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特許7542876神経突起成長及びシナプス形成活性を持つ新規プロリルＦＫ５０６誘導体及びその用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-23
(45)【発行日】2024-09-02
(54)【発明の名称】神経突起成長及びシナプス形成活性を持つ新規プロリルＦＫ５０６誘導体及びその用途
(51)【国際特許分類】
C12P 17/18 20060101AFI20240826BHJP
C07D 498/18 20060101ALI20240826BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240826BHJP
A61K 31/407 20060101ALI20240826BHJP
A61P 25/02 20060101ALI20240826BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20240826BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20240826BHJP
A61P 25/08 20060101ALI20240826BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20240826BHJP
A61P 25/18 20060101ALI20240826BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20240826BHJP
A61P 21/02 20060101ALI20240826BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240826BHJP
A61K 35/74 20150101ALI20240826BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20240826BHJP
C12R 1/465 20060101ALN20240826BHJP
【ＦＩ】
C12P17/18 C
C07D498/18
A61P25/00
A61K31/407
A61P25/02
A61P17/02
A61P9/00
A61P25/08
A61P25/28
A61P25/18
A61P25/16
A61P21/02
A61P37/04
A61K35/74 D
C12N1/20 A
C12R1:465
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2022578690
(86)(22)【出願日】2021-06-18
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-24
(86)【国際出願番号】 KR2021007681
(87)【国際公開番号】W WO2021256894
(87)【国際公開日】2021-12-23
【審査請求日】2023-02-16
(31)【優先権主張番号】10-2020-0075285
(32)【優先日】2020-06-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【微生物の受託番号】KCTC 14170BP
【微生物の受託番号】KCTC 14171BP
(73)【特許権者】
【識別番号】522490608
【氏名又は名称】モルジェンバイオ・カンパニー・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＭＯＬＧＥＮＢＩＯ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100150500
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 靖
(74)【代理人】
【識別番号】100176474
【弁理士】
【氏名又は名称】秋山 信彦
(72)【発明者】
【氏名】ユン，ヨジュン
(72)【発明者】
【氏名】ソン，ミョンジョン
(72)【発明者】
【氏名】チョン，ジンア
(72)【発明者】
【氏名】チョン，ウンジ
(72)【発明者】
【氏名】キム，サンウ
(72)【発明者】
【氏名】イ，ホンジュ
【審査官】奥谷 暢子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１７－５１８３８７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平０６－３４０６７２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平０４－２７１７９０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表平０４－５００３７２（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｐ
Ｃ０７Ｄ
Ａ６１Ｐ
Ａ６１Ｋ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記の式１で表される９－デオキソ－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）、下記の式２で表される９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）、下記の式３で表される９－デオキソ－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）、及び下記の式４で表される９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）からなる群より選ばれるいずれか一つの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。式１
【化1】
式２
【化2】
式３
【化3】
式４
【化4】
【請求項2】
下記の式１で表される９－デオキソ－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）、下記の式２で表される９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）、下記の式３で表される９－デオキソ－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）、及び下記の式４で表される９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）からなる群より選ばれるいずれか一つの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、神経系疾患の予防または治療用薬学的組成物。式１
【化1】
式２
【化2】
式３
【化3】
式４
【化4】
【請求項3】
前記神経系疾患は、神経損傷疾患、退行性神経疾患（Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ）、末梢神経損傷（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｒｖｅ ｉｎｊｕｒｙ）、外傷性脳損傷（Ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ）、及び脳卒中（Ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ）から選ばれるいずれか一つ以上のものである、請求項２に記載の神経系疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項4】
前記神経損傷疾患は、てんかん、中風、脳卒中、虚血性脳血管障害、脊髓損傷疾患、末梢神経疾患、行動障害、発達障害、精神障害、ダウン症、及び精神分裂病から選ばれるいずれか一つ以上のものである、請求項３に記載の神経系疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項5】
前記退行性神経疾患は、認知症、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、進行性核上性麻痺（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ ｐａｌｓｙ）、多系統萎縮症（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ｓｔｒｏｐｈｙ）、オリーブ橋小脳萎縮症（Ｏｌｉｖｏｐｏｎｔｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ；ＯＰＣＡ）、シャイ・ドレーガー症候群（Ｓｈｙ－Ｄｒａｇｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、線条体黒質変性症（Ｓｔｒｉａｔｏｎｉｇｒａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＡＬＳ）、本態性振戦（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｔｒｅｍｏｒ）、大脳皮質基底核変性症（Ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ ｇａｎｌｉｏｎｉｃ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、びまん性レビー小体病（Ｄｉｆｆｕｓｅ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｙ ｄｉｓｅａｓｅ）、パーキンソン認知症複合（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ－ＡＬＳ－ｄｅｍｅｎｔｉａ ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ Ｇｕａｍ）、及びピック病（Ｐｉｃｋ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）から選ばれるいずれか一つ以上のものである、請求項３または４に記載の神経系疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項6】
前記薬学的組成物は、免疫抑制活性が減少されたことを特徴とするものである、請求項２に記載の神経系疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項7】
前記薬学的組成物は、神経突起成長及びシナプス形成活性を示すものである、請求項２に記載の神経系疾患の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項8】
［１］ストレプトマイセス・カナマイセティカス（Streptomyces kanamyceticus）ΔｆｋｂＤ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬ（受託番号ＫＣＴＣ１４１７１ＢＰ）を培養して９－デオキソ－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）を生産するステップ、［２］ストレプトマイセス・カナマイセティカス（Streptomyces kanamyceticus）ΔｆｋｂＤ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬ（受託番号ＫＣＴＣ１４１７１ＢＰ）を培養して９－デオキソ－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）を生産するステップ、
［３］ストレプトマイセス・カナマイセティカス（Streptomyces kanamyceticus）ΔｆｋｂＤ-ｆｋｂＭ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬ（受託番号ＫＣＴＣ１４１７０ＢＰ）を培養して９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）を生産するステップ、または
［４］ストレプトマイセス・カナマイセティカス（Streptomyces kanamyceticus）ΔｆｋｂＤ-ｆｋｂＭ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬ（受託番号ＫＣＴＣ１４１７０ＢＰ）を培養して９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）を生産するステップのいずれかを含む、請求項１に記載の化合物の生産方法。
【請求項9】
請求項１に記載の化合物またはその塩、及び賦形剤を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、９－デオキソ－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）、９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）、９－デオキソ－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）、及び９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）からなる群より選ばれるいずれか一つの化合物；前記化合物、その異性体またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、神経系疾患の予防または治療用薬学的組成物；医薬部外品組成物；前記薬学的組成物を利用した神経系疾患の予防または治療方法；及びストレプトマイセス・カナマイセティカス（Streptomyces kanamyceticus）菌株を用いた前記新規化合物の生産方法に関する。
【背景技術】
【0002】
全世界的な人口の高齢化の急速な進展に伴い、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中などの退行性神経疾患患者が急増している。しかし、現在これらの神経損傷疾患に対して、損傷された神経を回復させ、神経細胞を再生させるなどの根本的な治療が施されず、痛症緩和や悪化緩和などを目的とした治療が行われている。これは、神経損傷を遅延させる効果を超えて、神経損傷疾患の治療に用いられる水準の神経再生及び回復効果を提供する薬物がなかったからである。退行性神経疾患を病む患者が増加し続けると見込まれることから、病気の進行を根本的に抑制することができるＤＭＴ（Disease-modifying treatment、疾患修飾療法）医薬品の開発がさらに重要になりつつある。神経損傷による障害が発生した患者は、社会及び家庭での役割に大きく制限を受けるようになり、これによる個人的損失及びクオリティオブライフが悪くなるからである。したがって、神経損傷に係わる多様な疾患に単独または併用療法としての活用が可能な、神経再生の効果を奏せる薬物の開発が切に求められていると言える。
【0003】
ＦＫ５０６は、ヒトの細胞内でＦＫ５０６－結合タンパク質（ＦＫＢＰ）１２と結合した後、カルシニューリン（ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ（ＣａＮ））に結合してその活性を阻害することで、インターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）の転写を阻害して免疫抑制作用を示し、また、ＦＫＢＰ５２（または５１）と結合することで正確に究明されない機序によって神経再生活性を示すものと知られている［Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１５、１１、３３］。ただし、依然として免疫抑制活性による副作用がない、神経損傷疾患の治療剤として適用可能な神経再生物質は報告されていない実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
そこで、本発明者らは、多種多様な努力を重ねた結果、神経系疾患の予防または治療用の薬学的組成物の主成分として活用可能な新規化合物、９－デオキソ－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）、９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）、９－デオキソ－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）、及び９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）（以下、「４種新規化合物」と通称する）の神経細胞の成長促進効果を究明し、これらの製造工程を開発し、ひいて、これらを有効成分として活用した神経系疾患の予防または治療用薬学的組成物を開発し、該組成物が免疫抑制活性による副作用なしに神経系疾患の予防または治療用薬学的組成物として有効に活用されることができることを確認することで、本発明を完成するに至った。特に、本発明の４種新規化合物は、ＦＫ５０６化合物よりも免疫抑制活性が顕著に減少され、神経細胞の成長促進活性能などの有効性が向上したことにその意義がある。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明の一つの目的は、９－デオキソ－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）、９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）、９－デオキソ－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）、及び９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）からなる群より選ばれるいずれか一つの化合物を提供することである。
本発明の他の目的は、前記化合物、その異性体またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、神経系疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、前記化合物、その異性体またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、神経系疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供することである。
