎｄＩＩＩ制限部位とｐＥＴ－３２ａ（＋）中の対応するＨＩｉｎｄＩＩＩ制限部位の下流のオーバーラップとを断片の３’末端に導入した。ｐＥＴ－３２ａ（＋）プラスミドをＢａｍＨＩとＨＩｉｎｄＩＩＩで二重消化した。ＧＩＢＳＯＮ ａｓｓｅｍｂｌｙによって、オーバーラップのある挿入断片を、消化されたベクターｐＥＴ－３２ａ（＋）に連結した。ＣＺ－ＧＦＰβ１－１０用には、ＰＣＲプロセスの最終ラウンドで、フォワードプライマーにより、ＮｄｅＩ制限部位とｐＥＴ２１ｂ（＋）中の対応するＮｄｅＩ制限部位の上流のオーバーラップとを断片の５’末端に導入し、リバースプライマーにより、ＢａｍＨＩ制限部位とｐＥＴ－２１ｂ（＋）中の対応するＢａｍＨＩ制限部位の下流のオーバーラップとを断片の３’末端に導入した。ｐＥＴ－２１ｂ（＋）プラスミドをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで二重消化した。ＧＩＢＳＯＮ ａｓｓｅｍｂｌｙによって、オーバーラップのある挿入断片を、消化されたベクターｐＥＴ－２１ｂ（＋）に連結した。
【0159】
【表7】
【0160】
５．２ 送達系－ＮＺ融合タンパク質およびＣＺ－ＧＦＰβ１－１０融合タンパク質の発現および精製
５．１に記載の発現プラスミドで大腸菌発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。単一コロニーを形質転換後のプレートから採取し、アンピシリン抵抗性を含有するＬＢ液体培地５ｍｌに播種し、終夜培養した。終夜培養された細菌培養物１ｍｌを、アンピシリン抵抗性を含有するＬＢ液体培地５００ｍｌに移し、細菌培養物のＯＤ６００が約０．６になるまで、３７℃、１８０ｒｐｍで培養した。２５℃で８時間の誘導を行うため、誘導物質であるＩＰＴＧを、最終濃度０．２ｍＭになるまで添加した。誘導の後、細菌細胞を４℃、７０００ｇで１０分間の遠心分離によって採取し、細菌細胞をタンパク質精製用の平衡緩衝剤（グリセロール５０ｍｌ、ＮａＣｌ ８ｇ、ＫＣｌ ０．２０１ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４ １．４４ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２４ｇが１Ｌの再蒸留水中に溶解している）１０ｍｌ中に再懸濁し、超音波で破砕した。遠心分離によって上清を収集し、タンパク質精製システムのポリヒスチジンタグ付きタンパク質用のタンパク質精製カラム上にロードした。次いで、タンパク質精製システムによって、タンパク質精製システム用の溶離緩衝剤、すなわち溶離緩衝剤２＃（グリセロール５０ｍｌ、ＮａＣｌ ８ｇ、ＫＣｌ ０．２０１ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４ １．４４ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２４ｇ、イミダゾール１７ｇが１Ｌの再蒸留水中に溶解している）を用いて、所望のタンパク質を溶出させた。タンパク質濃度は、分光光度計またはＢＣＡタンパク質アッセイキットで測定することができた。精製した各融合タンパク質を分注し、－２０℃で保存した。各タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を図２７に示した。
５．１に記載の発現プラスミドで大腸菌発現株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。単一コロニーを形質転換後のプレートから採取し、アンピシリン抵抗性を含有するＬＢ液体培地５ｍｌに播種し、終夜培養した。終夜培養された細菌培養物１ｍｌを、アンピシリン抵抗性を含有するＬＢ液体培地５００ｍｌに移し、細菌培養物のＯＤ６００が約０．６になるまで、３７℃、１８０ｒｐｍで培養した。２５℃で８時間の誘導を行うため、誘導物質であるＩＰＴＧを、最終濃度０．２ｍＭになるまで添加した。誘導の後、細菌細胞を４℃、７０００ｇで１０分間の遠心分離によって採取し、細菌細胞をタンパク質精製用の平衡緩衝剤（グリセロール５０ｍｌ、ＮａＣｌ ８ｇ、ＫＣｌ ０．２０１ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４ １．４４ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２４ｇが１Ｌの再蒸留水中に溶解している）１０ｍｌ中に再懸濁し、超音波で破砕した。遠心分離によって上清を収集し、タンパク質精製システムのポリヒスチジンタグ付きタンパク質用のタンパク質精製カラム上にロードした。