知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
特許7545478環状ジペプチド、プリンヌクレオチド及び／又はアミノ酸とチキンエキスとを含む組成物、その製造方法、並びに、環状ジペプチド、プリンヌクレオチド及び／又はアミノ酸、並びにチキンエキスの使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-27
(45)【発行日】2024-09-04
(54)【発明の名称】環状ジペプチド、プリンヌクレオチド及び／又はアミノ酸とチキンエキスとを含む組成物、その製造方法、並びに、環状ジペプチド、プリンヌクレオチド及び／又はアミノ酸、並びにチキンエキスの使用
(51)【国際特許分類】
A23L 33/18 20160101AFI20240828BHJP
A23L 2/52 20060101ALI20240828BHJP
A23L 33/10 20160101ALI20240828BHJP
A23L 33/175 20160101ALI20240828BHJP
A61K 31/405 20060101ALI20240828BHJP
A61K 31/708 20060101ALI20240828BHJP
A61K 35/57 20150101ALI20240828BHJP
A61K 38/01 20060101ALI20240828BHJP
A61K 38/12 20060101ALI20240828BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240828BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240828BHJP
【ＦＩ】
A23L33/18
A23L2/00 F
A23L2/52
A23L33/10
A23L33/175
A61K31/405
A61K31/708
A61K35/57
A61K38/01
A61K38/12
A61P29/00
A61P43/00 111
A61P43/00 121
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2022538443
(86)(22)【出願日】2020-06-26
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-06
(86)【国際出願番号】 JP2020025296
(87)【国際公開番号】W WO2021131106
(87)【国際公開日】2021-07-01
【審査請求日】2023-02-22
(31)【優先権主張番号】10201913617Y
(32)【優先日】2019-12-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SG
(73)【特許権者】
【識別番号】309007911
【氏名又は名称】サントリーホールディングス株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000914
【氏名又は名称】弁理士法人ＷｉｓｅＰｌｕｓ
(72)【発明者】
【氏名】中尾 嘉宏
(72)【発明者】
【氏名】シャンメイ ヨン
(72)【発明者】
【氏名】シャージャン リン
(72)【発明者】
【氏名】シム エリック キアン－シウン
【審査官】吉岡 沙織
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２００７／０２９３４２７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特開２００３－０４８８５０（ＪＰ，Ａ）
【文献】Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology，2015年，Vol.42，pp.1287-1295
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ２３Ｌ
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＦＳＴＡ／ＡＧＲＩＣＯＬＡ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物、及び、チキンエキスを含み、前記トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物がＣｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）又はその塩、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）又はその塩、グアノシン又はリン酸化グアノシン、及びトリプトファン又はその塩を含む組成物。
【請求項2】
Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）又はその塩、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）又はその塩、グアノシン又はリン酸化グアノシン、及びトリプトファン又はその塩を合計で０．０１～９９重量％含む請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物に由来し、ＨＰＬＣゲル濾過で測定される分子量が１１００未満であり、重量平均分子量が１５０～２５０の成分を含む請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項4】
前記チキンエキスが、カルノシン及び／又はアンセリン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数を含む請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項5】
飲食品又は医薬品である、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項6】
炎症を抑制するために使用される、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項7】
ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ， ｎｏｒｍａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－９（ＩＬ－９）及びマクロファージ炎症タンパク質－１（ＭＩＰ－１）からなる群より選択される１以上のサイトカインの産生を抑制する請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
炎症性の状態又は疾患の予防又は改善のために使用される請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項9】
トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を、チキンエキスと混合する工程を含み、
前記トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物が、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）又はその塩、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）又はその塩、グアノシン又はリン酸化グアノシン、及びトリプトファン又はその塩を含む、組成物の製造方法。
【請求項10】
前記チキンエキスが、カルノシン及び／又はアンセリン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数を含む、請求項９に記載の製造方法。
【請求項11】
抗炎症用組成物を製造するための、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物及びチキンエキスの使用であって、
前記トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物が、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）又はその塩、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）又はその塩、グアノシン又はリン酸化グアノシン、及びトリプトファン又はその塩を含む、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、環状ジペプチド、プリンヌクレオチド及び／又はアミノ酸とチキンエキスとを含む組成物及びその製造方法に関する。本発明は、また、抗炎症用組成物を製造するための環状ジペプチド、プリンヌクレオチド及び／又はアミノ酸、並びにチキンエキスの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
炎症は、細胞損傷によりヒスタミン及びキニンなどが放出され、血管拡張、毛細管透過性増大、及び炎症部位へのマクロファージの集結が起こり、それによって、感染部位の血流量増加、浮腫、兔疫細胞及び抗体の移動、痛症、発熱などが起こる現象である。
【0003】
近年、効果的な炎症緩和のために、炎症関連タンパク質の発現を抑制することができる成分に関わる研究が進められている。非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）とステロイド性抗炎症薬（ＳＡＩＤ）とを始めとした、多様なメカニズムの炎症抑制用薬物が開発されているが、それらは副作用の懸念がある。そのため、より安全であり、抗炎症作用を有する成分に対する要求が依然として存在する。
【0004】
例えば、特許文献１では、抗炎症活性を有するテロメラーゼ由来のペプチドを活性成分として含む抗炎症組成物が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特表２０１５－５２５７６８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、環状ジペプチド、プリンヌクレオチド、アミノ酸及び／又はそれらの１つ又は複数の塩と、キンエキスとを含む新規な組成物を提供することを目的とする。
また本発明は、抗炎症作用を有する組成物を提供することを目的とする。
また本発明は、抗炎症作用を有する組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つと、チキンエキスとを組み合わせて用いることにより、抗炎症活性が増強することを見出し、本発明を完成するに至った。
【0008】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
〔１〕Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つと、チキンエキスとを含む組成物。
〔２〕Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つを合計で０．０１～９９重量％含む上記〔１〕に記載の組成物。
〔３〕トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物に由来し、ＨＰＬＣゲル濾過で測定される分子量が１１００未満であり、重量平均分子量が１５０～２５０の成分を含む上記〔１〕又は〔２〕に記載の組成物。
〔４〕トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を含む上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の組成物。
〔５〕上記チキンエキスが、カルノシン及び／又はアンセリン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数を含む上記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の組成物。
〔６〕飲食品又は医薬品である、上記〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の組成物。
〔７〕炎症を抑制するために使用される、上記〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の組成物。
〔８〕ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ， ｎｏｒｍａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－９（ＩＬ－９）及びマクロファージ炎症タンパク質－１（ＭＩＰ－１）からなる群より選択される１以上のサイトカインの産生を抑制する上記〔１〕～〔７〕のいずれかに記載の組成物。
〔９〕炎症性の状態又は疾患の予防又は改善のために使用される上記〔１〕～〔８〕のいずれかに記載の組成物。
〔１０〕Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つを、チキンエキスと混合する工程を含む、組成物の製造方法。
〔１１〕上記工程が、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つを含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を、チキンエキスと混合する工程である、上記〔１０〕に記載の製造方法。
〔１２〕上記チキンエキスが、カルノシン及び／又はアンセリン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数を含む、上記〔１０〕又は〔１１〕に記載の製造方法。
〔１３〕抗炎症用組成物を製造するための、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つ、並びにチキンエキスの使用。
〔１〕Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つと、チキンエキスとを含む組成物。
〔２〕Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つを合計で０．０１～９９重量％含む上記〔１〕に記載の組成物。
〔３〕トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物に由来し、ＨＰＬＣゲル濾過で測定される分子量が１１００未満であり、重量平均分子量が１５０～２５０の成分を含む上記〔１〕又は〔２〕に記載の組成物。
〔４〕トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を含む上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の組成物。
〔５〕上記チキンエキスが、カルノシン及び／又はアンセリン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数を含む上記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の組成物。
〔６〕飲食品又は医薬品である、上記〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の組成物。
〔７〕炎症を抑制するために使用される、上記〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の組成物。
〔８〕ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ， ｎｏｒｍａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－９（ＩＬ－９）及びマクロファージ炎症タンパク質－１（ＭＩＰ－１）からなる群より選択される１以上のサイトカインの産生を抑制する上記〔１〕～〔７〕のいずれかに記載の組成物。
〔９〕炎症性の状態又は疾患の予防又は改善のために使用される上記〔１〕～〔８〕のいずれかに記載の組成物。
〔１０〕Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つを、チキンエキスと混合する工程を含む、組成物の製造方法。
〔１１〕上記工程が、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つを含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を、チキンエキスと混合する工程である、上記〔１０〕に記載の製造方法。
〔１２〕上記チキンエキスが、カルノシン及び／又はアンセリン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数を含む、上記〔１０〕又は〔１１〕に記載の製造方法。