【0006】
本発明のまた他の目的は、前記４種新規化合物を、ヒトを除く個体に投与するステップを含む、神経系疾患の予防または治療方法を提供することである。
本発明の別の目的は、前記４種新規化合物を個体に投与するステップを含む、神経系疾患の予防または改善用組成物を提供することである。
本発明のまた別の一つの目的は、ストレプトマイセス・カナマイセティカス（Streptomyces kanamyceticus）を培養するステップを含む前記４種新規化合物の生産方法を提供することである。
本発明の別の目的は、前記４種新規化合物を個体に投与するステップを含む、神経系疾患の予防または改善用組成物を提供することである。
本発明のまた別の一つの目的は、ストレプトマイセス・カナマイセティカス（Streptomyces kanamyceticus）を培養するステップを含む前記４種新規化合物の生産方法を提供することである。
【0007】
本発明の更なる他の一つの目的は、前記４種新規化合物の生産菌株を提供することである。
【発明の効果】
【0008】
本発明による４種新規化合物の中から選ばれた一つ以上を有効成分として含む神経系疾患の予防または治療用薬学的組成物は、免疫抑制活性は著しく減少されるが、神経突起の成長及びシナプス形成活性効果に優れ、神経毒性物質のＭＰＴＰによって誘導されたパーキンソン病マウスモデルにおいて神経系疾患、とりわけ退行性神経疾患の治療効果に優れることを確認した。これと共に細胞毒性及び安全性実験で優れた安全性を確認した。よって、本願の４種新規化合物は、神経系疾患の治療において免疫抑制活性に対する副作用なしに有効に活用されることができ、従来の薬物治療に比べてより根本的な治療効果を期待することができる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図7】図７は、９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）に対する高速液体クロマトグラフィー分析の結果である。
【図8】図８は、９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）に対する核磁気共鳴分光法（１Ｈ－ＮＭＲ）の結果である。
【図9】図９は、９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）に対する核磁気共鳴分光法（１３Ｃ－ＮＭＲ）の結果である。
【図10】図１０は、９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）に対する核磁気共鳴分光法（ＣＯＳＹ－ＮＭＲ）の結果である。
【図11】図１１は、９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）に対する核磁気共鳴分光法（ＨＳＱＣ－ＮＭＲ）の結果である。
【図12】図１２は、９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）に対する核磁気共鳴分光法（ＨＭＢＣ－ＮＭＲ）の結果である。
【図22】図２２は、９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）に対する核磁気共鳴分光法（ＣＯＳＹ－ＮＭＲ）の結果である。
【図23】図２３は、９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）に対する核磁気共鳴分光法（ＨＳＱＣ－ＮＭＲ）の結果である。
【図24】図２４は、９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）に対する核磁気共鳴分光法（ＨＭＢＣ－ＮＭＲ）の結果である。
【発明を実施するための形態】
【0010】
これを具体的に説明すると、次のようである。なお、本発明に開示のそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用し得る。すなわち、本発明に開示の多様な要素のすべての組み合わせが本発明の範疇に属する。また、後述する具体的な記載によって本発明の範疇が限定されるものではない。
前記目的を達成するための本発明の一態様は、４種新規化合物である、下記の式１で表される９－デオキソ－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）、下記の式２で表される９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）、下記の式３で表される９－デオキソ－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）、及び下記の式４で表される９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）からなる群より選ばれるいずれか一つの化合物を提供する。
式１
式２
式３
式４
前記目的を達成するための本発明の一態様は、４種新規化合物である、下記の式１で表される９－デオキソ－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）、下記の式２で表される９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）、下記の式３で表される９－デオキソ－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）、及び下記の式４で表される９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）からなる群より選ばれるいずれか一つの化合物を提供する。
式１
【化1】
式２
【化2】
式３
【化3】
式４
【化4】
【0011】
前記目的を達成するための本発明の他の一態様は、４種新規化合物である、下記の式１で表される９－デオキソ－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）、下記の式２で表される９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）、下記の式３で表される９－デオキソ－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）、及び下記の式４で表される９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）からなる群より選ばれるいずれか一つの化合物、その異性体またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、神経系疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
式１
式２
式３
式４
式１
【化1】
式２
【化2】
式３
【化3】
式４
【化4】
【0012】
本発明で使われた用語、「ＦＫ５０６、タクロリムス（ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ）またはフジマイシン（ｆｕｊｉｍｙｃｉｎ）」は、多様なストレプトマイセス・ツクバエンシス（Streptomyces tsukubaensis）から最初に分離された免疫抑制活性を持つ物質であり、２３員環マクロライド（２３－ｍｅｍｂｅｒｅｄ ｒｉｎｇ ｍａｃｒｏｌｉｄｅ）ポリケタイド（ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ）である。免疫抑制作用は、シクロスポリンよりも強く、臓器移植時、特に肝移植時に拒絶反応を抑制させるために使用するものと知られている。前記ＦＫ５０６は、ＰＫＳとＮＲＰＳとの（ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ／ｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）複合系によって合成されることができるが、本発明のＦＫ５０６誘導体は、ストレプトマイセス属（Streptomyces sp.）の生合成遺伝子欠損によって製造された新規な菌株を通じて生産された新規な化合物であることができる。
本発明で使われた用語、「ＦＫ５２０またはアスコマイシン（ａｓｃｏｍｙｃｉｎ）」も免疫抑制剤であって、２３個の炭素からなるマクロライド構造の化合物であり、ＦＫ５０６のＣ２１位のエチル類似体である。
本発明で使われた用語、「ＦＫ５２０またはアスコマイシン（ａｓｃｏｍｙｃｉｎ）」も免疫抑制剤であって、２３個の炭素からなるマクロライド構造の化合物であり、ＦＫ５０６のＣ２１位のエチル類似体である。
【0013】
本発明の一具体例として、本発明の化合物は、その異性体または薬学的に許容可能な塩を含むことができる。
【0014】
本発明で使われた用語、「異性体」とは、化学式は同じであるが、同一ではない化合物の関係を意味し、例えば構造異性体、幾何異性体、光学異性質体（鏡像異性体）、立体異性体、部分立体異性体を含むことができる。
【0015】
本発明で用いられる用語、「薬学的に許容可能な塩」は、患者に比較的非毒性でありかつ無害な有効作用を有する濃度であって、該塩に起因した副作用が母体化合物の有益な効能を低下させない任意のすべての有機または無機付加塩を意味することができる。例えば、前記塩は、薬学的に許容可能な遊離酸（Ｆｒｅｅ ａｃｉｄ）によって形成された酸付加塩であることができる。酸付加塩は、通常の方法、例えば化合物を過量の酸水溶液に溶解させ、この塩を水混和性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンまたはアセトニトリルを用いて沈殿させて製造することができる。同モル量の化合物及び水中の酸またはアルコール（例えば、グリコールモノメチルエーテル）を加熱し、次いで前記混合物を蒸発させて乾燥させるか、または析出された塩を吸引濾過させて製造されたものであってもよい。この時、遊離酸としては有機酸と無機酸を用いることができる。前記塩は、塩基を用いて製造された薬学的に許容可能な金属塩であることができる。
【0016】
また一つの具体例として、本発明の化合物は、溶媒和物またはプロドラッグ（Ｐｒｏ－ｄｒｕｇ）の形態であることができ、これは本発明の範囲内に含まれる。溶媒和物は、好ましくは、水和物及びエタノール和物を含むことができる。
本発明の薬学的組成物は、単一製剤としても用いることができ、公認された神経系疾患治療効果を持つと知られた薬物をさらに含んでなり、複合製剤に製造して用いることができ、薬学的に許容される担体または賦形剤を用いて製剤化することで、単位用量剤形で製造されるか、多回用量容器内に入れて製造されることができる。
本発明で用いられる用語、「薬学的に許容可能な担体」とは、生物体を刺激しないながらも、注入される化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体または希釈剤を意味することができる。本発明に使用可能な前記担体の種類は、特に制限されなく、当該技術分野において通常使われ、かつ薬学的に許容される担体であればいずれでも使用可能である。前記担体の非制限的な例としては、トランスクトール（Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ）、ポリエチレングリコール（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、トリアセチン（Ｔｒｉａｃｅｔｉｎ）、及びこれらの混合物が挙げられる共界面活性剤（Ｃｏ－ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）；クレモフォール（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）、ミリズ（Ｍｙｒｊ）、ポロキサマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）、ルトロ－ル（Ｌｕｔｒｏｌ）、インウィトール（Ｉｍｗｉｔｏｒ）、スパン（Ｓｐａｎ）、ラブラフィル（Ｌａｂｒａｆｉｌ）などの単独または混合物が挙げられる界面活性剤（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）；ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）、カプテックス（Ｃａｐｔｅｘ）、オレイン酸エチル（Ｅｔｈｙｌ ｏｌｅａｔｅ）などの単独または混合物が挙げられるオイル（Ｏｉｌ）；及び、エリソルビン酸（Ｅｒｙｔｈｏｒｏｂｉｃ ａｃｉｄ）、クエン酸（Ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ）などの単独または混合物が挙げられる有機酸類などが挙げられる。これらは単独または２種以上を混合して用いられることができる。
本発明の薬学的組成物は、単一製剤としても用いることができ、公認された神経系疾患治療効果を持つと知られた薬物をさらに含んでなり、複合製剤に製造して用いることができ、薬学的に許容される担体または賦形剤を用いて製剤化することで、単位用量剤形で製造されるか、多回用量容器内に入れて製造されることができる。
本発明で用いられる用語、「薬学的に許容可能な担体」とは、生物体を刺激しないながらも、注入される化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体または希釈剤を意味することができる。本発明に使用可能な前記担体の種類は、特に制限されなく、当該技術分野において通常使われ、かつ薬学的に許容される担体であればいずれでも使用可能である。前記担体の非制限的な例としては、トランスクトール（Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ）、ポリエチレングリコール（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、トリアセチン（Ｔｒｉａｃｅｔｉｎ）、及びこれらの混合物が挙げられる共界面活性剤（Ｃｏ－ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）；クレモフォール（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）、ミリズ（Ｍｙｒｊ）、ポロキサマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）、ルトロ－ル（Ｌｕｔｒｏｌ）、インウィトール（Ｉｍｗｉｔｏｒ）、スパン（Ｓｐａｎ）、ラブラフィル（Ｌａｂｒａｆｉｌ）などの単独または混合物が挙げられる界面活性剤（Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）；ミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）、カプテックス（Ｃａｐｔｅｘ）、オレイン酸エチル（Ｅｔｈｙｌ ｏｌｅａｔｅ）などの単独または混合物が挙げられるオイル（Ｏｉｌ）；及び、エリソルビン酸（Ｅｒｙｔｈｏｒｏｂｉｃ ａｃｉｄ）、クエン酸（Ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ）などの単独または混合物が挙げられる有機酸類などが挙げられる。これらは単独または２種以上を混合して用いられることができる。
【0017】
また、必要な場合、抗酸化剤、緩衝液及び／または静菌剤など他の通常の添加剤を添加して用いることができ、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、潤滑剤などを付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、料粒または錠剤などに製剤化して用いることができる。
【0018】
本発明で用いられる用語、「神経系疾患」とは、神経系統の疾患を通称するもので、一具体例として、神経損傷による疾患が含まれることができる。神経損傷疾患としては、退行性神経疾患（Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ）、末梢神経損傷（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｒｖｅ ｉｎｊｕｒｙ）、外傷性脳損傷（Ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ）と脳血管障害で現われる脳卒中（Ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0019】
一例として、前記退行性神経疾患は、中枢神経系の神経細胞に退行性変化が現われながら様々な症状を誘発する疾患を意味するもので、例えば、認知症、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、進行性核上性麻痺（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ ｐａｌｓｙ）、多系統萎縮症（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｙｓｔｅｍ ｓｔｒｏｐｈｙ）、オリーブ橋小脳萎縮症（Ｏｌｉｖｏｐｏｎｔｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ；ＯＰＣＡ）、シャイ・ドレーガー症候群（Ｓｈｙ－Ｄｒａｇｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；線条体黒質変性症（Ｓｔｒｉａｔｏｎｉｇｒａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ；ＡＬＳ）、本態性振戦（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｔｒｅｍｏｒ）、大脳皮質基底核変性症（Ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ ｇａｎｌｉｏｎｉｃ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、びまん性レビー小体病（Ｄｉｆｆｕｓｅ Ｌｅｗｙ ｂｏｄｙ ｄｉｓｅａｓｅ）、パーキンソン認知症複合（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ－ＡＬＳ－ｄｅｍｅｎｔｉａ ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ Ｇｕａｍ）またはピック病（Ｐｉｃｋ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）が挙げられる。
【0020】
