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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-23
(45)【発行日】2024-09-02
(54)【発明の名称】腫瘍溶解性ワクシニアウイルス
(51)【国際特許分類】
C12N 7/04 20060101AFI20240826BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240826BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240826BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20240826BHJP
C12N 15/863 20060101ALI20240826BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240826BHJP
C12N 15/39 20060101ALN20240826BHJP
【ＦＩ】
C12N7/04
A61K35/76
A61P35/00
A61P37/02
C12N15/863 Z
C12N15/12
C12N15/39 ZNA
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2021539282
(86)(22)【出願日】2020-08-07
(86)【国際出願番号】 JP2020030448
(87)【国際公開番号】W WO2021029385
(87)【国際公開日】2021-02-18
【審査請求日】2023-04-14
(31)【優先権主張番号】P 2019147885
(32)【優先日】2019-08-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】318010328
【氏名又は名称】ＫＭバイオロジクス株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(72)【発明者】
【氏名】村上 利夫
(72)【発明者】
【氏名】沖田 剛
(72)【発明者】
【氏名】上水流 結
【審査官】長谷川 強
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１５／０７６４２２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１１－５０４１０４（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ７／０４
Ａ６１Ｋ ３５／７６
Ａ６１Ｐ ３５／００
Ａ６１Ｐ ３７／０２
Ｃ１２Ｎ １５／８６３
Ｃ１２Ｎ １５／１２
Ｃ１２Ｎ １５／３９
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ）、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）活性化タンパク質、及びリボヌクレオチド還元酵素（ＲＮＲ）の機能が欠損した、Ｃ１１Ｒ、Ｏ１Ｌ、及びＦ４Ｌの各遺伝子の全部又は一部の領域が削除又は改変され、これらの遺伝子産物の機能が不活化されているワクシニアウイルスであって、
ここで、細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）関連タンパク質をコードする遺伝子が、ＥＥＶ産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子で置換されており、
細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）関連タンパク質をコードする遺伝子が、Ａ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、及びＦ１３Ｌよりなる群から選ばれたひとつ又は複数の遺伝子であり、ＥＥＶ産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子で置換されており、
ＥＥＶ産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子がワクシニアウイルスＩＨＤ－Ｊ株またはＩＨＤ－Ｗ株に存在するＡ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、及びＦ１３Ｌからなる群から選択されるＥＥＶ関連タンパク質と同一のアミノ酸配列をコードする遺伝子である、
ワクシニアウイルス。
【請求項2】
正常細胞内では複製せず、増殖細胞内で選択的に複製可能な、安全性が向上した制限増殖型の請求項１に記載のウイルス。
【請求項3】
細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）関連タンパク質をコードする遺伝子が、Ａ３３Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、及びＦ１３Ｌ遺伝子であり、ＥＥＶ産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子で置換されており、ＥＥＶ産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子がワクシニアウイルスＩＨＤ－Ｊ株またはＩＨＤ－Ｗ株に存在するＡ３３Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、及びＦ１３Ｌからなる群から選択されるＥＥＶ関連タンパク質と同一のアミノ酸配列をコードする遺伝子である、請求項１または２に記載のウイルス。
【請求項4】
細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）関連タンパク質をコードする遺伝子が、Ａ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、及びＦ１３Ｌ遺伝子であり、ＥＥＶ産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子で置換されており、ＥＥＶ産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子がワクシニアウイルスＩＨＤ－Ｊ株またはＩＨＤ－Ｗ株に存在するＡ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、及びＦ１３Ｌからなる群から選択されるＥＥＶ関連タンパク質と同一のアミノ酸配列をコードする遺伝子である、請求項１または２に記載のウイルス。
【請求項5】
請求項１－４のいずれか１項に記載のウイルスを含む、癌治療のための医薬組成物。
【請求項6】
静脈内投与用、腹腔内投与用又は腫瘍内投与用である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項7】
請求項１－５のいずれか１項に記載のウイルスに外来ＤＮＡを導入した制限増殖型ワクシニアウイルスベクター。
【請求項8】
外来ＤＮＡが、癌特異抗原遺伝子、免疫応答制御分子、又は癌細胞表面抗原親和性タンパク質をコードするＤＮＡである、請求項７に記載のベクター。
【請求項9】
正常細胞内では複製せず、増殖細胞内で選択的に複製可能な制限増殖型ワクシニアウイルスの細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）関連タンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列を、ＥＥＶ産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子のＤＮＡ配列で置換することを含む、制限増殖型ワクシニアウイルスの生産性を向上させる方法であって、
ここで、制限増殖型ワクシニアウイルスが、ワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ）、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）活性化タンパク質、及びリボヌクレオチド還元酵素（ＲＮＲ）の機能が欠損した、Ｃ１１Ｒ、Ｏ１Ｌ、及びＦ４Ｌの各遺伝子の全部又は一部の領域が削除又は改変され、これらの遺伝子産物の機能が不活化されており、
ここで、細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）関連タンパク質をコードする遺伝子が、Ａ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、及びＦ１３Ｌよりなる群から選ばれたひとつ又は複数の遺伝子であり、
ＥＥＶ産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子がワクシニアウイルスＩＨＤ－Ｊ株またはＩＨＤ－Ｗ株に存在するＡ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、及びＦ１３Ｌからなる群から選択されるＥＥＶ関連タンパク質と同一のアミノ酸配列をコードする遺伝子である、
方法。
【請求項10】
細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）関連タンパク質をコードする遺伝子が、Ａ３３Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、及びＦ１３Ｌ遺伝子である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）関連タンパク質をコードする遺伝子が、Ａ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、及びＦ１３Ｌ遺伝子である、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ）、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）活性化タンパク質、及びリボヌクレオチド還元酵素（ＲＮＲ）の機能を欠損させることにより正常細胞内でのウイルス複製を制限し、安全性を向上させるとともに、ワクシニアウイルスの細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）のビリオン形成に関連するタンパク質のアミノ酸残基を改変することにより腫瘍細胞及び工業生産に用いる宿主細胞でのウイルス生産性を向上させたことを特徴とする、静脈内投与可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスに関する。本発明のワクシニアウイルスは、ウイルスの安全性及び生産性がともに向上しており、抗癌剤として有効に用いることができる。
【背景技術】
【0002】
腫瘍溶解性ワクシニアウイルスとして、ワクシニアウイルス増殖因子（以下、「ＶＧＦ」ともいう）及び細胞外シグナル調節キナーゼ（以下、「ＥＲＫ」ともいう）を活性化するタンパク質であるＯ１Ｌタンパク質をコードする両遺伝子を欠損させることにより、正常細胞内では増殖が制限され、癌細胞内で特異的に増殖し、癌細胞を障害する分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ依存性ワクシニアウイルス（ＭＤ－ＲＶＶ）が開示されている（特許文献１）。
【0003】
ワクシニアウイルスは上皮増殖因子（以下、「ＥＧＦ」ともいう）受容体シグナル伝達経路を利用し、迅速で直接的な感染細胞の運動性を介してウイルスの拡散を促進する（非特許文献１）。ワクシニアウイルスの感染初期に分泌される、ＥＧＦと高い相同性を持つワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ）であるＣ１１Ｒタンパク質は、感染細胞及び周囲の細胞上のＥＧＦ受容体に結合し、ＭＡＰキナーゼカスケード（Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ代謝経路）にシグナルを伝達する。またワクシニアウイルスのＯ１Ｌタンパク質は、感染細胞内の細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）を持続的に活性化し、ウイルスの病原性を促進する（非特許文献２）。Ｃ１１Ｒ及びＯ１Ｌを欠損したウイルス（ＭＤ－ＲＶＶ）は、正常細胞ではＥＲＫを活性化できないためウイルス増殖を低下させるが、ＥＲＫ経路が異常に活性化している癌細胞では、不活化されているウイルスのＥＲＫの活性化機能が補われ、ウイルスが増殖し癌細胞を破壊する腫瘍溶解性ウイルスとなる（特許文献１）。
【0004】
ウイルス毒性を軽減させるために、ウイルスゲノムにコードされたリボヌクレオチド還元酵素を不活性化させたポックスウイルスを用いた腫瘍溶解性ウイルスが開示されている（特許文献２）。
【0005】
ワクシニアウイルスのＡ３４Ｒポリペプチドのアミノ酸位置Ｋ１５１の点変異が細胞外エンベロープウイルスの産生を向上させることが公知である（非特許文献３及び特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】再表２０１５／０７６４２２
【文献】特表２０１１－５０４１０４
【文献】特表２００６－５０６９７４
【非特許文献】
【0007】
【文献】Ｂｅｅｒｌｉ Ｃ．，ｅｔ ａｌ．, Ｎａｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４（２），２１６－２２５，２０１９
【文献】Ｓｃｈｗｅｎｅｋｅｒ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．, Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８６（４），２３２３－２３３６，２０１２
【文献】Ｂｌａｓｃｏ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６７（６），３３１９－３３２５，１９９３
【文献】Ｄｏｗｎｓ－Ｃａｎｎｅｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２４（８），１４９２－１５０１，２０１６
【文献】Ｌｏｒｅｎ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３（１９），５６９６－５７０２, ２０１７
【文献】ＭｃＩｎｔｏｓｈ Ａ．Ａ．，Ｓｍｉｔｈ Ｇ．Ｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７０（１），２７２－２８１, １９９６
【文献】Ｆｅｒｇｕｓｏｎ Ｍ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１２，８０５６２９，２０１２
【文献】Ｂａｄｒｉｎａｔｈ Ｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，１１，４８３５－４８４７，２０１６
【文献】Ｂｅｒｎｅｔ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，２８（３），２４９－２６４，２００３
【文献】Ｄｅｈａｖｅｎ Ｂ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ., Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ, ９２, １９７１-１９８０，２０１１
【文献】Ｃｈｕｎｇ，Ｃ．－Ｓ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７２（２），１５７７-１５８５，１９９８
【文献】Ｇａｍｍｏｎ，Ｄ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，６（７），ｅ１０００９８４，２０１０
【文献】Ａｙｅ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，３４（１６），２０１１－２０２１，２０１５
【文献】Ｅｎｇｓｔｒｏｅｍ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．, Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６０（１６），９１１４－９１１６，１９８５
