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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-27
(45)【発行日】2024-09-04
(54)【発明の名称】デジタルＰＣＲの測定方法および測定装置
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6844 20180101AFI20240828BHJP
C12Q 1/6816 20180101ALI20240828BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20240828BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20240828BHJP
G01N 21/64 20060101ALI20240828BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240828BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6844 Z ZNA
C12Q1/6816 Z
C12M1/00 A
C12M1/34 Z
G01N21/64 F
C12N15/09 Z
【請求項の数】
23
(21)【出願番号】P 2023038011
(22)【出願日】2023-03-10
(62)【分割の表示】P 2019118981の分割
【原出願日】2019-06-26
(65)【公開番号】P2023072013
(43)【公開日】2023-05-23
【審査請求日】2023-03-10
(73)【特許権者】
【識別番号】000005108
【氏名又は名称】株式会社日立製作所
(74)【代理人】
【識別番号】110000176
【氏名又は名称】弁理士法人一色国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】田中 淳子
(72)【発明者】
【氏名】中川 樹生
(72)【発明者】
【氏名】島崎 譲
(72)【発明者】
【氏名】白鳥 亜希子
【審査官】藤井 美穂
(56)【参考文献】
【文献】特許第７２４５７３４（ＪＰ，Ｂ２）
【文献】国際公開第２０１８／１２８０１３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Sci. Rep.，2019年02月22日，Vol.9, No.2626，pp.1-8
【文献】Anal. Chem.，2017年06月20日，Vol.89, No.12，pp.6305-6308
【文献】J. Clin. Microbiol.，2018年01月24日，Vol.56, No.2，e01239-17, pp.1-9
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００ － １５／９０
Ｃ１２Ｑ １／００ － ３／００
Ｃ１２Ｍ １／００ － ３／１０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数種類の検出対象のＤＮＡと、前記複数種類の検出対象のＤＮＡにそれぞれ結合する、同一の蛍光色素で標識された複数種類の蛍光標識プローブとを含有するＤＮＡ溶液を複数の区画に分割する工程と、前記複数の区画の中で核酸増幅反応を行う工程と、
温度変化に伴って前記ＤＮＡ溶液から放出される蛍光の蛍光強度を測定する工程と、
前記ＤＮＡ溶液の温度変化に伴う前記蛍光強度の変化からＤＮＡ二重鎖の融解温度を算出する工程と、
第１の軸に融解曲線又は融解曲線の微分曲線の形状を示す値をとり、第２の軸に前記融解温度をとって、前記複数の区画のそれぞれの前記ＤＮＡ溶液についてプロットする工程と、
前記プロットに基づいて、前記複数の区画のそれぞれが前記検出対象のＤＮＡを２種類含む区画なのか、１種類含む区画なのかを判別する工程と、を含み、
前記複数種類の検出対象のＤＮＡに対する、前記複数種類の蛍光標識プローブおのおのの融解温度の差が１０℃以下である、デジタルＰＣＲを用いたＤＮＡ検出方法。
【請求項2】
前記融解曲線又は融解曲線の微分曲線の形状を示す値が、前記融解曲線の所定値の傾きを有する２点の温度差であることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項3】
前記融解曲線又は融解曲線の微分曲線の形状を示す値が、前記微分曲線の半値幅であることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項4】
前記蛍光強度が所定の閾値以上の区画をＤＮＡ有りと判別し、前記所定の閾値未満の区画をＤＮＡ無しと判別する工程をさらに含み、ＤＮＡ有りと判別された区画に対して、前記検出対象のＤＮＡを２種類含む区画なのか、１種類含む区画なのかが判別される、請求項１に記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項5】
前記複数の区画内のＤＮＡの判別を行うためのデータとして、融解温度よりも低温な温度での蛍光強度、融解温度よりも高温な温度での蛍光強度、融解温度よりも高温な温度での蛍光強度に対する融解温度よりも低温な温度での蛍光強度の比、融解温度よりも低温な温度での蛍光強度と融解温度よりも高温な温度での蛍光強度との差、融解温度、及び融解曲線の形状を表す特徴量からなる群から選択される請求項１に記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項6】
複数種類の検出対象のＤＮＡと、前記複数種類の検出対象のＤＮＡにそれぞれ結合する、同一の蛍光色素で標識された複数種類の蛍光標識プローブとを含有するＤＮＡ溶液を複数の区画に分割する工程と、前記複数の区画の中で核酸増幅反応を行う工程と、
温度変化に伴って前記ＤＮＡ溶液から放出される蛍光の蛍光強度を測定する工程と、
前記ＤＮＡ溶液の温度変化に伴う前記蛍光強度の変化からＤＮＡ二重鎖の融解温度を算出する工程と、
前記蛍光強度の変化を示す融解曲線の微分曲線における所定値（＝－Δ蛍光強度／Δ温度）を有する２点の温度差を算出する工程と、を含み、
前記複数種類の検出対象のＤＮＡに対する、前記複数種類の蛍光標識プローブおのおのの融解温度の差が１０℃以下である、デジタルＰＣＲを用いたＤＮＡ検出方法。
【請求項7】
前記蛍光強度の変化を示す融解曲線の微分曲線における所定値（＝－Δ蛍光強度／Δ温度）を有する２点の温度差は、前記微分曲線の半値幅であることを特徴とする請求項６に記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項8】
前記複数の区画に分割された前記ＤＮＡ溶液について、前記融解温度を算出した後、前記蛍光強度の変化を示す融解曲線の微分曲線における所定値（＝－Δ蛍光強度／Δ温度）を有する２点の温度差を第１の軸に、前記融解温度を第２の軸にして、プロットすることにより、前記複数の区画のそれぞれが前記検出対象のＤＮＡを２種類含む区画なのか、１種類含む区画なのかを判別することを特徴とする請求項６に記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項9】
前記複数の区画のそれぞれが前記検出対象のＤＮＡを２種類含む区画なのか、１種類含む区画なのかを判別する工程の後、遺伝子の種類または変異の種類ごとにカウントされた検体溶液の区画の数または割合を表示する工程をさらに有する、請求項８に記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項10】
複数種類の検出対象のＤＮＡと、前記複数種類の検出対象のＤＮＡにそれぞれ結合する、同一の蛍光色素で標識された蛍光標識プローブとを含み、複数の区画に分割されたＤＮＡ溶液中の前記ＤＮＡを検出するための、デジタルＰＣＲを用いたＤＮＡ検出装置であって、前記ＤＮＡ溶液を加温するための加温部と、
前記複数種類の検出対象のＤＮＡを増幅するための増幅部と、
前記ＤＮＡ溶液から放出される蛍光の蛍光強度を測定するための蛍光測定部と、
