特許 7543144 抗体依存性細胞貪食の調節

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-08-23

(45)【発行日】2024-09-02

(54)【発明の名称】抗体依存性細胞貪食の調節

(51)【国際特許分類】

   C12P 21/08 20060101AFI20240826BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240826BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240826BHJP

   C07K 16/30 20060101ALN20240826BHJP

【ＦＩ】

C12P21/08

A61K39/395 T

A61P35/00

A61K39/395 N

C07K16/30 ZNA

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2020560902

(86)(22)【出願日】2019-06-05

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-09-30

(86)【国際出願番号】 US2019035643

(87)【国際公開番号】W WO2019236739

(87)【国際公開日】2019-12-12

【審査請求日】2022-03-22

(31)【優先権主張番号】62/680,934

(32)【優先日】2018-06-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500049716

【氏名又は名称】アムジエン・インコーポレーテツド

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】クーンズ，スコット・ティー

(72)【発明者】

【氏名】シュウ，ジュンヤン

(72)【発明者】

【氏名】ジャン，チンチュン

【審査官】大久保 智之

(56)【参考文献】

【文献】特表２００７－５２５４４３（ＪＰ，Ａ）

【文献】The Journal of Immunology, 2014, Vol. 192, No. 5, pp. 2252-2260

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＩｇＧ１抗体の抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）活性をマッチングさせる方法であって、（１）参照ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；（２）前記参照ＩｇＧ１抗体と同じ配列を有する第２のＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；並びに（３）前記第２の抗体中のコアフコースの量を増加若しくは減少させることか、又は前記第２の抗体の非フコシル化種の量を増加若しくは減少させることによって、前記第２のＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を変化させる工程を含み；ここで、コアフコースの量を増加若しくは減少させた後、又は非フコシル化種の量を増加若しくは減少させた後の前記第２の抗体のＡＤＣＰ活性は、前記参照抗体と同じであるか、又は前記参照抗体の１０％、１５％、２０％、２５％、３０％若しくは３５％以内であるか、又は前記参照抗体の１％～３５％の範囲内であり、前記ＡＤＣＰ活性は、ＦｃγＲレポーター遺伝子アッセイを用いて決定され、前記ＦｃγＲはＦｃγＲＩＩａであり、前記参照抗体及び前記第２のＩｇＧ１抗体はトラスツズマブである方法。

【請求項2】

前記第２の抗体のＡＤＣＰ活性は、前記第２の抗体中のコアフコースの量を減少させることか、又は前記第２の抗体の非フコシル化種の量を増加させることによって増加し、ＡＤＣＰ活性を増加させた後の前記第２の抗体のＡＤＣＰ活性は、前記参照抗体と同じであるか、又は前記参照抗体の１０％、１５％、２０％、２５％、３０％若しくは３５％以内であるか、又は前記参照抗体の１％～３５％の範囲内である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記第２のトラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性は、前記第２の抗体中のコアフコースの量を増加させることか、又は前記第２の抗体の非フコシル化種の量を減少させることによって減少し、ＡＤＣＰ活性を減少させた後の前記第２の抗体のＡＤＣＰ活性は、前記参照抗体と同じであるか、又は前記参照抗体の１０％、１５％、２０％、２５％、３０％若しくは３５％以内であるか、又は前記参照抗体の１％～３５％の範囲内である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

トラスツズマブ抗体の特定の目標抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）活性を操作する方法であって、（１）トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；（２）目標ＡＤＣＰ活性を決定する工程；及び（３）前記抗体中のコアフコースの量を増加若しくは減少させることか、又は前記抗体の非フコシル化種の量を増加若しくは減少させることによって、前記トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を変化させる工程を含み；ここで、コアフコースの量を増加若しくは減少させた後、又は非フコシル化種の量を増加若しくは減少させた後の前記抗体のＡＤＣＰ活性は、前記目標ＡＤＣＰ活性と同じであるか、又は前記目標ＡＤＣＰ活性の１０％、１５％、２０％、２５％、３０％若しくは３５％以内であるか、又は前記目標ＡＤＣＰ活性の１％～３５％の範囲内であり、前記ＡＤＣＰ活性は、ＦｃγＲレポーター遺伝子アッセイを用いて測定又は決定され、前記ＦｃγＲはＦｃγＲＩＩａである方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、一般に、トラスツズマブ及びリツキシマブを含むＩｇＧ１抗体の抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）エフェクター機能の調節に関する。

【0002】

電子ファイルでの提出物の参照による援用
本明細書と同時にコンピュータ可読のフォーマット（ＣＲＦ）により提出されたコンピュータ可読のヌクレオチド／アミノ酸配列リストは、その全体が参照によって援用され、当該リストは、以下のとおりである：２０１８年６月５日作成のＡ－２２３６－ＵＳ－ＰＳＰ＿ＳｅｑｌｉｓｔｉｎｇＦｉｎａｌ．ｔｘｔというファイル名の２０キロバイトのＡＳＣＩＩ（Ｔｅｘｔ）ファイル。

【背景技術】

【0003】

治療用モノクローナル抗体の開発及び製造プロセスを通して、製品の所望の安全性及び有効性をもたらす重要な品質特性を、適切に設計及び監視することが不可欠である。重要品質特性（ＣＱＡ）は、「要求される製品品質を保証するために適切な限度内、範囲内、又は分布内であるべき物理的、化学的、生物学的又は微生物学的特性又は特質」と定義されている。多くの重要な治療用モノクローナル抗体はＩｇＧ１サブクラスのものであり、それ故、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などのＦｃ介在性エフェクター機能活性の可能性がある。例えば、Ｊｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２０１１；１０：１０１－１１を参照されたい。過去約１５年間にわたり、エフェクター機能の可能性に影響を及ぼす品質特性に関する多くの研究が行われてきた。Ｆｃ－ＣＨ２ドメイン中の保存された二分枝型グリカンに関連する特定のグリカン構造が、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰを介在するＦｃγＲとの相互作用、並びにＣＤＣを導く最初の結合事象であるＣ１ｑ結合との相互作用に強く影響し得ることが十分に確立されている（Ｒｅｕｓｃｈ Ｄ，Ｔｅｊａｄａ ＭＬ．Ｆｃ ｇｌｙｃａｎｓ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｑｕａｌｉｔｙ ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１５；２５：１３２５－３４を参照）。例えば、コアフコースがＦｃγＲＩＩＩａ結合親和性に対して非常に大きな影響を有し、ＡＤＣＣ活性の実質的な変化をもたらすことが、構造的、機能的及び結合の研究によって示されている（Ｏｋａｚａｋｉ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｆｕｃｏｓｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｎｔｈａｌｐｙ ａｎｄ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ＩｇＧ１ ａｎｄ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ２００４；３３６：１２３９－４９、Ｆｅｒｒａｒａ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｕｎｉｑｕｅ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｅｔｗｅｅｎ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｌａｃｋｉｎｇ ｃｏｒｅ ｆｕｃｏｓｅ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ２０１１；１０８：１２６６９－７４を参照）。より最近では、高マンノース及びβ－ガラクトースレベルもまた、コアフコースよりはるかに小さく、且つ予測しにくい程度ではあるが、ＡＤＣＣ活性の調節に影響を及ぼし得ることも示されてきている（Ｔｈｏｍａｎｎ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｆｃ－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１６；７３：６９－７５）。同様に、ガラクトースがＣ１ｑ結合に関与することによって、ＣＤＣが影響されることが示されている（Ｈｏｄｏｎｉｃｚｋｙ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｂｙ Ｆｃ Ｎ－ｇｌｙｃａｎ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ２００５；２１：１６４４－５２）。これらの観察の多くは、組み換えモノクローナル抗体の非フコシル化又はバイセクト二分枝型グリカン構造を作る改変された宿主細胞株を用いて試験材料を作製する糖鎖工学プロセスによって可能にされている（Ｓｈｉｎｋａｗａ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｆｕｃｏｓｅ ｂｕｔ ｎｏｔ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｇａｌａｃｔｏｓｅ ｏｒ ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ｃｏｍｐｌｅｘ－ｔｙｐｅ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｓｈｏｗｓ ｔｈｅ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００３；２７８：３４６６－７３、Ｕｍａｎａ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｇｌｙｃｏｆｏｒｍｓ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ＩｇＧ１ ｗｉｔｈ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９９；１７：１７６－８０）。さらに最近では、グリカン修飾酵素及びアフィニティー濃縮クロマトグラフィーカラムが、エフェクター機能アッセイにおいて特徴付けることができる特定のサブ構造の明確に焦点を絞った分布を作り出すために使用されている。このアプローチはＡＤＣＣの研究において効果的に展開されている（例えば、Ｔｈｏｍａｎｎ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１６；７３：６９－７５を参照）。エフェクター機能活性に影響を及ぼすグリカン種のモニタリング及び制御は、バイオシミラーやバイオ後続品の開発の中心でもあり、厳密な類似性基準を適用しなければならない重要な特性や関連する活性を示している。先発品がエフェクター機能関連特性において実質的なドリフトを示した最近の例は、バイオシミラー候補を開発する努力に影響を与えた（Ｋｉｍ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｄｒｉｆｔｓ ｉｎ ＡＤＣＣ－ｒｅｌａｔｅｄ ｑｕａｌｉｔｙ ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｒ）：Ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｂｉｏｓｉｍｉｌａｒ．ｍＡｂｓ ２０１７；９：７０４－１４を参照）。

【0004】

治療用抗体の有効性におけるＡＤＣＰの寄与は十分にはわかっておらず、ＡＤＣＰ活性に影響を及ぼす品質特性も十分にはわかっていない。ＡＤＣＰ活性に最も影響し、且つ予測性があり、したがってＩｇＧ１抗体の製造中にモニターするのに最も適している重要品質特性は、十分に確立されていない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【文献】Ｊｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２０１１；１０：１０１－１１

【文献】Ｒｅｕｓｃｈ Ｄ，Ｔｅｊａｄａ ＭＬ．Ｆｃ ｇｌｙｃａｎｓ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｑｕａｌｉｔｙ ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１５；２５：１３２５－３４

【文献】Ｏｋａｚａｋｉ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｆｕｃｏｓｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｎｔｈａｌｐｙ ａｎｄ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ＩｇＧ１ ａｎｄ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ２００４；３３６：１２３９－４９

【文献】Ｆｅｒｒａｒａ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｕｎｉｑｕｅ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｅｔｗｅｅｎ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｌａｃｋｉｎｇ ｃｏｒｅ ｆｕｃｏｓｅ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ２０１１；１０８：１２６６９－７４

【文献】Ｔｈｏｍａｎｎ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｆｃ－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１６；７３：６９－７５

【文献】Ｈｏｄｏｎｉｃｚｋｙ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｂｙ Ｆｃ Ｎ－ｇｌｙｃａｎ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ２００５；２１：１６４４－５２

【文献】Ｓｈｉｎｋａｗａ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｆｕｃｏｓｅ ｂｕｔ ｎｏｔ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｇａｌａｃｔｏｓｅ ｏｒ ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ｃｏｍｐｌｅｘ－ｔｙｐｅ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｓｈｏｗｓ ｔｈｅ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００３；２７８：３４６６－７３

【文献】Ｕｍａｎａ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｇｌｙｃｏｆｏｒｍｓ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ＩｇＧ１ ｗｉｔｈ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９９；１７：１７６－８０

【文献】Ｔｈｏｍａｎｎ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１６；７３：６９－７５

【文献】Ｋｉｍ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｄｒｉｆｔｓ ｉｎ ＡＤＣＣ－ｒｅｌａｔｅｄ ｑｕａｌｉｔｙ ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｒ）：Ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｂｉｏｓｉｍｉｌａｒ．ｍＡｂｓ ２０１７；９：７０４－１４

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

本開示は、トラスツズマブ又はリツキシマブを含むＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性に対する種々のグリカン（例えば、β－ガラクトース、コア－フコース及び／又は高マンノースを含む）の影響を解明することを目的とする。いくつかの実施形態において、本開示は、グリカン種（例えば、β－ガラクトース、コア－フコース及び／又は高マンノース種の濃縮、増加、除去及び／又はリモデリングを含む）を増加又は減少させることによって、ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を調節する（すなわち、増加又は減少させる）方法（トラスツズマブ又はリツキシマブのＡＤＣＰ活性を増加又は減少させる方法を含む）を提供する。本開示はまた、増加又は減少したＡＤＣＰ活性を有する抗ＩｇＧ１抗体、並びにグリカン種（例えば、β－ガラクトース、コア－フコース及び／又は高マンノース種を濃縮、増加、除去及び／又はリモデリングすることを含む）を増加又は減少させることにより第２のＩｇＧ１抗体（トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）のＡＤＣＰ活性を調節する（すなわち、増加又は減少させる）ことによって、第２のＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を参照抗体のＡＤＣＰ活性に一致させる方法を提供する。グリカン種（例えば、Ｂ－ガラクトース、コアフコース及び／又は高マンノース種の濃縮、増加、除去及び／又はリモデリングを含む）を増加又は減少させることにより、ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を調節する（すなわち、増加又は減少させる）（トラスツズマブ又はリツキシマブのＡＤＣＰ活性を増加又は減少させることを含む）のに有用な細胞培養方法もまた開示される。

【0007】

一態様において、本開示は、抗体中の末端β－ガラクトースの量を増加若しくは減少させることか、又は抗体のＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種の量を増加若しくは減少させることを含む、トラスツズマブの抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）活性を調節する方法を提供する。

【0008】

別の態様において、本開示は、抗体中の末端β－ガラクトースの量を増加させることか、又は抗体のＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種の量を増加させることを含む、トラスツズマブのＡＤＣＰ活性を増加させる方法を提供する。例示的な態様では、β－ガラクトースの約１パーセントの増加が、ＡＤＣＰ活性を約２．５、約２．８、約２．８８又は約３パーセント増加させる。

【0009】

さらなる態様において、本開示は、抗体中の末端β－ガラクトースの量を減少させることか、又は抗体のＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種の量を減少させることを含む、トラスツズマブのＡＤＣＰ活性を減少させる方法を提供する。特定の例では、β－ガラクトースの約１パーセントの減少が、ＡＤＣＰ活性を約２．５、約２．８、約２．８８又は約３パーセント減少させる。

【0010】

さらなる態様において、本開示は、（１）参照トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；（２）参照トラスツズマブ抗体と同じ抗体配列を有する第２の抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；並びに（３）第２の抗体中の末端β－ガラクトースの量を増加若しくは減少させることか、又は第２の抗体のＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種の量を増加若しくは減少させることによって、第２の抗体のＡＤＣＰ活性を変化させる工程を含み；末端β－ガラクトースの量を増加若しくは減少させた後、又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種の量を増加若しくは減少させた後の第２の抗体のＡＤＣＰ活性は、参照抗体と同じであるか、又は参照抗体の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％若しくは約３５％以内であるか、又は参照抗体の約１％～約３５％の範囲内である、参照トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性をマッチングさせる方法を提供する。例示的な例では、第２の抗体のＡＤＣＰ活性は、第２の抗体中の末端β－ガラクトースの量を増加させることか、又は第２の抗体のＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種の量を増加させることによって増加し、ＡＤＣＰ活性を増加させた後の第２の抗体のＡＤＣＰ活性は、参照抗体と同じであるか、又は参照抗体の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％若しくは約３５％以内であるか、又は参照抗体の約１％～約３５％の範囲内である。場合により、第２の抗体のＡＤＣＰ活性を、第２の抗体中の末端β－ガラクトースの量を減少させることか、又は第２の抗体のＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種の量を減少させることによって減少させ、ＡＤＣＰ活性を減少させた後の第２の抗体のＡＤＣＰ活性は、参照抗体と同じであるか、又は参照抗体の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％若しくは約３５％以内であるか、又は参照抗体の約１％～約３５％の範囲内である。いくつかの実施形態では、工程１（「参照トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）は、工程２（「参照トラスツズマブ抗体と同じ抗体配列を有する第２の抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）及び／又は工程３（「第２の抗体のＡＤＣＰ活性を…変化させる」）の前、後若しくは同時に行われる。他の実施形態では、工程２は、工程１及び／又は工程３の前、後、若しくは同時に行われる。

【0011】

本開示はまた、（１）トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；（２）目標ＡＤＣＰ活性を決定する工程；並びに（３）抗体中の末端β－ガラクトースの量を増加若しくは減少させることか、又は抗体のＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種の量を増加若しくは減少させることによって、抗体のＡＤＣＰ活性を変化させる工程を含み；末端β－ガラクトースの量を増加若しくは減少させた後、又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種の量を増加若しくは減少させた後の抗体のＡＤＣＰ活性は、目標ＡＤＣＰ活性と同じであるか、又は目標ＡＤＣＰ活性の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％若しくは約３５％以内であるか、又は目標ＡＤＣＰ活性の約１％～約３５％の範囲内である、トラスツズマブ抗体の特定の目標ＡＤＣＰ活性を操作する方法を提供する。いくつかの実施形態では、工程１（「トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）は、工程２（「目標ＡＤＣＰ活性を決定する」）及び／又は工程３（「抗体のＡＤＣＰ活性を…変化させる」）の前、後若しくは同時に行われる。いくつかの実施形態では、工程２（「目標ＡＤＣＰ活性を決定する」）は、工程１（「トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）及び／又は工程３（「抗体のＡＤＣＰ活性を…変化させる」）の前、後若しくは同時に行われる。

【0012】

本開示はさらに、抗体中のコアフコースの量を増加若しくは減少させることか、又は抗体の非フコシル化種の量を増加若しくは減少させることを含む、トラスツズマブ又はリツキシマブのＡＤＣＰ活性を調節する方法を提供する。本開示はさらに、抗体中のコアフコースの量を減少させることか、又は抗体の非フコシル化種の量を増加させることを含む、トラスツズマブのＡＤＣＰ活性を増加させる方法を提供する。任意選択で、コアフコースの約１パーセントの減少により、トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性は、約０．５、約０．５６、約０．６又は約１パーセント増加する。

【0013】

本開示はさらに、抗体中のコアフコースの量を増加させることか、又は抗体の非フコシル化種の量を減少させることを含む、リツキシマブのＡＤＣＰ活性を増加させる方法を提供する。いくつかの例では、コアフコースの約１パーセントの増加により、リツキシマブのＡＤＣＰ活性は、約０．５、約０．７、約０．７５、約０．８又は約１パーセント増加する。

【0014】

本開示により、抗体中のコアフコースの量を増加させることか、又は抗体の非フコシル化種の量を減少させることを含む、トラスツズマブのＡＤＣＰ活性を減少させる方法が提供される。特定の態様では、コアフコースの約１パーセントの増加により、トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性は、約０．５、約０．５６、約０．６又は約１パーセント減少する。

【0015】

また本開示により、抗体中のコアフコースの量を減少させることか、又は抗体の非フコシル化種の量を増加させることを含む、リツキシマブのＡＤＣＰ活性を減少させる方法が提供される。場合により、コアフコースの約１パーセントの減少により、リツキシマブのＡＤＣＰ活性は、約０．５、約０．７、約０．７５、約０．８又は約１パーセント減少する。

【0016】

本開示により、ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性をマッチングさせる方法であって、（１）参照ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；（２）参照ＩｇＧ１抗体と同じ配列を有する第２のＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；並びに（３）第２の抗体中のコアフコースの量を増加若しくは減少させることか、又は第２の抗体の非フコシル化種の量を増加若しくは減少させることによって、第２のＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を変化させる工程を含み；コアフコースの量を増加若しくは減少させた後、又は非フコシル化種の量を増加若しくは減少させた後の第２の抗体のＡＤＣＰ活性は、参照抗体と同じであるか、又は参照抗体の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％若しくは約３５％以内であるか、又は参照抗体の約１％～約３５％の範囲内である方法もまた提供される。特定の例では、参照抗体及び第２のＩｇＧ１抗体はトラスツズマブであり、（ａ）第２の抗体のＡＤＣＰ活性は第２の抗体のコアフコースの量を減少させることか、若しくは第２の抗体の非フコシル化種の量を増加させることによって増加する；又は（ｂ）第２のトラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性は第２の抗体のコアフコースの量を増加させることか、若しくは第２の抗体の非フコシル化種の量を減少させることによって減少する。或いは、参照抗体及び第２のＩｇＧ１抗体はリツキシマブであり、（ａ）第２のリツキシマブ抗体のＡＤＣＰ活性は第２の抗体のコアフコースの量を増加させることか、若しくは第２の抗体の非フコシル化種の量を減少させることによって増加する；又は（ｂ）第２のリツキシマブ抗体のＡＤＣＰ活性は第２の抗体のコアフコースの量を減少させることか、若しくは第２の抗体の非フコシル化種の量を増加させることによって減少する。いくつかの実施形態では、工程１（「参照ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）は、工程２（「参照ＩｇＧ１抗体と同じ配列を有する第２のＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）及び／又は工程３（「第２のＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を…変化させる」）の前、後若しくは同時に行われる。いくつかの実施形態では、工程２は、工程１及び／又は工程３の前、後、若しくは同時に行われる。

【0017】

本開示によって、トラスツズマブ抗体の特定の目標ＡＤＣＰ活性を操作する方法であって、（１）トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；（２）目標ＡＤＣＰ活性を決定する工程；及び（３）抗体中のコアフコースの量を増加若しくは減少させることか、又は抗体の非フコシル化種の量を増加若しくは減少させることによって、トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を変化させる工程を含み；コアフコースの量を増加若しくは減少させた後、又は非フコシル化種の量を増加若しくは減少させた後の抗体のＡＤＣＰ活性は、目標ＡＤＣＰ活性と同じであるか、又は目標ＡＤＣＰ活性の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％若しくは約３５％以内であるか、又は目標ＡＤＣＰ活性の約１％～約３５％の範囲内である方法もまた提供される。いくつかの実施形態では、工程１（「トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）は、工程２（「目標ＡＤＣＰ活性を決定する」）及び／又は工程３（「トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を…変化させる」）の前、後若しくは同時に行われる。いくつかの実施形態では、工程２（「目標ＡＤＣＰ活性を決定する」）は、工程１（「トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）及び／又は工程３（「トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を…変化させる」）の前、後若しくは同時に行われる。

【0018】

本開示はさらに、（１）リツキシマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；（２）目標ＡＤＣＰ活性を決定する工程；及び（３）リツキシマブ抗体中のコアフコースの量を増加若しくは減少させることか、又はリツキシマブ抗体の非フコシル化種の量を増加若しくは減少させることによって、リツキシマブ抗体のＡＤＣＰ活性を変化させる工程を含み；コアフコースの量を増加若しくは減少させた後、又は非フコシル化種の量を増加若しくは減少させた後の抗体のＡＤＣＰ活性は、目標ＡＤＣＰ活性と同じであるか、又は目標ＡＤＣＰ活性の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％若しくは約３５％以内であるか、又は目標ＡＤＣＰ活性の約１％～約３５％の範囲内である、リツキシマブ抗体の特定の目標ＡＤＣＰ活性を操作する方法を提供する。いくつかの実施形態では、工程１（「リツキシマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）は、工程２（「目標ＡＤＣＰ活性を決定する」）及び／又は工程３（「リツキシマブ抗体のＡＤＣＰ活性を…変化させる」）の前、後若しくは同時に行われる。いくつかの実施形態では、工程２（「目標ＡＤＣＰ活性を決定する」）は、工程１（「リツキシマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）及び／又は工程３（「リツキシマブ抗体のＡＤＣＰ活性を…変化させる」）の前、後若しくは同時に行われる。

【0019】

本開示はまた、ＩｇＧ１抗体（トラスツズマブ又はリツキシマブなど）のＡＤＣＰ活性を調節する方法であって、抗体中の高マンノースの量を増加若しくは減少させることか、又は抗体のＭ５高マンノース種の量を増加又は減少させることを含む方法を提供する。

【0020】

本開示によって、ＩｇＧ１抗体（トラスツズマブ又はリツキシマブなど）のＡＤＣＰ活性を増加させる方法であって、抗体中の高マンノースの量を減少させることか、又は抗体のＭ５高マンノース種の量を減少させることを含む方法もまた提供される。いくつかの実施形態では、高マンノースの約１パーセントの減少により、ＡＤＣＰ活性は、約１、約１．２、約１．３１、約１．５、約１．７、約２、約２．１１又は約２．５パーセント増加する。

【0021】

本開示は、ＩｇＧ１抗体（トラスツズマブ又はリツキシマブなど）のＡＤＣＰ活性を減少させる方法であって、抗体中の高マンノースの量を増加させることか、又は抗体のＭ５高マンノース種の量を増加させることを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、高マンノースの約１パーセントの増加により、ＡＤＣＰ活性は、約１、約１．２、約１．３１、約１．５、約１．７、約２、約２．１１又は約２．５パーセント減少する。

【0022】

（１）参照ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；（２）参照ＩｇＧ１抗体と同じ配列を有する第２のＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；並びに（３）第２の抗体中の高マンノースの量を増加若しくは減少させることか、又は第２の抗体のＭ５高マンノース種の量を増加若しくは減少させることによって、第２のＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を変化させる工程を含み；高マンノースの量を増加若しくは減少させた後、又はＭ５高マンノース種の量を増加若しくは減少させた後の第２の抗体のＡＤＣＰ活性は、参照抗体と同じであるか、又は参照抗体の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％若しくは約３５％以内であるか、又は参照抗体の約１％～約３５％の範囲内である、ＩｇＧ１抗体（トラスツズマブ又はリツキシマブなど）のＡＤＣＰ活性をマッチングさせる方法もまた提供される。いくつかの態様では、第２のＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性は、第２の抗体中の高マンノースの量を減少させることか、又は第２の抗体中のＭ５高マンノース種の量を減少させることによって増加する。例示的な例において、第２のＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性は、第２の抗体中の高マンノースの量を増加させることか、又は第２の抗体中のＭ５高マンノース種の量を増加させることによって減少する。いくつかの実施形態では、工程１（「参照ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）は、工程２（「…第２のＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）及び／又は工程３（「第２のＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を…変化させる」）の前、後若しくは同時に行われる。いくつかの実施形態では、工程２は、工程１及び／又は工程３の前、後、若しくは同時に行われる。

【0023】

別の態様において、本開示は、（１）ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；（２）目標ＡＤＣＰ活性を決定する工程；及び（３）第２の抗体中の高マンノースの量を増加若しくは減少させることか、又は第２の抗体中のＭ５高マンノース種の量を増加若しくは減少させることによって、ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を変化させる工程を含み；高マンノースの量又はＭ５高マンノース種の量を増加若しくは減少させた後の抗体のＡＤＣＰ活性は、目標ＡＤＣＰ活性と同じであるか、又は目標ＡＤＣＰ活性の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％若しくは約３５％以内であるか、又は目標ＡＤＣＰ活性の約１％～約３５％の範囲内である、ＩｇＧ１抗体（トラスツズマブ又はリツキシマブなど）の特定の目標ＡＤＣＰ活性を操作する方法を提供する。いくつかの実施形態では、工程１（「ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）は、工程２（「目標ＡＤＣＰ活性を決定する」）及び／又は工程３（「ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を…変化させる」）の前、後若しくは同時に行われる。いくつかの実施形態では、工程２（「目標ＡＤＣＰ活性を決定する」）は、工程１（「ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）及び／又は工程３（「ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を…変化させる」）の前、後若しくは同時に行われる。

【0024】

本開示によって、ＩｇＧ１抗体（トラスツズマブ又はリツキシマブなど）のＡＤＣＰ活性を調節する方法であって、（１）抗体中の末端β－ガラクトースの量並びに／若しくはＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種の量；（２）抗体中のコアフコースの量並びに／若しくは非フコシル化種の量；並びに／又は（３）抗体中の高マンノースの量若しくはＭ５高マンノース種の量を増加若しくは減少させることを含む方法もまた提供される。さらに、ＩｇＧ１抗体（トラスツズマブ又はリツキシマブなど）のＡＤＣＰ活性を増加させる方法であって、（１）抗体中の末端β－ガラクトースの量又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種の量を増加させること；（２）抗体中のコアフコースの量を減少させることか、若しくは抗体中の非フコシル化種の量を増加させること；並びに／又は（３）抗体中の高マンノースの量を減少させることか、若しくは抗体中のＭ５高マンノース種の量を減少させることを含む方法が提供される。他の例示的な実施形態において、本開示は、ＩｇＧ１抗体（トラスツズマブ又はリツキシマブなど）のＡＤＣＰ活性を減少させる方法であって、（１）抗体中の末端β－ガラクトースの量又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種の量を減少させること；（２）抗体中のコアフコースの量を増加させることか、若しくは抗体中の非フコシル化種の量を減少させる；並びに／又は（３）抗体中の高マンノースの量若しくはＭ５高マンノース種の量を増加させることを含む方法を提供する。