【文献】Ｔｏｒｉｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ，９７（８），６９７－７０２，２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、腫瘍内投与による原発巣に対する治療のみならず、静脈注射で全身投与することにより、全身性の微小転移癌に対する効果も期待できる。しかしながら、これまでに腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを静脈内投与した臨床試験では、有効性を示唆する結果とともに、ウイルスの排出を伴う副作用が観察されており（非特許文献４；非特許文献５）、腫瘍溶解性ウイルスのさらなる安全性向上が求められていた。
【0009】
一方、安全性向上のために正常細胞におけるウイルスの増殖性が抑制されるように遺伝子改変された腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞及び工業生産で使用する宿主細胞において、遺伝子改変前の親株ウイルスと比較して、しばしばウイルス増殖性の低下を伴い、有効性及び生産性の低下が懸念される。そのため、ウイルスの安全性を向上させるとともに、生産性をも向上させることが望まれていた。
【0010】
しかしながら、有効性及び生産性向上のために、細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）関連タンパク質をコードする遺伝子を改変し、ＥＥＶの割合を増加させることは有用であるが、ＥＥＶ産生量の増加はウイルス毒性に関連する（非特許文献６）。
【0011】
これまでに報告されている腫瘍溶解性ウイルスの静脈内投与の臨床試験データは、それらのウイルスが限られた毒性で安全に全身的に送達され得ることを示したが、有効性に個体差が認められるなどの不完全さが認められる。この主な理由は、安全性が確認された用法・用量で、ウイルスが標的に到達する前にウイルスが循環から急速に排除されるためである。この現象は、肺、肝臓及び脾臓などの他の組織による非特異的な取り込みとともに、主に中和抗体、補体活性化、抗ウイルス性サイトカイン、及び組織内在性マクロファージを介して行われる（非特許文献７）。腫瘍溶解性ウイルスの中で、ワクシニアウイルスは、その多くの好ましい性質のために前臨床及び臨床研究の焦点となっている（非特許文献８）。いくつかの腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、静脈内投与による臨床試験が実施されている。ワクシニアウイルスが分泌するワクシニアウイルス補体制御タンパク質（以下、「ＶＣＰ」ともいう）は補体Ｃ４ｂ及びＣ３ｂを結合及び不活性化し、それにより補体活性化の古典的経路及び代替経路を阻害する（非特許文献９）。また、ＥＥＶ形態のワクシニアウイルスは、その膜内に補体活性化を防止し得る宿主タンパク質を組み込むとともに、ＥＥＶタンパク質であるＡ５６Ｒが分泌されたＶＣＰを固定し補体攻撃から保護している（非特許文献１０）。
【0012】
ワクシニアウイルスは特異的なレセプターが存在せず、動物の結合組織を中心にあらゆる組織に普遍的に存在するヘパラン硫酸のようなグリコサミノグリカンがワクシニアウイルスと宿主細胞との相互作用を媒介し、原形質膜にウイルスが直接融合し、エンドサイトーシスによって腫瘍細胞に入る（非特許文献１１）。従って、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは臓器により特異的な細胞指向性を示さず、幅広い癌種での治療効果が期待できる。その反面、静脈内投与による治療を実施する際には、ウイルス増殖による全身性の副作用が課題となる。この課題を解決するために、ワクシニアウイルスが正常細胞に感染し、侵入した後に生じる細胞内でのウイルス複製を厳しく制限する必要がある。一般に、抗癌剤は有効域と毒性域が近接しているため、有効性が期待される用法・用量で副作用が発生する。
【課題を解決するための手段】
【0013】
ワクシニアウイルスゲノムには、ＤＮＡ合成における律速酵素であるリボヌクレオチド還元酵素（以下、「ＲＮＲ」ともいう）遺伝子が、Ｉ４Ｌ（大サブユニット；ＲＲＭ１）及びＦ４Ｌ（小サブユニット；ＲＲＭ２）としてコードされており、培養細胞中での効率的な複製及びマウスでのウイルス毒性には、Ｆ４Ｌが必要である（非特許文献１２）。一方、細胞におけるＲＮＲ発現の上昇は多くの癌の特徴であり、ＯＮＣＯＭＩＮＥデータベースを使用してヒトの癌におけるＲＮＲ遺伝子発現を調査した結果、ＲＲＭ２は分析した１６８の癌のうち７３で最も過剰発現されている遺伝子のトップ１０％であった（非特許文献１３）。また、哺乳動物のＲＮＲ活性は細胞周期に依存し、ＲＲＭ１のタンパク質レベルは細胞周期を通して一定であるが、ＲＲＭ２はＤＮＡ複製が起こるＧ１／Ｓ期の間に発現し、細胞周期依存性の酵素活性はＲＲＭ２のレベルにより制御されている（非特許文献１４）。一方、Ｇ１期からＳ期への細胞周期の進行は活性化したＥＲＫ経路により引き起こされる（非特許文献１５）。従って、Ｆ４Ｌの機能を阻害したワクシニアウイルスは、細胞増殖が盛んな癌細胞では細胞由来のＲＲＭ２を利用してウイルスの複製が可能となるが、正常細胞ではＲＲＭ２の発現レベルが低いためウイルス複製が制限される。Ｃ１１Ｒ及びＯ１Ｌの機能が阻害されたＭＤ－ＲＶＶからさらにＦ４Ｌを削除することにより、正常細胞でのウイルス増殖性が著しく抑制され、安全性がさらに向上する。
【0014】
正常細胞内では増殖できず、標的とする癌細胞内で選択的に増殖可能な制限増殖型ウイルスである腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞及び工業生産に用いる宿主細胞においても、親株ウイルスと比較して増殖性が低下する傾向が予測される。前述のＣ１１Ｒ及びＯ１Ｌに加えてＦ４Ｌ遺伝子を削除した腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、増殖能が高い癌細胞では、ウイルス複製に必要なＥＲＫ及びＲＮＲを癌細胞内の酵素で補い、ウイルス複製が行われる。
【0015】
本発明者らは、細胞増殖に関連するＥＲＫ及びＲＮＲの機能を欠損させたウイルスの生産性をさらに補う方法として、ウイルス複製に必要なＥＲＫ及びＲＮＲの活性を癌細胞由来の酵素により補填するとともに、ウイルスライフサイクルの後期過程で発現されるビリオン形成に関連する分子に着目した。すなわち、ワクシニアウイルスの４つの異なる形態のビリオン（細胞内成熟ウイルス（以下、「ＩＭＶ」ともいう）、細胞内エンベロープウイルス（以下、「ＩＥＶ」ともいう）、細胞結合エンベロープウイルス（以下、「ＣＥＶ」ともいう）及び細胞外エンベロープウイルス（以下、「ＥＥＶ」））のうち、ＥＥＶの構成要素である７種類のタンパク質（Ａ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、Ｆ１３Ｌ）をコードする遺伝子を、ＥＥＶ産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子で置換することにより、ウイルスの生産性が向上するとともに、安全に静脈投与を行うことが可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0016】
本発明は、以下の［１］～［２０］を提供する。
［１］ワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ）、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）活性化タンパク質、及びリボヌクレオチド還元酵素（ＲＮＲ）の機能が欠損したワクシニアウイルス。
［２］正常細胞内では複製せず、増殖細胞内で選択的に複製可能な、安全性が向上した制限増殖型の［１］に記載のウイルス。
［３］Ｃ１１Ｒ、Ｏ１Ｌ、及びＦ４Ｌの各遺伝子の全部又は一部の領域が削除又は改変され、これらの遺伝子産物の機能が不活化されている、［１］又は［２］に記載のウイルス。
［４］ワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ）、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）活性化タンパク質、及びリボヌクレオチド還元酵素（ＲＮＲ）の機能が欠損しており、さらに、細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）関連タンパク質をコードする遺伝子が、ＥＥＶ産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子で置換されている、正常細胞内では複製せず、増殖細胞内で選択的に複製可能な、安全性及び生産性が向上した制限増殖型ワクシニアウイルス。
［５］Ｃ１１Ｒ、Ｏ１Ｌ、及びＦ４Ｌの各遺伝子の全部又は一部の領域が削除又は改変され、これらの遺伝子産物の機能が不活化されている、［４］に記載のウイルス。
［６］細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）関連タンパク質をコードする遺伝子が、Ａ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、及びＦ１３Ｌよりなる群から選ばれたひとつ又は複数の遺伝子であり、ＥＥＶ産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子で置換されている、［４］又は［５］に記載のウイルス。
［７］細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）関連タンパク質をコードする遺伝子が、Ａ３３Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、及びＦ１３Ｌ遺伝子であり、ＥＥＶ産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子で置換されている、［４］又は［５］に記載のウイルス。
［８］細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）関連タンパク質をコードする遺伝子が、Ａ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、及びＦ１３Ｌ遺伝子であり、ＥＥＶ産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子で置換されている、［４］又は［５］に記載のウイルス。
［９］ＥＥＶ産生能の高い他のワクシニアウイルス株が、ＩＨＤ－Ｊ株又はＩＨＤ－Ｗ株である、［４］～［８］のいずれかに記載のウイルス。
［１０］［１］～［９］のいずれかに記載のウイルスを含む、癌治療のための医薬組成物。
［１１］静脈内投与用、腹腔内投与用又は腫瘍内投与用である、［１０］に記載の医薬組成物。
［１２］［１］～［９］のいずれかに記載のウイルスに外来ＤＮＡを導入した制限増殖型ワクシニアウイルスベクター。
［１３］外来ＤＮＡが、癌特異抗原遺伝子、免疫応答制御分子、又は癌細胞表面抗原親和性タンパク質をコードするＤＮＡである、［１２］に記載のベクター。
［１４］正常細胞内では複製せず、増殖細胞内で選択的に複製可能な制限増殖型ワクシニアウイルスの細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）関連タンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列が、ＥＥＶ産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子のＤＮＡ配列で置換されている、生産性が向上した前記ウイルス。
［１５］細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）関連タンパク質をコードする遺伝子が、Ａ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、及びＦ１３Ｌよりなる群から選ばれたひとつ又は複数の遺伝子である、［１４］に記載のウイルス。
［１６］細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）関連タンパク質をコードする遺伝子が、Ａ３３Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、及びＦ１３Ｌ遺伝子である、［１４］に記載のウイルス。
［１７］細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）関連タンパク質をコードする遺伝子が、Ａ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、及びＦ１３Ｌ遺伝子である、［１４］に記載のウイルス。
［１８］ＥＥＶ産生能の高い他のワクシニアウイルス株が、ＩＨＤ－Ｊ株又はＩＨＤ－Ｗ株である、［１４］～［１７］のいずれかに記載のウイルス。
［１９］［１４］～［１８］のいずれかに記載のウイルスを含む、癌治療のための医薬組成物。
［２０］［１４］～［１８］のいずれかに記載のウイルスに外来ＤＮＡを導入した制限増殖型ワクシニアウイルスベクター。
［２１］外来ＤＮＡが、癌特異抗原遺伝子、免疫応答制御分子、又は癌細胞表面抗原親和性タンパク質をコードするＤＮＡである、［２０］に記載のベクター。
［１］ワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ）、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）活性化タンパク質、及びリボヌクレオチド還元酵素（ＲＮＲ）の機能が欠損したワクシニアウイルス。
［２］正常細胞内では複製せず、増殖細胞内で選択的に複製可能な、安全性が向上した制限増殖型の［１］に記載のウイルス。
［３］Ｃ１１Ｒ、Ｏ１Ｌ、及びＦ４Ｌの各遺伝子の全部又は一部の領域が削除又は改変され、これらの遺伝子産物の機能が不活化されている、［１］又は［２］に記載のウイルス。
［４］ワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ）、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）活性化タンパク質、及びリボヌクレオチド還元酵素（ＲＮＲ）の機能が欠損しており、さらに、細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）関連タンパク質をコードする遺伝子が、ＥＥＶ産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子で置換されている、正常細胞内では複製せず、増殖細胞内で選択的に複製可能な、安全性及び生産性が向上した制限増殖型ワクシニアウイルス。
［５］Ｃ１１Ｒ、Ｏ１Ｌ、及びＦ４Ｌの各遺伝子の全部又は一部の領域が削除又は改変され、これらの遺伝子産物の機能が不活化されている、［４］に記載のウイルス。
［６］細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）関連タンパク質をコードする遺伝子が、Ａ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、及びＦ１３Ｌよりなる群から選ばれたひとつ又は複数の遺伝子であり、ＥＥＶ産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子で置換されている、［４］又は［５］に記載のウイルス。
［７］細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）関連タンパク質をコードする遺伝子が、Ａ３３Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、及びＦ１３Ｌ遺伝子であり、ＥＥＶ産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子で置換されている、［４］又は［５］に記載のウイルス。
［８］細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）関連タンパク質をコードする遺伝子が、Ａ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、及びＦ１３Ｌ遺伝子であり、ＥＥＶ産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子で置換されている、［４］又は［５］に記載のウイルス。
［９］ＥＥＶ産生能の高い他のワクシニアウイルス株が、ＩＨＤ－Ｊ株又はＩＨＤ－Ｗ株である、［４］～［８］のいずれかに記載のウイルス。
［１０］［１］～［９］のいずれかに記載のウイルスを含む、癌治療のための医薬組成物。
［１１］静脈内投与用、腹腔内投与用又は腫瘍内投与用である、［１０］に記載の医薬組成物。