前記ＤＮＡ溶液の温度変化に伴う前記蛍光強度の変化からＤＮＡ二重鎖の融解温度を算出し、第１の軸に融解曲線又は融解曲線の微分曲線の形状を示す値をとり、第２の軸に前記融解温度をとって、複数の区画のそれぞれの前記ＤＮＡ溶液についてプロットされて作成されたグラフに基づいて、前記複数の区画のそれぞれが前記検出対象のＤＮＡを２種類含む区画なのか、１種類含む区画なのかを判別する計算部と、
前記計算部による結果を出力する出力部と、を備え、
前記複数種類の検出対象のＤＮＡに対する、前記複数種類の蛍光標識プローブおのおのの融解温度の差が１０℃以下である、ＤＮＡ検出装置。
【請求項11】
前記融解曲線又は融解曲線の微分曲線の形状は、前記融解曲線の所定値の傾きを有する２点の温度差であることを特徴とする請求項１０に記載のＤＮＡ検出装置。
【請求項12】
前記融解曲線又は融解曲線の微分曲線の形状は、前記微分曲線の半値幅であることを特徴とする請求項１０に記載のＤＮＡ検出装置。
【請求項13】
前記計算部は、前記蛍光強度が閾値以上の区画をＤＮＡ有りと判別し、閾値以下の区画をＤＮＡ無しと判別し、ＤＮＡ有りと判別された区画に対して、前記検出対象のＤＮＡを２種類含む区画なのか、１種類含む区画なのかを判別する、請求項１０に記載のＤＮＡ検出装置。
【請求項14】
データを記憶しておく記憶部を有し、前記計算部は、前記記憶部に格納された、前記複数の区画内のＤＮＡの判別を行うためのデータとして、融解温度よりも低温な温度での蛍光強度、融解温度よりも高温な温度での蛍光強度、融解温度よりも高温な温度での蛍光強度に対する融解温度よりも低温な温度での蛍光強度の比、融解温度よりも低温な温度での蛍光強度と融解温度よりも高温な温度での蛍光強度との差、融解温度、融解曲線の形状を表す特徴量のいずれかを用いることを特徴とする請求項１０に記載のＤＮＡ検出装置。
【請求項15】
前記出力部は表示装置であって、前記グラフ及び／又は前記蛍光標識プローブの蛍光強度または融解温度に対する検体溶液の数をプロットしたヒストグラムを表示する、請求項１０に記載のＤＮＡ検出装置。
【請求項16】
前記表示装置に表示された前記グラフ及び／又は前記ヒストグラムを基にして修正され入力された、前記融解曲線の所定値の傾きを有する２点の温度差の範囲設定に基づいて、対象遺伝子の数を計算して前記出力部に出力する、請求項１５に記載のＤＮＡ検出装置。
【請求項17】
複数種類の検出対象のＤＮＡと、前記複数種類の検出対象のＤＮＡにそれぞれ結合する、同一の蛍光色素で標識された蛍光標識プローブとを含み、複数の区画に分割されたＤＮＡ溶液中の前記ＤＮＡを検出するための、デジタルＰＣＲを用いたＤＮＡ検出装置であって、前記ＤＮＡ溶液を加温するための加温部と、
前記複数種類の検出対象のＤＮＡを増幅するための増幅部と、
前記ＤＮＡ溶液から放出される蛍光の蛍光強度を測定するための蛍光測定部と、
前記ＤＮＡ溶液の温度変化に伴う前記蛍光強度の変化からＤＮＡ二重鎖の融解温度を算出し、前記蛍光強度の変化を示す融解曲線の微分曲線における所定値（＝－Δ蛍光強度／Δ温度）を有する２点の温度差を算出する計算部と、
前記計算部による結果を出力する出力部と、を備え、
前記複数種類の検出対象のＤＮＡに対する、前記複数種類の蛍光標識プローブおのおのの融解温度の差が１０℃以下である、ＤＮＡ検出装置。
【請求項18】
前記蛍光強度の変化を示す融解曲線の微分曲線における所定値（＝－Δ蛍光強度／Δ温度）を有する２点の温度差は、前記微分曲線の半値幅である、請求項１７に記載のＤＮＡ検出装置。
【請求項19】
前記計算部は、前記複数の区画に分割された前記ＤＮＡ溶液について、前記融解温度を算出した後、第１の軸に前記蛍光強度の変化を示す融解曲線の微分曲線における所定値（＝－Δ蛍光強度／Δ温度）を有する２点の温度差をとり、第２の軸に前記融解温度をとって、前記複数の区画のそれぞれの前記ＤＮＡ溶液についてプロットされて作成されたグラフに基づいて、前記複数の区画のそれぞれが前記検出対象のＤＮＡを２種類含む区画なのか、１種類含む区画なのかを判別する、請求項１７に記載のＤＮＡ検出装置。
【請求項20】
前記出力部は、前記複数の区画のそれぞれが前記検出対象のＤＮＡを２種類含む区画なのか、１種類含む区画なのかを前記計算部が判別した後、遺伝子の種類または変異の種類ごとにカウントされた検体溶液の区画の数または割合を表示する、請求項１０または１９に記載のＤＮＡ検出装置。
【請求項21】
ＤＮＡ検出装置に、請求項１～９のいずれか１項に記載のＤＮＡ検出方法を行わせるためのプログラム。
【請求項22】
前記ＤＮＡ検出装置は、請求項１０～２０のいずれか１項に記載の検出装置である、請求項２１に記載のプログラム。
【請求項23】
請求項２１または２２に記載のプログラムを格納する記録媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、デジタルＰＣＲの測定方法および測定装置に関する。
【背景技術】
【0002】
デジタルＰＣＲ（特許文献１）は、ＰＣＲ（特許文献２－４）やリアルタイムＰＣＲ（非特許文献１）などの従来の遺伝子検査において、検出対象の遺伝子（本明細書で、対象遺伝子と称する）が微量なときに測定再現性が低下するという課題を解決する方法として開発された。デジタルＰＣＲを用いると、限界希釈したサンプルを用いてＤＮＡを０（無し）か１（有り）で検出することで微量なＤＮＡを定量できる。
【0003】
デジタルＰＣＲの検出方法の一例を以下に示す。まず、限界希釈した検体に、ＰＣＲに必要となるＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、蛍光標識プローブを加え、ＰＣＲ反応液を調製する。ＰＣＲ反応液をウェルまたはドロップレットなど微小な区画に分割する。このとき、１区画に１分子の対象遺伝子が入っているか、入っていないかのいずれかであるようにする。次に、微小区画内の対象遺伝子を、ＰＣＲにより増幅する。ＰＣＲ後に各微小区画の蛍光強度を測定し、閾値を超える蛍光強度をもつ微小区画の数をカウントすることにより、対象遺伝子を定量することができる。
【0004】
このようなデジタルＰＣＲは、限界希釈した検体を用いるため、ＰＣＲの反応を阻害する要因となる検体由来成分の影響を抑えることができる。また、検量線を必要としないため、対象とするＤＮＡの絶対量を直接測定できる。
【0005】
ところで、従来のＰＣＲでは、反応液中の反応阻害物の存在、テンプレートＤＮＡの二次構造の形成、プライマーの設計不十分などの理由により、反応効率が低下することが知られている。
【0006】
一方、デジタルＰＣＲでは、反応のエンドポイントで測定するため、ＰＣＲの反応効率自体は測定結果に大きく影響しないとされてきた。しかし実際には、エンドポイントで測定しても各微小区画のＰＣＲ反応効率の不均一性による蛍光強度ばらつきが大きく、デジタルＰＣＲの測定再現性および測定精度を低下させていた。
【0007】
そこで、本発明者らは、デジタルＰＣＲの測定再現性および測定精度の向上のため、各微小区画のＰＣＲ反応効率が不均一でも、ＰＣＲ増幅産物の融解温度（Ｔｍ）を測定することによって、微小区画内の対象遺伝子の判別ができる技術を開発した（特許文献５）。具体的には、例えば、ＰＣＲ後、微小区画内で増幅した対象遺伝子と蛍光標識プローブの融解温度（Ｔｍ）を測定することで、ＰＣＲの反応効率が不均一でも融解温度の違いによって対象遺伝子の遺伝子型を同定できるようになった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【文献】特表２０１３－５２１７６４号公開公報
【文献】米国特許第４６８３１９５号公報
【文献】米国特許第４６８３２０２号公報
【文献】米国特許第４８００１５９号公報
【文献】特開２０１８－１０８０６３号公開公報
【非特許文献】
【0009】
【文献】Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１０，ｐｐ９８６－９９４，１９９６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
デジタルＰＣＲでは微小区画に入る対象遺伝子の数はポワソン分布に従うため、検体を希釈して、大部分が１区画に１分子の対象遺伝子が入っているか、入っていないかのいずれかであっても、一定の確率で１区画に２分子の対象遺伝子が入る。頻度の低い変異型が同じ区画に２分子入ることはまれだが、変異型と野生型が１分子ずつ入ることは容易に生じ得る。このような２種類の分子が入った微小区画を判別することは、変異型遺伝子の擬陰性、擬陽性を低減し、測定再現性および測定精度を向上させる上で重要である。
