▶ 株式会社島津製作所の特許一覧 ▶ 国立大学法人島根大学の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-26
(45)【発行日】2024-09-03
(54)【発明の名称】分析方法および分析装置
(51)【国際特許分類】
G01N 30/72 20060101AFI20240827BHJP
G01N 30/88 20060101ALI20240827BHJP
G01N 30/06 20060101ALI20240827BHJP
G01N 30/86 20060101ALI20240827BHJP
G01N 33/66 20060101ALI20240827BHJP
G01N 27/62 20210101ALI20240827BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20240827BHJP
C12Q 1/34 20060101ALI20240827BHJP
【ＦＩ】
G01N30/72 C
G01N30/88 E
G01N30/06 E
G01N30/86 D
G01N33/66 Z
G01N27/62 V
C12M1/34 A
C12Q1/34
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2023093555
(22)【出願日】2023-06-06
(62)【分割の表示】P 2019076220の分割
【原出願日】2019-04-12
(65)【公開番号】P2023118717
(43)【公開日】2023-08-25
【審査請求日】2023-07-06
(31)【優先権主張番号】P 2018077555
(32)【優先日】2018-04-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３０年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、成育疾患克服等総合研究事業「タンデムマス・スクリーニングへのオルニチントランスカルバミラーゼ欠損症の追加、およびムコ多糖症の新規スクリーニング法の開発および適用に関する研究」委託研究開発、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
(73)【特許権者】
【識別番号】000001993
【氏名又は名称】株式会社島津製作所
(73)【特許権者】
【識別番号】504155293
【氏名又は名称】国立大学法人島根大学
(74)【代理人】
【識別番号】100108523
【弁理士】
【氏名又は名称】中川 雅博
(74)【代理人】
【識別番号】100125704
【弁理士】
【氏名又は名称】坂根 剛
(74)【代理人】
【識別番号】100187931
【弁理士】
【氏名又は名称】澤村 英幸
(72)【発明者】
【氏名】田中 美砂
(72)【発明者】
【氏名】渡邉 淳
(72)【発明者】
【氏名】小林 弘典
(72)【発明者】
【氏名】飯田 哲生
【審査官】高田 亜希
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１４－５３２４４２（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１６／００４５８９４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１６－５２９９１０（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１４／０２４９０５４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】LIU, Yang et al.，Multiplex Tandem Mass Spectrometry Enzymatic Activity Assay for Newborn Screening of the Mucopolysac，Clinical Chemistry，2017年，Vol.63, No.6，pp.1118-1126
【文献】Antonina Gucciardi et al.，A column-switching HPLC-MS/MS method formucopolysaccharidosis type I analysis in amultiplex assay for the simultaneous newbornscreening of six lysosomal storage disorders，Biomed.Chromatogr.，John Wiley &Sons, Ltd. 掲，2014年01月22日，28巻・8号，1131－1139
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３０／００ －３０／９６
Ｂ０１Ｊ ２０／２８１－２０／２９２
Ｇ０１Ｎ ３３／６６
Ｇ０１Ｎ ２７／６０ －２７／９２
Ｃ１２Ｍ １／００ － ３／１０
Ｃ１２Ｑ １／００ － ３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ライソゾーム病において、患者の体内で減少若しくは欠損しているかまたは正常に働いていない４以上の酵素の基質と、前記４以上の酵素のうち生体から取得した試料に含まれている酵素とを反応させ、反応生成物を生成することと、前記反応生成物を液体クロマトグラフィにより分離することと、
分離された前記反応生成物を質量分析により検出することとを備え、
前記液体クロマトグラフィにより分離することは、
２種類の移動相を用いたグラジエント溶離により分離することと、
前記反応生成物の保持時間が対応する前記基質の保持時間より短くなるように直鎖炭化水素が結合されたシランが充填された逆相カラムにより分離することとを含み、
前記４以上の酵素は、α－Ｌ－イズロニダーゼ、イズロン酸－２－スルファターゼ、α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼおよびＮ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼからなる群から選択される４以上の酵素を含み、
前記逆相カラムは、イソブチル基が導入されていることを特徴とする、分析方法。
【請求項2】
請求項１に記載の分析方法において、前記酵素は、ライソゾーム病において、前記患者の体内で減少若しくは欠損しているかまたは正常に働いていない５以上の酵素である分析方法。
【請求項3】
請求項１または２に記載の分析方法において、前記酵素は、５以上のムコ多糖症の各病型毎に、患者の体内で減少若しくは欠損しているかまたは正常に働いていない酵素を含む分析方法。
【請求項4】
請求項１から３までのいずれか一項に記載の分析方法において、前記酵素は、α－Ｌ－イズロニダーゼ、α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼおよびＮ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼを含む分析方法。
【請求項5】
請求項１から４までのいずれか一項に記載の分析方法において、生成された前記反応生成物と前記基質とを含む溶液が、液体クロマトグラフに導入され、
前記反応生成物および前記基質が前記液体クロマトグラフィにより分離される分析方法。
【請求項6】
請求項１から５までのいずれか一項に記載の分析方法において、前記液体クロマトグラフィが終了するときの保持時間は３分より短い分析方法。
【請求項7】
請求項１から６までのいずれか一項に記載の分析方法において、前記逆相カラムは、Ｃ１８が充填されていることを特徴とする分析方法。
【請求項8】
請求項１から７までのいずれか一項に記載の分析方法において、前記２種類の移動相のうち、一方の移動相が０．１％ギ酸を水に溶解させたものであり、他方の移動相が０．１％ギ酸をアセトニトリルに溶解させたものであることを特徴とする、分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、分析方法および分析装置に関する。
【背景技術】
【0002】
ライソゾーム病は、タンパク質、脂肪および糖等を分解する酵素が、遺伝的原因により
減少または欠損したり、正常に働かなくなることで、ライソゾームにおいて分解されるべ
き物質が蓄積し、細胞死や臓器等の組織の機能不全を起こす病気である。例えば、ムコ多
糖症では、ライソゾーム内で働く加水分解酵素の欠損等により、ライソゾームにムコ多糖
であるグリコサミノグリカンが蓄積する。ムコ多糖症の患者は骨および関節の異常や、知
能障害等の様々な症状により、成人までに死亡する例も少なくない。
減少または欠損したり、正常に働かなくなることで、ライソゾームにおいて分解されるべ
き物質が蓄積し、細胞死や臓器等の組織の機能不全を起こす病気である。例えば、ムコ多
糖症では、ライソゾーム内で働く加水分解酵素の欠損等により、ライソゾームにムコ多糖
であるグリコサミノグリカンが蓄積する。ムコ多糖症の患者は骨および関節の異常や、知
能障害等の様々な症状により、成人までに死亡する例も少なくない。
【0003】
ライソゾーム病は、酵素補充療法や造血幹細胞移植等により治療がなされるが、予後を
よくするためには早期の発見が重要である。従って、新生児に対してライソゾーム病の原
因遺伝子に対応する酵素が十分に産生されているかを調べるスクリーニング検査を行うこ
とが提案されている（非特許文献１参照）。
よくするためには早期の発見が重要である。従って、新生児に対してライソゾーム病の原
因遺伝子に対応する酵素が十分に産生されているかを調べるスクリーニング検査を行うこ
とが提案されている（非特許文献１参照）。
【0004】
このようなスクリーニング検査において、血液試料に各ライソゾーム病と関連する酵素
の基質を加え、酵素反応による反応生成物をタンデム質量分析計や液体クロマトグラフ－
質量分析計を用いて検出し、生体内での酵素の活性を測定することが行われている（特許
文献１参照）。
の基質を加え、酵素反応による反応生成物をタンデム質量分析計や液体クロマトグラフ－
質量分析計を用いて検出し、生体内での酵素の活性を測定することが行われている（特許
文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】日本国特表２０１７－５２６９２３号公報
【非特許文献】
【0006】
【文献】Michael H. Gelb, C. Ronald Scott, and Frantisek Turecek. "New born screening for lysosomal storage diseases," Clinical chemistry,（米国）, American Association for Clinical Chemistry, 2015年1月、Volume 61, Issue 2, pp.335-346
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
しかしながら、質量分析において、質量分析用試料に含まれる、ライソゾーム病に関連
する酵素の基質がイオン化された後に解離を起こし、解離されたイオンが反応生成物と区
別が難しくなってしまう等の理由で、反応生成物を十分に分離して検出することができな
い問題があった。
する酵素の基質がイオン化された後に解離を起こし、解離されたイオンが反応生成物と区
別が難しくなってしまう等の理由で、反応生成物を十分に分離して検出することができな
