ホーム > 特許ランキング > 樂▲鼎▼生醫股▲分▼有限公司
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-27
(45)【発行日】2024-09-04
(54)【発明の名称】関節炎を緩和するための組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 38/18 20060101AFI20240828BHJP
A61K 31/726 20060101ALI20240828BHJP
A61K 31/727 20060101ALI20240828BHJP
A61K 31/728 20060101ALI20240828BHJP
A61K 31/737 20060101ALI20240828BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20240828BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240828BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240828BHJP
【ＦＩ】
A61K38/18
A61K31/726
A61K31/727
A61K31/728
A61K31/737
A61P19/02
A61P29/00
A61P29/00 101
A61P43/00 121
【請求項の数】
8
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022133636
(22)【出願日】2022-08-24
(65)【公開番号】P2023074461
(43)【公開日】2023-05-29
【審査請求日】2022-10-18
(31)【優先権主張番号】110142734
(32)【優先日】2021-11-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】TW
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 ウェブサイトの掲載日 令和３年９月２３日 掲載アドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５５／２０２１／９１６３２７９ 上記アドレスのウェブサイト（Ｈｉｎｄａｗｉ，Ｅｖｉｄｅｎｃｅ－Ｂａｓｅｄ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ａｎｄ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌｕｍｅ ２０２１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ９１６３２７９，１０ ｐａｇｅｓ）にて、マイクロカプセル化された組換えヒト上皮成長因子によるマウスモデルの変形性関節症の改善に関する研究について公開した。
(73)【特許権者】
【識別番号】522337945
【氏名又は名称】樂▲鼎▼生醫股▲分▼有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】100121821
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 強
(72)【発明者】
【氏名】張樂心
(72)【発明者】
【氏名】邱▲彦▼碩
(72)【発明者】
【氏名】林季千
(72)【発明者】
【氏名】林士超
(72)【発明者】
【氏名】賈尚真
【審査官】春田 由香
(56)【参考文献】
【文献】山本 昌，ペプチド・タンパク性医薬品の経粘膜透過促進，薬剤学: 生命とくすり，2014年，第74巻，第1号，p.19-26
【文献】Bertrand-Duchesne, M. P. et al.，Epidermal growth factor released from platelet-rich plasma promotes endothelial cell proliferation in vitro，Journal of Periodontal Research，2010年，Vol.45, No.1，p.87-93，doi:10.1111/j.1600-0765.2009.01205.x
【文献】Nurmaulinda, D. S. et al.，Epidermal Growth Factor (EGF) representing the role of other growth factors contained in Platelet-Rich Plasma (PRP)，Bali Medical Journal，2021年08月21日，Vol.10, No.2，p.757-762，doi:10.15562/bmj.v10i2.2524
【文献】Lippross, S. et al.，Intraarticular injection of platelet-rich plasma reduces inflammation in a pig model of rheumatoid arthritis of the knee joint，Arthritis and Rheumatism，2011年，Vol.63, No.11，p.3344-3353，doi:10.1002/art.30547
【文献】Gobbi, A. et al.，Platelet-rich plasma treatment in symptomatic patients with knee osteoarthritis: preliminary results in a group of active patients，Sports Health，2012年，Vol.4, No.2，p.162-172，doi:10.1177/1941738111431801
【文献】Campo, G. M. et al.，Efficacy of treatment with glycosaminoglycans on experimental collagen-induced arthritis in rats，Arthritis research & therapy，2003年，Vol.5, No.3，p.R122-R131，doi:10.1186/ar748
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３８／００－３８／５８
Ａ６１Ｋ ３１／００－３１／８０
Ａ２３Ｌ ３３／００－３３／２９
Ａ６１Ｐ １／００－４３／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
上皮成長因子を含み、且つ多血小板血漿を有しない、関節炎を緩和するための組成物であり、
前記関節炎は、変形性関節症（ＯＡ）、関節リウマチ（ＲＡ）及びそれらの組み合わせからなる群より選択された、組成物。
【請求項2】
グリコサミノグリカン及びヒアルロン酸を更に含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記上皮成長因子、前記グリコサミノグリカン及び前記ヒアルロン酸は、１：１０：１００～１：１０００：５０００の範囲の重量比で存在する、請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
