特許 7545414 ヒト免疫不全ウイルス複製阻害剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-08-27

(45)【発行日】2024-09-04

(54)【発明の名称】ヒト免疫不全ウイルス複製阻害剤

(51)【国際特許分類】

   C07D 403/14 20060101AFI20240828BHJP

   A61K 31/517 20060101ALI20240828BHJP

   A61P 31/18 20060101ALI20240828BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240828BHJP

【ＦＩ】

C07D403/14 CSP

A61K31/517

A61P31/18

A61P43/00 121

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2021564572

(86)(22)【出願日】2020-04-27

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-07-06

(86)【国際出願番号】 IB2020053938

(87)【国際公開番号】W WO2020222108

(87)【国際公開日】2020-11-05

【審査請求日】2023-04-18

(31)【優先権主張番号】62/840,434

(32)【優先日】2019-04-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】520218040

【氏名又は名称】ビーブ、ヘルスケア、ユーケー、（ナンバー５）、リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＶＩＩＶ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ ＵＫ （ＮＯ．５） ＬＩＭＩＴＥＤ

(74)【代理人】

【識別番号】100091487

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 行孝

(74)【代理人】

【識別番号】100120031

【弁理士】

【氏名又は名称】宮嶋 学

(74)【代理人】

【識別番号】100120617

【弁理士】

【氏名又は名称】浅野 真理

(74)【代理人】

【識別番号】100126099

【弁理士】

【氏名又は名称】反町 洋

(72)【発明者】

【氏名】マノイ、パテル

【審査官】安藤 倫世

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１８／２０３２３５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０２０／０８４４８０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０２０／０９５１７６（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｄ

Ａ６１Ｋ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

【化1】

及びその薬学的に許容される塩からなる群より選択される化合物又は塩。

【請求項2】

【化2】

及びその薬学的に許容される塩から選択される請求項１に記載の化合物又は塩。

【請求項3】

【化3】

及びその薬学的に許容される塩から選択される請求項１に記載の化合物又は塩。

【請求項4】

立体化学が下記のとおりである、請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物又は塩。

【化4】

【請求項5】

請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物又は塩を含む医薬組成物。

【請求項6】

薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含む、請求項５に記載の組成物。

【請求項7】

経口投与、筋肉内注射又は皮下注射に適した、請求項５又は６に記載の組成物。

【請求項8】

ヒトにおけるＨＩＶ感染の治療に使用するための、請求項５～７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項9】

ヒトにおけるＨＩＶ感染の治療に使用される少なくとも１つの他の薬剤と組み合わせて使用するための、請求項８に記載の組成物。

【請求項10】

前記他の薬剤が、ドルテグラビル、ビテグラビル、ラミブジン、フォステムサビル、カボテグラビル、マラビロク、リルピビリン、アタザナビル、テノホビル・アラフェナミド、イスラトラビル、ドラビリン、及びダルナビルからなる群より選択される、請求項９に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

＜発明の属する技術分野＞
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染の治療のための化合物、組成物、及び方法に関する。より詳細には、本発明は、新規なＨＩＶ阻害剤、かかる化合物を含有する医薬組成物、及びＨＩＶ感染の治療においてこれらの化合物を使用する方法が提供される。本発明はまた、以下に記載される化合物を製造する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

＜背景技術＞
後天性免疫不全症候群（エイズ）はＨＩＶによる感染の結果である。ＨＩＶは依然として世界の主要な公衆衛生問題である。２０１５年には推定３６，７００，０００人（うち１，８００，０００人の子どもを含む）がＨＩＶとともに生活しており、世界のＨＩＶ陽性率は０．８％である。この数の大多数は低・中所得国に住んでいる。同年には１，１００，０００人がエイズ関連疾患で死亡した。

【0003】

ＨＩＶ感染者に対する現在の治療法は、承認された抗レトロウイルス薬の組み合わせで構成されている。現在、２４種類を超える薬剤が、ＨＩＶ感染に対して承認されており、１種類の薬剤、又は固定用量の組み合わせもしくは１種類の錠剤レジメンのいずれかとして承認されており、後者の２つには、承認された２種類から４種類の薬剤が含まれている。これらの薬剤は、ウイルス複製サイクル中のウイルス酵素又はウイルスタンパク質の機能を標的とする多くの異なるクラスに属する。したがって、薬剤は、ヌクレオチド逆転写酵素阻害薬（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオチド逆転写酵素阻害薬（ＮＮＲＴＩ）、プロテアーゼ阻害薬（ＰＩ）、インテグラーゼ鎖移動阻害薬（ＩＮＳＴＩ）又は侵入阻害薬（１つのマラビロクは宿主のＣＣＲ５タンパク質を標的とし、もう１つのエンフビルチドはウイルスのｇｐ１６０タンパク質のｇｐ４１領域を標的とするペプチド）のいずれかに分類される。さらに、抗ウイルス活性を持たない薬物動態学的エンハンサー（コビシスタット）が最近、ブースターを必要とする抗レトロウイルス薬（ＡＲＶ）との併用で承認された。

【0004】

薬剤及び薬剤の組み合わせの装備にもかかわらず、新しい抗レトロウイルス薬に対する医学的必要性が残っている。高いウイルス異質性、薬物関連毒性、耐用性の問題、及び不十分なアドヒアランスはすべて、治療の失敗につながる可能性があり、１つ以上の抗レトロウイルス薬又はクラス全体からの複数の薬物に対して耐性を与える突然変異を有するウイルスの選択をもたらす可能性がある（Ｂｅｙｒｅｒ，Ｃ．，Ｐｏｚｎｉａｋ Ａ．ＨＩＶ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ－ａｎ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｔｈｒｅａｔ ｔｏ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１７，３７７，１６０５－１６０７；Ｇｕｐｔａ，Ｒ．Ｋ．，Ｇｒｅｇｓｏｎ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．ＨＩＶ－１ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｂｅｆｏｒｅ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｒ ｒｅ－ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｒｓｔ－ｌｉｎｅ ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｌｏｗ－ｉｎｃｏｍｅ ａｎｄ ｍｉｄｄｌｅ－ｉｎｃｏｍｅ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ：ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｍｅｔａ－ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２０１７，１８，３４６－３５５；Ｚａｚｚｉ，Ｍ．，Ｈｕ，Ｈ．，Ｐｒｏｓｐｅｒｉ，Ｍ．Ｔｈｅ ｇｌｏｂａｌ ｂｕｒｄｅｎ ｏｆ ＨＩＶ－１ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｓｔ ２０ ｙｅａｒｓ．ＰｅｅｒＪ．２０１８，ＤＯＩ１０．７７１７／ｐｅｅｒｊ．４８４８）。その結果、より服用しやすく、耐性の発生に対する遺伝的障壁が高く、現在の薬剤よりも安全性が向上した新薬が必要とされている。この多様な選択肢の中で、好ましい抗レトロウィルス療法（ＡＲＴ）の一部として使用できる新しい作用機序（ＭＯＡ）は、現在の薬剤に耐性のあるウイルスに対して有効であるべきであるため、依然として主要な役割を果たすことができる。

【0005】

ある種の潜在的に治療可能な化合物は、現在、当該技術分野において記載されており、Ｂｌａｉｒ，Ｗａｄｅ Ｓ．ｅｔ．ａｌ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ（２００９），５３（１２），５０８０－５０８７，Ｂｌａｉｒ，Ｗａｄｅ Ｓ．ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ（２０１０），６（１２），ｅ１００１２２０，Ｔｈｅｎｉｎ－Ｈｏｕｓｓｉｅｒ，Ｓｕｚｉｅ；Ｖａｌｅｎｔｅ，Ｓｕｓａｎａ Ｔ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ＨＩＶ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１６，１４，２７０－２８２，並びに以下の番号のＰＣＴ特許出願： ＷＯ２０１２０６５０６２、ＷＯ２０１３００６７３８、ＷＯ２０１３００６７９２、ＷＯ２０１４１１０２９６、ＷＯ２０１４１１０２９７、ＷＯ２０１４１１０２９８、ＷＯ２０１４１３４５６６、ＷＯ２０１５１３０９６４、ＷＯ２０１５１３０９６６、ＷＯ２０１６０３３２４３、ＷＯ２０１８０３５３５９，及びＷＯ２０１８２０３２３５に記載されている。

【0006】

当技術分野において現在必要とされているのは、新規であり、かつＨＩＶの治療に有用な追加の化合物である。さらに、これらの化合物は、例えば、それらの作用機序、結合、阻害効力、標的選択性、溶解度、安全性プロファイル、又は生物学的利用能の１つ以上に関して、薬学的使用のための利点を提供するべきである。また、これらの化合物を利用する新しい製剤及び治療方法も必要とされている。

【発明の概要】

【0007】

＜発明の簡単な説明＞
簡単に説明すると、１つの態様において、本発明は以下に示される化合物、

【化1】

【0008】

及びその薬学的に許容される塩を開示する。

【0009】

別の態様において、本発明は、本発明の化合物又は塩を含む医薬組成物を開示する。

【0010】

別の態様において、本発明は、本発明の化合物又は塩を投与することを含む、ヒトにおけるＨＩＶ感染を治療する方法を開示する。

【0011】

別の態様において、本発明は、治療に使用するための本発明の化合物又は塩を開示する。

【0012】

別の態様において、本発明は、ヒトにおけるＨＩＶ感染を治療する際に使用するための本発明の化合物又は塩を開示する。

【0013】

別の態様において、本発明は、ヒトにおけるＨＩＶ感染の治療のための医薬の製造における本発明の化合物又は塩の使用を開示する。

【発明を実施するための形態】

【0014】

＜発明の詳細な説明＞
好ましくは、本発明の化合物及び塩の立体化学は以下に示す通りである。

【化2】

【0015】

本発明の塩は薬学的に許容可能である。そのような塩は酸付加塩又は塩基付加塩であり得る。適切な薬学的に許容可能な塩の総説については、例えば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ，Ｓｃｉ．６６，１－１９，１９７７を参照されたい。

