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特許7546015発現強化座位の使用に基づく抗体を作製するための組成物および方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-08-28
(45)【発行日】2024-09-05
(54)【発明の名称】発現強化座位の使用に基づく抗体を作製するための組成物および方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20240829BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240829BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20240829BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20240829BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20240829BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10
C12N15/13 ZNA
C12N15/85 Z
C07K16/46
C12P21/08
【請求項の数】
31
(21)【出願番号】P 2022137796
(22)【出願日】2022-08-31
(62)【分割の表示】P 2018552822の分割
【原出願日】2017-04-20
(65)【公開番号】P2022164824
(43)【公開日】2022-10-27
【審査請求日】2022-08-31
(31)【優先権主張番号】62/325,385
(32)【優先日】2016-04-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】597160510
【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(72)【発明者】
【氏名】ロバート バブ
(72)【発明者】
【氏名】ダリャ ブラコフ
(72)【発明者】
【氏名】ガン チェン
(72)【発明者】
【氏名】ジェイムズ ピー． ファンデル
【審査官】藤澤 雅樹
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１６－５０７５２５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１２－５３１４３９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００９－５３９３４９（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００８／１５１２１９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Biotechnol. Prog.，2015年，Vol.31, No.6，pp.1645-1656
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００
Ｃ１２Ｎ ５／００
Ｃ１２Ｐ ２１／００
Ｃ０７Ｋ １６／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
発現強化座位内で統合された外因性核酸を備えた哺乳類細胞であって、前記発現強化座位が、配列番号２または配列番号３と少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含み、
前記外因性核酸は二特異性抗体またはその抗原結合断片をコードしており、
前記外因性核酸は、第一の軽鎖断片（ＬＣＦ）をコードするヌクレオチド配列を備える第一の外因性核酸、第一の重鎖断片（ＨＣＦ）をコードするヌクレオチド配列を備える第二の外因性核酸、および第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備える第三の外因性核酸を備え、
前記二特異性抗体またはその抗原結合断片が、前記第一のＨＣＦ、前記第二のＨＣＦおよび前記第一のＬＣＦを備える、前記哺乳類細胞。
【請求項2】
前記第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第一のＣＨ２ドメインおよび第一のＣＨ３ドメインをコードし、前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第二のＣＨ２ドメインおよび第二のＣＨ３ドメインをコードする、請求項１に記載の細胞。
【請求項3】
前記第一および第二のＣＨ３ドメインが、少なくとも１つのアミノ酸位置で異なっている、請求項２に記載の細胞。
【請求項4】
前記第一および第二のＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧのＣＨ３ドメインであり、前記２つのＣＨ３ドメインのうちの１つが、少なくとも１つのアミノ酸位置で改変され、それにより非改変ＣＨ３ドメインとは異なるプロテインＡ結合特性が生じる、請求項２に記載の細胞。
【請求項5】
前記第一および第二のＣＨ３ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記ヌクレオチド配列のうちの１つがコドン改変されているという点で互いに異なっている、請求項２に記載の細胞。
【請求項6】
前記外因性核酸が、第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を備える追加の外因性核酸をさらに備える、請求項１に記載の細胞。
【請求項7】
前記第一の外因性核酸は、前記第一のＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列に動作可能に連結された第一のプロモーターをさらに備え、前記第二の外因性核酸は、前記第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列に動作可能に連結された第二のプロモーターをさらに備え、第三の外因性核酸は、前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列に動作可能に連結された第三のプロモーターを備え、前記第一、第二、および第三のプロモーターは、同一、または異なるプロモーターである、請求項１に記載の細胞。
【請求項8】
前記第一の外因性核酸は、前記第二および第三の外因性核酸に対し、上流に配置される、請求項１に記載の細胞。
【請求項9】
前記第一の外因性核酸に対し５’に位置付けられた第一のリコンビナーゼ認識部位（ＲＲＳ）、ならびに前記第二および第三の外因性核酸の両方に対し３’に位置付けられた第二のリコンビナーゼ認識部位（ＲＲＳ）をさらに備え、前記第一および第二のＲＲＳは異なる、請求項８に記載の細胞。
【請求項10】
前記第一の外因性核酸に対し３’に、ならびに前記第二および第三の外因性核酸の１つ、または両方に対し５’に位置付けられる第三のＲＲＳをさらに備え、前記第三のＲＲＳは、前記第一および第二のＲＲＳとは異なる、請求項８に記載の細胞。
【請求項11】
選択マーカー遺伝子を備える第四の外因性核酸をさらに備える、請求項９に記載の細胞。
【請求項12】
前記第四の外因性核酸が、第三のＲＲＳをさらに備え、前記第一の外因性核酸に対し３’に位置付けられる、請求項１１に記載の細胞。
【請求項13】
前記第二の外因性核酸は、前記第一および第三の外因性核酸に対し、上流に配置される、請求項１に記載の細胞。
【請求項14】
前記座位での前記外因性核酸の順序が、５’から３’の方向に、前記第一の外因性核酸、前記第四の外因性核酸、前記第二の外因性核酸、および前記第三の外因性核酸であり、前記第二の外因性核酸は、ヒトＩｇＧの改変型ＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列を備え、前記第三の外因性核酸は、前記ヒトＩｇＧの天然型ＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列を備える、請求項１１に記載の細胞。
【請求項15】
前記座位での前記外因性核酸の順序が、５’から３’の方向に、前記第一の外因性核酸、前記第二の外因性核酸、前記第四の外因性核酸、および前記第三の外因性核酸であり、前記第二の外因性核酸は、ヒトＩｇＧの前記天然型ＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列を備え、前記第三の外因性核酸は、前記ヒトＩｇＧの改変型ＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列を備える、請求項１２に記載の細胞。
【請求項16】
前記第一、第二、および第三のプロモーターが同一のプロモーターであり、前記選択マーカー遺伝子が動作可能に連結される前記プロモーターとは異なる、請求項１４または１５に記載の細胞。
【請求項17】
前記二特異性抗体は、Ｔ細胞抗原および腫瘍細胞抗原に特異的に結合する、請求項１に記載の細胞。
【請求項18】
前記強化発現座位は、配列番号２または配列番号３のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項19】
前記細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項１～１８のいずれかに記載の細胞。
【請求項20】
二特異性抗体またはその抗原結合断片を作製する方法であって、（ｉ）請求項１～１９のいずれか１項に記載の細胞を提供すること、
（ｉｉ）前記外因性核酸から、前記二特異性抗体またはその抗原結合断片を発現させること、および
（ｉｉｉ）前記細胞から、前記二特異性抗体またはその抗原結合断片を取得すること、を含む、方法。
【請求項21】
発現強化座位内で統合された、
第一のＲＲＳ、
第一の核酸、
第三のＲＲＳを備えるイントロンを備える選択マーカー遺伝子、
第二の核酸、および
第二のＲＲＳ
を、５’から３’の方向に含む哺乳類細胞であって、
前記第一の核酸および前記第二の核酸の一方は、第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を備え、前記第一の核酸および前記第二の核酸の他方は、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備え、