【0025】

本開示の方法の例示的な例において、（１）末端β－ガラクトースの量若しくはＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種の量；（２）コアフコースの量若しくは非フコシル化種の量；並びに／又は（３）高マンノースの量若しくはＭ５高マンノース種の量を、これらのグリカン（例えば、末端β－ガラクトース；Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種；コアフコース；非フコシル化種；高マンノース並びに／又はＭ５高マンノース種）の１つ以上の量を調節する細胞培養培地中又は細胞培養条件下で、抗体を発現する細胞を培養することによって、増加又は減少させる。いくつかの実施形態では、これらのグリカン（例えば、末端β－ガラクトース；Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種；コアフコース；非フコシル化種；高マンノース並びに／又はＭ５高マンノース種）の量は、化学的手段、又は酵素、例えば、ＥｎｄｏＳ、Ｅｎｄｏ－Ｓ２、Ｅｎｄｏ－Ｄ、Ｅｎｄｏ－Ｍ、ｅｎｄｏＬＬ、α－フコシダーゼ、β－（１－４）－ガラクトシダーゼ、Ｅｎｄｏ－Ｈ、β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び／若しくはＰＮＧアーゼＦを用いて増加又は減少させる。特定の態様では、これらのグリカンの量は、抗体をβ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼと共に約１０分間、約２０分間、約３０分間、約１時間、約２時間、約４時間、約９時間、又は約１０分～約９時間の範囲内にある時間、インキュベートすることによって調節される。

【0026】

本開示はまた、本開示の方法のいずれか１つによって生成される抗体組成物を提供する。特定の態様では、抗体は、参照ＩｇＧ１抗体と比較して、増加又は減少したＡＤＣＰ活性を有する（この参照ＩｇＧ１抗体は、増加又は減少したＡＤＣＰ活性を有するＩｇＧ１抗体と同じ抗体配列を有する）。いくつかの例では、抗体は、参照抗体と比較して、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、約１２５％、約１５０％、約１７５％若しくは約２００％、又は約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍若しくは約１０倍増加したＡＤＣＰ活性、或いは参照抗体と比較して、約０．５倍～約８倍増加したＡＤＣＰ活性を有する。場合により、抗体は、参照抗体と比較して、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、約１２５％、約１５０％、約１７５％若しくは約２００％、又は約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍若しくは約１０倍減少したＡＤＣＰ活性、或いは参照抗体と比較して、約０．５倍～約８倍減少したＡＤＣＰ活性を有する。例示的な態様では、ＩｇＧ１抗体は、表１又は２に列挙した配列のいずれか１つを含むトラスツズマブ又はリツキシマブである。

【0027】

本開示はさらに、本明細書に記載の抗体組成物のいずれか１つを含む医薬組成物を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1A】図１Ａは、３タイプのＮ－グリカン（オリゴマンノース型、複合型及びハイブリッド型）及びこのような糖類に関して一般的に使用されている記号の図解である。

【図1B】図１Ｂは、オリゴ糖構造の代表的な結合を有する、ヒトＩｇＧ中のＮ－グリコシル化部位アスパラギン（Ａｓｎ）２９７で見出される主要なＮ－結合型グリカンを示す概略図である。これらのグリカンは、通常、フコース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、シアル酸（ＳＡ）、及びバイセクト型Ｎ－ＧｌｃＮＡｃの可変付加によって構築された７糖コア及びアウターアームから構成される。

【図1C】図１Ｃは、フコース代謝のサルベージ経路及びデノボ経路の図である。サルベージ経路において、遊離Ｌ－フコースはＧＤＰ－フコースに変換されるが、デノボ経路において、ＧＤＰ－フコースは、ＧＭＤ及びＦＸにより触媒される３つの反応を介して合成される。次に、ＧＤＰ－フコースは、ＧＤＰ－Ｆｕｃトランスフェラーゼによって細胞質基質からゴルジ内腔に輸送され、アクセプターオリゴ糖及びタンパク質へ移される。他の反応産物であるＧＤＰは、内腔のヌクレオチドジホスファターゼによって、グアノシン５－一リン酸（ＧＭＰ）及び無機リン酸（Ｐｉ）に変換される。前者は、細胞質基質に排出されるが（ＧＤＰ－フコースの輸送と共役される対向輸送系を介して）、後者は、ゴルジアニオンチャネルであるＧＯＬＡＣを介してゴルジ内腔を離れると想定される。例えば、Ｎｏｒｄｅｅｎ ｅｔ ａｌ．２０００；Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．２００１を参照されたい。

【図2】図２は、ＡＤＣＰレポーター遺伝子アッセイにおける、ＨＥＲ２（トラスツズマブ）、ＴＮＦα、又はＣＤ２０（リツキシマブ）細胞表面抗原を標的とする３つの異なるＩｇＧ１ ｍＡｂの用量応答曲線（スムーズフィット）であり、このＡＤＣＰアッセイにおいて、試験抗体がある範囲の活性を示したことを示している。抗ＴＮＦα抗体は実質的に反応を示さなかったが、抗ＣＤ２０抗体は非常に強固な反応を示し、抗ＨＥＲ２抗体は中間の反応を示した。

【図3A】図３Ａ－Ｄは、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ（図３Ａ－Ｂ）及び抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブ（図３Ｃ－Ｄ）についての線形で幅を持った評価を示すグラフである。線形回帰直線（方程式を示す）を、各抗体について測定されたＡＤＣＰ活性と既知のＡＤＣＰ活性との関係を示すプロットに当てはめ（図３Ａ及び３Ｃ）、相関した線グラフ内の種々の活性レベルについて、代表的な用量応答曲線を示した（図３Ｂ及び３Ｄ）。このデータは、ＡＤＣＰレポーター遺伝子アッセイの定量的性質と範囲、及びＡＤＣＰ活性に影響する品質特性の評価に対するその適合性を示した。

【図3B】図３Ａ－Ｄは、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ（図３Ａ－Ｂ）及び抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブ（図３Ｃ－Ｄ）についての線形で幅を持った評価を示すグラフである。線形回帰直線（方程式を示す）を、各抗体について測定されたＡＤＣＰ活性と既知のＡＤＣＰ活性との関係を示すプロットに当てはめ（図３Ａ及び３Ｃ）、相関した線グラフ内の種々の活性レベルについて、代表的な用量応答曲線を示した（図３Ｂ及び３Ｄ）。このデータは、ＡＤＣＰレポーター遺伝子アッセイの定量的性質と範囲、及びＡＤＣＰ活性に影響する品質特性の評価に対するその適合性を示した。

【図3C】図３Ａ－Ｄは、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ（図３Ａ－Ｂ）及び抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブ（図３Ｃ－Ｄ）についての線形で幅を持った評価を示すグラフである。線形回帰直線（方程式を示す）を、各抗体について測定されたＡＤＣＰ活性と既知のＡＤＣＰ活性との関係を示すプロットに当てはめ（図３Ａ及び３Ｃ）、相関した線グラフ内の種々の活性レベルについて、代表的な用量応答曲線を示した（図３Ｂ及び３Ｄ）。このデータは、ＡＤＣＰレポーター遺伝子アッセイの定量的性質と範囲、及びＡＤＣＰ活性に影響する品質特性の評価に対するその適合性を示した。

【図3D】図３Ａ－Ｄは、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ（図３Ａ－Ｂ）及び抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブ（図３Ｃ－Ｄ）についての線形で幅を持った評価を示すグラフである。線形回帰直線（方程式を示す）を、各抗体について測定されたＡＤＣＰ活性と既知のＡＤＣＰ活性との関係を示すプロットに当てはめ（図３Ａ及び３Ｃ）、相関した線グラフ内の種々の活性レベルについて、代表的な用量応答曲線を示した（図３Ｂ及び３Ｄ）。このデータは、ＡＤＣＰレポーター遺伝子アッセイの定量的性質と範囲、及びＡＤＣＰ活性に影響する品質特性の評価に対するその適合性を示した。

【図4】図４は、非フコシル化種（すなわち、Ｇ０若しくはＧ１を含む、コアフコースを欠く種）、高マンノース種（Ｍ５種を含む）、又は末端β－ガラクトース種（すなわち、Ｇ１Ｆ若しくはＧ２Ｆを含む、末端β－ガラクトース）種を含む、ＡＤＣＰレポーター遺伝子アッセイにおいて評価された３つの主要なグリカン種の構造の要約である。

【図5】図５は、広範囲のβ－ガラクトースレベルを有する抗ＨＥＲ２抗体（トラスツズマブ）の代表的なＡＤＣＰ用量応答曲線であり、より高いレベルのβ－ガラクトースレベルが一般に、より高いＡＤＣＰ活性をもたらすことを示している。

【図6】図６は、抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブのＡＤＣＰ活性とβ－ガラクトースレベルとの間の相関を示す線グラフである。トラスツズマブのＡＤＣＰ活性に対するβ－ガラクトースの相対的影響は２．８８と計算された。

【図7】図７は、２つの広範囲のβ－ガラクトースレベル（０％及び８１％のβ－ガラクトース）の抗ＣＤ２０抗体（リツキシマブ）の相対ＡＤＣＰ活性を報告する棒グラフである。

【図8】図８は、ＡｌｐｈａＬＩＳＡフォーマットを用いたＦｃγＲＩＩａ結合アッセイによって測定された、抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブのＦｃγＲＩＩａ結合とβ－ガラクトースレベルとの間の相関を報告する線グラフである。

【図9A】図９Ａ－Ｂは、ＣＤ２０／リツキシマブ（図９Ａ）及びＨＥＲ２／トラスツズマブ（図９Ｂ）抗体についての、最小β－ラクトースレベルの活性に対して正規化された、示すような選択したβ－ガラクトース試料の相対的な標的結合活性を報告する棒グラフである。これらの結果は、観察された相対ＡＤＣＰ活性の差異がＦｃγＲＩＩａ結合の差異によるものであって、細胞表面標的結合の不測の変化によるものではないことを示している。

【図9B】図９Ａ－Ｂは、ＣＤ２０／リツキシマブ（図９Ａ）及びＨＥＲ２／トラスツズマブ（図９Ｂ）抗体についての、最小β－ラクトースレベルの活性に対して正規化された、示すような選択したβ－ガラクトース試料の相対的な標的結合活性を報告する棒グラフである。これらの結果は、観察された相対ＡＤＣＰ活性の差異がＦｃγＲＩＩａ結合の差異によるものであって、細胞表面標的結合の不測の変化によるものではないことを示している。

【図10A】図１０Ａ－Ｂは、抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブ（図１０Ａ）及び抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ（図１０Ｂ）のＡＤＣＰ活性と非フコシル化との間の相関を報告する線グラフである。このデータは、トラスツズマブの非フコシル化を増加させた場合のＡＤＣＰ活性の直線的増加（応答係数０．５６）を示している。リツキシマブは、非フコシル化を増加させると、ＡＤＣＰ活性のわずかな直線的減少を示した。

【図10B】図１０Ａ－Ｂは、抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブ（図１０Ａ）及び抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ（図１０Ｂ）のＡＤＣＰ活性と非フコシル化との間の相関を報告する線グラフである。このデータは、トラスツズマブの非フコシル化を増加させた場合のＡＤＣＰ活性の直線的増加（応答係数０．５６）を示している。リツキシマブは、非フコシル化を増加させると、ＡＤＣＰ活性のわずかな直線的減少を示した。

【図11A】図１１Ａ－Ｂは、トラスツズマブの、β－ガラクトースとＡＤＣＰ活性との相関（図１１Ａ）、又はβ－ガラクトースとＦｃγＲＩＩａ結合との相関（図１１Ｂ）を、高マンノース含有量が固定された試料と、高マンノースをある範囲で含有する試料の両方について報告する線グラフである。このデータは、高マンノースレベルの増加がトラスツズマブのＡＤＣＰ活性及びＦｃγＲＩＩａ結合を減少させることを示唆している。

【図11B】図１１Ａ－Ｂは、トラスツズマブの、β－ガラクトースとＡＤＣＰ活性との相関（図１１Ａ）、又はβ－ガラクトースとＦｃγＲＩＩａ結合との相関（図１１Ｂ）を、高マンノース含有量が固定された試料と、高マンノースをある範囲で含有する試料の両方について報告する線グラフである。このデータは、高マンノースレベルの増加がトラスツズマブのＡＤＣＰ活性及びＦｃγＲＩＩａ結合を減少させることを示唆している。

【図12A】図１２Ａ－Ｂは、リツキシマブ抗ＣＤ２０抗体の、高マンノースとＡＤＣＰ活性との相関（図１２Ａ）、又は高マンノースとＦｃγＲＩＩａ結合との相関（図１２Ｂ）を報告する線グラフである。このデータは、高マンノースレベルの増加がリツキシマブのＡＤＣＰ活性及びＦｃγＲＩＩａ結合を減少させることを示唆している。

【図12B】図１２Ａ－Ｂは、リツキシマブ抗ＣＤ２０抗体の、高マンノースとＡＤＣＰ活性との相関（図１２Ａ）、又は高マンノースとＦｃγＲＩＩａ結合との相関（図１２Ｂ）を報告する線グラフである。このデータは、高マンノースレベルの増加がリツキシマブのＡＤＣＰ活性及びＦｃγＲＩＩａ結合を減少させることを示唆している。

【発明を実施するための形態】

【0029】

本開示をより容易に理解できるようにするために、特定の用語を最初に定義する。発明を実施するための形態を通して、さらなる定義を記載する。

【0030】

本開示の説明に関する（とりわけ以下の特許請求の範囲に関する）「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」という用語、並びに類似の指示対象は、本明細書で使用する場合、本明細書に別段の指示がない限り又は文脈と明確に矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含するものと解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特に断らない限り、開放型用語として解釈されるべきである（すなわち、「包含するが、これに限定されない」を意味し、１つ以上の特徴又は構成要素の存在を許容する）。「１つの（ａ）」（又は「１つの（ａｎ）」）という用語、並びに「１つ以上の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」及び「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用することができる。さらに、「及び／又は」は、本明細書で使用される場合、２つの特定の特徴又は構成要素のそれぞれの特定の開示として（他の特徴又は構成要素の有無にかかわらず）解釈されるべきである。したがって、本明細書で「Ａ及び／又はＢ」などの句で使用される「及び／又は」という用語は、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を包含するものとする。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」などの句で使用される「及び／又は」という用語は、以下の態様のそれぞれを包含するものとする：Ａ、Ｂ及びＣ；Ａ、Ｂ又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；並びにＣ（単独）。

【0031】

明細書及び特許請求の範囲を通して数値に関連して使用される「約」という用語は、当業者によく知られ、且つ受け入れられる精度の間隔を示す。一般に、このような精度の間隔は±１０％である。

【0032】

他に定義されていない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、及びＯｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、本開示で使用される用語の多くの一般辞書を当業者に提供する。一般に、本明細書に記載される、細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、タンパク質グリコシル化、抗体産生及び抗体精製に関連して使用される命名法、並びにそれらの技術は当該技術分野でよく知られ、またよく使用されているものである。標準的手法を組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養及び形質転換、タンパク質精製、抗体生成などに使用することができる。酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様書に従って、又は当該技術分野において一般的に達成されるように若しくは本明細書に記載されるように実施することができる。以下の手順及び手法は、当該技術分野においてよく知られている従来の方法に従って、また明細書全体を通して引用され論じられている様々な一般的で且つより具体的な参考文献に記載されるように概ね実施することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕｅｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい。この文献はいかなる目的に対しても参照により本明細書に組み込まれる。

【0033】

単位、接頭辞及び記号は、国際単位系（ＳＩ）で認められた形式で示される。数値範囲は、範囲を規定する数値を含む。別段の指示がない限り、アミノ酸配列は、左から右に、アミノからカルボキシへの配向で書かれている。本明細書で示される見出しは、本開示の様々な１つ又は複数の態様を限定するものではなく、それは本明細書全体を参照することによって有することができる。

【0034】

翻訳後のグリコシル化
多くの分泌タンパク質が翻訳後グリコシル化され、この過程により、糖部分（例えばグリカン、糖類）がタンパク質の特定のアミノ酸に共有結合される。真核細胞においては、次の２種類のグリコシル化反応が起こる：（１）グリカンが認識配列Ａｓｎ－Ｘ－Ｔｈｒ／Ｓｅｒ（ここで、「Ｘ」はプロリン以外の任意のアミノ酸である）のアスパラギンに連結されるＮ結合型グリコシル化、及び（２）グリカンがセリン又はスレオニンに連結されるＯ結合型グリコシル化。グリコシル化のタイプ（Ｎ結合型又はＯ結合型）にかかわらず、各部位（Ｏ又はＮ）と結合されるグリカン構造は広範囲にわたるため、タンパク質グリコフォームには微小不均一性がある。

【0035】

全てのＮ－グリカンは、共通のコア糖配列：Ｍａｎα１－６（Ｍａｎα１－３）Ｍａｎβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２Ａｓｎ）を有し、次の３つのタイプのうちの１つに分類される：（Ａ）２個のＮ－アセチルグルコサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分及び多数（例えば、５、６、７、８若しくは９個）のマンノース（Ｍａｎ）残基からなる高マンノース（ＨＭ）若しくはオリゴマンノース（ＯＭ）型、（Ｂ）３個以上のＧｌｃＮＡｃ部分及び任意の数の他の糖タイプを含む複合型、又は（Ｃ）分枝の一方にＭａｎ残基を、複合枝の基部にＧｌｃＮＡｃを含むハイブリッド型。図１Ａ（Ｓｔａｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ８：Ｎ－Ｇｌｙｃａｎｓ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２^ｎｄｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；２００９に基づく）は、Ｎ－グリカンの３つのタイプを示す。

【0036】

Ｎ結合型グリカンは、通常、ガラクトース（Ｇａｌ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ－アセチルグルコアサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、マンノース（Ｍａｎ）、Ｎ０アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）、フコース（Ｆｕｃ）の１つ以上の単糖を含む。このような糖類に対し一般的に使用されている記号を、図１Ａに示す。

【0037】

Ｎ結合型グリコシル化は小胞体（ＥＲ）において開始され、複雑な一連の反応の結果、基本的に２個のＧｌｃＮＡｃ残基及び３個のＭａｎ残基から作られるコアグリカン構造の連結が起こる。ＥＲにおいて形成されるグリカン複合体は、ゴルジ装置において酵素の作用により修飾される。糖類が酵素に比較的接近しにくい場合、これは、一般的には元のＨＭ形態にとどまる。酵素が糖類に接近し得る場合、Ｍａｎ残基の多くは切り離され、糖類がさらに修飾され、その結果、複合型のＮ－グリカン構造が生じる。例えば、ｃｉｓ－ゴルジに位置するマンノシダーゼ－１は、ＨＭグリカンを切断又は加水分解し得、一方、メディアル－ゴルジに位置するフコシルトランスフェラーゼＦＵＴ－８はグリカンをフコシル化する（Ｈａｎｒｕｅ Ｉｍａｉ－Ｎｉｓｈｉｙａ（２００７），ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７：８４）。

【0038】

したがって、グリカン構造の糖組成及び構造立体配置は、とりわけ、ＥＲ及びゴルジ装置におけるグリコシル化機序、その機序の酵素のグリカン構造への到達性、各酵素の作用の順序及びタンパク質がグリコシル化機序から放出される段階に依存して変動する。

【0039】

Ｆｃドメインに結合するグリカン構造はＡＤＣＣ及びＡＤＣＰを媒介するＦｃγＲとの相互作用、並びにＣＤＣに導く最初の結合事象であるＣ１ｑ結合との相互作用に影響を及ぼすので、グリカン構造を制御することは、治療用モノクローナル抗体の組み換え産生において重要である。

【0040】

本開示は、トラスツズマブ又はリツキシマブを含むＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性に対する種々のグリカン（例えば、β－ガラクトース、コア－フコース及び／又は高マンノースを含む）の影響を解明する。したがって、本開示は、抗体又はそれを含む組成物（抗体組成物）のＡＤＣＰ活性を調節する方法を提供する。例示的な実施形態では、方法は、（ａ）抗体のガラクトシル化グリカン、（ｂ）抗体の非フコシル化グリカン、（ｃ）抗体の高マンノースグリカン、又は（ｄ）それらの組み合わせの量を調節することを含む。特定の理論に縛られるものではないが、本開示の方法は、目標レベルのＡＤＣＰ活性を示す、特定の量の所与の抗体の特定のグリコフォームを含むテーラーメイドの組成物に対する手段を提供すると考えられる。

【0041】

「抗体依存性細胞貪食」又は「ＡＤＣＰ」という用語は、抗体オプソニン化された標的細胞が免疫系の細胞（例えば、マクロファージ及び／又は好中球を含む）の表面のＦｃγＲを活性化して貪食を誘導し、その結果、ファゴソームの酸性化を介して標的細胞の内部移行及び分解をもたらす機構を意味する。ＡＤＣＰは一般に、（１）細胞上の抗原又は標的への抗体の結合、並びに（２）抗体結合細胞の内部移行、分解及び／又は破壊を誘導するための、マクロファージ又は他の食細胞上の受容体（Ｆｃ受容体）への抗体の結合の２段階機構を必要とする。例えば、Ｇｕｅｌ Ｎ ａｎｄ Ｅｇｍｏｎｄ Ｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ：Ａ Ｐｏｔｅｎｔ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １ ２０１５（７５）（２３）５００８－５０１３を参照されたい。

【0042】

「ＦｃγＲ」又は「Ｆｃ－ガンマ受容体」という用語は、オプソニン化された細胞又は微生物の食作用の誘導に関与するＩｇＧスーパーファミリーに属するタンパク質である。例えば、Ｆｒｉｄｍａｎ ＷＨ．Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ．ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ．５（１２）：２６８４－９０（１９９１）を参照されたい。Ｆｃ－ガンマ受容体ファミリーのメンバーには、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、及びＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）が含まれる。ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、及びＦｃγＲＩＩＩＢの配列は、多くの配列データベース、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）のアクセッション番号Ｐ１２３１４（ＦＣＧＲ１＿ＨＵＭＡＮ）、Ｐ１２３１８（ＦＣＧ２Ａ＿ＨＵＭＡＮ）、Ｐ３１９９４（ＦＣＧ２Ｂ＿ＨＵＭＡＮ）、Ｐ０８６３７（ＦＣＧ３Ａ＿ＨＵＭＡＮ）、及びＰ０８６３７（ＦＣＧ３Ａ＿ＨＵＭＡＮ）の下にそれぞれ見出すことができる。

【0043】

用語「ＡＤＣＰ活性」は、（１）細胞上の抗原又は標的への抗体の結合、並びに（２）抗体結合細胞の内部移行、分解及び／又は破壊を誘導するための、マクロファージ又は他の食細胞上の受容体（Ｆｃ受容体）への抗体の結合の２段階機構によって、ファゴソームの酸性化を介して標的細胞の内部移行及び分解をもたらす食作用が活性化又は刺激される程度を指す。「抗体のＡＤＣＰ活性」という句は、ＡＤＣＰを誘導する抗体の能力を指す。

【0044】

市販のアッセイ及びキットを含む、抗体のＡＤＣＰ活性を測定又は決定する方法は、例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｊ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ＦｃγＲＩＩａ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２００８；７，２５１７－２７、Ａｃｋｅｒｍａｎ ｅｔ．ａｌ，Ａ ｒｏｂｕｓｔ，ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ａｓｓａｙ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓａｍｐｌｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６６（２０１１）８－１９、Ｃｈｕｎｇ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｃｏｓｅ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ａ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｎ Ｆｃｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．ｍＡｂｓ ２０１２；４：３２６－４０、Ｈｅｒｂｒａｎｄ Ｕ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ：ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｇｅｔｓ ｎｏ ｒｅｓｐｅｃｔ－Ａ ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ａｂｏｕｔ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｂｉｏａｓｓａｙ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ．ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ Ｊ，２０１６；１５（１）：２６－９、ＡＤＣＰ Ｂｉｏａｓｓａｙｓ （Ｐｒｏｍｅｇａ，ｃａｔａｌｏｇ ｎｕｍｂｅｒ Ｇ９９０１ ｏｒ Ｇ９９９１）、及びＡＤＣＰ Ｂｉｏａｓｓａｙ（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｃａｔａｌｏｇ ｎｕｍｂｅｒ ６０５４０ ｏｒ ６０５４１）に記載されるように、当該技術分野でよく知られており、これらの文献は全て参照によりあらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。「ＡＤＣＰアッセイ」又は「ＦｃγＲレポーター遺伝子アッセイ」という用語は、抗体のＡＤＣＰ活性を決定するために有用なアッセイ、キット又は方法をいう。

【0045】

本明細書に記載の方法における抗体のＡＤＣＰ活性を測定又は決定する例示的な方法には、実施例に記載のＡＤＣＰアッセイ、又はＰｒｏｍｅｇａから市販されているＡＤＣＰレポーターアッセイ（カタログ番号Ｇ９９０１又はＧ９９９１）が含まれる。いくつかの実施形態では、ＡＤＣＰ活性はレポーター遺伝子アッセイ、例えば、以下の１つ以上を含むＦｃγＲレポーター遺伝子アッセイを用いて測定又は決定される：ＦｃγＲ受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩａを含む）を発現するＪｕｒｋａｔ細胞、活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）応答エレメント、及びルシフェラーゼ若しくは他のレポーター遺伝子又はレポーター産物。例示的な態様では、ＡＤＣＰ活性は、細胞表面にＦｃγＲＩＩａを発現する細胞、例えば、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞、及びＮＦＡＴ活性に連結されたレポーター遺伝子を含むレポーター遺伝子アッセイを使用して測定される。

【0046】

ＡＤＣＰ活性の調節
「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」又は「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）」という用語は、増加又は減少させることによって変化させることを意味する。したがって、本明細書において「抗体依存性細胞貪食活性を調節する」などの句で使用される「調節する」という用語は、抗体依存性細胞貪食活性を増加させること、又は抗体依存性細胞貪食活性を減少させることを含むことが意図される。また、「調節する」という用語は、「ガラクトシル化グリカン、非フコシル化グリカン、高マンノースグリカン、又はそれらの組み合わせの量を調節する」などの句で使用される場合、前記グリカンの量を増加させること、又は前記グリカンの量を減少させることを含むことが意図される。