い問題があった。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明の好ましい実施形態による分析方法は、ライソゾーム病において、患者の体内で減少若しくは欠損しているかまたは正常に働いていない４以上の酵素の基質と、前記４以上の酵素のうち生体から取得した試料に含まれている酵素とを反応させ、反応生成物を生成することと、前記反応生成物を液体クロマトグラフィにより分離することと、分離された前記反応生成物を質量分析により検出することとを備え、前記液体クロマトグラフィにより分離することは、２種類の移動相を用いたグラジエント溶離により分離することと、前記反応生成物の保持時間が対応する前記基質の保持時間より短くなるように直鎖炭化水素が結合されたシランが充填された逆相カラムにより分離することとを含み、前記４以上の酵素は、α－Ｌ－イズロニダーゼ、イズロン酸－２－スルファターゼ、α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼおよびＮ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼからなる群から選択される４以上の酵素を含む。
さらに好ましい実施形態では、前記酵素は、ライソゾーム病において、前記患者の体内で減少若しくは欠損しているかまたは正常に働いていない５以上の酵素である。
さらに好ましい実施形態では、前記酵素は、５以上のムコ多糖症の各病型毎に、患者の体内で減少若しくは欠損しているかまたは正常に働いていない酵素を含む。
さらに好ましい実施形態では、前記酵素は、α－Ｌ－イズロニダーゼ、α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼおよびＮ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼを含む。
さらに好ましい実施形態では、生成された前記反応生成物と前記基質とを含む溶液が、液体クロマトグラフに導入され、前記反応生成物および前記基質が前記液体クロマトグラフィにより分離される。
さらに好ましい実施形態では、前記逆相カラムは、イソブチル基が導入されていることを特徴とする。
さらに好ましい実施形態では、前記逆相カラムは、Ｃ１８が充填されていることを特徴とする。
さらに好ましい実施形態では、前記２種類の移動相のうち、一方の移動相が０．１％ギ酸を水に溶解させたものであり、他方の移動相が０．１％ギ酸をアセトニトリルに溶解させたものであることを特徴とする。
さらに好ましい実施形態では、前記酵素は、ライソゾーム病において、前記患者の体内で減少若しくは欠損しているかまたは正常に働いていない５以上の酵素である。
さらに好ましい実施形態では、前記酵素は、５以上のムコ多糖症の各病型毎に、患者の体内で減少若しくは欠損しているかまたは正常に働いていない酵素を含む。
さらに好ましい実施形態では、前記酵素は、α－Ｌ－イズロニダーゼ、α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼおよびＮ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼを含む。
さらに好ましい実施形態では、生成された前記反応生成物と前記基質とを含む溶液が、液体クロマトグラフに導入され、前記反応生成物および前記基質が前記液体クロマトグラフィにより分離される。
さらに好ましい実施形態では、前記逆相カラムは、イソブチル基が導入されていることを特徴とする。
さらに好ましい実施形態では、前記逆相カラムは、Ｃ１８が充填されていることを特徴とする。
さらに好ましい実施形態では、前記２種類の移動相のうち、一方の移動相が０．１％ギ酸を水に溶解させたものであり、他方の移動相が０．１％ギ酸をアセトニトリルに溶解させたものであることを特徴とする。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、ムコ多糖症等のライソゾーム病に関連する４以上の酵素の活性を、迅
速に測定することができる。
速に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下、図を参照して本発明を実施するための形態について説明する。以下の実施形態で
は、ライソゾーム病の各疾患において、遺伝的原因により患者の体内で減少若しくは欠損
しているかまたは正常に働いていない酵素を、ライソゾーム病関連酵素と呼ぶ。ここで、
「疾患」とは、ライソゾーム病関連酵素ごとに対応して定義され、例えばムコ多糖症にお
ける病型のそれぞれを指すものとする。
は、ライソゾーム病の各疾患において、遺伝的原因により患者の体内で減少若しくは欠損
しているかまたは正常に働いていない酵素を、ライソゾーム病関連酵素と呼ぶ。ここで、
「疾患」とは、ライソゾーム病関連酵素ごとに対応して定義され、例えばムコ多糖症にお
ける病型のそれぞれを指すものとする。
【0012】
図１は、本実施形態の分析方法を説明するための概念図である。本実施形態の分析方法
は、所定の数のライソゾーム病の疾患、特にムコ多糖症の病型に対応するライソゾーム病
関連酵素の基質と、試料に含まれている酵素とを反応させ、得られた反応生成物を液体ク
ロマトグラフィにより分離するものである。
は、所定の数のライソゾーム病の疾患、特にムコ多糖症の病型に対応するライソゾーム病
関連酵素の基質と、試料に含まれている酵素とを反応させ、得られた反応生成物を液体ク
ロマトグラフィにより分離するものである。
【0013】
生体から採取された血液等の試料Ｓｐに含まれるライソゾーム病関連酵素と、これらの
ライソゾーム関連酵素の基質とを反応させる操作が行われる。ここで、試料Ｓｐは、健常
者とライソゾーム病患者との間でライソゾーム病関連酵素の活性が統計等において異なる
試料であれば、特に血液に限定されない。以下では、試料Ｓｐは、人間の被検者から採取
されたものとするが、特に限定されない。被検者は、５歳以下、３歳以下等の子供または
新生児であることが、早期発見によりライソゾーム病の治療による予後をよくするために
好ましい。
ライソゾーム関連酵素の基質とを反応させる操作が行われる。ここで、試料Ｓｐは、健常
者とライソゾーム病患者との間でライソゾーム病関連酵素の活性が統計等において異なる
試料であれば、特に血液に限定されない。以下では、試料Ｓｐは、人間の被検者から採取
されたものとするが、特に限定されない。被検者は、５歳以下、３歳以下等の子供または
新生児であることが、早期発見によりライソゾーム病の治療による予後をよくするために
好ましい。
【0014】
以下では、試料Ｓｐを血液とし、乾燥血液スポット（Ｄｒｉｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｓｐｏ
ｔ；ＤＢＳ）を用いて試料Ｓｐと基質とを反応させる例を説明する。乾燥血液スポットは
、全血をそのまま使用することができるため、遠心分離が不要で操作が少なくて済み、採
血量も少なくて済む等の利点がある。試料Ｓｐは、ピペットＰ１等の分注用器具または分
注装置を用い、ろ紙Ｃの取り外し可能部分Ｄ全体に試料Ｓｐがしみ込むようにろ紙Ｃに滴
下される。ろ紙Ｃに滴下された試料Ｓｐは、数時間等乾燥に供される（矢印Ａ１１）。
ｔ；ＤＢＳ）を用いて試料Ｓｐと基質とを反応させる例を説明する。乾燥血液スポットは
、全血をそのまま使用することができるため、遠心分離が不要で操作が少なくて済み、採
血量も少なくて済む等の利点がある。試料Ｓｐは、ピペットＰ１等の分注用器具または分
注装置を用い、ろ紙Ｃの取り外し可能部分Ｄ全体に試料Ｓｐがしみ込むようにろ紙Ｃに滴
下される。ろ紙Ｃに滴下された試料Ｓｐは、数時間等乾燥に供される（矢印Ａ１１）。
【0015】
乾燥した試料Ｓｐは、ろ紙Ｃ上における乾燥血液スポット（ＤＢＳ）となる。ろ紙Ｃの
取り外し可能部分Ｄは、パンチ等によりろ紙Ｃ本体から取り外しが容易となるように形成
されている。取り外し可能部分Ｄは、例えば直径３ｍｍ～６ｍｍ等の円板状の部分である
。試料Ｓｐを含む取り外し可能部分Ｄが取り外されると、分注用チューブまたはウェルプ
レート等の分注用容器Ｗに配置される（矢印Ａ１２）
取り外し可能部分Ｄは、パンチ等によりろ紙Ｃ本体から取り外しが容易となるように形成
されている。取り外し可能部分Ｄは、例えば直径３ｍｍ～６ｍｍ等の円板状の部分である
。試料Ｓｐを含む取り外し可能部分Ｄが取り外されると、分注用チューブまたはウェルプ
レート等の分注用容器Ｗに配置される（矢印Ａ１２）
【0016】
分注用容器Ｗに配置された、試料Ｓｐを含む取り外し可能部分Ｄに、複数のライソゾー
ム関連酵素の基質Ｓｂと、基質Ｓｂから酵素反応で得られる反応生成物に対応する所定の
量の不図示の内部標準を含む基質溶液が加えられる。内部標準は、内部標準に対応する検
出強度が当該所定の量に対応することにより反応生成物に対応するイオンの定量を行うた
めの物質であり、基質Ｓｂから酵素反応で得られる反応生成物の一部の原子を重水素等の
安定同位体で置換した置換体等が適宜用いられる。
なお、乾燥血液スポットを用いずに、予め定められた量の血液を分注等して得られた溶
液と基質溶液を接触させることにより酵素反応を行ってもよい。
ム関連酵素の基質Ｓｂと、基質Ｓｂから酵素反応で得られる反応生成物に対応する所定の
量の不図示の内部標準を含む基質溶液が加えられる。内部標準は、内部標準に対応する検
出強度が当該所定の量に対応することにより反応生成物に対応するイオンの定量を行うた
めの物質であり、基質Ｓｂから酵素反応で得られる反応生成物の一部の原子を重水素等の
安定同位体で置換した置換体等が適宜用いられる。
なお、乾燥血液スポットを用いずに、予め定められた量の血液を分注等して得られた溶
液と基質溶液を接触させることにより酵素反応を行ってもよい。
【0017】
基質溶液が加えられた後、酵素反応のために数時間～数日等、分注用容器Ｗがインキュ
ベーションされる。以下の実施形態で「酵素反応」とはライソゾーム関連酵素と基質Ｓｂ
との酵素反応を指し、「反応溶液」とは酵素反応により得られた溶液を指す。その後、反
応溶液から酵素反応の反応生成物Ｐを含む成分が抽出され分析用試料Ｓａが調製される（
矢印Ａ１３）。反応生成物Ｐの抽出方法は特に限定されないが、液液抽出が液体クロマト
グラフィの分析カラムやイオン源等を保護する上で好ましく、酢酸エチルを用いる液液抽
出が、分析用試料Ｓａにおける基質Ｓｂの量を減少させることができるためより好ましい
。分析用試料Ｓａには、各ライソゾーム関連酵素の基質Ｓｂが残っていてもよく、基質Ｓ
ｂが含まれているものとして以下の説明を行う。
ベーションされる。以下の実施形態で「酵素反応」とはライソゾーム関連酵素と基質Ｓｂ
との酵素反応を指し、「反応溶液」とは酵素反応により得られた溶液を指す。その後、反
応溶液から酵素反応の反応生成物Ｐを含む成分が抽出され分析用試料Ｓａが調製される（
矢印Ａ１３）。反応生成物Ｐの抽出方法は特に限定されないが、液液抽出が液体クロマト
グラフィの分析カラムやイオン源等を保護する上で好ましく、酢酸エチルを用いる液液抽
出が、分析用試料Ｓａにおける基質Ｓｂの量を減少させることができるためより好ましい
。分析用試料Ｓａには、各ライソゾーム関連酵素の基質Ｓｂが残っていてもよく、基質Ｓ
ｂが含まれているものとして以下の説明を行う。
【0018】
調製された分析用試料Ｓａは、液体クロマトグラフに導入され、液体クロマトグラフィ
により反応生成物Ｐと対応する基質Ｓｂとが分離される。液体クロマトグラフから溶出さ
れた溶出試料は、タンデム質量分析計に導入される。異なるライソゾーム病関連酵素に対
応する複数の反応生成物Ｐは、液体クロマトグラフィおよび／または質量分離により分離
される。分離された反応生成物Ｐはタンデム質量分析計の検出部により検出される（矢印
Ａ１４）。各反応生成物Ｐは、液体クロマトグラフィ／タンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／
ＭＳ）により、同時並行に（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）測定される。ここで、「同
時並行に測定される」とは液体クロマトグラフに一度に導入された分析用試料Ｓａに含ま
れる複数の物質が分離されて検出されることを示す。
により反応生成物Ｐと対応する基質Ｓｂとが分離される。液体クロマトグラフから溶出さ
れた溶出試料は、タンデム質量分析計に導入される。異なるライソゾーム病関連酵素に対
応する複数の反応生成物Ｐは、液体クロマトグラフィおよび／または質量分離により分離
される。分離された反応生成物Ｐはタンデム質量分析計の検出部により検出される（矢印