前記第一または前記第二の核酸の一方は、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備え、
前記第一のＨＣＦ、前記第二のＨＣＦ、および前記第一のＬＣＦが、抗原結合タンパク質の断片であり、
前記発現強化座位が、配列番号２または配列番号３と少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含む、哺乳類細胞。
【請求項22】
前記第一の核酸が前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を備え、前記第二の核酸が前記第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備える、請求項２１に記載の細胞。
【請求項23】
前記第一の核酸が前記第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備え、前記第二の核酸が前記第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を備える、請求項２１に記載の細胞。
【請求項24】
前記選択マーカー遺伝子が抗生物質に対する抵抗性を与える、請求項２１～２３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項25】
前記抗生物質がハイグロマイシン、ネオマイシンまたはカナマイシンである、請求項２４に記載の細胞。
【請求項26】
前記第一のＨＣＦ、前記第一のＬＣＦおよび前記第二のＨＣＦのそれぞれが可変ドメインを備える、請求項２１～２５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項27】
前記第一のＨＣＦが、前記第二のＨＣＦの前記可変ドメインとは異なる可変ドメインを備え、前記第一のＨＣＦ、前記第二のＨＣＦおよび前記第一のＬＣＦが、二特異性抗体の断片である、請求項２６に記載の細胞。
【請求項28】
前記第一および第二の核酸が一緒になって全長抗体をコードする、請求項２１～２５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項29】
前記全長抗体が二特異性抗体である、請求項２８に記載の細胞。
【請求項30】
前記細胞がＣＨＯ細胞である、請求項２１～２９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項31】
抗原結合タンパク質を産生する方法であって、請求項２１～３０のいずれか１項に記載の哺乳類細胞を培養すること；および
前記細胞からそれぞれ、請求項２１～３０のいずれか１項に記載の前記抗原結合タンパク質を産生させること
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年４月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／３２５，３８５号の優先権の利益を主張するものであり、当該仮特許出願の全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１６年４月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／３２５，３８５号の優先権の利益を主張するものであり、当該仮特許出願の全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、真核細胞における組み換えタンパク質の部位特異的統合および発現に関するものである。特に本開示は、発現強化部位を利用することによる、真核細胞、特にチャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）の細胞株における、たとえば二特異性抗体などの抗原結合タンパク質の発現改善のための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【0003】
細胞発現システムは、研究用途および治療用途を問わず、所与のタンパク質製造のための信頼できる、効率的な供給源を提供することを目的としている。例えば、哺乳類の発現系は組み換え型タンパク質を翻訳後に適切に修飾できる能力があり、それゆえに、治療用タンパク質製造の目的に対し、哺乳類細胞中で組み換え型タンパク質を発現させることは、好ましい方法である。
【0004】
様々な発現系が利用可能な状態であるにもかかわらず、組換え型タンパク質発現のための効率的な遺伝子移入および統合遺伝子の安定性といった課題が未だ存在する。標的導入遺伝子を長期的に発現させるにあたっての懸念事項の１つは、その細胞株の表現型が変化しないよう、細胞遺伝子の破壊を最小限とすることである。
【0005】
安定細胞株を操作して、たとえば多特異性抗体にあるような複合的な抗体鎖などの複合的な遺伝子の発現に適合させることは特に困難である。統合遺伝子の発現レベルに幅広いバリエーションが発生する可能性がある。追加遺伝子の統合は、局所的な遺伝子環境（すなわち位置効果（ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔｓ））が原因でさらに大きな発現バリエーションと不安定性を生じさせる可能性がある。多特異性抗原結合タンパク質作製のための発現システムは多くの場合、特有の多量体形式としてのペア形成が意図された２個以上の異なるイムノグロブリン鎖の発現が必要であり、そしてしばしば、所望されるヘテロ二量体や多量体の組み合わせよりも、ホモ二量体の産生が優勢となってしまう場合がある。したがって、当技術分野には、哺乳類発現システムの改善に対するニーズが存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
１つの態様において、発現強化座位内の特定の部位で統合された外因性核酸を含有する細胞が提供され、当該外因性核酸配列は二特異性抗原結合タンパク質をコードしている。
【0007】
一部の実施形態では、外因性核酸配列は、第一の軽鎖断片（ＬＣＦ：ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ）をコードするヌクレオチド配列を含有する第一の外因性核酸、第一の重鎖断片（ＨＣＦ：ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ）をコードするヌクレオチド配列を含有する第二の外因性核酸、および第二のＨＣＦ（または第二のＨＣＦが第一のＨＣＦとは異なる場合には、ＨＣＦ＊と表される）をコードするヌクレオチド配列を含有する第三の外因性核酸を含み、この場合において当該第一および第二のＨＣＦ、ならびに第一のＬＣＦは、二特異性抗原結合タンパク質を形成する。ある実施形態では、第一および第二のＨＣＦ、ならびに第一のＬＣＦは、二特異性抗原結合タンパク質の少なくとも２個の可変領域と２個のＣＨ３定常ドメインを含有する。一部の実施形態では、当該２個の可変領域は異なっている。一部の実施形態では、当該２個のＣＨ３領域は異なっている。一部の実施形態では、各外因性核酸配列は、強化発現座位内の特定の部位に同時に統合される。
【0008】
一部の実施形態では、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一の定常領域由来のアミノ酸をコードし（たとえば、ＣＨ１、ＣＨ２、ヒンジまたはＣＨ３ドメインの内の１つ以上をコードし）、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第二の定常領域由来のアミノ酸をコードする。第一の定常領域由来のアミノ酸は、第二の定常領域由来のアミノ酸と同一、または異なってもよい。特定の実施形態では、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一のＣＨ３ドメインをコードし、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第二のＣＨ３ドメインをコードし、この場合において当該第一および第二のＣＨ３ドメインは、同一、または異なってもよい。一部の実施形態では、第一および第二のＣＨ３ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸位置で異なっている。たとえば、２つのＣＨ３ドメインの内の１つは、ヒトのＩｇＧ ＣＨ３ドメインであり、他方は、改変ヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメインであり、それら２つのＣＨ３ドメインは、異なるプロテインＡ結合特性を有している。他の実施形態では、第一および第二のＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列は、そのヌクレオチド配列のうちの１つがコドン改変されているという点で、互いに異なっている。
【0009】
他の特定の実施形態では、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一の重鎖可変（ＶＨ：ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ）領域をコードし、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第二のＶＨ領域をコードし、この場合において当該第一および第二の重鎖は、同一、または異なるＶＨ領域を有してもよい。別の実施形態では、第一および第二のＶＨは、同一または異なる定常領域に連結されている。
【0010】
一部の実施形態では、第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一の軽鎖可変（ＶＬ：ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ）領域をコードする。
【0011】
一部の実施形態では、外因性核酸配列は、たとえば第二の軽鎖可変（ＶＬ）領域などの第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を含む追加の外因性核酸を含有する。一部の実施形態では、第二のＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列は、第二の軽鎖定常領域をコードする。
【0012】