【0047】

したがって、例示的な実施形態では、現在開示されている方法は、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＰ活性を増加させる方法を表す。例示的な態様では、本開示の方法は、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＰ活性を、対照又は参照抗体と比較して、任意の程度又はレベルまで増加させる。例示的な例では、本開示の方法により提供される増加は、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも又は約１％～約１００％の増加（例えば、少なくとも又は約１％の増加、少なくとも又は約２％の増加、少なくとも又は約３％の増加、少なくとも又は約４％の増加、少なくとも又は約５％の増加、少なくとも又は約６％の増加、少なくとも又は約７％の増加、少なくとも又は約８％の増加、少なくとも又は約９％の増加、少なくとも又は約９．５％の増加、少なくとも又は約９．８％の増加、少なくとも又は約１０％の増加、少なくとも又は約１５％の増加、少なくとも又は約２０％の増加、少なくとも又は約２５％の増加、少なくとも又は約３０％の増加、少なくとも又は約３５％の増加、少なくとも又は約４０％の増加、少なくとも又は約４５％の増加、少なくとも又は約５０％の増加、少なくとも又は約５５％の増加、少なくとも又は約６０％の増加、少なくとも又は約６５％の増加、少なくとも又は約７０％の増加、少なくとも又は約７５％の増加、少なくとも又は約８０％の増加、少なくとも又は約８５％の増加、少なくとも又は約９０％の増加、少なくとも又は約９５％の増加、少なくとも又は約１００％の増加）である。例示的な実施形態では、本開示の方法により提供される増加は、対照又は参照抗体と比較して、１００％超、例えば、少なくとも又は約１２５％、少なくとも又は約１５０％、少なくとも又は約１７５％、少なくとも又は約２００％、少なくとも又は約３００％、少なくとも又は約４００％、少なくとも又は約５００％、少なくとも又は約６００％、少なくとも又は約７００％、少なくとも又は約８００％、少なくとも又は約９００％、或いは少なくとも又は約１０００％にもなる。例示的な実施形態では、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＰ活性のレベルは、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも約１．５倍増加する。例示的な実施形態では、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＰ活性のレベルは、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも約２倍増加する。例示的な実施形態では、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＰ活性のレベルは、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも約３倍増加する。例示的な実施形態では、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＰ活性のレベルは、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも約４倍又は約５倍増加する。例示的な実施形態では、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＰ活性のレベルは、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、又は約１０倍増加する。例示的な実施形態では、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＰ活性のレベルは、対照又は参照抗体と比較して、約０．５倍～約８倍の範囲内の量だけ増加する。

【0048】

代替の実施形態では、本開示の方法は、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＰ活性を減少させる方法を表す。いくつかの態様では、本開示の方法は、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＰ活性のレベルを、対照又は参照抗体と比較して、任意の程度又はレベルまで減少させる。本開示の方法により提供される減少は、対照又は参照抗体のレベルと比較して、少なくとも又は約１％～約１００％の減少（例えば、少なくとも又は約１％の減少、少なくとも又は約２％の減少、少なくとも又は約３％の減少、少なくとも又は約４％の減少、少なくとも又は約５％の減少、少なくとも又は約６％の減少、少なくとも又は約７％の減少、少なくとも又は約８％の減少、少なくとも又は約９％の減少、少なくとも又は約９．５％の減少、少なくとも又は約９．８％の減少、少なくとも又は約１０％の減少、少なくとも又は約１５％の減少、少なくとも又は約２０％の減少、少なくとも又は約２５％の減少、少なくとも又は約３０％の減少、少なくとも又は約３５％の減少、少なくとも又は約４０％の減少、少なくとも又は約４５％の減少、少なくとも又は約５０％の減少、少なくとも又は約５５％の減少、少なくとも又は約６０％の減少、少なくとも又は約６５％の減少、少なくとも又は約７０％の減少、少なくとも又は約７５％の減少、少なくとも又は約８０％の減少、少なくとも又は約８５％の減少、少なくとも又は約９０％の減少、少なくとも又は約９５％の減少、少なくとも又は約１００％の減少）である。例示的な実施形態では、本開示の方法により提供される減少は、対照又は参照抗体のレベルと比較して、約１００％超、例えば、少なくとも又は約１２５％、少なくとも又は約１５０％、少なくとも又は約１７５％、少なくとも又は約２００％、少なくとも又は約３００％、少なくとも又は約４００％、少なくとも又は約５００％、少なくとも又は約６００％、少なくとも又は約７００％、少なくとも又は約８００％、少なくとも又は約９００％、或いは少なくとも又は約１０００％にもなる。例示的な実施形態では、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＰ活性のレベルは、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも約１．５倍減少する。例示的な実施形態では、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＰ活性のレベルは、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも約２倍減少する。例示的な実施形態では、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＰ活性のレベルは、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも約３倍減少する。例示的な実施形態では、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＰ活性のレベルは、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも約４倍又は少なくとも約５倍減少する。例示的な実施形態では、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＰ活性のレベルは、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、又は約１０倍減少する。例示的な実施形態では、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＰ活性のレベルは、対照又は参照抗体と比較して、約０．５倍～約８倍の範囲内の量だけ減少する。

【0049】

グリカン
例示的な実施形態において、本明細書に開示する方法は、（ａ）ガラクトシル化グリカン、（ｂ）非フコシル化グリカン、（ｃ）高マンノースグリカン、又は（ｄ）これらの組み合わせを含む、抗体上のグリカンの量を調節して、抗体のＡＤＣＰ活性を増加又は減少させることを含む。例示的な態様において、本明細書に開示する方法は、（ａ）ガラクトシル化グリカン、（ｂ）非フコシル化グリカン、（ｃ）高マンノースグリカン、又は（ｄ）これらの組み合わせを含む、抗体のＦｃドメインに結合したグリカンの量を調節して、抗体のＡＤＣＰ活性を増加又は減少させることを含む。さらなる例示的な態様において、本明細書に開示する方法は、（ａ）ガラクトシル化グリカン、（ｂ）非フコシル化グリカン、（ｃ）高マンノースグリカン、又は（ｄ）これらの組み合わせを含む、抗体のＦｃドメインのＡｓｎ－２９７に結合したグリカンの量を調節して、抗体のＡＤＣＰ活性を増加又は減少させることを含む。

【0050】

例示的な態様では、本開示によって提供される方法は、抗体組成物、例えば、ＩｇＧ１抗体組成物（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）の調節であって、所望の又は所定の又は予め選択されたレベルのＡＤＣＰ活性を達成するために、ＩｇＧ１抗体のグリコフォームの所望の又は所定の又は予め選択されたレベルを達成するための工程が行われる調節に関する。例示的な実施形態において、この方法は、ＩｇＧ１抗体の（ａ）ガラクトシル化グリカン、（ｂ）非フコシル化グリカン、（ｃ）高マンノースグリカン；又は（ｄ）これらの組み合わせの量を調節（増加又は減少）して、抗体組成物により誘導又は刺激されるＡＤＣＰ活性を調節（増加又は減少）することを含む。例示的な実施形態において、この方法は、グリコフォーム、例えば、（ａ）ガラクトシル化グリコフォーム、（ｂ）非フコシル化グリコフォーム、（ｃ）高マンノースグリコフォーム；又は（ｄ）これらの組み合わせの量を調節（増加又は減少）して、抗体組成物により誘導又は刺激されるＡＤＣＰ活性を調節（増加又は減少）することを含む。特定の理論に束縛されるものではないが、本開示の方法は所与の抗体の特定のグリコフォームの量を調節する（すなわち、増加又は減少させる）ことによって、所望の、所定の、又は目標のＡＤＣＰ活性を有する抗体組成物を操作する手段を提供すると考えられる。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、抗体組成物中の（ａ）ガラクトシル化グリカン、（ｂ）非フコシル化グリカン、（ｃ）高マンノースグリカン、又は（ｄ）これらの組み合わせの量又は割合を調節して、所望の、所定の、又は目標のＡＤＣＰ活性、及び／或いは増加又は減少したＡＤＣＰ活性を有する組成物を達成することを含む。

【0051】

代替の態様では、本明細書に開示する方法は、特定のＩｇＧ１分子（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）に結合した末端β－ガラクトース、コアフコース、若しくは高マンノース、又はこれらの組み合わせの量を調節することを含む。例えば、この方法は、トラスツズマブ上の末端β－ガラクトースの量を（例えば、グリカンをＧ０種からＧ１種若しくはＧ２種に、又はＧ１種からＧ２種に効果的に変化させることにより）増加させて、トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を増加させることを含み得る。また、例えば、この方法は、トラスツズマブ上の末端β－ガラクトースの量を（例えば、グリカンをＧ２種からＧ１種若しくはＧ０種に、又はＧ１種からＧ０種に効果的に変化させることにより）減少させて、トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を減少させることを含み得る。他の例示的な態様においては、この方法は、トラスツズマブ抗体中のコアフコースの量を減少させるか、又は非フコシル化種の量を増加させて、ＡＤＣＰ活性を増加させることを含み得る。他の例示的な態様においては、この方法は、リツキシマブ抗体中のコアフコースの量を増加させるか、又は非フコシル化種の量を減少させて、抗体のＡＤＣＰ活性を増加させることを含み得る。他の例示的な態様においては、この方法は、トラスツズマブ抗体中のコアフコースの量を増加させるか、又は非フコシル化種の量を減少させて、ＡＤＣＰ活性を減少させることを含み得る。他の例示的な態様においては、この方法は、リツキシマブ抗体中のコアフコースの量を減少させるか、又は非フコシル化種の量を増加させて、抗体のＡＤＣＰ活性を減少させることを含み得る。さらなる例示的態様においては、この方法は、ＩｇＧ１抗体（トラスツズマブ若しくはリツキシマブなど）上の高マンノース若しくはＭ５高マンノースの量を増加させて、抗体のＡＤＣＰ活性を減少させるか、又はＩｇＧ１抗体（トラスツズマブ若しくはリツキシマブなど）上の高マンノース若しくはＭ５高マンノースの量を減少させて、抗体のＡＤＣＰ活性を増加させることを含み得る。

【0052】

用語「グリカン（ｇｌｙｃａｎ）」、「グリカン（ｇｌｙｃａｎｓ）」、「グリコフォーム（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）」又は「グリコフォーム（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍｓ）」は、種々のグリコシド結合によって連結された単糖種のオリゴマーを指す。哺乳動物のＮ結合型グリカンに一般に見られる単糖の例には、ヘキソース（Ｈｅｘ）、グルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）及びＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が含まれる。組み換えＩｇＧ１抗体上に見られる主要なＮ－グリカン種には、図１Ｂに示されるように、フコース、ガラクトース、マンノース、シアル酸及びＧｌｃＮＡｃが含まれる。グリカンオリゴ糖の構造は、Ａｓｎ－２９７のＮ－グリコシル化部位に結合しており、一般に、フコース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、シアル酸（ＳＡ）、及びバイセクト型Ｎ－ＧｌｃＮＡｃの可変付加によって構築されたアウターアームを有する７糖コアから構成されている。潜在的なオリゴ糖構造の各々は、以下のように略することができる：Ｇ０、Ｇ１又はＧ２は、それぞれ、０、１、又は２個の末端ガラクトース分子を有するコアＧｌｃＮＡｃ及びマンノースオリゴ糖構造を指す。Ｇ１には、Ｇ１ａとＧ１ｂと略される２つの付加的な構造が存在し、Ｇ１ａ又はＧ１ｂは末端ガラクトース基がコア構造の６－アーム及び３－アームのいずれに結合しているかを示すことがある。図１Ｂを参照されたい。フコシル化されている場合（すなわち、フコース基がコアグリカン構造に結合している場合）、Ｇ０、Ｇ１（Ｇ１ａ／Ｇ１ｂ）又はＧ２型はＧ０Ｆ、Ｇ１Ｆ（Ｇ１ａＦ／Ｇ１ｂＦ）又はＧ２Ｆと略記することができる。シアル酸が存在する場合、これらの略語は「Ｓ」を含み、例えば、Ｇ２ＦＳ２が２つのガラクトース、フコース及び２つのシアル酸基を有するグリカンを指す。追加のマンノース基を組み込むことによって形成される高マンノース（ＨＭ）構造、例えば、図４に示すような高マンノース種「Ｍ５」を含む、ＩｇＧ１抗体に連結されたさらなるグリカンも存在し得る。本明細書で使用される場合、「グリカン（ｇｌｙｃａｎ）」又は「グリカン（ｇｌｙｃａｎｓ）」という用語は、本明細書に記載される単糖種のオリゴマーのいずれか、又は抗体若しくはＩｇＧ１抗体に連結された単糖種の任意の他のオリゴマーを指す。

【0053】

「末端β－ガラクトース」、「ガラクトシル化グリカン」又は「Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種」は、コアマンノース構造に結合するＮ－アセチルグルコサミン部分を介して、Ｎ－グリコシル化部位（Ａｓｎ－２９７）でＩｇＧ１抗体に連結された１つ又は２つのガラクトース分子を含むグリカンを指す。「末端β－ガラクトース」、「ガラクトシル化グリカン」又は「Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種」を含む例示的なグリカンを図１Ｂに示す。いくつかの実施形態では、Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／又はＧ２ガラクトシル化種は、コアフコースを含んでも含まなくてもよい。

【0054】

用語「コアフコース」又は「フコシル化種」は、コアマンノース構造に結合するＮ－アセチルグルコサミン部分を介して、Ｎ－グリコシル化部位（Ａｓｎ－２９７）でＩｇＧ１抗体に連結されたフコース分子（アルファ１－６）を含むグリカンを指す。「コアフコース」又は「フコシル化種」を含む例示的なグリカンを図１Ｂに示す。いくつかの実施形態では、コアフコース及び／又はフコシル化種を含む抗体は、末端β－ガラクトース及び／又は高マンノースを含む他のグリカンを含んでも含まなくてもよい。

【0055】

用語「非フコシル化」、「非フコシル化グリカン」又は「非フコシル化」は、抗体上のコアフコースの除去又は欠如を指す。例示的な非フコシル化抗体種を図１Ｂに示す。いくつかの実施形態では、コアフコースを欠く抗体は、末端β－ガラクトース及び／又は高マンノースを含む他のグリカンを含んでも含まなくてもよい。非フコシル化グリコフォームとしては、Ａ１Ｇ０、Ａ１Ｇ１ａ、Ａ２Ｇ０、Ａ２Ｇ１ａ、Ａ２Ｇ１ｂ、Ａ２Ｇ２及びＡ１Ｇ１Ｍ５が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｒｅｕｓｃｈ ａｎｄ Ｔｅｊａｄａ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２５（１２）：１３２５－１３３４（２０１５）を参照されたい。

【0056】

「高マンノース」、「高マンノースグリカン」又は「ＨＭ」という用語は、Ｎ－グリコシル化部位（Ａｓｎ－２９７）でＩｇＧ１抗体に連結された３個を超えるマンノース分子を含むグリカンを指す。２つの追加のマンノース分子を含有する「Ｍ５高マンノース抗体種」を含む、例示的な高マンノース抗体を図４に示す。高マンノースグリカンは、それぞれＭａｎ５、Ｍａｎ６、Ｍａｎ７、Ｍａｎ８、及びＭａｎ９と略される、５、６、７、８、又は９個のマンノース残基を含むグリカンを包含する

【0057】

用語「量」は、グリカンの量（例えば、（１）末端β－ガラクトースの量、（２）Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種の量、（３）コアフコースの量、（４）非フコシル化種の量、（５）高マンノースの量、並びに／又は（６）Ｍ５高マンノース種の量を含む）をいう場合、グリカンの総量と比較した特定のグリカンの相対的な量又は割合を指す。例えば、（１）末端β－ガラクトース、（２）Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種、（３）コアフコース、（４）非フコシル化種、（５）高マンノース、並びに／又は（６）Ｍ５高マンノース種の量は、末端β－ガラクトース、Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種、コアフコース、非フコシル化種、高マンノース、又はＭ５高マンノース種の量を全グリカンの総量で除して算出される割合として示される。グリカン（例えば、末端β－ガラクトース、Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種、コアフコース、非フコシル化種、高マンノース、並びに／又はＭ５高マンノース種を含む）の量又は相対的割合を測定及び決定する方法は当該技術分野でよく知られており、実施例に記載されるような親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）が挙げられる。また、Ｐａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｆｃ Ｇｌｙｃａｎ Ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ＦｃｃＲＩＩＩａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎ ＩｇＧ１ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，２０１６，Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．５ ｐａｇｅｓ １１８１－１１９２、及びＳｈａｈ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍａｐｐｉｎｇ ｗｉｔｈ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｄａｔａ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｆｏｒ Ｒｏｕｔｉｎｅ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ Ｎ－Ｇｌｙｃａｎｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．（２０１４）２５：９９９を参照されたい。これらの各文献はあらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、量は取り込みモルパーセントとして決定又は算出することができる。

【0058】

グリカン量の調節
本明細書で使用される場合、「調節する」は減少又は増加によって変化することを意味し、したがって、例示的な態様では、本明細書に開示する方法は、抗体のグリカンの量を増加及び／又は減少させることを含む。例示的な態様では、本開示の方法は、抗体のグリカン（例えば、ガラクトシル化グリカン、Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種、非フコシル化グリカン、コアフコース、高マンノースグリカン、Ｍ５高マンノース種、又はこれらの組み合わせ）を、対照又は参照抗体と比較して任意の程度又はレベルまで増加させることを含む。例示的な例では、本方法は、対照又は参照抗体と比較して、グリカンを少なくとも又は約１％～約１００％（例えば、少なくとも又は約１％、少なくとも又は約２％、少なくとも又は約３％、少なくとも又は約４％、少なくとも又は約５％、少なくとも又は約６％、少なくとも又は約７％、少なくとも又は約８％、少なくとも又は約９％、少なくとも又は約９．５％、少なくとも又は約９．８％、少なくとも又は約１０％、少なくとも又は約１５％、少なくとも又は約２０％、少なくとも又は約２５％、少なくとも又は約３０％、少なくとも又は約３５％、少なくとも又は約４０％、少なくとも又は約４５％、少なくとも又は約５０％、少なくとも又は約５５％、少なくとも又は約６０％、少なくとも又は約６５％、少なくとも又は約７０％、少なくとも又は約７５％、少なくとも又は約８０％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約１００％）増加させることを含む。例示的な実施形態では、本方法は、対照又は参照抗体と比較して、グリカンを１００％以上、例えば、少なくとも又は約１２５％、少なくとも又は約１５０％、少なくとも又は約１７５％、少なくとも又は約２００％、少なくとも又は約３００％、少なくとも又は約４００％、少なくとも又は約５００％、少なくとも又は約６００％、少なくとも又は約７００％、少なくとも又は約８００％、少なくとも又は約９００％、或いは少なくとも又は約１０００％さえも増加させることを含む。例示的な実施形態では、本方法は、対照又は参照抗体と比較して、グリカンを少なくとも約１．５倍増加させることを含む。例示的な実施形態では、本方法は、対照又は参照抗体と比較して、グリカンを少なくとも約２倍増加させることを含む。例示的な実施形態では、本方法は、対照又は参照抗体と比較して、グリカンを少なくとも約３倍増加させることを含む。例示的な実施形態では、本方法は、対照又は参照抗体と比較して、グリカンを少なくとも約４倍又は約５倍増加させることを含む。例示的な実施形態では、本方法は、対照又は参照抗体と比較して、グリカンを少なくとも約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、又は約１０倍増加させることを含む。例示的な実施形態では、本方法は、対照又は参照抗体と比較して、グリカンを少なくとも約０．５倍～約８倍の範囲内の量だけ増加させることを含む。

【0059】

例示的な態様では、本開示の方法は、抗体のグリカン（例えば、ガラクトシル化グリカン、Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種、非フコシル化グリカン、コアフコース、高マンノースグリカン、Ｍ５高マンノース種、又はこれらの組み合わせ）を、対照又は参照抗体と比較して任意の程度又はレベルまで減少させることを含む。例示的な例では、本方法は、対照又は参照抗体と比較して、グリカンを少なくとも又は約１％～約１００％（例えば、少なくとも又は約１％、少なくとも又は約２％、少なくとも又は約３％、少なくとも又は約４％、少なくとも又は約５％、少なくとも又は約６％、少なくとも又は約７％、少なくとも又は約８％、少なくとも又は約９％、少なくとも又は約９．５％、少なくとも又は約９．８％、少なくとも又は約１０％、少なくとも又は約１５％、少なくとも又は約２０％、少なくとも又は約２５％、少なくとも又は約３０％、少なくとも又は約３５％、少なくとも又は約４０％、少なくとも又は約４５％、少なくとも又は約５０％、少なくとも又は約５５％、少なくとも又は約６０％、少なくとも又は約６５％、少なくとも又は約７０％、少なくとも又は約７５％、少なくとも又は約８０％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約１００％）減少させることを含む。例示的な実施形態では、本方法は、対照又は参照抗体と比較して、グリカンを１００％以上、例えば、少なくとも又は約１２５％、少なくとも又は約１５０％、少なくとも又は約１７５％、少なくとも又は約２００％、少なくとも又は約３００％、少なくとも又は約４００％、少なくとも又は約５００％、少なくとも又は約６００％、少なくとも又は約７００％、少なくとも又は約８００％、少なくとも又は約９００％、或いは少なくとも又は約１０００％さえも減少させることを含む。例示的な実施形態では、本方法は、対照又は参照抗体と比較して、グリカンを少なくとも約１．５倍減少させることを含む。例示的な実施形態では、本方法は、対照又は参照抗体と比較して、グリカンを少なくとも約２倍減少させることを含む。例示的な実施形態では、本方法は、対照又は参照抗体と比較して、グリカンを少なくとも約３倍減少させることを含む。例示的な実施形態では、本方法は、対照又は参照抗体と比較して、グリカンを少なくとも約４倍又は約５倍減少させることを含む。例示的な実施形態では、本方法は、対照又は参照抗体と比較して、グリカンを少なくとも約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、又は約１０倍減少させることを含む。例示的な実施形態では、本方法は、対照又は参照抗体と比較して、グリカンを少なくとも約０．５倍～約８倍の範囲内の量だけ減少させることを含む。

【0060】

例示的な態様では、本開示の方法は、抗体のグリカン（例えば、ガラクトシル化グリカン、Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種、非フコシル化グリカン、コアフコース、高マンノースグリカン、Ｍ５高マンノース種、又はこれらの組み合わせ）の量を、総量の少なくとも若しくは約０．５％、少なくとも若しくは約１％、少なくとも若しくは約２％、少なくとも若しくは約３％、少なくとも若しくは約５％、少なくとも若しくは約７％、少なくとも若しくは約１０％、少なくとも若しくは約１５％、少なくとも若しくは約２０％、少なくとも若しくは約２５％、少なくとも若しくは約３０％、少なくとも若しくは約３５％、少なくとも若しくは約４０％、少なくとも若しくは約４５％、少なくとも若しくは約５０％、少なくとも若しくは約５５％、少なくとも若しくは約６０％、少なくとも若しくは約６５％、少なくとも若しくは約７０％、少なくとも若しくは約７５％、少なくとも若しくは約８０％、少なくとも若しくは約８５％、少なくとも若しくは約９０％、少なくとも若しくは約９５％、少なくとも若しくは約９６％、少なくとも若しくは約９７％、又は少なくとも若しくは約９８％調節する（増加又は減少させる）、或いは総量の少なくとも又は約０．５％～９８％の範囲で増加又は減少させることを含む。

【0061】

本開示の方法の例示的な実施形態では、本方法は、抗体の、例えば、末端β－ガラクトース、又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種を含むガラクトシル化グリカンの量を調節して、抗体のＡＤＣＰ活性を調節することを含む。例示的な態様では、本方法は、抗体の、例えば、末端β－ガラクトース、又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種を含むガラクトシル化グリカンの量を増加させて、抗体のＡＤＣＰ活性を増加させることを含む。例示的な例では、本方法は、トラスツズマブの、例えば、末端β－ガラクトースの量、又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種の量を含むガラクトシル化グリカンの量を約１パーセント増加させて、トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を約２．５、約２．８、約２．８８又は約３パーセント増加させることを含む。いくつかの例では、本方法は、トラスツズマブの、例えば、末端β－ガラクトースの量、又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種の量を含むガラクトシル化グリカンの量を約１パーセント増加させて、トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を約２．８８パーセント増加させることを含む。

【0062】

例示的な態様では、本方法は、抗体の、例えば、末端β－ガラクトース、又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種を含むガラクトシル化グリカンの量を減少させて、抗体のＡＤＣＰ活性を減少させることを含む。例示的な例では、本方法は、トラスツズマブの、例えば、末端β－ガラクトースの量、又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種の量を含むガラクトシル化グリカンの量を約１パーセント減少させて、トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を約２．５、約２．８、約２．８８又は約３パーセント減少させることを含む。いくつかの例では、本方法は、トラスツズマブの、例えば、末端β－ガラクトースの量、又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種の量を含むガラクトシル化グリカンの量を約１パーセント減少させて、トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を約２．８８パーセント減少させることを含む。

【0063】

本開示の方法の例示的実施形態では、本方法は、抗体の非フコシル化グリカンの量又は抗体のコアフコースの量を調節して、抗体のＡＤＣＰ活性を調節することを含む。例示的な態様では、本方法は、抗体の非フコシル化グリカンの量を減少させることか、又は抗体のコアフコースの量を増加させることによって、抗体のＡＤＣＰ活性を増加させることを含む。例示的な態様では、本方法は、リツキシマブ抗体の非フコシル化グリカンの量を約１パーセント減少させるか、又はリツキシマブ抗体のコアフコースの量を約１パーセント増加させて、リツキシマブ抗体のＡＤＣＰ活性を約０．５、約０．７、約０．７５、約０．８又は約１パーセント増加させることを含む。いくつかの態様では、本方法は、リツキシマブ抗体の非フコシル化グリカンの量を約１パーセント減少させるか、又はリツキシマブ抗体のコアフコースの量を約１パーセント増加させて、リツキシマブ抗体のＡＤＣＰ活性を約０．７５パーセント増加させることを含む。

【0064】

本開示の方法の他の実施形態では、方法は、抗体の非フコシル化グリカンの量を増加させるか、又はコアフコースの量を減少させることによって、抗体のＡＤＣＰ活性を増加させることを含む。例示的な態様では、本方法は、トラスツズマブ抗体の非フコシル化グリカンの量を約１パーセント増加させるか、又はトラスツズマブ抗体のコアフコースの量を約１パーセント減少させて、トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を約０．５、約０．５６、約０．６又は約１パーセント増加させることを含む。いくつかの態様では、本方法は、トラスツズマブ抗体の非フコシル化グリカンの量を約１パーセント増加させるか、又はトラスツズマブ抗体のコアフコースの量を約１パーセント減少させて、トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を約０．５６パーセント増加させることを含む。

【0065】

他の例示的な態様では、本方法は、抗体の非フコシル化グリカンの量を減少させることか、又は抗体のコアフコースの量を増加させることによって、抗体のＡＤＣＰ活性を減少させることを含む。例示的な態様では、本方法は、トラスツズマブ抗体の非フコシル化グリカンの量を約１パーセント減少させるか、又はトラスツズマブ抗体のコアフコースの量を約１パーセント増加させて、トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を約０．５、約０．５６、約０．６又は約１パーセント減少させることを含む。いくつかの態様では、本方法は、トラスツズマブ抗体の非フコシル化グリカンの量を約１パーセント減少させるか、又はトラスツズマブ抗体のコアフコースの量を約１パーセント増加させて、トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を約０．５６パーセント減少させることを含む。

【0066】

本開示の方法の他の実施形態では、方法は、抗体の非フコシル化グリカンの量を増加させるか、又はコアフコースの量を減少させることによって、抗体のＡＤＣＰ活性を減少させることを含む。例示的な態様では、本方法は、リツキシマブ抗体の非フコシル化グリカンの量を約１パーセント増加させるか、又はリツキシマブ抗体のコアフコースの量を約１パーセント減少させて、リツキシマブ抗体のＡＤＣＰ活性を約０．５、約０．７、約０．７５、約０．８又は約１パーセント減少させることを含む。いくつかの態様では、本方法は、リツキシマブ抗体の非フコシル化グリカンの量を約１パーセント増加させるか、又はリツキシマブ抗体のコアフコースの量を約１パーセント減少させて、リツキシマブ抗体のＡＤＣＰ活性を約０．７５パーセント減少させることを含む。

【0067】

例示的な例において、トラスツズマブ又はリツキシマブ抗体上の調節（増加又は減少）される非フコシル化グリカンには、以下からなる群から選択される１つ以上の非フコシル化グリカンが含まれる：Ａ１Ｇ０、Ａ１Ｇ１、Ａ２Ｇ０、Ａ２Ｇ１ａ、Ａ２Ｇ１ｂ、Ａ２Ｇ２及びＡ１Ｇ１Ｍ５。

