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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-23
(45)【発行日】2024-09-02
(54)【発明の名称】カルボプラチン複合体及びその薬物製剤
(51)【国際特許分類】
A61K 47/54 20170101AFI20240826BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240826BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20240826BHJP
A61P 31/10 20060101ALI20240826BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20240826BHJP
A61K 47/12 20060101ALI20240826BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20240826BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20240826BHJP
A61K 9/20 20060101ALI20240826BHJP
A61K 9/06 20060101ALI20240826BHJP
A61K 9/12 20060101ALI20240826BHJP
A61K 9/19 20060101ALI20240826BHJP
A61K 31/282 20060101ALI20240826BHJP
【ＦＩ】
A61K47/54
A61P35/00
A61P31/04
A61P31/10
A61P31/12
A61K47/12
A61K9/08
A61K9/14
A61K9/20
A61K9/06
A61K9/12
A61K9/19
A61K31/282
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2022513668
(86)(22)【出願日】2020-08-26
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-02-07
(86)【国際出願番号】 CN2020111393
(87)【国際公開番号】W WO2021037059
(87)【国際公開日】2021-03-04
【審査請求日】2022-03-03
(31)【優先権主張番号】201910797724.6
(32)【優先日】2019-08-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】522076169
【氏名又は名称】上海先漢生物科技服務中心
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】鄭 建強
【審査官】長部 喜幸
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１８／２３３２７３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】ANALYST，2015年，Vol.140, No.8，p.2704-2712
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ４７／００－４７／６９
Ａ６１Ｋ ９／０８
Ａ６１Ｋ ９／１４
Ａ６１Ｋ ９／２０
Ａ６１Ｋ ９／０６
Ａ６１Ｋ ９／１２
Ａ６１Ｋ ９／１９
Ａ６１Ｋ ３１／００－３３／４４
Ａ６１Ｋ ３９／３９５
Ａ６１Ｐ １／００－４３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｒｅｃｔ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
カルボプラチン複合体の製造方法であって、
前記カルボプラチン複合体は、２つの水素結合を介してカルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸とによって形成される複合体であり、前記２つの水素結合は、カルボプラチン分子のカルボニル酸素と１,１-シクロブタンジカルボン酸分子のカルボキシル水素との間に形成され、前記カルボプラチン複合体は以下の化学式で表され、
【化1】
カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸をモル比１：１.５～３の割合で混合して過飽和水溶液に調製し、且つ、当該混合調製操作を６５℃±１０℃で行い、時間が０.５時間以上であることと、
前記カルボプラチン複合体の結晶を収集して得ることと、を含むカルボプラチン複合体の製造方法。
【請求項2】
薬物製剤の製造方法であって、前記薬物製剤の活性成分は請求項１に記載のカルボプラチン複合体であり、前記製造方法は、請求項１に記載の製造方法に従って前記カルボプラチン複合体の結晶を製造し、粉砕して乾燥させて、カルボプラチン複合体粉末を得ることと、前記カルボプラチン複合体粉末を製剤に製造することと、を含む薬物製剤の製造方法。
【請求項3】
前記カルボプラチン複合体粉末を滅菌水に溶解し、４５℃±５℃で攪拌溶解し、室温で１時間以上静置し、母液を得ること、前記母液を室温で濾過滅菌した後、水注射剤に小分けすること、又は、
前記母液を凍結乾燥粉末注射剤、固体経口製剤、ゲル剤形、スプレー剤形に製造すること、をさらに含む請求項２に記載の製造方法。
【請求項4】
カルボプラチン複合体の品質制御方法であって、Ｘ線粉末回折分析法により試料を検出し、前記試料は２θが約１１.５５±０.２°で回折ピークがないと決定することを含み、前記試料は請求項１に記載の製造方法によって得られたカルボプラチン複合体、或いは請求項２又は請求項３に記載の製造方法によって得られた薬物製剤であるカルボプラチン複合体の品質制御方法。
【請求項5】
ＨＰＬＣ方法により試料を検出し、前記試料におけるカルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸の含有量が９７％～１０３％であり、且つ、カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸のモル比が０.９５～１.０５であると決定すること、をさらに含む請求項４に記載の品質制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、プラチナ系誘導体に関し、特に、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）分子に基づいて水素結合によって得られるカルボプラチン複合体に関し、また、当該カルボプラチン複合体に基づいて得られるプラチナ系薬物製剤に関する。
【背景技術】
【0002】
シス－ジクロロジアミノプラチナの抗腫瘍効果の発見により、プラチナ類抗がん剤の研究と応用を開始し、プラチナ系抗がん剤の研究も近年の腫瘍治療分野で注目されている焦点の１つとなっている。シス－ジクロロジアミノプラチナが活性成分であるシスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）は、ヒト初のプラチナ系抗がん剤であり、細胞非特異性薬物であり、研究により、シスプラチンはＤＮＡと結合して交差結合を引き起こし、ＤＮＡの機能を破壊し、細胞ＤＮＡの複製を抑制できることが示された。臨床応用において、シスプラチンの抗腫瘍スペクトルは比較的に広く、頭頚部扁平上皮癌、卵巣癌、胚胞性癌、精原性細胞腫、肺癌、甲状腺癌、リンパ肉腫及び網状細胞肉腫などに用いられ、ビッグデータ統計には良好な腫瘍治療効果を示したが、その臨床でも深刻な毒性と副作用を示した。一方、化学療法薬としての薬剤耐性の観点から、代替薬を探す必要もある。
【0003】
カルボプラチンは、シスプラチンを分子改質して得られる第２世代のプラチナ系抗がん剤であり、シスプラチン分子における２つの塩素原子が１つの１,１-シクロブタンジカルボン酸で同時に置換されることによって得られる新しいプラチナ系化合物であり、シスプラチンの毒性と副作用を部分的に克服すると同時に抗腫瘍特性を保持している。臨床応用によると、カルボプラチンの生化学的徴候はシスプラチンと類似しているが、腎毒性、耳毒性、神経毒性、特に胃腸反応はシスプラチンより明らかに低いため、十数年にわたって広く重視される広域スペクトル抗腫瘍薬物となっている。カルボプラチンは、シスプラチンと同様に細胞周期非特異性薬物であり、主にＤＮＡのグアニンのＮ７とＯ６原子に作用し、ＤＮＡ鎖間と鎖内の架橋を引き起こし、ＤＮＡ分子複製を破壊し、腫瘍細胞のアポトーシスを招く。
【化1】
【化2】
【0004】
シスプラチンとカルボプラチンのほかに、多くのプラチナ系抗がん剤が研究と臨床段階に入り、毒性反応の問題を除いて、これらの薬物の安定性、特に水溶液における安定性問題は、その臨床応用の致命的な欠点となっている。従って、既存の構造の薬物の改良および修飾がずっと行われている。
【0005】
一方、化学療法薬剤耐性問題も腫瘍治療を影響するボトルネックであり、腫瘍細胞が何度も薬物と接触した後、薬物に対する感受性が低下し、さらには消失し、薬物の治療効果の低下または無効を招く。一旦薬剤耐性が生じると、薬物の化学療法作用は明らかに低下し、薬を使い続けると治療に失敗する。また、腫瘍細胞が１つの抗がん剤に対して薬剤耐性を持つ場合、構造や作用機序の異なる他の抗がん剤に対しても交差耐性を持ち、このような「多薬剤耐性」（ＭＤＲ、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）又は交差耐性（Ｃｒｏｓｓ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）は、腫瘍化学療法失敗の最も重要な原因であり、現在臨床ではまだ良策がない。転化医学（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）の発展に伴い、腫瘍駆動性遺伝子突然変異が異なるシグナルチャネル伝導機序を通じて腫瘍の発生と発展を促進することが明らかになり、腫瘍標的治療に道を開いたが、避けられないのは、標的治療も同様に８～１４ヶ月の治療期間後に薬剤耐性問題が現れ、薬剤耐性問題の解決は腫瘍治療の成功に依然として挑戦である。
【0006】
持続的な新薬の開発と発売はもちろん医薬分野が追求しているが、経典の抗がん、抗ウイルス、抗菌薬のアップグレードも治療効果を向上させ、適応症を拡大する重要な考え方と方向である。
【発明の概要】
【0007】
