▶ シージェイ チェイルジェダン コーポレーションの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-26
(45)【発行日】2024-09-03
(54)【発明の名称】プトレシン生産微生物及びそれを用いたプトレシン生産方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20240827BHJP
C12P 13/00 20060101ALI20240827BHJP
C12N 9/10 20060101ALN20240827BHJP
C12N 15/54 20060101ALN20240827BHJP
C12R 1/15 20060101ALN20240827BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21 ZNA
C12P13/00
C12N9/10
C12N15/54
C12R1:15
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2023510305
(86)(22)【出願日】2021-03-19
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-09-06
(86)【国際出願番号】 KR2021003408
(87)【国際公開番号】W WO2022035011
(87)【国際公開日】2022-02-17
【審査請求日】2023-02-10
(31)【優先権主張番号】10-2020-0101894
(32)【優先日】2020-08-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【微生物の受託番号】KCCM KCCM12774P
(73)【特許権者】
【識別番号】513178894
【氏名又は名称】シージェイ チェイルジェダン コーポレーション
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100151301
【弁理士】
【氏名又は名称】戸崎 富哉
(74)【代理人】
【識別番号】100152308
【弁理士】
【氏名又は名称】中 正道
(74)【代理人】
【識別番号】100201558
【弁理士】
【氏名又は名称】亀井 恵二郎
(72)【発明者】
【氏名】イ、ジェホン
(72)【発明者】
【氏名】イ、ギョン ミン
(72)【発明者】
【氏名】ペ、ヒョン－ジョン
【審査官】松原 寛子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１８－５２０６８７（ＪＰ，Ａ）
【文献】Microbial Cell Factories，2018年，doi:10.1186/s12934-018-0940-9
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００
Ｃ１２Ｐ １３／００
Ｃ１２Ｎ ９／１０
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
コリネバクテリウム属菌株由来のＮ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）及び大腸菌由来アセチルオルニチンデアセチラーゼ（Ａｃｅｔｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ，ａｒｇＥ）の活性が導入された、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項2】
前記コリネバクテリウム属菌株由来のＮ－アセチルトランスフェラーゼは、配列番号１またはこれと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項3】
前記大腸菌由来アセチルオルニチンデアセチラーゼは、配列番号３またはこれと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項4】
前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム属菌株由来の二重機能性オルニチンアセチルトランスフェラーゼ／Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ／Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ， ａｒｇＪ）の活性が、改変されていない微生物と比較して弱化されたものである、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項5】
前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である、請求項１に記載のプトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項6】
コリネバクテリウム属菌株由来のＮ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）及び大腸菌由来アセチルオルニチンデアセチラーゼ（Ａｃｅｔｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ，ａｒｇＥ）の活性が導入された、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階を含む、プトレシン生産方法。
【請求項7】
前記方法は、培養された培地または微生物からプトレシンを回収する段階をさらに含む、請求項６に記載のプトレシン生産方法。
【請求項8】
前記コリネバクテリウム属菌株由来のＮ－アセチルトランスフェラーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項６に記載のプトレシン生産方法。
【請求項9】
前記大腸菌由来アセチルオルニチンデアセチラーゼは、配列番号３のアミノ酸配列を有する、請求項６に記載のプトレシン生産方法。
【請求項10】
コリネバクテリウム属菌株由来のＮ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）及び大腸菌由来アセチルオルニチンデアセチラーゼ（Ａｃｅｔｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ， ａｒｇＥ）の活性が導入された、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を含む、プトレシン生産用組成物。
【請求項11】
前記コリネバクテリウム属菌株由来のＮ－アセチルトランスフェラーゼは、配列番号１またはこれと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載のプトレシン生産用組成物。
【請求項12】
前記大腸菌由来アセチルオルニチンデアセチラーゼは、配列番号３またはこれと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載のプトレシン生産用組成物。
【請求項13】
コリネバクテリウム属菌株由来のＮ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）及び大腸菌由来アセチルオルニチンデアセチラーゼ（Ａｃｅｔｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ，ａｒｇＥ）の活性が導入された、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物のプトレシン生産への使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、プトレシン生産微生物及び当該微生物を用いたプトレシン生産方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ナイロンなどの原料であるプトレシン（ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ）は、主に石油化合物を原料物質とする化学的方法で生産され、具体的には、アクリロニトリル（ａｃｒｙｌｏｎｉｔｒｉｌｅ）にシアン化水素を添加してスクシノニトリル（ｓｕｃｃｉｎｏｎｉｔｒｉｌｅ）を作った後、水素化過程を経てプトレシンが生産される。このような化学的工程は、効率性及び経済性を有したが、環境にやさしくない短所があるところ、最近強化している環境規制とともに生物基盤経路を通じた代替物質生産の必要性が台頭している。
【0003】
これに関連し、大腸菌とコリネバクテリウム属微生物を形質転換してプトレシンを高濃度で生産する方法が公開されている（Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２４１： １３， ３１２９－３１３５， １９９６， 国際特許公開Ｗ００６／００５６０３；国際特許公開 ＷＯ０９／１２５９２４； Ｑｉａｎ ＺＤ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． １０４： ４， ６５１－６６２， ２００９； Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ８８： ４， ８５９－８６８， ２０１０； Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９１： １７－３０， ２０１１）。それ以外にも、微生物を用いてプトレシンを生産するための多様な方法が知られている（ＵＳ１３／９９２２４２， ＵＳ１４／３７２０００， ＵＳ１４／３７３２６５， ＥＰ ２２３６６１３ Ｂ１， ＵＳ ８４９７０９８ Ｂ２）。
【0004】
プトレシン生合成経路に関連したタンパク質中、二重機能性オルニチンアセチルトランスフェラーゼ／Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ／Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）であるａｒｇＪは、アセチルＣｏＡ（ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ）とＮ－アセチルオルニチン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）の２種類の物質に対して転換反応を行うことができる酵素であり、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（Ｌ－グルタミン酸Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、ｇｌｕｔａｍａｔｅ Ｎ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）とＮ－アセチルグルタミン酸シンターゼの機能をいずれも有する。ａｒｇＪは、一つの酵素が２個の酵素反応を媒介することにより副産物を低減し、プトレシン生成に対する負担を減らすことができる。しかし、ａｒｇＪは、オルニチンのような中間代謝物質によりその活性が阻害され得（Ｓａｋａｎｙａｎ Ｖ， Ｐｅｔｒｏｓｙａｎ Ｐ， Ｌｅｃｏｃｑ Ｍ， Ｂｏｙｅｎ Ａ， Ｌｅｇｒａｉｎ Ｃ， Ｄｅｍａｒｅｚ Ｍ， Ｈａｌｌｅｔ Ｊ， Ｇｌａｎｓｄｏｒｆｆ Ｎ： Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｅｔｙｌ ｃｙｃｌｅ ｏｆ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ： ｅｎｚｙｍｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｓｔｅｐｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｐａｔｈｗａｙ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９６， １４２：９９－１０８．）、これによりプトレシン生合成効率が低くなり得る。
【0005】
一方、コリネバクテリウム・グルタミカムに存在するＮ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）は、アセチルＣｏＡとグルタミン酸の存在下にＮ－アセチル－Ｌ－グルタミン酸の生成能を有する。しかし、上記Ｎ－アセチルトランスフェラーゼは、ａｒｇ比９．４３倍高い非活性を有することが報告されている（Ａ ｎｏｖｅｌ ｔｙｐｅ ｏｆ Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｓｔｅｐ ｏｆ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ．’’ＢＭＣ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２０１３（１４） ｐ７１３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】国際特許公開ＷＯ０６／００５６０３
【文献】国際特許公開 ＷＯ０９／１２５９２４
【文献】ＵＳ１３／９９２２４２
【文献】ＵＳ１４／３７２０００
【文献】ＵＳ１４／３７３２６５
【文献】ＥＰ ２２３６６１３ Ｂ１
【文献】ＵＳ ８４９７０９８ Ｂ２
【文献】米国登録特許ＵＳ７６６２９４３Ｂ２
【文献】米国登録特許ＵＳ１０５８４３３８Ｂ２
【文献】米国登録特許ＵＳ１０２７３４９１Ｂ２
【文献】大韓民国公開特許第２０１２－００６４０４６号
【文献】大韓民国公開特許第１０－２０１３－００８２４７８号
【文献】国際公開特許ＷＯ２００９／１２５９９２
【文献】国際公開特許ＷＯ２００９／０９６６８９
【文献】米国登録特許ＵＳ ９８９０４０４
【文献】米国登録特許ＵＳ ９６７７０９９
【非特許文献】
【0007】
【文献】Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２４１： １３， ３１２９－３１３５， １９９６
【文献】Ｑｉａｎ ＺＤ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． １０４： ４， ６５１－６６２， ２００９
【文献】Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ８８： ４， ８５９－８６８， ２０１０
【文献】Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９１： １７－３０， ２０１１
【文献】Ｓａｋａｎｙａｎ Ｖ， Ｐｅｔｒｏｓｙａｎ Ｐ， Ｌｅｃｏｃｑ Ｍ， Ｂｏｙｅｎ Ａ， Ｌｅｇｒａｉｎ Ｃ， Ｄｅｍａｒｅｚ Ｍ， Ｈａｌｌｅｔ Ｊ， Ｇｌａｎｓｄｏｒｆｆ Ｎ： Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｅｔｙｌ ｃｙｃｌｅ ｏｆ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ： ｅｎｚｙｍｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｓｔｅｐｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｐａｔｈｗａｙ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９６， １４２：９９－１０８．
【文献】Ａ ｎｏｖｅｌ ｔｙｐｅ ｏｆ Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｓｔｅｐ ｏｆ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ．’’ＢＭＣ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２０１３（１４） ｐ７１３
【文献】Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ， ９．５０－９．５１， １１．７－１１．８
【文献】Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ （１９８８） ［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５］： ２４４４
