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特許7543404Ｔ細胞培養用培地組成物及びこれを用いたＴ細胞の培養方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-08-23

(45)【発行日】2024-09-02

(54)【発明の名称】Ｔ細胞培養用培地組成物及びこれを用いたＴ細胞の培養方法

(51)【国際特許分類】

C07K 19/00 20060101AFI20240826BHJP

C07K 14/55 20060101ALI20240826BHJP

C07K 14/705 20060101ALI20240826BHJP

C07K 16/00 20060101ALI20240826BHJP

C12N 5/0783 20100101ALI20240826BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00 ZNA

C07K14/55

C07K14/705

C07K16/00

C12N5/0783

【請求項の数】 15

(21)【出願番号】P 2022529599

(86)(22)【出願日】2020-11-19

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-01-26

(86)【国際出願番号】 KR2020016379

(87)【国際公開番号】W WO2021101271

(87)【国際公開日】2021-05-27

【審査請求日】2022-07-20

(31)【優先権主張番号】10-2019-0149779

(32)【優先日】2019-11-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】521126254

【氏名又は名称】ジーアイ・セル・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＧＩＣＥＬＬ，ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100139594

【弁理士】

【氏名又は名称】山口健次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100194973

【弁理士】

【氏名又は名称】尾崎祐朗

(72)【発明者】

【氏名】チャンミョンホ

(72)【発明者】

【氏名】ホンチュンピョ

(72)【発明者】

【氏名】チョヨンジュ

(72)【発明者】

【氏名】イチュンソプ

【審査官】西澤龍彦

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第８６／０００３３４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１４－５２２８４６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１６－５１８８２３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１２－５００８４７（ＪＰ，Ａ）

【文献】GI-101, a novel bispecific CD80-IgG4-IL2 variant fusion protein, elicits robust anti-tumor effects in preclinical models，ESMO Congress 2019, Barcelona, Spain; 27 Sep－01 Oct, 2019，2019年10月01日，https://www.gi-innovation.com/en/sub/company/certi.asp?s_cate=POSTER#gallery-4

【文献】GI101, a novel triple-targeting bispecific CD80-IgG4-IL2 variant fusion protein, elicits synergistic anti-tumour effects in preclinical models，Immunotherapy of Cancer，2019年，Vol. 30, No. 5，v500

【文献】KONG, L et al.，Expression of fusion IL2-B7.1(IgV+C) and effects on T lymphocytes，Biochemistry and Cell Biology，2007年，Vol. 85，pp. 685-695

【文献】CHAN, L et al.，IL-2/B7.1(CD80) Fusagene Transduction of AML Blasts by a Self-Inactivating Lentiviral Vector Stimulates T Cell Responses in Vitro: a Strategy to Generate Whole Cell Vaccines for AML，Molecular Therapy，2005年，Vol. 11, No. 1，pp. 120-131

【文献】INGRAM, W et al.，Human CD80/IL2 lentivirus transduced acute myeloid leukaemia cells enhance cytolytic activity in vitro in spite of an increase in regulatory CD4+ T cell in a subset of cultures，Cancer Immunology, Immunotherapy，2009年，Vol. 58，pp. 1679-1690

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ

Ｃ１２Ｎ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

融合タンパク質二量体を有効成分として含むＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＯ＋記憶Ｔ細胞イン・ビトロ増殖用組成物であって、
前記融合タンパク質二量体は、下記構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）：
Ｎ’－Ｘ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｙ－Ｃ’（Ｉ）
Ｎ’－Ｙ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｘ－Ｃ’（ＩＩ）
を含み、ここで、
Ｎ’は、融合タンパク質のＮ末端であり、
Ｃ’は、融合タンパク質のＣ末端であり、
Ｘは、ＣＤ８０タンパク質又はその断片であり、
Ｙは、ＩＬ－２タンパク質変異体であり、
リンカー（１）及びリンカー（２）は、ペプチドリンカーであり、
ｎ及びｍはそれぞれ独立に、０又は１であり、
前記ＩＬ－２タンパク質変異体が、配列番号６のアミノ酸配列を含み、
前記ＣＤ８０タンパク質断片が、ＣＤ８０の細胞外ドメインを含む、前記組成物。

【請求項2】

前記ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＯ＋記憶Ｔ細胞は、ＣＤ８＋ＣＤ２５＋ＣＤ４５ＲＯ＋記憶Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ＋記憶Ｔ細胞、又はＣＤ８＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ＋記憶Ｔ細胞である、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記ＩＬ－２タンパク質変異体は、配列番号６のアミノ酸配列である、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

前記ＣＤ８０は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むものである、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

前記融合タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項6】

融合タンパク質二量体を含むＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＯ＋記憶Ｔ細胞イン・ビトロ増殖用培地であって、
前記融合タンパク質二量体は、下記構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）：
Ｎ’－Ｘ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｙ－Ｃ’（Ｉ）
Ｎ’－Ｙ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｘ－Ｃ’（ＩＩ）
を含み、ここで、
Ｎ’は、融合タンパク質のＮ末端であり、
Ｃ’は、融合タンパク質のＣ末端であり、
Ｘは、ＣＤ８０タンパク質又はその断片であり、
Ｙは、ＩＬ－２タンパク質変異体であり、
リンカー（１）及びリンカー（２）は、ペプチドリンカーであり、
ｎ及びｍはそれぞれ独立に、０又は１であり、
前記ＩＬ－２タンパク質変異体が、配列番号６のアミノ酸配列を含み、
前記ＣＤ８０タンパク質断片が、ＣＤ８０の細胞外ドメインを含む、前記培地。

【請求項7】

Ｔ細胞培養用培地をさらに含むものである、請求項６に記載の培地。

【請求項8】

前記Ｔ細胞培養用培地は、アミノ酸（ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ）、糖類（ｓｕｇａｒｓ）、無機塩（ｉｎｏｒｇａｎｉｃｓａｌｔｓ）及びビタミンを含む、請求項７に記載の培地。

【請求項9】

ＣＤ８＋Ｔ細胞を培養する段階を含むＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＯ＋記憶Ｔ細胞のイン・ビトロ増殖方法であって、
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞を培養する段階を、下記構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）：
Ｎ’－Ｘ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｙ－Ｃ’（Ｉ）
Ｎ’－Ｙ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｘ－Ｃ’（ＩＩ）
を含む融合タンパク質二量体の存在下で行い、ここで、
Ｎ’は、融合タンパク質のＮ末端であり、
Ｃ’は、融合タンパク質のＣ末端であり、
Ｘは、ＣＤ８０タンパク質又はその断片であり、
Ｙは、ＩＬ－２タンパク質変異体であり、
リンカー（１）及びリンカー（２）は、ペプチドリンカーであり、
ｎ及びｍはそれぞれ独立に、０又は１であり、
前記ＩＬ－２タンパク質変異体が、配列番号６のアミノ酸配列を含み、
前記ＣＤ８０タンパク質断片が、ＣＤ８０の細胞外ドメインを含む、前記方法。

【請求項10】

前記ＣＤ８＋Ｔ細胞は、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）で取得されたものである、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

７～２１日間培養するものである、請求項９に記載の方法。

【請求項12】

前記ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＯ＋記憶Ｔ細胞は、ＣＤ８＋ＣＤ２５＋ＣＤ４５ＲＯ＋記憶Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ＋記憶Ｔ細胞、又はＣＤ８＋ＣＤ２５＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ＋記憶Ｔ細胞である、請求項９に記載の方法。

【請求項13】

前記ＩＬ－２タンパク質変異体は、配列番号６のアミノ酸配列である、請求項９に記載の方法。

【請求項14】

前記ＣＤ８０は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むものである、請求項９に記載の方法。

【請求項15】

前記融合タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＣＤ８０タンパク質及びＩＬ－２野生型又は変異体を含む融合タンパク質を含有するＴ細胞培養用培地組成物及びこれを用いたＴ細胞の培養方法に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）と欧州医薬品庁（ＥＭＡ）から市販許可を受けたノバルティスのキムリア（成分名：チサゲンレクルユーセル、製品コード：ＣＴＬ０１９）は、自家遺伝子変形Ｔ細胞で構成された遺伝子治療剤である（米国登録特許第９４９９６２９号）。この製品は、患者自身のＴ細胞で生産され、このＴ細胞は、ヒトＣＤ１９に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするレンチウイルスベクターを用いて形質導入される。該当のＴ細胞は、抗原依存的に作用し、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）とは独立的な方式でＣＤ１９陽性Ｂ細胞を特異的に標的として破壊させる。

【0003】

キムリアの製造工程は次の通りである。二つの他の工程を通じてＴ細胞を増殖させ、増殖されたＴ細胞は、ＣＤ３とＣＤ２８抗体とが結合された磁性ビーズによって刺激された後、ＣＴＬ０１９ＨＩＶ－１ベクターが形質導入される。そして、ＣＡＲを発現する自家Ｔ細胞を培養によって一定期間増殖させた後、ＣＤ３／ＣＤ２８が結合されたビーズなどの不純物を除去するために洗浄過程を経る。ところが、近年、キムリアの製造工程でＴ細胞の増殖及び活性化のために使用されるＣＤ３／ＣＤ２８抗体結合磁性ビーズであるＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）は、急性毒性を誘発する可能性があるものと確認された。

【0004】

また、医薬品内の複製可能レンチウイルス（ＲＣＬ、Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）は、感染性が存在し、接触した人に伝達され得るものとして知られている。輸血又は移植のための血液、臓器、組織又は細胞の寄贈を通じて新しいレンチウイルスを伝染させる危険性を保有した患者にキムリアを投与した後、プロウイルスと宿主配列との間の相補性によるベクター移動によってＲＣＬが形成され得る。よって、以前にＨＩＶ陽性であった患者の場合、新しいＨＩＶウイルスを生成させる可能性もある。このように、新しい複製可能なレンチウイルスがヒト個体群内に拡散される場合もあるので、環境に及ぼす理論的な潜在的副作用が大きいと判断された。

【0005】

そこで、このような副作用のない新しい自家Ｔ細胞治療剤に対する要求が増加している状況である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明者等は、ＣＤ３／ＣＤ２８抗体結合磁性ビーズを使用せず、Ｔ細胞の増殖及び活性を増加させるために鋭意努力した結果、細胞培養用培地にＣＤ８０タンパク質及びＩＬ－２野生型又は変異体を含む融合タンパク質の存在下で末梢血液単核細胞を培養することによってＴ細胞の増殖及び活性が増加することを確認し、本発明を完成した。

【課題を解決するための手段】

【0007】

前記目的を達成するために、ＩＬ－２タンパク質又はその変異体及びＣＤ８０タンパク質又はその断片を含む融合タンパク質二量体を有効成分として含むＴ細胞培養用組成物又は培地を提供する。

【0008】

また、ＩＬ－２タンパク質又はその変異体及びＣＤ８０タンパク質又はその断片を含む融合タンパク質二量体を用いたＴ細胞培養方法を提供する。

【0009】

また、ＩＬ－２タンパク質又はその変異体及びＣＤ８０タンパク質又はその断片を含む融合タンパク質二量体が含まれた培地で培養されたＴ細胞を有効成分として含む薬学的組成物を提供する。

【発明の効果】

【0010】

本発明のＴ細胞培養用培地組成物及びこれを用いるＴ細胞の培養方法で培養されたＴ細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８抗体結合磁性ビーズを使用しなくても、Ｔ細胞の増殖及び活性が増加する。よって、磁性ビーズなどの不純物が生成されないので、より安全にＴ細胞を製作することができる。さらに、患者自身の末梢血液単核細胞を培養することによってＴ細胞を増殖させるので、人体に副作用が発生するおそれがなく、新しいＴ細胞治療剤として広く活用され得る。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】本発明で使用された融合タンパク質の一製造例を図式化した図である。

【0012】

【図2】取得した融合タンパク質（ＧＩ－１０１）をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した図である。

【0013】

【図3】取得した融合タンパク質（ＧＩ－１０１）をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で分析した図である。

【0014】

【図4】取得したＦｃ－ＩＬ２ｖ２融合タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した図である。

【0015】

【図5】取得したＦｃ－ＩＬ２ｖ２融合タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で分析した図である。

【0016】

【図6】取得したＦｃ－ＩＬ２ｗｔ融合タンパク質二量体をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した図である。

【0017】

【図7】取得したＦｃ－ＩＬ２ｗｔ融合タンパク質二量体をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で分析した図である。

【0018】

【図8】取得したｈＣＤ８０－Ｆｃ－ＩＬ２ｗｔ融合タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した図である。

【0019】

【図9】取得したｈＣＤ８０－Ｆｃ－ＩＬ２ｗｔ融合タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で分析した図である。

【0020】

【図10】取得したｈＣＤ８０－Ｆｃ融合タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した図である。

【0021】

【図11】取得したｈＣＤ８０－Ｆｃ融合タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で分析した図である。

【0022】

【図12】表１の基本培養培地含有培養組成物における培養時のＣＤ４－ＰＢＭＣの総細胞数を示した図である。

【0023】

【図13】表１の基本培養培地含有培養組成物における培養時のＣＤ４－ＰＢＭＣ細胞の生存率を示した図である。

【0024】

【図14】表２の基本培養培地含有培養組成物における培養時のＣＤ４－ＰＢＭＣの総細胞数を示した図である。

【0025】

【図15】表２の基本培養培地含有培養組成物における培養時のＣＤ４－ＰＢＭＣ細胞の生存率を示した図である。

【0026】

【図16】表１の基本培養培地含有培養組成物における本発明に係るＧＩ－１０１、又はｈＣＤ８０－Ｆｃ及びＦｃ－ＩＬ２ｖ添加物質処理によるＣＤ４－ＰＢＭＣ細胞の細胞表面のフローサイトメトリー結果を示した図である。