前記上皮成長因子、前記グリコサミノグリカン及び前記ヒアルロン酸は、１：１００：１０００の重量比で存在する、請求項３に記載の組成物。
【請求項5】
前記グリコサミノグリカンは、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、グルコサミンサルフェイト及びそれらの組み合わせからなる群より選択された、請求項２に記載の組成物。
【請求項6】
前記グリコサミノグリカンは、コンドロイチン硫酸である、請求項５に記載の組成物。
【請求項7】
医薬組成物として製剤化された、請求項５に記載の組成物。
【請求項8】
該医薬組成物は、非経口剤形及び局所剤形からなる群より選択された剤形である、請求項７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、上皮成長因子（ＥＧＦ）を含む関節炎を緩和するための組成物に関し、特に、ＥＧＦと、グリコサミノグリカンと、ヒアルロン酸とを含む関節炎を緩和するための組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
関節炎は、様々な関節（例えば手、足、手首、肘、膝、腰、足首など）に起こる変性疾患である。一般の関節炎の形態は、変性性関節炎（変形性関節症（ＯＡ）としても知られている）、関節リウマチ（ＲＡ）、痛風性関節炎（ＧＡ）を含む。関節炎は、関節の炎症、腫れ、変形、痛み、萎縮、凝り、そして最終的には運動障害を引き起こす可能性がある。
【0003】
現在、関節炎の臨床的な治療法には、炎症を抑えるためのステロイドの使用や、潤滑性を改善するためのヒアルロン酸（ＨＡ）の使用があり、併せて身体のリハビリテーションを行うことにより、軟骨の損傷を抑制する。しかし、これらの治療法は期待する効果を得られず、且つ重症の場合は手術による人工関節置換術が必要となる。
【0004】
多血小板血漿（ＰＲＰ）は、全血から赤血球を除去して得られる濃縮液であり、且つ多数の血小板と種々の成長因子を含み、その中に、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）の含有量が最も多く、トランスフォーミング成長因子－β（ＴＧＦ－β）の含有量は２番目で、上皮成長因子（ＥＧＦ）は極めて少ない（ＩＧＦ－Ｉの約１／４５０倍）（Ｈａ Ｃ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（２０１９），Ａｒｔｈｒｏｓｃｏｐｙ，３５：２８７８－２８８４）。
【0005】
Ｇａｚｅｎｄａｍ Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０２１），Ｂｒ．Ｊ．Ｓｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ．，５５：２５６－２６１には、ＰＲＰ注射とプラシーボ（すなわち生理食塩水）注射の間に関節機能や痛みの改善に対して統計的差異がなかったと発表されている。特に、ＰＲＰとヒアルロン酸の併用で得られる治療効果は、ＰＲＰ単独で得られるものよりも低い。更に、Ｎａｈ Ｓ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｉｎｔ．，３０：４４３－４４９において、ＥＧＦは、ＲＡ患者において大量に発現していることから、関節炎、特にＲＡの炎症過程の発病機序に関連していると発表されている。
【0006】
また、Ｓｗａｎｓｏｎ Ｃ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８８：３５１３－３５２１において、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、コラーゲン誘発関節炎マウスやＲＡ患者において大量に発現していることから、関節炎の発病機序に関連していると発表されている。Ｓｗａｎｓｏｎ Ｃ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．は、ＥＧＦＲ阻害剤（即ちエルロチニブ）がコラーゲン誘発性関節炎を緩和することも開示しているので、ＥＧＦＲは、治療標的として期待されている。
【0007】
Ｓｕｎ Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０１８），ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ，３２：２２３－２３３ において、ＯＡ患者においては、ＥＧＦＲが高度に活性化し、関節損傷を引き起すことが発表されている。Ｓｕｎ Ｈ．ｅｔ ａｌ．は、別のＥＧＦＲ阻害剤（即ちゲフィチニブ）が、ＯＡ罹患マウスの症状を改善し、且つ有効な治療薬となることが期待されていることも開示している。
【0008】
それでもなお、関節炎を緩和する効果的な方法の開発が求められている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
従って、本開示の目的は、先行技術の欠点の少なくとも１つを緩和することができ且つ上皮成長因子を含む関節炎を緩和するための組成物を提供することにある。
【0010】
本開示の他の特徴および利点は、添付の図面を参照して、以下の実施形態の詳細に説明することにより明白になる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】後述の実施例１の各グループにおける測定した右膝関節の直径を示す図であり、記号“*”、“**”、“***”のそれぞれは、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１（病態対照群との比較）を表す。
【図2】後述の実施例１の各グループにおける測定した変形性関節症（ＯＡ）のスケールを示す図であり、記号“*”、“***”のそれぞれは、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．００１（病態対照群との比較）を表す。
【図3】後述の実施例１の各グループにおける測定した軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）の含有量を示す図であり、記号“**”は、ｐ＜０．０１（病態対照群との比較）を表す。
【図4】後述の実施例１の各グループにおける測定したＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６及びＩＬ－１７Ａの含有量を示す図であり、記号“*”、“**”、“***”のそれぞれは、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１（病態対照群との比較）を表す。
【図5】後述の実施例１の各グループにおける測定したＰＧＥ２及びＮＯの含有量を示す図であり、記号“*”、“**”、“***”のそれぞれは、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１（病態対照群との比較）を表す。
