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特許7544953α－サラセミアの治療薬の製造における甲状腺ホルモン及びその類似体の使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-26
(45)【発行日】2024-09-03
(54)【発明の名称】α－サラセミアの治療薬の製造における甲状腺ホルモン及びその類似体の使用
(51)【国際特許分類】
A61K 38/22 20060101AFI20240827BHJP
A61P 7/06 20060101ALI20240827BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240827BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALN20240827BHJP
A61K 31/192 20060101ALN20240827BHJP
【ＦＩ】
A61K38/22
A61P7/06
A61P43/00 111
C12Q1/6851 Z ZNA
A61K31/192
【請求項の数】
1
(21)【出願番号】P 2023504689
(86)(22)【出願日】2021-01-19
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-23
(86)【国際出願番号】 CN2021072745
(87)【国際公開番号】W WO2021208552
(87)【国際公開日】2021-10-21
【審査請求日】2022-10-12
(31)【優先権主張番号】202010304073.5
(32)【優先日】2020-04-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】522399736
【氏名又は名称】上海上薬睿尓薬品有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＳＰＨ ＲＡＲＥ ＤＩＳＥＡＳＥ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】２１／Ｆ， ６９９ Ｇｕａｎｇｚｈｏｎｇ Ｗｅｓｔ Ｒｏａｄ， Ｊｉｎｇ’ａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｓｈａｎｇｈａｉ， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100146374
【弁理士】
【氏名又は名称】有馬 百子
(72)【発明者】
【氏名】袁 浩
【審査官】長谷川 茜
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１４－５３０００２（ＪＰ，Ａ）
【文献】British Journal of Haematology，2000年，Vol.109，pp.882-890
【文献】Blood，2005年，Vol.106, No.11，3632，https://doi.org/10.1182/blood.V106.11.3632.3632
【文献】膜（MEMBRANE），2007年，Vol.32, No.3，pp.155-162
【文献】American Journal of Hematology，1978年，Vol.5，pp.163-168
【文献】Cold Spring Harb Perspect Med，2013年，Vol.3, No.1，a011718, pp.1-15，doi: 10.1101/cshperspect.a011718
【文献】Blood Reviews，2012年，Vol.26S，pp.S31-S34
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ゼブラフィッシュ胚を、甲状腺ホルモンアナログＴｒｉａｃ、又は甲状腺ホルモンにより処理する、ことを特徴とするゼータ－グロビン遺伝子（ＨＢＺ）の発現をアップレギュレートする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、サラセミアの技術分野に属し、具体的に、α－サラセミアの治療薬の製造における甲状腺ホルモン及びその類似体の使用に関する。’
【背景技術】
【0002】
サラセミアは、世界で最も一般的な単一遺伝子の遺伝病の１つであり、人間の健康に大きな影響を与える。それは、グロビン遺伝子（ｇｌｏｂｉｎ）の欠失や変異によるグロビン鎖合成障害により、ヘモグロビン（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）の組成比率に不均衡が生じ、最終的には赤血球が破壊されることで起こる溶血性貧血である。関連するグロビン鎖のタイプに従って分類すると、最も一般的なのはα－サラセミア及びβ－サラセミアである。α－グロビン合成の減少はα－サラセミアとして知られており、β－グロビン合成の減少はβ－サラセミアとして知られている。α－サラセミア遺伝子キャリアの数はβ－サラセミア遺伝子キャリアの数より多く、かつ中間型α－サラセミア（ＨｂＨ病としても知られる）及び重症型α－サラセミア（バートの胎児水腫症候群としても知られる）の患者の数は、中国は世界の他の国や地域よりはるかに高く、まさに「深刻な災害地域」であるが、これまでのところ、そのような病気に対する成熟した有効な治療方法はない。その結果、α－サラセミアの患者は、満たされていない巨大な医療ニーズに直面している。
【0003】