【0027】

【図17】本発明のＧＩ－１０１、又はｈＣＤ８０－Ｆｃ及びＦｃ－ＩＬ２ｖ添加物質を処理した表１の基本培養培地含有培養組成物において１４日間培養されたＣＤ４－ＰＢＭＣ細胞に対してＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｃｅｌｌｓｏｒｔｉｎｇ）分析を行い、総Ｔ細胞数（ＣＤ３＋ＣＤ１９－細胞）を定量化したグラフである。

【0028】

【図18】本発明のＧＩ－１０１、又はｈＣＤ８０－Ｆｃ及びＦｃ－ＩＬ２ｖ添加物質を処理した表１の基本培養培地含有培養組成物において１４日間培養されたＣＤ４－ＰＢＭＣ細胞に対してＦＡＣＳ分析を行い、ＣＤ８Ｔ細胞数を定量化したグラフである。

【0029】

【図19】本発明のＧＩ－１０１、又はｈＣＤ８０－Ｆｃ及びＦｃ－ＩＬ２ｖ添加物質を処理した表１の基本培養培地含有培養組成物において１４日間培養されたＣＤ４－ＰＢＭＣ細胞に対してＦＡＣＳ分析を行い、ＣＤ２５＋記憶Ｔ細胞数を定量化したグラフである。

【0030】

【図20】本発明のＧＩ－１０１、又はｈＣＤ８０－Ｆｃ及びＦｃ－ＩＬ２ｖ添加物質を処理した表１の基本培養培地含有培養組成物において１４日間培養されたＣＤ４－ＰＢＭＣ細胞に対してＦＡＣＳ分析を行い、中心記憶Ｔ細胞数を定量化したグラフである。

【0031】

【図21】表２の基本培養培地含有培養組成物における本発明に係るＧＩ－１０１、又はｈＣＤ８０－Ｆｃ及びＦｃ－ＩＬ２ｖ添加物質処理によるＣＤ４－ＰＢＭＣ細胞の細胞表面のフローサイトメトリー結果を示した図である。

【0032】

【図22】本発明のＧＩ－１０１、又はｈＣＤ８０－Ｆｃ及びＦｃ－ＩＬ２ｖ添加物質を処理した表２の基本培養培地含有培養組成物において１４日間培養されたＣＤ４－ＰＢＭＣ細胞に対してＦＡＣＳ分析を行い、総Ｔ細胞数（ＣＤ３＋ＣＤ１９－細胞）を定量化したグラフである。

【0033】

【図23】本発明のＧＩ－１０１、又はｈＣＤ８０－Ｆｃ及びＦｃ－ＩＬ２ｖ添加物質を処理した表２の基本培養培地含有培養組成物において１４日間培養されたＣＤ４－ＰＢＭＣ細胞に対してＦＡＣＳ分析を行い、ＣＤ８Ｔ細胞数を定量化したグラフである。

【0034】

【図24】本発明のＧＩ－１０１、又はｈＣＤ８０－Ｆｃ及びＦｃ－ＩＬ２ｖ添加物質を処理した表２の基本培養培地含有培養組成物において１４日間培養されたＣＤ４－ＰＢＭＣ細胞に対してＦＡＣＳ分析を行い、ＣＤ２５＋記憶Ｔ細胞数を定量化したグラフである。

【0035】

【図25】本発明のＧＩ－１０１、又はｈＣＤ８０－Ｆｃ及びＦｃ－ＩＬ２ｖ添加物質を処理した表２の基本培養培地含有培養組成物において１４日間培養されたＣＤ４－ＰＢＭＣ細胞に対してＦＡＣＳ分析を行い、中心記憶Ｔ細胞数を定量化したグラフである。

【0036】

【図26】表１の基本培養培地含有培養組成物における本発明に係るＧＩ－１０１、又はｈＣＤ８０－Ｆｃ及びＦｃ－ＩＬ２ｖ添加物質処理によるＣＤ４－ＰＢＭＣ細胞の細胞内部のフローサイトメトリー結果を示した図である。

【0037】

【図27】本発明のＧＩ－１０１、又はｈＣＤ８０－Ｆｃ及びＦｃ－ＩＬ２ｖ添加物質を処理した表１の基本培養培地含有培養組成物において１４日間培養されたＣＤ４－ＰＢＭＣ細胞に対してＦＡＣＳ分析を行い、グランザイムＢ＋ＣＴＬ（ＣｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙＴＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）細胞数を定量化したグラフである。

【0038】

【図28】本発明のＧＩ－１０１、又はｈＣＤ８０－Ｆｃ及びＦｃ－ＩＬ２ｖ添加物質を処理した表１の基本培養培地含有培養組成物において１４日間培養されたＣＤ４－ＰＢＭＣ細胞に対してＦＡＣＳ分析を行い、ＩＦＮ－γ ＣＴＬ細胞数を定量化したグラフである。

【0039】

【図29】本発明のＧＩ－１０１、又はｈＣＤ８０－Ｆｃ及びＦｃ－ＩＬ２ｖ添加物質を処理した表１の基本培養培地含有培養組成物において１４日間培養されたＣＤ４－ＰＢＭＣ細胞に対してＦＡＣＳ分析を行い、パーフォリン＋ＣＴＬ細胞数を定量化したグラフである。

【0040】

【図30】表２の基本培養培地含有培養組成物における本発明に係るＧＩ－１０１、又はｈＣＤ８０－Ｆｃ及びＦｃ－ＩＬ２ｖ添加物質処理によるＣＤ４－ＰＢＭＣ細胞の細胞内部のフローサイトメトリー結果を示した図である。

【0041】

【図31】本発明のＧＩ－１０１、又はｈＣＤ８０－Ｆｃ及びＦｃ－ＩＬ２ｖ添加物質を処理した表２の基本培養培地含有培養組成物において１４日間培養されたＣＤ４－ＰＢＭＣ細胞に対してＦＡＣＳ分析を行い、グランザイムＢ＋ＣＴＬ細胞数を定量化したグラフである。

【0042】

【図32】本発明のＧＩ－１０１、又はｈＣＤ８０－Ｆｃ及びＦｃ－ＩＬ２ｖ添加物質を処理した表２の基本培養培地含有培養組成物において１４日間培養されたＣＤ４－ＰＢＭＣ細胞に対してＦＡＣＳ分析を行い、ＩＦＮ－γ ＣＴＬ細胞数を定量化したグラフである。

【0043】

【図33】本発明のＧＩ－１０１、又はｈＣＤ８０－Ｆｃ及びＦｃ－ＩＬ２ｖ添加物質を処理した表２の基本培養培地含有培養組成物において１４日間培養されたＣＤ４－ＰＢＭＣ細胞に対してＦＡＣＳ分析を行い、パーフォリン＋ＣＴＬ細胞数を定量化したグラフである。

【0044】

【図34】表１の基本培養培地含有培養組成物における培養時のＣＤ８＋ＰＢＭＣの総細胞数を示した図である。

【0045】

【図35】表１の基本培養培地含有培養組成物における培養時のＣＤ８＋ＰＢＭＣ細胞の生存率を示した図である。

【0046】

【図36】表１の基本培養培地含有培養組成物における本発明に係るＧＩ－１０１、又はｈＣＤ８０－Ｆｃ及びＦｃ－ＩＬ２ｖ添加物質処理によるＣＤ８＋ＰＢＭＣ細胞の細胞表面のフローサイトメトリー結果を示した図である。

【0047】

【図37】本発明のＧＩ－１０１、又はｈＣＤ８０－Ｆｃ及びＦｃ－ＩＬ２ｖ添加物質を処理した表１の基本培養培地含有培養組成物において１２日間培養されたＣＤ８＋ＰＢＭＣ細胞に対してＦＡＣＳ分析を行い、総Ｔ細胞数（ＣＤ３＋ＣＤ１９－細胞）を定量化したグラフである。

【0048】

【図38】本発明のＧＩ－１０１、又はｈＣＤ８０－Ｆｃ及びＦｃ－ＩＬ２ｖ添加物質を処理した表１の基本培養培地含有培養組成物において１２日間培養されたＣＤ８＋ＰＢＭＣ細胞に対してＦＡＣＳ分析を行い、ＣＤ８Ｔ細胞数を定量化したグラフである。

【0049】

【図39】本発明のＧＩ－１０１、又はｈＣＤ８０－Ｆｃ及びＦｃ－ＩＬ２ｖ添加物質を処理した表１の基本培養培地含有培養組成物において１２日間培養されたＣＤ８＋ＰＢＭＣ細胞に対してＦＡＣＳ分析を行い、ＣＤ２５＋記憶Ｔ細胞数を定量化したグラフである。

【0050】

【図40】本発明のＧＩ－１０１、又はｈＣＤ８０－Ｆｃ及びＦｃ－ＩＬ２ｖ添加物質を処理した表１の基本培養培地含有培養組成物において１２日間培養されたＣＤ８＋ＰＢＭＣ細胞に対してＦＡＣＳ分析を行い、中心記憶Ｔ細胞数を定量化したグラフである。

【0051】

【図41】表１の基本培養培地含有培養組成物における本発明に係るＧＩ－１０１、又はｈＣＤ８０－Ｆｃ及びＦｃ－ＩＬ２ｖ添加物質処理によるＣＤ８＋ＰＢＭＣ細胞の細胞内部のフローサイトメトリー結果を示した図である。

【0052】

【図42】本発明のＧＩ－１０１、又はｈＣＤ８０－Ｆｃ及びＦｃ－ＩＬ２ｖ添加物質を処理した表１の基本培養培地含有培養組成物において１２日間培養されたＣＤ８＋ＰＢＭＣ細胞に対してＦＡＣＳ分析を行い、グランザイムＢ＋ＣＴＬ細胞数を定量化したグラフである。

【0053】

【図43】本発明のＧＩ－１０１、又はｈＣＤ８０－Ｆｃ及びＦｃ－ＩＬ２ｖ添加物質を処理した表１の基本培養培地含有培養組成物において１２日間培養されたＣＤ８＋ＰＢＭＣ細胞に対してＦＡＣＳ分析を行い、ＩＦＮ－γ ＣＴＬ細胞数を定量化したグラフである。

【0054】

【図44】本発明のＧＩ－１０１、又はｈＣＤ８０－Ｆｃ及びＦｃ－ＩＬ２ｖ添加物質を処理した表１の基本培養培地含有培養組成物において１２日間培養されたＣＤ８＋ＰＢＭＣ細胞に対してＦＡＣＳ分析を行い、パーフォリン＋ＣＴＬ細胞数を定量化したグラフである。

【0055】

【図45】本発明のＧＩ－１０１添加物質を処理した表１の基本培養培地含有培養組成物において培養されたＨｅｒ２タンパク質認識Ｔ細胞のＢＴ－４７４（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－２０^ＴＭ）癌細胞に対する死滅効果を分析した結果を示した図である。

【0056】

【図46】本発明のＧＩ－１０１添加物質を処理した表１の基本培養培地含有培養組成物において培養されたＨｅｒ２タンパク質認識Ｔ細胞のＣＡＭＡ－１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－２１^ＴＭ）癌細胞に対する死滅効果を分析した結果を示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0057】

Ｔ細胞増殖用組成物及び培地

【0058】

本発明の一側面は、ＩＬ－２タンパク質又はその変異体及びＣＤ８０タンパク質又はその断片を含む融合タンパク質を含有するＴ細胞増殖用組成物を提供する。また、前記融合タンパク質二量体を有効成分として含むＴ細胞増殖用又は培養用培地を提供する。

【0059】

前記Ｔ細胞増殖用培地は、Ｔ細胞培養用培地に前記ＩＬ－２タンパク質又はその変異体及びＣＤ８０タンパク質又はその断片を含む融合タンパク質二量体が添加された培地であり得る。このとき、前記Ｔ細胞培養用培地は、アミノ酸（ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ）、糖類（ｓｕｇａｒｓ）、無機塩（ｉｎｏｒｇａｎｉｃｓａｌｔｓ）及びビタミンからなる群から選ばれるいずれか一つを含むことができる。好ましくは、前記Ｔ細胞培養用培地は、アミノ酸、糖類、無機塩及びビタミンを全て含むものであり得る。また、前記培地は、ＦＢＳ（ＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ）、ＨＥＰＥＳ（ＨｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅＥｔｈａｎｅＳｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ）、タンパク質、炭水化物、メルカプトエタノール、成長因子をさらに含むことができる。

【0060】

本明細書で使用された用語である「細胞培養用培地」は、細胞を培養するために使用された培地を意味し、具体的にＴ細胞、より具体的にＣＤ８＋細胞を培養するための培地を意味する。試験管内で（ｉｎｖｉｔｒｏ）細胞の成長及び生存のために細胞が必要とする成分を含有したり、細胞の成長及び生存を促進する成分を含有する。具体的に、前記成分は、ビタミン、必須又は非必須アミノ酸、及び微量元素であり得る。