Ａ１４）。各反応生成物Ｐは、液体クロマトグラフィ／タンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／
ＭＳ）により、同時並行に（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）測定される。ここで、「同
時並行に測定される」とは液体クロマトグラフに一度に導入された分析用試料Ｓａに含ま
れる複数の物質が分離されて検出されることを示す。
【0019】
本実施形態の分析方法により活性を測定するライソゾーム病関連酵素は、以下の表１に
挙げられたムコ多糖症の各病型に関連するライソゾーム病関連酵素（以下、ムコ多糖症関
連酵素と呼ぶ）から選択されたものを含むことが好ましい。これにより、試料Ｓｐが採取
された生体が、ムコ多糖症のいずれかの病型を含む、各ライソゾーム関連酵素に対応する
ライソゾーム病に罹患しているか否か、または罹患している疑いがあるか否かを診断する
ための情報を提供することができる。活性を測定するライソゾーム病関連酵素の基質Ｓｂ
が、上述の基質溶液に含められて試料Ｓｐに加えられる。
挙げられたムコ多糖症の各病型に関連するライソゾーム病関連酵素（以下、ムコ多糖症関
連酵素と呼ぶ）から選択されたものを含むことが好ましい。これにより、試料Ｓｐが採取
された生体が、ムコ多糖症のいずれかの病型を含む、各ライソゾーム関連酵素に対応する
ライソゾーム病に罹患しているか否か、または罹患している疑いがあるか否かを診断する
ための情報を提供することができる。活性を測定するライソゾーム病関連酵素の基質Ｓｂ
が、上述の基質溶液に含められて試料Ｓｐに加えられる。
【表1】
【0020】
活性を測定するライソゾーム病関連酵素の種類は、４以上が好ましく、５以上がより好
ましい。活性を測定するライソゾーム病関連酵素の種類が多い程、より多くのライソゾー
ム病の診断のための情報を迅速に提供することができる。活性を測定するライソゾーム病
関連酵素の種類が多すぎると、液体クロマトグラフィおよび質量分析での分離が難しくな
るため、活性を測定するライソゾーム病関連酵素の種類は、適宜５０以下、２０以下、１
０以下等に設定されることが好ましい。
ましい。活性を測定するライソゾーム病関連酵素の種類が多い程、より多くのライソゾー
ム病の診断のための情報を迅速に提供することができる。活性を測定するライソゾーム病
関連酵素の種類が多すぎると、液体クロマトグラフィおよび質量分析での分離が難しくな
るため、活性を測定するライソゾーム病関連酵素の種類は、適宜５０以下、２０以下、１
０以下等に設定されることが好ましい。
【0021】
本実施形態の分析方法により活性を測定するライソゾーム病関連酵素は、ムコ多糖症関
連酵素から選択されることが好ましい。これにより、試料Ｓｐが採取された生体が、各ム
コ多糖症に罹患しているか否か、または罹患している疑いがあるか否かを診断するための
情報を提供することができる。この場合、活性を測定するムコ多糖症関連酵素の基質Ｓｂ
が、上述の基質溶液に含められて試料Ｓｐに加えられる。
連酵素から選択されることが好ましい。これにより、試料Ｓｐが採取された生体が、各ム
コ多糖症に罹患しているか否か、または罹患している疑いがあるか否かを診断するための
情報を提供することができる。この場合、活性を測定するムコ多糖症関連酵素の基質Ｓｂ
が、上述の基質溶液に含められて試料Ｓｐに加えられる。
【0022】
本実施形態の分析方法により活性を測定するムコ多糖症関連酵素は、表１に挙げられた
α－Ｌ－イズロニダーゼ、イズロン酸－２－スルファターゼ、α－Ｎ－アセチルグルコサ
ミニダーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼおよびＮ－アセチルガラ
クトサミン－４－スルファターゼからなる群から選択される４以上のムコ多糖症関連酵素
から選択されることがより好ましい。これにより、被検者が、他のムコ多糖症の病型と比
較して発症率が高い各ムコ多糖症Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ－Ａ型およびＶＩ型か
ら選択されるムコ多糖症の病型に罹患しているか否か、または罹患している疑いがあるか
否かを診断するための情報を提供することができる。
α－Ｌ－イズロニダーゼ、イズロン酸－２－スルファターゼ、α－Ｎ－アセチルグルコサ
ミニダーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼおよびＮ－アセチルガラ
クトサミン－４－スルファターゼからなる群から選択される４以上のムコ多糖症関連酵素
から選択されることがより好ましい。これにより、被検者が、他のムコ多糖症の病型と比
較して発症率が高い各ムコ多糖症Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ－Ａ型およびＶＩ型か
ら選択されるムコ多糖症の病型に罹患しているか否か、または罹患している疑いがあるか
否かを診断するための情報を提供することができる。
【0023】
本実施形態の分析方法により活性を測定するムコ多糖症関連酵素は、表１に挙げられた
α－Ｌ－イズロニダーゼおよび／またはイズロン酸－２－スルファターゼを含むことがさ
らに好ましい。これにより、被検者が、他のムコ多糖症の病型と比較して発症率が特に高
いムコ多糖症Ｉ型および／若しくはＩＩ型に罹患しているか否か、または罹患している疑
いがあるか否かを診断するための情報を提供することができる。
α－Ｌ－イズロニダーゼおよび／またはイズロン酸－２－スルファターゼを含むことがさ
らに好ましい。これにより、被検者が、他のムコ多糖症の病型と比較して発症率が特に高
いムコ多糖症Ｉ型および／若しくはＩＩ型に罹患しているか否か、または罹患している疑
いがあるか否かを診断するための情報を提供することができる。
【0024】
本実施形態の分析方法により活性を測定するムコ多糖症関連酵素は、表１に挙げられた
イズロン酸－２－スルファターゼを含むことが一層好ましい。これにより、被検者が、他
のムコ多糖症の病型と比較して、特定の地域や性別において発症率が特に高いムコ多糖症
ＩＩ型に罹患しているか否か、または罹患している疑いがあるか否かを診断するための情
報を提供することができる。ムコ多糖症ＩＩ型は、人間においてＸ染色体劣性遺伝により
発症するため、男性において多く発症する。男の新生児に対するスクリーニング検査には
ムコ多糖症ＩＩ型についての検査を含めることが好ましい。
イズロン酸－２－スルファターゼを含むことが一層好ましい。これにより、被検者が、他
のムコ多糖症の病型と比較して、特定の地域や性別において発症率が特に高いムコ多糖症
ＩＩ型に罹患しているか否か、または罹患している疑いがあるか否かを診断するための情
報を提供することができる。ムコ多糖症ＩＩ型は、人間においてＸ染色体劣性遺伝により
発症するため、男性において多く発症する。男の新生児に対するスクリーニング検査には
ムコ多糖症ＩＩ型についての検査を含めることが好ましい。
【0025】
本実施形態の分析方法により活性を測定するムコ多糖症関連酵素は、表１に挙げられた
α－Ｌ－イズロニダーゼ、イズロン酸－２－スルファターゼ、α－Ｎ－アセチルグルコサ
ミニダーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼおよびＮ－アセチルガラ
クトサミン－４－スルファターゼであるか、これら５つの酵素を含むことが最も好ましい
。これにより、被検者が、他のムコ多糖症の病型と比較して発症率が高い各ムコ多糖症Ｉ
型、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ－Ａ型およびＶＩ型に罹患しているか否か、または罹患し
ている疑いがあるか否かを診断するための情報を迅速に提供することができる。
α－Ｌ－イズロニダーゼ、イズロン酸－２－スルファターゼ、α－Ｎ－アセチルグルコサ
ミニダーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼおよびＮ－アセチルガラ
クトサミン－４－スルファターゼであるか、これら５つの酵素を含むことが最も好ましい
。これにより、被検者が、他のムコ多糖症の病型と比較して発症率が高い各ムコ多糖症Ｉ
型、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ－Ａ型およびＶＩ型に罹患しているか否か、または罹患し
ている疑いがあるか否かを診断するための情報を迅速に提供することができる。
【0026】
本実施形態の分析方法において用いるムコ多糖症関連酵素の基質Ｓｂは、液体クロマト
グラフィにより反応生成物Ｐの分離が可能であれば特に限定されないが、例えば以下の化
学式（１）で示されるものを用いることができる。
…（１）
グラフィにより反応生成物Ｐの分離が可能であれば特に限定されないが、例えば以下の化
学式（１）で示されるものを用いることができる。
【化1】
…（１）
【0027】
ここで、上記化学式（１）におけるＸ、Ｒ１、Ｒ２およびｎに対応する官能基の一例は
、以下の表２に示される。
、以下の表２に示される。
【表2】
【0028】
【0029】
液体クロマトグラフ１０は、移動相容器１１ａ，１１ｂと、送液ポンプ１２ａ，１２ｂ
と、試料導入部１３と、分析カラム１４とを備える。質量分析計２０は、イオン化部２１
１を備えるイオン化室２１と、イオンレンズ２２１を備える第１真空室２２ａと、イオン
化室２１から第１真空室２２ａへイオンを導入する管２１２と、イオンガイド２２２を備
える第２真空室２２ｂと、第３真空室２２ｃとを備える。第３真空室２２ｃは、第１質量
分離部２３と、コリジョンセル２４と、第２質量分離部２５と、検出部３０とを備える。
コリジョンセル２４は、イオンガイド２４０とＣＩＤガス導入口２４１とを備える。
と、試料導入部１３と、分析カラム１４とを備える。質量分析計２０は、イオン化部２１
１を備えるイオン化室２１と、イオンレンズ２２１を備える第１真空室２２ａと、イオン
化室２１から第１真空室２２ａへイオンを導入する管２１２と、イオンガイド２２２を備
える第２真空室２２ｂと、第３真空室２２ｃとを備える。第３真空室２２ｃは、第１質量
分離部２３と、コリジョンセル２４と、第２質量分離部２５と、検出部３０とを備える。
コリジョンセル２４は、イオンガイド２４０とＣＩＤガス導入口２４１とを備える。
【0030】
情報処理部４０は、入力部４１と、通信部４２と、記憶部４３と、出力部４４と、制御
部５０とを備える。制御部５０は、装置制御部５１と、解析部５２と、出力制御部５３と
を備える。
部５０とを備える。制御部５０は、装置制御部５１と、解析部５２と、出力制御部５３と
を備える。
【0031】
液体クロマトグラフ（ＬＣ）１０は、移動相と分析カラム１４の固定相とに対する各反
応生成物Ｐおよび基質Ｓｂの親和性の違いを利用して、各反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂを
分離し異なる保持時間で溶出させる。液体クロマトグラフ１０は、質量分析計２０により
反応生成物Ｐを検出することが可能な、所望の精度で反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂを分離
することができれば特にその種類は限定されない。液体クロマトグラフ１０として、ナノ
ＬＣ、マイクロＬＣ、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）および超高速液体クロマトグ
ラフ（ＵＨＰＬＣ）等を用いることができる。
応生成物Ｐおよび基質Ｓｂの親和性の違いを利用して、各反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂを
分離し異なる保持時間で溶出させる。液体クロマトグラフ１０は、質量分析計２０により
反応生成物Ｐを検出することが可能な、所望の精度で反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂを分離
することができれば特にその種類は限定されない。液体クロマトグラフ１０として、ナノ