【図6】後述の実施例２の各グループにおける測定した関節リウマチ（ＲＡ）のスケールを示す図である。
【図7】後述の実施例２の各グループにおける測定した炎症性細胞浸潤、滑膜の過形成及び軟骨表面の浸食のスケールを示す図であり、記号“*”、“***”のそれぞれは、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．００１（病態対照群との比較）を表す。
【図8】後述の実施例２の各グループにおける測定したＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－６の含有量を示す図であり、記号“*”、“**”、“***”のそれぞれは、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１（病態対照群との比較）を表す。
【図9】後述の実施例２の各グループにおける測定したＩＬ－１７Ａ、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－８の含有量を示す図であり、記号“*”、“**”、“***”のそれぞれは、ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１（病態対照群との比較）を表す。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本明細書の目的上、「含む」という単語は「含むが限定されない」を意味し、「含める」という単語もこれに対応する意味を有することも理解されたい。
【0013】
何らかの先行技術文献が本明細書において引用されても、台湾またはいかなる国においても、該先行技術文献の内容が本発明の属する分野における一般知識であることを示すものではないことを理解されたい。
【0014】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。当業者であれば、本開示の実施において、本明細書に記載のものと類似又は同等の多くの方法及び材料を認識し、利用することができる。実際、本開示は記載された方法及び材料に決して限定されない。
【0015】
本開示は、関節炎を緩和するための組成物を提供し、該組成物は、上皮成長因子（ＥＧＦ）を含む。
【0016】
本開示は、関節炎を緩和するための方法も提供し、該方法は、それを必要とする対象に上記の組成物を投与することを含む。
【0017】
本明細書で使用される場合、用語「緩和する」または「緩和」は、疾患または障害の１つ以上の臨床症状を、少なくとも部分的に低減、改善、緩和、制御、治療または除去すること、及び治療される状態または症状に関し、重症度の進行を低下、遅延、停止または逆転させ、またその可能性または確率を防止または低下させることを意味する。
本明細書で使用される「投与」または「投与する」という用語は、「意図された機能を果たすために、任意の適切な経路で予め決められた活性成分を対象に導入、提供または送達する」ことを意味する。
本明細書で使用される「対象」という用語は、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ゾウ、クマ、シカなど、関心のあるあらゆる動物を指す。
一部の実施形態において、該対象はヒトである。
本明細書で使用される「投与」または「投与する」という用語は、「意図された機能を果たすために、任意の適切な経路で予め決められた活性成分を対象に導入、提供または送達する」ことを意味する。
本明細書で使用される「対象」という用語は、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ゾウ、クマ、シカなど、関心のあるあらゆる動物を指す。
一部の実施形態において、該対象はヒトである。
【0018】
本開示によれば、該関節炎は、変形性関節症（ＯＡ）、関節リウマチ（ＲＡ）、痛風性関節炎（ＧＡ）、乾癬性関節炎（ＰＡ）、感染性関節炎（ＩＡ）及びそれらの組み合わせからなる群より選択されることができる。例示的な実施形態において、該関節炎は、変形性関節症である。他の例示的な実施形態において、該関節炎は、関節リウマチである。
【0019】
本開示によれば、本開示で使用することに適する該上皮成長因子は、ヒトまたは他の動物、植物、微生物に由来するものであることができ、且つ市販品として入手でき、または当業者によく知られた技術で調製することができる。例えば、該上皮成長因子は、生体物質（例えばヒトの組織など）から分離された天然物、または遺伝子工学で得られた組み換えタンパクまたはその機能的断片であることができる。一部の実施形態において、該上皮成長因子は、組み換えヒト上皮成長因子（ｒｈＥＧＦ）である。
【0020】
本開示によれば、該組成物は、グリコサミノグリカン及びヒアルロン酸（ＨＡ）を更に含むことができる。
【0021】
一部の実施形態において、該グリコサミノグリカンは、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、グルコサミンサルフェイト及びそれらの組み合わせからなる群より選択されることができる。例示的な実施形態において、該グリコサミノグリカンは、コンドロイチン硫酸である。
【0022】
一部の実施形態において、該組成物内の該上皮成長因子、該グリコサミノグリカン及び該ヒアルロン酸は、１：１０：１００～１：１０００：５０００の範囲の重量比で存在する。例示的な実施形態において、該組成物内の該上皮成長因子、該グリコサミノグリカン及び該ヒアルロン酸は、１：１００：１０００の範囲の重量比で存在する。
【0023】
本開示によれば、該組成物は、実質的に多血小板血漿（ＰＲＰ）を有しない。
【0024】
本開示によれば、該組成物は、当業者によく知られた標準的な技術を使用して食品として配合することができる。例えば、該組成物は、食用材料に直接に添加することができ、または後に食用材料に添加することに適する中間組成物（例えば食品添加物またはプレミックス）の調製に使用することができる。
【0025】
本明細書で使用される場合、用語「食品」は、対象によってその体内に摂取され得る任意の物品又は物質を指す。食品の例としては、粉乳、発酵乳、ヨーグルト、バター、飲料（例えば、茶、コーヒーなど）、機能性飲料、小麦粉製品、焼き食品、菓子、キャンディ、発酵食品、動物飼料、健康食品、乳児食及び栄養補助食品を含むことができるが、それらに限定されるものではない。
【0026】
本開示によれば、該組成物は、医薬組成物の形態に調製することができる。該医薬組成物は、当業者によく知られた技術を使用して、経口投与、非経口投与または局所投与に適する剤形に製剤化することができる。
非経口投与について、本開示による医薬組成物は、注射剤、例えば無菌水溶液または分散液に製剤化することができる。
非経口投与について、本開示による医薬組成物は、注射剤、例えば無菌水溶液または分散液に製剤化することができる。
【0027】