【0061】

本発明に係る前記細胞培養培地は、アミノ酸成分、ビタミン成分、無機塩成分、その他の成分及び精製水で構成され、

【0062】

ａ）前記アミノ酸成分は、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－バリン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－セリン、Ｌ－システイン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－リシン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－チロシン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－プロリン、β－アラニン、γ－アミノ酪酸、オルニチン、シトルリン、ホモセリン、トリヨードチロニン、チロキシン及びジオキシフェニルアラニンで構成された群から選ばれる少なくともいずれか一つのアミノ酸又はその組み合わせで、好ましくは、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－システイン、Ｌ－グルタミン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－リシン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－トレオニン及びＬ－バリンで構成された群から選ばれる少なくともいずれか一つのアミノ酸又はその組み合わせであり、

【0063】

ｂ）前記ビタミン成分は、ビオチン、Ｄ－パントテン酸カルシウム、葉酸、ナイアシンアミド、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、チアミン塩酸塩、ビタミンＢ１２、塩化コリン、ｉ－イノシトール及びアスコルビン酸で構成された群から選ばれる少なくともいずれか一つのビタミン又はその組み合わせで、好ましくは、ｉ－イノシトール、チアミン塩酸塩、ナイアシンアミド及びピリドキシン塩酸塩で構成された群から選ばれる少なくとも一つ以上のビタミン又はその組み合わせであり、

【0064】

ｃ）前記無機塩成分は、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）（無水）、硫酸銅五水和物（ＣｕＳＯ_４－５Ｈ_２Ｏ）、硫酸第二鉄七水和物（ＦｅＳＯ_４－７Ｈ_２Ｏ）、塩化マグネシウム（無水）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）（無水）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）、リン酸水素ナトリウム一水和物（ＮａＨ_２ＰＯ_４－Ｈ_２Ｏ）、硫酸亜鉛七水和物（ＺｎＳＯ_４－７Ｈ_２Ｏ）、硝酸第二鉄九水和物（Ｆｅ（ＮＯ_３）_３・９Ｈ_２Ｏ）及び炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）で構成された群から選ばれる少なくともいずれか一つの無機塩又はその組み合わせで、好ましくは、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ_３）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）（無水）及びリン酸水素ナトリウム一水和物（ＮａＨ_２ＰＯ_４－Ｈ_２Ｏ）で構成された群から選ばれる少なくともいずれか一つの無機塩又はその組み合わせであり、

【0065】

ｄ）前記その他の成分は、Ｄ－グルコース（デキストロース）、ピルビン酸ナトリウム、ヒポキサンチンＮａ、チミジン、リノール酸、リポ酸、アデノシン、シチジン、グアノシン、ウリジン、２'－デオキシアデノシン、２'－デオキシシチジンＨＣｌ及び２'－デオキシグアノシンで構成された群から選ばれる少なくともいずれか一つのその他の成分又はその組み合わせで、好ましくは、ピルビン酸ナトリウムであり得る。

【0066】

ｅ）精製水は、前記アミノ酸、ビタミン、無機塩及びその他の成分を溶解させるために使用され、１次以上の蒸留を経て取得されたり、フィルターを通じて精製された水であり得る。

【0067】

また、本発明に係る前記細胞培養培地に成長因子又はサイトカインをさらに含むことができる。前記成長因子として、ＩＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ又はＰＤＧＦなどを単独で又は２種以上使用できるが、これに特に制限するのではない。前記サイトカインとして、ＩＬ－１、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１０又はＩＬ－１７などを単独で又は２種以上使用できるが、これに特に制限するのではない。

【0068】

本明細書で使用した用語である「Ｔ細胞」は、抗原特異的な適応免疫を主管するリンパ球の一つを意味する。Ｔ細胞は、未だに抗原に出会っていない未接触Ｔ細胞（ｎａｉｖｅＴｃｅｌｌ）と、抗原に出会って成熟したＴ細胞、及び記憶Ｔ細胞に分類される。このとき、前記成熟した効果Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞、細胞毒性Ｔ細胞及び自然殺傷Ｔ細胞を含む。好ましくは、前記Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞であり得る。

【0069】

本明細書で使用した用語である「ペルパーＴ細胞（ｈｅｌｐｅｒＴｃｅｌｌ、又はＴｈｃｅｌｌ）」は、他の白血球の分化及び活性化を調節することによって体液性免疫を促進する細胞を言う。細胞表面にＣＤ４タンパク質を有しているので、ＣＤ４＋Ｔ細胞とも言う。ペルパーＴ細胞は、細部機能によって再びＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔｒｅｇに分類され得る。Ｔｈ１細胞は、インターフェロンガンマ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ、ＩＦＮ－γ）と腫瘍怪死因子ベータ（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒｂｅｔａ、ＴＮＦ－β）を分泌することによって大食細胞の内部でエンドソームとリソソームとが融合し、エンドリソソームを形成するように誘導する。一方、Ｔｈ２細胞は、多くの種類のインターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ、ＩＬ）を分泌し、Ｂ細胞を形質細胞に分化させる。Ｔｈ１７細胞は、インターロイキン－１７（ＩＬ－１７）を分泌し、好中球が集まるようにする。

【0070】

本明細書で使用した用語である「調節Ｔ細胞（ＲｅｇｕｌａｔｏｒｙＴｃｅｌｌ、Ｔｒｅｇ）」は、自然調節Ｔ細胞（ｎａｔｕｒａｌｒｅｇｕｌａｔｏｒｙＴｃｅｌｌｓ、ｎＴｒｅｇ）又は誘導調節Ｔ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄｒｅｇｕｌａｔｏｒｙＴｃｅｌｌｓ、ｉＴｒｅｇ）を含む。本明細書において、調節Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗ／－Ｔ細胞又はＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞を含む。前記調節Ｔ細胞は、免疫反応を抑制することによって免疫の恒常性を維持し、自家免疫反応などを遮断する。

【0071】

本明細書で使用した用語である「細胞毒性Ｔ細胞」は、グランザイム（ｇｒａｎｚｙｍｅ）やパーフォリン（ｐｅｒｆｏｒｉｎ）などの細胞毒性物質を分泌し、ウイルスに感染した細胞や腫瘍細胞などを殺す細胞である。細胞表面にＣＤ８タンパク質を有しているので、ＣＤ８Ｔ細胞とも言う。ペルパーＴ細胞とは反対に、細胞性免疫を媒介してウイルス及び癌細胞を除去する。

【0072】

本明細書で使用した用語である「自然殺傷Ｔ細胞」は、ペルパーＴ細胞及び細胞毒性Ｔ細胞に比べて少ない比率で分布する効果Ｔ細胞の一つを意味する。自然殺傷Ｔ細胞は、細胞表面にＴ細胞などのＴ細胞抗原受容体（Ｔｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＣＲ）を有しているが、ＮＫ１．１などの自然殺害細胞特異的な分子も有している。自然殺傷Ｔ細胞は、ガンマインターフェロン、インターロイキン－４などを分泌し、免疫反応を調節する役割をする。

【0073】

本明細書で使用した用語である「記憶Ｔ細胞」は、抗原を認知したＴ細胞が分化及び選別過程を経た後、長期間生存している途中で、後で抗原が再び侵入したときに速く活性化され、効果Ｔ細胞の機能を行える潜在的能力を有する細胞を意味する。ｎａｉｖｅＴ細胞が抗原に出会って活性化された状態の細胞、又は効果Ｔ細胞がインターロイキン－７とインターロイキン－１５の影響を受け、長期生存可能な記憶Ｔ細胞に分化するようになる。

【0074】

このとき、前記ＩＬ－２タンパク質又はその変異体及びＣＤ８０タンパク質又はその断片を含む融合タンパク質二量体は、培養培地内に１ｎＭ乃至２，０００ｎＭで含まれ得る。また、前記二量体は、１ｎＭ乃至１，０００ｎＭ、又は１ｎＭ乃至５００ｎＭで含まれ得る。また、前記二量体は、２ｎＭ乃至３００ｎＭ、５ｎＭ乃至１００ｎＭ、１０ｎＭ乃至８０ｎＭ、２０ｎＭ乃至７０ｎＭ、又は４０ｎＭ乃至５０ｎＭで含まれ得る。具体的に、前記融合タンパク質二量体は、培地内に１ｎＭ、３．２ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭで含まれ得る。

【0075】

ＩＬ－２タンパク質又はその変異体及びＣＤ８０タンパク質又はその断片を含む融合タンパク質二量体

【0076】

本明細書で使用する用語である「ＩＬ－２」又は「インターロイキン－２」は、別に断りのない限り、哺乳動物、例えば、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）を含めて任意の脊椎動物供給源から取得した任意の野生型ＩＬ－２を意味する。前記ＩＬ－２は、動物細胞から取得されたものであってもよいが、ＩＬ－２を生産できる組換え細胞から取得されたものも含む。また、前記ＩＬ－２は、野生型ＩＬ－２又はその変異体であり得る。

【0077】

本明細書では、ＩＬ－２或いはその変異体を総称して「ＩＬ－２タンパク質」或いは「ＩＬ－２ポリペプチド」の用語と表現することもある。ＩＬ－２、ＩＬ－２タンパク質、ＩＬ－２ポリペプチド、及びＩＬ－２変異体は、例えば、ＩＬ－２受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に特異的に結合する。この特異的な結合は、当業者に知られている方法によって確認することができる。

【0078】

前記ＩＬ－２の一具体例は、配列番号３５又は配列番号３６のアミノ酸配列を有することができる。また、このとき、前記ＩＬ－２は、成熟した形態であり得る。具体的に、前記成熟したＩＬ－２は、信号配列を含まないものであってよく、配列番号１０のアミノ酸配列を有するものであってよい。このとき、前記ＩＬ－２は、野生型ＩＬ－２のＮ末端又はＣ末端の一部が欠失した（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）断片を含む概念で利用され得る。

【0079】

また、前記ＩＬ－２の断片は、配列番号３５又は配列番号３６のアミノ酸配列を有するタンパク質のＮ末端から連続して１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個又は２５個のアミノ酸が欠失した形態であり得る。また、前記ＩＬ－２の断片は、配列番号３５又は配列番号３６のアミノ酸配列を有するタンパク質のＣ末端から連続して１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個又は２５個のアミノ酸が欠失した形態であり得る。

【0080】

本明細書で使用する用語である「ＩＬ－２変異体」は、全長（ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ）ＩＬ－２又は上述したＩＬ－２断片のアミノ酸の一部が置換された形態を意味する。すなわち、ＩＬ－２変異体は、野生型ＩＬ－２又はその断片と異なるアミノ酸配列を有することができる。しかし、前記ＩＬ－２変異体は、野生型ＩＬ－２と同等又は類似の活性を有することができる。ここで、「ＩＬ－２活性」は、例えば、ＩＬ－２受容体に特異的に結合することを意味でき、この特異的結合は、当業者に知られている方法によって測定できる。

【0081】

具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、野生型ＩＬ－２のアミノ酸の一部が置換されたものであり得る。アミノ酸置換によるＩＬ－２変異体の一具体例としては、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目、４５番目、６１番目及び７２番目のアミノ酸のうち少なくとも一つが置換されたものであり得る。

【0082】

具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目、４５番目、６１番目又は７２番目のアミノ酸のうち少なくともいずれか一つが別のアミノ酸に置換されたものであり得る。その他にも、ＩＬ－２が配列番号３５のアミノ酸配列のＮ末端の一部分が欠失した形態である場合、配列番号１０のアミノ酸配列において相補的に対応する位置のアミノ酸が別のアミノ酸に置換され得る。例えば、ＩＬ－２が配列番号３５のアミノ酸配列を有する場合に、前記ＩＬ－２の変異体は、配列番号３５のアミノ酸配列において５８番目、６２番目、６５番目、８１番目又は９２番目のアミノ酸のうち少なくともいずれか一つが別のアミノ酸に置換されたものであり得る。それらは、それぞれ、配列番号１０のアミノ酸配列の３８番目、４２番目、４５番目、６１番目及び７２番目のアミノ酸残基に該当する。一具体例によると、ＩＬ－２活性が維持される限り、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、或いは１０個のアミノ酸が置換され得る。更に他の具体例によると、１個から５個までのアミノ酸が置換され得る。

【0083】

一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、２箇所のアミノ酸が置換された形態であり得る。具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目及び４２番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目及び４５番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目及び６１番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４２番目及び４５番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４２番目及び６１番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４２番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４５番目及び６１番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４５番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において６１番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。

【0084】

さらに、前記ＩＬ－２変異体は、３箇所のアミノ酸が置換された形態であり得る。具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目及び４５番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目及び６１番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４５番目及び６１番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４５番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、６１番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４２番目、４５番目及び６１番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４２番目、４５番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４５番目、６１番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。

【0085】

また、前記ＩＬ－２変異体は、４箇所のアミノ酸が置換された形態であり得る。具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目、４５番目及び６１番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目、４５番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４５番目、６１番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目、６１番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において４２番目、４５番目、６１番目及び７２番目のアミノ酸が置換されたものであり得る。

【0086】

さらに、前記ＩＬ－２変異体は、５箇所のアミノ酸が置換された形態であり得る。具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目、４２番目、４５番目、６１番目及び７２番目のアミノ酸がいずれも別のアミノ酸に置換されたものであり得る。

【0087】

このとき、前記置換によって導入される「別のアミノ酸」は、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）、アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）、アスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃａｃｉｄ）、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ）、グルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）、イソロイシン（ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）、ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ）、リシン（ｌｙｓｉｎｅ）、メチオニン（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ）、トレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、トリプトファン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）、チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）及びバリン（ｖａｌｉｎｅ）からなる群から選ばれるいずれか一つであり得る。ただし、前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換において、前記配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目はアルギニンに置換できなく、４２番目はフェニルアラニンに置換できなく、４５番目はチロシンに置換できなく、６１番目はグルタミン酸に置換できなく、７２番目はロイシンに置換できない。