α－サラセミアは、α－グロビン鎖の合成の減少による赤血球の破壊によって引き起こされる溶血性貧血である。α－グロビン遺伝子の欠失または変異の数に応じて、（１）静止型α－サラセミア、（２）軽症型α－サラセミア、（３）中間型αサラセミア（ＨｂＨ病としても知られる）、（４）重症型α－サラセミア（バートの胎児水腫症候群としても知られる）という４種類に分けられる。そのうち静止型α－サラセミアや軽症型α－サラセミア患者は特別な治療を必要としないが、重度の貧血である一部の中間型α－サラセミア（ＨｂＨ病）患者は輸血療法が必要であり、重症型α－サラセミア（バートの胎児水腫症候群）の患者の場合、いくつかの病院は子宮内輸血が症状を緩和できると報告しているが、それ以外には、今のところ有効な治療方法はない。
【0004】
しかしながら、輸血療法には次のような問題がある。
１．輸血は、母体と乳児に深刻な合併症を引き起こし、患者の体内に鉄の過負荷を引き起こし、主に心臓、肝臓、膵臓、及び各内分泌器官に影響を与える複数の臓器の損傷を引き起こし、母と子の生命の安全を危険にさらす。
２．輸血は、発熱、悪寒、発疹などの副作用を引き起こし、重症の場合、急性溶血、気管収縮、血圧低下を引き起こす。
３．輸血は血液を介して伝染病に感染する危険性がある可能性がある。
４．子宮内輸血は技術的要件が高く、難しく、普及して広く使用しにくい。
５．輸血は、高額な費用が必要であり、特に生涯輸血が必要な患者にとって、大きな経済的負担となる。
１．輸血は、母体と乳児に深刻な合併症を引き起こし、患者の体内に鉄の過負荷を引き起こし、主に心臓、肝臓、膵臓、及び各内分泌器官に影響を与える複数の臓器の損傷を引き起こし、母と子の生命の安全を危険にさらす。
２．輸血は、発熱、悪寒、発疹などの副作用を引き起こし、重症の場合、急性溶血、気管収縮、血圧低下を引き起こす。
３．輸血は血液を介して伝染病に感染する危険性がある可能性がある。
４．子宮内輸血は技術的要件が高く、難しく、普及して広く使用しにくい。
５．輸血は、高額な費用が必要であり、特に生涯輸血が必要な患者にとって、大きな経済的負担となる。
【0005】
ゼータ－グロビンは、胚の段階でのみ発現するα－グロビン様タンパク質で、酸素を運ぶ機能もあり、且つ該タンパク質をコードする遺伝子は、ほとんどのα－サラセミア患者でよく保存され、胚発育が進むにつれて、その発現は徐々にオフになる。α－グロビン遺伝子欠失マウスにおいて、遺伝子組み換え方法によってゼータ－グロビンを再発現すると、α－サラセミア病のマウスの正常な発育を完全に回復できることが研究により示されている。したがって、患者体内のサイレンシングされたゼータ－グロビン遺伝子を再活性化して欠失しているα－グロビンを補うことは、α－サラセミアの有効な治療方法であると期待されている。しかしながら、ゼータ－グロビン遺伝子の発現を活性化する薬物は現在まで存在していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
先行技術の欠点に対して、本発明の第一の目的は、α－サラセミアの治療薬の製造における甲状腺ホルモン及びその類似体の使用を提供することである。
【0007】
本発明の第２の目的は、ゼータ－グロビン遺伝子の発現を調節する治療薬の製造における甲状腺ホルモン及びその類似体の使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
上記の第１の目的を達成するために、本発明の解決手段は、
α－サラセミアの治療薬の製造において、甲状腺ホルモン及びその類似体を使用することができることである。
α－サラセミアの治療薬の製造において、甲状腺ホルモン及びその類似体を使用することができることである。
【0009】
上記第２の目的を達成するために、本発明の的解決手段は、
ゼータ－グロビン遺伝子の発現調節薬において甲状腺ホルモン及びその類似体を使用することができることである。
ゼータ－グロビン遺伝子の発現調節薬において甲状腺ホルモン及びその類似体を使用することができることである。
【0010】
具体的には、甲状腺ホルモン及びその類似体は、ゼータ－グロビン遺伝子の発現を有意にアップレギュレートすることができる。
【0011】
Ｔｒｉａｃ（Ｔｉｒａｔｒｉｃｏｌまたは３，３’，５－ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｙｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄとも呼ばれる）（化学名：２－［４－（４－Ｈｙｄｒｏｘｙ－３－ｉｏｄｏｐｈｅｎｏｘｙ）－３，５－ｄｉｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ］ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、分子式：Ｃ１４Ｈ９Ｉ３Ｏ４）は甲状腺ホルモン類似体であり、甲状腺ホルモン抵抗性症候群（Ｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、高脂血症（ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉａ）、限局性脂肪代謝障害（ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｌｉｐｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）と肥満（ｏｂｅｓｉｔｙ）の治療に用いられる。また、Ｔｒｉａｃは現在、Ａｌｌａｎ－Ｈｅｒｎｄｏｎ－Ｄｕｄｌｅｙ症候群の治療のための臨床試験にも使用されている。
【0012】
