特許 7543621 癌の予防および／または治療のためのアミノ酸を含む組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-08-26

(45)【発行日】2024-09-03

(54)【発明の名称】癌の予防および／または治療のためのアミノ酸を含む組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/198 20060101AFI20240827BHJP

   A61K 31/194 20060101ALI20240827BHJP

   A61K 31/4172 20060101ALI20240827BHJP

   A61K 31/405 20060101ALI20240827BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240827BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240827BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240827BHJP

【ＦＩ】

A61K31/198

A61K31/194

A61K31/4172

A61K31/405

A61K45/00

A61P35/00

A61P43/00 121

【請求項の数】 15

(21)【出願番号】P 2022540336

(86)(22)【出願日】2020-12-21

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-09

(86)【国際出願番号】 IB2020062301

(87)【国際公開番号】W WO2021144640

(87)【国際公開日】2021-07-22

【審査請求日】2023-04-14

(31)【優先権主張番号】102020000000454

(32)【優先日】2020-01-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】IT

(73)【特許権者】

【識別番号】517061897

【氏名又は名称】プロフェッショナル ダイエテティクス エス．ピー．エー．

(74)【代理人】

【識別番号】110000877

【氏名又は名称】弁理士法人ＲＹＵＫＡ国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ジョルジェッティ、パオロ ルカ マリア

【審査官】三上 晶子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０２０／００３０１３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１９／０２１１３７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１９／０２１１３５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Xiao Wang et al.，Increases in mitochondrial biogenesis impair carcinogenesis at multiple levels，Molecular Oncology，Elsevier，2011年，vol.5，399-409

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３１／００－３３／４４

Ａ６１Ｐ １／００－４３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象の癌の予防および／または治療における使用のための組成物であって、前記組成物は、活性剤を備え、前記活性剤は、アミノ酸のロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニン、リシンと、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸とを含む、使用のための組成物。

【請求項2】

前記癌は、腺癌、黒色腫、大腸癌、および乳癌からなる群から選択される、請求項１に記載の使用のための組成物。

【請求項3】

クエン酸、リンゴ酸、コハク酸の合計と、分岐鎖アミノ酸のロイシン、イソロイシン、バリンにリシンおよびトレオニンを加えた合計との重量比は、０．０５～０．３に含まれる、請求項１または請求項２に記載の使用のための組成物。

【請求項4】

クエン酸、リンゴ酸、コハク酸の総量と、分岐鎖アミノ酸のロイシン、イソロイシン、バリンの総量との重量比は、０．１～０．４に含まれる、請求項１から３のいずれか１項に記載の使用のための組成物。

【請求項5】

クエン酸と、リンゴ酸およびコハク酸の合計との重量比は、１．０～４．０に含まれる、請求項１から４のいずれか１項に記載の使用のための組成物。

【請求項6】

クエン酸：リンゴ酸：コハク酸の重量比は、１０：１：１～２：１．５：１．５に含まれる、請求項１から５のいずれか１項に記載の使用のための組成物。

【請求項7】

前記活性剤は、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、チロシン、システインからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を更に有する、請求項１から６のいずれか１項に記載の使用のための組成物。

【請求項8】

前記活性剤は、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システインおよび任意にチロシンを更に有する、請求項１から７のいずれか１項に記載の使用のための組成物。

【請求項9】

クエン酸、リンゴ酸、コハク酸の総モル量と、メチオニン、フェニルアラニン、ヒスチジンおよびトリプトファンの総モル量との比は、１．３５より高い、請求項１から８のいずれか１項に記載の使用のための組成物。

【請求項10】

クエン酸、コハク酸、リンゴ酸の３つの酸の総モル量と、リシンおよびトレオニンの総モル量との比は、０．１０～０．７０に含まれる、請求項１から９のいずれか１項に記載の使用のための組成物。

【請求項11】

クエン酸の重量またはモル量は、リンゴ酸とコハク酸の両方の総重量またはモル量より高い、請求項１から１０のいずれか１項に記載の使用のための組成物。

【請求項12】

ロイシンとクエン酸との重量比は、５～１に含まれる、請求項１から１１のいずれか１項に記載の使用のための組成物。

【請求項13】

前記組成物は、アルギニンを含まない、請求項１から１２のいずれか１項に記載の使用のための組成物。

【請求項14】

前記組成物は、セリン、プロリン、アラニンを含まない、請求項１から１３のいずれか１項に記載の使用のための組成物。

【請求項15】

対象の癌の予防および／または治療において同時に、別々に、または逐次使用するための、請求項１から１４のいずれか１項に記載の組成物と、少なくとも１つの化学療法剤とを備える、複合製剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本明細書は、概して、癌の予防および治療に使用するためのアミノ酸を含む組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