次いで、タンパク質精製システムによって、タンパク質精製システム用の溶離緩衝剤、すなわち溶離緩衝剤２＃（グリセロール５０ｍｌ、ＮａＣｌ ８ｇ、ＫＣｌ ０．２０１ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４ １．４４ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２４ｇ、イミダゾール１７ｇが１Ｌの再蒸留水中に溶解している）を用いて、所望のタンパク質を溶出させた。タンパク質濃度は、分光光度計またはＢＣＡタンパク質アッセイキットで測定することができた。精製した各融合タンパク質を分注し、－２０℃で保存した。各タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を図２７に示した。
【0161】
５．３ スプリットＧＦＰシステムによるアダプターベースの送達系の送達効率の検出
上で得られたＨＥＫ－２９３Ｔ－Ｈｉｔｏｎｅ－ＧＦＰβ１１細胞系を１２ウェルプレートに播種し、終夜培養し、タンパク質処理前に、ウェルあたりの細胞数が確実に約５×１０６／ｍｌとなるようにした。次いで、細胞を無血清ＤＭＥＭ培地で３回ゆすいだ。対照群および実験群ならびにそれらが用いたタンパク質（５．２で得られたもの）の量を下の表に示した。表中、対照２および実験群における２種のタンパク質は、細胞をインキュベートする前に、無血清培地と室温で１０分間混合した。無血清培地条件における３時間のインキュベーションの後、細胞表面に吸着し、まだ飲食されていなかったタンパク質を除去するために、細胞をヘパリン溶液で３回洗浄し、次いで、培地を１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ培地に変えた後、培養を続けた。蛍光顕微鏡観察および緑色蛍光陽性の細胞の比率のフローサイトメトリー分析およびＭＦＩを１２時間時点に行った。
上で得られたＨＥＫ－２９３Ｔ－Ｈｉｔｏｎｅ－ＧＦＰβ１１細胞系を１２ウェルプレートに播種し、終夜培養し、タンパク質処理前に、ウェルあたりの細胞数が確実に約５×１０６／ｍｌとなるようにした。次いで、細胞を無血清ＤＭＥＭ培地で３回ゆすいだ。対照群および実験群ならびにそれらが用いたタンパク質（５．２で得られたもの）の量を下の表に示した。表中、対照２および実験群における２種のタンパク質は、細胞をインキュベートする前に、無血清培地と室温で１０分間混合した。無血清培地条件における３時間のインキュベーションの後、細胞表面に吸着し、まだ飲食されていなかったタンパク質を除去するために、細胞をヘパリン溶液で３回洗浄し、次いで、培地を１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ培地に変えた後、培養を続けた。蛍光顕微鏡観察および緑色蛍光陽性の細胞の比率のフローサイトメトリー分析およびＭＦＩを１２時間時点に行った。
【0162】
フローサイトメトリー分析の結果を図２８に示した。結果は、２つの対照群（ＣＺ－ＧＦＰβ１～１０／ＴｒｘＡ－ＴＩＮＮｅ＋ＣＺ－ＧＦＰβ１～１０）のＭＦＩ値が両方とも５未満であったことを示した。このうち、対照群２（ＴｒｘＡ－ＴＩＮＮｅ＋ＣＺ－ＧＦＰβ１～１０）は、対照群１の値よりわずかに高いＭＦＩを有した。本発明者らは、それは、ＴｒｘＡ－ＴＩＮＮｅとＣＺ－ＧＦＰβ１～１０の間の非特異的な吸着があり、それによって、ＴＩＮＮｅによりカーゴＣＺ－ＧＦＰβ１～１０が細胞に入り、エンドソームから脱出することが可能となったことによって引き起こされたと推測した。ＴｒｘＡ－ＴＩＮＮｅ－ＮＺ＋ＣＺ－ＧＦＰβ１～１０群のＭＦＩ値は、約２０であり、これは、対照群の値より有意に高かった。このことは、ＮＺとＣＺの作用の下で、ある程度、ＴｒｘＡ－ＴＩＮＮｅがＧＦＰβ１～１０と合体し、ＴＩＮＮｅの作用を介して、ＧＦＰβ１～１０が細胞に入り、エンドソームから脱出したことを示した。アダプターベースの接続法の蛍光強度は、融合発現によって得られたＴＩＮＮｅ－ＧＦＰβ１～１０のものより依然として低かったが、この実験は、ＮＺ－ＣＺまたは類似のアダプターをベースとした接続法が、送達系をカーゴと接続するのに使用でき、細胞に入り、エンドソームから脱出するようにカーゴを効果的に送達できることを確認した。
【0163】
【表8】
【0164】
本発明の特定の実施形態について詳細に記載したが、当業者ならば、そのような詳細には、開示されたすべての教示にしたがって様々な改変および変更を加えることができ、そのような変更形態も本発明の保護範囲内にあることを理解するであろう。本発明の全体は、添付の特許請求の範囲およびその任意の等価物によって示される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【配列表】