複数の外因性核酸の座位での相対的な位置は、変化し得る。一部の実施形態では、ＬＣＦをコードする核酸は、ＨＣＦをコードする両方の核酸に対し、上流または下流に位置付けられる。
【0013】
一部の実施形態では、ＨＣＦまたはＬＣＦをコードする配列の各々は、独立して、転写制御配列に連結される。特定の実施形態では、第一の外因性核酸は、第一のＬＣＦをコードするヌクレオチドに動作可能に連結された第一のプロモーターをさらに含み、第二の外因性核酸は、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された第二のプロモーターをさらに備え、そして第三の外因性核酸は、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された第三のプロモーターを備えており、この場合において当該第一、第二、および第三のプロモーターは、同一であっても、または異なっていてもよく、および／または当該プロモーターは、第四の外因性核酸が動作可能に連結される第四のプロモーターと同一であるか、または異なっている。一部の実施形態では、第一、第二、および第三のプロモーターは、同一である。
【0014】
一部の実施形態では、外因性核酸配列は統合部位でリコンビナーゼ認識部位をさらに含み、当該リコンビナーゼ認識部位はたとえば第一の外因性核酸に対し５’に位置付けられた第一のリコンビナーゼ認識部位（ＲＲＳ：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）と、第二および第三の外因性核酸の両方に対し３’に位置付けられた第二のリコンビナーゼ認識部位（ＲＲＳ）であり、この場合において当該第一および第二のＲＲＳは異なっている。一部の実施形態では、第三のＲＲＳも含まれ、第三のＲＲＳは、第一の外因性核酸に対し３’に、ならびに第二および第三の外因性核酸の１つ、または両方に対し５’に位置付けられ、この場合において第三のＲＲＳは、第一および第二のＲＲＳとは異なっている。
【0015】
一部の実施形態では、外因性核酸配列は、選択マーカー遺伝子を含有する第四の外因性核酸を含んでもよい。特定の実施形態では、第四の外因性核酸は、第一の外因性核酸に対し３’に位置付けられる。ある実施形態では、第四の外因性核酸は、分割遺伝子（ｓｐｌｉｔ ｇｅｎｅ）として統合される。他の実施形態では、第四の外因性核酸、すなわち選択マーカーは、第三のＲＲＳの３’に位置付けられ、これは、第四の外因性核酸に動作可能に連結される第四のプロモーターの３’である。一部の実施形態では、選択マーカー遺伝子は、挿入される第三のＲＲＳを備えており、当該第三のＲＲＳは任意で、選択マーカー遺伝子のイントロン内に挿入され、この場合において当該第三のＲＲＳは、第一および第二のＲＲＳとは異なっている。
【0016】
ある実施形態では、座位での外因性核酸の順序は以下であってもよい：５’から３’の方向に、第一の外因性核酸（ＬＣＦをコードする）、第四の外因性核酸（選択マーカーをコードする）、第二の外因性核酸（第一のＨＣＦをコードする）、そして第三の外因性核酸（第二のＨＣＦをコードする）。一部の特定の実施形態では。第二の外因性核酸は、ヒトＩｇＧの改変型ＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列を含有し、第三の外因性核酸は、ヒトＩｇＧの天然型ＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列を備えている。
【0017】
ある実施形態では、座位での外因性核酸の順序は以下である：５’から３’の方向に、第一の外因性核酸（ＬＣＦをコードする）、第二の外因性核酸（第一のＨＣＦをコードする）、第四の外因性核酸（選択マーカーをコードする）、そして第三の外因性核酸（第二のＨＣＦをコードする）。この場合において第二の外因性核酸は、ヒトＩｇＧの天然型ＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列を備え、第三の外因性核酸は、ヒトＩｇＧの改変型ＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列を備えている。
【0018】
一部の実施形態では、ＨＣＦまたはＬＣＦをコードする配列に連結されるプロモーターは同一であり、選択マーカー遺伝子が動作可能に連結されるプロモーターとは異なっている。
【0019】
一部の実施形態では、二特異定抗原結合タンパク質は、Ｔ細胞抗原および腫瘍細胞抗原に特異的に結合する。その他の適した二重抗原特異性も提供される。
【0020】
一部の実施形態では、強化発現座位は、配列番号１に対し少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を備えた座位、または配列番号２に対し少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を備えた座位から選択される。
【0021】
様々な実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【0022】
別の態様では、複数の外因性核酸の部位特異的統合用に設計されたベクターが提供される。
【0023】
一部の実施形態では、本開示はベクターセットを提供するものであり、当該セットは、５’から３’に向かって、第一のＲＲＳ、第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を含有する第一の核酸、および第三のＲＲＳを含有する第一のベクター；５’から３’に向かって、第三のＲＲＳ、第一のＶＨ領域をコードするヌクレオチド配列を含有する第二の核酸、および第二のＲＲＳを含有する第二のベクターを含む。この場合において、第一または第二の核酸のいずれかは、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに備え、およびこの場合において第一および第二のＨＣＦ、ならびに第一のＬＣＦは、二特異定抗原結合タンパク質を形成する。
【0024】
一部の実施形態では、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一の核酸中に含有され、第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列の下流に任意で位置付けられる。他の実施形態では、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第二の核酸中に含有される。
【0025】
一部の実施形態では、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一のキメラ定常領域をコードし（たとえば、任意のアイソタイプ由来のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２もしくはＣＨ３ドメイン、またはそれらの断片の内の１つ以上をコードし）、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第二のキメラ定常領域をコードする。キメラ定常領域の例は、２０１４年８月７日に公開されたＰＣＴ国際出願公開ＷＯ２０１４／１２１０８７Ａ１に記載され、当該出願は参照により本明細書に援用される。第一の定常領域由来のアミノ酸は、第二のキメラ定常領域由来のアミノ酸と同一であっても、異なっていてもよい。特定の実施形態では、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一のＣＨ３ドメインをコードし、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第二のＣＨ３ドメインをコードし、この場合において当該第一および第二のＣＨ３ドメインは、同一、または異なってもよい。一部の実施形態では、第一および第二のＣＨ３ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸位置で異なっている。たとえば、２つのＣＨ３ドメインの内の１つは、ヒトのＩｇＧ ＣＨ３ドメインであり、他方は、改変ヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメインであり、それら２つのＣＨ３ドメインは、異なるプロテインＡ結合特性を有している。他の実施形態では、第一および第二のＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列は、そのヌクレオチド配列のうちの１つがコドン改変されているという点で、互いに異なっている。
【0026】
他の特定の実施形態では、第一のＶＨ領域をコードするヌクレオチド配列は、第一の重鎖をコードし、第二のＶＨ領域をコードするヌクレオチド配列は、第二の重鎖をコードし、この場合において当該第一および第二の重鎖は、同一または異なる定常領域を有してもよい。
【0027】
一部の実施形態では、第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一の軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする。
【0028】
一部の実施形態では、ＬＣＦまたはＨＣＦをコードする配列の各々は、独立して、たとえばプロモーターなどの転写制御配列に連結される。特定の実施形態では、第一のＨＣＦをコードする配列に連結されたプロモーターと、第二のＨＣＦをコードする配列に連結されたプロモーターは、同一のプロモーターである。特定の実施形態では、ＬＣＦおよびＨＣＦに連結されるプロモーターはすべて同一のプロモーターである。
【0029】
一部の実施形態では、第一のベクター中の第一の核酸は、第一のベクター中の第三のＲＲＳに対し５’に位置付けられる、選択マーカー遺伝子の５’部分をさらに含む。第二の核酸は、第二のベクター中の第三のＲＲＳに対し３’に位置付けられる、選択マーカー遺伝子の残りの３’部分をさらに含む。すなわち、選択マーカー遺伝子は、２つのベクターに分割される。他の実施形態では、選択マーカーと、選択マーカーが動作可能に連結されるプロモーターは、２つのベクターの間で分割される。言い換えると、プロモーターと選択マーカー遺伝子は、異なるベクター上に配置される。ある実施形態では、マーカー遺伝子に動作可能に連結されるプロモーターは、第一のベクター中、第三のＲＲＳに対し５’に配置され、マーカー遺伝子は、第二のベクター中、第三のＲＲＳの３’に位置付けられ、ならびに第二の核酸に動作可能に連結される第二のプロモーター、および第三の核酸に動作可能に連結される第三のプロモーターの５’に位置付けられる。一部の実施形態では、第一のベクター中の第三のＲＲＳは、選択マーカー遺伝子のイントロンの５’部分内に存在する。第二のベクター中の第三のＲＲＳは、選択マーカー遺伝子のイントロンの３’部分内に存在する。