他の一例として、前記神経損傷疾患は、てんかん、中風、脳卒中、虚血性脳血管障害、脊髓損傷疾患、末梢神経疾患、行動障害、発達障害、精神障害、ダウン症または精神分裂病を含むことができるが、これらに限定されるものではない。
また他の一例として、前記神経損傷疾患は、神経細胞損傷または細胞死滅などを原因とする疾患であることができる。
また他の一例として、前記神経損傷疾患は、神経細胞損傷または細胞死滅などを原因とする疾患であることができる。
【0021】
本発明で用いられる用語、「予防」とは、本発明の前記薬学的組成物を、神経系疾患の発病可能性があるか、該疾患が疑われる症状または状態を有する個体に投与することにより、神経系疾患の発病可能性を低くするか、前記症状または状態を緩和する行為を意味する。
【0022】
本発明で用いられる用語、「治療」とは、本発明の前記薬学的組成物を神経系疾患発病疑心個体に投与して神経系疾患の症状を好転させるか、もしくは良好にするすべての行為を意味する。
【0023】
本発明の前記４種新規化合物を含む薬学的組成物は、免疫抑制活性が減少されたものであることを特徴とするものであることができる。
【0024】
本発明の一具体例では、前記４種新規化合物の免疫抑制活性効果を、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）Ｔ細胞活性分析法で確認してＦＫ５０６よりも著しく減少された免疫抑制活性を確認することができた（表７）。
【0025】
本発明の他の具体例では、前記４種新規化合物の神経突起成長を通じた神経細胞の成長促進活性能を確認した（図２６）。
【0026】
本発明のまた他の具体例では、前記４種新規化合物の機能性シナプス形成活性効果を確認することでＦＫ５０６よりも増加された興奮性シナプス電流の頻度を確認し、４種新規化合物の神経系疾患の治療効果を確認することができた（図２７）。
【0027】
本発明の別の具体例では前記４種新規化合物のイン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）神経再生活性効能を評価するために、神経毒性化合物である１－メチル－４－フェニル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）によって誘導されるパーキンソン病マウスモデルを疾患動物モデルとして用いて、ＭＰＴＰによって退行された神経細胞及び神経繊維の回復程度を確認して４種新規化合物の退行性神経疾患治療効果を確認することができた（図２８）。
【0028】
また、本発明の更なる他の具体例では、前記４種新規化合物の細胞毒性の調査のための３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイ（図２９）、簡易遺伝毒性評価のためのＡｍｅｓ試験、心再分極（ｃａｒｄｉａｃ ｒｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）に対する潜在的な影響評価のためのヒト遅延整流性カリウムイオンチャネル遺伝子（ｈｕｍａｎ ｅｔｈｅｒ－ａ－ｇｏ－ｇｏ－ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ（ｈＥＲＧ）アッセイで安全性を確認することができた。
【0029】
前記結果は、前記４種新規化合物が免疫抑制活性に起因した副作用なしに神経系疾患の治療効果及び安全性を確認した物質であり、神経系疾患の予防または治療に有用に用いられることができることを示唆することである。
【0030】
前記の目的を達成するためのまた他の一態様として、本発明は前記薬学的組成物を個体に投与するステップを含む神経系疾患の予防または治療方法を提供する。
本発明で用いられる用語、「神経系疾患」、「予防」、及び「治療」は、前述したものと同様である。
本発明で用いられる用語、「神経系疾患」、「予防」、及び「治療」は、前述したものと同様である。
【0031】
本発明で用いられる用語、「個体」とは、神経系疾患が発病されたか、もしくは発病可能性があるすべての動物を意味することができる。
【0032】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に有効な量の４種新規化合物の中から選ばれた一つ以上、またはこれの異性体や塩を含むことができる。本発明において、用語「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な受恵／危険の比率で疾患を治療するのに十分な量を意味し、一般に０．００１～１０００ｍｇ／ｋｇの量、好ましくは、０．０５～２００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは、０．１～１００ｍｇ／ｋｇの量を一日１回～数回に分けて投与することができる。しかし、本発明の目的上、特定の患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によって他の製剤が用いられるかどうかをはじめとした、具体的組成物、患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路、及び組成物の分泌率、治療期間、具体的組成物とともに用いられるか、同時に使用される薬物をはじめ、多様な因子と医薬分野によく知られた類似因子によって異なるように適用することが望ましい。
【0033】
本発明の薬学的組成物の投与頻度は、特にこれに限定されないが、１日１回投与するか、若しくは用量を分割して数回投与することができる。
【0034】
本発明の薬学的組成物の投与用量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇであってもよく、具体的には、０．０５ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇであることができるが、これらに限定されるものではない。
【0035】
本発明の薬学的組成物は、個別治療剤として投与するか、他の治療剤と併用して投与されることができ、従来の治療剤とは順次にまたは同時に投与することができる。そして単独または多重投与されることができる。前記要素をいずれも考慮して副作用の誘発を最小化するとともに最小限の量で最大効果が得られる量を投与することが重要であり、当業者によって容易に決定され得る。
【0036】
本発明で使われた用語、「投与」は、ある適切な方法で患者に本発明の薬学的組成物を導入することを意味し、本発明の組成物の投与経路は、目的組職に到逹することができる限り、経口または非経口の多様な経路を通じて投与され得る。
【0037】
本発明による薬学的組成物の投与方式は特に限定されなく、当該技術分野において通常使用する方式に従うことができる。前記投与方式の非制限的な例として、薬学的組成物を経口投与または非経口投与方式で投与することができる。本発明による薬学的組成物は目的とする投与方式に従って多様な剤形に製作されることができる。
本発明の一具体例では、前記４種新規化合物の免疫抑制活性は著しく減少されるが、神経突起成長及びシナプス形成活性効果、退行性神経疾患治療効果とともに安全性に優れることを確認した。
本発明の一具体例では、前記４種新規化合物の免疫抑制活性は著しく減少されるが、神経突起成長及びシナプス形成活性効果、退行性神経疾患治療効果とともに安全性に優れることを確認した。
【0038】
前記結果は、前記４種新規化合物が免疫抑制活性による副作用を著しく減少させて持続的な神経系疾患の治療に使用できることを示唆することである。
【0039】
前記目的を達成するための他の一態様として、本発明は、前記４種新規化合物の生物学的製造工程であり、ストレプトマイセス・カナマイセティカス（Streptomyces kanamyceticus）を培養するステップを含む前記４種新規化合物の生産方法を提供する。
前記４種新規化合物のうち、９－デオキソ－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）または９－デオキソ－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）は、ストレプトマイセス・カナマイセティカス（Streptomyces kanamyceticus）ΔｆｋｂＤ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬ（受託番号ＫＣＴＣ１４１７１ＢＰ）を培養するステップを通じて生産されることができる。
前記４種新規化合物のうち、９－デオキソ－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）または９－デオキソ－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）は、ストレプトマイセス・カナマイセティカス（Streptomyces kanamyceticus）ΔｆｋｂＤ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬ（受託番号ＫＣＴＣ１４１７１ＢＰ）を培養するステップを通じて生産されることができる。
【0040】
また、９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）または９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）は、ストレプトマイセス・カナマイセティカス（Streptomyces kanamyceticus）ΔｆｋｂＤ－ｆｋｂＭ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬ（受託番号ＫＣＴＣ１４１７０ＢＰ）を培養するステップを通じて生産されることができる。
【0041】
本出願において、用語「培養」は、前記微生物を適当に調節された環境条件下で生育させることを意味する。本出願の培養過程は、当業界に知られた適当な培地及び培養条件によって行われることができる。このような培養過程は、選択される菌株によって当業者が容易に調整して用いることができる。具体的に、前記培養は、回分式、連続式、及び流加式であることができるが、これらに限定されるものではない。
前記４種新規化合物の生産方法は、一般に、ストレプトマイセス属の培養工程で採択される培養温度を使用する。本発明の具現に適した培養温度としては、好ましくは、２３～３０℃を適用することができ、より好ましくは、２５～２８℃の培養温度を適用することができる。
前記４種新規化合物の生産方法は、一般に、ストレプトマイセス属の培養工程で採択される培養温度を使用する。本発明の具現に適した培養温度としては、好ましくは、２３～３０℃を適用することができ、より好ましくは、２５～２８℃の培養温度を適用することができる。
【0042】
また、前記生産方法では、培養工程のｐＨを６．５～９に維持し、好ましくは、培養ｐＨを７～８に維持する。
【0043】
一方、前記生産方法では、培養液での溶存酸素の水準を高く維持するのが重要であるが、培養初期の溶存酸素の水準を１００％とした時、培養終了時点までの溶存酸素の水準を３０％以上に維持することが重要である。これを具現するためには、通常、８００～１，５００ｒｐｍの水準で攪拌することが好ましい。
【0044】
前記生産方法での培養細胞体からの生産された４種新規化合物の抽出は、１次抽出工程、２次抽出工程、及び３次抽出工程の実施によって達成されるが、本発明では、１次抽出工程として有機溶媒抽出法を用いるが、この時、使用可能な溶媒には、酢酸エチル（Ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）、メタノール（Ｍｅｔｈａｎｏｌ）、アセトン（Ａｃｅｔｏｎｅ）などが挙げられるが、酢酸エチルまたはメタノールの使用が好ましい。そして、２次抽出工程としてシリカゲルクロマトグラフィー（Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いるが、この時、使用可能な溶媒としては、メタノール、塩化メチレン（Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）が好ましい。そして、３次抽出工程としてはクロマトグラフィーを用いるが、この時、使用可能な溶媒としては、アセトニトリル（Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）、酢酸アンモニウム緩衝液（Ａｍｍｏｎｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）、酢酸（Ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、ギ酸（Ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ）などが挙げられるが、アセトニトリルの使用が好ましい。これらの方法の適用は、４種新規化合物を回収し易くし、また収率も高める。
【0045】
前記の目的を達成するためのまた他の一態様として、本発明は、４種新規化合物の製造に用いられることができる生産菌株であるストレプトマイセス・カナマイセティカス（Streptomyces kanamyceticus）ΔｆｋｂＤ－ｆｋｂＭ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬ（受託番号ＫＣＴＣ１４１７０ＢＰ）、ストレプトマイセス・カナマイセティカス（Streptomyces kanamyceticus）ΔｆｋｂＤ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬ（受託番号ＫＣＴＣ１４１７１ＢＰ）を提供する。
【0046】
前記生産菌株は、組換え菌株であることができ、前記組換えは形質転換のような遺伝的組換え（genetically modification）によって行われることができる。
前記目的を達成するための別の一態様として、本発明は、９－デオキソ－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）、９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）、９－デオキソ－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）、及び９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）からなる群より選ばれたいずれか一つの化合物、その異性体またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、神経系疾患の予防または改善用医薬部外品組成物を提供する。
前記目的を達成するための別の一態様として、本発明は、９－デオキソ－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）、９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）、９－デオキソ－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）、及び９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）からなる群より選ばれたいずれか一つの化合物、その異性体またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、神経系疾患の予防または改善用医薬部外品組成物を提供する。
【0047】
前記４種の化合物、異性体、薬学的に許容可能な塩、神経系疾患、予防に関しては前述したものと同様である。
【0048】
本発明で用いられる用語「医薬部外品」は、ヒトや動物の疾患を診断、治療、軽減、処置または予防する目的で使用する物品のうち、機構、機械または装置ではないもの及びヒトや動物の構造と機能に薬学的影響を与える目的で使用する物品の中で機構、機械または装置ではないことを除いた物品を意味する。
【0049】
本発明において、前記医薬部外品組成物は、神経系疾患の予防または改善効果を持つことができるが、これに限定されない。
【0050】
本発明の医薬部外品組成物には、前記成分のほかに必要によって薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含むことができる。前記薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤は、本発明の効果を阻害しない限り制限されなく、例えば、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤、潤滑剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などを含むことができる。
【0051】
前記「薬学的に許容可能な担体」は、生物体を刺激しないながらも、注入される化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体、賦形剤または希釈剤を意味することができ、具体的に、非自然的担体（non-naturally occurring carrier）であることができる。本発明に使用可能な前記担体の種類は特に限定されなく、当該技術分野において通常使用されるもので、薬学的に許容される担体であれば、いずれでも使用可能である。前記担体の非制限的な例としては、食塩水、滅菌数、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールなどが挙げられる。これらは単独又は２種以上を混合して用いられることができる。
【0052】
薬学的に許容可能な担体を含む前記組成物は、経口または非経口の種々の剤形であることができるが、好ましくは、経口の剤形であることができ、これに限定されるものではない。製剤化する場合は、普通使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調剤される。具体的に、経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、カルボン酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ゼラチンなどを混ぜ合わせて調剤されることができる。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も用いられることができる。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、耐溶剤、乳剤、シロップ剤などが該当し、よく用いられる単純希釈剤である水、液体パラフィンのほかに、様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれることができる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水溶性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、及び坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが用いられることができる。坐剤の機序としては、ウィテプソール、マクロゴ－ル、ツイーン６１、カカオ脂、ラウリン系油脂、グリセロゼラチンなどが用いられることができる。