【0016】

代表的な薬学的に許容される酸付加塩としては、限定されるものではないが、４－アセトアミドベンゾエート、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホナート（ベシレート）、安息香酸塩、重硫酸塩、酸性酒石酸塩、酪酸塩、エデト酸カルシウム、カンファレート、カンファスルホン酸塩（カンシル酸塩）、カプリン酸塩（デカン酸塩）、カプロン酸塩（ヘキサン酸塩）、カプリル酸（オクタン酸塩）、ケイ皮酸塩、クエン酸塩、シクラミン酸塩、ジグルコン酸塩、２，５－ジヒドロ安息香酸塩、ジコハク酸塩、ドデシル硫酸塩（エストレート）、エデト酸塩（エチレンジアミン４酢酸塩）、エストレート（ラウリル硫酸塩）、エタン－１，２－ジスルホン酸塩（エジシル酸塩）、エタンスルホン酸塩（エシレート）、ギ酸塩、フマル酸塩、ガラクタル酸塩（粘液酸塩）、ゲンチジン酸塩（２，５－ジヒドロ安息香酸塩）、グルコヘプトン酸塩（グルセプト酸塩）、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、グルタミン酸塩、グルタル酸塩、グリセロリン酸塩、グリコール酸塩、ヘキシルレゾルシン酸塩、馬尿酸塩、ヒドラバミン（Ｎ，Ｎ’－ジヒドロ安息香酸）、ヒドロブロミド、ヒドロクロリド、ヒドロヨード、ヒドロキシナフトエ酸塩、イソブチル酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩（メシラート）、メチル硫酸塩、粘液酸塩、ナフタレン－１，５－ジスルホン酸塩（ナパジシレート）、ナフタレン－２－スルホン酸塩（ナプシレート）、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ｐ－アミノベンゼンスルホン酸塩、ｐ－アミノサリチル酸塩、パモ酸塩（エンボネート）、パントテン酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルエチルバルビツール酸塩、リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩（トシレート）、ピログルタミン酸塩、ピルビン酸塩、サリチル酸塩、セバシン酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、スルファミン酸塩、硫酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩（８－クロロテオフィリネート）、チオシアン酸塩、ウンデカン酸塩、ウンデシレン酸塩、及び吉草酸塩が含まれる。

【0017】

代表的な薬学的に許容される塩基付加塩としては、限定されないが、アルミニウム、２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）－１，３－プロパンジオール（ＴＲＩＳ、トロメタミン）、アルギニン、ベネタミン（Ｎ－ベンジルフェネチルアミン）、ベンザチン（Ｎ、Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン）、ビス－（２－ヒドロキシエチル）アミン、ビスマス、カルシウム、クロロプロカイン、コリン、クレミゾール（１－ｐクロロベンジル－２－ピロリルジン－１’－イルメチルベンズイミダゾール）、シクロヘキシルアミン、ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、ジエチルトリアミン、ジメチルアミン、ジメチルエタノールアミン、ドーパミン、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｌ－ヒスチジン、鉄、イソキノリン、レピジン、リチウム、リジン、マグネシウム、メグルミン（Ｎ－メチルグルカミン）、ピペラジン、ピペリジン、カリウム、プロカイン、キニン、キノリン、ナトリウム、ストロンチウム、ｔ－ブチルアミン、及び亜鉛が含まれる。

【0018】

１つの実施形態において、本発明の組成物はさらに、薬学的に受容可能な賦形剤を含む。本発明の方法において、好ましい投与経路は、経口及び皮下注射又は筋肉注射である。従って、好ましい医薬組成物は、経口投与に適した組成物（例えば、錠剤）及び皮下注射又は筋肉注射に適した組成物を含む。

【0019】

別の態様において、本発明は、本発明の化合物又は塩を投与することを含む、ヒトにおけるＨＩＶ感染を予防するか又は感染のリスクを低減する方法を開示する。曝露前予防（ＰｒＥＰ）とは、ＨＩＶ感染のリスクがある人がＨＩＶ感染の可能性を低下させるために毎日薬を服用することである。ＰｒＥＰは感染のリスクを低下させるのに有効であることが示されている。

【0020】

本発明の化合物及び塩は、それらの生物学的標的としてＨＩＶキャプシドを有すると考えられ、したがって、それらの作用機序は、ＨＩＶキャプシドの機能を１以上の方法で修飾することである。

【0021】

本発明の化合物及び塩は、単独で又は他の治療剤と組み合わせて使用することができる。従って、本発明による併用療法は、本発明の少なくとも１つの化合物又は塩の投与、及びＨＩＶ感染の治療に有用であり得る少なくとも１つの他の剤の投与を含む。本発明の化合物又は塩、及び他の剤は、単一の医薬組成物中で一緒に処方及び投与されてもよく、又は別々に処方及び投与されてもよい。別々に処方及び投与される場合、投与は同時に又は任意の順序で連続して行われてもよい。適切な他の薬剤には、例えば、ドルテグラビル、ビクテグラビル、ラミブジン、フォステムサビル、カボテグラビル、マラビロック、リルピベリン、アタザナビル、フマル酸テノホビルジソプロキシル、テノホビルアラフェナミド、イスラトラビル、ドラビリン、及びダルナビルが含まれる。好ましい薬剤には、例えば、ドルテグラビル、ビクテグラビル、イスラトラビル、ラミブジン、フォステムサビル、及びカボテグラビルが含まれる。特に好ましい薬剤には、例えば、ドルテグラビル、ビクテグラビル、ラミブジン、フォステムサビル、及びカボテグラビルが含まれる。

【実施例】

【0022】

例
２－メチル－２－（メチルスルホニル）プロパン酸エチルの調製

【化3】

【0023】

ＤＭＦ（５０ｍＬ）中のメタンスルフィン酸ナトリウム（５．０ｇ、４８．９８ｍｏｌ、２．４５当量）の室温及びＮ_２雰囲気下での撹拌懸濁液に、ピリジン（６．３ｍＬ）及び２－ブロモ－２－メチルプロパン酸エチル（３．９ｇ、２０．０ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加した。反応混合物を５０℃に加熱し、５０℃で１８時間撹拌した。混合物を２５℃に冷却し、次いで水（１５０ｍＬ）及びＭＴＢＥ（１００．０ｍＬ）で希釈した。混合物を同じ温度で３０～４５分間撹拌した。有機層を分離し保存した。水層をＭＴＢＥ（２×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を飽和ＮａＨＣＯ_３溶液（５０ｍＬ）、次いで２．０Ｎ ＨＣｌ（５０ｍＬ）、次いで１５％ＮａＣｌ溶液（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、次いで５０℃未満の真空下で濃縮して、２－メチル－２－（メチルスルホニル）プロパン酸エチルを液体として得た。粗生成物２．５ｇ（６４％）を、精製することなく次の工程に直接使用した。粗生成物の^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ 4.27 (q, J=7.04 Hz, 2H), 3.06 (s, 3H), 1.65 (s, 6H), 1.32 (t, J=7.04 Hz, 3H). APCI-MS[M+H]⁺: 195.0。

【0024】

２－メチル－２－（メチルスルホニル）プロパナールの調製

【化4】

【0025】

無水ジクロロメタン（１００ｍＬ）中の２－メチル－２－（メチルスルホニル）プロパン酸エチル（上記のように調製した粗製物質、５．０ｇ、２５．７４ｍｍｏｌ、１．０当量）の撹拌溶液に、ＤＩＢＡＬ－Ｈ（トルエン中１Ｍ、５１．４８ｍＬ）を－７０～－８０℃でゆっくりと加えた。反応混合物を－７８℃で２時間撹拌した。反応が完了したことを決定した後（ＴＬＣ）、混合物を－７０～－８０℃で水性２０％酒石酸カリウムナトリウム（５０．０ｍＬ）の添加によってクエンチした。混合物を室温まで温め、次いで４～６時間撹拌した。混合物をセライトパッドで濾過し、ジクロロメタン（２５ｍＬ）で洗浄した。濾液の相を分配した；有機相を保存した。水層をジクロロメタン（２５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を１５％ＮａＣｌ水溶液（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、次いで４５℃以下の真空下で濃縮した。得られたゴム状液体生成物、粗２－メチル－２－（メチルスルホニル）プロパナール（２．６ｇ、６７％）を、精製することなく次の工程に直接使用した。

【0026】

３－メチル－３－（メチルスルホニル）ブタ－１－インの調製

【化5】

【0027】

炭酸カリウム（３．６８ｇ、３６．３２ｍｍｏｌ、２．０当量）のメタノール（２０ｍＬ）中の攪拌溶液に、室温で（２－メチル－２－（メチルスルホニル）プロパナール（上記のように調製した粗製物質）（２．０ｇ、１３．３１ｍｍｏｌ、１．０当量））を加えた。１０～１５分間攪拌した後、混合物を０℃に冷却した。混合物にジメチル（１－ジアゾ－２－オキソプロピル）ホスホナート（「Ｂｅｓｔｍａｎｎ Ｏｈｉｒａ試薬」、３．０７ｇ、１５．９７ｍｍｏｌ、１．２当量）を加え、同じ温度で１５～３０分間攪拌した。反応混合物を室温に温め、次いで４時間攪拌した。反応混合物をセライトパッドで濾過し、ジクロロメタン（２０ｍＬ）で洗浄した。濾液を５０℃未満で真空下で濃縮した。粗残留物をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、次いで溶液を飽和ＮａＨＣＯ_３溶液（３０ｍＬ）、次いで１５％ＮａＣｌ溶液（３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、次いで４５℃未満で真空下で濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ ８０：２０→７０：３０）により精製して、純粋な３－メチル－３－（メチルスルホニル）ブタ－１－インを灰白色固体として得た、１．３ｇ（６７％）。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ3.04 (s,3H), 2.59 (s,1H), 1.67 (s,6H)。APCI-MS[M+H]+=147.1。