本発明は、カルボプラチン複合体を提供し、カルボプラチン分子において水素結合によって１,１-シクロブタンジカルボン酸分子を導入し、カルボプラチンの水溶性、安定性、生物学的利用能などの機能を高め、毒性が低下するプラチナ系薬物製剤を得る。
【0008】
本発明はさらに、上記カルボプラチン複合体を活性成分とする薬物製剤を提供し、良好な安定性を有するのみならず、効果も明確である。
【0009】
本発明はさらに、上記カルボプラチン複合体と薬物製剤の製造方法を提供し、処理工程を制御し最適化することにより、非共有結合を介してカルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸とによって形成される安定複合体を実現し、目標生成物として高い純度を有する。
【0010】
本発明はさらに、抗腫瘍薬、抗細菌薬、抗真菌薬または抗ウイルス薬の製造における上記カルボプラチン複合体の応用を提供し、薬物の標的性を高め、毒性副作用を低減する。
【0011】
本発明はさらに、上記カルボプラチン複合体を原料薬とする品質制御方法を提供し、当該カルボプラチン複合体が薬物製剤の製造に用いられる品質制御及び安全性を確保することができる。
【0012】
本発明の第１の態様では、２つの水素結合を介してカルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸とによって形成される複合体であるカルボプラチン複合体を提供し、前記２つの水素結合は、カルボプラチン分子のカルボニル酸素と１,１-シクロブタンジカルボン酸分子のカルボキシル水素との間に形成される。
【0013】
上記カルボプラチン複合体は具体的には、分子間水素結合を介して１分子カルボプラチンと１分子１,１-シクロブタンジカルボン酸とによって形成される複合体であってもよい。本発明で提出するカルボプラチン複合体の構造については、以下のように例示することができる。
【化3】
【0014】
カルボプラチンが１,１-シクロブタンジカルボン酸と結合して形成される主な生成物をこの構造で説明し、分子式は、Ｃ６Ｈ１２Ｎ２Ｏ４Ｐｔ・Ｃ６Ｈ６Ｏ４と書くことができ、分子量は５１５.０９１７である。
【0015】
前述のように、カルボプラチンは、シスプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸との間の置換反応生成物であり、シスプラチン分子における２つの塩素原子が１,１-シクロブタンジカルボン酸によって置換され、カルボプラチン合成中に形成される混合物には、遊離の単分子カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸の他に、いくつかの分子量の大きい成分が存在する。これらの不純物の構成のさらなる探究は、カルボプラチンがさらに１,１-シクロブタンジカルボン酸と水素結合によって自己組立されて形成される特定の生成物に本発明者の関心を向ける。さらなる分析と検出により、当該「不純物」は実際に、水素結合と幾何学的空間を介してカルボプラチンと遊離の１,１-シクロブタンジカルボン酸によって形成される１：１モルの複合体であることが分かった。研究によると、当該複合体は、「化学薬物」として非常に無秩序で不安定で、酸塩基、温度、スペクトル、クロマトグラフィー、電磁場などに非常に敏感で、カルボプラチンと遊離の１,１-シクロブタンジカルボン酸に分解されやすいが、温和（８０℃以下、ＰＨ２～７.５、光を避けるなど）の条件では、当該複合体は非常に安定であると発見した。また、発明者の研究によると、複合体構造は、ＤＮＡ塩基対に類似しており、カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸とを２つの水素結合と幾何学的空間構造を介して組み立てなるもので、多くの特徴もＤＮＡ塩基対に近いものであり、適切な環境において、例えば酵素（ヘリカーゼ）活性条件で水素結合が開かれ、カルボプラチンの活性が放出されることができるとさらに発見した。
【0016】
カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸との結合状況をさらに検討するため、本発明は、核磁気共鳴滴定法（１ＨＮＭＲ）を用いて、重水素化ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を溶媒として（通常、水環境の測定対象物への影響と同等と公認されている）、カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸との混合の場合の水素化学シフトを検討し、その結果、１,１-シクロブタンジカルボン酸の量を固定し、カルボプラチン添加量の増加に伴い、両者の混合物の滴定結果では、カルボキシル水素のみが化学シフト、アミノ水素が化学シフトしないと発見した。このことから、カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸とはカルボキシル水素を介して自己組立されると推定される。
【0017】
プラチナ系薬物の毒性はプラチナの配位結合に由来し、プラチナ原子の活発な配位結合はＤＮＡにおけるＧ-Ｎ７と結合し、より強い付加物を形成することができ、プラチナ系薬物の副作用を低下させることは付加物の形成速度と効率を遅らせることである。カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸が複合体を形成し、即ちＤＮＡの塩基対Ａ-Ｔ／Ｇ-Ｃ構造に類似する複合基質となり、カルボプラチン分子がホストとなり、１,１-シクロブタンジカルボン酸分子が水素結合を提供するゲストとなる場合、ホストの薬物活性はゲスト分子によって効果的に遮断され、ＤＮＡ毒性のないまたは極めて低い複合体を形成するので、正常な非複製細胞には毒性がない。
【0018】
本発明のさらなる態様において、前記カルボプラチン複合体は、カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸の自己組立生成物から得られ、かつ、前記カルボプラチン複合体の質量含有量は９５％以上である。
【0019】
適切な工程制御によって高純度の自己組立生成物を得ることができ、それにより、カルボプラチンの基礎の上で水溶安定性、抗腫瘍スペクトル、毒性と副作用、作用機序などの多くの面でより優れたプラチナ系薬物を提供するために構想と方向を見つけた。カルボプラチンと区別するために、本発明では、このようなカルボプラチン複合体を「カルボプラチン４.０」と略称する。つまり、本発明が提供するカルボプラチン４.０は、カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸との自己組立生成物を主成分とし、自己組立率が９５％以上であり、適切な製造工程を制御することにより、自己組立率が９６％以上、あるいは９８％以上、さらには９９％以上に達することができる。
【0020】
本発明のカルボプラチン複合体構造には、水素結合により結合されるカルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸が含まれ、示差走査熱量（ＤＳＣ）測定の結果、前記カルボプラチン複合体は約１９７.８±２℃で相転移ピークの形成を開始し（即ち、溶融分解を開始し、一般的には鋭い相転移ピークを形成し）、及び／又は、Ｘ線粉末回折分析（ＸＲＰＤ）測定の結果、２θが約１１.５５±０.２°で回折ピークがない。
【0021】
具体的には、上記ＸＲＰＤ測定結果において、２θが約１１.５５±０.２°での回折ピークはカルボプラチンの特徴的なピークである。理解できるものとして、サンプルや検出条件等の影響により、上記検出結果に一定の偏差が生じる可能性があり、通常、約１１.５５°付近（例えば１１.５５±０.２°）に現れる回折ピークは、いずれもカルボプラチンの特徴的なピークとして表されることができる。本発明の研究によると、カルボプラチン複合体のＸＲＰＤ測定結果において、一般的に主に７.５５°、１０.５１°、１４.６３°、１５.１０°、１５.６６°、１６.７８°、１８.５５°、２０.８３°、２２.８６°、２３.６７°、２４.０２°などに回折ピークがあり、これらの回折ピークは、上記カルボプラチン複合体の特徴的なピークとすることができ、その偏差範囲はいずれも±０.２°であってもよい（例えば、上記２θが７.５５°での回折ピークは７.５５±０.２°での回折ピークを指してもよい）。
【0022】
本発明はさらに、活性成分が前記カルボプラチン複合体である薬物製剤を提供する。
【0023】
薬学分野の区分によって、本発明が提供する薬物製剤は主に抗腫瘍製剤、抗細菌製剤、抗真菌製剤または抗ウイルス製剤である。
【0024】
具体的には、前記薬物製剤は、水注射剤又は凍結乾燥粉末注射剤、固体経口製剤、ゲル剤形、スプレー剤形を含む。
【0025】
本発明が提供する薬物製剤において、カルボプラチン複合体（即ち、カルボプラチン４.０）が活性成分であり、その中の１,１-シクロブタンジカルボン酸は実質的に薬物補助材料の役割を担う。本発明の研究によると、１,１-シクロブタンジカルボン酸のカルボプラチン４.０の薬用補助材料としての使用はその分子の特殊性によって決定されると考えられる。まず、１,１-シクロブタンジカルボン酸自体はカルボプラチン生産の重要な原料であり、次に、１,１-シクロブタンジカルボン酸は水素結合を介してカルボプラチンと最適な安定な複合基質を形成することができ、さらに、１,１-シクロブタンジカルボン酸の補助材料としての役割により、カルボプラチンの水溶性、安定性、生物学的利用能、ヘリカーゼ標的などの機能を変化させ、向上させ、一方、カルボプラチンとＤＮＡが結合した後も１,１-シクロブタンジカルボン酸を生成し、１,１-シクロブタンジカルボン酸の構造が明確で、品質が制御可能で、化学的に安定であることを証明するので、微量の１,１-シクロブタンジカルボン酸は生体に対しても安全である。
【0026】
上記カルボプラチン複合体の特性と効果の研究に基づいて、本発明はさらに、抗腫瘍薬物、抗細菌薬物、抗真菌薬物又は抗ウイルス薬物などの薬物の製造における当該カルボプラチン複合体の応用を提供する。
【0027】
上記カルボプラチン複合体の構造と特徴を詳細に検討した上で、出願人は、本発明に記載の特徴を有するカルボプラチン複合体がより正確には、カルボプラチンの新規剤形であると考え、リポソームに埋め込まれた薬物剤形に類似していると理解され得る。カルボプラチンの抗腫瘍効果は疑いの余地なく、水素結合を介してカルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸を結合してなるホスト／ゲスト構造の複合体は新規な薬物剤形として製造され、ヘリカーゼ活性を有する条件で開環し、単分子カルボプラチンと単分子１,１-シクロブタンジカルボン酸を放出することができ、即ち、当該複合体の水素結合はヘリカーゼの標的であり、当該複合体（カルボプラチン４.０）はヘリカーゼの複合基質と考えられ、このような作用機序も実験結果から検証できる。