【0088】

前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換において、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目のアミノ酸であるアルギニンは、アルギニン以外の別のアミノ酸に置換され得る。好ましくは、前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換において、配列番号１０のアミノ酸配列において３８番目のアミノ酸であるアルギニンは、アラニンに置換（Ｒ３８Ａ）され得る。

【0089】

前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換において、配列番号１０のアミノ酸配列において４２番目のアミノ酸であるフェニルアラニンは、フェニルアラニン以外の別のアミノ酸に置換され得る。好ましくは、前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換において、配列番号１０のアミノ酸配列において４２番目のアミノ酸であるフェニルアラニンは、アラニンに置換（Ｆ４２Ａ）され得る。

【0090】

前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換において、配列番号１０のアミノ酸配列において４５番目のアミノ酸であるチロシンは、チロシン以外の別のアミノ酸に置換され得る。好ましくは、前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換において、配列番号１０のアミノ酸配列において４５番目のアミノ酸であるチロシンは、アラニンに置換（Ｙ４５Ａ）され得る。

【0091】

前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換において、配列番号１０のアミノ酸配列において６１番目のアミノ酸であるグルタミン酸は、グルタミン酸以外の別のアミノ酸に置換され得る。好ましくは、前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換において、配列番号１０のアミノ酸配列において６１番目のアミノ酸であるグルタミン酸は、アルギニンに置換（Ｅ６１Ａ）され得る。

【0092】

前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換において、配列番号１０のアミノ酸配列において７２番目のアミノ酸であるロイシンは、ロイシン以外の別のアミノ酸に置換され得る。好ましくは、前記ＩＬ－２変異体のアミノ酸置換において、配列番号１０のアミノ酸配列において７２番目のアミノ酸であるロイシンは、グリシンに置換（Ｌ７２Ｇ）され得る。

【0093】

具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、配列番号１０のアミノ酸配列においてＲ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇからなる群から選ばれる少なくともいずれか一つの置換が起こったものであり得る。

【0094】

具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇからなる群から選ばれる位置において２箇所、３箇所、４箇所又は５箇所の位置でアミノ酸置換が起こり得る。

【0095】

また、前記ＩＬ－２変異体は、２箇所のアミノ酸が置換された形態であり得る。具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ及びＦ４２Ａに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ及びＹ４５Ａに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ及びＥ６１Ｒに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ及びＬ７２Ｇに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２Ａ及びＹ４５Ａに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２Ａ及びＥ６１Ｒに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２Ａ及びＬ７２Ｇに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇに置換が起こったものであり得る。

【0096】

さらに、前記ＩＬ－２変異体は、３箇所のアミノ酸が置換された形態であり得る。具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ及びＹ４５Ａに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ及びＥ６１Ｒに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ及びＬ７２Ｇに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＥ６１Ｒに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２Ａ、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇに置換が起こったものであり得る。

【0097】

また、前記ＩＬ－２変異体は、４箇所のアミノ酸が置換された形態であり得る。具体的に、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＥ６１Ｒに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＬ７２Ｇに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇに置換が起こったものであり得る。また、一具体例として、前記ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇに置換が起こったものであり得る。

【0098】

さらに、前記ＩＬ－２変異体は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ及びＬ７２Ｇに置換が起こったものであり得る。

【0099】

好ましくは、前記ＩＬ－２変異体の一具体例は、配列番号１０のアミノ酸配列において下記の（ａ）～（ｄ）組み合わせから選ばれるいずれか一つの組み合わせの置換が起こったものであり得る：

【0100】

（ａ）Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ

【0101】

（ｂ）Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ

【0102】

（ｃ）Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｅ６１Ｒ

【0103】

（ｄ）Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｌ７２Ｇ

【0104】

このとき、ＩＬ－２が配列番号３５のアミノ酸配列を有する場合に、配列番号１０と相補的に対応する位置にアミノ酸置換を有することができる。また、ＩＬ－２が配列番号３５のアミノ酸配列の断片である場合にも、配列番号１０と相補的に対応する位置のアミノ酸が置換され得る。

【0105】

具体的に、前記ＩＬ－２の変異体は、配列番号６、２２、２３又は２４のアミノ酸配列を有するものであり得る。

【0106】

また、前記ＩＬ－２変異体は、生体内で低い毒性を有することを特徴とするものであり得る。このとき、前記「生体内で低い毒性」とは、ＩＬ－２がＩＬ－２受容体のアルファチェーン（ＩＬ－２Ｒα）と結合して誘発される副作用であり得る。前記ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαとの結合による副作用を改善させるために様々なＩＬ－２変異体が開発されており、このようなＩＬ－２変異体としては、米国特許第５，２２９，１０９号及び大韓民国特許第１０－１６６７０９６号に開示されたものを使用することができる。特に、本出願で記述されるＩＬ－２の変異体は、ＩＬ－２受容体のアルファチェーン（ＩＬ－２Ｒα）との結合力が低いので、生体内毒性が野生型ＩＬ－２に比べて低い。

【0107】

本明細書で使用する用語である「ＣＤ８０」は、「Ｂ７－１」とも呼ばれ、樹状細胞、活性化されたＢ細胞及び単核球に存在する膜タンパク質である。ＣＤ８０は、Ｔ細胞の活性化と生存に必須な共刺激信号を提供する。ＣＤ８０は、Ｔ細胞表面に存在する異なる２つのタンパク質であるＣＤ２８及びＣＴＬＡ－４に対するリガンドとして知られている。ＣＤ８０は、２８８個のアミノ酸で構成されており、具体的に、配列番号１１のアミノ酸配列を有するものであり得る。また、本明細書において、「ＣＤ８０タンパク質」は、全長ＣＤ８０又はＣＤ８０断片を意味する。

【0108】

本明細書で使用する用語である「ＣＤ８０断片」とは、ＣＤ８０の切断型を意味する。また、前記ＣＤ８０断片は、ＣＤ８０の細胞外ドメインであり得る。ＣＤ８０断片の一具体例は、ＣＤ８０の信号配列であるＮ末端から１番目乃至３４番目のアミノ酸が除外されたものであり得る。具体的に、前記ＣＤ８０断片の一具体例は、配列番号１１の３５番目乃至２８８番目のアミノ酸で構成されたタンパク質であり得る。また、前記ＣＤ８０断片の一具体例は、配列番号１１の３５番目乃至２４２番目のアミノ酸で構成されたタンパク質であり得る。また、前記ＣＤ８０断片の一具体例は、配列番号１１の３５番目乃至２３２番目のアミノ酸で構成されたタンパク質であり得る。また、前記ＣＤ８０断片の一具体例は、配列番号１１の３５番目乃至１３９番目のアミノ酸で構成されたタンパク質であり得る。また、前記ＣＤ８０断片の一具体例は、配列番号１１の１４２番目乃至２４２番目のアミノ酸で構成されたタンパク質であり得る。前記一実施例として、ＣＤ８０断片は、配列番号２のアミノ酸配列を有するものであり得る。

【0109】

また、前記ＩＬ－２タンパク質及び前記ＣＤ８０タンパク質は、リンカー或いはキャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）によって結合したものであり得る。具体的に、前記ＩＬ－２又はその変異体及び前記ＣＤ８０（Ｂ７－１）又はその断片は、リンカー或いはキャリアによって結合したものであり得る。本明細書において、リンカーとキャリアは同じ意味で使用される場合もある。

【0110】

前記リンカーは、２つのタンパク質を連結する。リンカーの一具体例としては、１個乃至５０個のアミノ酸、アルブミン又はその断片、又は免疫グロブリンのＦｃドメインなどを含むことができる。このとき、前記免疫グロブリンのＦｃドメインは、免疫グロブリンの重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）を含み、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域及び軽鎖定常領域１（ＣＨ１）を含まないタンパク質を意味する。前記免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭであってよく、好ましくはＩｇＧ４であってよい。このとき、野生型免疫グロブリンＧ４のＦｃドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を有するものであり得る。

【0111】

また、前記免疫グロブリンのＦｃドメインは、野生型Ｆｃドメインの他、Ｆｃドメイン変異体であり得る。また、本明細書で使用する用語である「Ｆｃドメイン変異体」は、野生型Ｆｃドメインの糖鎖形態（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｐａｔｔｅｒｎ）と異なるか、野生型Ｆｃドメインに比べて増加した糖鎖、野生型Ｆｃドメインに比べて減少した糖鎖、又は糖鎖が除去された（ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）形態であり得る。また、無糖鎖（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）Ｆｃドメインも含まれる。Ｆｃドメイン或いは変異体は、培養条件或いはホストの遺伝子操作によって含量が調節されたシアル酸（ｓｉａｌｉｃａｃｉｄ）、フコシル化（ｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を有させたものであり得る。

【0112】

また、化学的方法、酵素的方法及び微生物を使用した遺伝工学的エンジニアリング方法などのように通常の方法で免疫グロブリンのＦｃドメインの糖鎖を変形させることができる。また、前記Ｆｃドメイン変異体は、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭのＦｃ領域が混合された形態であり得る。また、前記Ｆｃドメイン変異体は、前記Ｆｃドメインの一部のアミノ酸が別のアミノ酸に置換された形態であり得る。前記Ｆｃドメイン変異体の一具体例は、配列番号１２のアミノ酸配列を有するものであり得る。

【0113】

融合タンパク質は、Ｆｃドメインをリンカー（或いは、キャリア）にしてそのＮ末端及びＣ末端にそれぞれＣＤ８０及びＩＬ－２タンパク質が連結されるか或いはＩＬ－２及びＣＤ８０が連結された構造を有することができる（図１）。ＦｃドメインのＮ末端或いはＣ末端とＣＤ８０或いはＩＬ－２との連結は、任意にリンカーペプチドによってなされ得る。

【0114】

具体的に、前記融合タンパク質は、下記構造式（Ｉ）又は（ＩＩ）からなるものであり得る：

【0115】

Ｎ’－Ｘ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｙ－Ｃ’（Ｉ）

【0116】

Ｎ’－Ｙ－［リンカー（１）］ｎ－Ｆｃドメイン－［リンカー（２）］ｍ－Ｘ－Ｃ’（ＩＩ）

【0117】

このとき、前記構造式（Ｉ）及び（ＩＩ）において、

【0118】

前記Ｎ’は、融合タンパク質のＮ末端であり、

【0119】

前記Ｃ’は、融合タンパク質のＣ末端であり、

【0120】

前記Ｘは、ＣＤ８０タンパク質であり、

【0121】

前記Ｙは、ＩＬ－２タンパク質であり、

【0122】

前記リンカー（１）及びリンカー（２）は、ペプチドリンカーであり、

【0123】

前記ｎ及びｍはそれぞれ独立に、Ｏ又は１である。

【0124】

好ましくは、前記融合タンパク質は、構造式（Ｉ）からなるものであり得る。前記ＩＬ－２タンパク質は、上述した通りである。また、前記ＣＤ８０タンパク質は、上述した通りである。一具体例によると、ＩＬ－２タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、１個から５個までのアミノ酸が置換されたＩＬ－２変異体であり得る。ＣＤ８０タンパク質は、野生型ＣＤ８０のＮ末端或いはＣ末端から連続して約３４個までのアミノ酸残基が欠失した（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）断片であり得る。或いは、ＣＤ８０タンパク質は、Ｔ細胞表面受容体（Ｔｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）ＣＴＬＡ－４とＣＤ２８に結合する活性を有する細胞外免疫グロブリン様ドメインであり得る。

【0125】

具体的に、前記融合タンパク質は、配列番号９、２６、２８又は３０のアミノ酸配列を有するものであり得る。更に他の具体例によると、融合タンパク質は、配列番号９、２６、２８又は３０のアミノ酸配列に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％或いは１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。このとき、同一性は、例えば、パーセント相同性、ＮＣＢＩ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＢｌａｓｔＮｓｏｆｔｗａｒｅのような相同性比較ソフトウェアによって決定され得る。

【0126】

前記ＣＤ８０タンパク質とＦｃドメインとの間にはペプチドリンカー（１）が含まれ得る。前記ペプチドリンカー（１）は、５個乃至８０個の連続したアミノ酸、２０個乃至６０個の連続したアミノ酸、又は２５個乃至５０個の連続したアミノ酸、又は３０個乃至４０個のアミノ酸からなり得る。一具体例として、ペプチドリンカー（１）は、３０個のアミノ酸からなり得る。また、ペプチドリンカー（１）は、少なくとも一つのシステインを含むことができ、具体的に、１個、２個又は３個のシステインを含むことができる。また、前記ペプチドリンカー（１）は、免疫グロブリンのヒンジに由来するものであり得る。一具体例では、前記ペプチドリンカー（１）が配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーであり得る。

【0127】

前記ペプチドリンカー（２）は、１個乃至５０個の連続したアミノ酸、又は３個乃至３０個の連続したアミノ酸、又は５個乃至１５個のアミノ酸からなり得る。一具体例として、前記ペプチドリンカー（２）は、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ここで、ｎは１乃至１０の整数）であり得る。このとき、（Ｇ４Ｓ）ｎにおいて、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であり得る。一実施例として、前記ペプチドリンカー（２）が配列番号５のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーであり得る。

【0128】

本発明の他の側面は、前記ＩＬ－２タンパク質及び前記ＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質が２個結合した二量体を提供する。前記ＩＬ－２又はその変異体及びＣＤ８０又はその断片を含む融合タンパク質は、上述した通りである。