癌は、正常組織に対して異なる代謝プロファイルを有し、癌細胞の増殖におけるミトコンドリア活性の役割に関する対照的な証拠が明らかになってきている。酸素の存在下でさえグルコースが優先的に使用される、いわゆるワールブルク効果は、腫瘍細胞の特質の１つである。当初「好気性解糖」と定義されたこの現象は、癌におけるミトコンドリア機能不全の最初期の仮説につながった。しかしながら、この状況はより複雑であることが示されており、現在は、癌ミトコンドリアが発癌において高分子生合成、アポトーシス抵抗性、および発癌性シグナル伝達の活性化などの多面的機能に関与するという一般的な意見の一致が得られている。それにもかかわらず、実際には、多くのミトコンドリア変異が腫瘍中に見出されており、活性酸素種（ＲＯＳ）の低減に起因して酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）率が減少する結果、増殖が助長され、癌細胞増殖が増大することが示されている。更に、癌の成長における解糖経路の極めて重要な役割を所与とし、また、ＯＸＰＨＯＳおよび解糖が相互に調節されることから、ミトコンドリア機能を高めると解糖の阻害および癌細胞の死につながり得るとの推測が導かれる。更に、抗癌療法における薬学的手法として解糖阻害剤を開発するために多くの関心および労力が費やされてきた。いくつかの第一世代薬および第二世代薬が開発されているが、それらの安全性プロファイルおよび抵抗性の発現により、いくつかの懸念が生じている。

【発明の概要】

【0003】

本明細書の目的は、癌の予防および／または治療において特に有効であり、安全な投与プロファイルをもつ新規組成物を提供することである。

【0004】

本明細書によれば、上記の目的は、本開示の不可欠な部分をなすものとして理解される後続の特許請求の範囲において具体的に想起される主題によって達成される。

【0005】

本明細書の一実施形態は、対象の癌の予防および／または治療における使用のための組成物を提供し、この組成物は、活性剤を備え、当該活性剤は、アミノ酸のロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニン、リシンと、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸とを含む。

【0006】

１または複数の実施形態において、癌は、黒色腫、腺癌、大腸癌、乳癌からなる群から選択され得る。

【0007】

１または複数の実施形態において、組成物の活性剤は、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システインおよびチロシンからなる群から選択される１または複数のアミノ酸を更に含み得る。

【図面の簡単な説明】

【0008】

これより、添付図面を参照し、本発明を単なる例として説明する。

【図1】示されている時間にわたって正常培地（ＤＭＥＭ）または本願の組成物（α５）と共にインキュベートされた癌細胞および正常細胞におけるＭＴＴ生存率アッセイを示す。ＤＭＥＭに対して＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．０５。

【図2】０時間時点のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞と、２４時間（ｈｒ）にわたってＤＭＥＭ（ＮＴ）中またはα５組成物（α５）と共にインキュベートしたＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞とにおける、掻創アッセイを示す。

【図3】２４時間にわたってＤＭＥＭ（ＮＴ）またはα５組成物（α５）中でインキュベートしたＨｅＬａ細胞におけるコロニー形成アッセイを示す。

【図4】２４時間にわたってＤＭＥＭ（ＮＴ）またはα５組成物（α５）中でインキュベートしたＭ１４黒色腫細胞におけるシトクロムＣ（ＣｙｔＣ）転座およびアポトーシスマーカーのウエスタンブロット分析の結果を示す。上部：α５は、処理された細胞の細胞基質（ＰＭＳ）において特異的ＣｙｔＣ転座を誘導するが、特異的ＣＯＸ４転座は誘導しない。下部：Ｍ１４細胞におけるＰＡＲＰ－１およびカスパーゼ３による切断。

【図5】５時間にわたってＤＭＥＭ（ＮＴ）またはα５組成物（α５）中でインキュベートした細胞におけるｍＴＯＲ経路およびＨＩＦ１αのウエスタンブロット分析の結果を示す。左：Ｍ１４、Ｈｅｌａ、Ｂ１６Ｆ１０、およびＤｅｔｒｏｉｔ ５７３線維芽細胞中のｍＴＯＲ活性のマーカーとしてのｐｈｏｓｐｈｏ－ｐ７０Ｓ６Ｋ（ｔｈｒ３８６）レベル。右：Ｍ１４細胞およびＨｅＬａ細胞におけるＨＩＦ１α発現。ＧＡＰＤＨはローディングコントロールとして示されている。

【図6】癌細胞および正常細胞における代謝活性を示す。ＤＭＥＭ（ＮＴ）またはα５組成物（α５）で１時間処理した後のＨｅＬａ、Ｍ１４、およびＨＬ－１細胞における解糖（左）およびＯＣＲ（右）。ＮＴに対して＊ｐ＜０．０１。