〔１３〕抗炎症用組成物を製造するための、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つ、並びにチキンエキスの使用。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つと、チキンエキスとを含む新規な組成物を提供することができる。本発明の組成物は、炎症及び関節痛を抑制するための飲食品組成物又は医薬品組成物として使用することができる。Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及びにそれらの塩並びにチキンエキスは、飲食品等として摂取可能であり、安全性が高いという利点も有する。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図3】図３は、ＩＬ－６の産生抑制に対するＨＣＩＩ、画分Ｐ６、及びＰ６化合物（Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、及びトリプトファンの組み合わせ）の効果を示すグラフである。
【図4】図４は、ＭＣＰ－１の産生抑制に対するＨＣＩＩ、画分Ｐ６、Ｐ６化合物（Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、及びトリプトファンの組み合わせ）及びＣｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）（ｃＰＧ）の効果を示すグラフである。
【図6】図６（ａ）、図６（ｂ）は、炎症マーカーＭＣＰ－１及びＭＩＰ－１βの産生抑制に対するＨＣＩＩ、ＣＥ、画分Ｐ６の効果、ＨＣＩＩとＣＥとの組み合わせの相乗効果、画分Ｐ６とＣＥとの組み合わせの相乗効果を示すグラフである。
【図7-1】図７－１（ａ）、図７－１（ｂ）は、炎症マーカーＩＬ－６及びＩＬ－８の産生抑制に対するＨＣＩＩとＣＥとの組み合わせの相乗効果、Ｐ６化合物とＣＥとの組み合わせの相乗効果、ｃＰＧとＣＥとの組み合わせの相乗効果、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）（ｃＡＨ）とＣＥとの組み合わせの相乗効果、グアノシンとＣＥとの組み合わせの相乗効果、又はトリプトファンとＣＥとの組み合わせの相乗効果を示すグラフである。
【図7-2】図７－２（ｃ）、図７－２（ｄ）は、炎症マーカーＩＬ－９及びＭＣＰ－１の産生抑制に対するＨＣＩＩとＣＥとの組み合わせの相乗効果、Ｐ６化合物とＣＥとの組み合わせの相乗効果、ｃＰＧとＣＥとの組み合わせの相乗効果、ｃＡＨとＣＥとの組み合わせの相乗効果、グアノシンとＣＥとの組み合わせの相乗効果、又はトリプトファンとＣＥとの組み合わせの相乗効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本発明の一態様によれば、本発明の組成物は、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つと、チキンエキスとを含む。
【0012】
Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）及びＣｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）は、環状ジペプチドである。本明細書において「環状ジペプチド」とは、アミノ酸を構成単位とすることを特徴とし、Ｎ末端側アミノ酸のアミノ基とＣ末端側アミノ酸のカルボキシル基とが脱水縮合することにより生成したジケトピペラジン構造を有する化合物をいう。なお、本明細書において、環状ジペプチドのアミノ酸構成が同じであれば、それらの記載順序はいずれが先でも構わなく、例えば、〔Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）〕と〔Ｃｙｃｌｏ（Ｈｙｐ－Ａｌａ）〕は同じ環状ジペプチドを表すものである。
グアノシンはプリンヌクレオシドであり、トリプトファンはアミノ酸である。
グアノシンはプリンヌクレオシドであり、トリプトファンはアミノ酸である。
【0013】
Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン及びトリプトファンは、動植物のタンパク質等を加水分解して得られたものであってもよいし、人工的に合成したものでもよい。Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン及びトリプトファンは、好ましくは２型コラーゲン加水分解物由来であり、より好ましくはトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物由来であり、更に好ましくはトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物に由来し、ＨＰＬＣゲル濾過で測定される分子量が１１００未満であり、重量平均分子量が１５０～２００の画分中に含まれる。本明細書では、「トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物に由来し、ＨＰＬＣゲル濾過で測定される分子量が１１０未満であり、重量平均分子量が１５０～２００の画分」を「画分６」ともいう。
【0014】
Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン及びトリプトファンは、精製されたものを使用してもよく、これらを含む画分６の形態で組成物に含有させてもよいし、画分６を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の形態で組成物に含有させてもよい。好ましい態様においては、本発明の組成物は、画分６又はトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を含む。本発明の組成物は、画分６又はトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を含むと抗炎症作用がより高くなる。
【0015】
Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）及びトリプトファンは、無機酸又は有機酸との塩や無機塩基又は有機塩基との塩の形態として、本発明の組成物に含むことができる。酸や塩基としては、塩の用途に応じて選択できるが、飲食品、医薬品等への用途を考慮すると、以下に挙げる飲食品又は薬学的に許容される塩が好ましい。上記無機酸塩としては、例えば、塩酸塩、硝酸塩、硫酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩等を挙げることができる。有機酸塩としては、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、又はフマル酸等のジカルボン酸との塩、酢酸、プロピオン酸、又は酪酸等のモノカルボン酸との塩等を挙げる事ができる。無機塩基としては、例えば、ナトリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム等の水酸化物、炭酸塩及び重炭酸塩、アンモニア等である。有機塩基との塩としては、例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、トリエチルアミンの様なモノ－、ジ－又はトリ－アルキルアミン塩、モノ－、ジ－又はトリ－ヒドロキシアルキルアミン塩、グアニジン塩、Ｎ－メチルグルコサミン塩等を挙げる事ができる。
本発明の組成物において、グアノシンはリン酸化グアノシンであってもよい。
本発明の組成物において、グアノシンはリン酸化グアノシンであってもよい。
【0016】
＜トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物＞
本発明の組成物は、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を含むことが好ましい。
トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物（以下では、「トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物」を「ＨＣＩＩ」と記載することがある）は、２型コラーゲンを酵素等で加水分解することで得ることができる。２型コラーゲンは、トリ軟骨から公知の方法で抽出することができる。また、本発明で用いられるトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物は、本分野で用いられる通常の技術を用いて軟骨から調製することができる。
例えば、トリ軟骨を酵素処理することにより２型コラーゲン加水分解物を得ることができる。具体的に、（１）トリ軟骨を液体中にて加熱する前処理工程、及び（２）前処理工程後のトリ軟骨を酵素処理する工程により、２型コラーゲン加水分解物を調製することができる。なお、上記工程（２）で用いられる酵素は、本分野で通常用いられる酵素であればよく、特に限定されないが、例えば、コラゲナーゼ、パパイン、ブロメライン、アクチニジン、フィシン、カテプシン、ペプシン、キモシン、トリプシン、プロテアーゼ、スブチリシン、アミノペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ及びこれらの酵素を混合した酵素製剤等を用いることができる。ただし、２型コラーゲン加水分解物の調製方法は酵素処理方法に限定されるものではない。
本発明の組成物は、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を含むことが好ましい。
トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物（以下では、「トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物」を「ＨＣＩＩ」と記載することがある）は、２型コラーゲンを酵素等で加水分解することで得ることができる。２型コラーゲンは、トリ軟骨から公知の方法で抽出することができる。また、本発明で用いられるトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物は、本分野で用いられる通常の技術を用いて軟骨から調製することができる。
例えば、トリ軟骨を酵素処理することにより２型コラーゲン加水分解物を得ることができる。具体的に、（１）トリ軟骨を液体中にて加熱する前処理工程、及び（２）前処理工程後のトリ軟骨を酵素処理する工程により、２型コラーゲン加水分解物を調製することができる。なお、上記工程（２）で用いられる酵素は、本分野で通常用いられる酵素であればよく、特に限定されないが、例えば、コラゲナーゼ、パパイン、ブロメライン、アクチニジン、フィシン、カテプシン、ペプシン、キモシン、トリプシン、プロテアーゼ、スブチリシン、アミノペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ及びこれらの酵素を混合した酵素製剤等を用いることができる。ただし、２型コラーゲン加水分解物の調製方法は酵素処理方法に限定されるものではない。
【0017】
トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物には、トリ軟骨を加水分解して得られる溶液を使用してもよく、その濃縮物若しくは乾燥粉末又はこれらの精製物を使用してもよい。トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の精製物としては、例えばトリ軟骨を加水分解して得られる溶液を限外ろ過や膜処理、分液操作又は樹脂等による分画処理に供して精製度を上げたものが用いられる。Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及びそれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも１つを含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の精製度を上げた後、凍結乾燥や噴霧乾燥等によって粉末化しても良い。
【0018】
トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物は、通常Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）及び／又はそれらの塩の１つ又は複数を含むペプチド混合物であり、２型コラーゲン由来のコラーゲンペプチドということもできる。
トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物は、重量平均分子量が１００～２０，０００であることが好ましく、２，０００～８，０００であることがより好ましく、３，０００～７，０００であることが更に好ましい。分子量及び重量平均分子量は、ユーロフィンＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ法で測定することができる。
トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物は、重量平均分子量が１００～２０，０００であることが好ましく、２，０００～８，０００であることがより好ましく、３，０００～７，０００であることが更に好ましい。分子量及び重量平均分子量は、ユーロフィンＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ法で測定することができる。
【0019】
一態様において、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物をゲル濾過法等の方法により分子量の大きさに応じて分画し、得られる画分の１又は２以上を組み合わせて本発明の組成物に使用することができる。
本態様の組成物に用いるトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を分画した画分としては、上述の画分６が好ましい。本態様においては、画分６と、画分６以外の他の画分とを組み合わせて組成物に使用してもよい。
本態様の組成物に用いるトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を分画した画分としては、上述の画分６が好ましい。本態様においては、画分６と、画分６以外の他の画分とを組み合わせて組成物に使用してもよい。
【0020】
＜チキンエキス＞
本発明で用いられるチキンエキス（以下ではＣＥと記載することがある）としては、トリ肉を原料として用い、液体中で加熱することにより得られる抽出物等を用いることができ、市販品を用いてもよい。原料に骨、軟骨、脚等が含まれていてもよいが、トリ頭部及び内蔵を含まないことが好ましい。
本発明で用いられるチキンエキス（以下ではＣＥと記載することがある）としては、トリ肉を原料として用い、液体中で加熱することにより得られる抽出物等を用いることができ、市販品を用いてもよい。原料に骨、軟骨、脚等が含まれていてもよいが、トリ頭部及び内蔵を含まないことが好ましい。
【0021】
上記チキンエキス（ＣＥ）の市販品としては、例えば、「ＢＥＣ Ｂｒａｎｄ’ｓ Ｅｓｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｈｉｃｋｅｎ（サントリー食品アジア社製）」や、「ＳｃｏｔｃｈＴＭ Ｅｓｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｈｉｃｋｅｎ（Ｓｃｏｔｃｈ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ（タイ）製）」、「Ｑｕａｋｅｒ Ｅｓｓｅｎｃｅ ｏｆ ｃｈｉｃｋｅｎ（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｆｏｏｄｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（台湾）製）」、「Ｃｈｉｃｋｅｎ ｓｔｏｃｋ ａｎｄ ｂｒｏｔｈ ｏｆ ＳＷＡＮＳＯＮＴＭ（Ｃａｍｐｂｅｌｌ Ｓｏｕｐ Ｃｏｍｐａｎｙ（ＮＹＳＥ：ＣＰＢ）製）」、「Ｄｒｉｐ Ｃｈｉｃｋｅｎ Ｅｓｓｅｎｃｅ（Ｅｕ Ｙａｎ Ｓａｎｇ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（シンガポール）製）」、「Ｂｏｎｅｄ Ｃｈｉｃｋｅｎ Ｔｏｎｉｃ（Ｅｕ Ｙａｎ Ｓａｎｇ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（シンガポール）製）」、「Ｂｏｉｌｅｄ Ｅｓｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｈｉｃｋｅｎ（Ｌａｏ Ｘｉｅ Ｚｈｅｎ（台湾）製）」等が挙げられる。いずれの市販品を用いてもよいが、なかでもＢＥＣ Ｂｒａｎｄ’ｓ Ｅｓｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｈｉｃｋｅｎを用いることが好ましい。
【0022】
本発明で用いられるチキンエキスを熱水抽出により製造する場合、本分野で用いられている通常の方法により製造することができる。例えば、１００℃以上、好ましくは１２５℃以上の液体を用いた常圧抽出及び／又は加圧抽出を行い、得られた抽出物を膜処理やろ過することにより、チキンエキスを製造することができる。具体的には、（３）トリ肉を液体中にて加熱する前処理工程、及び（４）上記前処理後に液体を交換し、再度加熱する工程により得られる抽出物が挙げられる。なお、工程（３）及び工程（４）における加熱処理は、溶媒中で行うのが好ましい。溶媒としては、水、エタノール、又はこれらの混合物等を用いるのが好ましい。