【0129】

このとき、二量体を構成する融合タンパク質間の結合は、リンカー内に存在するシステインによって二硫化結合によってなされたものであり得るが、これに限定されるものではない。二量体を構成する融合タンパク質は、同一又は個別の融合タンパク質であり得る。好ましくは、前記二量体は、同型二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）であり得る。前記二量体を構成する融合タンパク質の一実施例は、配列番号９のアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。

【0130】

Ｔ細胞培養方法

【0131】

本発明は、他の側面において、前記Ｔ細胞増殖用培地組成物において細胞を培養する段階を含むＴ細胞培養方法に関する。本発明において、前記細胞は、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）であることを特徴とすることができる。また、前記細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＰＢＭＣから由来したＣＤ８＋Ｔ細胞であり得る。

【0132】

本発明において、前記Ｔ細胞培養用培地組成物は、０．１ｎＭ乃至１，０００，０００ｎＭの融合タンパク質二量体を含有することを特徴とすることができ、より具体的には、１ｎＭ乃至１，０００ｎＭ又は１．６ｎＭ乃至１００ｎＭの融合タンパク質を含有することができる。具体的に、前記融合タンパク質二量体は、Ｔ細胞培地内に１ｎＭ、１．６ｎＭ、２ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ又は５０ｎＭで含まれ得る。

【0133】

本発明の具体的な実施例では、１．６ｎＭの前記ＩＬ－２タンパク質又はその変異体及びＣＤ８０タンパク質又はその断片を含む融合タンパク質二量体又は５０ｎＭの前記ＩＬ－２タンパク質又はその変異体及びＣＤ８０タンパク質又はその断片を含む融合タンパク質二量体を含有する細胞培養用培地組成物を使用し、ＰＢＭＣを培養した。また、ＣＤ８＋Ｔ細胞を培養するときに１．６ｎＭの前記ＩＬ－２タンパク質又はその変異体及びＣＤ８０タンパク質又はその断片を含む融合タンパク質二量体が含有された細胞培養用培地組成物を使用した。

【0134】

本発明において、前記細胞を培養する段階は、７日乃至２１日間行うことを特徴とすることができる。より具体的には、前記細胞を培養する段階は、９日乃至１５日間行うことができる。

【0135】

本発明の具体的な実施例では、ＰＢＭＣを培養する段階を１４日間行った。本明細書で使用された用語である「ＰＢＭＣ」は、末梢血液単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）としてＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及び単核球を含む。

【0136】

本明細書で使用された用語である「ＣＤ４－ＰＢＭＣ」は、ＣＤ４（ｃｌｕｓｔｅｒｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ４）糖タンパク質を発現する免疫細胞を含まない末梢血液単核細胞であり、好ましくは、ＣＤ４＋ペルパーＴ細胞を含まない細胞を意味する。

【0137】

本明細書で使用された用語である「Ｔ細胞」は、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。

【0138】

本明細書で使用された用語である「ＣＤ８＋Ｔ細胞」は、細胞毒性Ｔ細胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｃｅｌｌ、ＣＤ８＋）又は記憶Ｔ細胞（ＭｅｍｏｒｙＴｃｅｌｌ）を含む。

【0139】

本明細書で使用された用語である「記憶Ｔ細胞（ＭｅｍｏｒｙＴｃｅｌｌ）」は、効果記憶Ｔ細胞（ＥｆｆｅｃｔｏｒＭｅｍｏｒｙＴｃｅｌｌ）、中心記憶Ｔ細胞（ｃｅｎｔｒａｌｍｅｍｏｒｙＴｃｅｌｌ）、組織居住記憶Ｔ細胞（Ｔｉｓｓｕｅ－ｒｅｓｉｄｅｎｔｍｅｍｏｒｙＴｃｅｌｌ）、末梢記憶Ｔ細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｍｅｍｏｒｙＴｃｅｌｌ）又はＣＤ２５＋記憶Ｔ細胞（ＣＤ２５＋ｍｅｍｏｒｙＴｃｅｌｌ）を含む。

【0140】

本発明の一実施例において、前記ＩＬ－２タンパク質又はその変異体及びＣＤ８０タンパク質又はその断片を含む融合タンパク質二量体を含有する培地組成物において培養する段階を含む培養方法によって培養されたＴ細胞は、Ｆｃ－ＩＬ２ｖ２、Ｆｃ－ＩＬ２ｖ３又はｒｈＩＬ－２を含有する培地組成物において培養されたＴ細胞と比較して細胞数及びＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞で分泌するＩＦＮ－γ分泌量が著しく増加したことを確認した。

【0141】

取得されたＴ細胞及びその用途

【0142】

本発明の更に他の側面において、前記培養方法によって取得されたＴ細胞を提供する。このとき、前記培養方法で取得されたＴ細胞、好ましくＣＤ８＋Ｔ細胞は、他の培養方法によって取得されたＣＤ８＋Ｔ細胞に比べて、グランザイムＢ、ＩＦＮ－γ及びパーフォリンの分泌量が増加することを確認した。よって、前記ＣＤ８＋Ｔ細胞の癌殺傷能が増加したことを確認した（図４５及び図４６）。

【0143】

本発明の更に他の側面において、上述した方法によって取得されたＴ細胞を有効成分として含む癌治療用医薬組成物を提供する。

【0144】

前記医薬組成物の投与量は、疾患の種類、疾患の重症度、組成物に含まれた有効成分及び他の成分の種類及び含量、剤形の種類、患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路、組成物の分泌率、治療期間、同時に使用される薬物を始めとした多様な因子によって調節され得る。

【0145】

また、前記医薬組成物は、当業界に公知となっている多様な方法で個体に投与され得る。前記投与経路は、投与方法、体液の体積、粘度などを考慮した上で、通常の技術者が適宜選択することができる。

【0146】

前記癌は、胃癌、肝癌、肺癌、大腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵癌、子宮頸癌、甲状腺癌、喉頭癌、急性骨髄性白血病、脳腫瘍、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、頭頸部癌、唾液腺癌及びリンパ腫からなる群から選ばれるいずれか一つであり得る。

【0147】

本発明の組成物は、薬剤学的に許容される担体及び／又は添加物などを含むことができる。例えば、滅菌水、生理食塩水、慣用の緩衝剤（リン酸、クエン酸、その他の有機酸など）、安定剤、塩、酸化防止剤、界面活性剤、懸濁剤、等張化剤、又は保存剤などを含むことができる。また、バイオポリマーなどの有機物、水酸燐灰石（ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ）などの無機物、具体的には、コラーゲンマトリックス、ポリ乳酸ポリマー又はコポリマー、ポリエチレングリコールポリマー又はコポリマー及びその化学的誘導体、そして、これらの混合組成物を利用できるが、これに限定されるのではない。前記安定剤としては、例えば、デキストラン４０、メチルセルロース、ゼラチン、亜硫酸ナトリウム、メタ硫酸ナトリウムなどを使用することができる。前記酸化防止剤としては、例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α－トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ－アスコルビン酸及びその塩、Ｌ－アスコルビン酸パルミチン酸、Ｌ－アスコルビン酸ステアリン酸、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピル又はエチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウムなどのキレート剤を使用することができる。前記懸濁剤は、例えば、メチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガカントゴム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートなどを使用することができる。前記等張化剤としては、例えば、Ｄ－マンニトール、ソルビトールなどを使用することができる。前記保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾールなどを使用することができる。

【0148】

取得されたＴ細胞を用いた治療方法

【0149】

本発明の更に他の側面において、前記Ｔ細胞を、癌を有している個体に投与する段階を含む癌治療方法を提供する。このとき、癌は上述した通りである。

【0150】

本発明の更に他の側面において、癌治療のための前記Ｔ細胞の用途を提供する。

【0151】

Ｔ細胞活性化組成物

【0152】

本発明の更に他の側面において、ＩＬ－２タンパク質又はその変異体及びＣＤ８０タンパク質又はその断片を含む融合タンパク質二量体を有効成分として含むＴ細胞の抗原認識効率増進用組成物を提供する。

【0153】

本発明の更に他の側面において、ＩＬ－２タンパク質又はその変異体及びＣＤ８０タンパク質又はその断片を含む融合タンパク質二量体を有効成分として含むＴ細胞癌殺傷強化増進用組成物を提供する。

【0154】

前記ＩＬ－２タンパク質又はその変異体及びＣＤ８０タンパク質又はその断片を含む融合タンパク質二量体は、上述した通りである。前記融合タンパク質二量体を含む組成物によってＴ細胞の活性が上昇的に誘導され、これによって、Ｔ細胞の標的抗原に対する認識効率が増進し、窮極的に、標的細胞、すなわち、癌細胞に対する細胞殺傷能が効果的に増進することによって抗癌免疫治療療法に適用され得る。

【0155】

癌抗原を用いたＴ細胞活性化方法

【0156】

本発明の更に他の側面において、ＩＬ－２タンパク質又はその変異体及びＣＤ８０タンパク質又はその断片を含む融合タンパク質二量体が存在する培地において、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）又はＴ細胞；及び癌抗原を同時に培養する段階を含むＣＤ８＋Ｔ細胞の体外活性化及び増殖方法を提供する。このとき、前記Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞であり、上述した通りである。