【0028】

ビシクロ［３．１．０］ヘキサン－３－オールの調製

【化6】

【0029】

０～５℃のＮ_２雰囲気下、ＤＣＭ（１２００ｍＬ）中のシクロペンタ－３－エノール（１３０ｇ、１５４５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ジエチル亜鉛のヘキサン（１．０Ｍ、３０９１ｍＬ、３０９１ｍｍｏｌ）中の溶液を３時間かけて滴下した。０℃の溶液に、ジヨードメタン（２４９ｍＬ、３０９１ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（３００ｍＬ）中の溶液を１時間かけて滴下した。反応混合物を２７℃に加温したところ、白色沈殿の形成が観察された。混合物を１６時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣ（ＳｉＯ_２、２０％ＥｔＯＡｃ／ペット、Ｒｆ＝０．３、ＵＶ不活性、ＰＭＡ活性）によってモニターした。反応混合物を、飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液（１．５Ｌ）の注意深い添加によってクエンチした。混合物をセライトのパッドで濾過した。水層をＤＣＭ（２×１Ｌ）で抽出した。合わせた有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、次いで減圧下で濃縮して、粗ビシクロ［３．１．０］ヘキサン－３－オールを赤色液体として得た、１８０ｇ。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ=4.41-4.35 (m, 1h), 2.18-2.05 (m, 2H), 1.73 (d, J=13.9 Hz, 2H), 1.35-1.25 (m, 2H), 1.21-1.14 (m, 1h), 0.57-0.43 (m, 2H)。GCMS: m/z=98.1)。

【0030】

ビシクロ［３．１．０］ヘキサン－３－オンの製造

【化7】

【0031】

０℃のＮ_２雰囲気下、ＤＣＭ（５０００ｍＬ）中のビシクロ［３．１．０］ヘキサン－３－オール（２１０ｇ、２０５４ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、少しずつＤｅｓｓ－Ｍａｒｔｉｎペルヨージナン（９５４ｇ、２２５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２７℃に加温し、次いで１６時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣ（ＳｉＯ_２、２０％アセトン／ヘキサン、Ｒｆ＝０．３、ＵＶ不活性、ＰＭＡ不活性）によりモニターした。反応混合物をセライトのパッドを通して濾過し、濾液を水性ＮａＯＨ（１Ｎ、８×１Ｌ）で洗浄した。合わせた水性相をＤＣＭ（５×１Ｌ）で抽出した。合わせた有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、次いで減圧下（浴温度：２０℃）で濃縮して、褐色液体としての粗ビシクロ［３．１．０］ヘキサン－３－オンを得た。この液体をさらに７０℃での下方蒸留により精製して、淡黄色粘性液体としてビシクロ［３．１．０］ヘキサン－３－オン、１２５ ｇ（６２％）を得た。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ=2.61-2.54 (m, 2H), 2.17-2.12 (m, 2H), 1.54-1.46 (m, 2H), 0.92-0.86 (m, 1H), -0.01--0.08 (m, 1H); GCMS:M/Z=96.1。

【0032】

２－（２，２－ジフルオロアセチル）ビシクロ［３．１．０］ヘキサン－３－オンの調製

【化8】

【0033】

－７８℃のＮ_２雰囲気下、ＴＨＦ（１５００ｍＬ）中のビシクロ［３．１．０］ヘキサン－３－オン（１２５ｇ、１２７４ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＬＤＡ（ＴＨＦ中２．０Ｍ、０．７０１Ｌ、１４０２ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を－７８℃で１時間撹拌した。溶液をＴＨＦ（３００ｍＬ）中のジフルオロ酢酸エチル（１７４ｇ、１４０２ｍｍｏｌ）の溶液を－７８℃の温度を維持しながら３０分かけてゆっくりと加えた。反応混合物を２７℃に加温し、次いで１時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣ（ＳｉＯ_２、２０％アセトン／ヘキサン、Ｒｆ＝０．３、ＵＶ活性）によってモニターした。反応混合物を水性ＨＣｌ（１Ｎ、２０００ｍＬ）の添加によってクエンチした。混合物を３０分間撹拌し、次いでＥｔＯＡｃ（３×１０００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を食塩水（１０００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過した。濾液を減圧下で濃縮して、２－（２，２－ジフルオロアセチル）ビシクロ［３．１．０］ヘキサン－３－オンを淡黄色粘性液体として得た、１８０ｇ（７１％）。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ=6.18 (t, J=54.8 Hz, 1H), 2.70-2.62 (m, 1H), 2.35 (d, J=19.4 Hz, 1H), 2.14 (br s, 1H), 1.26-1.21 (m, 1H), 1.04-1.03 (m, 1H), 0.22-0.21 (m, 1H), LCMS:M/Z=173.17)。

【0034】

２－（３－（ジフルオロメチル）－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１ Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）酢酸エチルの調製

【化9】

【0035】

２－（２，２－ジフルオロアセチル）ビシクロ［３．１．０］ヘキサン－３－オン（１８０ｇ、９１０ｍｍｏｌ）のエタノール（２Ｌ）中の、Ｎ_２雰囲気下、２７℃で攪拌した溶液に、２－ヒドラジニル酢酸エチル塩酸塩（４２２ｇ、２７２９ｍｍｏｌ）、次いで硫酸（２０ｍＬ、３７５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を３０分間攪拌し、次いで１００℃に加熱し、１６時間攪拌した。反応の進行をＴＬＣ（ＳｉＯ_２、２０％アセトン／ヘキサン、Ｒｆ＝０．３、ＵＶ活性）によりモニターした。反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃ（２０００ｍＬ）に溶解し、水（２×１Ｌ）、ブライン（１．０Ｌ）で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、次いで減圧下で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｐｅｔ．：アセトン１００：０→９８：２）に付して、２－（３－（ジフルオロメチル）－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）酢酸エチルをオフホワイト固体１１０ｇ（４６％）として得た。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ=6.86 (t, J=54.8 Hz, 1H), 4.93(s,2H), 4.14 (q, J=7.2 Hz, 2H), 2.88-2.79 (m, 1H), 2.76-2.68 (m, 1H), 2.14-2.04 (m, 2H), 1.19 (t, J=7.2 Hz, 3H), 1.10-1.03 (m, 1H), 0.14 (q, J=4.3 Hz, 1H)。

【0036】

２－（３－（ジフルオロメチル）－５－オキソ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）酢酸エチルの調製

【化10】

【0037】

シクロヘキサン（３．５Ｌ）中の２－（３－（ジフルオロメチル）－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）酢酸エチル（１１０ｇ、４２２ｍｍｏｌ）及びセライト（３９５ｇ）の０℃での撹拌溶液に、二クロム酸ピリジニウム（７９４ｇ、２１１０ｍｍｏｌ）を少量ずつ加えた。窒素雰囲気下の混合物に、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド（３５５ｍＬ、２１３０ｍｍｏｌ）を１０分間かけて滴下した。反応混合物を２７℃に加温し、次いで、その温度で４８時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣ（ＳｉＯ_２、３０％アセトン／ペット、Ｒｆ＝０．４、ＵＶ活性）によりモニターした。反応混合物を濾過し、フィルターケーキをＥｔＯＡｃ（１０００ｍＬ）で抽出した。濾液を飽和水性Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３（２×５００ｍＬ）；飽和水性ＦｅＳＯ_４（３００ｍＬ）；次いでブライン（５００ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して、粗標記化合物（１５０ｇ）を得た。

【0038】

２－（３－（ジフルオロメチル）－４，４ ａ－ジヒドロスピロ［シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－５，２’－［１，３］ジチオラン］－１（３ｂＨ）－イル）酢酸エチルの調製

【化11】

【0039】

ＤＣＭ（１５００ｍＬ）中の２－（３－（ジフルオロメチル）－５－オキソ－３ｂ，４，４ａ、５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）酢酸エチル（７５ｇ、２６９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、２７℃、窒素雰囲気下で、エタン－１，２－ジチオール（４３．０ｍＬ、５１１ｍｍｏｌ）を加え、次いで、三フッ化ホウ素酢酸（７２．６ｍＬ、５１１ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を１６時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣ（ＳｉＯ_２、２０％アセトン／Ｐｅｔ、Ｒｆ＝０．３５、ＵＶ活性）によってモニターした。完了後、反応混合物を０℃に冷却し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（５００ｍＬ）の添加によってクエンチした。混合物をＤＣＭ（２×１０００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物を食塩水（１０００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して褐色液体を得た。この物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｐｅｔ．：ＥｔＯＡｃ ９５：５→９０：１０）に付して、２－（３－（ジフルオロメチル）－４，４ａ－ジヒドロスピロ［シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－５，２’－［１，３］ジチオラン］－１（３ｂＨ）－イル）酢酸エチルをオフホワイト固体として８０ｇ（７４％）で得た。¹H-NMR (400MHz,CDCl₃) δ=6.61 (t, J=55.2 Hz, 1H), 5.00-4.85 (m, 2H), 4.29-4.19 (m,2H), 3.55-3.46 (m,4H), 2.63-2.53 (m, 1H), 2.49-2.38 (m, 1H), 1.30-1.24 (m,4H), 0.65-0.60 (m, 1H)。LCMS M+H=346.9。

【0040】

２－（３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）酢酸エチルの調製

【化12】

【0041】

ＤＣＭ（２０ｍＬ）中の１，３－ジブロモ－５，５－ジメチルイミダゾリジン－２，４－ジオン（２６．３ｇ、９２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＨＦ－ピリジン（２．４６０ｇ、２４．８３ｍｍｏｌ）を添加した。溶液は３０分間であった。溶液に、ＤＣＭ（２０ｍＬ）中の２－（３－（ジフルオロメチル）－４，４ａ－ジヒドロスピロ［シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－５，２’－１，３］ジチオラン］－１（３ｂＨ）－イル）酢酸エチル（１０ｇ、２５ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応混合物を－４０℃に加温し、次いで、その温度で１時間撹拌した。反応の進行は、ＴＬＣ（ＳｉＯ_２、３０％ＥｔＯＡｃ／Ｐｅｔ、Ｒｆ＝０．３、ＵＶ不活性）によってモニターした。反応混合物を、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２００ｍＬ）の添加によってクエンチした。混合物を室温に温め、次いで、ＥｔＯＡｃ（２ｘ１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物を食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して、褐色固体を得た。この物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｐｅｔ．：ＥｔＯＡｃ １００：０→７５－２５）にかけて、２－（３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）酢酸エチルを淡黄色固体として８．５ｇ（９１％）得た。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ=6.62 (t, J=55.2 Hz, 1H), 4.82 (s, 2H), 4.30-4.18 (m, 2H), 2.51-2.37 (m, 2H), 1.42-1.35 (m, 1H), 1.31-1.23 (m, 3H), 1.14-1.08 (m, 1H)。LCMS M+H=293.07。