【0028】
従って、上記機序の研究によれば、本発明が提供する薬物は、活性成分の分子中の水素結合がヘリカーゼ作用標的となる標的薬物系であると考えられる。前記標的薬物は、抗腫瘍薬物、抗ウイルス薬物、抗細菌薬物及び抗真菌薬物などを含んでもよい。
【0029】
本発明はさらに、上記カルボプラチン複合体を製造する方法を提供し、特に、操作条件を最適化し、意識的に制御することにより、カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸の自己組立を実現し、できるだけ高純度または高含有量の上記特徴を満たす目標生成物を製造する。
【0030】
前記製造方法に含まれる操作プロセス（自己組立条件）は、
カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸をモル比１：１.５～３の割合で混合して過飽和水溶液に調製し、かつ、当該混合調製操作を６５℃±１０℃で行い、時間が０.５時間以上であることと、
前記カルボプラチン複合体の結晶（即ち自己組立生成物）を収集して得ることとを含む。
カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸をモル比１：１.５～３の割合で混合して過飽和水溶液に調製し、かつ、当該混合調製操作を６５℃±１０℃で行い、時間が０.５時間以上であることと、
前記カルボプラチン複合体の結晶（即ち自己組立生成物）を収集して得ることとを含む。
【0031】
上記過飽和水溶液とは、カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸によって形成される複合体の過飽和水溶液であり、通常、一定濃度のカルボプラチン水溶液を調製した後、当該カルボプラチン水溶液に１,１-シクロブタンジカルボン酸を加えることができ、ここで、上記自己組立条件で、できるだけ各原料の濃度を高くしながら、結晶析出がない状態を維持すれば、調製したものは過飽和水溶液と考えられる。
【0032】
出願人の研究によると、カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸との水溶液混合物も自然に不安定な複合体を生成することができ、異なる条件下でも異なる含有量の複合体を生成することができ、カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸との粉末物理混合物さえも少量の複合体の分子情報を生成することができると発見した。このような状況に基づいて、本発明が提出する製造方法は、カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸によって形成された溶液系条件を最適化することにより、１,１-シクロブタンジカルボン酸が著しく過剰となるように調製するとともに、混合後の溶液系における２つの反応原料の濃度ができるだけ高く、生成される複合体が過飽和状態となるように確保し、適当な温度で一定時間（一般的には１時間を超えるだけでよく、例えば、３時間又は４時間を維持してもよい）を維持し、非共有結合を介してカルボプラチン分子と１,１-シクロブタンジカルボン酸分子とによって形成された秩序安定複合体の形成を促進するのに有利であり、即ち、高収率のカルボプラチン複合体を得るとともに、遊離の単分子カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸を不純物と見なし、極めて低い微量に低減する。自己組立後の生成物は結晶状態であり、反応系を室温以下に冷却して結晶を析出させ、分離処理により得られることができ、純度の高い生成物は無色に近い結晶として表現される。分離後、１回以上の再結晶を実施し、生成物の純度を向上させることができる。高純度の原料を用いることも、生成物の純度と収率を向上させる有効な手段であることが理解できる。
【0033】
上記組立工程は、カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸が水溶液での混合割合（モル割合）を最適化し、温度、組立時間などの要因を最適化することにより、２つの成分を水溶液で安定な複合体に組立し、結晶分離精製を経て、自己組立率が高いカルボプラチン複合体を得る。本発明の一実施形態において、必要に応じて、調製した過飽和溶液を濾過し、濾液を集めて室温（通常、２０±５℃）に置き、遮光処理を行い、一般的に７日以上の時間をかけて、複合体結晶の析出を促進し、カルボプラチン複合体の純度と収率をさらに向上させることができる。
【0034】
本発明において言及されるカルボプラチン複合体収率、自己組立生成物系における含有量、及び自己組立率は、特に説明されていない限り、いずれも同じ意味で理解される。
【0035】
上記カルボプラチン複合体を得る上で、前記当該カルボプラチン複合体を活性組成とする薬物製剤をさらに製造する方法は、
前記方法に従って前記カルボプラチン複合体の結晶を製造し、粉砕し乾燥してカルボプラチン複合体粉末を得ることと、
前記カルボプラチン複合体粉末を製剤に製造することとを含む。
前記方法に従って前記カルボプラチン複合体の結晶を製造し、粉砕し乾燥してカルボプラチン複合体粉末を得ることと、
前記カルボプラチン複合体粉末を製剤に製造することとを含む。
【0036】
具体的には、まずカルボプラチン複合体粉末を母液に製造し、さらに水注射剤、又は凍結乾燥粉末注射剤などに製造することができ、
前記カルボプラチン複合体粉末を滅菌水に溶解し、４５℃±５℃で攪拌溶解し、室温で１時間以上静置し、母液を得、
前記母液を室温で濾過滅菌後、水注射剤に小分けし、又は、
前記母液を凍結乾燥粉末注射剤、固体経口製剤、ゲル剤形、スプレー剤形などに製造する。
前記カルボプラチン複合体粉末を滅菌水に溶解し、４５℃±５℃で攪拌溶解し、室温で１時間以上静置し、母液を得、
前記母液を室温で濾過滅菌後、水注射剤に小分けし、又は、
前記母液を凍結乾燥粉末注射剤、固体経口製剤、ゲル剤形、スプレー剤形などに製造する。
【0037】
本発明は、１,１-シクロブタンジカルボン酸をカルボプラチン新規製剤の補助材料として用いり、リポソーム埋め込み技術に類似し、カルボプラチン複合体粉末製剤を非常に安定な水注射剤に変更する。水注射剤の製造の一具体例は、５００グラムのカルボプラチン複合体粉末を滅菌水に溶解し、５００リットルまで定量し、４５℃±５℃で攪拌し均一に溶解させ、室温で１時間以上放置し、製剤母液に調製し、含有量を検出し、調製した母液は検出によって含有量が基準に達すれば、室温で濾過滅菌し、５ミリグラム／５ミリリットルの水注射剤に小分けし、低温（４℃～１０℃）で光を避けて貯蔵することができることであってもよい。
【0038】
本発明の態様では、所望のカルボプラチン複合体（カルボプラチン４.０と呼ぶことができる）が製造される限り、製薬分野における通常の手段に従って対応する薬物剤形を調製することができる。注射製剤の他に、経口製剤、又はゲル剤、スプレー剤などの局所投与製剤であってもよい。
【0039】
本発明のさらなる態様では、上記カルボプラチン複合体に対する品質制御方法を提供する。
【0040】
発明者の研究によると、多くの合成生成物の含有量検出は、クロマトグラフィー-質量スペクトル分析併用（ＬＣ-ＭＳ）分析が好ましいが、当該カルボプラチン複合体における２つの分子は水素結合のみによって結合しているため、クロマトグラフィー分離は水素結合を破壊し、カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸の放出によって検出結果を誤らせる可能性がある。一方、サンプルを流動注入した後に直接質量スペクトル分析により、マイナスイオンモードでカルボプラチン４.０の正確な分子量を得ることができるが、カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸との物理混合物（以下、２成分の物理混合物と略称する）はこのモードで同じイオンを生じ、たとえ正確に分子量を測定することができても、カルボプラチン４.０の含有量測定根拠とすることができない。
【0041】
キャピラリー電気泳動分析により、水相ゾーンキャピラリー電気泳動（ＣＺＥ）、非水相キャピラリーゾーン電気泳動（ＮＡＣＥ）、ミセルキャピラリー電気泳動（ＭＥＫＣ）の３つのモードで、カルボプラチン４.０、カルボプラチン、１,１-シクロブタンジカルボン酸などのサンプルを鑑別し、上記様々な最適化された分離条件で、上記サンプルはいずれも分離現象が現れず、且つ、カルボプラチン４.０とカルボプラチンのピーク出現時間が一致し、１ＨＮＭＲ、ＬＣ-ＭＳなどの分析結果と組み合わせて、カルボプラチン４.０は分子内に共有結合に比べて弱い水素結合が存在するため、電界エネルギー環境の作用でカルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸に解離することをさらに示す。
【0042】
なお、カルボプラチン４.０（又は水溶後に凍結乾燥して形成される凍結乾燥粉末）は、上記２成分の物理混合物の赤外スペクトルと明らかな差はなく、赤外スペクトル分析もカルボプラチン４.０の定量的および定性的分析には適さない。
【0043】
一方、Ｘ線粉末回折分析法（ＸＲＰＤ）を用いて測定するとき、水素結合が存在する上記カルボプラチン複合体とカルボプラチンのＸＲＰＤ測定図では、回折ピークの特徴は明らかに異なり、即ち、カルボプラチンの特徴的なピークは１１.５５±０.２°の回折角付近に現れるが、カルボプラチン４.０はここに回折ピークがほとんどなく、その主要な特徴的なピークは、２θが７.５５°、１０.５１°、１４.６３°、１５.１０°、１５.６６°、１６.７８°、１８.５５°、２０.８３°、２２.８６°、２３.６７°、２４.０２°などであるところにある（その偏差範囲はいずれも±０.２°である）。もちろん、さらにクロマトグラフィーと質量スペクトル分析を用いてカルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸との吸収ピークを検出することも、製品の品質制御に必要なステップである。
【0044】