【0157】

本明細書で使用された用語である「癌抗原（ｃａｎｃｅｒａｎｔｉｇｅｎ）」は、癌細胞表面に提示されたり、癌細胞によって血液に分泌された癌細胞特異的なタンパク質を意味する。このような癌抗原は、特定癌の診断や抗癌治療のための抗癌ワクチンなどに利用されている。癌抗原としては、ＰＳＣＡ（ｐｒｏｓｔａｔｅｓｔｅｍｃｅｌｌａｎｔｉｇｅｎ）、ＨＥＲ－２（ｈｕｍａｎｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ２）、ＭＵＣ１（ｍｕｃｉｎ１）、ＣＡ１５－３（ｃａｎｃｅｒａｎｔｉｇｅｎ１５－３）、ＣＡ１９－９（ｃａｎｃｅｒａｎｔｉｇｅｎ１９－９）、ＣＡ２７－２９（ｃａｎｃｅｒａｎｔｉｇｅｎ２７－２９）、ＣＡ１２５（ｃａｎｃｅｒａｎｔｉｇｅｎ１２５）、ＣＡ１９５（ｃａｎｃｅｒａｎｔｉｇｅｎ１９５）、ＰＳＡ（ｐｒｏｓｔａｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎ）、ＣＡ５４９（ｃａｎｃｅｒａｎｔｉｇｅｎ５４９）、ＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃａｎｔｉｇｅｎ）、ＡＣＴＨ（ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃｈｏｒｍｏｎｅ）、ＡＦＰ（ａｌｐｈａ－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ｂｃｌ－２（Ｂ－ｃｅｌｌｌｙｍｐｈｏｍａ２）、β－２マイクログロブリン（ｂｅｔａ２ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）、カルシトニン（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）、カテプシンＤ（ｃａｔｈｅｐｓｉｎＤ）、クロモグラニンＡ（ｃｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎ－Ａ）、ＥＦＧＲ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ガストリン（ｇａｓｔｒｉｎ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ、ｈｕｍａｎｃｈｏｒｉｏｎｉｃｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）、α－ｈＣＧ（ｈＣＧのアルファサブユニット）、β－ｈＣＧ（ｈＣＧのベータサブユニット）、ＬＤＨ（ｌａｃｔｉｃｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ＮＳＥ（ｎｅｕｒｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃｅｎｏｌａｓｅ）、膵臓ポリペプチド（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、プロインスリンＣ－ペプチド（ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎＣ－ｐｅｐｔｉｄｅ）、サイログロブリン（ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）、ＴＤＴ（ｔｅｒｍｉｎａｌｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄａｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ＴＰＡ（ｔｉｓｓｕｅｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅａｎｔｉｇｅｎ）、ケラチン１９（ＫＲＴ１９、ｋｅｒａｔｉｎ１９）、ＥＴＡ（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｔｕｍｏｒａｎｔｉｇｅｎ）、チロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）、ＭＡＧＥＡ１（ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｎｔｉｇｅｎｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒＡ１）、ＭＡＧＥＡ２（ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｎｔｉｇｅｎｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒＡ２）、ＭＡＧＥＡ３（ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｎｔｉｇｅｎｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒＡ３）、ＭＡＧＥＡ４（ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｎｔｉｇｅｎｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒＡ４）、ＭＡＧＥＡ６（ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｎｔｉｇｅｎｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒＡ６）、ＭＡＧＥＡ９（ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｎｔｉｇｅｎｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒＡ９）、ＭＡＧＥＡ１０（ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｎｔｉｇｅｎｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒＡ１０）、ＭＡＧＥＡ１１（ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｎｔｉｇｅｎｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒＡ１１）、ＭＡＧＥＡ１２（ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｎｔｉｇｅｎｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒＡ１２）、ＭＡＧＥＣ１（ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｎｔｉｇｅｎｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒＣ１）、ＭＡＧＥＣ２（ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｎｔｉｇｅｎｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒＣ２）、ＴＲＰ－２（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ２）、ＥｐＣＡＭ（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ）、ＧＰＣ３（ｇｌｙｐｉｃａｎ３）、ＭＳＬＮ（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、ＢＴＡ（ｂｌａｄｄｅｒｔｕｍｏｒａｎｔｉｇｅｎ）、ＲＯＲ１（ＲｅｃｅｐｔｏｒＴｙｒｏｓｉｎｅＫｉｎａｓｅＬｉｋｅＯｒｐｈａｎＲｅｃｅｐｔｏｒ１）、サイトケラチン断片２１－１（ＣＹＦＲＡ２１－１、ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎｆｒａｇｍｅｎｔ２１－１）、ＣＴＡＧ２（ｃａｎｃｅｒ／ｔｅｓｔｉｓａｎｔｉｇｅｎ２）、ＢＡＧＥ（Ｂｍｅｌａｎｏｍａａｎｔｉｇｅｎ）、ＬＲＰＡＰ１（ＬＤＬｒｅｃｅｐｔｏｒｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ１）、ＬＹ６Ｋ（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅａｎｔｉｇｅｎ６ｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒＫ）、ＳＡＧＥ１（ｓａｒｃｏｍａａｎｔｉｇｅｎ１）、ＳＰＡ１７（ｓｐｅｒｍｓｕｒｆａｃｅｐｒｏｔｅｉｎ１７）、ＳＳＸ－２（ＳＳＸｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒ２）、ＳＳＸ－４（ＳＳＸｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒ４）、ＡＬＤＨ１Ａ１（ａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ１ｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒＡ１）、ＣＳＡＧ２（ｃｈｏｎｄｒｏｓａｒｃｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒ２）、ＸＡＧＥ１Ｂ（Ｘａｎｔｉｇｅｎｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒ１Ｂ）、ＣＡＬＣＡ（Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎｇｅｎｅ－ｒｅｌａｔｅｄｐｅｐｔｉｄｅ１）、ＣＤ２７４（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈ１ｌｉｇａｎｄ１）、ＣＤ４５（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｔｙｐｅｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅＣ）、ＣＰＳＦ１（Ｃｌｅａｖａｇｅａｎｄｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｆａｃｔｏｒｓｕｂｕｎｉｔ１）、ＤＫＫ１（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ－ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ１）、ＥＮＡＨ（Ｐｒｏｔｅｉｎｅｎａｂｌｅｄｈｏｍｏｌｏｇ）、ＥＰＨＡ３（Ｅｐｈｒｉｎｔｙｐｅ-Ａｒｅｃｅｐｔｏｒ３）、ＥＺＨ２（Ｈｉｓｔｏｎｅ－ｌｙｓｉｎｅＮ－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅＥＺＨ２）、ＦＧＦ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、ＨＥＰＡＣＡＭ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ）、ＨＰＮ（Ｓｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅｈｅｐｓｉｎ）、ＩＤＯ１（ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ２）、ＩＭＰ３（Ｕ３ｓｍａｌｌｎｕｃｌｅｏｌａｒｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ３）、ＩＬ１３ＲＡ２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１３ｒｅｃｅｐｔｏｒｓｕｂｕｎｉｔａｌｐｈａ２）、ＣＥＳ２（ｃａｒｂｏｘｙｌｅｓｔｅｒａｓｅ２）、ＫＬＫ４（Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ－４）、ＫＩＦ２０Ａ（Ｋｉｎｅｓｉｎ－ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎＫＩＦ２０Ａ）、ＬＧＳＮ（ｌｅｎｇｓｉｎ）、ＣＳＦ１（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ１）、ＣＳＰＧ４（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎｓｕｌｆａｔｅｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ４）、ＭＤＫ（ｍｉｄｋｉｎｅ）、ＭＭＰ－２（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ２）、ＭＭＰ－７（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ７）、ＭＵＣ５ＡＣ（ｍｕｃｉｎ５ＡＣ）、ＭＡＲＴ１（ｍｅｌａｎｏｍａａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄｂｙＴ－ｃｅｌｌｓ１）、ＢＣＬ２Ｌ１（Ｂｃｌ－２－ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎ１）、Ｎｅｃｔｉｎ－４、ＰＬＩＮ２（ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ２）、ＰＡＸ５（ｐａｉｒｅｄｂｏｘ５）、ＰＬＡＣ１（Ｐｌａｃｅｎｔａ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｏｔｅｉｎ１）、ＺＮＦ３９５（ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｐｒｏｔｅｉｎ３９５）、ＰＲＡＭＥ（Ｍｅｌａｎｏｍａａｎｔｉｇｅｎｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｔｕｍｏｒｓ）、ＦＯＬＨ１（ｆｏｌａｔｅｈｙｄｒｏｌａｓｅ１）、ＲＧＳ５（ＲｅｇｕｌａｔｏｒｏｆＧｐｒｏｔｅｉｎｓｉｇｎａｌｉｎｇ５）、ＲＮＦ４３（ＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒｐｒｏｔｅｉｎ４３）、ＤＣＤＣ２（Ｄｏｕｂｌｅｃｏｒｔｉｎｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ２）、ＳＣＲＮ１（Ｓｅｃｅｒｎｉｎ－１）、ＳＯＸ１０（ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＳＯＸ－１０）、ＳＣＧＢ２Ａ２（ｓｅｃｒｅｔｏｇｌｏｂｉｎｆａｍｉｌｙ２Ａｍｅｍｂｅｒ２）、Ｍａｍｍａｇｌｏｂｉｎ－Ａ、ＢＩＲＣ５（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ；ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌＩＡＰｒｅｐｅａｔｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ５）、Ｓｕｒｉｖｉｎ、ＮＹＥＳＯ１（ＮｅｗＹｏｒｋＥｓｏｐｈａｇｅａｌＳｑｕａｍｏｕｓＣｅｌｌＣａｒｃｉｎｏｍａ－１）、ＴＲＯＰ２（Ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅａｎｔｉｇｅｎ２）、ＴＥＲＴ（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）、ＴＰＢＧ（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、ＷＴ１（Ｗｉｌｍｓｔｕｍｏｒｐｒｏｔｅｉｎ１）、ＷＤＲ４６（ＷＤｒｅｐｅａｔ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ４６）、ＰＭＥＬ（ｐｒｅｍｅｌａｎｏｓｏｍｅｐｒｏｔｅｉｎ）、ＡＮＫＲＤ３０Ａ（ａｎｋｙｒｉｎｒｅｐｅａｔｄｏｍａｉｎ３０Ａ）、ＧＰＲ１４３（Ｇｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ１４３）、ＡＣＰ３（Ｐｒｏｓｔａｔｉｃａｃｉｄｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、ＲＡＢ３８（Ｒａｓ－ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎＲａｂ－３８）、α－ＴＳＨ（ａｌｐｈａｓｕｂｕｎｉｔｔｈｙｒｏｉｄｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｈｏｒｍｏｎｅ）、ｃ－Ｍｅｔ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＭｅｔ）、ＣＤ１３３、ＫＫ－ＬＣ－１（Ｋｉｔａ－Ｋｙｕｓｈｕｌｕｎｇｃａｎｃｅｒａｎｔｉｇｅｎ－１）、ＣＤ７０、ＧＰＮＭＢ（ＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎＮｍｂ）、ＭＵＣ１６（Ｍｕｃｉｎ１６）などが存在する。前記以外にも、ｐ５３（ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ５３）などの癌抑制遺伝子（ｔｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｇｅｎｅ）の特定の突然変異体を含む多様な突然変異タンパク質も癌抗原として使用され得る。

【実施例】

【0158】

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎなく、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないことは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明であろう。

【0159】

製造例１．ｈＣＤ８０－Ｆｃ－ＩＬ－２変異体（２Ｍ）の製造：ＧＩ－１０１

【0160】

ヒトＣＤ８０断片、Ｆｃドメイン及びＩＬ－２変異体を含む融合タンパク質を生産するために、シグナルペプチド（配列番号１）、ＣＤ８０断片（配列番号２）、リンカーが結合したＩｇヒンジ（配列番号３）、Ｆｃドメイン（配列番号４）、リンカー（配列番号５）及び２個のアミノ酸が置換されたＩＬ－２変異体（２Ｍ）（Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ）（配列番号６）をＮ末端から順次に含む融合タンパク質をコードする塩基配列（配列番号８）を含むポリヌクレオチドを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＧｅｎｅＡｒｔＧｅｎｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓサービスを用いてポリヌクレオチド合成してｐｃＤＮＡ３＿４ベクターに積載した。また、前記ベクターをＣＨＯ細胞（Ｅｘｐｉ－ＣＨＯ^ＴＭ）に導入し、配列番号９の融合タンパク質を発現させた。ベクターを導入した後、３７℃、１２５ＲＰＭ、ＣＯ_２８％濃度の環境において７日培養後に培養液を回収し、融合タンパク質を精製した。前記精製した融合タンパク質二量体を「ＧＩ－１０１」と命名した。

【0161】

精製は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅｐｒｏｔｅｉｎＡレジンが含まれたクロマトグラフィーを用いて行った。２５ｍＭトリス、２５ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４の条件で融合タンパク質を結合させた。その後、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ３の１００ｍＭの酢酸で溶出した。ｐＨ９の２０％の１Ｍトリス－ＨＣｌを回収用チューブに入れた後、融合タンパク質を回収した。回収した融合タンパク質をＰＢＳバッファーで１６時間透析して変えた。

【0162】

その後、ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷＸＬカラム（ＴＯＳＯＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてサイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅｅｘｃｌｕｓｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で時間による２８０ｎｍ波長における吸光度を測定し、高濃度融合タンパク質を確保した。このとき、分離精製された融合タンパク質は、還元（Ｒ）又は非還元（ＮＲ）条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、クマシーブルー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅｂｌｕｅ）で染色し、その純度を確認した（図２）。ＮａｎｏＤｒｏｐを用いた検出時に、２．７８ｍｇ／ｍｌの濃度で融合タンパク質が含まれたことを確認した。また、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて分析した結果は、図３に示す通りである。

【0163】

製造例２．Ｆｃ－ＩＬ－２変異体（２Ｍ）二量体の製造：Ｆｃ－ＩＬ－２ｖ２

【0164】

Ｆｃドメイン及びＩＬ－２変異体を含む融合タンパク質を生産するために、シグナルペプチド（配列番号１）、Ｉｇヒンジ（配列番号３８）、Ｆｃドメイン（配列番号４）、リンカー（配列番号５）及び２個のアミノ酸が置換されたＩＬ－２変異体（２Ｍ）（Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ）（配列番号６）を含む融合タンパク質をコードする塩基配列（配列番号４５）をＮ末端から順次に含むポリヌクレオチドを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＧｅｎｅＡｒｔＧｅｎｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓサービスを用いてポリヌクレオチド合成してｐｃＤＮＡ３＿４ベクターに積載した。また、前記ベクターをＣＨＯ細胞（Ｅｘｐｉ－ＣＨＯ^ＴＭ）に導入し、配列番号４４の融合タンパク質を発現させた。ベクターを導入した後、３７℃、１２５ＲＰＭ、ＣＯ_２８％濃度の環境において７日培養後に培養液を回収し、融合タンパク質二量体を精製した。前記精製した融合タンパク質二量体を「Ｆｃ－ＩＬ２ｖ２」と命名した。

【0165】

前記精製及び融合タンパク質の回収は、前記製造例１と同じ方法で行った。分離精製された融合タンパク質は、還元（Ｒ）又は非還元（ＮＲ）条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、クマシーブルーで染色し、その純度を確認した（図４）。その結果、前記融合タンパク質が二量体を形成することを確認した。また、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて分析した結果は、図５に示す通りである。

【0166】

製造例３．Ｆｃ－ＩＬ－２二量体の製造：Ｆｃ－ＩＬ－２ｗｔ

【0167】

Ｆｃドメイン及び野生型ＩＬ－２を含む融合タンパク質を生産するために、シグナルペプチド（配列番号１）、Ｉｇヒンジ（配列番号３８）、Ｆｃドメイン（配列番号４）、リンカー（配列番号５）及び野生型ＩＬ－２（配列番号１０）を含む融合タンパク質をコードする塩基配列（配列番号４３）をＮ末端から順次に含むポリヌクレオチドを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＧｅｎｅＡｒｔＧｅｎｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓサービスを用いてポリヌクレオチド合成してｐｃＤＮＡ３＿４ベクターに積載した。また、前記ベクターをＣＨＯ細胞（Ｅｘｐｉ－ＣＨＯ^ＴＭ）に導入し、配列番号４２の融合タンパク質を発現させた。ベクターを導入した後、３７℃、１２５ＲＰＭ、ＣＯ_２８％濃度の環境において７日培養後に培養液を回収し、融合タンパク質二量体を精製した。前記精製した融合タンパク質二量体を「Ｆｃ－ＩＬ２ｗｔ」と命名した。

【0168】

前記精製及び融合タンパク質の回収は、前記製造例１と同じ方法で行った。分離精製された融合タンパク質は、還元（Ｒ）又は非還元（ＮＲ）条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、クマシーブルーで染色し、その純度を確認した（図６）。その結果、前記融合タンパク質が二量体を形成することを確認した。また、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて分析した結果は、図７に示す通りである。