【文献】Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １６： ２７６－２７７
【文献】Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３－４５３
【文献】Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２： ３８７ （１９８４）
【文献】Ａｔｓｃｈｕｌ， ［Ｓ．］ ［Ｆ．，］ ［ＥＴ ＡＬ， Ｊ ＭＯＬＥＣ ＢＩＯＬ ２１５］： ４０３ （１９９０）
【文献】Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ， Ｍａｒｔｉｎ Ｊ． Ｂｉｓｈｏｐ， ［ＥＤ．，］ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９４
【文献】［ＣＡＲＩＬＬＯ ＥＴＡ／．］（１９８８） ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８： １０７３
【文献】Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ （１９８１） ２：４８２
【文献】Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ， ｅｄｓ．， Ａｔｌａｓ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， ｐｐ． ３５３－３５８ （１９７９）
【文献】Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ（１９８６） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４： ６７４５
【文献】Ｓｉｔｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ． Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ２０１０， Ｖｏｌ． ２． １－１６
【文献】Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２０１２
【文献】Ｎａｋａｓｈｉｍａ Ｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ． Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ． ２０１４；１５（２）：２７７３－２７９３
【文献】Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ－ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｒｅｖｉｅｗｓ － Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｖｏｌ． １（１） １９８６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明者らは、微生物においてプトレシンの生産を増加させるために鋭意努力した結果、コリネバクテリウム属微生物にコリネバクテリウム属菌株由来のＮ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）及び大腸菌由来アセチルオルニチンデアセチラーゼ（Ａｃｅｔｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ）の活性を導入した時、プトレシンの生産が増加することを確認することにより、本出願を完成した。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本出願は、コリネバクテリウム属菌株由来のＮ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）及び大腸菌由来アセチルオルニチンデアセチラーゼ（Ａｃｅｔｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ，ａｒｇＥ）の活性が導入された、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供することである。
【0010】
本出願は、コリネバクテリウム属菌株由来のＮ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）及び大腸菌由来アセチルオルニチンデアセチラーゼ（Ａｃｅｔｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ，ａｒｇＥ）の活性が導入された、ブトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階を含む、プトレシン生産方法を提供することである。
【0011】
本出願は、コリネバクテリウム属菌株由来のＮ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）及び大腸菌由来アセチルオルニチンデアセチラーゼ（Ａｃｅｔｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ，ａｒｇＥ）の活性が導入された、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を含む、プトレシン生産用組成物を提供することである。
【発明の効果】
【0012】
本出願のコリネバクテリウム属菌株由来のＮ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）及び大腸菌由来アセチルオルニチンデアセチラーゼ（Ａｃｅｔｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ，ａｒｇＥ）の活性が導入された、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を培養する場合、既存の非変形微生物に比べて高収率のプトレシン生産が可能である。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】Ａ．コリネバクテリウム属微生物のプトレシン及びオルニチン生合成経路、Ｂ．大腸菌のプトレシン及びオルニチン生合成経路を示した模式図である。
【図2】コリネＮｃｇ１２６４４強化及び大腸菌ａｒｇＥの導入を通じたプトレシン及びオルニチン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物のプトレシン及びオルニチン生合成経路を示した模式図である。
【発明を実施するための形態】
【0014】
これを具体的に説明すると、次の通りである。一方、本出願で開示されたそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの異なる説明及び実施形態にも適用することができる。すなわち、本出願で開示された様々な要素の全ての組み合わせが、本出願の範囲に属する。また、以下に記載される具体的な記述により本出願の範囲が制限されるとは見られない。
【0015】
本出願の一つの様態は、コリネバクテリウム属菌株由来のＮ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）及び大腸菌由来アセチルオルニチンデアセチラーゼ（Ａｃｅｔｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ，ａｒｇＥ）の活性が導入されたプトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
【0016】
本出願において、用語「プトレシン（ｐｕｔｒｅｓｃｉｎｅ）」は、ＮＨ２（ＣＨ２）４ＮＨ２の分子式を有する４個の炭素で構成されたジアミン（ｄｉａｍｉｎｅ）有機化合物であり、１，４－ジアミノブタン（１，４－ｄｉａｍｉｎｏｂｕｔａｎｅ）またはブタンジアミン（ｂｕｔａｎｅｄｉａｍｉｎｅ）とも命名される。
【0017】
本出願において、用語「Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）」は、アセチルＣｏＡ（ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ）からアリールアミン（ａｒｙｌａｍｉｎｅ）、アリールヒドロキシルアミン（ａｒｙｌｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ）及びアリールヒドラジン（ａｒｙｌｈｙｄｒａｚｉｎｅ）でアセチル基の伝達を触媒する酵素（ＥＣ２．３．１．５）である。上記酵素は、ＣｏＡなしにアリールアミン間のアセチル転移を触媒することができ、アセチルＣｏＡとグルタミン酸の存在の下にＮ－アセチル－Ｌ－グルタミン酸の生成能を有することができる。上記酵素は、芳香族アミンに対して広い特異性を有することが知られている。
【0018】
本出願において、上記Ｎ－アセチルトランスフェラーゼは、ＧＮＡＴ（ＧＣＮ５－ｒｅｌａｔｅｄ Ｎ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ）ファミリーに属するものであってもよいが、これに制限されない。
【0019】
上記Ｎ－アセチルトランスフェラーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を有したり、配列番号１のアミノ酸配列からなるか、または、配列番号１で記載されるアミノ酸配列を含むものであってもよいが、これに制限されない。上記配列番号１の配列は、公知のデータベースであるＮＣＢＩジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）からその配列を確認することができる。
【0020】
具体的には、上記Ｎ－アセチルトランスフェラーゼは、配列番号１及び／又は上記配列番号１と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）または同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有するアミノ酸配列を有することができる。また、このような相同性または同一性を有し、上記Ｎ－アセチルトランスフェラーゼに対応する機能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有するＮ－アセチルトランスフェラーゼも本出願の範囲内に含まれることは自明である。即ち、本出願において「特定配列番号で記載されたアミノ酸配列を含むタンパク質またはポリペプチド」、「特定配列番号で記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質またはポリペプチド」と記載されているとしても、当該配列番号のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一あるいは対応する活性を有する場合であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質も本出願で用いられることは自明である。例えば、「配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド」は、これと同一あるいは対応する活性を有する場合であれば、「配列番号１のアミノ酸配列として含むポリペプチド」に属し得ることは自明である。
【0021】
本出願において、上記Ｎ－アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、コリネバクテリウム属菌株に由来するものであってもよく、具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）に由来するものであってもよいが、Ｎ－アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を発現できるコリネバクテリウム属菌株であれば、特に制限されない。上記遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含み、より具体的には、配列番号２の塩基配列を含んでもよいが、これに制限されない。上記配列番号２の塩基配列は、公知のデータベースであるジェンバンクから得ることができ、Ｎｃｇ１２６４４と命名され得る。上記配列番号２の塩基配列を含む遺伝子は、配列番号２の塩基配列を含むポリヌクレオチド、配列番号２の塩基配列を有する遺伝子またはポリヌクレオチド、配列番号２の塩基配列からなる遺伝子またはポリヌクレオチドと混用され得る。
【0022】
本出願において、用語「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単位体（ｍｏｎｏｍｅｒ）が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（ｐｏｌｙｍｅｒ）であり、一定の長さ以上のＤＮＡまたはＲＮＡ鎖であり、より具体的には、上記変異体をコードするポリヌクレオチド断片を意味する。上記ポリヌクレオチドは、機能をすることができるポリヌクレオチド集合体の場合、遺伝子として記載され得る。本出願においてポリヌクレオチドと遺伝子は混用され得る。
【0023】
具体的には、本出願のポリヌクレオチドは、コドンの縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）により、または上記ポリペプチドを発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮し、ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させない範囲内でコード領域に多様な変形がなされてもよい。具体的には、配列番号１のアミノ酸配列からなるＮ－アセチルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列であれば、制限なく含み得る。
【0024】
また、公知の遺伝子配列から調製され得るプローブ、例えば、上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下にハイブリット化し、配列番号１のアミノ酸配列からなるＮ－アセチルトランスフェラーゼをコードする配列であれば、制限なく含まれる。上記「ストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は、当該技術分野によく知られている。例えば、相同性または同一性が高い遺伝子同士、４０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、より具体的には９７％以上、特に具体的には９９％以上の相同性または同一性を有する遺伝子同士をハイブリダイズし、それより相同性または同一性が低い遺伝子同士をハイブリダイズしない条件、またはサザンハイブリダイゼーション（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、具体的には、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度で１回、具体的には、２回～３回洗浄する条件を列挙することができる。
【0025】
ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することを要求する。用語「相補的」は、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するのに使用される。例えば、ＤＮＡに関し、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本出願は、また、実質的に類似の核酸配列だけでなく、配列全体に相補的な単離された核酸断片を含んでもよい。
【0026】
具体的には、相同性または同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーション段階を含むハイブリダイゼーション条件を用い、上述の条件を用いて探知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃または６５℃であってもよいが、これに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節され得る。