発明者の研究によると、Ｋ５６２細胞分化プロセスにおいて、Ｔｒｉａｃはゼータ－グロビン遺伝子（ＨＢＺ）の発現を有意にアップレギュレートすることができ、さらに、モデル動物ゼブラフィッシュ胚において、Ｔｒｉａｃによって処理された後にゼータ－グロビン遺伝子（ｈｂａｅ５）の発現も、特異的有意にアップレギュレートされたが、他のグロビン遺伝子の発現は有意にアップレギュレートされなかった。さらに、発明者の研究は、甲状腺ホルモン（３，３’，５－Ｔｒｉｉｏｄｏ－Ｌ－ｔｈｙｒｏｎｉｎｅ、Ｔ３と呼ばれ、または３，３’，５，５’－ｔｅｔｒａｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ、Ｔ４と呼ばれる）も同様の機能を有することを発見した。したがって、発明者は、甲状腺ホルモン類似体であるＴｒｉａｃ及び甲状腺ホルモン（Ｔ３またはＴ４）が、細胞レベル及び動物レベルでゼータ－グロビン遺伝子の発現を有意に活性化できることを初めて発見し、したがって、ゼータ－グロビン遺伝子発現を有意に活性化する最初類の低分子化合物になり、それは、α－サラセミアの治療に重要な役割を果たす。
【0013】
具体的には、Ｔｒｉａｃは米国のＳｅｌｌｅｃｋバイオテック株式会社から、Ｔ３（３，３’，５－Ｔｒｉｉｏｄｏ－Ｌ－ｔｈｙｒｏｎｉｎｅ）はＳｉｇｍａ会社から、Ｔ４（３，３’，５，５’－ｔｅｔｒａｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ）は生工生物工程（上海）股▲分▼有限公司から購入した。
【発明の効果】
【0014】
上記手段の採用により、本発明の有益な効果は以下のとおりである。
本発明は、甲状腺ホルモン及びその類似体を使用して、ゼータ－グロビン遺伝子の発現を有意に活性化でき、すなわち、α－サラセミア患者体内のサイレンシングされたゼータ－グロビン遺伝子を再活性化して赤血球の破壊を抑制することにより、α－サラセミアの治療薬を製造する方法となり、特に中間型α－サラセミア（ＨｂＨ病）及び重症型α－サラセミア（バートの胎児水腫症候群）における使用であり、これは、α－サラセミアの治療に経済的で安全かつ効果的な方法を提供し、広く普及して使用することができる。
本発明は、甲状腺ホルモン及びその類似体を使用して、ゼータ－グロビン遺伝子の発現を有意に活性化でき、すなわち、α－サラセミア患者体内のサイレンシングされたゼータ－グロビン遺伝子を再活性化して赤血球の破壊を抑制することにより、α－サラセミアの治療薬を製造する方法となり、特に中間型α－サラセミア（ＨｂＨ病）及び重症型α－サラセミア（バートの胎児水腫症候群）における使用であり、これは、α－サラセミアの治療に経済的で安全かつ効果的な方法を提供し、広く普及して使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】本発明の実施例１におけるヒトＫ５６２細胞分化プロセスにおける各遺伝子の発現状況の概略図である（縦座標のＲｅｌａｔｉｖｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎは相対発現である）。
【図2】本発明の実施例２におけるゼブラフィッシュ胚のＴｒｉａｃ、Ｔ３及びＴ４で処理した後のゼータ－グロビン遺伝子（ｈｂａｅ５）の発現状況の概略図である。
【図3】本発明の実施例３におけるゼブラフィッシュ胚のＴｒｉａｃ、Ｔ３及びＴ４で処理した後の各遺伝子の発現状況の概略図（縦座標のＲｅｌａｔｉｖｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎは相対発現である）。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本発明は、α－サラセミアの治療薬の製造における甲状腺ホルモン及びその類似体の使用を提供する。
【0017】
実験材料：
Ｋ５６２細胞を１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ）を含む１６４０培地で培養し、ヘミン（Ｈｅｍｉｎ）を０．２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液に溶解し、Ｋ５６２細胞の作業濃度を処理して２０μｍｏｌ／Ｌにし、Ｔｒｉａｃ、Ｔ３、及びＴ４を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、Ｋ５６２細胞の作業濃度を処理して２０μｍｏｌ／Ｌにし、ゼブラフィッシュ胚の作業濃度を処理して５μｍｏｌ／Ｌにする。
Ｋ５６２細胞を１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ）を含む１６４０培地で培養し、ヘミン（Ｈｅｍｉｎ）を０．２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液に溶解し、Ｋ５６２細胞の作業濃度を処理して２０μｍｏｌ／Ｌにし、Ｔｒｉａｃ、Ｔ３、及びＴ４を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、Ｋ５６２細胞の作業濃度を処理して２０μｍｏｌ／Ｌにし、ゼブラフィッシュ胚の作業濃度を処理して５μｍｏｌ／Ｌにする。
【0018】
以下で実施例を参照しながら本発明をさらに説明する。
【0019】
実施例１：
Ｋ５６２細胞では、Ｔｒｉａｃがゼータ－グロビン遺伝子（ＨＢＺ）の発現を有意に活性化するプロセスは以下のとおりである。
Ｋ５６２細胞では、Ｔｒｉａｃがゼータ－グロビン遺伝子（ＨＢＺ）の発現を有意に活性化するプロセスは以下のとおりである。
【0020】
Ｋ５６２細胞の分化中、それをそれぞれｈｅｍｉｎまたはｈｅｍｉｎ＋Ｔｒｉａｃで７２時間処理した後、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞を収集し、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを抽出し、次に、逆転写キット（ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ、ＴＯＹＯＢＯ）を使用してｃＤＮＡを合成し、最後に、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）試薬を使用して、定量的ＰＣＲを使用して遺伝子発現レベルを検出した。