【0053】
本発明の医薬部外品組成物は、消毒清潔剤、シャワーフォーム、軟膏液、ウェットティシュー、コーティング剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、医薬部外品の製剤化方法、用量、利用方法、構成成分などは技術分野において公知された通常の技術から適宜選択され得る。
【0054】
本発明の目的のための更なる他の一態様は、９－デオキソ－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）、９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）、９－デオキソ－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）、及び９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）からなる群より選ばれたいずれか一つの化合物、その異性体またはその食品学的に許容可能な塩を有効成分として含む、神経系疾患の予防または改善用食品組成物を提供する。
【0055】
前記４種の化合物、異性体、食品学的に許容可能な塩、神経系疾患、予防については、前述したものと同様である。
【0056】
本発明の食品組成物は、日常的に摂取することが可能であり、一般薬品とは異なり、天然物を原料にするため、薬品の長期服用時に発生することができる副作用などがないという長所があるので、神経系疾患の予防または改善の目的で非常に有用に用いられることができる。
【0057】
本発明の用語「改善」は、前記食品組成物の攝取により、神経系疾患と係わるパラメーター、例えば症状の程度を緩和または減少させるすべての行為を意味する。
本発明の用語「食品」は、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンデー類、スナック類、お菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料水、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料、ビタミン複合剤、健康機能食品及び健康食品などが挙げられ、普通の意味での食品をすべて含む。
本発明の用語「食品」は、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンデー類、スナック類、お菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料水、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料、ビタミン複合剤、健康機能食品及び健康食品などが挙げられ、普通の意味での食品をすべて含む。
【0058】
前記健康機能（性）食品（health functional food）は、特定保健用食品（food for special health use、ＦｏＳＨＵ）と同一な用語であり、栄養供給の他にも生体調節機能が効率的に現われるように加工された、医学、医療効果が高い食品を意味する。
【0059】
ここで、「機能（性）」とは、人体の構造及び機能に対して栄養素を調節するか、生理学的作用などのような保健用途に有用な効果を得ることを意味する。前記健康食品（health food）は、一般食品に比べて積極的な健康維持や増進効果を持つ食品を意味し、健康補助食品（health supplement food）は、健康補助の目的の食品を意味する。場合によって、健康機能食品、健康食品、健康補助食品の用語は混用されることができる。
【0060】
具体的に、前記健康機能食品は、前記４種新規化合物を飲み物、お茶類、香辛料、ガム、お菓子類などの食品素材に添加するか、カプセル化、粉末化、懸濁液などで製造した食品であり、これを摂取する場合、健康上特定の効果をもたらすことを意味するが、一般薬品とは異なり、食品を原料にするため薬品の長期服用時に発生することができる副作用がないという長所がある。
【0061】
本発明の食品は、当業界で通常用いられる方法によって製造可能であり、当業界で通常添加する原料及び成分を添加して製造することができる。
また、前記食品組成物は、食品と認められる剤形であれば、多様な形態の剤形で制限なしに製造されることができる。
また、前記食品組成物は、食品と認められる剤形であれば、多様な形態の剤形で制限なしに製造されることができる。
【0062】
また、前記食品組成物は、食品学的に許容可能な担体をさらに含むことができるが、担体の種類は特に制限されなく、当該技術分野において通常用いられる担体であればいずれでも使用できる。
【0063】
また、前記食品組成物は、食品組成物に通常使われて、匂い、味、視覚を向上させることができる追加成分を含むことができる。例えば、ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、ナイアシン（ｎｉａｃｉｎ）、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）、葉酸（ｆｏｌａｔｅ）、パントテン酸（ｐａｎｔｈｏｔｅｎｉｃ ａｃｉｄ）などを含むことができる。また、亜鉛（Ｚｎ）、鉄（Ｆｅ）、カルシウム（Ｃａ）、クロム（Ｃｒ）、マグネシウム（Ｍｇ）、マンガン（Ｍｎ）、銅（Ｃｕ）、クロム（Ｃｒ）などのミネラル；及びリジン、トリプトファン、システイン、バリンなどのアミノ酸を含むことができる。
【0064】
また、前記食品組成物は、防腐剤（ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、サリチル酸、デヒドロ酢酸ナトリウムなど）、殺菌剤（漂白粉と高度漂白粉、次亜塩素酸ナトリウムなど）、酸化防止剤（ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）など）、着色剤（タール色素など）、発色剤（亜硝酸ナトリウム、亜酢酸ナトリウムなど）、漂白剤（亜硫酸ナトリウム）、調味料（ＭＳＧグルタミン酸ナトリウムなど）、甘味料（ダルシン、サイクラミン酸、サッカリン、ナトリウムなど）、香料（バニリン、ラックトン類など）、膨張剤（明礬、Ｄ－酒石酸水素カリウムなど）、強化剤、乳化剤、増粘剤（糊料）、被膜剤、ガムベース、消泡剤、溶剤、改良剤などの食品添加物（ｆｏｏｄ ａｄｄｉｔｉｖｅｓ）を含むことができる。前記添加物は食品の種類によって選別して適正量で使用することができる。
【0065】
本発明の目的のための更なる別の一態様は、神経系疾患の予防、改善または治療のための９－デオキソ－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）、９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）、９－デオキソ－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）、及び９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）からなる群より選ばれたいずれか一つの化合物、その異性体またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む組成物の用途を提供することである。
【実施例】
【0066】
以下、下記実施例によって本発明をより詳細に説明する。ただし、下記実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらに限定されるものではない。
【0067】
実施例１：９－デオキソ－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）の製造
ＦＫ５０６を生産する菌株であるストレプトマイセス・カナマイセティカスに対してＢａｎ、Ｙ．Ｈ．ら（Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．２０１３、７６、１０９１－１０９８）に記載された方法によって二重交叉相同組換え（Ｄｏｕｂｌｅ ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）によるインフレーム（Ｉｎ－ｆｒａｍｅ）欠損方法を用いてｆｋｂＤ、ｔｃｓＤ及びｆｋｂＬ遺伝子の非活性化をもたらして９－デオキソ－３６，３７－ジヒドロ－プロピルＦＫ５０６の生産菌株であるストレプトマイセス・カナマイセティカス（Streptomyces kanamyceticus）ΔｆｋｂＤ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬ（受託番号ＫＣＴＣ１４１７１ＢＰ）を製作した。
ＦＫ５０６を生産する菌株であるストレプトマイセス・カナマイセティカスに対してＢａｎ、Ｙ．Ｈ．ら（Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．２０１３、７６、１０９１－１０９８）に記載された方法によって二重交叉相同組換え（Ｄｏｕｂｌｅ ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）によるインフレーム（Ｉｎ－ｆｒａｍｅ）欠損方法を用いてｆｋｂＤ、ｔｃｓＤ及びｆｋｂＬ遺伝子の非活性化をもたらして９－デオキソ－３６，３７－ジヒドロ－プロピルＦＫ５０６の生産菌株であるストレプトマイセス・カナマイセティカス（Streptomyces kanamyceticus）ΔｆｋｂＤ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬ（受託番号ＫＣＴＣ１４１７１ＢＰ）を製作した。
【0068】
具体的に説明すると、ＦＫ５０６を生産するストレプトマイセス・カナマイセティカス菌株からｆｋｂＤ、ｔｃｓＤとｆｋｂＬ遺伝子の欠損突然変異体を製作するために、それぞれの遺伝子をｐＫＣ１１３９ベクターにクローニングしてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２に移した後、接合（Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）を通じてＦＫ５０６生産菌株ストレプトマイセス・カナマイセティカスに形質転換した。
【0069】
菌株の製作方法は、より具体的に、インフレーム（Ｉｎ－ｆｒａｍｅ）遺伝子欠損プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）の製作、遺伝子欠損菌株の製作で説明することができる。
インフレーム（Ｉｎ－ｆｒａｍｅ）遺伝子欠失プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）の製作は、大膓菌－放線菌シャトル（Ｅ．ｃｏｌｉ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｈｕｔｔｌｅ）ベクターｐＫＣ１１３９をインフレーム遺伝子欠損のために用いた。プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）の製作は、ストレプトマイセス・カナマイセティカスに由来するフォスミド（Ｆｏｓｍｉｄ）ＤＮＡからの除去のための標的遺伝子の左側及び右側隣接切片（Ｌｅｆｔ－ ａｎｄ ｒｉｇｈｔ－ｆｌａｎｋｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）のＰＣＲ増幅によって実施した。ｆｋｂＤ遺伝子の欠損のためには、左側隣接切片のプライマー対ＦｋｂＤＬＦ／ＦｋｂＤＬＲ、右側隣接切片のプライマー対ＦｋｂＤＲＦ／ＦｋｂＤＲＲを設計した。ｔｃｓＤ遺伝子の欠損のためには、左側隣接切片のプライマー対ＴｃｓＤＬＦ／ＴｃｓＤＬＲ、右側隣接切片のプライマー対ＴｃｓＤＲＦ／ＴｃｓＤＲＲを設計した。ｆｋｂＬ遺伝子の欠損のためには、左側隣接切片のプライマー対ＦｋｂＬＬＦ／ＦｋｂＬＬＲ、右側隣接切片のプライマー対ＦｋｂＬＲＦ／ＦｋｂＬＲＲを設計した。ＰＣＲ切片はいずれも分離してＨｉｎｄＩＩＩ－ＸｂａＩまたはＸｂａＩ－ＥｃｏＲＩにより切断した後、ｐＫＣ１１３９ベクターにクローニングした。本実施例で用いられた菌株、プラスミド及びプライマーに対する情報は、下記表１及び表２に示した。
インフレーム（Ｉｎ－ｆｒａｍｅ）遺伝子欠失プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）の製作は、大膓菌－放線菌シャトル（Ｅ．ｃｏｌｉ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｈｕｔｔｌｅ）ベクターｐＫＣ１１３９をインフレーム遺伝子欠損のために用いた。プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）の製作は、ストレプトマイセス・カナマイセティカスに由来するフォスミド（Ｆｏｓｍｉｄ）ＤＮＡからの除去のための標的遺伝子の左側及び右側隣接切片（Ｌｅｆｔ－ ａｎｄ ｒｉｇｈｔ－ｆｌａｎｋｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）のＰＣＲ増幅によって実施した。ｆｋｂＤ遺伝子の欠損のためには、左側隣接切片のプライマー対ＦｋｂＤＬＦ／ＦｋｂＤＬＲ、右側隣接切片のプライマー対ＦｋｂＤＲＦ／ＦｋｂＤＲＲを設計した。ｔｃｓＤ遺伝子の欠損のためには、左側隣接切片のプライマー対ＴｃｓＤＬＦ／ＴｃｓＤＬＲ、右側隣接切片のプライマー対ＴｃｓＤＲＦ／ＴｃｓＤＲＲを設計した。ｆｋｂＬ遺伝子の欠損のためには、左側隣接切片のプライマー対ＦｋｂＬＬＦ／ＦｋｂＬＬＲ、右側隣接切片のプライマー対ＦｋｂＬＲＦ／ＦｋｂＬＲＲを設計した。ＰＣＲ切片はいずれも分離してＨｉｎｄＩＩＩ－ＸｂａＩまたはＸｂａＩ－ＥｃｏＲＩにより切断した後、ｐＫＣ１１３９ベクターにクローニングした。本実施例で用いられた菌株、プラスミド及びプライマーに対する情報は、下記表１及び表２に示した。
【0070】
遺伝子欠損菌株の製作のために用いたプラスミドは、表１に要約した。Ｃ９のヒドロキシラーゼ（Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）を除去するためのプラスミドｐΔｆｋｂＤは大膓菌ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２に移した後に接合によってストレプトマイセス・カナマイセティカス内に導入して標的遺伝子を相同組換えで欠損させた。欠損プラスミドとストレプトマイセス・カナマイセティカス染色体との間で単一交叉が生じた菌株としては、アプラマイシン（Ａｐｒａｍｙｃｉｎ）が存在する３７℃（ｐＳＧ５基本とするレプリコン（Ｒｅｐｌｉｃｏｎ）のための非増殖許容温度）でアプラマイシン耐性トランスコンジュガント（Ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔ）の培養を選択した。その後、確保されたコロニーは、２８℃で選択なしに３回増殖を行うことで２回目の交叉を許容した。２つの達成された二重交叉突然変異、すなわちΔｆｋｂＤを、アプラマイシン敏感性の発現形質で選択し、その後にＰＣＲで確認し、選択的にサザンブロット分析法で確認した。
【0071】
製作したｆｋｂＤ遺伝子が欠損されたストレプトマイセス・カナマイセティカスΔｆｋｂＤに、Ｃ２１側鎖を変形するためのプラスミドｐΔｔｃｓＤを導入してｆｋｂＤ遺伝子欠損方法と同様な方法を利用してｔｃｓＤ遺伝子を欠損させた。ΔｆｋｂＤ、ｔｃｓＤはアプラマイシン敏感性の発現形質で選択し、その後に、ＰＣＲで確認したし、選択的にサザンブロット分析法で確認した。追加的に製作したｆｋｂＤとｔｃｓＤ遺伝子が欠損されたストレプトマイセス・カナマイセティカスΔｆｋｂＤ、ｔｃｓＤに、Ｃ１プロリン環を形成するためのプラスミドｐΔｆｋｂＬを導入してｆｋｂＤとｔｃｓＤ遺伝子欠損方法と同様な方法を利用してｆｋｂＬ遺伝子を欠損させた。ΔｆｋｂＤ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬはアプラマイシン敏感性の発現形質で選択したし、その後にＰＣＲで確認した。
【0072】
製作したｆｋｂＤ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬ遺伝子欠損菌株であるストレプトマイセス・カナマイセティカス（Streptomyces kanamyceticus）ΔｆｋｂＤ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬは、韓国生命工学研究院の生物資源センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、ＫＣＴＣ）に２０２０年４月１４日付けで寄託した（受託番号ＫＣＴＣ１４１７１ＢＰ）。
【表1】
【表2】
【0073】
前記製作した生産菌株ストレプトマイセス・カナマイセティカスΔｆｋｂＤ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬ（受託番号ＫＣＴＣ１４１７１ＢＰ）の培養を通じて、９－デオキソ－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）を製造した。具体的に説明すると、次のようである。２５０ｍｌのバッフル付三角フラスコ（Ｂａｆｆｌｅｄ ｆｌａｓｋ）に５０ｍｌのＲ２ＹＥ培地（スクロース１０３ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、硫酸カリウム０．２５ｇ／Ｌ、塩化マグネシウム６水和物１０．１２ｇ／Ｌ、カザミノ酸０．１ｇ／Ｌ、酵母抽出物（１０％）５０ｍｌ／Ｌ、ＴＥＳ緩衝液（５．７３％、ｐＨ７．２）１００ｍｌ／Ｌ、リン酸カリウム（０．５％）１０ｍｌ／Ｌ、塩化カルシウム２水和物（３．６８％）８０ｍｌ／Ｌ、Ｌ－プロリン（２０％）１５ｍｌ／Ｌ、微量元素溶液２ｍｌ／Ｌ、水酸化ナトリウム（１Ｎ）５ｍｌ／Ｌ）を添加し、ここに生産菌株を接種した後に回転式振とう培養器で２８℃、１８０ｒｐｍの条件下で２日間前培養を実施した。次いで、１ＬのＲ２ＹＥ培地が添加されている３Ｌ三角フラスコ（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ ｆｌａｓｋ）に２日間前培養した培養液１０ｍｌを接種した。接種後に２８℃、１８０ｒｐｍの条件下で６日間培養を実施した。６日間培養後に１次回収工程によって生産された９－デオキソ－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）を抽出した。