［１２］［１］～［９］のいずれかに記載のウイルスに外来ＤＮＡを導入した制限増殖型ワクシニアウイルスベクター。
［１３］外来ＤＮＡが、癌特異抗原遺伝子、免疫応答制御分子、又は癌細胞表面抗原親和性タンパク質をコードするＤＮＡである、［１２］に記載のベクター。
［１４］正常細胞内では複製せず、増殖細胞内で選択的に複製可能な制限増殖型ワクシニアウイルスの細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）関連タンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列が、ＥＥＶ産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子のＤＮＡ配列で置換されている、生産性が向上した前記ウイルス。
［１５］細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）関連タンパク質をコードする遺伝子が、Ａ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、及びＦ１３Ｌよりなる群から選ばれたひとつ又は複数の遺伝子である、［１４］に記載のウイルス。
［１６］細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）関連タンパク質をコードする遺伝子が、Ａ３３Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、及びＦ１３Ｌ遺伝子である、［１４］に記載のウイルス。
［１７］細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）関連タンパク質をコードする遺伝子が、Ａ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、及びＦ１３Ｌ遺伝子である、［１４］に記載のウイルス。
［１８］ＥＥＶ産生能の高い他のワクシニアウイルス株が、ＩＨＤ－Ｊ株又はＩＨＤ－Ｗ株である、［１４］～［１７］のいずれかに記載のウイルス。
［１９］［１４］～［１８］のいずれかに記載のウイルスを含む、癌治療のための医薬組成物。
［２０］［１４］～［１８］のいずれかに記載のウイルスに外来ＤＮＡを導入した制限増殖型ワクシニアウイルスベクター。
［２１］外来ＤＮＡが、癌特異抗原遺伝子、免疫応答制御分子、又は癌細胞表面抗原親和性タンパク質をコードするＤＮＡである、［２０］に記載のベクター。
【0017】
本発明はさらに、以下の［２２］～［２６］を提供する。
［２２］正常細胞内では複製せず、増殖細胞内で選択的に複製可能な制限増殖型ワクシニアウイルスの細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）関連タンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列を、ＥＥＶ産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子のＤＮＡ配列で置換することを含む、制限増殖型ワクシニアウイルスの生産性を向上させる方法。
［２３］細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）関連タンパク質をコードする遺伝子が、Ａ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、及びＦ１３Ｌよりなる群から選ばれたひとつ又は複数の遺伝子である、［２２］に記載の方法。
［２４］細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）関連タンパク質をコードする遺伝子が、Ａ３３Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、及びＦ１３Ｌ遺伝子である、［２２］に記載の方法。
［２５］細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）関連タンパク質をコードする遺伝子が、Ａ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、及びＦ１３Ｌ遺伝子である、［２２］に記載の方法。
［２６］ＥＥＶ産生能の高い他のワクシニアウイルス株が、ＩＨＤ－Ｊ株又はＩＨＤ－Ｗ株である、［２２］に記載の方法。
［２２］正常細胞内では複製せず、増殖細胞内で選択的に複製可能な制限増殖型ワクシニアウイルスの細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）関連タンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列を、ＥＥＶ産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子のＤＮＡ配列で置換することを含む、制限増殖型ワクシニアウイルスの生産性を向上させる方法。
［２３］細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）関連タンパク質をコードする遺伝子が、Ａ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、及びＦ１３Ｌよりなる群から選ばれたひとつ又は複数の遺伝子である、［２２］に記載の方法。
［２４］細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）関連タンパク質をコードする遺伝子が、Ａ３３Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、及びＦ１３Ｌ遺伝子である、［２２］に記載の方法。
［２５］細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）関連タンパク質をコードする遺伝子が、Ａ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、及びＦ１３Ｌ遺伝子である、［２２］に記載の方法。
［２６］ＥＥＶ産生能の高い他のワクシニアウイルス株が、ＩＨＤ－Ｊ株又はＩＨＤ－Ｗ株である、［２２］に記載の方法。
【発明の効果】
【0018】
本発明によれば、ワクシニアウイルス由来のＶＧＦ、ＥＲＫ及びＲＮＲの機能を欠損させることにより正常細胞でのウイルス増殖を著しく抑制し安全性を向上させるとともに、当該ウイルスのＥＥＶ関連タンパク質をコードする遺伝子を、ＥＥＶ産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子で置換することにより生産性を向上させた、静脈内投与可能な腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが提供される。当該ウイルスは、新規の抗癌剤として有効に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】本発明の例示的な遺伝子組換えワクシニアウイルスの構造を示す図である。
【図2】本発明の例示的な遺伝子組換えワクシニアウイルスの作製方法を示す図である。
【図3】Ｆ４Ｌ欠損改変ウイルスによる癌細胞及び正常細胞の細胞障害性への影響を示す図である。Ａ：ＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌細胞）；Ｂ：ＮＨＤＦ（ヒト正常皮膚線維芽細胞）。
【図4】Ｆ４Ｌ欠損改変ウイルスを静脈内投与した免疫不全マウスの生存率を示す図である。
【図5】Ｆ４Ｌ欠損改変ウイルスを静脈内投与した免疫不全マウスの体重変化を示す図である。
【図6】Ｆ４Ｌ欠損改変ウイルスを静脈内投与した免疫不全マウスの状態変化を示す図である。
【図7】ＥＥＶ関連タンパク質の改変による血清含有培地を用いたＨｅＬａ細胞での生産性への影響を示す図である。ＭＤ－ＲＶＶ（Ａ）及びＭＤ－ＲＶＶのＦ４Ｌ遺伝子を欠損させたウイルス（Ｂ）を基に改変。
【図8】ＥＥＶ関連タンパク質の改変によるケミカリーディファインド培地を用いたＨｅＬａ細胞での生産性への影響を示す図である。Ａ：培養上清ウイルス；Ｂ：細胞内ウイルス。
【図9】ヒト膵がん腹膜播種マウスにおけるＲＮＲ遺伝子欠損ウイルスの腹腔内投与後のウイルス症状スコアを示す図である。
【図10】ヒト膵がん腹膜播種マウスにおけるＲＮＲ遺伝子欠損ウイルスの腹腔内投与後の生存率を示す図である。
【図11】ヒト膵がん腹膜播種マウスにおけるＲＮＲ遺伝子欠損ウイルスの腹腔内投与後のウイルス症状スコアを示す図である。
【図12】ヒト膵がん腹膜播種マウスにおけるＲＮＲ遺伝子欠損ウイルスの腹腔内投与後の生存率を示す図である。
【図13】ヒト膵がん同所移植マウスにおけるＲＮＲ遺伝子欠損ウイルスの静脈内投与後のウイルス症状スコアを示す図である。
【図14】ヒト膵がん同所移植マウスにおけるＲＮＲ遺伝子欠損ウイルスの静脈内投与後の生存率を示す図である。
【図15】ヒト膵がん皮下移植マウスにおけるＲＮＲ遺伝子欠損ウイルスの腫瘍内投与後の腫瘍体積を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0020】
本明細書中に使用されている遺伝子命名法は、ワクシニアウイルスコペンハーゲン株に用いられ、特に限定されない限り、他のポックスウイルス科の相同性遺伝子にも用いられる。
【0021】
本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、ワクシニアウイルスゲノムの改変により、遺伝子組換えワクシニアウイルスとして作製することができる。親株ワクシニアウイルスとして、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ、Ｌｉｓｔｅｒ、ＬＣ１６ｍＯ、ＬＣ１６ｍ８、ＴｉａｎＴａｎ、Ｗｙｅｔｈ等が挙げられる。
【0022】
斯かるワクシニアウイルスゲノムの改変は、例えば、人体への投与実績のある痘そうワクチン株であるＬＣ１６ｍ８ワクシニアウイルスのゲノム（Ｍｏｒｉｋａｗａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７９（１８），１１８７３－１１８９１，２００５）を用いて行うことができる。弱毒株のＬＣ１６ｍ８は、その親株であるＬＣ１６ｍＯのＥＥＶ構成要素の一つであるＢ５Ｒ遺伝子の変異によりウイルスの感染及び伝播の効率が低下している。正常細胞での複製能が制限された本発明のワクシニアウイルスは、癌細胞においては、増殖及び伝播が著しく、強い細胞障害性を示すことが望ましい。従って、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの構築には、ＬＣ１６ｍＯ又はＬＣ１６ｍ８ウイルスゲノムのＢ５Ｒ遺伝子をＬＣ１６ｍＯウイルスのＢ５Ｒ領域のＤＮＡ配列に改変したウイルスを用いてもよい。
【0023】
ワクシニアウイルスゲノムの改変は、ベクターを用いた相同組換えにより行うことができる。改変されるＤＮＡ遺伝子配列を含有する単離されたプラスミドは、培養細胞にワクシニアウイルスの感染とともに形質移入される。プラスミドの相同ウイルスＤＮＡとウイルスゲノムとの間の組み換えは、改変されたＤＮＡ配列の存在により改変されたウイルスを生成する。ワクシニアウイルスＤＮＡの改変にはＢａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ（ＢＡＣ）システムを使用してもよい。ＢＡＣシステムは、ＢＡＣｇｆｐ配列が組み込まれたウイルスゲノムを大腸菌内で保持し、大腸菌の遺伝学を駆使してウイルスゲノムの組換えを行う方法である（図２）。
【0024】
本発明により、ＶＧＦ、ＥＲＫ活性化タンパク質、及びＲＮＲの機能を欠損させることにより、増殖細胞内で選択的に複製可能な、安全性が向上した制限増殖型ワクシニアウイルスを得ることができる。
【0025】
ＶＧＦをコードする遺伝子はＣ１１Ｒであり、ＥＲＫ活性化タンパク質であるＯ１Ｌタンパク質をコードする遺伝子はＯ１Ｌであり、ＲＮＲの小サブユニットであるＲＲＭ２をコードする遺伝子はＦ４Ｌであるので、ワクシニアウイルスのゲノムにおいてこれら遺伝子を改変することにより、ＶＧＦ、ＥＲＫ活性化タンパク質、及びＲＮＲの機能を欠損させることができる。
【0026】
ワクシニアウイルスのＶＧＦ、Ｏ１Ｌタンパク質及びＲＲＭ２の機能の欠損とは、Ｃ１１Ｒ、Ｏ１Ｌ、及びＦ４Ｌ遺伝子が発現しないか、又は発現してもその発現タンパク質がＶＧＦ、Ｏ１Ｌタンパク質、及びＲＲＭ２の正常な機能を保持していないことをいう。ＶＧＦ、Ｏ１Ｌタンパク質及びＲＲＭ２の機能を欠損させるためには、Ｃ１１Ｒ、Ｏ１Ｌ、及びＦ４Ｌ遺伝子の総て又は一部を欠失させればよい。また、塩基の置換、欠失又は付加により遺伝子を変異させ、正常なＶＧＦ、Ｏ１Ｌタンパク質、又はＲＲＭ２が発現できないようにしてもよい。また、Ｃ１１Ｒ、Ｏ１Ｌ、又はＦ４Ｌ遺伝子中に外来遺伝子を挿入してもよい。外来遺伝子の挿入や遺伝子の欠失、変異は例えば公知の相同組換えや部位特異的突然変異導入法により行うことができる。本発明において、遺伝子の欠失や変異により正常な遺伝子産物が発現されない場合、遺伝子が欠損しているという。Ｃ１１Ｒ、Ｏ１Ｌ及びＦ４Ｌ遺伝子の欠損は、これらの遺伝子を特異的に増幅するプライマーペアを用いたＰＣＲ法により確認できる。
【0027】
さらに、ＶＧＦ、ＥＲＫ活性化タンパク質、及びＲＮＲの機能を欠損させることに加えて、ＥＥＶ関連タンパク質をコードする遺伝子を、ＥＥＶ産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子で置換することにより、安全性が向上した制限増殖型ワクシニアウイルスの生産性を向上させることができる。
【0028】
改変させるＥＥＶ関連タンパク質をコードする遺伝子としては、ＥＥＶの構成要素である７種類のタンパク質（Ａ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、Ｆ１３Ｌ）をコードする遺伝子のうちの少なくとも一つであってよい。例えば、Ａ３４Ｒをコードする遺伝子を改変することによりワクシニアウイルスの生産性を向上させることができる。Ａ３３Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、及びＦ１３Ｌのすべてを改変するのが好ましく、Ａ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、及びＦ１３Ｌのすべてを改変するのがさらに好ましい。
【0029】
ＥＥＶ関連タンパク質をコードする遺伝子を改変するために用いるＤＮＡ配列の由来となるワクシニアウイルスとしては、ＩＨＤ－Ｊ、ＩＨＤ－Ｗ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0030】
本発明において、生産性を向上させるためにＥＥＶ関連タンパク質をコードする遺伝子をＥＥＶ産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子で置換する対象となる制限増殖型ワクシニアウイルスとしては、正常細胞内では複製せず、増殖細胞内で選択的に複製可能な制限増殖型ワクシニアウイルスであれば特に制限されない。斯かる制限増殖型ワクシニアウイルスは、ＶＧＦ、ＥＲＫ活性化タンパク質、及びＲＮＲの機能を欠損させることにより安全性が向上した、本発明による上記制限増殖型ワクシニアウイルスが好ましいが、これに限られるものではない。例えば、Ｃ１１Ｒ及びＯ１Ｌを欠損したウイルス（ＭＤ－ＲＶＶ）であっても、ＥＥＶ関連タンパク質をコードする遺伝子をＥＥＶ産生能の高い他のワクシニアウイルス株の対応する遺伝子で置換することにより、生産性を向上させることができる。
【0031】
本発明に従って作製した改変ワクシニアウイルスの例示を図１に示す。
「ＬＣ１６ｍ８－Ｂ５ＲｍＯ」は、ＬＣ１６ｍ８のＢ５Ｒ遺伝子をその親株ウイルスであるＬＣ１６ｍＯのＢ５Ｒ遺伝子のＤＮＡ配列に改変したウイルスである。
「ＭＤ－ＲＶＶ」は、ＬＣ１６ｍ８－Ｂ５ＲｍＯウイルスのＣ１１Ｒ及びＯ１Ｌ遺伝子を欠損させたウイルスである。
「ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ」は、ＭＤ－ＲＶＶウイルスのＦ４Ｌ遺伝子を欠損させたウイルスである。
「ＭＤ－ＲＶＶ－Ａ３４Ｒ」は、ＭＤ－ＲＶＶのＡ３４Ｒ遺伝子をＩＨＤ－Ｊワクシニアウイルス株のＡ３４Ｒ遺伝子ＤＮＡ配列に置換したウイルスである。
「ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－Ａ３４Ｒ」は、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲウイルスのＡ３４Ｒ遺伝子をＩＨＤ－Ｊワクシニアウイルス株のＡ３４Ｒ遺伝子のＤＮＡ配列に置換したウイルスである。