【0021】
定量的ＰＣＲ反応系は以下のとおりである。
２×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ５ｕｌ
Ｆ－Ｐｒｉｍｅｒ（１０μｍｏｌ／Ｌ） ０．６ｕｌ
Ｒ－Ｐｒｉｍｅｒ（１０μｍｏｌ／Ｌ） ０．６ｕｌ
ｃＤＮＡ １ｕｌ
ｄｄＨ２Ｏ ２．８ｕｌ
Ｔｏｔａｌ ｖｏｌｕｍｅ １０ｕｌ
２×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ５ｕｌ
Ｆ－Ｐｒｉｍｅｒ（１０μｍｏｌ／Ｌ） ０．６ｕｌ
Ｒ－Ｐｒｉｍｅｒ（１０μｍｏｌ／Ｌ） ０．６ｕｌ
ｃＤＮＡ １ｕｌ
ｄｄＨ２Ｏ ２．８ｕｌ
Ｔｏｔａｌ ｖｏｌｕｍｅ １０ｕｌ
【0022】
定量的ＰＣＲ反応条件は以下のとおりである。
ホットスタート：９５℃、１０分。
変性：９５℃、１０秒。
アニール・伸長：６０℃、３０秒。
４０サイクル。
溶解曲線分析。
ホットスタート：９５℃、１０分。
変性：９５℃、１０秒。
アニール・伸長：６０℃、３０秒。
４０サイクル。
溶解曲線分析。
【0023】
図１に示すように、Ｋ５６２をＴｒｉａｃで７２時間処理した後、定量的ＰＣＲの結果は、ゼータ－グロビン遺伝子（ＨＢＺ）の発現が５０．９倍アップレギュレートされたことを示した。
【0024】
実際、ヒトゼータ－グロビン遺伝子（ＨＢＺ）（ＮＭ＿００５３３２．３）の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）は以下の通りである。
ＡＴＧＴＣＴＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＣＴＧＡＧＡＧＧＡＣＣＡＴＣＡＴＴＧＴＧＴＣＣＡＴＧＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡＴＣＴＣＣＡＣＧ
ＣＡＧＧＣＣＧＡＣＡＣＣＡＴＣＧＧＣＡＣＣＧＡＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＡＧＧＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡＧＣＣＡＣＣＣＧＣＡＧＡＣＣ
ＡＡＧＡＣＣＴＡＣＴＴＣＣＣＧＣＡＣＴＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＣＣＣＧＧＧＧＴＣＣＧＣＧＣＡＧＴＴＧＣＧＣＧＣＧＣＡＣＧＧＣ
ＴＣＣＡＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＣＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＧＣＧＧＴＧＡＡＧＡＧＣＡＴＣＧＡＣＧＡＣＡＴＣＧＧＣＧＧＣＧＣＣ
ＣＴＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧＡＧＣＧＡＧＣＴＧＣＡＣＧＣＣＴＡＣＡＴＣＣＴＧＣＧＣＧＴＧＧＡＣＣＣＧＧＴＣＡＡＣＴＴＣＡＡＧ
ＣＴＣＣＴＧＴＣＣＣＡＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＧＴＣＡＣＣＣＴＧＧＣＣＧＣＧＣＧＣＴＴＣＣＣＣＧＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＧＧＣＣ
ＧＡＧＧＣＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＣＧＧＴＣＧＴＡＴＣＣＴＣＴＧＴＣＣＴＧＡＣＣＧＡＧＡＡＧ
ＴＡＣＣＧＣＴＧＡ。
ＡＴＧＴＣＴＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＣＴＧＡＧＡＧＧＡＣＣＡＴＣＡＴＴＧＴＧＴＣＣＡＴＧＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡＴＣＴＣＣＡＣＧ
ＣＡＧＧＣＣＧＡＣＡＣＣＡＴＣＧＧＣＡＣＣＧＡＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＡＧＧＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡＧＣＣＡＣＣＣＧＣＡＧＡＣＣ
ＡＡＧＡＣＣＴＡＣＴＴＣＣＣＧＣＡＣＴＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＣＣＣＧＧＧＧＴＣＣＧＣＧＣＡＧＴＴＧＣＧＣＧＣＧＣＡＣＧＧＣ
ＴＣＣＡＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＣＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＧＣＧＧＴＧＡＡＧＡＧＣＡＴＣＧＡＣＧＡＣＡＴＣＧＧＣＧＧＣＧＣＣ
ＣＴＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧＡＧＣＧＡＧＣＴＧＣＡＣＧＣＣＴＡＣＡＴＣＣＴＧＣＧＣＧＴＧＧＡＣＣＣＧＧＴＣＡＡＣＴＴＣＡＡＧ
ＣＴＣＣＴＧＴＣＣＣＡＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＧＴＣＡＣＣＣＴＧＧＣＣＧＣＧＣＧＣＴＴＣＣＣＣＧＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＧＧＣＣ
ＧＡＧＧＣＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＣＧＧＴＣＧＴＡＴＣＣＴＣＴＧＴＣＣＴＧＡＣＣＧＡＧＡＡＧ
ＴＡＣＣＧＣＴＧＡ。
【0025】
そのうち、Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲプライマーは次のとおりである。
Ｈｕｍａｎ－β－ａｃｔｉｎ－Ｆ ＣＣＡＡＣＣＧＣＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）
Ｈｕｍａｎ－β－ａｃｔｉｎ－Ｒ ＣＣＡＧＡＧＧＣＧＴＡＣＡＧＧＧＡＴＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）
Ｈｕｍａｎ－ＨＢＡ１／２－Ｆ ＡＡＧＧＴＣＧＧＣＧＣＧＣＡＣＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）
Ｈｕｍａｎ－ＨＢＡ１／２－Ｒ ＣＴＣＡＧＧＴＣＧＡＡＧＴＧＣＧＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）
Ｈｕｍａｎ－ＨＢＺ－Ｆ ＧＧＡＣＣＡＴＣＡＴＴＧＴＧＴＣＣＡＴＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）
Ｈｕｍａｎ－ＨＢＺ－Ｒ ＧＧＧＡＡＧＴＡＧＧＴＣＴＴＧＧＴＣＴＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７）
Ｈｕｍａｎ－ＨＢＥ１－Ｆ ＴＧＣＡＴＧＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＡＡＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８）
Ｈｕｍａｎ－ＨＢＥ１－Ｒ ＣＧＡＣＡＧＣＡＧＡＣＡＣＣＡＧＣＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９）
Ｈｕｍａｎ－ＨＢＧ１／２－Ｆ ＡＧＣＡＣＣＴＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＡＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０）
Ｈｕｍａｎ－ＨＢＧ１／２－Ｒ ＡＡＡＣＧＧＴＣＡＣＣＡＧＣＡＣＡＴＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１）
Ｈｕｍａｎ－ＨＢＤ－Ｆ ＧＡＴＧＣＡＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２）
Ｈｕｍａｎ－ＨＢＤ－Ｒ ＧＧＧＴＴＧＣＣＣＡＴＡＡＣＡＧＣＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３）
Ｈｕｍａｎ－ＨＢＢ－Ｆ ＧＣＡＣＧＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＡＡＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４）
Ｈｕｍａｎ－ＨＢＢ－Ｒ ＣＡＣＴＧＧＴＧＧＧＧＴＧＡＡＴＴＣＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５）。
Ｈｕｍａｎ－β－ａｃｔｉｎ－Ｆ ＣＣＡＡＣＣＧＣＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）
Ｈｕｍａｎ－β－ａｃｔｉｎ－Ｒ ＣＣＡＧＡＧＧＣＧＴＡＣＡＧＧＧＡＴＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）
Ｈｕｍａｎ－ＨＢＡ１／２－Ｆ ＡＡＧＧＴＣＧＧＣＧＣＧＣＡＣＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）
Ｈｕｍａｎ－ＨＢＡ１／２－Ｒ ＣＴＣＡＧＧＴＣＧＡＡＧＴＧＣＧＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）
Ｈｕｍａｎ－ＨＢＺ－Ｆ ＧＧＡＣＣＡＴＣＡＴＴＧＴＧＴＣＣＡＴＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）
Ｈｕｍａｎ－ＨＢＺ－Ｒ ＧＧＧＡＡＧＴＡＧＧＴＣＴＴＧＧＴＣＴＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７）
Ｈｕｍａｎ－ＨＢＥ１－Ｆ ＴＧＣＡＴＧＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＡＡＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８）
Ｈｕｍａｎ－ＨＢＥ１－Ｒ ＣＧＡＣＡＧＣＡＧＡＣＡＣＣＡＧＣＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９）
Ｈｕｍａｎ－ＨＢＧ１／２－Ｆ ＡＧＣＡＣＣＴＧＧＡＴＧＡＴＣＴＣＡＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０）
Ｈｕｍａｎ－ＨＢＧ１／２－Ｒ ＡＡＡＣＧＧＴＣＡＣＣＡＧＣＡＣＡＴＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１）
Ｈｕｍａｎ－ＨＢＤ－Ｆ ＧＡＴＧＣＡＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２）