【0074】
１次回収工程は次のように実施した。まず、培養液に同量のメタノールを添加して３０分間混合した後に遠心分離して菌体を除去し、菌体を除去した抽出液に対しては回転蒸発器（Ｒｏｔａｒｙ ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）を利用した濃縮を実施した。次に、濃縮した抽出液を水に溶解させて、２倍の用量の酢酸エチル（Ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）を添加後、よく混合してから層分離が行われるまで放置した。層が分離された後に上層の有機溶媒層を回収し、これを回転蒸発器を用いて濃縮させて濃縮後の重量を測定した。１次回収工程を実施して得られた抽出液をシリカゲルが充填されたコラムを通過させた。この時、シリカゲルの量は、１次回収工程の抽出液の重量の１５倍を使用したし、移動相は、５種の割合のメタノールと塩化メチレン（分液１は、０：１００、分液２は、１：１００、分液３は、１：１０、分液４は、１：１、分液５は、１００：０）を使用した。分液３から９－デオキソ－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）が確認された。このように得られた分液３は、回転蒸発器を用いて濃縮してＨＰＬＣを利用して最終的に精製した。
【0075】
これを凍結乾燥させて粉末形態の式１で表される物質である９－デオキソ－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）が得られた。
製造した９－デオキソ－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）の確認は、次のように実施した。具体的に、高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）分析、質量分析（Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、核磁気共鳴分光法（Ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）を実施した。
製造した９－デオキソ－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）の確認は、次のように実施した。具体的に、高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）分析、質量分析（Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、核磁気共鳴分光法（Ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）を実施した。
【0076】
９－デオキソ－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）に対する分析結果は、表３及び図１～図６で整理され、これらの結果から製作した生産菌株ストレプトマイセス・カナマイセティカスΔｆｋｂＤ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬから９－デオキソ－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）が生産されることを確認することができた。
【0077】
９－デオキソ－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６；分子式Ｃ４３Ｈ７１ＮＯ１１、分子量７７７．５０）に対する分析結果を、下記の表３に示した。
【表3】
【0078】
１Ｈ、１３Ｃ－ＮＭＲから特徴的な官能基として、１個のケトン炭素（δＣ２１４．８）と２個のカルボニル炭素（δＣ１７１．６、１６９．７）、２個のオレフィン骨格（δＣ１４０．６、１２２．６；δＣ１３２．３、１２９．４）が確認されたし、脱酸素化された第４級炭素（δＣ９８．４）、７個の酸素化されたメチン炭素（δＣ８４．２、７７．８、７７．４、７４．４、７３．６、７０．８、６９．１）、３個のメトキシ炭素（δＣ５７．７、５６．６、５６．２）が観測されたし、６個のメチル炭素（δＣ１８．９、１６．９、１５．４、１４．０、９．８）が観測されたし、総計４３個の炭素からなるＦＫ５０６誘導体であることが観測された。
【0079】
正確な構造の確認のために、２Ｄ－ＮＭＲを確認した。ｇＣＯＳＹからプロトンの連結を確認した結果、Ｈ－２～Ｈ－４の間の結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）から、本化合物は、ピペコリル骨格のＦＫ５０６ではない、ＣＨ２官能基がないプロピル骨格を持っていることを確認した。ｇＨＭＢＣデータからＨ－９（δＨ２．５５、２．６２）がＣ－８（δＣ１７１．６）、Ｃ－１０（δＣ９８．４）と相関関係（ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）から本化合物は、Ｃ－９にケトンではないＣＨ２に還元された骨格であることを確認した。ＦＫ５０６基本骨格であるＣ３６～Ｃ３７のエキソメチレンが観測されず、ｇＣＯＳＹ ２Ｄ－ＮＭＲにおいてトリプレットであると観測されるＨ３７がＨ３６ａ／ｂ及びＨ３６ａ／ｂとＨ３５ａ／ｂとの間にそれぞれ結合相関（ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）を示すことから、Ｃ３６－Ｃ３７の骨格が脱水素されたものであることを確認することができた。これと共に、３個のメトキシ官能基がＣ－１３、Ｃ－１５、及びＣ－３１に存在する構造であることを確認した。これらを総合して、本化合物は９－デオキソ－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）であることを確認した。
【0080】
実施例２：９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）の製造
ＦＫ５０６を生産する菌株であるストレプトマイセス・カナマイセティカスに対してＢａｎ、Ｙ．Ｈ．ら（Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．２０１３、７６、１０９１－１０９８）に記載された方法によって二重交叉相同組換え（Ｄｏｕｂｌｅ ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）によるインフレーム（Ｉｎ－ｆｒａｍｅ）欠損方法を用いてｆｋｂＤ-ｆｋｂＭ、ｔｃｓＤ及びｆｋｂＬ遺伝子の非活性化をもたらして９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）の生産菌株であるストレプトマイセス・カナマイセティカス（Streptomyces kanamyceticus）ΔｆｋｂＤ－ｆｋｂＭ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬ（受託番号ＫＣＴＣ１４１７０ＢＰ）を製作した。
ＦＫ５０６を生産する菌株であるストレプトマイセス・カナマイセティカスに対してＢａｎ、Ｙ．Ｈ．ら（Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．２０１３、７６、１０９１－１０９８）に記載された方法によって二重交叉相同組換え（Ｄｏｕｂｌｅ ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）によるインフレーム（Ｉｎ－ｆｒａｍｅ）欠損方法を用いてｆｋｂＤ-ｆｋｂＭ、ｔｃｓＤ及びｆｋｂＬ遺伝子の非活性化をもたらして９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）の生産菌株であるストレプトマイセス・カナマイセティカス（Streptomyces kanamyceticus）ΔｆｋｂＤ－ｆｋｂＭ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬ（受託番号ＫＣＴＣ１４１７０ＢＰ）を製作した。
【0081】
具体的に説明すれば、ＦＫ５０６を生産するストレプトマイセス・カナマイセティカス菌株からｆｋｂＤ－ｆｋｂＭ、ｔｃｓＤとｆｋｂＬ遺伝子の欠損突然変異体を製作するためにそれぞれの遺伝子をｐＫＣ１１３９ベクターにクローニングしてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２に移した後、接合（Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）を通じてＦＫ５０６生産菌株ストレプトマイセス・カナマイセティカスに形質転換した。
【0082】
より具体的に、菌株の製作方法は、インフレーム（Ｉｎ－ｆｒａｍｅ）遺伝子欠損プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）の製作、遺伝子欠損菌株の製作により説明することができる。
インフレーム（Ｉｎ－ｆｒａｍｅ）遺伝子欠損プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）の製作は、大膓菌－放線菌シャトル（Ｅ．ｃｏｌｉ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｈｕｔｔｌｅ）ベクターｐＫＣ１１３９をインフレーム遺伝子欠損のために使用した。プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）の製作は、ストレプトマイセス・カナマイセティカスに由来するフォスミド（Ｆｏｓｍｉｄ）ＤＮＡからの除去のための標的遺伝子の左側及び右側隣接切片（Ｌｅｆｔ－ ａｎｄ ｒｉｇｈｔ－ｆｌａｎｋｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）のＰＣＲ増幅によって実施した。ｆｋｂＤ-ｆｋｂＭ遺伝子の欠損のためには、左側隣接切片のプライマー対ＦｋｂＤ－ＭＬＦ／ＦｋｂＤ－ＭＬＲ、右側隣接切片のプライマー対ＦｋｂＤ－ＭＲＦ／ＦｋｂＤ－ＭＲＲを設計した。ｔｃｓＤ遺伝子の欠損のためには、左側隣接切片のプライマー対ＴｃｓＤＬＦ／ＴｃｓＤＬＲ、右側隣接切片のプライマー対ＴｃｓＤＲＦ／ＴｃｓＤＲＲを設計した。ｆｋｂＬ遺伝子の欠損のためには、左側隣接切片のプライマー対ＦｋｂＬＬＦ／ＦｋｂＬＬＲ、右側隣接切片のプライマー対ＦｋｂＬＲＦ／ＦｋｂＬＲＲを設計した。ＰＣＲ切片はいずれも分離してＨｉｎｄＩＩＩ－ＸｂａＩまたはＸｂａＩ－ＥｃｏＲＩにより切断した後、ｐＫＣ１１３９ベクターにクローニングした。本実施例で用いられた菌株、プラスミド及びプライマーに対する情報は、前記表１及び表２に示した。
インフレーム（Ｉｎ－ｆｒａｍｅ）遺伝子欠損プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）の製作は、大膓菌－放線菌シャトル（Ｅ．ｃｏｌｉ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｈｕｔｔｌｅ）ベクターｐＫＣ１１３９をインフレーム遺伝子欠損のために使用した。プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）の製作は、ストレプトマイセス・カナマイセティカスに由来するフォスミド（Ｆｏｓｍｉｄ）ＤＮＡからの除去のための標的遺伝子の左側及び右側隣接切片（Ｌｅｆｔ－ ａｎｄ ｒｉｇｈｔ－ｆｌａｎｋｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）のＰＣＲ増幅によって実施した。ｆｋｂＤ-ｆｋｂＭ遺伝子の欠損のためには、左側隣接切片のプライマー対ＦｋｂＤ－ＭＬＦ／ＦｋｂＤ－ＭＬＲ、右側隣接切片のプライマー対ＦｋｂＤ－ＭＲＦ／ＦｋｂＤ－ＭＲＲを設計した。ｔｃｓＤ遺伝子の欠損のためには、左側隣接切片のプライマー対ＴｃｓＤＬＦ／ＴｃｓＤＬＲ、右側隣接切片のプライマー対ＴｃｓＤＲＦ／ＴｃｓＤＲＲを設計した。ｆｋｂＬ遺伝子の欠損のためには、左側隣接切片のプライマー対ＦｋｂＬＬＦ／ＦｋｂＬＬＲ、右側隣接切片のプライマー対ＦｋｂＬＲＦ／ＦｋｂＬＲＲを設計した。ＰＣＲ切片はいずれも分離してＨｉｎｄＩＩＩ－ＸｂａＩまたはＸｂａＩ－ＥｃｏＲＩにより切断した後、ｐＫＣ１１３９ベクターにクローニングした。本実施例で用いられた菌株、プラスミド及びプライマーに対する情報は、前記表１及び表２に示した。
【0083】
遺伝子欠損菌株の製作のために用いたプラスミドは、表１に要約した。Ｃ９ヒドロキシラーゼ（Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）と３１－Ｏ－メチルトランスフェラーゼを一緒に除去するためのプラスミドｐΔｆｋｂＤ－ｆｋｂＭは、大膓菌ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２に移した後、接合によってストレプトマイセス・カナマイセティカス内に導入して標的遺伝子を相同組換えにより欠損させた。欠損プラスミドとストレプトマイセス・カナマイセティカス染色体との間で単一交叉が生じた菌株としては、アプラマイシン（Ａｐｒａｍｙｃｉｎ）が存在する３７℃（ｐＳＧ５基本とするレプリコン（Ｒｅｐｌｉｃｏｎ）のための非増殖許容温度）でアプラマイシン耐性トランスコンジュガント（Ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔ）の培養を選択した。その後、確保されたコロニーは、２８℃で選択なしに３回増殖を行うことで２回目の交叉を許容した。
２つの達成された二重交叉突然変異、すなわちΔｆｋｂＤ-ｆｋｂＭをアプラマイシン敏感性の発現形質で選択し、その後に、ＰＣＲで確認し、選択的にサザンプロット分析法で確認した。
２つの達成された二重交叉突然変異、すなわちΔｆｋｂＤ-ｆｋｂＭをアプラマイシン敏感性の発現形質で選択し、その後に、ＰＣＲで確認し、選択的にサザンプロット分析法で確認した。
【0084】
製作したｆｋｂＤ-ｆｋｂＭ遺伝子が欠損されたストレプトマイセス・カナマイセティカスΔｆｋｂＤ-ｆｋｂＭに、Ｃ２１側鎖を変形するためのプラスミドｐΔｔｃｓＤを導入してｆｋｂＤ-ｆｋｂＭ遺伝子欠損方法と同様な方法を利用してｔｃｓＤ遺伝子を欠損させた。ΔｆｋｂＤ-ｆｋｂＭ、ｔｃｓＤはアプラマイシン敏感性の発現形質で選択し、その後にＰＣＲで確認したし、選択的にサザンプロット分析法で確認した。追加的に製作したｆｋｂＤ-ｆｋｂＭとｔｃｓＤ遺伝子が欠損されたストレプトマイセス・カナマイセティカスΔｆｋｂＤ-ｆｋｂＭ、ｔｃｓＤに、Ｃ１プロリン環を形成するためのプラスミドｐΔｆｋｂＬを導入してｆｋｂＤ-ｆｋｂＭとｔｃｓＤ遺伝子欠損方法と同様な方法を利用してｆｋｂＬ遺伝子を欠損させた。ΔｆｋｂＤ-ｆｋｂＭ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬは、アプラマイシン敏感性の発現形質で選択し、その後にＰＣＲで確認した。
【0085】
製作したｆｋｂＤ-ｆｋｂＭ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬ遺伝子欠損菌株であるストレプトマイセス・カナマイセティカス（Streptomyces kanamyceticus）ΔｆｋｂＤ-ｆｋｂＭ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬは、韓国生命工学研究院の生物資源センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、ＫＣＴＣ）に ２０２０年４月１４日付けで寄託した（受託番号ＫＣＴＣ１４１７０ＢＰ）。
【0086】
前記製作した生産菌株ストレプトマイセス・カナマイセティカスΔｆｋｂＤ-ｆｋｂＭ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬ（受託番号ＫＣＴＣ１４１７０ＢＰ）の培養を通じて９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）を製造した。具体的に説明すると、次のようである。２５０ｍｌのバッフル付き三角フラスコ（Ｂａｆｆｌｅｄ ｆｌａｓｋ）に５０ｍｌのＲ２ＹＥ培地（スクロース１０３ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、硫酸カリウム０．２５ｇ／Ｌ、塩化マグネシウム６水和物１０．１２ｇ／Ｌ、カザミノ酸０．１ｇ／Ｌ、酵母抽出物（１０％）５０ｍｌ／Ｌ、ＴＥＳ緩衝液（５．７３％、ｐＨ ７．２）１００ｍｌ／Ｌ、リン酸カリウム（０．５％）１０ｍｌ／Ｌ、塩化カルシウム２水和物（３．６８％）８０ｍｌ／Ｌ、Ｌ－プロリン（２０％）１５ｍｌ／Ｌ、微量元素溶液２ｍｌ／Ｌ、水酸化ナトリウム（１Ｎ）５ｍｌ／Ｌ）を添加し、ここに生産菌株を接種した後、回転式振とう培養器で２８℃、１８０ｒｐｍの条件下で２日間前培養を実施した。次いで、１ＬのＲ２ＹＥ培地が添加されている３Ｌ三角フラスコ（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ ｆｌａｓｋ）に２日間前培養した培養液１０ｍｌを接種した。接種後に２８℃、１８０ｒｐｍの条件下で６日間培養を実施した。６日間培養後に１次回収工程によって生産された９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）を抽出した。
【0087】
１次回収工程は次のように実施した。まず、培養液に同量のメタノールを添加して３０分間混合した後、遠心分離して菌体を除去し、菌体を除去した抽出液に対しては、回転蒸発器（Ｒｏｔａｒｙ ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）を利用した濃縮を実施した。次に、濃縮した抽出液を水に溶解させ、２倍の用量の酢酸エチル（Ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）を添加後、よく混合してから層分離が行われるまで放置した。層が分離された後に上層の有機溶媒層を回収し、これを回転蒸発器を利用して濃縮させて濃縮後の重量を測定した。１次回収工程を実施して得られた抽出液をシリカゲルが充填されたコラムを通過させた。この時、シリカゲルの量は、１次回収工程の抽出液の重量の１５倍を使用し、移動相は ５種の割合のメタノールと塩化メチル（分液１は、０：１００、分液２は、１：１００、分液３は、１：１０、分液４は、１：１、分液５は、１００：０）を使用した。分液３から ９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）が確認された。このように得られた分液３は、回転蒸発器を利用して濃縮してＨＰＬＣを用いて最終的に精製した。