【0030】
特定の実施形態では、第一のベクターは、５’から３’の方向に、第一のＲＲＳ、第一の核酸、および第三のＲＲＳを含む。第二のベクターは、５’から３’の方向に、第三のＲＲＳ、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列と第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を含有する第二の核酸、および第二のＲＲＳを含む。他の特定の実施形態では、第一のベクターは、５’から３’の方向に、第一のＲＲＳ、第一の核酸、および第三のＲＲＳを備え、当該第一の核酸は、第一のＨＣＦ領域をコードするヌクレオチド配列と第二のＨＣＦ領域をコードするヌクレオチド配列を備える。第二のベクターは、５’から３’の方向に、第三のＲＲＳ、第二の核酸、および第二のＲＲＳを含み、当該第二の核酸は、第一のＨＣＦ領域をコードするヌクレオチド配列を備える。これら特定の実施形態のいずれかにおいて、第一の核酸は、第一のベクター中の第三のＲＲＳに対し５’に位置付けられる、選択マーカー遺伝子の５’部分をさらに含んでもよい。そして第二の核酸は、第二のベクター中の第三のＲＲＳに対し３’に位置付けられる、選択マーカー遺伝子の残りの３’部分をさらに備える。この場合において、任意で、第一のベクター中の第三のＲＲＳは、選択マーカー遺伝子のイントロンの５’部分内に存在し、第二のベクター中の第三のＲＲＳは、選択マーカー遺伝子のイントロンの３’部分内に存在する。
【0031】
一部の実施形態では、ベクターセットは、追加のベクターを含んでもよい。追加のベクターは、たとえば、１つ以上のＲＲＳと第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を含有するベクター、またはＲＲＳを認識する１つ以上のリコンビナーゼをコードするベクターなどである。
【0032】
他の実施形態では、本開示は、相同アームに基づく相同組み換えを介した、複数の外因性核酸の部位特異的統合を達成するために設計されたベクターを提供する。一部の実施形態では、ベクターは、二特異性抗原結合タンパク質をコードし、細胞の発現強化座位内への統合用の５’相同アームと３’相同アームに隣接される外因性核酸配列を含有する。
【0033】
さらなる態様において、本開示は、細胞と１つ以上のベクターの組み合わせを含み、発現強化座位内に外因性核酸が統合された細胞の作製に利用可能なシステムを提供するものであり、当該外因性核酸はともに二特異性抗原結合タンパク質をコードする。
【0034】
ある実施形態では、細胞とベクターセットを含むシステムが提供され、この場合において当該細胞は、そのゲノムの発現強化座位内に統合されたＲＲＳセットを含有し、当該ＲＲＳは互いに異なっており、およびベクターセット中の対象遺伝子との組み換え交換のための１つ以上の外因性核酸、たとえば選択マーカーなどの間で分けられている。ならびにこの場合において当該ベクターセット中のＲＲＳは、細胞中のＲＲＳと同じ配置を備えている。
【0035】
一部の実施形態では、細胞とベクターセットを含むシステムが提供され、この場合において当該細胞は、５’から３’の方向に、そのゲノムの発現強化座位内に統合された以下を含有する：第一のＲＲＳ、第一の外因性核酸、第二のＲＲＳ、第二の外因性核酸、および第三のＲＲＳ。この場合においてその３つのＲＲＳは互いに異なっている。この場合においてベクターセットは、５’から３’の方向に第一のＲＲＳ、第一のイムノグロブリン鎖またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含有する第一の核酸、そして第二のＲＲＳを含有する第一のベクターと、第二のＲＲＳ、第二のイムノグロブリン鎖またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含有する第二の核酸、そして第三のＲＲＳを含有する第二のベクターを含み、この場合において第一の核酸または第二の核酸のいずれかは第三のイムノグロブリン鎖又はその断片をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。ベクターが細胞内に導入されると、ベクター中の第一および第二の核酸が、第一、第二および第三のＲＲＳにより介在される組み換えを介して発現強化座位内に統合する。
【0036】
一部の実施形態では、細胞中の第一の外因性核酸は、第一の選択マーカー遺伝子を含有し、細胞中の第二の外因性核酸は、第二の選択マーカー遺伝子を含有し、この場合において当該第一および第二の選択マーカー遺伝子は異なっている。選択マーカーは、細胞において統合される外因性核酸を交換する。
【0037】
一部の実施形態では、第一のベクターは、５’から３’の方向に、第一のＲＲＳ、第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を含有する第一の核酸、および第三のＲＲＳを含有する。第二のベクターは、５’から３’の方向に、第三のＲＲＳ、第二の核酸、および第二のＲＲＳを含有し、この場合において当該第二の核酸は第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列と第二のＨＣをコードするヌクレオチド配列の両方を含有する。他の実施形態では、第一のベクターは、５’から３’の方向に、第一のＲＲＳ、第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を含有する第一の核酸、および第三のＲＲＳを含有する。第二のベクターは、５’から３’の方向に、第三のＲＲＳ、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を含有する第二の核酸、および第二のＲＲＳを含有する。
【0038】
一部の実施形態では、第一のベクターは、５’から３’の方向に、第一のＲＲＳ、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を含有する第一の核酸、および第三のＲＲＳを含む。第二のベクターは、５’から３’の方向に、第三のＲＲＳ、第二の核酸、および第二のＲＲＳを含有し、この場合において第二の核酸は第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列と第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列の両方を含有する。他の実施形態では、第一のベクターは、５’から３’の方向に、第一のＲＲＳ、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列と第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を含有する第一の核酸、および第三のＲＲＳを含有する。第二のベクターは、５’から３’の方向に、第三のＲＲＳ、第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を含有する第二の核酸、および第二のＲＲＳを含有する。これらの実施形態のいずれかでは、第一のベクター中の第一の核酸は、第三のＲＲＳに対し５’に位置付けられたプロモーターをさらに含んでもよく、第二のベクター中の第二の核酸は、プロモーターが動作可能に連結され、第三のＲＲＳに対し３’に位置付けられる選択マーカー遺伝子をさらに含む。他の実施形態では、第一のベクター中の第一の核酸は、第三のＲＲＳに対し５’に位置付けられる、選択マーカー遺伝子の５’部分をさらに含んでもよい。そして第二のベクター中の第二の核酸は、第三のＲＲＳに対し３’に位置付けられる、選択マーカー遺伝子の残りの３’部分をさらに含む。この場合において、任意で、第一のベクター中の第三のＲＲＳは、選択マーカー遺伝子のイントロンの５’部分内に存在し、第二のベクター中の第三のＲＲＳは、選択マーカー遺伝子のイントロンの３’部分内に存在する。
【0039】
一部の実施形態では、ＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一のプロモーターに動作可能に連結され、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第二のプロモーターに動作可能に連結され、そして第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第三のプロモーターに動作可能に連結される。この場合において第一、第二、および第三のプロモーターは同一のプロモーターであり、選択マーカー遺伝子がベクターの内の１つに存在する場合、選択マーカー遺伝子が動作可能に連結されるプロモーターとは異なっている。
【0040】
一部の実施形態では、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一のＣＨ３ドメインをコードし、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第二のＣＨ３ドメインをコードし、この場合において当該第一および第二のＣＨ３ドメインは、同一であっても、異なっていてもよい。一部の実施形態では、その２つのＣＨ３ドメインの内の１つは、ヒトＩｇＧの天然型ＣＨ３ドメインであり、他方のＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧの改変型ＣＨ３ドメインである。特定の実施形態では、改変型ＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列は、第一のベクター（すなわち第一のＬＣＦをコードするベクター）中にあり、任意で、第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列の下流にある。他の特定の実施形態では、改変型ＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列は、第二のベクター中にあり、非改変型ＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列の上流にある。
【0041】
