(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-26
(45)【発行日】2024-09-03
(54)【発明の名称】ペプチドの血中動態改善方法
(51)【国際特許分類】
A61K 38/57 20060101AFI20240827BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240827BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240827BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20240827BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20240827BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240827BHJP
【ＦＩ】
A61K38/57 ZNA
A61K47/68
A61P43/00 111
C07K14/47
C07K16/00
C07K19/00
【請求項の数】
26
(21)【出願番号】P 2020556105
(86)(22)【出願日】2019-11-06
(86)【国際出願番号】 JP2019043386
(87)【国際公開番号】W WO2020095922
(87)【国際公開日】2020-05-14
【審査請求日】2022-10-05
(31)【優先権主張番号】P 2018209730
(32)【優先日】2018-11-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】307010166
【氏名又は名称】第一三共株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100146581
【弁理士】
【氏名又は名称】石橋 公樹
(74)【代理人】
【識別番号】100113583
【弁理士】
【氏名又は名称】北野 範子
(74)【代理人】
【識別番号】100161160
【弁理士】
【氏名又は名称】竹元 利泰
(74)【代理人】
【識別番号】100167678
【弁理士】
【氏名又は名称】西田 直浩
(72)【発明者】
【氏名】西宮 大祐
(72)【発明者】
【氏名】矢野 秀法
【審査官】鈴木 理文
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１５－５０４８９９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５１９５６９（ＪＰ，Ａ）
【文献】TASAKI ET AL，'The mammalian N-end rule pathway: new insights into its components and physiological roles'，TRENDS IN BIOCHEMICAL SCIENCES，2007年，Vol. 32, No. 11，pp. 520-528
【文献】GONDA ET AL，'Universality and structure of the N-end rule'，JBC，1989年，Vol. 264、No. 28，pp. 16700-16712
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３８／５７
Ａ６１Ｋ ４７／６８
Ａ６１Ｐ ４３／００
Ｃ０７Ｋ １４／４７
Ｃ０７Ｋ １６／００
Ｃ０７Ｋ １９／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ペプチドのコンジュゲートであって、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、１乃至３個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸、該ペプチドに含まれるアミノ酸配列、及び、免疫グロブリンのＦｃ領域に含まれるアミノ酸配列を、その順に含み、該ペプチドがＳＰＩＮＫ２変異体であり、該ペプチドに含まれるアミノ酸配列が配列番号２（図８）で示される、該コンジュゲート。
【請求項2】
該ペプチドに含まれるアミノ酸配列が、Ｆｃ領域に含まれるアミノ酸配列に、リンカー配列を介して付加している、請求項１記載のコンジュゲート。
【請求項3】
該ペプチドに含まれるアミノ酸配列が、Ｆｃ領域に含まれるアミノ酸配列に、直接付加している、請求項１記載のコンジュゲート。
【請求項4】
１乃至３個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸が、該ペプチドに含まれるアミノ酸配列に、リンカー配列を介して付加している、請求項１乃至３のいずれか一つに記載のコンジュゲート。
【請求項5】
１乃至３個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸が、該ペプチドに含まれるアミノ酸配列に、直接付加している、請求項１乃至３のいずれか一つに記載のコンジュゲート。
【請求項6】
免疫グロブリンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、及び／又は、ＩｇＥのＦｃ領域である、請求項１乃至５のいずれか一つに記載のコンジュゲート。
【請求項7】
免疫グロブリンが、ヒト免疫グロブリンである、請求項１乃至６のいずれか一つに記載のコンジュゲート。
【請求項8】
免疫グロブリンが、ヒトＩｇＧ１である、請求項１乃至７のいずれか一つに記載のコンジュゲート。
【請求項9】
免疫グロブリンが、野生型又は変異型である、請求項１乃至８のいずれか一つに記載のコンジュゲート。
【請求項10】
アミノ末端に１乃至３個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸を欠くコンジュゲートと比較して、抑制された血中濃度の経時的減少又は増加した血中曝露量を有する、請求項１乃至９のいずれか一つに記載のコンジュゲート。
【請求項11】
ヒト疾患関連標的分子に結合することを特徴とする、請求項１乃至１０のいずれか一つに記載のコンジュゲート。
【請求項12】
請求項１乃至１１のいずれか一つに記載のコンジュゲートを含む組成物。
【請求項13】
該ペプチドが、ヒト疾患関連標的分子の活性を抑制、阻害、作動又は活性化することを特徴とする、請求項１乃至１１記載のコンジュゲート。
【請求項14】
請求項１３記載のコンジュゲートを含む医薬組成物。
【請求項15】
下記の工程（ｉ）又は（ｉｉ）を含んでなる、請求項１記載のコンジュゲートを製造する方法：（ｉ）該ペプチド及び免疫グロブリンのＦｃ領域を含む融合体のアミノ末端側に、１乃至３個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸を付加する工程；
（ｉｉ）該融合体に含まれるアミノ酸配列（ａ）、及び、１乃至３個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸からなるアミノ酸配列（ｂ）、を含み、且つ、アミノ酸配列（ｂ）がアミノ酸配列（ａ）のアミノ末端側に位置してなるアミノ酸配列（ｃ）を含むポリヌクレオチドを細胞に導入し、該細胞を培養し、該培養物から該融合体を含むコンジュゲートを回収する工程。
【請求項16】
Ｆｃ領域が、該ペプチドに、リンカーを介して融合しているか、又は 、該ペプチドに含まれるアミノ酸配列が、免疫グロブリンのＦｃ領域に含まれるアミノ酸配列に、リンカー配列を介して付加している、請求項１５記載の方法。
【請求項17】
Ｆｃ領域が、該ペプチドに、直接融合しているか、又は、該ペプチドに含まれるアミノ酸配列が、免疫グロブリンのＦｃ領域に含まれるアミノ酸配列に、直接付加している、請求項１５記載の方法。
【請求項18】
免疫グロブリンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、及び／又は、ＩｇＥのＦｃ領域である、請求項１６又は１７記載の方法。
【請求項19】
免疫グロブリンが、ヒト免疫グロブリンである、請求項１５乃至１８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項20】
免疫グロブリンが、ヒトＩｇＧ１である、請求項１５乃至１９のいずれか一つに記載の方法。
【請求項21】
免疫グロブリンが、野生型又は変異型である、請求項１５乃至２０のいずれか一つに記載の方法。
【請求項22】
アミノ末端に１乃至３個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸を欠くコンジュゲートと比較して、抑制された血中濃度の経時的減少又は増加した血中曝露量を有する請求項１５乃至２１のいずれか一つに記載の方法。
【請求項23】
該融合体のアミノ末端側に、１乃至３個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸が、リンカーを介して付加しているか、又は、該融合体に含まれるアミノ酸配列のアミノ末端側に、１乃至３個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸からなるアミノ酸配列が、リンカー配列を介して、付加している、請求項１５乃至２２のいずれか一つに記載の方法。
【請求項24】
該融合体のアミノ末端側に、１乃至３個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸が、直接付加しているか、又は、該融合体に含まれるアミノ酸配列のアミノ末端側に、１乃至３個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸からなるアミノ酸配列が、直接付加している、請求項１５乃至２２のいずれか一つに記載の方法。
【請求項25】
該ペプチドが、ヒト疾患関連標的分子に結合することを特徴とする、請求項１５乃至２４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項26】
該ペプチドが、ヒト疾患関連標的分子の活性を抑制、阻害、作動又は活性化することを特徴とする、請求項１５乃至２５のいずれか一つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はペプチド又は該ペプチドを含むコンジュゲートの血中動態を改善する方法、血中動態が改善されたペプチド又は該ペプチドを含むコンジュゲート、血中動態が改善されたペプチド又は該ペプチドを含むコンジュゲートを含む医薬組成物等に関する。
【背景技術】
【0002】
抗体医薬や組換え蛋白質など生物製剤の研究開発は目覚しく、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）で承認された生物製剤は２００を超える（非特許文献１）。それらの適応症はがんをはじめ、関節リウマチや多発性硬化症などの自己免疫疾患、皮膚疾患、神経障害性疼痛など様々な疾患に広がりをみせている。近年ではタンパク質工学の進歩により、フラグメント抗体やｎｏｎ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｃａｆｆｏｌｄなどの組換え蛋白質の開発も盛んになりつつある。これらの分子は抗体医薬と同様、標的となるタンパク質Ｘに対して高い結合活性を有しているため、治療薬として使用することで、高い薬効及び副作用の低減が期待されている。抗体医薬の分子量は１５０ｋＤａ程度であるのに対し、これらは５～５０ｋＤａ程度と小さいことを特徴とする。組換え蛋白質やホルモンペプチドなどは高い生物活性を示す一方で、分子量の小ささに起因して血中半減期は短い。より長期に亘って、低分子量蛋白質やペプチドの活性を維持するためには、これらの血中半減期を延長させるアプローチが必要である。
【0003】
一般的に、標的細胞による特異的な消失経路を除き、より高分子量の蛋白質はピノサイトーシスや受容体介在性エンドサイトーシスに続く細胞内分解を経て、また、より低分子量の蛋白質やペプチドは腎臓の糸球体ろ過や再吸収時の分解を経て体内から消失する。低分子量蛋白質やペプチドの分子量、形状、電荷などはクリアランスに大きな影響を及ぼすことが知られている。そのため、低分子量蛋白質やペプチドの血中半減期を改善するためには、分子量を大きくする、又は、血清中に含まれる蛋白質に結合させるアプローチが考えられる（非特許文献２）。低分子量蛋白質やペプチドの分子量を増大するアプローチとして、Ｐｏｌｙ－ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ（ＰＥＧ）や糖鎖、生体分解性ポリマーなどとの結合が挙げられる。低分子量蛋白質やペプチドを血清蛋白質に結合させるアプローチとして、アルブミン又はアルブミン結合分子との融合が挙げられる。さらに、免疫グロブリンＦｃ領域との結合も血中半減期延長に有効である。抗体は分子量の大きさに加え、血管内皮細胞などに取り込まれても免疫グロブリンＦｃ部分がエンドソームにある胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との結合を介して血液中に汲み出されるリサイクリング効果を示すため、他の蛋白質よりも長い血中半減期を示す（非特許文献３）。Ｆｃ領域のその特徴的な性質に着目することで、Ｆｃ融合体は低分子量蛋白質やペプチドの血中半減期延長ツールとして開発されている。いずれの修飾法も蛋白質やペプチドへの適応例が報告されており、複数の品目が上市に至っている。
【0004】
低分子量蛋白質やペプチドはＦｃ領域との融合により、血中半減期の延長効果は期待されるが、ＩｇＧよりも血中半減期は短い例が多く、血中曝露量の改善には課題が残る（非特許文献４）。治療薬としての薬効を持続させるためには、これらＦｃ融合体の血中曝露量をより改善することが求められる。これまでに、モノクローナル抗体及びＦｃ融合体の血中半減期又は血中曝露量を変化させる方法が報告されている。例えば、抗体とＦｃＲｎとの親和性を変化させることで血中半減期を変化させる方法が挙げられる（非特許文献３、５）。抗体や受容体Ｆｃ融合体では、Ｆｃ領域以外の部分（抗体では可変領域、受容体Ｆｃ融合体では受容体部分）に糖鎖を付加することで、より高い曝露を達成している（非特許文献３）が、５０～６０ｋＤａ以下のより小さなタンパク質に適用する場合は十分な効果が得られない。また、タンパク質の電荷を知る方法として等電点（ｐＩ）が挙げられる。抗体のｐＩが高い場合、体内は中性付近のｐＨを示すため、抗体は正電荷を帯びる。そのため、抗体は負に帯電した細胞膜と相互作用しやすくなり、組織への取り込みやクリアランスが増大し、血中半減期や血中曝露量が低下、減少する。逆に、抗体のｐＩを低くすることで、血中半減期の延長に繋がることが知られている（非特許文献３）が、抗体以外のタンパク質について、それらの方法が適用され得ることは知られていない。一方、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－硫酸スルファターゼのＮ末端側に酸性アミノ酸を４～１５個付加することで、血中での安定性を改善させた例が報告されている（特許文献１）。
【0005】
しかしながら、いずれの公知の方法も、分子量にかかわらず任意のタンパク質に対する汎用性が示されたことはなく、個々のケースにおいて、血中半減期又は血中曝露を改善する方法を模索するのが現状である。
【0006】
ＳＰＩＮＫ２（Ｓｅｒｉｎｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｋａｚａｌ－ｔｙｐｅ ２）は、３つのジスルフィド結合を有するＫａｚａｌ様ドメインであり、ｔｒｙｐｓｉｎ／ａｃｒｏｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒとして機能する（非特許文献６）。その分子量は７ｋＤａと小さく、ＳＰＩＮＫ２又はＳＰＩＮＫ２変異体を個体に投与する場合、体内からの消失は速いと推測される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】ＪＰ４７５０７１８Ｂ２
【非特許文献】
【0008】
【文献】ウスマニ エスエス他（Ｕｓｍａｎｉ ＳＳ，ｅｔ ａｌ．）（２０１７年刊） プロス・ワン（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ）１２巻（７号）：ｅ０１８１７４８
【文献】ストロール ダブリュアール他（Ｓｔｒｏｈｌ ＷＲ）（２０１５年刊） バイオドラッグズ（ＢｉｏＤｒｕｇｓ）２９巻（４号）：２１５－２３９頁
【文献】リュウ エル他（Ｌｉｕ Ｌ）（２０１８年刊） プロテインセル（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ）９巻（１号）：１５－３２頁
【文献】アンバードーベン エフ他（Ｕｎｖｅｒｄｏｒｂｅｎ Ｆ，ｅｔ ａｌ．）（２０１６年刊） マブズ（ＭＡｂｓ）８巻（１号）：１２０－１２８頁
【文献】サクセナ エイ他（Ｓａｘｅｎａ Ａ，ｅｔ ａｌ．）（２０１６年刊） フロンティアーズ・イン・イムノロジー（Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．）７巻：５８０
【文献】チェン ティー他（Ｃｈｅｎ Ｔ，ｅｔ ａｌ．）（２００９年刊） プロテインズ（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．）７７巻（１号）：２０９－２１９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
ペプチドの血中動態を改善する方法を提供すること。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は、
（１）
下記（ｉ）又は（ｉｉ）であるペプチドのコンジュゲート：
（ｉ）アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、１乃至３個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸、該ペプチドに含まれるアミノ酸配列、及び、免疫グロブリンのＦｃ領域又はその断片に含まれるアミノ酸配列を、その順に含む、該ペプチドのコンジュゲート；
（ｉｉ）アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、１乃至３個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸、免疫グロブリンのＦｃ領域又はその断片に含まれるアミノ酸配列、及び、該ペプチドに含まれるアミノ酸配列を、その順に含む、該ペプチドのコンジュゲート、
（２）
該ペプチドがＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドである、（１）記載のコンジュゲート、
（３）
該ペプチドが抗体又はその抗原結合断片である、（１）記載のコンジュゲート、
（４）
該ペプチドに含まれるアミノ酸配列が、Ｆｃ領域又はその断片に含まれるアミノ酸配列に、リンカー配列を介して付加している、（１）乃至（３）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（５）
該ペプチドに含まれるアミノ酸配列が、Ｆｃ領域又はその断片に含まれるアミノ酸配列に、直接付加している、（１）乃至（３）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（６）
１乃至３個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸が、該ペプチドに含まれるアミノ酸配列又はＦｃ領域若しくはその断片に含まれるアミノ酸配列に、リンカー配列を介して付加している、（１）乃至（５）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（７）
１乃至３個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸が、該ペプチドに含まれるアミノ酸配列又はＦｃ領域若しくはその断片に含まれるアミノ酸配列に、直接付加している、（１）乃至（５）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（８）
免疫グロブリン又はその断片が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、及び／又は、ＩｇＥのＦｃ領域又はその断片である、（１）乃至（７）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（９）
免疫グロブリンが、ヒト免疫グロブリンである、（１）乃至（８）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（１０）
免疫グロブリンが、ヒトＩｇＧ１である、（１）乃至（９）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（１）
下記（ｉ）又は（ｉｉ）であるペプチドのコンジュゲート：
（ｉ）アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、１乃至３個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸、該ペプチドに含まれるアミノ酸配列、及び、免疫グロブリンのＦｃ領域又はその断片に含まれるアミノ酸配列を、その順に含む、該ペプチドのコンジュゲート；
（ｉｉ）アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、１乃至３個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸、免疫グロブリンのＦｃ領域又はその断片に含まれるアミノ酸配列、及び、該ペプチドに含まれるアミノ酸配列を、その順に含む、該ペプチドのコンジュゲート、
（２）
該ペプチドがＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドである、（１）記載のコンジュゲート、
（３）
該ペプチドが抗体又はその抗原結合断片である、（１）記載のコンジュゲート、
（４）
該ペプチドに含まれるアミノ酸配列が、Ｆｃ領域又はその断片に含まれるアミノ酸配列に、リンカー配列を介して付加している、（１）乃至（３）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（５）
該ペプチドに含まれるアミノ酸配列が、Ｆｃ領域又はその断片に含まれるアミノ酸配列に、直接付加している、（１）乃至（３）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（６）
１乃至３個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸が、該ペプチドに含まれるアミノ酸配列又はＦｃ領域若しくはその断片に含まれるアミノ酸配列に、リンカー配列を介して付加している、（１）乃至（５）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（７）
１乃至３個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸が、該ペプチドに含まれるアミノ酸配列又はＦｃ領域若しくはその断片に含まれるアミノ酸配列に、直接付加している、（１）乃至（５）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（８）
免疫グロブリン又はその断片が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、及び／又は、ＩｇＥのＦｃ領域又はその断片である、（１）乃至（７）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（９）
免疫グロブリンが、ヒト免疫グロブリンである、（１）乃至（８）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（１０）
免疫グロブリンが、ヒトＩｇＧ１である、（１）乃至（９）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
【0011】
（１１）
免疫グロブリンが、野生型又は変異型である、（１）乃至（１０）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（１２）
アミノ末端に１乃至３個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸を欠くコンジュゲートと比較して、抑制された血中濃度の経時的減少又は増加した血中曝露量を有する、（１）乃至（１１）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（１３）
ヒト疾患関連標的分子に結合することを特徴とする、（１）乃至（１２）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（１４）
該ペプチドがＳＰＩＮＫ２変異体であり、該ペプチドに含まれるアミノ酸配列が配列番号２（図８）で示される、（１３）に記載のコンジュゲート、
（１５）
（１）乃至（１４）のいずれか一つに記載のコンジュゲートを含む組成物、
（１６）
該ペプチドが、ヒト疾患関連標的分子の活性を抑制、阻害、作動又は活性化することを特徴とする、（１）乃至（１３）記載のコンジュゲート、
（１７）
該ペプチドがＳＰＩＮＫ２変異体であり、該ペプチドに含まれるアミノ酸配列が配列番号２（図８）で示される、（１６）記載のコンジュゲート、
（１８）
（１６）又は（１７）に記載のコンジュゲートを含む医薬組成物、
（１９）
下記の工程（ｉ）又は（ｉｉ）を含んでなる、（１）記載のコンジュゲートを製造する方法：
（ｉ）該ペプチド及び免疫グロブリンのＦｃ領域又はその断片を含む融合体のアミノ末端側に、１乃至３個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸を付加する工程；
（ｉｉ）該融合体に含まれるアミノ酸配列（ａ）、及び、１乃至３個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸からなるアミノ酸配列（ｂ）、を含み、且つ、アミノ酸配列（ｂ）がアミノ酸配列（ａ）のアミノ末端側に位置してなるアミノ酸配列（ｃ）を含むポリヌクレオチドを細胞に導入し、該細胞を培養し、該培養物から該融合体を含むコンジュゲートを回収する工程、
（２０）
該ペプチドが、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドである、（１９）記載の方法、
免疫グロブリンが、野生型又は変異型である、（１）乃至（１０）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（１２）