本発明の研究結果によれば、従来のいくつかの分析方法を用いてカルボプラチン４.０の直接含有量測定方法を確立することはできないが、カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸の含有量を測定することによってカルボプラチン４.０の間接含有量測定を実現することができるので、カルボプラチン４.０に対して以下の品質制御方法を確立することができる。（１）ＸＲＰＤ方法を用いて、カルボプラチン４.０とカルボプラチン、１,１-シクロブタンジカルボン酸との特徴回折ピークの違いに対して、カルボプラチン４.０における遊離カルボプラチンの限定量検査制御を実現する。（２）カルボプラチン４.０は、水素結合を介して１分子カルボプラチンと１分子１,１-シクロブタンジカルボン酸によって形成され、且つ極性溶媒条件で解離してカルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸を生成しやすいので、高効率液体クロマトグラフィー分析（ＨＰＬＣ）法を追加して、カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸のモル比及び両者の含有量を測定し、カルボプラチン４.０に対する品質制御標準に組み入れることができる。
【0045】
これにより、本発明は、前記カルボプラチン複合体の品質制御方法を提供し、Ｘ線粉末回折分析法により試料を検出し、前記試料は２θが約１１.５５±０.２°で回折ピークがないと決定することを含み、ここで、前記試料は、上記カルボプラチン複合体、又は当該カルボプラチン複合体を活性組成とする上記薬物製剤を含むことができる。
【0046】
理解できるものとして、本発明の品質制御方法は、カルボプラチン複合体（カルボプラチン４.０）に対するものであり、当該方法は、カルボプラチン４.０原料薬の純度の品質制御としても用いることができ、一般的には原料薬における遊離カルボプラチンの含有量が２％を超えず、より正確な場合には１％を超えないことが要求される。
【0047】
カルボプラチン４.０のＸＲＰＤ測定結果によれば、カルボプラチン４.０は２θが約１１.５５±０.２°で特徴的なピークがないが、２θが約７.５５°、１０.５１°、１４.６３°、１５.１０°、１５.６６°、１６.７８°、１８.５５°、２０.８３°、２２.８６°、２３.６７°、２４.０２°などで回折ピーク（その偏差範囲はいずれも±０.２°である）があり、ここで、２θが約１５.１０±０.２°での回折ピークは、カルボプラチン４.０の半定量的特徴的なピークとすることができ、これに基づいて、２θが約１５.１０±０.２°での特徴的なピークとカルボプラチンの特徴的なピーク（２θが約１１.５５±０.２°での回折ピーク）との相対積分面積を定量標準として、遊離カルボプラチンの限定量検出を実現することができる。
【0048】
具体的には、カルボプラチン４.０試料のＸＲＰＤ測定結果において、２θが約１１.５５±０.２°での回折ピークを検出する場合、２θが約１１.５５±０.２°での回折ピークの積分面積をＡ１とし、２θが約１５.１０±０.２°での回折ピークの積分面積をＡ２とし、カルボプラチン４.０における遊離カルボプラチンの含有量をＡ１／Ａ２の値で判断することができる。例えば、本発明の一実施形態では、カルボプラチン４.０原料薬（カルボプラチン４.０試料）における遊離カルボプラチン含有量の有効な制御を実現するために、カルボプラチン４.０試料に対するＸＲＰＤ測定結果に従って、Ａ１／Ａ２の値は、遊離カルボプラチンの含有量がＸ％を超えないことを保証するために、カルボプラチン４.０とカルボプラチン４.０の質量のＸ％を占めるカルボプラチンから調製された混合サンプル（又は混合対照サンプルと称する）に対応する積分面積比より大きくないべきである。具体的に実施する場合、Ｘ％は例えば１％、０.５％、０.１％などであってもよく、上記混合サンプルを調製するためのカルボプラチン４.０は２θが約１１.５５±０.２°で回折ピークがほとんど検出されず、一般的には純粋なカルボプラチン４.０と考えられる。
【0049】
本発明の一具体的な実施例では、カルボプラチン４.０とカルボプラチンの混合サンプルを調製し、ここで、カルボプラチンがカルボプラチン４.０の質量の１％（即ち、上記Ｘ％＝１％）を占め、当該混合対照サンプル及びカルボプラチン４.０原料薬に対してＸＲＰＤ測定を行い、上記混合対照サンプルから測定されたＡ１／Ａ２の値は約０.６７であるので、原料薬における遊離カルボプラチンの含有量が１％を超えないことを保証するために、カルボプラチン４.０原料薬から測定されたＡ１／Ａ２の値は０.６７以下であるべきである。別の実施例では、上記Ｘ％は具体的には０.５％であってもよく、混合対照サンプルから測定されたＡ１／Ａ２の値は約０.５５であるので、原料薬における遊離カルボプラチンの含有量が０.５％を超えないことを保証するために、カルボプラチン４.０原料薬から測定されたＡ１／Ａ２の値は０.５５以下であるべきである。さらなる実施例では、上記Ｘ％は具体的には０.１％であってもよく、混合対照サンプルから測定されたＡ１／Ａ２の値は約０.５であるので、原料薬における遊離カルボプラチンの含有量が０.１％を超えないことを保証するために、カルボプラチン４.０原料薬から測定されたＡ１／Ａ２の値は０.５以下であるべきである。
【0050】
あるいは、別の実施形態では、別の限定量検査方法を提供することができる。カルボプラチン４.０原料薬の２θが１１.５５±０.２°での回折ピークの強度（又は積分面積）は、カルボプラチン４.０とカルボプラチン４.０の質量のＸ％を占めるカルボプラチンから調製された混合サンプルの当該ところの回折ピークの強度（又は積分面積）より大きいべきである。ここで、Ｘ％は上記の通り、例えば１％、０.５％、０.１％などであってもよい。
【0051】
本発明が提供する品質制御方法はさらに、ＨＰＬＣ方法を用いてカルボプラチン４.０試料を検出し、前記試料におけるカルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸の含有量が９７％～１０３％で、且つ、両者のモル比が０.９５～１.０５であると決定することを含む。即ち、本発明の品質制御方法によれば、ＸＲＰＤにおける回折ピーク特徴を決定することに加えて、ＨＰＬＣ方法により水素結合破断後に放出されるカルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸を検出する必要があり、結果はその結合状態において理論的にそれぞれの存在量の９７％～１０３％で、且つ、両者は基本的に１:１のモル比で存在すべきであり、制御標準は±０.０５の範囲（即ち、両者のモル比は約０.９５～１.０５）に把握すべきである。
【0052】
発明者の研究によると、ＨＰＬＣ方法を用いて分析し、カルボプラチン濃度は０.０２５～０.９９９ｍｇ／ｍＬ範囲内でクロマトグラフィーピーク面積積分値と良好な線形関係を呈し、線形回帰方程式はＹ＝４０１６９＋８.６２Ｅ６Ｘであり、相関係数ｒ＝０.９９９であり、１,１-シクロブタンジカルボン酸の濃度は０.１０１～３.９９ｍｍｏｌ／Ｌ範囲内でクロマトグラフィーピーク面積積分値と良好な線形関係を呈し、線形回帰方程式はＹ＝７４０７＋９６２２０２Ｘであり、相関係数ｒ＝０.９９９である。これに基づいて、本発明の一実施形態では、カルボプラチン４.０試料、カルボプラチン及び１,１-シクロブタンジカルボン酸の混合対照サンプルをＨＰＬＣ検出し、測定結果に基づいて、外部標準法によりピーク面積でカルボプラチン４.０試料におけるカルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸の含有量及びモル濃度比（モル比）を決定することができる。
【0053】
本発明の一実施例では、含有量／モル比を測定する場合、カルボプラチン４.０試料用検出用移動相を、カルボプラチン４.０の濃度（理論存在量計）が約１.０ｍｇ／ｍＬの試料検出液に調製し、カルボプラチン対照サンプルと１,１-シクロブタンジカルボン酸対照サンプルを用いて両者の濃度がそれぞれ約０.７ｍｇ／ｍＬと０.３ｍｇ／ｍＬの混合対照サンプル測定液を調製し、ＨＰＬＣ検出を行う。
【0054】
本発明は、特定の水素結合によって形成されるカルボプラチン複合体（カルボプラチン４.０）を提供するだけでなく、当該カルボプラチン複合体で製造される薬物製剤を提供し、特に、ヘリカーゼ作用標的となる標的薬物を提供し、カルボプラチン薬のアップグレード版となることが期待される。本発明はまた、製造されるカルボプラチン４.０を原料薬する場合について、実行可能な品質制御方法を提出し、カルボプラチンを対照とし、当該カルボプラチン４.０の活性と薬物動態学に対して研究を行う。
【0055】
本発明の研究によると、カルボプラチン４.０が解離された後にカルボプラチンが放出されるので、臨床適応症はカルボプラチン原薬のすべての適応症を含むことが完全に合理的に予想されることができ、現在、臨床ではカルボプラチンは主に小細胞肺癌、卵巣癌、精巣癌、生殖細胞腫瘍、甲状腺癌、鼻咽頭癌の治療に用いられており、子宮頸癌、非小細胞肺癌、食道癌、精原細胞腫、膀胱癌、中皮腫、小児脳腫瘍及びその他の頭頚部癌などの悪性腫瘍にも応用できる。腎機能損傷、頑固性嘔吐、聴力低下或いは神経毒性のためシスプラチンに耐えられない患者は、カルボプラチン４.０をアップグレード薬として選択することが好ましい。適応症は更に脳腫瘍や脳転移腫瘍、骨腫瘍や骨転移腫瘍、前立腺癌、膵臓癌、胆管癌などに拡大することが期待され、即ち更に広い範囲の適応症を有している。同時に、カルボプラチン４.０は他のプラチナ系薬剤耐性患者の治療及び標的薬物治療にも適している。臨床では他の化学療法薬と交差耐性がなく、単独で使用することができ、他の化学薬物と組み合わせて使用することもでき、そして手術、放射線治療と協力して治療効果を高めることができる。
【0056】
一具体的な実施過程において、カルボプラチン４.０を用いて８種類のオキサリプラチン（Ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）耐性或いはイリノテカン（Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）耐性の結腸癌薬剤耐性細胞及びその初代細胞に対する化学療法感受性研究を行い、その結果、カルボプラチン４.０は、オキサリプラチンとイリノテカンと交差耐性反応がなく、カルボプラチン４.０を臨床薬剤耐性結腸癌患者のもう１つの化学療法選択として考えることができる。
【0057】
一方、カルボプラチンのプラチナ原子は別の１分子１,１-シクロブタンジカルボン酸によって封鎖されているため、プラチナ原子とＤＮＡの結合を阻害し、カルボプラチン４.０のＤＮＡ毒性活性を大きく低下させる。
【0058】