【0169】

製造例４．ｈＣＤ８０－Ｆｃ－ＩＬ－２野生型二量体の製造：ｈＣＤ８０－Ｆｃ－ＩＬ－２ｗｔ

【0170】

ヒトＣＤ８０断片、Ｆｃドメイン及びＩＬ－２野生型タンパク質を含む融合タンパク質を生産するために、シグナルペプチド（配列番号１）、ＣＤ８０断片（配列番号２）、リンカーが結合されたＩｇヒンジ（配列番号３）、Ｆｃドメイン（配列番号４）、リンカー（配列番号５）及びＩＬ－２野生型（配列番号１０）をＮ末端から順次に含む融合タンパク質をコードする塩基配列（配列番号４１）を含むポリヌクレオチドを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＧｅｎｅＡｒｔＧｅｎｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓサービスを用いてポリヌクレオチド合成してｐｃＤＮＡ３＿４ベクターに積載した。また、前記ベクターをＣＨＯ細胞（Ｅｘｐｉ－ＣＨＯ^ＴＭ）に導入し、配列番号４６の融合タンパク質を発現させた。ベクターを導入した後、３７℃、１２５ＲＰＭ、ＣＯ_２８％濃度の環境において７日培養後に培養液を回収し、融合タンパク質二量体を精製した。前記精製した融合タンパク質二量体を「ｈＣＤ８０－Ｆｃ－ＩＬ２ｗｔ」と命名した。

【0171】

精製は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅｐｒｏｔｅｉｎＡレジンが含まれたクロマトグラフィーを用いて行った。２５ｍＭトリス、２５ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４の条件で融合タンパク質を結合させた。その後、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ３の１００ｍＭの酢酸で溶出した。ｐＨ９の２０％の１Ｍトリス－ＨＣｌを回収用チューブに入れた後、融合タンパク質を回収した。回収された融合タンパク質をＰＢＳバッファーで１６時間透析して変えた。

【0172】

その後、ＴＳＫｇｅl Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（ＴＯＳＯＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてサイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅｅｘｃｌｕｓｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で時間による２８０ｎｍ波長における吸光度を測定し，高濃度融合タンパク質を確保した。このとき、分離精製された融合タンパク質は、還元（Ｒ）又は非還元（ＮＲ）条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、クマシーブルー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅｂｌｕｅ）で染色し、その純度を確認した（図８）。その結果、前記融合タンパク質が二量体を形成することを確認した。また、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて分析した結果は、図９に示す通りである。

【0173】

製造例５．ｈＣＤ８０－Ｆｃ二量体の製造：ｈＣＤ８０－Ｆｃ

【0174】

ヒトＣＤ８０断片及びＦｃドメインを含む融合タンパク質を生産するために、シグナルペプチド（配列番号１）、ＣＤ８０断片（配列番号２）、リンカーが結合されたＩｇヒンジ（配列番号３）及びＦｃドメイン（配列番号４）をＮ末端から順次に含む融合タンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド（配列番号３９）を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＧｅｎｅＡｒｔＧｅｎｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓサービスを用いてポリヌクレオチド合成してｐｃＤＮＡ３＿４ベクターに積載した。また、前記ベクターをＣＨＯ細胞（Ｅｘｐｉ－ＣＨＯ^ＴＭ）に導入し、配列番号４０の融合タンパク質を発現させた。ベクターを導入した後、３７℃、１２５ＲＰＭ、ＣＯ_２８％濃度の環境において７日培養後に培養液を回収し、融合タンパク質二量体を精製した。前記精製した融合タンパク質二量体を「ｈＣＤ８０－Ｆｃ」と命名した。

【0175】

【0176】

その後、ＴＳＫｇｅl Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（ＴＯＳＯＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてサイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅｅｘｃｌｕｓｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で時間による２８０ｎｍ波長における吸光度を測定し、高濃度融合タンパク質を確保した。このとき、分離精製された融合タンパク質は、還元（Ｒ）又は非還元（ＮＲ）条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、クマシーブルー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅｂｌｕｅ）で染色し、その純度を確認した（図１０）。その結果、前記融合タンパク質が二量体を形成することを確認した。また、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて分析した結果は、図１１に示す通りである。

【0177】

準備例１．Ｔ細胞培養のための培養用組成物

【0178】

下記のような組成でＴ細胞培養用培地を製造した。このとき、下記の表１及び表２の基本培養培地を製造した後、表３の各添加条件によってＧＩ－１０１又はｈＣＤ８０－Ｆｃ＋Ｆｃ－ＩＬ－２ｖを使用前に添加した。

【0179】

【表1】

【0180】

【表2】

【0181】

【表3】

【0182】

実施例１．ＣＤ４－ＰＢＭＣ細胞培養によるＴ細胞増殖及び活性確認

【0183】

実施例１．１．ＣＤ４－ＰＢＭＣ細胞分離及び培養

【0184】

ヒト末梢血液単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）（Ｚｅｎ－Ｂｉｏ．Ｉｎｃ、ＲｅｓｅａｒｃｈＴｒｉａｎｇｌｅＰａｒｋ、ＮＣ、ＵＳＡ、Ｃａｔ＃ＳＥＲ－ＰＢＭＣ－２００－Ｆ）を解凍（ｔｈａｗｉｎｇ）して表１及び表２の基本培養培地５ｍＬに解した後、３００×ｇで５分間遠心分離し、細胞を洗浄した。その後、ヒトＣＤ４マイクロビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ、ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｃａｔ＃１３０－０４５－１０１）及び磁性細胞分離システムを用いてＰＢＭＣからＣＤ４＋細胞を除去した。

【0185】

ＣＤ４＋細胞が除去されたＰＢＭＣ（ＣＤ４－ＰＢＭＣ）を１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように培養液に懸濁し、２４－ウェルプレート（２４－ｗｅｌｌｐｌａｔｅ）に１ｍＬずつ分注した。その後、抗ヒトＣＤ３抗体（Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎＣＤ３ａｎｔｉｂｏｄｙ）（ｃｌｏｎｅ：ＯＫＴ３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ＃３１７３２６）を、各細胞が分注されているウェル（ｗｅｌｌ）に１μｇ／ｍＬの濃度になるように添加した。これと同時に、基本培養培地（表１及び表２）以外の添加物質（表３）をそれぞれ１．６ｎＭになるように添加した後、３７℃、５％ＣＯ_２の条件で培養した。その後、４日後に抗ヒトＣＤ３抗体と培地基本成分（表１及び表２）以外の添加物質（表３）をそれぞれ１．６ｎＭ添加した細胞培養組成物を各ウェルに１ｍＬずつ入れ、培養１４日目に取得して細胞数及び細胞生存率を計算した。

【0186】

具体的に、表１の基本培養培地を含むＴ細胞培養培地組成物において、ＣＤ４－ＰＢＭＣ細胞の増殖結果は表４及び図１２に示し、細胞生存率は表５及び図１３に示す通りである。また、表２の基本培養培地を含むＴ細胞培養培地組成物において、ＣＤ４－ＰＢＭＣ細胞の増殖結果は表６及び図１４に示し、細胞生存率は表７及び図１５に示す通りである。

【0187】

【表4】

【0188】

【表5】

【0189】

【表6】

【0190】

【表7】

【0191】

実施例１．２．細胞表面染色を通じたフローサイトメトリー

【0192】

前記実施例１．１によって培地基本成分（表１及び表２）及び添加物質（表３）で１４日間培養されたＣＤ４－（ＣＤ４ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）細胞の表現型を確認するためにＦＡＣＳ分析を進行した。各細胞群別に２×１０^５個～３×１０^５個ずつの細胞をそれぞれ丸底９６－ウェルプレート（Ｕ－ｂｏｔｔｏｍｅｄ９６－ｗｅｌｌｐｌａｔｅ）に分注し、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、３％ＦＢＳ、１０ｍＭＥＤＴＡ、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１０μｇ／ｍＬポリミキシンＢ、１×抗生剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｐｙｒｕｖａｔｅ））を１００μｌずつ添加し、３００×ｇで５分間遠心分離し、細胞を洗浄した。

【0193】

各ウェルの細胞ペレット（ｐｅｌｌｅｔ）にＨｕｍａｎＴｒｕＳｔａｉｎＦｃＸ^ＴＭ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ＃４２２３０２）をＦＡＣＳバッファーで１：２００に希釈した後、各ウェルに５０μｌずつ添加し、４℃で１０分間インキュベートした。細胞表面を分析するために、下記の表８の抗体をＦＡＣＳバッファー（ｂｕｆｆｅｒ）５０μｌ当たり２μｌずつ混合し、各ウェルに５０μｌずつ分注した後、４℃で２０分間インキュベートした。その後、ＦＡＣＳバッファーを１００μｌずつ添加し、３００×ｇで５分間遠心分離し、細胞を洗浄した。洗浄後、ＦＡＣＳバッファーに再懸濁した後、ＢＤＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメーター（ＢＤｓｃｉｅｎｃｅ、ＳａｎＪｏｓｅ、Ｃａ、ＵＳＡ）及びＦｌｏｗｊｏ^ＴＭソフトウェアを用いて細胞の表現型を確認した。

【0194】

その結果、表１の基本培養培地を含むＴ細胞培養培地組成物において、各添加物質処理による１４日間培養したＣＤ４－ＰＢＭＣ細胞の細胞表面のフローサイトメトリー結果（ＦＡＣＳＰｌｏｔ）は図１６に示した。また、Ｔ細胞数、具体的に、総Ｔ細胞数、ＣＤ８Ｔ細胞数、ＣＤ２５＋Ｔ細胞数及び中心記憶Ｔ細胞数の確認結果は表９及び図１７乃至図２０に示す通りである。

【0195】

併せて、表２の基本培養培地を含むＴ細胞培養培地組成物において、各添加物質処理による１４日間培養したＣＤ４－ＰＢＭＣ細胞の細胞表面のフローサイトメトリー結果（ＦＡＣＳＰｌｏｔ）は図２１に示した。また、Ｔ細胞数、具体的に、総Ｔ細胞数、ＣＤ８Ｔ細胞数、ＣＤ２５＋Ｔ細胞数及び中心記憶Ｔ細胞数の確認結果は表１０及び図２２乃至図２５に示す通りである。

【0196】

実施例１．２の細胞表面染色を通じたフローサイトメトリーの結果、ＧＩ－１０１を添加物質として含む場合、基本培養培地と関係なく、総Ｔ細胞数、ＣＤ８Ｔ細胞数、ＣＤ２５＋Ｔ細胞数及び中心記憶Ｔ細胞数がいずれも高く増殖したことを確認した。

【0197】

【表8】

【0198】

【表9】

【0199】

^１）総Ｔ細胞数：総ＣＤ４－ＰＢＭＣ数×ＣＤ３＋ＣＤ１９－Ｔ細胞比率

【0200】

^２）ＣＤ８Ｔ細胞数：総Ｔ細胞数×ＣＤ８Ｔ細胞比率

【0201】

^３）ＣＤ２５＋記憶細胞数：ＣＤ８Ｔ細胞数×ＣＤ２５＋記憶細胞比率

【0202】

^４）中心記憶Ｔ細胞数：ＣＤ８Ｔ細胞数×中心記憶細胞比率

【0203】

【表10】

【0204】

^１）総Ｔ細胞数：総ＣＤ４－ＰＢＭＣ数×ＣＤ３＋ＣＤ１９－Ｔ細胞比率

【0205】

^２）ＣＤ８Ｔ細胞数：総Ｔ細胞数×ＣＤ８Ｔ細胞比率

【0206】

^３）ＣＤ２５＋記憶細胞数：ＣＤ８Ｔ細胞数×ＣＤ２５＋記憶細胞比率

【0207】

^４）中心記憶Ｔ細胞数：ＣＤ８Ｔ細胞数×中心記憶細胞比率

【0208】

実施例１．３．細胞内部染色を通じたフローサイトメトリー

【0209】

各細胞群別に２×１０^５個～３×１０^５個ずつの細胞をそれぞれ丸底９６－ウェルプレートに分注し、１×細胞刺激カクテル（ＣｅｌｌＳｔｉｍｕｌａｔｉｏｎＣｏｃｋｔａｉｌ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ＃００－４９７０－９３）が添加された表１及び表２の培地を処理し、３７℃で４時間反応させた後、１×モネンシン（ｍｏｎｅｎｓｉｎ；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ＃４２０７０１）が含まれたＦＡＣＳバッファーで洗浄した。ＨｕｍａｎＴｒｕＳｔａｉｎＦｃＸ^ＴＭ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ＃４２２３０２）と１×モネンシンが添加されたＦＡＣＳバッファーを１：２００の比率に希釈した後、各細胞群別に５０μｌずつ分注し、４℃で１０分間インキュベートした。１×モネンシンが混合されているＦＡＣＳバッファーに前記表８の抗体のうち細胞表面染色抗体（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８）を５０μｌ当たり２μｌずつ混合し、各ウェルに５０μｌずつ分注した後、４℃で２０分間インキュベートした。その後、１×モネンシンが混合されているＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した。

【0210】

洗浄後、ＢＤＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ^ＴＭ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｔ＃５５４７１４）を用いて製造社のプロトコルによって前記細胞を固定及び透過可能にした。表８の細胞内部の染色抗体（パーフォリン、グランザイムＢ、ＩＦＮ－γ）を１× ＢＤＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ^ＴＭ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｔ＃５５４７２３）５０μｌ当たり２μｌずつ混合し、各ウェルに５０μｌずつ分注した後、４℃で２０分間インキュベートした。その後、１× ＢＤＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ^ＴＭバッファーで細胞を１回洗浄し、ＦＡＣＳバッファーでさらに２回洗浄した。洗浄した細胞をＦＡＣＳバッファーに再懸濁した後、ＢＤＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメーターを用いて細胞を整列し、Ｆｌｏｗｊｏ^ＴＭソフトウェアを用いて結果を分析した。