【0027】
ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切なストリンジェンシーは、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当技術分野においてよく知られている （Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ，９．５０－９．５１，１１．７－１１．８を参照）。
【0028】
本出願において、用語「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」または「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は二つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列相互間の類似の程度を意味し、百分率で表示されることができる。用語、相同性及び同一性はしばしば相互交換的に利用できる。
【0029】
保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準配列アルゴリズムにより決定され、使用されるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に使用されてもよい。実質的に、相同性を有したり（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）または同一の（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）配列は、一般に、配列の全体または一部分と中程度または高いストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）でハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドにおける一般のコドンまたはコドン縮退性を考慮したコドンを含有するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションも含まれることが自明である。
【0030】
任意の二つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ （１９８８） ［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５］： ２４４４でのようなデフォルトパラメータを用いて「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの既知のコンピュータアルゴリズムを用いて決定されることができる。または、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ， Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １６： ２７６－２７７）（バージョン５．０．０または以降のバージョン）で行われるような、ニードルマン－ウンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３－４５３）を使用して決定されてもよい（ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２： ３８７ （１９８４））， ＢＬＡＳＴＰ， ＢＬＡＳＴＮ， ＦＡＳＴＡ （Ａｔｓｃｈｕｌ， ［Ｓ．］ ［Ｆ．，］ ［ＥＴ ＡＬ， Ｊ ＭＯＬＥＣ ＢＩＯＬ ２１５］： ４０３ （１９９０）； Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ， Ｍａｒｔｉｎ Ｊ． Ｂｉｓｈｏｐ， ［ＥＤ．，］ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９４， 及び［ＣＡＲＩＬＬＯ ＥＴＡ／．］（１９８８） ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８： １０７３を含む）。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴ、またはＣｌｕｓｔａｌＷを用いて相同性、類似性または同一性を決定することができる。
【0031】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性、類似性または同一性は、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ （１９８１） ２：４８２において公知となっているように、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９７０）， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ４８：４４３のようなＧＡＰコンピュータプログラムを用いて配列情報を比較することにより決定されてもよい。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列中、より短いものにおける記号の総数であり、類似の配列された記号（即ち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を除した値と定義することができる。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、（１）二進法比較マトリックス（同一性のために１、そして非同一性のために０の値を含有する）及びＳｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ， ｅｄｓ．， Ａｔｌａｓ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， ｐｐ． ３５３－３５８ （１９７９）により開示されているように、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ（１９８６） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４： ６７４５の加重比較マトリックス（またはＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）；（２）各ギャップのための３．０のペナルティ及び各ギャップにおいて各記号のための追加の０．１０ペナルティ（またはギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）；及び（３）末端ギャップのための無ペナルティを含むことができる。
【0032】
本出願の一例として、本出願の変異体は、フィトエン不飽和化酵素（Ｐｈｙｔｏｅｎｅ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）活性を有することができる。また、本出願の変異体は、フィトエン不飽和化酵素活性を有する野生型ポリペプチドに比べてＩＭＰ（５’－ｉｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）生産能を増加させる活性を有することができる。
【0033】
本出願において、用語「フィトエン不飽和化酵素（Ｐｈｙｔｏｅｎｅ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）」は、ポリトランス（ｐｏｌｙ－ｔｒａｎｓ）経路と呼ばれる生化学的経路において無色の１５－シス－フィトエン（１５－ｃｉｓ－ｐｈｙｔｏｅｎｅ）を鮮やかな赤色のリコペン（ｌｙｃｏｐｅｎｅ）に転換させるポリペプチドである。具体的には、本出願のフィトエン不飽和化酵素は、フィトエンデサチュラーゼまたはＣｒｔＩと混用され得る。本出願において上記フィトエン不飽和化酵素は、公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋからその配列が得られる。具体的には、ｃｒｔＩによりコードされるフィトエン不飽和化酵素活性を有するポリペプチドであってもよいが、これに制限されない。
【0034】
本出願において、用語「アセチルオルニチンデアセチラーゼ（Ａｃｅｔｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ）」は、アセチルオルニチンの加水分解を媒介して酢酸とオルニチンが生成される反応を媒介する酵素（ＥＣ３．５．１．１６）である。本出願において、上記アセチルオルニチンデアセチラーゼはａｒｇＥであってもよいが、これに制限されない。
上記ａｒｇＥは、配列番号３のアミノ酸配列を有してもよく、配列番号３のアミノ酸配列からなっってもよく、配列番号３で記載されるアミノ酸配列を含むものであってもよいが、これに制限されない。上記配列番号３の配列は、公知のデータベースであるＮＣＢＩジェンバンクからその配列を確認することができる。
上記ａｒｇＥは、配列番号３のアミノ酸配列を有してもよく、配列番号３のアミノ酸配列からなっってもよく、配列番号３で記載されるアミノ酸配列を含むものであってもよいが、これに制限されない。上記配列番号３の配列は、公知のデータベースであるＮＣＢＩジェンバンクからその配列を確認することができる。
【0035】
本出願において上記ａｒｇＥをコードする遺伝子は、バクテリアに由来するものであってもよく、具体的には、大腸菌に由来するものであってもよいが、ａｒｇＥをコードする遺伝子を発現できる菌株であれば、特に制限されない。上記遺伝子は、配列番号３のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含んでもよく、より具体的には、配列番号４の塩基配列を含んでもよいが、これに制限されない。上記配列番号４の塩基配列は、公知のデータベースであるジェンバンクから得ることができる。
【0036】
本出願において、上記プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム属菌株由来の二重機能性オルニチンアセチルトランスフェラーゼ／Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ／Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ， ａｒｇＪ）の活性が弱化したものであってもよいが、これに制限されない。
【0037】
本出願において、用語「二重機能性オルニチンアセチルトランスフェラーゼ／Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ／Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）」は、アセチルＣｏＡ（ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ）とＮ－アセチルオルニチン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）の２種類の物質に対して転換反応を行うことができる酵素であり、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ［Ｌ－グルタミン酸Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、ｇｌｕｔａｍａｔｅ Ｎ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＥＣ２．３．１．３５）］とＮ－アセチルグルタミン酸シンターゼ（ＥＣ２．３．１．１）の機能をいずれも有する。上記オルニチンアセチルトランスフェラーゼは、Ｎ２－アセチル－Ｌ－オルニチン（Ｎ２－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）及びＬ－グルタミン酸（Ｌ－ｇｌｕｔａｍａｔｅ）をＬ－オルニチン（Ｌ－ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）及びＮ－アセチル－Ｌ－グルタミン酸（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｇｌｕｔａｍａｔｅ）に転換し、上記Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼは、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）及びアセチル－ＣｏＡからＮ－アセチルグルタミン酸（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ）の生成を触媒する。本出願において、上記二重機能性オルニチンアセチルトランスフェラーゼ／Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼはａｒｇＪであってもよいが、これに制限されない。
【0038】
上記ａｒｇＪは、一つの酵素が２つの酵素反応を媒介することにより副産物を低減し、プトレシン生成に対する負担を減らすことができる。しかし、ａｒｇＪは、オルニチンのような中間代謝物質によりその活性が阻害され、これによりプトレシン生合成効率が低くなる。
【0039】
上記ａｒｇＪは、配列番号５または配列番号７のアミノ酸配列を有してもよく、配列番号５または配列番号７のアミノ酸配列からなっってもよく、あるいは、配列番号５または配列番号７で記載されるアミノ酸配列を含むものであってもよいが、これに制限されない。上記配列番号５または配列番号７の配列は、公知のデータベースであるＮＣＢＩジェンバンクからその配列を確認することができる。
【0040】
本出願において上記ａｒｇＪをコードする遺伝子は、コリネバクテリウム属菌株に由来するものであってもよく、具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）に由来するものであってもよいが、ａｒｇＪをコードする遺伝子を発現できるコリネバクテリウム属菌株であれば、特に制限されない。具体的には、上記配列番号５のアミノ酸配列をコードする遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来であってもよいが、これに制限されない。上記遺伝子は、配列番号５のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含んでもよく、より具体的には、配列番号６の塩基配列を含んでもよくが、これに制限されない。上記配列番号６の塩基配列は公知のデータベースであるジェンバンクから得ることができる。
【0041】
また、上記配列番号７のアミノ酸配列をコードする遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来であってもよいが、これに制限されない。上記遺伝子は、配列番号７のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含んでもよく、より具体的には、配列番号８の塩基配列を含んでもよいが、これに制限されない。上記配列番号８の塩基配列は公知のデータベースであるジェンバンクから得ることができる。
【0042】
本出願において、用語「プトレシン生産能を有する微生物」とは、自然にプトレシンの生産能を有している微生物またはプトレシンの生産能のない親株に、プトレシンの生産能が付与された微生物を意味する。具体的には、上記微生物は、コリネバクテリウム属菌株由来のＮ－アセチルトランスフェラーゼ及び大腸菌由来ａｒｇＥの活性が導入されたプトレシンを生産する微生物であってもよいが、これに制限されない。
【0043】
具体的には、上記「プトレシンを生産する微生物」は、野生型微生物や天然または人為的に遺伝的変形が起こった微生物をいずれも含む。より具体的には、外部遺伝子が挿入されたり、内在的遺伝子の活性が強化または弱化されるなどの原因により特定の機序が弱化または強化された微生物であり、目的とするプトレシンの生産のために遺伝的変異が起きたりプトレシン生産活性を強化させた微生物であってもよい。
【0044】