他の態様では、本開示は、二特異性抗原結合タンパク質の作製方法を提供する。
【0042】
一部の実施形態では、当該方法は、ＲＲＳを有する細胞と、複数の外因性核酸を含有するベクターセットを含有する、本明細書に記載されるシステムを提供すること、トランスフェクションにより細胞内にベクターを導入すること、ＲＲＳにより介在される組み換えを介してベクター中の外因性核酸が発現強化座位内に統合されたトランスフェクト細胞を選択すること、形質転換細胞中の核酸によりコードされるポリペプチドを発現させること、およびトランスフェクト細胞から二特異性抗原結合タンパク質を取得すること、を含み、この場合において当該複数の外因性核酸はともに二特異性抗原結合タンパク質と、細胞中のＲＲＳと合致するＲＲＳをコードする。
【0043】
一部の実施形態では、当該方法は、発現強化座位内に統合された二特異性抗原結合タンパク質をコードする外因性核酸配列を含有する細胞、当該外因性核酸から二特異性抗原結合タンパク質を発現させること、および細胞から二特異性抗原結合タンパク質を取得することを含んでもよい。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
発現強化座位内の特定の部位で統合される外因性核酸を備えた細胞であって、前記外因性核酸配列は二特異性抗原結合タンパク質をコードしている、前記細胞。
（項目２）
前記外因性核酸配列は、第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を備えた第一の外因性核酸、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備えた第二の外因性核酸、および第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備えた第三の外因性核酸を備える、項目１に記載の細胞。
（項目３）
前記第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第一のＣＨ２ドメインおよび第一のＣＨ３ドメインをコードし、前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第二のＣＨ２ドメインおよび第二のＣＨ３ドメインをコードする、項目２に記載の細胞。
（項目４）
前記第一および第二のＣＨ３ドメインが、少なくとも１つのアミノ酸位置で異なっている、項目３に記載の細胞。
（項目５）
前記第一および第二のＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧのＣＨ３ドメインであり、前記２つのＣＨ３ドメインの内の１つが、少なくとも１つのアミノ酸位置で改変され、それにより非改変ＣＨ３ドメインとは異なるプロテインＡ結合特性が生じる、項目３に記載の細胞。
（項目６）
前記第一および第二のＣＨドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記ヌクレオチド配列のうちの１つがコドン改変されているという点で互いに異なっている、項目３に記載の細胞。
（項目７）
前記第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第一のＶＨをコードし、前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第二のＶＨをコードする、項目２に記載の細胞。
（項目８）
前記第一のＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第一のＶＬをコードする、項目２に記載の細胞。
（項目９）
前記外因性核酸配列が、第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を備える追加の外因性核酸をさらに備える、項目１に記載の細胞。
（項目１０）
前記第二のＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第二のＶＬをコードする、項目９に記載の細胞。
（項目１１）
前記第一の外因性核酸は、第一のＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列に動作可能に連結された第一のプロモーターをさらに備え、前記第二の外因性核酸は、第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列に動作可能に連結された第二のプロモーターをさらに備え、第三の外因性核酸は、第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列に動作可能に連結された第三のプロモーターを備え、前記第一、第二、および第三のプロモーターは、同一、または異なるプロモーターである、項目２に記載の細胞。
（項目１２）
前記第一の外因性核酸は、前記第二および第三の外因性核酸に対し、上流に配置される、項目２に記載の細胞。
（項目１３）
前記第一の外因性核酸に対し５’に位置付けられた第一のリコンビナーゼ認識部位（ＲＲＳ）、ならびに前記第二および第三の外因性核酸の両方に対し３’に位置付けられた第二のリコンビナーゼ認識部位（ＲＲＳ）をさらに備え、前記第一および第二のＲＲＳは異なる、項目１２に記載の細胞。
（項目１４）
前記第一の外因性核酸に対し３’に、ならびに前記第二および第三の外因性核酸の１つ、または両方に対し５’に位置付けられる第三のＲＲＳをさらに備え、前記第三のＲＲＳは、前記第一および第二のＲＲＳとは異なる、項目１２に記載の細胞。
（項目１５）
選択マーカー遺伝子を備える第四の外因性核酸をさらに備える、項目１３に記載の細胞。
（項目１６）
前記第四の外因性核酸が、第三のＲＲＳをさらに備え、前記第一の外因性核酸に対し３’に位置付けられる、項目１５に記載の細胞。
（項目１７）
前記第二の外因性核酸は、前記第一および第三の外因性核酸に対し、上流に配置される、項目２に記載の細胞。
（項目１８）
前記座位での前記外因性核酸の順序が、５’から３’の方向に、前記第一の外因性核酸、前記第四の外因性核酸、前記第二の外因性核酸、および前記第三の外因性核酸であり、前記第二の外因性核酸は、ヒトＩｇＧの改変型ＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列を備え、前記第三の外因性核酸は、前記ヒトＩｇＧの天然型ＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列を備える、項目１６に記載の細胞。
（項目１９）
前記座位での前記外因性核酸の順序が、５’から３’の方向に、前記第一の外因性核酸、前記第二の外因性核酸、前記第四の外因性核酸、および前記第三の外因性核酸であり、前記第二の外因性核酸は、ヒトＩｇＧの前記天然型ＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列を備え、前記第三の外因性核酸は、前記ヒトＩｇＧの改変型ＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列を備える、項目１６に記載の細胞。
（項目２０）
前記第一、第二、および第三のプロモーターが同一のプロモーターであり、前記選択マーカー遺伝子が動作可能に連結される前記プロモーターとは異なる、項目１８または１９に記載の細胞。
（項目２１）
前記二特異性抗原結合タンパク質は、Ｔ細胞抗原および腫瘍細胞抗原に特異的に結合する、項目１に記載の細胞。
（項目２２）
前記強化発現座位は、配列番号１に対し少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を備えた座位、および配列番号２に対し少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を備えた座位からなる群から選択される、項目１に記載の細胞。
（項目２３）
前記細胞が、ＣＨＯ細胞である、項目１～２２のいずれかに記載の細胞。
（項目２４）
５’から３’の方向に、第一のＲＲＳ、第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を備えた第一の核酸、および第三のＲＲＳを備えた第一のベクター、
５’から３’の方向に、前記第三のＲＲＳ、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備えた第二の核酸、および第二のＲＲＳを備えた第二のベクター、を備えたベクターセットであって、
前記第一または前記第二の核酸は、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに備え、ならびに、
前記第一および第二のＨＣＦ、ならびに前記第一のＬＣＦが、二特異性抗原結合タンパク質をコードする、ベクターセット。
（項目２５）
前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記第一の核酸中に含まれる、項目２４に記載のベクターセット。
（項目２６）
前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、前記第一のＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列の上流または下流に配置される、項目２５に記載のベクターセット。
（項目２７）
前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記第二の核酸中に含まれる、項目２４に記載のベクターセット。
（項目２８）
前記第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第一のＣＨ３ドメインをコードし、前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、前記第二のＣＨ３ドメインをコードする、項目２４に記載のベクターセット。
（項目２９）
前記第一および第二のＣＨ３ドメインが、少なくとも１つのアミノ酸位置で異なっている、項目２８に記載のベクターセット。
（項目３０）
前記第一および第二のＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧのＣＨ３ドメインであり、前記２つのＣＨ３ドメインの内の１つが、少なくとも１つのアミノ酸位置で改変され、それにより前記非改変ＣＨ３ドメインとは異なるプロテインＡ結合特性が生じる、項目２８に記載のベクターセット。