【0068】

本開示の方法の例示的な実施形態において、方法は、抗体の、例えば、Ｍ５高マンノース種を含む高マンノースグリカンの量を調節して、抗体、例えば、ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を調節することを含む。いくつかの例では、ＩｇＧ１抗体は、抗ＨＥＲ２抗体又は抗ＣＤ２０抗体である。例示的な態様では、方法は、抗ＨＥＲ２抗体の高マンノースグリカンの量を増加させて、抗体組成物のＡＤＣＰ活性を減少させることか、又は抗ＨＥＲ２抗体の高マンノースグリカンの量を減少させて、抗体組成物のＡＤＣＰ活性を増加させることを含む。例示的な例では、方法は、抗ＣＤ２０抗体の高マンノースグリカンの量を増加させて、抗体組成物のＡＤＣＰ活性を減少させることか、又は抗ＣＤ２０抗体の高マンノースグリカンの量を減少させて、抗体組成物のＡＤＣＰ活性を増加させることを含む。例示的な態様では、ＩｇＧ１抗体（トラスツズマブ又はリツキシマブなど）におけるＡＤＣＰ活性を調節するために増加又は減少させる高マンノースグリカンは、以下からなる群から選択される１つ以上の高マンノース種を含む：ＨＭ５、ＨＭ６、ＨＭ７、ＨＭ８及びＨＭ９。

【0069】

例示的な態様では、方法は、抗体の、例えば、Ｍ５高マンノース種を含む高マンノースグリカンの量を増加させて、抗体のＡＤＣＰ活性を減少させることを含む。例示的な例では、本方法は、ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）の高マンノースグリカン（例えば、Ｍ５高マンノース種を含む）の量を約１パーセント増加させて、ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）のＡＤＣＰ活性を約１％、約１．２％、約１．３１％、約１．５％、約１．７％、約２％、約２．１１％、約２．５％、又は約１％～約２．５％の範囲で減少させることを含む。いくつかの例では、本方法は、ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）の高マンノースグリカン（例えば、Ｍ５高マンノース種を含む）の量を約１パーセント増加させて、ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）のＡＤＣＰ活性を約１．３１％又は約２．１１％減少させることを含む。

【0070】

例示的な態様では、方法は、抗体の、例えば、Ｍ５高マンノース種を含む高マンノースグリカンの量を減少させて、抗体のＡＤＣＰ活性を増加させることを含む。例示的な例では、本方法は、ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）の高マンノースグリカン（例えば、Ｍ５高マンノース種を含む）の量を約１パーセント減少させて、ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）のＡＤＣＰ活性を約１％、約１．２％、約１．３１％、約１．５％、約１．７％、約２％、約２．１１％、約２．５％、又は約１％～約２．５％の範囲で増加させることを含む。いくつかの例では、本方法は、ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）の高マンノースグリカン（例えば、Ｍ５高マンノース種を含む）の量を約１パーセント減少させて、ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）のＡＤＣＰ活性を約１．３１％又は約２．１１％増加させることを含む。

【0071】

本開示の方法の例示的な実施形態では、方法は、ガラクトシル化グリカン（例えば、末端β－ガラクトース、又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種を含む）、非フコシル化グリカン又はコアフコース、並びに／或いは高マンノースグリカン（例えば、Ｍ５高マンノース種を含む）の組み合わせの量を調節して、ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）のＡＤＣＰ活性を調節することを含む。本開示の方法の例示的な実施形態では、方法は、ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）のＡＤＣＰ活性を、（１）抗体中の末端β－ガラクトースの量及び／若しくは抗体のＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種の量、（２）抗体中のコアフコースの量及び／若しくは抗体の非フコシル化種の量、並びに／又は（３）抗体中の高マンノースの量若しくは抗体のＭ５高マンノース種の量を増加若しくは減少させることによって調節することを含む。

【0072】

本開示の方法のいくつかの実施形態では、方法は、ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）のＡＤＣＰ活性を、（１）抗体中の末端β－ガラクトースの量を増加させるか、若しくは抗体のＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種の量を増加させる、（２）抗体中のコアフコースの量を減少させるか、若しくは抗体の非フコシル化種の量を増加させる、並びに／又は（３）抗体中の高マンノースの量を減少させるか、又は抗体のＭ５高マンノース種の量を減少させることによって増加させることを含む。

【0073】

本開示の方法のいくつかの他の実施形態では、方法は、ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）のＡＤＣＰ活性を、（１）抗体中の末端β－ガラクトースの量を減少させるか、若しくは抗体のＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種の量を減少させる、（２）抗体中のコアフコースの量を増加させるか、若しくは抗体の非フコシル化種の量を減少させる、並びに／又は（３）抗体中の高マンノースの量を増加させるか、若しくは抗体のＭ５高マンノース種の量を増加させることによって減少させることを含む。

【0074】

抗体のＡＤＣＰ活性を操作する方法
本明細書で提供される方法にはまた、第２の抗体中のグリカン（例えば、ガラクトシル化グリカン、末端β－ガラクトース、Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種、非フコシル化グリカン、コアフコース、高マンノースグリカン、Ｍ５高マンノース種、又はこれらの組み合わせ）の量を、第１の参照抗体のＡＤＣＰ活性にマッチングするように調節することによって、第１の参照抗体のＡＤＣＰ活性と第２の抗体のＡＤＣＰ活性をマッチングさせる方法が含まれる。例示的な例では、本方法は、第２の抗体中のグリカン（例えば、ガラクトシル化グリカン、末端β－ガラクトース、Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種、非フコシル化グリカン、コアフコース、高マンノースグリカン、Ｍ５高マンノース種、又はこれらの組み合わせ）の量を、第１の参照抗体のＡＤＣＰ活性にマッチングするように調節することによって、第２の抗体のＡＤＣＰ活性を、第１の参照抗体のＡＤＣＰ活性にマッチするように変化させることを含む。例示的な態様では、方法は、本明細書に記載される方法を使用して、第２の抗体及び／又は参照抗体のＡＤＣＰ活性を決定又は測定することを含む。例示的な態様では、参照抗体又は第２の抗体のＡＤＣＰ活性の決定又は測定は、（ｉ）抗体中のグリカン量を調節する前、（ｉｉ）抗体中のグリカン量を調節した後、又は（ｉｉｉ）抗体中のグリカン量を調節する前及び調節した後に行われる。

【0075】

例えば、本開示の方法のいくつかの例示的な実施形態では、方法は、（１）参照抗体又は参照ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；（２）参照抗体と同じ抗体配列を有する第２の抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；並びに（３）第２の抗体のグリカン（例えば、ガラクトシル化グリカン、末端β－ガラクトース、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種、非フコシル化グリカン、コアフコース、高マンノースグリカン、Ｍ５高マンノース種、又はこれらの組み合わせ）の量を、グリカンの量を増加又は減少させた後の第２の抗体のＡＤＣＰ活性が参照抗体と同じであるか、或いは参照抗体の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％若しくは約３５％以内であるか、又は参照抗体の約１％～約３５％の範囲内であるように、増加又は減少させることによって、第２の抗体のＡＤＣＰ活性を変化させる工程によって、参照抗体のＡＤＣＰ活性をマッチングさせることを含む。いくつかの例では、工程１（「参照抗体又は参照ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）は、工程２（「…第２の抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）及び／又は工程３（「第２の抗体のＡＤＣＰ活性を…変化させる」）の前、後若しくは同時に行われ、一方、他の例では、工程２は工程１及び／又は工程３の前、後若しくは同時に行われる。

【0076】

いくつかの実施形態では、方法は、（１）参照トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；（２）参照トラスツズマブ抗体と同じ抗体配列を有する第２の抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；並びに（３）第２の抗体中の末端β－ガラクトースの量を増加させることか、又は第２の抗体のＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種の量を増加させることによって、第２の抗体のＡＤＣＰ活性を増加させる工程であって、第２の抗体中の末端β－ガラクトース、又は第２の抗体のＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種を増加させた後の第２の抗体のＡＤＣＰ活性は、参照抗体と同じであるか、又は参照抗体の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％若しくは約３５％以内であるか、又は参照抗体の約１％～約３５％の範囲内である工程によって、参照トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性をマッチングさせることを含む。いくつかの例では、工程１（「参照トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）は、工程２（「…第２の抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）及び／又は工程３（「第２の抗体のＡＤＣＰ活性を…増加させる」）の前、後若しくは同時に行われ、一方、他の例では、工程２は工程１及び／又は工程３の前、後若しくは同時に行われる。

【0077】

いくつかの他の実施形態では、方法は、（１）参照トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；（２）参照トラスツズマブ抗体と同じ抗体配列を有する第２の抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；並びに（３）第２の抗体中の末端β－ガラクトースの量を減少させることか、又は第２の抗体のＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種の量を減少させることによって、第２の抗体のＡＤＣＰ活性を減少させる工程であって、第２の抗体中の末端β－ガラクトース、又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種を減少させた後の第２の抗体のＡＤＣＰ活性は、参照抗体と同じであるか、又は参照抗体の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％若しくは約３５％以内であるか、又は参照抗体の約１％～約３５％の範囲内である工程によって、参照トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性をマッチングさせることを含む。いくつかの例では、工程１（「参照トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）は、工程２（「…第２の抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）及び／又は工程３（「第２の抗体のＡＤＣＰ活性を…減少させる」）の前、後若しくは同時に行われ、一方、他の例では、工程２は工程１及び／又は工程３の前、後若しくは同時に行われる。

【0078】

いくつかの実施形態では、方法は、（１）参照トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；（２）参照トラスツズマブ抗体と同じ抗体配列を有する第２の抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；並びに（３）第２の抗体中のコアフコースの量を減少させることか、又は第２の抗体の非フコシル化種の量を増加させることによって、第２の抗体のＡＤＣＰ活性を増加させる工程であって、コアフコースを減少させたか、又は非フコシル化種を増加させた後の第２の抗体のＡＤＣＰ活性は、参照抗体と同じであるか、又は参照抗体の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％若しくは約３５％以内であるか、又は参照抗体の約１％～約３５％の範囲内である工程によって、参照トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性をマッチングさせることを含む。いくつかの例では、工程１（「参照トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）は、工程２（「…第２の抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）及び／又は工程３（「第２の抗体のＡＤＣＰ活性を…増加させる」）の前、後若しくは同時に行われ、一方、他の例では、工程２は工程１及び／又は工程３の前、後若しくは同時に行われる。

【0079】

いくつかの実施形態では、方法は、（１）参照トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；（２）参照トラスツズマブ抗体と同じ抗体配列を有する第２の抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；並びに（３）第２の抗体中のコアフコースの量を増加させることか、又は第２の抗体の非フコシル化種の量を減少させることによって、第２の抗体のＡＤＣＰ活性を減少させる工程であって、コアフコースを増加させたか、又は非フコシル化種を減少させた後の第２の抗体のＡＤＣＰ活性は、参照抗体と同じであるか、又は参照抗体の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％若しくは約３５％以内であるか、又は参照抗体の約１％～約３５％の範囲内である工程によって、参照トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性をマッチングさせることを含む。いくつかの例では、工程１（「参照トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）は、工程２（「…第２の抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）及び／又は工程３（「第２の抗体のＡＤＣＰ活性を…減少させる」）の前、後若しくは同時に行われ、一方、他の例では、工程２は工程１及び／又は工程３の前、後若しくは同時に行われる。

【0080】

いくつかの実施形態では、方法は、（１）参照リツキシマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；（２）参照リツキシマブ抗体と同じ抗体配列を有する第２の抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；並びに（３）第２の抗体中のコアフコースの量を増加させることか、又は第２の抗体の非フコシル化種の量を減少させることによって、第２の抗体のＡＤＣＰ活性を増加させる工程であって、コアフコースを増加させたか、又は非フコシル化種を減少させた後の第２の抗体のＡＤＣＰ活性は、参照抗体と同じであるか、又は参照抗体の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％若しくは約３５％以内であるか、又は参照抗体の約１％～約３５％の範囲内である工程によって、参照リツキシマブ抗体のＡＤＣＰ活性をマッチングさせることを含む。いくつかの例では、工程１（「参照リツキシマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）は、工程２（「…第２の抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）及び／又は工程３（「第２の抗体のＡＤＣＰ活性を…増加させる」）の前、後若しくは同時に行われ、一方、他の例では、工程２は工程１及び／又は工程３の前、後若しくは同時に行われる。

【0081】

いくつかの実施形態では、方法は、（１）参照リツキシマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；（２）参照リツキシマブ抗体と同じ抗体配列を有する第２の抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；並びに（３）第２の抗体中のコアフコースの量を減少させることか、又は第２の抗体の非フコシル化種の量を増加させることによって、第２の抗体のＡＤＣＰ活性を減少させる工程であって、コアフコースを減少させたか、又は非フコシル化種を増加させた後の第２の抗体のＡＤＣＰ活性は、参照抗体と同じであるか、又は参照抗体の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％若しくは約３５％以内であるか、又は参照抗体の約１％～約３５％の範囲内である工程によって、参照リツキシマブ抗体のＡＤＣＰ活性をマッチングさせることを含む。いくつかの例では、工程１（「参照リツキシマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）は、工程２（「…第２の抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）及び／又は工程３（「第２の抗体のＡＤＣＰ活性を…減少させる」）の前、後若しくは同時に行われ、一方、他の例では、工程２は工程１及び／又は工程３の前、後若しくは同時に行われる。

【0082】

いくつかの実施形態では、方法は、（１）参照ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）のＡＤＣＰ活性を決定する工程；（２）参照抗体と同じ抗体配列を有する第２の抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；並びに（３）第２の抗体中の高マンノースの量を減少させることか、又は第２の抗体のＭ５高マンノース種の量を減少させることによって、第２の抗体のＡＤＣＰ活性を増加させる工程であって、高マンノース又はＭ５高マンノース種を減少させた後の第２の抗体のＡＤＣＰ活性は、参照抗体と同じであるか、又は参照抗体の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％若しくは約３５％以内であるか、又は参照抗体の約１％～約３５％の範囲内である工程によって、参照ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）のＡＤＣＰ活性をマッチングさせることを含む。いくつかの例では、工程１（「参照ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）は、工程２（「…第２の抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）及び／又は工程３（「第２の抗体のＡＤＣＰ活性を…増加させる」）の前、後若しくは同時に行われ、一方、他の例では、工程２は工程１及び／又は工程３の前、後若しくは同時に行われる。

【0083】

いくつかの実施形態では、方法は、（１）参照ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）のＡＤＣＰ活性を決定する工程；（２）参照抗体と同じ抗体配列を有する第２の抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；並びに（３）第２の抗体中の高マンノースの量を増加させることか、又は第２の抗体のＭ５高マンノース種の量を増加させることによって、第２の抗体のＡＤＣＰ活性を減少させる工程であって、高マンノース又はＭ５高マンノース種を増加させた後の第２の抗体のＡＤＣＰ活性は、参照抗体と同じであるか、又は参照抗体の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％若しくは約３５％以内であるか、又は参照抗体の約１％～約３５％の範囲内である工程によって、参照ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）のＡＤＣＰ活性をマッチングさせることを含む。いくつかの例では、工程１（「参照ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）は、工程２（「…第２の抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）及び／又は工程３（「第２の抗体のＡＤＣＰ活性を…減少させる」）の前、後若しくは同時に行われ、一方、他の例では、工程２は工程１及び／又は工程３の前、後若しくは同時に行われる。

【0084】

参照抗体のＡＤＣＰをマッチングさせる方法に加えて、本明細書で提供される方法にはまた、目的ＡＤＣＰ活性を達成するように、抗体のグリカン（例えば、ガラクトシル化グリカン、末端β－ガラクトース、Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種、非フコシル化グリカン、コアフコース、高マンノースグリカン、Ｍ５高マンノース種、又はこれらの組み合わせ）の量を調節することによって、特定のＡＤＣＰ活性を有する抗体を操作する方法が含まれる。

【0085】

例えば、本開示の方法のいくつかの例示的な実施形態では、方法は、（１）抗体又はＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；（２）目標ＡＤＣＰ活性を決定又は特定する工程；並びに（３）抗体のグリカン（例えば、ガラクトシル化グリカン、末端β－ガラクトース、Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種、非フコシル化グリカン、コアフコース、高マンノースグリカン、Ｍ５高マンノース種、又はこれらの組み合わせ）の量を増加又は減少させることによって、グリカンの量を増加又は減少させた後の抗体のＡＤＣＰ活性が、目標ＡＤＣＰ活性と同じであるか、又は目標ＡＤＣＰ活性の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％若しくは約３５％以内であるか、又は目標ＡＤＣＰ活性の約１％～約３５％の範囲内であるように、抗体のＡＤＣＰ活性を変化させる工程によって、抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）の特定の目標ＡＤＣＰ活性を操作することを含む。いくつかの例では、工程１（「抗体又はＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）は、工程２（「目標ＡＤＣＰ活性を決定又は特定する」）及び／又は工程３（「…抗体のＡＤＣＰ活性を変化させる」）の前、後若しくは同時に行われ、一方、他の例では、工程２は工程１及び／又は工程３の前、後若しくは同時に行われる。

【0086】

いくつかの実施形態では、方法は、（１）トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；（２）目標ＡＤＣＰ活性を決定又は特定する工程；並びに（３）抗体中の末端β－ガラクトースの量を増加させることか、又は抗体のＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種の量を増加させることによって、トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を増加させる工程であって、抗体中の末端β－ガラクトース、又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種を増加させた後のトラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性は、目標ＡＤＣＰ活性と同じであるか、又は目標ＡＤＣＰ活性の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％若しくは約３５％以内であるか、又は目標ＡＤＣＰ活性の約１％～約３５％の範囲内である工程によって、トラスツズマブ抗体の特定の目標ＡＤＣＰ活性を操作することを含む。いくつかの例では、工程１（「トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）は、工程２（「目標ＡＤＣＰ活性を決定又は特定する」）及び／又は工程３（「…トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を増加させる」）の前、後若しくは同時に行われ、一方、他の例では、工程２は工程１及び／又は工程３の前、後若しくは同時に行われる。

【0087】

いくつかの他の実施形態では、方法は、（１）トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；（２）目標ＡＤＣＰ活性を決定又は特定する工程；並びに（３）抗体中の末端β－ガラクトースの量を減少させることか、又は抗体のＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種の量を減少させることによって、トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を減少させる工程であって、抗体中の末端β－ガラクトース、又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種を減少させた後のトラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性は、目標ＡＤＣＰ活性と同じであるか、又は目標ＡＤＣＰ活性の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％若しくは約３５％以内であるか、又は目標ＡＤＣＰ活性の約１％～約３５％の範囲内である工程によって、トラスツズマブ抗体の特定の目標ＡＤＣＰ活性を操作することを含む。いくつかの例では、工程１（「トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）は、工程２（「目標ＡＤＣＰ活性を決定又は特定する」）及び／又は工程３（「…トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を減少させる」）の前、後若しくは同時に行われ、一方、他の例では、工程２は工程１及び／又は工程３の前、後若しくは同時に行われる。

【0088】

いくつかの実施形態では、方法は、（１）トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；（２）目標ＡＤＣＰ活性を決定する又は特定する工程；及び（３）抗体中のコアフコースの量を減少させることか、又は抗体の非フコシル化種の量を増加させることによって、トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を増加させる工程であって、コアフコースを減少させた後、又は非フコシル化種を増加させた後のトラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性は、目標ＡＤＣＰ活性と同じであるか、又は目標ＡＤＣＰ活性の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％若しくは約３５％以内であるか、又は目標ＡＤＣＰ活性の約１％～約３５％の範囲内である工程によって、トラスツズマブ抗体の特定の目標ＡＤＣＰ活性を操作することを含む。いくつかの例では、工程１（「トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）は、工程２（「目標ＡＤＣＰ活性を決定又は特定する」）及び／又は工程３（「…トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を増加させる」）の前、後若しくは同時に行われ、一方、他の例では、工程２は工程１及び／又は工程３の前、後若しくは同時に行われる。

【0089】

いくつかの実施形態では、方法は、（１）トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；（２）目標ＡＤＣＰ活性を決定する又は特定する工程；及び（３）抗体中のコアフコースの量を増加させることか、又は抗体の非フコシル化種の量を減少させることによって、トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を減少させる工程であって、コアフコースを増大させた後、又は非フコシル化種を減少させた後のトラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性は、目標ＡＤＣＰ活性と同じであるか、又は目標ＡＤＣＰ活性の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％若しくは約３５％以内であるか、又は目標ＡＤＣＰ活性の約１％～約３５％の範囲内である工程によって、トラスツズマブ抗体の特定の目標ＡＤＣＰ活性を操作することを含む。いくつかの例では、工程１（「トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）は、工程２（「目標ＡＤＣＰ活性を決定又は特定する」）及び／又は工程３（「…トラスツズマブ抗体のＡＤＣＰ活性を減少させる」）の前、後若しくは同時に行われ、一方、他の例では、工程２は工程１及び／又は工程３の前、後若しくは同時に行われる。

【0090】

いくつかの実施形態では、方法は、（１）リツキシマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；（２）目標ＡＤＣＰ活性を決定又は特定する工程；及び（３）抗体中のコアフコースの量を増加させることか、又は抗体の非フコシル化種の量を減少させることによって、リツキシマブ抗体のＡＤＣＰ活性を増加させる工程であって、コアフコースを増加させた後、又は非フコシル化種を減少させた後のリツキシマブ抗体のＡＤＣＰ活性は、目標ＡＤＣＰ活性と同じであるか、又は目標ＡＤＣＰ活性の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％若しくは約３５％以内であるか、又は目標ＡＤＣＰ活性の約１％～約３５％の範囲内である工程によって、リツキシマブ抗体の特定の目標ＡＤＣＰ活性を操作することを含む。いくつかの例では、工程１（「リツキシマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）は、工程２（「目標ＡＤＣＰ活性を決定又は特定する」）及び／又は工程３（「…リツキシマブ抗体のＡＤＣＰ活性を増加させる」）の前、後若しくは同時に行われ、一方、他の例では、工程２は工程１及び／又は工程３の前、後若しくは同時に行われる。

【0091】

いくつかの実施形態では、方法は、（１）リツキシマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する工程；（２）目標ＡＤＣＰ活性を決定又は特定する工程；及び（３）抗体中のコアフコースの量を減少させることか、又は抗体の非フコシル化種の量を増加させることによって、リツキシマブ抗体のＡＤＣＰ活性を減少させる工程であって、コアフコースを減少させた後、又は非フコシル化種を増加させた後のリツキシマブ抗体のＡＤＣＰ活性は、目標ＡＤＣＰ活性と同じであるか、又は目標ＡＤＣＰ活性の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％若しくは約３５％以内であるか、又は目標ＡＤＣＰ活性の約１％～約３５％の範囲内である工程によって、リツキシマブ抗体の特定の目標ＡＤＣＰ活性を操作することを含む。いくつかの例では、工程１（「リツキシマブ抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）は、工程２（「目標ＡＤＣＰ活性を決定又は特定する」）及び／又は工程３（「…リツキシマブ抗体のＡＤＣＰ活性を減少させる」）の前、後若しくは同時に行われ、一方、他の例では、工程２は工程１及び／又は工程３の前、後若しくは同時に行われる。

【0092】

いくつかの実施形態では、方法は、（１）ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）のＡＤＣＰ活性を決定する工程；（２）目標ＡＤＣＰ活性を決定又は特定する工程；及び（３）抗体中の高マンノースの量を減少させることか、又は抗体のＭ５高マンノース種の量を減少させることによって、ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）のＡＤＣＰ活性を増加させる工程であって、高マンノース又はＭ５高マンノース種を減少させた後のＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）のＡＤＣＰ活性は、目標ＡＤＣＰ活性と同じであるか、又は目標ＡＤＣＰ活性の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％若しくは約３５％以内であるか、又は目標ＡＤＣＰ活性の約１％～約３５％の範囲内である工程によって、ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）の特定の目標ＡＤＣＰ活性を操作することを含む。いくつかの例では、工程１（「ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）は、工程２（「目標ＡＤＣＰ活性を決定又は特定する」）及び／又は工程３（「…ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を増加させる」）の前、後若しくは同時に行われ、一方、他の例では、工程２は工程１及び／又は工程３の前、後若しくは同時に行われる。

【0093】

いくつかの実施形態では、方法は、（１）参照ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）のＡＤＣＰ活性を決定する工程；（２）目標ＡＤＣＰ活性を決定又は特定する工程；及び（３）抗体中の高マンノースの量を増加させることか、又は抗体のＭ５高マンノース種の量を増加させることによって、ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）のＡＤＣＰ活性を減少させる工程であって、高マンノース又はＭ５高マンノース種を増加させた後のＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）のＡＤＣＰ活性は、目標ＡＤＣＰ活性と同じであるか、又は目標ＡＤＣＰ活性の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％若しくは約３５％以内であるか、又は目標ＡＤＣＰ活性の約１％～約３５％の範囲内である工程によって、ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）の特定の目標ＡＤＣＰ活性を操作することを含む。いくつかの例では、工程１（「ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を決定する」）は、工程２（「目標ＡＤＣＰ活性を決定又は特定する」）及び／又は工程３（「…ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性を減少させる」）の前、後若しくは同時に行われ、一方、他の例では、工程２は工程１及び／又は工程３の前、後若しくは同時に行われる。

【0094】

グリカンの調節方法
糖タンパク質、例えば、抗体上の、グリカン（ガラクトシル化グリカン（例えば、末端β－ガラクトース、若しくはＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種を含む）、非フコシル化グリカン又はコアフコースを含有するグリカン、並びに／又は抗体を含む糖タンパク質上の高マンノースグリカン（例えば、Ｍ５高マンノース種を含む）など）の量を調節する好適な方法は、当該技術分野で知られている。例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ２１（５）：２０１６を参照されたい。したがって、いくつかの態様では、グリコシル化コンピテント細胞（これは糖タンパク質、例えば、抗体を、組み換え技術により産生するために使用することができる）は、所望のレベルのグリカンを達成するための特定の条件下で培養される。

【0095】

例えば、国際公開第２０１３／１１４１６４号パンフレット、国際公開第２０１３／１１４２４５号パンフレット、国際公開第２０１３／１１４１６７号パンフレット、国際公開第２０１５１２８７９３号パンフレット、及び国際公開第２０１６／０８９９１９号パンフレットはそれぞれ、グリカン、例えば、ガラクトシル化グリカン（例えば、末端β－ガラクトース、又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種を含む）、非フコシル化グリカン、又はコアフコースを含有するグリカン、並びに／或いは、高マンノースグリカン（例えば、Ｍ５高マンノース種を含む）を調節するのに有用な組み換え細胞培養技術、例えば、全非フコシル化グリカンの割合が増加した糖タンパク質を得る方法（国際公開第２０１３／１１４１６４号パンフレット）、Ｍａｎ５グリカン及び／又は非フコシル化グリカンの割合が増加した糖タンパク質を得る方法（国際公開第２０１３／１１４２４５号パンフレット）、特定量の高マンノースグリカン、非フコシル化グリカン及びＧ０Ｆグリカンを有する糖タンパク質を得る方法（国際公開第２０１３／１１４１６７号パンフレット）；高マンノースグリカン並びに減少したガラクトシル化及び／又は高ガラクトシル化グリカンを有する糖タンパク質を得る方法（国際公開第２０１５／１２８７９３号パンフレット）；並びに組み換えタンパク質上のフコシル化グリカン含有量を操作する方法（国際公開第２０１６／０８９９１９号パンフレット）を教示している。国際公開第２０１３／１１４１６４号パンフレット、国際公開第２０１３／１１４２４５号パンフレット、国際公開第２０１３／１１４１６７号パンフレット、国際公開第２０１５／１２８７９３号パンフレット、及び国際公開第２０１６／０８９９１９号パンフレットによって記載されている細胞培養方法には、特異的グリカンを調節するために、温度、ｐＨなどの１つ以上の細胞培養パラメーターを改変、細胞をマンガンイオン若しくはその塩（例えば、０．３５μＭ～約２０μＭのマンガン）と共に培養、及び／又は細胞を銅（例えば、１０～１００ｐｐｂ）及びマンガン（例えば、５０～１０００ｎＭ）と共に培養することが含まれる。