本開示による医薬組成物は、非経口ルートを介して投与することができる。非経口ルートは、腹腔内注射、胸腔内注射、筋肉内注射、静脈内注射、動脈内注射、関節内注射、滑液嚢内注射、くも膜下腔内注射、頭蓋内注射、表皮内注射、皮下注射、皮内注射、病巣内注射、インプラント投与及び舌下投与を含むが、それらに限定されるものではない。一部の実施形態において、該医薬組成物は、腹腔内注射または関節内注射を介して投与することができる。
【0028】
本開示によれば、経口投与に適する剤形は、滅菌粉末、錠剤、トローチ、ロゼンジ、ペレット、カプセル、分散性粉末または顆粒、溶液、懸濁液、エマルション、シロップ、エリキシル剤、スラリー、スキャフォールド、凍結乾燥製剤、コロイド粒子などを含むが、それらに限定されない。
【0029】
本開示によれば、該医薬組成物は、当業者によく知られた技術を使用して、皮膚への局所適用に適する外用剤に製剤化することができる。該外用剤は、エマルション、ゲル、軟膏、クリーム、パッチ、塗布薬、パウダー、エアゾール、スプレー、ローション、セラム、ペースト、フォーム、ドロップ、懸濁液、硬膏、スキャフォールド、凍結乾燥製剤、コロイド粒子及び包帯を含むが、それらに限定されない。
【0030】
本開示によれば、該医薬組成物は、医薬製造の技術分野で広く採用されている薬学的に許容される担体を更に含むことができる。例えば、該薬学的に許容される担体は、以下の薬剤の１つまたはそれ以上を含むことができる。該薬剤は、溶媒、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、分解剤、崩壊剤、分散剤、結合剤、賦形剤、安定化剤、キレート剤、希釈剤、ゲル化剤、保存剤、湿潤剤、滑剤、吸収遅延剤、リポソーム、スキャフォールド、凍結乾燥製剤、コロイド粒子などを含むが、それらに限定されない。前記の薬剤の選択及び量は、当業者の経験及び通常の技術の範囲内である。
【0031】
本開示による医薬組成物の投与量及び投与頻度は、以下の要因：治療すべき疾患又は障害の重症度、投与経路、並びに治療すべき対象の年齢、身体状態及び反応によって変化することができる。一般的に、該医薬組成物は単回で投与してもよいし、数回に分けて投与してもよい。
【0032】
以下、本発明の実施例について説明する。これらの実施例は、例示的かつ説明的なものであり、且つ、本発明を限定するものと解釈されるべきではないことを理解されたい。
【実施例】
【0033】
一般実験材料
Ａ．以下の実験で使用した上皮成長因子（ＥＧＦ）（カタログ番号０２－１０８）、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）（カタログ番号０５－１０３）、ヒアルロン酸（ＨＡ）（カタログ番号０７－１１３）は、台湾Ｊｏｙｃｏｍ Ｂｉｏ－ｃｈｅｍ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．社から購入したものである。
Ａ．以下の実験で使用した上皮成長因子（ＥＧＦ）（カタログ番号０２－１０８）、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）（カタログ番号０５－１０３）、ヒアルロン酸（ＨＡ）（カタログ番号０７－１１３）は、台湾Ｊｏｙｃｏｍ Ｂｉｏ－ｃｈｅｍ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．社から購入したものである。
【0034】
基本手順
１.統計分析
以下に説明する実験はすべて３回行った。該実験データは、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）で表されている。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．４（米国サンディエゴのＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いて行った。すべての実験データは、グループ間の差異を評価するために、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）のテューキー検定を用いて分析された。統計的な有意性はｐ＜０．０５で示された。
１.統計分析
以下に説明する実験はすべて３回行った。該実験データは、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）で表されている。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．４（米国サンディエゴのＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いて行った。すべての実験データは、グループ間の差異を評価するために、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）のテューキー検定を用いて分析された。統計的な有意性はｐ＜０．０５で示された。
【0035】
実施例１．ＥＧＦの変形性関節症（ＯＡ）を緩和する効果の評価
Ａ．ＥＧＦ、ＣＳ及びＨＡ含有の混合物の調製
ＥＧＦ、ＣＳ及びＨＡを１：１００：１０００の重量比で滅菌水に混合して、ＥＧＦ（２０μｇ／ｇ）、ＣＳ及びＨＡ含有の混合物を得た。
Ａ．ＥＧＦ、ＣＳ及びＨＡ含有の混合物の調製
ＥＧＦ、ＣＳ及びＨＡを１：１００：１０００の重量比で滅菌水に混合して、ＥＧＦ（２０μｇ／ｇ）、ＣＳ及びＨＡ含有の混合物を得た。
【0036】
Ｂ．実験ラット
以下の実験で使用したオスのスプラーグドーリーラット（６週齢、体重約２００～３００ｇ）は、台湾台北市の国家実験動物センターから購入したものである。全ての実験マウスは、１２時間の明と１２時間の暗とが交互する周期で、温度を２１℃～２４℃に維持し、且つ相対湿度を４５％～７０％に維持した実験室条件下の動物部屋で飼育された。更に、水と飼料は、全ての実験マウスに自由に摂取させた。実験マウスに関わる全ての実験手順は、台湾国立中興大学の実験動物管理使用委員会の法的規定に準拠し、且つ、アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）の実験動物の管理使用のガイドに従って実施された。
以下の実験で使用したオスのスプラーグドーリーラット（６週齢、体重約２００～３００ｇ）は、台湾台北市の国家実験動物センターから購入したものである。全ての実験マウスは、１２時間の明と１２時間の暗とが交互する周期で、温度を２１℃～２４℃に維持し、且つ相対湿度を４５％～７０％に維持した実験室条件下の動物部屋で飼育された。更に、水と飼料は、全ての実験マウスに自由に摂取させた。実験マウスに関わる全ての実験手順は、台湾国立中興大学の実験動物管理使用委員会の法的規定に準拠し、且つ、アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）の実験動物の管理使用のガイドに従って実施された。
【0037】
Ｃ．ＯＡの誘導及びＥＧＦの投与
スプラーグドーリーラットは、１つの正常対照群、１つの病態対照群、１つの比較群及び２つの実験群（即ち、実験群１～２）を含む５つのグループに分けられた（各グループにおいてｎ＝５ラット）。
ＥＧＦと、ＥＧＦ、ＣＳ及びＨＡ含有の混合物とのそれぞれ１つを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解して、ＥＧＦ溶液及び混合物溶液を得た。