（項目３１）
前記第一および第二のＣＨドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記ヌクレオチド配列のうちの１つがコドン改変されているという点で互いに異なっている、項目２８に記載のベクターセット。
（項目３２）
前記第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第一のＶＨをコードし、前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第二の重鎖ＶＨをコードする、項目２４に記載のベクターセット。
（項目３３）
前記第一のＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第一のＶＬをコードする、項目２４に記載のベクターセット。
（項目３４）
第一の軽鎖ＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第一のプロモーターに動作可能に連結され、第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第二のプロモーターに動作可能に連結され、第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第三のプロモーターに動作可能に連結される、項目２４に記載のベクターセット。
（項目３５）
前記第一、第二、および第三のプロモーターは、同一または異なるプロモーターである、項目３４に記載のベクターセット。
（項目３６）
前記第一の核酸は、前記第一のベクター中の前記第三のＲＲＳに対し５’に位置付けられる第二のプロモーターをさらに備え、前記第二の核酸は、前記第二のベクター中の前記第三のＲＲＳに対し３’に位置付けられる前記選択マーカー遺伝子をさらに備える、項目２４に記載のベクターセット。
（項目３７）
前記第一の核酸は、選択マーカー遺伝子の５’部分に対し５’に位置付けられる、前記第一のベクター中の第二のプロモーターをさらに備え、前記第二のベクター中の前記選択マーカーの３’部分は、前記選択マーカー遺伝子の前記５’部分の相同アームに対し３’に存在する、項目２４に記載のベクターセット。
（項目３８）
前記第一のベクターが、５’から３’の方向に、前記第一のＲＲＳ、前記第一の核酸、および前記第三のＲＲＳを備え、
前記第二のベクターが、５’から３’の方向に、前記第三のＲＲＳ、前記第二の核酸を備え、前記第二の核酸は、第一の重鎖またはその断片をコードする前記ヌクレオチド配列、および第二の重鎖またはその断片をコードする前記ヌクレオチド配列を備える、項目２４に記載のベクターセット。
（項目３９）
前記第一のベクターが、５’から３’の方向に、前記第一のＲＲＳ、前記第一の核酸であって、第一のＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列と第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列を備える第一の核酸、および前記第三のＲＲＳを備え、
前記第二のベクターが、５’から３’の方向に、前記第三のＲＲＳ、前記第二の核酸を備え、前記第二の核酸は、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備える、項目２４に記載のベクターセット。
（項目４０）
前記第一の核酸は、前記第一のベクター中の前記第三のＲＲＳに対し５’に位置付けられる、選択マーカー遺伝子の５’部分をさらに備え、前記第二の核酸は、前記第二のベクター中の前記第三のＲＲＳに対し３’に位置付けられる、前記選択マーカー遺伝子の残りの３’部分をさらに備え、任意で、前記第一のベクター中の前記第三のＲＲＳは、前記選択マーカー遺伝子のイントロンの５’部分内に存在し、前記第二のベクター中の前記第三のＲＲＳは、前記選択マーカー遺伝子のイントロンの３’部分内に存在する、項目３８または３９に記載のベクターセット。
（項目４１）
１つ以上のＲＲＳ、および第二のＬＣＦをコードするヌクレオチドを備える第三のベクターをさらに備える、項目２４に記載のベクターセット。
（項目４２）
前記ＲＲＳを認識するリコンビナーゼを１つ以上コードする第三のベクターをさらに備える、項目２４に記載のベクターセット。
（項目４３）
二特異性抗原結合タンパク質をコードし、細胞の発現強化座位内への統合用の５’相同アームと３’相同アームに隣接される外因性核酸を備えるベクター。
（項目４４）
細胞およびベクターセットを備えるシステムであって、
前記細胞は、５’から３’の方向に、そのゲノムの発現強化座位内に統合された、第一のＲＲＳ、第一の外因性核酸、第三のＲＲＳ、第二の外因性核酸、および第二のＲＲＳを備え、前記３つのＲＲＳは互いに異なり、
前記ベクターセットが、
５’から３’の方向に、前記第一のＲＲＳ、第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を備えた第一の核酸、および前記第三のＲＲＳを備えた第一ベクターと、
前記第三のＲＲＳ、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備えた第二の核酸、および前記第二のＲＲＳを備えた第二のベクターと、を備え、
前記第一の核酸または前記第二の核酸のいずれかは、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに備え、
前記ベクターが前記細胞内に導入されると、前記ベクター中の前記第一および第二の核酸が、前記第一、第二および第三のＲＲＳにより介在される組み換えを介して前記発現強化座位内に統合する、システム。
（項目４５）
前記第一の外因性核酸が、第一の選択マーカー遺伝子を備え、前記第二の外因性核酸が、第二の選択マーカー遺伝子を備え、前記第一と第二の選択マーカー遺伝子は異なる、項目４４に記載のシステム。
（項目４６）
前記第一のベクターが、５’から３’の方向に、前記第一のＲＲＳ、前記第一のＬＣＦを備える前記第一の核酸、および前記第三のＲＲＳを備え、および
前記第二のベクターが、５’から３’の方向に、前記第三のＲＲＳ、前記第二の核酸であって、前記第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列、および前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列の両方を備える第二の核酸、および第二のＲＲＳを備える、項目４４に記載のシステム。
（項目４７）
前記第一のベクターが、５’から３’の方向に、前記第一のＲＲＳ、前記第一のＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列と前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列を備える前記第一の核酸、および前記第三のＲＲＳを備え、
前記第二のベクターが、５’から３’の方向に、前記第三のＲＲＳ、前記第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列を備えた前記第二の核酸、および前記第二のＲＲＳを備える、項目４４に記載のシステム。
（項目４８）
前記第一のベクター中の前記第一の核酸は、前記第三のＲＲＳに対し５’に位置付けられる、選択マーカー遺伝子の５’部分をさらに備え、前記第二のベクター中の前記第二の核酸は、前記第三のＲＲＳに対し３’に位置付けられる、前記選択マーカー遺伝子の残りの３’部分をさらに備える、項目４６または４７に記載のシステム。
（項目４９）
前記第一のベクター中の前記第三のＲＲＳは、前記選択マーカー遺伝子のイントロンの５’部分内に存在し、前記第二のベクター中の前記第三のＲＲＳは、前記選択マーカー遺伝子のイントロンの３’部分内に存在する、項目４８に記載のシステム。
（項目５０）
前記ＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第一のプロモーターに動作可能に連結され、前記第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第二のプロモーターに動作可能に連結され、および前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第三のプロモーターに動作可能に連結され、前記第一、第二、および第三のプロモーターは同一または異なるプロモーターであり、ならびに／または前記プロモーターは、前記選択マーカー遺伝子が動作可能に連結されるプロモーターと同一または異なる、項目４８に記載のシステム。
（項目５１）
前記第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第一のＣＨ３ドメインをコードし、前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第二のＣＨ３ドメインをコードする、項目４４に記載のシステム。
（項目５２）
前記第一および第二のＣＨ３ドメインの内の１つは、ヒトＩｇＧの前記ＣＨ３ドメインであり、他方は、少なくとも１つのアミノ酸位置の改変を備える前記ヒトＩｇＧの改変型ＣＨ３ドメインである、項目５１に記載のシステム。
（項目５３）
前記改変型ＣＨ３ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列は、前記第一のベクター中にある、項目５２に記載のシステム。
（項目５４）
前記改変型ＣＨ３ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列は、前記第二のベクター中にあり、前記非改変型ＣＨ３ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列の上流にある、項目５２に記載のシステム。
（項目５５）
方法であって、
（ｉ）項目４４～５４のいずれか１項に記載のシステムを提供すること、
（ｉｉ）前記細胞内に、前記ベクターを、トランスフェクションにより同時に導入すること、および、
（ｉｉｉ）前記ベクター中の前記第一および第二の核酸が、前記第一、第二、および第三のＲＲＳにより介在される組み換えを介して前記細胞の前記発現強化座位内に統合されたトランスフェクト細胞を選択すること、を含む、方法。
（項目５６）
（ｉｖ）前記選択されたトランスフェクト細胞中の前記第一のＬＣＦ、前記第一のＨＣＦ、および前記第二のＨＣＦを発現させること、および、