【0096】

さらに、国際公開第２０１５／１４０７００号パンフレットには、非フコシル化グリカンを増加させるためにベタインの存在下で細胞を培養すること、又はマンノシル化グリカン、ガラクトシル化グリカン及び非フコシル化グリカンの目標値を得るためにマンガン、ガラクトース及びベタインと共に細胞を培養することが記載されている。米国特許出願公開第２０１４／０３５６９１０号明細書は、細胞培養培地処方物中のマンノース対総ヘキソース比を操作することによって、高マンノースグリコフォームを増加させる方法を教示している。Ｐａｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １０８（１０）：２３４８－２３５８（２０１１）は、細胞培養培地の浸透圧レベルを高め、培養期間を延長することによって、高レベルのＭａｎ５グリカンを得ることを教示している。同様に、Ｋｏｎｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６４：２４９－３＋６（２０１２）には、培養培地の浸透圧によって抗体フコース含量を制御する方法が記載されている。Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ８９（２）：１６４－１７７（２００４）は、低グルタミン流加培養を使用することによって、組み換えタンパク質シアリル化を減少させ、高マンノースグリカンを増加させる方法を教示している。国際公開第２０１７／０７９１６５号パンフレットには、ＧＭＤもＦＸも有さないように遺伝子操作された宿主細胞を使用し、この宿主細胞をフコースと共に培養することによって、組み換えタンパク質の非フコシル化又はフコシル化形態を増加又は減少させる方法が記載されている。国際公開第２０１７／１３４６６７号パンフレットには、細胞をニコチンアミド及びフコースと共に培養して、非フコシル化レベルが減少した抗体を産生することが記載されている。Ｓｈａ ｅｔ ａｌ．，ＴＩＢｓ ３４（１０）：８３５－８４６（２０１６）にもまた、グリカンを調節するいくつかの方法、例えば、ウリジン、マンガン、及びガラクトースと共に培養して抗体上のガラクトシル化レベルを増加させること、及びマンノースを炭素源として使用して高マンノースグリコフォームを増加させることを含む方法が概説されている。

【0097】

したがって、本開示の方法は、例示的な態様において、ガラクトシル化グリカン（例えば、末端β－ガラクトース、又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種を含む）、非フコシル化グリカン若しくはコアフコースを含有するグリカン、及び／又は高マンノースグリカン（例えば、Ｍ５高マンノース種を含む）の量を調節するために、上記参考文献又は本明細書に記載の他の参考文献のいずれか１つ以上において教示されている手順、細胞培養培地及び／又は細胞培養条件の１つ以上を採用することを含む。例示的な態様では、方法は、ガラクトシル化グリカン（例えば、末端β－ガラクトース、又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種を含む）、非フコシル化グリカン若しくはコアフコースを含有するグリカン、及び／又は高マンノースグリカン（例えば、Ｍ５高マンノース種を含む）のレベルを調節する条件下、細胞培養培地中で抗体を発現するグリコシル化コンピテント細胞を培養することを含む。例えば、方法は、いくつかの態様では、グリカンレベルを調節する条件下、細胞培養培地中で抗体を発現するグリコシル化コンピテント細胞を培養することを含み、その細胞培養培地は、フコース、又はフコース及びグルコースを含む。

【0098】

細胞培養物中で細胞を維持又は培養することを含む方法において、細胞培養物は、組み換えグリコシル化タンパク質又は抗体産生に好適な任意の組の条件に従って維持され得る。例えば、いくつかの態様では、細胞培養は、特定のｐＨ、温度、細胞密度、培養体積、溶存酸素レベル、圧力、浸透圧などで維持される。例示的な態様において、ＣＯ_２インキュベーター中、標準的な加湿条件下、５％ＣＯ_２で接種前の細胞培養物を振盪する（例えば、７０ｒｐｍで）。例示的な態様では、方法は、グリカンのレベルを調節する条件下、細胞培養培地中で、抗体を発現するグリコシル化コンピテント細胞を培養することを含み、例えば、Ｋｏｎｎｏ ｅｔ ａｌ．（上記）により教示されているように、その細胞培養培地の浸透圧を高めて、抗体の非フコシル化グリカンのレベルを減少させる。例示的な態様では、方法は、グリカンのレベルを調節する条件下、細胞培養培地中で、抗体を発現するグリコシル化コンピテント細胞を培養することを含み、例えば、国際公開第２０１３／１１４１６４号パンフレット、国際公開第２０１３／１１４２４５号パンフレット、国際公開第２０１３／１１４１６７号パンフレット、又は国際公開第２０１５／１２８７９３号パンフレット（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）によって教示されているように、細胞培養物のｐＨ及び温度を調節する。

【0099】

例示的な態様では、本開示の方法は、当該技術分野でよく知られているように、細胞培養培地中のグリコシル化コンピテント細胞を、組み換えグリコシル化タンパク質又は抗体の産生に好適なｐＨ、温度、浸透圧、及び溶存酸素レベルに維持することを含む。例示的な態様では、細胞培養物は、当該技術分野でよく知られているように、細胞増殖に好適な培地中で維持され、且つ／又は任意の好適な供給スケジュールに従って１つ以上のフィード培地が与えられる。

【0100】

例示的な態様では、グリコシル化コンピテント細胞は真核細胞であり、例えば、酵母細胞、糸状菌細胞、原生生物細胞、藻類細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。このような宿主細胞は、当該技術分野で記載されている。例えば、Ｆｒｅｎｚｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４：２１７（２０１３）を参照されたい。例示的な態様では、真核細胞は哺乳動物細胞である。例示的な態様では、哺乳動物細胞は非ヒト哺乳動物細胞である。いくつかの態様では、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及びその誘導体（例えば、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ ｐｒｏ－３）、マウス骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ０、ＧＳ－ＮＳ０、Ｓｐ２／０）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）活性を欠くように操作された細胞（例えば、ＤＵＫＸ－Ｘ１１、ＤＧ４４）、ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞又はその誘導体（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ）、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞）、ヒト子宮頸癌細胞（例えば、ＨｅＬａ）、ヒト骨の骨肉腫上皮細胞Ｕ２－ＯＳ、腺癌ヒト肺胞基底上皮細胞Ａ５４９、ヒト線維肉腫細胞ＨＴ１０８０、マウス脳腫瘍細胞ＣＡＤ、胚性癌腫細胞Ｐ１９、マウス胚性繊維芽細胞ＮＩＨ ３Ｔ３、マウス繊維芽細胞Ｌ９２９、マウス神経芽腫細胞Ｎ２ａ、ヒト乳癌細胞ＭＣＦ－７、網膜芽腫細胞Ｙ７９、ヒト網膜芽腫細胞ＳＯ－Ｒｂ５０、ヒト肝臓癌細胞Ｈｅｐ Ｇ２、マウスＢ骨髄腫細胞Ｊ５５８Ｌ又は新生児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞（Ｇａｉｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．２００７；Ｋｈａｎ，Ａｄｖ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ ３（２）：２５７－２６３（２０１３））である。

【0101】

グリコシル化にコンピテントではない細胞はまた、例えば、グリコシル化に必要な関連酵素をコードする遺伝子をそれらに導入することによって、グリコシル化コンピテント細胞に形質転換され得る。例示的な酵素としては、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、グリコシダーゼ、グルコシダーゼＩ、グルコシダーゼＩＩ、カルネキシン／カルレティキュリン、グリコシルトランスフェラーゼ、マンノシダーゼ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びシアリルトランスフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。

【0102】

さらなる又は代替の態様において、抗体を組み換え技術により産生するグリコシル化コンピテント細胞は、抗体のグリカン（ガラクトシル化グリカン（例えば、末端β－ガラクトース、又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種を含む）、非フコシル化グリカン若しくはコアフコースを含有するグリカン、及び／又は高マンノースグリカン（例えば、Ｍ５高マンノース種を含む）など）を調節するように遺伝子操作される。例示的な態様では、グリコシル化コンピテント細胞は、デノボ経路又はサルベージ経路の酵素の活性を変えるように遺伝子操作される。任意選択により、グリコシル化コンピテント細胞は、ＧＤＰ－ケト－６－デオキシマンノース－３，５－エピメラーゼ、４－レダクターゼをコードする遺伝子をノックアウトするように遺伝子操作される。例示的な実施形態では、グリコシル化コンピテント細胞は、デノボ経路又はサルベージ経路の酵素の活性を変えるように遺伝子操作される。フコース代謝のこれらの２つの経路は当該技術分野でよく知られており、図１Ｃに示す。例示的な実施形態では、グリコシル化コンピテント細胞は、フコシル－トランスフェラーゼ（ＦＵＴ、例えば、ＦＵＴ１、ＦＵＴ２、ＦＵＴ３、ＦＵＴ４、ＦＵＴ５、ＦＵＴ６、ＦＵＴ７、ＦＵＴ８、ＦＵＴ９）、フコースキナーゼ、ＧＤＰ－フコースピロホスホリラーゼ、ＧＤＰ－Ｄ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ（ＧＭＤ）、及びＧＤＰ－ケト－６－デオキシマンノース－３，５－エピメラーゼ、４－レダクターゼ（ＦＸ）のいずれか１つ以上の活性を変えるように遺伝子操作される。例示的な実施形態では、グリコシル化コンピテント細胞は、ＦＸをコードする遺伝子をノックアウトするように遺伝子操作される。例示的な実施形態では、グリコシル化コンピテント細胞は、β（１，４）－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧＮＴＩＩＩ）及び／又はＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソ－４－ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）の活性を変えるように遺伝子操作される。例示的な態様では、グリコシル化コンピテント細胞は、ＧＮＴＩＩＩ及び／又はＲＭＤを過剰発現するように遺伝子操作される。例示的な実施形態では、グリコシル化コンピテント細胞は、改変されたベータ－ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するように遺伝子操作される。いくつかの実施形態では、グリコシル化コンピテント細胞は、ＧＤＰ－ケト－６－デオキシマンノース－３，５－エピメラーゼ、４－レダクターゼ、β１－４ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び／又はβ１－４Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現レベルを調節するように遺伝子操作される。

【0103】

当該技術分野においては、Ｆｃ含有分子、例えば、抗体の、フコシル化を減少又はなくすためのいくつかの方法が知られている。これらには、ＦＵＴ８ノックアウト細胞株、変異型ＣＨＯ株Ｌｅｃ１３、ラットハイブリドーマ細胞株ＹＢ２／０、ＦＵＴ８遺伝子に対し特異的な低分子干渉ＲＮＡを含む細胞株、及びβ－１，４－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ及びゴルジα－マンノシダーゼＩＩを共発現する細胞株を含む特定の哺乳動物細胞株における組み換え発現が含まれる。或いは、Ｆｃ含有分子を、植物細胞、酵母、又は原核細胞（例えば、Ｅ，コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））などの非哺乳動物細胞において発現し得る。

【0104】

例示的な態様では、目標グリカン量は、抗体の産生後の化学的処理又は酵素による処理によって達成される。例示的な態様では、本開示の方法は、抗体が組み換え技術により産生された後に、抗体を化学的に又は酵素により処理することを含む。例示的な態様では、化学薬品又は酵素は、Ｅｎｄｏ－Ｓ、Ｅｎｄｏ－Ｓ２、Ｅｎｄｏ－Ｄ、Ｅｎｄｏ－Ｍ、Ｅｎｄｏ－ＬＬ、α－フコシダーゼ、β－（１－４）－ガラクトシダーゼ、Ｅｎｄｏ－Ｈ、Ｅｎｄｏ－Ｆ１、Ｅｎｄｏ－Ｆ２、Ｅｎｄｏ－Ｆ３、β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ、キフネンシン、及びＰＮＧアーゼ－Ｆからなる群から選択される。例示的な態様では、化学薬品又は酵素を抗体と様々な時間インキュベートして、種々の量のグリカンを有する抗体を生成する。いくつかの態様では、抗体を、実施例に記載するように、β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼとインキュベートする。いくつかのさらなる態様では、種々のレベルのガラクトースを有する抗体は、抗体をβ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼと一定時間、例えば、以下に限定されないが、約１０分、約２０分、約３０分、約１時間、約２時間、約４時間、約９時間、又は約１０分～約９時間の範囲内の時間、インキュベートすることによって生成され得る。

【0105】

グリカンの測定方法
糖タンパク質含有組成物中に存在するグリコフォーム、例えば、抗体を評価するため、又は糖タンパク質を含む特定の試料のグリコフォームプロファイルを決定、検出若しくは測定するための様々な方法が、当該技術分野で知られている。好適な方法としては、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）、液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ）、陽イオンＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析、陰イオンＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析、ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換（ＷＡＸ）クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー（ＮＰ－ＨＰＬＣ）、エキソグリコシダーゼ消化、バイオゲルＰ－４クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー及び一次元ＮＭＲ分光法、並びにこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｐａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，２０１６，Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．５ ｐａｇｅｓ １１８１－１１９２、Ｓｈａｈ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．（２０１４）２５：９９９、Ｍａｔｔｕ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ ２７３：２２６０－２２７２（１９９８）、Ｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２９９（Ｐｔ １）：２６１－２７５（１９９４）、Ｙｏｏ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ２（３）：３２０－３３４（２０１０）、Ｗｕｈｒｅｒ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ，２００５，Ｖｏｌ．８２５，Ｉｓｓｕｅ ２，ｐａｇｅｓ １２４－１３３、Ｒｕｈａａｋ Ｌ．Ｒ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ，２０１０，Ｖｏｌ．３９７：３４５７－３４８１、Ｋｕｒｏｇｏｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ １０（７）：ｅ０１３２８４８；ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１３２８４８、Ｔｈｏｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ １０（８）：ｅ０１３４９４９．Ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１３４９４９、Ｐａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．３２（５）：１１８１－１１９２（２０１６）、及びＧｅｏｆｆｒｅｙ，Ｒ．Ｇ．ｅｔ．ａｌ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９６，Ｖｏｌ．２４０，ｐａｇｅｓ２１０－２２６を参照されたい。また、本明細書中に示す例は、抗体などの糖タンパク質含有組成物中に存在するグリコフォームを評価するのに好適な方法を記載する。

【0106】

対照
本明細書に記載するように、本開示の方法のいくつかは、「対照」又は「参照抗体」と比較して、そのような方法によってもたらされる調節（例えば、増加又は減少）を挙げる。例示的な態様では、ＡＤＣＰ活性又はグリカンの量に関して、「対照」は、最初に測定又は決定されたときの抗体又は組成物（例えば、参照抗体）のＡＤＣＰ活性レベル及び／又はグリカン量などの、ＡＤＣＰ活性の調節及び／又はグリカンプロファイルの調節に向けた実験的介入の前の、抗体又は組成物（例えば、参照抗体）のＡＤＣＰ活性レベル及び／又はグリカン量である。特定の態様では、「対照」又は「参照抗体」は、ＡＤＣＰ活性の調節及び／又はグリカンプロファイルの調節に向けた有意な実験的介入を受けたが、ＡＤＣＰ活性及び／又はグリカンプロファイルのさらなる調節が所望される抗体であり得る。これらの例では、「対照」は、ＡＤＣＰ活性のさらなる調節及び／又はグリカンプロファイルのさらなる調節に向けたさらなる実験的介入の前の抗体又は組成物（例えば、参照抗体）のＡＤＣＰ活性のレベル及び／又はグリカン量である。

【0107】

抗体、断片及びタンパク質産物
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、重及び軽鎖を含み、且つ可変及び定常領域を含む、従来の免疫グロブリン構成を有するタンパク質を指す。例えば、抗体は、２つの同一のペアのポリペプチド鎖からなる「Ｙ字型」構造であり、各ペアは１本の「軽」鎖（通常、分子量が約２５ｋＤａである）及び１本の「重」鎖（通常、分子量が約５０～７０ｋＤａである）を有する、ＩｇＧであり得る。抗体は、可変領域及び定常領域を有する。ＩｇＧ型では、可変領域は、一般に、約１００～１１０又はそれを超えるアミノ酸であり、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、主に抗原認識に関与し、異なる抗原に結合する他の抗体と実質的に異なる。例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，４^ｔｈｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．／Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，（１９９９）を参照されたい。

【0108】

「抗体断片」又は「その抗体断片」という用語は、完全な抗体の一部を指す。「抗原結合断片」又は「その抗原結合断片」は、抗原に結合する完全な抗体の一部を指す。抗原結合断片は、完全な抗体の抗原決定可変領域を含み得る。抗体断片の抗原結合断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、線形抗体、ｓｃＦｖ、並びに一本鎖抗体が含まれるが、これらに限定されない。

【0109】

本明細書で使用される用語「ＩｇＧ」は、認識される免疫グロブリンγ遺伝子によって実質的にコードされる抗体のクラスに属するポリペプチドを指す。ヒトでは、このクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む。マウスでは、このクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３を含む。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の重鎖の配列は、多くの配列データベースにおいて見出すことができ、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）において、アクセッション番号Ｐ０１８５７（ＩＧＨＧ１＿ＨＵＭＡＮ）、Ｐ０１８５９（ＩＧＨＧ２＿ＨＵＭＡＮ）、Ｐ０１８６０（ＩＧＨＧ３＿ＨＵＭＡＮ）及びＰ０１８６１（ＩＧＨＧ１＿ＨＵＭＡＮ）でそれぞれ見出すことができる。好ましい実施形態では、本明細書に開示する方法及び抗体は、ＩｇＧ１抗体に関する。いくつかの他の好ましい実施形態では、本明細書に開示する方法及び抗体は、ヒトＩｇＧ１抗体に関する。

【0110】

用語「ＣＤＲ」及びその複数形である「ＣＤＲｓ」は、相補性決定領域を指し、そのうちの３つが軽鎖可変領域の結合特性を構成し（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３）、３つが重鎖可変領域の結合特性を構成する（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３）。ＣＤＲは、抗体と抗原との特異的相互作用を担う残基の大部分を含み、したがって抗体分子の機能的活性に寄与する。ＣＤＲは、抗原特異性の主要な決定基である。

【0111】

ＣＤＲの境界及び長さの厳密な定義は、各種の分類及び付番方式に従う。したがって、ＣＤＲは、本明細書に記載される付番方式を含む、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、接触又は任意の他の境界定義によって表わされ得る。境界が異なっていても、これらの方式の各々は、可変配列内のいわゆる「超可変領域」を構成する部分においてある程度の重複を有する。したがって、これらの方式によるＣＤＲの定義は、長さ及び隣接するフレームワーク領域に関する境界領域が相違する場合がある。例えば、Ｋａｂａｔ（異種間の配列可変性に基づく手法）、Ｃｈｏｔｈｉａ（抗原－抗体複合体の結晶学的研究に基づく手法）及び／又はＭａｃＣａｌｌｕｍを参照されたい（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，前掲；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，１９８７，１９６：９０１－９１７；及びＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６２：７３２）。抗原結合部位の特性決定のためのさらに別の基準は、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって用いられるＡｂＭ定義である。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ．Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ（Ｅｄ．：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を参照されたい。２つの残基同定技法が、重複するが、同一ではない領域を定義する限り、それらを組み合わせてハイブリッドＣＤＲを定義することができる。しかしながら、いわゆるＫａｂａｔ方式による付番が好ましい。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，１９８７，１９６：９０１、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４２：８７７、Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６３：８００、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｅｄｓ．Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８８を参照されたい。各文献は参照により本明細書に組み込まれる。

【0112】

用語「可変」は、配列内で可変性を示し、特定の抗体の特異性及び結合親和性の決定に関与する、抗体又は免疫グロブリンドメインの一部分（すなわち「可変ドメイン」）を指す。可変重鎖（ＶＨ）と可変軽鎖（ＶＬ）が対合し、共に単一の抗原結合部位を形成する。

【0113】

可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布しているのではなく、重鎖及び軽鎖可変領域の各々のサブドメインに集中している。これらのサブドメインは、「超可変領域」又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる。可変ドメインのより保存的な（すなわち非超可変）部分は、「フレームワーク」領域（ＦＲＭ又はＦＲ）と呼ばれ、抗原結合表面を形成する三次元空間内における６つのＣＤＲのための足場を提供する。天然に存在する重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、大部分がβシート配置をとる４つのＦＲＭ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）をそれぞれ含み、これらは、ループ接続を形成し、場合によりβシート構造の一部を形成する３つの超可変領域によって接続される。各鎖の超可変領域は、ＦＲＭによって近接して一体に保持されており、他の鎖の超可変領域と共に抗原結合部位の形成に寄与する（前掲のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．を参照されたい）。

【0114】

本明細書で使用される用語「Ｆｃドメイン」、「Ｆｃ領域」、及び「ＩｇＧ Ｆｃドメイン」は、免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ分子のパパイン消化によって得られる結晶性断片と相関するＩｇＧ分子の一部分を指す。Ｆｃ領域は、ジスルフィド結合によって連結されたＩｇＧ分子の２本の重鎖のＣ末端側半分を含む。それは抗原結合活性を有さないが、炭水化物部分と、補体受容体及びＦｃ受容体、例えばＦｃＲｎ受容体、に結合する部位とを含む。例えば、Ｆｃドメインは、第２の定常ドメインＣＨ２全体（ヒトＩｇＧ１のＥＵ位置２３１～３４０の残基）及び第３の定常ドメインＣＨ３（ヒトＩｇＧ１のＥＵ位置３４１～４４７の残基）を含む。

【0115】

Ｆｃは、単離されたこの領域、又は抗体若しくは抗体断片と関連したこの領域を指し得る。多型は、Ｆｃドメイン中の多くの位置で、例えば、以下に限定されないが、ＥＵ位置２７０、２７２、３１２、３１５、３５６、及び３５８で、観察されている。したがって、「野生型ＩｇＧ Ｆｃドメイン」又は「ＷＴ ＩｇＧ Ｆｃドメイン」は、天然に存在するＩｇＧ Ｆｃ領域（すなわち、いずれかのアレル）を指す。Ｍｙｒｉａｄ Ｆｃ変異体、Ｆｃ断片、Ｆｃバリアント、及びＦｃ誘導体は、例えば、米国特許第５，６２４，８２１号明細書、同第５，８８５，５７３号明細書、同第５，６７７，４２５号明細書、同第６，１６５，７４５号明細書、同第６，２７７，３７５号明細書、同第５，８６９，０４６号明細書、同第６，１２１，０２２号明細書、同第５，６２４，８２１号明細書、同第５，６４８，２６０号明細書、同第６，５２８，６２４号明細書、同第６，１９４，５５１号明細書、同第６，７３７，０５６号明細書、同第７，１２２，６３７号明細書、同第７，１８３，３８７号明細書、同第７，３３２，５８１号明細書、同第７，３３５，７４２号明細書、同第７，３７１，８２６号明細書、同第６，８２１，５０５号明細書、同第６，１８０，３７７号明細書、同第７，３１７，０９１号明細書、同第７，３５５，００８号明細書、米国特許出願公開第２００４／０００２５８７号明細書、並びに国際公開第９９／０５８５７２号パンフレット、国際公開第２０１１／０６９１６４号パンフレット、及び国際公開第２０１２／００６６３５号パンフレットに記載されている。

【0116】

Ｆｃ領域は一般に、抗原結合後に生じる抗体エフェクター機能を決定する。Ｃ１ｑなどの自然免疫系のほか、Ｆｃγ受容体との結合相互作用を介して細胞傷害性細胞や抗原提示細胞の分子を動員することができる。ＩｇＧ Ｆｃ領域は、Ａｓｎ２９７に２つの保存されたＮ－グリコシル化部位（各重鎖に１つ）を含む（Ｐ．Ｍ．Ｒｕｄｄ．Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９１（２００１），ｐｐ．２３７０－２３７６を参照）。ＡＳＮ２９７における構造グリカンの変動は、ＩｇＧと免疫系との相互作用に影響する構造の微妙な変化をもたらす。例えば、Ｆｃ領域グリカンは、Ｆｃ領域の構造を変化させることによって（Ｓ．Ｋｒａｐｐ，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ－Ｆｃ ｇｌｙｃｏｆｏｒｍｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３２５（２００３）；９７９－９８９３１、Ｙ．Ｍｉｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｏｆ ＩｇＧ１－Ｆｃ ｉｎ Ｆｃ ＲＩＩｂ ｂｉｎｄｉｎｇ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（２００１），４５５３９－４５５４７を参照）、又はグリカン－グリカンの相互作用によって（Ｃ．Ｆｅｒｒａｒａ，ｅｔ ａｌ．Ｕｎｉｑｕｅ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｆｃ（ＲＩＩＩ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｌａｃｋｉｎｇ ｃｏｒｅ ｆｕｃｏｓｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０８（２０１１），１２６６９－１２６７４を参照）、Ｆｃγ受容体に対するＩｇＧの親和性に直接影響を及ぼし、その結果として、それらの免疫エフェクター細胞を動員する能力に強く影響し得る。また、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ：ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｏｐｔｉｍａｌ ａｎｄ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｄｒｕｇｓ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ，（２１）５（２０１６）７４０－７６５を参照されたい。

【0117】

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体、すなわち少量存在する可能性がある、考えられる天然に存在する変異及び／又は翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除いて同一である集団を含む個々の抗体を指す。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、異なる決定基（又はエピトープ）に対して誘導された異なる抗体を通常含む従来の（ポリクローナル）抗体製剤とは対照的に、抗原上の単一の抗原部位又は決定基に対して誘導される。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養によって合成されるため、他の免疫グロブリンが混入しない点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。

【0118】

モノクローナル抗体の調製には、連続細胞株培養物によって作製される抗体を提供する任意の技法を用いることができる。例えば、使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作られ得、又は組み換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照）によって作られ得る。ヒトモノクローナル抗体を作製するさらなる技法の例としては、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４（１９８３），７２）及びＥＢＶ－ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５），７７－９６）が挙げられる。

【0119】

次に、ハイブリドーマを、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）及び表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））分析などの標準的な方法を使用してスクリーニングして、指定の抗原に特異的に結合する抗体を産生する１つ以上のハイブリドーマを同定することができる。例えば、組み換え抗原、天然に存在する形態、その任意のバリアント又は断片並びにその抗原性ペプチドなど、任意の形態の関連抗原が免疫原として使用され得る。ＢＩＡｃｏｒｅシステムで採用されている表面プラズモン共鳴を使用して、標的抗原のエピトープにファージ抗体が結合する効率を高めることができる（Ｓｃｈｉｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ７（１９９６），９７－１０５、Ｍａｌｍｂｏｒｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３（１９９５），７－１３）。

【0120】

モノクローナル抗体を作製する別の例示的な方法としては、タンパク質発現ライブラリ、例えばファージディスプレイ又はリボソームディスプレイライブラリのスクリーニングが挙げられる。ファージディスプレイについては、例えば、Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，２２３，４０９号明細書、Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５－１３１７、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１－５９７（１９９１）に記載されている。

【0121】

ディスプレイライブラリの使用に加えて、関連抗原を使用して、非ヒト動物、例えば齧歯類（マウス、ハムスター、ウサギ又はラットなど）を免疫化することができる。一実施形態では、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。例えば、マウス抗体産生が欠損したマウス系統を、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）遺伝子座の大きい断片を用いて改変することが可能である。ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する遺伝子由来の抗原特異的モノクローナル抗体を作製し、選択し得る。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３－２１、米国特許出願公開第２００３－００７０１８５号明細書、国際公開第９６／３４０９６号パンフレット及び国際公開第９６／３３７３５号パンフレットを参照されたい。

【0122】

モノクローナル抗体は、非ヒト動物から得た後、当該技術分野で知られる組み換えＤＮＡ技術を用いて、例えばヒト化、脱免疫、キメラ化などの改変を行うこともできる。改変抗体コンストラクトの例としては、非ヒト抗体のヒト化バリアント、「親和性成熟」抗体（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４，８８９－８９６（１９９２）及びＬｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０，１０８３２－１０８３７（１９９１）を参照）及びエフェクター機能が改変された抗体変異体（例えば、米国特許第５，６４８，２６０号明細書、前掲のＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｅｂｅｌ（２０１０）及び前掲のＬｉｔｔｌｅ（２００９）を参照）が挙げられる。