「ＭＤ－ＲＶＶ－ＥＥＶ６」は、ＭＤ－ＲＶＶウイルスのＡ３３Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、Ｆ１３Ｌ遺伝子を、それぞれ、ＩＨＤ－Ｊワクシニアウイルス株のＡ３３Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、Ｆ１３Ｌ遺伝子のＤＮＡ配列に置換したウイルスである。
「ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－ＥＥＶ６」は、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲウイルスのＡ３３Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、Ｆ１３Ｌ遺伝子を、それぞれ、ＩＨＤ－Ｊワクシニアウイルス株のＡ３３Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、Ｆ１３Ｌ遺伝子のＤＮＡ配列に置換したウイルスである。
「ＭＤ－ＲＶＶ－ＥＥＶ７」は、ＭＤ－ＲＶＶウイルスのＡ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、Ｆ１３Ｌ遺伝子を、それぞれ、ＩＨＤ－Ｊワクシニアウイルス株のＡ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、Ｆ１３Ｌ遺伝子のＤＮＡ配列に置換したウイルスである。
「ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－ＥＥＶ７」は、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲウイルスのＡ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、Ｆ１３Ｌ遺伝子を、それぞれ、ＩＨＤ－Ｊワクシニアウイルス株のＡ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、Ｆ１３Ｌ遺伝子のＤＮＡ配列に置換したウイルスである。
「ＬＣ１６ｍ８－Ｂ５ＲｍＯ」は、ＬＣ１６ｍ８のＢ５Ｒ遺伝子をその親株ウイルスであるＬＣ１６ｍＯのＢ５Ｒ遺伝子のＤＮＡ配列に改変したウイルスである。
「ＭＤ－ＲＶＶ」は、ＬＣ１６ｍ８－Ｂ５ＲｍＯウイルスのＣ１１Ｒ及びＯ１Ｌ遺伝子を欠損させたウイルスである。
「ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ」は、ＭＤ－ＲＶＶウイルスのＦ４Ｌ遺伝子を欠損させたウイルスである。
「ＭＤ－ＲＶＶ－Ａ３４Ｒ」は、ＭＤ－ＲＶＶのＡ３４Ｒ遺伝子をＩＨＤ－Ｊワクシニアウイルス株のＡ３４Ｒ遺伝子ＤＮＡ配列に置換したウイルスである。
「ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－Ａ３４Ｒ」は、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲウイルスのＡ３４Ｒ遺伝子をＩＨＤ－Ｊワクシニアウイルス株のＡ３４Ｒ遺伝子のＤＮＡ配列に置換したウイルスである。
「ＭＤ－ＲＶＶ－ＥＥＶ６」は、ＭＤ－ＲＶＶウイルスのＡ３３Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、Ｆ１３Ｌ遺伝子を、それぞれ、ＩＨＤ－Ｊワクシニアウイルス株のＡ３３Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、Ｆ１３Ｌ遺伝子のＤＮＡ配列に置換したウイルスである。
「ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－ＥＥＶ６」は、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲウイルスのＡ３３Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、Ｆ１３Ｌ遺伝子を、それぞれ、ＩＨＤ－Ｊワクシニアウイルス株のＡ３３Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、Ｆ１３Ｌ遺伝子のＤＮＡ配列に置換したウイルスである。
「ＭＤ－ＲＶＶ－ＥＥＶ７」は、ＭＤ－ＲＶＶウイルスのＡ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、Ｆ１３Ｌ遺伝子を、それぞれ、ＩＨＤ－Ｊワクシニアウイルス株のＡ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、Ｆ１３Ｌ遺伝子のＤＮＡ配列に置換したウイルスである。
「ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－ＥＥＶ７」は、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲウイルスのＡ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、Ｆ１３Ｌ遺伝子を、それぞれ、ＩＨＤ－Ｊワクシニアウイルス株のＡ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ３６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ１２Ｌ、Ｆ１３Ｌ遺伝子のＤＮＡ配列に置換したウイルスである。
【0032】
本明細書において、「増殖細胞」とは、正常細胞よりも増殖機能が亢進した細胞を意味し、癌細胞、悪性腫瘍細胞が例として挙げられるが、これに限られるものではない。
【0033】
本発明の制限増殖型ワクシニアウイルスは、腫瘍細胞及び工業生産に用いる宿主細胞のいずれにおいても用いることができる。腫瘍細胞は主として悪性腫瘍細胞を意味し、癌細胞と同義である。対象とする癌細胞としては、特に限定されないが、例えば発生臓器別に分類した場合、肺癌、膵癌、卵巣癌、皮膚癌、胃癌、肝臓癌、結腸癌、肛門・直腸癌、食道癌、子宮癌、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、食道癌、脳・神経腫瘍、リンパ腫・白血病、骨・骨肉腫、平滑筋腫、横紋筋腫等あらゆる癌種の癌細胞が対象となる。また、工業生産に用いる宿主細胞としては、例えばＶｅｒｏ、ＧＬ３７、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＲＣ－５、ｈｕＧＫ－１４等のワクチン及びバイオ医薬品の生産に用いられる哺乳動物細胞が挙げられる。
【0034】
本発明の制限増殖型ワクシニアウイルスは、医薬組成物として、ヒトを含む哺乳動物の体内にウイルスを投与するためのあらゆる製剤化方法で製造することができる。例えば、バイオリアクターにより培養された哺乳動物細胞を宿主とし本発明のウイルスを接種及び培養し、細胞培養液から目的のウイルスを抽出し、精製後、医薬上許容される塩等を添加して製剤化される。
【0035】
本発明の制限増殖型ワクシニアウイルスを含む医薬組成物は、医薬的に有効量の本発明の制限増殖型ワクシニアウイルスを有効成分として含んでおり、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁液、又はエマルションの形態であってもよい。さらに、塩、緩衝剤、アジュバント等の医薬的に許容できる希釈剤、助剤、担体等を含んでいてもよい。投与方法は特に限定されず、当業者に既知の方法を用いて体内に投与することが可能であり、例えば、腫瘍内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮内、皮下、筋肉内、脳室内、胸腔内、脊髄腔内、表皮内、粘膜表面への注射を挙げることができる。静脈内、腹腔内又は腫瘍内投与が好ましい。好ましくは、静脈内投与により全身的に投与する。本発明において静脈内投与による全身性腫瘍溶解性ウイルス療法を行うことにより、原発腫瘍のみならず微小転移癌も治療することができる。有効投与量は被験体の年齢、性別 、健康、及び体重等により適宜決定することができる。例えば、限定されないが、ヒト成人に対して、投与当たり約１０６～１０１１プラーク形成単位（ＰＦＵ）、好ましくは１０８～１０９プラーク形成単位（ＰＦＵ）である。
【0036】
ワクシニアウイルスに感染した細胞は、ウイルスのライフサイクルにおいて異なる役割を果たす４種類のウイルス形態を産生する。ＩＭＶは最も豊富な形態のウイルスであり、物理的に強固な性質のために宿主間の輸送を媒介するのに適しているが、補体及び抗体に対する感受性のために宿主内での伝播の媒介にはあまり適していない。ＩＥＶは、ＩＭＶとＣＥＶ／ＥＥＶとの間の中間体として働き、ＥＥＶ特異的タンパク質の取り込みを確実にし、微小管を用いてビリオンを細胞表面に輸送し、さらなる膜及び宿主タンパク質でＩＭＶ粒子を覆い隠して抗体及び補体に対する感受性を低下させ、ワクシニアウイルスが結合することができる宿主受容体の範囲を拡大している。ＣＥＶは、細胞表面でビリオンの下からアクチンテイルの形成を誘導し、ウイルスの効率的な細胞間伝播を促進するために必要とされる。最終的に、ＥＥＶは細胞表面から放出され、宿主内での感染拡大を媒介する（Ｓｍｉｔｈ Ｇ．Ｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８３（Ｐｔ １２），２９１５－２９３１，２００２）。静脈投与に用いる腫瘍溶解性ワクシニアウイルスにはＥＥＶ形態のウイルス製剤が望ましいが、ウイルスのライフサイクルの間にビリオンの形態は連続的に変化するため、ウイルス培養時に培養上清には放出されたＥＥＶのみならずウイルス増殖により破壊された細胞から流出したＩＭＶ等のビリオンが混在する。生産性及び物理的安定性の観点から、ＥＥＶのみを分離して製造することは困難であるため、ＥＥＶ関連分子の改変は、種々のビリオン形態で構成される腫瘍溶解性ウイルス製剤の有効性及び生産性向上に寄与する。
【0037】
腫瘍溶解性ウイルスにより破壊された癌細胞の断片は、自己の癌に特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導することが予想される。癌特異抗原及び免疫応答制御分子の遺伝子を組み込んだ種々のウイルスベクターが癌ワクチンとして研究されてきた。ワクシニアウイルスは、ウイルスゲノムのサイズが比較的大きいため抗原タンパク質の遺伝子全体を挿入可能であり、感染細胞の核ではなく細胞質内で複製する能力を有するため宿主細胞のゲノム中に遺伝物質を組み込むリスクが最小限に抑えられることから、ウイルスベクターとして優れている。哺乳動物細胞での増殖性が極めて低い弱毒ワクシニアウイルスのＭＶＡ株などが安全なウイルスベクターとして用いられてきた。腫瘍溶解性ウイルスは正常細胞での増殖性が著しく制限された弱毒化ウイルスである。腫瘍溶解性ウイルスをウイルスベクターとして用いることは抗腫瘍免疫応答の誘導に有利である（Ｇｕｏ，Ｚ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ ＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，７（１），６，２０１９）。本発明の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、遺伝子を挿入したベクターとしての使用も可能である。挿入遺伝子及び挿入部位は特に限定されず、例えば、癌特異抗原遺伝子、免疫応答制御分子、癌細胞表面抗原親和性タンパク質を本発明で遺伝子機能を欠損させるＣ１１Ｒ、Ｏ１Ｌ、及びＦ４Ｌ遺伝子、又はＥＥＶ関連遺伝子近傍に挿入する方法が挙げられる。
【0038】
本発明に係る腫瘍溶解性ウイルスは、ワクシニアウイルスゲノムのＣ１１Ｒ、Ｏ１Ｌ及びＦ４Ｌを欠損し、さらに複数のＥＥＶ関連タンパク質のアミノ酸配列をＩＨＤ－Ｊ株のアミノ酸配列に置換することにより、安全性及び生産性が向上する。
【0039】
次に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例1】
【0040】
ワクチン株ワクシニアウイルスゲノムの改変による制限増殖性ワクシニアウイルスの作製
人体への投与実績のある痘そうワクチン株であるＬＣ１６ｍ８ワクシニアウイルスゲノム（Ｍｏｒｉｋａｗａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７９（１８），１１８７３－１１８９１，２００５）の改変により、遺伝子組換えワクシニアウイルスを作製した（図１）。
人体への投与実績のある痘そうワクチン株であるＬＣ１６ｍ８ワクシニアウイルスゲノム（Ｍｏｒｉｋａｗａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７９（１８），１１８７３－１１８９１，２００５）の改変により、遺伝子組換えワクシニアウイルスを作製した（図１）。
【0041】
１．ＬＣ１６ｍ８－ＢＡＣｍｉｄの作製
ＢＡＣシステムを用いてワクシニアウイルスゲノムを改変した（図２参照）。細胞培養での相同組換えにより、ワクシニアウイルスＬＣ１６ｍ８株のゲノムにＢＡＣｇｆｐ配列を挿入したＢＡＣウイルスを作製し、ＢＡＣウイルスのゲノムを環状化してＬＣ１６ｍ８－ＢＡＣｍｉｄを作製した。第一段階として、ＬＣ１６ｍ８にマーカーとなるＢＡＣｇｆｐ配列を導入するためのインサーションプラスミド（ｐＵＣ－ＶＶＴＫ－ＢＡＣ－ＥＧＦＰ）の構築を行った。具体的な手法は、ワクシニアウイルスＬＣ１６ｍ８株ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ６７８２７５．１）を鋳型に、ＴＫ１プライマーＦｗ（配列番号１）及びＴＫ１プライマーＲｅ（配列番号２）を用いてＴＫ１を増幅し、また、同株ゲノムを鋳型に、ＴＫ２プライマーＦｗ（配列番号３）及びＴＫ２プライマーＲｅ（配列番号４）を用いてＴＫ２を増幅した。ＴＫ１に制限酵素ＫｐｎＩ及びＰａｃＩを処理し、ＴＫ２に制限酵素ＸｂａＩ及びＰａｃＩを処理した後、アガロースゲルから目的断片を精製した。
ＢＡＣシステムを用いてワクシニアウイルスゲノムを改変した（図２参照）。細胞培養での相同組換えにより、ワクシニアウイルスＬＣ１６ｍ８株のゲノムにＢＡＣｇｆｐ配列を挿入したＢＡＣウイルスを作製し、ＢＡＣウイルスのゲノムを環状化してＬＣ１６ｍ８－ＢＡＣｍｉｄを作製した。第一段階として、ＬＣ１６ｍ８にマーカーとなるＢＡＣｇｆｐ配列を導入するためのインサーションプラスミド（ｐＵＣ－ＶＶＴＫ－ＢＡＣ－ＥＧＦＰ）の構築を行った。具体的な手法は、ワクシニアウイルスＬＣ１６ｍ８株ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ６７８２７５．１）を鋳型に、ＴＫ１プライマーＦｗ（配列番号１）及びＴＫ１プライマーＲｅ（配列番号２）を用いてＴＫ１を増幅し、また、同株ゲノムを鋳型に、ＴＫ２プライマーＦｗ（配列番号３）及びＴＫ２プライマーＲｅ（配列番号４）を用いてＴＫ２を増幅した。ＴＫ１に制限酵素ＫｐｎＩ及びＰａｃＩを処理し、ＴＫ２に制限酵素ＸｂａＩ及びＰａｃＩを処理した後、アガロースゲルから目的断片を精製した。
【0042】
次に、ｐＵＣ１１９プラスミド（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ０７６５０．１）を制限酵素ＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理、精製し、アルカリフォスファターゼ処理したプラスミドのＫｐｎＩ／ＸｂａＩサイトに、上述の２つの断片を挿入し、ｐＵＣ１１９－ＴＫ１－２を構築した。次に、ｐＵＣＩＤＴ－ＫＡＮ－ｏｐ７．５＋ＥＧＦＰプラスミド（配列番号５）を人工合成し、制限酵素ＰａｃＩで処理後精製したものを、ｐＵＣ１１９－ＴＫ１－２を制限酵素ＰａｃＩで処理後精製し、アルカリフォスファターゼ処理したプラスミドのＰａｃＩサイトに挿入し、ｐＵＣ－ＶＶＴＫ－ｏｐ７．５＋ＥＧＦＰプラスミドを構築した。さらに、ｐＢＳＩＩプラスミド（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ２５２６７．１）にｐＢｅｌｏＢＡＣ１１配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＶＵ５１１１３．１）を挿入したプラスミドを制限酵素ＮｏｔＩで処理後アガロースゲルから精製したものを、ｐＵＣ－ＶＶＴＫ－ｏｐ７．５＋ＥＧＦＰを制限酵素ＮｏｔＩで処理後精製しアルカリフォスファターゼ処理したプラスミドのＮｏｔＩサイトに挿入し、ｐＵＣ－ＶＶＴＫ－ＢＡＣ－ＥＧＦＰプラスミドを構築した。
【0043】