【0011】
そこで、本発明の目的は、融解曲線分析を用いたデジタルＰＣＲにおいて、１区画に２種類の異なる検出対象遺伝子が入った微小区画を測定装置により明確に見分け、対象遺伝子のカウント数を補正する新たなデジタルＰＣＲの測定方法および測定装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明者らは、融解曲線分析を用いたデジタルＰＣＲにおいて、プローブとの融解温度が異なる２種類の対象遺伝子があり、それぞれのプローブを同じ蛍光色素で標識した場合、２種類の対象遺伝子が同一の微小区画に１分子ずつ入ると、融解曲線の傾きが全体的になだらかになり、融解曲線の微分曲線の半値幅が大きくなることから、融解曲線の微分曲線から融解温度に加えて半値幅も算出することによって、統計的に２種類の分子が入った微小区画を見分けられることを見出し、本発明の完成に至った。
【0013】
本発明の一実施態様は、蛍光標識プローブまたはＤＮＡインターカレーターと複数種類の検出対象のＤＮＡを含有するＤＮＡ溶液を複数の微小区画に分割する工程と、前記微小区画の中で核酸増幅反応を行う工程と、温度変化に伴って蛍光強度を測定する工程と、前記ＤＮＡ溶液の温度変化に伴う前記蛍光の強度の変化からＤＮＡ二重鎖の融解温度を算出する工程と、前記蛍光の強度の変化を示す融解曲線上で、所定値の傾きを有する２点の温度差を算出する工程と、を含む、ＤＮＡ検出方法である。前記温度差が所定の閾値以上の区画を、前記検出対象のＤＮＡを２種類含む区画であると特定する工程や、前記温度差が所定の閾値未満の区画を、前記検出対象のＤＮＡを１種類含む区画であると特定する工程をさらに含んでもよい。
【0014】
上記いずれかのＤＮＡ検出方法において、前記ＤＮＡ溶液が蛍光標識プローブを含み、前記融解温度が、前記蛍光標識プローブと前記検出対象のＤＮＡとの間で形成される二重鎖の融解温度であってもよい。ここで、前記蛍光標識プローブが、蛍光色素とそのクエンチャーを有してもよい。あるいは、前記ＤＮＡ溶液がＤＮＡインターカレーターを含み、前記融解温度が、前記検出対象のＤＮＡの二重鎖の融解温度であってもよい。
【0015】
上記いずれかのＤＮＡ検出方法において、前記複数の微小区画が平面配置されていてもよい。また、前記ＤＮＡ溶液を、ドロップレットまたはウェルによって前記複数の区画に分割してもよい。
【0016】
本発明の他の実施態様は、複数種類の検出対象のＤＮＡを含むＤＮＡ溶液中の前記ＤＮＡを検出するためのＤＮＡ検出装置であって、前記ＤＮＡ溶液を加温するための加温部と、前記ＤＮＡ溶液から放出される蛍光の強度を測定するための蛍光測定部と、前記ＤＮＡ溶液の温度変化に伴う前記蛍光の強度の変化からＤＮＡ二重鎖の融解温度を算出し、前記蛍光の強度の変化を示す融解曲線において、所定値の傾きを有する２点の温度差を算出する計算部と、を備える、ＤＮＡ検出装置である。このＤＮＡ検出装置は、前記検出対象の
ＤＮＡを増幅するための増幅部をさらに備えてもよい。また、前記検出結果を表示するモニターをさらに備えてもよい。
ＤＮＡを増幅するための増幅部をさらに備えてもよい。また、前記検出結果を表示するモニターをさらに備えてもよい。
【0017】
本発明のさらなる実施態様は、上記いずれかのＤＮＡ検出装置などのＤＮＡ検出装置に、上記いずれかのＤＮＡ検出方法を行わせるためのプログラムである。
【0018】
本発明のさらなる実施態様は、上記プログラムを格納する記録媒体である。
【発明の効果】
【0019】
本発明によって、融解曲線分析を用いたデジタルＰＣＲにおいて、１区画に２種類の異なる対象遺伝子が入った微小区画を測定装置により明確に見分け、対象遺伝子のカウント数を補正する、新たなデジタルＰＣＲの解析方法を提供することができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】本発明の一実施態様における融解曲線分析を用いたデジタルＰＣＲにおいて、ＰＣＲ増幅産物に対し、温度変化に伴う蛍光強度の変化に基づいて計測されるＤＮＡ二重鎖の融解温度に加えて、蛍光の強度の変化を示す融解曲線上で、所定値の傾きを有する２点の温度差を算出して行うＤＮＡ検出方法の基本概念を示す図である。
【図2】本発明の一実施態様における融解曲線分析を用いたデジタルＰＣＲにおいて、ＰＣＲ増幅産物の融解温度と蛍光強度を用いて行うＤＮＡ検出方法の基本概念を示す図である。
【図3】本発明の一実施態様における、ドロップレットまたはウェルが含む蛍光色素の色と蛍光強度を測定するための蛍光測定部の模式図である。
【図4】本発明の一実施態様における、（Ａ）ＰＣＲ増幅産物の蛍光強度および融解温度を用いて行うＤＮＡ検出方法を用いたデジタルＰＣＲ測定結果の一例、（Ｂ）ＰＣＲ増幅産物に対し、蛍光強度の変化の微分関数における、所定値の融解曲線の傾きを有する２点の温度差と融解温度を用いて行うＤＮＡ検出方法を用いたデジタルＰＣＲ測定結果の一例、を示す図である。
【図5】本発明の一実施態様におけるＤＮＡ検出方法において、ＤＮＡインターカレーターを用いてＤＮＡの融解温度を測定する方法を示す模式図である。
【図6】本発明の一実施態様におけるＤＮＡ検出方法において、蛍光標識プローブを用いてＤＮＡの融解温度を測定する方法を示す模式図である。
【図8】モニターに表示される測定結果の一例である。
【図9】モニターに表示される測定結果の一例である。
【図10】本発明の一実施例において、蛍光標識プローブを用いてウェル内対象遺伝子の種類を判別する結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【0022】
（１）ＤＮＡ検出方法の原理及び効果
本発明に係るＤＮＡ検出方法は、蛍光標識プローブまたはＤＮＡインターカレーターと数種類の検出対象のＤＮＡを含有するＤＮＡ溶液を複数の区画に分割する工程と、区画の
中で核酸増幅反応を行う工程と、温度変化に伴って蛍光強度を測定する工程と、ＤＮＡ溶液の温度変化に伴う蛍光の強度の変化からＤＮＡ二重鎖の融解温度を算出する工程と、蛍光の強度の変化を示す融解曲線上で、所定値の融解曲線の傾きを有する２点の温度差を算出する工程と、を含む。なお、融解曲線上のある点における融解曲線の傾きとは、その点における融解曲線に対する接線の傾きを意味する。
本発明に係るＤＮＡ検出方法は、蛍光標識プローブまたはＤＮＡインターカレーターと数種類の検出対象のＤＮＡを含有するＤＮＡ溶液を複数の区画に分割する工程と、区画の
中で核酸増幅反応を行う工程と、温度変化に伴って蛍光強度を測定する工程と、ＤＮＡ溶液の温度変化に伴う蛍光の強度の変化からＤＮＡ二重鎖の融解温度を算出する工程と、蛍光の強度の変化を示す融解曲線上で、所定値の融解曲線の傾きを有する２点の温度差を算出する工程と、を含む。なお、融解曲線上のある点における融解曲線の傾きとは、その点における融解曲線に対する接線の傾きを意味する。
【0023】
ここで、図１に、ＰＣＲ増幅産物に対し、温度変化に伴う蛍光強度の変化に基づいて計測されるＤＮＡ二重鎖の融解温度に加えて、蛍光の強度の変化を示す融解曲線上での、所定値の傾きを有する２点の温度差を算出して行うことによって、ＤＮＡを検出する方法の代表的な実施態様において想定される測定結果の例を示した。また、図２に、ＰＣＲ増幅産物の融解温度と蛍光強度を用いて行う場合の融解曲線分析を用いたデジタルＰＣＲの測定結果の例を示した。
【0024】