チキンエキスは、上記のような方法で得られる抽出液、その希釈液、濃縮物又は乾燥粉末、及び、これらの精製物を含む。精製物としては、例えばチキンエキスの抽出液を限外ろ過や膜処理、分液操作又は樹脂等による分画処理に供して精製度を上げたものが用いられる。チキンエキスの精製度を上げた後、凍結乾燥や噴霧乾燥等によって粉末化しても良い。
チキンエキスは、上記のような方法で得られる抽出液、その希釈液、濃縮物又は乾燥粉末、及び、これらの精製物を含む。精製物としては、例えばチキンエキスの抽出液を限外ろ過や膜処理、分液操作又は樹脂等による分画処理に供して精製度を上げたものが用いられる。チキンエキスの精製度を上げた後、凍結乾燥や噴霧乾燥等によって粉末化しても良い。
【0023】
本発明で用いられるチキンエキスは、カルノシン及び／又はアンセリン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数を含むことが好ましい。カルノシンは、βアラニンとヒスチジンのジペプチドでβアラニル・ヒスチジンとなったものである。アンセリンは、ヒスチジン部分がメチル化されβアラニル・１メチルヒスチジンとなったものである。
カルノシンの塩及びアンセリンの塩としては、例えば、上述したＣｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、及びトリプトファンの塩と同じものを含む。
カルノシンの塩及びアンセリンの塩としては、例えば、上述したＣｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、及びトリプトファンの塩と同じものを含む。
【0024】
本発明の組成物がカルノシン及び／又はその塩を含む場合、カルノシン及び／又はその塩の含有量は、例えば、該組成物中にカルノシン換算で、０．００００１重量％以上が好ましく、０．０００１重量％以上がより好ましく、また、１０重量％以下が好ましく、１重量％以下がより好ましい。一態様において、カルノシン及び／又はその塩の含有量は、例えば、該組成物中にカルノシン換算で、０．００００１～１０重量％が好ましく、０．０００１～１重量％がより好ましい。
【0025】
本発明の組成物がアンセリン及び／又はその塩を含む場合、アンセリン及び／又はその塩の含有量は、例えば、該組成物中にアンセリン換算で、０．００００１重量％以上が好ましく、０．０００１重量％以上がより好ましく、また、１０重量％以下が好ましく、１重量％以下がより好ましい。一態様において、アンセリン及び／又はその塩の含有量は、例えば、該組成物中にアンセリン換算で０．００００１～１０重量％が好ましく、０．０００１～１重量％がより好ましい。
【0026】
カルノシン、アンセリン、及びそれらの塩は、例えばＨＰＬＣで定量することができる。本発明の飲食品組成物は、カルノシン及び／又はその塩、並びにアンセリン及び／又はその塩を含むことがより好ましい。
【0027】
上記カルノシン、アンセリン、及びそれらの塩のカルノシン及アンセリン換算の合計重量と、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及びそれらの塩の遊離体換算の合計重量との重量比（カルノシン及びアンセリンの合計／遊離体換算の合計）は、１／１５０００～２００／１であることが好ましい。上記重量比は、より好ましくは、１／２００～２００／１であり、更に好ましくは、１／５０～５０／１である。
【0028】
上記「Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン、及びそれらの塩の遊離体」において、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）塩の遊離体とはＣｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）であり、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）塩の遊離体とはＣｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）であり、グアノシン塩の遊離体とはグアノシンであり、トリプトファン塩の遊離体とはトリプトファンである。
【0029】
上記画分６と、カルノシン、アンセリン、及びそれらの塩のカルノシン及びアンセリン換算の合計との重量比（画分６／カルノシン及びアンセリンの合計）は、１／１００～１０／１であることが好ましい。上記重量比は、さらに好ましくは、１／１００～５／１である。
【0030】
上記トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物（固形分換算）と、カルノシン、アンセリン、及びそれらの塩のカルノシン及びアンセリン換算の合計との重量比（ＨＣＩＩ／カルノシン及びアンセリンの合計）は、１００００／１～１０／１であることが好ましい。上記重量比は、さらに好ましくは、１０００／１～１００／１である。
【0031】
本発明の組成物に含まれる各成分の含有量は特に限定されず、その形態等に応じて設定することができる。
一態様において、本発明の組成物中のＣｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及びそれらの塩の合計含有量は、例えば、該組成物中に０．０１重量％以上が好ましく、０．１重量％以上がより好ましく、また、９９重量％以下が好ましく、９０重量％以下がより好ましい。一態様において、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及びそれらの塩の合計含有量は、例えば、該組成物中に０．０１～９９重量％が好ましく、０．１～９０重量％がより好ましい。
一態様において、本発明の組成物中のＣｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及びそれらの塩の合計含有量は、例えば、該組成物中に０．０１重量％以上が好ましく、０．１重量％以上がより好ましく、また、９９重量％以下が好ましく、９０重量％以下がより好ましい。一態様において、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及びそれらの塩の合計含有量は、例えば、該組成物中に０．０１～９９重量％が好ましく、０．１～９０重量％がより好ましい。
【0032】
一態様において、本発明の組成物中の画分６の含有量は、例えば、該組成物中に０．０１重量％以上が好ましく、０．１重量％以上がより好ましく、また、９９重量％以下が好ましく、９０重量％以下がより好ましい。一態様において、画分６の含有量は、例えば、該組成物中に０．０１～９９重量％が好ましく、０．１～９０重量％がより好ましい。本明細書において、画分６の含有量には、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及びそれらの塩が含まれる。
【0033】
一態様において、本発明の組成物中のトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物（固形分換算）の含有量は、例えば、該組成物中に０．１重量％以上が好ましく、０．５重量％以上がより好ましく、また、９９重量％以下が好ましく、９０重量％以下がより好ましい。一態様において、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物（固形分換算）の含有量は、例えば、該組成物中に０．１～９９重量％が好ましく、０．５～９０重量％がより好ましい。
本明細書において、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の含有量には、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及び画分６が含まれる。
本明細書において、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の含有量には、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及び画分６が含まれる。
【0034】
一態様において、本発明の組成物中のチキンエキス（固形分換算）の含有量は、例えば、該組成物中に０．１重量％以上が好ましく、０．５重量％以上がより好ましく、また、９９重量％以下が好ましく、９０重量％以下がより好ましい。一態様において、チキンエキス（固形分換算）の含有量は、例えば、該組成物中に０．１～９９重量％が好ましく、０．５～９０重量％がより好ましい。本明細書において、チキンエキス（固形分換算）の含有量には、カルノシン及びアンセリンが含まれる。
【0035】
本発明の組成物は、飲食品又は医薬品として用いることが好ましい。飲食品としては、一般的な飲食品、機能性食品、保健機能食品、特別用途食品、栄養補助食品、健康補助食品、サプリメント等が挙げられる。飲食品の形態としては特に限定されず、固形状の食品であってもよいし、液状の食品であってもよい。好ましくは飲料である。
医薬品の形態としては特に限定されず、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、ドライシロップ等の内用剤のほか、軟膏、貼り薬、点眼剤、坐剤等の外用剤や注射剤等が挙げられるが、これに限定されない。医薬品は、好ましくは内用剤（経口用医薬品）である。
医薬品の形態としては特に限定されず、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、ドライシロップ等の内用剤のほか、軟膏、貼り薬、点眼剤、坐剤等の外用剤や注射剤等が挙げられるが、これに限定されない。医薬品は、好ましくは内用剤（経口用医薬品）である。
【0036】
本発明の組成物には、医薬品又は飲食品への添加物として許容されている各種の担体、賦形剤、希釈剤、酸味料、酸化防止剤、安定剤、保存料、香料、乳化剤、色素類、調味料、ｐＨ調整剤、栄養強化剤等が添加されていてもよい。
【0037】
本発明の組成物は、治療的用途（医療用途）又は非治療的用途（非医療用途）のいずれにも適用することができる。非治療的とは、医療行為、すなわち人間の手術、治療又は診断を含まない概念である。
【0038】
＜抗炎症用組成物＞
一態様において、本発明の組成物は、炎症を抑制するために用いることができる。本発明の組成物は、抗炎症用組成物であってよく、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つと、チキンエキスとを有効成分として含む抗炎症用組成物であってよい。
一態様において、本発明の組成物は、炎症を抑制するために用いることができる。本発明の組成物は、抗炎症用組成物であってよく、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つと、チキンエキスとを有効成分として含む抗炎症用組成物であってよい。
【0039】
本発明において目的とする抗炎症効果を得るためには、上記組成物について上述したように、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つと、チキンエキスとを、組成物に配合する。Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及びそれらの塩からなる群から選ばれる少なくとも１つを含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物及びチキンエキスは、そのまま使用してもよく、また本発明の効果を損なわない限り、上述したようにその濃縮物、乾燥粉末又は精製度を高めたものを配合してもよい。添加物等は、上述したものと同様のものを用いることができる。添加物等は、上述したものと同様のものを用いることができる。
【0040】
本発明の組成物は、経口で摂取（経口投与）されることが好ましい。本発明の組成物の投与量（摂取量ということもできる）は特に限定されない。本発明の組成物の投与量は、炎症の抑制効果が得られるような量であればよく、対象の体重等に応じて適宜設定すればよい。
【0041】
一態様において、本発明の組成物をヒト（成人）を対象に経口で摂取させる又は投与する場合、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及びそれらの塩の合計投与量は、遊離体換算で、１日当たり体重６０ｋｇあたり、好ましくは０．０１ｍｇ以上、より好ましくは０．１ｍｇ以上、また、好ましくは２０００ｍｇ以下、より好ましくは１０００ｍｇ以下である。一態様において、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及び／又はそれらの塩の合計投与量は、ヒト（成人）であれば、遊離体換算で、１日当たり体重６０ｋｇあたり、好ましくは０．０１～２０００ｍｇ、より好ましくは０．１～１０００ｍｇである。
【0042】
一態様において、本発明の組成物をヒト（成人）を対象に経口で摂取させる又は投与する場合、画分６の投与量は、１日当たり体重６０ｋｇあたり、好ましくは０．０１ｍｇ以上、より好ましくは０．１ｍｇ以上、また、好ましくは２０００ｍｇ以下、より好ましくは１０００ｍｇ以下である。一態様において、画分６の投与量は、ヒト（成人）であれば、１日当たり体重６０ｋｇあたり、好ましくは０．０１～２０００ｍｇ、より好ましくは０．１～１０００ｍｇである。
本明細書において、画分６の投与量には、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及びそれらの塩が含まれる。
本明細書において、画分６の投与量には、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及びそれらの塩が含まれる。
【0043】
一態様において、本発明の組成物を、ヒト（成人）を対象に経口で摂取させる又は投与する場合、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の投与量（固形分換算）は、１日当たり体重６０ｋｇあたり、好ましくは０．０１ｍｇ以上、より好ましくは０．１ｍｇ以上、また、好ましくは４０００ｍｇ以下、より好ましくは３０００ｍｇ以下である。一態様において、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の投与量（固形分換算）は、ヒト（成人）であれば、１日当たり体重６０ｋｇあたり、好ましくは０．０１～４０００ｍｇ、より好ましくは０．１～３０００ｍｇである。
本明細書において、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の投与量には、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及びそれらの塩又は画分６が含まれる。
本明細書において、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の投与量には、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及びそれらの塩又は画分６が含まれる。
【0044】
一態様において、本発明の組成物をヒト（成人）を対象に経口で摂取させる又は投与する場合、チキンエキス（固形分換算）の投与量は、１日当たり体重６０ｋｇあたり、好ましくは０．１ｍｇ以上、より好ましくは１ｍｇ以上、また、好ましくは１５０００ｍｇ以下、より好ましくは１３０００ｍｇ以下である。一態様において、チキンエキス（固形分換算）の投与量は、ヒト（成人）であれば、１日当たり体重６０ｋｇあたり、好ましくは０．１～１５０００ｍｇ、より好ましくは１～１３０００ｍｇである。チキンエキスの投与量には、カルノシン、アンセリン、及びそれらの塩が含まれる。
【0045】
一態様において、本発明の組成物を、ヒト（成人）を対象に経口で摂取させる又は投与する場合、カルノシン、アンセリン、及びそれらの塩の合計投与量は、カルノシン及びアンセリン換算で、１日当たり体重６０ｋｇあたり、好ましくは０．００１ｍｇ以上、より好ましくは０．０１ｍｇ以上、また、好ましくは５００ｍｇ以下、より好ましくは４００ｍｇ以下である。一態様において、カルノシン、アンセリン、及びそれらの塩の合計投与量は、ヒト（成人）であれば、１日当たり体重６０ｋｇあたり、カルノシン及びアンセリン換算で、好ましくは０．００１～５００ｍｇ、より好ましくは０．０１～４００ｍｇである。
【0046】
一態様において、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数を含む上記量のトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物並びに上記量のチキンエキスを、１日１回以上、例えば、１日１回又は数回（例えば２～３回）に分けて、摂取させる又は投与することが好ましい。一態様においては、上記量のＣｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物並びに上記量のチキンエキスを、ヒトに経口で摂取させる又は投与することが好ましい。一態様において、本発明の組成物は、ヒトに、1日あたり体重６０ｋｇあたり、上記量のＣｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物並びに上記量のチキンエキスを摂取させる又は投与するために使用することができる。