病態対照群、比較群及び実験群１～２におけるラットのそれぞれの右膝関節に、３０μＬのヨウ化酢酸モノナトリウム（ＭＩＡ）溶液（５０ｇ/Ｌ、０．９％生理食塩水の中に）を関節内注射した。更に、正常対照群におけるラットのそれぞれの右膝関節に３０μＬの０．９％生理食塩水を関節内注射した。
ＭＩＡ溶液を注射後の第３日及び第１４日に、比較群におけるラットのそれぞれの右膝関節に３０μＬの１％ＨＡを関節内注射し、実験群１におけるラットのそれぞれの右膝関節に３０μＬの該ＥＧＦ溶液（２０μｇ／ｇのＥＧＦ含有）を関節内注射し、実験群２におけるラットのそれぞれの右膝関節に３０μＬの該混合物溶液（２０μｇ／ｇのＥＧＦ含有）を関節内注射し、病態対照群におけるラットのそれぞれの右膝関節に３０μＬの０．９％生理食塩水を関節内注射した。更に、正常対照群におけるラットは、処理を受けていない。
スプラーグドーリーラットは、１つの正常対照群、１つの病態対照群、１つの比較群及び２つの実験群（即ち、実験群１～２）を含む５つのグループに分けられた（各グループにおいてｎ＝５ラット）。
ＥＧＦと、ＥＧＦ、ＣＳ及びＨＡ含有の混合物とのそれぞれ１つを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解して、ＥＧＦ溶液及び混合物溶液を得た。
病態対照群、比較群及び実験群１～２におけるラットのそれぞれの右膝関節に、３０μＬのヨウ化酢酸モノナトリウム（ＭＩＡ）溶液（５０ｇ/Ｌ、０．９％生理食塩水の中に）を関節内注射した。更に、正常対照群におけるラットのそれぞれの右膝関節に３０μＬの０．９％生理食塩水を関節内注射した。
ＭＩＡ溶液を注射後の第３日及び第１４日に、比較群におけるラットのそれぞれの右膝関節に３０μＬの１％ＨＡを関節内注射し、実験群１におけるラットのそれぞれの右膝関節に３０μＬの該ＥＧＦ溶液（２０μｇ／ｇのＥＧＦ含有）を関節内注射し、実験群２におけるラットのそれぞれの右膝関節に３０μＬの該混合物溶液（２０μｇ／ｇのＥＧＦ含有）を関節内注射し、病態対照群におけるラットのそれぞれの右膝関節に３０μＬの０．９％生理食塩水を関節内注射した。更に、正常対照群におけるラットは、処理を受けていない。
【0038】
Ｄ．右膝関節の直径の測定
ＭＩＡ溶液の注射後の第２８日終了の時、各グループにおけるラットのそれぞれの右膝関節は、測径器を使用して直径を測定させた。
ＭＩＡ溶液の注射後の第２８日終了の時、各グループにおけるラットのそれぞれの右膝関節は、測径器を使用して直径を測定させた。
【0039】
このように得られたデータを、「基本手順」のセクション１の方法に従って分析した。
図１を参照すると、比較群と実験群１及び２とにおける測定された右膝関節の直径は、それぞれが病態対照群における測定されたものより低い。特に、実験群２における測定された右膝関節の直径は、正常対照群における測定されたものと同等であった。
図１を参照すると、比較群と実験群１及び２とにおける測定された右膝関節の直径は、それぞれが病態対照群における測定されたものより低い。特に、実験群２における測定された右膝関節の直径は、正常対照群における測定されたものと同等であった。
【0040】
これらの結果から、ＥＧＦはＯＡを緩和する十分な有効性を表し、且つ、ＥＧＦをＣＳ及びＨＡと合わせて使用すると、該有効性が増進されたことが示された。
【0041】
Ｅ．生体サンプルの調製
この実施例のセクションＤの第２８日終了の時における右膝関節の直径の測定の後、各グループのラットを９５％ＣＯ２で窒息させることにより屠殺した。次に、２５Ｇ針を使用した動脈穿刺により各ラットの心臓から収集された血液サンプルは、２５℃で１０分間の１５００ｇの遠心分離にかけて、血清サンプルを得た。その後、各ラットの死体から得られた各グループにおけるラットのそれぞれの右膝関節組織を０．９％生理食塩水で洗った。
得られた血清サンプル及び右膝関節組織を以下の実験に使用した。
この実施例のセクションＤの第２８日終了の時における右膝関節の直径の測定の後、各グループのラットを９５％ＣＯ２で窒息させることにより屠殺した。次に、２５Ｇ針を使用した動脈穿刺により各ラットの心臓から収集された血液サンプルは、２５℃で１０分間の１５００ｇの遠心分離にかけて、血清サンプルを得た。その後、各ラットの死体から得られた各グループにおけるラットのそれぞれの右膝関節組織を０．９％生理食塩水で洗った。
得られた血清サンプル及び右膝関節組織を以下の実験に使用した。
【0042】
Ｆ．組織病理学分析
この実施例のセクションＥで得られた各右膝関節組織を、１０％中性緩衝ホルマリン（ＢｉＯＴｎＡ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、カタログ番号ＴＡＢＳ０６－４０００）で室温で２４時間の固定処理にかけた。固定された組織サンプルを、パラフィンで包埋し、続いて薄切りにすることにより厚さ５μｍの組織切片を得た。
該組織切片は、当業者によく知られた染色方法を用いて、ヘマトキシリン－エオシン染色させ、且つ、サフラニンＯ及びファストグリーン染色させ、そして、光学顕微鏡（オリンパス、ＣＫＸ４１）で２００倍の倍率で観察された。ランダムに選択された各該組織切片の２つのエリアを撮影し、Ｐａｕｌｉ Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，２０：４７６－４８５に説明されている修正Ｍａｎｋｉｎスコアリングシステムにより、各該組織切片の病変（例えば軟骨損傷、軟骨細胞の損失及びプロテオグリカンの損失など）を評価した。軟骨損傷、軟骨細胞の損失及びプロテオグリカンの損失の程度は、１～５のスケールで採点された。スケールが高いほど、ＯＡの重症度が高い。
この実施例のセクションＥで得られた各右膝関節組織を、１０％中性緩衝ホルマリン（ＢｉＯＴｎＡ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、カタログ番号ＴＡＢＳ０６－４０００）で室温で２４時間の固定処理にかけた。固定された組織サンプルを、パラフィンで包埋し、続いて薄切りにすることにより厚さ５μｍの組織切片を得た。
該組織切片は、当業者によく知られた染色方法を用いて、ヘマトキシリン－エオシン染色させ、且つ、サフラニンＯ及びファストグリーン染色させ、そして、光学顕微鏡（オリンパス、ＣＫＸ４１）で２００倍の倍率で観察された。ランダムに選択された各該組織切片の２つのエリアを撮影し、Ｐａｕｌｉ Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，２０：４７６－４８５に説明されている修正Ｍａｎｋｉｎスコアリングシステムにより、各該組織切片の病変（例えば軟骨損傷、軟骨細胞の損失及びプロテオグリカンの損失など）を評価した。軟骨損傷、軟骨細胞の損失及びプロテオグリカンの損失の程度は、１～５のスケールで採点された。スケールが高いほど、ＯＡの重症度が高い。
【0043】
このように得られたデータを、「基本手順」のセクション１の方法に従って分析した。