ＬＣ、マイクロＬＣ、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）および超高速液体クロマトグ
ラフ（ＵＨＰＬＣ）等を用いることができる。
【0032】
移動相容器１１ａおよび１１ｂは、バイアル等の液体を格納可能な容器を備え、それぞ
れ異なる組成の移動相を格納する。移動相容器１１ａおよび１１ｂに格納されている移動
相をそれぞれ移動相Ａおよび移動相Ｂと呼ぶ。移動相Ａおよび移動相Ｂは、所望の精度で
反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂを分離することができればその組成は特に限定されず、溶媒
として水、アセトニトリル等、添加剤としてギ酸等を用いることができる。
れ異なる組成の移動相を格納する。移動相容器１１ａおよび１１ｂに格納されている移動
相をそれぞれ移動相Ａおよび移動相Ｂと呼ぶ。移動相Ａおよび移動相Ｂは、所望の精度で
反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂを分離することができればその組成は特に限定されず、溶媒
として水、アセトニトリル等、添加剤としてギ酸等を用いることができる。
【0033】
送液ポンプ１２ａおよび１２ｂは、それぞれ移動相Ａおよび移動相Ｂを所定の流量にな
るように送液する。送液ポンプ１２ａおよび１２ｂからそれぞれ出力された移動相Ａおよ
び移動相Ｂは、流路の途中で混合され、試料導入部１３へと導入される。送液ポンプ１２
ａおよび１２ｂは、それぞれ移動相Ａおよび移動相Ｂの流量を変化させることにより、時
間によって分析カラム１４に導入される移動相の組成を変化させる。
るように送液する。送液ポンプ１２ａおよび１２ｂからそれぞれ出力された移動相Ａおよ
び移動相Ｂは、流路の途中で混合され、試料導入部１３へと導入される。送液ポンプ１２
ａおよび１２ｂは、それぞれ移動相Ａおよび移動相Ｂの流量を変化させることにより、時
間によって分析カラム１４に導入される移動相の組成を変化させる。
【0034】
分析用試料Ｓａの導入等の分析の開始に対応する時点からの各時間における、移動相の
組成を示すデータをグラジエントデータと呼ぶ。グラジエントデータに基づいて送液ポン
プ１２ａおよび１２ｂが制御され、設定された組成の移動相が分析カラム１４に導入され
る。移動相の組成の時間変化は、所望の精度で反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂを分離するこ
とができれば特に限定されないが、１０分未満の保持時間で反応生成物Ｐの全てを分析カ
ラム１４から溶出することが好ましく、７分未満がより好ましく、３分未満がさらに好ま
しく、２分未満が一層好ましく、１．５分未満がより一層好ましい。反応生成物Ｐの保持
時間が短い程、多くの被検者、特に人間の新生児に対して迅速にライソゾーム病のスクリ
ーニング検査を行うことができる。液体クロマトグラフィが停止により終了する際の保持
時間を分析時間と呼ぶ。分析時間は、分析カラム１４等の条件を調整することにより、３
分未満とすることができ、より好ましくは２．５分未満とすることができる点が、発明者
らにより見出された。これにより、効率よく分析を行うことができる。分析時間が短すぎ
ると、液体クロマトグラフィにおける反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂの分離が難しくなるた
め、分析時間は、適宜３０秒以上または１分以上等とすることができる。
組成を示すデータをグラジエントデータと呼ぶ。グラジエントデータに基づいて送液ポン
プ１２ａおよび１２ｂが制御され、設定された組成の移動相が分析カラム１４に導入され
る。移動相の組成の時間変化は、所望の精度で反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂを分離するこ
とができれば特に限定されないが、１０分未満の保持時間で反応生成物Ｐの全てを分析カ
ラム１４から溶出することが好ましく、７分未満がより好ましく、３分未満がさらに好ま
しく、２分未満が一層好ましく、１．５分未満がより一層好ましい。反応生成物Ｐの保持
時間が短い程、多くの被検者、特に人間の新生児に対して迅速にライソゾーム病のスクリ
ーニング検査を行うことができる。液体クロマトグラフィが停止により終了する際の保持
時間を分析時間と呼ぶ。分析時間は、分析カラム１４等の条件を調整することにより、３
分未満とすることができ、より好ましくは２．５分未満とすることができる点が、発明者
らにより見出された。これにより、効率よく分析を行うことができる。分析時間が短すぎ
ると、液体クロマトグラフィにおける反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂの分離が難しくなるた
め、分析時間は、適宜３０秒以上または１分以上等とすることができる。
【0035】
試料導入部１３は、オートサンプラー等の試料導入装置を備え、分析用試料Ｓａを移動
相に導入する（矢印Ａ１）。試料導入部１３により導入された分析用試料Ｓａは、適宜不
図示のガードカラムを通過して分析カラム１４に導入される。
相に導入する（矢印Ａ１）。試料導入部１３により導入された分析用試料Ｓａは、適宜不
図示のガードカラムを通過して分析カラム１４に導入される。
【0036】
分析カラム１４は、固定相を備え、導入された分析用試料Ｓａに含まれる各反応生成物
Ｐおよび基質Ｓｂを、移動相と固定相とに対する各反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂの親和性
の違いを利用して異なる時間に溶出させる。分析カラム１４の種類は、所望の精度で各反
応生成物Ｐおよび基質Ｓｂを分離することができれば特に限定されないが、逆相カラムが
取扱いの容易さや質量分析でのイオン化の容易さの観点から好ましい。分析カラム１４の
固定相は、例えばシリカゲル等の担体に担持された、Ｃ１８等の直鎖炭化水素が結合され
たシランが好ましい。
Ｐおよび基質Ｓｂを、移動相と固定相とに対する各反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂの親和性
の違いを利用して異なる時間に溶出させる。分析カラム１４の種類は、所望の精度で各反
応生成物Ｐおよび基質Ｓｂを分離することができれば特に限定されないが、逆相カラムが
取扱いの容易さや質量分析でのイオン化の容易さの観点から好ましい。分析カラム１４の
固定相は、例えばシリカゲル等の担体に担持された、Ｃ１８等の直鎖炭化水素が結合され
たシランが好ましい。
【0037】
分析カラム１４の長さは、５０ｍｍ未満が好ましく、４０ｍｍ未満がより好ましく、３
０ｍｍ以下がさらに好ましい。分析カラム１４が短いほど、分析にかかる時間が短くなり
、効率よく分析を行うことができるため好ましい。分析カラム１４が短すぎると、液体ク
ロマトグラフィにおける反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂの分離が難しくなるため、分析カラ
ム１４は、３ｍｍより長いことが好ましく、１０ｍｍより長いことがさらに好ましく、２
０ｍｍより長いことが一層好ましく、２５ｍｍより長いことがより一層好ましい。
０ｍｍ以下がさらに好ましい。分析カラム１４が短いほど、分析にかかる時間が短くなり
、効率よく分析を行うことができるため好ましい。分析カラム１４が短すぎると、液体ク
ロマトグラフィにおける反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂの分離が難しくなるため、分析カラ
ム１４は、３ｍｍより長いことが好ましく、１０ｍｍより長いことがさらに好ましく、２
０ｍｍより長いことが一層好ましく、２５ｍｍより長いことがより一層好ましい。
【0038】
分析カラム１４は、各ライソゾーム病関連酵素について、基質Ｓｂが切断されて得られ
た反応生成物Ｐを、当該基質Ｓｂの溶出が開始されるよりも先に、すなわち短い保持時間
で溶出させることが好ましい。
た反応生成物Ｐを、当該基質Ｓｂの溶出が開始されるよりも先に、すなわち短い保持時間
で溶出させることが好ましい。
【0039】
図３（Ａ）は、従来の例として、反応生成物Ｐと基質Ｓｂとが略同時に液体クロマトグ
ラフ１０から溶出する場合の、質量分析における検出強度を模式的に示すクロマトグラム
である。以下の実施形態では、一例として、プリカーサーイオンとして分離したイオンを
解離させて生成イオンを生成し、この生成イオンを分離して検出する、多重反応モニタリ
ング（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ；ＭＲＭ）により反
応生成物Ｐを検出する例を示す。
ラフ１０から溶出する場合の、質量分析における検出強度を模式的に示すクロマトグラム
である。以下の実施形態では、一例として、プリカーサーイオンとして分離したイオンを
解離させて生成イオンを生成し、この生成イオンを分離して検出する、多重反応モニタリ
ング（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ；ＭＲＭ）により反
応生成物Ｐを検出する例を示す。
【0040】
基質Ｓｂは、質量分析計２０のイオン化部２１でイオン化された後、インソース分解に
より反応生成物Ｐのｍ／ｚと略等しいｍ／ｚを有するイオンとなる場合がある。この場合
に、反応生成物Ｐのｍ／ｚに対応するイオンをプリカーサーイオンとして質量分離し、反
応生成物Ｐのフラグメントイオンに対応するｍ／ｚを有するイオンを質量分離して検出し
たクロマトグラムが図３（Ａ）上部のグラフである。このクロマトグラムでは、基質Ｓｂ
がインソース分解されたイオンのフラグメントイオンのピークＰｓ（以下、インソース分
解された基質ｓｂに対応するピークＰｓと呼ぶ）と、反応生成物Ｐのフラグメントイオン
のピークＰｐ（以下、反応生成物Ｐに対応するピークＰｐと呼ぶ）とが重なったピークＰ
ｐ＋Ｐｓが観察される。
より反応生成物Ｐのｍ／ｚと略等しいｍ／ｚを有するイオンとなる場合がある。この場合
に、反応生成物Ｐのｍ／ｚに対応するイオンをプリカーサーイオンとして質量分離し、反
応生成物Ｐのフラグメントイオンに対応するｍ／ｚを有するイオンを質量分離して検出し
たクロマトグラムが図３（Ａ）上部のグラフである。このクロマトグラムでは、基質Ｓｂ
がインソース分解されたイオンのフラグメントイオンのピークＰｓ（以下、インソース分
解された基質ｓｂに対応するピークＰｓと呼ぶ）と、反応生成物Ｐのフラグメントイオン
のピークＰｐ（以下、反応生成物Ｐに対応するピークＰｐと呼ぶ）とが重なったピークＰ
ｐ＋Ｐｓが観察される。
【0041】
基質Ｓｂのｍ／ｚに対応するイオンをプリカーサーイオンとして質量分離し、基質Ｓｂ
のフラグメントイオンに対応するｍ／ｚを有するイオンを質量分離して検出したクロマト
グラムが図３（Ａ）下部である。このクロマトグラムに示されるように、基質Ｓｂのフラ
グメントイオンのピークＰｓｂは、反応生成物Ｐに対応するピークＰｐよりも、大きく、
また長い保持時間の範囲にわたって検出され得る。従って、基質Ｓｂが液体クロマトグラ
フ１０から溶出を始めた後に、反応生成物Ｐが溶出すると、反応生成物Ｐとインソース分
解された基質Ｓｂに対応するピークＰｓとが重なり、反応生成物Ｐの検出を正確に行うこ
とができない。
のフラグメントイオンに対応するｍ／ｚを有するイオンを質量分離して検出したクロマト
グラムが図３（Ａ）下部である。このクロマトグラムに示されるように、基質Ｓｂのフラ
グメントイオンのピークＰｓｂは、反応生成物Ｐに対応するピークＰｐよりも、大きく、
また長い保持時間の範囲にわたって検出され得る。従って、基質Ｓｂが液体クロマトグラ
フ１０から溶出を始めた後に、反応生成物Ｐが溶出すると、反応生成物Ｐとインソース分
解された基質Ｓｂに対応するピークＰｓとが重なり、反応生成物Ｐの検出を正確に行うこ
とができない。
【0042】
図３（Ｂ）は、本実施形態の分析方法において、反応生成物Ｐが基質Ｓｂよりも前に液