これを凍結乾燥させて粉末形態の式２で表される物質である９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）が得られた。
これを凍結乾燥させて粉末形態の式２で表される物質である９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）が得られた。
【0088】
製造した９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）の確認は、次のように実施した。具体的に、高速液体クロマトグラフィー分析（Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）、質量分析（Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、核磁気共鳴分光法（Ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）を実施した。９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）に対する分析結果は、表４及び図７～図１２により整理され、これらの結果から製作した生産菌株ストレプトマイセス・カナマイセティカスΔｆｋｂＤ-ｆｋｂＭ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬから、９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）が生産されることを確認することができた。
【0089】
９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６；分子式Ｃ４２Ｈ７３ＮＯ１１、分子量７６３．４９）に対する分析結果を下記の表４に示した。
【表4】
【0090】
１Ｈ、１３Ｃ－ＮＭＲから特徴的な官能基として、１個のケトン炭素（δＣ２１６．３）と２個のカルボニル炭素（δＣ１７１．７、１６９．８）、２個のオレフィン骨格（δＣ１４０．８、１２２．６；δＣ１３２．４、１２９．４）が確認されたし、脱酸素化された第４級炭素（δＣ９８．４）、７個の酸素化されたメチン炭素（δＣ７７．９、７７．３、７５．５、７５．０、７４．４、７０．８、６９．１）、２個のメトキシ炭素（δＣ５８．７、５７．７）が観測されたし、５個のメチル炭素（δＣ１８．９、１６．９、１５．４、１４．０、９．８）が観測されたし、 総計４２個の炭素からなるＦＫ５０６誘導体であることが観測された。正確な構造を確認するために、２Ｄ－ＮＭＲを確認した。ｇＣＯＳＹからプロトンの連結を確認した結果、Ｈ－２～Ｈ－４の間の結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）から本化合物は、プロリン骨格を持っていることを確認した。ｇＨＭＢＣデータからＨ－９（δＨ２．５４、２．６３）がＣ－８（δＣ１７１．７）、Ｃ－１０（δＣ９８．４）と相関関係（ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）から本化合物は Ｃ－９にケトンではないＣＨ２に還元された骨格であることを確認した。これと共に、２個のメトキシ官能基がＣ－１３、Ｃ－１５に結合されており、Ｃ－３１にはメトキシが存在しない構造であることを確認した。
これらを総合して、本化合物は、９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）であることを確認した。
これらを総合して、本化合物は、９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）であることを確認した。
【0091】
実施例３：９－デオキソ－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）の製造
ＦＫ５０６を生産する菌株であるストレプトマイセス・カナマイセティカスに対してＢａｎ、Ｙ．Ｈ．ら（Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．２０１３、７６、１０９１－１０９８）に記載された方法によって二重交叉相同組換え（Ｄｏｕｂｌｅ ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）によるインフレーム（Ｉｎ－ｆｒａｍｅ）欠損方法を用いて、ｆｋｂＤ、ｔｃｓＤ及びｆｋｂＬ遺伝子の非活性化をもたらして９－デオキソ－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－ｐｒｏｌｙｌ－ＦＫ５２０）の生産菌株であるストレプトマイセス・カナマイセティカスΔｆｋｂＤ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬ（受託番号ＫＣＴＣ１４１７１ＢＰ）を製作した。
ＦＫ５０６を生産する菌株であるストレプトマイセス・カナマイセティカスに対してＢａｎ、Ｙ．Ｈ．ら（Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．２０１３、７６、１０９１－１０９８）に記載された方法によって二重交叉相同組換え（Ｄｏｕｂｌｅ ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）によるインフレーム（Ｉｎ－ｆｒａｍｅ）欠損方法を用いて、ｆｋｂＤ、ｔｃｓＤ及びｆｋｂＬ遺伝子の非活性化をもたらして９－デオキソ－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－ｐｒｏｌｙｌ－ＦＫ５２０）の生産菌株であるストレプトマイセス・カナマイセティカスΔｆｋｂＤ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬ（受託番号ＫＣＴＣ１４１７１ＢＰ）を製作した。
【0092】
具体的に説明すれば、ＦＫ５０６を生産するストレプトマイセス・カナマイセティカス菌株から、ｆｋｂＤ、ｔｃｓＤとｆｋｂＬ遺伝子の欠損突然変異体を製作するために、それぞれの遺伝子をｐＫＣ１１３９ベクターにクローニングしてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２に移した後、接合（Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）によってＦＫ５０６生産菌株ストレプトマイセス・カナマイセティカスに形質転換した。
【0093】
より具体的に、菌株の製作方法は、インフレーム（Ｉｎ－ｆｒａｍｅ）遺伝子欠損プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）の製作、遺伝子欠損菌株の製作により説明することができる。
インフレーム（Ｉｎ－ｆｒａｍｅ）遺伝子欠損プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）の製作は、大膓菌－放線菌シャトル（Ｅ．ｃｏｌｉ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｈｕｔｔｌｅ）ベクターｐＫＣ１１３９をインフレーム遺伝子欠損のために使用した。プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）の製作は、ストレプトマイセス・カナマイセティカスに由来するフォスミド（Ｆｏｓｍｉｄ）ＤＮＡからの除去のための標的遺伝子の左側及び右側隣接切片（Ｌｅｆｔ－ ａｎｄ ｒｉｇｈｔ－ｆｌａｎｋｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）のＰＣＲ増幅によって実施した。ｆｋｂＤ遺伝子の欠損のためには、左側隣接切片のプライマー対ＦｋｂＤＬＦ／ＦｋｂＤＬＲ、右側隣接切片のプライマー対ＦｋｂＤＲＦ／ＦｋｂＤＲＲを設計した。ｔｃｓＤ遺伝子の欠損のためには、左側隣接切片のプライマー対ＴｃｓＤＬＦ／ＴｃｓＤＬＲ、右側隣接切片のプライマー対ＴｃｓＤＲＦ／ＴｃｓＤＲＲを設計した。ｆｋｂＬ遺伝子の欠損のためには、左側隣接切片のプライマー対ＦｋｂＬＬＦ／ＦｋｂＬＬＲ、右側隣接切片のプライマー対ＦｋｂＬＲＦ／ＦｋｂＬＲＲを設計した。ＰＣＲ切片はいずれも分離してＨｉｎｄＩＩＩ－ＸｂａＩまたはＸｂａＩ－ＥｃｏＲＩにより切断した後、ｐＫＣ１１３９ベクターにクローニングした。本実施例で使用された菌株、プラスミド及びプライマーに対する情報は、表１及び表２に示した。
インフレーム（Ｉｎ－ｆｒａｍｅ）遺伝子欠損プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）の製作は、大膓菌－放線菌シャトル（Ｅ．ｃｏｌｉ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｈｕｔｔｌｅ）ベクターｐＫＣ１１３９をインフレーム遺伝子欠損のために使用した。プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）の製作は、ストレプトマイセス・カナマイセティカスに由来するフォスミド（Ｆｏｓｍｉｄ）ＤＮＡからの除去のための標的遺伝子の左側及び右側隣接切片（Ｌｅｆｔ－ ａｎｄ ｒｉｇｈｔ－ｆｌａｎｋｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）のＰＣＲ増幅によって実施した。ｆｋｂＤ遺伝子の欠損のためには、左側隣接切片のプライマー対ＦｋｂＤＬＦ／ＦｋｂＤＬＲ、右側隣接切片のプライマー対ＦｋｂＤＲＦ／ＦｋｂＤＲＲを設計した。ｔｃｓＤ遺伝子の欠損のためには、左側隣接切片のプライマー対ＴｃｓＤＬＦ／ＴｃｓＤＬＲ、右側隣接切片のプライマー対ＴｃｓＤＲＦ／ＴｃｓＤＲＲを設計した。ｆｋｂＬ遺伝子の欠損のためには、左側隣接切片のプライマー対ＦｋｂＬＬＦ／ＦｋｂＬＬＲ、右側隣接切片のプライマー対ＦｋｂＬＲＦ／ＦｋｂＬＲＲを設計した。ＰＣＲ切片はいずれも分離してＨｉｎｄＩＩＩ－ＸｂａＩまたはＸｂａＩ－ＥｃｏＲＩにより切断した後、ｐＫＣ１１３９ベクターにクローニングした。本実施例で使用された菌株、プラスミド及びプライマーに対する情報は、表１及び表２に示した。
【0094】
遺伝子欠損菌株の製作のために用いたプラスミドは表１に要約した。Ｃ９ヒドロキシラーゼ（Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）を除去するためのプラスミドｐΔｆｋｂＤは、大膓菌ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２に移した後、接合によってストレプトマイセス・カナマイセティカス内に導入して標的遺伝子を相同組換えで欠損させた。欠損プラスミドとストレプトマイセス・カナマイセティカス染色体との間で単一交叉が生じた菌株としては、アプラマイシン（Ａｐｒａｍｙｃｉｎ）が存在する３７℃（ｐＳＧ５基本とするレプリコン（Ｒｅｐｌｉｃｏｎ）のための非増殖許容温度）でアプラマイシン耐性トランスコンジュガント（Ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔ）の培養を選択した。その以後確保されたコロニーは、２８℃で選択なしに３回増殖を行うことで２回目の交叉を許容した。２つの達成された二重交叉突然変異、すなわちΔｆｋｂＤをアプラマイシン敏感性の発現形質で選択し、その後にＰＣＲで確認したし、選択的にサザンプロット分析法で確認した。
【0095】
製作したｆｋｂＤ遺伝子が欠損されたストレプトマイセス・カナマイセティカスΔｆｋｂＤに、Ｃ２１側鎖を変形するためのプラスミドｐΔｔｃｓＤを導入してｆｋｂＤ遺伝子欠損方法と同様な方法を利用してｔｃｓＤ遺伝子を欠損させた。ΔｆｋｂＤ、ｔｃｓＤはアプラマイシン敏感性の発現形質で選択したし、その後にＰＣＲで確認したし、選択的にサザンプロット分析法で確認した。追加的に製作したｆｋｂＤとｔｃｓＤ遺伝子が欠損されたストレプトマイセス・カナマイセティカスΔｆｋｂＤ、ｔｃｓＤにＣ１プロリン環を形成するためのプラスミドｐΔｆｋｂＬを導入してｆｋｂＤとｔｃｓＤ遺伝子欠損方法と同様な方法を利用してｆｋｂＬ遺伝子を欠損させた。ΔｆｋｂＤ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬはアプラマイシン敏感性の発現形質で選択し、その後にＰＣＲで確認したし、選択的にサザンプロット分析法で確認した。
【0096】
製作したｆｋｂＤ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬ遺伝子欠損菌株であるストレプトマイセス・カナマイセティカス（Streptomyces kanamyceticus）ΔｆｋｂＤ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬは、韓国生命工学研究院の生物資源センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、ＫＣＴＣ）に２０２０年４月１４日付けで寄託した（受託番号ＫＣＴＣ１４１７１ＢＰ）。
【0097】
前記製作した生産菌株ストレプトマイセス・カナマイセティカスΔｆｋｂＤ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬ（受託番号ＫＣＴＣ１４１７１ＢＰ）の培養を通じて９－デオキソ－プロリル－ＦＫ５２０を製造した。具体的に説明すると、次のようである。２５０ｍｌのバッフル付き三角フラスコ（Ｂａｆｆｌｅｄ ｆｌａｓｋ）に ５０ｍｌのＲ２ＹＥ培地（スクロース １０３ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、硫酸カリウム０．２５ｇ／Ｌ、塩化マグネシウム６水和物１０．１２ｇ／Ｌ、カザミノ酸０．１ｇ／Ｌ、酵母抽出物（１０％）５０ｍｌ／Ｌ、ＴＥＳ緩衝液（５．７３％、ｐＨ ７．２）１００ｍｌ／Ｌ、リン酸カリウム（０．５％）１０ｍｌ／Ｌ、塩化カルシウム２水和物（３．６８％）８０ｍｌ／Ｌ、Ｌ－プロリン（２０％）１５ｍｌ／Ｌ、微量元素溶液２ｍｌ／Ｌ、水酸化ナトリウム（１Ｎ）５ｍｌ／Ｌ）を添加し、ここに生産菌株を接種した後に回転式振とう培養器で２８℃、１８０ｒｐｍの条件下で２日間前培養を実施した。次に、１ＬのＲ２ＹＥ培地が添加されている３Ｌ三角フラスコ（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ ｆｌａｓｋ）に２日間前培養した培養液１０ｍｌを接種した。接種後に２８℃、１８０ｒｐｍの条件下で６日間培養を実施した。６日間培養後に１次回収工程によって生産された９－デオキソ－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）を抽出した。
【0098】
１次回収工程は次のように実施した。まず、培養液に同量のメタノールを添加して３０分間混合した後、遠心分離して菌体を除去し、菌体を除去した抽出液に対しては回転蒸発器（Ｒｏｔａｒｙ ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）を利用した濃縮を実施した。次に、濃縮した抽出液を水に溶解させて、２倍の用量の酢酸エチル（Ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）を添加後、よく混合した層分離が行われるまで放置した。層が分離した後に上層の有機溶媒層を回収し、これを回転蒸発器を利用して濃縮させて濃縮後の重量を測定した。１次回収工程を実施して得られた抽出液をシリカゲルが充填されたコラムを通過させた。この時、シリカゲルの量は、１次回収工程の抽出液の重量の１５倍を使用し、移動相は５種の割合のメタノールと塩化メチル（分液１は、０：１００、分液２は、１：１００、分液３は、１：１０、分液４は、１：１、分液５は、１００：０）を使用した。分液３から９－デオキソ－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）が確認された。このように得られた分液３は、回転蒸発器を利用して濃縮してＨＰＬＣを用いて最終的に精製した。
これを凍結乾燥させて粉末形態の式３で表される物質である９－デオキソ－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）が得られた。
これを凍結乾燥させて粉末形態の式３で表される物質である９－デオキソ－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）が得られた。
【0099】
製造した９－デオキソ－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）の確認は、次のように実施した。具体的に、高速液体クロマトグラフィー分析（Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）、質量分析（Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、核磁気共鳴分光法（Ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）を実施した。９－デオキソ－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）に対する分析結果は、表５及び図１３～図１８で整理され、これらの結果から製作した生産菌株ストレプトマイセス・カナマイセティカスΔｆｋｂＤ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬから、９－デオキソ－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）が生産されることを確認することができた。
【0100】
９－デオキソ－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０；分子式Ｃ４２Ｈ６９ＮＯ１１、分子量７６３．４９）に対する分析結果を下記の表５に示した。
【表5】
【0101】