形態学的観察の結果（データは表示されない）に基づくと、病態対照群において、右膝関節の関節軟骨は、明白な亀裂及びでこぼこな表面を有し、且つ重大な軟骨細胞及びプロテオグリカンの損失が観察され、ＭＩＡがＯＡ及び軟骨損傷を成功に誘発したことを示した。その一方、比較群及び実験群１及び２において、右膝関節の関節軟骨は、亀裂が比較的少なく且つ表面がより滑らかであり、且つ軟骨細胞及びプロテオグリカンの損失が比較的少ないことが観察された。
形態学的観察の結果（データは表示されない）に基づくと、病態対照群において、右膝関節の関節軟骨は、明白な亀裂及びでこぼこな表面を有し、且つ重大な軟骨細胞及びプロテオグリカンの損失が観察され、ＭＩＡがＯＡ及び軟骨損傷を成功に誘発したことを示した。その一方、比較群及び実験群１及び２において、右膝関節の関節軟骨は、亀裂が比較的少なく且つ表面がより滑らかであり、且つ軟骨細胞及びプロテオグリカンの損失が比較的少ないことが観察された。
【0044】
【0045】
これらの結果から、ＥＧＦはＯＡ及び関節軟骨損傷を緩和する十分な有効性を表し、且つ、ＥＧＦをＣＳ及びＨＡと合わせて使用すると、該有効性が増進されたことが示された。
【0046】
Ｇ．血清サンプル中のＯＡの生体指標及び炎症マーカーの測定
この実施例のセクションＥで得られた各血清サンプルをＲＰＭＩ１６４０培地で５倍希釈した。その後、軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）の含有量を、メーカーの指示に従ってラットＣＯＭＰ ＥＬＩＳＡキット（中国Ｃｕｓａｂｉｏ社、カタログ番号ＣＳＢ－Ｅ１３８３３ｒ)を使用して測定した。更に、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６及びＩＬ－１７Ａの含有量を、それぞれメーカーの指示に従って、ＴＮＦ－α ＥＬＩＳＡキット（米Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号８８－７３４０－８８）、ＩＬ－１β ＥＬＩＳＡキット（米Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号８８－６０１0－２２）、ＩＬ－６ ＥＬＩＳＡキット（米Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号８８－５０６２５－８８）、及びＩＬ－１７Ａ ＥＬＩＳＡキット（米Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号８８－７１７０－２２）を使用して測定した。また、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の含有量を、メーカーの指示に従って、ＰＧＥ２ ＥＬＩＳＡキット（中国Ｃｕｓａｂｉｏ社、カタログ番号ＣＳＢ－Ｅ０７９６７ｒ）を使用して測定した。
この実施例のセクションＥで得られた各血清サンプルをＲＰＭＩ１６４０培地で５倍希釈した。その後、軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）の含有量を、メーカーの指示に従ってラットＣＯＭＰ ＥＬＩＳＡキット（中国Ｃｕｓａｂｉｏ社、カタログ番号ＣＳＢ－Ｅ１３８３３ｒ)を使用して測定した。更に、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６及びＩＬ－１７Ａの含有量を、それぞれメーカーの指示に従って、ＴＮＦ－α ＥＬＩＳＡキット（米Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号８８－７３４０－８８）、ＩＬ－１β ＥＬＩＳＡキット（米Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号８８－６０１0－２２）、ＩＬ－６ ＥＬＩＳＡキット（米Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号８８－５０６２５－８８）、及びＩＬ－１７Ａ ＥＬＩＳＡキット（米Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号８８－７１７０－２２）を使用して測定した。また、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の含有量を、メーカーの指示に従って、ＰＧＥ２ ＥＬＩＳＡキット（中国Ｃｕｓａｂｉｏ社、カタログ番号ＣＳＢ－Ｅ０７９６７ｒ）を使用して測定した。
【0047】
更に、酸化窒素（ＮＯ）の含有量を、Ｇｒｉｅｓｓ ａｓｓａｙを使用して測定した。簡潔に言うと、この実施例のセクションＥで得られた血清サンプルのそれぞれ１００μＬを、１００μＬのグリース試薬（０．２％のＮ－（１－ナフチル）エチレンジアミン、２％のスルファニルアミド、及び５％のリン酸を含有)と混合し、続いて、室温で１０分間放置して反応を進行させた。得られた反応混合物は、分光光度計を使用して５４０ｎｍ波長における吸収の測定（ＯＤ５４０）にかけた。得られた該ＯＤ５４０値は、その後に、標準硝酸ナトリウムの様々な既知濃度に対するそのＯＤ５４０値を描くことによって予め用意された相関曲線に基づいて、ｐｇ／ｍＬで表される濃度に変換された。
【0048】
このように得られたデータを、「基本手順」のセクション１の方法に従って分析した。
図３を参照すると、比較群と実験群１及び２とにおける測定されたＣＯＭＰの含有量は、それぞれが病態対照群における測定されたものより低い。特に、実験群２における測定されたＣＯＭＰの含有量は、正常対照群における測定されたものと同等であった。
図３を参照すると、比較群と実験群１及び２とにおける測定されたＣＯＭＰの含有量は、それぞれが病態対照群における測定されたものより低い。特に、実験群２における測定されたＣＯＭＰの含有量は、正常対照群における測定されたものと同等であった。
【0049】
図４を参照すると、比較群と実験群１及び２とにおける測定されたＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６及びＩＬ－１７Ａの含有量は、それぞれが病態対照群における測定されたものより低い。
【0050】
図５を参照すると、比較群と実験群１及び２とにおける測定されたＰＧＥ２及びＮＯの含有量は、それぞれが病態対照群における測定されたものより低い。
【0051】
これらの結果から、ＥＧＦはＯＡ及び関節の炎症の症状を緩和する十分な有効性を表し、且つ、ＥＧＦをＣＳ及びＨＡと合わせて使用すると、該有効性が増進されたことが示された。
【0052】
実施例２ ＥＧＦの関節リウマチ（ＲＡ）を緩和する効果の評価
Ａ．実験マウス
以下の実験で使用したメスのＤＢＡ／１マウス（８週齢、体重約２０ｇ）は、台湾台北市の国家実験動物センターから購入したものである。全ての実験マウスは、１２時間の明と１２時間の暗とが交互する周期で、温度を２１℃～２３℃に維持し、且つ相対湿度を４５％～６０％に維持した実験室条件下の動物部屋で飼育された。更に、水と飼料は、全ての実験マウスに自由に摂取させた。実験マウスに関わる全ての実験手順は、台湾国立中興大学の実験動物管理使用委員会の法的規定に準拠し、且つ、アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）の実験動物の管理使用のガイドに従って実施された。