【0047】
一態様において、抗炎症効果を得ることを目的として、本発明の組成物を摂取させる場合、上記量のＣｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物及び上記量のチキンエキスを摂取させることが好ましい。
【0048】
本発明の組成物は、ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ， ｎｏｒｍａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－９（ＩＬ－９）及びマクロファージ炎症タンパク質－１（ＭＩＰ－１）等のサイトカイン産生を抑制する。本発明の組成物は、特に、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、及びＭＩＰ－βの産生の抑制効果が高い。
上記のサイトカイン産生を抑制することで、生体の炎症を抑制することができる。
上記のサイトカイン産生を抑制することで、生体の炎症を抑制することができる。
【0049】
本発明の組成物は、炎症性の状態又は疾患の予防又は改善のために使用することができる。炎症性の状態又は疾患とは、炎症に起因する状態又は疾患、又は炎症を伴う状態又は疾患が挙げられる。このような状態又は疾患としては、関節炎、関節リウマチ等の膠原病、炎症性大腸炎、変形性関節症、腱炎、坐骨神経痛、椎間板ヘルニア、狭窄症、脊髄症、腰痛、椎間関節痛、手根管症候群、足根管症候群、腰椎術後疼痛症候群、エイズ、動脈硬化、喘息、関節炎、糖尿病、肝炎、脳卒中、認知症、筋消耗、ウイルス感染、光老化を含めた皮膚老化、がん、老化、アレルギー疾患、パーキンソン病、脳梗塞、白内障、てんかん、脊髄損傷、未熟児網膜症、腎障害、消化性潰瘍、膵炎、潰瘍性大腸炎、心筋梗塞、成人呼吸窮迫症候群、肺気腫、血管炎、浮腫、糖尿病合併症、紫外線障害、高山病、ポルフィリン血症、熱傷、凍傷、接触性皮膚炎、ショック、多臓器不全、ＤＩＣ、疲労、サルコぺニア（筋力低下）、ミトコンドリア機能障害、アルツハイマー病、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、若年性特発性関節炎、及び全身性エリテマトーデス（ｌｕｐｕｓ）等が挙げられる。本発明の組成物は、これらの疾患の予防又は改善のために、好ましく使用される。特に、該飲食品組成物は、変形性関節症、関節リウマチ、及び乾癬性関節炎等の予防又は改善のために、好ましく使用される。
本明細書において、状態又は疾患の予防は、発症を防止すること、発症を遅延させること、発症率を低下させること、発症のリスクを軽減すること等を包含する。状態又は疾患の改善は、対象を状態又は疾患から回復させること、状態又は疾患の症状を軽減すること、状態又は疾患の症状を好転させること、状態又は疾患の進行を遅延させること、防止すること等を包含する。
本明細書において、状態又は疾患の予防は、発症を防止すること、発症を遅延させること、発症率を低下させること、発症のリスクを軽減すること等を包含する。状態又は疾患の改善は、対象を状態又は疾患から回復させること、状態又は疾患の症状を軽減すること、状態又は疾患の症状を好転させること、状態又は疾患の進行を遅延させること、防止すること等を包含する。
【0050】
本発明の組成物を摂取又は投与する対象（投与対象ということもできる）は、特に限定されない。好ましくはヒト又は非ヒト哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
一態様において、投与対象として、炎症の抑制を必要とする又は希望する対象等が挙げられる。このような対象として、例えば、炎症の予防又は改善を必要とする又は希望する対象、上記の炎症性の状態又は疾患の予防又は改善を必要とする又は希望する対象が挙げられる。一態様において、本発明における投与対象として、中高年者が挙げられる。本発明の組成物は、例えば、炎症の抑制により予防又は改善が期待できる状態の予防等を目的として、健常者に対して使用することもできる。
一態様において、投与対象として、炎症の抑制を必要とする又は希望する対象等が挙げられる。このような対象として、例えば、炎症の予防又は改善を必要とする又は希望する対象、上記の炎症性の状態又は疾患の予防又は改善を必要とする又は希望する対象が挙げられる。一態様において、本発明における投与対象として、中高年者が挙げられる。本発明の組成物は、例えば、炎症の抑制により予防又は改善が期待できる状態の予防等を目的として、健常者に対して使用することもできる。
【0051】
本発明の組成物には、炎症を抑制することにより発揮される機能の表示が付されていてもよい。このような表示は機能性表示ともいい、その表示内容は特に限定されない。このような表示として、例えば、「関節の痛みを緩和する」、「関節の痛みを軽減する」、「膝の調子を整える」、「膝を健康に保つ」、「関節の健康を改善する」、「関節の動きを改善する」等、又は、これらと同視できる表示又は機能性表示が挙げられる。
本発明の一態様において、本発明の組成物は、上記の表示が付された飲食品であることが好ましく、飲料であることがより好ましい。また上記の表示は、上記の機能を得るために本発明の組成物を用いる旨の表示であってもよい。当該表示は、組成物自体に付されてもよいし、飲食品組成物の容器又は包装に付されていてもよい。
本発明の一態様において、本発明の組成物は、上記の表示が付された飲食品であることが好ましく、飲料であることがより好ましい。また上記の表示は、上記の機能を得るために本発明の組成物を用いる旨の表示であってもよい。当該表示は、組成物自体に付されてもよいし、飲食品組成物の容器又は包装に付されていてもよい。
【0052】
＜製造方法＞
本発明はまた、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つを、チキンエキスと混合する工程を含む、組成物の製造方法に関する。
上記工程において、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数は、そのままチキンエキスと混合することができるが、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）等を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物とチキンエキスとを混合して組成物を製造することが好ましい。この場合、例えば、トリ軟骨の２型コラーゲンを酵素等で加水分解して得られた加水分解物をそのままチキンエキスとの混合に用いることができる。また、本発明の効果を損なわない限り、上述したようにトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物由来で、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）等を含む画分６を配合したり、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の濃縮物、乾燥粉末又は精製度を高めたものを配合してもよい。
本発明はまた、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つを、チキンエキスと混合する工程を含む、組成物の製造方法に関する。
上記工程において、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数は、そのままチキンエキスと混合することができるが、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）等を含むトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物とチキンエキスとを混合して組成物を製造することが好ましい。この場合、例えば、トリ軟骨の２型コラーゲンを酵素等で加水分解して得られた加水分解物をそのままチキンエキスとの混合に用いることができる。また、本発明の効果を損なわない限り、上述したようにトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物由来で、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）等を含む画分６を配合したり、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の濃縮物、乾燥粉末又は精製度を高めたものを配合してもよい。
【0053】
本発明の製造方法では、原料の配合順は特に限定されない。例えば、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数、又はこれらを含む画分６又はトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を先に容器等に投入して、次いでチキンエキスを加えてもよい。また、チキンエキスを先に容器等に投入しておき、その後Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数、又はこれらを含む画分６やトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物を加えてもよい。
本発明の製造方法において、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の好ましい態様は、上記と同じである。またチキンエキスの好ましい態様は、上記と同じである。
本発明の製造方法において、チキンエキスがカルノシン、アンセリン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数を含むことが好ましい。
本発明の製造方法において、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の好ましい態様は、上記と同じである。またチキンエキスの好ましい態様は、上記と同じである。
本発明の製造方法において、チキンエキスがカルノシン、アンセリン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数を含むことが好ましい。
【0054】
本発明の製造方法では、チキンエキスは、市販品や熱水抽出して製造したものをそのままＣｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数、又はこれらを含む画分６又はトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物と混合することができるが、チキンエキスが濃縮物、乾燥粉末又はこれらの精製物の形態である場合、水、エタノール又はその混合物等の液体で希釈、溶解等してからＣｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及び／又はそれらの塩、又はこれらを含む画分６やトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物等と混合してもよい。Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数を含む画分６やトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物が濃縮物、乾燥粉末又はこれらの精製物の形態である場合も同様に、上記の液体で希釈、溶解等してから配合に用いることができる。予め希釈、溶解等せずに原料を配合し、その後、液体を添加して希釈、溶解等してもよい。
【0055】
本発明の製造方法で製造する組成物には、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数、トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物及びチキンエキスの他に、上述したものと同じ添加物を配合することができる。
【0056】
本発明はまた、抗炎症用組成物を製造するための、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つ、並びにチキンエキスの使用に関する。
上記抗炎症用組成物としては、上述したＣｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数と、チキンエキスとを含む組成物と同様の組成物が挙げられる。Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数は、これらを含む画分６又はトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の形態で使用することができる。チキンエキスやその他の添加物は、上述したものと同じものを使用することができる。
上記抗炎症用組成物としては、上述したＣｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数と、チキンエキスとを含む組成物と同様の組成物が挙げられる。Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及び／又はそれらの塩の１つ又は複数は、これらを含む画分６又はトリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の形態で使用することができる。チキンエキスやその他の添加物は、上述したものと同じものを使用することができる。
【実施例】
【0057】
以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、これにより本発明の範囲を限定するものではない。
【0058】
実施例及び比較例で使用した原料、試薬等を以下に示す。
＜トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の調製＞
図１に、ＨＣＩＩ調製方法を簡略に説明したフローを示す。先ず、凍結トリ軟骨を４０℃の水で解凍し、４０℃の水で洗浄を行った（１時間）。次に、洗浄水を廃棄し、新たな水をトリ軟骨の３倍量となるように１２００Ｌポットに入れた。水を酵素処理に最適な温度まで昇温し、ここに洗浄後のトリ軟骨を浸漬させ、数時間酵素処理を行った。酵素処理を行った後に、トリ軟骨の入ったポットを９０℃以上まで昇温し、３０分間９０℃以上で保持し、先の酵素処理で用いた酵素を不活化させた。得られた混合物（液体及び酵素処理後のトリ軟骨）をろ過した。得られた液体を濃縮した。最後に、得られた濃縮液を２００℃で噴霧乾燥させ、ＨＣＩＩ粉末を調製した。
＜トリ軟骨の２型コラーゲン加水分解物の調製＞
図１に、ＨＣＩＩ調製方法を簡略に説明したフローを示す。先ず、凍結トリ軟骨を４０℃の水で解凍し、４０℃の水で洗浄を行った（１時間）。次に、洗浄水を廃棄し、新たな水をトリ軟骨の３倍量となるように１２００Ｌポットに入れた。水を酵素処理に最適な温度まで昇温し、ここに洗浄後のトリ軟骨を浸漬させ、数時間酵素処理を行った。酵素処理を行った後に、トリ軟骨の入ったポットを９０℃以上まで昇温し、３０分間９０℃以上で保持し、先の酵素処理で用いた酵素を不活化させた。得られた混合物（液体及び酵素処理後のトリ軟骨）をろ過した。得られた液体を濃縮した。最後に、得られた濃縮液を２００℃で噴霧乾燥させ、ＨＣＩＩ粉末を調製した。
【0059】
＜ＨＣＩＩ粉末の分子量の測定＞
得られたＨＣＩＩの分子量分布をユーロフィンＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ法により測定した。得られたＨＣＩＩの分子量分布を下記表１に示す。本分野で用いられている通常の方法で算出されたＨＣＩＩの重量平均分子量は、４５８２であった。
得られたＨＣＩＩの分子量分布をユーロフィンＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ法により測定した。得られたＨＣＩＩの分子量分布を下記表１に示す。本分野で用いられている通常の方法で算出されたＨＣＩＩの重量平均分子量は、４５８２であった。
【0060】
【表1】
【0061】
＜ＨＣＩＩの画分の分画＞
（ＨＣＩＩ分画及び生物活性同定のための材料及び方法）
（材料）
ギ酸は東京化成工業株式会社から購入した。超純水はＭｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉ－Ｑ浄水システムから入手した。
（ＨＣＩＩ分画及び生物活性同定のための材料及び方法）
（材料）
ギ酸は東京化成工業株式会社から購入した。超純水はＭｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉ－Ｑ浄水システムから入手した。
【0062】
（分取ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ））