【図7】ＭＣＦ７乳癌細胞増殖に関する。（Ａ）酸性ホスファターゼアッセイ：細胞（９６ウェルプレート中５，０００～２０，０００個／ウェル）を１％のα５組成物で４８時間処理し、１μＭのドキソルビシン（ＤＯＸ）で１６時間処理した。（Ｂ）増殖アッセイ：細胞（１２ウェルプレート中５０，０００個／ウェル）を（Ａ）のように処理し、トリパンブルー排除アッセイを使用した。実験数ｎ＝３。未処理細胞に対して＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１。すべてのデータは平均±ＳＤとして提示されている。

【発明を実施するための形態】

【0009】

以下の説明には、実施形態の十分な理解をもたらすべく、多くの具体的な詳細が記載されている。実施形態は、具体的な詳細のうちの１または複数を用いずに実施することも、他の方法、成分、材料などを用いて実施することもできる。他の例では、よく知られた構造、材料または動作は、実施形態の態様を不明瞭にすることを避けるために、詳細に示されることも説明されることもない。

【0010】

本明細書の全体における「１つの実施形態」または「一実施形態」への言及は、その実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造、または特性が、少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通して様々な箇所における「１つの実施形態において」または「一実施形態において」という表現の出現は、必ずしもすべてが同一の実施形態を指すとは限らない。更に、特定の特徴、構造、または特性は、１または複数の実施形態において任意の好適な方式で組み合わせてもよい。本明細書で提供される見出しは、便宜上のものに過ぎず、実施形態の範囲または意味を解釈するものではない。

【0011】

本明細書の一実施形態は、対象の癌の予防および／または治療における使用のための組成物を提供し、この組成物は、活性剤を備え、当該活性剤は、アミノ酸のロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニン、リシンと、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸とを含む。

【0012】

癌は、腺癌、黒色腫、大腸癌、乳癌からなる群から選択され得る。

【0013】

本開示は、更に、対象の癌の予防および／または治療において同時に、別々に、または逐次使用するための、本明細書で開示される組成物と、少なくとも１つの化学療法剤とを備える、複合製剤を提供する。

【0014】

本願の発明者は、驚いたことに、本明細書で開示される組成物が、子宮頸癌細胞、黒色腫細胞、結腸癌細胞、乳癌細胞などの癌細胞の増殖率を低減させるのに特に有効であり、正常細胞の増殖の率には影響しないことを見出した。本組成物はまた、癌細胞の運動性およびクローン形成能の阻害に有効であることが示された。非常に重要なことに、本組成物は、ｍＴＯＲ経路に対する阻害効果を及ぼし、この証拠は注目に値するが、なぜなら、ｍＴＯＲ活性の増大は腫瘍形成に関連付けられることが多く、必須アミノ酸ベースの組成物はｍＴＯＲ経路を活性化することが知られているためである。

【0015】

更に、以下のセクションで示すように、本組成物は、単独または少なくとも１つの化学療法剤との組み合わせのいずれにおいても安全に投与され得る。化学療法剤は、例えば少なくとも１つのアントラサイクリン、例えばドキソルビシンであり得る。

【0016】

１または複数の実施形態において、本明細書で開示される組成物は、活性剤を備え、当該活性剤は、クエン酸、コハク酸およびリンゴ酸を、ロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニン、リシンと組み合わせて含み、クエン酸、コハク酸およびリンゴ酸の総量と、アミノ酸のロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニン、リシンの総量との重量比は、０．０５～０．３、好ましくは０．１～０．２５に含まれる。

【0017】

１または複数の実施形態において、本組成物は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニン、リシン、クエン酸、コハク酸およびリンゴ酸、ならびに任意にビタミンＢ１およびビタミンＢ６からなり得る。

【0018】

１または複数の実施形態において、活性剤は、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン、チロシンからなる群から選択される１または複数のアミノ酸を更に含み得る。

【0019】

１または複数の実施形態において、本組成物は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン、および任意にチロシン、ならびにクエン酸、コハク酸、およびリンゴ酸からなる活性剤を備えてもよく、当該アミノ酸だけが組成物中に含まれるアミノ酸である。

【0020】

１または複数の実施形態において、本組成物は、任意の化学療法剤、すなわち、急速に成長する細胞の増殖を直接的または間接的に阻害し、抗腫瘍原性効果を及ぼす任意の薬剤のような、任意の他の活性剤を含まなくてもよい。

【0021】

１または複数の実施形態において、本組成物は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン、チロシン、クエン酸、コハク酸、およびリンゴ酸、ならびに任意にビタミンＢ１および／またはビタミンＢ６からなり得る。