体クロマトグラフ１０から溶出する場合の、質量分析における検出強度を模式的に示すク
ロマトグラムである。プリカーサーイオンとして反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂに対応する
ｍ／ｚを有するイオンを質量分離し、反応生成物Ｐのフラグメントイオンおよび基質Ｓｂ
のフラグメントイオンに対応するｍ／ｚを有するイオンを質量分離して検出したクロマト
グラムをそれぞれ図３（Ｂ）の上部および下部に示す。基質Ｓｂのフラグメントイオンの
ピークＰｓｂの検出（図３（Ｂ）下部）と略同時にインソース分解された基質Ｓｂに対応
するピークＰｓが反応生成物Ｐのフラグメントイオンに対応するｍ／ｚについてのクロマ
トグラムに観察される（図３（Ｂ）上部）。しかし、反応生成物Ｐに対応するピークＰｐ
と、インソース分解された基質Ｓｂに対応するピークＰｓとは重ならず、反応生成物Ｐを
正確に検出および定量することができる。
体クロマトグラフ１０から溶出する場合の、質量分析における検出強度を模式的に示すク
ロマトグラムである。プリカーサーイオンとして反応生成物Ｐおよび基質Ｓｂに対応する
ｍ／ｚを有するイオンを質量分離し、反応生成物Ｐのフラグメントイオンおよび基質Ｓｂ
のフラグメントイオンに対応するｍ／ｚを有するイオンを質量分離して検出したクロマト
グラムをそれぞれ図３（Ｂ）の上部および下部に示す。基質Ｓｂのフラグメントイオンの
ピークＰｓｂの検出（図３（Ｂ）下部）と略同時にインソース分解された基質Ｓｂに対応
するピークＰｓが反応生成物Ｐのフラグメントイオンに対応するｍ／ｚについてのクロマ
トグラムに観察される（図３（Ｂ）上部）。しかし、反応生成物Ｐに対応するピークＰｐ
と、インソース分解された基質Ｓｂに対応するピークＰｓとは重ならず、反応生成物Ｐを
正確に検出および定量することができる。
【0043】
分析カラム１４は、好ましくは、特にムコ多糖症ＩＩ型、ＩＶ－Ａ型およびＶＩ型にそ
れぞれ対応する、イズロン酸－２－スルファターゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－
スルファターゼおよびＮ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼからなる群から
選択される少なくとも１つ、より好ましくは少なくとも２つ、さらに好ましくは３つを含
む酵素の酵素反応の反応生成物Ｐを当該酵素反応の基質Ｓｂの溶出が開始されるよりも前
に溶出させる。これらの酵素の基質Ｓｂは、インソース分解を特に起こしやすいため、よ
り多くのこれらの酵素の反応生成物Ｐを対応する基質Ｓｂより先に溶出させることでより
正確に反応生成物Ｐの検出を行うことができる。
なお、分析条件に応じてより正確に反応生成物Ｐの検出を行う観点から、任意のライソ
ゾーム病関連酵素の反応生成物Ｐを基質Ｓｂよりも先に溶出させることができる。
れぞれ対応する、イズロン酸－２－スルファターゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－
スルファターゼおよびＮ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼからなる群から
選択される少なくとも１つ、より好ましくは少なくとも２つ、さらに好ましくは３つを含
む酵素の酵素反応の反応生成物Ｐを当該酵素反応の基質Ｓｂの溶出が開始されるよりも前
に溶出させる。これらの酵素の基質Ｓｂは、インソース分解を特に起こしやすいため、よ
り多くのこれらの酵素の反応生成物Ｐを対応する基質Ｓｂより先に溶出させることでより
正確に反応生成物Ｐの検出を行うことができる。
なお、分析条件に応じてより正確に反応生成物Ｐの検出を行う観点から、任意のライソ
ゾーム病関連酵素の反応生成物Ｐを基質Ｓｂよりも先に溶出させることができる。
【0044】
図２に戻って、分析カラム１４から溶出された反応生成物Ｐを含む溶出試料は、質量分
析計２０のイオン化部２１に導入される。分析カラム１４の溶出液は、分析装置１のユー
ザー（以下、単に「ユーザー」と呼ぶ）による分注等の操作を必要とせず、オンライン制
御により質量分析計２０に入力されることが好ましい。
析計２０のイオン化部２１に導入される。分析カラム１４の溶出液は、分析装置１のユー
ザー（以下、単に「ユーザー」と呼ぶ）による分注等の操作を必要とせず、オンライン制
御により質量分析計２０に入力されることが好ましい。
【0045】
質量分析計２０は、分析カラム１４から導入された溶出試料に対してタンデム質量分析
を行い反応生成物Ｐおよび反応生成物Ｐの内部標準を検出する。イオン化された溶出試料
Ｓｅの経路を、一点鎖線の矢印Ａ２により模式的に示した。
なお、質量分析計２０の種類や質量分析の方法は、各反応生成物Ｐに由来するイオンを
所望の精度で検出可能であれば特に限定されない。
を行い反応生成物Ｐおよび反応生成物Ｐの内部標準を検出する。イオン化された溶出試料
Ｓｅの経路を、一点鎖線の矢印Ａ２により模式的に示した。
なお、質量分析計２０の種類や質量分析の方法は、各反応生成物Ｐに由来するイオンを
所望の精度で検出可能であれば特に限定されない。
【0046】
質量分析計２０のイオン化部２１は、導入された反応生成物Ｐを含む溶出試料Ｓｅをイ
オン化する。イオン化の方法は、所望の精度で反応生成物Ｐが検出される程度に反応生成
物Ｐがイオン化されれば特に限定されないが、本実施形態のようにＬＣ／ＭＳ／ＭＳを行
う場合にはエレクトロスプレー法（ＥＳＩ）が好ましく、以下の実施形態でもＥＳＩを行
うものとして説明する。イオン源２１１から出射されイオン化された溶出試料Ｓｅは、不
図示の電極に印加された電圧により移動し、管２１２を通過して第１真空室２２ａに入射
する。
オン化する。イオン化の方法は、所望の精度で反応生成物Ｐが検出される程度に反応生成
物Ｐがイオン化されれば特に限定されないが、本実施形態のようにＬＣ／ＭＳ／ＭＳを行
う場合にはエレクトロスプレー法（ＥＳＩ）が好ましく、以下の実施形態でもＥＳＩを行
うものとして説明する。イオン源２１１から出射されイオン化された溶出試料Ｓｅは、不
図示の電極に印加された電圧により移動し、管２１２を通過して第１真空室２２ａに入射
する。
【0047】
第１真空室２２ａ、第２真空室２２ｂおよび第３真空室２２ｃは、この順に真空度が高
くなっており、第３真空室２２ｃでは例えば１０－２Ｐａ以下等の高真空まで排気されて
いる。第１真空室２２ａに入射したイオンは、イオンレンズ２２１を通過して第２真空室
２２ｂに導入される。第２真空室２２ｂに入射したイオンは、イオンガイド２２２の間を
通過して第３真空室２２ｃに導入される。第３真空室２２ｃに導入されたイオンは、第１
質量分離部２３へと出射される。第１質量分離部２３に入射するまでの間に、イオンレン
ズ２２１やイオンガイド２２２等は、通過するイオンを電磁気学的作用により収束させる
。
くなっており、第３真空室２２ｃでは例えば１０－２Ｐａ以下等の高真空まで排気されて
いる。第１真空室２２ａに入射したイオンは、イオンレンズ２２１を通過して第２真空室
２２ｂに導入される。第２真空室２２ｂに入射したイオンは、イオンガイド２２２の間を
通過して第３真空室２２ｃに導入される。第３真空室２２ｃに導入されたイオンは、第１
質量分離部２３へと出射される。第１質量分離部２３に入射するまでの間に、イオンレン
ズ２２１やイオンガイド２２２等は、通過するイオンを電磁気学的作用により収束させる
。
【0048】
第１質量分離部２３は、四重極に印加される電圧に基づく電磁気学的作用により設定さ
れたｍ／ｚを有するイオンをプリカーサイオンとして選択的に通過させてコリジョンセル
２４に向けて出射する。第１質量分離部２３は、イオン化された反応生成物Ｐおよび反応
生成物Ｐに対応する内部標準をプリカーサイオンとして選択的に通過させる。
れたｍ／ｚを有するイオンをプリカーサイオンとして選択的に通過させてコリジョンセル
２４に向けて出射する。第１質量分離部２３は、イオン化された反応生成物Ｐおよび反応
生成物Ｐに対応する内部標準をプリカーサイオンとして選択的に通過させる。
【0049】
コリジョンセル２４は、イオンガイド２４０によりイオンの移動を制御しながら、衝突
誘起解離（Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ；ＣＩＤ）
によりイオン化された反応生成物Ｐおよび反応生成物Ｐに対応する内部標準を解離させ、
フラグメントイオンを生成する。ＣＩＤの際にイオンが衝突させられるアルゴンや窒素等
を含むガス（以下、ＣＩＤガスと呼ぶ）は、コリジョンセル内で所定の圧力になるように
ＣＩＤガス導入口２４１から導入される（矢印Ａ３）。生成されたフラグメントイオンは
、第２質量分離部２５に向けて出射される。
誘起解離（Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ；ＣＩＤ）
によりイオン化された反応生成物Ｐおよび反応生成物Ｐに対応する内部標準を解離させ、
フラグメントイオンを生成する。ＣＩＤの際にイオンが衝突させられるアルゴンや窒素等
を含むガス（以下、ＣＩＤガスと呼ぶ）は、コリジョンセル内で所定の圧力になるように
ＣＩＤガス導入口２４１から導入される（矢印Ａ３）。生成されたフラグメントイオンは
、第２質量分離部２５に向けて出射される。
【0050】
第２質量分離部２５は、四重極に印加される電圧に基づく電磁気学的作用により設定さ
れたｍ／ｚを有するフラグメントイオンを選択的に通過させて検出部３０に向けて出射す
る。第２質量分離部２３は、反応生成物Ｐおよび反応生成物Ｐの内部標準のフラグメント
イオンを選択的に通過させる。
れたｍ／ｚを有するフラグメントイオンを選択的に通過させて検出部３０に向けて出射す
る。第２質量分離部２３は、反応生成物Ｐおよび反応生成物Ｐの内部標準のフラグメント
イオンを選択的に通過させる。
【0051】
質量分析計２０において、表２に示された基質Ｓｂを用いた場合、ムコ多糖症Ｉ型に対
応するムコ多糖症関連酵素の反応生成物Ｐは、４２５．８～４２６．８の範囲のいずれか
のｍ／ｚにより分離することが好ましい。より好ましくは、当該反応生成物Ｐをプリカー
サイオンとして４２５．８～４２６．８の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離し、生成イ
オンを３１６．８～３１７．８の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離して検出することが
好ましい。
応するムコ多糖症関連酵素の反応生成物Ｐは、４２５．８～４２６．８の範囲のいずれか
のｍ／ｚにより分離することが好ましい。より好ましくは、当該反応生成物Ｐをプリカー
サイオンとして４２５．８～４２６．８の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離し、生成イ
オンを３１６．８～３１７．８の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離して検出することが
好ましい。
【0052】
質量分析計２０において、表２に示された基質Ｓｂを用いた場合、ムコ多糖症ＩＩ型に
対応するムコ多糖症関連酵素の反応生成物Ｐは、６４３．９～６４４．９の範囲のいずれ
かのｍ／ｚにより分離することが好ましい。より好ましくは、当該反応生成物Ｐをプリカ
ーサイオンとして６４３．９～６４４．９の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離し、生成
イオンを３５８．９～３５９．９の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離して検出すること
が好ましい。
対応するムコ多糖症関連酵素の反応生成物Ｐは、６４３．９～６４４．９の範囲のいずれ
かのｍ／ｚにより分離することが好ましい。より好ましくは、当該反応生成物Ｐをプリカ
ーサイオンとして６４３．９～６４４．９の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離し、生成