アミノ末端に１乃至３個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸を欠くコンジュゲートと比較して、抑制された血中濃度の経時的減少又は増加した血中曝露量を有する、（１）乃至（１１）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（１３）
ヒト疾患関連標的分子に結合することを特徴とする、（１）乃至（１２）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（１４）
該ペプチドがＳＰＩＮＫ２変異体であり、該ペプチドに含まれるアミノ酸配列が配列番号２（図８）で示される、（１３）に記載のコンジュゲート、
（１５）
（１）乃至（１４）のいずれか一つに記載のコンジュゲートを含む組成物、
（１６）
該ペプチドが、ヒト疾患関連標的分子の活性を抑制、阻害、作動又は活性化することを特徴とする、（１）乃至（１３）記載のコンジュゲート、
（１７）
該ペプチドがＳＰＩＮＫ２変異体であり、該ペプチドに含まれるアミノ酸配列が配列番号２（図８）で示される、（１６）記載のコンジュゲート、
（１８）
（１６）又は（１７）に記載のコンジュゲートを含む医薬組成物、
（１９）
下記の工程（ｉ）又は（ｉｉ）を含んでなる、（１）記載のコンジュゲートを製造する方法：
（ｉ）該ペプチド及び免疫グロブリンのＦｃ領域又はその断片を含む融合体のアミノ末端側に、１乃至３個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸を付加する工程；
（ｉｉ）該融合体に含まれるアミノ酸配列（ａ）、及び、１乃至３個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸からなるアミノ酸配列（ｂ）、を含み、且つ、アミノ酸配列（ｂ）がアミノ酸配列（ａ）のアミノ末端側に位置してなるアミノ酸配列（ｃ）を含むポリヌクレオチドを細胞に導入し、該細胞を培養し、該培養物から該融合体を含むコンジュゲートを回収する工程、
（２０）
該ペプチドが、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドである、（１９）記載の方法、
【0012】
（２１）
該ペプチドが、抗体又はその抗原結合断片である、（１９）記載の方法、
（２２）
Ｆｃ領域又はその断片が、該ペプチドのカルボキシル末端側に位置している、（１９）乃至（２１）のいずれか一つに記載の方法、
（２３）
Ｆｃ領域又はその断片が、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドのアミノ末端側に位置している、（１９）乃至（２１）のいずれか一つに記載の方法、
（２４）
Ｆｃ領域若しくはその断片が、該ペプチドに、リンカーを介して融合しているか、又は、該ペプチドに含まれるアミノ酸配列が、免疫グロブリンのＦｃ領域若しくはその断片に含まれるアミノ酸配列に、リンカー配列を介して付加している、（１９）乃至（２３）のいずれか一つに記載の方法、
（２５）
Ｆｃ領域若しくはその断片が、該ペプチドに、直接融合しているか、又は、該ペプチドに含まれるアミノ酸配列が、免疫グロブリンのＦｃ領域若しくはその断片に含まれるアミノ酸配列に、直接付加している、（１９）乃至（２３）のいずれか一つに記載の方法、
（２６）
免疫グロブリンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、及び／又は、ＩｇＥのＦｃ領域又はその断片である、（１９）乃至（２５）のいずれか一つに記載の方法、
（２７）
免疫グロブリンが、ヒト免疫グロブリンである、（１９）乃至（２６）のいずれか一つに記載の方法、
（２８）
免疫グロブリンが、ヒトＩｇＧ１である、（１９）乃至（２７）のいずれか一つに記載の方法、
（２９）
免疫グロブリンが、野生型又は変異型である、（１９）乃至（２８）のいずれか一つに記載の方法、
（３０）
アミノ末端に１乃至３個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸を欠くコンジュゲートと比較して、抑制された血中濃度の経時的減少又は増加した血中曝露量を有する（１９）乃至（２９）記載の方法、
該ペプチドが、抗体又はその抗原結合断片である、（１９）記載の方法、
（２２）
Ｆｃ領域又はその断片が、該ペプチドのカルボキシル末端側に位置している、（１９）乃至（２１）のいずれか一つに記載の方法、
（２３）
Ｆｃ領域又はその断片が、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドのアミノ末端側に位置している、（１９）乃至（２１）のいずれか一つに記載の方法、
（２４）
Ｆｃ領域若しくはその断片が、該ペプチドに、リンカーを介して融合しているか、又は、該ペプチドに含まれるアミノ酸配列が、免疫グロブリンのＦｃ領域若しくはその断片に含まれるアミノ酸配列に、リンカー配列を介して付加している、（１９）乃至（２３）のいずれか一つに記載の方法、
（２５）
Ｆｃ領域若しくはその断片が、該ペプチドに、直接融合しているか、又は、該ペプチドに含まれるアミノ酸配列が、免疫グロブリンのＦｃ領域若しくはその断片に含まれるアミノ酸配列に、直接付加している、（１９）乃至（２３）のいずれか一つに記載の方法、
（２６）
免疫グロブリンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、及び／又は、ＩｇＥのＦｃ領域又はその断片である、（１９）乃至（２５）のいずれか一つに記載の方法、
（２７）
免疫グロブリンが、ヒト免疫グロブリンである、（１９）乃至（２６）のいずれか一つに記載の方法、
（２８）
免疫グロブリンが、ヒトＩｇＧ１である、（１９）乃至（２７）のいずれか一つに記載の方法、
（２９）
免疫グロブリンが、野生型又は変異型である、（１９）乃至（２８）のいずれか一つに記載の方法、
（３０）
アミノ末端に１乃至３個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸を欠くコンジュゲートと比較して、抑制された血中濃度の経時的減少又は増加した血中曝露量を有する（１９）乃至（２９）記載の方法、
【0013】
（３１）
該融合体のアミノ末端側に、１乃至３個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸が、リンカーを介して付加しているか、又は、該融合体に含まれるアミノ酸配列のアミノ末端側に、１乃至３個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸からなるアミノ酸配列が、リンカー配列を介して、付加している、（１９）乃至（３０）のいずれか一つに記載の方法、
（３２）
該融合体のアミノ末端側に、１乃至３個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸が、直接付加しているか、又は、該融合体に含まれるアミノ酸配列のアミノ末端側に、１乃至３個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸からなるアミノ酸配列が、直接付加している、（１９）乃至（３０）のいずれか一つに記載の方法、
（３３）
該ペプチドが、ヒト疾患関連標的分子に結合することを特徴とする、（１９）乃至（３２）のいずれか一つに記載の方法、
（３４）
該ペプチドが、ヒト疾患関連標的分子の活性を抑制、阻害、作動又は活性化することを特徴とする、（１９）乃至（３３）のいずれか一つに記載の方法、
（３５）
該ペプチドがＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドであり、該ペプチドに含まれるアミノ酸配列が配列番号２（図８）で示される、（３４）に記載の方法、
（１Ａ）
下記の工程（ｉ）又は（ｉｉ）を含んでなる、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチド含有コンジュゲートの血中濃度の経時的減少を抑制する及び／又は血中曝露量を増加させる方法：
（ｉ）ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドが、免疫グロブリンのＦｃ領域又はその断片に融合してなるコンジュゲートのアミノ末端側に、１乃至数個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸からなるオリゴペプチドを付加する工程；
（ｉｉ）ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドに含まれるアミノ酸配列及び免疫グロブリンのＦｃ領域又はその断片に含まれるアミノ酸配列を含んでなるアミノ酸配列のアミノ末端側に１乃至数個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸が付加してなるアミノ酸配列を含むコンジュゲートを調製する工程、
（２Ａ）
Ｆｃ領域又はその断片が、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドのカルボキシル末端側に位置している、（１Ａ）記載の方法、
該融合体のアミノ末端側に、１乃至３個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸が、リンカーを介して付加しているか、又は、該融合体に含まれるアミノ酸配列のアミノ末端側に、１乃至３個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸からなるアミノ酸配列が、リンカー配列を介して、付加している、（１９）乃至（３０）のいずれか一つに記載の方法、
（３２）
該融合体のアミノ末端側に、１乃至３個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸が、直接付加しているか、又は、該融合体に含まれるアミノ酸配列のアミノ末端側に、１乃至３個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸からなるアミノ酸配列が、直接付加している、（１９）乃至（３０）のいずれか一つに記載の方法、
（３３）
該ペプチドが、ヒト疾患関連標的分子に結合することを特徴とする、（１９）乃至（３２）のいずれか一つに記載の方法、
（３４）
該ペプチドが、ヒト疾患関連標的分子の活性を抑制、阻害、作動又は活性化することを特徴とする、（１９）乃至（３３）のいずれか一つに記載の方法、
（３５）
該ペプチドがＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドであり、該ペプチドに含まれるアミノ酸配列が配列番号２（図８）で示される、（３４）に記載の方法、
（１Ａ）
下記の工程（ｉ）又は（ｉｉ）を含んでなる、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチド含有コンジュゲートの血中濃度の経時的減少を抑制する及び／又は血中曝露量を増加させる方法：
（ｉ）ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドが、免疫グロブリンのＦｃ領域又はその断片に融合してなるコンジュゲートのアミノ末端側に、１乃至数個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸からなるオリゴペプチドを付加する工程；
（ｉｉ）ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドに含まれるアミノ酸配列及び免疫グロブリンのＦｃ領域又はその断片に含まれるアミノ酸配列を含んでなるアミノ酸配列のアミノ末端側に１乃至数個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸が付加してなるアミノ酸配列を含むコンジュゲートを調製する工程、
（２Ａ）
Ｆｃ領域又はその断片が、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドのカルボキシル末端側に位置している、（１Ａ）記載の方法、
【0014】
（３Ａ）
Ｆｃ領域又はその断片が、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドのアミノ末端側に位置している、（１Ａ）記載の方法、
（４Ａ）
Ｆｃ領域若しくはその断片が、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドに、リンカーを介して融合しているか、又は、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドに含まれるアミノ酸配列が、免疫グロブリンのＦｃ領域に含まれるアミノ酸配列に、リンカー配列を介して付加している、（１Ａ）乃至（３Ａ）のいずれか一つに記載の方法、
（５Ａ）
Ｆｃ領域若しくはその断片が、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドに、直接融合しているか、又は、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドに含まれるアミノ酸配列が、免疫グロブリンのＦｃ領域に含まれるアミノ酸配列に、直接付加している、（１Ａ）乃至（３Ａ）のいずれか一つに記載の方法、
（６Ａ）
免疫グロブリンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、及び／又は、ＩｇＥのＦｃ領域又はその断片である、（１Ａ）乃至（５Ａ）のいずれか一つに記載の方法、
（７Ａ）
免疫グロブリンが、ヒト免疫グロブリンである、（１Ａ）乃至（６Ａ）のいずれか一つに記載の方法、
（８Ａ）
免疫グロブリンが、ヒトＩｇＧ１である、（１Ａ）乃至（７Ａ）のいずれか一つに記載の方法、
（９Ａ）
免疫グロブリンが、野生型又は変異型である、（１Ａ）乃至（８Ａ）のいずれか一つに記載の方法、
（１０Ａ）
（ｉ）記載のコンジュゲートのアミノ末端側に、該オリゴペプチドが、リンカーを介して付加しているか、又は、（ｉｉ）記載のＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドに含まれるアミノ酸配列及び免疫グロブリンのＦｃ領域又はその断片に含まれるアミノ酸配列を含んでなるアミノ酸配列のアミノ末端側に、１乃至数個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸が、リンカー配列を介して、付加している、（１Ａ）乃至（９Ａ）のいずれか一つに記載の方法、
Ｆｃ領域又はその断片が、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドのアミノ末端側に位置している、（１Ａ）記載の方法、
（４Ａ）
Ｆｃ領域若しくはその断片が、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドに、リンカーを介して融合しているか、又は、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドに含まれるアミノ酸配列が、免疫グロブリンのＦｃ領域に含まれるアミノ酸配列に、リンカー配列を介して付加している、（１Ａ）乃至（３Ａ）のいずれか一つに記載の方法、
（５Ａ）
Ｆｃ領域若しくはその断片が、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドに、直接融合しているか、又は、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドに含まれるアミノ酸配列が、免疫グロブリンのＦｃ領域に含まれるアミノ酸配列に、直接付加している、（１Ａ）乃至（３Ａ）のいずれか一つに記載の方法、
（６Ａ）
免疫グロブリンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、及び／又は、ＩｇＥのＦｃ領域又はその断片である、（１Ａ）乃至（５Ａ）のいずれか一つに記載の方法、
（７Ａ）
免疫グロブリンが、ヒト免疫グロブリンである、（１Ａ）乃至（６Ａ）のいずれか一つに記載の方法、
（８Ａ）
免疫グロブリンが、ヒトＩｇＧ１である、（１Ａ）乃至（７Ａ）のいずれか一つに記載の方法、
（９Ａ）
免疫グロブリンが、野生型又は変異型である、（１Ａ）乃至（８Ａ）のいずれか一つに記載の方法、
（１０Ａ）
（ｉ）記載のコンジュゲートのアミノ末端側に、該オリゴペプチドが、リンカーを介して付加しているか、又は、（ｉｉ）記載のＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドに含まれるアミノ酸配列及び免疫グロブリンのＦｃ領域又はその断片に含まれるアミノ酸配列を含んでなるアミノ酸配列のアミノ末端側に、１乃至数個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸が、リンカー配列を介して、付加している、（１Ａ）乃至（９Ａ）のいずれか一つに記載の方法、
【0015】
（１１Ａ）
（ｉ）記載のコンジュゲートのアミノ末端側に、該オリゴペプチドが、直接付加しているか、又は、（ｉｉ）記載のＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドに含まれるアミノ酸配列及び免疫グロブリンのＦｃ領域又はその断片に含まれるアミノ酸配列を含んでなるアミノ酸配列のアミノ末端側に、１乃至数個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸が、直接付加している、（１Ａ）乃至（９Ａ）のいずれか一つに記載の方法、
（１２Ａ）
ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドが、ヒト疾患関連標的分子に結合することを特徴とする、（１Ａ）乃至（１１Ａ）のいずれか一つに記載の方法、
（１３Ａ）
ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドが、ヒト疾患関連標的分子の活性を抑制又は阻害することを特徴とする、（１Ａ）乃至（１２Ａ）のいずれか一つに記載の方法、
（１４Ａ）
ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドに含まれるアミノ酸配列が、下記（ｉ）又は（ｉｉ）である、（１Ａ）乃至（１３Ａ）のいずれか一つに記載の方法：
（ｉ）配列番号２（図８）で示され、ヒト疾患関連標的分子に結合するか又は該分子の活性を抑制若しくは阻害するペプチドに含まれるアミノ酸配列；
（ｉｉ）（ｉ）記載のアミノ酸配列と９０％以上同一なアミノ酸配列を含み、且つ該分子に結合するか又は該分子の活性を抑制若しくは阻害するペプチドに含まれるアミノ酸配列、
（１５Ａ）
下記（ｉ）又は（ｉｉ）であるＳＰＩＮＫ２変異体のコンジュゲート：
（ｉ）アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、１乃至数個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドに含まれるアミノ酸配列、及び、免疫グロブリンのＦｃ領域又はその断片に含まれるアミノ酸配列を、その順に含む、ＳＰＩＮＫ２変異体のコンジュゲート；
（ｉｉ）アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、１乃至数個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸、免疫グロブリンのＦｃ領域又はその断片に含まれるアミノ酸配列、及び、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドに含まれるアミノ酸配列を、その順に含む、ＳＰＩＮＫ２変異体のコンジュゲート、
（１６Ａ）
ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドに含まれるアミノ酸配列が、Ｆｃ領域に含まれるアミノ酸配列に、リンカー配列を介して付加している、（１５Ａ）記載のコンジュゲート、
（１７Ａ）
ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドに含まれるアミノ酸配列が、Ｆｃ領域に含まれるアミノ酸配列に、直接付加している、（１５Ａ）記載のコンジュゲート、
（１８Ａ）
１乃至数個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸が、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドに含まれるアミノ酸配列又はＦｃ領域に含まれるアミノ酸配列に、リンカー配列を介して付加している、（１５Ａ）乃至（１７Ａ）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（１９Ａ）
１乃至数個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸が、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドに含まれるアミノ酸配列又はＦｃ領域に含まれるアミノ酸配列に、直接付加している、（１５Ａ）乃至（１７Ａ）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（２０Ａ）
免疫グロブリンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、及び／又は、ＩｇＥのＦｃ領域又はその断片である、（１５Ａ）乃至（１９Ａ）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（ｉ）記載のコンジュゲートのアミノ末端側に、該オリゴペプチドが、直接付加しているか、又は、（ｉｉ）記載のＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドに含まれるアミノ酸配列及び免疫グロブリンのＦｃ領域又はその断片に含まれるアミノ酸配列を含んでなるアミノ酸配列のアミノ末端側に、１乃至数個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸が、直接付加している、（１Ａ）乃至（９Ａ）のいずれか一つに記載の方法、
（１２Ａ）
ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドが、ヒト疾患関連標的分子に結合することを特徴とする、（１Ａ）乃至（１１Ａ）のいずれか一つに記載の方法、
（１３Ａ）
ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドが、ヒト疾患関連標的分子の活性を抑制又は阻害することを特徴とする、（１Ａ）乃至（１２Ａ）のいずれか一つに記載の方法、
（１４Ａ）
ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドに含まれるアミノ酸配列が、下記（ｉ）又は（ｉｉ）である、（１Ａ）乃至（１３Ａ）のいずれか一つに記載の方法：
（ｉ）配列番号２（図８）で示され、ヒト疾患関連標的分子に結合するか又は該分子の活性を抑制若しくは阻害するペプチドに含まれるアミノ酸配列；
（ｉｉ）（ｉ）記載のアミノ酸配列と９０％以上同一なアミノ酸配列を含み、且つ該分子に結合するか又は該分子の活性を抑制若しくは阻害するペプチドに含まれるアミノ酸配列、
（１５Ａ）
下記（ｉ）又は（ｉｉ）であるＳＰＩＮＫ２変異体のコンジュゲート：
（ｉ）アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、１乃至数個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドに含まれるアミノ酸配列、及び、免疫グロブリンのＦｃ領域又はその断片に含まれるアミノ酸配列を、その順に含む、ＳＰＩＮＫ２変異体のコンジュゲート；
（ｉｉ）アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、１乃至数個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸、免疫グロブリンのＦｃ領域又はその断片に含まれるアミノ酸配列、及び、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドに含まれるアミノ酸配列を、その順に含む、ＳＰＩＮＫ２変異体のコンジュゲート、
（１６Ａ）
ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドに含まれるアミノ酸配列が、Ｆｃ領域に含まれるアミノ酸配列に、リンカー配列を介して付加している、（１５Ａ）記載のコンジュゲート、
（１７Ａ）
ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドに含まれるアミノ酸配列が、Ｆｃ領域に含まれるアミノ酸配列に、直接付加している、（１５Ａ）記載のコンジュゲート、
（１８Ａ）
１乃至数個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸が、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドに含まれるアミノ酸配列又はＦｃ領域に含まれるアミノ酸配列に、リンカー配列を介して付加している、（１５Ａ）乃至（１７Ａ）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（１９Ａ）
１乃至数個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸が、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドに含まれるアミノ酸配列又はＦｃ領域に含まれるアミノ酸配列に、直接付加している、（１５Ａ）乃至（１７Ａ）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（２０Ａ）
免疫グロブリンが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、及び／又は、ＩｇＥのＦｃ領域又はその断片である、（１５Ａ）乃至（１９Ａ）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
【0016】
（２１Ａ）
免疫グロブリンが、ヒト免疫グロブリンである、（１５Ａ）乃至（２０Ａ）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（２２Ａ）
免疫グロブリンが、ヒトＩｇＧ１である、（１５Ａ）乃至（２１Ａ）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（２３Ａ）
免疫グロブリンが、野生型又は変異型である、（１５Ａ）乃至（２２Ａ）のいずれか一つに記載の方法、
（２４Ａ）
アミノ末端に１乃至数個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸を欠くコンジュゲートと比較して、抑制された血中濃度の経時的減少又は増加した血中曝露量を有する、（１５Ａ）乃至（２３Ａ）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（２５Ａ）
ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドが、ヒト疾患関連標的分子に結合することを特徴とする、（１５Ａ）乃至（２４Ａ）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（２６Ａ）
ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドが、ヒト疾患関連標的分子の活性を抑制又は阻害することを特徴とする、（１５Ａ）乃至（２５Ａ）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（２７Ａ）
ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドに含まれるアミノ酸配列が、下記（ｉ）又は（ｉｉ）である、（１５Ａ）乃至（２６Ａ）のいずれか一つに記載のコンジュゲート：
（ｉ）配列番号２（図８）で示され、ヒト疾患関連標的分子に結合するか又は該分子の活性を抑制若しくは阻害するペプチドに含まれるアミノ酸配列；
（ｉｉ）（ｉ）記載のアミノ酸配列と９０％以上同一なアミノ酸配列を含み、且つ該分子に結合するか又は該分子の活性を抑制若しくは阻害するペプチドに含まれるアミノ酸配列、
（２８Ａ）
（１５Ａ）乃至（２７Ａ）のいずれか一つに記載のコンジュゲートを含む組成物、
及び、
（２９Ａ）
（２５Ａ）乃至（２７Ａ）のいずれか一つに記載のコンジュゲートを含む医薬組成物、
等に関する。
免疫グロブリンが、ヒト免疫グロブリンである、（１５Ａ）乃至（２０Ａ）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（２２Ａ）
免疫グロブリンが、ヒトＩｇＧ１である、（１５Ａ）乃至（２１Ａ）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（２３Ａ）
免疫グロブリンが、野生型又は変異型である、（１５Ａ）乃至（２２Ａ）のいずれか一つに記載の方法、
（２４Ａ）
アミノ末端に１乃至数個のアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸を欠くコンジュゲートと比較して、抑制された血中濃度の経時的減少又は増加した血中曝露量を有する、（１５Ａ）乃至（２３Ａ）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（２５Ａ）
ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドが、ヒト疾患関連標的分子に結合することを特徴とする、（１５Ａ）乃至（２４Ａ）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（２６Ａ）
ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドが、ヒト疾患関連標的分子の活性を抑制又は阻害することを特徴とする、（１５Ａ）乃至（２５Ａ）のいずれか一つに記載のコンジュゲート、
（２７Ａ）
ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドに含まれるアミノ酸配列が、下記（ｉ）又は（ｉｉ）である、（１５Ａ）乃至（２６Ａ）のいずれか一つに記載のコンジュゲート：
（ｉ）配列番号２（図８）で示され、ヒト疾患関連標的分子に結合するか又は該分子の活性を抑制若しくは阻害するペプチドに含まれるアミノ酸配列；
（ｉｉ）（ｉ）記載のアミノ酸配列と９０％以上同一なアミノ酸配列を含み、且つ該分子に結合するか又は該分子の活性を抑制若しくは阻害するペプチドに含まれるアミノ酸配列、
（２８Ａ）
（１５Ａ）乃至（２７Ａ）のいずれか一つに記載のコンジュゲートを含む組成物、
及び、
（２９Ａ）
（２５Ａ）乃至（２７Ａ）のいずれか一つに記載のコンジュゲートを含む医薬組成物、
等に関する。
【発明の効果】
【0017】
本発明の提供する血中動態改善方法は、ペプチド又は該ペプチドを含有するコンジュゲートの血中濃度の経時的減少の抑制、血中曝露量の増加等をもたらし、該ペプチド又は該コンジュゲートを含有する医薬は、各種疾患の治療又は予防等に好適に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】ＰＫ試験に供したＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ融合体
【図2】ペプチド基質の分解速度を指標として、ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体のＫＬＫ５阻害活性（５０％阻害濃度：ＩＣ５０）を示した図。ＫＬＫ５阻害活性評価には終濃度２０ｎＭのＫＬＫ５及び終濃度１００μＭのＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＥＳ０１１）を使用した。Ｋ５１０２８－Ｆｃを基に、（Ａ）Ａｓｐを１～５個付加した場合においても、（Ｂ）Ａｓｐ又はＧｌｕを付加した場合においても、ＫＬＫ５阻害活性に変化はなかった。
【図3】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに５ｍｇ／ｋｇのＫ５１０２８－Ｆｃを静脈内投与し、経時的に血漿中のＫ５１０２８－Ｆｃ濃度を測定した図。血漿中のＫ５１０２８－Ｆｃ濃度はビオチン標識した抗ＳＰＩＮＫ２抗体（Ａｔｌａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、ＤｙＬｉｇｈｔ６５０で標識した抗ＳＰＩＮＫ２抗体６Ｄ８（第一三共株式会社）及びＧｙｒｏｌａｂ ｘＰ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ＧＹＲＯＳ ＰＲＯＴＥＩＮ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、（Ａ）投与後１週間まで、（Ｂ）投与後２４時間まで、血漿中のＫ５１０２８－Ｆｃ濃度を測定した。
【図4】Ｋ５１０２８－ＦｃにＡｓｐ又はＧｌｕを付加することで、ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ融合体の血中動態が改善したことを示した図。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに５ｍｇ／ｋｇの被験物質を静脈内投与し、血漿中の被験物質濃度を投与後２４時間まで測定した。被験物質はＫ５１０２８－Ｆｃ、Ｄ１－Ｋ５１０２８－Ｆｃ又はＥ１－Ｋ５１０２８－Ｆｃで、被験物質濃度の測定にはビオチン標識した抗ＳＰＩＮＫ２抗体、ＤｙＬｉｇｈｔ６５０で標識した抗ＳＰＩＮＫ２抗体６Ｄ８及びＧｙｒｏｌａｂ ｘＰ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを用いた。
【図5】Ｋ５１０２８－Ｆｃと同様、Ｋ５００５５－ＦｃにおいてもＡｓｐ付加によりＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ融合体の血中動態が改善したことを示した図。
【図6】Ｋ５１０２８－Ｆｃを基に、ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ融合体の血中動態改善に効果があるＡｓｐ付加数を最適化した図。Ａｓｐ付加数１～５個はいずれも改善効果を示し、Ａｓｐ付加数３個が最も高い効果を示した。
【図7】ヒトＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列（配列番号１）
【図8】ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドの一般式（配列番号２）
【図9】ヒトＫＬＫ５のアミノ酸配列（配列番号３）
【図10】ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５００５５のアミノ酸配列（配列番号４）
【0019】
【図11】ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５１０２８のアミノ酸配列（配列番号５）
【図12】ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ０－Ｋ５１０２８－Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号６）
【図13】ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ１－Ｋ５１０２８－Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号７）
【図14】ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ２－Ｋ５１０２８－Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号８）
【図15】ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１０２８－Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号９）
【図16】ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ４－Ｋ５１０２８－Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号１０）
【図17】ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ５－Ｋ５１０２８－Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号１１）
【図18】ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｋ５１０２８－Ｄ５－Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号１２）
【図19】ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｅ１－Ｋ５１０２８－Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号１３）
【図20】ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ１－Ｋ５００５５－Ｆｃのアミノ酸配列（配列番号１４）
【0020】
【図21】プライマー１のヌクレオチド配列（配列番号１５）
【図22】プライマー２のヌクレオチド配列（配列番号１６）
【図23】プライマー３のヌクレオチド配列（配列番号１７）
【図24】プライマー４のヌクレオチド配列（配列番号１８）
【図25】プライマー５のヌクレオチド配列（配列番号１９）
【図26】プライマー６のヌクレオチド配列（配列番号２０）
【図27】プライマー７のヌクレオチド配列（配列番号２１）
【図28】プライマー８のヌクレオチド配列（配列番号２２）
【図29】プライマー９のヌクレオチド配列（配列番号２３）
【図30】プライマー１０のヌクレオチド配列（配列番号２４）
【図31】プライマー１１のヌクレオチド配列（配列番号２５）
【図32】プライマー１２のヌクレオチド配列（配列番号２６）
【図33】プライマー１３のヌクレオチド配列（配列番号２７）
【図34】プライマー１４のヌクレオチド配列（配列番号２８）
【図35】プライマー１５のヌクレオチド配列（配列番号２９）
【図36】プライマー１６のヌクレオチド配列（配列番号３０）
【図37】プライマー１７のヌクレオチド配列（配列番号３１）
【図38】プライマー１８のヌクレオチド配列（配列番号３２）
【図39】プライマー１９のヌクレオチド配列（配列番号３３）
【図40】ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のアミノ酸配列（配列番号３４）
【図41】プライマー２０のヌクレオチド配列（配列番号３５）
【図42】プライマー２１のヌクレオチド配列（配列番号３６）
【図43】ヒトＩｇＧ２のＦｃ領域のアミノ酸配列（配列番号３７）
【図44】プライマー２２のヌクレオチド配列（配列番号３８）
【図45】プライマー２３のヌクレオチド配列（配列番号３９）
【図46】ヒトＩｇＧ４ＰのＦｃ領域のアミノ酸配列（配列番号４０）
【図47】プライマー２４のヌクレオチド配列（配列番号４１）
【図48】プライマー２５のヌクレオチド配列（配列番号４２）
【図49】ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ０－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ２）のアミノ酸配列（配列番号４３）
【図50】ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ１－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ２）のアミノ酸配列（配列番号４４）
【0021】
【図51】ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ２）のアミノ酸配列（配列番号４５）
【図52】ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ０－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ４Ｐ）のアミノ酸配列（配列番号４６）
【図53】ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ１－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ４Ｐ）のアミノ酸配列（配列番号４７）
【図54】ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ４Ｐ）のアミノ酸配列（配列番号４８）
【図55】ペプチド基質の分解速度を指標として、ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ（ＩｇＧ２，ＩｇＧ４Ｐ）融合体のＫＬＫ５阻害活性（５０％阻害濃度：ＩＣ５０）を示した図。ＫＬＫ５阻害活性評価には終濃度２０ｎＭのＫＬＫ５及び終濃度１００μＭのＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＥＳ０１１）を使用した。（Ａ）Ｄ０－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ２）を基に、Ａｓｐを１又は３個付加した場合においても、（Ｂ）Ｄ０－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ４Ｐ）を基に、Ａｓｐを１又は３個付加した場合においても、ＫＬＫ５阻害活性に変化はなかった。
【図56】Ｄ０－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ２）にＡｓｐを１個以上付加することで、ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ（ＩｇＧ２）融合体の血中動態が改善したことを示した図。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに５ｍｇ／ｋｇのＤ０－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ２），Ｄ１－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ２）又はＤ３－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ２）を静脈内投与し、血漿中のＤ０－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ２），Ｄ１－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ２）又はＤ３－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ２）濃度を投与後２４時間まで測定した。濃度測定にはビオチン標識した抗ＳＰＩＮＫ２抗体、ＤｙＬｉｇｈｔ６５０で標識した抗ＳＰＩＮＫ２抗体６Ｄ８及びＧｙｒｏｌａｂ ｘＰ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを用いた。
【図57】Ｄ０－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ２）と同様、Ｄ０－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ４Ｐ）においてもＡｓｐ付加によりＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ（ＩｇＧ４Ｐ）融合体の血中動態が改善したことを示した図。
【発明を実施するための形態】
【0022】
１．定義
本発明において、「遺伝子」とは、蛋白質に含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子又はその相補鎖を意味し、一本鎖、二本鎖又は三本鎖以上からなり、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖の会合体、一本の鎖上にリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドが混在するもの及びそのような鎖を含む二本鎖又は三本鎖以上の核酸分子も「遺伝子」の意味に含まれる。
本発明において、「遺伝子」とは、蛋白質に含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子又はその相補鎖を意味し、一本鎖、二本鎖又は三本鎖以上からなり、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖の会合体、一本の鎖上にリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドが混在するもの及びそのような鎖を含む二本鎖又は三本鎖以上の核酸分子も「遺伝子」の意味に含まれる。
【0023】
本発明において、「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」及び「核酸分子」は同義であり、それらの構成単位であるリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオチド、ヌクレオシド等の個数によっては何ら限定されず、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、プライマー等もその範囲に含まれる。「核酸分子」は略して「核酸」と呼ばれる場合がある。
【0024】
本発明において、「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「蛋白質」は同義である。
【0025】
本発明において、標的分子Ｘを認識する、又は標的分子Ｘに結合する（以下、その認識又は結合作用をまとめて「Ｘ結合活性」という。）ペプチドを、「Ｘ結合ペプチド」と呼ぶことができる。さらに、標的分子Ｘを認識し、又は標的分子Ｘに結合し、且つ標的分子Ｘの有する１つ又は２つ以上の活性又は機能を阻害又は抑制する（以下、それらの阻害又は抑制作用をまとめて「Ｘ阻害活性」という。）ペプチドを、「Ｘ阻害ペプチド」と呼ぶことができる。
【0026】
本発明において、「ＳＰＩＮＫ２」は、Ｓｅｒｉｎｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｋａｚａｌ－ｔｙｐｅ ２を意味し、３つのジスルフィド結合を有するＫａｚａｌ様ドメインから成る７ｋＤａの蛋白質である。好適なＳＰＩＮＫ２はヒト由来である。本発明においては、別段記載された場合を除き、ヒトＳＰＩＮＫ２（配列番号１：図７）を単に「ＳＰＩＮＫ２」という。
【0027】
本発明において、ペプチドが結合する「部位」、すなわちペプチドが認識する「部位」とは、ペプチドが結合又は認識する標的分子上の連続的若しくは断続的な部分アミノ酸配列又は部分高次構造を意味する。本発明においては、かかる部位のことを標的分子上のエピトープ又は結合部位と呼ぶことができる。
【0028】
本発明において、「細胞」には、動物個体に由来する各種細胞、継代培養細胞、初代培養細胞、細胞株、組換え細胞、酵母、微生物等も含まれる。
【0029】
本発明において、「ＳＰＩＮＫ２変異体」とは、野生型ＳＰＩＮＫ２の有するアミノ酸配列において、１個又は２個以上のアミノ酸が野生型とは異なるアミノ酸で置換され、１個又は２個以上の野生型のアミノ酸が欠失し、１個又は２個以上の野生型には無いアミノ酸が挿入されて（以下、「変異」と総称する。）なるアミノ酸配列を含むペプチドを意味する。
【0030】
本発明において、「１乃至数個」における「数個」とは、３乃至１０個を指す。
【0031】
本発明において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、５×ＳＳＣを含む溶液中で６５℃にてハイブリダイゼーションを行い、ついで２×ＳＳＣ－０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で６５℃にて２０分間、０．５×ＳＳＣ－０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で６５℃にて２０分間、並びに、０．２×ＳＳＣ－０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で６５℃にて２０分間、それぞれ洗浄する条件又はそれと同等の条件でハイブリダイズすることを意味する。ＳＳＣとは１５０ｍＭ ＮａＣｌ－１５ｍＭクエン酸ナトリウムの水溶液であり、ｎ×ＳＳＣはｎ倍濃度のＳＳＣを意味する。
【0032】
本発明において「特異的」及び「特異性」なる語は「選択的」及び「選択性」とそれぞれ同義であり、互換性がある。
【0033】
「血中動態」とは、血液循環における薬物動態、すなわち個体に投与された薬物が時間的経過に伴い、血液循環においてとる動態（吸収や分布など）と消失（代謝や排泄など）を意味し、血中薬物濃度の経時的変化（ＰＫ）又は血中曝露量（ＡＵＣ）、薬物消失半減期（ｔ１／２）、薬物最高血中濃度（Ｃｍａｘ）、最高血中濃度に達するまでの時間（ｔｍａｘ）等を指標として評価される。
【0034】
「血中曝露量」とは、一定時間における血中薬物濃度を、血中濃度－時間曲線下面積に代えて表した数値を意味する。
【0035】
「血中動態の改善」とは、血中薬物濃度の経時的減少の抑制、ＰＫの延長、ＡＵＣの増加、ｔ１／２の延長、Ｃｍａｘの上昇、及び／又は、ｔｍａｘの短縮を意味する。
【0036】
２．ペプチド
２－１．アミノ酸
「アミノ酸」は、アミノ基及びカルボキシル基を含む有機化合物であり、好適には蛋白質に、より好適には天然の蛋白質に、構成単位として含まれるα－アミノ酸を意味する。本発明において、より好適なアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌであり、特に明記しない限り「アミノ酸」はこれらの計２０アミノ酸を意味する。それらの計２０アミノ酸を「天然アミノ酸」と呼ぶことができる。
２－１．アミノ酸
「アミノ酸」は、アミノ基及びカルボキシル基を含む有機化合物であり、好適には蛋白質に、より好適には天然の蛋白質に、構成単位として含まれるα－アミノ酸を意味する。本発明において、より好適なアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌであり、特に明記しない限り「アミノ酸」はこれらの計２０アミノ酸を意味する。それらの計２０アミノ酸を「天然アミノ酸」と呼ぶことができる。
【0037】
本発明においては「アミノ酸残基」は「アミノ酸」と略記される場合がある。
【0038】
また、本発明において、アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、又はその混合物（ＤＬ－アミノ酸）であるが、特に明記しない限りＬ－アミノ酸を意味する。
【0039】
天然アミノ酸は、その共通する側鎖の性質に基づいて、例えば、次のグループに分けることができる。
（１）疎水性アミノ酸グループ：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
（２）中性親水性アミノ酸グループ：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
（３）酸性アミノ酸グループ：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
（４）塩基性アミノ酸グループ：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
（５）主鎖の方角に影響を与えるアミノ酸のグループ：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
（６）芳香族アミノ酸グループ：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
ただし、天然アミノ酸の分類はこれらに限定されるものではない。
（１）疎水性アミノ酸グループ：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
（２）中性親水性アミノ酸グループ：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ
（３）酸性アミノ酸グループ：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
（４）塩基性アミノ酸グループ：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
（５）主鎖の方角に影響を与えるアミノ酸のグループ：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
（６）芳香族アミノ酸グループ：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
ただし、天然アミノ酸の分類はこれらに限定されるものではない。
【0040】
本発明においては、天然アミノ酸は保存的アミノ酸置換を受け得る。
【0041】