【0123】

本発明に記載のモノクローナル抗体としては、重鎖及び／若しくは軽鎖の一部が特定の種に由来するか、又は特定の抗体のクラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一若しくは相同である一方、鎖の残部は、所望の生物活性を示す限り、別の種に由来するか、又は別の抗体のクラス若しくはサブクラスに属する抗体並びにそのような抗体の断片中の対応する配列と同一若しくは相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）（米国特許第４，８１６，５６７号明細書、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４））が挙げられる。本明細書における目的のキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）に由来する可変ドメイン抗原結合配列及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体が含まれる。キメラ抗体を作製するための様々な手法が記載されている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１，１９８５、Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２，１９８５、Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｂｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，３９７号明細書；Ｔａｎａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，欧州特許第０１７１４９６号明細書；欧州特許第０１７３４９４号明細書；及び英国特許第２１７７０９６号明細書を参照されたい。

【0124】

ヒト化抗体はまた、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子を発現するが、内在性のマウス免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子を発現することができないマウスなどのトランスジェニック動物を用いて作製され得る。Ｗｉｎｔｅｒは、本明細書に記載されるヒト化抗体の調製に使用され得る例示的なＣＤＲ移植法を記載している（米国特許第５，２２５，５３９号明細書）。特定のヒト抗体のＣＤＲの全ては、非ヒトＣＤＲの少なくとも一部分で置換されるか又はＣＤＲの一部のみが非ヒトＣＤＲで置換され得る。所定の抗原に対するヒト化抗体の結合に必要とされる数のＣＤＲを置換することのみが必要である。

【0125】

ヒト化抗体は、保存的置換、コンセンサス配列置換、生殖細胞系列置換及び／又は復帰変異の導入によって最適化することができる。このような改変免疫グロブリン分子は、当該技術分野で知られる複数の技術のいずれかによって作製することができる（例えば、Ｔｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：７３０８－７３１２，１９８３、Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，４：７２７９，１９８３、Ｏｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９２：３－１６，１９８２、及び欧州特許第０２３９４００号明細書）。

【0126】

「ヒト抗体」という用語には、例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）（前掲）によって記載されているものを含む、当該技術分野で知られるヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に実質的に対応する、可変及び定常領域又はドメインなどの抗体領域を有する抗体を含む。本発明のヒト抗体、抗体コンストラクト又は結合ドメインは、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム変異誘発若しくは部位特異的変異誘発により、又はインビボでの体細胞変異により導入される変異）を、例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３に含み得る。ヒト抗体、抗体コンストラクト又は結合ドメインは、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基で置換された少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれを超える位置を有し得る。本明細書で使用されるヒト抗体、抗体コンストラクト及び結合ドメインの定義は、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅなどの技術又はシステムを使用することによって得ることができる、非人為的且つ／又は遺伝的に改変された抗体のヒト配列のみを含む完全ヒト抗体も意図している。

【0127】

有利には、本明細書に記載の方法は、Ｆｃドメインを含む抗体、及び例示的な例ではＩｇＧ１抗体に関する。例示的な実施形態では、抗体は、特定の抗体配列を有するＩｇＧ１抗体である。「抗体配列」という用語は、抗体のアミノ酸配列を指す。本明細書中で使用される句「参照抗体と同じ配列を有する」は、参照抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）、可変重鎖（ＶＨ）及び／又は可変軽鎖（ＶＬ）のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する抗体を指す。好ましい実施形態では、本明細書で使用される「参照抗体と同じ配列を有する」抗体は、参照抗体のＣＤＲ、ＶＨ及びＶＬ配列と同じＣＤＲ、ＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を有する抗体を指す。

【0128】

例示的な態様では、ＩｇＧ１抗体は、抗ＥＧＦＲ抗体、例えば、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体である。例示的な態様では、ＩｇＧ１抗体は、トラスツズマブ、又はそのバイオシミラーである。トラスツズマブという用語は、表１に列挙される、すなわち配列番号１～８、２１又は２２に記載されるＶＨ及びＶＬ、又はＶＨ－ＩｇＧ１及びＶＬ－ＩｇＧカッパ配列を含む、ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原に結合するＩｇＧ１カッパヒト化モノクローナル抗体を指す（ＣＡＳ番号：１８０２８８－６９－１；ＤｒｕｇＢａｎｋ－ＤＢ０００７２；Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ）ｅｎｔｒｙ Ｄ０３２５７を参照）。

【0129】

【表1】

【0130】

トラスツズマブ抗体は、いくつかの例では、（ａ）（ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１配列、（ｉｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２配列、及び（ｉｉｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン、並びに（ｂ）（ｉ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１配列、（ｉｉ）配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２配列、及び（ｉｉｉ）配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメインを含む。

【0131】

代替の態様では、ＩｇＧ１抗体は、抗ＣＤ２０抗体、例えば、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。代替の態様では、ＩｇＧ１抗体は、リツキシマブ、又はそのバイオシミラーである。リツキシマブという用語は、表２に列挙される、すなわち配列番号１１～１８、２３又は２４に記載されるＶＨ及びＶＬ、又はＶＨ－ＩｇＧ１及びＶＬ－ＩｇＧカッパ配列を含む、ＣＤ２０抗原に結合するＧ１カッパキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体を指す（ＣＡＳ番号：１７４７２２－３１－７；ＤｒｕｇＢａｎｋ－ＤＢ０００７３；Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ）ｅｎｔｒｙ Ｄ０２９９４を参照）。

【0132】

【表2】

【0133】

リツキシマブ抗体は、いくつかの例では、（ａ）（ｉ）配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１配列、（ｉｉ）配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２配列、及び（ｉｉｉ）配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン、並びに（ｂ）（ｉ）配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１配列、（ｉｉ）配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２配列、及び（ｉｉｉ）配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３配列を含む重鎖可変ドメインを含む。

【0134】

追加の工程
本明細書に開示する方法は、様々な態様において、追加の工程を含む。例えば、いくつかの態様では、本方法は、組み換えタンパク質（例えば、抗体）を産生し、精製し、製剤化することに関与する１つ以上の上流工程又は下流工程を含む。例示的な実施形態では、本方法は、組み換えグリコシル化タンパク質（例えば、抗体）を発現する宿主細胞を作製するための工程を含む。宿主細胞は、いくつかの態様では、原核宿主細胞、例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）若しくはバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）であるか、又は宿主細胞は、いくつかの態様では、真核宿主細胞、例えば、酵母細胞、糸状菌細胞、原生動物細胞、昆虫細胞、若しくは哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）である。このような宿主細胞は、当該技術分野で記載されている。例えば、Ｆｒｅｎｚｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４：２１７（２０１３）及び本明細書の「細胞」の節を参照されたい。例えば、本方法は、いくつかの例では、組み換えタンパク質又はそのポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むベクターを宿主細胞に導入することを含む。

【0135】

例示的な実施形態では、本明細書で開示する方法は、培養物から組み換えタンパク質（例えば、組み換え抗体）を単離及び／又は精製するための工程を含む。例示的な態様では、本方法は、以下に限定されないが、例えば、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー、及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む１つ以上のクロマトグラフィー工程を含む。例示的な態様において、本方法は、組み換えタンパク質を含む溶液から結晶性生体分子を生成させるための工程を含む。

【0136】

本開示の方法は、様々な態様において、組成物、例えば、いくつかの態様では、精製組み換えタンパク質を含む医薬組成物、を調製するための１つ以上の工程を含む。このような組成物について、以下で説明する。

【0137】

組成物
本明細書に記載される方法によって生成される組み換えグリコシル化タンパク質及び抗体を含む組成物もまた、本明細書において提供される。例示的な実施形態では、組成物は、抗体中のグリカン（例えば、ガラクトシル化グリカン、末端β－ガラクトース、Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種、非フコシル化グリカン、コアフコース、高マンノースグリカン、Ｍ５高マンノース種、又はこれらの組み合わせ）の量を調節する方法によって調製される。例示的な態様では、組み換えグリコシル化タンパク質は抗体である。したがって、ＡＤＣＰ活性が増加又は減少したＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブ抗体）を含み、このＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブ抗体）は、ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブ抗体）上のグリカン（例えば、ガラクトシル化グリカン、末端β－ガラクトース、Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種、非フコシル化グリカン、コアフコース、高マンノースグリカン、Ｍ５高マンノース種、又はこれらの組み合わせ）の量を調節する（例えば、増加又は減少させる）ことによって、特定のＡＤＣＰ活性又は対照若しくは参照抗体と比較して増加若しくは減少したＡＤＣＰ活性を有するように操作されている、抗体組成物が本明細書において提供される。

【0138】

いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載される方法によって生成されるＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブ抗体）を含み、このＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブ抗体）は参照ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブ抗体）と比較して増加又は減少したＡＤＣＰ活性を有し、その参照ＩｇＧ１抗体は増加又は減少したＡＤＣＰ活性を有するＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブ抗体）と同じ抗体配列を有する。

【0139】

したがって、例示的な実施形態では、本開示の抗体組成物は、対照又は参照抗体と比較して任意の程度又はレベルにまでＡＤＣＰ活性が増加している。例示的な例では、本明細書の方法を使用した、本明細書に開示する抗体組成物のＡＤＣＰ活性の増加は、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも又は約１％～約１００％の増加（例えば、少なくとも又は約１％の増加、少なくとも又は約２％の増加、少なくとも又は約３％の増加、少なくとも又は約４％の増加、少なくとも又は約５％の増加、少なくとも又は約６％の増加、少なくとも又は約７％の増加、少なくとも又は約８％の増加、少なくとも又は約９％の増加、少なくとも又は約９．５％の増加、少なくとも又は約９．８％の増加、少なくとも又は約１０％の増加、少なくとも又は約１５％の増加、少なくとも又は約２０％の増加、少なくとも又は約２５％の増加、少なくとも又は約３０％の増加、少なくとも又は約３５％の増加、少なくとも又は約４０％の増加、少なくとも又は約４５％の増加、少なくとも又は約５０％の増加、少なくとも又は約５５％の増加、少なくとも又は約６０％の増加、少なくとも又は約６５％の増加、少なくとも又は約７０％の増加、少なくとも又は約７５％の増加、少なくとも又は約８０％の増加、少なくとも又は約８５％の増加、少なくとも又は約９０％の増加、少なくとも又は約９５％の増加、少なくとも又は約１００％の増加）である。例示的な実施形態では、本明細書の方法を使用した、本明細書に開示する抗体組成物のＡＤＣＰ活性の増加は、対照又は参照抗体のレベルと比較して、１００％超、例えば、少なくとも又は約１２５％、少なくとも又は約１５０％、少なくとも又は約１７５％、少なくとも又は約２００％、少なくとも又は約３００％、少なくとも又は約４００％、少なくとも又は約５００％、少なくとも又は約６００％、少なくとも又は約７００％、少なくとも又は約８００％、少なくとも又は約９００％、或いは少なくとも又は約１０００％にもなる。例示的な実施形態では、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＰ活性のレベルは、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも約１．５倍増加する。例示的な実施形態では、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＰ活性のレベルは、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも約２倍増加する。例示的な実施形態では、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＰ活性のレベルは、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも約３倍増加する。例示的な実施形態では、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＰ活性のレベルは、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも約４倍又は約５倍増加する。例示的な実施形態では、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＰ活性のレベルは、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、又は約１０倍増加する。例示的な実施形態では、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＰ活性のレベルは、対照又は参照抗体と比較して、約０．５倍～約８倍の範囲内の量だけ増加する。

【0140】

代替の実施形態では、本開示の抗体組成物は、対照又は参照抗体と比較して任意の程度又はレベルにまでＡＤＣＰ活性が減少している。例えば、本明細書の方法を使用した、本明細書に開示する抗体組成物のＡＤＣＰ活性の減少は、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも又は約１％～約１００％の減少（例えば、少なくとも又は約１％の減少、少なくとも又は約２％の減少、少なくとも又は約３％の減少、少なくとも又は約４％の減少、少なくとも又は約５％の減少、少なくとも又は約６％の減少、少なくとも又は約７％の減少、少なくとも又は約８％の減少、少なくとも又は約９％の減少、少なくとも又は約９．５％の減少、少なくとも又は約９．８％の減少、少なくとも又は約１０％の減少、少なくとも又は約１５％の減少、少なくとも又は約２０％の減少、少なくとも又は約２５％の減少、少なくとも又は約３０％の減少、少なくとも又は約３５％の減少、少なくとも又は約４０％の減少、少なくとも又は約４５％の減少、少なくとも又は約５０％の減少、少なくとも又は約５５％の減少、少なくとも又は約６０％の減少、少なくとも又は約６５％の減少、少なくとも又は約７０％の減少、少なくとも又は約７５％の減少、少なくとも又は約８０％の減少、少なくとも又は約８５％の減少、少なくとも又は約９０％の減少、少なくとも又は約９５％の減少、少なくとも又は約１００％の減少）である。例示的な実施形態では、本明細書の方法を使用した、本明細書に開示する抗体組成物のＡＤＣＰ活性の減少は、対照又は参照抗体のレベルと比較して、約１００％超、例えば、少なくとも又は約１２５％、少なくとも又は約１５０％、少なくとも又は約１７５％、少なくとも又は約２００％、少なくとも又は約３００％、少なくとも又は約４００％、少なくとも又は約５００％、少なくとも又は約６００％、少なくとも又は約７００％、少なくとも又は約８００％、少なくとも又は約９００％、或いは少なくとも又は約１０００％にもなる。例示的な実施形態では、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＰ活性のレベルは、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも約１．５倍減少する。例示的な実施形態では、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＰ活性のレベルは、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも約２倍減少する。例示的な実施形態では、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＰ活性のレベルは、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも約３倍減少する。例示的な実施形態では、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＰ活性のレベルは、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも約４倍又は少なくとも約５倍減少する。例示的な実施形態では、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＰ活性のレベルは、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、又は約１０倍減少する。例示的な実施形態では、抗体又はそれを含む組成物のＡＤＣＰ活性のレベルは、対照又は参照抗体と比較して、約０．５倍～約８倍の範囲内の量だけ減少する。

【0141】

例示的な態様では、本開示の抗体組成物は、グリカン（例えば、ガラクトシル化グリカン、Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種、非フコシル化グリカン、コアフコース、高マンノースグリカン、Ｍ５高マンノース種、又はこれらの組み合わせ）の量が、対照又は参照抗体と比較して任意の程度又はレベルまで増加した抗体を含む。例示的な例では、抗体組成物はグリカンの量が増加しており、グリカンは、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも又は約１％～約１００％（例えば、少なくとも又は約１％、少なくとも又は約２％、少なくとも又は約３％、少なくとも又は約４％、少なくとも又は約５％、少なくとも又は約６％、少なくとも又は約７％、少なくとも又は約８％、少なくとも又は約９％、少なくとも又は約９．５％、少なくとも又は約９．８％、少なくとも又は約１０％、少なくとも又は約１５％、少なくとも又は約２０％、少なくとも又は約２５％、少なくとも又は約３０％、少なくとも又は約３５％、少なくとも又は約４０％、少なくとも又は約４５％、少なくとも又は約５０％、少なくとも又は約５５％、少なくとも又は約６０％、少なくとも又は約６５％、少なくとも又は約７０％、少なくとも又は約７５％、少なくとも又は約８０％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約１００％）増加している。例示的な実施形態では、抗体組成物は、グリカンの量が増加しており、グリカンは、対照又は参照抗体と比較して、１００％以上、例えば、少なくとも又は約１２５％、少なくとも又は約１５０％、少なくとも又は約１７５％、少なくとも又は約２００％、少なくとも又は約３００％、少なくとも又は約４００％、少なくとも又は約５００％、少なくとも又は約６００％、少なくとも又は約７００％、少なくとも又は約８００％、少なくとも又は約９００％、或いは少なくとも又は約１０００％さえも増加している。例示的な実施形態では、抗体組成物はグリカンの量が増加しており、グリカンは、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも約１．５倍増加している。例示的な実施形態では、抗体組成物はグリカンの量が増加しており、グリカンは、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも約２倍増加している。例示的な実施形態では、抗体組成物はグリカンの量が増加しており、グリカンは、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも約３倍増加している。例示的な実施形態では、抗体組成物はグリカンの量が増加しており、グリカンは、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも約４倍又は約５倍増加している。例示的な実施形態では、抗体組成物はグリカンの量が増加しており、グリカンは、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、又は約１０倍増加している。例示的な実施形態では、抗体組成物はグリカンの量が増加しており、グリカンは、対照又は参照抗体と比較して、約０．５倍～約８倍の範囲内の量だけ増加している。

【0142】

例示的な態様では、本開示の組成物は、グリカン（例えば、ガラクトシル化グリカン、Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種、非フコシル化グリカン、コアフコース、高マンノースグリカン、Ｍ５高マンノース種、又はこれらの組み合わせ）の量が、対照又は参照抗体と比較して任意の程度又はレベルまで減少した抗体を含む。例示的な例では、抗体組成物はグリカンの量が減少しており、グリカンは、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも又は約１％～約１００％（例えば、少なくとも又は約１％、少なくとも又は約２％、少なくとも又は約３％、少なくとも又は約４％、少なくとも又は約５％、少なくとも又は約６％、少なくとも又は約７％、少なくとも又は約８％、少なくとも又は約９％、少なくとも又は約９．５％、少なくとも又は約９．８％、少なくとも又は約１０％、少なくとも又は約１５％、少なくとも又は約２０％、少なくとも又は約２５％、少なくとも又は約３０％、少なくとも又は約３５％、少なくとも又は約４０％、少なくとも又は約４５％、少なくとも又は約５０％、少なくとも又は約５５％、少なくとも又は約６０％、少なくとも又は約６５％、少なくとも又は約７０％、少なくとも又は約７５％、少なくとも又は約８０％、少なくとも又は約８５％、少なくとも又は約９０％、少なくとも又は約９５％、少なくとも又は約１００％）減少している。例示的な実施形態では、抗体組成物はグリカンの量が減少しており、グリカンは、対照又は参照抗体と比較して、１００％以上、例えば、少なくとも又は約１２５％、少なくとも又は約１５０％、少なくとも又は約１７５％、少なくとも又は約２００％、少なくとも又は約３００％、少なくとも又は約４００％、少なくとも又は約５００％、少なくとも又は約６００％、少なくとも又は約７００％、少なくとも又は約８００％、少なくとも又は約９００％、或いは少なくとも又は約１０００％さえも減少している。例示的な実施形態では、抗体組成物はグリカンの量が減少しており、グリカンは、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも約１．５倍減少している。例示的な実施形態では、抗体組成物はグリカンの量が減少しており、グリカンは、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも約２倍減少している。例示的な実施形態では、抗体組成物はグリカンの量が減少しており、グリカンは、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも約３倍減少している。例示的な実施形態では、抗体組成物はグリカンの量が減少しており、グリカンは、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも約４倍又は約５倍減少している。例示的な実施形態では、抗体組成物はグリカンの量が減少しており、グリカンは、対照又は参照抗体と比較して、少なくとも約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、又は約１０倍減少している。例示的な実施形態では、抗体組成物はグリカンの量が減少しており、グリカンは、対照又は参照抗体と比較して、約０．５倍～約８倍の範囲内の量だけ減少している。

【0143】

例示的な態様では、本開示の抗体組成物は、グリカン（例えば、ガラクトシル化グリカン、Ｇ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種、非フコシル化グリカン、コアフコース、高マンノースグリカン、Ｍ５高マンノース種、又はこれらの組み合わせ）を、総量で少なくとも若しくは約０．５％、少なくとも若しくは約１％、少なくとも若しくは約２％、少なくとも若しくは約３％、少なくとも若しくは約５％、少なくとも若しくは約７％、少なくとも若しくは約１０％、少なくとも若しくは約１５％、少なくとも若しくは約２０％、少なくとも若しくは約２５％、少なくとも若しくは約３０％、少なくとも若しくは約３５％、少なくとも若しくは約４０％、少なくとも若しくは約４５％、少なくとも若しくは約５０％、少なくとも若しくは約５５％、少なくとも若しくは約６０％、少なくとも若しくは約６５％、少なくとも若しくは約７０％、少なくとも若しくは約７５％、少なくとも若しくは約８０％、少なくとも若しくは約８５％、少なくとも若しくは約９０％、少なくとも若しくは約９５％、少なくとも若しくは約９６％、少なくとも若しくは約９７％、又は少なくとも若しくは約９８％含む、或いは総量が少なくとも又は約０．５％～９８％の範囲で増加又は減少したグリカンを含む。

【0144】

例示的な実施形態では、本開示の抗体組成物は、対照又は参照トラスツズマブ抗体と比較して、末端β－ガラクトース又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種の量が増加し、且つ対照又は参照トラスツズマブ抗体と比較して、ＡＤＣＰ活性が増加しているトラスツズマブ抗体を含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗体組成物は、トラスツズマブ抗体を含み、対照又は参照トラスツズマブ抗体と比較して末端β－ガラクトースの量又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種の量の約１パーセントの増加が、対照又は参照トラスツズマブ抗体と比較して約２．５、約２．８、約２．８８又は約３パーセントのＡＤＣＰ活性の増加をもたらす。

【0145】

例示的な実施形態では、本開示の抗体組成物は、対照又は参照トラスツズマブ抗体と比較して、末端β－ガラクトース又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種の量が減少し、且つ対照又は参照トラスツズマブ抗体と比較して、ＡＤＣＰ活性が減少しているトラスツズマブ抗体を含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗体組成物は、トラスツズマブ抗体を含み、対照又は参照トラスツズマブ抗体と比較して末端β－ガラクトースの量又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種の量の約１パーセントの減少が、対照又は参照トラスツズマブ抗体と比較して約２．５、約２．８、約２．８８又は約３パーセントのＡＤＣＰ活性の減少をもたらす。

【0146】

例示的な実施形態では、本開示の抗体組成物は、対照又は参照リツキシマブ抗体と比較して、非フコシル化グリカンが減少するか、又はコアフコースの量が増加し、且つ対照又は参照リツキシマブ抗体と比較して、ＡＤＣＰ活性が増加しているリツキシマブ抗体を含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗体組成物は、リツキシマブ抗体を含み、非フコシル化グリカンの約１パーセントの減少又はコアフコースの約１パーセントの増加が、対照又は参照リツキシマブ抗体と比較して約０．５、約０．７、約０．７５、約０．８又は約１パーセントのＡＤＣＰ活性の増加をもたらす。

【0147】

例示的な実施形態では、本開示の抗体組成物は、対照又は参照トラスツズマブ抗体と比較して、非フコシル化グリカンの量が増加するか、又はコアフコースの量が減少し、且つ対照又は参照トラスツズマブ抗体と比較して、ＡＤＣＰ活性が増加しているトラスツズマブ抗体を含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗体組成物は、トラスツズマブ抗体を含み、非フコシル化グリカンの約１パーセントの増加又はコアフコースの約１パーセントの減少が、対照又は参照トラスツズマブ抗体と比較して約０．５、約０．５６、約０．６、又は約１パーセントのＡＤＣＰ活性の増加をもたらす。

【0148】

例示的な実施形態では、本開示の抗体組成物は、対照又は参照トラスツズマブ抗体と比較して、非フコシル化グリカンの量が減少するか、又はコアフコースの量が増加し、且つ対照又は参照トラスツズマブ抗体と比較して、ＡＤＣＰ活性が減少しているトラスツズマブ抗体を含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗体組成物は、トラスツズマブ抗体を含み、非フコシル化グリカンの約１パーセントの減少又はコアフコースの約１パーセントの増加が、対照又は参照トラスツズマブ抗体と比較して約０．５、約０．５６、約０．６、又は約１パーセントのＡＤＣＰ活性の減少をもたらす。

【0149】

例示的な実施形態では、本開示の抗体組成物は、対照又は参照リツキシマブ抗体と比較して、非フコシル化グリカンの量が増加するか、又はコアフコースの量が減少し、且つ対照又は参照リツキシマブ抗体と比較して、ＡＤＣＰ活性が減少しているリツキシマブ抗体を含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗体組成物は、リツキシマブ抗体を含み、非フコシル化グリカンの約１パーセントの増加又はコアフコースの約１パーセントの減少が、対照又は参照リツキシマブ抗体と比較して約０．５、約０．７、約０．７５、約０．８又は約１パーセントのＡＤＣＰ活性の減少をもたらす。

【0150】

例示的な実施形態では、本開示の抗体組成物は、対照又は参照ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）と比較して、例えばＭ５高マンノース種を含む、高マンノースグリカンの量が増加し、且つ対照又は参照ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）と比較して、ＡＤＣＰ活性が減少しているＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）を含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗体組成物は、ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）を含み、例えばＭ５高マンノース種を含む、高マンノースグリカンの約１パーセントの増加が、対照又は参照ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）と比較して約１％、約１．２％、約１．３１％、約１．５％、約１．７％、約２％、約２．１１％又は約２．５％のＡＤＣＰ活性の減少をもたらす。

【0151】

例示的な実施形態では、本開示の抗体組成物は、対照又は参照ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）と比較して、例えばＭ５高マンノース種を含む、高マンノースグリカンの量が減少し、且つ対照又は参照ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）と比較して、ＡＤＣＰ活性が増加しているＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）を含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗体組成物は、ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）を含み、例えばＭ５高マンノース種を含む、高マンノースグリカンの約１パーセントの減少が、対照又は参照ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）と比較して約１％、約１．２％、約１．３１％、約１．５％、約１．７％、約２％、約２．１１％又は約２．５％のＡＤＣＰ活性の増加をもたらす。

【0152】

いくつかのさらなる例示的な実施形態では、本開示の抗体組成物は、ガラクトシル化グリカン（例えば、末端β－ガラクトース、又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種を含む）、非フコシル化グリカン又はコアフコース、並びに／或いは高マンノースグリカン（例えば、Ｍ５高マンノース種を含む）の組み合わせの量が増加又は減少しているＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）を含む。例示的な実施形態では、抗体組成物は、対照又は参照ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）と比較して、（１）末端β－ガラクトース、又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種の量が増加し、（２）コアフコースの量が減少するか、又は非フコシル化種の量が増加し、且つ／或いは（３）高マンノース又はＭ５高マンノース種の量が減少し、その結果、対照又は参照ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）と比較して、ＡＤＣＰ活性の増加がもたらされるＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）を含む。いくつかの他の例示的な実施形態では、抗体組成物は、対照又は参照ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）と比較して、（１）末端β－ガラクトース、又はＧ１、Ｇ１ａ、Ｇ１ｂ及び／若しくはＧ２ガラクトシル化種の量が減少し、（２）コアフコースの量が増加するか、又は非フコシル化種の量が減少し、且つ／或いは（３）高マンノース又はＭ５高マンノース種の量が増加し、その結果、対照又は参照ＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）と比較して、ＡＤＣＰ活性の減少がもたらされるＩｇＧ１抗体（例えば、トラスツズマブ又はリツキシマブを含む）を含む。

【0153】

例示的な実施形態では、本明細書で提供される抗体組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と組み合わされる。したがって、本明細書では、本明細書に記載される組み換えグリコシル化タンパク質組成物（例えば、抗体組成物）及び薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物が提供される。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容可能な担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水又は水／油エマルションなどのエマルション、及び様々なタイプの湿潤剤などの標準的な医薬担体のいくつかを含む。

【0154】

以下の実施例は、単に本開示を説明するために与えられ、決してその範囲を限定するものではない。

【実施例】

【0155】

以下の実施例は、β－ガラクトース、コアフコース／非フコシル化、及び／又は高マンノースを含む特定のグリカンの増加又は減少によって、抗ＨＥＲ２抗体及び抗ＣＤ２０抗体を含むＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰエフェクター機能を調節することを記載する。