【0042】

２－（３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）酢酸の調製

【化13】

【0043】

ＴＨＦ（１７ｍＬ）中の２－（３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）酢酸エチル（１５ｇ，５０ｍｍｏｌ）及びＮ_２雰囲気下０℃のＭｅＯＨ（６６ｍＬ）の攪拌溶液に、ＬｉＯＨ（１．７８８ｇ，７４．７ｍｍｏｌ）の水（６６ｍＬ）溶液を添加した。反応混合物を２７℃加温し、次いで、その温度で３時間攪拌した。反応の進行をＴＬＣ（ＳｉＯ_２，５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ，Ｒｆ＝０．２，ＵＶ活性）によってモニターした。完了後、反応混合物を減圧下で濃縮し、水（５０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（２×２５０ｍＬ）で洗浄して不純物を除去した。水性層を、ＨＣｌ水溶液（１Ｍ）を用いてｐＨ ２～３に調整し、次いで、ＥｔＯＡｃ（３×１０００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機物を無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して、２－（３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）酢酸をオフホワイト固体１４ｇ（９８％）として得た。LCMS M+H=265.15。

【0044】

２－（（３ｂＳ，４ａＲ）－３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）酢酸及び２－（（３ｂＲ，４ａＳ）－３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）酢酸を与える分離

【化14】

【0045】

２－（３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）酢酸（５．５ｇ）をイソプロパノール（２０ｍＬ）に溶解した。この溶液を次のように部分的にＳＦＣキラル分離に供した：機器＝Ｔｈａｒ８０；カラム＝Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＩＣ ３０ｘ２５０ｍｍ，５ミクロン；溶媒Ａ＝超臨界ＣＯ２；溶媒Ｂ＝イソプロパノールと０．５％イソプロピルアミン（ｖ／ｖ）；溶離液組成＝７０％Ａ：３０％Ｂ；流速＝６５ｇ／分；背圧＝１００バール；温度＝３０℃；注入量＝２．５ｍＬ；検出＝２２０ｎｍ。２－（（３ｂＳ，４ａＳ）－３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）酢酸を７．５分から１４分まで溶出するピークとして集めた；２－（（３ｂＲ，４ａＳ）－３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）酢酸を２．７分から５．８分まで溶出するピークとして集めた。各エナンチオマーについて、得られた溶液を減圧下で濃縮し、得られた固体をＥｔＯＡｃ中に溶解し、次いでクエン酸水溶液（１Ｍ）、次いで水、次いでブラインで２回洗浄した。有機溶液をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、次いで真空中で濃縮して、８０～９０％回収率で分離されたエナンチオマーを得た。

【0046】

３－ブロモ－６－クロロ－２－フルオロベンズアルデヒドの調製

【化15】

【0047】

無水ＴＨＦ（２．０Ｌ）中の１－ブロモ－４－クロロ－２－フルオロベンゼン（２００ｇ、０．９５５ｍｏｌ、１．０当量）の撹拌溶液に、ＴＨＦ（２．０Ｍ、６２０ｍＬ、１．２４ｍｏｌ、１．３当量）中のＬＤＡの溶液を－５０℃で添加した。反応混合物を－２０℃に加温し、１時間撹拌した。混合物を－５０℃に冷却し、混合物にＤＭＦ（１８４．８ｍＬ、２．４８ｍｏｌ、２．６当量）を－５０℃の温度に維持しながらゆっくりと加えた。混合物を、０℃に加温し、同じ温度（０℃）で３０～４５分間撹拌した。混合物を氷冷水（２．０Ｌ）のゆっくりした添加によってクエンチした。反応混合物を酢酸エチル（２．０Ｌ）で希釈し、室温で１５分間撹拌した。有機層を分離し、保存した；水層を酢酸エチル（２×１．０Ｌ）で抽出した。合わせた有機層を水（２×１．０Ｌ）；１．０Ｎ ＨＣｌ（１．０Ｌ）、次いで１５％ＮａＣｌ溶液（２．０Ｌ）で洗浄した。有機溶液をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、次いで減圧下で濃縮した。得られた粗製固体をさらに精製することなく次の工程で直接使用した。粗製生成物の収率：２１０．０ｇ（９３％）。

【0048】

３－ブロモ－６－クロロ－２－フルオロベンゾニトリルの調製

【化16】

【0049】

水（２．１Ｌ）中の３－ブロモ－６－クロロ－２－フルオロベンズアルデヒド（２１０．０ｇ、０．８９ｍｏｌ、１．０当量）の、室温で撹拌した溶液に、ヒドロキシルアミン－０－スルホン酸（１７５．１５ｇ、１．５５ｍｏｌ、１．７５当量）を加えた。反応混合物を５０℃に加熱し、１８時間撹拌した。混合物を室温に冷却し、１－１．５時間撹拌した。固体を濾過により単離し、次いで水で洗浄した。湿った固体を５０℃で１２－１５時間真空下で乾燥して、３－ブロモ－６－クロロ－２－フルオロベンズアルデヒド、１９０．０ｇ（９１％）を得た。

【0050】

７－ブロモ－４－クロロ－１Ｈ－インダゾール－３－アミンの調製

【化17】

【0051】

水冷コンデンサ、温度計及びメカニカルスターラーを取り付けた３Ｌの三口丸底フラスコに、３－ブロモ－６－クロロ－２－フルオロベンゾニトリル（１００ｇ、４２７ｍｍｏｌ）及びエタノール（５００ｍＬ）を加えた。溶液にヒドラジン水和物（１０４ｍｌ、２１３３ｍｍｏｌ）を室温で加えた。溶液を８０℃に加熱し、その温度で１時間維持した後、混合物が均質な溶液となり、ＬＣＭＳ分析により反応が完了したことが示された。溶液を４５℃に冷却し、次いで水（１Ｌ）をゆっくりと加えて、白色沈殿を濃厚スラリーとして得た。添加後、混合物を３０分間撹拌した。固体を濾過により単離した。固体を濾過により単離した。固体を水（１Ｌ）で洗浄し、次いで真空下４５℃で乾燥して、７－ブロモ－４－クロロ－１Ｈ－インダゾール－３－アミンを薄いオレンジ色の固体として得た１０３ｇ（９８％）。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 12.21 (bs, 1H), 7.41 (d, J=7.8 Hz, 1H), 6.84 (d, J=7.8 Hz, 1H), 5.34 (bs ,2H) ppm。

【0052】

７－ブロモ－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－アミンの調製

【化18】

【0053】

３－ブロモ－６－クロロ－２－フルオロベンゾニトリル（３６０．０ｇ、１．５５ｍｏｌ、１．０当量）のエタノール（１．０８Ｌ）溶液に、メチルヒドラジン硫酸塩（１．１１ｋｇ、７．７３ｍｏｌ、５．０当量）を加え、次いでトリエチルアミン（１．３Ｌ、９．３ｍｏｌ、６．０当量）を２５～３５℃で加えた。反応混合物を１１０℃に加熱し、その温度で１５時間維持した。混合物を室温に冷却し、混合物に水（３．０Ｌ）を加えた。混合物を室温で１時間撹拌した。固体を濾過により単離し、水で洗浄した。湿潤固体を５０℃で１２－１５時間真空下で乾燥した。材料をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ ９０：１０→６０：４０）に付して、７－ブロモ－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－アミンを淡黄色固体、１８５．０ｇ（４６％）として得た。

【0054】

Ｎ－（７－ブロモ－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－イル）メタンスルホンアミドの調製

【化19】

【0055】

ＣＨ_２Ｃｌ_２（９００ｍＬ）中の７－ブロモ－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－アミン（９０ｇ、０．３４ｍｏｌ、１．０当量）の溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（「ＤＩＰＥＡ」、１８０．４ｍＬ、１．０４ｍｏｌ、３．０当量）及び４－ジメチルアミノピリジン（「ＤＭＡＰ」、２．０７ｇ、０．０１７ｍｏｌ、０．０５当量）を添加した。混合物を５分間攪拌し、次いで０℃に冷却し、メタンスルホニルクロリド（６７．７ｍＬ、０．８７ｍｏｌ、２．５当量）を添加して、顕著な発熱を生じさせた。反応混合物を室温に加温し、その温度で３時間攪拌したところ、沈殿が形成された。混合物をジクロロメタン（１．０Ｌ）で希釈し、次いで水（２．０Ｌ）、次いでＨＣｌ水溶液（１．０Ｍ、１．０Ｌ）、次いでブライン（１．５Ｌ）で洗浄した。有機溶液をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、次いで減圧下で濃縮した。粗製残渣をＥｔＯＨ（１．８Ｌ）に溶解した。溶液にＮａＯＨ水溶液（２０％、６５０ｍＬ）を室温で添加し、わずかな発熱が認められた。得られた混合物を２時間攪拌し、混合物は均一な溶液となった。溶液を水（２．０Ｌ）で希釈し、ｐＨをＨＣｌ水溶液（１．０Ｍ、ａｐｐ．３．０Ｌ）を用いてｐＨ ２～３に調整した。形成された沈殿を濾過により集めた。固体を水で洗浄し、次いで減圧下で乾燥して、Ｎ－（７－ブロモ－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－イル）メタンスルホンアミドを灰白色固体９６ｇ（８２％）として得た。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7.48 (d, J=7.9 Hz, 1H), 7.24 (br s, 1H), 6.95 (d, J=7.9 Hz, 1H), 4.38 (s, 3H), 3.42 (s, 3H)。 LC/MS(M+H)⁺=337.80。