「保存的アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」とは、機能的に等価又は類似のアミノ酸との置換を意味する。ペプチドにおける保存的アミノ酸置換は、該ペプチドのアミノ酸配列に静的変化をもたらす。例えば、同様の極性を有する一つ又は二つ以上のアミノ酸は機能的に等価に作用し、かかるペプチドのアミノ酸配列に静的変化をもたらす。一般に、あるグループ内の置換は構造及び機能について保存的であると考えることができる。しかしながら、当業者には自明であるように、特定のアミノ酸残基が果たす役割は当該アミノ酸を含む分子の三次元構造における意味合いにおいて決定され得る。例えば、システイン残基は、還元型の（チオール）フォームと比較してより極性の低い、酸化型の（ジスルフィド）フォームをとることができる。アルギニン側鎖の長い脂肪族の部分は構造的及び機能的に重要な特徴を構成し得る。また、芳香環を含む側鎖（トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン）はイオン－芳香族相互作用又は陽イオン－パイ相互作用に寄与し得る。かかる場合において、これらの側鎖を有するアミノ酸を、酸性又は非極性グループに属するアミノ酸と置換しても、構造的及び機能的には保存的であり得る。プロリン、グリシン、システイン（ジスルフィド・フォーム）等の残基は主鎖の立体構造に直接的な効果を与える可能性があり、しばしば構造的ゆがみなしに置換することはできない。
【0042】
保存的アミノ酸置換は、以下に示すとおり、側鎖の類似性に基づく特異的置換（レーニンジャ、生化学、改訂第２版、１９７５年刊行、７３乃至７５頁：Ｌ． Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， ｐｐ７３－７５， Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９７５））及び典型的置換を含む。
（１）非極性アミノ酸グループ：アラニン（以下、「Ａｌａ」又は単に「Ａ」と記す）、バリン（以下、「Ｖａｌ」又は単に「Ｖ」と記す）、ロイシン（以下、「Ｌｅｕ」又は単に「Ｌ」と記す）、イソロイシン（以下、「Ｉｌｅ」又は単に「Ｉ」と記す）、プロリン（以下、「Ｐｒｏ」又は単に「Ｐ」と記す）、フェニルアラニン（「Ｐｈｅ」又は単に「Ｆ」と記す）、トリプトファン（以下、「Ｔｒｐ」又は単に「Ｗ」と記す）、メチオニン（以下、「Ｍｅｔ」又は単に「Ｍ」と記す）
（２）非荷電極性アミノ酸グループ：グリシン（以下、「Ｇｌｙ」又は単に「Ｇ」と記す）、セリン（以下、「Ｓｅｒ」又は単に「Ｓ」と記す）、スレオニン（以下、「Ｔｈｒ」又は単に「Ｔ」と記す）、システイン（以下、「Ｃｙｓ」又は単に「Ｃ」と記す）、チロシン（以下、「Ｔｙｒ」又は単に「Ｙ」と記す）、アスパラギン（以下、「Ａｓｎ」又は単に「Ｎ」と記す）、グルタミン（以下、「Ｇｌｎ」又は単に「Ｑ」と記す）
（３）酸性アミノ酸グループ：アスパラギン酸（以下、「Ａｓｐ」又は単に「Ｄ」と記す）、グルタミン酸（以下、「Ｇｌｕ」又は単に「Ｅ」と記す）
（４）塩基性アミノ酸グループ：リジン（以下、「Ｌｙｓ」又は単に「Ｋ」と記す）、アルギニン（以下、「Ａｒｇ」又は単に「Ｒ」と記す）、ヒスチジン（以下、「Ｈｉｓ」又は単に「Ｈ」と記す）
本発明において、アミノ酸は、天然アミノ酸以外のアミノ酸であってもよい。例えば、天然のペプチドや蛋白質において見出されるセレノシステイン、Ｎ－ホルミルメチオニン、ピロリジン、ピログルタミン酸、シスチン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、チロキシン、Ｏ－ホスホセリン、デスモシン、β－アラニン、サルコシン、オルニチン、クレアチン、γアミノ酪酸、オパイン、テアニン、トリコロミン酸、カイニン酸、ドウモイ酸、アクロメリン酸等を挙げることができ、ノルロイシン、Ａｃ－アミノ酸、Ｂｏｃ－アミノ酸、Ｆｍｏｃ－アミノ酸、Ｔｒｔ－アミノ酸、Ｚ－アミノ酸等のＮ末端保護アミノ酸、アミノ酸ｔ－ブチルエステル、ベンジルエステル、シクロヘキシルエステル、フルオレニルエステル等のＣ末端保護アミノ酸、ジアミン、ωアミノ酸、βアミノ酸、γアミノ酸、アミノ酸のＴｉｃ誘導体、アミノフォスフォン酸を含むその他の天然界には見出されないアミノ酸等を挙げることができるが、それらに限らず上記２０の「天然アミノ酸」以外のアミノ酸を、本発明では便宜的に「非天然アミノ酸」と総称する。
（１）非極性アミノ酸グループ：アラニン（以下、「Ａｌａ」又は単に「Ａ」と記す）、バリン（以下、「Ｖａｌ」又は単に「Ｖ」と記す）、ロイシン（以下、「Ｌｅｕ」又は単に「Ｌ」と記す）、イソロイシン（以下、「Ｉｌｅ」又は単に「Ｉ」と記す）、プロリン（以下、「Ｐｒｏ」又は単に「Ｐ」と記す）、フェニルアラニン（「Ｐｈｅ」又は単に「Ｆ」と記す）、トリプトファン（以下、「Ｔｒｐ」又は単に「Ｗ」と記す）、メチオニン（以下、「Ｍｅｔ」又は単に「Ｍ」と記す）
（２）非荷電極性アミノ酸グループ：グリシン（以下、「Ｇｌｙ」又は単に「Ｇ」と記す）、セリン（以下、「Ｓｅｒ」又は単に「Ｓ」と記す）、スレオニン（以下、「Ｔｈｒ」又は単に「Ｔ」と記す）、システイン（以下、「Ｃｙｓ」又は単に「Ｃ」と記す）、チロシン（以下、「Ｔｙｒ」又は単に「Ｙ」と記す）、アスパラギン（以下、「Ａｓｎ」又は単に「Ｎ」と記す）、グルタミン（以下、「Ｇｌｎ」又は単に「Ｑ」と記す）
（３）酸性アミノ酸グループ：アスパラギン酸（以下、「Ａｓｐ」又は単に「Ｄ」と記す）、グルタミン酸（以下、「Ｇｌｕ」又は単に「Ｅ」と記す）
（４）塩基性アミノ酸グループ：リジン（以下、「Ｌｙｓ」又は単に「Ｋ」と記す）、アルギニン（以下、「Ａｒｇ」又は単に「Ｒ」と記す）、ヒスチジン（以下、「Ｈｉｓ」又は単に「Ｈ」と記す）
本発明において、アミノ酸は、天然アミノ酸以外のアミノ酸であってもよい。例えば、天然のペプチドや蛋白質において見出されるセレノシステイン、Ｎ－ホルミルメチオニン、ピロリジン、ピログルタミン酸、シスチン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、チロキシン、Ｏ－ホスホセリン、デスモシン、β－アラニン、サルコシン、オルニチン、クレアチン、γアミノ酪酸、オパイン、テアニン、トリコロミン酸、カイニン酸、ドウモイ酸、アクロメリン酸等を挙げることができ、ノルロイシン、Ａｃ－アミノ酸、Ｂｏｃ－アミノ酸、Ｆｍｏｃ－アミノ酸、Ｔｒｔ－アミノ酸、Ｚ－アミノ酸等のＮ末端保護アミノ酸、アミノ酸ｔ－ブチルエステル、ベンジルエステル、シクロヘキシルエステル、フルオレニルエステル等のＣ末端保護アミノ酸、ジアミン、ωアミノ酸、βアミノ酸、γアミノ酸、アミノ酸のＴｉｃ誘導体、アミノフォスフォン酸を含むその他の天然界には見出されないアミノ酸等を挙げることができるが、それらに限らず上記２０の「天然アミノ酸」以外のアミノ酸を、本発明では便宜的に「非天然アミノ酸」と総称する。
【0043】
２－２．ペプチド
本発明において、ペプチドは、任意のペプチドの野生型、変異型、改変型、人工的に設計されたペプチド等であれば特に限定されないが、好適には、標的分子に結合する、標的分子の活性を賦活化、促進、抑制する若しくは阻害する、及び／又は、標的分子に拮抗若しくは作動するペプチドである。より好適なペプチドは、ＳＰＩＮＫ２変異体である。
本発明において、ペプチドは、任意のペプチドの野生型、変異型、改変型、人工的に設計されたペプチド等であれば特に限定されないが、好適には、標的分子に結合する、標的分子の活性を賦活化、促進、抑制する若しくは阻害する、及び／又は、標的分子に拮抗若しくは作動するペプチドである。より好適なペプチドは、ＳＰＩＮＫ２変異体である。
【0044】
本発明において「標的分子」とは、本発明のペプチドが結合する、ヒト若しくは非ヒト動物の個体に内在する物質又は生体内に取り込まれ得る外因性の物質を意味する。ペプチドがＳＰＩＮＫ２変異体の場合、本発明の標的分子は、好適にはＳＰＩＮＫ２の内在性の標的であるトリプシン及び／又はアクロシン以外の、より好適にはトリプシン以外の分子であり、より一層好適にはヒト由来のトリプシン以外のヒト由来の分子である。さらにより一層好適には、かかるヒト個体が罹患し得る疾患の発症若しくは増悪に直接又は間接的に関与し得るか、又は、かかる疾患と相関若しくは逆相関を示す、内在するかあるいは外因性の酵素、受容体、該受容体のリガンド、サイトカイン等の液性因子、その他の生体高分子、シグナル伝達物質、細胞、病原体、毒素、又は、それらのいずれか一つ若しくはそれ以上に由来する物質、例えば、その断片、分解物、代謝産物、加工物等である（以下、「疾患関連標的分子」という。）。また、本発明のある態様において、好適な標的分子はトリプシン及び／又はアクロシン以外の、より好適にはトリプシン以外のプロテアーゼである。かかるプロテアーゼは、好ましくは疾患関連標的分子である。
【0045】
標的分子に結合する、及び／又は、標的分子の活性を賦活化、促進若しくは抑制する、及び／又は、標的分子に拮抗又は作動するペプチドは、ペプチド・ライブラリーから、標的分子に結合する活性、標的分子を賦活、促進、抑制若しくは阻害する活性、及び／又は、標的分子に拮抗若しくは作動する活性（以下まとめて「標的分子に対する活性」という。）を指標として、当業者に周知のスクリーニングを実施することにより、同定又は濃縮することができる（ＷＯ２０１４／０２４９１４Ａ１、ＷＯ２０１８／１１７２４４Ａ１）。同定又は濃縮されたペプチドのアミノ酸配列は、公知のシーケンスにより決定することができる。アミノ酸配列が判明したペプチドは、組換え、化学合成又はイン・ビトロ翻訳により、調製することができる。
【0046】
疾患関連標的分子としては、例えば、キモトリプシン、カリクレイン、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＫＬＫ１、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ８、ＨＴＲＡ１、ＭＭＰ－９等を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
【0047】
疾患関連標的分子に対する活性を有するＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドとしては、例えば、キモトリプシン結合ペプチド（ＷＯ２０１４／０２４９１４Ａ１）、カリクレイン結合ペプチド、ＥＧＦＲ結合ペプチド及びＨＥＲ２結合ペプチド（以上、ＷＯ２０１４／０２４９１４Ａ１）、ヒトＫＬＫ５の有するプロテアーゼ活性を阻害するペプチド（以下「ＫＬＫ５阻害ペプチド」という。）であるＫ５００５５（配列番号４：図１０）及びＫ５１０２８（配列番号５：図１１）、ＨＴＲＡ１阻害ペプチド（ＷＯ２０１８／１１７２４４Ａ１）、ＭＭＰ－９結合ペプチド（ＷＯ２０１９／０１７３３８Ａ１）、並びに、ＫＬＫ１阻害ペプチド、ＫＬＫ４阻害ペプチド及び／又はＫＬＫ８阻害ペプチド（ＷＯ２０１９／０４９９３３Ａ１）等を挙げることができるが、それらに限定されない。
【0048】
ＫＬＫ５は、Ｎ末プロペプチドとプロテアーゼ活性ドメインからなり、３箇所のＮ型糖鎖が付加したトリプシン様のプロテアーゼ活性を示す蛋白質であり、好適にはヒトＫＬＫ５（配列番号３：図９）である。ＫＬＫ５阻害剤は、ネザートン症候群、アトピー性皮膚炎、酒さ、紫外線による皮膚傷害、乾癬、喘息、脊髄損傷、がん、Ｂａｒｒｅｔｔ食道等の治療及び／又は予防に有用である。なお、Ｋ５１０２８は、ヒトＫＬＫ７の有するプロテアーゼ活性をも阻害する（データ示さず）。
【0049】
疾患関連標的分子に対する活性を有するＳＰＩＮＫ２変異体は、医薬及び診断薬として当該分野で使用される抗体等の他の生体高分子と比較して分子量が小さく、その製造が比較的容易であり、保存安定性や熱安定性等の物性の面で優れており、医薬組成物として使用される場合の投与経路、投与方法、製剤等の選択の幅が広い等の長所を有する。ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドの分子量は、１０，０００未満、好適には８，０００未満、より好適には約７，０００～７，２００である。また、配列番号２（図８）の１５番Ｃｙｓ～３１番Ｃｙｓからなる可変ループ部分又は１５番Ｃｙｓ～６３番Ｃｙｓからなるペプチド断片（以下「６つのＣｙｓを含む部分」という。）も本発明のペプチドの範囲に含まれ、可変ループ部分の分子量は２，５００未満、好適には約１，８００～２，０００であり、６つのＣｙｓを含む部分の分子量は６，０００未満、好適には約５，３００～５，５００である。また、生体高分子やポリマーの付加等、公知の方法を適用して本発明のペプチドの分子量を大きくすることにより、医薬組成物として使用された場合の血中半減期をより長く調節することもできる。
【0050】
本発明において、「変異した」とは、天然に存在する核酸分子又はペプチドと比較のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列において、１つ又は２つ以上のヌクレオチド若しくはヌクレオチド残基又はアミノ酸若しくはアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入がなされていることを意味する。本発明のＳＰＩＮＫ２変異体のアミノ酸配列は、ヒトＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列と比較して、１つ又は２つ以上のアミノ酸又はアミノ酸残基が変異されている。
【0051】
本発明のある態様において、ＳＰＩＮＫ２変異体のアミノ酸配列は、ヒトＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列（配列番号１：図７）の：
１６番Ｓｅｒ～２２番Ｇｌｙのうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又は７つのアミノ酸が他のアミノ酸又はアミノ酸残基に置換されており；
２４番Ｐｒｏ～２８番Ａｓｎのうち１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸が他のアミノ酸又はアミノ酸残基に置換されており；
１５番Ｃｙｓ、２３番Ｃｙｓ、３１番Ｃｙｓ、４２番Ｃｙｓ、４５番Ｃｙｓ及び６３番Ｃｙｓは、天然型のジスルフィド結合を維持するためには野生型と同じくＣｙｓであることが好ましく、天然型のジスルフィド結合を消失させたり、非天然型のジスルフィド結合を生じさせたりするためには、それらのうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つを他のアミノ酸に置換してもよい。ＳＰＩＮＫ２変異体においては、天然型と同じ当該６箇所にＣｙｓが維持され、ジスルフィド結合が保持されている。かかるペプチドのうちより好適な一部の態様においては、１５番Ｃｙｓ－４５番Ｃｙｓ、２３番Ｃｙｓ－４２番Ｃｙｓ、及び、３１番Ｃｙｓ－６３番Ｃｙｓが、それぞれジスルフィド結合を形成しており、野生型ＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列に含まれる１６番Ｓｅｒ乃至３０番Ｖａｌからなるループ構造、３１番Ｃｙｓ及び３２番Ｇｌｙからなるβストランド（１）並びに５７番Ｉｌｅ乃至５９番Ａｒｇからなるβストランド（２）から構成されるβシート、４１番Ｇｌｕ乃至５１番Ｇｌｙからなるαへリックス、又は、それらに類似しているか若しくはそれら（の位置）に少なくとも部分的に対応するループ構造、βシート、αへリックス等から構成される立体構造が、標的分子に対する活性を発揮し得る程度に、維持されていることが好ましい。
１６番Ｓｅｒ～２２番Ｇｌｙのうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又は７つのアミノ酸が他のアミノ酸又はアミノ酸残基に置換されており；
２４番Ｐｒｏ～２８番Ａｓｎのうち１つ、２つ、３つ、４つ又は５つのアミノ酸が他のアミノ酸又はアミノ酸残基に置換されており；
１５番Ｃｙｓ、２３番Ｃｙｓ、３１番Ｃｙｓ、４２番Ｃｙｓ、４５番Ｃｙｓ及び６３番Ｃｙｓは、天然型のジスルフィド結合を維持するためには野生型と同じくＣｙｓであることが好ましく、天然型のジスルフィド結合を消失させたり、非天然型のジスルフィド結合を生じさせたりするためには、それらのうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つを他のアミノ酸に置換してもよい。ＳＰＩＮＫ２変異体においては、天然型と同じ当該６箇所にＣｙｓが維持され、ジスルフィド結合が保持されている。かかるペプチドのうちより好適な一部の態様においては、１５番Ｃｙｓ－４５番Ｃｙｓ、２３番Ｃｙｓ－４２番Ｃｙｓ、及び、３１番Ｃｙｓ－６３番Ｃｙｓが、それぞれジスルフィド結合を形成しており、野生型ＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列に含まれる１６番Ｓｅｒ乃至３０番Ｖａｌからなるループ構造、３１番Ｃｙｓ及び３２番Ｇｌｙからなるβストランド（１）並びに５７番Ｉｌｅ乃至５９番Ａｒｇからなるβストランド（２）から構成されるβシート、４１番Ｇｌｕ乃至５１番Ｇｌｙからなるαへリックス、又は、それらに類似しているか若しくはそれら（の位置）に少なくとも部分的に対応するループ構造、βシート、αへリックス等から構成される立体構造が、標的分子に対する活性を発揮し得る程度に、維持されていることが好ましい。
【0052】
３．ペプチドへの変更又は変異の導入
本発明のペプチド（又はコンジュゲート：後述）の有するアミノ酸配列において、１つ又は２つ以上（例えば、１乃至数個）のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入してなるペプチド（又はコンジュゲート）の変異体、及び、元のペプチド（又はコンジュゲート）の有するアミノ酸配列を８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％以上同一であるアミノ酸配列を有するペプチド（又はコンジュゲート）の変異体も、本発明のペプチド（又はコンジュゲート）の範囲に含まれ、好適なペプチド（又はコンジュゲート）変異体は、元のペプチド（又はコンジュゲート）が有する標的分子に対する活性の一部又は全部を保持している。
本発明のペプチド（又はコンジュゲート：後述）の有するアミノ酸配列において、１つ又は２つ以上（例えば、１乃至数個）のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入してなるペプチド（又はコンジュゲート）の変異体、及び、元のペプチド（又はコンジュゲート）の有するアミノ酸配列を８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％以上同一であるアミノ酸配列を有するペプチド（又はコンジュゲート）の変異体も、本発明のペプチド（又はコンジュゲート）の範囲に含まれ、好適なペプチド（又はコンジュゲート）変異体は、元のペプチド（又はコンジュゲート）が有する標的分子に対する活性の一部又は全部を保持している。
【0053】
本発明のペプチドのアミノ末端及び／又はカルボキシル末端において、１つ又は２つ以上（例えば、１乃至数個）のアミノ酸が置換、付加及び／又は欠失されてなり、且つ、元のペプチドの有する標的分子に対する活性の一部又は全部を保持しているペプチドも、本発明のペプチドの範囲に含まれる。
【0054】
本発明のＳＰＩＮＫ２変異体の有するアミノ酸配列においては、配列番号２（図８）のＸ１乃至Ｘ１２以外の部分、すなわち、野生型ヒトＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列（配列番号１：図７）中の、２番Ｐｒｏ～１５番Ｃｙｓ、２３番Ｃｙｓ及び２９番Ｐｒｏ～６３番Ｃｙｓの位置において、天然型のアミノ酸若しくは変異したアミノ酸又はアミノ酸配列を含むことができる。例えば、ＳＰＩＮＫ２変異体は、標的分子に対する活性又はフォールディングを少なくとも部分的に妨げないか又は干渉をしない限りにおいて、１つ又は２つ以上（例えば、１乃至数個）の位置において変異してよい。そのような変異は、当業者に公知の標準的な方法を使用することによりなし得る。アミノ酸配列中の典型的な変異としては、１つ又は２つ以上（例えば、１乃至数個）のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を挙げることができ、置換としては、保存的置換を例示することができる。保存的置換により、あるアミノ酸残基は、嵩高さのみならず、極性の面についても化学的特徴が類似しているアミノ酸残基により置換される。保存的置換の例は、本明細書の他の部分に記載されている。一方で、Ｘ１乃至Ｘ１２以外の部分は、標的分子に対する活性又はフォールディングを少なくとも部分的に妨げないか又は干渉をしない限りにおいて、１つ又は２つ以上（例えば、１乃至数個）のアミノ酸の非保存的置換も許容し得る。
【0055】
従って、本発明の血中動態改善方法が適用され得るペプチド又はコンジュゲート（後述）中に含まれるペプチドが有するアミノ酸配列は：（ａ１）配列番号２（図８）からなるアミノ酸配列からなるアミノ酸配列；（ａ２）配列番号２（図８）からなるアミノ酸配列において１乃至２０、１乃至１５、１乃至１０、１乃至８、１乃至６、１乃至５、１乃至４、１乃至３、１若しくは２、又は１個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入してなり且つ（ａ１）記載のアミノ酸配列を含むペプチドの有する標的分子に対する活性の一部又は全部を保持したペプチドに含まれるアミノ酸配列；（ａ３）配列番号２（図８）からなるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし且つ（ａ１）記載のアミノ酸配列を含むペプチドの有する標的分子に対する活性の一部又は全部を保持したペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列：及び、（ａ４）配列番号２（図８）からなるアミノ酸配列と６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上同一であり且つ（ａ１）記載のアミノ酸配列を含むペプチドの有する標的分子に対する活性の一部又は全部を保持したペプチドに含まれるアミノ酸配列：のいずれでもよく、それらに限定されるものではない。
【0056】
ペプチドに、そのフォールディング安定性、熱安定性、保存安定性、水溶性、生物活性、薬理活性、副次的作用等を改善する目的で、変異を導入することができる。例えば、ポリエチレングルコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ビオチン等にコンジュゲートさせるため、Ｃｙｓのような新たな反応性基を変異により導入することができる。
【0057】
４．ペプチドを含有するコンジュゲート
本発明において、ペプチドには、他の部分が融合、連結又は付加等していてもよく、そのような融合、連結又は付加等したフォームを「ペプチドのコンジュゲート」と呼ぶ。本発明において「コンジュゲート」とは、ペプチド又はその断片に他の部分が結合してなる分子を意味する。「コンジュゲート」又は「コンジュゲーション」には、ある部分が架橋剤等の化学物質を介して、ある部分をアミノ酸の側鎖に連結するのに適した作用物質等を介して、ペプチドのＮ末及び／又はＣ末に合成化学的手法や遺伝子工学的手法等により、ペプチドに連結又は結合される形態が含まれる。そのような「部分」には、血中半減期を改善するものとして、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のポリアルキレングリコール分子、ヒドロキシエチルデンプン、パルミチン酸等の脂肪酸分子、免疫グロブリンのＦｃ領域、免疫グロブリンのＣＨ３ドメイン、免疫グロブリンのＣＨ４ドメイン、アルブミン又はその断片、アルブミン結合ペプチド、連鎖球菌プロテインＧ等のアルブミン結合蛋白質、トランスフェリンを、例示することができる。その他の「部分」としては、かかる「部分」はペプチドリンカー等のリンカーを介して本発明のペプチドが連結され得る。
本発明において、ペプチドには、他の部分が融合、連結又は付加等していてもよく、そのような融合、連結又は付加等したフォームを「ペプチドのコンジュゲート」と呼ぶ。本発明において「コンジュゲート」とは、ペプチド又はその断片に他の部分が結合してなる分子を意味する。「コンジュゲート」又は「コンジュゲーション」には、ある部分が架橋剤等の化学物質を介して、ある部分をアミノ酸の側鎖に連結するのに適した作用物質等を介して、ペプチドのＮ末及び／又はＣ末に合成化学的手法や遺伝子工学的手法等により、ペプチドに連結又は結合される形態が含まれる。そのような「部分」には、血中半減期を改善するものとして、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のポリアルキレングリコール分子、ヒドロキシエチルデンプン、パルミチン酸等の脂肪酸分子、免疫グロブリンのＦｃ領域、免疫グロブリンのＣＨ３ドメイン、免疫グロブリンのＣＨ４ドメイン、アルブミン又はその断片、アルブミン結合ペプチド、連鎖球菌プロテインＧ等のアルブミン結合蛋白質、トランスフェリンを、例示することができる。その他の「部分」としては、かかる「部分」はペプチドリンカー等のリンカーを介して本発明のペプチドが連結され得る。
【0058】
本発明のある態様において、コンジュゲートは、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドと、抗体のＦｃ領域又はその断片との融合体である。抗体の起源は、ヒト、及び、非ヒト動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ等のげっ歯類、ウシ、ブタ、イヌ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザル等その他の哺乳類、ニワトリ等の鳥類を上げることができ、好適にはヒトである。抗体としては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ及びＩｇＥを例示することができ、好適にはＩｇＧ１である。より好適には、コンジュゲートは、本発明のペプチドと、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域又はその断片との融合体である。本発明のペプチドと抗体のＦｃ領域又はその断片の融合体を「Ｆｃ融合体」又は「Ｆｃコンジュゲート」と記載することがあるが、いずれも同義である。
【0059】
ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域としては、例えば、配列番号３４（図４０）で示されるアミノ酸配列を含むか該配列からなるもの又はその断片を挙げることができるが、それらに限定されない。抗体のＦｃ領域又はその断片は、野生型、変異型のいずれであってもよい。
【0060】
抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基の一部を置換することによって、エフェクター機能を調整することが可能である（ＷＯ８８／００７０８９、Ｗ０９４／２８０２７、Ｗ０９４／２９３５１参照）。エフェクター機能を減弱させたＩｇＧ１の変異体としては、ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ（ＩｇＧ１－Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）、ＩｇＧ１ ＬＡＧＡ（ＩｇＧ１－Ｌ２３５Ａ，Ｇ２３７Ａ）等が挙げられる。ヒトＩｇＧ２は、５種存在するヒトＩｇＧサブクラスのなかで、補体結合を介したＣＤＣ活性、抗体依存的な細胞障害活性といったエフェクター機能が非常に弱い（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１３５１－１３６１，１９８７）。ヒトＩｇＧ４は、５種存在するヒトＩｇＧサブクラスのなかで、補体結合を介したＣＤＣ活性、抗体依存的な細胞障害活性といったエフェクター機能が非常に弱い（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１３５１－１３６１，１９８７）。ＩｇＧ４を用いる場合は、定常領域のアミノ酸残基の一部を置換することによって、ＩｇＧ４特有の分割が抑制され、半減期を延長することが可能である（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３０，１０５－１０８，１９９３）。ＩｇＧ４の変異体としては、ＩｇＧ４Ｐ（ＩｇＧ４－Ｓ２４１Ｐ）又はＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡ（ＩｇＧ４－Ｓ２４１Ｐ，Ｆ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ）等が挙げられる。ヒトＩｇＧ４Ｐとは、Ｈ鎖同士の結合によるＨ２Ｌ２テトラマー形成に関与するヒトＩｇＧ４の２４１番目セリン残基をヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２と同様の配列になる様、プロリンに置換することで、Ｈ２Ｌ２テトラマー形成を抑制し、血中の安定性が高まった変異体を示している（Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３０，１０５－１０８，１９９３）。ＩｇＧ４Ｐ ＦＡＬＡは、ＣＨ２ドメインに存在するＦｃγＲＩＩＩとの相互作用に必要なアミノ酸残基２つをアラニンに置換することで、更にエフェクター機能を減弱させている（Ｐａｒｅｋｈ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ，３１０－３１８，２０１２）。それらの、人工的に改変されたＦｃ領域のみならず、天然に見出されるＦｃ領域配列の多型も、「変異型」の範囲に含まれる。
【0061】
コンジュゲートは、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチド以外のペプチドと、抗体のＦｃ領域又はその断片との融合体であってもよく、ヒト腫瘍壊死因子II型受容体（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＮＦＲ）の細胞外ドメイン蛋白質とＦｃとのコンジュゲート（エタネルセプト）やヒト細胞傷害性Ｔリンパ球抗原－４（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎ ４：ＣＴＬＡ４）の細胞外ドメイン蛋白質とＦｃとのコンジュゲート（アバタセプト）、ヒト血管内皮増殖因子受容体（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＶＥＧＦＲ）の細胞外ドメイン蛋白質とＦｃとのコンジュゲート（アフリベルセプト）、ヒト血液凝固第VIII因子とＦｃとのコンジュゲート（エフラロクトコグ アルファ）、ヒト血液凝固第IX因子とＦｃとのコンジュゲート（エフトレノナコグ アルファ）、ヒトトロンボポエチン受容体結合ペプチドとＦｃとのコンジュゲート（ロミプロスチム）、ヒトグルカゴン様ペプチド－１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ－Ｌｉｋｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ：ＧＬＰ－１）アナログとＦｃとのコンジュゲート（デュラグルチド）などが挙げられるが、それらに限定されない。
【0062】
ある態様において、コンジュゲートに含まれるペプチドには、Ａｔｒｉａｌ Ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ（ＡＮＰ）、Ｌｅｐｔｉｎ、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２（ＩＬ－２）、ＩＬ－２２、Ｓｅｃｒｅｔｉｎ、Ｂｅｔａ－ｅｎｄｏｒｐｈｉｎ、ＧＬＰ－１、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ－２（ＦＧＦ－２）等が挙げられるが、それらに限定されない。
【0063】
ある態様において、コンジュゲートに含まれるペプチドは抗体の抗原結合断片であってもよい。本発明において「抗体の抗原結合断片」とは、抗原を認識する機能を保持した抗体の部分断片を意味し、「抗体の機能性断片」と同義である。抗体の抗原結合断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、一本鎖免疫グロブリン等を挙げることができるが、それらに限定されない。かかる抗体の機能性断片は、抗体の全長分子をパパイン、ペプシン等の酵素で処理することによって得られたものに加え、組換え遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生された組換え蛋白質であってもよい。
【0064】
ＳＰＩＮＫ２変異体等のペプチドのＦｃコンジュゲートにおいては、該ペプチドがＦｃ領域又はその断片のアミノ末端側に位置しても、Ｆｃ領域が該ペプチドのアミノ末端側に位置しても、いずれでもよいが、好適には前者である。また、該ペプチドとＦｃ領域又はその断片が、直接融合していても、リンカー等を介して間接的に融合していても、いずれでもよい。リンカーは、ペプチド及び／又は非ペプチドである。また、ＳＰＩＮＫ２変異体等のペプチドのＦｃコンジュゲートは、該ペプチド、Ｆｃ領域又はその断片、及び任意で両者の間の介在部分（リンカー等）に加え、他のペプチド又は非ペプチドを含んでよい。
【0065】
ペプチドには、薬理活性を発揮するか又は増強するために、他の薬物がコンジュゲーションされていてもよい。抗体分野において抗体－薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ：ＡＤＣ）として当業者に公知の技術や態様は、抗体を本発明のペプチドに置き換えることにより、本発明の一部の態様となり得る。
【0066】
さらに、ペプチドは、他の標的分子に対する活性を発揮する１つ又は２つ以上の部分をさらに含むか、そのような部分にコンジュゲートされていてもよい。かかる「部分」としては、抗体又はその断片、ＳＰＩＮＫ２変異体のような抗体以外の骨格を有する蛋白質又はその断片を例示することができる。抗体分野において多重特異的抗体及び二重特異的抗体（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）として当業者に公知の技術や態様は、それらに含まれる２つ以上の「抗体」のうち少なくとも１つを本発明のペプチドに置き換えることにより、本発明のコンジュゲートの一部の態様となる。
【0067】
また、ペプチド又はその前駆体は、シグナル配列を含み得る。あるペプチド若しくはその前駆体のＮ末に存在するか又は付加されたシグナル配列は、当該ペプチドを細胞の特定の区画、例えば、大腸菌であれば周辺質、真核細胞であれば小胞体に送達するために有用であり、多くのシグナル配列が当業者に公知であり、宿主細胞に応じて選択され得る。大腸菌の周辺質中に所望のペプチドを分泌させるためのシグナル配列としては、ＯｍｐＡを例示することができる、シグナル配列を含む形態も、本発明のコンジュゲートの範囲に含まれる。
【0068】
さらに、ペプチドに予めタグを付加させることにより、アフィニティー・クロマトグラフィーによって該ペプチドを精製することができることができる。例えば、そのＣ末に、ビオチン、Ｓｔｒｅｐタグ（登録商標）、ＳｔｒｅｐタグＩＩ（登録商標）、Ｈｉｓ６等のオリゴヒスチジン、ポリヒスチジン、免疫グロブリンドメイン、マルトース結合蛋白質、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、ジゴキシゲニンやジニトロフェノール等のハプテン、ＦＬＡＧ（登録商標）等のエピトープタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ等（以下まとめて「アフィニティー・タグ」と呼ぶ。）を含むことができる。タグ付加体も、本発明のコンジュゲートに、その一部の態様として含まれ得る。本発明のコンジュゲートは、全体としてペプチド（ポリペプチド）であってもよい。
【0069】
また、ペプチドは、標識のための部分を含むことができ、具体的には、酵素標識、放射性標識、着色標識、蛍光標識、発色標識、発光標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、金属複合体、金属、コロイド金等の標識部分がコンジュゲートされ得る。標識のための部分を含む態様も、本発明のコンジュゲートの範囲に含まれる。
【0070】
さらに、ペプチド（のアミノ酸配列）には、天然アミノ酸及び非天然アミノ酸のいずれをも含むことができ、天然アミノ酸としてはＬ－アミノ酸及びＤ－アミノ酸のいずれをも含むことができる。
【0071】
また、ペプチドは、単量体、２量体、３量体以上のオリゴマー又は多量体として存在し得る。２量体、３量体以上のオリゴマー及び多量体は、単一の単量体から構成されるホモ、及び、２つ以上の異なる単量体から構成されるヘテロ、のいずれでもよい。単量体は、例えば、速やかに拡散し組織への浸透に優れている場合がある。２量体、オリゴマー及び多量体は、例えば、局所において標的分子に対する活性において優れる、遅い解離速度を有する等、有利な面を有し得る。自発的な２量体化、オリゴマー化及び多量体化に加え、意図した２量体化、オリゴマー化及び多量体化も、ｊｕｎ－ｆｏｓドメイン、ロイシンジッパー等を本発明のペプチドに導入することにより、なし得る。
【0072】
さらに、ペプチドは、単量体、２量体、３量体以上のオリゴマー又は多量体で、１つ又は２つ以上の標的分子に対する活性を発揮することができる。
【0073】
また、ペプチドがとり得る形態としては、単離された形態（凍結乾燥標品、溶液等）、上述のコンジュゲート体、他の分子に結合した形態（固相化された形態、異分子との会合体、標的分子と結合した形態等）等を挙げることができるが、それらに限定されるものではなく、発現、精製、使用、保存等に適合した形態を任意に選択することができる。
【0074】
血中動態が改善された、本発明のコンジュゲートに含まれるＳＰＩＮＫ２変異体が有するアミノ酸配列としては、前述の（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）、（ａ４）等を挙げることができる。また、血中動態が改善された、本発明のＳＰＩＮＫ２変異体Ｆｃコンジュゲートのアミノ酸配列うち、アミノ末端に付加された１つ又は２つ以上、好適には１乃至数個のアミノ酸を除いたアミノ酸配列としては、ＳＰＩＮＫ２変異体のアミノ酸配列として前述の（ａ１）、（ａ２）、（ａ３）又は（ａ４）、及び、抗体のＦｃ領域のアミノ酸配列として前述の各種ＩｇのＦｃ領域又はその断片のアミノ酸配列を含んでいれば、特に限定されるものではないが、例えば、次のようなアミノ酸配列を例示することができる：（ｂ１）配列番号２（図８）からなるアミノ酸配列及びヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のアミノ酸配列（例えば、配列番号３４、図４０）を含んでなるアミノ酸配列；（ｂ２）前記（ｂ１）記載のアミノ酸配列において１乃至２０、１乃至１５、１乃至１０、１乃至８、１乃至６、１乃至５、１乃至４、１乃至３、１若しくは２、又は１個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入してなり且つ（ｂ１）記載のアミノ酸配列を含むコンジュゲートの有する標的分子に対する活性の一部又は全部を保持したペプチド又はコンジュゲートに含まれるアミノ酸配列；（ｂ３）前記（ｂ１）記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし且つ（ｂ１）記載のアミノ酸配列を含むコンジュゲートの有する標的分子に対する活性の一部又は全部を保持したペプチド又はコンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列；及び、（ｂ４）前記（ｂ１）記載のアミノ酸配列と６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上同一であり且つ（ｂ１）記載のアミノ酸配列を含むコンジュゲートの有する標的分子に対する活性の一部又は全部を保持したペプチド又はコンジュゲートに含まれるアミノ酸配列：を挙げることができる。
【0075】
５．ペプチド又はコンジュゲートの血中動態改善
本発明は、ペプチド又はペプチド含有コンジュゲートの血中動態改善方法を提供する。本発明のペプチド（コンジュゲートに含まれるものを含み、好適には疾患関連標的分子に対する活性を有する。）の有するアミノ酸配列の１番アミノ酸（アミノ末端のアミノ酸に同じ。）のさらにアミノ末端側に、１つ又は２つ以上、好適には１乃至数個のアミノ酸（天然アミノ酸以外のアミノ酸であってもよい。）が付加していてもよい。そのようなアミノ酸の付加としては、好適には酸性アミノ酸、より好適にはＡｓｐ及び／又はＧｌｕが１乃至数個付加したもの（ＡｓｐとＧｌｕの両方を含んでいてもよい）、より一層好適にはＡｓｐが１乃至数個付加したもの又はＧｌｕが１乃至数個付加したものを挙げることができる。付加されるＡｓｐ及び／又はＧｌｕ等のアミノ酸の個数は、好適には１乃至５個、又は１乃至４個、より好適には１乃至３個、より一層好適には２又は３個、最適には３個である。
本発明は、ペプチド又はペプチド含有コンジュゲートの血中動態改善方法を提供する。本発明のペプチド（コンジュゲートに含まれるものを含み、好適には疾患関連標的分子に対する活性を有する。）の有するアミノ酸配列の１番アミノ酸（アミノ末端のアミノ酸に同じ。）のさらにアミノ末端側に、１つ又は２つ以上、好適には１乃至数個のアミノ酸（天然アミノ酸以外のアミノ酸であってもよい。）が付加していてもよい。そのようなアミノ酸の付加としては、好適には酸性アミノ酸、より好適にはＡｓｐ及び／又はＧｌｕが１乃至数個付加したもの（ＡｓｐとＧｌｕの両方を含んでいてもよい）、より一層好適にはＡｓｐが１乃至数個付加したもの又はＧｌｕが１乃至数個付加したものを挙げることができる。付加されるＡｓｐ及び／又はＧｌｕ等のアミノ酸の個数は、好適には１乃至５個、又は１乃至４個、より好適には１乃至３個、より一層好適には２又は３個、最適には３個である。
【0076】
かかるアミノ末端へのアミノ酸付加により、ペプチド又はコンジュゲートの血中動態は改善され得る。血中動態の改善は、個体に投与されたペプチド又はコンジュゲートが時間的経過に伴い、血液循環においてとる動態（吸収や分布など）と消失（代謝や排泄など）が改善されたことを示す指標の改善であれば特に限定されないが、好適には、血中薬物濃度の経時的減少の抑制（「ＰＫの延長」ともいう。）、血中曝露量（ＡＵＣ）の増大、薬物消失半減期（ｔ１／２）の延長、薬物最高血中濃度（Ｃｍａｘ）の上昇、及び／又は、最高血中濃度に達するまでの時間（ｔｍａｘ）の短縮により判定することができ、より好適には血中薬物濃度の経時的減少の抑制（ＰＫの延長）又は血中曝露量（ＡＵＣ）の増加である。ＳＰＩＮＫ２変異体等のペプチドに抗体のＦｃ領域又はその断片が融合してなるコンジュゲート（好適には、該ペプチドのカルボキシル末端側にＦｃ領域が位置する。）のアミノ末端に、１つ又は２つ以上、１乃至数個、１乃至５個、又は１乃至４個、より好適には１乃至３個、より一層好適には２又は３個、最適には３個のアミノ酸が付加していてもよく、好適なアミノ酸としてはＡｓｐ及び／又はＧｌｕ、より好適にはＡｓｐ又はＧｌｕであり、より一層好適にはＡｓｐ又はＧｌｕ３個であり、最適にはＡｓｐ３個である。そのようなアミノ酸が付加した形態は、本発明のコンジュゲートの範囲に含まれる。
【0077】
１つ又は２つ以上、好適には１乃至数個のアミノ酸、好適にはＡｓｐ及び／又はＧｌｕがペプチド又はコンジュゲート（好適にはＦｃ融合体）のアミノ末端に付加していれば、局所的に負電荷が帯電するものの、ペプチド又はコンジュゲートの等電点（ｐＩ）には大きな影響は与えることなく、投与後初期におけるペプチド又はコンジュゲートの血中濃度低下を抑制し、元のペプチド又はコンジュゲートと比較して血中濃度をより長時間、高濃度に保つことができる。負電荷アミノ酸の付加が、ペプチド又はコンジュゲートのｐＩに大きな影響を与えないことにより、血中動態に限らず、生物学的又は薬理学的活性や物理化学的性質等への影響を最小化することができる。
【0078】
本発明は、血中動態が改善されたペプチド及びコンジュゲートをも提供する。Ａｓｐが１個付加しているコンジュゲートの例（Ｄ１－Ｋ５１０２８－Ｆｃ、配列番号７、図１３：Ｄ１－Ｋ５００５５－Ｆｃ、配列番号１４、図２０：Ｄ１－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ２）、配列番号４４、図５０：Ｄ１－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ４Ｐ）、配列番号４７、図５３）、Ａｓｐが２個付加しているコンジュゲートの例（Ｄ２－Ｋ５１０２８－Ｆｃ、配列番号８、図１４）、Ａｓｐが３個付加しているコンジュゲートの例（Ｄ３－Ｋ５１０２８－Ｆｃ、配列番号９、図１５：Ｄ３－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ２）、配列番号４５、図５１：Ｄ３－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ４Ｐ）、配列番号４８、図５４）、Ａｓｐが４個付加しているコンジュゲートの例（Ｄ４－Ｋ５１０２８－Ｆｃ、配列番号１０、図１６）、Ａｓｐが５個付加しているコンジュゲートの例（Ｄ５－Ｋ５１０２８－Ｆｃ、配列番号１１、図１７）、Ｇｌｕが１個付加しているコンジュゲートの例（Ｅ１－Ｋ５１０２８－Ｆｃ、配列番号１３、図１９）を、それぞれ挙げることができるが、血中動態が改善されたコンジュゲートはそれらに限定されるものではなく、任意の標的分子に対する活性を有するペプチド（好適には該ペプチドのＦｃ融合体）に、上記の血中動態改善方法を適用することにより、所望の薬理活性を有するペプチドの血中動態を改善することができ、血中動態が改善されたペプチド又はコンジュゲートを得ることができる。
【0079】
６．ペプチド又はコンジュゲートの調製
本発明は、ペプチド又は該ペプチドを含むコンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド（以下、「コード遺伝子」という。）、コード遺伝子が挿入された組換えベクター、該遺伝子若しくはベクターが導入された細胞（以下、「コード遺伝子含有細胞」）、ペプチド又はコンジュゲートを産生する細胞（以下単に「産生細胞」）、コード遺伝子含有細胞又は産生細胞を培養する工程を含む、ペプチド又はコンジュゲートの製造方法をも提供する。
本発明は、ペプチド又は該ペプチドを含むコンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド（以下、「コード遺伝子」という。）、コード遺伝子が挿入された組換えベクター、該遺伝子若しくはベクターが導入された細胞（以下、「コード遺伝子含有細胞」）、ペプチド又はコンジュゲートを産生する細胞（以下単に「産生細胞」）、コード遺伝子含有細胞又は産生細胞を培養する工程を含む、ペプチド又はコンジュゲートの製造方法をも提供する。
【0080】
アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を設計するには、各アミノ酸に対応するコドンを１種又は２種以上使用することができる。そのため、あるペプチドが有する単一のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、複数のバリエーションを有し得る。かかるコドンの選択に際しては、該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド又はそれを含むベクターが導入される、発現用の宿主細胞のコドン使用（ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）に応じて適宜コドンを選択したり、複数のコドンの使用の頻度若しくは割合を適宜調節したりすることができる。例えば、大腸菌を宿主細胞として用いる場合は、大腸菌において使用頻度が高いコドンを使用してヌクレオチド配列を設計してもよい。
【0081】
コード遺伝子は、１つ又は２つ以上の調節配列に機能的に連結されていてもよい。「機能的に連結される」とは、連結されたコード遺伝子を発現させることができる、又は、コード遺伝子に含まれるヌクレオチド配列の発現を可能にする、ことを意味する。調節配列は、転写調節及び／又は翻訳調節に関する情報を含む配列エレメントを含む。調節配列は、種により様々であるが、一般に、プロモーターを含み、原核生物の－３５／－１０ボックス及びシャイン・ダルガノ配列、真核生物のＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴ配列、及び５’キャッピング配列等で例示される、転写及び翻訳の開始に関与する５’非コード配列を含む。かかる配列は、エンハンサーエレメント及び／又はリプレッサーエレメント、並びに宿主細胞内外の特定の区画へと天然型又は成熟型のペプチドを送達するための、翻訳され得るシグナル配列、リーダー配列等を含んでもよい。さらに、調節配列は３’非コード配列を含んでよく、かかる配列には、転写終結又はポリアデニル化等に関与するエレメントを含み得る。ただし、転写終結に関する配列が、特定の宿主細胞において充分に機能しない場合は、当該細胞に適した配列で置換され得る。
【0082】
プロモーター配列としては、原核生物ではｔｅｔプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、Ｔ７プロモーター等を、真核細胞ではＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター等を例示することができる。
【0083】
コード遺伝子は、単離された形態、ベクター若しくは他のクローニングビヒクル（以下、単に「ベクター」という：プラスミド、ファージミド、ファージ、バキュロウイルス、コスミド等。）中又は染色体中に含まれる形態であってよいが、それらの形態に限定されない。ベクターは、上記調節配列に加え、発現に使用される宿主細胞に適した複製配列及び制御配列、並びに形質転換等により核酸分子が導入された細胞を選択可能な表現型を与える選択マーカーを含んでいてもよい。
【0084】
コード遺伝子、又はコード遺伝子を含むベクターは、当該遺伝子又はその翻訳産物であるペプチドを発現可能な宿主細胞に形質転換等の当業者に公知の方法により導入することができる。コード遺伝子又は該ベクターを導入された宿主細胞は、当該遺伝子又はペプチドの発現に適した条件下で培養され得る。宿主細胞は、原核及び真核のいずれでもよく、原核では大腸菌、枯草菌等、真核ではサッカロミセス・セレヴィシエ、ピキア・パストリス等の酵母、ＳＦ９、Ｈｉｇｈ５等の昆虫細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳ０等の動物細胞を例示することができる。真核細胞等を宿主細胞として用いることにより、発現した本発明のペプチドに所望の翻訳後修飾を施すことができる。翻訳後修飾としては、糖鎖等の官能基付加、ペプチド又は蛋白質の付加、アミノ酸の化学的性質の変換等を例示することができる。また、本発明のペプチドへの所望の修飾を人工的に施すことも可能である。そのようなペプチドの修飾体も、本発明のペプチド又はコンジュゲートの範囲に包含される。
【0085】
本発明はペプチド又はコンジュゲートの製造方法をも提供する。当該方法には、コード遺伝子含有細胞若しくは産生細胞を培養する工程１、及び／又は、工程１で得られた培養物からペプチド又はコンジュゲートを回収する工程２が含まれる。工程２には、当業者に公知の分画、クロマトグラフィー、精製等の操作を適用することができ、例えば、後述する本発明の抗体を利用したアフィニティー・クロマトグラフィーによる精製が適用可能である。
【0086】
本発明のペプチド又はコンジュゲートは、メリフィールド他のペプチド固相合成法、並びに、ｔ－ブトキシカルボニル（ｔ－Ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ：Ｂｏｃ）や９－フルオレニルメトキシカルボニル（９－Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ：Ｆｍｏｃ）等を利用した有機合成化学的ペプチド合成法により例示される化学合成、イン・ビトロ翻訳等の、他の当業者に公知の方法によっても製造することができる。
【0087】
７．医薬組成物
本発明はペプチド又はコンジュゲートを含む医薬組成物をも提供する。
本発明はペプチド又はコンジュゲートを含む医薬組成物をも提供する。
【0088】
本発明の医薬組成物は、疾患関連標的分子により惹起されるか又は増悪化され、該標的分子の発現又は機能を阻害又は抑制することにより、かかる惹起又は増悪化の抑制、治癒、症状の維持若しくは改善、二次性疾患の回避等し得る各種疾患の治療及び／又は予防に有用である。医薬組成物は、好適には、疾患関連標的分子に対する活性を有する元のペプチド又はコンジュゲートの血中動態が改善されたペプチド又はコンジュゲートを含む。
【0089】
本発明の医薬組成物には、治療又は予防に有効な量の疾患関連標的分子に対する活性を有するペプチド又はコンジュゲートと薬学上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤及び／又は補助剤を含有せしめることができる。
【0090】
「治療又は予防に有効な量」とは、特定の疾患、投与形態及び投与経路につき治療又は予防効果を奏する量を意味し、「薬理学的に有効な量」と同義である。
【0091】
本発明の医薬組成物には、ｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、無菌性、該組成物又はそれに含まれるペプチド、コンジュゲート等の安定性、溶解性、徐放性、吸収性、浸透性、剤型、強度、性状、形状等を変化させたり、維持したり、保持したりするための物質（以下、「製剤用の物質」という。）を含有せしめることができる。製剤用の物質としては、薬理学的に許容される物質であれば特に限定されるものではない。例えば、非毒性又は低毒性であることは、製剤用の物質が好適に具備する性質である。
【0092】