【0156】

緒言
治療用モノクローナル抗体、特にＩｇＧ１サブクラスのモノクローナル抗体には、それらの作用機序に重要であり得るエフェクター機能活性がある。そのようなエフェクター機能活性の１つは抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）であり、これは、マクロファージ及び好中球の活性化ＦｃγＲ、ＦｃγＲＩＩａを介して主に媒介されることが示されている。ＡＤＣＰ活性に最も影響し、且つ予測性があり、したがってＩｇＧ１抗体の製造中にモニターするのに最も適している重要品質特性は、十分に確立されていない。ＡＤＣＰのためのプライマリー細胞アッセイは、多くの場合、骨が折れるとともに、ドナー間のばらつきに左右され、このことがこのようなアッセイを産物の特徴付けにあまり望ましくないものにしている。ＡＤＣＰレポーター遺伝子アッセイを開発し使用することによって、本発明者らは、複数の異なるＩｇＧ１ ｍＡｂにわたってＦｃγＲＩＩａ媒介ＡＤＣＰに影響を及ぼし得るグリカン構造を高感度で決定することができた。興味深いことに、いくつかのＩｇＧ１抗体はＡＤＣＰの非常に強力なメディエーターであるが、他の抗体は他のエフェクター機能活性（ＡＤＣＣ及びＣＤＣ）を有するにもかかわらずＡＤＣＰを媒介しないことが観察された。さらに、本発明者らは、ＩｇＧ１ ｍＡｂの相異によってＡＤＣＰのグリカン種に対する感受性が著しく異なり、１つのｍＡｂはβ－ガラクトシル化及び高いマンノースレベルが驚くほど強い影響を示すことを見出した。

【0157】

ＦｃγＲＩＩａ媒介ＡＤＣＰがいくつかの治療用Ｍａｂの作用機序（ＭｏＡ）に役割を果たし得ることが確認されている。Ｗｅｎｇ ＷＫ，Ｌｅｖｙ Ｒ．Ｔｗｏ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｐｒｅｄｉｃｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｎｃｏｌｏｇｙ：Ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２００３；２１：３９４０－７、Ｚｈａｎｇ Ｗ，ｅｔ ａｌ．ＦＣＧＲ２Ａ ａｎｄ ＦＣＧＲ３Ａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｉｎｇｌｅ－ａｇｅｎｔ ｃｅｔｕｘｉｍａｂ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｎｃｏｌｏｇｙ：Ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２００７；２５：３７１２－８。この認識により、十分な分解能及び識別力を有する好適なインビトロアッセイが必要となっている。ＡＤＣＰにおけるグリカン構造の影響についての明確な理解が欠如している１つの考えられる理由は、必要な機能アッセイを実施する際の問題であり得る。発表されているＡＤＣＰプロトコルのほとんどは、プライマリーエフェクター細胞及び蛍光マーカーを使用して、フローサイトメトリーにより活性を追跡する（例えば、Ｐｅｔｒｉｃｅｖｉｃ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｄｉａｔｅｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｔｏ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｅｘｔｅｎｔ ｉｎ ｂｏｔｈ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ＨＥＲ２／ｎｅｕ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１３；１１：３０７を参照されたい）。このようなアッセイは方向性効果を示し得るが、ドナー間のばらつき及び応答レベルの限定に起因して、定量能力が限られ、且つ再現性が欠如し得る。また、プライマリー細胞を用いることにより、細胞株を用いた試験や受容体結合試験に比べて、より生理学的に意義のある評価を提供すると主張し得るが、エフェクター機能活性の可能性を明らかにするには感度や精度が十分でない場合がある。最近、ＦｃγＲＩＩａレポーター遺伝子アッセイが記載されており、高い精度及び正確さを持った非常に簡易化された性能を約束する。Ｔａｄａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩａ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ ２０１４；９：ｅ９５７８７を参照されたい。本発明者らは、ＦｃγＲＩＩａ結合に応答するレポーター遺伝子細胞株を利用する市販の供給源に由来する同様のアッセイを確立した。このアッセイは、非常に正確で、再現性があり、且つ種々のグリコフォームの寄与を検出する良好な感度を有する。Ｆｃグリカン構造は製造プロセス中に制御するために緊密なプロセスモニタリングを必要とし得るという認識から、十分に開発された製造プロセスからの生成物においてさえ、比較的高い割合で不均一性に遭遇する可能性がある。Ｒｅａｄ ＥＫ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｄｕｓｔｒｙ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１１；５８：２１３－９を参照されたい。したがって、種々のグリカン構造の寄与とＡＤＣＰ活性についての頑強なモデルを確立することが不可欠である。ここで、本発明者らは、エフェクター機能を示す多くのＩｇＧ１モノクローナル抗体にわたる広範囲のグリカン型及びレベルの影響を特徴付けるために、ＦｃγＲ結合研究と組み合わせた遺伝子工学的ＡＤＣＰアッセイの結果を記載する。

【0158】

以下の例では、以下の方法を用いた。

【0159】

材料及び方法
試料の調製
ヒト化モノクローナルＩｇＧ１抗体をＣＨＯ細胞中で発現させ、Ａｍｇｅｎ（Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、ＣＡ）で産生させた。この研究で用いたＩｇＧ１抗体（「ｍＡｂ」）は膜発現標的（ＣＤ２０、ＨＥＲ２又はＴＮＦα）に結合し、そしてトラスツズマブ（抗ＨＥＲ２）及びリツキシマブ（抗ＣＤ２０）を含む。

【0160】

グリカン種の濃縮と酵素によるリモデリング
高マンノース含有種を、流量０．５ｍＬ／ｍｉｎのＡｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズＨＰＬＣシステム上でＰｒｏＳｗｉｆｔ ＣｏｎＡ－１Ｓアフィニティーカラム（５×５０ｍｍ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＰＮ ０７４１４８）を用いてｍＡｂから濃縮した。カラムを最初に１００％緩衝液Ａ（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．２Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ５．３）で１０．５分間、初期条件に保ち、次いで１００％緩衝液Ｂ（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．２Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ α－メチル－マンノピラノシド ｐＨ５．３）で１７．５分間溶出した。フロースルー画分及び溶出画分の両方を回収し、β－（１－４）－ガラクトシダーゼ（ＱＡ Ｂｉｏ、ＰＮ Ｅ－ＢＧ０７）で処理して、末端ガラクトースを除去した。具体的には、ｍＡｂ画分を、５０ｍＭリン酸ナトリウムを含有する反応緩衝液（ｐＨ６．０）の存在下、１／５０（μｇ／μｇ）の比でβ－（１－４）－ガラクトシダーゼと共に３７℃で１時間インキュベートした。瞬間冷凍により反応を停止させた。

【0161】

Ｅｎｄｏ－Ｈ（ＱＡ－Ｂｉｏ、ＰＮ Ｅ‐ＥＨ０２）による酵素処理によりｍＡｂから非フコシル化種を調製した。具体的には、５０ｍＭリン酸ナトリウムの反応緩衝液（ｐＨ５．５）中、３７℃で、２４時間、ｍＡｂをＥｎｄｏ－Ｈと共にインキュベートした。最終ｍＡｂ濃度は４ｍｇ／ｍＬである。続いて、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＨＰＬＣ上で、カスタマイズしたｇｌｙｃａｐ－３Ａカラム（低密度ＦｃγＩＩＩａ、３×１５０ｍｍ、Ｚｅｐｔｅｏｎ、ＰＮ Ｒ３ＡＶＤ１Ｐ１ＭＬ）を使用してアフィニティークロマトグラフィーにより、非フコシル化ｍＡｂを分離した。移動相Ａは２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）を含み、移動相Ｂは５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ４．２）であった。０．５ｍＬ／ｍｉｎの流量で勾配（０％Ｂで８分間保持、０％から１８％Ｂへ２２分間）を使用して、非フコース枯渇（フロースルー）及び濃縮（溶出）ｍＡｂの両方を分離した。また、末端ガラクトースのいずれかの潜在的な影響を除去するために、β－（１－４）－ガラクトシダーゼによる酵素処理を行った（上記のように）。

【0162】

ガラクトースリモデリング試料を、β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｓｉｇｍａ／Ｒｏｃｈｅ）のインビトロ活性により生成した。最初に、フコシル化ｍＡｂ（主にＧ０Ｆ）を、ＦｃγＩＩＩａカラムからフロースルー画分を収集することによって調製し、ガラクトシダーゼで処理して末端ガラクトースを除去した。次いで、Ｇ０Ｆ濃縮ｍＡｂを、１０ｍＭのＵＤＰ－ガラクトース、１００ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６．５）、２０ｍＭのＭｎＣｌ２、及び０．０２％のアジ化ナトリウムを含有する反応緩衝液中で、β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼと共に３７℃でインキュベートした。最終的な酵素とｍＡｂの比は６（μＬ／ｍｇ）であり、ｍＡｂ濃度は２ｍｇ／ｍＬである。種々の時点（１０分、２０分、３０分、１時間、２時間、４時間及び９時間）で反応混合物から試料を採取し、続いて瞬間冷凍して反応を停止させることによって、種々のレベルのガラクトースを有するＭＡｂを得た。

【0163】

濃縮しリモデリングした全ての試料についてプロテインＡクロマトグラフィー精製を実施し、酵素及び他の成分を除去した。精製は、予め充填したプロテインＡカラム（Ｐｏｒｏｓ Ａ／２０、４．６×１００ｍｍ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＮ １－５０２２－２６）を用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＨＰＬＣシステム上で流量３ｍＬ／ｍｉｎで行った。適切な量の各試料をロードした後、カラムを、まず１００％緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス－ＨＣｌ／１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で、１．４分間、初期条件に維持し、次いで、１００％緩衝液Ｂ（０．１％酢酸）で２．９分間溶出した。溶出した全てのｍＡｂを、３ｋＤａカットオフ膜を備えたＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心フィルターを使用して処方緩衝液中に透析濾過した。タンパク質濃度は、典型的には、全ての濃縮／リモデリングｍＡｂ試料で約１ｍｇ／ｍＬであった。

【0164】

グリカン種の濃縮及びリモデリングの特性評価。
所望のグリカン特性及び最小レベルの高分子量種を確実にするために、濃縮及びリモデリンした全ての試料を、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）及びサイズ排除クロマトグラフィーで特性評価した。ｍＡｂからグリカンをＥ／Ｓ比１／２５（μＬ／μｇ）のＰＮＧアーゼＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて放出させ、１２ｍｇ／ｍＬの２－アミノ安息香酸（２－ＡＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で、反応混合物を８０℃で７５分間インキュベートすることにより標識した。２－ＡＡ標識グリカンを、蛍光検出器を備えたＷａｔｅｒｓ Ａｃｕｉｔｙ又はＨ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣシステム上で、ＢＥＨグリカンカラム（１．７μｍ、２．１×１００ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）を用いて分離した。カラム温度は５５℃に維持した。移動相Ａは１００ｍＭのギ酸アンモニウム（ｐＨ３．０）を含み、移動相Ｂは１００％アセトニトリルであった。グリカンを高有機溶媒中でカラムに結合させ、次いで、水性ギ酸アンモニウム緩衝液の勾配を増加させて溶出した（７６％Ｂを５分間保持し、続いて１４分間にわたって７６％Ｂから６５．５％Ｂへの勾配により溶出した）。必要な操作が高分子量種の形成をもたらさなかったことの確認を、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣシステム上で、０．５ｍＬ／ｍｉｎの流量で、サイズ排除カラム（ＳＥＣ）ＴＳＫ－Ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＬＸＬ（７．８×３００ｍｍ、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して評価した。試料２０～４０μｇの試料負荷を、典型的には、１００ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）及び２５０ｍＭのＮａＣｌを含有する移動相を用いて定組成的に分離した。

【0165】

ＡＤＣＰアッセイ
ＡＤＣＰルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイは、遺伝子操作されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用する。Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞は、Ｔ細胞活性化因子（ＮＦＡＴ）の応答エレメントを有するルシフェラーゼレポーター遺伝子と同様に、細胞表面にＦｃγＲＩＩａ－（Ｈ１３１バリアント）を発現する。これらの細胞をＰｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ９９０１から改変した。標的細胞に結合した抗体とＪｕｒｋａｔエフェクター細胞上のＦｃγＲＩＩａに結合した抗体間の同時結合により、転写因子ＮＦＡＴが活性化される。活性化されたＮＦＡＴはＪｕｒｋａｔ細胞の核内に移行し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現を誘導する。ルシフェリン及び界面活性剤を含有するルシフェラーゼ基質の添加により、発光シグナルが生成され、ＡＤＣＰレポーター活性の検出が可能になる。抗ＣＤ２０抗体では、用量応答曲線とするため、参照標準、アッセイ対照、及び試験試料を、低ＩｇＧ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０アッセイ培地中で、最終プレートウェル濃度が１．７６～６００ｎｇ／ｍＬの範囲まで８濃度レベルにわたって段階希釈した。エフェクターＪｕｒｋａｔレポーター細胞及び標的（ＣＤ２０＋Ｒａｊｉ）細胞を、３：２のエフェクター対標的（Ｅ対Ｔ）細胞比で混合して、細胞懸濁液を調製した。次いで、プレートを、５％ＣＯ２及び３７℃の加湿インキュベーター中で５．５時間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、細胞をルシフェラーゼアッセイ緩衝液中の界面活性剤によって溶解する。ルシフェラーゼの触媒作用により、その基質のルシフェリンを発光させ、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダーによって検出した。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ７による４パラメーター曲線フィットを用いてデータを平均発光値にフィットさせ、一般的なバイオアッセイの実施ごとの相対活性パーセント（ＥＣ５０標準／ＥＣ５０試料）として報告した。各試料を３つの独立したアッセイで試験し、試料の最終結果を３回の測定の平均として報告する。抗ＴＮＦα抗体アッセイも同様に実施したが、２３４．４～３００００ｎｇ／ｍＬの用量範囲、及びその細胞表面１５上に非切断型ＴＮＦαを発現するように操作されたＣＨＯ標的細胞株を使用した。抗ＨＥＲ２抗体についてのＡＤＣＰアッセイを同様に実施したが、３１．３～４０００ｎｇ／ｍＬの用量応答範囲を有し、標的細胞としてＨＥＲ２＋ＳＫＯＶ－３細胞株を使用した。より高いルシフェラーゼ応答を達成するために、５％ＣＯ２及び３７℃でのプレートのインキュベーションは、約６．５時間である。抗ＨＥＲ２抗体の活性は、用量応答データを、他の分子と同様の４パラメーター曲線にフィッティングすることによって算出したが、相対活性の算出は、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏを使用せず、次の経験的に導き出された式を使用した：相対力価＝（Ｂ試料／Ｂ参照）Ｅ×（Ｃ参照／Ｃ試料）×（Ｄ試料／Ｄ参照）Ｆ。Ｂ比（Ｂ試料／Ｂ参照）は、参照標準のヒル勾配を試料のヒル勾配で除すことによって得られた。Ｃ比（Ｃ参照／Ｃ試料）は、参照標準のＥＣ５０を試料値のＥＣ５０で除すことによって得られた。Ｄ比（Ｄ試料／Ｄ参照）は、参照標準の上漸近線を試料値の上漸近線で除すことによって得られた。Ｂ試料／Ｂ参照≧１．０及びＣ参照／Ｃ試料≧１．０なら、Ｅ＝０．０５、Ｂ試料／Ｂ参照≧１．０及びＣ参照／Ｃ試料＜１．０なら、Ｅ＝０．２０、Ｂ試料／Ｂ参照＜１．０なら、Ｅ＝０．１５、Ｄ参照／Ｄ試料＞１．０なら、Ｆ＝１．８×（Ｄ参照／Ｄ試料）（０．４５×（Ｄ参照／Ｄ試料）＾０．３５）、Ｄ参照／Ｄ試料≦１．０なら、Ｆ＝１．８×（Ｄ試料／Ｄ参照）（１．４５×（Ｄ参照／Ｄ試料）＾１．７５）。この式は、Ｂ、Ｃ及びＤ値が全てこのアッセイにおける品質特性によって影響されるという事実を考慮した。

【0166】

ＦｃγＲＩＩａ結合。
抗体試料によるＦｃγＲＩＩａに対する相対結合活性を、競合的増幅発光近接ホモジニアスアッセイ（ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（商標）、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で測定した。このアッセイは、２つのビーズ型、アクセプタービーズ及びドナービーズを含む。アクセプタービーズはグルタチオンを含み、グルタチオンは、社内で調製された組み換えヒトＦｃγＲＩＩａ－グルタチオン－Ｓトランスフェラーゼ（ＦｃγＲＩＩａ ＧＳＴ）に結合する。ドナービーズはストレプトアビジンでコーティングされ、ストレプトアビジンは、社内で調製されたビオチン化ヒトＩｇＧ１に結合し、試料の競合体として機能する。ＦｃγＲＩＩａ ＧＳＴとビオチン化ヒトＩｇＧ１が結合すると、それらはアクセプタービーズとドナービーズを近接させる。この複合体にレーザーを照射すると、周囲の酸素がドナービーズによって一重項酸素に変換され、５７０ｎｍで測定される発光をもたらす。試料が、ビオチン化ヒトＩｇＧ１へのＦｃγＲＩＩａ ＧＳＴの結合を阻害するのに十分な濃度で存在する場合、発光の用量依存性の減少が測定される。結合アッセイは、９６ウェルＡｌｐｈａＰｌａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）中で行った。グルタチオン被覆アクセプタービーズを、ヒトＦｃガンマＲＩＩａ－ＧＳＴ－Ｈ６で被覆し、それぞれ、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ免疫アッセイ緩衝液中で２５μｇ／ｍＬ及び５ｎＭの最終濃度に調製した。この混合物を暗所において室温で２～４時間インキュベートする（ビーズは感光性である）。参照標準、対照及び試料物質を、希釈プレート中のＡｌｐｈａＬＩＳＡ（商標）イムノアッセイ緩衝液中で１００ｎＭから０．１６４ｎＭ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に２．５倍段階希釈し、各ウェルの９０μＬを新鮮な混合プレートに移す。ビオチン化ＩｇＧ１競合体を、イムノアッセイ緩衝液中、２ｎＭの最終濃度に調製する。９０μＬのビオチン化ＩｇＧ１競合体を、低濃度から高濃度まで混合プレートの全てのウェルに加えた。各ウェルを、上下にピペッティングすることによって少なくとも５回混合し、次いで、４０μＬを、３つの反復アッセイプレートの適切な各ウェルに移した。グルタチオン受容体ビーズ及びＦｃγＲＩＩａの２時間のインキュベーションが完了した後、４０μＬの混合物をアッセイプレートの各ウェルに添加した。プレートを密封し、振盪機上に２分間置き、次いで、暗所にて２２～２６時間、室温でインキュベートした。インキュベーションの後、ストレプトアビジンドナービーズをイムノアッセイ緩衝液中、５０μｇ／ｍＬの最終濃度に希釈し、２０μＬをアッセイプレートの各ウェルに加え、総反応容量を１００μＬとした。プレートを再び密封し、振盪機上に２分間置き、暗所にて２～６時間、室温でインキュベートした。インキュベーションの後、プレートシーラーを除去し、プレートをＥｎｖｉｓｉｏｎで６８０ｎｍ励起、５７０ｎｍ発光で読み取った。参照標準に対する試験試料の結合を測定し、相対結合パーセントとして報告した。希釈曲線の各データ点を、３つのアッセイプレートで３連で実行した。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ７による４パラメーター曲線フィットを使用してデータを平均発光値にフィットさせ、ＩＣ５０標準／ＩＣ５０試料を計算し、活性パーセントとして報告した。各試料を３つの独立したアッセイで試験し、試料の最終結果を３回の測定の平均として報告した。

【0167】

抗原の結合
ＣＤ２０抗原結合アッセイを、蛍光阻害を報告する競合的アッセイフォーマットを利用して、ヒトβ－リンパ芽球様細胞株であるＷＩＬ２－Ｓ細胞を用いて行った。試験試料は、ＷＩＬ２－Ｓ細胞の細胞表面発現ＣＤ２０への結合について、参照標準の固定濃度のＡｌｅｘａ－４８８標識形態と競合する。０．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有するＰＢＳ中で、４．９２～３０００ｎｇ／ｍＬの最終濃度範囲まで８つの濃度にわたって段階希釈することによって、参照標準、アッセイ対照及び試験試料の用量応答曲線を作成した。Ａｌｅｘａ－４８８標識競合体を最終的なウェル内濃度１００ｎｇ／ｍＬに希釈した。３０，０００細胞／ウェルに希釈した試料、競合体及びＷＩＬ２－Ｓ細胞を９６ウェルプレートに２連で加え、プレートシーラーで密封した。次いで、プレートを室温で４．５～６時間インキュベートした後、Ａｃｕｍｅｎ（登録商標）ｅＸ３イメージングサイトメーター（ＴＴＰ Ｌａｂｔｅｃｈ）で蛍光シグナルを測定した。蛍光シグナルの用量依存的減少が、試験試料の濃度の上昇につれて検出された。参照標準試料に対する試験試料の相対ＣＤ２０結合を報告した。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ７による４パラメーター曲線フィットを使用してデータを平均発光値にフィットさせ、ＩＣ５０標準／ＩＣ５０試料を計算し、パーセント相対結合活性として報告した。各試料を３つの独立したアッセイで試験し、試料の最終結果を３回の測定の平均として報告した。ＨＥＲ２結合アッセイを、ＨＥＲ２陽性ＳＫＢＲ－３を標的細胞として使用し、用量応答曲線が（０．０１６～１０μｇ／ｍＬ）の範囲であったことを除いて、同様の様式で実施した。

【0168】

実施例１
抗ＨＥＲ２、抗ＣＤ２０及び抗ＴＮＦαのＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性の評価
細胞表面抗原に対する一連のヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体についての潜在的ＡＤＣＰ活性の評価を、ＡＤＣＰレポーター遺伝子アッセイを用いて行った（詳細については上記の材料及び方法を参照）。評価した抗体は、このアッセイにおいて一連の活性を示した。ある範囲の活性を表す３つの異なるＩｇＧ１ ｍＡｂの用量応答曲線のオーバーレイを図２に示す。抗ＴＮＦα抗体は、全ての抗体の試験された最高濃度範囲で評価されたにもかかわらず、実質的に応答を示さなかった。対照的に、抗ＣＤ２０抗体は、比較的低い濃度範囲で非常に強い応答を示し、２０倍の分数で最大刺激に達した。抗ＨＥＲ２抗体は中間の応答を示す。これらの３つの抗体の全ては、インビトロＡＤＣＣ活性アッセイで測定されるように、これらの同じ標的細胞株に対しＡＤＣＣを媒介する（データは示さず）。２つの異なる標的に対するＡＤＣＰ活性が２つの異なる抗体によって得られたとの観察から、このアッセイ及びこれらの活性に影響を及ぼす特性のより詳細な研究が行われた。

【0169】

第１段階として、ＡＤＣＰレポーター遺伝子アッセイの定量的性質及び範囲、及び、したがってＡＤＣＰ活性に影響を及ぼす品質特性の評価に対するその適合性を示すために、濃度調整によるシミュレートされた活性又は効力レベルを使用して線形アッセイを行った。図３Ａ～Ｄは、抗ＣＤ２０（図３Ａ～Ｂ）及び抗ＨＥＲ２（図３Ｃ～Ｄ）抗体の両方について、予測されたＡＤＣＰ活性値と観測されたＡＤＣＰ活性値の結果を示し、それぞれの用量応答曲線（図３Ｂ及び３Ｄを参照）及び相関グラフ（図３Ａ及び３Ｃを参照）を示す。

【0170】

２５％から２５０％の相対ＡＤＣＰ活性から確立したアッセイの定量範囲を用いて、２種類の活性ｍＡｂ（抗ＣＤ２０及び抗ＨＥＲ２）のＦｃドメインにおける保存されたＮ－結合グリカンに関連する品質特性を次に調べた。各抗体の試料を調製して、図４に示すような様々な高マンノース、ベータ－ガラクトース及びフコース構造を評価した。

【0171】

様々な主要なグリカン種の各々を有する抗体試料を、記載のように調製した。各グリカンの相対ＡＤＣＰ活性に対する影響を以下の節で詳述する。

【0172】

実施例２
抗ＨＥＲ２及び抗ＣＤ２０のＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性に対する末端β－ガラクトースの影響
調べた最初のグリカン種はβ－ガラクトースであった。抗ＨＥＲ２抗体は、様々なβ－ガラクトースに対して非常に強い応答を示した。ガラクトシル化の用量応答曲線を図５に示す。定量的に非常に異なる活性レベルを生じることに加えて、β－ガラクトースレベルに対する用量応答曲線の形状にも定性的な変化があり、ヒル勾配及びＥｍａｘはβ－ガラクトースレベルの減少と共に低下した。相対活性の算出の説明については、上述の材料及び方法を参照されたい。

【0173】

算出された活性は、グリカンに対して非常に直線的な応答をもたらした（図６）。本発明者らはまた、ＡＤＣＰ活性に対するβ－ガラクトースの相対的影響を、活性／特性相関プロットの勾配に関してそれを表すことによって定量化することができた。これは応答係数を表すと見なすことができる。抗ＨＥＲ２抗体におけるこのアプローチを使用して、ＡＤＣＰインパクトは、β－ガラクトースで、２．８８と計算することができる。

【0174】

驚くべきことに、同じ分析を抗ＣＤ２０抗体について行ったところ、β－ガラクトースレベルに対する応答は、図７に示すように、実質的に変わらないことがわかった。抗ＣＤ２０抗体では、観察された影響はβ－ガラクトースの達成可能な最低レベルと最高レベルとの間で最小であったので、中間レベルは試験しなかった。

【0175】

ＡＤＣＰレポーター遺伝子アッセイのグリカンレベルに対する応答性のさらなる尺度として、ＡｌｐｈａＬＩＳＡフォーマットを使用するＦｃγＲＩＩａ結合アッセイを行って、抗ＨＥＲ２抗体に対するβ－ガラクトースの影響を直交評価した。ＦｃγＲＩＩａ結合アッセイは、ＡＤＣＰアッセイで使用した線形アプローチと同様の広範囲の結合活性をカバーするように適格化した（データは示さず）。図８に見られるように、同じ範囲のβ－ガラクトースをカバーする試料のサブセットで、β－ガラクトースレベルに対して線形応答があった。ＡｌｐｈａＬＩＳＡ結合アッセイの応答の大きさが、ＡＤＣＰアッセイが生成する応答よりもはるかに穏やかであったことは興味深い。β－ガラクトースレベルの関数としての相対ＦｃγＲＩＩａ結合のプロットの勾配は、図６の３．０５応答係数に対して、わずか０．３３であり、これは、ＡＤＣＰアッセイより約９倍強力な応答率である。

【0176】

グリコエンジニアリング操作の結果として生じた可能性がある抗原結合インパクトの対照として、代表的な広範囲のβ－ガラクトースレベル試料の相対抗原結合活性のグラフを図９Ａ－Ｂに示す。これらの結果から、相対ＡＤＣＰ活性の差異は、ＦｃγＲＩＩａ結合の差異に起因し得、細胞表面標的結合の不測の変化に起因しないと結論付けることができる。

【0177】

実施例３
ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性に対するコアフコース／非フコシル化の影響
フコシル化に対する応答（非フコシル化［フコースの欠如］レベルの形態で）を図１０Ａ～Ｂに示す。β－ガラクトースに対する応答よりも劇的ではないが、抗ＨＥＲ２抗体に対するＡＤＣＰ活性の直線的な増加が観察され、応答係数は０．５６であった。図１０Ａ。抗ＣＤ２０抗体は、非フコシル化の増加に伴い、ＡＤＣＰ活性はわずかではあるが直線的な減少を示した。図１０Ｂ。負の傾きは非常に浅いが、本法の精度を考慮すると認識可能であり、且つ再現可能である。