本出願において、用語活性の「導入」は、微生物が本来有していなかった遺伝子がその微生物内で発現されることにより特定タンパク質の活性を示すようになることまたは当該タンパク質の内在的活性または変形前の活性に比べて増加または向上した活性を示すようになることを意味する。例えば、特定タンパク質をコードするポリヌクレオチドが微生物内の染色体に導入されたり、特定タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが微生物内に導入され、その活性が示されるものであってもよい。
【0045】
本出願において、用語ポリペプチド活性の「強化」は、ポリペプチドの活性が内在的活性に比べて増加することを意味する。上記強化は、活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、上方制御（ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）、過発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、増加（ｉｎｃｒｅａｓｅ）などの用語と混用され得る。ここで、活性化、強化、上方制御、過発現、増加は、本来有していなかった活性を示すようになること、もしくは内在的活性または変形前の活性に比べて向上した活性を示すようになることをいずれも含み得る。上記「内在的活性」は、天然または人為的要因による遺伝的変異により形質が変化した場合、形質変化前の親株または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性を意味する。これは、「変形前の活性」と混用され得る。ポリペプチドの活性が内在的活性に比べて「強化」、「上方制御」「過発現」または「増加」するということは、形質変化前の親株または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性及び／又は濃度（発現量）に比べて向上したことを意味する。
【0046】
上記強化は、外来のポリペプチドを導入したり、内在的なポリペプチドの活性強化及び／又は濃度（発現量）を通じて達成できる。上記ポリペプチドの活性の強化有無は、当該ポリペプチドの活性程度、発現量または該当ポリペプチドから排出される産物の量の増加から確認することができる。
【0047】
上記ポリペプチドの活性の強化は、当該分野によく知られている多様な方法の適用が可能であり、目的ポリペプチドの活性を変形前の微生物より強化させることができる限り、制限されない。具体的には、分子生物学の通常の方法である当業界の通常の技術者によく知られている遺伝子工学及び／又はタンパク質工学を用いたものであってもよいが、これに制限されない。（例えば、Ｓｉｔｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ． Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ２０１０， Ｖｏｌ． ２． １－１６， Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２０１２など）。
【0048】
具体的には、本出願のポリペプチドの強化は
１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加；
２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子発現調節領域を活性が強力な配列で交換；
３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形；
４）ポリペプチド活性が強化するように、上記ポリペプチドのアミノ酸配列の変形；
５）ポリペプチド活性が強化するように、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変形（例えば、ポリペプチドの活性が強化するように変形されたポリペプチドをコードするように、上記ポリペプチド遺伝子のポリヌクレオチド配列の変形）；
６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリペプチドまたはこれをコードする外来ポリヌクレオチドの導入；
７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化；
８）ポリペプチドの三次構造を分析し、露出部位を選択して変形したり化学的に修飾；または
９）上記１）～８）から選択された２以上の組み合わせであってもよいが、これに特に制限されるものではない。
１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加；
２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子発現調節領域を活性が強力な配列で交換；
３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形；
４）ポリペプチド活性が強化するように、上記ポリペプチドのアミノ酸配列の変形；
５）ポリペプチド活性が強化するように、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変形（例えば、ポリペプチドの活性が強化するように変形されたポリペプチドをコードするように、上記ポリペプチド遺伝子のポリヌクレオチド配列の変形）；
６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリペプチドまたはこれをコードする外来ポリヌクレオチドの導入；
７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化；
８）ポリペプチドの三次構造を分析し、露出部位を選択して変形したり化学的に修飾；または
９）上記１）～８）から選択された２以上の組み合わせであってもよいが、これに特に制限されるものではない。
【0049】
より具体的には、
上記１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加は、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主とは関係なく複製され、機能できるベクターの宿主細胞内への導入により達成されるものであってもよい。または、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが宿主細胞内の染色体内に１コピーまたは２コピー以上の導入により達成されるものであってもよい。上記染色体内への導入は、宿主細胞内の染色体内に上記ポリヌクレオチドを挿入させることができるベクターが宿主細胞内に導入されることにより行われ得るが、これに制限されない。上記ベクターは、前述した通りである。
上記１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加は、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主とは関係なく複製され、機能できるベクターの宿主細胞内への導入により達成されるものであってもよい。または、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが宿主細胞内の染色体内に１コピーまたは２コピー以上の導入により達成されるものであってもよい。上記染色体内への導入は、宿主細胞内の染色体内に上記ポリヌクレオチドを挿入させることができるベクターが宿主細胞内に導入されることにより行われ得るが、これに制限されない。上記ベクターは、前述した通りである。
【0050】
上記２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子発現調節領域（または発現調節配列）を活性が強力な配列への交換は、例えば、上記発現調節領域の活性をより強化するように欠失、挿入、非保存的若しくは保存的置換またはこれらの組合わせにより配列上の変異発生、またはより強い活性を有する配列への交換であってもよい。上記発現調節領域は、特にこれに制限されないが、プロモーター、オペレータ配列、リボソーム結合部位をコードする配列、そして転写及び解読の終結を調節する配列などを含んでもよい。一例として、本来のプロモーターを強力なプロモーターで交換させるものであってもよいが、これに制限されない。
【0051】
公知となった強力なプロモーターの例としては、ＣＪ１～ＣＪ７プロモーター（米国登録特許ＵＳ ７６６２９４３ Ｂ２）、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ＳＰＬ７プロモーター、ＳＰＬ１３（ｓｍ３）プロモーター（米国登録特許ＵＳ １０５８４３３８ Ｂ２）、０２プロモーター（米国登録特許ＵＳ １０２７３４９１ Ｂ２）、ｔｋｔプロモーター、ｙｃｃＡプロモーターなどがあるが、これに制限されない。
【0052】
上記３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列変形は、例えば、内在的開始コドンに比べてポリペプチド発現率がさらに高い他の開始コドンをコードする塩基配列で置換されるものであってもよいが、これに制限されない。
【0053】
上記４）及び５）のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の変形は、ポリペプチドの活性を強化するように、上記ポリペプチドのアミノ酸配列または上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的若しくは保存的置換またはこれらの組合わせにより配列上の変異発生、またはより強い活性を有するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列または活性が増加するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列への交換であってもよいが、これに限定されるものではない。上記交換は、具体的には、相同組換えによりポリヌクレオチドを染色体内に挿入することにより行われてもよいが、これに制限されない。この時に用いられるベクターは、染色体挿入有無を確認するための選別マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）をさらに含んでもよい。上記選別マーカーは、前述した通りである。
【0054】
上記６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリヌクレオチドの導入は、上記ポリペプチドと同一／類似した活性を示すポリペプチドをコードする外来ポリヌクレオチドの宿主細胞内への導入であってもよい。上記外来ポリヌクレオチドは、上記ポリペプチドと同一／類似した活性を示す限り、その由来や配列に制限がない。上記導入に用いられる方法は、公知となった形質転換方法を当業者が適切に選択して行うことができ、宿主細胞内で上記導入されたポリヌクレオチドが発現することにより、ポリペプチドが生成され、その活性が増加することができる。
【0055】
上記７）ポリペプチドをコードするボリヌクレオチドのコドン最適化は、内在ポリヌクレオチドが宿主細胞内で転写または翻訳が増加するようにコドン最適化したものであってもよく、または外来ポリヌクレオチドが宿主細胞内で最適化された転写、翻訳がなされるようにこのコドンを最適化したものであってもよい。
【0056】
上記８）ポリペプチドの三次構造を分析し、露出部位を選択して変形したり化学的に修飾することは、例えば、分析しようとするポリペプチドの配列情報を既知のタンパク質の配列情報が格納されたデータベースと比較することにより配列の類似性程度に応じて鋳型タンパク質の候補を決定し、これに基づいて構造を確認し、変形したり化学的に修飾する露出部位を選択して変形または修飾するものであってもよい。
【0057】
このようなポリペプチド活性の強化は、対応するポリペプチドの活性または濃度発現量が野生型や変形前の微生物菌株で発現されたポリペプチドの活性または濃度を基準として増加してもよく、当該ポリペプチドから生産される産物の量が増加するものであってもよいが、これに制限されるものではない。
【0058】
本出願の微生物においてポリヌクレオチドの一部または全体の変形は、（ａ）微生物内の染色体挿入用ベクターを用いた相同組換えまたは遺伝子ハサミ（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ， ｅ．ｇ．， ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）を用いたゲノム編集及び／又は（ｂ）紫外線及び放射線などのような光及び／又は化学物質の処理により誘導されてもよいが、これに制限されない。上記遺伝子の一部または全体の変形方法には、ＤＮＡ組換え技術による方法が含まれ得る。例えば、目的遺伝子と相同性があるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列またはベクターを上記微生物に注入して相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が起こるようにして遺伝子の一部または全体の欠損がなされてもよい。上記注入されるヌクレオチド配列またはベクターは、優性選別マーカーを含んでもよいが、これに制限されるものではない。
【0059】
このようなタンパク質の活性強化は、対応するタンパク質の活性または濃度が野生型や変形前の微生物菌株で発現されたタンパク質の活性または濃度を基準として増加するものであってもよいが、これに制限されるものではない。本出願において、用語「変形前の菌株」または「変形前の微生物」は、微生物に自然に発生し得る突然変異を含む菌株を除外するものではなく、天然型菌株自体であるか、人為的要因による遺伝的変異により形質が変化する前の菌株を意味する。本出願において、上記形質変化は、コリネバクテリウム属菌株由来のＮ－アセチルトランスフェラーゼ及び大腸菌由来ａｒｇＥ活性の導入であってもよい。上記「変形前の菌株」または「変形前の微生物」は、「非変異菌株」、「非変形菌株」、「非変異微生物」、「非変形微生物」または「基準微生物」と混用され得る。
【0060】
本出願において、上記基準微生物は、プトレシンを生産する微生物であれば、特に制限されず、野生型に比べてプトレシン生産能が強化された変異菌株も制限なく含まれる。その例として、野生型コリネバクテリウム・グルタミカム菌株ＡＴＣＣ１３０３２菌株、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９菌株またはプトレシン生合成経路を強化するために、上記菌株に一つ以上の遺伝的変形が追加された菌株が含まれてもよいが、これに制限されない。
【0061】
上記一つ以上の遺伝的変形は、例えば、プトレシン生合成経路の遺伝子を強化させる；プトレシンオペロン（ｏｐｅｒｏｎ）の活性を過発現させる；プトレシンの前駆体の供給及び効率を改善する；プトレシンの排出を向上させる；競争経路の遺伝子、プトレシンオペロンの方向性経路の調節因子、プトレシン流入遺伝子、プトレシン流入及び分解遺伝子の活性を弱化させる；ことから選択されるいずれか一つ以上の遺伝的変形であってもよいが、これに制限されない。
【0062】
上記プトレシン生合成経路の遺伝子を強化させる遺伝的変形は、例えば、野生型大腸菌Ｗ３１１０菌株由来のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）をコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）を染色体内に導入するものであってもよいが、これに制限されない。
【0063】
上記プトレシンオペロンの活性を過発現させる遺伝的変形は、例えば、グルタミン酸においてオルニチン合成に関与する酵素をコードするａｒｇＣＪＢＤ遺伝子群のプロモーターを置換するものであってもよいが、これに制限されない。
【0064】
上記プトレシンの排出を向上させてもよく；競争経路の遺伝子、プトレシンオペロンの方向性経路の調節因子、プトレシン流入遺伝子、プトレシン流入及び分解遺伝子の活性を弱化させる遺伝的変形は、例えば、染色体内のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ａｒｇＦ）及びグルタミン酸の排出に関与するグルタミン酸エクスポータ（ＮＣｇ１１２２１）をコードする遺伝子を欠損させてもよく；ヒストンアセチルトランスフェラーゼＨＰＡ２及び関連アセチルトランスフェラーゼ（ｈｉｓｔｏｎｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ＨＰＡ２ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）と定義されるＮＣｇ１１４６９タンパク質の活性を欠失させるものであってもよいが、これに制限されない。