Ａ．実験マウス
以下の実験で使用したメスのＤＢＡ／１マウス（８週齢、体重約２０ｇ）は、台湾台北市の国家実験動物センターから購入したものである。全ての実験マウスは、１２時間の明と１２時間の暗とが交互する周期で、温度を２１℃～２３℃に維持し、且つ相対湿度を４５％～６０％に維持した実験室条件下の動物部屋で飼育された。更に、水と飼料は、全ての実験マウスに自由に摂取させた。実験マウスに関わる全ての実験手順は、台湾国立中興大学の実験動物管理使用委員会の法的規定に準拠し、且つ、アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）の実験動物の管理使用のガイドに従って実施された。
【0053】
Ｂ．ＲＡの誘導及びＥＧＦの投与
２ｍｇ／ｍＬのＣｈｉｃｋ ｔｙｐｅ ＩＩコラーゲン（ＣＩＩ）溶液（米Ｃｈｏｎｄｒｅｘ Ｉｎｃ.社、カタログ番号２００１２）を完全フロイントアジュバント（米Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社、カタログ番号Ｆ５８８１－１０ＭＬ）と１：１（ｖ／ｖ）の比率で混合して、第１のＣＩＩエマルションを得た。２ｍｇ／ｍＬのＣｈｉｃｋ ｔｙｐｅ ＣＩＩ溶液を、不完全フロイントアジュバント（米Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社、カタログ番号ｓｃ－２４６４８）と１：１（ｖ／ｖ）の比率で混合して、第２のＣＩＩエマルションを得た。
２ｍｇ／ｍＬのＣｈｉｃｋ ｔｙｐｅ ＩＩコラーゲン（ＣＩＩ）溶液（米Ｃｈｏｎｄｒｅｘ Ｉｎｃ.社、カタログ番号２００１２）を完全フロイントアジュバント（米Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社、カタログ番号Ｆ５８８１－１０ＭＬ）と１：１（ｖ／ｖ）の比率で混合して、第１のＣＩＩエマルションを得た。２ｍｇ／ｍＬのＣｈｉｃｋ ｔｙｐｅ ＣＩＩ溶液を、不完全フロイントアジュバント（米Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社、カタログ番号ｓｃ－２４６４８）と１：１（ｖ／ｖ）の比率で混合して、第２のＣＩＩエマルションを得た。
【0054】
該メスのＤＢＡ／１マウスは、１つの正常対照群、１つの病態対照群、１つの比較群及び２つの実験群（即ち、実験群１～２）を含む５つのグループに分けられた（各グループにおいてｎ＝６マウス）。２００μＬの該第１のＣＩＩエマルションを、正常対照群、病態対照群、比較群及び２つの実験群の各マウスの尾部の皮下に注射した。該マウスは、初回予防接種後の第２１日に２００μＬの該第２のＣＩＩエマルションを使用してブースター接種させて、ＲＡの発生を誘発する。更に、正常対照群のラットにはアジュバント溶液（ＰＢＳ中）を注射した。
【0055】
ブースター接種完了後、比較群の各マウスに１００μＬの１％ＨＡを腹腔内注射し、実験群１の各マウスに実施例１のセクションＣで調製された該ＥＧＦ溶液（２０μｇ／ｇのＥＧＦ含有）１００μＬを腹腔内注射し、実験群２の各マウスに実施例１のセクションＣで調製された該混合物溶液（２０μｇ／ｇのＥＧＦ含有）１００μＬを腹腔内注射した。各マウスに１日１回、計２０日間投与した。
更に、正常対照群及び病態対照群におけるマウスは、処理を受けていない。
更に、正常対照群及び病態対照群におけるマウスは、処理を受けていない。
【0056】
Ｃ．ＲＡ重症度の評価
初回予防接種後の第２１日終了の時、Ｂｒａｎｄ Ｄ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．（２００７）、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．，２：１２６９－１２７５、及び、Ｍｉｌｉｃｉ Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００８）、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．，１０：Ｒ１４に説明されているビジュアル関節炎スコアリングシステムにより、各マウスにおける病的症状（即ち、足底の関節、足首及び膝関節の紅斑と浮腫）を評価した。その後、上記のビジュアル関節炎スコアリングシステムは、初回予防接種後の第４２日まで３日ごとに実施した（即ち、各マウスは８回採点された）。ＲＡ重症度の程度は、１～８のスケールで採点された。スケールが高いほど、ＲＡの重症度が高い。
初回予防接種後の第２１日終了の時、Ｂｒａｎｄ Ｄ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．（２００７）、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．，２：１２６９－１２７５、及び、Ｍｉｌｉｃｉ Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００８）、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．，１０：Ｒ１４に説明されているビジュアル関節炎スコアリングシステムにより、各マウスにおける病的症状（即ち、足底の関節、足首及び膝関節の紅斑と浮腫）を評価した。その後、上記のビジュアル関節炎スコアリングシステムは、初回予防接種後の第４２日まで３日ごとに実施した（即ち、各マウスは８回採点された）。ＲＡ重症度の程度は、１～８のスケールで採点された。スケールが高いほど、ＲＡの重症度が高い。
【0057】
図６を参照すると、病態対照群のＲＡの重症度は、時間の経過とともに徐々に増加した。病態対照群と比較すると、比較群及び実験群１のＲＡの重症度の増加は緩慢であった。特に、実験群２のＲＡの重症度は、病態対照群、比較群及び実験群１のより低く、且つ、初回予防接種後の第３３日～第４２日では、ＲＡの進行においてＲＡの緩和傾向が観察された。
【0058】
これらの結果から、ＥＧＦはＲＡ及びＲＡに関わる症状を緩和する十分な有効性を表し、且つ、ＥＧＦをＣＳ及びＨＡと合わせて使用すると、該有効性が増進されたことが示された。
【0059】
Ｄ．組織病理学の分析
この実施例のセクションＣのＲＡ重症度の評価が完了した後、各グループのマウスを９５％ＣＯ２で窒息させることにより屠殺し、且つ各マウスの死体から後肢の膝関節組織及び足底組織を得た。各マウスの後肢の膝関節組織は、実施例１のセクションＦで説明されている方法に従って、組織切片、ヘマトキシリン-エオシン染色、光学顕微鏡での観察を順に行った。
この実施例のセクションＣのＲＡ重症度の評価が完了した後、各グループのマウスを９５％ＣＯ２で窒息させることにより屠殺し、且つ各マウスの死体から後肢の膝関節組織及び足底組織を得た。各マウスの後肢の膝関節組織は、実施例１のセクションＦで説明されている方法に従って、組織切片、ヘマトキシリン-エオシン染色、光学顕微鏡での観察を順に行った。
【0060】