イオンを３５８．９～３５９．９の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離して検出すること
が好ましい。
【0053】
質量分析計２０において、表２に示された基質Ｓｂを用いた場合、ムコ多糖症ＩＩＩＢ
型に対応するムコ多糖症関連酵素の反応生成物Ｐは、４１９．８～４２０．８の範囲のい
ずれかのｍ／ｚにより分離することが好ましい。より好ましくは、当該反応生成物Ｐをプ
リカーサイオンとして４１９．８～４２０．８の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離し、
生成イオンを３１０．９～３１１．９の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離して検出する
ことが好ましい。
型に対応するムコ多糖症関連酵素の反応生成物Ｐは、４１９．８～４２０．８の範囲のい
ずれかのｍ／ｚにより分離することが好ましい。より好ましくは、当該反応生成物Ｐをプ
リカーサイオンとして４１９．８～４２０．８の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離し、
生成イオンを３１０．９～３１１．９の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離して検出する
ことが好ましい。
【0054】
質量分析計２０において、表２に示された基質Ｓｂを用いた場合、ムコ多糖症ＩＶ－Ａ
型に対応するムコ多糖症関連酵素の反応生成物Ｐは、６８４．９～６８５．９の範囲のい
ずれかのｍ／ｚにより分離することが好ましい。より好ましくは、当該反応生成物Ｐをプ
リカーサイオンとして６８４．９～６８５．９の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離し、
生成イオンを３７２．７～３７３．７の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離して検出する
ことが好ましい。
型に対応するムコ多糖症関連酵素の反応生成物Ｐは、６８４．９～６８５．９の範囲のい
ずれかのｍ／ｚにより分離することが好ましい。より好ましくは、当該反応生成物Ｐをプ
リカーサイオンとして６８４．９～６８５．９の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離し、
生成イオンを３７２．７～３７３．７の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離して検出する
ことが好ましい。
【0055】
質量分析計２０において、表２に示された基質Ｓｂを用いた場合、ムコ多糖症ＶＩ型に
対応するムコ多糖症関連酵素の反応生成物Ｐは、６５６．９～６５７．９の範囲のいずれ
かのｍ／ｚにより分離することが好ましい。より好ましくは、当該反応生成物Ｐをプリカ
ーサイオンとして６５６．９～６５７．９の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離し、生成
イオンを３４４．９～３４５．９の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離して検出すること
が好ましい。
なお、質量分析計２０において選択的に分離するｍ／ｚの値は、イオン化された反応生
成物Ｐおよび検出する反応生成物Ｐのフラグメントイオンに応じて適宜設定され、上記の
例に限定されない。
対応するムコ多糖症関連酵素の反応生成物Ｐは、６５６．９～６５７．９の範囲のいずれ
かのｍ／ｚにより分離することが好ましい。より好ましくは、当該反応生成物Ｐをプリカ
ーサイオンとして６５６．９～６５７．９の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離し、生成
イオンを３４４．９～３４５．９の範囲のいずれかのｍ／ｚにより分離して検出すること
が好ましい。
なお、質量分析計２０において選択的に分離するｍ／ｚの値は、イオン化された反応生
成物Ｐおよび検出する反応生成物Ｐのフラグメントイオンに応じて適宜設定され、上記の
例に限定されない。
【0056】
検出部３０は、二次電子増倍管や光電子増倍管等のイオン検出器を備え、入射した反応
生成物Ｐと反応生成物Ｐの内部標準とのフラグメントイオンを検出する。検出モードは正
イオンを検出する正イオンモードと、負イオンを検出する負イオンモードとのいずれでも
よい。フラグメントイオンを検出して得た検出信号は不図示のＡ／Ｄ変換器によりＡ／Ｄ
変換され、デジタル信号となって情報処理部４０の制御部５０に入力される（矢印Ａ４）
。
生成物Ｐと反応生成物Ｐの内部標準とのフラグメントイオンを検出する。検出モードは正
イオンを検出する正イオンモードと、負イオンを検出する負イオンモードとのいずれでも
よい。フラグメントイオンを検出して得た検出信号は不図示のＡ／Ｄ変換器によりＡ／Ｄ
変換され、デジタル信号となって情報処理部４０の制御部５０に入力される（矢印Ａ４）
。
【0057】
情報処理部４０は、電子計算機等の情報処理装置を備え、適宜ユーザーとのインターフ
ェースとなる他、様々なデータに関する通信、記憶、演算等の処理を行う。情報処理部４
０は、測定部１００の制御や、解析、表示の処理を行う処理装置となる。
なお、情報処理部４０は、液体クロマトグラフ１０および／または質量分析計２０と一
体になった一つの装置として構成してもよい。また、本実施形態の分析方法に用いるデー
タの一部は遠隔のサーバ等に保存してもよく、当該分析方法で行う演算処理の一部は遠隔
のサーバ等で行ってもよい。測定部１００の各部の動作の制御は、情報処理部４０が行っ
てもよいし、各部を構成する装置がそれぞれ行ってもよい。
ェースとなる他、様々なデータに関する通信、記憶、演算等の処理を行う。情報処理部４
０は、測定部１００の制御や、解析、表示の処理を行う処理装置となる。
なお、情報処理部４０は、液体クロマトグラフ１０および／または質量分析計２０と一
体になった一つの装置として構成してもよい。また、本実施形態の分析方法に用いるデー
タの一部は遠隔のサーバ等に保存してもよく、当該分析方法で行う演算処理の一部は遠隔
のサーバ等で行ってもよい。測定部１００の各部の動作の制御は、情報処理部４０が行っ
てもよいし、各部を構成する装置がそれぞれ行ってもよい。
【0058】
情報処理部４０の入力部４１は、マウス、キーボード、各種ボタンおよび／またはタッ
チパネル等の入力装置を含んで構成される。入力部４１は、検出するイオンのｍ／ｚの値
等の制御部５０が行う処理に必要な情報等を、ユーザーから受け付ける。
チパネル等の入力装置を含んで構成される。入力部４１は、検出するイオンのｍ／ｚの値
等の制御部５０が行う処理に必要な情報等を、ユーザーから受け付ける。
【0059】
情報処理部４０の通信部４２は、インターネット等のネットワークを介して無線や有線
の接続により通信可能な通信装置を含んで構成される。通信部４２は、測定部１００の測
定に必要なデータを受信したり、解析部５２の解析結果等の制御部５０が処理したデータ
を送信したり、適宜必要なデータを送受信する。
の接続により通信可能な通信装置を含んで構成される。通信部４２は、測定部１００の測
定に必要なデータを受信したり、解析部５２の解析結果等の制御部５０が処理したデータ
を送信したり、適宜必要なデータを送受信する。
【0060】
情報処理部４０の記憶部４３は、不揮発性の記憶媒体を備える。記憶部４３は、測定部
１００から出力された測定データ、および制御部５０が処理を実行するためのプログラム
等を記憶する。
１００から出力された測定データ、および制御部５０が処理を実行するためのプログラム
等を記憶する。
【0061】
情報処理部４０の出力部４４は、出力制御部５３により制御され、液晶モニタ等の表示
装置および／またはプリンターを含んで構成され、測定部１００の測定に関する情報や、
解析部５２の解析結果等を、表示装置に表示したり印刷媒体に印刷して出力する。
装置および／またはプリンターを含んで構成され、測定部１００の測定に関する情報や、
解析部５２の解析結果等を、表示装置に表示したり印刷媒体に印刷して出力する。
【0062】
情報処理部４０の制御部５０は、ＣＰＵ等のプロセッサを含んで構成される。制御部５
０は、測定部１００の制御や、測定部１００から出力された測定データを解析する等、記
憶部４３等に記憶されたプログラムを実行することにより各種処理を行う。
０は、測定部１００の制御や、測定部１００から出力された測定データを解析する等、記
憶部４３等に記憶されたプログラムを実行することにより各種処理を行う。
【0063】
処理部５０の装置制御部５１は、入力部４１を介した入力等に応じて設定された分析条
件等に基づいて、測定部１００の測定動作を制御する。装置制御部５１は、送液ポンプ１
２ａおよび１２ｂの流量を制御したり、試料導入部１３による試料導入を制御したり、第
１質量分離部２３および第２質量分離部２５で選択的に通過させるイオンのｍ／ｚ値を制
御したり等する。
件等に基づいて、測定部１００の測定動作を制御する。装置制御部５１は、送液ポンプ１
２ａおよび１２ｂの流量を制御したり、試料導入部１３による試料導入を制御したり、第
１質量分離部２３および第２質量分離部２５で選択的に通過させるイオンのｍ／ｚ値を制
御したり等する。
【0064】
解析部５２は、測定部１００から出力された測定データに基づいて反応生成物Ｐの定量
等の解析を行う。解析部５２は、検出部３０から出力された測定データから各反応生成物
Ｐおよびその内部標準のフラグメントイオンに対応する検出強度を取得して記憶部４３等
に記憶させる。
等の解析を行う。解析部５２は、検出部３０から出力された測定データから各反応生成物
Ｐおよびその内部標準のフラグメントイオンに対応する検出強度を取得して記憶部４３等
に記憶させる。
【0065】
解析部５２は、各反応生成物Ｐのフラグメントイオンに対応する検出強度を、当該反応
生成物Ｐの内部標準のフラグメントイオンに対応する検出強度で割った比に、当該内部標
準の既知の量を掛けた値を、各反応生成物Ｐの量として算出する。解析部５２は算出した
各反応生成物Ｐの量と、血液量等の試料Ｓｐの体積と、酵素反応のためのインキュベーシ
ョンに供した時間等とから、各反応生成物Ｐに対応する試料Ｓｐ中の酵素の活性を算出す
る。また、解析部５２は、保持時間と検出強度とを対応させたクロマトグラムに対応する
データを作成する。
生成物Ｐの内部標準のフラグメントイオンに対応する検出強度で割った比に、当該内部標
準の既知の量を掛けた値を、各反応生成物Ｐの量として算出する。解析部５２は算出した
各反応生成物Ｐの量と、血液量等の試料Ｓｐの体積と、酵素反応のためのインキュベーシ
ョンに供した時間等とから、各反応生成物Ｐに対応する試料Ｓｐ中の酵素の活性を算出す
る。また、解析部５２は、保持時間と検出強度とを対応させたクロマトグラムに対応する
データを作成する。
【0066】
解析部５２は、記憶部４３に記憶された基準値に基づいて、被検者が、ライソゾーム病
である程度に、またはライソゾーム病の疑いが有る程度に各ライソゾーム病関連酵素の活
性が低いか否かを判定する。当該基準値は、健常者と各ライソゾーム病患者におけるライ
ソゾーム関連酵素の活性の値に基づいて予め設定されたものを用いることが好ましい。解
析部５２は、適宜統計値のばらつき等を考慮して、上記判定を行うことができる。
である程度に、またはライソゾーム病の疑いが有る程度に各ライソゾーム病関連酵素の活
性が低いか否かを判定する。当該基準値は、健常者と各ライソゾーム病患者におけるライ
ソゾーム関連酵素の活性の値に基づいて予め設定されたものを用いることが好ましい。解
析部５２は、適宜統計値のばらつき等を考慮して、上記判定を行うことができる。
【0067】
出力制御部５３は、測定部１００の測定条件および／または解析部５２の解析結果等か
ら各ライソゾーム関連酵素の活性、各反応生成物Ｐの量、クロマトグラム、被検者が罹患
しているか、罹患している疑いのあるライソゾーム病についての情報等を含む出力画像を