発明者の研究によると、カルボプラチン４.０、カルボプラチンをそれぞれ直鎖状ＤＮＡと結合する試験を行い、その結果、一定時間内にカルボプラチンはすぐにＤＮＡと架橋付加物を形成し、直鎖状ＤＮＡが変形、収縮、凝集するが、カルボプラチン４.０は直鎖状ＤＮＡと架橋反応を起こさず、直鎖状ＤＮＡの形状はほとんど変化しないと発見した。また、カルボプラチン４.０、カルボプラチンをそれぞれスーパーコイルプラスミドＤＮＡと混合し、一定時間後の電気泳動観察により、カルボプラチンはスーパーコイルプラスミドＤＮＡと架橋して付加物を形成するが、カルボプラチン４.０はスーパーコイルプラスミドＤＮＡと架橋せず、且つ、いかなるプラチナ系薬物を添加しない空白対照組のスーパーコイルプラスミドＤＮＡ運動速度と一致する。上記研究結果から、カルボプラチン４.０構造において、カルボプラチンのプラチナ原子が別の１分子の１,１-シクロブタンジカルボン酸によって封鎖され、この封鎖がプラチナ原子とＤＮＡとの結合を阻害し、カルボプラチン４.０のＤＮＡ毒性活性を大きく低下させることを示す。
【0059】
薬物動態学研究の結果、カルボプラチンに比べて、カルボプラチン４.０の薬物排出半減期（ｈａｌｆ ｌｉｆｅ、ｔ１／２）は明らかに速い。カルボプラチン４.０は、カルボプラチンよりも優れた溶解性と非極性を示すため、機体器官での排出半減期時間が短く、排出率がより高くし、毒性と副作用も著しく低下し、特に腎臓毒性の発生率はもっと明らかに低下した。カルボプラチンに比べて、カルボプラチン４.０はカルボプラチンの絶対的生物学的利用能とほぼ一致するが、血漿タンパク質との結合が低く、膜貫通輸送が速く、非複製細胞に対して破壊がないなどの利点を持っているため、より高い生物学的利用能を示している。なお、見かけ分布容積（ａｐｐａｒｅｎｔ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ、Ｖｄ）において、カルボプラチンに比べて、カルボプラチン４.０の分布、特に脳組織、骨髄、前立腺などの障壁のある組織器官においてはもっと広く、カルボプラチン４.０の臨床適応症がより広いことを示している。
【0060】
また、本発明の研究によると、カルボプラチン４.０が抗腫瘍においてカルボプラチンよりも優れた性能を有しているので、カルボプラチンのアップグレード版抗腫瘍薬として有望であることに加えて、抗ウイルス、抗真菌及び細菌抑制においても優れた性能を有しているので、より広い適応症を示し、例えば、手足口ウイルス（ＥＶ７１ウイルス）、インフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ２）、ＨＳＶ-１ウイルス、ＥＢウイルス、ＨＰＶウイルス、バクテリオファージ、インジケーターバクテリア、カンジダアルビカンスなどのいずれもに対して明らかな抑制効果を有する。
【0061】
また、発明者は、抗ウイルスにおけるカルボプラチン４.０とカルボプラチンの応用を細胞毒性実験のデータにより評価した結果、カルボプラチンの細胞毒性がその抗ウイルスへの応用を阻害し、カルボプラチン４.０は細胞毒性実験による薬物の有効性、毒性、薬剤耐性、薬物の細胞アポトーシス、増殖などの作用に対する影響評価を通過したことを示す。
【0062】
本発明のさらなる態様では、上記カルボプラチン複合体を活性成分とする薬物、又は上記薬物製剤を患者に投与することを含む悪性腫瘍疾患の治療方法をさらに提供する。
【0063】
本発明のさらなる態様では、上記カルボプラチン複合体を活性成分とする薬物、又は上記薬物製剤を患者に投与することを含む細菌又は真菌感染の治療方法をさらに提供する。
【0064】
本発明のさらなる態様では、上記カルボプラチン複合体を活性成分とする薬物、又は上記薬物製剤を患者に投与することを含むウイルス感染の治療方法をさらに提供する。
【発明の効果】
【0065】
本発明が提供する２つの水素結合を介してカルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸とによって形成されるカルボプラチン複合体によれば、分子間水素結合によりカルボプラチンの水溶性、安定性、生物学的利用能などの機能を改善し、カルボプラチンに対して毒性と副作用を大幅に低減し、極めて低い薬剤耐性／交差耐性を有し、抗腫瘍、抗ウイルス、抗真菌、抗細菌においてより広範な適応症がある。
【図面の簡単な説明】
【0066】
【図1】カルボプラチン濃度（Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）の増加に伴うカルボキシル水素の化学シフト（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｈｉｆｔ ｏｆ ＯＨ）の変化図である。
【図2】カルボキシル水素の化学シフト値逆数（１／Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｈｉｆｔ）とカルボプラチンモル濃度の逆数（１／Ｃ ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）の非線形フィッティング図である。
【図3】１,１-シクロブタンジカルボン酸、カルボプラチン、混合粉末ｃ、凍結乾燥粉末ｂ、カルボプラチン４.０原料薬、凍結乾燥粉末ａのＤＳＣ測定図である。
【図4】４ロットのカルボプラチン４.０原料薬のＤＳＣ測定図である。
【図5】カルボプラチン４.０原料薬のＸＲＰＤ図であり、ここで、Ａは反射法で測定するＸＲＰＤ図であり、Ｂは透過法で測定するＸＲＰＤ図である。
【図6】混合粉末ｃ、凍結乾燥粉末ｂ、カルボプラチン４.０原料薬、凍結乾燥粉末ａのＸＲＰＤ図である。
【図7】図７～図１０は、カルボプラチン４.０についてＬＣ-ＭＳ分析を行うスペクトル図であり、ここで、図７と図８はそれぞれ陽イオンモードにおけるカルボプラチンの全イオンフロークロマトグラフィー図と質量スペクトル図（保持時間ＲＴ＝０.８３ｍｉｎ）であり、図９と図１０はそれぞれ負イオンモードにおける１,１-シクロブタンジカルボン酸の全イオンフロークロマトグラフィー図と質量スペクトル図（保持時間ＲＴ＝１.７ｍｉｎ）である。
【図8】図７～図１０は、カルボプラチン４.０についてＬＣ-ＭＳ分析を行うスペクトル図であり、ここで、図７と図８はそれぞれ陽イオンモードにおけるカルボプラチンの全イオンフロークロマトグラフィー図と質量スペクトル図（保持時間ＲＴ＝０.８３ｍｉｎ）であり、図９と図１０はそれぞれ負イオンモードにおける１,１-シクロブタンジカルボン酸の全イオンフロークロマトグラフィー図と質量スペクトル図（保持時間ＲＴ＝１.７ｍｉｎ）である。
【図9】図７～図１０は、カルボプラチン４.０についてＬＣ-ＭＳ分析を行うスペクトル図であり、ここで、図７と図８はそれぞれ陽イオンモードにおけるカルボプラチンの全イオンフロークロマトグラフィー図と質量スペクトル図（保持時間ＲＴ＝０.８３ｍｉｎ）であり、図９と図１０はそれぞれ負イオンモードにおける１,１-シクロブタンジカルボン酸の全イオンフロークロマトグラフィー図と質量スペクトル図（保持時間ＲＴ＝１.７ｍｉｎ）である。
【図10】図７～図１０は、カルボプラチン４.０についてＬＣ-ＭＳ分析を行うスペクトル図であり、ここで、図７と図８はそれぞれ陽イオンモードにおけるカルボプラチンの全イオンフロークロマトグラフィー図と質量スペクトル図（保持時間ＲＴ＝０.８３ｍｉｎ）であり、図９と図１０はそれぞれ負イオンモードにおける１,１-シクロブタンジカルボン酸の全イオンフロークロマトグラフィー図と質量スペクトル図（保持時間ＲＴ＝１.７ｍｉｎ）である。
【図11】図１１～図１２は、カルボプラチン４.０について流動注入-質量スペクトル分析を行うスペクトル図であり、ここで、図１１は負イオンモードにおけるカルボプラチン４.０サンプルの質量スペクトル図であり、図１２は陽イオンモードにおけるカルボプラチン４.０サンプルの質量スペクトル図である。
【図12】図１１～図１２は、カルボプラチン４.０について流動注入-質量スペクトル分析を行うスペクトル図であり、ここで、図１１は負イオンモードにおけるカルボプラチン４.０サンプルの質量スペクトル図であり、図１２は陽イオンモードにおけるカルボプラチン４.０サンプルの質量スペクトル図である。
【図13】ヘリカーゼが関与するカルボプラチン４.０とカルボプラチンとのＤＮＡ結合実験の電気泳動図である。
【図14】異なる昇温速度条件でのカルボプラチン４.０原料薬のＤＳＣ測定図である。
【発明を実施するための形態】
【0067】
以下、本発明の内容を実施例に関連してより具体的に説明する。理解すべきものとして、本発明の実施は、以下の実施例に限定されるものではなく、本発明に対する任意の形態の変通及び／又は変更が本発明の保護範囲に含まれる。
【0068】
特に説明がない限り、以下の実施例に係るプロセス（温度制御、昇温、計量、収集、試験用検出液調製、検出過程など）は、いずれも本分野の従来の処理形態を用いることができ、例えば従来の機器、方法などを用いて対応する処理を行う。
【0069】
以下の実施例に係る機器及び関連試験条件は以下の通りである。
１）核磁気共鳴滴定法（１ＨＮＭＲ）
日本電子ＥＣＡ-４００型超伝導フーリエ変換核磁気共鳴装置は、選択パルスＬａｍｉｎａｌ波形発生器と５ｍｍ ｚ-軸勾配パルス多核プローブを備えている。１Ｈ動作周波数はそれぞれ４００ＭＨｚであり、ＤＭＳＯ-ｄ６を溶媒とし、ＴＭＳを内部標準とし、実験温度は室温であり、Ф５ｍｍの多核プローブを使用する。１ＨＮＭＲのスペクトル幅は９.１８ｋＨｚ、データポイントは３２７６８、９０°パルス幅は１１μｓ、緩和遅延は１.２ｓである。
２）示差走査熱量測定分析（ＤＳＣ）
分析機器は米国ＴＡ Ｑ２０００、Ａｌ盤は参照盤、サンプル盤はアルミニウム盤、昇温速度は１０℃／ｍｉｎ、昇温区間は４０℃～２４０℃である。
３）Ｘ線粉末回折分析（ＸＲＰＤ）
Ｘ線粉末回折装置（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄ８-ａｄｖａｎｃｅ、反射透過回転試料台付き）、
透過：ＣｕＫα放射、集束モノクロメータ、ｇｏｂｅｌ-ｍｉｒｒｏｒ集束光路、管圧４０ｋＶ、管流４０ｍＡ、
スキャン形態：θ／２θスキャン、ＤＳ発散スリット１.２ｍｍ、ソーラースリット２.５ｍｍ、
２θスキャン範囲：６-５０°、スキャン速度：０.４ｓ／ステップ、ステップサイズ：０.０１５°／ステップ。
４）液体クロマトグラフィー-質量スペクトル分析併用法（ＬＣ-ＭＳ）
機器：島津ＬＣＭＳ-８０４０
キャピラリー電圧：３ＫＶ(又は-２.６ＫＶ)
抽出コーンホール電圧：４Ｖ(又は-４Ｖ)、
サンプルコーンホール電圧：１５Ｖ(又は-２０Ｖ)、
ソース温度：３００℃、
スキャン範囲：８０-１０００ａｍｕ、
クロマトグラフィーカラム：ＸＤＢ-Ｃ１８、４.６Ｘ５０ｍｍ、１.８uｍ、
移動相Ａ：０.１％ギ酸水溶液、
移動相Ｂ：メタノール、
勾配：０ｍｉｎ、９９％Ａと１％Ｂ、１ｍｉｎ、９９％Ａと１％Ｂ、３.５ｍｉｎ、４０％Ａと６０％Ｂ、５.５ｍｉｎ、４０％Ａと６０％Ｂ、
流速：０.５ｍＬ／ｍｉｎ
注入体積：２uＬ。
１）核磁気共鳴滴定法（１ＨＮＭＲ）