製剤用の物質として、例えば、以下のものを挙げることができるが、これらに限定されるものではない；グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸類、抗菌剤、アスコルビン酸、硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤、リン酸、クエン酸、ホウ酸バッファー、炭酸水素ナトリウム、トリス－塩酸（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）溶液等の緩衝剤、マンニトールやグリシン等の充填剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤、カフェイン、ポリビニルピロリジン、β－シクロデキストリンやヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン等の錯化剤、グルコース、マンノース又はデキストリン等の増量剤、単糖類、二糖類やグルコース、マンノースやデキストリン等の他の炭水化物、着色剤、香味剤、希釈剤、乳化剤やポリビニルピロリジン等の親水ポリマー、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン、塩化ベンズアルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロレキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素等の防腐剤、グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の溶媒、マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール、懸濁剤、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０やポリソルベート８０等のポリソルベート、トリトン（ｔｒｉｔｏｎ）、トロメタミン（ｔｒｏｍｅｔｈａｍｉｎｅ）、レシチン又はコレステロール等の界面活性剤、スクロースやソルビトール等の安定化増強剤、塩化ナトリウム、塩化カリウム、マンニトールやソルビトール等の弾性増強剤、輸送剤、希釈剤、賦形剤、及び／又は薬学上の補助剤。ペプチド又はコンジュゲートをリポソーム中に含有せしめたもの、該ペプチド又はコンジュゲートとリポソームとが結合してなる修飾体を含有する医薬組成物も、本発明に含まれる。
【0093】
賦形剤や担体は、通常液体又は固体であり、注射用の水、生理食塩水、人工脳脊髄液、その他の、経口投与又は非経口投与用の製剤に用いられる物質であれば特に限定されない。生理食塩水としては、中性のもの、血清アルブミンを含むもの等を挙げることができる。
【0094】
緩衝剤としては、医薬組成物の最終ｐＨが７．０乃至８．５になるように調製されたＴｒｉｓバッファー、同じく４．０乃至５．５になるように調製された酢酸バッファー、同じく５．０乃至８．０になるように調製されたクエン酸バッファー、同じく５．０乃至８．０になるように調製されたヒスチジンバッファー等を例示することができる。
【0095】
本発明の医薬組成物は、固体、液体、懸濁液等である。本発明の別の医薬組成物の例として、凍結乾燥製剤を挙げることができる。凍結乾燥製剤を成型するには、スクロース等の賦形剤を用いることができる。
【0096】
本発明の医薬組成物の投与経路としては、点眼、経腸投与、局所投与及び非経口投与のいずれでもよく、例えば、結膜上への点眼、硝子体内投与、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、経皮投与、骨内投与、関節内投与等を挙げることができる。
【0097】
かかる医薬組成物の組成は、投与方法、標的に対する活性、結合親和性等に応じて決定することができる。標的に対する活性が強いほど、少ない投与量でその薬効を発揮し得る。
【0098】
本発明のペプチド又はコンジュゲートの投与量は、薬理学的に有効な量であれば限定されず、個体の種、疾患の種類、症状、性別、年齢、持病、該ペプチドの標的に対する阻害活性、結合親和性、その他の要素に応じて適宜決定することができるが、通常、０．０１乃至１０００ｍｇ／ｋｇ、好適には０．１乃至１００ｍｇ／ｋｇを、１乃至１８０日間に１回、又は１日２回若しくは３回以上投与することができる。
【0099】
医薬組成物の形態としては、注射剤（凍結乾燥製剤、点滴剤を含む。）、坐剤、経鼻型吸収製剤、経皮型吸収製剤、舌下剤、カプセル、錠剤、軟膏剤、顆粒剤、エアーゾル剤、丸剤、散剤、懸濁剤、乳剤、点眼剤、生体埋め込み型製剤等を例示することができる。
【0100】
ペプチド、コンジュゲート、それらを含む医薬組成物は、他の医薬と同時に又は別個に投与することができる。例えば、他の医薬を投与した後にペプチド又はコンジュゲートを有効成分として含む医薬組成物を投与するか、かかる医薬組成物を投与した後に、他の医薬を投与するか、又は、当該医薬組成物と他の医薬とを同時に投与してもよい。同時に投与する場合、ペプチド又はコンジュゲートと他の医薬とは、単一の製剤、及び、別々の製剤（複数の製剤）、のいずれに含有されてもよい。
【0101】
それらの他の医薬は、１つの場合もあり、２つ、３つあるいはそれ以上を投与するか又は受けることもできる。それらをまとめて本発明の医薬組成物と「他の医薬との併用」又は「他の医薬との組み合わせ」と呼び、本発明のペプチド又はそのコンジュゲートに加えて他の医薬を含むか又は他の療法と組み合わせて使用される本発明の医薬組成物も「他の医薬との併用」又は「他の医薬との組み合わせ」の態様として本発明に含まれる。
【実施例】
【0102】
以下の実施例において、本発明の一部の態様についてさらに詳述するが、本発明はそれらに限定されない。
【0103】
なお、下記実施例において遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓより１９８２年発刊又は１９８９年発刊）に記載の方法及びその他の当業者が使用する実験書に記載の方法により行うか、又は、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って行った。
【0104】
実施例１．ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ融合体の調製
（１－１）ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ融合体発現ベクターの構築
各阻害ＳＰＩＮＫ２の配列（配列表）を鋳型として、下記プライマー及びＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたＰＣＲ法（（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ ２０秒）×３０サイクル）により阻害剤断片（Ｄ０～Ｄ５、Ｅ１）を増幅した。
阻害剤断片（Ｄ０）用プライマー
プライマー１：５’－ＡＧＡＴＧＧＧＴＧＴＴＧＴＣＴＧＧＣＣＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＣＣＴＧＴＴＣ－３’（配列番号１５：図２１）
プライマー２：５’－ＧＣＡＧＧＧＧＣＣＡＴＴＣＣＧＧＡＴ－３’（配列番号１６：図２２）
阻害剤断片（Ｄ１）用プライマー
プライマー３：５’－ＡＧＡＴＧＧＧＴＧＴＴＧＴＣＴＧＡＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＣＣＴＧＴＴＣ－３’（配列番号１７：図２３）
プライマー２（配列番号１６：図２２）
阻害剤断片（Ｅ１）用プライマー
プライマー４：５’－ＡＧＡＴＧＧＧＴＧＴＴＧＴＣＴＧＡＡＧＧＣＣＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＣＣＴＧＴＴＣ－３’（配列番号１８：図２４）
プライマー２（配列番号１６：図２２）
（１－１）ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ融合体発現ベクターの構築
各阻害ＳＰＩＮＫ２の配列（配列表）を鋳型として、下記プライマー及びＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたＰＣＲ法（（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ ２０秒）×３０サイクル）により阻害剤断片（Ｄ０～Ｄ５、Ｅ１）を増幅した。
阻害剤断片（Ｄ０）用プライマー
プライマー１：５’－ＡＧＡＴＧＧＧＴＧＴＴＧＴＣＴＧＧＣＣＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＣＣＴＧＴＴＣ－３’（配列番号１５：図２１）
プライマー２：５’－ＧＣＡＧＧＧＧＣＣＡＴＴＣＣＧＧＡＴ－３’（配列番号１６：図２２）
阻害剤断片（Ｄ１）用プライマー
プライマー３：５’－ＡＧＡＴＧＧＧＴＧＴＴＧＴＣＴＧＡＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＣＣＴＧＴＴＣ－３’（配列番号１７：図２３）
プライマー２（配列番号１６：図２２）
阻害剤断片（Ｅ１）用プライマー
プライマー４：５’－ＡＧＡＴＧＧＧＴＧＴＴＧＴＣＴＧＡＡＧＧＣＣＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＣＣＴＧＴＴＣ－３’（配列番号１８：図２４）
プライマー２（配列番号１６：図２２）
【0105】
阻害剤断片（Ｄ２）用プライマー
プライマー５：５’－ＡＧＡＴＧＧＧＴＧＴＴＧＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＣＣＴＧＴＴＣ－３’（配列番号１９：図２５）
プライマー２（配列番号１６：図２２）
阻害剤断片（Ｄ３）用プライマー
プライマー６：５’－ＡＧＡＴＧＧＧＴＧＴＴＧＴＣＴＧＡＴＧＡＣＧＡＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＣＣＴＧＴＴＣ－３’（配列番号２０：図２６）
プライマー２（配列番号１６：図２２）
阻害剤断片（Ｄ４）用プライマー
プライマー７：５’－ＡＧＡＴＧＧＧＴＧＴＴＧＴＣＴＧＡＴＧＡＴＧＡＣＧＡＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＣＣＴＧＴＴＣ－３’（配列番号２１：図２７）
プライマー２（配列番号１６：図２２）
阻害剤断片（Ｄ５）用プライマー
プライマー８：５’－ＡＧＡＴＧＧＧＴＧＴＴＧＴＣＴＧＡＣＧＡＴＧＡＴＧＡＣＧＡＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＣＣＴＧＴＴＣ－３’（配列番号２２：図２８）
プライマー２（配列番号１６：図２２）
プライマー５：５’－ＡＧＡＴＧＧＧＴＧＴＴＧＴＣＴＧＡＣＧＡＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＣＣＴＧＴＴＣ－３’（配列番号１９：図２５）
プライマー２（配列番号１６：図２２）
阻害剤断片（Ｄ３）用プライマー
プライマー６：５’－ＡＧＡＴＧＧＧＴＧＴＴＧＴＣＴＧＡＴＧＡＣＧＡＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＣＣＴＧＴＴＣ－３’（配列番号２０：図２６）
プライマー２（配列番号１６：図２２）
阻害剤断片（Ｄ４）用プライマー
プライマー７：５’－ＡＧＡＴＧＧＧＴＧＴＴＧＴＣＴＧＡＴＧＡＴＧＡＣＧＡＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＣＣＴＧＴＴＣ－３’（配列番号２１：図２７）
プライマー２（配列番号１６：図２２）
阻害剤断片（Ｄ５）用プライマー
プライマー８：５’－ＡＧＡＴＧＧＧＴＧＴＴＧＴＣＴＧＡＣＧＡＴＧＡＴＧＡＣＧＡＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＣＣＴＧＴＴＣ－３’（配列番号２２：図２８）
プライマー２（配列番号１６：図２２）
【0106】
下記プライマー及びＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたＰＣＲ法（（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ １０秒）×３０サイクル）により断片Ａを増幅した。
プライマー９：５’－ＡＡＡＡＴＣＴＡＧＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴ－３’（配列番号２３：図２９）
プライマー１０：５’－ＡＧＡＣＡＡＣＡＣＣＣＡＴＣＴＡＧＧＡＧＣＧＧＣＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＣＣ－３’（配列番号２４：図３０）
プライマー９：５’－ＡＡＡＡＴＣＴＡＧＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴ－３’（配列番号２３：図２９）
プライマー１０：５’－ＡＧＡＣＡＡＣＡＣＣＣＡＴＣＴＡＧＧＡＧＣＧＧＣＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＣＣ－３’（配列番号２４：図３０）
【0107】
ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域（配列番号３４：図４０）を鋳型として下記プライマー及びＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたＰＣＲ法（（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ ３０秒）×３０サイクル）によりヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を含む断片Ｂを増幅した。
プライマー１１：５’－ＡＴＣＣＧＧＡＡＴＧＧＣＣＣＣＴＧＣＧＡＡＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴＧＣＧＡＣ－３’（配列番号２５：図３１）
プライマー１２：５’－ＡＡＡＡＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＡＴＴＴＧＣＣＧＧＧＧＣＴＣＡＧ－３’（配列番号２６：図３２）
プライマー１１：５’－ＡＴＣＣＧＧＡＡＴＧＧＣＣＣＣＴＧＣＧＡＡＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴＧＣＧＡＣ－３’（配列番号２５：図３１）
プライマー１２：５’－ＡＡＡＡＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＡＴＴＴＧＣＣＧＧＧＧＣＴＣＡＧ－３’（配列番号２６：図３２）
【0108】
上記で増幅した阻害剤断片と断片Ａ、断片Ｂ、プライマー９（配列番号２３：図２９）、プライマー１２（配列番号２６：図３２）及びＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたオーバーラップＰＣＲ法により、所望のＤＮＡ断片を増幅した。
【0109】
増幅した断片をアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）によりＤＮＡを調製した。調製したＤＮＡ断片及び哺乳細胞発現ベクターｐＣＭＡを制限酵素ＸｂａＩ（ＮＥＢ）及びＰｍｅＩ（ＮＥＢ）を用いて、３７℃で１時間以上処理し、アガロースゲル電気泳動後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）により精製した。ＬｉｇａＦａｓｔ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、それぞれの精製断片を室温で１０分間反応させることでｌｉｇａｔｉｏｎ反応を実施した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ溶液は、大腸菌ＪＭ１０９（ＴＯＹＯＢＯ）に添加し、氷上で３０分間静置した後、４２℃で４５秒の熱処理、さらに氷上で５分間静置し、０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含む２ＹＴプレートに播種後、３７℃で一晩静置培養することで、大腸菌を形質転換した。翌日、形質転換した大腸菌を、０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に植菌し、３７℃で一晩培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ ９６ Ｔｕｒｂｏ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミドＤＮＡを回収し（以下、「ｍｉｎｉｐｒｅｐ処理」という。）、配列解析を実施することで、哺乳細胞発現ベクターｐＣＭＡ＿ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ融合体を構築した（各クローンのＩＤは図１に記載）。
【0110】
さらに、ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２クローンｐＣＭＡ＿Ｋ５１０２８－Ｆｃを鋳型として、下記プライマー及びＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２とヒトＩｇＧ１のＦｃ領域との間にＡｓｐ５個を挿入した断片を増幅し、自己環状化した。上記記載の方法に準じて大腸菌の形質転換と配列解析を実施し、哺乳細胞発現ベクターｐＣＭＡ＿Ｋ５１０２８－Ｄ５－Ｆｃを構築した。
プライマー１３：５’－ＧＡＴＧＡＣＧＡＣＧＡＡＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴＧＣ－３’（配列番号２７：図３３）
プライマー１４：５’－ＡＴＣＧＴＣＧＣＡＧＧＧＧＣＣＡＴＴＣＣＧ－３’（配列番号２８：図３４）
プライマー１３：５’－ＧＡＴＧＡＣＧＡＣＧＡＡＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴＧＣ－３’（配列番号２７：図３３）
プライマー１４：５’－ＡＴＣＧＴＣＧＣＡＧＧＧＧＣＣＡＴＴＣＣＧ－３’（配列番号２８：図３４）
【0111】
（１－２）ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ融合体の発現精製
（１－１）で構築した発現ベクターは、ＰＥＩ ＭＡＸ ４００００（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にトランスフェクションし、培養６日後に培養上清を回収した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて培養上清から所望のＦｃ融合体を回収し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ＮＭＷＬ １０，０００（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＰＢＳにバッファー交換することで、ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ融合体を調製した（図１）。
（１－１）で構築した発現ベクターは、ＰＥＩ ＭＡＸ ４００００（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にトランスフェクションし、培養６日後に培養上清を回収した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて培養上清から所望のＦｃ融合体を回収し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ＮＭＷＬ １０，０００（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＰＢＳにバッファー交換することで、ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ融合体を調製した（図１）。
【0112】
実施例２．ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ融合体のＫＬＫ５阻害活性評価
（２－１）ＫＬＫ５の調製
下記プライマー及びＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたＰＣＲ法（（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ １０秒）×３０サイクル）により断片Ｃを増幅した。
プライマー１５：５’－ＧＧＣＧＡＴＴＡＴＡＡＡＧＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＴＡＡＡＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣ－３’（配列番号２９：図３５）
プライマー１６：５’－ＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＡＡＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＴＴＴＡＴＣＡＴＣＧＴＣＡＴ－３’（配列番号３０：図３６）
（２－１）ＫＬＫ５の調製
下記プライマー及びＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたＰＣＲ法（（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ １０秒）×３０サイクル）により断片Ｃを増幅した。
プライマー１５：５’－ＧＧＣＧＡＴＴＡＴＡＡＡＧＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＴＡＡＡＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣ－３’（配列番号２９：図３５）
プライマー１６：５’－ＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＡＡＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＴＴＴＡＴＣＡＴＣＧＴＣＡＴ－３’（配列番号３０：図３６）
【0113】
次に、ヒトｐｒｏ－ＫＬＫ５（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ９Ｙ３３７）をコードするヌクレオチド配列をそれぞれ鋳型として、下記プライマー及びＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたＰＣＲ法（（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ ６０秒）×３０サイクル）により断片を増幅した。
プライマー１７：５’－ＡＡＡＡＴＣＴＡＧＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＡＣＡＧＣＴＡＧＡＣＣＣＣＣＴ－３’（配列番号３１：図３７）
プライマー１８：５’－ＣＧＴＣＡＴＣＴＴＴＡＴＡＡＴＣＧＣＣＧＣＴＧＴＴＧＧＣＣＴＧＧＡＴＧＧＴＴＴＣＣＴＧ－３’（配列番号３２：図３８）
プライマー１７：５’－ＡＡＡＡＴＣＴＡＧＡＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＡＣＡＧＣＴＡＧＡＣＣＣＣＣＴ－３’（配列番号３１：図３７）
プライマー１８：５’－ＣＧＴＣＡＴＣＴＴＴＡＴＡＡＴＣＧＣＣＧＣＴＧＴＴＧＧＣＣＴＧＧＡＴＧＧＴＴＴＣＣＴＧ－３’（配列番号３２：図３８）
【0114】
上記で増幅した断片と断片Ｃ、下記プライマー及びＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたオーバーラップＰＣＲ法により、所望のＤＮＡ断片を増幅した。
プライマー１７（配列番号３１：図３７）
プライマー１９：５’－ＡＡＡＡＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＡＡＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＴ－３’（配列番号３３：図３９）
プライマー１７（配列番号３１：図３７）
プライマー１９：５’－ＡＡＡＡＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＡＡＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＴ－３’（配列番号３３：図３９）
【0115】
さらに、制限酵素ＸｂａＩ（ＮＥＢ）及びＰｍｅＩ（ＮＥＢ）を用いたクローニングにより、各遺伝子のＣ末端にＦｌａｇ ｔａｇ及びＨｉｓ ｔａｇが付加した哺乳細胞発現ベクターｐＣＭＡ＿ｐｒｏ－ＫＬＫ５を構築した。
【0116】
（２－２）ＫＬＫ５の発現精製
（２－１）で構築した発現ベクターは、ＰＥＩ ＭＡＸ ４００００（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にトランスフェクションし、培養３日後に培養上清を回収した。ＨｉｓＴｒａｐ ｅｘｃｅｌ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて培養上精から所望のＨｉｓ ｔａｇ融合タンパク質を回収し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ＮＭＷＬ １０，０００（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＰＢＳにバッファー交換することで、ＫＬＫ５を精製した。
（２－１）で構築した発現ベクターは、ＰＥＩ ＭＡＸ ４００００（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にトランスフェクションし、培養３日後に培養上清を回収した。ＨｉｓＴｒａｐ ｅｘｃｅｌ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて培養上精から所望のＨｉｓ ｔａｇ融合タンパク質を回収し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ＮＭＷＬ １０，０００（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＰＢＳにバッファー交換することで、ＫＬＫ５を精製した。
【0117】
（２－３）ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ融合体のＫＬＫ５阻害活性評価