作成し、出力部４４に出力させる。医師等は、出力画像に含まれる情報に基づいて、被検
者がライソゾーム病に罹患しているか否かの診断等を行うことができる。
ら各ライソゾーム関連酵素の活性、各反応生成物Ｐの量、クロマトグラム、被検者が罹患
しているか、罹患している疑いのあるライソゾーム病についての情報等を含む出力画像を
作成し、出力部４４に出力させる。医師等は、出力画像に含まれる情報に基づいて、被検
者がライソゾーム病に罹患しているか否かの診断等を行うことができる。
【0068】
図４は、本実施形態の分析方法の流れを示すフローチャートである。ステップＳ１００
１において、医療従事者等により、人間の新生児等の被検者から、血液等の試料Ｓｐが取
得される。ステップＳ１００１が終了したら、ステップＳ１００３が開始される。
１において、医療従事者等により、人間の新生児等の被検者から、血液等の試料Ｓｐが取
得される。ステップＳ１００１が終了したら、ステップＳ１００３が開始される。
【0069】
ステップＳ１００３において、医療従事者やユーザー等により、所定の数以上の種類の
ライソゾーム病関連酵素の基質Ｓｂを含む基質溶液が調製される。ここで、所定の数は、
例えば４、５等である。ステップＳ１００３が終了したら、ステップＳ１００５が開始さ
れる。ステップＳ１００５において、医療従事者やユーザー等により、試料Ｓｐと基質溶
液とを接触させることにより、試料Ｓｐに含まれているライソゾーム病関連酵素と基質Ｓ
ｂとを反応させ、反応生成物Ｐが生成される。ステップＳ１００５が終了したら、ステッ
プＳ１００７が開始される。
ライソゾーム病関連酵素の基質Ｓｂを含む基質溶液が調製される。ここで、所定の数は、
例えば４、５等である。ステップＳ１００３が終了したら、ステップＳ１００５が開始さ
れる。ステップＳ１００５において、医療従事者やユーザー等により、試料Ｓｐと基質溶
液とを接触させることにより、試料Ｓｐに含まれているライソゾーム病関連酵素と基質Ｓ
ｂとを反応させ、反応生成物Ｐが生成される。ステップＳ１００５が終了したら、ステッ
プＳ１００７が開始される。
【0070】
ステップＳ１００７において、医療従事者やユーザー等により、反応生成物Ｐと、基質
Ｓｂとを含む反応溶液から分析用試料Ｓａが調製される。ステップＳ１００７が終了した
ら、ステップＳ１００９が開始される。ステップＳ１００９において、試料導入部１３は
分析用試料Ｓａを液体クロマトグラフ１０に導入し、分析カラム１４は反応生成物Ｐと基
質Ｓｂとを分離する。ステップＳ１００９が終了したら、ステップＳ１０１１が開始され
る。
Ｓｂとを含む反応溶液から分析用試料Ｓａが調製される。ステップＳ１００７が終了した
ら、ステップＳ１００９が開始される。ステップＳ１００９において、試料導入部１３は
分析用試料Ｓａを液体クロマトグラフ１０に導入し、分析カラム１４は反応生成物Ｐと基
質Ｓｂとを分離する。ステップＳ１００９が終了したら、ステップＳ１０１１が開始され
る。
【0071】
ステップＳ１０１１において、質量分析計２０は、分離された反応生成物Ｐを質量分析
により分離して検出する。ステップＳ１０１１が終了したら、ステップＳ１０１３が開始
される。ステップＳ１０１３において、解析部５２は、検出された反応生成物Ｐのデータ
に基づいて、試料Ｓｐにおいてライソゾーム関連酵素の活性が基準値より減少しているか
について解析する。ステップＳ１０１３が終了したら、ステップＳ１０１５が開始される
。
により分離して検出する。ステップＳ１０１１が終了したら、ステップＳ１０１３が開始
される。ステップＳ１０１３において、解析部５２は、検出された反応生成物Ｐのデータ
に基づいて、試料Ｓｐにおいてライソゾーム関連酵素の活性が基準値より減少しているか
について解析する。ステップＳ１０１３が終了したら、ステップＳ１０１５が開始される
。
【0072】
ステップＳ１０１５において、出力部４４は、ライソゾーム病関連酵素のうち、試料Ｓ
ｐにおける活性が基準値より低い酵素または当該酵素に対応するライソゾーム病および／
またはムコ多糖症の病型についての情報を出力する。ステップＳ１０１５が終了したら、
処理が終了される。
ｐにおける活性が基準値より低い酵素または当該酵素に対応するライソゾーム病および／
またはムコ多糖症の病型についての情報を出力する。ステップＳ１０１５が終了したら、
処理が終了される。
【0073】
上述の実施の形態によれば、次の作用効果が得られる。
（１）本実施形態に係る分析装置１は、ライソゾーム病において、患者の体内で減少若し
くは欠損しているかまたは正常に働いていない４以上の酵素の基質Ｓｂと、この４以上の
酵素のうち生体から取得された試料Ｓｐに含まれている酵素とを反応させて得られた反応
生成物Ｐを含む分析用試料Ｓａが導入される試料導入部と、導入された分析用試料Ｓａに
含まれる反応生成物Ｐを液体クロマトグラフィにより分離する液体クロマトグラフ１０と
、液体クロマトグラフ１０により分離した反応生成物Ｐを質量分析により検出する質量分
析計２０とを備え、上記４以上の酵素は、イズロン酸－２－スルファターゼを含む。これ
により、被検者が、他のムコ多糖症の病型と比較して発症率が高い各ムコ多糖症Ｉ型、Ｉ
ＩＩＢ型、ＩＶ－Ａ型およびＶＩ型から選択される病型に罹患しているか否か、または罹
患している疑いがあるか否かを診断するための情報を迅速に提供することができる。さら
に、男性や特定の地域においてさらに発症率の高いムコ多糖症ＩＩ型についても同様の情
報を迅速に提供することができる。
（１）本実施形態に係る分析装置１は、ライソゾーム病において、患者の体内で減少若し
くは欠損しているかまたは正常に働いていない４以上の酵素の基質Ｓｂと、この４以上の
酵素のうち生体から取得された試料Ｓｐに含まれている酵素とを反応させて得られた反応
生成物Ｐを含む分析用試料Ｓａが導入される試料導入部と、導入された分析用試料Ｓａに
含まれる反応生成物Ｐを液体クロマトグラフィにより分離する液体クロマトグラフ１０と
、液体クロマトグラフ１０により分離した反応生成物Ｐを質量分析により検出する質量分
析計２０とを備え、上記４以上の酵素は、イズロン酸－２－スルファターゼを含む。これ
により、被検者が、他のムコ多糖症の病型と比較して発症率が高い各ムコ多糖症Ｉ型、Ｉ
ＩＩＢ型、ＩＶ－Ａ型およびＶＩ型から選択される病型に罹患しているか否か、または罹
患している疑いがあるか否かを診断するための情報を迅速に提供することができる。さら
に、男性や特定の地域においてさらに発症率の高いムコ多糖症ＩＩ型についても同様の情
報を迅速に提供することができる。
【0074】
（２）本実施形態に係る分析装置において、分析用試料Ｓａは、反応生成物Ｐおよび基質
Ｓｂを備え、液体クロマトグラフ１０は、導入された分析用試料Ｓａに含まれる反応生成
物Ｐおよび基質Ｓｂを液体クロマトグラフィにより分離する。これにより、インソース分
解が起こる場合でも基質Ｓｂを正確に検出することができる。
Ｓｂを備え、液体クロマトグラフ１０は、導入された分析用試料Ｓａに含まれる反応生成
物Ｐおよび基質Ｓｂを液体クロマトグラフィにより分離する。これにより、インソース分
解が起こる場合でも基質Ｓｂを正確に検出することができる。
【0075】
（３）本実施形態に係る分析装置は、ライソゾーム関連酵素のうち、試料Ｓｐにおける活
性が基準値より低い酵素または当該酵素に対応するライソゾーム病についての情報を出力
する出力部４４をさらに備える。これにより、医師等に、ライソゾーム病の診断のための
情報を迅速に伝えることができる。
性が基準値より低い酵素または当該酵素に対応するライソゾーム病についての情報を出力
する出力部４４をさらに備える。これにより、医師等に、ライソゾーム病の診断のための
情報を迅速に伝えることができる。
【0076】
本発明は上記実施形態の内容に限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内
で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。
で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。
【実施例】
【0077】
（実施例１）
以下の実施例では、それぞれムコ多糖症Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ－Ａ型および
ＶＩ型に対応するα－Ｌ－イズロニダーゼ、イズロン酸－２－スルファターゼ、α－Ｎ－
アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼおよび
Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼの５種類の酵素の活性を上述の分析方
法を用いて分析した実験結果が説明される。
なお、本発明は、以下の実施例に示された数値、条件に限定されない。
以下の実施例では、それぞれムコ多糖症Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ－Ａ型および
ＶＩ型に対応するα－Ｌ－イズロニダーゼ、イズロン酸－２－スルファターゼ、α－Ｎ－
アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼおよび
Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼの５種類の酵素の活性を上述の分析方
法を用いて分析した実験結果が説明される。
なお、本発明は、以下の実施例に示された数値、条件に限定されない。
【0078】
試料と基質との反応
上記５種類の酵素が含まれていない試料（コントロール試料）、上記５種類の酵素が含
まれている試料（所定の濃度の試料）、および、健常者から取得した試料（健常者試料）
のそれぞれをろ紙に滴下した後、乾燥させ、ＤＢＳ様のスポットを作成した。当該スポッ
トをパンチにより直径３ｍｍの円盤状に切り取り、９６ウェルのウェルプレートに配置し
た。当該スポットが配置されたウェルに、上記５種類の酵素の基質と、当該基質から酵素
反応により生成される反応生成物Ｐの内部標準とを含む３０μＬの基質溶液を加え、３７
℃で１６時間インキュベーションした。
上記５種類の酵素が含まれていない試料（コントロール試料）、上記５種類の酵素が含
まれている試料（所定の濃度の試料）、および、健常者から取得した試料（健常者試料）
のそれぞれをろ紙に滴下した後、乾燥させ、ＤＢＳ様のスポットを作成した。当該スポッ
トをパンチにより直径３ｍｍの円盤状に切り取り、９６ウェルのウェルプレートに配置し
た。当該スポットが配置されたウェルに、上記５種類の酵素の基質と、当該基質から酵素
反応により生成される反応生成物Ｐの内部標準とを含む３０μＬの基質溶液を加え、３７
℃で１６時間インキュベーションした。
【0079】
基質および内部標準
基質溶液に含まれる基質は、表２に示されたものを用いた。内部標準は、反応生成物Ｐ
が表２に示されたものとし、表２に示された反応生成物Ｐを置換した以下の置換体を用い
た。
Ｉ型：表２のムコ多糖症Ｉ型の反応生成物のＲ２を５つの重水素で置換した置換体。
ＩＩ型：表２のムコ多糖症ＩＩ型の反応生成物のＲ２を５つの重水素で置換した置換体。
ＩＩＩＢ型：表２のムコ多糖症ＩＩＩＢ型の反応生成物のＲ２を３つの重水素で置換した
置換体。
ＩＶ－Ａ型：表２のムコ多糖症ＩＶ－Ａ型の反応生成物のＲ２を５つの重水素で置換した
置換体。
ＶＩ型：表２のムコ多糖症ＶＩ型の反応生成物のＲ２を５つの重水素で置換した置換体。
基質溶液に含まれる基質は、表２に示されたものを用いた。内部標準は、反応生成物Ｐ
が表２に示されたものとし、表２に示された反応生成物Ｐを置換した以下の置換体を用い
た。
Ｉ型：表２のムコ多糖症Ｉ型の反応生成物のＲ２を５つの重水素で置換した置換体。
ＩＩ型：表２のムコ多糖症ＩＩ型の反応生成物のＲ２を５つの重水素で置換した置換体。
ＩＩＩＢ型：表２のムコ多糖症ＩＩＩＢ型の反応生成物のＲ２を３つの重水素で置換した
置換体。
ＩＶ－Ａ型：表２のムコ多糖症ＩＶ－Ａ型の反応生成物のＲ２を５つの重水素で置換した
置換体。
ＶＩ型：表２のムコ多糖症ＶＩ型の反応生成物のＲ２を５つの重水素で置換した置換体。