ＨＣＩＩの分画は、分取ＶＥＲＩＴＹ２７１ＨＰＬＣシステム（Ｇｉｌｓｏｎ社製）を使用して実施した。ＨＣＩＩを超純水に溶解して、１０ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）溶液を調製した。１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、ガードカラム（ＳｅｃｕｒｉｔｙＧｕａｒｄ ＰＲＥＰ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ Ｃ１２ １５×２１．２ｍｍ ＩＤ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製））に取り付けられた分取ＧＰＣカラム（ＢｉｏＳｅｐ ５μｍ ＳＥＣ－ｓ２０００ １４５ÅＬＣカラム３００×２１．２ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製））にアリコート（１０００μＬ）を注入し、５ｍＬ／ｍｉｎの速度で３０分間、溶離液Ａ（超純水：ギ酸＝１００：０．１（ｖ／ｖ））でイソクラティック溶離した。クロマトグラムは２１４ｎｍで観察した。
ＧＸシリーズのフラクションコレクター（Ｇｉｌｓｏｎ社製）を使用して、８分から２８分の間、０．５分ごとに画分を収集し、結果として得られた４０の個々の画分は、その後、Ｐ１からＰ７の７つの画分にプールされた（Ｐ１：８．５－１２．０分、Ｐ２：１２．０－１３．５分、Ｐ３：１３．５－１４．５分、Ｐ４：１４．５－１６．０分、Ｐ５：１６．０－１７．５分、Ｐ６：１７．５－１９．０分、Ｐ７：１９．０－２７．５分）。プールした画分を凍結乾燥機（ＳｃａｎＶａｃ社製）で蒸発乾固し、乾燥したサンプルをさらに使用するまで－２０℃で保存した。
ＨＣＩＩの分画は、分取ＶＥＲＩＴＹ２７１ＨＰＬＣシステム（Ｇｉｌｓｏｎ社製）を使用して実施した。ＨＣＩＩを超純水に溶解して、１０ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）溶液を調製した。１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、ガードカラム（ＳｅｃｕｒｉｔｙＧｕａｒｄ ＰＲＥＰ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ Ｃ１２ １５×２１．２ｍｍ ＩＤ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製））に取り付けられた分取ＧＰＣカラム（ＢｉｏＳｅｐ ５μｍ ＳＥＣ－ｓ２０００ １４５ÅＬＣカラム３００×２１．２ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製））にアリコート（１０００μＬ）を注入し、５ｍＬ／ｍｉｎの速度で３０分間、溶離液Ａ（超純水：ギ酸＝１００：０．１（ｖ／ｖ））でイソクラティック溶離した。クロマトグラムは２１４ｎｍで観察した。
ＧＸシリーズのフラクションコレクター（Ｇｉｌｓｏｎ社製）を使用して、８分から２８分の間、０．５分ごとに画分を収集し、結果として得られた４０の個々の画分は、その後、Ｐ１からＰ７の７つの画分にプールされた（Ｐ１：８．５－１２．０分、Ｐ２：１２．０－１３．５分、Ｐ３：１３．５－１４．５分、Ｐ４：１４．５－１６．０分、Ｐ５：１６．０－１７．５分、Ｐ６：１７．５－１９．０分、Ｐ７：１９．０－２７．５分）。プールした画分を凍結乾燥機（ＳｃａｎＶａｃ社製）で蒸発乾固し、乾燥したサンプルをさらに使用するまで－２０℃で保存した。
【0063】
上記で得られた各画分の分子量を表２に示す。表２において、「Ｍｗ」及び「Ｍｐ」は、それぞれ、重量平均分子量及びピーク分子量を示す。表２に示すように、画分６（Ｐ６）は分子量が３００Ｄａ未満の一般的な小分子で構成されている。
ＨＣＩＩ画分の分子量は、下記の条件でＨＰＬＣゲル濾過法により測定した。
装置：Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズ
検出：ＵＶ２１４ｎｍ
流速：１ｍＬ／分
移動相：ｐＨ６．８のアイソクラティック０．１ｍＭリン酸ナトリウムバッファー
実行時間：２０分
カラム：ＢｉｏｓｅｐＴＭ ５μｍ ＳＥＣ－ｓ２０００ １４５ÅＬＣカラム３００×７．８ｍｍ
ＨＣＩＩ画分の分子量は、下記の条件でＨＰＬＣゲル濾過法により測定した。
装置：Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズ
検出：ＵＶ２１４ｎｍ
流速：１ｍＬ／分
移動相：ｐＨ６．８のアイソクラティック０．１ｍＭリン酸ナトリウムバッファー
実行時間：２０分
カラム：ＢｉｏｓｅｐＴＭ ５μｍ ＳＥＣ－ｓ２０００ １４５ÅＬＣカラム３００×７．８ｍｍ
【0064】
【表2】
【0065】
＜Ｐ６の主要成分の同定＞
画分６（Ｐ６）の主要成分は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製のＬｕｎａＴＭ Ｏｍｅｇａ ５μｍＰＳ Ｃ１８ １００Ａ ２５０×４．６ｍｍを、Ａｇｉｌｅｎｔ社製ＨＰＬＣ、１１００シリーズで用いて、次のリニアグラジエント：０－４．０分：溶離液Ａ１００％；４．０－１２．０分：溶離液Ａ０－９０％；１２．０－１５．５分：溶離液Ａ９０－８０％；１５．５－１７．０分：溶離液Ａ８０－１５％；１７．０－１８．０分：リニア、溶離液Ａ１５％；１８．０－１９．０分：溶離液Ａ１５－１００％；１９．０－２１．０分：溶離液Ａで１００％、溶離液Ａ（超純水：ギ酸＝１００：０．１（ｖ／ｖ））及び溶離液Ｂ（アセトニトリル：ギ酸＝１００：０．１（ｖ／ｖ））を用いて溶出し、分離した。注入量は１ｍＬ／ｍｉｎの流量で１０μＬ、溶出液のＵＶ吸光度は２１４ｎｍでモニターし、溶出液は装備したフラクションコレクターで収集した。次に、４つの画分を凍結乾燥した後、精製水で再構成し、Ｄｕｏ Ｓｐｒａｙ Ｔｕｒｂｏ Ｖイオン源とガス発生器（Ｐｅａｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １２９０シリーズ結合Ｔｒｉｐｌｅ ＴＯＦ ５６００（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）でＬＣ－ＭＳ分析を行った。一部の画分は、特性評価のためにＢｒｕｋｅｒ ＥＣＡ ４００で実施したプロトンＮＭＲ実験にも供した。画分Ｐ６の主要な成分は、市販の化学物質によって確認した。
またＨＣＩＩ中の遊離アミノ酸は、ＡＯＡＣ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄ ９９９．１３の方法に従って検出し、定量した。
画分６（Ｐ６）の主要成分は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製のＬｕｎａＴＭ Ｏｍｅｇａ ５μｍＰＳ Ｃ１８ １００Ａ ２５０×４．６ｍｍを、Ａｇｉｌｅｎｔ社製ＨＰＬＣ、１１００シリーズで用いて、次のリニアグラジエント：０－４．０分：溶離液Ａ１００％；４．０－１２．０分：溶離液Ａ０－９０％；１２．０－１５．５分：溶離液Ａ９０－８０％；１５．５－１７．０分：溶離液Ａ８０－１５％；１７．０－１８．０分：リニア、溶離液Ａ１５％；１８．０－１９．０分：溶離液Ａ１５－１００％；１９．０－２１．０分：溶離液Ａで１００％、溶離液Ａ（超純水：ギ酸＝１００：０．１（ｖ／ｖ））及び溶離液Ｂ（アセトニトリル：ギ酸＝１００：０．１（ｖ／ｖ））を用いて溶出し、分離した。注入量は１ｍＬ／ｍｉｎの流量で１０μＬ、溶出液のＵＶ吸光度は２１４ｎｍでモニターし、溶出液は装備したフラクションコレクターで収集した。次に、４つの画分を凍結乾燥した後、精製水で再構成し、Ｄｕｏ Ｓｐｒａｙ Ｔｕｒｂｏ Ｖイオン源とガス発生器（Ｐｅａｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １２９０シリーズ結合Ｔｒｉｐｌｅ ＴＯＦ ５６００（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）でＬＣ－ＭＳ分析を行った。一部の画分は、特性評価のためにＢｒｕｋｅｒ ＥＣＡ ４００で実施したプロトンＮＭＲ実験にも供した。画分Ｐ６の主要な成分は、市販の化学物質によって確認した。
またＨＣＩＩ中の遊離アミノ酸は、ＡＯＡＣ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄ ９９９．１３の方法に従って検出し、定量した。
【0066】
上記の分析の結果、Ｐ６の主要成分は、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン及びトリプトファンであった。
【0067】
＜Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）及びＣｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）の定量＞
Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）を超純水で再構成し、ＵＨＰＬＣ Ｇｕａｒｄ Ｚｏｒｂａｘ ＥｃｌｉｐｓｅＰｌｕｓＣ１８ １．８μｍ ２．１×５ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を使って、Ｚｏｒｂａｘ ＥｃｌｉｐｓｅＰｌｕｓＣ１８ ＲＲＨＤ １．８μｍ ２．１×５０ｍｍカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）に注入し、下記のリニアグラジエントを用いて溶離液Ａ（超純水：ギ酸＝１００：０．１（ｖ／ｖ））及び溶離液Ｂ（アセトニトリル：ギ酸＝１００：０．１（ｖ／ｖ））で溶出した：０－０．５分：１００％溶離液Ａ；０．５－７．５分：溶離液Ａを１００％から６５％に減少；７．５－１０．０分：溶離液Ａを６５％から０％に減少；１１．０－１３．０分：溶離液Ａ０％；１３．０－１３．１分：溶離液Ａを０％から１００％に増加；１３．１－１５．０分：溶離液Ａ１００％。
注入量は、流量３００μＬ／ｍｉｎで１０μＬ、溶出液のＵＶ吸光度は２１４ｎｍでモニターした。ＭＳの衝突エネルギー（ＣＥ）及びクラスター解除ポテンシャル（ＤＰ）は、それぞれ２７．０Ｖ及び１００Ｖとして最適化した。Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）は、ｍ／ｚ１８５．１／８６．１でＱ１／Ｑ３イオン遷移を使用して、定量イオン及び確認イオンとして保持時間２．４５分で検出した。３１．２５ｎｇ／ｍＬ、６２．５ｎｇ／ｍＬ、１２５ｎｇ／ｍＬ、又は２５０ｎｇ／ｍＬの標準Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）を質量分析計に注入して、検量線を作成した。画分Ｐ６は、作業溶液として１００μｇ／ｍＬ溶液として再構成した。画分Ｐ６のＣｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）の定量化は、Ｓｃｉｅｘ ＯＳ（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）によって行った。
Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）を超純水で再構成し、ＵＨＰＬＣ Ｇｕａｒｄ Ｚｏｒｂａｘ ＥｃｌｉｐｓｅＰｌｕｓＣ１８ １．８μｍ ２．１×５ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を使って、Ｚｏｒｂａｘ ＥｃｌｉｐｓｅＰｌｕｓＣ１８ ＲＲＨＤ １．８μｍ ２．１×５０ｍｍカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）に注入し、下記のリニアグラジエントを用いて溶離液Ａ（超純水：ギ酸＝１００：０．１（ｖ／ｖ））及び溶離液Ｂ（アセトニトリル：ギ酸＝１００：０．１（ｖ／ｖ））で溶出した：０－０．５分：１００％溶離液Ａ；０．５－７．５分：溶離液Ａを１００％から６５％に減少；７．５－１０．０分：溶離液Ａを６５％から０％に減少；１１．０－１３．０分：溶離液Ａ０％；１３．０－１３．１分：溶離液Ａを０％から１００％に増加；１３．１－１５．０分：溶離液Ａ１００％。
注入量は、流量３００μＬ／ｍｉｎで１０μＬ、溶出液のＵＶ吸光度は２１４ｎｍでモニターした。ＭＳの衝突エネルギー（ＣＥ）及びクラスター解除ポテンシャル（ＤＰ）は、それぞれ２７．０Ｖ及び１００Ｖとして最適化した。Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）は、ｍ／ｚ１８５．１／８６．１でＱ１／Ｑ３イオン遷移を使用して、定量イオン及び確認イオンとして保持時間２．４５分で検出した。３１．２５ｎｇ／ｍＬ、６２．５ｎｇ／ｍＬ、１２５ｎｇ／ｍＬ、又は２５０ｎｇ／ｍＬの標準Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）を質量分析計に注入して、検量線を作成した。画分Ｐ６は、作業溶液として１００μｇ／ｍＬ溶液として再構成した。画分Ｐ６のＣｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）の定量化は、Ｓｃｉｅｘ ＯＳ（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）によって行った。
【0068】
Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）を超純水で再構成し、ＵＨＰＬＣ Ｇｕａｒｄ Ｚｏｒｂａｘ ＥｃｌｉｐｓｅＰｌｕｓＣ１８ ２．１×５ｍｍ １．８μｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）でＺｏｒｂａｘ ＥｃｌｉｐｓｅＰｌｕｓＣ１８ ＲＲＨＤ １．８μｍ ２．１×５０ｍｍカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）に注入し、下記のリニアグラジエントを用いて溶離液Ａ（超純水：ギ酸＝１００：０．１（ｖ／ｖ））及び溶離液Ｂ（アセトニトリル：ギ酸＝１００：０．１（ｖ／ｖ））で溶出した：０－０．５分：溶離液Ａ１００％；０．５－７．５分：溶離液Ａを１００％から６５％に減少；７．－１０．０分：溶離液Ａを６５％から０％に減少；１１．０－１３．０分：溶離液Ａ０％；１３．０－１３．１分：溶離液Ａを０％から１００％に増加；１３．１－１５．０分：溶離液Ａ１００％。
注入量は３００μＬ／ｍｉｎの流量で１０μＬであり、溶出液のＵＶ吸光度は２１４ｎｍでモニターした。ＭＳの衝突エネルギー（ＣＥ）及びクラスター解除ポテンシャル（ＤＰ）は、それぞれ３０．０Ｖ及び１００Ｖとして最適化した。Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）は、ｍ／ｚ７０．１／１２７．１ＴｈでＱ１／Ｑ３イオン遷移を使用して、定量イオン及び確認イオンとして保持時間２．６分で検出した。７０ｎｇ／ｍＬ、１４０ｎｇ／ｍＬ、２８０ｎｇ／ｍＬ、５６０ｎｇ／ｍＬの標準Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）を質量分析計に注入して、検量線を作成した。画分Ｐ６は、作業溶液として１００μｇ／ｍＬ溶液として再構成した。画分Ｐ６に含まれるＣｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）の定量化は、Ｓｃｉｅｘ ＯＳ（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）によって行った。
注入量は３００μＬ／ｍｉｎの流量で１０μＬであり、溶出液のＵＶ吸光度は２１４ｎｍでモニターした。ＭＳの衝突エネルギー（ＣＥ）及びクラスター解除ポテンシャル（ＤＰ）は、それぞれ３０．０Ｖ及び１００Ｖとして最適化した。Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）は、ｍ／ｚ７０．１／１２７．１ＴｈでＱ１／Ｑ３イオン遷移を使用して、定量イオン及び確認イオンとして保持時間２．６分で検出した。７０ｎｇ／ｍＬ、１４０ｎｇ／ｍＬ、２８０ｎｇ／ｍＬ、５６０ｎｇ／ｍＬの標準Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）を質量分析計に注入して、検量線を作成した。画分Ｐ６は、作業溶液として１００μｇ／ｍＬ溶液として再構成した。画分Ｐ６に含まれるＣｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）の定量化は、Ｓｃｉｅｘ ＯＳ（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）によって行った。
【0069】
＜グアノシンの定量＞
グアノシンを超純水で再構成し、ＵＨＰＬＣ Ｇｕａｒｄ Ｚｏｒｂａｘ ＥｃｌｉｐｓｅＰｌｕｓＣ１８ ２．１×５ｍｍ １．８μｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）でＺｏｒｂａｘ ＥｃｌｉｐｓｅＰｌｕｓＣ１８ ＲＲＨＤ １．８μｍ ２．１×５０ｍｍカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）に注入し、下記のリニアグラジエントを用いて溶離液Ａ（超純水：ギ酸＝１００：０．１（ｖ／ｖ））及び溶離液Ｂ（アセトニトリル：ギ酸＝１００：０．１（ｖ／ｖ））で溶出した：０－０．５分：溶離液Ａ１００％；０．５－１０．５分：溶離液Ａを１００％から０％に減少；１０．５－１４．０分：溶離液Ａ０％；１４．０－１６．１分：溶離液Ａを０％から１００％に増加；１６．１－１８．０分：溶離液Ａ１００％。