１Ｈ、１３Ｃ－ＮＭＲから特徴的な官能基として、１個のケトン炭素（δＣ２１５．０）と２個のカルボニル炭素（δＣ１７１．８、１６９．９）、２個のオレフィン骨格（δＣ１４１．１、１２２．６；δＣ１３２．５、１２９．７）が確認されたし、脱酸素化第４級炭素（δＣ ９８．６）、７個の酸素化メチン炭素（δＣ８４．２、７８．０、７７．４、７４．４、７３．８、７１．１、６９．４）、３個のメトキシ炭素 （δＣ５７．９、５７．９、５６．４）が観測されたし、５個のメチル炭素（δＣ１９．１、１７．１、１５．７、１４．４、１０．０）が観測されたし、総計４２個の炭素からなるＦＫ５０６誘導体であることが観測された。正確な構造の確認のために、２Ｄ－ＮＭＲを確認した。ｇＣＯＳＹからプロトンの連結を確認した結果、Ｈ－２～Ｈ－４の間の結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）から本化合物は、プロリン骨格を持っていることを確認した。ｇＨＭＢＣデータからＨ－９（δＨ２．５７、２．６２）がＣ－８（δＣ１７１．８）、Ｃ－１０（δＣ９８．６）と相関関係（ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）から本化合物は、Ｃ－９にケトンではないＣＨ２に還元された骨格であることを確認した。これと共に、３個のメトキシ官能基がＣ－１３、Ｃ－１５及びＣ－３１に存在する構造であることを確認した。また、ｇＣＯＳＹ結合相関（ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）とｇＨＭＢＣ長距離相関（ｌｏｎｇ ｒａｎｇｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）を通じて、Ｃ－２１にＣ－３５及びＣ－３６がエチル基で連結された構造であることを確認した。これらを総合して、本化合物は９－デオキソ－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）であることを確認した。
【0102】
実施例４：９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）の製造
ＦＫ５０６を生産する菌株であるストレプトマイセス・カナマイセティカスに対してＢａｎ、Ｙ．Ｈ．ら（Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．２０１３、７６、１０９１－１０９８）に記載した方法によって二重交叉相同組換え（Ｄｏｕｂｌｅ ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）によるインフレーム（Ｉｎ－ｆｒａｍｅ）欠損方法を用いてｆｋｂＤ-ｆｋｂＭ、ｔｃｓＤ及びｆｋｂＬ遺伝子の非活性化をもたらして９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）の生産菌株であるストレプトマイセス・カナマイセティカスΔｆｋｂＤ－ｆｋｂＭ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬ（受託番号ＫＣＴＣ１４１７０ＢＰ）を製作した。
ＦＫ５０６を生産する菌株であるストレプトマイセス・カナマイセティカスに対してＢａｎ、Ｙ．Ｈ．ら（Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．２０１３、７６、１０９１－１０９８）に記載した方法によって二重交叉相同組換え（Ｄｏｕｂｌｅ ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）によるインフレーム（Ｉｎ－ｆｒａｍｅ）欠損方法を用いてｆｋｂＤ-ｆｋｂＭ、ｔｃｓＤ及びｆｋｂＬ遺伝子の非活性化をもたらして９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）の生産菌株であるストレプトマイセス・カナマイセティカスΔｆｋｂＤ－ｆｋｂＭ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬ（受託番号ＫＣＴＣ１４１７０ＢＰ）を製作した。
【0103】
具体的に説明すれば、ＦＫ５０６を生産するストレプトマイセス・カナマイセティカス菌株から、ｆｋｂＤ-ｆｋｂＭ、ｔｃｓＤ、及びｆｋｂＬ遺伝子の欠損突然変異体を製作するためにそれぞれの遺伝子を、ｐＫＣ１１３９ベクターにクローニングしてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２に移した後、接合（Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）によってＦＫ５０６生産菌株ストレプトマイセス・カナマイセティカスに形質転換した。
【0104】
より具体的に、菌株の製作方法は、インフレーム（Ｉｎ－ｆｒａｍｅ）遺伝子欠損プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）の製作、遺伝子欠損菌株の製作により説明することができる。
インフレーム（Ｉｎ－ｆｒａｍｅ）遺伝子欠損プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）の製作は、大膓菌－放線菌シャトル（Ｅ．ｃｏｌｉ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｈｕｔｔｌｅ）ベクターｐＫＣ１１３９をインフレーム遺伝子欠損のために使用した。プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）の製作は、ストレプトマイセス・カナマイセティカスに由来するフォスミド（Ｆｏｓｍｉｄ）ＤＮＡからの除去のための標的遺伝子の左側及び右側隣接切片（Ｌｅｆｔ－ ａｎｄ ｒｉｇｈｔ－ｆｌａｎｋｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）のＰＣＲ増幅によって実施した。ｆｋｂＤ－ｆｋｂＭ遺伝子の欠損のためには、左側隣接切片のプライマー対ＦｋｂＤ－ＭＬＦ／ＦｋｂＤ－ＭＬＲ、右側隣接切片のプライマー対ＦｋｂＤ－ＭＲＦ／ＦｋｂＤ－ＭＲＲを設計した。ｔｃｓＤ遺伝子の欠損のためには、左側隣接切片のプライマー対ＴｃｓＤＬＦ／ＴｃｓＤＬＲ、右側隣接切片のプライマー対ＴｃｓＤＲＦ／ＴｃｓＤＲＲを設計した。ｆｋｂＬ遺伝子の欠損のためには、左側隣接切片のプライマー対ＦｋｂＬＬＦ／ＦｋｂＬＬＲ、右側隣接切片のプライマー対ＦｋｂＬＲＦ／ＦｋｂＬＲＲを設計した。ＰＣＲ切片はいずれも分離してＨｉｎｄＩＩＩ－ＸｂａＩまたはＸｂａＩ－ＥｃｏＲＩにより切断した後、ｐＫＣ１１３９ベクターにクローニングした。本実施例で用いられた菌株、プラスミド及びプライマーに対する情報は、表１及び表２に示した。
インフレーム（Ｉｎ－ｆｒａｍｅ）遺伝子欠損プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）の製作は、大膓菌－放線菌シャトル（Ｅ．ｃｏｌｉ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｈｕｔｔｌｅ）ベクターｐＫＣ１１３９をインフレーム遺伝子欠損のために使用した。プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）の製作は、ストレプトマイセス・カナマイセティカスに由来するフォスミド（Ｆｏｓｍｉｄ）ＤＮＡからの除去のための標的遺伝子の左側及び右側隣接切片（Ｌｅｆｔ－ ａｎｄ ｒｉｇｈｔ－ｆｌａｎｋｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ）のＰＣＲ増幅によって実施した。ｆｋｂＤ－ｆｋｂＭ遺伝子の欠損のためには、左側隣接切片のプライマー対ＦｋｂＤ－ＭＬＦ／ＦｋｂＤ－ＭＬＲ、右側隣接切片のプライマー対ＦｋｂＤ－ＭＲＦ／ＦｋｂＤ－ＭＲＲを設計した。ｔｃｓＤ遺伝子の欠損のためには、左側隣接切片のプライマー対ＴｃｓＤＬＦ／ＴｃｓＤＬＲ、右側隣接切片のプライマー対ＴｃｓＤＲＦ／ＴｃｓＤＲＲを設計した。ｆｋｂＬ遺伝子の欠損のためには、左側隣接切片のプライマー対ＦｋｂＬＬＦ／ＦｋｂＬＬＲ、右側隣接切片のプライマー対ＦｋｂＬＲＦ／ＦｋｂＬＲＲを設計した。ＰＣＲ切片はいずれも分離してＨｉｎｄＩＩＩ－ＸｂａＩまたはＸｂａＩ－ＥｃｏＲＩにより切断した後、ｐＫＣ１１３９ベクターにクローニングした。本実施例で用いられた菌株、プラスミド及びプライマーに対する情報は、表１及び表２に示した。
【0105】
遺伝子欠損菌株の製作のために用いたプラスミドは表１に要約した。Ｃ９ ヒドロキシラーゼ（Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）と３１－Ｏ－メチルトランスフェラーゼを一緒に除去するためのプラスミドｐΔｆｋｂＤ-ｆｋｂＭは、大膓菌ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２に移した後、接合によってストレプトマイセス・カナマイセティカス内に導入して標的遺伝子を相同組換えで欠損させた。欠損プラスミドとストレプトマイセス・カナマイセティカス染色体との間で単一交叉が生じた菌株としては、アプラマイシン（Ａｐｒａｍｙｃｉｎ）が存在する３７℃（ｐＳＧ５基本とするレプリコン（Ｒｅｐｌｉｃｏｎ）のための非増殖許容温度）でアプラマイシン耐性トランスコンジュガント（Ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔ）の培養を選択した。その後、確保されたコロニーは、２８℃で選択なしに３回増殖を行うことで２回目の交叉を許容した。
２つの達成された二重交叉突然変異、すなわちΔｆｋｂＤ-ｆｋｂＭをアプラマイシン敏感性の発現形質で選択し、その後にＰＣＲで確認したし、選択的にサザンプロット分析法で確認した。
２つの達成された二重交叉突然変異、すなわちΔｆｋｂＤ-ｆｋｂＭをアプラマイシン敏感性の発現形質で選択し、その後にＰＣＲで確認したし、選択的にサザンプロット分析法で確認した。
【0106】
製作したｆｋｂＤ-ｆｋｂＭ遺伝子が欠損されたストレプトマイセス・カナマイセティカスΔｆｋｂＤ－ｆｋｂＭにＣ２１側鎖を変形するためのプラスミドｐΔｔｃｓＤを導入してｆｋｂＤ遺伝子欠損方法と同様な方法を利用してｔｃｓＤ遺伝子を欠損させた。ΔｆｋｂＤ－ｆｋｂＭ、ｔｃｓＤはアプラマイシン敏感性の発現形質で選択し、その後にＰＣＲで確認したし、選択的にサザンプロット分析法で確認した。追加的に製作したｆｋｂＤ-ｆｋｂＭとｔｃｓＤ遺伝子が欠損されたストレプトマイセス・カナマイセティカスΔｆｋｂＤ-ｆｋｂＭ、ｔｃｓＤに、Ｃ１プロリン環を形成するためのプラスミドｐΔｆｋｂＬを導入してｆｋｂＤ-ｆｋｂＭとｔｃｓＤ遺伝子欠損方法と同様な方法を利用してｆｋｂＬ遺伝子を欠損させた。ΔｆｋｂＤ-ｆｋｂＭ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬはアプラマイシン敏感性の発現形質で選択し、その後にＰＣＲで確認した。
【0107】
製作したｆｋｂＤ-ｆｋｂＭ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬ遺伝子欠損菌株であるストレプトマイセス・カナマイセティカスΔｆｋｂＤ-ｆｋｂＭ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬは韓国生命工学研究院の生物資源センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、ＫＣＴＣ）に２０２０年４月 １４日付けで寄託した（受託番号ＫＣＴＣ１４１７０ＢＰ）。
【0108】
前記製作した生産菌株ストレプトマイセス・カナマイセティカスΔｆｋｂＤ-ｆｋｂＭ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬ（受託番号ＫＣＴＣ１４１７０ＢＰ）の培養を通じて９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）を製造した。具体的に説明すると、次のようである。２５０ｍｌのバッフル付き三角フラスコ （Ｂａｆｆｌｅｄ ｆｌａｓｋ）に５０ｍｌのＲ２ＹＥ培地（スクロース １０３ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、硫酸カリウム０．２５ｇ／Ｌ、塩化マグネシウム６水和物１０．１２ｇ／Ｌ、カザミノ酸０．１ｇ／Ｌ、酵母抽出物（１０％）５０ｍｌ／Ｌ、ＴＥＳ緩衝液（５．７３％、ｐＨ７．２）１００ｍｌ／Ｌ、リン酸カリウム（０．５％）１０ｍｌ／Ｌ、塩化カルシウム２水和物（３．６８％）８０ｍｌ／Ｌ、Ｌ－プロリン（２０％）１５ｍｌ／Ｌ、微量元素溶液２ｍｌ／Ｌ、水酸化ナトリウム（１Ｎ）５ｍｌ／Ｌ）を添加し、ここに生産菌株を接種した後に回転式振とう培養器で２８℃、１８０ｒｐｍの条件下で２日間前培養を実施した。次に、１ＬのＲ２ＹＥ培地が添加されている３Ｌ三角フラスコ（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ ｆｌａｓｋ）に２日間前培養した培養液１０ｍｌを接種した。接種後に２８℃、１８０ｒｐｍの条件下で６日間培養を実施した。６日間培養後に１次回収工程によって生産された９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）を抽出した。
【0109】
１次回収工程は次のように実施した。まず、培養液に同量のメタノールを添加して３０分間混合した後遠心分離して菌体を除去し、菌体を除去した抽出液に対しては回転蒸発器（Ｒｏｔａｒｙ ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）を利用した濃縮を実施した。次に、濃縮した抽出液を水に溶解させて、２倍の用量の酢酸エチル（Ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）を添加後、よく混合した層分離が行われるまで放置した。層が分離された後に上層の有機溶媒層を回収してこれを回転蒸発器を利用して濃縮させて濃縮後の重量を測定した。１次回収工程を実施して得られた抽出液をシリカゲルが充填されたコラムを通過させた。この時、シリカゲルの量は、１次回収工程の抽出液の重量の１５倍を使用し、移動相は５種の割合のメタノールと塩化メチル（分液１は、０：１００、分液２は、１：１００、分液３は、１：１０、分液４は、１：１、分液５は、１００：０）を使用した。分液３から９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）が確認された。このように得られた分液３は回転蒸発器を利用して濃縮してＨＰＬＣを用いて最終的に精製した。
これを凍結乾燥させて粉末形態の式４で表される物質である９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）が得られた。
これを凍結乾燥させて粉末形態の式４で表される物質である９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）が得られた。
【0110】
製造した９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）の確認は次のように実施した。具体的に、高速液体クロマトグラフィー分析（Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）、質量分析（Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、核磁気共鳴分光法（Ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）を実施した。９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｌｙｌ－ＦＫ５２０）に対する分析結果は表６及び図１９～図２４により整理され、これらの結果から製作した生産菌株ストレプトマイセス・カナマイセティカスΔｆｋｂＤ-ｆｋｂＭ、ｔｃｓＤ、ｆｋｂＬから、９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）が生産されることを確認することができた。
【0111】
９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０；分子式Ｃ４１Ｈ６７ＮＯ１１、分子量７４９．９７）に対する分析結果を下記の表６に示した。
【表6】
【0112】
１Ｈ、１３Ｃ－ＮＭＲから特徴的な官能基として、１個のケトン炭素（δＣ２１４．７）と ２個のカルボニル炭素（δＣ１７１．６、１６９．８）、２個のオレフィン骨格（δＣ１４０．８、１２２．４；δＣ１３２．４、１２９．４）が確認され、脱酸素化第４級炭素（δＣ９８．４）、７個の酸素化メチン炭素（δＣ７７．９、７７．３、７５．５、７５．０、７４．４、７０．９、６９．１）、２個のメトキシ炭素（δＣ５７．７、５６．２）が観測され、５個のメチル炭素（δＣ １８．９、１６．９、１５．４、１１．７、９．８）が観測されたし、総計４１個の炭素からなる炭素数が減ったＦＫ５０６誘導体と観測された。正確な構造の確認のために、２Ｄ－ＮＭＲを確認した。ｇＣＯＳＹからプロトンの連結を確認した結果、Ｈ－２～Ｈ－４の間の結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）から本化合物は、プロリン骨格を持って、Ｈ２１－Ｈ３５－３６の結合相関（ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）からＦＫ５２０形態を取っていることを確認した。ｇＨＭＢＣ データからＨ－９（δＨ２．５６、２．６２）がＣ－８（δＣ１７１．６）、Ｃ－１０（δＣ９８．４）と相関関係（ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）から本化合物は、Ｃ－９にケトンではないＣＨ２に還元された骨格であることを確認した。これと共に、２個のメトキシ官能基がＣ－１３、Ｃ－１５に結合されており、Ｃ－３１にはメトキシが存在しない構造であることを確認した。これを総合して、本化合物は、９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）であることを確認した。
【0113】
実施例５：４種新規化合物の免疫抑制活性の調査
４種新規化合物の免疫抑制活性の減少程度を通常のイン・ビトロ（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ）Ｔ－細胞活性分析法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：７１８－７２６、１９８９）を利用して調査した。ＣＤ４＋Ｔ細胞が分裂されることは、免疫反応が起きていることを示す指標であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞をＣｅｌｌ ＴｒａｃｅＴＭ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）で染色して細胞が免疫反応による分裂をしてＴ細胞が増殖する場合に、各細胞のＣＴＶ保有量が減少される現象が現われるので、これを指標として利用して免疫抑制活性程度を調査した。