【0080】
分析用試料の調製
インキュベーションが終了した後、得られた反応溶液から反応生成物を含む成分を酢酸
エチルを用いて抽出した。抽出された反応生成物を含む酢酸エチルを別の容器に配置した
後、乾燥させた。その後、０．１％のギ酸が添加された水５５％／アセトニトリル４５％
溶液を加え分析用試料とした。
インキュベーションが終了した後、得られた反応溶液から反応生成物を含む成分を酢酸
エチルを用いて抽出した。抽出された反応生成物を含む酢酸エチルを別の容器に配置した
後、乾燥させた。その後、０．１％のギ酸が添加された水５５％／アセトニトリル４５％
溶液を加え分析用試料とした。
【0081】
液体クロマトグラフィの条件
分析用試料を、以下の条件で液体クロマトグラフィで分離した。
システム：LCMS-8060システム（島津製作所）
分析カラム： Kinetex XB-C18（Phenomenex）（内径２．１ｍｍ、長さ１５０ｍｍ、粒径
１．７μｍ）
注入量： １μＬ
カラム温度： ４０℃
移動相：
（Ａ）０．１％ギ酸（水に溶解）
（Ｂ）０．１％ギ酸（アセトニトリルに溶解）
流速： ０．４ｍＬ／ｍｉｎ
グラジエントプログラム：
時間（分） 移動相Ｂの濃度（％）
０ ３０
０．５ ３０
３．５ １００
５．０ １００
５．０１ ３０
６．０ 停止
分析用試料を、以下の条件で液体クロマトグラフィで分離した。
システム：LCMS-8060システム（島津製作所）
分析カラム： Kinetex XB-C18（Phenomenex）（内径２．１ｍｍ、長さ１５０ｍｍ、粒径
１．７μｍ）
注入量： １μＬ
カラム温度： ４０℃
移動相：
（Ａ）０．１％ギ酸（水に溶解）
（Ｂ）０．１％ギ酸（アセトニトリルに溶解）
流速： ０．４ｍＬ／ｍｉｎ
グラジエントプログラム：
時間（分） 移動相Ｂの濃度（％）
０ ３０
０．５ ３０
３．５ １００
５．０ １００
５．０１ ３０
６．０ 停止
【0082】
質量分析の条件
上記液体クロマトグラフィにおいて溶出された溶出試料を、溶出口に直接接続したタン
デム質量分析により検出した。
システム：LCMS-8060システム（島津製作所）
イオン化の方法： エレクトロスプレー法、正イオンモード
測定モード： 多重反応モニタリング（ＭＲＭ）
温度：
脱溶媒管（Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ Ｌｉｎｅ；ＤＬ）温度： ２５０℃
ヒートブロック温度： １００℃
インターフェース温度： －
ガス流量：
ネブライザーガス流量： ３Ｌ／ｍｉｎ
ドライングガス流量： ５Ｌ／ｍｉｎ
ヒーティングガス流量： １５Ｌ／ｍｉｎ
上記液体クロマトグラフィにおいて溶出された溶出試料を、溶出口に直接接続したタン
デム質量分析により検出した。
システム：LCMS-8060システム（島津製作所）
イオン化の方法： エレクトロスプレー法、正イオンモード
測定モード： 多重反応モニタリング（ＭＲＭ）
温度：
脱溶媒管（Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ Ｌｉｎｅ；ＤＬ）温度： ２５０℃
ヒートブロック温度： １００℃
インターフェース温度： －
ガス流量：
ネブライザーガス流量： ３Ｌ／ｍｉｎ
ドライングガス流量： ５Ｌ／ｍｉｎ
ヒーティングガス流量： １５Ｌ／ｍｉｎ
【0083】
溶出試料の保持時間と、ＭＲＭの測定条件（ＣＥはコリジョンエネルギー電圧）とは以
下の表３に示した。
下の表３に示した。
【表3】
【0084】
コントロール試料についてのクロマトグラムを図５に、所定の濃度の試料についてのク
ロマトグラムを図６に、健常者試料についてのクロマトグラムを図７にそれぞれ示した。
各ムコ多糖症の病型に対応するクロマトグラムにおいて、上段は、反応生成物に対応する
トランジションであり、下段は内部標準に対応するトランジション（表３）のクロマトグ
ラムである。Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ－Ａ型およびＶＩ型のインソース分解され
た基質に対応するピークをそれぞれＰ１ｓ，Ｐ２ｓ，Ｐ３ｓ，Ｐ４ｓおよびＰ６ｓとした
。Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ－Ａ型およびＶＩ型の内部標準のフラグメントイオン
のピークをそれぞれＰ１ｉｓ，Ｐ２ｉｓ，Ｐ３ｉｓ，Ｐ４ｉｓおよびＰ６ｉｓとした。Ｉ
型、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ－Ａ型およびＶＩ型の反応生成物のフラグメントイオンの
ピークをそれぞれＰ１ｐ，Ｐ２ｐ，Ｐ３ｐ，Ｐ４ｐおよびＰ６ｐとした。
ロマトグラムを図６に、健常者試料についてのクロマトグラムを図７にそれぞれ示した。
各ムコ多糖症の病型に対応するクロマトグラムにおいて、上段は、反応生成物に対応する
トランジションであり、下段は内部標準に対応するトランジション（表３）のクロマトグ
ラムである。Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ－Ａ型およびＶＩ型のインソース分解され
た基質に対応するピークをそれぞれＰ１ｓ，Ｐ２ｓ，Ｐ３ｓ，Ｐ４ｓおよびＰ６ｓとした
。Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ－Ａ型およびＶＩ型の内部標準のフラグメントイオン
のピークをそれぞれＰ１ｉｓ，Ｐ２ｉｓ，Ｐ３ｉｓ，Ｐ４ｉｓおよびＰ６ｉｓとした。Ｉ
型、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ－Ａ型およびＶＩ型の反応生成物のフラグメントイオンの
ピークをそれぞれＰ１ｐ，Ｐ２ｐ，Ｐ３ｐ，Ｐ４ｐおよびＰ６ｐとした。
【0085】
コントロール試料では、反応生成物のフラグメントイオンのピークは観察されなかった
が、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ－Ａ型およびＶＩ型のインソース分解された基質にそれぞ
れ対応するピークＰ２ｓ，Ｐ３ｓ，Ｐ４ｓおよびＰ６ｓが観察された（図５）。
が、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型、ＩＶ－Ａ型およびＶＩ型のインソース分解された基質にそれぞ
れ対応するピークＰ２ｓ，Ｐ３ｓ，Ｐ４ｓおよびＰ６ｓが観察された（図５）。
【0086】
所定の濃度の試料（図６）および健常者試料（図７）においては、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩ
ＩＢ型、ＩＶ－Ａ型およびＶＩ型の反応生成物のフラグメントイオンのピークＰ１ｐ，Ｐ
２ｐ，Ｐ３ｐ，Ｐ４ｐおよびＰ６ｐが観察された。このうち、ＩＩ型、ＩＶ－Ａ型および
ＶＩ型の反応生成物のフラグメントイオンのピークＰ２ｐ，Ｐ４ｐおよびＰ６ｐは、対応
するインソース分解された基質のピークＰ２ｓ、Ｐ４ｓおよびＰ６ｓよりも短い保持時間
で溶出された。５種類のムコ多糖症関連酵素について、液体クロマトグラフィおよび質量
分析により反応生成物が分離されて検出された。
ＩＢ型、ＩＶ－Ａ型およびＶＩ型の反応生成物のフラグメントイオンのピークＰ１ｐ，Ｐ
２ｐ，Ｐ３ｐ，Ｐ４ｐおよびＰ６ｐが観察された。このうち、ＩＩ型、ＩＶ－Ａ型および
ＶＩ型の反応生成物のフラグメントイオンのピークＰ２ｐ，Ｐ４ｐおよびＰ６ｐは、対応
するインソース分解された基質のピークＰ２ｓ、Ｐ４ｓおよびＰ６ｓよりも短い保持時間
で溶出された。５種類のムコ多糖症関連酵素について、液体クロマトグラフィおよび質量
分析により反応生成物が分離されて検出された。
【0087】
（実施例２）
以下のように液体クロマトグラフィの条件を変え、さらに、ムコ多糖症Ｉ型の基質を、
反応生成物を質量分離する際の条件とは別の質量分離の条件で直接検出した他は、実施例
１と同様の条件で、コントロール試料（酵素なし）のＬＣ／ＭＳ／ＭＳを行った。
カラム：Kinetex XB-C18（Phenomenex）(内径２．１ｍｍ、長さ３０ｍｍ、粒径１．７μ
ｍ)
グラジエントプログラム：
時間（分） 移動相Ｂの濃度（％）
０ ３０
０．０１ ３０
１．３０ １００
１．５０ １００
１．５１ ３０
２．５０ 停止
以下のように液体クロマトグラフィの条件を変え、さらに、ムコ多糖症Ｉ型の基質を、
反応生成物を質量分離する際の条件とは別の質量分離の条件で直接検出した他は、実施例
１と同様の条件で、コントロール試料（酵素なし）のＬＣ／ＭＳ／ＭＳを行った。
カラム：Kinetex XB-C18（Phenomenex）(内径２．１ｍｍ、長さ３０ｍｍ、粒径１．７μ
ｍ)
グラジエントプログラム：
時間（分） 移動相Ｂの濃度（％）
０ ３０
０．０１ ３０
１．３０ １００
１．５０ １００
１．５１ ３０
２．５０ 停止
【0088】
図８は、実施例２で得られたマスクロマトグラムを示す図である。Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩ
ＩＢ型、ＩＶ－Ａ型およびＶＩ型のインソース分解された基質に対応するピークＰ１ｓ，
Ｐ２ｓ，Ｐ３ｓ，Ｐ４ｓおよびＰ６ｓがそれぞれ観察された。Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型
、ＩＶ－Ａ型およびＶＩ型の内部標準のフラグメントイオンのピークＰ１ｉｓ，Ｐ２ｉｓ
，Ｐ３ｉｓ，Ｐ４ｉｓおよびＰ６ｉｓは、上記基質とは時間的に分離されて検出された。
従って、分析時間を２．５０分とする条件でも、液体クロマトグラフィによる反応生成物
および基質の分離が可能であることが示された。
ＩＢ型、ＩＶ－Ａ型およびＶＩ型のインソース分解された基質に対応するピークＰ１ｓ，
Ｐ２ｓ，Ｐ３ｓ，Ｐ４ｓおよびＰ６ｓがそれぞれ観察された。Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩＢ型
、ＩＶ－Ａ型およびＶＩ型の内部標準のフラグメントイオンのピークＰ１ｉｓ，Ｐ２ｉｓ
，Ｐ３ｉｓ，Ｐ４ｉｓおよびＰ６ｉｓは、上記基質とは時間的に分離されて検出された。
従って、分析時間を２．５０分とする条件でも、液体クロマトグラフィによる反応生成物
および基質の分離が可能であることが示された。
【符号の説明】
【0089】
１…分析装置、１０…液体クロマトグラフ、１４…分析カラム、２０…質量分析計、２１
…イオン化部、２３…第１質量分離部、２４…コリジョンセル、２５…第２質量分離部、
３０…検出部、４０…情報処理部、５０…処理部、５１…装置制御部、５２…解析部、５
３…出力制御部、１００…測定部、Ｃ…ろ紙、Ｄ…取り外し可能部分、ＤＢＳ…乾燥血液
スポット、Ｐ…反応生成物、Ｐ１，Ｐ２…ピペット、Ｐ１ｉｓ，Ｐ２ｉｓ，Ｐ３ｉｓ，Ｐ
４ｉｓ，Ｐ６ｉｓ…反応生成物の内部標準のフラグメントイオンのピーク、Ｐｐ，Ｐ１ｐ
，Ｐ２ｐ，Ｐ３ｐ，Ｐ４ｐ，Ｐ６ｐ…反応生成物のフラグメントイオンのピーク、Ｐｓ，
Ｐ１ｓ，Ｐ２ｓ，Ｐ３ｓ，Ｐ４ｓ，Ｐ６ｓ…基質イオンがインソース分解されたイオンの
フラグメントイオンのピーク、Ｐｓｂ…基質イオンのフラグメントイオンのピーク、Ｓａ
…分析用試料、Ｓｂ…基質、Ｓｐ…試料。
…イオン化部、２３…第１質量分離部、２４…コリジョンセル、２５…第２質量分離部、
３０…検出部、４０…情報処理部、５０…処理部、５１…装置制御部、５２…解析部、５
３…出力制御部、１００…測定部、Ｃ…ろ紙、Ｄ…取り外し可能部分、ＤＢＳ…乾燥血液
スポット、Ｐ…反応生成物、Ｐ１，Ｐ２…ピペット、Ｐ１ｉｓ，Ｐ２ｉｓ，Ｐ３ｉｓ，Ｐ
４ｉｓ，Ｐ６ｉｓ…反応生成物の内部標準のフラグメントイオンのピーク、Ｐｐ，Ｐ１ｐ
，Ｐ２ｐ，Ｐ３ｐ，Ｐ４ｐ，Ｐ６ｐ…反応生成物のフラグメントイオンのピーク、Ｐｓ，
Ｐ１ｓ，Ｐ２ｓ，Ｐ３ｓ，Ｐ４ｓ，Ｐ６ｓ…基質イオンがインソース分解されたイオンの
フラグメントイオンのピーク、Ｐｓｂ…基質イオンのフラグメントイオンのピーク、Ｓａ
…分析用試料、Ｓｂ…基質、Ｓｐ…試料。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】