融解曲線分析を用いたデジタルＰＣＲでは、蛍光標識プローブとＤＮＡとの融解温度が遺伝子型によって異なることを利用し、遺伝子型の判別を行う。図２の例は、対象遺伝子の野生型と変異型のそれぞれに対応した蛍光標識プローブを用いて、各微小区画内のＤＮＡの融解温度を測定した結果を模式的に示した図である。ここで、蛍光標識プローブは、例えばモレキュラービーコンを用いることができ、以下モレキュラービーコンを例として、ＤＮＡ検出方法を詳細に説明する。モレキュラービーコンは、検出対象遺伝子を増幅させるＰＣＲに用いられるプライマーペアの間にある配列に相補的であって、両端に相補的な配列を有し、末端にはそれぞれ蛍光色素と消光色素（クエンチャー）が設けられているオリゴヌクレオチドである。モレキュラービーコンは、検出対象遺伝子とハイブリダイズすると、両末端にある蛍光色素と消光色素が離れて蛍光を発するが、温度上昇に伴って検出対象遺伝子から解離すると、両端の相補的な配列がハイブリダイズしてステムループ構造を形成し、蛍光色素と消光色素が近づいて蛍光色素が消光する。検出対象遺伝子の野生型アレルを含む微小区画２０１では、検出対象遺伝子の野生型アレルに対応した蛍光標識プローブがＰＣＲにより増幅したＤＮＡにハイブリダイズして蛍光を発し、野生型アレルの蛍光標識プローブに対応した融解温度が観察される。また、検出対象遺伝子の変異型アレルを含む微小区画２０２では、検出対象遺伝子の変異型アレルに対応した蛍光標識プローブがＰＣＲにより増幅したＤＮＡにハイブリダイズして蛍光を発し、変異型アレルの蛍光標識プローブに対応した融解温度が観察される。こうして、蛍光強度、蛍光の種類および融解温度で、野生型アレルを有する検出対象遺伝子の有無及び変異型アレルを有する検出対象遺伝子の有無を判断できる。微小区画内のＰＣＲの反応効率は微小区画ごとに均一でないこと、蛍光測定時の平面内測定ばらつきが大きいことなどにより、検出対象遺伝子の野生型アレルを含む微小区画２０１と変異型アレルを含む微小区画２０２を蛍光強度によって判別するのが難しい場合がある。そのような場合おいても、ＤＮＡの融解温度はＰＣＲの反応効率や蛍光測定時の平面内測定ばらつきに左右されないため、各蛍光標識プローブの検出対象遺伝子に対する融解温度（Ｔｍ）が異なるように蛍光標識プローブの配列を決めておき、微小区画内のＤＮＡに対し、温度変化に伴う蛍光強度変化を測定し、融解曲線分析を行い、融解温度を比較することにより、より高精度な遺伝子検出が可能になる。
【0025】
このように、デジタルＰＣＲでは、実験者が蛍光強度や融解温度の閾値を設定し、対象遺伝子を含まない空の微小区画をデータから排除したり、変異の種類ごとに微小区画の数をカウントしたりすることができる。しかしながら、デジタルＰＣＲでは微小区画に入る対象遺伝子の数はポワソン分布に従うため、検体を希釈して、大部分が１区画に１分子の対象遺伝子が入っているか、入っていないかのいずれかであっても、一定の確率で１区画に２分子の対象遺伝子が入ることが生じる。検出対象遺伝子の野生型アレルと変異型アレルを１分子ずつ含む微小区画２０３は、検出対象遺伝子の野生型アレルおよび変異型アレルのそれぞれに対応した蛍光標識プローブがＰＣＲにより増幅したＤＮＡにハイブリダイ
ズして蛍光を発し、野生型アレルおよび変異型アレルに対応した融解温度の中間温度が観察される。しかし、各蛍光標識プローブの検出対象遺伝子に対する融解温度が十分離れていない場合、例えば、その差が１０℃以下、好ましくは５℃以下、より好ましくは３℃以下、さらに好ましくは１℃以下であって、０℃より大きい場合、検出対象遺伝子の野生型アレルおよび変異型アレルの２つの融解曲線が合わさって１つの傾きの小さい融解曲線として観察されるため、融解温度を算出するための微分曲線が広がりの大きい形状となり、融解温度が定まりにくくばらつきが大きくなる。その結果、図２に示すように、検出対象遺伝子の野生型アレルが含まれる微小区画２０１、変異型アレルが含まれる微小区画２０２のグラフ上での分布と、検出対象遺伝子の野生型アレルおよび変異型アレルが１分子ずつ含まれる微小区画２０３のグラフ上での分布が重なってしまい、その部分で、遺伝子の有無が判定できなくなって、測定精度が低下する要因となる。
ズして蛍光を発し、野生型アレルおよび変異型アレルに対応した融解温度の中間温度が観察される。しかし、各蛍光標識プローブの検出対象遺伝子に対する融解温度が十分離れていない場合、例えば、その差が１０℃以下、好ましくは５℃以下、より好ましくは３℃以下、さらに好ましくは１℃以下であって、０℃より大きい場合、検出対象遺伝子の野生型アレルおよび変異型アレルの２つの融解曲線が合わさって１つの傾きの小さい融解曲線として観察されるため、融解温度を算出するための微分曲線が広がりの大きい形状となり、融解温度が定まりにくくばらつきが大きくなる。その結果、図２に示すように、検出対象遺伝子の野生型アレルが含まれる微小区画２０１、変異型アレルが含まれる微小区画２０２のグラフ上での分布と、検出対象遺伝子の野生型アレルおよび変異型アレルが１分子ずつ含まれる微小区画２０３のグラフ上での分布が重なってしまい、その部分で、遺伝子の有無が判定できなくなって、測定精度が低下する要因となる。
【0026】
そこで、２種類の検出対象遺伝子が同一の微小区画に１分子ずつ入ると、融解曲線の傾きが小さくなり、融解曲線の所定値の傾きを有する２点の温度差が大きくなることを利用して、融解温度に加えて、融解曲線の微分曲線において、融解曲線の所定値の傾きを有する２点の温度差を算出する。そして、図１に示すように、横軸を融解曲線の所定値の傾きを有する２点の温度差、縦軸を蛍光標識プローブとＤＮＡの融解温度として計測結果をプロットすると、検出対象遺伝子の野生型アレルが含まれる微小区画２０１、変異型アレルが含まれる微小区画２０２、検出対象遺伝子の野生型アレルおよび変異型アレルが１分子ずつ含まれる微小区画２０３の分布をグラフ上で分離することができる。このとき、横軸に用いる値は、融解曲線や融解曲線の微分曲線の形状を示すものであればよいが、融解曲線の所定値の傾きを有する２点の温度差であることが好ましく、微分曲線の半値幅であることがさらに好ましい。融解曲線の形状を微小区画内で増幅した検出対象遺伝子の判別に用いることで、２種類の検出対象遺伝子が同じ微小区画に入った場合も確実に識別することができ、測定再現性および測定精度を向上させることができる。
【0027】
（２）ＤＮＡ検出装置の主要な構成
本発明のＤＮＡ検出装置は、ＤＮＡ溶液中の検出対象のＤＮＡを検出するためのＤＮＡ検出装置であって、ＤＮＡ溶液を加温するための加温部と、ＤＮＡ溶液から放出される蛍光の強度を測定するための蛍光測定部と、ＤＮＡ溶液の温度変化に伴う前記蛍光の強度の変化である融解曲線からＤＮＡ二重鎖の融解温度を算出し、融解曲線または融解曲線の微分曲線の形状を算出する計算部と、を備える。
本発明のＤＮＡ検出装置は、ＤＮＡ溶液中の検出対象のＤＮＡを検出するためのＤＮＡ検出装置であって、ＤＮＡ溶液を加温するための加温部と、ＤＮＡ溶液から放出される蛍光の強度を測定するための蛍光測定部と、ＤＮＡ溶液の温度変化に伴う前記蛍光の強度の変化である融解曲線からＤＮＡ二重鎖の融解温度を算出し、融解曲線または融解曲線の微分曲線の形状を算出する計算部と、を備える。
【0028】
ＤＮＡ溶液は、どのような担体にあってもよく、例えば、オイル中のドロップレットであってもよく、プレートなどのウェル内の溶液であってもよい。図３に、ＤＮＡ検出装置の一例として、ドロップレットまたはウェル中のＤＮＡ溶液が含む蛍光色素の色と蛍光強度を測定するための蛍光測定部を有するＤＮＡ検出装置を示すが、本発明のＤＮＡ検出装置はこれに限定されない。
【0029】
図３Ａに示す蛍光測定部の例では、マイクロ流路を用いてドロップレットの蛍光強度を測定する。ドロップレット３０１がマイクロ流路３０３中を矢印の方向に流れている。ドロップレット３０２の位置までドロップレットが流れると、加温部（図示せず）によってドロップレットが加温されつつ、光源３０４により励起光がドロップレットに照射される。光源３０４によりドロップレットに含まれる蛍光物質が励起され、発する蛍光を蛍光フィルター３０５を通してフォトマルチプルメーター３０６で検出する。検出された蛍光データは、計算部（図示せず）に送られ、そこで蛍光標識プローブとＤＮＡとの融解温度またはＤＮＡの二重鎖の融解温度が算出される。光源３０４、蛍光フィルター３０５、フォトマルチプルメーター３０６で構成される蛍光測定部は、蛍光色素の色ごとに別々に設けてもよいし、図３Ａに示すように１つの光源の励起光で励起して２つの蛍光フィルターでそれぞれの蛍光を同時に検出する構成にしてもよい。
【0030】
また、図３ＢおよびＣのようにドロップレットを平面配置し、ドロップレットの蛍光色素の色と蛍光強度を測定してもよい。具体的には、例えば、ドロップレット３１１をドロップレット検出用カートリッジ３１０に平面配置し、加温部である温調ステージ３１２の上にセットする。温調装置３１２でドロップレット検出用カートリッジの温度を変化させ、温度変化に伴うドロップレットの蛍光強度を以下の手順で測定する。まず、光源３０４からレンズ３０８、フィルター３０５およびダイクロイックミラー３０９を通して、励起光をドロップレット検出用カートリッジ３１０に平面配置したドロップレット３１１に照射する。励起光によりドロップレットに含まれる蛍光物質が励起され、発する蛍光をダイクロイックミラー３０９、フィルター３０５、レンズ３０８を通してＣＣＤカメラ３０７で検出する。検出された蛍光データは、計算部（図示せず）に送られ、そこで増幅産物の融解温度が算出される。図３Ａでは、ドロップレットを一つずつ処理する必要があるが、多数のドロップレットを一度に処理できるという点で、図３ＢおよびＣの装置が好ましい。また、図３ＢおよびＣの装置では、温調装置３１２をＤＮＡの増幅反応にも用いることができる点でも、図３Ａより好適である。