【0065】
上記一つ以上の遺伝的変形が追加された菌株は、例えば、ＡＴＣＣ１３０３２において染色体内のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ａｒｇＦ）及びグルタミン酸の排出に関与するグルタミン酸エクスポータ（ＮＣｇ１１２２１）をコードする遺伝子が欠損し、野生型大腸菌Ｗ３１１０菌株由来のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）をコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）が染色体内に導入され、グルタミン酸においてオルニチン合成に関与する酵素をコードしているａｒｇＣＪＢＤ遺伝子群のプロモーターが置換されてプトレシン生産能を有するＣＣ０１－００６４菌株（大韓民国公開特許第２０１２－００６４０４６号、ＫＣＣＭ１１１３８Ｐ）、ＣＣ０１－００６４菌株にヒストンアセチルトランスフェラーゼＨＰＡ２及び関連アセチルトランスフェラーゼ（ｈｉｓｔｏｎｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ＨＰＡ２ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）と定義されるＮＣｇ１１４６９タンパク質の活性が欠失したＣＣ０１－０１６３菌株（大韓民国公開特許第１０－２０１３－００８２４７８号、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ）であってもよいが、これに制限されない。
【0066】
また、上記プトレシンを生産する微生物は、コリネバクテリウム属菌株由来ａｒｇＪの活性が弱化したものであってもよいが、これに制限されない。
【0067】
本出願において、用語タンパク質の「弱化」は、内在的活性に比べて活性が減少したりまたは活性がないことをいずれも含む概念である。上記弱化は、不活性化（ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、欠乏（ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、下方制御（ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）、減少（ｄｅｃｒｅａｓｅ）、低下（ｒｅｄｕｃｅ）、減衰（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）などの用語と混用され得る。
【0068】
上記弱化は、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの変異などによりポリペプチド自体の活性が本来微生物が有しているポリペプチドの活性に比べて減少または除去された場合、それをコードするポリヌクレオチドの遺伝子の発現阻害またはポリペプチドへの翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）の阻害などにより細胞内で全体的なポリペプチド活性程度及び／又は濃度（発現量）が天然型菌株に比べて低い場合、上記ポリヌクレオチドの発現が全く行われていない場合、及び／又はポリヌクレオチドが発現されてもポリペプチドの活性がない場合も含み得る。上記「内在的活性」は、天然または人為的要因による遺伝的変異により形質が変化した場合、形質変化前の親株、野生型または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性を意味する。これは、「変形前の活性」と混用され得る。ポリペプチドの活性が内在的活性に比べて「不活性化、欠乏、減少、下方制御、低下、減衰」するということは、形質変化前の親株または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性に比べて低下したことを意味する。
【0069】
このようなポリペプチドの活性の弱化は、当業界に知られた任意の方法により行われ得るが、これに制限されるものではなく、当該分野においてよく知られている様々な方法の適用により達成されることができる（例えば、Ｎａｋａｓｈｉｍａ Ｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ． Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ． ２０１４；１５（２）：２７７３－２７９３， Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２０１２など）。
【0070】
本出願において、上記弱化の対象になるタンパク質、即ち、目的タンパク質はａｒｇＪであってもよいが、これに制限されない。
【0071】
１）ポリペプチドをコードする遺伝子の全部または一部の欠損；
２）ポリペプチドをコードする遺伝子の発現が減少するように発現調節領域（または発現調節配列）の変形；
３）ポリペプチドの活性が除去または弱化するように、上記ポリペプチドを構成するアミノ酸配列の変形（例えば、アミノ酸配列上の１以上のアミノ酸の削除／置換／付加）；
４）ポリペプチドの活性が除去または弱化するように、上記ポリペプチドをコードする遺伝子配列の変形（例えば、ポリペプチドの活性が除去または弱化するように変形されたポリペプチドをコードするように、上記ポリペプチド遺伝子の核酸塩基配列上の１以上の核酸塩基の削除／置換／付加）；
５）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形；
６）ポリペプチドをコードする上記遺伝子の転写体に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）の導入；
７）リボソーム（ｒｉｂｏｓｏｍｅ）の付着が不可能な２次構造物を形成させるためにポリペプチドをコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列の前端にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列の付加；
８）ポリペプチドをコードする遺伝子配列のＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）の３’末端に反対方向に転写されるプロモーターの付加（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ＲＴＥ）；または
９）上記１）～８）から選択された２以上の組み合わせであってもよいが、これについて、特に制限されるものではない。
２）ポリペプチドをコードする遺伝子の発現が減少するように発現調節領域（または発現調節配列）の変形；
３）ポリペプチドの活性が除去または弱化するように、上記ポリペプチドを構成するアミノ酸配列の変形（例えば、アミノ酸配列上の１以上のアミノ酸の削除／置換／付加）；
４）ポリペプチドの活性が除去または弱化するように、上記ポリペプチドをコードする遺伝子配列の変形（例えば、ポリペプチドの活性が除去または弱化するように変形されたポリペプチドをコードするように、上記ポリペプチド遺伝子の核酸塩基配列上の１以上の核酸塩基の削除／置換／付加）；
５）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形；
６）ポリペプチドをコードする上記遺伝子の転写体に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）の導入；
７）リボソーム（ｒｉｂｏｓｏｍｅ）の付着が不可能な２次構造物を形成させるためにポリペプチドをコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列の前端にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列の付加；
８）ポリペプチドをコードする遺伝子配列のＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）の３’末端に反対方向に転写されるプロモーターの付加（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ＲＴＥ）；または
９）上記１）～８）から選択された２以上の組み合わせであってもよいが、これについて、特に制限されるものではない。
【0072】
例えば、
上記１）ポリペプチドをコードする上記遺伝子の一部または全体の欠損は、染色体内の内在的目的ポリペブチドをコードするポリヌクレオチド全体の除去、一部のヌクレオチドが欠失したポリヌクレオチドへの交換、またはマーカー遺伝子への交換であってもよい。
上記１）ポリペプチドをコードする上記遺伝子の一部または全体の欠損は、染色体内の内在的目的ポリペブチドをコードするポリヌクレオチド全体の除去、一部のヌクレオチドが欠失したポリヌクレオチドへの交換、またはマーカー遺伝子への交換であってもよい。
【0073】
また、上記２）発現調節領域（または発現調節配列）の変形は、欠失、挿入、非保存的若しくは保存的置換またはこれらの組合わせにより発現調節領域（または発現調節配列）上の変異発生、またはより弱い活性を有する配列への交換であってもよい。上記発現調節領域には、プロモーター、オペレータ配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と解読の終結を調節する配列を含むが、これに限定されるものではない。
【0074】
また、上記３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列変形は、例えば、内在的開始コドンに比べてポリペプチド発現率がさらに低い他の開始コドンをコードする塩基配列で置換されるものであってもよいが、これに制限されない。
【0075】
また、上記４）及び５）のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の変形は、ポリペプチドの活性を弱化するように、上記ポリペプチドのアミノ酸配列または上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的若しくは保存的置換またはこれらの組合わせにより配列上の変異発生、またはより弱い活性を有するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列または活性がないように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列への交換であってもよいが、これに限定されるものではない。例えば、ポリヌクレオチド配列内の変異を導入して終結コドンを形成させることにより、遺伝子の発現を阻害または弱化させることができるが、これに制限されない。
【0076】
上記６）ポリペプチドをコードする上記遺伝子の転写体に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）の導入は、例えば、文献［Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ－ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｒｅｖｉｅｗｓ － Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｖｏｌ． １（１） １９８６］を参考にすることができる。
【0077】
上記７）リボソーム（ｒｉｂｏｓｏｍｅ）の付着が不可能な２次構造物を形成させるためにポリペプチドをコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列の前端にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列の付加は、ｍＲＮＡ翻訳を不可能にしたり速度を低下させることであってもよい。
【0078】
上記８）ポリペプチドをコードする遺伝子配列のＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）の３’末端に反対方向に転写されるプロモーターの付加（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＲＴＥ）は、上記ポリペプチドをコードする遺伝子の転写体に相補的なアンチセンスヌクレオチドを作って活性を弱化することであってもよい。
【0079】
上記プトレシンを生産する微生物は、前述した方法でコリネバクテリウム属菌株由来のＮ－アセチルトランスフェラーゼ及び大腸菌由来ａｒｇＥの活性が導入され、プトレシンを生産できる微生物であれば、いずれも可能である。本出願の目的上、上記プトレシンを生産する微生物は、前述した方法でコリネバクテリウム属菌株由来のＮ－アセチルトランスフェラーゼ及び大腸菌由来ａｒｇＥの活性が導入され、コリネバクテリウム属菌株由来ａｒｇＪの活性が弱化し、目的とするプトレシン生産能が増加したことを特徴とし、遺伝的に変形された微生物または組換え微生物であってもよいが、これに制限されない。本出願において上記「プトレシンを生産する微生物」は、「プトレシン生産微生物」、「プトレシン生産能を有する微生物」と混用され得る。
【0080】
上記微生物は、例えば、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｂａｃｔｅｒ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属及びブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物であってもよく、具体的には、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属微生物であってもよい。
【0081】
より具体的には、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・クルジラクチス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ）、コリネバクテリウム・デセルティ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｓｅｒｔｉ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・シングラレ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｎｇｕｌａｒｅ）、コリネバクテリウム・ハロトレランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、コリネバクテリウム・ストリアツム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒｉａｔｕｍ）、コリネバクテリウム・ポルティソリ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｌｌｕｔｉｓｏｌｉ）、コリネバクテリウム・イミタンスＣｘｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｉｔａｎｓ）、コリネバクテリウム・テスツディノリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｅｓｔｕｄｉｎｏｒｉｓ）またはコリネバクテリウム・フラベッセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）などであってもよく、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）であってもよく、コリネバクテリウム属に属する微生物は制限なく含まれてもよい。
【0082】
本出願のもう一つの様態は、コリネバクテリウム属菌株由来のＮ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）及び大腸菌由来アセチルオルニチンデアセチラーゼ（Ａｃｅｔｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ， ａｒｇＥ）の活性が導入された、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階を含む、プトレシン生産方法を提供する。上記Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、アセチルオルニチンデアセチラーゼ、プトレシン及び微生物については、前述した通りである。