（ｖ）前記選択されたトランスフェクト細胞から、前記第一のＬＣＦ、前記第一のＨＣＦ、および前記第二のＨＣＦを備えた前記二特異性抗原結合タンパク質を取得すること、をさらに含む項目５５に記載の方法。
（項目５７）
二特異性抗原結合タンパク質を作製する方法であって、
（ｉ）項目１～２３のいずれか１項に記載の細胞を提供すること、
（ｉｉ）前記外因性核酸配列から、前記二特異性抗原結合タンパク質を発現させること、および
（ｉｉｉ）前記細胞から、前記二特異性抗原結合タンパク質を取得すること、を含む、方法。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
発現強化座位内の特定の部位で統合される外因性核酸を備えた細胞であって、前記外因性核酸配列は二特異性抗原結合タンパク質をコードしている、前記細胞。
（項目２）
前記外因性核酸配列は、第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を備えた第一の外因性核酸、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備えた第二の外因性核酸、および第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備えた第三の外因性核酸を備える、項目１に記載の細胞。
（項目３）
前記第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第一のＣＨ２ドメインおよび第一のＣＨ３ドメインをコードし、前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第二のＣＨ２ドメインおよび第二のＣＨ３ドメインをコードする、項目２に記載の細胞。
（項目４）
前記第一および第二のＣＨ３ドメインが、少なくとも１つのアミノ酸位置で異なっている、項目３に記載の細胞。
（項目５）
前記第一および第二のＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧのＣＨ３ドメインであり、前記２つのＣＨ３ドメインの内の１つが、少なくとも１つのアミノ酸位置で改変され、それにより非改変ＣＨ３ドメインとは異なるプロテインＡ結合特性が生じる、項目３に記載の細胞。
（項目６）
前記第一および第二のＣＨドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記ヌクレオチド配列のうちの１つがコドン改変されているという点で互いに異なっている、項目３に記載の細胞。
（項目７）
前記第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第一のＶＨをコードし、前記第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第二のＶＨをコードする、項目２に記載の細胞。
（項目８）
前記第一のＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第一のＶＬをコードする、項目２に記載の細胞。
（項目９）
前記外因性核酸配列が、第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を備える追加の外因性核酸をさらに備える、項目１に記載の細胞。
（項目１０）
前記第二のＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第二のＶＬをコードする、項目９に記載の細胞。
（項目１１）
前記第一の外因性核酸は、第一のＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列に動作可能に連結された第一のプロモーターをさらに備え、前記第二の外因性核酸は、第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列に動作可能に連結された第二のプロモーターをさらに備え、第三の外因性核酸は、第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列に動作可能に連結された第三のプロモーターを備え、前記第一、第二、および第三のプロモーターは、同一、または異なるプロモーターである、項目２に記載の細胞。
（項目１２）
前記第一の外因性核酸は、前記第二および第三の外因性核酸に対し、上流に配置される、項目２に記載の細胞。
（項目１３）
前記第一の外因性核酸に対し５’に位置付けられた第一のリコンビナーゼ認識部位（ＲＲＳ）、ならびに前記第二および第三の外因性核酸の両方に対し３’に位置付けられた第二のリコンビナーゼ認識部位（ＲＲＳ）をさらに備え、前記第一および第二のＲＲＳは異なる、項目１２に記載の細胞。
（項目１４）
前記第一の外因性核酸に対し３’に、ならびに前記第二および第三の外因性核酸の１つ、または両方に対し５’に位置付けられる第三のＲＲＳをさらに備え、前記第三のＲＲＳは、前記第一および第二のＲＲＳとは異なる、項目１２に記載の細胞。
（項目１５）
選択マーカー遺伝子を備える第四の外因性核酸をさらに備える、項目１３に記載の細胞。
（項目１６）
前記第四の外因性核酸が、第三のＲＲＳをさらに備え、前記第一の外因性核酸に対し３’に位置付けられる、項目１５に記載の細胞。
（項目１７）
前記第二の外因性核酸は、前記第一および第三の外因性核酸に対し、上流に配置される、項目２に記載の細胞。
（項目１８）
前記座位での前記外因性核酸の順序が、５’から３’の方向に、前記第一の外因性核酸、前記第四の外因性核酸、前記第二の外因性核酸、および前記第三の外因性核酸であり、前記第二の外因性核酸は、ヒトＩｇＧの改変型ＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列を備え、前記第三の外因性核酸は、前記ヒトＩｇＧの天然型ＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列を備える、項目１６に記載の細胞。
（項目１９）
前記座位での前記外因性核酸の順序が、５’から３’の方向に、前記第一の外因性核酸、前記第二の外因性核酸、前記第四の外因性核酸、および前記第三の外因性核酸であり、前記第二の外因性核酸は、ヒトＩｇＧの前記天然型ＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列を備え、前記第三の外因性核酸は、前記ヒトＩｇＧの改変型ＣＨ３ドメインをコードするヌクレオチド配列を備える、項目１６に記載の細胞。
（項目２０）
前記第一、第二、および第三のプロモーターが同一のプロモーターであり、前記選択マーカー遺伝子が動作可能に連結される前記プロモーターとは異なる、項目１８または１９に記載の細胞。
（項目２１）
前記二特異性抗原結合タンパク質は、Ｔ細胞抗原および腫瘍細胞抗原に特異的に結合する、項目１に記載の細胞。
（項目２２）
前記強化発現座位は、配列番号１に対し少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を備えた座位、および配列番号２に対し少なくとも９０％同一なヌクレオチド配列を備えた座位からなる群から選択される、項目１に記載の細胞。
（項目２３）
前記細胞が、ＣＨＯ細胞である、項目１～２２のいずれかに記載の細胞。
（項目２４）
５’から３’の方向に、第一のＲＲＳ、第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を備えた第一の核酸、および第三のＲＲＳを備えた第一のベクター、
５’から３’の方向に、前記第三のＲＲＳ、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備えた第二の核酸、および第二のＲＲＳを備えた第二のベクター、を備えたベクターセットであって、
前記第一または前記第二の核酸は、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに備え、ならびに、
前記第一および第二のＨＣＦ、ならびに前記第一のＬＣＦが、二特異性抗原結合タンパク質をコードする、ベクターセット。
（項目２５）
前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記第一の核酸中に含まれる、項目２４に記載のベクターセット。
（項目２６）
前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、前記第一のＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列の上流または下流に配置される、項目２５に記載のベクターセット。
（項目２７）
前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記第二の核酸中に含まれる、項目２４に記載のベクターセット。
（項目２８）
前記第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第一のＣＨ３ドメインをコードし、前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、前記第二のＣＨ３ドメインをコードする、項目２４に記載のベクターセット。
（項目２９）
前記第一および第二のＣＨ３ドメインが、少なくとも１つのアミノ酸位置で異なっている、項目２８に記載のベクターセット。
（項目３０）
前記第一および第二のＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧのＣＨ３ドメインであり、前記２つのＣＨ３ドメインの内の１つが、少なくとも１つのアミノ酸位置で改変され、それにより前記非改変ＣＨ３ドメインとは異なるプロテインＡ結合特性が生じる、項目２８に記載のベクターセット。
（項目３１）
前記第一および第二のＣＨドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記ヌクレオチド配列のうちの１つがコドン改変されているという点で互いに異なっている、項目２８に記載のベクターセット。
（項目３２）
前記第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第一のＶＨをコードし、前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第二の重鎖ＶＨをコードする、項目２４に記載のベクターセット。
（項目３３）