【0031】
さらに、図３Ｄのようにドロップレットの代わりにアレイ状に並んだウェルを用いて、１ウェルに１つか０の対象遺伝子が入るように検体を添加し、ウェル内でＰＣＲを行ってウェルの蛍光色素の色と蛍光強度を測定してもよい。具体的には、例えば、ウェル方式検出用カートリッジ３１３に設けられたウェルに検体を含む反応液を添加後、ウェル内でＰＣＲを行い、加温部である温調ステージ３１２の上にセットする。温調装置３１２でウェル方式検出用カートリッジの温度を変化させ、温度変化に伴うウェルの蛍光強度を以下の手順で測定する。まず、光源３０４からレンズ３０８、フィルター３０５およびダイクロイックミラー３０９を通して、励起光をウェル方式検出用カートリッジ３１３に平面配置したウェルに照射する。励起光によりウェル内の反応液に含まれる蛍光物質が励起され、発する蛍光をダイクロイックミラー３０９、フィルター３０５、レンズ３０８を通してＣＣＤカメラ３０７で検出する。検出された蛍光データは、計算部（図示せず）に送られ、そこで増幅産物の融解温度が算出される。図３Ｄのようにウェルを用いた場合、ドロップレットをドロップレット検出用カートリッジに平面配置する工程なしに、ウェル方式検出用カートリッジ内でＰＣＲから融解曲線分析まで行える。
【0032】
本発明の一実施態様にかかるＤＮＡ検出装置は、検出対象のＤＮＡを含有するＤＮＡ溶液をカートリッジ内にアレイ上に並んだウェルまたはオイル中に分散するドロップレットなどの微小区画に分割するサンプル分割部、及び／又は微小区画に対してＤＮＡを増幅するための増幅部を含んでもよい。
【0033】
（３）融解曲線分析方法
図４Ａは、図２で述べたのと同様に、ＰＣＲ増幅産物の融解温度（Ｔｍ）を用いて行うＤＮＡ検出方法を用いた場合で、計測した融解温度が重なり、各微小区画の検体溶液内の対象遺伝子の種類を判定できない場合がある測定結果の一例を示す模式図である。一方、図４Ｂは図１で述べたのと同様に、ＰＣＲ増幅産物に対し、蛍光の強度の変化を示す融解曲線における所定値の傾きを有する２点の温度差と融解温度とを用いて行うＤＮＡ検出方法を用いたデジタルＰＣＲ測定結果の一例で、各微小区画の検体溶液内の対象遺伝子の種類をより精度高く判定できた測定結果の一例を示す模式図である。図５および図６は、図４で検出対象遺伝子の種類を判定できなかった検体溶液に対し、溶液内で増幅したＤＮＡの融解曲線分析を行った結果の一例を示す模式図である。
図４Ａは、図２で述べたのと同様に、ＰＣＲ増幅産物の融解温度（Ｔｍ）を用いて行うＤＮＡ検出方法を用いた場合で、計測した融解温度が重なり、各微小区画の検体溶液内の対象遺伝子の種類を判定できない場合がある測定結果の一例を示す模式図である。一方、図４Ｂは図１で述べたのと同様に、ＰＣＲ増幅産物に対し、蛍光の強度の変化を示す融解曲線における所定値の傾きを有する２点の温度差と融解温度とを用いて行うＤＮＡ検出方法を用いたデジタルＰＣＲ測定結果の一例で、各微小区画の検体溶液内の対象遺伝子の種類をより精度高く判定できた測定結果の一例を示す模式図である。図５および図６は、図４で検出対象遺伝子の種類を判定できなかった検体溶液に対し、溶液内で増幅したＤＮＡの融解曲線分析を行った結果の一例を示す模式図である。
【0034】
図４Ａに示すように、融解温度と低温時の蛍光強度により検体溶液内の検出対象遺伝子の遺伝子型判別を行うと、測定結果が検体溶液ａ４０４または検体溶液ｂ４０５の位置にプロットされれば、融解温度の値から溶液ａ４０４が検出対象遺伝子の野生型遺伝子を含
み、検体溶液ｂ４０５が検出対象遺伝子の変異型遺伝子を含むと分かる。しかし、検体溶液ｃ４０６や検体溶液ｄ４０７の位置に蛍光強度が観察されると、それらの検体溶液が検出対象遺伝子の変異型を含むかどうかは測定結果から判断することができない。
み、検体溶液ｂ４０５が検出対象遺伝子の変異型遺伝子を含むと分かる。しかし、検体溶液ｃ４０６や検体溶液ｄ４０７の位置に蛍光強度が観察されると、それらの検体溶液が検出対象遺伝子の変異型を含むかどうかは測定結果から判断することができない。
【0035】
そこで、ＤＮＡインターカレーターを用いて検体溶液内で増幅したＤＮＡの融解温度を測定する際に、蛍光の強度の変化を示す融解曲線における所定値の傾きを有する２点の温度差も算出することによって、図４Ａで判別できなかった対象遺伝子の有無を判別することができるようになる。具体的な方法は、まず、ＤＮＡインターカレーター５０２をＰＣＲ反応液に添加して検体溶液を作製し、ＰＣＲなどの核酸増幅反応を行うと、室温程度の温度では検体溶液内で増幅した２本鎖ＤＮＡ５０１にＤＮＡインターカレーター５０２が結合し、強い蛍光を発する。その後、検体溶液の温度が上昇するにつれ、検体溶液内の２本鎖ＤＮＡ５０１が解離して１本鎖ＤＮＡ５０１となり、ＤＮＡインターカレーター５０２が結合しなくなるため、蛍光強度が減少する。このときの温度変化に対する蛍光強度変化をグラフにプロットした時の結果の一例を図５に示す。なお、温度変化に対する蛍光強度変化の測定は、核酸増幅反応とは独立に（例えば、核酸増幅反応完了後に）、検体溶液を昇温させることによって行ってもよい。
【0036】
図５では、検体溶液ａ４０４の測定結果が図５Ａ、検体溶液ｂ４０５の測定結果が図５Ｃ、検体溶液ｃ４０６の測定結果が図５Ｂ、検体溶液ｄ４０７の測定結果が図５Ｄに示されている。さらに、図５Ａ～Ｄの蛍光強度変化を温度変化で微分するとそれぞれ図５Ｅ～Ｈのようになり、蛍光強度変化の変極点となる温度が求められ、これがＤＮＡ二重鎖の融解温度として算出できる。図４Ａでは、検体溶液ｃ４０６と検体溶液ｄ４０７は検体溶液が対象遺伝子を含むのかどうか測定結果から判断することができないが、融解曲線の傾きが図５Ｂは大きく、図５Ｄは小さいために、融解曲線の微分曲線における、所定値の融解曲線の傾き（＝－Δ蛍光強度／Δ温度）を有する２点の温度差が図５Ｆは小さく、図５Ｈは大きくなり、図４Ｂのように所定値の融解曲線の傾きを有する２点の温度差を横軸に、融解温度を縦軸にプロットすると検体溶液ｃ４０６は対象遺伝子の野生型を含み、検体溶液ｄ４０７は野生型と変異型の両方を含む溶液だと判断できる。
【0037】
なお、対象遺伝子の融解温度は、プライマーの設計を変えることでＰＣＲ増幅産物の配列や配列の鎖長に依存して制御することができる。
【0038】
ここで用いるＤＮＡインターカレーターは、２本鎖ＤＮＡと結合することによって蛍光強度が増加し、２本鎖ＤＮＡの検出に用いることのできるインターカレーターであれば適用できる。具体的には、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ ＩやＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＳＹＴＯ（登録商標） Ｂｌｕｅ、ＳＹＴＯ Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯ Ｏｒａｎｇｅ、ＳＹＴＯ Ｒｅｄ、ＰＯＰＯ（登録商標）－１、ＢＯＢＯ（登録商標）－１、ＹＯＹＯ（登録商標）－１、ＴＯＴＯ（登録商標）－１、ＪＯＪＯ（登録商標）－１、ＰＯＰＯ－３、ＬＯＬＯ（登録商標）－１、ＢＯＢＯ－３、ＹＯＹＯ－３、ＴＯＴＯ－３、ＰＯ－Ｐｒｏ（登録商標）－１、ＹＯ－Ｐｒｏ（登録商標）－１、ＴＯ－Ｐｒｏ（登録商標）－１、ＪＯ－Ｐｒｏ（登録商標）－１、ＰＯ－Ｐｒｏ－３、ＹＯ－Ｐｒｏ－３、ＴＯ－Ｐｒｏ－３、ＴＯ－Ｐｒｏ－５、エチジウムブロマイドなどが適用可能である。ＤＮＡインターカレーターが熱耐性である場合、ＰＣＲ反応を行う前からウェルまたはドロップレットに添加しておくことができる。
【0039】
図６に示すように、本方法で、ＤＮＡインターカレーターの代わりとして、蛍光標識プローブを用いることもできる。蛍光標識プローブは、両端またはその近傍に蛍光色素とそのクエンチャーを有し、両端周辺の配列が相補的になっており、モレキュラービーコンのようなステムループ構造を形成する一方、ループ部分の配列が検出対象遺伝子と相補的になっており、検出対象遺伝子にハイブリダイズできるような構造を有するように設計する