Ｈｕｍａｎ－ＨＢＤ－Ｒ ＧＧＧＴＴＧＣＣＣＡＴＡＡＣＡＧＣＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３）
Ｈｕｍａｎ－ＨＢＢ－Ｆ ＧＣＡＣＧＴＧＧＡＴＣＣＴＧＡＧＡＡＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４）
Ｈｕｍａｎ－ＨＢＢ－Ｒ ＣＡＣＴＧＧＴＧＧＧＧＴＧＡＡＴＴＣＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５）。
【0026】
実施例２：
ゼブラフィッシュ胚発育中、ゼブラフィッシュ胚の受精後９６時間でＴｒｉａｃ、Ｔ３、及びＴ４の添加を開始し、Ｔｒｉａｃ、Ｔ３、及びＴ４でそれぞれ２４時間処理した後、４％パラホルムアルデヒドで胚を固定し、全胚ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによりゼータ－グロビン遺伝子（ｈｂａｅ５）の発現を検出した。
ゼブラフィッシュ胚発育中、ゼブラフィッシュ胚の受精後９６時間でＴｒｉａｃ、Ｔ３、及びＴ４の添加を開始し、Ｔｒｉａｃ、Ｔ３、及びＴ４でそれぞれ２４時間処理した後、４％パラホルムアルデヒドで胚を固定し、全胚ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによりゼータ－グロビン遺伝子（ｈｂａｅ５）の発現を検出した。
【0027】
図２に示すように、ゼブラフィッシュ胚では、Ｔｒｉａｃ、Ｔ３、及びＴ４がゼータ－グロビン遺伝子（ｈｂａｅ５）の発現を有意に活性化し、つまり、有意にアップレギュレートした。
【0028】
実施例３：
ゼブラフィッシュ胚発育中、ゼブラフィッシュ胚の受精後９６時間でＴｒｉａｃ、Ｔ３、及びＴ４の添加を開始し、２４時間処理した後に胚を収集し、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを抽出し、次に、逆転写キット（ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ、ＴＯＹＯＢＯ）を使用してｃＤＮＡを合成し、最後に、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）試薬を使用して、定量的ＰＣＲを使用して遺伝子発現レベルを検出した。
ゼブラフィッシュ胚発育中、ゼブラフィッシュ胚の受精後９６時間でＴｒｉａｃ、Ｔ３、及びＴ４の添加を開始し、２４時間処理した後に胚を収集し、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを抽出し、次に、逆転写キット（ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ、ＴＯＹＯＢＯ）を使用してｃＤＮＡを合成し、最後に、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）試薬を使用して、定量的ＰＣＲを使用して遺伝子発現レベルを検出した。
【0029】
定量的ＰＣＲ反応系は以下のとおりである。
２×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ５ｕｌ
Ｆ－Ｐｒｉｍｅｒ（１０μｍｏｌ／Ｌ） ０．６ｕｌ
Ｒ－Ｐｒｉｍｅｒ（１０μｍｏｌ／Ｌ） ０．６ｕｌ
ｃＤＮＡ １ｕｌ
ｄｄＨ２Ｏ ２．８ｕｌ
Ｔｏｔａｌ ｖｏｌｕｍｅ １０ｕｌ
２×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ５ｕｌ
Ｆ－Ｐｒｉｍｅｒ（１０μｍｏｌ／Ｌ） ０．６ｕｌ
Ｒ－Ｐｒｉｍｅｒ（１０μｍｏｌ／Ｌ） ０．６ｕｌ
ｃＤＮＡ １ｕｌ
ｄｄＨ２Ｏ ２．８ｕｌ
Ｔｏｔａｌ ｖｏｌｕｍｅ １０ｕｌ
【0030】
定量的ＰＣＲ反応条件は以下のとおりである。
ホットスタート：９５℃、１０分。
変性：９５℃、１０秒。
アニール・伸長：６０℃、３０秒。
４０サイクル。
溶解曲線分析。
ホットスタート：９５℃、１０分。
変性：９５℃、１０秒。
アニール・伸長：６０℃、３０秒。
４０サイクル。
溶解曲線分析。
【0031】
図３に示すように、ゼブラフィッシュ胚において、Ｔｒｉａｃ、Ｔ３とＴ４はゼータ－グロビン遺伝子（ｈｂａｅ５）の発現を有意に活性化し、すなわち定量的ＰＣＲの結果は、ゼータ－グロビン遺伝子（ｈｂａｅ５）の発現がそれぞれ７６倍、３１倍、及び４１倍アップレギュレートされたことを示した。
【0032】
実際、ゼブラフィッシュゼータ－グロビン遺伝子（ｈｂａｅ５）（ＮＭ＿００１３２６７０１．１）の配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６）は以下の通りである。
ＡＴＧＡＧＴＣＴＴＴＣＴＧＣＴＡＡＡＧＡＣＡＡＧＧＣＣＧＣＣＧＴＧＡＧＧＧＧＣＴＴＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡＴＴＧＣＣＣＣＡ
ＡＡＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＡＴＴＧＧＴＡＡＣＧＡＧＧＣＧＴＴＴＴＣＣＡＧＡＴＴＧＣＴＴＴＴＧＧＴＧＴＡＣＣＣＴＣＡＧＡＣＣ
ＡＡＧＡＣＣＴＡＣＴＴＣＴＣＣＣＡＣＴＧＧＡＡＣＧＡＴＣＴＧＧＣＣＣＣＣＧＧＣＴＣＴＣＣＣＴＣＴＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＡＧ
ＧＧＡＡＡＧＡＡＧＡＴＣＧＴＣＧＧＴＧＧＡＣＴＣＧＧＴＣＴＧＧＣＴＧＴＴＧＡＴＡＡＡＡＴＣＧＡＣＧＡＣＣＴＴＴＴＣＡＡＣ
ＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＴＴＧＣＡＣＧＣＣＴＴＴＣＡＧＣＴＧＡＧＡＧＴＣＧＡＣＣＣＴＧＣＴＡＡＣＴＴＣ