【0083】
上記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム属菌株由来の二重機能性オルニチンアセチルトランスフェラーゼ／Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ／Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ａｒｇＪ）の活性が弱化したものであってもよいが、これに制限されない。
【0084】
上記方法は、当業界に公知となった最適化された培養条件及び酵素活性条件で当業者により容易に決定され得る。具体的には、上記微生物を培養する段階は、特にこれに制限されないが、公知となった回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などにより行われてもよい。この時、培養条件は、特にこれに制限されないが、塩基性化合物（例：水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例：リン酸または硫酸）を用いて適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５～９、具体的にはｐＨ６～８、最も具体的にはｐＨ６．８）を調節することができ、酸素または酸素含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持できる。培養温度は２０～４５℃、具体的には２５～４０℃を維持でき、約１０～１６０時間培養できるが、これに制限されるものではない。上記培養により生産されたプトレシンは、培地中に分泌されたり細胞内に残留する。
【0085】
併せて、用いられる培養用培地は、炭素供給源としては、糖及び炭水化物（例：グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラッセ、澱粉及びセルロース）、油脂及び脂肪（例：大豆油、ひまわり種子油、ピーナッツ油及びココナッツ油）、脂肪酸（例：パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸）、アルコール（例：グリセロール及びエタノール）及び有機酸（例：酢酸）などを個別に用いたり、または混合して用いられるが、これに制限されない。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物（例：ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆粕粉及びウレア）、または無機化合物（例：硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム）などを個別に用いたり、または混合して用いられるが、これに制限されない。リン供給源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに対応するナトリウム含有塩などを個別に用いたり、または混合して用いられるが、これに制限されない。また、培地にはその他の金属塩（例：硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）、アミノ酸及びビタミンのような必須成長促進物質を含んでもよい。
【0086】
上記方法は、上記培養段階後に培養された培地または微生物からプトレシンを回収する段階をさらに含んでもよいが、これに制限されない。
【0087】
上記培養段階で生産されたプトレシンを回収する方法は、培養方法により当該分野において公知となった適合した方法を用いて培養液から目的とするプトレシンを収集することができる。例えば、遠心分離、濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びＨＰＬＣなどが用いられ、当該分野において公知となった適合した方法を用いて培地または微生物から目的とするプトレシンを回収することができる。
【0088】
上記プトレシンを回収する方法は、精製段階をさらに含んでもよい。上記精製段階は、当該分野において公知となった適合した方法を用いて行われてもよい。従って、上記回収されるプトレシンは、精製された形態またはプトレシンを含有した微生物発酵液であってもよい。
【0089】
本出願のもう一つの様態は、コリネバクテリウム属菌株由来のＮ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）及び大腸菌由来アセチルオルニチンデアセチラーゼ（Ａｃｅｔｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ，ａｒｇＥ）の活性が導入された、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を含む、プトレシン生産用組成物を提供する。
【0090】
上記Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、アセチルオルニチンデアセチラーゼ、プトレシン及び微生物については、前述した通りである。
【0091】
上記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム属菌株由来の二重機能性オルニチンアセチルトランスフェラーゼ／Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ／Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ，ａｒｇＪ）の活性が弱化したものであってもよいが、これに制限されない。
【0092】
上記プトレシン生産用組成物は、上記コリネバクテリウム属菌株由来のＮ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）及び大腸菌由来アセチルオルニチンデアセチラーゼ（Ａｃｅｔｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ，ａｒｇＥ）の活性を導入させる構成を制限なく含んでもよい。具体的には、上記構成は、導入された宿主細胞で作動可能に連結された遺伝子を発現させるようにベクター内に含まれた形態であってもよく、これについては、前述した通りである。
【0093】
上記コリネバクテリウム属菌株由来のＮ－アセチルトランスフェラーゼは、配列番号１またはこれと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよく、これについては、前述した通りである。
【0094】
上記大腸菌由来アセチルオルニチンデアセチラーゼは、配列番号３またはこれと９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよく、これについては、前述した通りである。
【0095】
本出願の組成物は、アミノ酸生産用組成物に通常使用される任意の適切な賦形剤をさらに含むことができ、そのような賦形剤は、例えば、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤または等張化剤等であってもよいが、これに限定されるものではない。
【0096】
本出願の他の一つの様態は、プトレシン生産のための、組成物の使用を提供する。
【0097】
本出願の他の一つの様態は、コリネバクテリウム属菌株由来のＮ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）及び大腸菌由来アセチルオルニチンデアセチラーゼ（Ａｃｅｔｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ， ａｒｇＥ）の活性が導入された、プトレシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物のプトレシン生産への使用を提供する。
【0098】
以下、本出願を実験例を通じてより詳細に説明する。しかし、これら実施例は、本出願を例示的に説明するためのものであり、本出願の範囲がこれら実施例により制限されるものではなく、本出願の属する技術分野において通常の知識を有する者にとって明白なはずである。
【0099】
実施例１：コリネ由来ａｒｇＪ遺伝子強化菌株のプトレシン生産能の確認
１－１．ＡＴＣＣ１３０３２基盤プトレシン生産菌株のトランスポゾン遺伝子内へのＡＴＣＣ１３８６９由来ａｒｇＪ強化菌株の製作
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２基盤のプトレシン生産菌株においてコリネバクテリウム属菌株由来の二重機能性オルニチンアセチルトランスフェラーゼ／Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ／Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードするａｒｇＪ遺伝子を強化するために、ａｒｇＪ遺伝子を上記菌株のトランスポゾン遺伝子内に導入した。
１－１．ＡＴＣＣ１３０３２基盤プトレシン生産菌株のトランスポゾン遺伝子内へのＡＴＣＣ１３８６９由来ａｒｇＪ強化菌株の製作
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２基盤のプトレシン生産菌株においてコリネバクテリウム属菌株由来の二重機能性オルニチンアセチルトランスフェラーゼ／Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ／Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードするａｒｇＪ遺伝子を強化するために、ａｒｇＪ遺伝子を上記菌株のトランスポゾン遺伝子内に導入した。
【0100】
コリネバクテリウム属微生物のトランスポゾン遺伝子部位を用いて染色体内遺伝子導入を可能にする形質転換用ベクターとしてｐＤＺＴｎ（国際公開特許ＷＯ２００９／１２５９９２）を用い、プロモーターとしてコリネバクテリウム・グルタミカム由来ｌｙｓＣ－ａｓｄオペロン遺伝子のプロモーターを改良した１ｙｓＣＰ１プロモーター（国際公開特許ＷＯ２００９／０９６６８９、配列番号９）を用いた。
【0101】
具体的には、上記ｐＤＺＴｎベクターの製作過程は、次の通りである。トランスポゾン遺伝子を確保するために、ＮＩＨジェンバンク（ＮＩＨＧｅｎＢａｎｋ）からコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来の全体塩基配列中、トランスポゾン遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩ登録番号ＮＣ＿００３４５０、ＮＣｇ１１０２１）を確保し、これに基づいて２対のプライマー（表１、配列番号１０～１３）を合成した。
【0102】
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、下記配列番号１０～１３のプライマ一対を用いてＰＣＲを行った。ポリメラーゼは ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は、変性９６℃３０秒；アニーリング５８℃３０秒；及び重合反応７２℃１分を３０回繰り返した。
【0103】
【表1】
【0104】
その結果、ＰＣＲ結果物として約５００ｂｐのプロモーター部位を含むトランスポゾン遺伝子２対（Ｔｎ－Ａ、Ｔｎ－Ｂ）を得た。Ｔｎ－Ａ（配列番号１４）は、配列番号１０と１１をプライマーとして用いて増幅されたものであり、Ｔｎ－Ｂ（配列番号１５）は、配列番号１２と１３をプライマーとして用いて増幅されたものである。上記増幅産物をＢＤインフュージョンキット（Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ｋｉｔ，ＢＤ）を用いて予めＳａｌＩ制限酵素で処理したｐＤＺベクターにクローニングしてｐＤＺＴｎベクターを得た。２つの増幅された産物間にはプライマー製作時に人為的に挿入した多数の制限酵素認識部位を含んでいる。
【0105】
ｌｙｓＣＰ１プロモーターの製作過程は、次の通りである。コリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１０８８１を１ｙｓＣＰ１プロモーターを含むベクターで形質転換させたＣＡ０１－０１３５菌株（国際公開特許ＷＯ２００９－０９６６８９、ＫＣＣＭ１０９１９Ｐ）の染色体ＤＮＡを鋳型とし、下記配列番号１６及び１７のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。ポリメラーゼは、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング及び７２℃で３０秒の過程を３０回繰り返した。
【0106】
ここで用いられたプライマーの配列は、下記表２の通りである。
【0107】
【表2】
【0108】
その結果、ＰＣＲ結果物としてｌｙｓＣＰ１プロモーター部位（配列番号９）を得た。
【0109】
ａｒｇＪ遺伝子を得るために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来ａｒｇＪ遺伝子の塩基配列（配列番号６）に基づいてａｒｇＪ ＯＲＦ（ｏｐｅｎ－ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）相同組換え断片を得るための配列番号１８及び１９のブライマー対を製作した。
【0110】
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９菌株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、下記配列番号１８及び１９のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。ポリメラーゼはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング及び７２℃で１分３０秒の伸長過程を３０回繰り返した。
【0111】
ここで用いられたプライマーの配列は、下記表３の通りである。
【0112】
【表3】
【0113】
その結果、ＰＣＲ結果物として約１．２ｋｂのａｒｇＪ遺伝子断片が増幅され、これを０．８％アガロースゲルで電気泳動した後、所望の大きさのバンドを溶離して精製した。
【0114】
先に製作したｐＤＺＴｎベクターに制限酵素であるＸｈｏＩを処理し、上記で得られた各ＰＣＲ産物（１ｙｓＣＰ１プロモーター部位及びａｒｇＪ遺伝子断片）をインフュージョンＨＤクローニングキット（Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ(R) ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてフュージョンクローニングした後、その結果として得られたプラスミドをｐＤＺＴｎ－ｌｙｓＣＰ１－ａｒｇＪと命名した。
【0115】