【0022】

本組成物は、アミノ酸のイソロイシン、ロイシン、およびバリンを、活性剤の重量に対して３５重量％～６５重量％、好ましくは４２重量％～５６重量％の量で含み得る。

【0023】

ロイシンとクエン酸との重量比は、５～１、好ましくは２．５０～３．５０に含まれ得る。

【0024】

更なる実施形態では、クエン酸の重量またはモル量は、リンゴ酸およびコハク酸の各々の重量またはモル量より高い。好ましくは、クエン酸の重量またはモル量は、リンゴ酸にコハク酸を加えた総重量または総モル量より高い。更なる実施形態では、クエン酸と、リンゴ酸およびコハク酸の合計との重量比は、１．０～４．０、好ましくは１．５～２．５に含まれる。好ましい実施形態では、クエン酸：リンゴ酸：コハク酸の重量比は、１０：１：１～２：１．５：１．５、好ましくは７：１：１～１．５：１：１、より好ましくは５：１：１～３：１：１に含まれる。好ましい実施形態では、クエン酸：リンゴ酸：コハク酸の重量比は、４：１：１である。

【0025】

好ましいイソロイシン：ロイシンのモル比は、０．２～０．７の範囲内、好ましくは０．３０～０．６０の範囲内に含まれ、かつ／または、好ましいバリン：ロイシンの重量比は、０．２～０．７０の範囲内、好ましくは０．３０～０．６５の範囲内に含まれる。

【0026】

更なる実施形態では、トレオニン：ロイシンのモル比は、０．１０～０．９０の範囲内、好ましくは０．２０～０．７０の範囲内に含まれ、かつ／または、リシン：ロイシンの重量比は、０．２０～１．００の範囲内、好ましくは０．４０～０．９０の範囲内に含まれる。

【0027】

好ましい実施形態では、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸の総モル量と、メチオニン、フェニルアラニン、ヒスチジンおよびトリプトファンの総モル量との比は、１．３５より高い。

【0028】

１または複数の実施形態において、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸の合計と、分岐鎖アミノ酸のロイシン、イソロイシン、バリンの合計との重量比は、０．１～０．４、好ましくは０．１５～０．３５に含まれる。

【0029】

更なる実施形態では、分岐鎖アミノ酸のロイシン、イソロイシン、バリンにトレオニンおよびリシンを加えた総重量は、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸の３つの酸の総重量より高い。好ましくは、単一酸（クエン酸、コハク酸またはリンゴ酸）の重量は、単一アミノ酸のロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニンおよびリシンの各々の重量よりも少ない。

【0030】

更なる実施形態では、リシンおよびトレオニンの総モル量は、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸の３つの酸の総モル量より高い。好ましくは、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸の３つの酸の総モル量と、リシンおよびトレオニンの総モル量との比は、０．１～０．７、好ましくは０．１５～０．５５に含まれる。

【0031】

１または複数の実施形態において、本明細書で開示される組成物は、ビタミン類を更に含み、このビタミン類は、好ましくは、ビタミンＢ_１および／またはビタミンＢ_６などのビタミンＢ群から選択される。本組成物は、炭水化物、香味物質、天然甘味料および人工甘味料、賦形剤を含み得る。賦形剤は、マルトデキストリン、フルクトース、魚油、スクラロース、ショ糖エステル、ビタミンＤ３、ビタミンＢ群から選択され得る。

【0032】

１または複数の実施形態において、本組成物は、薬学的に許容されるビヒクルと、上記で開示したような少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とを更に備える医薬組成物であり得る。

【0033】

本明細書で開示されるアミノ酸は、それぞれの薬学的に許容される誘導体、すなわち塩で置き換えられ得る。

【0034】

更に、特に本開示による組成物、具体的には活性剤を調製する際、アミノ酸のアルギニンは回避される。加えて、本明細書で開示される組成物によって具体的に除外される更なるアミノ酸は、セリン、プロリン、アラニンである。そのようなアミノ酸は、組成物中のある濃度または化学量論比では、逆効果または有害でさえあり得る。

【0035】

経口使用の場合、本明細書に記載の組成物は、錠剤、カプセル、顆粒、ゲル、ゼリー化粉末、粉末の形態をとり得る。

【0036】

本開示はまた、対象の癌を予防および／または治療する方法を提供し、本方法は、活性剤を有する組成物を選択する段階であって、当該活性剤は、アミノ酸のロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニン、リシン、ならびにカルボン酸のクエン酸、コハク酸、およびリンゴ酸を含む、段階と、組成物を対象に投与する段階とを備える。活性剤は、本明細書で開示されるように、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン、チロシンからなる群から選択される１または複数のアミノ酸を更に含み得る。本組成物は単独で投与されてもよく、したがって本方法の本質は、組成物を選択する段階と、組成物を対象に投与する段階とにある。１または複数の実施形態において、本組成物は、少なくとも１つの化学療法剤、好ましくは少なくとも１つのアントラサイクリンと同時に、別々に、または順次投与されてもよく、より好ましくは、当該少なくとも１つのアントラサイクリンは、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、ピクサントロン、サバルビシン、バルルビシン、それらの誘導体からなる群から選択される。