注入量は３００μＬ／ｍｉｎの流量で１０μＬであり、溶出液のＵＶ吸光度は２１４ｎｍでモニターした。ＭＳの衝突エネルギー（ＣＥ）及びクラスター解除ポテンシャル（ＤＰ）は、それぞれ１０．０Ｖ及び８０Ｖとして最適化した。グアノシンは、ｍ／ｚ１５２．１／２８４．１ＴｈでＱ１／Ｑ３イオン遷移を使用して、定量イオン及び確認イオンとして保持時間２．１７分で検出した。３１．２５ｎｇ／ｍＬ、６２．５ｎｇ／ｍＬ、１２５ｎｇ／ｍＬ、又は２５０ｎｇ／ｍＬの標準グアノシンを質量分析計に注入して、検量線を作成した。Ｐ６は、作業溶液として１００μｇ／ｍＬ溶液として再構成した。Ｐ６に含まれるグアノシンの定量化は、Ｓｃｉｅｘ ＯＳ（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）によって行った。
グアノシンを超純水で再構成し、ＵＨＰＬＣ Ｇｕａｒｄ Ｚｏｒｂａｘ ＥｃｌｉｐｓｅＰｌｕｓＣ１８ ２．１×５ｍｍ １．８μｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）でＺｏｒｂａｘ ＥｃｌｉｐｓｅＰｌｕｓＣ１８ ＲＲＨＤ １．８μｍ ２．１×５０ｍｍカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）に注入し、下記のリニアグラジエントを用いて溶離液Ａ（超純水：ギ酸＝１００：０．１（ｖ／ｖ））及び溶離液Ｂ（アセトニトリル：ギ酸＝１００：０．１（ｖ／ｖ））で溶出した：０－０．５分：溶離液Ａ１００％；０．５－１０．５分：溶離液Ａを１００％から０％に減少；１０．５－１４．０分：溶離液Ａ０％；１４．０－１６．１分：溶離液Ａを０％から１００％に増加；１６．１－１８．０分：溶離液Ａ１００％。
注入量は３００μＬ／ｍｉｎの流量で１０μＬであり、溶出液のＵＶ吸光度は２１４ｎｍでモニターした。ＭＳの衝突エネルギー（ＣＥ）及びクラスター解除ポテンシャル（ＤＰ）は、それぞれ１０．０Ｖ及び８０Ｖとして最適化した。グアノシンは、ｍ／ｚ１５２．１／２８４．１ＴｈでＱ１／Ｑ３イオン遷移を使用して、定量イオン及び確認イオンとして保持時間２．１７分で検出した。３１．２５ｎｇ／ｍＬ、６２．５ｎｇ／ｍＬ、１２５ｎｇ／ｍＬ、又は２５０ｎｇ／ｍＬの標準グアノシンを質量分析計に注入して、検量線を作成した。Ｐ６は、作業溶液として１００μｇ／ｍＬ溶液として再構成した。Ｐ６に含まれるグアノシンの定量化は、Ｓｃｉｅｘ ＯＳ（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ社製）によって行った。
【0070】
ＨＣＩＩ全体の重量を１００重量％として、ＨＣＩＩ中、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）が０．２３重量％、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）が０．３０重量％、グアノシンが０．１０重量％、トリプトファンが０．１３２重量％であった。
【0071】
＜カルノシン及びアンセリンの定量＞
チキンエキス中のカルノシン及びアンセリンの定量は、下記の条件でＨＰＬＣにより行った。
カルノシンの標準原液は、カルノシン粉末を脱イオン水に添加して溶解し、カルノシン濃度２．５０ｍｇ／ｍｌで調製した。アンセリンの標準原液は、Ｌ－アンセリン硝酸塩の粉末を脱イオン水に添加して溶解し、Ｌ－アンセリン濃度３．９６ｍｇ／ｍｌで調製した。
Ｌ－アンセリンの重量は、下記の式を用いて計算した。
Ｌ－アンセリン（ｇ）＝０．７９２×Ｌ－アンセリン硝酸塩（ｇ）
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
装置：紫外検出器付き高速液体クロマトグラフシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ１１００、Ａｇｉｌｅｎｔ社製）
カラム：Ｚｏｒｂａｘ ３００－ＳＣＸ ４．６ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）
移動相：５０ｍＭリン酸二水素カリウム
流速：１．０ｍＬ／分
フローチャネル：チャネルＡ（５０ｍＭリン酸二水素カリウム）、チャネルＢ（アセトニトリル）、チャネルＤ（脱イオン水）
ＵＶ検出波長：２１０ｎｍ
サンプル注入量：１０μＬ
チキンエキス中のカルノシン及びアンセリンの定量は、下記の条件でＨＰＬＣにより行った。
カルノシンの標準原液は、カルノシン粉末を脱イオン水に添加して溶解し、カルノシン濃度２．５０ｍｇ／ｍｌで調製した。アンセリンの標準原液は、Ｌ－アンセリン硝酸塩の粉末を脱イオン水に添加して溶解し、Ｌ－アンセリン濃度３．９６ｍｇ／ｍｌで調製した。
Ｌ－アンセリンの重量は、下記の式を用いて計算した。
Ｌ－アンセリン（ｇ）＝０．７９２×Ｌ－アンセリン硝酸塩（ｇ）
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
装置：紫外検出器付き高速液体クロマトグラフシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ１１００、Ａｇｉｌｅｎｔ社製）
カラム：Ｚｏｒｂａｘ ３００－ＳＣＸ ４．６ｍｍＩＤ×２５０ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）
移動相：５０ｍＭリン酸二水素カリウム
流速：１．０ｍＬ／分
フローチャネル：チャネルＡ（５０ｍＭリン酸二水素カリウム）、チャネルＢ（アセトニトリル）、チャネルＤ（脱イオン水）
ＵＶ検出波長：２１０ｎｍ
サンプル注入量：１０μＬ
【0072】
＜抗炎症活性の評価方法＞
実施例及び比較例では、下記の方法で炎症マーカーの産生抑制効果を評価した。
（原料及び試薬）
チキンエキス（ＣＥ）：Ｂｒａｎｄ’ｓ Ｅｓｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｈｉｃｋｅｎ（サントリー食品アジア社、１ｍｌ中のカルノシンの含有量：０．９４ｍｇ／ｍｌ、１ｍｌ中のアンセリンの含有量：１．９ｍｇ／ｍｌ）
軟骨細胞培地（ＣＭ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、軟骨細胞増殖サプリメント（ＣＧＳ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）：ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製
ＩＬ－１β：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製
ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）被覆９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）
実施例及び比較例では、下記の方法で炎症マーカーの産生抑制効果を評価した。
（原料及び試薬）
チキンエキス（ＣＥ）：Ｂｒａｎｄ’ｓ Ｅｓｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｈｉｃｋｅｎ（サントリー食品アジア社、１ｍｌ中のカルノシンの含有量：０．９４ｍｇ／ｍｌ、１ｍｌ中のアンセリンの含有量：１．９ｍｇ／ｍｌ）
軟骨細胞培地（ＣＭ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、軟骨細胞増殖サプリメント（ＣＧＳ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）：ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製
ＩＬ－１β：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製
ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）被覆９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）
【0073】
（細胞培養及び前処理）
ヒト軟骨細胞（ＨＣ－ａ、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）は、ヒト関節軟骨から分離され、５％ＦＢＳ、１％ＣＧＳ、１％Ｐ／Ｓを添加したＣＭで保存した。ＰＬＬ被覆９６ウェルプレートに細胞を細胞密度４０００細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ２を含む加湿ガスチャンバー内で、３７℃で一晩培養した。軟骨細胞をＰＢＳで１回洗浄し、チキンエキス（ＣＥ）、ＨＣＩＩ、ＨＣＩＩから分画した画分Ｐ６、画分Ｐ６とＣＥとの組み合わせ、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）と、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）と、グアノシンと、トリプトファンとを含むＰ６化合物、Ｐ６化合物とＣＥとの組み合わせ、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン、又は、ＣＥと、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、及びトリプトファンのいずれか１つとの組み合わせで処理した。２４時間の処理後、２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１βを添加して、軟骨細胞を更に２４時間処理した。細胞を１１００ｇで５分間遠心分離し、上清をサイトカイン分析に使用した。対比のため、ＣＥ、ＨＣＩＩ、画分Ｐ６、Ｐ６化合物、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファンで前処理せずに、ＩＬ－１βで処理した細胞（ＩＬ－１β処理細胞）を準備した。
ヒト軟骨細胞（ＨＣ－ａ、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）は、ヒト関節軟骨から分離され、５％ＦＢＳ、１％ＣＧＳ、１％Ｐ／Ｓを添加したＣＭで保存した。ＰＬＬ被覆９６ウェルプレートに細胞を細胞密度４０００細胞／ウェルで播種し、５％ＣＯ２を含む加湿ガスチャンバー内で、３７℃で一晩培養した。軟骨細胞をＰＢＳで１回洗浄し、チキンエキス（ＣＥ）、ＨＣＩＩ、ＨＣＩＩから分画した画分Ｐ６、画分Ｐ６とＣＥとの組み合わせ、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）と、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）と、グアノシンと、トリプトファンとを含むＰ６化合物、Ｐ６化合物とＣＥとの組み合わせ、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン、又は、ＣＥと、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、及びトリプトファンのいずれか１つとの組み合わせで処理した。２４時間の処理後、２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１βを添加して、軟骨細胞を更に２４時間処理した。細胞を１１００ｇで５分間遠心分離し、上清をサイトカイン分析に使用した。対比のため、ＣＥ、ＨＣＩＩ、画分Ｐ６、Ｐ６化合物、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファンで前処理せずに、ＩＬ－１βで処理した細胞（ＩＬ－１β処理細胞）を準備した。
【0074】
＜多重サイトカイン分析＞
Ｐｒｏ－Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ａｓｓａｙｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を使用して、培地中のサイトカインを分析した。多重分析は以下の２７個である：ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８（ＣＸＣＬ８）、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、エオタキシン（ＣＣＬ１１）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）－γ、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ－１；ＣＣＬ２）、マクロファージ炎症性タンパク質－１α（ＭＩＰ－１α；ＣＣＬ３）、ＭＩＰ－１β（ＣＣＬ４）、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）、ＴＮＦ－α及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）。製造元の指示に従って多重分析を実行し、Ｌｕｍｉｎｅｘ ｘＰＯＮＥＮＴ ｆｏｒ ＭＡＧＰＩＸプラットフォームで実行した。データ処理にはＢｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒバージョン６．０を使用した。サイトカインとケモカインの濃度は、標準曲線を参照して計算された。マルチプレックスキットの感度は５ｐｇ／ｍＬ未満であった。
Ｐｒｏ－Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ａｓｓａｙｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を使用して、培地中のサイトカインを分析した。多重分析は以下の２７個である：ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８（ＣＸＣＬ８）、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、エオタキシン（ＣＣＬ１１）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）－γ、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ－１；ＣＣＬ２）、マクロファージ炎症性タンパク質－１α（ＭＩＰ－１α；ＣＣＬ３）、ＭＩＰ－１β（ＣＣＬ４）、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）、ＴＮＦ－α及び血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）。製造元の指示に従って多重分析を実行し、Ｌｕｍｉｎｅｘ ｘＰＯＮＥＮＴ ｆｏｒ ＭＡＧＰＩＸプラットフォームで実行した。データ処理にはＢｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒバージョン６．０を使用した。サイトカインとケモカインの濃度は、標準曲線を参照して計算された。マルチプレックスキットの感度は５ｐｇ／ｍＬ未満であった。
【0075】
（統計分析）
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ社製）を使用して、統計分析を実施した。すべての結果は、平均±標準偏差として表される。統計分析は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続く事後テューキーの多重比較検定によって実行された。ｐ＜０．０５の場合、データは有意であると見なされる。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ社製）を使用して、統計分析を実施した。すべての結果は、平均±標準偏差として表される。統計分析は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続く事後テューキーの多重比較検定によって実行された。ｐ＜０．０５の場合、データは有意であると見なされる。
【0076】
（比較例１）画分Ｐ６の炎症マーカーの産生抑制効果
ＨＣＩＩ及びＨＣＩＩから分画された分画Ｐ６について、ヒト軟骨細胞によって生成される炎症マーカー（ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９及びＭＩＰ－１β）に対する影響を評価するため、下記の４つの異なる条件を比較した：処理前の細胞（未処理コントロール）、ＩＬ－１β処理細胞、ＩＬ－１β＋ＨＣＩＩ処理細胞（比較例１）、及びＩＬ－１β＋Ｐ６処理細胞（比較例１）。ＨＣＩＩ処理細胞、画分６処理細胞は、前処理にＨＣＩＩ又は画分Ｐ６を使用したものである。前処理において、ＨＣＩＩの濃度は５ｍｇ／ｍｌであり、画分Ｐ６の濃度は５ｍｇ／ｍｌであった。