４種新規化合物の免疫抑制活性の減少程度を通常のイン・ビトロ（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ）Ｔ－細胞活性分析法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：７１８－７２６、１９８９）を利用して調査した。ＣＤ４＋Ｔ細胞が分裂されることは、免疫反応が起きていることを示す指標であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞をＣｅｌｌ ＴｒａｃｅＴＭ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）で染色して細胞が免疫反応による分裂をしてＴ細胞が増殖する場合に、各細胞のＣＴＶ保有量が減少される現象が現われるので、これを指標として利用して免疫抑制活性程度を調査した。
【0114】
６～８週齢のＢ６Ｊ実験用マウスの脾臓（Ｓｐｌｅｅｎ）から単細胞（Ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ）を剥離してＭａｇｎｉＳｏｒｔ（登録商標） Ｍｏｕｓｅ ＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いてＣＤ４＋ Ｔ細胞を分離した。ＣＤ４＋Ｔ細胞をＣｅｌｌ ＴｒａｃｅＴＭ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）で染色してＦＫ５０６または４種新規化合物を０．０１ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０００ｎｇ／ｍｌ濃度になるように添加した後に、７２時間の間培養した。Ｔ細胞の活性化のためにＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍｏｕｓｅ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｇｉｂｃｏ社製）を使用した。対照群としては活性化されないＴ細胞を使用した。培養後にフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）でＣＴＶ強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を分析した。
【0115】
下記表７及び図２５は、フローサイトメトリーを用いてＣＴＶ強度を測定することによりＴ細胞増殖程度を示し、ＦＫ５０６及び４種新規化合物の免疫抑制活性程度を示している。下記表７及び図２５に示されているように、本願発明で提示しているすべての新規化合物は ＦＫ５０６よりも顕著に減少された免疫抑制活性を示した。特に、９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）は、今まで報告された神経再生活性が維持または向上したＦＫ５０６誘導体の中で最も低い免疫抑制活性を示した。
【表7】
【0116】
このような結果から、本発明による４種新規化合物がＦＫ５０６に比べて免疫抑制活性が大きく減少されたことを確認することができたし、４種新規化合物が、少なくとも１．１４×１０５倍以上のＩＣ５０（ｎｇ／ｍｌ）濃度を示すことにより、免疫抑制活性が著しく減少されることを確認することができた。これにより、４種新規化合物の中から選ばれた一つ以上を有効成分として含む神経系疾患の予防または治療用薬学的組成物を、免疫抑制活性に起因した副作用に対する心配なしに使用可能であると判断した。
【0117】
実施例６：４種新規化合物の神経細胞の成長促進活性の調査
４種新規化合物の神経細胞の成長促進能を初代培養したマウスの海馬神経細胞（ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎ）を利用してＪｉｎｇ Ｓｕｎらによって報告された方法（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍ．１５： １８０、２０１８）によって調査した。具体的に、初代培養した海馬神経細胞にＦＫ５０６または４種新規化合物のいずれか一つを一緒に処理し（処理濃度：１ｎｇ／ｍｌ）対照群は、何らの処理もしなかった。神経突起の長さは、印画された写真を利用して既存に報告された方法（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３０２：１２７８－１２８５、２００２）によって測定した。
４種新規化合物の神経細胞の成長促進能を初代培養したマウスの海馬神経細胞（ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎ）を利用してＪｉｎｇ Ｓｕｎらによって報告された方法（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍ．１５： １８０、２０１８）によって調査した。具体的に、初代培養した海馬神経細胞にＦＫ５０６または４種新規化合物のいずれか一つを一緒に処理し（処理濃度：１ｎｇ／ｍｌ）対照群は、何らの処理もしなかった。神経突起の長さは、印画された写真を利用して既存に報告された方法（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３０２：１２７８－１２８５、２００２）によって測定した。
【0118】
その結果を図２６に示した。図２６から分かるように、本発明の４種新規化合物は、優れた神経軸索形成（ｎｅｕｒｉｔｅ ｇｒｏｗｔｈ）効果を示した。
すなわち、本発明の４種新規化合物は、優れた神経細胞成長促進能を持っていることを確認することができた。特に、９－デオキソ－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）の場合、ＦＫ５０６に比べて優れた神経軸索形成効果を示すことを確認することができた。よって、本発明による４種新規化合物は神経系疾患の予防または治療目的で使用することができると結論付けられた。
すなわち、本発明の４種新規化合物は、優れた神経細胞成長促進能を持っていることを確認することができた。特に、９－デオキソ－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）の場合、ＦＫ５０６に比べて優れた神経軸索形成効果を示すことを確認することができた。よって、本発明による４種新規化合物は神経系疾患の予防または治療目的で使用することができると結論付けられた。
【0119】
実施例７：４種新規化合物の神経系疾患治療効果の確認
４種新規化合物の機能性シナプス形成活性を、初代培養した海馬神経細胞を利用してＤ．Ｐａｒｋ．らによって報告された方法（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．７：７２６０、２０１７）によって調べた。より具体的に、ＦＫ５０６または４種新規化合物に露出させて（処理濃度：１ｎｇ／ｍｌ）初代培養した１０日～１４日目の海馬神経細胞を対象としパッチ固定レコードを施して、興奮性シナプス電流の頻度を測定した。興奮性シナプス電流の頻度は、シナプス数の変化を確認することができる指標として用いられる。
測定した興奮性シナプス電流の頻度を示した結果を図２７に示した。
４種新規化合物の機能性シナプス形成活性を、初代培養した海馬神経細胞を利用してＤ．Ｐａｒｋ．らによって報告された方法（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．７：７２６０、２０１７）によって調べた。より具体的に、ＦＫ５０６または４種新規化合物に露出させて（処理濃度：１ｎｇ／ｍｌ）初代培養した１０日～１４日目の海馬神経細胞を対象としパッチ固定レコードを施して、興奮性シナプス電流の頻度を測定した。興奮性シナプス電流の頻度は、シナプス数の変化を確認することができる指標として用いられる。
測定した興奮性シナプス電流の頻度を示した結果を図２７に示した。
【0120】
その結果、自発性興奮性シナプス後電流（ｓＥＰＳＣｓ）は、９－デオキソ－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）および９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）において、それぞれ３．２９±０．２２（ｐ＜０．００１、ｎ＝７）及び２．６３±０．２７（ｐ＜０．０５、ｎ＝６）に増加されることを確認することができたし、これはＦＫ５０６（２．６１±０．１８（ｐ＜０．０５、ｎ＝１０））に比べて増加された数値に当たることを確認することができた。
【0121】
すなわち、本発明の４種新規化合物のうち、９－デオキソ－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）及び９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）を処理した群において、興奮性シナプス電流の頻度が有意味に増加したことを確認した。これは前記実施例６で新規化合物を処理した群が示した神経細胞の成長促進活性の向上が、機能性シナプス形成の増加にも関連付けられることを示唆する。
【0122】
実施例８：４種新規化合物の退行性神経疾患治療効果の確認
４種新規化合物の合成毒素のＭＰＴＰによるドーパミン性の神経繊維の密度変化を調査した。具体的に覚めている動物の特定の脳部位に薬物を注入することができるカニューレ（ｃａｎｎｕｌａ）注入システムを利用して、生理食塩水、ＦＫ５０６、４種新規化合物（処理濃度：５ｍｇ／ｍｌ）を３日間投与して、２日目に神経毒性化合物である１－メチル－４－フェニル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）を腹腔内に注入してパーキンソン病動物モデルを作って運動能力に係るドーパミン作働性黒質-線条体神経路（ｎｉｇｒｏｓｔｒｉａｔａｌ ｐａｔｈｗａｙ）の退行を誘導した。４日目にドーパミン性神経細胞の特異的標識であるＴＨ抗体を利用して免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を施してドーパミン性神経細胞体の数及び神経繊維の密度の変化を測定した。
測定したドーパミン性神経細胞体の数及び神経繊維の密度の変化を示す結果を図２８に示した。
４種新規化合物の合成毒素のＭＰＴＰによるドーパミン性の神経繊維の密度変化を調査した。具体的に覚めている動物の特定の脳部位に薬物を注入することができるカニューレ（ｃａｎｎｕｌａ）注入システムを利用して、生理食塩水、ＦＫ５０６、４種新規化合物（処理濃度：５ｍｇ／ｍｌ）を３日間投与して、２日目に神経毒性化合物である１－メチル－４－フェニル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）を腹腔内に注入してパーキンソン病動物モデルを作って運動能力に係るドーパミン作働性黒質-線条体神経路（ｎｉｇｒｏｓｔｒｉａｔａｌ ｐａｔｈｗａｙ）の退行を誘導した。４日目にドーパミン性神経細胞の特異的標識であるＴＨ抗体を利用して免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を施してドーパミン性神経細胞体の数及び神経繊維の密度の変化を測定した。
測定したドーパミン性神経細胞体の数及び神経繊維の密度の変化を示す結果を図２８に示した。
【0123】
その結果、ドーパミン性神経細胞体の数および神経繊維の密度は、回復されたことを確認した。
すなわち、本発明の４種新規化合物である９－デオキソ－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）、９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）、９－デオキソ－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）、及び９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）を処理した群において、いずれもＦＫ５０６よりも優れた神経纎維密度の回復を示し、免疫抑制能もほとんどないことを確認した。
前記の結果は、４種新規化合物の全部が神経系疾患の治療用途、特に退行性神経疾患向けの薬物物質として使用可能であることを示唆する。
すなわち、本発明の４種新規化合物である９－デオキソ－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）、９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）、９－デオキソ－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）、及び９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）を処理した群において、いずれもＦＫ５０６よりも優れた神経纎維密度の回復を示し、免疫抑制能もほとんどないことを確認した。
前記の結果は、４種新規化合物の全部が神経系疾患の治療用途、特に退行性神経疾患向けの薬物物質として使用可能であることを示唆する。
【0124】
実施例９：４種新規化合物の安全性の確認
４種新規化合物の安全性を、細胞毒性の調査のためのＭＴＴアッセイ、簡易遺伝毒性評価のためのＡｍｅｓ試験、心再分極（ｃａｒｄｉａｃ ｒｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）に対する潜在的な影響評価のためのｈＥＲＧアッセイで遂行した。方法的には一般に用いる方法によって調査した。
４種新規化合物の安全性を、細胞毒性の調査のためのＭＴＴアッセイ、簡易遺伝毒性評価のためのＡｍｅｓ試験、心再分極（ｃａｒｄｉａｃ ｒｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）に対する潜在的な影響評価のためのｈＥＲＧアッセイで遂行した。方法的には一般に用いる方法によって調査した。
【0125】
具体的に、ＭＴＴアッセイは、４種新規化合物に細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）実験濃度（１ｎｇ／ｍｌ＝１．２４ｎＭ）よりも８０～８００倍高い濃度（１００ｎＭ～１，０００ｎＭ）の薬物を試験濃度に設定し、哺乳動物由来の正常細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ Ｃｅｌｌ）に対する薬物毒性評価を測定した。Ａｍｅｓ試験は、４種新規化合物の処理濃度をそれぞれプレート当たり４ｍｇ、１６ｍｇ、６４ｍｇ処理して実施し、４種新規化合物にヒスチジン要求性菌株（Ｓａｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＴＡ９８）、トリプトファン要求性菌株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ ＷＰ２ ｕｖｒＡ）での復帰突然変異誘発性を指標にして測定した。ｈＥＲＧアッセイは、４種新規化合物の処理濃度をそれぞれ０μＭ 、２μＭ 、８μＭ 、３２μＭずつ２個以上の細胞数で処理して実施した。一つのＣＨＯ－ｈＥＲＧ細胞に正常タイロード液（ｎｏｒｍａｌ ｔｙｒｏｄｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を貫流させ、ｈＥＲＧチャンネル電流（ｃｈａｎｎｅｌ ｃｕｒｒｅｎｔ）が３～４回のスイープの間に一定に記録されることを確認した上で、賦形剤対照群及び４種新規化合物処理群を約１～２分以上貫流させてｈＥＲＧチャンネル電流の大きさが一定に記録されることを実行して、相対電流（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｕｒｒｅｎｔ、ｐＡまたはｎＡ）の大きさ及び抑制の割合（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒａｔｅ、％）を測定した。
この中、ＭＴＴアッセイの結果を図２９に示した。図２９から分かるように、本発明の４種新規化合物は、細胞毒性がほとんど観察されなかった。
この中、ＭＴＴアッセイの結果を図２９に示した。図２９から分かるように、本発明の４種新規化合物は、細胞毒性がほとんど観察されなかった。
【0126】
すなわち、本発明の４種新規化合物である９－デオキソ－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）、９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－３６，３７－ジヒドロ－プロリルＦＫ５０６（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－３６，３７－ｄｉｈｙｄｒｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５０６）、９－デオキソ－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）、及び９－デオキソ－３１－Ｏ－デメチル－プロリルＦＫ５２０（９－ｄｅｏｘｏ－３１－Ｏ－ｄｅｍｅｔｈｙｌ－ｐｒｏｌｙｌＦＫ５２０）を処理した群でいずれも細胞毒性が観察されなかったし、Ａｍｅｓ試験における使用した試験菌株の復帰突然変異誘発及びｈＥＲＧアッセイでの心再分極（ｃａｒｄｉａｃ ｒｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）において危険のない安全な物質であるということが確認された。
【0127】
以上の説明から、本発明の属する技術分野における当業者は、本発明がその技術的思想や主旨を変更することなく、他の具体的な形態で実施できるということを理解することができるはずである。これと関連して、前述した実施形態を、すべての面で例示的なものであり、限定的なものではないことと理解しなければならない。本発明の範囲は、前記詳細な説明よりは後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、且つ、その等価の概念から導き出されるあらゆる変更または変形された形態が、本発明の範囲に含まれるものと解釈されなければならない。
【受託番号】
【0128】
寄託機関名： 韓国生命工学研究院の生物資源センター（ＫＣＴＣ）
受託番号ＫＣＴＣ１４１７０ＢＰ
受託日 ： ２０２００４１４
受託番号ＫＣＴＣ１４１７０ＢＰ
受託日 ： ２０２００４１４
【0129】
寄託機関名： 韓国生命工学研究院の生物資源センター（ＫＣＴＣ）
受託番号ＫＣＴＣ１４１７１ＢＰ
受託日 ： ２０２００４１４
受託番号ＫＣＴＣ１４１７１ＢＰ
受託日 ： ２０２００４１４
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