次に、製作した上記プラスミドｐＤＺＴｎ－ｌｙｓＣＰ１－ａｒｇＪを野生型コリネバクテリウム・グルタミカム菌株ＡＴＣＣ１３０３２で染色体内のオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ａｒｇＦ）及びグルタミン酸の排出に関与するグルタミン酸エクスポータ（ＮＣｇ１１２２１）をコードする遺伝子が欠損し、野生型大腸菌Ｗ３１１０菌株由来のオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）をコードする遺伝子（ｓｐｅＣ）が染色体内に導入され、グルタミン酸においてオルニチン合成に関与する酵素をコードしているａｒｇＣＪＢＤ遺伝子群のプロモーターが置換され、プトレシン生産能を有するＣＣ０１－００６４菌株（米国登録特許ＵＳ ９８９０４０４、ＫＣＣＭ１１１３８Ｐ）においてヒストンアセチルトランスフェラーゼＨＰＡ２及び関連アセチルトランスフェラーゼ（ｈｉｓｔｏｎｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ＨＰＡ２ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）と定義されるＮＣｇ１１４６９タンパク質の活性が欠失したＣＣ０１－０１６３菌株（米国登録特許ＵＳ ９６７７０９９、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ）に電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）で導入して形質転換体を得、上記形質転換体をカナマイシン２５μｇ／ｍｌとＸ－ｇａｌ（５－ｂｒｏｍｏ－４－ｃｈｌｏｒｏ－３－ｉｎｄｏｌｉｎ－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）が含まれたＢＨＩＳ平板培地（Ｂｒａｉｎｅ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ３７ｇ／ｌ、ソルビトール９１ｇ／ｌ、寒天２％）に塗抹し、培養してコロニーを形成させた。形成されたコロニー中、白色のコロニーを選択することにより上記プラスミドｐＤＺＴｎ－ｌｙｓＣＰ１－ａｒｇＪが導入された形質転換菌株を選別した。
【0116】
上記選別された菌株をＣＭ培地（グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）１０ｇ／ｌ、ポリペプトン（ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ）１０ｇ／ｌ、酵母抽出物（ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）５ｇ／ｌ、牛肉抽出物（ｂｅｅｆ ｅｘｔｒａｃｔ）５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ２．５ｇ／ｌ、尿素（ｕｒｅａ）２ｇ／ｌ、ｐＨ６．８）において３０℃で８時間振盪培養し、それぞれ１０－４から１０－１０まで順次希釈した後、Ｘ－ｇａｌ含有固体培地に塗抹し、培養してコロニーを形成させた。形成されたコロニー中、相対的に低い比率で示される白色のコロニーを選択することにより、２次交差（ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）によりａｒｇＪをコードする遺伝子が導入された菌株を最終選別した。
【0117】
最終選別された菌株を対象に配列番号１８及び１９のプライマー対を用いてＰＣＲを行ってａｒｇＪをコードする遺伝子が導入されたことを確認し、上記コリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＣＣ０１－０１６３ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１－ａｒｇＪと命名した。
【0118】
１－２．コリネ由来ａｒｇ遺伝子が強化されたコリネ基盤菌株のプトレシン生産能の評価
プトレシン生産菌株にコリネバクテリウム由来ａｒｇＪ遺伝子を強化させた時、プトレシン生産に及ぼす効果を確認するために、上記実施例１－１で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象にプトレシン生産能を比較した。
プトレシン生産菌株にコリネバクテリウム由来ａｒｇＪ遺伝子を強化させた時、プトレシン生産に及ぼす効果を確認するために、上記実施例１－１で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象にプトレシン生産能を比較した。
【0119】
具体的には、上記実施例１－１で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株（ＣＣ０１－０１６３ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１－ａｒｇＪ）をそれぞれ１ｍＭアルギニン含有ＣＭ平板培地（グルコース１％、ポリペプトン１％、酵母抽出物０．５％、牛肉抽出物０．５％、ＮａＣｌ ０．２５％、尿素０．２％、５０％ ＮａＯＨ １００μｌ、寒天２％、ｐＨ６．８、１Ｌ基準）に塗抹し、３０℃で２４時間培養した。
【0120】
これから培養された各菌株を２５ｍｌの力価培地（グルコース８％、大豆タンパク質０．２５％、トウモロコシ固形０．５０％、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５％、尿素０．１５％、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩３ｍｇ、パントテン酸カルシウム３ｍｇ、ニコチンアミド３ｍｇ、ＣａＣＯ３ ５％、１Ｌ基準）に一白金耳程度で接種した後、３０℃で２００ｒｐｍで９８時間振盪培養した。全ての菌株の培養時に培地に１ｍＭアルギニンを添加した。各培養物から生産されたプトレシン濃度を測定し、その結果を下記表４に示した。
【0121】
【表4】
【0122】
その結果、上記表４に示された通り、コリネバクテリウム由来ａｒｇＪが強化されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株においてプトレシン生産が６％増加したことを確認した。
【0123】
実施例２：大腸菌由来ａｒｇＡ及びａｒｇＥのプトレシン生産菌株内の導入及びこのプトレシン生産能の確認
２－１．ＡＴＣＣ１３０３２基盤プトレシン生産菌株のトランスポゾン遺伝子内への大腸菌由来ａｒｇＡ及びａｒｇＥ同時導入した菌株の製作
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２基盤のプトレシン生産菌株（ＣＣ０１－０１６３）に大腸菌由来Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードするａｒｇＡとアセチルオルニチンデアセチラーゼ（Ａｃｅｔｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ）をコードするａｒｇＥ遺伝子を挿入した時、プトレシン生産能が向上するかを確認するために、ａｒｇＡとａｒｇＥを上記菌株のトランスポゾン遺伝子内に導入した。
２－１．ＡＴＣＣ１３０３２基盤プトレシン生産菌株のトランスポゾン遺伝子内への大腸菌由来ａｒｇＡ及びａｒｇＥ同時導入した菌株の製作
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２基盤のプトレシン生産菌株（ＣＣ０１－０１６３）に大腸菌由来Ｎ－アセチルグルタミン酸シンターゼ（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードするａｒｇＡとアセチルオルニチンデアセチラーゼ（Ａｃｅｔｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ）をコードするａｒｇＥ遺伝子を挿入した時、プトレシン生産能が向上するかを確認するために、ａｒｇＡとａｒｇＥを上記菌株のトランスポゾン遺伝子内に導入した。
【0124】
そのために、上記大腸菌由来ａｒｇＡ遺伝子の塩基配列（配列番号２０）からａｒｇＡ ＯＲＦ部位の相同組換え断片を得るための配列番号２１及び２２のプライマー対を製作し、ａｒｇＥ遺伝子の塩基配列（配列番号４）からａｒｇＥ ＯＲＦ部位の相同組換え断片を得るための配列番号２３及び２４のプライマー対を製作した。
【0125】
上記プライマーの配列は、下記表５の通りである。
【0126】
【表5】
【0127】
ｌｙｓＣＰ１プロモーター部位は、実施例１－１と同様の方法でＫＣＣＭ１０９１９Ｐ菌株染色体を鋳型とし、配列番号１６及び１７のプライマー対を用いたＰＣＲを通じて得た。
【0128】
ａｒｇＡ遺伝子を得るために、大腸菌Ｗ３１１０菌株の染色体を鋳型とし、配列番号２１及び２２のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。ポリメラーゼはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング及び７２℃で１分３０秒の伸長過程を３０回繰り返した。
【0129】
その結果、ＰＣＲ結果物として約１．６ｋｂのａｒｇＡ遺伝子断片が増幅され、これを実施例１－１で製作したｐＤＺＴｎベクターに実施例１－１と同様の方法でｌｙｓＣＰ１プロモーター部位とフュージョンクローニングした。その結果として得られたプラスミドをｐＤＺＴｎ－ｌｙｓＣＰ１－ａｒｇＡと命名した。
【0130】
実施例１－１で製作したｐＤＺＴｎベクターに制限酵素であるＸｈｏＩを処理し、上記で得られた各ＰＣＲ産物（１ｙｓＣＰ１プロモーター部位及びａｒｇＡ遺伝子断片）を実施例１－１と同様の方法でフュージョンクローニングした後、その結果として得られたプラスミドをｐＤＺＴｎ－ｌｙｓＣＰ１－ａｒｇＡと命名した。
【0131】
ａｒｇＥ遺伝子を得るために、上記と同様の方法で大腸菌Ｗ３１１０菌株の染色体を鋳型とし、配列番号２３及び２４のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。ポリメラーゼはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング及び７２℃で１分３０秒の伸長過程を３０回繰り返した。
【0132】
その結果、ＰＣＲ結果物として約１．４ｋｂのａｒｇＥ遺伝子断片が増幅され、これを実施例１－１で製作したｐＤＺＴｎベクターに実施例１－１と同様の方法で既に得られた１ｙｓＣＰ１プロモーター部位とフュージョンクローニングした。その結果として得られたプラスミドをｐＤＺＴｎ－ｌｙｓＣＰ１－ａｒｇＥと命名した。
【0133】
次に、上記プラスミドｐＤＺＴｎ－ｌｙｓＣＰ１－ａｒｇＡをＣＣ０１－０１６３に電気穿孔法で導入して形質転換体を得、実施例１－１と同様の方法で上記プラスミドｐＤＺＴｎ－ｌｙｓＣＰ１－ａｒｇＡが導入された形質転換菌株を選別した。
【0134】
上記選別された菌株を２次交差によりａｒｇＡをコードする遺伝子が導入された菌株を最終選別した。最終選別された菌株を対象に配列番号２１及び２２のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ａｒｇＡをコードする遺伝子が導入されたことを確認し、上記コリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＣＣ０１－０１６３ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１－ａｒｇＡと命名した。
【0135】
上記製作されたａｒｇＡが導入されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株にａｒｇＥを導入するために、先に製作したｐＤＺＴｎ－ｌｙｓＣＰ１－ａｒｇＥを上記と同様の方法でＣＣ０１－０１６３ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１－ａｒｇＡに形質転換し、最終選別された菌株を対象に配列番号２３及び２４のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、トランスポゾン内ａｒｇＥが導入されたことを確認した。
【0136】
これから選別されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＣＣ０１－０１６３ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１－ａｒｇＡ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１ａｒｇＥと命名した。
【0137】
２－２．大腸菌由来ａｒｇＡ及びａｒｇＥ遺伝子が導入されたプトレシン生産コリネバクテリウム属菌株のプトレシン生産能の評価
プトレシン生産菌株に大腸菌由来ａｒｇＡとａｒｇＥ導入がプトレシン生産に及ぼす効果を確認するために、上記実施例２－１で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象にプトレシン生産能を比較した。
プトレシン生産菌株に大腸菌由来ａｒｇＡとａｒｇＥ導入がプトレシン生産に及ぼす効果を確認するために、上記実施例２－１で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象にプトレシン生産能を比較した。
【0138】
具体的には、上記実施例２－１で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株（ＣＣ０１－０１６３ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１ａｒｇＡ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１－ａｒｇＥ）と親株（ＣＣ０１－０１６３）をそれぞれ実施例１－２と同様の方法で培養し、各培養物から生産されたプトレシン濃度を測定し、その結果を下記表６に示した。
【0139】
【表6】
【0140】
その結果、上記表６に示された通り、大腸菌由来ａｒｇＡとａｒｇＥ遺伝子が同時に導入されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株においてプトレシン生産量が９．８％増加したことを確認した。
【0141】
実施例３：コリネ由来Ｎｃｇ１２６４４遺伝子強化菌株のプトレシン生産能の確認
３－１．ＡＴＣＣ１３０３２基盤プトレシン生産菌株のトランスポゾン遺伝子内へのＡＴＣＣ１３８６９由来Ｎｃｇ１２６４４導入菌株の製作
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２基盤のプトレシン生産菌株（ＣＣ０１－０１６３）においてコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来ＧＮＡＴ（ＧＣＮ５－ｒｅｌａｔｅｄ Ｎ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ）ファミリーＮ－アセチルトランスフェラーゼ（ＧＮＡＴ ｆａｍｉｌｙ Ｎ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）をコードするＮｃｇ１２６４４遺伝子を強化した時、プトレシン生産能が向上するかを確認するために、Ｎｃｇ１２６４４を上記菌株のトランスポゾン遺伝子内に導入及び強化した。
３－１．ＡＴＣＣ１３０３２基盤プトレシン生産菌株のトランスポゾン遺伝子内へのＡＴＣＣ１３８６９由来Ｎｃｇ１２６４４導入菌株の製作
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２基盤のプトレシン生産菌株（ＣＣ０１－０１６３）においてコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来ＧＮＡＴ（ＧＣＮ５－ｒｅｌａｔｅｄ Ｎ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ）ファミリーＮ－アセチルトランスフェラーゼ（ＧＮＡＴ ｆａｍｉｌｙ Ｎ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）をコードするＮｃｇ１２６４４遺伝子を強化した時、プトレシン生産能が向上するかを確認するために、Ｎｃｇ１２６４４を上記菌株のトランスポゾン遺伝子内に導入及び強化した。
【0142】
そのために、上記コリネバクテリウム由来遺伝子Ｎｃｇ１２６４４の塩基配列（配列番号２）からＮｃｇｌ２６４４ ＯＲＦ部位の相同組換え断片を得るための配列番号２５及び２６のプライマー対を製作した。
【0143】
上記プライマーの配列は、下記表７の通りである。
【0144】
【表7】
【0145】
Ｎｃｇ１２６４４遺伝子を得るために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９菌株の染色体を鋳型とし、配列番号２５及び２６のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。ポリメラーゼはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング及び７２℃で１分の伸長過程を３０回繰り返した。その結果、ＰＣＲ結果物として約１ｋｂのＮｃｇ１２６４４遺伝子断片が増幅され、これを実施例１－１で製作したｐＤＺＴｎベクターに実施例１－１と同様の方法で実施例２－１で得られた１ｙｓＣＰ１プロモーター部位とフュージョンクローニングした。その結果として得られたプラスミドをｐＤＺＴｎ－ｌｙｓＣＰ１－Ｎｃｇ１２６４４と命名した。