次に、ＬＣ１６ｍ８ゲノムへのＢＡＣｇｆｐ配列の導入方法を以下に示す。ウサギ初代腎細胞（ＰＲＫ）にワクシニアウイルスＬＣ１６ｍ８株をＭＯＩ＝１０で感染後、１時間培養し細胞を回収した。回収細胞をＨｅＢＳバッファーで懸濁後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで線状化したｐＵＣ－ＶＶＴＫ－ＢＡＣ－ＥＧＦＰプラスミドを加え、エレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション液を段階希釈し、９６穴プレートで培養したＰＲＫに感染させ培養後、蛍光顕微鏡を用い緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現を観察し、希釈倍率の高いウェルで蛍光陽性プラークもしくは細胞変性効果（ＣＰＥ）が得られたものを選択した。選択したウェルの細胞を回収し、超音波処理、遠心後、上清をＬＣ１６ｍ８にＢＡＣｇｆｐ配列が挿入されたウイルス（ＬＣ１６ｍ８－ＢＡＣｇｆｐ）として得た。
【0044】
さらに、ＬＣ１６ｍ８－ＢＡＣｇｆｐゲノムの環状化と大腸菌へのクローニングによるＬＣ１６ｍ８－ＢＡＣｍｉｄの構築は、以下の通り実施した。ＬＣ１６ｍ８－ＢＡＣｇｆｐをＭＯＩ＝５で感染させたＰＲＫに、ｐＣＡＧＧＳ－Ｃｒｅプラスミド（自家調製）を、トランスフェクション試薬を用いてトランスフェクションし、環状化したウイルスゲノムとしてＬＣ１６ｍ８－ＢＡＣｍｉｄを抽出後、大腸菌ＧＳ１７８３（ＷＯ２０１４０７７０９６Ａ１）にエレクトロポレーションを用いて導入した。エレクトロポレーション液をクロラムフェニコール添加ＣＧ寒天培地で培養し、ＢＡＣｇｆｐ配列中のクロラムフェニコール耐性をマーカーとしてＬＣ１６ｍ８－ＢＡＣｍｉｄを保持した大腸菌を選択し、目的のクローンをグリセロールストックした。
【0045】
２．改変ＢＡＣｍｉｄの作製
ＬＣ１６ｍ８－ＢＡＣｍｉｄを鋳型として改変ＢＡＣｍｉｄを作製した。あらかじめ、後に培養細胞からＢＡＣｇｆｐ配列が除かれた組換えウイルスを回収するために必要なＢＡＣｇｆｐ除去配列カセット（配列番号６）を作製した。ＢＡＣｇｆｐ除去配列カセットの作製方法は以下の通りであった。ｐＵＣ１１９プラスミド（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ０７６５０．１）を制限酵素ＨｉｎｃＩＩ及びＢａｍＨＩで処理後精製し、アルカリフォスファターゼ処理し、また、ｐＢＳＩＩプラスミド（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ２５２６７．１）にｐＢｅｌｏＢＡＣ１１配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＶＵ５１１１３．１）を挿入したプラスミドを制限酵素ＸｂａＩで処理後精製した断片に、制限酵素ＳｃａＩ及びＢｇｌＩＩを処理後精製し、前述のプラスミドとライゲーションさせ、ｐＵＣ１１９－ｐＢｅｌｏＳＢを構築した。さらに、ｐＵＣ１１９－ｐＢｅｌｏＳＢに制限酵素ＮｒｕＩを処理し、精製した（ｐＵＣ１１９－ｐＢｅｌｏＳＢ／ＮｒｕＩ／ｅｌｕｔｉｏｎ）。次に、ワクシニアウイルスＬＣ１６ｍ８株ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ６７８２７５．１）を鋳型に、ＴＫプライマーＦｗ（配列番号７）及びＴＫプライマーＲｅ（配列番号８）を用いてＴＫ領域を増幅し、また、ｐＥＰｋａｎ－Ｓプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ）を鋳型に、カナマイシンプライマー１Ｆｗ（配列番号９）及びカナマイシンプライマー１Ｒｅ（配列番号１０）を用いてＰＣＲを行い、カナマイシン耐性遺伝子を増幅させた。上述２つのＰＣＲ産物を精製し、ｐＵＣ１１９－ｐＢｅｌｏＳＢ／ＮｒｕＩ／ｅｌｕｔｉｏｎとともに、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて3つの断片を反応させ、反応液を大腸菌ＪＭ１０９（Ｔａｋａｒａ）へ導入し、反応後、アンピシリン、カナマイシン及びクロラムフェニコールを添加したＣＧ寒天培地にプレーティングし、目的のプラスミド（ｐＵＣ１１９－ＢＡＣ－ＳＢＴＫｄｕｐ）を保持したクローンを得た。培養した大腸菌からｐＵＣ１１９－ＢＡＣ－ＳＢＴＫｄｕｐプラスミドを抽出し、制限酵素ＰｓｔＩ及びＫｐｎＩで処理後精製してｐＵＣ１１９－ＢＡＣ－ＳＢＴＫｄｕｐ／ＰｓｔＩ／ＫｐｎＩ／ｅｌｕｔｉｏｎを作製し、ＢＡＣｇｆｐ除去配列カセット（配列番号６）とした。
ＬＣ１６ｍ８－ＢＡＣｍｉｄを鋳型として改変ＢＡＣｍｉｄを作製した。あらかじめ、後に培養細胞からＢＡＣｇｆｐ配列が除かれた組換えウイルスを回収するために必要なＢＡＣｇｆｐ除去配列カセット（配列番号６）を作製した。ＢＡＣｇｆｐ除去配列カセットの作製方法は以下の通りであった。ｐＵＣ１１９プラスミド（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ０７６５０．１）を制限酵素ＨｉｎｃＩＩ及びＢａｍＨＩで処理後精製し、アルカリフォスファターゼ処理し、また、ｐＢＳＩＩプラスミド（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ２５２６７．１）にｐＢｅｌｏＢＡＣ１１配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＶＵ５１１１３．１）を挿入したプラスミドを制限酵素ＸｂａＩで処理後精製した断片に、制限酵素ＳｃａＩ及びＢｇｌＩＩを処理後精製し、前述のプラスミドとライゲーションさせ、ｐＵＣ１１９－ｐＢｅｌｏＳＢを構築した。さらに、ｐＵＣ１１９－ｐＢｅｌｏＳＢに制限酵素ＮｒｕＩを処理し、精製した（ｐＵＣ１１９－ｐＢｅｌｏＳＢ／ＮｒｕＩ／ｅｌｕｔｉｏｎ）。次に、ワクシニアウイルスＬＣ１６ｍ８株ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ６７８２７５．１）を鋳型に、ＴＫプライマーＦｗ（配列番号７）及びＴＫプライマーＲｅ（配列番号８）を用いてＴＫ領域を増幅し、また、ｐＥＰｋａｎ－Ｓプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ）を鋳型に、カナマイシンプライマー１Ｆｗ（配列番号９）及びカナマイシンプライマー１Ｒｅ（配列番号１０）を用いてＰＣＲを行い、カナマイシン耐性遺伝子を増幅させた。上述２つのＰＣＲ産物を精製し、ｐＵＣ１１９－ｐＢｅｌｏＳＢ／ＮｒｕＩ／ｅｌｕｔｉｏｎとともに、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて3つの断片を反応させ、反応液を大腸菌ＪＭ１０９（Ｔａｋａｒａ）へ導入し、反応後、アンピシリン、カナマイシン及びクロラムフェニコールを添加したＣＧ寒天培地にプレーティングし、目的のプラスミド（ｐＵＣ１１９－ＢＡＣ－ＳＢＴＫｄｕｐ）を保持したクローンを得た。培養した大腸菌からｐＵＣ１１９－ＢＡＣ－ＳＢＴＫｄｕｐプラスミドを抽出し、制限酵素ＰｓｔＩ及びＫｐｎＩで処理後精製してｐＵＣ１１９－ＢＡＣ－ＳＢＴＫｄｕｐ／ＰｓｔＩ／ＫｐｎＩ／ｅｌｕｔｉｏｎを作製し、ＢＡＣｇｆｐ除去配列カセット（配列番号６）とした。
【0046】
Ｂ５Ｒ改変カセット：
目的の組換えウイルスを作製するために、改変する遺伝子の発現カセットを以下の方法で作製した。ＬＣ１６ｍ８株は安全なワクチン株として弱毒化されたウイルスであるが、腫瘍溶解性ウイルスの有効性においては、培養細胞での増殖性の高い親株であるＬＣ１６ｍＯ株を用いる方が望ましい。ＬＣ１６ｍ８は、Ｂ５Ｒ遺伝子配列中の１塩基欠損（グアニン欠損）によるフレームシフトにより不完全なＢ５Ｒタンパク質が産生されることが知られている（Ｍｏｒｉｋａｗａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７９（１８），１１８７３－１１８９１，２００５）。そこで、ＬＣ１６ｍ８－ＢＡＣｍｉｄのＢ５Ｒ遺伝子配列を、完全なＢ５Ｒ遺伝子配列をもつＬＣ１６ｍＯの配列に改変したＢＡＣｍｉｄを構築するため、Ｂ５Ｒ改変カセット（配列番号１１）を以下の方法で作製した。ＬＣ１６ｍＯのＢ５Ｒ遺伝子配列中の、上記グアニンから上流、下流それぞれ約１ｋｂ、計２１３２ｂｐを人工合成し、ｐＵＣＦｋ－Ｂ５ＲｍＯ（配列番号１２）を構築した。このＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで処理し精製後、アルカリフォスファターゼ処理した（ｐＵＣＦｋ－Ｂ５ＲｍＯ／ＥｃｏＲＩ／ｅｌｕｔｉｏｎ／ＢＡＰ）。また、ｐＥＰｋａｎ－Ｓプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ）を鋳型に、カナマイシンプライマー２Ｆｗ（配列番号１３）及びカナマイシンプライマー２Ｒｅ（配列番号１４）を用いてＰＣＲを行い、カナマイシン耐性遺伝子を増幅し、精製後、制限酵素ＥｃｏＲＩで処理し精製してｒＫａｎＩ/ＥｃｏＲＩ/ｅｌｕｔｉｏｎを作製した。ｐＵＣＦｋ－Ｂ５ＲｍＯ／ＥｃｏＲＩ／ｅｌｕｔｉｏｎ／ＢＡＰとｒＫａｎＩ／ＥｃｏＲＩ/ｅｌｕｔｉｏｎをライゲーションし、ｐＵＣＦｋ－Ｂ５ＲｍＯ－ｒＫａｎＩを構築した。ｐＵＣＦｋ－Ｂ５ＲｍＯ－ｒＫａｎＩを制限酵素ＸｂａＩ及びＤｒａＩで処理後精製し、ｐＵＣＦｋ－Ｂ５ＲｍＯ－ｒＫａｎＩ／ＸｂａＩ／ＤｒａＩ／ｅｌｕｔｉｏｎを作製した。これをＢ５Ｒ改変カセット（配列番号１１）としてＢＡＣｍｉｄの改変に用いた。
目的の組換えウイルスを作製するために、改変する遺伝子の発現カセットを以下の方法で作製した。ＬＣ１６ｍ８株は安全なワクチン株として弱毒化されたウイルスであるが、腫瘍溶解性ウイルスの有効性においては、培養細胞での増殖性の高い親株であるＬＣ１６ｍＯ株を用いる方が望ましい。ＬＣ１６ｍ８は、Ｂ５Ｒ遺伝子配列中の１塩基欠損（グアニン欠損）によるフレームシフトにより不完全なＢ５Ｒタンパク質が産生されることが知られている（Ｍｏｒｉｋａｗａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７９（１８），１１８７３－１１８９１，２００５）。そこで、ＬＣ１６ｍ８－ＢＡＣｍｉｄのＢ５Ｒ遺伝子配列を、完全なＢ５Ｒ遺伝子配列をもつＬＣ１６ｍＯの配列に改変したＢＡＣｍｉｄを構築するため、Ｂ５Ｒ改変カセット（配列番号１１）を以下の方法で作製した。ＬＣ１６ｍＯのＢ５Ｒ遺伝子配列中の、上記グアニンから上流、下流それぞれ約１ｋｂ、計２１３２ｂｐを人工合成し、ｐＵＣＦｋ－Ｂ５ＲｍＯ（配列番号１２）を構築した。このＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで処理し精製後、アルカリフォスファターゼ処理した（ｐＵＣＦｋ－Ｂ５ＲｍＯ／ＥｃｏＲＩ／ｅｌｕｔｉｏｎ／ＢＡＰ）。また、ｐＥＰｋａｎ－Ｓプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ）を鋳型に、カナマイシンプライマー２Ｆｗ（配列番号１３）及びカナマイシンプライマー２Ｒｅ（配列番号１４）を用いてＰＣＲを行い、カナマイシン耐性遺伝子を増幅し、精製後、制限酵素ＥｃｏＲＩで処理し精製してｒＫａｎＩ/ＥｃｏＲＩ/ｅｌｕｔｉｏｎを作製した。ｐＵＣＦｋ－Ｂ５ＲｍＯ／ＥｃｏＲＩ／ｅｌｕｔｉｏｎ／ＢＡＰとｒＫａｎＩ／ＥｃｏＲＩ/ｅｌｕｔｉｏｎをライゲーションし、ｐＵＣＦｋ－Ｂ５ＲｍＯ－ｒＫａｎＩを構築した。ｐＵＣＦｋ－Ｂ５ＲｍＯ－ｒＫａｎＩを制限酵素ＸｂａＩ及びＤｒａＩで処理後精製し、ｐＵＣＦｋ－Ｂ５ＲｍＯ－ｒＫａｎＩ／ＸｂａＩ／ＤｒａＩ／ｅｌｕｔｉｏｎを作製した。これをＢ５Ｒ改変カセット（配列番号１１）としてＢＡＣｍｉｄの改変に用いた。
【0047】
Ｃ１１Ｒ欠損カセット：
ＶＧＦの機能を欠損したウイルスを回収するために、Ｃ１１Ｒ欠損カセット（配列番号１５）を作製した。Ｃ１１Ｒ遺伝子配列の開始コドンから制限酵素ＡｃｃＩサイトまでの２５５ｂｐを欠失させた配列及びその前後約１ｋｂを人工合成し、ｐＵＣ５７－ΔＶＧＦ（配列番号１６）を構築した。ｐＵＣ５７－ΔＶＧＦを制限酵素ＡｃｃＩで処理し精製後、アルカリフォスファターゼ処理しｐＵＣ５７－ΔＶＧＦ/ＡｃｃＩ/ｅｌｕｔｉｏｎ/ＢＡＰを作製した。ｐＥＰｋａｎ－Ｓプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ）を鋳型に、カナマイシンプライマー３Ｆｗ（配列番号１７）及びカナマイシンプライマー３Ｒｅ（配列番号１８）を用いたＰＣＲによりカナマイシン耐性遺伝子を増幅し、アガロースゲルから精製後、ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。反応液を大腸菌ＪＭ１０９（Ｔａｋａｒａ）へ導入し、得られたコロニーからプラスミドを抽出してＴＯＰＯ－ｒＫａｎＩを作製した。ＴＯＰＯ－ｒＫａｎＩを制限酵素ＡｃｃＩで処理し、精製後、制限酵素ＳｃａＩで処理し、アガロースゲルから精製し、ｒＫａｎＩ/ＡｃｃＩ/ＳｃａＩ/ｅｌｕｔｉｏｎを作製した。ｐＵＣ５７－ΔＶＧＦ/ＡｃｃＩ/ｅｌｕｔｉｏｎ/ＢＡＰとｒＫａｎＩ／ＡｃｃＩ／ＳｃａＩ／ｅｌｕｔｉｏｎをライゲーションし、ｐＵＣ５７－ΔＶＧＦ－ｒＫａｎＩを構築した。ｐＵＣ５７－ΔＶＧＦ－ｒＫａｎＩを制限酵素ＳｃａＩで処理し、さらに、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで処理後アガロースゲルから精製し、Ｃ１１Ｒ欠損カセット（配列番号１５）としてＢＡＣｍｉｄの改変に用いた。
ＶＧＦの機能を欠損したウイルスを回収するために、Ｃ１１Ｒ欠損カセット（配列番号１５）を作製した。Ｃ１１Ｒ遺伝子配列の開始コドンから制限酵素ＡｃｃＩサイトまでの２５５ｂｐを欠失させた配列及びその前後約１ｋｂを人工合成し、ｐＵＣ５７－ΔＶＧＦ（配列番号１６）を構築した。ｐＵＣ５７－ΔＶＧＦを制限酵素ＡｃｃＩで処理し精製後、アルカリフォスファターゼ処理しｐＵＣ５７－ΔＶＧＦ/ＡｃｃＩ/ｅｌｕｔｉｏｎ/ＢＡＰを作製した。ｐＥＰｋａｎ－Ｓプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ）を鋳型に、カナマイシンプライマー３Ｆｗ（配列番号１７）及びカナマイシンプライマー３Ｒｅ（配列番号１８）を用いたＰＣＲによりカナマイシン耐性遺伝子を増幅し、アガロースゲルから精製後、ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。反応液を大腸菌ＪＭ１０９（Ｔａｋａｒａ）へ導入し、得られたコロニーからプラスミドを抽出してＴＯＰＯ－ｒＫａｎＩを作製した。ＴＯＰＯ－ｒＫａｎＩを制限酵素ＡｃｃＩで処理し、精製後、制限酵素ＳｃａＩで処理し、アガロースゲルから精製し、ｒＫａｎＩ/ＡｃｃＩ/ＳｃａＩ/ｅｌｕｔｉｏｎを作製した。ｐＵＣ５７－ΔＶＧＦ/ＡｃｃＩ/ｅｌｕｔｉｏｎ/ＢＡＰとｒＫａｎＩ／ＡｃｃＩ／ＳｃａＩ／ｅｌｕｔｉｏｎをライゲーションし、ｐＵＣ５７－ΔＶＧＦ－ｒＫａｎＩを構築した。ｐＵＣ５７－ΔＶＧＦ－ｒＫａｎＩを制限酵素ＳｃａＩで処理し、さらに、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで処理後アガロースゲルから精製し、Ｃ１１Ｒ欠損カセット（配列番号１５）としてＢＡＣｍｉｄの改変に用いた。
【0048】
Ｏ１Ｌ欠損カセット：
Ｏ１Ｌの機能を欠損したウイルスを回収するために、Ｏ１Ｌ欠損カセット（配列番号１９）を作製した。Ｏ１Ｌ遺伝子配列の開始コドンから制限酵素ＸｂａＩサイトまでの１０４９ｂｐを欠失させた後に、ＸｂａＩサイト直後の５０ｂｐに、カナマイシン耐性遺伝子配列（Ａｄｄｇｅｎｅ）を挿入した配列を人工合成し、ｐＵＣ５７－ΔＯ１Ｌ－ｒＫａｎＩ（配列番号２０）を構築した。ｐＵＣ５７－ΔＯ１Ｌ－ｒＫａｎＩに、制限酵素ＳｃａＩ及びＥｃｏＲＩを処理し、アガロースゲルから精製し、Ｏ１Ｌ欠損カセット（配列番号１９）としてＢＡＣｍｉｄの改変に用いた。
Ｏ１Ｌの機能を欠損したウイルスを回収するために、Ｏ１Ｌ欠損カセット（配列番号１９）を作製した。Ｏ１Ｌ遺伝子配列の開始コドンから制限酵素ＸｂａＩサイトまでの１０４９ｂｐを欠失させた後に、ＸｂａＩサイト直後の５０ｂｐに、カナマイシン耐性遺伝子配列（Ａｄｄｇｅｎｅ）を挿入した配列を人工合成し、ｐＵＣ５７－ΔＯ１Ｌ－ｒＫａｎＩ（配列番号２０）を構築した。ｐＵＣ５７－ΔＯ１Ｌ－ｒＫａｎＩに、制限酵素ＳｃａＩ及びＥｃｏＲＩを処理し、アガロースゲルから精製し、Ｏ１Ｌ欠損カセット（配列番号１９）としてＢＡＣｍｉｄの改変に用いた。
【0049】
Ｆ４Ｌ欠損カセット：
ＲＮＲの機能を欠損したウイルスを回収するために、Ｆ４Ｌ欠損カセット（配列番号２１）を作製した。Ｆ４Ｌ遺伝子配列の開始コドンからＥｃｏＲＩサイトまでの７６５ｂｐを欠失させた後に、ＥｃｏＲＩサイト直後の５０ｂｐに、カナマイシン耐性遺伝子配列（Ａｄｄｇｅｎｅ）を挿入した配列を人工合成し、ｐＵＣ５７－ΔＦ４Ｌ－ｒＫａｎＩ（配列番号２２）を構築した。ｐＵＣ５７－ΔＦ４Ｌ－ｒＫａｎＩに、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを処理し、アガロースゲルから精製し、Ｆ４Ｌ欠損カセット（配列番号２１）としてＢＡＣｍｉｄの改変に用いた。