図２に示すように、ＩＬ－１β２５ｎｇ／ｍＬはヒト軟骨細胞に炎症を誘発し、未処理細胞（コントロール）と比較して全ての炎症マーカーのレベルを大幅に増加させた。細胞をＨＣＩＩ及び画分Ｐ６で前処理すると、ＩＬ－１βによって誘導される全ての炎症マーカーのレベルが低下した。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表した。教示がない限り、＊は、ｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１のＩＬ－１β（ＩＬ－１β処理細胞）に対する有意差を示す。
ＨＣＩＩ及びＨＣＩＩから分画された分画Ｐ６について、ヒト軟骨細胞によって生成される炎症マーカー（ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９及びＭＩＰ－１β）に対する影響を評価するため、下記の４つの異なる条件を比較した：処理前の細胞（未処理コントロール）、ＩＬ－１β処理細胞、ＩＬ－１β＋ＨＣＩＩ処理細胞（比較例１）、及びＩＬ－１β＋Ｐ６処理細胞（比較例１）。ＨＣＩＩ処理細胞、画分６処理細胞は、前処理にＨＣＩＩ又は画分Ｐ６を使用したものである。前処理において、ＨＣＩＩの濃度は５ｍｇ／ｍｌであり、画分Ｐ６の濃度は５ｍｇ／ｍｌであった。
図２に示すように、ＩＬ－１β２５ｎｇ／ｍＬはヒト軟骨細胞に炎症を誘発し、未処理細胞（コントロール）と比較して全ての炎症マーカーのレベルを大幅に増加させた。細胞をＨＣＩＩ及び画分Ｐ６で前処理すると、ＩＬ－１βによって誘導される全ての炎症マーカーのレベルが低下した。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表した。教示がない限り、＊は、ｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１のＩＬ－１β（ＩＬ－１β処理細胞）に対する有意差を示す。
【0077】
（比較例２）Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファンの組み合わせ（Ｐ６化合物）の炎症マーカーＩＬ－６の産生抑制効果
Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン及びトリプトファンを含むＰ６化合物（これらの成分比はＨＣＩＩにおける成分比と同じ）について、ヒト軟骨細胞によって生成される炎症マーカーＩＬ－６に対する影響を評価するため、下記の５つの異なる条件を比較した：処理前の細胞（未処理コントロール）、ＩＬ－１β処理細胞、ＩＬ－１β＋ＨＣＩＩ処理細胞（比較例２）、ＩＬ－１β＋画分Ｐ６処理細胞（比較例２）、及びＩＬ－１β＋Ｐ６化合物処理細胞（比較例２）。ＨＣＩＩ処理細胞、画分Ｐ６処理細胞、及びＰ６化合物処理細胞は、前処理にＨＣＩＩ、画分Ｐ６、又はＰ６化合物を使用した。前処理において、ＨＣＩＩの濃度は５ｍｇ／ｍｌ、画分Ｐ６の濃度は５ｍｇ／ｍｌ、Ｐ６化合物の濃度は１００ｍｇ／ｍｌとした。
図３に示すように、ＩＬ－１β２５ｎｇ／ｍＬはヒト軟骨細胞に炎症を誘発し、未処理細胞（コントロール）と比較してＩＬ－６のレベルを大幅に増加させた。細胞をＨＣＩＩ、Ｐ６又はＰ６化合物で前処理すると、ＩＬ－１βによって誘導される炎症マーカーＩＬ－６のレベルが低下した。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表した。教示がない限り、＊は、ｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１のＩＬ－１βに対する有意差を示す。
Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン及びトリプトファンを含むＰ６化合物（これらの成分比はＨＣＩＩにおける成分比と同じ）について、ヒト軟骨細胞によって生成される炎症マーカーＩＬ－６に対する影響を評価するため、下記の５つの異なる条件を比較した：処理前の細胞（未処理コントロール）、ＩＬ－１β処理細胞、ＩＬ－１β＋ＨＣＩＩ処理細胞（比較例２）、ＩＬ－１β＋画分Ｐ６処理細胞（比較例２）、及びＩＬ－１β＋Ｐ６化合物処理細胞（比較例２）。ＨＣＩＩ処理細胞、画分Ｐ６処理細胞、及びＰ６化合物処理細胞は、前処理にＨＣＩＩ、画分Ｐ６、又はＰ６化合物を使用した。前処理において、ＨＣＩＩの濃度は５ｍｇ／ｍｌ、画分Ｐ６の濃度は５ｍｇ／ｍｌ、Ｐ６化合物の濃度は１００ｍｇ／ｍｌとした。
図３に示すように、ＩＬ－１β２５ｎｇ／ｍＬはヒト軟骨細胞に炎症を誘発し、未処理細胞（コントロール）と比較してＩＬ－６のレベルを大幅に増加させた。細胞をＨＣＩＩ、Ｐ６又はＰ６化合物で前処理すると、ＩＬ－１βによって誘導される炎症マーカーＩＬ－６のレベルが低下した。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表した。教示がない限り、＊は、ｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１のＩＬ－１βに対する有意差を示す。
【0078】
（比較例３）Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、及び、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファンの組み合わせ（Ｐ６化合物）の炎症マーカーＭＣＰ－１（ＭＣＡＦ）の産生抑制効果
Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン及びトリプトファンを含むＰ６化合物（これらの成分比はＨＣＩＩにおける成分比と同じ）及びＣｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）（ｃＰＧ）について、ヒト軟骨細胞によって生成される炎症マーカーＭＣＰ－１（ＭＣＡＦ）に対する影響を評価するため、下記の６つの異なる条件を比較した：処理前の細胞（未処理コントロール）、ＩＬ－１β処理細胞、ＩＬ－１β＋ＨＣＩＩ処理細胞（比較例３）、ＩＬ－１β＋画分Ｐ６処理細胞（比較例３）、ＩＬ－１β＋Ｐ６化合物処理細胞（比較例３）、及びＩＬ－１β＋ｃＰＧ化合物処理細胞（比較例３）。ＨＣＩＩ処理細胞、画分Ｐ６処理細胞、Ｐ６化合物処理細胞、及びｃＰＧ処理細胞は、前処理にＨＣＩＩ、画分Ｐ６、ｐ６化合物、又はｃＰＧを使用した。前処理において、ＨＣＩＩの濃度は５ｍｇ／ｍｌ、画分Ｐ６の濃度は５ｍｇ／ｍｌ、Ｐ６化合物の濃度は１００ｍｇ／ｍｌ、ｃＰＧの濃度は５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、又は２５０ｍｇ／ｍｌとした。
図４に示すように、ＩＬ－１β２５ｎｇ／ｍＬはヒト軟骨細胞に炎症を誘発し、未処理細胞（コントロール）と比較してＭＣＰ－１（ＭＣＡＦ）のレベルを大幅に増加させた。細胞をＨＣＩＩ、Ｐ６、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、又はＰ６化合物で前処理すると、ＩＬ－１βによって誘導される炎症マーカーＭＣＰ－１のレベルが低下した。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表した。教示がない限り、＊は、ｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１のＩＬ－１βに対する有意差を示す。
Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン及びトリプトファンを含むＰ６化合物（これらの成分比はＨＣＩＩにおける成分比と同じ）及びＣｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）（ｃＰＧ）について、ヒト軟骨細胞によって生成される炎症マーカーＭＣＰ－１（ＭＣＡＦ）に対する影響を評価するため、下記の６つの異なる条件を比較した：処理前の細胞（未処理コントロール）、ＩＬ－１β処理細胞、ＩＬ－１β＋ＨＣＩＩ処理細胞（比較例３）、ＩＬ－１β＋画分Ｐ６処理細胞（比較例３）、ＩＬ－１β＋Ｐ６化合物処理細胞（比較例３）、及びＩＬ－１β＋ｃＰＧ化合物処理細胞（比較例３）。ＨＣＩＩ処理細胞、画分Ｐ６処理細胞、Ｐ６化合物処理細胞、及びｃＰＧ処理細胞は、前処理にＨＣＩＩ、画分Ｐ６、ｐ６化合物、又はｃＰＧを使用した。前処理において、ＨＣＩＩの濃度は５ｍｇ／ｍｌ、画分Ｐ６の濃度は５ｍｇ／ｍｌ、Ｐ６化合物の濃度は１００ｍｇ／ｍｌ、ｃＰＧの濃度は５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、又は２５０ｍｇ／ｍｌとした。
図４に示すように、ＩＬ－１β２５ｎｇ／ｍＬはヒト軟骨細胞に炎症を誘発し、未処理細胞（コントロール）と比較してＭＣＰ－１（ＭＣＡＦ）のレベルを大幅に増加させた。細胞をＨＣＩＩ、Ｐ６、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、又はＰ６化合物で前処理すると、ＩＬ－１βによって誘導される炎症マーカーＭＣＰ－１のレベルが低下した。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表した。教示がない限り、＊は、ｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１のＩＬ－１βに対する有意差を示す。
【0079】
＜実施例１＞ＨＣＩＩとＣＥとの組み合わせの相乗効果
炎症マーカーＭＩＰ－１βの産生抑制に対するＨＣＩＩとＣＥを組み合わせた相乗効果を評価するために、ＨＣＩＩ単独、ＣＥ単独、ＨＣＩＩとＣＥとを組み合わせた条件で前処理を行った。前処理の際のＨＣＩＩの濃度は０．５ｍｇ／ｍｌ、ＣＥの濃度は１．２５ｍｇ／ｍｌとした。
図５に示すように、ＨＣＩＩ０．５ｍｇ／ｍＬとＣＥ１．２５ｍｇ／ｍＬの組み合わせは、ＨＣＩＩ又はＣＥ単独での処理と比較して、炎症を軽減する相乗効果をもたらした。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表される。教示がない限り、＊は、ｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１のＩＬ－１β（ＩＬ－１β処理細胞）に対する有意差を示す。
炎症マーカーＭＩＰ－１βの産生抑制に対するＨＣＩＩとＣＥを組み合わせた相乗効果を評価するために、ＨＣＩＩ単独、ＣＥ単独、ＨＣＩＩとＣＥとを組み合わせた条件で前処理を行った。前処理の際のＨＣＩＩの濃度は０．５ｍｇ／ｍｌ、ＣＥの濃度は１．２５ｍｇ／ｍｌとした。
図５に示すように、ＨＣＩＩ０．５ｍｇ／ｍＬとＣＥ１．２５ｍｇ／ｍＬの組み合わせは、ＨＣＩＩ又はＣＥ単独での処理と比較して、炎症を軽減する相乗効果をもたらした。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表される。教示がない限り、＊は、ｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１のＩＬ－１β（ＩＬ－１β処理細胞）に対する有意差を示す。
【0080】
＜実施例２＞炎症マーカーＭＣＰ－１及びＭＩＰ－１βの産生抑制に対するＨＣＩＩとＣＥとの組み合わせの相乗効果、及び画分Ｐ６とＣＥとの組み合わせの相乗効果
炎症マーカーＭＣＰ－１及びＭＩＰ－１βの産生抑制に対するＨＣＩＩとＣＥとの組み合わせの相乗効果、及び画分Ｐ６とＣＥとの組み合わせの相乗効果を評価するために、実施例１と同様に、ＩＬ－１βとＨＣＩＩ単独、ＣＥ単独、Ｐ６単独、ＨＣＩＩとＣＥとの組み合わせ、又はＰ６とＣＥとの組み合わせの条件で前処理を行った。前処理の際のＨＣＩＩの濃度は２．５ｍｇ／ｍｌ又は５ｍｇ／ｍｌとし、Ｐ６の濃度は２．５ｍｇ／ｍｌ又は５ｍｇ／ｍｌとし、ＣＥの濃度は６．２５ｍｇ／ｍｌとした。
図６（ａ）及び図６（ｂ）に結果を示す。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表される。教示がない限り、＊は、ｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１のＩＬ－１β（ＩＬ－１β処理細胞）に対する有意差を示す。
炎症マーカーＭＣＰ－１及びＭＩＰ－１βの産生抑制に対するＨＣＩＩとＣＥとの組み合わせの相乗効果、及び画分Ｐ６とＣＥとの組み合わせの相乗効果を評価するために、実施例１と同様に、ＩＬ－１βとＨＣＩＩ単独、ＣＥ単独、Ｐ６単独、ＨＣＩＩとＣＥとの組み合わせ、又はＰ６とＣＥとの組み合わせの条件で前処理を行った。前処理の際のＨＣＩＩの濃度は２．５ｍｇ／ｍｌ又は５ｍｇ／ｍｌとし、Ｐ６の濃度は２．５ｍｇ／ｍｌ又は５ｍｇ／ｍｌとし、ＣＥの濃度は６．２５ｍｇ／ｍｌとした。
図６（ａ）及び図６（ｂ）に結果を示す。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表される。教示がない限り、＊は、ｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１のＩＬ－１β（ＩＬ－１β処理細胞）に対する有意差を示す。
【0081】
＜実施例３＞炎症マーカーの産生抑制に対するＨＣＩＩとＣＥとの組み合わせの相乗効果、Ｐ６化合物とＣＥとの組み合わせの相乗効果、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）とＣＥとの組み合わせの相乗効果、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）とＣＥとの組み合わせの相乗効果、グアノシンとＣＥとの組み合わせの相乗効果、及びトリプトファンとＣＥとの組み合わせの相乗効果
炎症マーカーであるＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、及びＲＡＮＴＥＳの産生抑制に対するＨＣＩＩとＣＥとの組み合わせの相乗効果、Ｐ６化合物とＣＥとの組み合わせの相乗効果、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）（ｃＰＧ）とＣＥとの組み合わせの相乗効果、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）（ｃＡＨ）とＣＥとの組み合わせの相乗効果、グアノシンとＣＥとの組み合わせの相乗効果、及びトリプトファンとＣＥとの組み合わせの相乗効果を評価するために、実施例１と同様に、前処理を行った。前処理において、ＨＣＩＩの濃度は２．５ｍｇ／ｍＬ、Ｐ６化合物の濃度は２５ｍｇ／ｍｌ、１２５ｍｇ／ｍｌ、又は２５０ｍｇ／ｍＬ、ｃＰＧの濃度は２５ｍｇ／ｍｌ、１２５ｍｇ／ｍｌ、又は２５０ｍｇ／ｍＬ、ｃＡＨの濃度は２５ｍｇ／ｍｌ、１２５ｍｇ／ｍｌ、又は２５０ｍｇ／ｍＬ、グアノシンの濃度は２５ｍｇ／ｍｌ、１２５ｍｇ／ｍｌ又は２５０ｍｇ／ｍＬ、トリプトファンの濃度は２５ｍｇ／ｍｌ、１２５ｍｇ／ｍｌ、又は２５０ｍｇ／ｍＬ、及びＣＥの濃度は６．２５ｍｇ／ｍｌとした。
図７－１（ａ）、図７－１（ｂ）、図７－２（ｃ）、図７－２（ｄ）、図７－３（ｅ）、及び図７－３（ｆ）に結果を示す。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表される。教示がない限り、＊は、ｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１のＩＬ－１β（ＩＬ－１β処理細胞）に対する有意差を示す。
炎症マーカーであるＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、及びＲＡＮＴＥＳの産生抑制に対するＨＣＩＩとＣＥとの組み合わせの相乗効果、Ｐ６化合物とＣＥとの組み合わせの相乗効果、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）（ｃＰＧ）とＣＥとの組み合わせの相乗効果、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）（ｃＡＨ）とＣＥとの組み合わせの相乗効果、グアノシンとＣＥとの組み合わせの相乗効果、及びトリプトファンとＣＥとの組み合わせの相乗効果を評価するために、実施例１と同様に、前処理を行った。前処理において、ＨＣＩＩの濃度は２．５ｍｇ／ｍＬ、Ｐ６化合物の濃度は２５ｍｇ／ｍｌ、１２５ｍｇ／ｍｌ、又は２５０ｍｇ／ｍＬ、ｃＰＧの濃度は２５ｍｇ／ｍｌ、１２５ｍｇ／ｍｌ、又は２５０ｍｇ／ｍＬ、ｃＡＨの濃度は２５ｍｇ／ｍｌ、１２５ｍｇ／ｍｌ、又は２５０ｍｇ／ｍＬ、グアノシンの濃度は２５ｍｇ／ｍｌ、１２５ｍｇ／ｍｌ又は２５０ｍｇ／ｍＬ、トリプトファンの濃度は２５ｍｇ／ｍｌ、１２５ｍｇ／ｍｌ、又は２５０ｍｇ／ｍＬ、及びＣＥの濃度は６．２５ｍｇ／ｍｌとした。
図７－１（ａ）、図７－１（ｂ）、図７－２（ｃ）、図７－２（ｄ）、図７－３（ｅ）、及び図７－３（ｆ）に結果を示す。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表される。教示がない限り、＊は、ｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１のＩＬ－１β（ＩＬ－１β処理細胞）に対する有意差を示す。
【0082】
＜実施例４＞膝痛に対するＨＣＩＩ及びＣＥの効果を調べるためのランダム化二重盲検４アームパイロット試験
本パイロット試験は、単一施設、二重盲検、ランダム化、プラセボ対照試験として実施した。
本パイロット試験は、単一施設、二重盲検、ランダム化、プラセボ対照試験として実施した。
【0083】