【0211】

その結果、表１の基本培養培地を含むＴ細胞培養培地組成物において、各添加物質処理によるＣＤ４－ＰＢＭＣ細胞の細胞内部のフローサイトメトリー結果（ＦＡＣＳＰｌｏｔ）は図２６に示した。また、表１の基本培養培地を含むＴ細胞培養培地組成物において、各添加物質処理によるグランザイムＢ、ＩＦＮ－γ及びパーフォリン発現ＣＴＬ細胞数の確認結果は表１１及び図２７乃至図２９に示す通りである。

【0212】

併せて、表２の基本培養培地を含むＴ細胞培養培地組成物において、各添加物質処理によるＣＤ４－ＰＢＭＣ細胞の細胞内部のフローサイトメトリー結果（ＦＡＣＳＰｌｏｔ）は図３０に示した。また、表２の基本培養培地を含むＴ細胞培養培地組成物において、各添加物質処理によるグランザイムＢ、ＩＦＮ－γ及びパーフォリン発現ＣＴＬ細胞数の確認結果は表１２及び図３１乃至図３３に示す通りである。

【0213】

【表11】

【0214】

^２）ＣＤ８Ｔ細胞数：総Ｔ細胞数×ＣＤ８Ｔ細胞比率

【0215】

^５）グランザイムＢ＋ＣＴＬ細胞数：ＣＤ８Ｔ細胞数^２）×ＣＤ８＋グランザイムＢ＋細胞比率

【0216】

^６）ＩＦＮｇ＋ＣＴＬ細胞数：ＣＤ８Ｔ細胞数^２）×ＣＤ８＋ＩＦＮｇ＋細胞比率

【0217】

^７）パーフォリンＣＴＬ細胞数：ＣＤ８Ｔ細胞数^２）×ＣＤ８＋パーフォリン＋細胞比率

【0218】

【表12】

【0219】

^２）ＣＤ８Ｔ細胞数：総Ｔ細胞数×ＣＤ８Ｔ細胞比率

【0220】

^５）グランザイムＢ＋ＣＴＬ細胞数：ＣＤ８Ｔ細胞数^２）×ＣＤ８＋グランザイムＢ＋細胞比率

【0221】

^６）ＩＦＮｇ＋ＣＴＬ細胞数：ＣＤ８Ｔ細胞数^２）×ＣＤ８＋ＩＦＮｇ＋細胞比率

【0222】

^７）パーフォリンＣＴＬ細胞数：ＣＤ８Ｔ細胞数^２）×ＣＤ８＋パーフォリン＋細胞比率

【0223】

実施例２．ＣＤ８＋Ｔ細胞培養によるＴ細胞増殖及び活性確認

【0224】

実施例２．１．ＣＤ８＋Ｔ細胞分離及び培養

【0225】

ヒト末梢血液単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）（Ｚｅｎ－Ｂｉｏ．Ｉｎｃ、ＲｅｓｅａｒｃｈＴｒｉａｎｇｌｅＰａｒｋ、ＮＣ、ＵＳＡ、Ｃａｔ＃ＳＥＲ－ＰＢＭＣ－２００－Ｆ）を解凍して５ｍＬの培地基本成分（表１及び表２）に解した後、３００×ｇで５分間遠心分離し、細胞を洗浄した。その後、ヒトＣＤ８マイクロビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ、ＢｅｒｇｉｓｃｈＧｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｃａｔ＃１３０－０４５－２０１）及び磁性細胞分離システムを用いてＰＢＭＣからＣＤ８＋細胞を取得した。

【0226】

分離されたＣＤ８＋Ｔ細胞を１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように培養液に懸濁し、２４－ウェルプレート（２４－ｗｅｌｌｐｌａｔｅ）に１ｍＬずつ分注した。その後、抗ヒトＣＤ３抗体（Ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎＣＤ３ａｎｔｉｂｏｄｙ）（ｃｌｏｎｅ：ＯＫＴ３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ＃３１７３２６）を、各細胞が分注されているウェルに１μｇ／ｍＬの濃度になるように添加した。これと同時に、培地基本成分（表１及び表２）以外の添加物質（表３、ＧＩ－１０１とｈＣＤ８０－Ｆｃ及びＦｃ－ＩＬ２変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）の同時処理）をそれぞれ１．６ｎＭ添加した後、３７℃、５％ＣＯ_２の条件で培養した。培養してから４日目に、抗ヒトＣＤ３抗体と培地基本成分（表１及び表２）以外の添加物質（表３、ＧＩ－１０１とｈＣＤ８０－Ｆｃ及びＦｃ－ＩＬ２変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）の同時処理）をそれぞれ１．６ｎＭ添加した細胞培養組成物を各ウェルに１ｍＬずつ入れ、培養してから１２日目に取得して細胞数及び細胞生存率を計算した。

【0227】

具体的に、表１の基本培養培地を含むＴ細胞培養培地組成物において、ＣＤ８＋ＰＢＭＣ細胞の増殖結果は表１３及び図３４に示し、細胞生存率は表１４及び図３５に示す通りである。

【0228】

【表13】

【0229】

【表14】

【0230】

実施例２．２．細胞表面染色を通じたフローサイトメトリー

【0231】

前記実施例２．１によって表１の基本培地成分及び表３の添加物質を含む組成物において、１２日間培養されたＣＤ８＋（ＣＤ８ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）細胞の表現型を確認するためにＦＡＣＳ分析を進行した。各細胞群別に２×１０^５個～３×１０^５個ずつの細胞をそれぞれ丸底９６－ウェルプレート（Ｕ－ｂｏｔｔｏｍｅｄ９６－ｗｅｌｌｐｌａｔｅ）に分注し、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、３％ＦＢＳ、１０ｍＭＥＤＴＡ、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１０μｇ／ｍＬポリミキシンＢ、１×抗生剤、１ｍＭピルビン酸ナトリウム）を１００μｌずつ添加し、３００×ｇで５分間遠心分離し、細胞を洗浄した。

【0232】

各ウェルの細胞ペレットにＨｕｍａｎＴｒｕＳｔａｉｎＦｃＸ^ＴＭ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ＃４２２３０２）をＦＡＣＳバッファーで１：２００に希釈した後、各ウェルに５０μｌずつ添加し、４℃で１０分間インキュベートした。細胞表面を分析するために、前記表８の抗体をＦＡＣＳバッファー５０μｌ当たり２μｌずつ混合し、各ウェルに５０μｌずつ分注した後、４℃で２０分間インキュベートした。その後、ＦＡＣＳバッファーを１００μｌずつ添加し、３００×ｇで５分間遠心分離し、細胞を洗浄した。洗浄後、ＦＡＣＳバッファーに再懸濁した後、ＢＤＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメーター（ＢＤｓｃｉｅｎｃｅ、ＳａｎＪｏｓｅ、Ｃａ、ＵＳＡ）及びＦｌｏｗｊｏ^ＴＭソフトウェアを用いて細胞の表現型を確認した。

【0233】

その結果、表１の基本培養培地を含むＴ細胞培養培地組成物において、各添加物質処理による１２日間培養したＣＤ８＋ＰＢＭＣ細胞の細胞表面のフローサイトメトリー結果（ＦＡＣＳＰｌｏｔ）は図３６に示した。また、Ｔ細胞数、ＣＤ８Ｔ細胞数、ＣＤ２５＋Ｔ細胞数及び中心記憶Ｔ細胞数の確認結果は表１５及び図３７乃至図４０に示す通りである。

【0234】

【表15】

【0235】

^８）総Ｔ細胞数：総ＣＤ８＋ＰＢＭＣ数×ＣＤ３＋ＣＤ１９－Ｔ細胞比率

【0236】

^９）ＣＤ８Ｔ細胞数：総Ｔ細胞数×ＣＤ８Ｔ細胞比率

【0237】

^１０）ＣＤ２５＋記憶細胞数：ＣＤ８Ｔ細胞数×ＣＤ２５＋記憶細胞比率

【0238】

^１１）中心記憶Ｔ細胞数：ＣＤ８Ｔ細胞数×中心記憶細胞比率

【0239】

実施例２．３．細胞内部染色を通じたフローサイトメトリー

【0240】

【0241】

【0242】

その結果、表１の基本培養培地を含むＴ細胞培養培地組成物において、各添加物質処理によって１２日間培養されたＣＤ８＋ＰＢＭＣ細胞の細胞内部のフローサイトメトリー結果（ＦＡＣＳＰｌｏｔ）は図４１に示した。また、表１の基本培養培地を含むＴ細胞培養培地組成物において、各添加物質処理によるグランザイムＢ、ＩＦＮ－γ及びパーフォリン発現ＣＴＬ細胞数の確認結果は表１６及び図４２乃至図４４に示す通りである。

【0243】

【表16】

【0244】

^９）ＣＤ８Ｔ細胞数：総Ｔ細胞数×ＣＤ８Ｔ細胞比率

【0245】

^１２）グランザイムＢ＋ＣＴＬ細胞数：ＣＤ８Ｔ細胞数^９）×ＣＤ８＋グランザイムＢ＋細胞比率

【0246】

^１３）ＩＦＮｇ＋ＣＴＬ細胞数：ＣＤ８Ｔ細胞数^９）×ＣＤ８＋ＩＦＮｇ＋細胞比率

【0247】

^１４）パーフォリンＣＴＬ細胞数：ＣＤ８Ｔ細胞数^９）×ＣＤ８＋パーフォリン＋細胞比率

【0248】

実施例３．ＧＩ１０１処理によるＨｅｒ２認識Ｔ細胞の癌細胞死滅効果確認

【0249】

実施例３．１．Ｔ細胞活性化

【0250】

前記実施例１で取得されたＣＤ４欠乏（ＣＤ４－）ＰＢＭＣ細胞を細胞計数器を用いて１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにＴ細胞培地基本成分（表１）に懸濁した後、１０ｍＬずつＴ７５フラスコに播種した。その後、１μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬのＨｅｒ２タンパク質（Ａｃｒｏ、Ｃａｔ＃ＨＥ２－Ｈ５２２５－１ｍｇ）を細胞が播種されている培地に接種し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件で２時間にわたって培養した。

【0251】

実施例３．２．活性化されたＴ細胞の再刺激

【0252】

前記実施例３．１で２時間にわたってＨｅｒ２タンパク質（Ａｃｒｏ、Ｃａｔ＃ＨＥ２－Ｈ５２２５－１ｍｇ）と共に培養された細胞に、表１の基本培地成分以外の添加物質（ＧＩ－１０１及びプロリュウキン）（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、ＵＳＡ）５０ｎＭと０．１μｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬのＯＫＴ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を同時に添加して７日間培養した。

【0253】

前記７日間培養した細胞は、培養してから４日目に実施例３．１に記載の方法と同じ方法で活性化されたＨｅｒ２タンパク質（Ａｃｒｏ、Ｃａｔ＃ＨＥ２－Ｈ５２２５－１ｍｇ）接種Ｔ細胞と細胞数の比率が１：１になるように共培養することによって再刺激（ｒｅ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）した。このとき、細胞の飽和度は１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬを超えないようにした。

【0254】

実施例３．３．活性化されたＴ細胞の癌細胞死滅効果分析

【0255】

培養された活性化Ｔ細胞の癌細胞死滅効果を確認するために、前記実施例３．２から得られた細胞を癌細胞２種ＣＡＭＡ－１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－２１^ＴＭ；乳癌細胞株）；ＢＴ－４７４（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－２０^ＴＭ；乳癌細胞株））と多様な比率（１：１、５：１、１０：１）で２４時間にわたって共培養した。その後、前記細胞をＡｎｎｅｘｉｎ－Ｖと７－ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で癌細胞死滅効果を評価した。

【0256】

具体的に、前記２種の癌細胞をそれぞれ１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにＴ細胞培地基本成分（表１）に懸濁した後、丸底９６－ウェルプレート（ｒｏｕｎｄｂｏｔｔｏｍ９６－ｗｅｌｌｐｌａｔｅ）に播種した。前記実施例３．２から得られた活性化Ｔ細胞は、Ｔ細胞培地基本成分（表１）に懸濁した後、癌細胞との比率（Ｅ：Ｔ）が１：１、５：１、１０：１になるように９６－ウェルプレート（９６－ｗｅｌｌｐｌａｔｅ）に播種し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件で２４時間にわたって共培養した。２４時間にわたって共培養を終了した細胞を１，３００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄液を除去した。

【0257】

前記共培養された細胞を含有する各ウェルに１００μｌの予熱された０．２５％トリプシンを添加し、３７℃で５分間培養した。分離された細胞をＦＡＣＳバッファーで洗浄し、抗ヒトＣＤ４５抗体（ＣｌｏｎｅＨＩ３０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ＃２５－０４５９－４２）で染色した後、製造社のプロトコルによって７－ＡＡＤが含まれたＦＩＴＣＡｎｎｅｘｉｎ－Ｖ細胞死滅検出キットを用いてＡｎｎｅｘｉｎ－Ｖ及び７－ＡＡＤ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、ＵＳＡ、Ｃａｔ＃６４０９２２）で染色した。染色は、４℃で２０分間インキュベートした後、ＦＡＣＳバッファーを１００μｌずつ添加し、３００×ｇで５分間遠心分離し、細胞を洗浄した。その後、ＦＡＣＳバッファーに再懸濁した後、ＢＤＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメーター（ＢＤｓｃｉｅｎｃｅ、ＳａｎＪｏｓｅ、Ｃａ、ＵＳＡ）及びＦｌｏｗｊｏ^ＴＭソフトウェアを用いて癌細胞死滅効果を確認した。

【0258】

前記実験を通じて確認されたＴ細胞の癌細胞死滅効果は図４５及び図４６に示した。

【図1】