ＲＮＲの機能を欠損したウイルスを回収するために、Ｆ４Ｌ欠損カセット（配列番号２１）を作製した。Ｆ４Ｌ遺伝子配列の開始コドンからＥｃｏＲＩサイトまでの７６５ｂｐを欠失させた後に、ＥｃｏＲＩサイト直後の５０ｂｐに、カナマイシン耐性遺伝子配列（Ａｄｄｇｅｎｅ）を挿入した配列を人工合成し、ｐＵＣ５７－ΔＦ４Ｌ－ｒＫａｎＩ（配列番号２２）を構築した。ｐＵＣ５７－ΔＦ４Ｌ－ｒＫａｎＩに、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを処理し、アガロースゲルから精製し、Ｆ４Ｌ欠損カセット（配列番号２１）としてＢＡＣｍｉｄの改変に用いた。
【0050】
エンベロープ改変カセット：
ＥＥＶ関連遺伝子をＩＨＤ－Ｊ株もしくはＩＨＤ－Ｗ株のＤＮＡ配列に置換したウイルスを回収するために、Ａ３３Ｒ改変カセット（配列番号２３）、Ａ３４Ｒ改変カセット（配列番号２４）、Ａ３６Ｒ改変カセット（配列番号２５）、Ａ３３－３４－３６Ｒ改変カセット（配列番号２６）、Ａ５６Ｒ改変カセット（配列番号２７）、Ｂ５Ｒ改変カセット（配列番号２８）、Ｆ１２－１３Ｌ改変カセット（配列番号２９）を作製した。その具体的な手法は、ＩＨＤ－Ｊ株もしくはＩＨＤ－Ｗ株由来の各遺伝子配列を用意し、特定の部位の直後５０ｂｐに、カナマイシン耐性遺伝子配列（Ａｄｄｇｅｎｅ）を挿入した配列を人工合成し、ｐＵＣ５７－Ａ３３Ｒ－ｒＫａｎＩ（配列番号３０）、ｐＵＣ５７－Ａ３４Ｒ－ｒＫａｎＩ（配列番号３１）、ｐＵＣ５７－Ａ３６Ｒ－ｒＫａｎＩ（配列番号３２）、ｐＵＣ５７－Ａ３３―３４－３６Ｒ－ｒＫａｎＩ（配列番号３３）、ｐＵＣ５７－Ａ５６Ｒ－ｒＫａｎＩ（配列番号３４）、ｐＵＣ５７－Ｂ５Ｒ－ｒＫａｎＩ（配列番号３５）、ｐＵＣ５７－Ｆ１２－１３Ｌ－ｒＫａｎＩ（配列番号３６）を構築した。ｐＵＣ５７－Ｂ５Ｒ－ｒＫａｎＩ（配列番号３５）に制限酵素ＸｂａＩ及びＢｇｌＩを処理し、それ以外には制限酵素ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩを処理し、アガロースゲルから精製し、エンベロープ改変カセットとして各ＢＡＣｍｉｄの改変に用いた。
ＥＥＶ関連遺伝子をＩＨＤ－Ｊ株もしくはＩＨＤ－Ｗ株のＤＮＡ配列に置換したウイルスを回収するために、Ａ３３Ｒ改変カセット（配列番号２３）、Ａ３４Ｒ改変カセット（配列番号２４）、Ａ３６Ｒ改変カセット（配列番号２５）、Ａ３３－３４－３６Ｒ改変カセット（配列番号２６）、Ａ５６Ｒ改変カセット（配列番号２７）、Ｂ５Ｒ改変カセット（配列番号２８）、Ｆ１２－１３Ｌ改変カセット（配列番号２９）を作製した。その具体的な手法は、ＩＨＤ－Ｊ株もしくはＩＨＤ－Ｗ株由来の各遺伝子配列を用意し、特定の部位の直後５０ｂｐに、カナマイシン耐性遺伝子配列（Ａｄｄｇｅｎｅ）を挿入した配列を人工合成し、ｐＵＣ５７－Ａ３３Ｒ－ｒＫａｎＩ（配列番号３０）、ｐＵＣ５７－Ａ３４Ｒ－ｒＫａｎＩ（配列番号３１）、ｐＵＣ５７－Ａ３６Ｒ－ｒＫａｎＩ（配列番号３２）、ｐＵＣ５７－Ａ３３―３４－３６Ｒ－ｒＫａｎＩ（配列番号３３）、ｐＵＣ５７－Ａ５６Ｒ－ｒＫａｎＩ（配列番号３４）、ｐＵＣ５７－Ｂ５Ｒ－ｒＫａｎＩ（配列番号３５）、ｐＵＣ５７－Ｆ１２－１３Ｌ－ｒＫａｎＩ（配列番号３６）を構築した。ｐＵＣ５７－Ｂ５Ｒ－ｒＫａｎＩ（配列番号３５）に制限酵素ＸｂａＩ及びＢｇｌＩを処理し、それ以外には制限酵素ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩを処理し、アガロースゲルから精製し、エンベロープ改変カセットとして各ＢＡＣｍｉｄの改変に用いた。
【0051】
ＬＣ１６ｍ８－Ｂ５ＲｍＯ－ＢＡＣｍｉｄの作製：
ＬＣ１６ｍ８－Ｂ５ＲｍＯ－ＢＡＣｍｉｄの作製方法を下記に記す。前述のＬＣ１６ｍ８－ＢＡＣｍｉｄを保持した大腸菌を培養し、Ｂ５Ｒ改変カセット（配列番号１１）をエレクトロポレーションにより導入した。エレクトロポレーション溶液を、クロラムフェニコール及びカナマイシンを添加したＣＧ寒天培地で培養し、カセット中のカナマイシン耐性をマーカーとして、カセットが導入されたクローンを選択し、さらにカナマイシン耐性遺伝子除去操作を行い、ＢＡＣｇｆｐ配列中のクロラムフェニコール耐性をマーカーとして目的クローンを取得した。プライマーペア（配列番号３７及び配列番号３８）を用いたＰＣＲにより目的遺伝子断片を増幅し、精製後、シーケンス用プライマー（配列番号３７）を用いた塩基配列解析により、得られたクローンは目的の改変ＢＡＣｍｉｄ（ＬＣ１６ｍ８－Ｂ５ＲｍＯ－ＢＡＣｍｉｄ）であることが確認された。
ＬＣ１６ｍ８－Ｂ５ＲｍＯ－ＢＡＣｍｉｄの作製方法を下記に記す。前述のＬＣ１６ｍ８－ＢＡＣｍｉｄを保持した大腸菌を培養し、Ｂ５Ｒ改変カセット（配列番号１１）をエレクトロポレーションにより導入した。エレクトロポレーション溶液を、クロラムフェニコール及びカナマイシンを添加したＣＧ寒天培地で培養し、カセット中のカナマイシン耐性をマーカーとして、カセットが導入されたクローンを選択し、さらにカナマイシン耐性遺伝子除去操作を行い、ＢＡＣｇｆｐ配列中のクロラムフェニコール耐性をマーカーとして目的クローンを取得した。プライマーペア（配列番号３７及び配列番号３８）を用いたＰＣＲにより目的遺伝子断片を増幅し、精製後、シーケンス用プライマー（配列番号３７）を用いた塩基配列解析により、得られたクローンは目的の改変ＢＡＣｍｉｄ（ＬＣ１６ｍ８－Ｂ５ＲｍＯ－ＢＡＣｍｉｄ）であることが確認された。
【0052】
そのほかの改変ＢＡＣｍｉｄも上述と同様の方法により作製した。改変体に特異的なプライマーペアを用いたＰＣＲによりバンドサイズを確認した。改変体に特異的なプライマーペアは以下の通りであった。
Ｃ１１Ｒ欠損確認プライマーＦｗ（配列番号３９）及びＣ１１Ｒ欠損確認プライマーＲｅ（配列番号４０）；
Ｏ１Ｌ欠損確認プライマーＦｗ（配列番号４１）及びＯ１Ｌ欠損確認プライマーＲｅ（配列番号４２）；
Ｆ４Ｌ欠損確認プライマーＦｗ（配列番号４３）及びＦ４Ｌ欠損確認プライマーＲｅ（配列番号４４）；
Ａ３３Ｒ改変確認プライマーＦｗ（配列番号４５）及びＡ３３Ｒ改変確認プライマーＲｅ（配列番号４６）；
Ａ３４Ｒ改変確認プライマーＦｗ（配列番号４７）及びＡ３４Ｒ改変確認プライマーＲｅ（配列番号４８）；
Ａ３６Ｒ改変確認プライマーＦｗ（配列番号４９）及びＡ３６Ｒ改変確認プライマーＲｅ（配列番号５０）；
Ａ５６Ｒ改変確認プライマーＦｗ（配列番号５１）及びＡ５６Ｒ改変確認プライマーＲｅ（配列番号５２）；
Ｂ５Ｒ改変確認プライマーＦｗ（配列番号５３）及びＢ５Ｒ改変確認プライマーＲｅ（配列番号５４）；
Ｆ１２―１３Ｌ改変確認プライマーＦｗ（配列番号５５）及びＦ１２―１３Ｌ改変確認プライマーＲｅ（配列番号５６）
Ｃ１１Ｒ欠損確認プライマーＦｗ（配列番号３９）及びＣ１１Ｒ欠損確認プライマーＲｅ（配列番号４０）；
Ｏ１Ｌ欠損確認プライマーＦｗ（配列番号４１）及びＯ１Ｌ欠損確認プライマーＲｅ（配列番号４２）；
Ｆ４Ｌ欠損確認プライマーＦｗ（配列番号４３）及びＦ４Ｌ欠損確認プライマーＲｅ（配列番号４４）；
Ａ３３Ｒ改変確認プライマーＦｗ（配列番号４５）及びＡ３３Ｒ改変確認プライマーＲｅ（配列番号４６）；
Ａ３４Ｒ改変確認プライマーＦｗ（配列番号４７）及びＡ３４Ｒ改変確認プライマーＲｅ（配列番号４８）；
Ａ３６Ｒ改変確認プライマーＦｗ（配列番号４９）及びＡ３６Ｒ改変確認プライマーＲｅ（配列番号５０）；
Ａ５６Ｒ改変確認プライマーＦｗ（配列番号５１）及びＡ５６Ｒ改変確認プライマーＲｅ（配列番号５２）；
Ｂ５Ｒ改変確認プライマーＦｗ（配列番号５３）及びＢ５Ｒ改変確認プライマーＲｅ（配列番号５４）；
Ｆ１２―１３Ｌ改変確認プライマーＦｗ（配列番号５５）及びＦ１２―１３Ｌ改変確認プライマーＲｅ（配列番号５６）
【0053】
さらに、ゲノム精製後、改変確認用のシーケンスプライマー［Ａ３３Ｒ改変（配列番号４５）、Ａ３４Ｒ改変（配列番号４７）、Ａ３６Ｒ改変（配列番号４９）、Ａ５６Ｒ改変（配列番号５１、配列番号５７）、Ｂ５Ｒ改変（配列番号５３）、Ｆ１２－１３Ｌ改変（配列番号５５、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０）］を用いた塩基配列解析により、得られたクローンは目的の改変ＢＡＣｍｉｄ（ＭＤ－ＲＶＶ－ＢＡＣｍｉｄ、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－ＢＡＣｍｉｄ、ＭＤ－ＲＶＶ－ＥＥＶ７－ＢＡＣｍｉｄ、ＭＤ－ＲＶＶ－ＥＥＶ６－ＢＡＣｍｉｄ、ＭＤ－ＲＶＶ－Ａ３４Ｒ－ＢＡＣｍｉｄ、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－ＥＥＶ７－ＢＡＣｍｉｄ、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－ＥＥＶ６－ＢＡＣｍｉｄ、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－Ａ３４Ｒ－ＢＡＣｍｉｄ）であることが確認された。
【0054】
各改変ＢＡＣｍｉｄにＢＡＣｇｆｐ除去配列カセット［（ＳＢＴＫｄｕｐ配列）（配列番号６）を同様の手法で導入した。プライマーペア（ＢＡＣｇｆｐ合成プライマーＦｗ（配列番号６１）及びＢＡＣｇｆｐ合成プライマーＲｅ（配列番号６２）］を用いたＰＣＲによりバンドサイズを確認した。ＰＣＲ産物を精製し、シーケンス用プライマー（配列番号６１）を用いて塩基配列を解析した。 得られたクローンは目的の改変ＢＡＣｍｉｄ（ＭＤ－ＲＶＶ－ＳＢＴＫｄｕｐ－ＢＡＣｍｉｄ、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－ＳＢＴＫｄｕｐ－ＢＡＣｍｉｄ、ＭＤ－ＲＶＶ－ＥＥＶ７－ＳＢＴＫｄｕｐ－ＢＡＣｍｉｄ、ＭＤ－ＲＶＶ－ＥＥＶ６－ＳＢＴＫｄｕｐ－ＢＡＣｍｉｄ、ＭＤ－ＲＶＶ－Ａ３４Ｒ－ＳＢＴＫｄｕｐ－ＢＡＣｍｉｄ、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－ＥＥＶ７－ＳＢＴＫｄｕｐ－ＢＡＣｍｉｄ、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－ＥＥＶ６－ＳＢＴＫｄｕｐ－ＢＡＣｍｉｄ、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－Ａ３４Ｒ－ＳＢＴＫｄｕｐ－ＢＡＣｍｉｄ）であることが確認された。
【0055】
３．ウイルスゲノムの抽出
ＢＡＣｇｆｐ除去配列カセットを持つＢＡＣｍｉｄ由来のウイルスは、培養細胞で継代を重ねることでＢＡＣｇｆｐが抜けるように設計されている。前述のＢＡＣウイルス（ＬＣ１６ｍ８－ＢＡＣｇｆｐ）をヘルパーウイルスとして用い、ＲＫ１３細胞からＬＣ１６ｍ８－Ｂ５ＲｍＯ－ＳＢＴＫｄｕｐ－ＢＡＣｍｉｄ由来のウイルスを回収した。６穴プレートで培養したＲＫ１３細胞に、ヘルパーウイルスとしてＬＣ１６ｍ８－ＢＡＣｇｆｐをＭＯＩ＝１で接種し、１時間培養後にウイルスを除き、新たに培地を加えた。次に、ＬＣ１６ｍ８－Ｂ５ＲｍＯ－ＳＢＴＫｄｕｐ－ＢＡＣｍｉｄ及びトランスフェクション試薬を混合し、１５分間反応後、細胞へ添加し、３７℃で一晩培養した。蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰ発現を確認した後、ＧＦＰ蛍光陰性プラークの割合が多いウェルから細胞をハーベストし、凍結融解後、超音波処置し、遠心後の上清をウイルス液として得た。ウイルス液を培地で段階希釈し、９６穴プレートで培養したＲＫ１３細胞に接種し、３７℃で二晩培養した。蛍光顕微鏡でＧＦＰ蛍光陰性プラークの割合が多いウェルから細胞をハーベストし、凍結融解後、超音波処置し、遠心後、上清をウイルス液として得た。本作業を繰り返し、２回連続で、ＲＫ１３細胞におけるウイルスプラークが全て蛍光陰性になったところでウイルス純化完了とした。回収したウイルスを６穴プレートで培養したＲＫ１３細胞に接種し、３７℃で二晩培養後、ゲノム抽出キットを用いてウイルスゲノムを抽出した。抽出したウイルスゲノムを鋳型とし、プライマーペア（配列番号６１及び配列番号６２）を用いてＰＣＲを実施し、バンドサイズからＢＡＣｇｆｐ配列の除去を確認した。さらに、ＰＣＲ産物を精製し、ＢＡＣｇｆｐ除去確認プライマー（配列番号６１）及びＢ５Ｒグアニン挿入確認プライマー（配列番号３７）を用いて塩基配列解析を行い、ＢＡＣｇｆｐ配列挿入部位から当該配列が除去されていること、さらに、Ｂ５Ｒ遺伝子配列中の特定の位置に、ＬＣ１６ｍ８では欠失している塩基（グアニン）が挿入されたことが確認され、これをＬＣ１６ｍ８－Ｂ５ＲｍＯとした。
ＢＡＣｇｆｐ除去配列カセットを持つＢＡＣｍｉｄ由来のウイルスは、培養細胞で継代を重ねることでＢＡＣｇｆｐが抜けるように設計されている。前述のＢＡＣウイルス（ＬＣ１６ｍ８－ＢＡＣｇｆｐ）をヘルパーウイルスとして用い、ＲＫ１３細胞からＬＣ１６ｍ８－Ｂ５ＲｍＯ－ＳＢＴＫｄｕｐ－ＢＡＣｍｉｄ由来のウイルスを回収した。６穴プレートで培養したＲＫ１３細胞に、ヘルパーウイルスとしてＬＣ１６ｍ８－ＢＡＣｇｆｐをＭＯＩ＝１で接種し、１時間培養後にウイルスを除き、新たに培地を加えた。次に、ＬＣ１６ｍ８－Ｂ５ＲｍＯ－ＳＢＴＫｄｕｐ－ＢＡＣｍｉｄ及びトランスフェクション試薬を混合し、１５分間反応後、細胞へ添加し、３７℃で一晩培養した。蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰ発現を確認した後、ＧＦＰ蛍光陰性プラークの割合が多いウェルから細胞をハーベストし、凍結融解後、超音波処置し、遠心後の上清をウイルス液として得た。ウイルス液を培地で段階希釈し、９６穴プレートで培養したＲＫ１３細胞に接種し、３７℃で二晩培養した。蛍光顕微鏡でＧＦＰ蛍光陰性プラークの割合が多いウェルから細胞をハーベストし、凍結融解後、超音波処置し、遠心後、上清をウイルス液として得た。本作業を繰り返し、２回連続で、ＲＫ１３細胞におけるウイルスプラークが全て蛍光陰性になったところでウイルス純化完了とした。回収したウイルスを６穴プレートで培養したＲＫ１３細胞に接種し、３７℃で二晩培養後、ゲノム抽出キットを用いてウイルスゲノムを抽出した。抽出したウイルスゲノムを鋳型とし、プライマーペア（配列番号６１及び配列番号６２）を用いてＰＣＲを実施し、バンドサイズからＢＡＣｇｆｐ配列の除去を確認した。さらに、ＰＣＲ産物を精製し、ＢＡＣｇｆｐ除去確認プライマー（配列番号６１）及びＢ５Ｒグアニン挿入確認プライマー（配列番号３７）を用いて塩基配列解析を行い、ＢＡＣｇｆｐ配列挿入部位から当該配列が除去されていること、さらに、Ｂ５Ｒ遺伝子配列中の特定の位置に、ＬＣ１６ｍ８では欠失している塩基（グアニン）が挿入されたことが確認され、これをＬＣ１６ｍ８－Ｂ５ＲｍＯとした。
【0056】
上記と同様の方法により、ＬＣ１６ｍ８－ＢＡＣｇｆｐをヘルパーウイルスとして用い、ＭＤ－ＲＶＶ－ＳＢＴＫｄｕｐ－ＢＡＣｍｉｄ、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－ＳＢＴＫｄｕｐ－ＢＡＣｍｉｄ、ＭＤ－ＲＶＶ－ＥＥＶ７－ＳＢＴＫｄｕｐ－ＢＡＣｍｉｄ、ＭＤ－ＲＶＶ－ＥＥＶ６－ＳＢＴＫｄｕｐ－ＢＡＣｍｉｄ、ＭＤ－ＲＶＶ－Ａ３４Ｒ－ＳＢＴＫｄｕｐ－ＢＡＣｍｉｄ、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－ＥＥＶ７－ＳＢＴＫｄｕｐ－ＢＡＣｍｉｄ、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－ＥＥＶ６－ＳＢＴＫｄｕｐ－ＢＡＣｍｉｄ、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－Ａ３４Ｒ－ＳＢＴＫｄｕｐ－ＢＡＣｍｉｄ由来のウイルスを作製した。これらから抽出したゲノムを鋳型として、特異的プライマーペアを用いたＰＣＲによりバンドサイズを確認した。特異的プライマーペアは以下の通りであった。
Ｃ１１Ｒ欠損確認プライマーＦｗ（配列番号３９）及びＣ１１Ｒ欠損確認プライマーＲｅ（配列番号４０）；
Ｏ１Ｌ欠損確認プライマーＦｗ（配列番号４１）及びＯ１Ｌ欠損確認プライマーＲｅ（配列番号４２）；
Ｆ４Ｌ欠損確認プライマーＦｗ（配列番号４３）及びＦ４Ｌ欠損確認プライマーＲｅ（配列番号４４）；
Ａ３３Ｒ改変確認プライマーＦｗ（配列番号４５）及びＡ３３Ｒ改変確認プライマーＲｅ（配列番号４６）；
Ａ３４Ｒ改変確認プライマーＦｗ（配列番号４７）及びＡ３４Ｒ改変確認プライマーＲｅ（配列番号４８）；
Ａ３６Ｒ改変確認プライマーＦｗ（配列番号４９）及びＡ３６Ｒ改変確認プライマーＲｅ（配列番号５０）；
Ａ５６Ｒ改変確認プライマーＦｗ（配列番号５１）及びＡ５６Ｒ改変確認プライマーＲｅ（配列番号５２）；
Ｂ５Ｒ改変確認プライマーＦｗ（配列番号５３）及びＢ５Ｒ改変確認プライマーＲｅ（配列番号５４）；