（被験者の登録とランダム化）
表３にまとめる選択基準及び除外基準を用いて、４５歳～７５歳の合計１６０人の被験者を選択した。被験者をランダムに下記の４群に分けた：「プラセボ」、「グルコサミン」、「ＨＣＩＩ」、及び「ＨＣＩＩとＣＥ」。各群には４０人の被験者が含まれた。
表３にまとめる選択基準及び除外基準を用いて、４５歳～７５歳の合計１６０人の被験者を選択した。被験者をランダムに下記の４群に分けた：「プラセボ」、「グルコサミン」、「ＨＣＩＩ」、及び「ＨＣＩＩとＣＥ」。各群には４０人の被験者が含まれた。
【0084】
【表3】
【0085】
（試験製品）
「プラセボ」群は、マルトデキストリン６．８ｇ及びキサンタンガム７ｍｇを摂取した。「グルコサミン」群は、グルコサミン塩酸塩１．５ｇを摂取した。グルコサミン塩酸塩は陽性対照として用いた。
「ＨＣＩＩ」群は、２型コラーゲン加水分解物（ＨＣＩＩ）の天然の基質と、低分子量コンドロイチン硫酸と、ヒアルロン酸（ＨＡ）とからなるトリ胸肋軟骨加水分解抽出物である、ＢＲＡＮＤコラーゲン加水分解物（サントリー食品アジア社製）を摂取した。この製品には、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、及びトリプトファンを含むＨＣＩＩが含まれる。容量６８ｍＬの各ボトルに２ｇのＨＣＩＩが含まれ、ＨＣＩＩ（６６．５％）と、解重合したコンドロイチン硫酸（１８％）と、ＨＡ（１１％）とからなる天然組成物を提供する。残り４．５％は、胸肋軟骨の成分のうち、特性のないものが占める。
「ＨＣＩＩとＣＥ」群は、６８ｍＬのボトルに含まれるＢｒａｎｄ’ｓ Ｅｓｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｈｉｃｋｅｎ（ＢＥＣ）７０ｇ（乾燥重量：５～６ｇ）及びＨＣＩＩ２ｇの混合物を摂取した。試験品は、全て、ガラス瓶詰めの液体製品として調製され、等カロリー、同一の外観、及び同等の風味と食感を有した。参加者は、１日１回、午前中、食後に試験製品を摂取した。
参加者は、試験結果に影響がないと見なされる場合、併用薬又はサプリメントを継続して摂取することが許可された。痛み止め又は鎮痛剤は、処方箋の下で救急薬として許可された。「鎮痛剤の併用」欄の記録に基づいて鎮痛剤による治療日数カバー比率（ＰＤＣ）を算出し、ｖｉｓｉｔ間の総日数に対する鎮痛剤の治療日数カバー率と定義した。試験期間中、ホルモン療法（成長ホルモン、プロゲステロン、エストロゲン、テストステロン）、カルシウム、ビタミンＤ、又は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、オメガ３、オメガ６、グルコサミン、又はコンドロイチンを豊富に含むサプリメント等、関節、骨、及び筋肉の健康をサポートする治療や栄養補助食品は全て禁止された。
「プラセボ」群は、マルトデキストリン６．８ｇ及びキサンタンガム７ｍｇを摂取した。「グルコサミン」群は、グルコサミン塩酸塩１．５ｇを摂取した。グルコサミン塩酸塩は陽性対照として用いた。
「ＨＣＩＩ」群は、２型コラーゲン加水分解物（ＨＣＩＩ）の天然の基質と、低分子量コンドロイチン硫酸と、ヒアルロン酸（ＨＡ）とからなるトリ胸肋軟骨加水分解抽出物である、ＢＲＡＮＤコラーゲン加水分解物（サントリー食品アジア社製）を摂取した。この製品には、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、及びトリプトファンを含むＨＣＩＩが含まれる。容量６８ｍＬの各ボトルに２ｇのＨＣＩＩが含まれ、ＨＣＩＩ（６６．５％）と、解重合したコンドロイチン硫酸（１８％）と、ＨＡ（１１％）とからなる天然組成物を提供する。残り４．５％は、胸肋軟骨の成分のうち、特性のないものが占める。
「ＨＣＩＩとＣＥ」群は、６８ｍＬのボトルに含まれるＢｒａｎｄ’ｓ Ｅｓｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｈｉｃｋｅｎ（ＢＥＣ）７０ｇ（乾燥重量：５～６ｇ）及びＨＣＩＩ２ｇの混合物を摂取した。試験品は、全て、ガラス瓶詰めの液体製品として調製され、等カロリー、同一の外観、及び同等の風味と食感を有した。参加者は、１日１回、午前中、食後に試験製品を摂取した。
参加者は、試験結果に影響がないと見なされる場合、併用薬又はサプリメントを継続して摂取することが許可された。痛み止め又は鎮痛剤は、処方箋の下で救急薬として許可された。「鎮痛剤の併用」欄の記録に基づいて鎮痛剤による治療日数カバー比率（ＰＤＣ）を算出し、ｖｉｓｉｔ間の総日数に対する鎮痛剤の治療日数カバー率と定義した。試験期間中、ホルモン療法（成長ホルモン、プロゲステロン、エストロゲン、テストステロン）、カルシウム、ビタミンＤ、又は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、オメガ３、オメガ６、グルコサミン、又はコンドロイチンを豊富に含むサプリメント等、関節、骨、及び筋肉の健康をサポートする治療や栄養補助食品は全て禁止された。
【0086】
（手順）
本試験では、最初にスクリーニングｖｉｓｉｔ（ベースラインｖｉｓｉｔの２８日前）を行い、その後、ベースラインｖｉｓｉｔ（ベースラインｖｉｓｉｔは０日目であるが、スクリーニングｖｉｓｉｔとベースラインｖｉｓｉｔは同日でもよい）、そして３回のフォローアップｖｉｓｉｔ（８週目、１６週目、２４週目）を行った。０日目の２８日前から０日目にかけて被験者をスクリーニングして、試験への適格性を判断した。ベースラインｖｉｓｉｔの翌日から１６８日間（２４週間）連続して被験物質を摂取した。１６８日間（２４週間）連続して、被験者は１日１本を午前中、食後に摂取した。摂取コンプライアンスを日誌カードに記録した。
膝痛における視覚的アナログスケール（ＶＡＳ）は、摂取後０日目、７日目、及び１４日目にスコア化した。
試験期間中、被験者はトレーニングスケジュールに従って、自宅で週２回、１回３０分のレジスタンストレーニング（強制ではない）を行うことが推奨された。トレーニングは日誌カードに記録し、ｖｉｓｉｔ前１週間の食事内容を食事アンケートにより記録した。
本試験では、最初にスクリーニングｖｉｓｉｔ（ベースラインｖｉｓｉｔの２８日前）を行い、その後、ベースラインｖｉｓｉｔ（ベースラインｖｉｓｉｔは０日目であるが、スクリーニングｖｉｓｉｔとベースラインｖｉｓｉｔは同日でもよい）、そして３回のフォローアップｖｉｓｉｔ（８週目、１６週目、２４週目）を行った。０日目の２８日前から０日目にかけて被験者をスクリーニングして、試験への適格性を判断した。ベースラインｖｉｓｉｔの翌日から１６８日間（２４週間）連続して被験物質を摂取した。１６８日間（２４週間）連続して、被験者は１日１本を午前中、食後に摂取した。摂取コンプライアンスを日誌カードに記録した。
膝痛における視覚的アナログスケール（ＶＡＳ）は、摂取後０日目、７日目、及び１４日目にスコア化した。
試験期間中、被験者はトレーニングスケジュールに従って、自宅で週２回、１回３０分のレジスタンストレーニング（強制ではない）を行うことが推奨された。トレーニングは日誌カードに記録し、ｖｉｓｉｔ前１週間の食事内容を食事アンケートにより記録した。
【0087】
（処理コンプライアンス）
試験製品の摂取に関するコンプライアンスは、未使用薬の回収と被験者による毎日の摂取記録によって確認した。コンプライアンスは、ｖｉｓｉｔ間の日数に対して、割り付けられた用量のうち実際に摂取した用量の割合によって定義した。摂取率が７０％であれば、準拠していると見なした。
試験製品の摂取に関するコンプライアンスは、未使用薬の回収と被験者による毎日の摂取記録によって確認した。コンプライアンスは、ｖｉｓｉｔ間の日数に対して、割り付けられた用量のうち実際に摂取した用量の割合によって定義した。摂取率が７０％であれば、準拠していると見なした。
【0088】
（運動プログラム）
ベースラインｖｉｓｉｔ時に配布されたトレーニングマニュアルに従って、全被験者に週２回、各３０分間の自宅でのレジスタンストレーニングを奨励した。トレーニングプログラムのコンプライアンスを日誌カードに記録し、以下の式で算出した。
ベースラインｖｉｓｉｔ時に配布されたトレーニングマニュアルに従って、全被験者に週２回、各３０分間の自宅でのレジスタンストレーニングを奨励した。トレーニングプログラムのコンプライアンスを日誌カードに記録し、以下の式で算出した。
【0089】
【数1】
【0090】
コンプライアンス率が≧５０％であれば、準拠していると見なした。
【0091】
（膝痛における視覚的アナログスケール（ＶＡＳ））
視覚的アナログスケール（ＶＡＳ）は、０～１００ｍｍでスコア化した。０は無痛を示し、１００はこれまでで最大の痛みを示す。摂取後０日目、７日目、及び１４日目において、対象者は、感じた痛みの程度を特定するよう求められた。痛みの程度は、スケールで直線を引き、実線に沿った位置を示すことで表した。
視覚的アナログスケール（ＶＡＳ）は、０～１００ｍｍでスコア化した。０は無痛を示し、１００はこれまでで最大の痛みを示す。摂取後０日目、７日目、及び１４日目において、対象者は、感じた痛みの程度を特定するよう求められた。痛みの程度は、スケールで直線を引き、実線に沿った位置を示すことで表した。
【0092】
（忍容性と安全性）
試験期間中、自発的に報告された有害事象を記録した。バイタルサインをｖｉｓｉｔ毎に確認した。試験製品の安全性を評価するため、試験期間中のｖｉｓｉｔ毎に、全参加者の血清及び尿を測定した。
試験期間中、自発的に報告された有害事象を記録した。バイタルサインをｖｉｓｉｔ毎に確認した。試験製品の安全性を評価するため、試験期間中のｖｉｓｉｔ毎に、全参加者の血清及び尿を測定した。
【0093】
（統計分析）
先験的な統計解析計画に従って、ｐｅｒ－ｐｒｏｔｏｃｏｌ統計解析を行った。摂取コンプライアンス率≧７０％のランダム化された被験者をｐｅｒ－ｐｒｏｔｏｃｏｌ解析の対象とした。安全性パラメータの解析は、試験製品を２８本以上摂取した被験者を対象に実施した。二分変数はパーセンテージで報告し、連続変数は平均値とＳＤで報告した。カテゴリー変数の比較にはカイ二乗検定を使用し、連続変数の群間差の比較にはクラスカル・ウォリス検定を使用した。
連続的な主要及び副次評価項目に関し、試験群間の変化の平均差の検定で使用する混合効果モデルを用いて、ｖｉｓｉｔ毎の摂取の相互作用を固定効果因子として反復測定分散分析（ＡＮＯＶＡ）を実施した。結果は全て、対応するｐ値が０．０５未満の場合、統計的に有意であると見なした。ｖｉｓｉｔ毎の摂取の相互作用項が有意であった場合、処理群間の事後ペアワイズ比較を行い、調整後のｐ値を報告した。評価項目に影響を及ぼすと予想される変数は、因子としてモデルに含めた。関節の健康に関する分析では性別とｖｉｓｉｔ毎の性別の相互作用項を因子として含めた。
更に、レジスタンストレーニングの実施回数が全トレーニング期間の１０パーセンタイル未満の被験者については、サブグループ解析を行った。分析は、独立した統計学者によって、ＳＡＳ ｖｅｒｓｉｏｎ９．４（米国ノースカロライナ州ケーリー）を使用して行われた。
先験的な統計解析計画に従って、ｐｅｒ－ｐｒｏｔｏｃｏｌ統計解析を行った。摂取コンプライアンス率≧７０％のランダム化された被験者をｐｅｒ－ｐｒｏｔｏｃｏｌ解析の対象とした。安全性パラメータの解析は、試験製品を２８本以上摂取した被験者を対象に実施した。二分変数はパーセンテージで報告し、連続変数は平均値とＳＤで報告した。カテゴリー変数の比較にはカイ二乗検定を使用し、連続変数の群間差の比較にはクラスカル・ウォリス検定を使用した。
連続的な主要及び副次評価項目に関し、試験群間の変化の平均差の検定で使用する混合効果モデルを用いて、ｖｉｓｉｔ毎の摂取の相互作用を固定効果因子として反復測定分散分析（ＡＮＯＶＡ）を実施した。結果は全て、対応するｐ値が０．０５未満の場合、統計的に有意であると見なした。ｖｉｓｉｔ毎の摂取の相互作用項が有意であった場合、処理群間の事後ペアワイズ比較を行い、調整後のｐ値を報告した。評価項目に影響を及ぼすと予想される変数は、因子としてモデルに含めた。関節の健康に関する分析では性別とｖｉｓｉｔ毎の性別の相互作用項を因子として含めた。
更に、レジスタンストレーニングの実施回数が全トレーニング期間の１０パーセンタイル未満の被験者については、サブグループ解析を行った。分析は、独立した統計学者によって、ＳＡＳ ｖｅｒｓｉｏｎ９．４（米国ノースカロライナ州ケーリー）を使用して行われた。
【0094】
＜結果＞
（ベースライン特性と処理コンプライアンス）
合計１６０名の被験者が登録され、１５１名の被験者が試験を完了し、統計解析の対象となった（ＰＰ）。９名の被験者が途中で脱落したが、群間において脱落者数に有意差はなかった。なお、脱落者は試験製品又はプラセボの摂取による副作用とは無関係であった。有害事象は認められなかった。血清生化学マーカーと尿検査で臨床的に有意な変化は認められなかった。
全体的に、４つの全ての群間で、コンプライアンス率における統計的な差はなかった（表４）。データの均一性を評価するために、全てのパラメータを４つのアーム間で比較した。ベースライン時の試験群間に統計的に有意な差はなかった（表４）。
（ベースライン特性と処理コンプライアンス）
合計１６０名の被験者が登録され、１５１名の被験者が試験を完了し、統計解析の対象となった（ＰＰ）。９名の被験者が途中で脱落したが、群間において脱落者数に有意差はなかった。なお、脱落者は試験製品又はプラセボの摂取による副作用とは無関係であった。有害事象は認められなかった。血清生化学マーカーと尿検査で臨床的に有意な変化は認められなかった。
全体的に、４つの全ての群間で、コンプライアンス率における統計的な差はなかった（表４）。データの均一性を評価するために、全てのパラメータを４つのアーム間で比較した。ベースライン時の試験群間に統計的に有意な差はなかった（表４）。
【0095】
【表4】
【0096】
（膝痛のＶＡＳにおける変化）
１４日間摂取した後、レジスタンストレーニングの実施回数がレジスタンストレーニングの全期間の１０パーセンタイル未満の被験者のサブグループ解析では、プラセボ群はＨＣＩＩ＋ＣＥ（ｐ＝０．０４７）群に比べ、１４日目にベースラインから２００％、０日目から４２．９％と大幅に疼痛スコアが増加した（図８、表５）。
表５において、「Ｐ値（＄）」は群間のｐ値、「（ａ）」はｐ値の決定に用いた方法（（ａ）＝１元配置分散分析）、「９５％Ｃ．Ｉ.」は９５％信頼区間を意味する。
図８において、各データの括弧内の２つの数値は、「平均－標準偏差」「平均＋標準偏差」である。
１４日間摂取した後、レジスタンストレーニングの実施回数がレジスタンストレーニングの全期間の１０パーセンタイル未満の被験者のサブグループ解析では、プラセボ群はＨＣＩＩ＋ＣＥ（ｐ＝０．０４７）群に比べ、１４日目にベースラインから２００％、０日目から４２．９％と大幅に疼痛スコアが増加した（図８、表５）。
表５において、「Ｐ値（＄）」は群間のｐ値、「（ａ）」はｐ値の決定に用いた方法（（ａ）＝１元配置分散分析）、「９５％Ｃ．Ｉ.」は９５％信頼区間を意味する。
図８において、各データの括弧内の２つの数値は、「平均－標準偏差」「平均＋標準偏差」である。
【0097】
【表5】
【0098】
（結論）
以上より、ＨＣＩＩ及びＣＥは変形性関節症の疼痛に悩む患者に対して、忍容性が高く、迅速かつ有意な症状緩和をもたらすことがわかった。プラセボと比較して、ＨＣＩＩとＣＥとの組み合わせは、最小限のレジスタンストレーニングを行った被験者において、わずか１４日間で膝関節痛が大幅に減少した。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験では、その作用機序は、基礎疾患プロセスの改善、特に局所的な疼痛感覚をもたらす炎症の抑制である可能性が示唆される。ＨＣＩＩとＣＥとの組み合わせは、変形性膝関節症（ＯＡ）症状の管理において、現在の医学的及び食事療法の選択肢を安全かつ有効に補完し得ると考えられる。
以上より、ＨＣＩＩ及びＣＥは変形性関節症の疼痛に悩む患者に対して、忍容性が高く、迅速かつ有意な症状緩和をもたらすことがわかった。プラセボと比較して、ＨＣＩＩとＣＥとの組み合わせは、最小限のレジスタンストレーニングを行った被験者において、わずか１４日間で膝関節痛が大幅に減少した。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験では、その作用機序は、基礎疾患プロセスの改善、特に局所的な疼痛感覚をもたらす炎症の抑制である可能性が示唆される。ＨＣＩＩとＣＥとの組み合わせは、変形性膝関節症（ＯＡ）症状の管理において、現在の医学的及び食事療法の選択肢を安全かつ有効に補完し得ると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【0099】
本発明は、Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つと、チキンエキスとを含む新規な組成物を提供することができる。本発明の組成物は、炎症及び関節痛を抑制するための飲食品組成物又は医薬品組成物として使用することができる。Ｃｙｃｌｏ（Ａｌａ－Ｈｙｐ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、グアノシン、トリプトファン及びそれらの塩並びにチキンエキスは、飲食品等として摂取可能であり、安全性が高いという利点も有する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図8】