基質ペプチドを１０ｍＭになるようＤＭＳＯで溶解し、Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）で希釈して終濃度１００μＭで使用した。Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで希釈したＫＬＫ５とＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ融合体をそれぞれ２５μＬずつ混ぜ、３７℃で２０分反応させた後にＡｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで希釈した基質を５０μＬ加えて、Ｅｎｓｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で蛍光シグナルを測定した。各酵素と基質の組み合わせは以下の通り使用した。なお、各阻害ペプチドＦｃ融合体は終濃度０．０２２～１，３００ｎＭ、反応及び測定にはプロテオセーブ（登録商標）ＳＳ９６Ｆ黒プレート（住友ベークライト株式会社）を使用した。
Ｈｕｍａｎ ＫＬＫ５阻害活性評価；終濃度２０ｎＭ ＫＬＫ５、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＥＳ０１１）、蛍光シグナルｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６０ｎｍ
基質ペプチドを１０ｍＭになるようＤＭＳＯで溶解し、Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）で希釈して終濃度１００μＭで使用した。Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで希釈したＫＬＫ５とＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ融合体をそれぞれ２５μＬずつ混ぜ、３７℃で２０分反応させた後にＡｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで希釈した基質を５０μＬ加えて、Ｅｎｓｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で蛍光シグナルを測定した。各酵素と基質の組み合わせは以下の通り使用した。なお、各阻害ペプチドＦｃ融合体は終濃度０．０２２～１，３００ｎＭ、反応及び測定にはプロテオセーブ（登録商標）ＳＳ９６Ｆ黒プレート（住友ベークライト株式会社）を使用した。
Ｈｕｍａｎ ＫＬＫ５阻害活性評価；終濃度２０ｎＭ ＫＬＫ５、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＥＳ０１１）、蛍光シグナルｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６０ｎｍ
【0118】
各濃度における各ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ融合体の基質ペプチド分解速度を算出し、阻害剤濃度０ｎＭの分解速度を１００％としてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ （ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０；ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を用いて、４－パラメータロジスティック曲線でシグモイド型に回帰した。いずれのＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ融合体も低濃度でＫＬＫ５酵素活性を阻害し、デザイン間でＫＬＫ５阻害活性に変化は認められなかった（図２）。
【0119】
実施例３．ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ融合体のマウスＰＫ試験
（３－１）動物試験
実施例１で作製したＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ融合体をＰＢＳで０．７５ｍｇ／ｍＬに調製し、投与液とした。入荷後４～８日間馴化した４．５週齢ないし８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本チャールス・リバー株式会社）に、５ｍｇ／ｋｇの投与量で静脈内投与を行った。静脈内投与は、頚静脈内投与、尾静脈内投与のいずれかで実施した。頚静脈内投与は、以下に示す通りに行った。マウスにイソフルラン吸入麻酔を施し、頚部の体毛をバリカンで剃毛したのちに皮膚を切開して頚静脈を露出させた。投与液を満たしたインスリン皮下投与用針付注射筒（２９Ｇ）の針先を露出した頚静脈より下部の筋肉から穿刺し、針先が頚静脈内に入ったことを目視で確認したのち、プランジャーを押して投与した。尾静脈内投与は、以下に示す通りに行った。マウスにイソフルラン吸入麻酔を施し、尾部を微温湯で濡らした布で温めるか酒精綿で尾部を拭くことにより静脈を怒張させ、投与液を満たしたインスリン皮下投与用針付注射筒の針先を尾静脈内へ挿入した。プランジャーを若干引いて注射筒内に静脈血の逆流を確認したのち、プランジャーを押して投与した。インスリン皮下投与用針付注射筒にヘパリンナトリウム注射液を一度吸わせたのち吐き出させ、採血用注射筒とした。投与後５分、１時間、３時間、６時間及び２４時間に、採血用注射筒を用いてイソフルラン吸入麻酔下で非投与側の頚静脈から約０．０５ｍＬずつ採血した。血液を１．５ｍＬ容のポリプロピレンチューブに移し、冷却下、２１，６００×ｇの遠心力で３分間遠心分離にかけることにより、上清（血漿）を得た。
（３－１）動物試験
実施例１で作製したＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ融合体をＰＢＳで０．７５ｍｇ／ｍＬに調製し、投与液とした。入荷後４～８日間馴化した４．５週齢ないし８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本チャールス・リバー株式会社）に、５ｍｇ／ｋｇの投与量で静脈内投与を行った。静脈内投与は、頚静脈内投与、尾静脈内投与のいずれかで実施した。頚静脈内投与は、以下に示す通りに行った。マウスにイソフルラン吸入麻酔を施し、頚部の体毛をバリカンで剃毛したのちに皮膚を切開して頚静脈を露出させた。投与液を満たしたインスリン皮下投与用針付注射筒（２９Ｇ）の針先を露出した頚静脈より下部の筋肉から穿刺し、針先が頚静脈内に入ったことを目視で確認したのち、プランジャーを押して投与した。尾静脈内投与は、以下に示す通りに行った。マウスにイソフルラン吸入麻酔を施し、尾部を微温湯で濡らした布で温めるか酒精綿で尾部を拭くことにより静脈を怒張させ、投与液を満たしたインスリン皮下投与用針付注射筒の針先を尾静脈内へ挿入した。プランジャーを若干引いて注射筒内に静脈血の逆流を確認したのち、プランジャーを押して投与した。インスリン皮下投与用針付注射筒にヘパリンナトリウム注射液を一度吸わせたのち吐き出させ、採血用注射筒とした。投与後５分、１時間、３時間、６時間及び２４時間に、採血用注射筒を用いてイソフルラン吸入麻酔下で非投与側の頚静脈から約０．０５ｍＬずつ採血した。血液を１．５ｍＬ容のポリプロピレンチューブに移し、冷却下、２１，６００×ｇの遠心力で３分間遠心分離にかけることにより、上清（血漿）を得た。
【0120】
（３－２）測定
血漿中ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ融合体の濃度測定は、全自動イムノアッセイプラットフォーム、Ｇｙｒｏｌａｂ ｘＰ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ＧＹＲＯＳ ＰＲＯＴＥＩＮ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使って実施した。ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ融合体を１％ブランクマウス血漿含有ＲｅｘｘｉｐＡＮ（ＧＹＲＯＳ ＰＲＯＴＥＩＮ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で２，０００ｎｇ／ｍＬから２倍公比で８段階に希釈し、検量線用試料を調製した。実験で得られた血漿はＲｅｘｘｉｐＡＮで１００倍希釈し、測定用試料とした。ビオチン標識した抗ＳＰＩＮＫ２抗体（Ａｔｌａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）を０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）含有ＰＢＳで３５０ｎＭに調製し、捕捉抗体とした。ＤｙＬｉｇｈｔ６５０で標識した自社製抗ＳＰＩＮＫ２抗体６Ｄ８をＲｅｘｘｉｐＦバッファーで２０ｎＭに調製し、検出抗体とした。検量線試料、測定用試料、捕捉抗体、検出抗体及びＷａｓｈバッファー（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）含有ＰＢＳ）を９６ウェルＰＣＲプレートに入れ、Ｇｙｒｏｌａｂ Ｂｉｏａｆｆｙ ２００とともにＧｙｒｏｌａｂ ｘＰ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎにセットして、３－ＳｔｅｐＣ－Ａ－Ｄ（ｗｉｚａｒｄ ｍｅｔｈｏｄ）で測定した。検量線はＧｙｒｏｌａｂ Ｅｖａｌｕａｔｏｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ を用いて４－パラメータロジスティックモデル（重み付け；Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）で回帰した。Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ６．３（Ｃｅｒｔａｒａ Ｌ．Ｐ．）を用いてノンコンパートメント解析を実施し、投与後０から２４時間における血漿中濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣ０－２４ｈ）を算出した（Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ；Ｌｉｎｅａｒ Ｕｐ Ｌｏｇ Ｄｏｗｎ）。
血漿中ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ融合体の濃度測定は、全自動イムノアッセイプラットフォーム、Ｇｙｒｏｌａｂ ｘＰ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ＧＹＲＯＳ ＰＲＯＴＥＩＮ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使って実施した。ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ融合体を１％ブランクマウス血漿含有ＲｅｘｘｉｐＡＮ（ＧＹＲＯＳ ＰＲＯＴＥＩＮ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で２，０００ｎｇ／ｍＬから２倍公比で８段階に希釈し、検量線用試料を調製した。実験で得られた血漿はＲｅｘｘｉｐＡＮで１００倍希釈し、測定用試料とした。ビオチン標識した抗ＳＰＩＮＫ２抗体（Ａｔｌａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）を０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）含有ＰＢＳで３５０ｎＭに調製し、捕捉抗体とした。ＤｙＬｉｇｈｔ６５０で標識した自社製抗ＳＰＩＮＫ２抗体６Ｄ８をＲｅｘｘｉｐＦバッファーで２０ｎＭに調製し、検出抗体とした。検量線試料、測定用試料、捕捉抗体、検出抗体及びＷａｓｈバッファー（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）含有ＰＢＳ）を９６ウェルＰＣＲプレートに入れ、Ｇｙｒｏｌａｂ Ｂｉｏａｆｆｙ ２００とともにＧｙｒｏｌａｂ ｘＰ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎにセットして、３－ＳｔｅｐＣ－Ａ－Ｄ（ｗｉｚａｒｄ ｍｅｔｈｏｄ）で測定した。検量線はＧｙｒｏｌａｂ Ｅｖａｌｕａｔｏｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ を用いて４－パラメータロジスティックモデル（重み付け；Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）で回帰した。Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ６．３（Ｃｅｒｔａｒａ Ｌ．Ｐ．）を用いてノンコンパートメント解析を実施し、投与後０から２４時間における血漿中濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣ０－２４ｈ）を算出した（Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ；Ｌｉｎｅａｒ Ｕｐ Ｌｏｇ Ｄｏｗｎ）。
【0121】
（３－３）ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ融合体のＰＫ
ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ融合体Ｋ５１０２８－Ｆｃは、マウス投与後７日において図３（Ａ）に示される血中動態を示し、投与後３時間までに大幅な血中濃度の低下が認められた（図３（Ｂ））。Ｋ５１０２８－ＦｃのＮ末にＡｓｐ又はＧｌｕを１残基付加させることで、投与後３時間までに認められた大幅な投与検体の血中濃度低下は抑制された（図４）。この効果は配列に依らず、Ｄ１－Ｋ５１０２８－Ｆｃ、Ｄ１－Ｋ５００５５－Ｆｃいずれの配列においても、同様の効果が認められた（図５）。さらに、Ｋ５１０２８－Ｆｃを対象に、Ｎ末Ａｓｐの付加数を１～５残基としても、いずれのデザインも投与後３時間までに認められた大幅な投与検体の血中濃度低下を抑制した（図６）。さらに、投与後３時間までの大幅な血中濃度低下の改善により、投与後２４時間までの血中曝露も大幅な増加が認められた（表１）。血中曝露量の亢進効果はＡｓｐ付加数３（Ｄ３）が最も高く、Ａｓｐ付加数２（Ｄ２）、Ａｓｐ付加数１（Ｄ１）という順であった。しかし、Ａｓｐ５個をＳＰＩＮＫ２とＦｃ領域の間に配置したＫ５１０２８－Ｄ５－Ｆｃでは投与後３時間までに認められた大幅な投与検体の血中濃度低下の抑制及び投与後２４時間までの血中曝露の増加には繋がらなかった。以上の結果から、ＳＰＩＮＫ２－ＦｃのＮ末部分に、Ａｓｐ又はＧｌｕを１～５個挿入することで、投与後初期に認められる血中濃度の低下を抑制し、大幅な血中曝露の増加を達成した。
ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ融合体Ｋ５１０２８－Ｆｃは、マウス投与後７日において図３（Ａ）に示される血中動態を示し、投与後３時間までに大幅な血中濃度の低下が認められた（図３（Ｂ））。Ｋ５１０２８－ＦｃのＮ末にＡｓｐ又はＧｌｕを１残基付加させることで、投与後３時間までに認められた大幅な投与検体の血中濃度低下は抑制された（図４）。この効果は配列に依らず、Ｄ１－Ｋ５１０２８－Ｆｃ、Ｄ１－Ｋ５００５５－Ｆｃいずれの配列においても、同様の効果が認められた（図５）。さらに、Ｋ５１０２８－Ｆｃを対象に、Ｎ末Ａｓｐの付加数を１～５残基としても、いずれのデザインも投与後３時間までに認められた大幅な投与検体の血中濃度低下を抑制した（図６）。さらに、投与後３時間までの大幅な血中濃度低下の改善により、投与後２４時間までの血中曝露も大幅な増加が認められた（表１）。血中曝露量の亢進効果はＡｓｐ付加数３（Ｄ３）が最も高く、Ａｓｐ付加数２（Ｄ２）、Ａｓｐ付加数１（Ｄ１）という順であった。しかし、Ａｓｐ５個をＳＰＩＮＫ２とＦｃ領域の間に配置したＫ５１０２８－Ｄ５－Ｆｃでは投与後３時間までに認められた大幅な投与検体の血中濃度低下の抑制及び投与後２４時間までの血中曝露の増加には繋がらなかった。以上の結果から、ＳＰＩＮＫ２－ＦｃのＮ末部分に、Ａｓｐ又はＧｌｕを１～５個挿入することで、投与後初期に認められる血中濃度の低下を抑制し、大幅な血中曝露の増加を達成した。
【0122】
Ｆｃ融合体のＮ末部分に負電荷アミノ酸を配位することは、Ｆｃ融合体としてのｐＩに大きな影響は与えず、局所的に負電荷を帯電させるため、活性や物性等への影響は無い。このデザインにより、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドの活性や物性等への大きな影響を及ぼすことなく、投与後初期におけるＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドＦｃ融合体の血中濃度低下を抑制し、投与後のＦｃ融合体を高濃度で保つことに成功した。
【0123】
【表1】
【0124】
実施例４．ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ（ＩｇＧ２，ＩｇＧ４Ｐ）融合体の調製と評価
（４－１）ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ（ＩｇＧ２，ＩｇＧ４Ｐ）融合体発現ベクターの構築
（１－１）で構築した哺乳細胞発現ベクターｐＣＭＡ＿Ｋ５１０２８－Ｆｃ、ｐＣＭＡ＿Ｄ１－Ｋ５１０２８－Ｆｃ又はｐＣＭＡ＿Ｄ３－Ｋ５１０２８－Ｆｃを鋳型として、下記プライマー及びＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたＰＣＲ法（（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ ７５秒）×３０サイクル）により阻害剤断片（Ｄ０－Ｋ５１０２８、Ｄ１－Ｋ５１０２８、Ｄ３－Ｋ５１０２８）を増幅した。
阻害剤断片（Ｄ０－Ｋ５１０２８、Ｄ１－Ｋ５１０２８、Ｄ３－Ｋ５１０２８）用プライマー
プライマー２０：５’－ＴＧＡＧＴＴＴＡＡＡＣＴＴＴＴＡＡＡＣＧＧＧＧＧ－３’（配列番号３５：図４１）
プライマー２１：５’－ＧＣＡＧＧＧＧＣＣＡＴＴＣＣＧＧＡＴＧＡＴＣＴＴ－３’（配列番号３６：図４２）
（４－１）ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ（ＩｇＧ２，ＩｇＧ４Ｐ）融合体発現ベクターの構築
（１－１）で構築した哺乳細胞発現ベクターｐＣＭＡ＿Ｋ５１０２８－Ｆｃ、ｐＣＭＡ＿Ｄ１－Ｋ５１０２８－Ｆｃ又はｐＣＭＡ＿Ｄ３－Ｋ５１０２８－Ｆｃを鋳型として、下記プライマー及びＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたＰＣＲ法（（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ ７５秒）×３０サイクル）により阻害剤断片（Ｄ０－Ｋ５１０２８、Ｄ１－Ｋ５１０２８、Ｄ３－Ｋ５１０２８）を増幅した。
阻害剤断片（Ｄ０－Ｋ５１０２８、Ｄ１－Ｋ５１０２８、Ｄ３－Ｋ５１０２８）用プライマー
プライマー２０：５’－ＴＧＡＧＴＴＴＡＡＡＣＴＴＴＴＡＡＡＣＧＧＧＧＧ－３’（配列番号３５：図４１）
プライマー２１：５’－ＧＣＡＧＧＧＧＣＣＡＴＴＣＣＧＧＡＴＧＡＴＣＴＴ－３’（配列番号３６：図４２）
【0125】
ヒトＩｇＧ２のＦｃ領域（配列番号３７：図４３）を鋳型として下記プライマー及びＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたＰＣＲ法（（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ ３０秒）×３０サイクル）によりヒトＩｇＧ２のＦｃ領域を含む断片Ｄを増幅した。
プライマー２２：５’－ＣＧＧＡＡＴＧＧＣＣＣＣＴＧＣＧＡＧＣＧＴＡＡＧＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧＡＧＴＧＴ－３’（配列番号３８：図４４）
プライマー２３：５’－ＣＣＣＣＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＡＣＴＴＴＣＣＡＧＧＧＣＴＣＡＧＧＧＡＡＡＧＧＣＴ－３’（配列番号３９：図４５）
プライマー２２：５’－ＣＧＧＡＡＴＧＧＣＣＣＣＴＧＣＧＡＧＣＧＴＡＡＧＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧＡＧＴＧＴ－３’（配列番号３８：図４４）
プライマー２３：５’－ＣＣＣＣＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＡＣＴＴＴＣＣＡＧＧＧＣＴＣＡＧＧＧＡＡＡＧＧＣＴ－３’（配列番号３９：図４５）
【0126】
ヒトＩｇＧ４ＰのＦｃ領域（配列番号４０：図４６）を鋳型として下記プライマー及びＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたＰＣＲ法（（９４℃ １５秒、６０℃ ３０秒、６８℃ ３０秒）×３０サイクル）によりヒトＩｇＧ４ＰのＦｃ領域を含む断片Ｅを増幅した。
プライマー２４：５’－ＣＧＧＡＡＴＧＧＣＣＣＣＴＧＣＧＡＡＴＣＴＡＡＧＴＡＣＧＧＣＣＣＴＣＣＣＴＧＣ－３’（配列番号４１：図４７）
プライマー２５：５’－ＣＣＣＣＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＡＴＴＴＧＣＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡ－３’（配列番号４２：図４８）
プライマー２４：５’－ＣＧＧＡＡＴＧＧＣＣＣＣＴＧＣＧＡＡＴＣＴＡＡＧＴＡＣＧＧＣＣＣＴＣＣＣＴＧＣ－３’（配列番号４１：図４７）
プライマー２５：５’－ＣＣＣＣＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＡＴＴＴＧＣＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡ－３’（配列番号４２：図４８）
【0127】
増幅した断片をアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のＤＮＡ断片を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）によりＤＮＡを調製した。調製した各阻害剤断片に、断片Ｄ又は断片Ｅを添加し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ）を用いて５０℃で１５分間反応させることで断片を連結した。連結した断片は、大腸菌ＪＭ１０９（ＴＯＹＯＢＯ）に添加し、氷上で３０分間静置した後、４２℃で４５秒の熱処理、さらに氷上で５分間静置し、０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含む２ＹＴプレートに播種後、３７℃で一晩静置培養することで、大腸菌を形質転換した。翌日、形質転換した大腸菌を、０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に植菌し、３７℃で一晩培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ ９６ Ｔｕｒｂｏ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミドＤＮＡを回収し（以下、「ｍｉｎｉｐｒｅｐ処理」という。）、配列解析を実施することで、哺乳細胞発現ベクターｐＣＭＡ＿ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ（ＩｇＧ２，ＩｇＧ４Ｐ）融合体を構築した。
【0128】
（４－２）ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ（ＩｇＧ２，ＩｇＧ４Ｐ）融合体の発現精製
（４－１）で構築した発現ベクターは、ＰＥＩ ＭＡＸ ４００００（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にトランスフェクションし、培養６日後に培養上清を回収した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて培養上清から所望のＦｃ融合体を回収し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ＮＭＷＬ １０，０００（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＰＢＳにバッファー交換することで、ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ（ＩｇＧ２，ＩｇＧ４Ｐ）融合体を調製した。
（４－１）で構築した発現ベクターは、ＰＥＩ ＭＡＸ ４００００（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にトランスフェクションし、培養６日後に培養上清を回収した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて培養上清から所望のＦｃ融合体を回収し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ＮＭＷＬ １０，０００（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＰＢＳにバッファー交換することで、ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ（ＩｇＧ２，ＩｇＧ４Ｐ）融合体を調製した。
【0129】
（４－３）ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ（ＩｇＧ２，ＩｇＧ４Ｐ）融合体のＫＬＫ５阻害活性評価
基質ペプチドを１０ｍＭになるようＤＭＳＯで溶解し、Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）で希釈して終濃度１００μＭで使用した。Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで希釈したＫＬＫ５とＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ（ＩｇＧ２，ＩｇＧ４Ｐ）融合体をそれぞれ２５μＬずつ混ぜ、３７℃で２０分反応させた後にＡｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで希釈した基質を５０μＬ加えて、Ｅｎｓｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で蛍光シグナルを測定した。各酵素と基質の組み合わせは以下の通り使用した。なお、各ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ（ＩｇＧ２，ＩｇＧ４Ｐ）融合体は終濃度１．６～１００ｎＭ、反応及び測定にはプロテオセーブ（登録商標）ＳＳ９６Ｆ黒プレート（住友ベークライト株式会社）を使用した。