。蛍光標識プローブ６０２は、単独で遊離して存在するとき、ステムループを形成し、蛍光色素６０３とクエンチャー６０４が近接しているため、蛍光は発しない。蛍光標識プローブ６０２をＰＣＲ反応が終了した検体溶液に添加すると、室温程度の温度では検体溶液に内で増幅したＤＮＡ６０１に蛍光標識プローブ６０２のループ部分がアニールし、蛍光色素６０３とクエンチャー６０４が離れるため、蛍光標識プローブ６０２は強い蛍光を発する。その後、検体溶液を加熱すると、ＤＮＡ６０１と蛍光標識プローブ６０２が解離し、蛍光標識プローブ６０２内でステムループが形成するため蛍光標識プローブ６０２からの蛍光強度が低下する。さらに検体溶液を加熱すると、蛍光標識プローブ６０２のステムループも解離するため、蛍光強度が再度増加する。このときの温度変化に対する蛍光強度変化をグラフにプロットした時の結果の一例を図６に示す。なお、この蛍光標識プローブは、ＰＣＲのための蛍光標識プローブと共用してもよいが、ＰＣＲのための蛍光標識プローブとは別のプローブを作製して用いてもよい。また、温度変化に対する蛍光強度変化の測定は、核酸増幅反応の中で行ってもよく、核酸増幅反応とは独立に（例えば、核酸増幅反応完了後に）、検体溶液を昇温させることによって行ってもよい。
。蛍光標識プローブ６０２は、単独で遊離して存在するとき、ステムループを形成し、蛍光色素６０３とクエンチャー６０４が近接しているため、蛍光は発しない。蛍光標識プローブ６０２をＰＣＲ反応が終了した検体溶液に添加すると、室温程度の温度では検体溶液に内で増幅したＤＮＡ６０１に蛍光標識プローブ６０２のループ部分がアニールし、蛍光色素６０３とクエンチャー６０４が離れるため、蛍光標識プローブ６０２は強い蛍光を発する。その後、検体溶液を加熱すると、ＤＮＡ６０１と蛍光標識プローブ６０２が解離し、蛍光標識プローブ６０２内でステムループが形成するため蛍光標識プローブ６０２からの蛍光強度が低下する。さらに検体溶液を加熱すると、蛍光標識プローブ６０２のステムループも解離するため、蛍光強度が再度増加する。このときの温度変化に対する蛍光強度変化をグラフにプロットした時の結果の一例を図６に示す。なお、この蛍光標識プローブは、ＰＣＲのための蛍光標識プローブと共用してもよいが、ＰＣＲのための蛍光標識プローブとは別のプローブを作製して用いてもよい。また、温度変化に対する蛍光強度変化の測定は、核酸増幅反応の中で行ってもよく、核酸増幅反応とは独立に（例えば、核酸増幅反応完了後に）、検体溶液を昇温させることによって行ってもよい。
【0040】
図６では、検体溶液ａ４０４の測定結果が図６Ａ、検体溶液ｂ４０５の測定結果が図６Ｃ、検体溶液ｃ４０６の測定結果が図６Ｂ、検体溶液ｄ４０７の測定結果が図６Ｄのようになる。さらに、図６Ａ～Ｄの蛍光強度変化を温度変化で微分するとそれぞれ図６Ｅ～Ｈのようになり、蛍光強度変化の変極点となる温度が求められ、これが検出対象遺伝子を検出するための蛍光標識プローブとＤＮＡの融解温度となる。図４Ａでは、検体溶液ｃ４０６と検体溶液ｄ４０７は検体溶液が検出対象遺伝子を含むのかどうか測定結果から判断することができなかったが、融解曲線の傾きが図６Ｂは大きく、図６Ｄは小さいために、所定値の融解曲線の傾きを有する２点の温度差が図６Ｆは小さく、図６Ｈは大きくなり、図４Ｂのように所定値の融解曲線の傾きを有する２点の温度差を横軸に、融解温度を縦軸にプロットすると検体溶液ｃ４０６は対象遺伝子の野生型を含み、検体溶液ｄ４０７は野生型と変異型の両方を含む溶液だと判断できる。
なお、検出対象遺伝子を検出するための蛍光標識プローブの融解温度は、プローブの配列や鎖長を変えることで制御することができる。また、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ（ＰＮＡ）やＬｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）のような人工ＤＮＡを利用することで、融解温度を制御することができる。蛍光標識プローブの設計によっては検出対象遺伝子の野生型と変異型の融解温度が大きく異なるために、図６Ｄのようになだらかな融解曲線にならず、２段階で蛍光強度が減少し、微分曲線を求めると図６Ｅのピークと図６Ｇのピークの両方が観察されることもある。その場合は、野生型と変異型の融解温度の両方が得られるため、融解温度によって各微小区画の検体溶液内のＤＮＡの種類を判別できる。
なお、検出対象遺伝子を検出するための蛍光標識プローブの融解温度は、プローブの配列や鎖長を変えることで制御することができる。また、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ（ＰＮＡ）やＬｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）のような人工ＤＮＡを利用することで、融解温度を制御することができる。蛍光標識プローブの設計によっては検出対象遺伝子の野生型と変異型の融解温度が大きく異なるために、図６Ｄのようになだらかな融解曲線にならず、２段階で蛍光強度が減少し、微分曲線を求めると図６Ｅのピークと図６Ｇのピークの両方が観察されることもある。その場合は、野生型と変異型の融解温度の両方が得られるため、融解温度によって各微小区画の検体溶液内のＤＮＡの種類を判別できる。
【0041】
ここで用いる蛍光標識プローブ６０２の蛍光色素６０３とクエンチャー６０４の組み合わせは、一般的にリアルタイムＰＣＲに用いられている組み合わせであれば特に限定されず、蛍光色素６０３がＦＡＭ、ＶＩＣ、ＲＯＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５など、クエンチャー６０４がＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３などが例示できる。
【0042】
蛍光標識プローブ６０２が認識する配列は、検出対象遺伝子と同じ遺伝子上にあっても、異なる遺伝子上にあってもよく、検出対象の遺伝子と１塩基だけ異なる配列を有する遺伝子、例えば同じ遺伝子の野生型と変異型であってもよい。一例として、肺がんの遺伝子検査を行う場合であれば、分子標的薬の効果を予測するため、ＡＬＫ融合遺伝子とＥＧＦＲ遺伝子変異の有無を判定する。その時、ＡＬＫ融合遺伝子とＥＧＦＲ遺伝子の各々を認識する配列であってもよいし、ＥＧＦＲのＬ８５８Ｒ変異型とその野生型を認識する配列であってもよい。
【0043】
（４）融解温度測定方法
図３Ｂの装置と図３Ｄのウェルを備えたカートリッジ、及びＤＮＡインターカレーターまたはモレキュラービーコンを用いて融解温度測定を行う方法の一例を、図７のフローチャートを参考にしながら説明する。まず、ＤＮＡを含む生体試料由来の検体溶液を、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ＤＮＡインターカレーターまたはモレキュラービーコン、デオキシリボヌクレオチド類、緩衝液を含むＰＣＲ反応液に添加する（Ｓ７０１）。このＰＣＲ反応液をカートリッジ３１３内にアレイ上に並んだウェルに分割する（Ｓ７０２）。カートリッジ３１３をサーマルサイクラーにセットし、サーマルサイクラーの温度制御によりＰＣＲを行う（Ｓ７０３）。変性工程、伸長工程、アニーリング工程のサイクルを繰り返すことで、ＤＮＡが増幅するとともに、ＤＮＡインターカレーターの場合は増幅したＤＮＡにインターカレートし、モレキュラービーコンの場合は増幅したＤＮＡにハイブリダイズすることによって、蛍光強度が高くなる。各工程の温度や時間、サイクル数などの反応条件は、当業者が容易に設定することができる。ＰＣＲ後、温度を室温へと下げると合成したＤＮＡは２本鎖を形成する。
図３Ｂの装置と図３Ｄのウェルを備えたカートリッジ、及びＤＮＡインターカレーターまたはモレキュラービーコンを用いて融解温度測定を行う方法の一例を、図７のフローチャートを参考にしながら説明する。まず、ＤＮＡを含む生体試料由来の検体溶液を、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ＤＮＡインターカレーターまたはモレキュラービーコン、デオキシリボヌクレオチド類、緩衝液を含むＰＣＲ反応液に添加する（Ｓ７０１）。このＰＣＲ反応液をカートリッジ３１３内にアレイ上に並んだウェルに分割する（Ｓ７０２）。カートリッジ３１３をサーマルサイクラーにセットし、サーマルサイクラーの温度制御によりＰＣＲを行う（Ｓ７０３）。変性工程、伸長工程、アニーリング工程のサイクルを繰り返すことで、ＤＮＡが増幅するとともに、ＤＮＡインターカレーターの場合は増幅したＤＮＡにインターカレートし、モレキュラービーコンの場合は増幅したＤＮＡにハイブリダイズすることによって、蛍光強度が高くなる。各工程の温度や時間、サイクル数などの反応条件は、当業者が容易に設定することができる。ＰＣＲ後、温度を室温へと下げると合成したＤＮＡは２本鎖を形成する。