Ｆ１２―１３Ｌ改変確認プライマーＦｗ（配列番号５５）及びＦ１２―１３Ｌ改変確認プライマーＲｅ（配列番号５６）；
ＢＡＣｇｆｐ合成プライマーＦｗ（配列番号６１）及びＢＡＣｇｆｐ合成プライマーＲｅ（配列番号６２）
Ｃ１１Ｒ欠損確認プライマーＦｗ（配列番号３９）及びＣ１１Ｒ欠損確認プライマーＲｅ（配列番号４０）；
Ｏ１Ｌ欠損確認プライマーＦｗ（配列番号４１）及びＯ１Ｌ欠損確認プライマーＲｅ（配列番号４２）；
Ｆ４Ｌ欠損確認プライマーＦｗ（配列番号４３）及びＦ４Ｌ欠損確認プライマーＲｅ（配列番号４４）；
Ａ３３Ｒ改変確認プライマーＦｗ（配列番号４５）及びＡ３３Ｒ改変確認プライマーＲｅ（配列番号４６）；
Ａ３４Ｒ改変確認プライマーＦｗ（配列番号４７）及びＡ３４Ｒ改変確認プライマーＲｅ（配列番号４８）；
Ａ３６Ｒ改変確認プライマーＦｗ（配列番号４９）及びＡ３６Ｒ改変確認プライマーＲｅ（配列番号５０）；
Ａ５６Ｒ改変確認プライマーＦｗ（配列番号５１）及びＡ５６Ｒ改変確認プライマーＲｅ（配列番号５２）；
Ｂ５Ｒ改変確認プライマーＦｗ（配列番号５３）及びＢ５Ｒ改変確認プライマーＲｅ（配列番号５４）；
Ｆ１２―１３Ｌ改変確認プライマーＦｗ（配列番号５５）及びＦ１２―１３Ｌ改変確認プライマーＲｅ（配列番号５６）；
ＢＡＣｇｆｐ合成プライマーＦｗ（配列番号６１）及びＢＡＣｇｆｐ合成プライマーＲｅ（配列番号６２）
【0057】
さらに、各ＰＣＲ産物を精製し、改変確認用シーケンスプライマー［Ａ３３Ｒ改変（配列番号４５）、Ａ３４Ｒ改変（配列番号４７）、Ａ３６Ｒ改変（配列番号４９）、Ａ５６Ｒ改変（配列番号５１、配列番号５７）、Ｂ５Ｒ改変（配列番号５３）、Ｆ１２－１３Ｌ改変（配列番号５５、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０）、ＢＡＣｇｆｐ除去（配列番号６１）］を用いた塩基配列解析により、得られたクローンは、それぞれ、目的の組換えウイルス（ＭＤ－ＲＶＶ、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ、ＭＤ－ＲＶＶ－ＥＥＶ７、ＭＤ－ＲＶＶ－ＥＥＶ６、ＭＤ－ＲＶＶ－Ａ３４Ｒ、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－ＥＥＶ７、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－ＥＥＶ６、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－Ａ３４Ｒ）であることが確認された。
【実施例2】
【0058】
ＲＮＲ遺伝子欠損による正常細胞における細胞障害性の低減
Ｃ１１Ｒ及びＯ１Ｌ遺伝子が欠損した腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであるＭＤ－ＲＶＶ及びそのＥＥＶ関連遺伝子改変ウイルス、並びにそれらのウイルスゲノムに存在するリボヌクレオチド還元酵素（ＲＮＲ）小サブユニットをコードするＦ４Ｌ遺伝子を欠損させた改変ウイルスを、癌細胞及び正常細胞由来の培養細胞に感染させ、細胞障害性を細胞数測定キット（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８，同仁化学）により評価した。癌細胞（ヒト子宮頸癌由来細胞株：ＨｅＬａ細胞）及び正常細胞（ヒト皮膚線維芽細胞：ＮＨＤＦ）を９６穴プレートに播種し、血清含有培地で接着培養後、無血清ＥＭＥＭ培地で血清飢餓培養した各細胞に、ＬＣ１６ｍ８－Ｂ５ＲｍＯ、ＭＤ－ＲＶＶ、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－Ａ３４Ｒ、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－ＥＥＶ６、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－ＥＥＶ７の各ウイルスを低濃度（０．８×１０６ＰＦＵ／ｍＬ）及び高濃度（４．０×１０６ＰＦＵ／ｍＬ）で接種し、７２時間後、ウイルスを接種していない対照群の吸光度を１００％とした場合の各ウイルス接種群の細胞生存率を細胞数測定キットにより定量した。その結果を図３に示す。ここで用いたすべてのウイルスは癌細胞に対し同様の細胞障害性を示したが（図３Ａ）、正常細胞に対してはＦ４Ｌ遺伝子を欠損したウイルス（ΔＲＲ）においてウイルス毒性が著しく軽減された（図３Ｂ）。
Ｃ１１Ｒ及びＯ１Ｌ遺伝子が欠損した腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであるＭＤ－ＲＶＶ及びそのＥＥＶ関連遺伝子改変ウイルス、並びにそれらのウイルスゲノムに存在するリボヌクレオチド還元酵素（ＲＮＲ）小サブユニットをコードするＦ４Ｌ遺伝子を欠損させた改変ウイルスを、癌細胞及び正常細胞由来の培養細胞に感染させ、細胞障害性を細胞数測定キット（Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８，同仁化学）により評価した。癌細胞（ヒト子宮頸癌由来細胞株：ＨｅＬａ細胞）及び正常細胞（ヒト皮膚線維芽細胞：ＮＨＤＦ）を９６穴プレートに播種し、血清含有培地で接着培養後、無血清ＥＭＥＭ培地で血清飢餓培養した各細胞に、ＬＣ１６ｍ８－Ｂ５ＲｍＯ、ＭＤ－ＲＶＶ、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－Ａ３４Ｒ、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－ＥＥＶ６、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－ＥＥＶ７の各ウイルスを低濃度（０．８×１０６ＰＦＵ／ｍＬ）及び高濃度（４．０×１０６ＰＦＵ／ｍＬ）で接種し、７２時間後、ウイルスを接種していない対照群の吸光度を１００％とした場合の各ウイルス接種群の細胞生存率を細胞数測定キットにより定量した。その結果を図３に示す。ここで用いたすべてのウイルスは癌細胞に対し同様の細胞障害性を示したが（図３Ａ）、正常細胞に対してはＦ４Ｌ遺伝子を欠損したウイルス（ΔＲＲ）においてウイルス毒性が著しく軽減された（図３Ｂ）。
【実施例3】
【0059】
ＲＮＲ遺伝子欠損による免疫不全マウスへの静脈内投与におけるウイルス毒性の軽減
免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウス、５週齢、雌、各群５匹）にＬＣ１６ｍ８－Ｂ５ＲｍＯ、ＭＤ－ＲＶＶ、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－ＥＥＶ６を２．５×１０４、５×１０５、１×１０７ＰＦＵ/０．１ｍＬの用量でマウス静脈内に投与し、生存数、体重、ウイルス症状スコアを観察した。ウイルス症状スコアは、最大５点で、０点：症状なし、１点：発痘１～２個、２点：発痘３～４個、３点：発痘多数、毛並みの荒れ、立毛、４点：呼吸困難、瀕死、５点：死亡、とした。その結果を図４～６に示す。ＬＣ１６ｍ８－Ｂ５ＲｍＯ及びＭＤ－ＲＶＶ投与群は、それぞれ、ウイルス投与１９日後及び４０日後までにすべての用量群の動物が死亡したが、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－ＥＥＶ６は、観察終了とした７１日まで、高用量投与群、中用量投与群は５匹中３匹が生存し、また、低用量投与群はすべての動物が生存していた（図４）。いずれのウイルスも投与量依存的に体重の減少が観察され、体重減少の程度は、ＬＣ１６ｍ８－Ｂ５ＲｍＯ、ＭＤ－ＲＶＶ、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－ＥＥＶ６の順に大きかった（図５）。ウイルス症状スコアもまた、ＬＣ１６ｍ８－Ｂ５ＲｍＯ、ＭＤ－ＲＶＶ、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－ＥＥＶ６の順に、投与量依存的に高値を示した（図６）。
免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウス、５週齢、雌、各群５匹）にＬＣ１６ｍ８－Ｂ５ＲｍＯ、ＭＤ－ＲＶＶ、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－ＥＥＶ６を２．５×１０４、５×１０５、１×１０７ＰＦＵ/０．１ｍＬの用量でマウス静脈内に投与し、生存数、体重、ウイルス症状スコアを観察した。ウイルス症状スコアは、最大５点で、０点：症状なし、１点：発痘１～２個、２点：発痘３～４個、３点：発痘多数、毛並みの荒れ、立毛、４点：呼吸困難、瀕死、５点：死亡、とした。その結果を図４～６に示す。ＬＣ１６ｍ８－Ｂ５ＲｍＯ及びＭＤ－ＲＶＶ投与群は、それぞれ、ウイルス投与１９日後及び４０日後までにすべての用量群の動物が死亡したが、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－ＥＥＶ６は、観察終了とした７１日まで、高用量投与群、中用量投与群は５匹中３匹が生存し、また、低用量投与群はすべての動物が生存していた（図４）。いずれのウイルスも投与量依存的に体重の減少が観察され、体重減少の程度は、ＬＣ１６ｍ８－Ｂ５ＲｍＯ、ＭＤ－ＲＶＶ、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－ＥＥＶ６の順に大きかった（図５）。ウイルス症状スコアもまた、ＬＣ１６ｍ８－Ｂ５ＲｍＯ、ＭＤ－ＲＶＶ、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－ＥＥＶ６の順に、投与量依存的に高値を示した（図６）。
【実施例4】
【0060】
ＥＥＶ関連タンパク質の改変による癌細胞での生産性向上
ＨｅＬａ細胞を２４穴プレートに播種し、血清含有培地で接着培養後、ＭＤ－ＲＶＶ、ＭＤ－ＲＶＶ－Ａ３４Ｒ、ＭＤ－ＲＶＶ－ＥＥＶ６、ＭＤ－ＲＶＶ－ＥＥＶ７、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－Ａ３４Ｒ、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－ＥＥＶ６、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－ＥＥＶ７をＭＯＩ＝１で接種し、１時間培養後にウイルスを除き、新たに血清含有培地を加え、１６、２４、３２、４８時間後に培地を回収し、培養上清ウイルスを得た。回収ウイルスを段階希釈し、６穴プレートで培養したＲＫ１３細胞に接種し、１時間培養後にウイルスを除き、新たにメチルセルロース培地を加え、３７℃で７２時間培養後、プラークをカウントし感染価を算出した。その結果を図７に示す。ＭＤ－ＲＶＶ（図７Ａ）及びＭＤ－ＲＶＶのＦ４Ｌ遺伝子を欠損させたウイルス（図７Ｂ）に対して、ＥＥＶ関連タンパク質を改変することにより、いずれの改変ウイルスも培養期間を通して培養上清ウイルスの産生量の増加傾向が示された。特に、ＥＥＶ関連タンパク質の改変数が多いほどその効果は大きかった。
ＨｅＬａ細胞を２４穴プレートに播種し、血清含有培地で接着培養後、ＭＤ－ＲＶＶ、ＭＤ－ＲＶＶ－Ａ３４Ｒ、ＭＤ－ＲＶＶ－ＥＥＶ６、ＭＤ－ＲＶＶ－ＥＥＶ７、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－Ａ３４Ｒ、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－ＥＥＶ６、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－ＥＥＶ７をＭＯＩ＝１で接種し、１時間培養後にウイルスを除き、新たに血清含有培地を加え、１６、２４、３２、４８時間後に培地を回収し、培養上清ウイルスを得た。回収ウイルスを段階希釈し、６穴プレートで培養したＲＫ１３細胞に接種し、１時間培養後にウイルスを除き、新たにメチルセルロース培地を加え、３７℃で７２時間培養後、プラークをカウントし感染価を算出した。その結果を図７に示す。ＭＤ－ＲＶＶ（図７Ａ）及びＭＤ－ＲＶＶのＦ４Ｌ遺伝子を欠損させたウイルス（図７Ｂ）に対して、ＥＥＶ関連タンパク質を改変することにより、いずれの改変ウイルスも培養期間を通して培養上清ウイルスの産生量の増加傾向が示された。特に、ＥＥＶ関連タンパク質の改変数が多いほどその効果は大きかった。
【0061】
また、ＨｅＬａ細胞を２４穴プレートに播種し、血清含有培地で接着培養後、ケミカリーディファンイド培地でＬＣ１６ｍ８－Ｂ５ＲｍＯ、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－Ａ３４Ｒ、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－ＥＥＶ６、ＭＤ－ＲＶＶ－ΔＲＲ－ＥＥＶ７をＭＯＩ＝０．０１で接種し、１時間培養後にウイルスを除き、新たにケミカリーディファインド培地を加え、４８時間後に培地を回収し、培養上清ウイルスを得た。さらに、細胞を回収し凍結融解後、超音波処理し、遠心後の上清を細胞内ウイルスとして得た。回収ウイルスを段階希釈し、６穴プレートで培養したＲＫ１３細胞に接種し、１時間培養後にウイルスを除き、新たにメチルセルロース培地を加え、３７℃で７２時間培養後、プラークをカウントし感染価を算出した。その結果を図８に示す。ＥＥＶ関連タンパク質の改変により、培養上清ウイルス（図８Ａ）及び細胞内ウイルス（図８Ｂ）のいずれにおいても、ＲＮＲ遺伝子の欠損により低下したウイルス産生量を回復する傾向が示された。特に、ＥＥＶ関連タンパク質の改変数が多いほどその効果は大きかった。
【実施例5】
【0062】
ヒト膵がん腹膜播種マウスにおけるＲＮＲ遺伝子欠損ウイルスの腹腔内投与による効果
腹腔内投与において、ＲＮＲ遺伝子欠損ウイルスが腹膜播種モデルマウスの生存延長効果を示すことを確認するために、３×１０６個のヒト膵がんＢｘＰＣ３－Ｌｕｃ細胞を、免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウス、６週齢、雌）の腹腔内に移植しヒト膵がん腹膜播種マウスを構築後、２１日後にＭＤ－ＲＶＶまたはＭＤ－ＲＶＶ－△ＲＲ－ＥＥＶ６（１０５ＰＦＵ／０．１ｍＬ）を、マウス腹腔内に投与した。また、対照としたウイルス非投与群には、同じく２１日後に、ＰＢＳ（０．１ｍＬ）をマウス腹腔内に投与した。投与後、ウイルス毒性、生存数を観察した。なお、ウイルス毒性はその症状をスコア化し、最大５点で、０点：症状なし、１点：発痘（ポックス）１～２個、２点：発痘（ポックス）３～４個、３点：発痘（ポックス）多数、毛並みの荒れ、立毛、４点：呼吸困難、瀕死、５点：ウイルス関連死、とした。結果を図９～１０に示す（図９：ウイルス症状スコア、図１０：生存率）。
腹腔内投与において、ＲＮＲ遺伝子欠損ウイルスが腹膜播種モデルマウスの生存延長効果を示すことを確認するために、３×１０６個のヒト膵がんＢｘＰＣ３－Ｌｕｃ細胞を、免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウス、６週齢、雌）の腹腔内に移植しヒト膵がん腹膜播種マウスを構築後、２１日後にＭＤ－ＲＶＶまたはＭＤ－ＲＶＶ－△ＲＲ－ＥＥＶ６（１０５ＰＦＵ／０．１ｍＬ）を、マウス腹腔内に投与した。また、対照としたウイルス非投与群には、同じく２１日後に、ＰＢＳ（０．１ｍＬ）をマウス腹腔内に投与した。投与後、ウイルス毒性、生存数を観察した。なお、ウイルス毒性はその症状をスコア化し、最大５点で、０点：症状なし、１点：発痘（ポックス）１～２個、２点：発痘（ポックス）３～４個、３点：発痘（ポックス）多数、毛並みの荒れ、立毛、４点：呼吸困難、瀕死、５点：ウイルス関連死、とした。結果を図９～１０に示す（図９：ウイルス症状スコア、図１０：生存率）。
【0063】
ウイルス毒性に関して、ＭＤ－ＲＶＶ投与群は、投与後１０日目あたりから発痘（ポックス）症状が認められ、以降も発痘（ポックス）数の増加、毛並みの荒れ、呼吸困難等の重度のウイルス症状が発現し、最終的に４２日までに全例がそれらウイルス毒性により死亡した（図９）。一方で、ＭＤ－ＲＶＶ－△ＲＲ－ＥＥＶ６投与群は、一切のウイルス症状を示さず、ＲＮＲ遺伝子欠損による安全性向上効果が確認された（図９）。
【0064】
生存数による評価では、ＭＤ－ＲＶＶ投与群は、重度のウイルス毒性を伴い、腫瘍が増大したウイルス非投与群と同時期に全例が死亡した（図１０）。一方で、生存期間に差があることを検定するｌｏｇ－ｒａｎｋ ｔｅｓｔにおいて、ＭＤ－ＲＶＶ－△ＲＲ－ＥＥＶ６投与群は、ウイルス非投与群及びＭＤ－ＲＶＶ投与群に対して、有意な生存延長効果を示した（図１０）。
【0065】