日本電子ＥＣＡ-４００型超伝導フーリエ変換核磁気共鳴装置は、選択パルスＬａｍｉｎａｌ波形発生器と５ｍｍ ｚ-軸勾配パルス多核プローブを備えている。１Ｈ動作周波数はそれぞれ４００ＭＨｚであり、ＤＭＳＯ-ｄ６を溶媒とし、ＴＭＳを内部標準とし、実験温度は室温であり、Ф５ｍｍの多核プローブを使用する。１ＨＮＭＲのスペクトル幅は９.１８ｋＨｚ、データポイントは３２７６８、９０°パルス幅は１１μｓ、緩和遅延は１.２ｓである。
２）示差走査熱量測定分析（ＤＳＣ）
分析機器は米国ＴＡ Ｑ２０００、Ａｌ盤は参照盤、サンプル盤はアルミニウム盤、昇温速度は１０℃／ｍｉｎ、昇温区間は４０℃～２４０℃である。
３）Ｘ線粉末回折分析（ＸＲＰＤ）
Ｘ線粉末回折装置（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄ８-ａｄｖａｎｃｅ、反射透過回転試料台付き）、
透過：ＣｕＫα放射、集束モノクロメータ、ｇｏｂｅｌ-ｍｉｒｒｏｒ集束光路、管圧４０ｋＶ、管流４０ｍＡ、
スキャン形態：θ／２θスキャン、ＤＳ発散スリット１.２ｍｍ、ソーラースリット２.５ｍｍ、
２θスキャン範囲：６-５０°、スキャン速度：０.４ｓ／ステップ、ステップサイズ：０.０１５°／ステップ。
４）液体クロマトグラフィー-質量スペクトル分析併用法（ＬＣ-ＭＳ）
機器：島津ＬＣＭＳ-８０４０
キャピラリー電圧：３ＫＶ(又は-２.６ＫＶ)
抽出コーンホール電圧：４Ｖ(又は-４Ｖ)、
サンプルコーンホール電圧：１５Ｖ(又は-２０Ｖ)、
ソース温度：３００℃、
スキャン範囲：８０-１０００ａｍｕ、
クロマトグラフィーカラム：ＸＤＢ-Ｃ１８、４.６Ｘ５０ｍｍ、１.８uｍ、
移動相Ａ：０.１％ギ酸水溶液、
移動相Ｂ：メタノール、
勾配：０ｍｉｎ、９９％Ａと１％Ｂ、１ｍｉｎ、９９％Ａと１％Ｂ、３.５ｍｉｎ、４０％Ａと６０％Ｂ、５.５ｍｉｎ、４０％Ａと６０％Ｂ、
流速：０.５ｍＬ／ｍｉｎ
注入体積：２uＬ。
【0070】
以下の実施例では、カルボプラチンは斉魯製薬株式会社から購入され、１,１-シクロブタンジカルボン酸はドイツＭＥＲＣＫ会社の商品である。
【0071】
実施例１、カルボプラチン４.０の自己組立工程及びその水注射剤製造
１、カルボプラチン４.０の自己組立工程
１）純度９９％以上のカルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸をモル比１：２の割合で混合して過飽和水溶液（各成分濃度ができるだけ高く、結晶析出がないように維持する）を調製し、当該混合調製操作を６５℃±５℃で行い、約４時間維持し、自己組立反応を完了させる。
２）反応系を濾過し、濾液を室温（２０±５℃）で１０日間静置し、結晶形成を見ることができる。
３）濾液を回収し、複合体結晶、即ちカルボプラチン４.０結晶生成物を収集し、ＸＲＰＤ分析法により生成物純度を検出し、生成物におけるカルボプラチン４.０含有量が９９％以上に達することが測定される。
１、カルボプラチン４.０の自己組立工程
１）純度９９％以上のカルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸をモル比１：２の割合で混合して過飽和水溶液（各成分濃度ができるだけ高く、結晶析出がないように維持する）を調製し、当該混合調製操作を６５℃±５℃で行い、約４時間維持し、自己組立反応を完了させる。
２）反応系を濾過し、濾液を室温（２０±５℃）で１０日間静置し、結晶形成を見ることができる。
３）濾液を回収し、複合体結晶、即ちカルボプラチン４.０結晶生成物を収集し、ＸＲＰＤ分析法により生成物純度を検出し、生成物におけるカルボプラチン４.０含有量が９９％以上に達することが測定される。
【0072】
２、カルボプラチン４.０水注射剤の製造
１）上記カルボプラチン４.０結晶生成物を適量取り（又は再調製し）、粉末に粉砕し、真空乾燥し、結晶水を脱ぎ、カルボプラチン４.０粉末を得る。
２）上記カルボプラチン４.０粉末５００ｇを取り、滅菌水に溶解し、５００Ｌまで定量し、４５℃±５℃で均一に攪拌溶解し、室温で１時間以上放置し、母液を調製し、含有量を検出する。
３）上記母液は検査により含有量が基準に達すれば、室温で濾過滅菌し、５ｍｇ／５ｍＬの水注射剤に小分け、４℃で光を避けて貯蔵する。
１）上記カルボプラチン４.０結晶生成物を適量取り（又は再調製し）、粉末に粉砕し、真空乾燥し、結晶水を脱ぎ、カルボプラチン４.０粉末を得る。
２）上記カルボプラチン４.０粉末５００ｇを取り、滅菌水に溶解し、５００Ｌまで定量し、４５℃±５℃で均一に攪拌溶解し、室温で１時間以上放置し、母液を調製し、含有量を検出する。
３）上記母液は検査により含有量が基準に達すれば、室温で濾過滅菌し、５ｍｇ／５ｍＬの水注射剤に小分け、４℃で光を避けて貯蔵する。
【0073】
３、対照例
１）純度９９％以上のカルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸をモル比１：１.１の割合で混合して過飽和水溶液を調製し、当該混合調製操作を約４０℃で行い、約４時間維持し、反応を完了させる。
２）反応系を濾過し、濾液を室温（２０±５℃）で１０日間静置し、結晶形成を見ることができる。
３）濾液を回収し、結晶生成物を収集し、ＸＲＰＤ分析法により純度を検出し、生成物におけるカルボプラチン４.０含有量が８８％未満であることが測定される。
１）純度９９％以上のカルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸をモル比１：１.１の割合で混合して過飽和水溶液を調製し、当該混合調製操作を約４０℃で行い、約４時間維持し、反応を完了させる。
２）反応系を濾過し、濾液を室温（２０±５℃）で１０日間静置し、結晶形成を見ることができる。
３）濾液を回収し、結晶生成物を収集し、ＸＲＰＤ分析法により純度を検出し、生成物におけるカルボプラチン４.０含有量が８８％未満であることが測定される。
【0074】
以下、実施例２～３は、カルボプラチン４.０の構造、理化特性を研究し、特に説明がない限り、用いたカルボプラチン４.０原料薬（即ちカルボプラチン４.０結晶生成物）は、いずれも実施例１の自己組立工程に従って調製され、また、用いたカルボプラチン４.０原料薬の水溶後の凍結乾燥粉末（以下、凍結乾燥粉末ａと呼ばれ）、カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸の物理的に混合水溶後の凍結乾燥粉末（以下、凍結乾燥粉末ｂと呼ばれる）、及び、カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸の物理的に混合後の粉砕粉末（以下、混合粉末ｃと呼ばれる）は、いずれも以下の方法で調製される。
【0075】
１）カルボプラチン４.０原料薬１００ｍｇを精秤し、脱イオン水５.０ｍｌで溶解し、室温で２ｈ放置した後、-７０℃冷蔵庫で４ｈ冷凍し、そして冷凍乾燥機（ドイツＣｈｒiｓｔ冷凍乾燥機Ａｌｐｈａ２-４ＬＤ ＰＬＵＳ、コールドトラップ温度-６９℃、真空１０ｐａ）に移し、１２ｈ冷凍乾燥し、乳鉢で軽く粉砕し、白色凍結乾燥粉末を製造し、凍結乾燥粉末ａを得る。
２）カルボプラチン１００ｍｇと１,１-シクロブタンジカルボン酸３８ｍｇ（モル比約１:１）を含む混合物を精秤し、上記凍結乾燥粉末ａの調製手順に従い、凍結乾燥粉末ｂを調製する。
３）カルボプラチン１００ｍｇと１,１-シクロブタンジカルボン酸３８ｍｇを精秤し、混合した後、乳鉢で軽く粉末状に粉砕し、混合粉末ｃを製造する。
２）カルボプラチン１００ｍｇと１,１-シクロブタンジカルボン酸３８ｍｇ（モル比約１:１）を含む混合物を精秤し、上記凍結乾燥粉末ａの調製手順に従い、凍結乾燥粉末ｂを調製する。
３）カルボプラチン１００ｍｇと１,１-シクロブタンジカルボン酸３８ｍｇを精秤し、混合した後、乳鉢で軽く粉末状に粉砕し、混合粉末ｃを製造する。
【0076】
実施例２、カルボプラチン４.０構造、物理的および化学的性質分析試験
１、１ＨＮＭＲ分析試験
一定量の１,１-シクロブタンジカルボン酸とカルボプラチンを取り、重水素化ＤＭＳＯ（ＤＭＳＯ-ｄ６）０.５ｍｌで溶解し、１,１-シクロブタンジカルボン酸とカルボプラチンの混合測定対象液を調製し、一晩放置した後、１ＨＮＭＲ検出を行う。
１、１ＨＮＭＲ分析試験
一定量の１,１-シクロブタンジカルボン酸とカルボプラチンを取り、重水素化ＤＭＳＯ（ＤＭＳＯ-ｄ６）０.５ｍｌで溶解し、１,１-シクロブタンジカルボン酸とカルボプラチンの混合測定対象液を調製し、一晩放置した後、１ＨＮＭＲ検出を行う。
【0077】
上記方法に従って、番号が０～８である９組の上記混合測定対象液を調製し、各組の混合測定対象液における１,１-シクロブタンジカルボン酸とカルボプラチンの濃度を表１（１,１-シクロブタンジカルボン酸の添加量を固定し、カルボプラチンの添加量を変更させる）に示し、９組の混合測定対象液についてそれぞれ１ＨＮＭＲ検出を行い、結果を表１及び図１、図２に示す。
【0078】
その結果、１,１-シクロブタンジカルボン酸分子における２つのカルボキシル水素を除いて、他のすべての水素原子の化学シフトはいずれもカルボプラチン添加量の増加に伴って変化していなく、１,１-シクロブタンジカルボン酸のカルボキシル水素の化学シフトは、カルボプラチン添加量／濃度の増加とともに著しく変化し（図１と表１に示すように、ここで、カルボキシル水素のシフトはカルボプラチン濃度とほぼ次のような関係にある：ｙ＝１２.６９＋０.００３６４ｘ）、高電界から低電界へとシフトし（１２.６８１→１３.４２２ｐｐｍ）、このことから、１,１-シクロブタンジカルボン酸とカルボプラチンとの間には２つの水素結合作用が存在することが説明される。滴定の過程において、カルボプラチン分子におけるアミノ水素（ＮＨ３）の化学シフトは意外にも明らかな変化が発生せず、これはカルボプラチン分子におけるアミノ水素（ＮＨ３）が１,１-シクロブタンジカルボン酸の添加による影響をほとんど受けないことを示し、即ち、カルボプラチン分子におけるアミノ水素（ＮＨ３）は１,１-シクロブタンジカルボン酸と水素結合を形成していない。
【0079】
図２に示すように、カルボプラチン添加量が異なる場合のカルボキシル水素の化学シフト値に基づいて、非線形フィッティングによりカルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸との間の解離定数ｋ１が０.３ｍｍｏｌ／Ｌであると計算され、カルボキシル水素の化学シフト値の逆数とカルボプラチンのモル濃度の逆数に基づいて、１,１-シクロブタンジカルボン酸とカルボプラチンの結合定数が４.２２×１０４Ｌ／ｍｏｌであると計算される。カルボプラチン４.０の２つの成分（即ち、カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸）の間には確かに２つの水素結合作用が存在するが、両者間の結合力は共有結合に対して弱いことがさらに示される。