【0044】
ＰＣＲ後、カートリッジ３１３をＤＮＡ検出装置の温調装置３１２上に置き、温調装置３１２によりカートリッジ３１３を温度変化させながら、蛍光測定部（図３Ａ）が、各ウェルのＤＮＡインターカレーターまたはモレキュラービーコンからの蛍光強度を測定し、得られた蛍光データを、計算部（図示せず）に送る。
【0045】
計算部は、その蛍光データをもとに融解曲線を作成し（Ｓ７０４）、その融解曲線を用いて融解温度を算出する（Ｓ７０５）。さらに、融解曲線の微分曲線を作成し、所定値の融解曲線の傾きを有する２点の温度差を算出する（Ｓ７０６）。蛍光強度が閾値以上のウェルをポジティブ（ＤＮＡ有）、蛍光強度が閾値以下のウェルをネガティブ（ＤＮＡ無）として、ウェル内のＤＮＡの有無を判別する（Ｓ７０７）。ポジティブと判別されたウェルに対して、融解温度と、所定値の融解曲線の傾きを有する２点の温度差とからウェル内のＤＮＡの種類を判別する（Ｓ７０８）。最後に、カートリッジ内の対象遺伝子の数を計測し、モニターに表示する。
【0046】
温度変化に伴うウェルの蛍光強度変化を観察する際は、カートリッジ３１３を置く温調装置３１２の下に傾斜調整部（図示せず）を設けてもよい。傾斜調整部は、温調装置３１２による温度によってカートリッジ３１３内に発生した気泡を除去する。これは、その後、温調装置３１２により試料の温度を下降させながら各ウェルの蛍光強度を計測する際、気泡によって蛍光画像が取得できなくなるのを防ぐ。
【0047】
各ウェルのＤＮＡがポジティブかネガティブかの判定においては、蛍光強度の情報が利用されるが、この際、例えば、融解温度よりも低温な温度での蛍光強度と、融解温度よりも高温な温度での蛍光強度との比あるいは差を用いることで、蛍光強度を標準化することができる。例えば、５０℃での蛍光強度から８５℃での蛍光強度を減算することにより、蛍光標識プローブ自体の蛍光の影響、すなわち、バックグラウンドの影響を除去することができる。
【0048】
なお、所定の蛍光強度の閾値、融解温度の所定の範囲、および所定値の融解曲線の傾きを有する２点の温度差の閾値は、あらかじめパイロット実験などを行い、その結果から統計的に作業者が決めてもよく、自動的に決まるようにしてもよい。また、デジタルＰＣＲ測定のたび、カートリッジ内の各ウェルの測定データを用いて統計的に蛍光強度の閾値および融解温度の所定の範囲を決めてもよい。
【0049】
ウェル内のＤＮＡの判別を統計的に行うためのデータには、次のような項目が含まれてもよい：融解温度よりも低温な温度での蛍光強度、融解温度よりも高温な温度での蛍光強度、融解温度よりも高温な温度での蛍光強度に対する融解温度よりも低温な温度での蛍光
強度の比、融解温度よりも低温な温度での蛍光強度と融解温度よりも高温な温度での蛍光強度との差、融解温度、融解曲線の形状を表す特徴量など。
強度の比、融解温度よりも低温な温度での蛍光強度と融解温度よりも高温な温度での蛍光強度との差、融解温度、融解曲線の形状を表す特徴量など。
【0050】
用いる検体溶液は特に限定されないが、検出対象のＤＮＡを含む試料であればよく、動植物の体液や組織、細胞、排泄物などの生体試料や、土壌サンプルなど真菌や細菌などが含まれる試料が例示できる。体液としては血液、唾液、髄液などが例示でき、血液中には存在するセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）や血中循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）が含まれる。組織としては、外科手術や生検法によって得られた疾患の患部（例えば、乳房や肝臓などのがん組織）が例示できる。すでに固定された組織でもよく、例えばホルマリン固定パラフィン包埋組織切片（ＦＦＰＥ）でもよい。細胞としては、生検法によって採取した患部またはその付近の細胞や、血液中を循環する血中循環腫瘍細胞などが例示できる。これらの検体の前処理は特に限定されず、生体や環境などから採取後、懸濁液に添加してホモジネートしたり、あるいは溶解液で溶解させたりしたものをそのまま用いてもよいが、それらに含まれる核酸を抽出したり、精製したものを用いることが好ましい。
【0051】
ウェルに分割したＰＣＲ反応液がＰＣＲおよび融解曲線分析の計測中に蒸発しないように、ＰＣＲ反応液の上面にオイルを添加することが望ましい。オイルはＰＣＲ反応液に不溶性もしくは難溶性である化学的に不活性な物質であり、また、ＰＣＲのような高温での温度変化に対して安定である物質が好ましく、フッ素系オイル、シリコーン系オイル、炭化水素系オイルなどが使用可能である。フッ素系オイルとしては、例えばＰｅｒｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎやＨｙｄｒｏｆｌｕｏｒｏｅｔｈｅｒなどが挙げられる。フッ素系オイルは、炭素鎖が長いほうが揮発性が低いので好ましい。シリコーン系オイルとしては、例えばＰｏｌｙｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅやＴｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘｙｓｉｌｉｃａｔｅなどが挙げられる。炭化水素系オイルとしては、例えばミネラルオイルや流動パラフィン、ヘキサデカンなどが挙げられる。このオイルは、界面活性剤を添加して用いてもよい。ここで界面活性剤の種類は特に限定されないが、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｓｐａｎ８０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００などが適用可能である。
【0052】
（５）結果の表示
図８および図９は、モニターに表示される測定結果のイメージの一例である。図８に示すように、がん関連遺伝子の種類や変異の種類ごとにカウントされた検体溶液の数が表示されてもよいし、図９に示すように、がん関連遺伝子の種類や変異の種類ごとにカウントされた検体溶液の割合が表示されてもよい。モニターに表示される結果は、図８や図９のような検体溶液の数や割合だけでなく、図１のような所定値の融解曲線の傾きを有する２点の温度差、融解温度の２軸で検体溶液の計測値をプロットしたグラフを含んでいてもよい。また、蛍光標識プローブの蛍光強度または融解温度に対する検体溶液の数をプロットしたヒストグラムを含んでいてもよい。ユーザーがそのグラフやヒストグラムを見て、蛍光標識プローブの蛍光強度や融解温度の範囲および／または所定値の融解曲線の傾きを有する２点の温度差の範囲の設定を変えて、蛍光強度の範囲内及び融解温度の範囲内にある検体溶液の数を再度カウントすることもできる。
図８および図９は、モニターに表示される測定結果のイメージの一例である。図８に示すように、がん関連遺伝子の種類や変異の種類ごとにカウントされた検体溶液の数が表示されてもよいし、図９に示すように、がん関連遺伝子の種類や変異の種類ごとにカウントされた検体溶液の割合が表示されてもよい。モニターに表示される結果は、図８や図９のような検体溶液の数や割合だけでなく、図１のような所定値の融解曲線の傾きを有する２点の温度差、融解温度の２軸で検体溶液の計測値をプロットしたグラフを含んでいてもよい。また、蛍光標識プローブの蛍光強度または融解温度に対する検体溶液の数をプロットしたヒストグラムを含んでいてもよい。ユーザーがそのグラフやヒストグラムを見て、蛍光標識プローブの蛍光強度や融解温度の範囲および／または所定値の融解曲線の傾きを有する２点の温度差の範囲の設定を変えて、蛍光強度の範囲内及び融解温度の範囲内にある検体溶液の数を再度カウントすることもできる。
【0053】
なお、上述したように、検体溶液はウェルやドロップレット中の溶液として扱われるので、検体溶液数の代わりに、ウェル数やドロップレット数として表されてもよい。