【0037】

組成物により提供される様々なアミノ酸の量および比に関する更なる仕様は、本発明に関して本明細書で提供される技術的教示の不可欠な部分をなす添付の特許請求の範囲に含まれる。

【実施例】

【0038】

表１は、本願で開示される組成物（名称「α５」）を示す。この組成物は、クエン酸、コハク酸、およびリンゴ酸と組み合わせてアミノ酸を含む活性剤を備え、いかなる化学療法剤も含まない。

【表1】

上記の表１の組成物は、まず、０．８メッシュですべての成分を篩分けることにより調製することができる。予備混合物を得るには、各成分（総量の１０重量％未満の量）をＬ－リシンＨＣｌの一部と共にポリエチレン袋にとり、組成物全体の重量の１０％を得る。次に、袋を５分間手で振る。次に、予備混合物を残りの成分と共にミキサ（Ｐｌａｎｅｔａｒｉａ）に入れ、１２０ｒｐｍで１５分間混合して均一な最終組成物を得る。
［方法］

【0039】

［細胞および処理］
使用した細胞株は、Ｂ１６Ｆ１０（マウス黒色腫、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－６４７５）、Ｃ２Ｃ１２（マウス筋芽細胞、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－１７７２）、ＨｅＬａ（ヒト腺癌、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－２）、Ｄｅｔｒｏｉｔ ５７３（ヒト線維芽細胞、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－１１７）、ＮＩＨ３Ｔ３（マウス胎児線維芽細胞、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－１６５８）、ＭＣＦ－７（ヒト乳癌細胞株、ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ－２２）、ＨＣＴ１１６（ヒト大腸癌細胞ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ－２４７）、Ｍ１４（ヒト黒色腫）［Ｃｈｅｅ ＤＯ ｅｔ ａｌ． １９７６ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ３６（４）：１５０３－９］、ＨＣＴ１１６ ＴＰ５３（－／－）（ｐ５３ヌルヒト大腸癌細胞）［Ｓｕｒ Ｓ ｅｔ ａｌ． ２００９ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １０；１０６（１０）］、ＨＬ－１（マウス心筋細胞）［Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ミラノ、イタリア）（ＳＣＣ０６５）］であった。

【0040】

４ｍＭのグルタミン、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、および１００単位／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（すべてＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ミラノ、イタリア）の試薬）を補った標準的なダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）において、細胞を定型的に８０％コンフルエンシーまで成長させた。α５での処理のためには、示された期間にわたり、完全ＤＭＥＭ中で、または同じ培地に溶解させたα５混合物の１％溶液と共に、細胞をインキュベートした。

【0041】

ＭＣＦ－７細胞を上記のようにＤＭＥＭ中で培養し、１％のα５組成物で４８時間処理し、１μＭのドキソルビシン（ＤＯＸ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ミラノ、イタリア）で１６時間処理した（図７）。

【0042】

［生存率アッセイ］
標準的なＭＴＴ［３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド］アッセイを使用し、細胞の生存率を決定した。すべての処理は、９６ウェルプレートにて、１００μＬの培地中、２×１０^４個の細胞／ウェルを使用して行った。紫色のホルマザン結晶を５％ ＳＤＳ／０．１Ｍ ＨＣｌ（１００μＬ／ウェル）に溶解させ、吸光度をマイクロプレートリーダーにて５７０ｎｍの波長で記録した。

【0043】

［単一層創傷治癒アッセイ］
細胞を２４ウェルプレート内の成長培地中でフルコンフルエンスまで成長させ、次に、コントロールまたはα５含有培地中で一晩インキュベートした。次に、細胞培養物を２００μＬ滅菌ピペットチップで掻爬し、ＰＢＳで十分に洗浄して、分離した細胞および残骸を除去した。次に、遊走能の回復を評価するために、顕微鏡像を１６～２４時間後に収集した。

【0044】

［クローン原性生存率アッセイ］
コントロールＤＭＥＭまたはα５組成物で処理する１日前に、１００～１０００個の細胞を三連で６ウェルプレートに播種した。次に、約１０日間、細胞がコロニーを形成するまで、ＤＭＥＭまたはα５培地中で成長させた。生存したコロニーを１００％メタノールで固定し、メタノール中のメチレンブルーで染色した。少なくとも３つの独立した生物学的実験を実行した。