ＡＡＧＣＴＣＣＴＧＴＣＴＣＡＣＴＧＴＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＣＴＴＣＣＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＣＡＣＣ
ＧＣＴＧＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴＧＧＣＣＡＴＣＧＡＣＡＡＧＴＴＣＣＴＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧＧＣＴＴＴＧＧＣＴＣＴＧＴＣＴＧＡＣ
ＡＡＡＴＡＴＣＧＴＴＡＡ。
ＡＴＧＡＧＴＣＴＴＴＣＴＧＣＴＡＡＡＧＡＣＡＡＧＧＣＣＧＣＣＧＴＧＡＧＧＧＧＣＴＴＣＴＧＧＧＣＣＡＡＧＡＴＴＧＣＣＣＣＡ
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ＡＡＧＣＴＣＣＴＧＴＣＴＣＡＣＴＧＴＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＣＴＴＣＣＣＴＧＡＴＧＡＣＴＴＣＡＣＣ
ＧＣＴＧＡＧＧＴＣＣＡＴＣＴＧＧＣＣＡＴＣＧＡＣＡＡＧＴＴＣＣＴＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧＧＣＴＴＴＧＧＣＴＣＴＧＴＣＴＧＡＣ
ＡＡＡＴＡＴＣＧＴＴＡＡ。
【0033】
そのうち、Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲプライマーは次のとおりである。
Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ－β－ａｃｔｉｎ－Ｆ ＴＧＣＴＧＴＴＴＴＣＣＣＣＴＣＣＡＴＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７）
Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ－β－ａｃｔｉｎ－Ｒ ＴＴＣＴＧＴＣＣＣＡＴＧＣＣＡＡＣＣＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８）
Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ－ｈｂａｅ１－Ｆ ＣＴＧＡＧＧＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＡＡＴＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９）
Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ－ｈｂａｅ１－Ｒ ＧＡＡＣＡＡＡＧＴＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０）
Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ－ｈｂａｅ３－Ｆ ＧＣＴＧＡＴＧＧＡＴＧＡＣＣＴＧＡＡＧＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１）
Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ－ｈｂａｅ３－Ｒ ＣＴＣＡＧＧＡＧＴＧＡＡＧＴＣＧＴＣＴＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）
Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ－ｈｂａｅ５－Ｆ ＴＧＣＴＧＡＡＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＴＴＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３）
Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ－ｈｂａｅ５－Ｒ ＧＧＡＡＣＴＴＧＴＣＧＡＴＧＧＣＣＡＧＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４）
Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ－ｈｂｂｅ１－Ｆ ＴＣＣＡＣＧＴＡＧＡＴＣＣＣＧＡＣＡＡＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５）
Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ－ｈｂｂｅ１－Ｒ ＴＡＣＴＧＴＣＴＴＣＣＣＡＧＡＧＣＧＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６）
Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ－ｈｂｂｅ２－Ｆ ＧＧＡＣＴＧＧＡＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＡＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７）
Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ－ｈｂｂｅ２－Ｒ ＧＡＧＧＣＡＡＴＣＡＣＧＡＴＴＧＴＣＡＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２８）
Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ－ｈｂｂｅ３－Ｆ ＴＴＧＴＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２９）
Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ－ｈｂｂｅ３－Ｒ ＡＣＧＧＡＴＡＧＡＣＧＡＣＣＡＡＧＣＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０）。
Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ－β－ａｃｔｉｎ－Ｆ ＴＧＣＴＧＴＴＴＴＣＣＣＣＴＣＣＡＴＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７）
Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ－β－ａｃｔｉｎ－Ｒ ＴＴＣＴＧＴＣＣＣＡＴＧＣＣＡＡＣＣＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８）
Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ－ｈｂａｅ１－Ｆ ＣＴＧＡＧＧＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＡＡＴＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９）
Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ－ｈｂａｅ１－Ｒ ＧＡＡＣＡＡＡＧＴＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０）
Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ－ｈｂａｅ３－Ｆ ＧＣＴＧＡＴＧＧＡＴＧＡＣＣＴＧＡＡＧＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１）
Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ－ｈｂａｅ３－Ｒ ＣＴＣＡＧＧＡＧＴＧＡＡＧＴＣＧＴＣＴＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）
Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ－ｈｂａｅ５－Ｆ ＴＧＣＴＧＡＡＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＴＴＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３）
Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ－ｈｂａｅ５－Ｒ ＧＧＡＡＣＴＴＧＴＣＧＡＴＧＧＣＣＡＧＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４）
Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ－ｈｂｂｅ１－Ｆ ＴＣＣＡＣＧＴＡＧＡＴＣＣＣＧＡＣＡＡＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５）
Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ－ｈｂｂｅ１－Ｒ ＴＡＣＴＧＴＣＴＴＣＣＣＡＧＡＧＣＧＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６）
Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ－ｈｂｂｅ２－Ｆ ＧＧＡＣＴＧＧＡＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＡＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７）
Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ－ｈｂｂｅ２－Ｒ ＧＡＧＧＣＡＡＴＣＡＣＧＡＴＴＧＴＣＡＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２８）
Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ－ｈｂｂｅ３－Ｆ ＴＴＧＴＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２９）
Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ－ｈｂｂｅ３－Ｒ ＡＣＧＧＡＴＡＧＡＣＧＡＣＣＡＡＧＣＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０）。
【0034】
上記の実施例の説明は、当業者が本発明を理解して使用するのに便利なものである。当業者には、創造的な労働なしでこれらの実施例に対する様々な変更を容易に行うことができ、本明細書に記載の一般原理を他の実施例に適用できることが明らかである。したがって、本発明は上記実施例に限定されるものではない。本発明の範囲から逸脱することなく、本発明の原理に従って当業者によってなされた改良及び変更は、すべて本発明の保護範囲内にあるはずである。
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】