【0054】
（６）プログラム
本発明の一実施態様は、ＤＮＡ検出装置に、ＤＮＡ検出方法を行わせるためのプログラムである。ここでＤＮＡ検出装置は、（２）で詳述した装置を用い、ＤＮＡ検出方法として、（１）で詳述した方法を実行する。
本発明の一実施態様は、ＤＮＡ検出装置に、ＤＮＡ検出方法を行わせるためのプログラムである。ここでＤＮＡ検出装置は、（２）で詳述した装置を用い、ＤＮＡ検出方法として、（１）で詳述した方法を実行する。
【0055】
また、このプログラムを格納する記録媒体も、本発明の実施形態の一つである。
【実施例】
【0056】
本実施例では、蛍光標識プローブを用いて、ウェル内のＤＮＡの融解温度を測定した結果を示す。
【0057】
まず、ＫＲＡＳ遺伝子の野生型およびＧ１３Ｄ変異型のゲノムＤＮＡ（最終濃度１３３分子／μＬ）を用意し、ＰＣＲに必要となるフォワードプライマー（最終濃度０．２５μＭ）、リバースプライマー（最終濃度２．０μＭ），野生型に対応した蛍光標識プローブ（最終濃度０．５μＭ）、Ｇ１３Ｄ変異型に対応した蛍光標識プローブ（最終濃度０．５μＭ）、及び１ｘマスターミックス（ＤＮＡポリメラーゼ，ｄＮＴＰを含む）を加え、ＰＣＲ反応液を調製した。このとき、蛍光標識プローブの相補ＤＮＡ鎖が過剰に増幅するようにプライマーペアの濃度は非対称になるように添加した。プライマー及びプローブの配列は以下のとおりである。なお、蛍光標識プローブはいずれも、両端近くに相補的な配列を有し、それらが分子内で二重鎖を形成するように設計されている。また、５’末端に蛍光色素としてＨＥＸ、３’末端にクエンチャーとしてＢＨＱ－１が結合している。
【0058】
フォワードプライマー：5'‐GTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGG‐3' （配列番号１）
リバースプライマー：5'‐GTATCGTCAAGGCACTCTTGCC‐3' （配列番号２）
野生型に対応した蛍光標識プローブ：5'‐TTGGAGCTGGTGGCGT‐3' （配列番号３）
変異型に対応した蛍光標識プローブ：5'‐CTGGTGACGTAGGCA‐3' （配列番号４）
その後、各ウェルに対し、ＫＲＡＳ遺伝子の野生型またはＧ１３Ｄ変異型のＤＮＡのいずれかが１個入るか、どちらも入らないようにするため、１５μＬのＰＣＲ反応液を入れて、ＰＣＲによりＤＮＡを増幅した。ＰＣＲの反応は，９６℃、１０分処理後、（６０℃，２分→９８℃，３０秒）を５９サイクル行い、最後に６０℃、２分処理をした。反応後、ウェルが設けられたチップを温調ステージ上で８５℃から５０℃に冷却しながら各ウェルの蛍光強度変化を観察し、融解曲線の測定および解析を行った。
リバースプライマー：5'‐GTATCGTCAAGGCACTCTTGCC‐3' （配列番号２）
野生型に対応した蛍光標識プローブ：5'‐TTGGAGCTGGTGGCGT‐3' （配列番号３）
変異型に対応した蛍光標識プローブ：5'‐CTGGTGACGTAGGCA‐3' （配列番号４）
その後、各ウェルに対し、ＫＲＡＳ遺伝子の野生型またはＧ１３Ｄ変異型のＤＮＡのいずれかが１個入るか、どちらも入らないようにするため、１５μＬのＰＣＲ反応液を入れて、ＰＣＲによりＤＮＡを増幅した。ＰＣＲの反応は，９６℃、１０分処理後、（６０℃，２分→９８℃，３０秒）を５９サイクル行い、最後に６０℃、２分処理をした。反応後、ウェルが設けられたチップを温調ステージ上で８５℃から５０℃に冷却しながら各ウェルの蛍光強度変化を観察し、融解曲線の測定および解析を行った。
【0059】
図１０Ａは、ＫＲＡＳ遺伝子の野生型とＧ１３Ｄ変異型が等量混合された検体を測定した際の結果を、５０℃の蛍光強度を横軸に、融解温度を縦軸にプロットしたものである。融解温度の違いにより２つの分布に分かれ、６９℃付近に分布をもつ集団１００１が野生型のみを含むウェル、６３℃付近に分布をもつ集団１００３が変異型のみを含むウェルである。融解温度が６３℃から６９℃の間に広くばらついて観察されている点１００２が野生型とＧ１３Ｄ変異型が１コピーずつ入ったウェルである。
【0060】
図１０Ａの融解温度によって分けられた１００１、１００２、１００３に含まれる各ウェルの融解曲線をそれぞれ図１０Ｂ～Ｄに示し、融解曲線の微分曲線を図１０Ｅ～Ｇに示す。野生型のみを含むウェルおよびＧ１３Ｄ変異型のみを含むウェルは、図１０ＢおよびＤに示すように、融解曲線の傾きが大きく、図１０ＥおよびＧに示すように微分曲線の半値幅も小さい。一方、野生型とＧ１３Ｄ変異型が１コピーずつ入ったウェルは、図１０Ｃに示すように、融解曲線の傾きが小さく、微分曲線の半値幅も大きいことが分かる。
【0061】
図１０Ｈは、ＫＲＡＳ遺伝子の野生型とＧ１３Ｄ変異型が等量混合された検体を測定した際の結果を、融解曲線の微分曲線の半値幅を横軸に、融解温度を縦軸にプロットしたものである。融解曲線の微分曲線の半値幅を横軸に用いた結果、ＫＲＡＳ遺伝子を１種類含むウェルと２種類含むウェルの横軸方向の分布が異なることから、野生型のみを含むウェル、Ｇ１３Ｄ変異型のみを含むウェル、野生型とＧ１３Ｄ変異型の２種類を含むウェルの集団を明確に判別できる。
【0062】
このように、融解曲線の傾きや融解曲線の微分曲線の半値幅をウェル内のＤＮＡの種類の判別に用いることで、蛍光強度と融解温度だけではプロットが重なって分けられない、
野生型と変異型が１コピーずつ入ったウェルを判別でき、測定再現性および測定精度の向上を図ることができる。
野生型と変異型が１コピーずつ入ったウェルを判別でき、測定再現性および測定精度の向上を図ることができる。
【符号の説明】
【0063】
１０１ 野生型の遺伝子を含む微小区画
１０２ 変異型の遺伝子を含む微小区画
１０３ 野生型および変異型の遺伝子を含む微小区画
２０１ 野生型の遺伝子を含む微小区画
２０２ 変異型の遺伝子を含む微小区画
２０３ 野生型および変異型の遺伝子を含む微小区画
３０１ 対象遺伝子を含むドロップレット
３０２ 対象遺伝子を含まないドロップレット
３０３ マイクロ流路
３０４ 光源
３０５ フィルター
３０６ フォトマルチプルメーター
３０７ ＣＣＤ
３０８ レンズ
３０９ ダイクロイックミラー
３１０ ドロップレット検出用カートリッジ
３１１ ドロップレット
３１２ 温調装置
３１３ ウェル方式検出用カートリッジ
３１４ 対象遺伝子を含むウェル
３１５ 対象遺伝子を含まないウェル
４０１ 野生型の遺伝子を含む微小区画
４０２ 変異型の遺伝子を含む微小区画
４０３ 野生型および変異型の遺伝子を含む微小区画
４０４ 微小区画ａ
４０５ 微小区画ｂ
４０６ 微小区画ｃ
４０７ 微小区画ｄ
５０１ ＤＮＡ
５０２ ＤＮＡインターカレーター
５０３ 融解温度
６０１ ＤＮＡ
６０２ 蛍光標識プローブ
６０３ 蛍光色素
６０４ クエンチャー
６０５ 融解温度
１００１ 野生型のみを含むウェル
１００２ 野生型と変異型が１コピーずつ入ったウェル
１００３ 変異型のみを含むウェル
１０２ 変異型の遺伝子を含む微小区画
１０３ 野生型および変異型の遺伝子を含む微小区画
２０１ 野生型の遺伝子を含む微小区画
２０２ 変異型の遺伝子を含む微小区画
２０３ 野生型および変異型の遺伝子を含む微小区画
３０１ 対象遺伝子を含むドロップレット
３０２ 対象遺伝子を含まないドロップレット
３０３ マイクロ流路
３０４ 光源
３０５ フィルター
３０６ フォトマルチプルメーター
３０７ ＣＣＤ
３０８ レンズ
３０９ ダイクロイックミラー
３１０ ドロップレット検出用カートリッジ
３１１ ドロップレット
３１２ 温調装置
３１３ ウェル方式検出用カートリッジ
３１４ 対象遺伝子を含むウェル
３１５ 対象遺伝子を含まないウェル
４０１ 野生型の遺伝子を含む微小区画
４０２ 変異型の遺伝子を含む微小区画
４０３ 野生型および変異型の遺伝子を含む微小区画
４０４ 微小区画ａ
４０５ 微小区画ｂ
４０６ 微小区画ｃ
４０７ 微小区画ｄ
５０１ ＤＮＡ
５０２ ＤＮＡインターカレーター
５０３ 融解温度
６０１ ＤＮＡ
６０２ 蛍光標識プローブ
６０３ 蛍光色素
６０４ クエンチャー
６０５ 融解温度
１００１ 野生型のみを含むウェル
１００２ 野生型と変異型が１コピーずつ入ったウェル
１００３ 変異型のみを含むウェル
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】