【0045】

［ウエスタンブロット分析］
プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を補った溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、４００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭピロリン酸Ｎａ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１０％グリセロール）を使用し、全細胞抽出物を単離した。ＢＣＡタンパク質アッセイを使用し、単離されたタンパク質の濃度を決定した。１５～２０マイクログラムのタンパク質を４～２０％のＴｒｉｓ－グリシンゲル上で分離し、ニトロセルロース膜またはＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、セグラーテ（ＭＩ）、イタリア）に電気泳動で転写した。ＴＢＳ－Ｔ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０）中で５％の脱脂粉乳と６０分インキュベーションした後、膜をＴＢＳ－Ｔで１回洗浄し、適切な抗体と４℃で１２時間インキュベートした。膜を１０分間にわたり３回洗浄し、抗マウス抗体または抗ウサギ抗体の西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートの１：３０００希釈物と共に２時間インキュベートした。ブロットをＴＢＳ－Ｔで３回洗浄し、ＥＣＬ系で展開した。使用した抗体は、ｐ－ｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔｈｒ３８９）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇカタログ番号９２０５）、ｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇカタログ番号９２０２）、ＨＩＦ１－α（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号６１０９５８）、ＧＡＰＤＨ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇカタログ番号２１１８）、ＣｙｔＣ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇカタログ番号４２８０）、ＣＯＸＩＶ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇカタログ番号４８４４）、ＰＡＲＰ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ ＃４３３８）、カスパーゼ３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇカタログ番号９６６２）であった。
［酸素消費率（ＯＣＲ）および細胞外酸性化率（ＥＣＡＲ）の測定］
溶解したＯ_２の変化率（酸素消費率、ＯＣＲ）およびｐＨの変化率（細胞外酸性化率、ＥＣＡＲ）を、製造元の説明に従ってＸＦ２４ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定した。

【0046】

細胞（ウェル当たり２～４×１０^３個）をＸＦ２４細胞培養マイクロプレート（Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）にプレーティングし、１８時間後、ＣＯ_２を含まないインキュベータにおいて、グルコースを補った重炭酸塩を含まないＤＭＥＭ（Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、３７℃で１時間にわたって平衡化した。基礎ＯＣＲ測定の後、次に、化合物のオリゴマイシン（２μＭ）、脱共役剤のカルボニルシアニド－４－（トリフルオロメトキシ）－フェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）（１μＭ）、ならびに電子伝達阻害剤のロテノンおよびアンチマイシンＡ（Ｒ／Ａ）（いずれも０．５μＭ）をウェルに注入して、脱共役呼吸、最大呼吸、および非ミトコンドリア呼吸をそれぞれモニタリングした。化合物を示されている時間でウェルに注入した。

【0047】

［酸性ホスファターゼアッセイ］
ＭＣＦ７細胞の成長を定量するために、［Ｙａｎｇ ＴＴ ｅｔ ａｌ． １９９６ Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４１（１）：１０３－８］に説明されているように、酸性ホスファターゼアッセイを使用した。簡単に述べると、ＭＣＦ７細胞をウェル当たり細胞５，０００個～２０，０００個の密度で９６ウェルプレートに入れ、１％のα５（４８時間）および１μＭのＤＯＸ（１６時間）で処理した。培養培地を除去し、各ウェルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）で１回洗浄し、０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、および５ｍＭ ｐ－ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）を含む緩衝液１００μｌを添加した。次に、プレートを３７℃のインキュベータに２時間入れた。１０μｌの１Ｎ ＮａＯＨを添加して反応を停止させ、発色を４０５ｎｍで評価した。細胞を含まないウェルにおいて、ｐＮＰＰの非酵素加水分解を測定した。

【0048】

［統計分析］
スチューデントｔ検定（両側、独立、独立）を使用して、異なる群の平均のペアワイズ比較を実行した。データはｐ＜０．０５で有意とみなした。
［結果］

【0049】

［癌細胞の増殖、運動性、およびクローン形成能力に対するα５組成物の阻害効果］
α５組成物の投与の効果を、まず、ｉｎ ｖｉｔｒｏ癌細胞増殖について試験した。この目的のために、様々な癌細胞株をα５組成物（１％）と共にインキュベートした。図１に示すように、α５組成物は、コントロール培地のみを用いる培養下で成長させた細胞に対して、癌細胞の成長を減少させた。最も重要なことに、α５による処理は、正常な非癌細胞の成長には影響を与えなかった。留意すべき点は、α５が、ＨＣＴ１１６の野生型（ＷＴ）とｐ５３－／－の両方の生存率を低減させたことであり、したがって、ｐ５３の非存在下でもその有効性が立証された。最も重要な腫瘍抑制遺伝子のうちの１つであるｐ５３は、多くの腫瘍において変異しており不活性であるため、したがってこのデータは、α５の作用の範囲を大幅に拡大する。