【0080】
【表1】
【0081】
２、ＤＳＣ分析試験
１）ＤＳＣ分析
（１）カルボプラチン４.０原料薬、凍結乾燥粉末ａ、凍結乾燥粉末ｂ、混合粉末ｃ、カルボプラチン、１,１-シクロブタンジカルボン酸を適量精秤し、ＤＳＣ分析機器を用いてその熱重量パラメータ（即ち溶融過程）を測定し、結果を図３に示す。
その結果、カルボプラチン４.０原料薬（図３における曲線５）、凍結乾燥粉末ａ（図３における曲線４）、凍結乾燥粉末ｂ（図３における曲線６）の３つのサンプルのＤＳＣ曲線は比較的に似ており、それぞれ１９８.９４℃、１９８.６８℃、１９３.０６℃で吸熱ピークが現れ始め、相対的に、凍結乾燥粉末ａの吸熱過程（又は曲線）はカルボプラチン４.０原料薬とより近いが、凍結乾燥粉末ｂの吸熱過程とカルボプラチン４.０原料薬の吸熱過程との差がやや大きくし、混合粉末ｃは１９８℃で吸熱ピークを有する他、１５３.０５℃でも１つの顕著な吸熱ピーク（図３における曲線３を参照）を有し、当該ピークは１,１-シクロブタンジカルボン酸の吸熱ピーク（図３における曲線１を参照）に近くし、１,１-シクロブタンジカルボン酸の吸熱ピークであると決定することができ、このことから、カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸の物理混合物は、その構成成分の特徴を示し、カルボプラチンは、１５３℃と１９８℃付近に吸熱ピークを示さず、温度が２５２℃まで上昇すると１つの分解ピークを有する（図３における曲線２を参照）。
（２）１９８℃付近のピークがカルボプラチン４.０の溶融ピークであるか否かを検証するために、さらに昇温速度を変えてカルボプラチン４.０の融点を調べ、結果を図１４に示す。ここで、図１４における曲線１～４に対応する昇温速度は、それぞれ３℃／ｍｉｎ、５℃／ｍｉｎ、１０℃／ｍｉｎ、２０℃／ｍｉｎである。
図１４から分かるように、昇温速度の増加に伴って溶融ピークが右にシフトしていることから、カルボプラチン４.０には融点が固定されておらず、ＤＳＣが示すピークが溶融分解ピークであることが確認できる。
（３）番号１-４である４ロットのカルボプラチン４.０原料薬を製造し、１～４ロットのカルボプラチン４.０原料薬をそれぞれ適量取り、ＤＳＣ分析機器を用いてその熱重量パラメータを測定し、結果を図４に示す。４ロットの異なるロットのカルボプラチン４.０原料薬はいずれも１９８℃付近にのみ吸熱ピークを示し、１５３℃と２５２℃付近には吸熱ピークがないことが見られる。
１）ＤＳＣ分析
（１）カルボプラチン４.０原料薬、凍結乾燥粉末ａ、凍結乾燥粉末ｂ、混合粉末ｃ、カルボプラチン、１,１-シクロブタンジカルボン酸を適量精秤し、ＤＳＣ分析機器を用いてその熱重量パラメータ（即ち溶融過程）を測定し、結果を図３に示す。
その結果、カルボプラチン４.０原料薬（図３における曲線５）、凍結乾燥粉末ａ（図３における曲線４）、凍結乾燥粉末ｂ（図３における曲線６）の３つのサンプルのＤＳＣ曲線は比較的に似ており、それぞれ１９８.９４℃、１９８.６８℃、１９３.０６℃で吸熱ピークが現れ始め、相対的に、凍結乾燥粉末ａの吸熱過程（又は曲線）はカルボプラチン４.０原料薬とより近いが、凍結乾燥粉末ｂの吸熱過程とカルボプラチン４.０原料薬の吸熱過程との差がやや大きくし、混合粉末ｃは１９８℃で吸熱ピークを有する他、１５３.０５℃でも１つの顕著な吸熱ピーク（図３における曲線３を参照）を有し、当該ピークは１,１-シクロブタンジカルボン酸の吸熱ピーク（図３における曲線１を参照）に近くし、１,１-シクロブタンジカルボン酸の吸熱ピークであると決定することができ、このことから、カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸の物理混合物は、その構成成分の特徴を示し、カルボプラチンは、１５３℃と１９８℃付近に吸熱ピークを示さず、温度が２５２℃まで上昇すると１つの分解ピークを有する（図３における曲線２を参照）。
（２）１９８℃付近のピークがカルボプラチン４.０の溶融ピークであるか否かを検証するために、さらに昇温速度を変えてカルボプラチン４.０の融点を調べ、結果を図１４に示す。ここで、図１４における曲線１～４に対応する昇温速度は、それぞれ３℃／ｍｉｎ、５℃／ｍｉｎ、１０℃／ｍｉｎ、２０℃／ｍｉｎである。
図１４から分かるように、昇温速度の増加に伴って溶融ピークが右にシフトしていることから、カルボプラチン４.０には融点が固定されておらず、ＤＳＣが示すピークが溶融分解ピークであることが確認できる。
（３）番号１-４である４ロットのカルボプラチン４.０原料薬を製造し、１～４ロットのカルボプラチン４.０原料薬をそれぞれ適量取り、ＤＳＣ分析機器を用いてその熱重量パラメータを測定し、結果を図４に示す。４ロットの異なるロットのカルボプラチン４.０原料薬はいずれも１９８℃付近にのみ吸熱ピークを示し、１５３℃と２５２℃付近には吸熱ピークがないことが見られる。
【0082】
２）結果検討
（１）カルボプラチン４.０、凍結乾燥粉末ａ及び混合粉末ｃのＤＳＣ曲線は大きな差を示し、熱吸収ピーク（又は吸熱ピーク）の位置及びピーク形状が著しく変化するだけでなく、吸収ピークの個数も異なる。
（２）カルボプラチン４.０原料薬と凍結乾燥粉末ａは１９８℃付近に急峻な相転移ピークを示し始め、凍結乾燥粉末ｂは１９３℃付近に相転移ピークを示すことから、カルボプラチン４.０の２つの成分（カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸）は結晶状態にあり、凍結乾燥粉末ｂの２つの成分は半結晶状態又は非晶質状態にあることが示される。
（３）凍結乾燥粉末ｂと混合粉末ｃには差があり、凍結乾燥粉末ｂのＤＳＣ曲線はカルボプラチン４.０と類似しており、１５３℃付近に１,１-シクロブタンジカルボン酸の溶解吸熱ピークが現れず、水溶凍結乾燥後、カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸は水素結合作用力によりカルボプラチン４.０の類似物を形成したが、その結晶状態は本実施例の特別な工程によって組み立てられて製造されるカルボプラチン４.０と著しく異なることが示される。
（４）カルボプラチン４.０原料薬と凍結乾燥粉末ａのＤＳＣ曲線を比較すると、両者のＤＳＣ曲線は比較的に類似しており、カルボプラチン４.０は凍結乾燥によって凍結乾燥粉末ａを製造した後、吸収ピークが少しシフトしたが、１５３℃付近に吸熱ピークが現れず、凍結乾燥過程がカルボプラチン４.０の２つの成分間の結合に対する影響は大きくないことが示される。
上記ＤＳＣ試験の結果、カルボプラチン４.０原料薬（固体）と、カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸の物理混合物（例えば上記凍結乾燥粉末ｂ、混合粉末ｃ）とは確かに明らかな差があり、カルボプラチン４.０は、水素結合を介して２つの成分によって結合されたものであり、単純な物理混合物ではない。したがって、本発明の自己組立工程により、カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸という２つの成分は確かに、水素結合作用力によって新しい化学実体（即ちカルボプラチン４.０）を形成し、比較的温和な条件で安定に存在することができることもさらに示される。
（１）カルボプラチン４.０、凍結乾燥粉末ａ及び混合粉末ｃのＤＳＣ曲線は大きな差を示し、熱吸収ピーク（又は吸熱ピーク）の位置及びピーク形状が著しく変化するだけでなく、吸収ピークの個数も異なる。
（２）カルボプラチン４.０原料薬と凍結乾燥粉末ａは１９８℃付近に急峻な相転移ピークを示し始め、凍結乾燥粉末ｂは１９３℃付近に相転移ピークを示すことから、カルボプラチン４.０の２つの成分（カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸）は結晶状態にあり、凍結乾燥粉末ｂの２つの成分は半結晶状態又は非晶質状態にあることが示される。
（３）凍結乾燥粉末ｂと混合粉末ｃには差があり、凍結乾燥粉末ｂのＤＳＣ曲線はカルボプラチン４.０と類似しており、１５３℃付近に１,１-シクロブタンジカルボン酸の溶解吸熱ピークが現れず、水溶凍結乾燥後、カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸は水素結合作用力によりカルボプラチン４.０の類似物を形成したが、その結晶状態は本実施例の特別な工程によって組み立てられて製造されるカルボプラチン４.０と著しく異なることが示される。
（４）カルボプラチン４.０原料薬と凍結乾燥粉末ａのＤＳＣ曲線を比較すると、両者のＤＳＣ曲線は比較的に類似しており、カルボプラチン４.０は凍結乾燥によって凍結乾燥粉末ａを製造した後、吸収ピークが少しシフトしたが、１５３℃付近に吸熱ピークが現れず、凍結乾燥過程がカルボプラチン４.０の２つの成分間の結合に対する影響は大きくないことが示される。
上記ＤＳＣ試験の結果、カルボプラチン４.０原料薬（固体）と、カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸の物理混合物（例えば上記凍結乾燥粉末ｂ、混合粉末ｃ）とは確かに明らかな差があり、カルボプラチン４.０は、水素結合を介して２つの成分によって結合されたものであり、単純な物理混合物ではない。したがって、本発明の自己組立工程により、カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸という２つの成分は確かに、水素結合作用力によって新しい化学実体（即ちカルボプラチン４.０）を形成し、比較的温和な条件で安定に存在することができることもさらに示される。
【0083】
３、ＸＲＰＤ分析試験
本試験により、カルボプラチン４.０原料薬が針状結晶であるため、深刻な優先配向が存在し、通常の反射法ではサンプルの構造情報を忠実に反映できないが、透過法で優先配向を弱め、より真実にサンプルの構造情報を反映でき、定量分析に対してもより精確である（カルボプラチン４.０原料薬の透過と反射結果を図５に示す）ことが分かる。そのため、以下の試験過程において、いずれも透過法を用いてＸＲＰＤ分析を行う。
本試験により、カルボプラチン４.０原料薬が針状結晶であるため、深刻な優先配向が存在し、通常の反射法ではサンプルの構造情報を忠実に反映できないが、透過法で優先配向を弱め、より真実にサンプルの構造情報を反映でき、定量分析に対してもより精確である（カルボプラチン４.０原料薬の透過と反射結果を図５に示す）ことが分かる。そのため、以下の試験過程において、いずれも透過法を用いてＸＲＰＤ分析を行う。
【0084】
ＸＲＰＤ分析