【0056】

Ｎ－（７－ブロモ－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－イル）－Ｎ－（４－メトキシベンジル）メタンスルホンアミドの調製

【化20】

【0057】

ＤＭＦ（９８０ｍＬ）中のＮ－（７－ブロモ－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－イル）メタンスルホンアミド（４９ｇ、０．１４４ｍｏｌ、１．０当量）の混合物に、１－（クロロメチル）－４－メトキシベンゼン（２３．５４ｍＬ、０．１７ｍｏｌ、１．２当量）を加えた。混合物に、炭酸セシウム（６１．３ｇ、０．１８ｍｏｌ、１．３当量）を加えた。混合物を８０℃に加熱し、２時間その温度に維持した。反応の完了後（ＴＬＣで監視）、混合物を水（２．０Ｌ）に注いだ。混合物をＥｔＯＡｃ（２×１．５Ｌ）で抽出した。合わせた有機層をブライン（１．０Ｌ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、次いで減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン：ＥｔＯＡｃ（９：１、１２０ｍＬ）から結晶化して、所望の生成物Ｎ－（７－ブロモ－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－イル）－Ｎ－（４－メトキシベンジル）メタンスルホンアミドを白色固体として得た。収率：６２ｇ（９４％）。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7.44 (d, J=7.9 Hz, 1H), 7.31 (d, J=8.5 Hz, 2H), 6.99 (d, J=7.9 Hz, 1H), 6.84(d, J=8.5 Hz, 2H), 4.99(br s, 1H), 4.76 (br s, 1H), 4.40 (s, 3H), 3.80 (s, 3H), 3.01 (s, 3H)。

【0058】

Ｎ－（７－アミノ－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－イル）－Ｎ－（４－メトキシベンジル）メタンスルホンアミドの調製

【化21】

【0059】

室温でＮＭＰ（９００ｍＬ）中のＮ－（７－ブロモ－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－イル）－Ｎ－（４－メトキシベンジル）メタンスルホンアミド（５５ｇ、０．１２ｍｏｌ、１．０当量）の撹拌溶液にヨウ化銅（Ｉ）（４．５７ｇ、０．０２４ｍｏｌ、０．２当量）、アスコルビン酸ナトリウム（４７．４ｇ、０．２４ｍｏｌ、２当量）及び（１Ｒ、２Ｒ）－Ｎ_１，Ｎ_２－ジメチルシクロヘキサン－１，２－ジアミン（８．５２ｇ、０．０６ｍｏｌ、０．５当量）を添加した。次いで、水（１８２ｍＬ）中のアジ化ナトリウム（２３．３ｇ、０．３６ｍｏｌ、３．０当量）の溶液を添加した。混合物を１００℃に加熱し、その温度で１２時間維持した。反応混合物を室温に冷却し、酢酸エチル（１．５Ｌ）で希釈し、次いでセライトのパッドで濾過した。フィルターパッドをＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）で抽出した。合わせた濾液を水（２．０Ｌ）で希釈し、有機層を単離し、保存した。水相をＥｔＯＡｃ（２×１．０Ｌ）で抽出した。合わせた有機層を水（１．０Ｌ）；ブライン（１．０Ｌ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し；濾過し；及び減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ １００：０～８０：２０）で精製して標記化合物Ｎ－（７－アミノ－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－イル）－Ｎ－（４－メトキシベンジル）メタンスルホンアミドを灰白色固体として２７．０ｇ（５７％）で得た。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.33-7.29 (m,2H), 6.89 (d, J=7.8 Hz, 1H), 6.85-6.79 (m, 2H), 6.48 (d, J=7.8 Hz, 1H), 5.11 (br. s, 1H), 4.81 (br. s, 1H), 4.30 (s, 3H), 3.80 (br. s, 2H), 3.79 (s, 3H), 2.99 (s, 3H)。LC/MS(M+H)⁺=395.00。

【0060】

ｔｅｒｔ－ブチル（Ｓ）－（１－（７－ブロモ－３－（４－クロロ－３－（Ｎ－（４－メトキシベンジル）メチルスルホンアミド）－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－４－オキソ－３，４－ジヒドロキナゾリン－２－イル）－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）カルバメートの調製

【化22】

【0061】

ピリジン（５０ｍＬ）中の（Ｓ）－２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－３－（３，５－ジフルオロフェニル）プロパン酸（３．８２ｇ、１２．６６ｍｍｏｌ）、２－アミノ－４－ブロモ安息香酸（３．０１ｇ、１３．９３ｍｍｏｌ）及びＮ－（７－アミノ－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－イル）－Ｎ－（４－メトキシベンジル）メタンスルホンアミド（５ｇ、１２．６６ｍｍｏｌ）の溶液に、亜リン酸ジフェニル（９．８０ｍＬ、５０．６ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を予熱した油浴（７０℃）上に置き、７０℃で１６時間加熱した。混合物を室温に冷却し、次いで減圧下で濃縮した。次いで混合物をＥｔＯＡｃ（約５００ｍＬ）で希釈し、水性クエン酸（０．５Ｍ、２×５０ｍＬ）、次いで水性ＮａＯＨ（１Ｍ、３×５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、次いで濃縮した。次いで残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（３３０ｇシリカゲルカラム、ヘキサンの勾配：ＥｔＯＡｃ ０：１００→５０：５０）で精製して、ｔｅｒｔ－ブチル（Ｓ）－（１－（７－ブロモ－３－（４－クロロ－３－（Ｎ－（４－メトキシベンジル）メチルスルホンアミド）－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－４－オキソ－３，４－ジヒドロキナゾリン－２－イル）－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）カルバメート（６．２ｇ、７．２２ｍｍｏｌ、収率５７．１％）を淡黄色固体フォーム（アトロプ異性体の分離不可能な混合物）として得た。ＬＣ／ＭＳ：ｍ／ｚ＝８０１．１０［Ｍ－ｔＢｕ］。

【0062】

（Ｓ）－Ｎ－（７－（２－（１－アミノ－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）－７－ブロモ－４－オキソキナゾリン－３（４Ｈ）－イル）－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－イル）メタンスルホンアミドの調製

【化23】

【0063】

ジクロロメタン（ＤＣＭ）（５０ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチル（Ｓ）－（１－（７－ブロモ－３－（４－クロロ－３－（Ｎ－（４－メトキシベンジル）メチルスルホンアミド）－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－４－オキソ－３，４－ジヒドロキナゾリン－２－イル）－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）カルバメート（６．２ｇ、７．２２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、トリフルオロ酢酸（２０ｍＬ、２６０ｍｍｏｌ）、次いでトリフルオロメタンスルホン酸（０．７７０ｍＬ、８．６７ｍｍｏｌ）を加えた。得られた暗赤色溶液を室温で１時間攪拌した。この時点でのＬＣＭＳは、２つのジアステレオマーアトロプ異性体の存在に一致する所望の生成物質量を含む２つのピークを示す（約３０：７０の比）。混合物を減圧下で濃縮し、得られた残渣を、ＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）と水性ＮａＯＨ（１Ｍ、３０ｍＬ）との間で分配した。水相を試験し、ｐＨ＞＝８．０と決定した。有機相を単離し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、次いで真空下で濃縮した。残渣をＣ１８クロマトグラフィー（２７５ｇ ＲｅｄｉＳｅｐ Ｇｏｌｄカラム、移動相Ａ： ５：９５アセトニトリル：０．１％ＴＦＡを添加した水；移動相Ｂ： ９５：５アセトニトリル：０．１％ＴＦＡを添加した水；３０分かけて１０－６０％Ｂの勾配）により３つの約等分の画分において精製した。主要なアトロプ異性体を含む画分（２回目の溶出）を合わせ、水性１Ｍ ＮａＯＨの添加によりｐＨ８に調製し、酢酸エチルで抽出し、ブライン（飽和食塩水）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、次いで濃縮して、所望の主要なアトロプ異性体（Ｓ）－Ｎ－（７－（２－（１－アミノ－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）－７－ブロモ－４－オキソキナゾリン－３（４Ｈ）－イル）－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－イル）メタンスルホンアミドを得た。（２．４ｇ、３．７６ｍｍｏｌ、５２％収率）。 ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.11 (d, J=8.55 Hz, 1 H), 8.06 (d, J=1.53 Hz, 1 H), 7.81 (dd, J=8.55, 1.83 Hz, 1 H), 7.33 (s, 2 H), 6.96 - 7.05 (m, 1 H), 6.75 (br d, J=7.02 Hz, 2 H), 3.67 (s, 3 H), 3.56 (dd, J=7.63, 5.19 Hz, 1 H), 3.25 - 3.29 (m, 1 H), 3.21 (s, 3 H), 2.81 (dd, J=13.43, 8.24 Hz, 1 H)。 LCMS: m/z = 637.05 [M+H]⁺。

【0064】

Ｎ－（（Ｓ）－１－（７－ブロモ－３－（４－クロロ－１－メチル－３－（メチルスルホンアミド）－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－４－オキソ－３，４－ジヒドロキナゾリン－２－イル）－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）－２－（（３ｂＳ，４ａＲ）－３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）アセトアミドの調製