続いて、別のヒト膵がん細胞ＭＩＡ－ＰａＣａ２／ＣＭＶ－Ｌｕｃ細胞３×１０６個を、免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウス、６週齢、雌）の腹腔内に移植しヒト膵がん腹膜播種マウスを構築後、１４日後にＭＤ－ＲＶＶ（１０６ＰＦＵ／０．１ｍＬ）またはＭＤ－ＲＶＶ－△ＲＲ－ＥＥＶ６（１０６または１０７ＰＦＵ／０．１ｍＬ）を、マウス腹腔内に投与した。また、ウイルス非投与群には、同じく１４日後に、ＰＢＳ（０．１ｍＬ）をマウス腹腔内に投与した。投与後、ウイルス毒性、生存数を観察した。なお、ウイルス毒性はその症状をスコア化し、最大５点で、０点：症状なし、１点：発痘（ポックス）１～２個、２点：発痘（ポックス）３～４個、３点：発痘（ポックス）多数、毛並みの荒れ、立毛、４点：呼吸困難、瀕死、５点：ウイルス関連死、とした。結果を図１１及び１２に示す（図１１：ウイルス症状スコア、図１２：生存率）。
【0066】
ウイルス毒性に関して、ＭＤ－ＲＶＶ投与群は、ウイルス症状が顕著に認められる個体とそうでない個体のばらつきが観察されたが、全体として中程度～重度のウイルス症状が認められた（図１１）。一方で、ＭＤ－ＲＶＶ－△ＲＲ－ＥＥＶ６投与群は、一切のウイルス症状を示さず、ＲＮＲ遺伝子欠損による安全性向上効果が確認された（図１１）。
【0067】
生存数による評価では、ＭＤ－ＲＶＶ投与群は、重度のウイルス毒性及び腫瘍増大によりウイルス未接種群と同時期に全例が死亡した（図１２）。一方で、ＭＤ－ＲＶＶ－△ＲＲ－ＥＥＶ６投与群は、ウイルス非投与群及びＭＤ－ＲＶＶ投与群に対して、用量依存的な生存延長傾向を示した（図１２）。
【0068】
以上の結果から、ＲＮＲ遺伝子欠損ウイルスは、腹腔内投与可能な安全性の高い腫瘍溶解性ウイルスであることが示唆された。
【実施例6】
【0069】
ヒト膵がん同所移植マウスにおけるＲＮＲ遺伝子欠損ウイルスの静脈内投与による効果
静脈内投与において、ＲＮＲ遺伝子欠損ウイルスが膵がんモデルマウスの生存延長効果を示すことを確認するために、１×１０６個のヒト膵がんＭＩＡ－ＰａＣａ２／ＣＭＶ－Ｌｕｃ細胞を、免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウス、５週齢、雌）の膵被膜に移植しヒト膵がん同所移植マウスを構築後、１２日後にＭＤ－ＲＶＶ－ＲＬｕｃ（１０５ＰＦＵ／０．１ｍＬ）またはＭＤ－ＲＶＶ－△ＲＲ－ＥＥＶ６－ＲＬｕｃ（１０５ＰＦＵ／０．１ｍＬ）をマウス静脈内に投与した。なお、ＲＬｕｃはウミシイタケ由来ルシフェラーゼ遺伝子を意味し、将来ウイルスの生体内分布を確認することを目的に、ＲＬｕｃ発現カセット（配列番号６３）を構築後、実施例１で欠損後のＣ１１Ｒ－ＡｃｃＩサイトの直前に挿入した。また、ＭＤ－ＲＶＶ－△ＲＲ－ＥＥＶ６－ＲＬｕｃは、１回目の投与後、１週間以内に追加で２回投与した（頻回投与）。また、ウイルス非投与群には、同じく１２日後に、ＰＢＳ（０．１ｍＬ）をマウス静脈内に投与した。投与後、ウイルス毒性、生存数を観察した。なお、ウイルス毒性はその症状をスコア化し、最大５点で、０点：症状なし、１点：発痘（ポックス）１～２個、２点：発痘（ポックス）３～４個、３点：発痘（ポックス）多数、毛並みの荒れ、立毛、４点：呼吸困難、瀕死、５点：ウイルス関連死、とした。結果を図１３及び１４に示す（図１３：ウイルス症状スコア、図１４：生存率）。
静脈内投与において、ＲＮＲ遺伝子欠損ウイルスが膵がんモデルマウスの生存延長効果を示すことを確認するために、１×１０６個のヒト膵がんＭＩＡ－ＰａＣａ２／ＣＭＶ－Ｌｕｃ細胞を、免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウス、５週齢、雌）の膵被膜に移植しヒト膵がん同所移植マウスを構築後、１２日後にＭＤ－ＲＶＶ－ＲＬｕｃ（１０５ＰＦＵ／０．１ｍＬ）またはＭＤ－ＲＶＶ－△ＲＲ－ＥＥＶ６－ＲＬｕｃ（１０５ＰＦＵ／０．１ｍＬ）をマウス静脈内に投与した。なお、ＲＬｕｃはウミシイタケ由来ルシフェラーゼ遺伝子を意味し、将来ウイルスの生体内分布を確認することを目的に、ＲＬｕｃ発現カセット（配列番号６３）を構築後、実施例１で欠損後のＣ１１Ｒ－ＡｃｃＩサイトの直前に挿入した。また、ＭＤ－ＲＶＶ－△ＲＲ－ＥＥＶ６－ＲＬｕｃは、１回目の投与後、１週間以内に追加で２回投与した（頻回投与）。また、ウイルス非投与群には、同じく１２日後に、ＰＢＳ（０．１ｍＬ）をマウス静脈内に投与した。投与後、ウイルス毒性、生存数を観察した。なお、ウイルス毒性はその症状をスコア化し、最大５点で、０点：症状なし、１点：発痘（ポックス）１～２個、２点：発痘（ポックス）３～４個、３点：発痘（ポックス）多数、毛並みの荒れ、立毛、４点：呼吸困難、瀕死、５点：ウイルス関連死、とした。結果を図１３及び１４に示す（図１３：ウイルス症状スコア、図１４：生存率）。
【0070】
ウイルス毒性に関して、ＭＤ－ＲＶＶ－ＲＬｕｃ投与群は、投与後１０日目あたりから発痘（ポックス）症状が認められ、以降も発痘（ポックス）数の増加、毛並みの荒れ、呼吸困難等の重度のウイルス症状が発現し、最終的に３２日までに全例がそれらウイルス毒性を伴い死亡した（図１３）。一方で、ＭＤ－ＲＶＶ－△ＲＲ－ＥＥＶ６－ＲＬｕｃ投与群は、単回投与及び頻回投与共に多少のウイルス症状が認められたものの、致死的な症状は見られず、ＲＮＲ遺伝子欠損による安全性向上効果が確認された（図１３）。
【0071】
生存数による評価では、ＭＤ－ＲＶＶ－ＲＬｕｃ投与群は、重度のウイルス毒性により、腫瘍を形成したウイルス非投与群よりも早期に全例が死亡した（図１４）。一方で、生存期間に差があることを検定するｌｏｇ－ｒａｎｋ ｔｅｓｔにおいて、ＭＤ－ＲＶＶ－△ＲＲ－ＥＥＶ６－ＲＬｕｃの単回投与群は、ウイルス非投与群と同様の生存変化であったものの、頻回投与群は、ウイルス非投与群に対して、有意な生存延長効果を示した（図１４）。
【0072】
以上の結果から、ＲＮＲ遺伝子欠損ウイルスは、静脈内頻回投与可能な安全性の高い腫瘍溶解性ウイルスであることが示唆された。
【実施例7】
【0073】
ヒト膵がん皮下移植マウスにおけるＲＮＲ遺伝子欠損ウイルスの腫瘍内投与による効果
ＲＮＲ遺伝子欠損ウイルスの腫瘍内投与での腫瘍増殖抑制効果を確認するために、５×１０６個のヒト膵がんＭＩＡ－ＰａＣａ２／ＣＭＶ－Ｌｕｃ細胞を、免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウス、６週齢、雌）の右大腿部皮下に移植し、腫瘍体積が１００ｍｍ３以上に達した個体に対して、ＭＤ－ＲＶＶ－△ＲＲ－ＥＥＶ６－ＲＬｕｃ（１０４、１０５、１０６ＰＦＵ/０．１ｍL）を腫瘍内に投与した。また、ウイルス非投与群には、ＰＢＳ（０．１ｍＬ）を腫瘍内に投与した。投与後、腫瘍体積変化を観察した。腫瘍体積は、短径×短径×長径×１／２で算出した。
ＲＮＲ遺伝子欠損ウイルスの腫瘍内投与での腫瘍増殖抑制効果を確認するために、５×１０６個のヒト膵がんＭＩＡ－ＰａＣａ２／ＣＭＶ－Ｌｕｃ細胞を、免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウス、６週齢、雌）の右大腿部皮下に移植し、腫瘍体積が１００ｍｍ３以上に達した個体に対して、ＭＤ－ＲＶＶ－△ＲＲ－ＥＥＶ６－ＲＬｕｃ（１０４、１０５、１０６ＰＦＵ/０．１ｍL）を腫瘍内に投与した。また、ウイルス非投与群には、ＰＢＳ（０．１ｍＬ）を腫瘍内に投与した。投与後、腫瘍体積変化を観察した。腫瘍体積は、短径×短径×長径×１／２で算出した。
【0074】
腫瘍体積変化に関して、ＭＤ－ＲＶＶ－△ＲＲ－ＥＥＶ６－ＲＬｕｃは、おおよそ用量依存的に腫瘍増殖の抑制傾向を示し、腫瘍内投与での腫瘍増殖抑制効果が確認された（図１５）。
【0075】
実施例５～７の結果から、ＲＮＲ遺伝子欠損ウイルスであるＭＤ－ＲＶＶ－△ＲＲ－ＥＥＶ６およびＭＤ－ＲＶＶ－△ＲＲ－ＥＥＶ６－ＲＬｕｃは、複数のヒト膵がんマウスにおいて、自身の持つ腫瘍溶解作用により、安全性を確保しつつ生存延長効果を発揮することが示唆された。
【配列表フリーテキスト】
【0076】
配列番号１は、ＴＫ１プライマーＦｗの塩基配列である。
配列番号２は、ＴＫ１プライマーＲｅの塩基配列である。
配列番号３は、ＴＫ２プライマーＦｗの塩基配列である。
配列番号４は、ＴＫ２プライマーＲｅの塩基配列である。
配列番号５は、ｐＵＣＩＤＴ－ＫＡＮ－ｏｐ７．５＋ＥＧＦＰプラスミドの塩基配列である。
配列番号６は、ＢＡＣｇｆｐ除去配列カセットの塩基配列である。
配列番号７は、ＴＫプライマーＦｗの塩基配列である。
配列番号８は、ＴＫプライマーＲｅの塩基配列である。
配列番号９は、カナマイシンプライマー１Ｆｗの塩基配列である。
配列番号１０は、カナマイシンプライマー１Ｒｅの塩基配列である。
配列番号１１は、Ｂ５Ｒ改変カセットの塩基配列である。
配列番号１２は、ｐＵＣＦｋ－Ｂ５ＲｍＯの塩基配列である。
配列番号１３は、カナマイシンプライマー２Ｆｗの塩基配列である。
配列番号１４は、カナマイシンプライマー２Ｒｅの塩基配列である。
配列番号１５は、Ｃ１１Ｒ欠損カセットの塩基配列である。
配列番号１６は、ｐＵＣ５７－ΔＶＧＦの塩基配列である。
配列番号１７は、カナマイシンプライマー３Ｆｗの塩基配列である。
配列番号１８は、カナマイシンプライマー３Ｒｅの塩基配列である。
配列番号１９は、Ｏ１Ｌ欠損カセットの塩基配列である。
配列番号２０は、ｐＵＣ５７－ΔＯ１Ｌ－ｒＫａｎＩの塩基配列である。
配列番号２１は、Ｆ４Ｌ欠損カセットの塩基配列である。
配列番号２２は、ｐＵＣ５７－ΔＦ４Ｌ－ｒＫａｎＩの塩基配列である。
配列番号２３は、Ａ３３Ｒ改変カセットの塩基配列である。
配列番号２４は、Ａ３４Ｒ改変カセットの塩基配列である。
配列番号２５は、Ａ３６Ｒ改変カセットの塩基配列である。
配列番号２６は、Ａ３３－３４－３６Ｒ改変カセットの塩基配列である。
配列番号２７は、Ａ５６Ｒ改変カセットの塩基配列である。
配列番号２８は、Ｂ５Ｒ改変カセットの塩基配列である。
配列番号２９は、Ｆ１２－１３Ｌ改変カセットの塩基配列である。
配列番号３０は、ｐＵＣ５７－Ａ３３Ｒ－ｒＫａｎＩの塩基配列である。
配列番号３１は、ｐＵＣ５７－Ａ３４Ｒ－ｒＫａｎＩの塩基配列である。
配列番号３２は、ｐＵＣ５７－Ａ３６Ｒ－ｒＫａｎＩの塩基配列である。
配列番号３３は、ｐＵＣ５７－Ａ３３―３４－３６Ｒ－ｒＫａｎＩの塩基配列である。
配列番号３４は、ｐＵＣ５７－Ａ５６Ｒ－ｒＫａｎＩの塩基配列である。
配列番号３５は、ｐＵＣ５７－Ｂ５Ｒ－ｒＫａｎＩの塩基配列である。
配列番号３６は、ｐＵＣ５７－Ｆ１２－１３Ｌ－ｒＫａｎＩの塩基配列である。
配列番号３７は、Ｂ５Ｒ改変確認プライマーＦｗの塩基配列である。
配列番号３８は、Ｂ５Ｒ改変確認プライマーＲｅの塩基配列である。
配列番号３９は、Ｃ１１Ｒ欠損確認プライマーＦｗの塩基配列である。
配列番号４０は、Ｃ１１Ｒ欠損確認プライマーＲｅの塩基配列である。
配列番号４１は、Ｏ１Ｌ欠損確認プライマーＦｗの塩基配列である。
配列番号４２は、Ｏ１Ｌ欠損確認プライマーＲｅの塩基配列である。
配列番号４３は、Ｆ４Ｌ欠損確認プライマーＦｗの塩基配列である。
配列番号４４は、Ｆ４Ｌ欠損確認プライマーＲｅの塩基配列である。
配列番号４５は、Ａ３３Ｒ改変確認プライマーＦｗの塩基配列である。
配列番号４６は、Ａ３３Ｒ改変確認プライマーＲｅの塩基配列である。
配列番号４７は、Ａ３４Ｒ改変確認プライマーＦｗの塩基配列である。
配列番号４８は、Ａ３４Ｒ改変確認プライマーＲｅの塩基配列である。
配列番号４９は、Ａ３６Ｒ改変確認プライマーＦｗの塩基配列である。
配列番号５０は、Ａ３６Ｒ改変確認プライマーＲｅの塩基配列である。
配列番号５１は、Ａ５６Ｒ改変確認プライマーＦｗの塩基配列である。
配列番号５２は、Ａ５６Ｒ改変確認プライマーＲｅの塩基配列である。
配列番号５３は、Ｂ５Ｒ改変確認プライマーＦｗの塩基配列である。
配列番号５４は、Ｂ５Ｒ改変確認プライマーＲｅの塩基配列である。
配列番号５５は、Ｆ１２―１３Ｌ改変確認プライマーＦｗの塩基配列である。
配列番号５６は、Ｆ１２―１３Ｌ改変確認プライマーＲｅの塩基配列である。
配列番号５７は、Ａ５６Ｒ改変確認プライマーＦｗの塩基配列である。
配列番号５８は、Ｆ１２―１３Ｌ改変確認プライマーＦｗの塩基配列である。
配列番号５９は、Ｆ１２―１３Ｌ改変確認プライマーＦｗの塩基配列である。
配列番号６０は、Ｆ１２―１３Ｌ改変確認プライマーＦｗの塩基配列である。
配列番号６１は、ＢＡＣｇｆｐ合成プライマーＦｗの塩基配列である。
配列番号６２は、ＢＡＣｇｆｐ合成プライマーＲｅの塩基配列である。
配列番号６３は、ＲＬｕｃ発現カセットの塩基配列である。
配列番号２は、ＴＫ１プライマーＲｅの塩基配列である。
配列番号３は、ＴＫ２プライマーＦｗの塩基配列である。
配列番号４は、ＴＫ２プライマーＲｅの塩基配列である。
配列番号５は、ｐＵＣＩＤＴ－ＫＡＮ－ｏｐ７．５＋ＥＧＦＰプラスミドの塩基配列である。
配列番号６は、ＢＡＣｇｆｐ除去配列カセットの塩基配列である。
配列番号７は、ＴＫプライマーＦｗの塩基配列である。
配列番号８は、ＴＫプライマーＲｅの塩基配列である。
配列番号９は、カナマイシンプライマー１Ｆｗの塩基配列である。
配列番号１０は、カナマイシンプライマー１Ｒｅの塩基配列である。
配列番号１１は、Ｂ５Ｒ改変カセットの塩基配列である。
配列番号１２は、ｐＵＣＦｋ－Ｂ５ＲｍＯの塩基配列である。
配列番号１３は、カナマイシンプライマー２Ｆｗの塩基配列である。
配列番号１４は、カナマイシンプライマー２Ｒｅの塩基配列である。
配列番号１５は、Ｃ１１Ｒ欠損カセットの塩基配列である。
配列番号１６は、ｐＵＣ５７－ΔＶＧＦの塩基配列である。
配列番号１７は、カナマイシンプライマー３Ｆｗの塩基配列である。
配列番号１８は、カナマイシンプライマー３Ｒｅの塩基配列である。
配列番号１９は、Ｏ１Ｌ欠損カセットの塩基配列である。
配列番号２０は、ｐＵＣ５７－ΔＯ１Ｌ－ｒＫａｎＩの塩基配列である。
配列番号２１は、Ｆ４Ｌ欠損カセットの塩基配列である。
配列番号２２は、ｐＵＣ５７－ΔＦ４Ｌ－ｒＫａｎＩの塩基配列である。
配列番号２３は、Ａ３３Ｒ改変カセットの塩基配列である。
配列番号２４は、Ａ３４Ｒ改変カセットの塩基配列である。
配列番号２５は、Ａ３６Ｒ改変カセットの塩基配列である。
配列番号２６は、Ａ３３－３４－３６Ｒ改変カセットの塩基配列である。
配列番号２７は、Ａ５６Ｒ改変カセットの塩基配列である。
配列番号２８は、Ｂ５Ｒ改変カセットの塩基配列である。
配列番号２９は、Ｆ１２－１３Ｌ改変カセットの塩基配列である。
配列番号３０は、ｐＵＣ５７－Ａ３３Ｒ－ｒＫａｎＩの塩基配列である。
配列番号３１は、ｐＵＣ５７－Ａ３４Ｒ－ｒＫａｎＩの塩基配列である。
配列番号３２は、ｐＵＣ５７－Ａ３６Ｒ－ｒＫａｎＩの塩基配列である。
配列番号３３は、ｐＵＣ５７－Ａ３３―３４－３６Ｒ－ｒＫａｎＩの塩基配列である。
配列番号３４は、ｐＵＣ５７－Ａ５６Ｒ－ｒＫａｎＩの塩基配列である。
配列番号３５は、ｐＵＣ５７－Ｂ５Ｒ－ｒＫａｎＩの塩基配列である。
配列番号３６は、ｐＵＣ５７－Ｆ１２－１３Ｌ－ｒＫａｎＩの塩基配列である。
配列番号３７は、Ｂ５Ｒ改変確認プライマーＦｗの塩基配列である。
配列番号３８は、Ｂ５Ｒ改変確認プライマーＲｅの塩基配列である。
配列番号３９は、Ｃ１１Ｒ欠損確認プライマーＦｗの塩基配列である。
配列番号４０は、Ｃ１１Ｒ欠損確認プライマーＲｅの塩基配列である。
配列番号４１は、Ｏ１Ｌ欠損確認プライマーＦｗの塩基配列である。
配列番号４２は、Ｏ１Ｌ欠損確認プライマーＲｅの塩基配列である。
配列番号４３は、Ｆ４Ｌ欠損確認プライマーＦｗの塩基配列である。
配列番号４４は、Ｆ４Ｌ欠損確認プライマーＲｅの塩基配列である。
配列番号４５は、Ａ３３Ｒ改変確認プライマーＦｗの塩基配列である。
配列番号４６は、Ａ３３Ｒ改変確認プライマーＲｅの塩基配列である。
配列番号４７は、Ａ３４Ｒ改変確認プライマーＦｗの塩基配列である。
配列番号４８は、Ａ３４Ｒ改変確認プライマーＲｅの塩基配列である。
配列番号４９は、Ａ３６Ｒ改変確認プライマーＦｗの塩基配列である。
配列番号５０は、Ａ３６Ｒ改変確認プライマーＲｅの塩基配列である。
配列番号５１は、Ａ５６Ｒ改変確認プライマーＦｗの塩基配列である。
配列番号５２は、Ａ５６Ｒ改変確認プライマーＲｅの塩基配列である。
配列番号５３は、Ｂ５Ｒ改変確認プライマーＦｗの塩基配列である。
配列番号５４は、Ｂ５Ｒ改変確認プライマーＲｅの塩基配列である。
配列番号５５は、Ｆ１２―１３Ｌ改変確認プライマーＦｗの塩基配列である。
配列番号５６は、Ｆ１２―１３Ｌ改変確認プライマーＲｅの塩基配列である。
配列番号５７は、Ａ５６Ｒ改変確認プライマーＦｗの塩基配列である。
配列番号５８は、Ｆ１２―１３Ｌ改変確認プライマーＦｗの塩基配列である。
配列番号５９は、Ｆ１２―１３Ｌ改変確認プライマーＦｗの塩基配列である。
配列番号６０は、Ｆ１２―１３Ｌ改変確認プライマーＦｗの塩基配列である。
配列番号６１は、ＢＡＣｇｆｐ合成プライマーＦｗの塩基配列である。
配列番号６２は、ＢＡＣｇｆｐ合成プライマーＲｅの塩基配列である。
配列番号６３は、ＲＬｕｃ発現カセットの塩基配列である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】