【0050】

注目すべきことに、α５混合物は、早ければ処理の開始から２４時間後には癌細胞の成長を阻害することができた。この迅速な効果は、ＷＴとｐ５３－／－の両方のＨＣＴ１１６細胞およびＨｅｌａにおいて特に顕著であった（それぞれ４９％、４４％、および４６％の阻害）。次に、α５の成長阻害効果は４８時間時点で更に増大し、７２時間までには、７４％、６１％、および７０％の阻害率に達した。しかしながら、この混合物は、ヒトとマウスの両方の黒色腫細胞にも有効であった。特に、７２時間時点において、α５は、マウスＢ１６Ｆ１０マウス黒色腫の成長を８７％阻害した。

【0051】

α５組成物の投与はまた、Ｂ１６Ｆ１０における掻創アッセイによって評価すると、癌細胞の運動性を低減させた。コンフルエント細胞を掻爬し（０時間）、次にコントロール培地またはα５組成物中でインキュベートした。図２に示すように、掻爬の２４時間後、コントロール培地中でインキュベートした細胞は、増殖および運動を再開し、一方、α５中でインキュベートしたものは、増殖および運動を再開せず、したがって、低減した遊走能を示した。

【0052】

更に、コロニー形成アッセイにおいて単細胞のクローン形成能を検証したとき、α５組成物はまた、ＨｅＬａ細胞におけるクローン形成能力を完全にブロックした。図３に示すように、コントロール培地中でインキュベートした細胞は、１０日間の成長中に単細胞由来コロニーを効率的に形成した一方で、α５組成物でのインキュベーションは、ＨｅＬａ細胞がコロニーを形成する能力を大幅に低減させ、したがって、α５が、癌細胞の複製能力および無制限に分裂する癌の能力をブロックすることが裏付けられた。

【0053】

［α５組成物は癌細胞のアポトーシス細胞死を促進する］
観察された細胞増殖の低減が細胞分裂のブロックに起因したのか細胞死の誘導に起因したのかを評価するために、Ｍ１４黒色腫中で様々なアポトーシスマーカーを分析した。アポトーシス中、ミトコンドリアタンパク質であるシトクロムＣ（ＣｙｔＣ）が細胞の細胞基質中に放出されることはよく知られている。この目的のために、Ｍ１４細胞をコントロールまたはα５培地中で２４時間インキュベートし、その後、ミトコンドリア（ｍｉｔｏ）を細胞質画分から分離させることにより（ミトコンドリアを除いた後の上清、Ｐｏｓｔ－ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ－ＰＭＳ）、細胞分画を実行した。次に、ミトコンドリアとＰＭＳの両方にウエスタンブロット分析を実行することにより、ＣｙｔＣの局在を評価した。ＰＭＳへのＣｙｔＣの放出がアポトーシスに特有の結果であり、ミトコンドリア障害（すなわち、分画過程中の）の結果ではないことを検証することを目的としたコントロールとして、アポトーシス中に放出されないシトクロムオキシダーゼ４（Ｃｏｘ４）の局在も評価した。

【0054】

図４に示すように、イムノブロット分析は、α５中で２４時間インキュベートしたＭ１４細胞のＰＭＳにおいて、特異的ＣｙｔＣ転座を示したが、特異的Ｃｏｘ４転座は示さなかった。更に、Ｍ１４黒色腫細胞において、α５組成物による処理の２４時間後には、別のよく知られているアポトーシスマーカーである明らかなＰａｒｐ－１切断が明白であった。加えて、２４時間のα５組成物は、Ｍ１４黒色腫細胞におけるアポトーシス促進性カスパーゼ３の切断および形成も誘導した（図４）。

【0055】

これらの結果は、α５組成物が癌細胞のアポトーシス細胞死を促進するという証拠を強く支持している。

【0056】

［ｐｈｏｓｐｈｏ－ｐ７０Ｓ６ｋおよびＨＩＦ１αの発現に対するα５組成物の阻害効果］
細胞内アミノ酸の主要な標的の１つは、ラパマイシン機構的標的（ｍＴＯＲ）経路であり、これは、その下流エフェクターｐ７０Ｓ６キナーゼをリン酸化することにより、栄養シグナルをタンパク質合成および細胞成長の誘導と統合する、細胞の成長および分裂の主要な調節因子である。

【0057】

ｍＴＯＲ経路は数種の癌で調節不全になり、その活性化は細胞の発癌過程と高頻度で関連しており、したがって腫瘍原性を高めるので、本願の発明者は、標準培養培地ＤＭＥＭまたはα５組成物で処理した癌細胞におけるｍＴＯＲ活性の読み出し情報として、ｐ７０Ｓ６のリン酸化状態についても調査した。