【化24】

【0065】

テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（３０ ｍＬ）中の（Ｓ）－Ｎ－（７－（２－（１－アミノ－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）－７－ブロモ－４－オキソキナゾリン－３（４Ｈ）－イル）－４－クロロ－１－メチル－１Ｈ－インダゾール－３－イル）メタンスルホンアミド（２．０８ｇ，３．２６ｍｍｏｌ）、２－（（３ｂＳ，４ａＲ）－３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）酢酸（０．８６１ｇ、３．２６ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（「ＤＩＰＥＡ」）（１．７０９ｍＬ、９．７８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＡＴＵ（１．３６４ｇ，３．５９ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で３時間撹拌した。得られた混合物に、メタノール（２Ｍ，３ｍＬ）中のアンモニアを加えた。得られた混合物を室温で３０分間撹拌した。次いで、水を加え、混合物を酢酸エチルで抽出し、ブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ １００：０→３０：７０）に付して、Ｎ－（（Ｓ）－１－（７－ブロモ－３－（４－クロロ－１－メチル－３－（メチルスルホンアミド）－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－４－オキソ－３，４－ジヒドロキナゾリン－２－イル）－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）－２－（（３ｂＳ，４ａＲ）－３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）アセトアミド（２．５ｇ、２．８３ｍｍｏｌ、８７％収率）を得た。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ ppm 8.18 (d, J=8.24 Hz, 1 H), 7.88 (d, J=1.53 Hz, 1 H), 7.72 (dd, J=8.55, 1.83 Hz, 1 H), 7.33 (s, 1 H), 7.16 (d, J=7.63 Hz, 1 H), 6.57 - 6.83 (m, 4 H), 6.38 (br d, J=5.80 Hz, 2 H), 4.71 - 4.80 (m, 1 H), 4.63 (d, J=6.71 Hz, 2 H), 3.56 (s, 3 H), 3.40 (s, 3 H), 3.18 (dd, J=13.73, 6.10 Hz, 1 H), 2.86 (dd, J=13.58, 7.48 Hz, 1 H), 2.52 - 2.61 (m, 1 H), 2.41 - 2.50 (m, 1 H), 1.42 - 1.50 (m, 1 H), 1.09 - 1.16 (m, 1 H)。LCMS: m/z = 883.05 [M+H]⁺。

【0066】

７－ブロモ－４－クロロ－１－（２，２－ジフルオロエチル）－１Ｈ－インダゾール－３－アミンの調製

【化25】

【0067】

０℃の乾燥ＴＨＦ（１．９２Ｌ）中の７－ブロモ－４－クロロ－１Ｈ－インダゾール－３－アミン（１２８．０ｇ、０．５２ｍｏｌ、１．０当量）の撹拌溶液に、部分的にｔＢｕＯＫ（７６ｇ、０．６７ｍｏｌ、１．３当量）を添加した。反応混合物を０℃で１０分間撹拌し、次いで、この溶液に、２，２－ジフルオロエチルトリフルオロメタンスルホン酸（１２２．５ｇ、０．５７ｍｏｌ、１．１当量）を０℃でゆっくりと加えた。混合物を室温にゆっくりと温め、次いで、２時間撹拌した。混合物を氷冷水（３．０Ｌ）及びＭＴＢＥ（２×１．５Ｌ）で希釈した。有機層を分離し、水（２×１．２Ｌ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、次いで、減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ ９５：５→９０：１０）に付した。望ましくない位置異性体で汚染された生成物含有画分を濃縮し、次いで、ＤＣＭ（５ｍＬ／ｇ）でトリチュレートして純粋な所望の生成物を得て、次いで、純粋な物質の画分と合わせた。この方法により、７－ブロモ－４－クロロ－１－（２，２－ジフルオロエチル）－１Ｈ－インダゾール－３－アミンが淡黄色固体として得られ、１１０ｇ（６８％）であった。¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ 7.55 (d, 1H, J=7.9 Hz), 6.96 (d, 1H, J=7.9 Hz), 6.1-6.5 (m, 1H), 5.62 (s, 2H), 4.94 (dt, 2H, J=3.8, 14.1 Hz)。

【0068】

Ｎ－（７－ブロモ－４－クロロ－１－（２，２－ジフルオロエチル）－１Ｈ－インダゾール－３－イル）シクロプロパンスルホンアミドの調製

【化26】

【0069】

乾燥ピリジン（１００ｍＬ）中の７－ブロモ－４－クロロ－１－（２，２－ジフルオロエチル）－１Ｈ－インダゾール－３－アミン（１０ｇ、０．０３２ｍｏｌ、１．０当量）の攪拌溶液に、塩化シクロプロピルスルホニル（１８．１ｇ、０．１２８ｍｏｌ、４．０当量）を加えた。反応混合物を室温で４８時間攪拌した。混合物を水（４００ｍＬ）で希釈し、ＭＴＢＥ（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を水（３×３００ｍＬ）、食塩水（３００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をヘキサン（１５Ｖ）でトリチュレートして、Ｎ－（７－ブロモ－４－クロロ－１－（２，２－ジフルオロエチル）－１Ｈ－インダゾール－３－イル）シクロプロパンスルホンアミドを淡赤色固体として得た、１１．１ｇ（８２％）。

【0070】

Ｎ－（７－ブロモ－４－クロロ－１－（２，２－ジフルオロエチル）－１ Ｈ－インダゾール－３－イル）－Ｎ－（４－メトキシベンジル）シクロプロパンスルホンアミドの調製

【化27】

【0071】

ＤＭＦ（１５０ｍＬ）中のＮ－（７－ブロモ－４－クロロ－１－（２，２－ジフルオロエチル）－１Ｈ－インダゾール－３－イル）シクロプロパンスルホンアミド（１５ｇ、０．０３６ｍｏｌ、１．０当量）及び１－（クロロメチル）－４－メトキシベンゼン（６．７９ｇ、０．０４３ｍｏｌ、１．２当量）の撹拌混合物に、炭酸セシウム（１５．３２ｇ、０．０４７ｍｏｌ、１．３当量）を添加した。反応混合物を８０℃に加熱し、その温度で２時間撹拌した。反応の完了後（薄層クロマトグラフィーで監視）、混合物を水（３００ｍＬ）に注ぎ、生成物をＭＴＢＥ（２×２００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を食塩水（３００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲルカラム精製（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ ８０：２０→７５：２５）に付して、Ｎ－（７－ブロモ－４－クロロ－１－（２，２－ジフルオロエチル）－１Ｈ－インダゾール－３－イル）－Ｎ－（４－メトキシベンジル）メタンスルホンアミドをゴム状液体１６．５ｇ（８６％）として得た。

【0072】

Ｎ－（７－アミノ－４－クロロ－１－（２，２－ジフルオロエチル）－１Ｈ－インダゾール－３－イル）－Ｎ－（４－メトキシベンジル）シクロプロパンスルホンアミドの調製

【化28】

【0073】

室温でＮＭＰ（５１２ｍＬ）中のＮ－（７－ブロモ－４－クロロ－１－（２，２－ジフルオロエチル）－１Ｈ－インダゾール－３－イル）－Ｎ－（４－メトキシベンジル）シクロプロパンスルホンアミド（３２ｇ、０．０５９ｍｏｌ、１．０当量）の攪拌溶液に、ヨウ化銅（Ｉ）（２．２７ｇ、０．０１２ｍｏｌ、０．２当量）、アスコルビン酸ナトリウム（２３．７ｇ、０．１２ｍｏｌ、２当量）及び（１Ｒ、２Ｒ）－Ｎ_１，Ｎ_２－ジメチルシクロヘキサン－１，２－ジアミン（４．２５ｇ、０．０３ｍｏｌ、０．５当量）を添加した。混合物に、水（１１２ｍＬ）中のアジ化ナトリウム（１１．６ｇ、０．１８ｍｏｌ、３．０当量）の溶液を添加した。反応物を１００℃に加熱し、１８時間同じ温度で攪拌した。混合物を室温に冷却し、酢酸エチル（１．２Ｌ）で希釈した。混合物をセライトのパッドで濾過し、ＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）で抽出した。合わせた濾液を水（１．５Ｌ）に注ぎ、有機層を単離し、保存した。水層をＥｔＯＡｃ（２×０．８Ｌ）で抽出した。合わせた有機層を水（２×０．８ Ｌ）、ブライン（０．８Ｌ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、次いで減圧下で濃縮した。粗残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ １００：０～８０：２０）に付して、標記化合物、Ｎ－（７－アミノ－４－クロロ－１－（２，２－ジフルオロエチル）－１Ｈ－インダゾール－３－イル）－Ｎ－（４－メトキシベンジル）シクロプロパンスルホンアミドを灰白色固体、１４．２ｇ（５０％）で得た。

【0074】

（Ｓ）－（１－（７－ブロモ－３－（４－クロロ－１－（２，２－ジフルオロエチル）－３－（Ｎ－（４－メトキシベンジル）シクロプロパンスルホンアミド）－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－４－オキソ－３，４－ジヒドロキナゾリン－２－イル）－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチルの調製

【化29】

【0075】

（Ｓ）－２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－３－（３，５－ジフルオロフェニル）プロパン酸（１５ｇ、４９．８ｍｍｏｌ）及び２－アミノ－４－ブロモ安息香酸（１２．９１ｇ、５９．７ｍｍｏｌ）のピリジン（１５０ｍＬ）中の攪拌溶液に、密封チューブ中、２６℃で、ジフェニルホスファイト（３５．７ｍＬ、１８４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、試薬の各添加につきＮ_２バブリングにより脱気した。反応混合物を８０℃に加熱し、２時間攪拌した。反応混合物を２６℃に冷却し、次いで、Ｎ－（７－アミノ－４－クロロ－１－（２，２－ジフルオロエチル）－１Ｈ－インダゾール－３－イル）－Ｎ－（４－メトキシベンジル）シクロプロパンスルホンアミド（Ｎ６６７３４－９０－Ａ２、２０．４９ｇ、３４．９ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を８０℃で１６時間加熱した。反応の進行をＴＬＣ（ＳｉＯ_２、３０％ＥｔＯＡｃ／Ｐｅｔ．Ｒｆ＝０．３）によりモニターした。反応混合物を２６℃に冷却し、次いで減圧下で濃縮した。残渣を水（１５０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（２×５００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を、クエン酸水溶液（５％ｗ／ｖ、２×１５０ｍＬ）、次いでブライン（２５０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮して、褐色のゴム状液体（４０ｇ）を得た。上記手順を繰り返し、両方の反復の粗生成物を合わせた。次いで、この物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｐｅｔ．：ＥｔＯＡｃ，６０：４０→５５：４５）に付して、（Ｓ）－（１－（７－ブロモ－３－（４－クロロ－１－（２，２－ジフルオロエチル）－３－（Ｎ－（４－メトキシベンジル）シクロプロパンスルホンアミド）－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－４－オキソ－３，４－ジヒドロキナゾリン－２－イル）－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（ジアステレオマーの混合物）を黄色固体（４２ｇ，９８％）として得た。LCMS: M+H=933.88 & 935.88；純度＝７６．９１％。