Ｈｕｍａｎ ＫＬＫ５阻害活性評価；終濃度２０ｎＭ ＫＬＫ５、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＥＳ０１１）、蛍光シグナルｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６０ｎｍ
基質ペプチドを１０ｍＭになるようＤＭＳＯで溶解し、Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）で希釈して終濃度１００μＭで使用した。Ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで希釈したＫＬＫ５とＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ（ＩｇＧ２，ＩｇＧ４Ｐ）融合体をそれぞれ２５μＬずつ混ぜ、３７℃で２０分反応させた後にＡｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒで希釈した基質を５０μＬ加えて、Ｅｎｓｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で蛍光シグナルを測定した。各酵素と基質の組み合わせは以下の通り使用した。なお、各ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ（ＩｇＧ２，ＩｇＧ４Ｐ）融合体は終濃度１．６～１００ｎＭ、反応及び測定にはプロテオセーブ（登録商標）ＳＳ９６Ｆ黒プレート（住友ベークライト株式会社）を使用した。
Ｈｕｍａｎ ＫＬＫ５阻害活性評価；終濃度２０ｎＭ ＫＬＫ５、終濃度１００μＭ 基質ペプチドＢｏｃ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＥＳ０１１）、蛍光シグナルｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３８０ｎｍ／ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６０ｎｍ
【0130】
各濃度における各ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ（ＩｇＧ２，ＩｇＧ４Ｐ）融合体の基質ペプチド分解速度を算出し、阻害剤濃度０ｎＭの分解速度を１００％としてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ （ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０；ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）を用いて、４－パラメータロジスティック曲線でシグモイド型に回帰した。いずれのＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ（ＩｇＧ２，ＩｇＧ４Ｐ）融合体も低濃度でＫＬＫ５酵素活性を阻害し、デザイン間でＫＬＫ５阻害活性に変化は認められなかった（図５５）。
【0131】
実施例５．ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ（ＩｇＧ２，ＩｇＧ４Ｐ）融合体のマウスＰＫ試験
（５－１）動物試験
（４－２）で作製したＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ（ＩｇＧ２，ＩｇＧ４Ｐ）融合体をＰＢＳで１ｍｇ／ｍＬに調製し、投与液とした。入荷後７日間馴化した６週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本チャールス・リバー株式会社）に、５ｍｇ／ｋｇの投与量で頚静脈内投与を以下に示す通りに行った。マウスにイソフルラン吸入麻酔を施し、頚部の体毛をバリカンで剃毛したのちに皮膚を切開して頚静脈を露出させた。投与液を満たしたインスリン皮下投与用針付注射筒（２９Ｇ）の針先を露出した頚静脈より下部の筋肉から穿刺し、針先が頚静脈内に入ったことを目視で確認したのち、プランジャーを押して投与した。インスリン皮下投与用針付注射筒にヘパリンナトリウム注射液を一度吸わせたのち吐き出させ、採血用注射筒とした。投与後５分、１時間、３時間、６時間及び２４時間に、採血用注射筒を用いてイソフルラン吸入麻酔下で非投与側の頚静脈から約０．０３ｍＬずつ採血した。血液を１．５ｍＬ容のポリプロピレンチューブに移し、冷却下、２１，６００×ｇの遠心力で３分間遠心分離にかけることにより、上清（血漿）を得た。
（５－１）動物試験
（４－２）で作製したＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ（ＩｇＧ２，ＩｇＧ４Ｐ）融合体をＰＢＳで１ｍｇ／ｍＬに調製し、投与液とした。入荷後７日間馴化した６週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本チャールス・リバー株式会社）に、５ｍｇ／ｋｇの投与量で頚静脈内投与を以下に示す通りに行った。マウスにイソフルラン吸入麻酔を施し、頚部の体毛をバリカンで剃毛したのちに皮膚を切開して頚静脈を露出させた。投与液を満たしたインスリン皮下投与用針付注射筒（２９Ｇ）の針先を露出した頚静脈より下部の筋肉から穿刺し、針先が頚静脈内に入ったことを目視で確認したのち、プランジャーを押して投与した。インスリン皮下投与用針付注射筒にヘパリンナトリウム注射液を一度吸わせたのち吐き出させ、採血用注射筒とした。投与後５分、１時間、３時間、６時間及び２４時間に、採血用注射筒を用いてイソフルラン吸入麻酔下で非投与側の頚静脈から約０．０３ｍＬずつ採血した。血液を１．５ｍＬ容のポリプロピレンチューブに移し、冷却下、２１，６００×ｇの遠心力で３分間遠心分離にかけることにより、上清（血漿）を得た。
【0132】
（５－２）測定
血漿中ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ（ＩｇＧ２，ＩｇＧ４Ｐ）融合体の濃度測定は、全自動イムノアッセイプラットフォーム、Ｇｙｒｏｌａｂ ｘＰ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ＧＹＲＯＳ ＰＲＯＴＥＩＮ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使って実施した。ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ（ＩｇＧ２，ＩｇＧ４Ｐ）融合体を１％ブランクマウス血漿含有ＲｅｘｘｉｐＡＮ（ＧＹＲＯＳ ＰＲＯＴＥＩＮ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１，０００ｎｇ／ｍＬから２．７倍公比で７段階に希釈し、検量線用試料を調製した。実験で得られた血漿はＲｅｘｘｉｐＡＮで１００倍希釈し、測定用試料とした。ビオチン標識した抗ＳＰＩＮＫ２抗体（Ａｔｌａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）を０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）含有ＰＢＳで３５０ｎＭに調製し、捕捉抗体とした。ＤｙＬｉｇｈｔ６５０で標識した自社製抗ＳＰＩＮＫ２抗体６Ｄ８をＲｅｘｘｉｐＦバッファーで２０ｎＭに調製し、検出抗体とした。検量線試料、測定用試料、捕捉抗体、検出抗体及びＷａｓｈバッファー（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）含有ＰＢＳ）を９６ウェルＰＣＲプレートに入れ、Ｇｙｒｏｌａｂ Ｂｉｏａｆｆｙ ２００とともにＧｙｒｏｌａｂ ｘＰ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎにセットして、３－ＳｔｅｐＣ－Ａ－Ｄ（ｗｉｚａｒｄ ｍｅｔｈｏｄ）で測定した。検量線はＧｙｒｏｌａｂ Ｅｖａｌｕａｔｏｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ を用いて４－パラメータロジスティックモデル（重み付け；Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）で回帰した。Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ６．３（Ｃｅｒｔａｒａ Ｌ．Ｐ．）を用いてノンコンパートメント解析を実施し、投与後０から２４時間における血漿中濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣ０－２４ｈ）を算出した（Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ；Ｌｉｎｅａｒ Ｕｐ Ｌｏｇ Ｄｏｗｎ）。
血漿中ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ（ＩｇＧ２，ＩｇＧ４Ｐ）融合体の濃度測定は、全自動イムノアッセイプラットフォーム、Ｇｙｒｏｌａｂ ｘＰ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ＧＹＲＯＳ ＰＲＯＴＥＩＮ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使って実施した。ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ（ＩｇＧ２，ＩｇＧ４Ｐ）融合体を１％ブランクマウス血漿含有ＲｅｘｘｉｐＡＮ（ＧＹＲＯＳ ＰＲＯＴＥＩＮ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１，０００ｎｇ／ｍＬから２．７倍公比で７段階に希釈し、検量線用試料を調製した。実験で得られた血漿はＲｅｘｘｉｐＡＮで１００倍希釈し、測定用試料とした。ビオチン標識した抗ＳＰＩＮＫ２抗体（Ａｔｌａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）を０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）含有ＰＢＳで３５０ｎＭに調製し、捕捉抗体とした。ＤｙＬｉｇｈｔ６５０で標識した自社製抗ＳＰＩＮＫ２抗体６Ｄ８をＲｅｘｘｉｐＦバッファーで２０ｎＭに調製し、検出抗体とした。検量線試料、測定用試料、捕捉抗体、検出抗体及びＷａｓｈバッファー（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）含有ＰＢＳ）を９６ウェルＰＣＲプレートに入れ、Ｇｙｒｏｌａｂ Ｂｉｏａｆｆｙ ２００とともにＧｙｒｏｌａｂ ｘＰ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎにセットして、３－ＳｔｅｐＣ－Ａ－Ｄ（ｗｉｚａｒｄ ｍｅｔｈｏｄ）で測定した。検量線はＧｙｒｏｌａｂ Ｅｖａｌｕａｔｏｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ を用いて４－パラメータロジスティックモデル（重み付け；Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）で回帰した。Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ６．３（Ｃｅｒｔａｒａ Ｌ．Ｐ．）を用いてノンコンパートメント解析を実施し、投与後０から２４時間における血漿中濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣ０－２４ｈ）を算出した（Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ；Ｌｉｎｅａｒ Ｕｐ Ｌｏｇ Ｄｏｗｎ）。
【0133】
（５－３）ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ（ＩｇＧ２，ＩｇＧ４Ｐ）融合体のＰＫ
ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ（ＩｇＧ２）融合体Ｄ０－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ２）は、マウス投与後２４時間において図５６に示される血中動態を示し、投与後３時間までに大幅な血中濃度の低下が認められた。Ｄ０－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ２）のＮ末にＡｓｐを１残基付加させることで、投与後３時間までに認められた大幅な血中濃度低下は抑制された（図５６）。Ｎ末Ａｓｐの付加数を３残基としても、投与後３時間までに認められた大幅な血中濃度低下を抑制した（図５６）。この効果はＦｃの配列に依らず、ＩｇＧ４Ｐにおいても同様に認められた（図５７）。さらに、投与後３時間までの大幅な血中濃度低下の改善により、投与後２４時間までの血中曝露も大幅な増加が認められた（表２）。以上の結果から、ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ融合体のＮ末部分に、Ａｓｐを１残基付加することで、ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ融合体の投与後初期に認められる血中濃度の低下とそれに付随する血中低曝露は改善し、アイソタイプの異なるＩｇＧのＦｃ配列を融合した場合においても同じ効果を発揮した。
ＫＬＫ５阻害ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ（ＩｇＧ２）融合体Ｄ０－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ２）は、マウス投与後２４時間において図５６に示される血中動態を示し、投与後３時間までに大幅な血中濃度の低下が認められた。Ｄ０－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ２）のＮ末にＡｓｐを１残基付加させることで、投与後３時間までに認められた大幅な血中濃度低下は抑制された（図５６）。Ｎ末Ａｓｐの付加数を３残基としても、投与後３時間までに認められた大幅な血中濃度低下を抑制した（図５６）。この効果はＦｃの配列に依らず、ＩｇＧ４Ｐにおいても同様に認められた（図５７）。さらに、投与後３時間までの大幅な血中濃度低下の改善により、投与後２４時間までの血中曝露も大幅な増加が認められた（表２）。以上の結果から、ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ融合体のＮ末部分に、Ａｓｐを１残基付加することで、ＳＰＩＮＫ２－Ｆｃ融合体の投与後初期に認められる血中濃度の低下とそれに付随する血中低曝露は改善し、アイソタイプの異なるＩｇＧのＦｃ配列を融合した場合においても同じ効果を発揮した。
【0134】
Ｆｃ融合体のＮ末部分に負電荷アミノ酸を配位することは、Ｆｃ融合体のＦｃ配列として、エフェクター機能が非常に弱いＩｇＧ２やＩｇＧ４Ｐを採用しても、Ｆｃ融合体としてのｐＩに大きな影響は与えず、局所的に負電荷を帯電させるため、活性や物性等への影響は無い。このデザインにより、ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドの活性や物性等への大きな影響を及ぼすことなく、投与後初期におけるＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドＦｃ融合体の血中濃度低下を抑制し、投与後のＦｃ融合体を高濃度で保つことに成功した。
【0135】
【表2】
【産業上の利用可能性】
【0136】
本発明の提供する血中動態改善方法は、ペプチド又は該ペプチドを含有するコンジュゲートの血中半減期の延長、血中曝露量の増大等をもたらし、該ペプチド又は該コンジュゲートを含有する医薬は、各種疾患の治療又は予防等に好適に使用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【0137】
配列番号１：ヒトＳＰＩＮＫ２のアミノ酸配列（図７）
配列番号２：ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドの一般式（図８）
配列番号３：ヒトＫＬＫ５のアミノ酸配列（図９）
配列番号４：ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５００５５のアミノ酸配列（図１０）
配列番号５：ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５１０２８のアミノ酸配列（図１１）
配列番号６：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ０－Ｋ５１０２８－Ｆｃのアミノ酸配列（図１２）
配列番号７：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ１－Ｋ５１０２８－Ｆｃのアミノ酸配列（図１３）
配列番号８：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ２－Ｋ５１０２８－Ｆｃのアミノ酸配列（図１４）
配列番号９：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１０２８－Ｆｃのアミノ酸配列（図１５）
配列番号１０：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ４－Ｋ５１０２８－Ｆｃのアミノ酸配列（図１６）
配列番号２：ＳＰＩＮＫ２変異体ペプチドの一般式（図８）
配列番号３：ヒトＫＬＫ５のアミノ酸配列（図９）
配列番号４：ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５００５５のアミノ酸配列（図１０）
配列番号５：ＫＬＫ５阻害ペプチドＫ５１０２８のアミノ酸配列（図１１）
配列番号６：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ０－Ｋ５１０２８－Ｆｃのアミノ酸配列（図１２）
配列番号７：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ１－Ｋ５１０２８－Ｆｃのアミノ酸配列（図１３）
配列番号８：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ２－Ｋ５１０２８－Ｆｃのアミノ酸配列（図１４）
配列番号９：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１０２８－Ｆｃのアミノ酸配列（図１５）
配列番号１０：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ４－Ｋ５１０２８－Ｆｃのアミノ酸配列（図１６）
【0138】
配列番号１１：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ５－Ｋ５１０２８－Ｆｃのアミノ酸配列（図１７）
配列番号１２：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｋ５１０２８－Ｄ５－Ｆｃのアミノ酸配列（図１８）
配列番号１３：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｅ１－Ｋ５１０２８－Ｆｃのアミノ酸配列（図１９）
配列番号１４：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ１－Ｋ５００５５－Ｆｃのアミノ酸配列（図２０）
配列番号１５：プライマー１のヌクレオチド配列（図２１）
配列番号１６：プライマー２のヌクレオチド配列（図２２）
配列番号１７：プライマー３のヌクレオチド配列（図２３）
配列番号１８：プライマー４のヌクレオチド配列（図２４）
配列番号１９：プライマー５のヌクレオチド配列（図２５）
配列番号２０：プライマー６のヌクレオチド配列（図２６）
配列番号２１：プライマー７のヌクレオチド配列（図２７）
配列番号２２：プライマー８のヌクレオチド配列（図２８）
配列番号２３：プライマー９のヌクレオチド配列（図２９）
配列番号２４：プライマー１０のヌクレオチド配列（図３０）
配列番号２５：プライマー１１のヌクレオチド配列（図３１）
配列番号２６：プライマー１２のヌクレオチド配列（図３２）
配列番号２７：プライマー１３のヌクレオチド配列（図３３）
配列番号２８：プライマー１４のヌクレオチド配列（図３４）
配列番号２９：プライマー１５のヌクレオチド配列（図３５）
配列番号３０：プライマー１６のヌクレオチド配列（図３６）
配列番号１２：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｋ５１０２８－Ｄ５－Ｆｃのアミノ酸配列（図１８）
配列番号１３：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｅ１－Ｋ５１０２８－Ｆｃのアミノ酸配列（図１９）
配列番号１４：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ１－Ｋ５００５５－Ｆｃのアミノ酸配列（図２０）
配列番号１５：プライマー１のヌクレオチド配列（図２１）
配列番号１６：プライマー２のヌクレオチド配列（図２２）
配列番号１７：プライマー３のヌクレオチド配列（図２３）
配列番号１８：プライマー４のヌクレオチド配列（図２４）
配列番号１９：プライマー５のヌクレオチド配列（図２５）
配列番号２０：プライマー６のヌクレオチド配列（図２６）
配列番号２１：プライマー７のヌクレオチド配列（図２７）
配列番号２２：プライマー８のヌクレオチド配列（図２８）
配列番号２３：プライマー９のヌクレオチド配列（図２９）
配列番号２４：プライマー１０のヌクレオチド配列（図３０）
配列番号２５：プライマー１１のヌクレオチド配列（図３１）
配列番号２６：プライマー１２のヌクレオチド配列（図３２）
配列番号２７：プライマー１３のヌクレオチド配列（図３３）
配列番号２８：プライマー１４のヌクレオチド配列（図３４）
配列番号２９：プライマー１５のヌクレオチド配列（図３５）
配列番号３０：プライマー１６のヌクレオチド配列（図３６）
【0139】
配列番号３１：プライマー１７のヌクレオチド配列（図３７）
配列番号３２：プライマー１８のヌクレオチド配列（図３８）
配列番号３３：プライマー１９のヌクレオチド配列（図３９）
配列番号３４：ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のアミノ酸配列（図４０）
配列番号３５：プライマー２０のヌクレオチド配列（図４１）
配列番号３６：プライマー２１のヌクレオチド配列（図４２）
配列番号３７：ヒトＩｇＧ２のＦｃ領域のアミノ酸配列（図４３）
配列番号３８：プライマー２２のヌクレオチド配列（図４４）
配列番号３９：プライマー２３のヌクレオチド配列（図４５）
配列番号４０：ヒトＩｇＧ４ＰのＦｃ領域のアミノ酸配列（図４６）
配列番号４１：プライマー２４のヌクレオチド配列（図４７）
配列番号４２：プライマー２５のヌクレオチド配列（図４８）
配列番号４３：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ０－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ２）のアミノ酸配列（図４９）
配列番号４４：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ１－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ２）のアミノ酸配列（図５０）
配列番号４５：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ２）のアミノ酸配列（図５１）
配列番号４６：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ０－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ４Ｐ）のアミノ酸配列（図５２）
配列番号４７：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ１－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ４Ｐ）のアミノ酸配列（図５３）
配列番号４８：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ４Ｐ）のアミノ酸配列（図５４）
配列番号３２：プライマー１８のヌクレオチド配列（図３８）
配列番号３３：プライマー１９のヌクレオチド配列（図３９）
配列番号３４：ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のアミノ酸配列（図４０）
配列番号３５：プライマー２０のヌクレオチド配列（図４１）
配列番号３６：プライマー２１のヌクレオチド配列（図４２）
配列番号３７：ヒトＩｇＧ２のＦｃ領域のアミノ酸配列（図４３）
配列番号３８：プライマー２２のヌクレオチド配列（図４４）
配列番号３９：プライマー２３のヌクレオチド配列（図４５）
配列番号４０：ヒトＩｇＧ４ＰのＦｃ領域のアミノ酸配列（図４６）
配列番号４１：プライマー２４のヌクレオチド配列（図４７）
配列番号４２：プライマー２５のヌクレオチド配列（図４８）
配列番号４３：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ０－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ２）のアミノ酸配列（図４９）
配列番号４４：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ１－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ２）のアミノ酸配列（図５０）
配列番号４５：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ２）のアミノ酸配列（図５１）
配列番号４６：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ０－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ４Ｐ）のアミノ酸配列（図５２）
配列番号４７：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ１－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ４Ｐ）のアミノ酸配列（図５３）
配列番号４８：ＫＬＫ５阻害ペプチドＦｃ融合体Ｄ３－Ｋ５１０２８－Ｆｃ（ＩｇＧ４Ｐ）のアミノ酸配列（図５４）
【図1】
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