【0146】
次に、上記プラスミドｐＤＺＴｎ－ｌｙｓＣＰ１－Ｎｃｇ１２６４４をＣＣ０１－０１６３に電気穿孔法で導入して形質転換体を得、実施例１－１と同様の方法で上記プラスミドｐＤＺＴｎ－ｌｙｓＣＰ１－Ｎｃｇ１２６４４が導入された形質転換菌株を選別した。
【0147】
上記選別された菌株を２次交差によりＮｃｇ１２６４４をコードする遺伝子が導入された菌株を最終選別した。最終選別された菌株を対象に配列番号２５及び２６のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、Ｎｃｇ１２６４４をコードする遺伝子が導入されたことを確認し、上記コリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＣＣ０１－０１６３ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１－Ｎｃｇ１２６４４と命名した。
【0148】
３－２．コリネ由来Ｎｃｇ１２６４４遺伝子が強化されたプトレシン生産コリネバクテリウム属菌株のプトレシン生産能の評価
プトレシン生産菌株においてコリネバクテリウム由来Ｎｃｇ１２６４４遺伝子を強化させた時、プトレシン生産に及ぼす効果を確認するために、上記実施例３－１で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象にプトレシン生産能を比較した。
プトレシン生産菌株においてコリネバクテリウム由来Ｎｃｇ１２６４４遺伝子を強化させた時、プトレシン生産に及ぼす効果を確認するために、上記実施例３－１で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象にプトレシン生産能を比較した。
【0149】
具体的には、上記実施例３－１で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株（ＣＣ０１－０１６３ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１－ Ｎｃｇｌ２６４４）と親株（ＣＣ０１－０１６３）をそれぞれ実施例１－２と同様の方法で培養し、各培養物から生産されたプトレシン濃度を測定し、その結果を下記表８に示した。
【0150】
【表8】
【0151】
その結果、上記表８に示された通り、コリネバクテリウム由来Ｎｃｇ１２６４４が強化された場合には、プトレシン生産能が減少することを確認した。これは、プトレシン生産経路の中間代謝物質であるアセチルグルタミン酸の濃度が増加しながら生合成経路のボトルネック現象が起こることにより現れる現象であってもよい。これについて、下記追加の実施例を通じてプトレシン生産に対するＮｃｇ１２６４４の影響性を評価した。
【0152】
実施例４：ａｒｇＪ遺伝子欠損、Ｎｃｇ１２６４４強化菌株のプトレシン生産能の確認
４－１．ＡＴＣＣ１３０３２基盤プトレシン生産菌株のａｒｇＪ欠損菌株の製作
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２基盤のプトレシン生産菌株（ＣＣ０１－０１６３）においてコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来ａｒｇＪ遺伝子を欠損した菌株を製作した。
４－１．ＡＴＣＣ１３０３２基盤プトレシン生産菌株のａｒｇＪ欠損菌株の製作
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２基盤のプトレシン生産菌株（ＣＣ０１－０１６３）においてコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来ａｒｇＪ遺伝子を欠損した菌株を製作した。
【0153】
そのために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２由来ａｒｇＪ遺伝子の塩基配列（配列番号８）からａｒｇＪのＮ末端部位の相同組換え断片を得るための配列番号２７及び２８のプライマー対と、ａｒｇＪのＣ末端部位の相同組換え断片を得るための配列番号２９及び３０のプライマー対を製作した。
【0154】
上記プライマーの配列は、下記表９の通りである。
【0155】
【表9】
【0156】
ａｒｇＪのＮ末端部位とＣ末端部位の相同組換え断片をそれぞれ得るために、上記コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２７及び２８、配列番号２９及び３０のプライマー対を用いたＰＣＲをそれぞれ行った。ポリメラーゼはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、ＰＣＲ条件は９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング及び７２℃で３０秒の伸長過程を３０回繰り返した。その結果、ＰＣＲ結果物としてＮ末端部位とＣ末端部位のＰＣＲ断片がそれぞれ増幅され、これを０．８％アガロースゲルで電気泳動した後、所望の大きさのバンドを溶離して精製した。
【0157】
得られたＮ末端部位の断片を制限酵素であるＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで、Ｃ末端部位の断片を制限酵素であるＳａｌＩ及びＸｂａｌで処理し、処理された断片を制限酵素であるＢａｍＨＩとＸｂａＩで処理されたｐＤＺベクターにクローニングしてプラスミドｐＤＺ－１’ａｒｇＪ（Ｋ／Ｏ）を製作した。
【0158】
製作したプラスミドｐＤＺ－１’ａｒｇＪ（Ｋ／Ｏ）を電気穿孔法でコリネバクテリウム・グルタミカムＣＣ０１－０１６３に導入して形質転換体を得、実施例１－１と同様の方法でｐＤＺ－１’ＮＣｇｌａｒｇＪ（Ｋ／Ｏ）が導入された菌株を選別した。
【0159】
上記選別された菌株からａｒｇＪをコードする遺伝子が欠失してプトレシン生産性が弱化したコリネバクテリウム・グルタミカム菌株を最終選別し、上記のように製作されたプトレシン排出能が弱化したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をＣＣ０１－０１６３ △ａｒｇＪと命名した。
【0160】
製作されたＣＣ０１－０１６３ △ａｒｇＪ菌株に実施例３－１と同様の方法でＮｃｇ１２６４４遺伝子を形質転換させてＣＣ０１－０１６３ △ａｒｇＪ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１－Ｎｃｇ１２６４４菌株を製作した。
【0161】
４－２．コリネ由来ａｒｇＪ欠損、Ｎｃｇ１２６４４遺伝子が強化されたプトレシン生産コリネバクテリウム属菌株のプトレシン生産能の評価
プトレシン生産菌株においてコリネバクテリウム由来ａｒｇＪ遺伝子を欠損及びＮｃｇ１２６４４を強化させた時、プトレシン生産に及ぼす効果を確認するために、上記実施例４－１で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象にプトレシン生産能を比較した。
プトレシン生産菌株においてコリネバクテリウム由来ａｒｇＪ遺伝子を欠損及びＮｃｇ１２６４４を強化させた時、プトレシン生産に及ぼす効果を確認するために、上記実施例４－１で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象にプトレシン生産能を比較した。
【0162】
具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム変異株（ＣＣ０１－０１６３ △ａｒｇＪ Ｔｎ：１ｙｓＣＰ１－Ｎｃｇ１２６４４）と親株（ＣＣ０１－０１６３ △ａｒｇＪ）をそれぞれ実施例１－２と同様の方法で培養し、各培養物から生産されたプトレシン濃度を測定し、その結果を下記表１０に示した。
【0163】
【表10】
【0164】
その結果、上記表１０に示された通り、ａｒｇＪが欠損した菌株はプトレシン生産能を有し難いことが確認され、アセチルグルタミン酸（ａｃｅｔｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅ）を生成できるＮｃｇ１２６４４が導入されても、その後に生成される中間代謝物質であるアセチルオルニチン（ａｃｅｔｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）を脱アセチル化させることができる酵素の不在によりプトレシン生産が低いことが考えられた。これについて、下記追加の実施例を通じてＮｃｇ１２６４４及びａｒｇＥが同時強化された菌株においてプトレシン生産能を評価した。
【0165】
実施例５：コリネ由来Ｎｃｇ１２６４４遺伝子強化と大腸菌由来ａｒｇＥ遺伝子導入菌株のプトレシン生産能の確認
５－１．ＡＴＣＣ１３０３２基盤プトレシン生産菌株に関するＮｃｇ１２６４４遺伝子強化菌株の製作
上記実施例３－１で製作されたＣＣ０１－０１６３ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１－Ｎｃｇ１２６４４菌株と実施例４－１で製作されたＣＣ０１－０１６３ △ａｒｇＪ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１－Ｎｃｇ１２６４４菌株にアセチルオルニチン（ａｃｅｔｙｌ ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）を脱アセチル化させることができる大腸菌Ｗ３１１０由来アセチルオルニチンデアセチラーゼ（Ａｃｅｔｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ）をコードするａｒｇＥ遺伝子を導入した。
５－１．ＡＴＣＣ１３０３２基盤プトレシン生産菌株に関するＮｃｇ１２６４４遺伝子強化菌株の製作
上記実施例３－１で製作されたＣＣ０１－０１６３ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１－Ｎｃｇ１２６４４菌株と実施例４－１で製作されたＣＣ０１－０１６３ △ａｒｇＪ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１－Ｎｃｇ１２６４４菌株にアセチルオルニチン（ａｃｅｔｙｌ ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）を脱アセチル化させることができる大腸菌Ｗ３１１０由来アセチルオルニチンデアセチラーゼ（Ａｃｅｔｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ）をコードするａｒｇＥ遺伝子を導入した。
【0166】
具体的には、上記実施例２－１で製作されたｐＤＺＴｎ－ｌｙｓＣＰ１－ａｒｇＥプラスミドを実施例２－１と同様の方法でＣＣ０１－０１６３ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１－Ｎｃｇ１２６４４菌株とＣＣ０１－０１６３ △ａｒｇＪ Ｔｎ：１ｙｓＣＰ１－Ｎｃｇ１２６４４菌株に形質転換して形質転換体を得、実施例１－１と同様の方法で上記プラスミドｐＤＺＴｎ－ｌｙｓＣＰ１－ａｒｇＥが導入された形質転換菌株を選別した。
【0167】
上記選別された菌株からａｒｇＥが導入されたコリネバクテリウム・グルタミカム菌株を最終選別し、上記のように製作されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株ＣＣ０１－０１６３ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１－Ｎｃｇ１２６４４ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１－ａｒｇＥとＣＣ０１－０１６３ △ａｒｇＪ Ｔｎ：１ｙｓＣＰ１－Ｎｃｇ１２６４４ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１－ａｒｇＥを製作し、ＣＣ０１－０１６３ △ａｒｇＪ Ｔｎ：１ｙｓＣＰ１－Ｎｃｇ１２６４４ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１－ａｒｇＥの場合、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＣＣ０１－１４２５と命名した。また、上記Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＣＣ０１－１４２５（ＣＣ０１－０１６３ △ａｒｇＪ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１－Ｎｃｇ１２６４４ Ｔｎ：１ｙｓＣＰ１－ａｒｇｅ）は２０２０年７月２４日付で寄託（ＫＣＣＭ１２７７４Ｐ）した。
【0168】
５－２．Ｎｃｇ１２６４４遺伝子及びａｒｇＥが強化されたプトレシン生産コリネバクテリウム属菌株のプトレシン生産能の評価
プトレシン生産菌株においてコリネバクテリウム由来Ｎｃｇ１２６４４を強化及びａｒｇＥを導入した時、プトレシン生産に及ぼす効果を確認するために、上記実施例５－１で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象にプトレシン生産能を比較した。
プトレシン生産菌株においてコリネバクテリウム由来Ｎｃｇ１２６４４を強化及びａｒｇＥを導入した時、プトレシン生産に及ぼす効果を確認するために、上記実施例５－１で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象にプトレシン生産能を比較した。
【0169】
具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム変異株（ＣＣ０１－０１６３ Ｔｎ：１ｙｓＣＰ１－Ｎｃｇ１２６４４ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１－ａｒｇＥ， ＣＣ０１－０１６３ △ａｒｇＪ Ｔｎ：１ｙｓＣＰ１－Ｎｃｇ１２６４４ Ｔｎ：１ｙｓＣＰ１－ａｒｇＥ）と親株（ＣＣ０１－０１６３）をそれぞれ実施例１－２と同様の方法で培養し、各培養物から生産されたプトレシン濃度を測定し、その結果を下記表１１に示した。
【0170】
【表11】
【0171】
上記表１１に示された通り、Ｎｃｇ１２６４４とａｒｇＥが同時に導入されながらＣＣ０１－０１６３菌株より顕著に向上したプトレシン生産量を確認することができた。特に、ａｒｇＪの活性が除去されたＣＣ０１－０１６３ △ａｒｇＪ Ｔｎ：１ｙｓＣＰ１－Ｎｃｇｌ２６４４ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１－ａｒｇＥ菌株の場合、ＣＣ０１－０１６３菌株より３６．６％向上したプトレシン生産能を示し、ａｒｇＪの活性が残っているＣＣ０１－０１６３ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１－Ｎｃｇ１２６４４ Ｔｎ：ｌｙｓＣＰ１－ａｒｇＥ菌株の場合、ａｒｇＪの活性が除去された菌株に比べて低いプトレシン生産能を示すが、ＣＣ０１－０１６３菌株比３０．８％だけ向上したプトレシン生産能を有することが確認された。また、ａｒｇＪの活性が残っているＣＣ０１－０１６３ Ｔｎ：１ｙｓＣＰ１－Ｎｃｇ１２６４４ Ｔｎ：１ｙｓＣＰ１－ａｒｇＥ菌株はＮｃｇ１２６４４と類似の機能を示す大腸菌由来ａｒｇＡとａｒｇＥ遺伝子が同時に導入されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株より顕著に高いプトレシン生産量を示した（表６）。
【0172】
本実施例の結果を通じて、ａｒｇＪを欠損させ、Ｎｃｇ１２６４４とａｒｇＥを同時発現する場合、ａｒｇＪを欠損させないか、ａｒｇＪを欠損させ、Ｎｃｇ１２６４４と類似の機能を示す大腸菌由来ａｒｇＡ及びａｒｇＥを導入した時より顕著なプトレシン生産能を有することを確認した。
【0173】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されうることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願の範囲は上記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈すべきである。
【0174】
【図1】
【図2】
【配列表】