【0076】

（Ｓ）－Ｎ－（７－（２－（１－アミノ－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）－７－ブロモ－４－オキソキナゾリン－３（４Ｈ）－イル）－４－クロロ－１－（２，２－ジフルオロエチル）－１Ｈ－インダゾール－３－イル）シクロプロパンスルホンアミドの調製

【化30】

【0077】

Ｎ_２雰囲気下２７℃のＤＣＭ（１４０ｍＬ）中の（Ｓ）－（１－（７－ブロモ－３－（４－クロロ－１－（２，２－ジフルオロエチル）－３－（Ｎ－（４－メトキシベンジル）シクロプロパンスルホンアミド）－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－４－オキソ－３，４－ジヒドロキナゾリン－２－イル）－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ－ブチル（１４ｇ、１１．５３ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、ＴＦＡ（１４０ｍＬ）を加えた。溶液を１０分間攪拌した。溶液にトリフルオロメタンスルホン酸（７．１６ｍＬ、８１ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を２７℃で１時間攪拌した。反応の進行をＴＬＣ（ＳｉＯ_２、５０％ＥｔＯＡｃ／ｐｅｔ、Ｒｆ＝０．２）でモニターした。溶媒を穏やかな窒素流下で除去した。残渣をＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）に溶解し、有機層を飽和ＮａＨＣＯ３（２×１５０ｍＬ）水溶液、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥し、濾過し、乾燥するまで濃縮して、灰白色固体（１２ｇ）として粗化合物を得た。上記の手順をさらに２回繰り返し、追加の粗生成物（２×１４ｇ）を上記と合わせた。合わせた物質をジクロロメタン（５００ｍＬ）に溶解し、濃縮して、均一な粗固体を得た。この物質をｐｅｔ．エーテル：ＥｔＯＡｃ（８０：２０）で洗浄し、次いで真空下で乾燥させ、茶色の固体（３０ｇ）を得た。この物質を次いで以下の条件でＣ１８逆相クロマトグラフィーにかけた：カラム＝ＲｅｄｉＳｅｐ Ｇｏｌｄ ＨＰ Ｃ１８ ２７５ｇ；移動相Ａ＝水：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ（９５０：５０：１）；移動相Ｂ＝水：ＭｅＣＮ：ＴＦＡ（５０：９５０：１）；流速＝８０ｍＬ／ｍｉｎ；勾配のプロファイル（時間／％Ｂ）＝５／５，５／１０，５／１５，１０／２０，１５／３０，２０／４０，１５／４５，１０／５０；温度＝周囲。主要なピークの各分をプールし、減圧下で濃縮して、非水性溶媒を除去した。得られた水性溶液を飽和ＮａＨＣＯ_３（１０００ｍＬ）水溶液の添加により中和し、次いでＥｔＯＡｃ（４×５００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブライン（５００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、ろ過し、濃縮して、（Ｓ）－Ｎ－（７－（２－（１－アミノ－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）－７－ブロモ－４－オキソキナゾリン－３（４Ｈ）－イル）－４－クロロ－１－（２，２－ジフルオロエチル）－１Ｈ－インダゾール－３－イル）シクロプロパンスルホンアミド（単一のジアステレオマー）を灰白色の個体として得た。次いで、この物質を以下の条件下でＳＦＣ精製に供した：カラム／寸法＝Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＯＸ－Ｈ（３０×２５０ｍｍ）、５μ；溶媒Ａ＝液体ＣＯ_２；溶媒Ｂ＝０．５％ジエチルアミンを添加されたメタノール；溶離液＝Ａ：Ｂ（７０：３０）；流量＝１００．０ｇ／分；背圧＝１００．０バール；検出＝ＵＶ（２１４ｎｍ）；注入量＝１．３ｍＬ（９３ｍｇ／注入）；１６０注入。２つのピークを別々に収集し、主ピークを減圧下で濃縮して、淡黄色固体として（Ｓ）－Ｎ－（７－（２－（１－アミノ－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）－７－ブロモ－４－オキソキナゾリン－３（４Ｈ）－イル）－４－クロロ－１－（２，２－ジフルオロエチル）－１Ｈ－インダゾール－３－イル）シクロプロパンスルホンアミド（単一立体異性体）、７．５ｇ（２０％）を得た。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 8.11 - 8.04 (m, 2H), 7.82-7.78 (m, 1H), 7.47 - 7.39 (m, 2H), 7.02 - 6.95 (m, 1H), 6.76-6.69 (m, 2H), 6.38 - 6.19 (m, 1H), 4.48 - 4.37 (m, 1H), 4.32 - 4.24 (m, 1H), 3.54 - 3.48 (m, 1H), 3.3 -3.20 (m, 1 H), 2.97 - 2.90 (m, 1H), 2.83 - 2.76 (m, 1H), 1.05 - 0.99 (m, 4H)。LCMS: M+H = 712.94 and 714.94; 純度＝９８．３７％、キラルＨＰＬＣ純度＝９６％。

【0078】

Ｎ－（（Ｓ）－１－（７－ブロモ－３－（４－クロロ－３－（シクロプロパンスルホンアミド）－１－（２，２－ジフルオロエチル）－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－４－オキソ－３，４－ジヒドロキナゾリン－２－イル）－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）－２－（（３ｂＳ，４ａＲ）－３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）アセトアミドの調製

【化31】

【0079】

ＤＭＦ（５ｍＬ）中、（Ｓ）－Ｎ－（７－（２－（１－アミノ－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）－７－ブロモ－４－オキソキナゾリン－３（４Ｈ）－イル）－４－クロロ－１Ｈ）－イル）－４－クロロ－１－（２，２－ジフルオロエチル）－１Ｈ－インダゾール－３－イル）シクロプロパンスルホンアミド（５００ｍｇ、０．７００ｍｍｏｌ）、２－（（３ｂＳ，４ａＲ）－３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）酢酸（Ｎ６８０８４－１５－Ａ１、１８５ｍｇ、０．７００ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（４２．９ｍｇ、０．２８０ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、Ｎ－メチルモルホリン（０．３０８ｍＬ、２．８０ｍｍｏｌ）及びＮ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（２４２ｍｇ、１．２６１ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を２７℃で１６時間攪拌した。反応の進行をＴＬＣ（ＳｉＯ_２、５０％ＥｔＯＡｃ／Ｐｅｔ、Ｒｆ＝０．３、ＵＶ活性）でモニターした。完了時に、反応混合物を氷冷水（７０ｍＬ）で希釈し、２７℃で１５分間攪拌した。沈殿固体を濾過により集め、次いで真空下で乾燥して、灰白色の固体として、粗化合物を得た。この粗化合物をシリカゲルクロマトグラフィー （ｐｅｔ．：ＥｔＯＡｃ（９８：２→５０：５０）にかけ、Ｎ－（（Ｓ）－１－（７－ブロモ－３－（４－クロロ－３－（シクロプロパンスルホンアミド）－１－（２，２－ジフルオロエチル）－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－４－オキソ－３，４－ジヒドロキナゾリン－２－イル）－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）－２－（（３ｂＳ，４ａＲ）－３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）アセトアミドを灰白色個体、５５０ｍｇ（８０％）として得た。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 9.99 (s, 1H), 9.24 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.13 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.97 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.87-7.83 (m, 1H), 7.77 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.54 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.06-6.79 (m, 2H), 6.64-6.58 (m, 2H), 6.23-5.98 (m, 1H), 4.74-4.57 (m, 2H), 4.41-4.35 (m, 1H), 4.29-4.16 (m, 1H), 3.94-3.84 (m, 1H), 3.38-3.34 (m, 1H), 3.02-2.93 (m, 1H), 2.90-2.83 (m, 1H), 2.48-2.35 (m, 2H), 1.37-1.30 (m, 1H), 1.02-0.90 (m, 4H), 0.87-0.82 (m, 1H)。ＬＣＭＳ分析法Ｆ：ＲＴ＝６．７４分、(M+H)=959.0 and 961.0; LCMS純度＝９８％；キラルＨＰＬＣ純度＝９８％。

【0080】

実施例１の調製：Ｎ－（（Ｓ）－１－（３－（４－クロロ－１－メチル－３－（メチルスルホンアミド）－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－７－（３－メチル－３－（メチルスルホニル）ブタ－１－イン－１－イル）－４－オキソ－３，４－ジヒドロキナゾリン－２－イル）－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）－２－（（３ｂＳ，４ａＲ）－３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）アセトアミド