【0058】

図５に示すように、ｐ７０Ｓ６キナーゼリン酸化レベルは、α５で処理したＭ１４細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＢ１６Ｆ１０細胞において、標準培養培地中でインキュベートした細胞（図５の縦列「ＮＴ」または「未処理」）に対して低下した。これらの結果は、α５組成物が、驚いたことに、ｍＴＯＲ経路に阻害効果を及ぼし、したがってその活性化を阻止したことを示す。非常に興味深いことに、ｐ７０Ｓ６ｋのリン酸化は、正常なＤｅｔｒｏｉｔ ５７３細胞では影響を受けなかった。

【0059】

最も重要なことに、α５組成物はまた、Ｍ１４細胞とＨｅＬａ細胞の両方において、腫瘍形成に関わる最も重要な癌遺伝子のうちの１つである低酸素誘導因子１アルファ（ＨＩＦ１α）の発現レベルを下方制御した（図５）。

【0060】

主要な癌遺伝子として、ＨＩＦ１αは、癌の解糖の極めて重要な調節因子でもあるため、未処理（ＮＴ）またはα５組成物と共に１時間インキュベートした癌細胞と正常細胞の両方で、解糖速度の測度として、細胞外酸性化率（ＥＣＡＲ）を分析した。図６に示すように、α５組成物での処理は、癌細胞における基礎ＥＣＡＲを有意に下方制御し（ＮＴに対してｐ＜０．０１）、一方で、コントロール（ＮＳ）の非腫瘍ＨＬ－１心筋細胞における解糖をわずかに減少させた。しかしながら、ＯＣＲは、Ｍ１４およびＨｅＬａでは上方制御されなかった一方で、ＨＬ－１コントロール心筋細胞では大幅に増大した（ＮＴに対してｐ＜０．０１）。

【0061】

これらのデータは、急性のα５組成物が癌細胞における解糖をブロックする一方で、正常細胞のみにおいてＯＣＲを同時に増大させることを立証する。

【0062】

［ＤＯＸの抗増殖効果はα５組成物の存在下のＭＣＦ７乳癌細胞で増強される］
単独またはドキソルビシン（ＤＯＸ）と組み合わせたα５組成物にＭＣＦ７乳癌細胞株を曝露する効果を、２つの異なるアッセイで評価した（図７）。ＭＣＦ７細胞におけるＤＯＸの抗増殖効果は、アミノ酸の存在に全く影響されなかった（図７）。非常に興味深いことに、癌細胞に対する抗増殖効果は、ＤＯＸをα５組成物と共に投与すると増強される。

【0063】

まとめると、結果は、本明細書で開示される組成物が、癌細胞増殖をブロックできることを示している。注目すべきことに、正常細胞の増殖は、かなりの安全性プロファイルがあり有毒な副作用のないα５組成物に影響されなかったため、この効果は、癌細胞に特異的である。

【0064】

最も重要なことには、α５組成物は、その下流標的ｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化（活性）の低減によって評価すると、ｍＴＯＲ経路に対して阻害効果を及ぼす。繰り返しになるが、ｍＴＯＲ活性の増大は腫瘍形成に関連付けられることが多く、必須アミノ酸ベースの組成物はｍＴＯＲ経路を活性化することが知られているため、これは注目に値する。

【0065】

本明細書で開示される組成物は、特定のアミノ酸およびトリカルボン酸（ＴＣＡサイクル中間体）を含む。本組成物の投与は、ミトコンドリア活性およびＯＣＲを上昇させることができ、結果として、代謝活性が解糖から離れてアミノ酸およびＴＣＡサイクル中間体の酸化に移り、解糖の下方制御につながる。

【0066】

非常に驚いたことに、そのような切り替えは、癌細胞における解糖を効果的に阻害するが、非癌細胞でのみ起こった（図６に示すとおり）。この結果は、癌細胞の解糖に対する極めて高い感受性が原因であり得、α５組成物が及ぼすその急速な阻害は、ＯＣＲへの切り替えが起こり得る前にアポトーシスの発生を活性化する可能性が高い。

【0067】

したがって、本願の組成物は、副作用を呈することなく癌細胞の増殖率を低減させるのに有効であることが示された。

【0068】

本組成物は、単独で使用されても、少なくとも１つの化学療法剤との複合製剤で使用されてもよい。本明細書で提供される結果は、ドキソルビシンと共に投与した場合、癌細胞増殖率が更に低減することを示している。したがって、併用療法の効果は、化学療法薬の投与量を大幅に低減させることも可能にし、したがって、より効率的かつ安全な抗癌手法につながる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】