次に、各該組織切片の病的症状（即ち炎症性細胞浸潤、滑膜の過形成及び軟骨表面の浸食）を、Ｄｅｎｇ Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｎａｔ Ｍｅｄ．，１１：１０６６－１０７２に説明されている方法に従って評価した。炎症性細胞浸潤、滑膜の過形成及び軟骨表面の浸食の程度は、１～４のスケールで採点された。スケールが高いほど、病的症状の重症度が高い。
【0061】
このように得られたデータを、「基本手順」のセクション１の方法に従って分析した。
形態学的観察の結果（データは表示されない）に基づくと、比較群及び実験群１において、軟骨構造が部分的に損傷していて、部分的に無傷軟骨表面が観察された。特に、実験群２において、軟骨構造が完全であって、軟骨表面が正常対照群の軟骨表面に似て滑らかであった。
形態学的観察の結果（データは表示されない）に基づくと、比較群及び実験群１において、軟骨構造が部分的に損傷していて、部分的に無傷軟骨表面が観察された。特に、実験群２において、軟骨構造が完全であって、軟骨表面が正常対照群の軟骨表面に似て滑らかであった。
【0062】
図７を参照すると、実験群１及び２における測定された病的症状（即ち炎症性細胞浸潤、滑膜の過形成及び軟骨表面の浸食）のスケールは、それぞれが病態対照群における測定されたものより明白にまたは著しく低い。
【0063】
これらの結果から、ＥＧＦはＲＡ及びＲＡと関連している軟骨病変を緩和する十分な有効性を表し、且つ、ＥＧＦをＣＳ及びＨＡと合わせて使用すると、該有効性が増進されたことが示された。
【0064】
Ｅ．足底組織の炎症マーカーの測定
１００ｍｇのこの実施例のセクションＤで得られた各マウスの足底組織を、液体窒素で凍結処理し、そしてすりつぶした。得られた基本組織を１ｍＬの組織溶解緩衝液（台湾Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．社、カタログ番号ＧＢ－１８１－１００）（プロテアーゼ阻害剤カクテル含有）と混合し、続いて、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１７Ａ、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－８の含有量を、それぞれメーカーの指示に従って、ＴＮＦ－α ＥＬＩＳＡキット（米ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、カタログ番号４３０９０４）、ＩＬ－１βＥＬＩＳＡキット（米ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、カタログ番号４３２６０４）、ＩＬ－６ ＥＬＩＳＡキット（米ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、カタログ番号４３１３０４）、ＩＬ－１７Ａ ＥＬＩＳＡキット（米ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、カタログ番号４３２５０４）、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡキット（米ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、カタログ番号４３０８０７）、ＩＬ－８ ＥＬＩＳＡキット（米ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社、カタログ番号ＭＢＳ２６１９６７）を使用して測定した。
１００ｍｇのこの実施例のセクションＤで得られた各マウスの足底組織を、液体窒素で凍結処理し、そしてすりつぶした。得られた基本組織を１ｍＬの組織溶解緩衝液（台湾Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．社、カタログ番号ＧＢ－１８１－１００）（プロテアーゼ阻害剤カクテル含有）と混合し、続いて、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１７Ａ、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－８の含有量を、それぞれメーカーの指示に従って、ＴＮＦ－α ＥＬＩＳＡキット（米ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、カタログ番号４３０９０４）、ＩＬ－１βＥＬＩＳＡキット（米ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、カタログ番号４３２６０４）、ＩＬ－６ ＥＬＩＳＡキット（米ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、カタログ番号４３１３０４）、ＩＬ－１７Ａ ＥＬＩＳＡキット（米ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、カタログ番号４３２５０４）、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡキット（米ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、カタログ番号４３０８０７）、ＩＬ－８ ＥＬＩＳＡキット（米ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社、カタログ番号ＭＢＳ２６１９６７）を使用して測定した。
【0065】
このように得られたデータを、「基本手順」のセクション１の方法に従って分析した。
図８及び９を参照すると、実験群１及び２とにおける測定されたＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１７Ａ、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－８の含有量は、それぞれが病態対照群における測定されたものより明白にまたは著しく低い。
図８及び９を参照すると、実験群１及び２とにおける測定されたＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１７Ａ、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－８の含有量は、それぞれが病態対照群における測定されたものより明白にまたは著しく低い。
【0066】
これらの結果から、ＥＧＦはＲＡ及びＲＡによる炎症の反応を緩和する十分な有効性を表し、且つ、ＥＧＦをＣＳ及びＨＡと合わせて使用すると、該有効性が増進されたことが示された。
【0067】
上記の試験結果をまとめと、ＥＧＦは、関節炎（例えば、ＯＡ及びＲＡなど）を有効的に緩和する能力があり、グリコサミノグリカン（例えばＣＳなど）及びＨＡと更に合わせて使用して期待の効果を発揮することができる。
【0068】
以上、本開示の好ましい実施形態及び変化例を説明したが、本開示はこれらに限定されるものではなく、最も広い解釈の精神および範囲内に含まれる様々な構成として、全ての修飾および均等な構成を包含するものとする。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】