【化32】

【0081】

Ｎ－（（Ｓ）－１－（７－ブロモ－３－（４－クロロ－１－メチル－３－（メチルスルホンアミド）－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－４－オキソ－３，４－ジヒドロキナゾリン－２－イル）－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）－２－（（３ ｂＳ，４ ａＲ）－３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）アセトアミド（５０ ｍｇ，０．０５７ ｍｍｏｌ）、３－メチル－３－（メチルスルホニル）ブタ－１－イン（９．９２ ｍｇ，０．０６８ ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１．５ ｍＬ）及びトリエチルアミン（０．０２４ ｍＬ，０．１７０ ｍｍｏｌ）を充填したバイアルに、ヨウ化銅（Ｉ）（１．０７７ ｍｇ，５．６６μｍｏｌ）、続いてビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）クロリド（３．９７ ｍｇ，５．６６μｍｏｌ）を加えた。次いで、混合物をアルゴンで５分間脱気し、次いで６０℃で５時間加熱した。次いで、混合物を室温に冷却し、濾過した。濾液をＨＰＬＣ精製（カラム：Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８，２１．２ ｘ １００ ｍｍ，５μｍ粒子；溶媒Ａ＝１００％水中の０．１％ギ酸；溶媒Ｂ＝アセトニトリル、流速＝４０ｍＬ／分、開始％＝３０、最終％Ｂ＝７２．２、勾配時間＝７分、次いで９８％Ｂで２分保持。波長＝２１５ｎｍ及び２５４ｎｍ。ＥＳＩ＋範囲：１５０から１５００ダルトン。資料は３０％Ｂでロードした）にかけて、Ｎ－（（Ｓ）－１－（３－（４－クロロ－１－メチル－３－（メチルスルホンアミド）－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－７－（３－メチル－３－（メチルスルホニル）ブタ－１－イン－１－イル）－４－オキソ－３，４－ジヒドロキナゾリン－２－イル）－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）－２－（（３ｂＳ，４ａＲ）－３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）アセトアミド（２４ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ、４４．７％収率）を得た。¹H NMR (500 MHz, METHANOL-d4) δ ppm 8.26 (d, J=8.05 Hz, 1 H), 7.95 (d, J=1.79 Hz, 1 H), 7.66 - 7.71 (m, 1 H), 7.26 - 7.32 (m, 1 H), 7.20 (d, J=7.75 Hz, 1 H), 6.54 - 6.81 (m, 4 H), 4.78 - 4.82 (m, 1 H), 4.57 - 4.62 (m, 1 H), 4.45 - 4.55 (m, 2 H), 3.59 (s, 3 H), 3.41 - 3.46 (m, 1 H), 3.23 (s, 3 H), 3.19 (s, 3 H), 3.06 (dd, J=14.01, 9.24 Hz, 1 H), 2.37 - 2.47 (m, 2 H), 1.79 (s, 6 H), 1.33 - 1.38 (m, 1 H), 0.95 - 1.01 (m, 1 H)。ＬＣ／ＭＳ保持時間＝１．３６分；ｍ／ｚ＝９４９．３［Ｍ＋Ｈ］^＋。ＬＣＭＳ分析法：カラム＝Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ１８，２．１×３０ｍｍ、１．７μｍ粒子；溶媒Ａ＝１００％水中０．１％ギ酸。溶媒Ｂ＝１００％アセトニトリル中０．１％ギ酸。流速＝０．８ｍＬ／分。開始％Ｂ＝５。最終％Ｂ＝９５。勾配時間＝１．７分、次いで９５％Ｂで０．２分ホールド。波長＝２１５及び２５４ｎｍ。ＥＳＩ＋範囲：１５０から１５００ダルトン。システム＝Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ。

【0082】

実施例２の調製：Ｎ－（（Ｓ）－１－（３－（４－クロロ－３－（シクロプロパンスルホンアミド）－１－（２，２－ジフルオロエチル）－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－７－（３－メチル－３－（メチルスルホニル）ブタ－１－イン－１－イル）－４－オキソ－３，４－ジヒドロキナゾリン－２－イル）－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）－２－（（３ｂＳ，４ａＲ）－３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）アセトアミド

【化33】

【0083】

Ｎ－（（Ｓ）－１－（７－ブロモ－３－（４－クロロ－３－（シクロプロパンスルホンアミド）－１－（２，２－ジフルオロエチル）－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－４－オキソ－３，４－ジヒドロキナゾリン－２－イル）－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）－２－（（３ｂＳ，４ａＲ）－３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）アセトアミド（５０ｍｇ，０．０５２ｍｍｏｌ）、３－メチル－３－（メチルスルホニル）ブタ－１－イン（９．１４ｍｇ，０．０６２ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１．５ｍＬ）及びトリエチルアミン（０．０２２ｍＬ，０．１５６ｍｍｏｌ）を充填したバイアルに、ヨウ化銅（Ｉ）（０．９９２ｍｇ，５．２１μｍｏｌ）、続いてビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（ＩＩ）クロリド（３．６６ｍｇ，５．２１μｍｏｌ）を添加した。次いで、混合物をアルゴンで５分間脱気し、次いで６０℃で５時間加熱した。次いで、混合物を室温に冷却し、濾過した。濾液をＨＰＬＣ精製（カラム＝Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８，２１．２×１００ｍｍ，５μｍ粒子；溶媒Ａ＝１００％水中の０．１％ギ酸；溶媒Ｂ＝アセトニトリル。流速＝４０ｍＬ／分。開始％Ｂ＝３０。最終％Ｂ＝７５．４。勾配時間＝７分、次いで９８％Ｂで２分間保持。波長＝２１５ｎｍ及び２５４ｎｍ。ＥＳＩ＋範囲：１５０から１５００ダルトン。試料を３０％Ｂ）でチャージして、Ｎ－（（Ｓ）－１－（３－（４－クロロ－３－（シクロプロパンスルホンアミド）－１－（２，２－ジフルオロエチル）－１Ｈ－インダゾール－７－イル）－７－（３－メチル－３－（メチルスルホニル）ブタ－１－イン－１－イル）－４－オキソ－３，４－ジヒドロキナゾリン－２－イル）－２－（３，５－ジフルオロフェニル）エチル）－２－（（３ｂＳ，４ａＲ）－３－（ジフルオロメチル）－５，５－ジフルオロ－３ｂ，４，４ａ，５－テトラヒドロ－１Ｈ－シクロプロパ［３，４］シクロペンタ［１，２－ｃ］ピラゾール－１－イル）アセトアミド（３５ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ、６５．５％収率）を得た。

【0084】

¹H NMR (500 MHz, METHANOL-d4) δ ppm 8.25 (d, J=8.05 Hz, 1 H), 7.94 (d, J=1.49 Hz, 1 H), 7.62 - 7.73 (m, 1 H), 7.37 (d, J=8.05 Hz, 1 H), 7.28 (d, J=8.05 Hz, 1 H), 6.45 - 6.82 (m, 4 H), 5.84 - 6.13 (m, 1 H), 4.66 - 4.74 (m, 1 H), 4.54 - 4.64 (m, 2 H), 4.31 - 4.42 (m, 1 H), 3.84 - 3.96 (m, 1 H), 3.34 - 3.40 (m, 1 H), 3.19 (s, 3 H), 3.15 - 3.25 (m, 1 H), 3.02 (dd, J=14.31, 9.54 Hz, 1 H), 2.89 (tt, J=8.05, 4.77 Hz, 1 H), 2.34 - 2.48 (m, 2 H), 1.79 (s, 6 H), 1.31 - 1.39 (m, 1 H), 1.04 - 1.12 (m, 2 H), 0.91 - 1.01 (m, 3 H)。ＬＣ／ＭＳ保持時間＝１．４５分；ｍ／ｚ＝１０２５．２［Ｍ＋Ｈ］^＋。ＬＣＭＳ分析法：カラム＝Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ１８，２．１×３０ｍｍ、１．７μｍ粒子；溶媒Ａ＝１００％水中０．１％ギ酸。溶媒Ｂ＝１００％アセトニトリル中０．１％ギ酸。流速＝０．８ｍＬ／分。開始％Ｂ＝５。最終％Ｂ＝９５。勾配時間＝１．７分、次いで９５％Ｂで０．２分保持。波長＝２１５ｎｍ及び２５４ｎｍ。ＥＳＩ＋範囲：１５０から１５００ダルトン。システム：Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ）

【0085】

生物学的方法：
ＨＩＶ細胞培養アッセイ－ＭＴ－２細胞、２９３Ｔ細胞及びＮＬ_４－３ウイルスのプロウイルスＤＮＡクローンを、ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍから得た。ＭＴ－２細胞を、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００ ｍｇ／ｍｌペニシリンＧ及び１００単位／ｍＬまでのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ １６４０培地中で増殖させた。２９３Ｔ細胞を、１０％熱不活化ＦＢＳ、１００ ｍｇ／ｍＬペニシリンＧ及び１００単位／ｍＬまでのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地中で増殖させた。ｎｅｆ遺伝子の一部をＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子で置換した組換えＮＬ_４－３プロウイルスクローンを用いて、これらの研究で用いた参照ウイルスを作製した。組換えウイルスは、組換えＮＬ_４－３プロウイルスクローンの２９３Ｔ細胞へのトランスフェクションを介して、Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのＴｒａｎｓｉｔ－２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを用いて調製した。上清を２～３日後に回収し、存在するウイルスの量を、ルシフェラーゼ酵素活性を測定することによって、マーカーとしてのルシフェラーゼ酵素活性を用いてＭＴ－２細胞中で力価測定した。ルシフェラーゼは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのＥｎｄｕＲｅｎ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを用いて定量した。組換えウイルスに対する化合物の抗ウイルス活性は、化合物の連続希釈の存在下で組換えウイルスで４～５日間感染させたＭＴ－２細胞中のルシフェラーゼ活性を測定することによって定量した。

【0086】

（Ｆａ）＝１／［１＋（ＥＤ ５０／薬剤濃度）ｍ］（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＶＡ，Ｂｙｉｎｇｔｏｎ ＲＴ．Ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ．Ｉｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ＨＩＶ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．ｅｄ．Ａｌｄｏｖｉｎｉ Ａ，Ｗａｌｋｅｒ ＢＤ．７１－７６．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ．１９９０）のメジアン効果式の指数形式を用いて５０％有効濃度（ＥＣ_５０）を算出した。％阻害率＝１／［１＋（ＥＣ５０／薬剤濃度）ｍ］（ｍは濃度－反応曲線の傾きを反映するパラメータ）のメジアン効果式の指数形式を用いて５０％阻害濃度（ＥＣ_５０）を算出した。モデル２０３（ＩＤ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，ＬＴＤ，Ｇｕｉｌｆｏｒｄ，ＵＫ）を用いてＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅ ＸＥ Ｒｕｎｎｅｒソフトウェアバージョン９．１．０．４で曲線あてはめと解析を行った。

【0087】

化合物毒性及び対応するＣＣ_５０値は、非感染細胞を用いた点以外は、抗ウイルスアッセイに記載されたものと同一のプロトコルを使用して決定した。ＸＴＴ（２，３－ビス［２－メトキシ－４－ニトロ－５－スルホフェニル］－２Ｈ－テトラゾリウム－５－カルボキシアニリド内塩）ベースの比色アッセイ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ）を用いて、非感染ＭＴ２細胞において、４日目に細胞毒性を評価した。

【0088】

【表1】