カルボプラチン４.０原料薬、凍結乾燥粉末ａ、凍結乾燥粉末ｂ、混合粉末ｃ、カルボプラチン、１,１-シクロブタンジカルボン酸サンプルをそれぞれ１００ｍｇ透過サンプルホルダーに入れ、同じ実験条件でＸＲＰＤ測定を行い、結果を図６に示す。
カルボプラチン４.０原料薬、凍結乾燥粉末ａ、凍結乾燥粉末ｂ、混合粉末ｃ、カルボプラチン、１,１-シクロブタンジカルボン酸サンプルをそれぞれ１００ｍｇ透過サンプルホルダーに入れ、同じ実験条件でＸＲＰＤ測定を行い、結果を図６に示す。
【0085】
その結果、カルボプラチン４.０原料薬（図６におけるパターン４）、凍結乾燥粉末ａ（図６におけるパターン３）と凍結乾燥粉末ｂ（図６におけるパターン２）、混合粉末ｃ（図６におけるパターン１）とのＸＲＰＤパターンには明らかな差があることが示され、具体的には以下の通りである。
【0086】
（１）凍結乾燥粉末ｂ、混合粉末ｃはいずれも２θ角が約１１.５５±０.２°で回折ピークがあり、当該ピークはカルボプラチンの特徴的なピークである。カルボプラチン４.０原料薬と凍結乾燥粉末ａという両者のＸＲＰＤパターンは類似し、その主要な特徴的なピークは２θが約７.５５°、１０.５１°、１４.６３°、１５.１０°、１５.６６°、１６.７８°、１８.５５°、２０.８３°、２２.８６°、２３.６７°、２４.０２°などのところにあるが、２θ角が約１１.５５±０.２°で回折ピークがない。カルボプラチン４.０原料薬、凍結乾燥粉末ａは、カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸の物理混合物（即ち凍結乾燥粉末ｂ、混合粉末ｃ）と異なることが示され、本発明の自己組立工程により、カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸という２つの成分は確かに、水素結合作用力によって新しい化学実体（即ちカルボプラチン４.０）を形成し、比較的温和な条件で安定に存在することができることがさらに示される。
【0087】
上記比較分析を組み合わせると、約１１.５５±０.２°での特徴回折ピークをカルボプラチン４.０の品質制御ピークとすることができ、即ち、ＸＲＰＤ分析法をカルボプラチン４.０原料薬の純度の品質制御方法として用いることができ、さらにカルボプラチン４.０原料薬におけるカルボプラチン４.０の含有量測定方法とすることができることが示される。
【0088】
４、ＬＣ-ＭＳ分析試験
１）ＬＣ-ＭＳ分析
本実施例のカルボプラチン４.０結晶生成物について、従来の操作方法に従ってＬＣ-ＭＳ分析を行う。
カルボプラチン４.０に対してＬＣ-ＭＳ分析を行い、それぞれ陽イオンと負イオンモードで解離したカルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸が検出され(図７～図１０参照)、ここで、ｍ／ｚ３７２.０５１４はカルボプラチンの分子イオンピーク[Ｍ＋Ｈ]＋であり、ｍ／ｚ１４３.０３４１は１,１-シクロブタンジカルボン酸の分子イオンピーク[Ｍ-Ｈ]-であり、カルボプラチン４.０が液体クロマトグラフィー分離条件でカルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸に解離されることが示される。
２）流動注入-質量スペクトル分析
液体クロマトグラフィー分離は、カルボプラチン４.０分子内水素結合を破壊することを考慮して、サンプルを流動注入し、カルボプラチン４.０水溶液サンプルを直接分析する。負イオンモードでカルボプラチン４.０[ｍ／ｚ５１４.０９１７]及び１,１-シクロブタンジカルボン酸[ｍ／ｚ１４３.０３７５]の分子イオンピークが観察され（図１１）、陽イオンモードでカルボプラチンの分子イオンピーク[ｍ／ｚ３７２.０５４３]のみが観察される（図１２）。
３）カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸（モル比１:１）の物理混合サンプルについて、上記流動注入-質量スペクトル分析を行ったところ、負イオンモードでもカルボプラチン４.０と同じイオンが生成することを発見した。
１）ＬＣ-ＭＳ分析
本実施例のカルボプラチン４.０結晶生成物について、従来の操作方法に従ってＬＣ-ＭＳ分析を行う。
カルボプラチン４.０に対してＬＣ-ＭＳ分析を行い、それぞれ陽イオンと負イオンモードで解離したカルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸が検出され(図７～図１０参照)、ここで、ｍ／ｚ３７２.０５１４はカルボプラチンの分子イオンピーク[Ｍ＋Ｈ]＋であり、ｍ／ｚ１４３.０３４１は１,１-シクロブタンジカルボン酸の分子イオンピーク[Ｍ-Ｈ]-であり、カルボプラチン４.０が液体クロマトグラフィー分離条件でカルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸に解離されることが示される。
２）流動注入-質量スペクトル分析
液体クロマトグラフィー分離は、カルボプラチン４.０分子内水素結合を破壊することを考慮して、サンプルを流動注入し、カルボプラチン４.０水溶液サンプルを直接分析する。負イオンモードでカルボプラチン４.０[ｍ／ｚ５１４.０９１７]及び１,１-シクロブタンジカルボン酸[ｍ／ｚ１４３.０３７５]の分子イオンピークが観察され（図１１）、陽イオンモードでカルボプラチンの分子イオンピーク[ｍ／ｚ３７２.０５４３]のみが観察される（図１２）。
３）カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸（モル比１:１）の物理混合サンプルについて、上記流動注入-質量スペクトル分析を行ったところ、負イオンモードでもカルボプラチン４.０と同じイオンが生成することを発見した。
【0089】
上記分析の結果、クロマトグラフィー分離はカルボプラチン４.０の水素結合を破壊するため、液体クロマトグラフィー-質量スペクトル分析併用法はカルボプラチン４.０の品質標準研究に適用できないことが明らかになった。一方、サンプルを流動注入して直接質量スペクトル分析を行うことは、負イオンモードでカルボプラチン４.０の正確な分子量を取得することができるが、カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸の物理混合サンプルはこのモードでもカルボプラチン４.０と同じイオンを生成するので、質量スペクトル分析は、カルボプラチン４.０と、カルボプラチンと１,１-シクロブタンジカルボン酸の物理混合物とを区別することができず、カルボプラチン４.０の正確な分子量の測定にのみ使用されることができる。
【0090】
実施例３、ヘリカーゼ検証方法
本試験は、ヘリカーゼが参与するＤＮＡ結合実験を通じて、ヘリカーゼのカルボプラチン４.０に対する作用を検証し、スーパーコイルと線状プラスミドＤＮＡ（Ｈｒ.ｐｃＤＮＡ、通常の形態で抽出することができる）をテンプレートとし、異なるプラチナ系抗がん剤と結合反応することによってＤＮＡコンフォメーションを変化させ、さらにゲル電気泳動パターンの違いによって異なるプラチナ系薬物を区別する。
本試験は、ヘリカーゼが参与するＤＮＡ結合実験を通じて、ヘリカーゼのカルボプラチン４.０に対する作用を検証し、スーパーコイルと線状プラスミドＤＮＡ（Ｈｒ.ｐｃＤＮＡ、通常の形態で抽出することができる）をテンプレートとし、異なるプラチナ系抗がん剤と結合反応することによってＤＮＡコンフォメーションを変化させ、さらにゲル電気泳動パターンの違いによって異なるプラチナ系薬物を区別する。
【0091】
プラチナ系薬物とプラスミドＤＮＡとの結合は、薬物濃度（カルボプラチン又はカルボプラチン４.０の濃度）、反応時間、プラスミドサイズ、溶液におけるＣｌイオン、ＥＤＴＡ、酸塩基性（ｐＨ)、温度などの様々な要因によって影響を受け、発明者は大量の比較試験を通じて最後に、薬物濃度０.０５～０.２ｍｍｏｌ／Ｌ、プラスミドサイズ６０００ｂｐ程度、反応時間１時間、ｐＨ６.５～７.３、緩衝液にはＥＤＴＡとＣｌイオンがなく、温度３７℃の条件を選択し、カルボプラチンとカルボプラチン４.０の結合ＤＮＡの差は明らかである（図１３参照）。
【0092】
具体的には以下の通りである。
本実験に用いるのは、クローニン（Ｃｌｏｎｉｎｇ）生物科学技術有限会社から輸入したＴ４ ＧＰ４１ ＤＮＡヘリカーゼ（以下、Ｔ４と略称する）である。
試験条件：０.８％アガロース（Ｐｒｏｍｅｇａ社輸入小分け）ゲル電気泳動、ｐＨ６.５～７.３、３７℃、反応時間１時間、薬物濃度０.１ｍｍｏｌ／Ｌ、５Ｖ １ Ｈｒ. ｐｃＤＮＡ :６０００ｂｐで、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ社輸入小分け）を加える。
本実験に用いるのは、クローニン（Ｃｌｏｎｉｎｇ）生物科学技術有限会社から輸入したＴ４ ＧＰ４１ ＤＮＡヘリカーゼ（以下、Ｔ４と略称する）である。
試験条件：０.８％アガロース（Ｐｒｏｍｅｇａ社輸入小分け）ゲル電気泳動、ｐＨ６.５～７.３、３７℃、反応時間１時間、薬物濃度０.１ｍｍｏｌ／Ｌ、５Ｖ １ Ｈｒ. ｐｃＤＮＡ :６０００ｂｐで、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ社輸入小分け）を加える。
【0093】
上記試験条件で以下のサンプル（試験番号１～５、Ｍ）を分析し、各サンプルにおけるｐｃＤＮＡ、薬物、ヘリカーゼの添加状況は以下の通りである。
試験１：ｐｃＤＮＡ＋カルボプラチン＋Ｔ４、
試験２：ｐｃＤＮＡ＋カルボプラチン４.０＋Ｔ４
試験３：ｐｃＤＮＡ＋カルボプラチン４.０
試験４：ｐｃＤＮＡ＋カルボプラチン
試験５：ｐｃＤＮＡ
試験Ｍ：ｍａｒｋｅｒ（標準参照）
試験１：ｐｃＤＮＡ＋カルボプラチン＋Ｔ４、
試験２：ｐｃＤＮＡ＋カルボプラチン４.０＋Ｔ４
試験３：ｐｃＤＮＡ＋カルボプラチン４.０
試験４：ｐｃＤＮＡ＋カルボプラチン
試験５：ｐｃＤＮＡ
試験Ｍ：ｍａｒｋｅｒ（標準参照）
【0094】
【0095】
その結果、試験１と試験４のプラスミドの電気泳動状況はほぼ同じで、ヘリカーゼがカルボプラチンに対してほとんど明らかな影響がないことが示される。しかし、カルボプラチン４.０は全く異なり、試験３と試験５のプラスミドの電気泳動状況は基本的に一致し、カルボプラチン４.０自身はスーパーコイルプラスミド（ｐｃＤＮＡ）と基本的に結合しないことが示される。一方、試験２のプラスミドの電気泳動速度は最も遅く、ヘリカーゼがカルボプラチン４.０の水素結合を開き、カルボプラチンを放出し、カルボプラチンはさらにプラスミドと結合してＤＮＡ付加物を形成し、付加物により電気泳動速度を引き下げることが示される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