【0178】

実施例４
ＩｇＧ１抗体のＡＤＣＰ活性に対する高マンノースの影響
抗ＨＥＲ２抗体の高マンノースに対する応答は、アフィニティークロマトグラフィー法によって、より低レベルの高マンノース種をより高レベルの高マンノース種から完全に分離することができず、また、それらの試料に関連する異なるβ－ガラクトースレベルを持ち込まなかったことでやや複雑になった。通常、β－ガラクトースはこの評価のために除去され、高マンノースの相異のみによる影響の評価を可能にする。しかしながら、実施例２に示したように、β－ガラクトースの除去は活性を消失させる。したがって、抗ＨＥＲ２抗体のＡＤＣＰ活性に対する高マンノースの影響を評価するために、２組の試料を比較した。第１のセットは、実施例２で論じた１％～９１％の範囲であるが、全て、高マンノースを共通レベル（約２％）で含有する同じβ－ガラクトースレベルである。第２のセットは、１７％のβ－ガラクトース～３６％のβ－ガラクトース（２つをブレンドすることによって中間レベルを達成）の範囲の試料を含むが、１．６％～５２％の範囲の高マンノースも含む。報告された各セットからのβ－ガラクトースに対するＡＤＣＰ活性を図１１Ａ～Ｂにプロットする。１．２～５２％の範囲の高マンノースを含有するセットは全て、２％に固定された高マンノースを有するセットと比較してより低いＡＤＣＰ活性を示したことが観察され、これは、抗ＨＥＲ２抗体では、ＡＤＣＰ活性に対し、高マンノースが負の影響を及ぼすことを示している。図１１Ａ。同じ分析をＦｃγＲＩＩａ結合アッセイを用いて行い、図１１Ｂに示す。様々な高マンノースを含有する試料セットの勾配はまた、これらの試料に存在するβ－ガラクトースの範囲による影響を受けるので、勾配の値は、他のグリカン特性のように、高マンノースの応答係数と見なすことはできない。むしろ、これらの試料のβ－ガラクトースと高マンノースとの間の関係、及びβ－ガラクトースとＡＤＣＰ活性との間の関係を知ることにより、高マンノースの応答係数は、ＡＤＣＰ活性では－２．１１、結合アッセイでは－０．８１と算出することができた。

【0179】

ＡＤＣＰアッセイにおける高マンノースの応答係数を決定するための計算は、以下の通りであった：
β－ガラクトース％の関数としての相対ＡＤＣＰ活性％
ｙ＝５．４３７９ｘ－１００．１
ｘ＝（ｙ＋１００．１）／５．４３７９（１）
β－ガラクトース％対マンノース％の式をｚに関して書き換える。ｚはマンノースレベル％である。
ｙ＝－０．３８８１ｘ＋３６．９６１
ｘ＝－０．３８８１ｚ＋３６．９６１（２）
次に、（２）に（１）を代入して、ｚ（マンノースレベル％）に関してｙ（相対ＦｃγＲＩＩａ結合％）の式を得る
ｘ＝－０．３８８１ｚ＋３６．９６１
（ｙ＋１００．１）／５．４３７９＝－０．３８８１ｚ＋３６．９６１

【数1】

ｙ＋１００．１＝－２．１１０４ｚ＋２００．９９０２
ｙ＝－２．１１０４ｚ＋１００．８９０２（３）
したがって、ＡＤＣＰアッセイにおける高マンノースの応答係数は－２．１１０４である

【0180】

ＦｃγＲＩＩａ結合アッセイにおける高マンノースの応答係数を決定するための計算は、以下の通りであった：
β－ガラクトース％の関数としての相対ＦｃγＲＩＩａ結合％
ｙ＝２．０７５９ｘ＋２５．８０５
ｘ＝（ｙ－２５．８０５）／２．０７５９（１）
β－ガラクトース％対マンノース％の式をｚに関して書き換える。ｚはマンノースレベル％である。
ｙ＝－０．３８８１ｘ＋３６．９６１
ｘ＝－０．３８８１ｚ＋３６．９６１（２）
次に、（２）に（１）を代入して、ｚ（マンノースレベル％）に関してｙ（相対ＦｃγＲＩＩａ結合％）の式を得る
ｘ＝－０．３８８１ｚ＋３６．９６１
（ｙ－２５．８０５）／２．０７５９＝－０．３８８１ｚ＋３６．９６１

【数2】

ｙ－２５．８０５＝－０．８０５６５７ｚ＋７６．７２７３
ｙ＝－０．８０５６５７ｚ＋１０２．５３２３（３）
したがって、ＦｃγＲＩＩａ結合における高マンノースの応答係数は－０．８１である

【0181】

抗ＣＤ２０抗体上の高マンノースの評価のための試料は、β－ガラクトースがＡＤＣＰ活性に有意な影響を及ぼさないので、操作はより簡単であった。フコシル化についてわかったことと同様に、図１２Ａに示すように、抗ＣＤ２０抗体では高マンノースレベルの増加に伴ってＡＤＣＰ活性がわずかに直線的に減少する。また、図１２Ｂに、対応するＦｃγＲＩＩａ ＡｌｐｈａＬＩＳＡ結合アッセイの結果を示すが、高マンノースと同様に負の相関を示している。ここでも、ＡＤＣＰアッセイは直交結合アッセイよりも、わずかではあるが、より大きなグリカン効果を示している。

【0182】

考察
ＣＤ２０及びＨＥＲ２抗体の応答係数によって測定した、ＡＤＣＰ活性に対する種々のグリカン種の影響の要約を表３にまとめる。特定のグリカン（非フコース、高マンノース又は末端β－ガラクトース）の量が各抗体において増加した場合、ＡＤＣＰ活性の増加（表３において、正数で示される）又はＡＤＣＰ活性の減少（表３において、負数で示される）が観察された。

【0183】

【表3】

【0184】

治療用抗体の製造において、分子が媒介することができるエフェクター機能活性の全てを確認し、特徴付けることが重要である。ＡＤＣＣ及びＣＤＣアッセイは十分に確立されているが、ＡＤＣＰは必要とされるアッセイの感度及び範囲がより限定されているために、活性及び作用の可能なメカニズムとして見過ごされやすく、活性に影響を及ぼす品質特性はあまり理解されていない。しかしながら、ＡＤＣＰは、現在市販されている少なくとも２つの治療用モノクローナル抗体の作用の可能なメカニズムとして示唆されている（Ｋｉｍ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｄｒｉｆｔｓ ｉｎ ＡＤＣＣ－ｒｅｌａｔｅｄ ｑｕａｌｉｔｙ ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｒ）：Ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｂｉｏｓｉｍｉｌａｒ．ｍＡｂｓ ２０１７；９：７０４－１４、及びＷｅｎｇ ＷＫ，Ｌｅｖｙ Ｒ．Ｔｗｏ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｐｒｅｄｉｃｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｎｃｏｌｏｇｙ：Ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２００３；２１：３９４０－７）ので、ＡＤＣＰ活性に影響を及ぼし得る重要品質特性をモニターすることは極めて重要である。実際、これらの活性のいずれかを示す分子では、適切なプロセス制御を確実にするために、またバイオシミラーの開発における分析的類似性の実証のために、これらの構造／機能関係を解明することが必須であろう。この目的を達成するための中心は、製造プロセスの一部として変化し得る品質特性の変化に敏感な機能アッセイの開発である。本研究では、それぞれ単離された広範囲の３つの主要なグリカン種を得るために、組み合わせた酵素修飾及び濃縮プロセスを使用して、ＣＨＯ産生プロセスで産生された２つの代表的な治療用モノクローナル抗体から材料を生成した。本発明者らは、グリカン種とエフェクター活性との間の関係をより正確に見出すために、プロセスパラメーターを調節することによって可能であるよりも実質的に広い範囲を達成することができた。

【0185】

ＩｇＧ抗体ＦｃドメインとＦｃγ受容体ファミリーメンバーとの間の相互作用の性質は、Ｒｅｕｓｃｈ Ｄ，Ｔｅｊａｄａ ＭＬ．Ｆｃ ｇｌｙｃａｎｓ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｑｕａｌｉｔｙ ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１５；２５：１３２５－３４に広範囲に概説されている。保存されたグリカン及び種々の構造形態の役割は、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＡＤＣＣについての結合及び機能的研究によって十分に確立されているが、ＦｃγＲＩＩａ及びＡＤＣＰに対するグリカン構造の影響はあまり明確にされていない。ほとんどの研究は保存されたＮ結合型グリカンの構造とＦｃγＲＩＩａ結合及びＡＤＣＰとの間の実質的な関係を見出していないが、相関を観察する報告は少数存在する。Ｃｈｕｎｇら（Ｃｈｕｎｇ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｃｏｓｅ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ａ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｎ Ｆｃｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．ｍＡｂｓ ２０１２；４：３２６－４０を参照）は、抗ＣＤ２０抗体の場合、０～１００％の非フコシル化レベルの増加に伴ってＦｃγＲＩＩａ結合が増加する傾向があることを見出した。これらのデータは、ＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて、ＤＰ１２（野生型生成）及びＦＵＴ８欠損（非フコース生成）ＣＨＯ細胞株からの混合試料を試験して得られた。本発明者らは、レポーター遺伝子ＡＤＣＰアッセイにおいて、非フコシル化のレベルの増加に伴って抗ＨＥＲ２抗体でわずかな増加を観察する一方、抗ＣＤ２０抗体ではむしろ活性がわずかに減少することを見出した。アッセイ形式の違い、並びにＣｈｕｎｇらが結合試験に１３１Ｒアロタイプを使用し、一方、本研究では１３１Ｈアロタイプを使用したという事実が、異なる観察の一因になった可能性がある。結果はまた、これらの研究に異なる抗ＣＤ２０分子が使用された可能性、並びに本研究で使用されたインビトロ工学プロセスで示されていないＦＵＴ８欠損宿主に由来する他の構造的差異が存在し得る可能性によっても影響されている可能性がある。注目すべきことに、別の研究（Ｇｏｌａｙ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＤ２０ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ ａｎｄ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ＣＤ１６Ｂ ｍｏｒｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｔｈａｎ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ．Ｂｌｏｏｄ ２０１３；１２２：３４８２－９１）は、フコシルトランスフェラーゼの基質ではなく、したがって主に非フコシル化形態として発現するバイセクト型グリカンを生じる、誘導型Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎｔＩＩＩ）発現によるＣＨＯ株での産生によって糖質改変された抗ＣＤ２０抗体を使用している。Ｕｍａｎａ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｇｌｙｃｏｆｏｒｍｓ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ＩｇＧ１ ｗｉｔｈ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ －ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９９；１７：１７６－８０を参照されたい。その研究では、著者らは、１３１Ｒアロタイプに対するＦｃγＲＩＩａ結合についてフコースレベルからの影響を実質的に観察することはなかったが、表面プラズモン共鳴による測定で、１３１Ｈアロタイプへの結合のわずかな減少を観察し、これは本発明者らの研究と一致しているであろう。最近の研究で、ガラクトースレベルが影響を及ぼすことが確認されている（Ｃｈｕｎｇ ＡＷ ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｔｈａｔ ｐｒｅｄｉｃｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ－ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ａｉｄｓ ２０１４；２８：２５２３－３０を参照）。この研究において、著者らは、ガラクトースなどの末端の糖を高レベルで含有する抗体の、ヒトマクロファージ細胞株ＡＤＣＰアッセイ、及びＦｃγＲＩＩａ結合のＳＰＲ結合アッセイにおける増加を観察することができた。これらの実験に特有であるが、グリカン種は全て、本研究で使用されているβ結合ではなくα結合が主であり、且つ、はるかに一般的に使用されているＣＨＯ宿主細胞株上に存在する種々のマウスモノクローナル抗体上にあった。別の研究は、ＦｃγＲＩＩａに構造的に関連する受容体であるＦｃγＲＩＩｂへのマウスモノクローナルの結合に対するガラクトースレベルの効果に注目した（Ｗｏｏｆ ＪＭ，Ｂｕｒｔｏｎ ＤＲ．Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｅｄ ｂｙ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００４；４：８９－９９を参照）が、抑制性の細胞内シグナル伝達モチーフを有した。ＦｃγＲＩＩａにより媒介されると考えられる好中球活性についてのいくつかのインビボアッセイにおいて、これらの著者らは、酵素により完全に脱ガラクトシル化された形態の分子よりも、酵素により完全にガラクトシル化された形態がはるかに高い活性を有することを観察した。Ｋａｒｓｔｅｎ ＣＭ ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＩｇＧ１ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ｆｃ ｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＢ ａｎｄ ｄｅｃｔｉｎ－１．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１２；１８：１４０１－６。そこで、ＦｃγＲＩＩａ結合及びシグナル伝達活性に対するグリカン構造への影響を探す努力がなされてきたが、この報告は、ＦｃγＲＩＩａ結合についての細胞ベースのアッセイにおいて、多くの異なるグリカン種を系統的に評価する最初の努力であると思われる。

【0186】

おそらく、ＡＤＣＰ活性の構造決定因子を研究する上での最大の課題は、ドナー間の応答変動に感受性のあるプライマリーエフェクター細胞、並びにアッセイアウトプットに影響を与え得る受容体のアロタイプの差異、及び他の背景にある遺伝的な変化や表現型の変化に依存することであった。また、他にも記載されているように、多くの異なるＦｃγＲ型が対象のエフェクター細胞に発現され得るので、食細胞上のＡＤＣＰに関連するレセプターを識別することは一般により困難である。Ａｃｋｅｒｍａｎ ＭＥ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｒｏｂｕｓｔ，ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ａｓｓａｙ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓａｍｐｌｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１１；３６６：８－１９を参照されたい。それ故、医薬品の開発にこれらのタイプのアッセイの限界があり、品質管理設定における特徴付けが認識されるべきである。これらの課題を回避するために、Ｔａｄａら（Ｔａｄａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩａ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ ２０１４；９：ｅ９５７８７）は、ＦｃγＲＩＩａ媒介ＡＤＣＰのレポーター遺伝子アッセイを開発した。このアッセイは上記の多くの限界を克服した。ＡＤＣＰ活性についてレポーター遺伝子アッセイを使用することの有用性及び便利さを示すことに加えて、彼らは、セツキシマブのメチオニン酸化によるＡＤＣＰ活性への影響を見出した。

【0187】

同様のアッセイ法を用いて、本発明者らは、一般的なグリコフォームがＩｇＧ１ ｍＡｂ間でＡＤＣＰ活性に対する実質的且つ差次的影響を有し得ることを初めて報告する。最も印象的なのは、抗ＨＥＲ２抗体に対するβ－ガラクトースの影響である。末端β－ガラクトースレベル範囲が、一般的な製造プロセスの間に観察されるレベルに限定される場合でさえ、活性に１０倍の変化が認められた。興味深いことに、同様の大きさの影響であるが、反対方向の影響（レベルの増加に伴って抑制される）が、この抗体上の高マンノースについて見出された。そのような結果は、ＡＤＣＰが提案された作用メカニズムの一部である任意のそのような分子についての制御戦略を与えることができよう。興味深いことに、抗ＣＤ２０抗体については、同様に広範囲の末端β－ガラクトースレベルで実質的な影響は観察されなかった。対照的に、同じ分子について、非フコシル化及び高マンノースの影響は、ＦｃγＲＩＩＩａ結合及びＡＤＣＣについて一般に予測されるものとは逆である。これらのグリカンがＡＤＣＣに及ぼす影響の構造的基礎は、ＦｃｇＲＩＩＩａとＩｇＧ１ Ｆｃドメインとの共結晶構造から明らかになった。Ｆｅｒｒａｒａ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｕｎｉｑｕｅ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｅｔｗｅｅｎ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｌａｃｋｉｎｇ ｃｏｒｅ ｆｕｃｏｓｅ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ２０１１；１０８：１２６６９－７４を参照されたい。ＦｃγＲＩＩａ結合についての同様の構造研究が行われるとしたら、同様に明らかになり得る。

【0188】

最終観察として、ここに提示した結果は、グリカンの影響が観察される場合、応答の大きさは、それ自体一般に結合差に対するＳＰＲ又はＥＬＩＳＡアッセイフォーマットよりも応答性が高い直交ＡｌｐｈａＬＩＳＡ結合アッセイによって報告された大きさよりも大きい可能性があることを示している。Ｘｕ Ｚ，ｅｔ ａｌ．Ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ＣＴＬＡ４－Ｉｇ ｔｏ ｍｏｄｕｌａｔｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１２；１８９：４４７０－７を参照されたい。細胞ベースのアッセイ及び結合アッセイの両方を利用するＡＤＣＣの影響特性の報告が、細胞ベースの活性アッセイよりも結合アッセイの方が応答性がより高いことを見出していると考えると、このＡＤＣＰアッセイで見られる応答性は独特であり得る。Ｒｅｕｓｃｈ Ｄ，Ｔｅｊａｄａ ＭＬ．Ｆｃ ｇｌｙｃａｎｓ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｑｕａｌｉｔｙ ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１５；２５：１３２５－３４を参照されたい。またＣｈｕｎｇ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１４；４０７：６３－７５も参照されたい。この事実は、ＦｃγＲＩＩａ結合についてのこのアッセイの潜在的な感度及び有用性をさらに強調する。

【0189】

結論として、細胞表面標的に誘導された全てのＩｇＧ１ ｍＡｂが全てのエフェクター機能を誘発する同じ能力を有するわけではなく、そして、活性が存在する場合、品質特性は、異なるエフェクター機能に差次的な影響を有し得る。このことは、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの活性評価と同様にＡＤＣＰ活性を丁寧に評価し、且つ製造プロセスにおいて関連する重要品質特性を制御することの重要性を強調するものである。また、プラットフォーム制御戦略が適切でない可能性があるため、ケースバイケースで適切な制御を確立する必要性も強調される。この目的のために、本発明者らは、そうでなければ見過ごされていたかもしれないエフェクター機能に関連するＣＱＡを明らかにすることができる、高スループットの可能性を有する高分解能アッセイを有することの価値を強調する。生理学的に関連するアッセイを追求したいという願望はプライマリー細胞への依存につながる可能性があるが、最良のアプローチは、仮説検証のための生理学的状況を提供するプライマリー細胞アッセイと、産生パラメーターを確立する強固で感度が高くハイスループットのレポーター遺伝子アッセイの組み合わせを適用することであり得る。

【0190】

参照文献
１． Ｊｉａｎｇ ＸＲ，Ｓｏｎｇ Ａ，Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ Ｓ，Ａｒｒｏｌｌ Ｔ，Ｐａｒｅｋｈ Ｂ，Ｍａｙ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２０１１；１０：１０１－１１．
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３． Ｏｋａｚａｋｉ Ａ，Ｓｈｏｊｉ－Ｈｏｓａｋａ Ｅ，Ｎａｋａｍｕｒａ Ｋ，Ｗａｋｉｔａｎｉ Ｍ，Ｕｃｈｉｄａ Ｋ，Ｋａｋｉｔａ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｆｕｃｏｓｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｎｔｈａｌｐｙ ａｎｄ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ＩｇＧ１ ａｎｄ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ２００４；３３６：１２３９－４９．
４． Ｆｅｒｒａｒａ Ｃ，Ｇｒａｕ Ｓ，Ｊａｇｅｒ Ｃ，Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ Ｐ，Ｂｒｕｎｋｅｒ Ｐ，Ｗａｌｄｈａｕｅｒ Ｉ，ｅｔ ａｌ．Ｕｎｉｑｕｅ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｅｔｗｅｅｎ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｌａｃｋｉｎｇ ｃｏｒｅ ｆｕｃｏｓｅ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ２０１１；１０８：１２６６９－７４．
５． Ｔｈｏｍａｎｎ Ｍ，Ｒｅｃｋｅｒｍａｎｎ Ｋ，Ｒｅｕｓｃｈ Ｄ，Ｐｒａｓｓｅｒ Ｊ，Ｔｅｊａｄａ ＭＬ．Ｆｃ－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１６；７３：６９－７５．
６． Ｈｏｄｏｎｉｃｚｋｙ Ｊ，Ｚｈｅｎｇ ＹＺ，Ｊａｍｅｓ ＤＣ．Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｂｙ Ｆｃ Ｎ－ｇｌｙｃａｎ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ２００５；２１：１６４４－５２．
７． Ｓｈｉｎｋａｗａ Ｔ，Ｎａｋａｍｕｒａ Ｋ，Ｙａｍａｎｅ Ｎ，Ｓｈｏｊｉ－Ｈｏｓａｋａ Ｅ，Ｋａｎｄａ Ｙ，Ｓａｋｕｒａｄａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｆｕｃｏｓｅ ｂｕｔ ｎｏｔ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｇａｌａｃｔｏｓｅ ｏｒ ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ｃｏｍｐｌｅｘ－ｔｙｐｅ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｓｈｏｗｓ ｔｈｅ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００３；２７８：３４６６－７３．
８． Ｕｍａｎａ Ｐ，Ｊｅａｎ－Ｍａｉｒｅｔ Ｊ，Ｍｏｕｄｒｙ Ｒ，Ａｍｓｔｕｔｚ Ｈ，Ｂａｉｌｅｙ ＪＥ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｇｌｙｃｏｆｏｒｍｓ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ＩｇＧ１ ｗｉｔｈ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９９；１７：１７６－８０．
９． Ｋｉｍ Ｓ，Ｓｏｎｇ Ｊ，Ｐａｒｋ Ｓ，Ｈａｍ Ｓ，Ｐａｅｋ Ｋ，Ｋａｎｇ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｄｒｉｆｔｓ ｉｎ ＡＤＣＣ－ｒｅｌａｔｅｄ ｑｕａｌｉｔｙ ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｒ）：Ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｂｉｏｓｉｍｉｌａｒ．ｍＡｂｓ ２０１７；９：７０４－１４．
１０． Ｗｅｎｇ ＷＫ，Ｌｅｖｙ Ｒ．Ｔｗｏ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｐｒｅｄｉｃｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ：ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２００３；２１：３９４０－７．
１１． Ｚｈａｎｇ Ｗ，Ｇｏｒｄｏｎ Ｍ，Ｓｃｈｕｌｔｈｅｉｓ ＡＭ，Ｙａｎｇ ＤＹ，Ｎａｇａｓｈｉｍａ Ｆ，Ａｚｕｍａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．ＦＣＧＲ２Ａ ａｎｄ ＦＣＧＲ３Ａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｉｎｇｌｅ－ａｇｅｎｔ ｃｅｔｕｘｉｍａｂ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ：ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２００７；２５：３７１２－８．
１２． Ｐｅｔｒｉｃｅｖｉｃ Ｂ，Ｌａｅｎｇｌｅ Ｊ，Ｓｉｎｇｅｒ Ｊ，Ｓａｃｈｅｔ Ｍ，Ｆａｚｅｋａｓ Ｊ，Ｓｔｅｇｅｒ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｄｉａｔｅｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｔｏ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｅｘｔｅｎｔ ｉｎ ｂｏｔｈ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ＨＥＲ２／ｎｅｕ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１３；１１：３０７．
１３． Ｔａｄａ Ｍ，Ｉｓｈｉｉ－Ｗａｔａｂｅ Ａ，Ｓｕｚｕｋｉ Ｔ，Ｋａｗａｓａｋｉ Ｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩａ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ ２０１４；９：ｅ９５７８７．
１４． Ｒｅａｄ ＥＫ，Ｐａｒｋ ＪＴ，Ｂｒｏｒｓｏｎ ＫＡ．Ｉｎｄｕｓｔｒｙ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１１；５８：２１３－９．
１５． Ａｒｏｒａ Ｔ，Ｐａｄａｋｉ Ｒ，Ｌｉｕ Ｌ，Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ ＡＥ，Ｅｌｌｉｓｏｎ ＡＲ，Ｓｔｅｖｅｎｓ ＳＲ，ｅｔ ａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｌａｓｓｅｓ ｏｆ ＴＮＦ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ２００９；４５：１２４－３１．
１６． Ｃｈｕｎｇ Ｓ，Ｑｕａｒｍｂｙ Ｖ，Ｇａｏ Ｘ，Ｙｉｎｇ Ｙ，Ｌｉｎ Ｌ，Ｒｅｅｄ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｃｏｓｅ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ａ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｎ Ｆｃｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．ｍＡｂｓ ２０１２；４：３２６－４０．
１７． Ｇｏｌａｙ Ｊ，Ｄａ Ｒｏｉｔ Ｆ，Ｂｏｌｏｇｎａ Ｌ，Ｆｅｒｒａｒａ Ｃ，Ｌｅｕｓｅｎ ＪＨ，Ｒａｍｂａｌｄｉ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＤ２０ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ ａｎｄ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ＣＤ１６Ｂ ｍｏｒｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｔｈａｎ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ．Ｂｌｏｏｄ ２０１３；１２２：３４８２－９１．
１８． Ｃｈｕｎｇ ＡＷ，Ｃｒｉｓｐｉｎ Ｍ，Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ Ｌ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｈ，Ｇｏｒｎｙ ＭＫ，Ｙｕ Ｘ，ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｔｈａｔ ｐｒｅｄｉｃｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ－ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ａｉｄｓ ２０１４；２８：２５２３－３０．
１９． Ｗｏｏｆ ＪＭ，Ｂｕｒｔｏｎ ＤＲ．Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｆｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｅｄ ｂｙ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００４；４：８９－９９．
２０． Ｋａｒｓｔｅｎ ＣＭ，Ｐａｎｄｅｙ ＭＫ，Ｆｉｇｇｅ Ｊ，Ｋｉｌｃｈｅｎｓｔｅｉｎ Ｒ，Ｔａｙｌｏｒ ＰＲ，Ｒｏｓａｓ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＩｇＧ１ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ｆｃ ｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＢ ａｎｄ ｄｅｃｔｉｎ－１．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１２；１８：１４０１－６．
２１． Ａｃｋｅｒｍａｎ ＭＥ，Ｍｏｌｄｔ Ｂ，Ｗｙａｔｔ ＲＴ，Ｄｕｇａｓｔ ＡＳ，ＭｃＡｎｄｒｅｗ Ｅ，Ｔｓｏｕｋａｓ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｒｏｂｕｓｔ，ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ａｓｓａｙ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓａｍｐｌｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１１；３６６：８－１９．
２２． Ｘｕ Ｚ，Ｊｕａｎ Ｖ，Ｉｖａｎｏｖ Ａ，Ｍａ Ｚ，Ｐｏｌａｋｏｆｆ Ｄ，Ｐｏｗｅｒｓ ＤＢ，ｅｔ ａｌ．Ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ＣＴＬＡ４－Ｉｇ ｔｏ ｍｏｄｕｌａｔｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１２；１８９：４４７０－７．
２３． Ｃｈｕｎｇ Ｓ，Ｌｉｎ ＹＬ，Ｒｅｅｄ Ｃ，Ｎｇ Ｃ，Ｃｈｅｎｇ ＺＪ，Ｍａｌａｖａｓｉ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ － ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１４；４０７：６３－７５．

【0191】

本明細書で引用される全ての刊行物、特許及び特許出願は、各々の個々の刊行物、特許又は特許出願が具体的且つ個別に参照により組み込まれるとあたかも示されたかのように、参照により本明細書に組み込まれる。上記の発明は、理解を明確にする目的で、説明や例によってある程度詳細に記載されているが、本開示の教示に照らして、開示された実施形態の精神又は範囲から逸脱することなく、それに対して特定の変更及び修正がなされ得ることは、当業者には容易に明らかであろう。本明細書で使用される項目の見出しは、単に構成を目的とするものに過ぎず、記載される主題を限定するものと解釈されるべきではない。

【0192】

本明細書における値の範囲の記載は、本明細書に別段の指示がない限り、単に、その範囲及び各端点にある別個の値の各々を個々に指す簡略法の役目をするものに過ぎず、別個の値及び端点の各々は、それが個々に本明細書に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。

【0193】

本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り又は文脈と明確に矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供されるあらゆる例又は例示的な語（例えば、「など」）の使用は、単に本開示をさらに明らかにするものであり、別段の主張がない限り、本開示の範囲に限定を課すものではない。本明細書におけるいかなる語も、任意の特許請求されていない要素を本開示の実施に必須として示していると解釈されるべきではない。

【0194】

本開示を実行するために、本発明者らには既知の最良の形態を含む、本開示の好ましい実施形態が本明細書に記載される。それらの好ましい実施形態の変形形態は、上述の記載を読めば、当業者には明らかになるであろう。本発明者らは、当業者が必要に応じてこのような変形形態を採用することを期待し、また、本発明者らは、本明細書で具体的に記載されている形態以外で本開示が実施されることを意図している。したがって、この開示には、適用可能な法律により許容される場合、本明細書に添付される特許請求の範囲で示される主題の全ての変更物及び均等物が含まれる。さらに、上記の要素の全ての可能な変形形態におけるそれらの要素の任意の組み合わせは、本明細書に別段の指示がない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、本開示に包含される。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【配列表】

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