前記第一のＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第一のＶＬをコードする、項目２４に記載のベクターセット。
（項目３４）
第一の軽鎖ＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第一のプロモーターに動作可能に連結され、第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第二のプロモーターに動作可能に連結され、第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第三のプロモーターに動作可能に連結される、項目２４に記載のベクターセット。
（項目３５）
前記第一、第二、および第三のプロモーターは、同一または異なるプロモーターである、項目３４に記載のベクターセット。
（項目３６）
前記第一の核酸は、前記第一のベクター中の前記第三のＲＲＳに対し５’に位置付けられる第二のプロモーターをさらに備え、前記第二の核酸は、前記第二のベクター中の前記第三のＲＲＳに対し３’に位置付けられる前記選択マーカー遺伝子をさらに備える、項目２４に記載のベクターセット。
（項目３７）
前記第一の核酸は、選択マーカー遺伝子の５’部分に対し５’に位置付けられる、前記第一のベクター中の第二のプロモーターをさらに備え、前記第二のベクター中の前記選択マーカーの３’部分は、前記選択マーカー遺伝子の前記５’部分の相同アームに対し３’に存在する、項目２４に記載のベクターセット。
（項目３８）
前記第一のベクターが、５’から３’の方向に、前記第一のＲＲＳ、前記第一の核酸、および前記第三のＲＲＳを備え、
前記第二のベクターが、５’から３’の方向に、前記第三のＲＲＳ、前記第二の核酸を備え、前記第二の核酸は、第一の重鎖またはその断片をコードする前記ヌクレオチド配列、および第二の重鎖またはその断片をコードする前記ヌクレオチド配列を備える、項目２４に記載のベクターセット。
（項目３９）
前記第一のベクターが、５’から３’の方向に、前記第一のＲＲＳ、前記第一の核酸であって、第一のＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列と第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列を備える第一の核酸、および前記第三のＲＲＳを備え、
前記第二のベクターが、５’から３’の方向に、前記第三のＲＲＳ、前記第二の核酸を備え、前記第二の核酸は、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備える、項目２４に記載のベクターセット。
（項目４０）
前記第一の核酸は、前記第一のベクター中の前記第三のＲＲＳに対し５’に位置付けられる、選択マーカー遺伝子の５’部分をさらに備え、前記第二の核酸は、前記第二のベクター中の前記第三のＲＲＳに対し３’に位置付けられる、前記選択マーカー遺伝子の残りの３’部分をさらに備え、任意で、前記第一のベクター中の前記第三のＲＲＳは、前記選択マーカー遺伝子のイントロンの５’部分内に存在し、前記第二のベクター中の前記第三のＲＲＳは、前記選択マーカー遺伝子のイントロンの３’部分内に存在する、項目３８または３９に記載のベクターセット。
（項目４１）
１つ以上のＲＲＳ、および第二のＬＣＦをコードするヌクレオチドを備える第三のベクターをさらに備える、項目２４に記載のベクターセット。
（項目４２）
前記ＲＲＳを認識するリコンビナーゼを１つ以上コードする第三のベクターをさらに備える、項目２４に記載のベクターセット。
（項目４３）
二特異性抗原結合タンパク質をコードし、細胞の発現強化座位内への統合用の５’相同アームと３’相同アームに隣接される外因性核酸を備えるベクター。
（項目４４）
細胞およびベクターセットを備えるシステムであって、
前記細胞は、５’から３’の方向に、そのゲノムの発現強化座位内に統合された、第一のＲＲＳ、第一の外因性核酸、第三のＲＲＳ、第二の外因性核酸、および第二のＲＲＳを備え、前記３つのＲＲＳは互いに異なり、
前記ベクターセットが、
５’から３’の方向に、前記第一のＲＲＳ、第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を備えた第一の核酸、および前記第三のＲＲＳを備えた第一ベクターと、
前記第三のＲＲＳ、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備えた第二の核酸、および前記第二のＲＲＳを備えた第二のベクターと、を備え、
前記第一の核酸または前記第二の核酸のいずれかは、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに備え、
前記ベクターが前記細胞内に導入されると、前記ベクター中の前記第一および第二の核酸が、前記第一、第二および第三のＲＲＳにより介在される組み換えを介して前記発現強化座位内に統合する、システム。
（項目４５）
前記第一の外因性核酸が、第一の選択マーカー遺伝子を備え、前記第二の外因性核酸が、第二の選択マーカー遺伝子を備え、前記第一と第二の選択マーカー遺伝子は異なる、項目４４に記載のシステム。
（項目４６）
前記第一のベクターが、５’から３’の方向に、前記第一のＲＲＳ、前記第一のＬＣＦを備える前記第一の核酸、および前記第三のＲＲＳを備え、および
前記第二のベクターが、５’から３’の方向に、前記第三のＲＲＳ、前記第二の核酸であって、前記第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列、および前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列の両方を備える第二の核酸、および第二のＲＲＳを備える、項目４４に記載のシステム。
（項目４７）
前記第一のベクターが、５’から３’の方向に、前記第一のＲＲＳ、前記第一のＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列と前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列を備える前記第一の核酸、および前記第三のＲＲＳを備え、
前記第二のベクターが、５’から３’の方向に、前記第三のＲＲＳ、前記第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列を備えた前記第二の核酸、および前記第二のＲＲＳを備える、項目４４に記載のシステム。
（項目４８）
前記第一のベクター中の前記第一の核酸は、前記第三のＲＲＳに対し５’に位置付けられる、選択マーカー遺伝子の５’部分をさらに備え、前記第二のベクター中の前記第二の核酸は、前記第三のＲＲＳに対し３’に位置付けられる、前記選択マーカー遺伝子の残りの３’部分をさらに備える、項目４６または４７に記載のシステム。
（項目４９）
前記第一のベクター中の前記第三のＲＲＳは、前記選択マーカー遺伝子のイントロンの５’部分内に存在し、前記第二のベクター中の前記第三のＲＲＳは、前記選択マーカー遺伝子のイントロンの３’部分内に存在する、項目４８に記載のシステム。
（項目５０）
前記ＬＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第一のプロモーターに動作可能に連結され、前記第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第二のプロモーターに動作可能に連結され、および前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第三のプロモーターに動作可能に連結され、前記第一、第二、および第三のプロモーターは同一または異なるプロモーターであり、ならびに／または前記プロモーターは、前記選択マーカー遺伝子が動作可能に連結されるプロモーターと同一または異なる、項目４８に記載のシステム。
（項目５１）
前記第一のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第一のＣＨ３ドメインをコードし、前記第二のＨＣＦをコードする前記ヌクレオチド配列は、第二のＣＨ３ドメインをコードする、項目４４に記載のシステム。
（項目５２）
前記第一および第二のＣＨ３ドメインの内の１つは、ヒトＩｇＧの前記ＣＨ３ドメインであり、他方は、少なくとも１つのアミノ酸位置の改変を備える前記ヒトＩｇＧの改変型ＣＨ３ドメインである、項目５１に記載のシステム。
（項目５３）
前記改変型ＣＨ３ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列は、前記第一のベクター中にある、項目５２に記載のシステム。
（項目５４）
前記改変型ＣＨ３ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列は、前記第二のベクター中にあり、前記非改変型ＣＨ３ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列の上流にある、項目５２に記載のシステム。
（項目５５）
方法であって、
（ｉ）項目４４～５４のいずれか１項に記載のシステムを提供すること、
（ｉｉ）前記細胞内に、前記ベクターを、トランスフェクションにより同時に導入すること、および、
（ｉｉｉ）前記ベクター中の前記第一および第二の核酸が、前記第一、第二、および第三のＲＲＳにより介在される組み換えを介して前記細胞の前記発現強化座位内に統合されたトランスフェクト細胞を選択すること、を含む、方法。
（項目５６）
（ｉｖ）前記選択されたトランスフェクト細胞中の前記第一のＬＣＦ、前記第一のＨＣＦ、および前記第二のＨＣＦを発現させること、および、
（ｖ）前記選択されたトランスフェクト細胞から、前記第一のＬＣＦ、前記第一のＨＣＦ、および前記第二のＨＣＦを備えた前記二特異性抗原結合タンパク質を取得すること、をさらに含む項目５５に記載の方法。
（項目５７）
二特異性抗原結合タンパク質を作製する方法であって、
（ｉ）項目１～２３のいずれか１項に記載の細胞を提供すること、
（ｉｉ）前記外因性核酸配列から、前記二特異性抗原結合タンパク質を発現させること、および
（ｉｉｉ）前記細胞から、前記二特異性抗原結合タンパク質を取得すること、を含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【0044】
【図1】図１ 発現強化座位内への統合を目的とした二特異性クローニング戦略の例。たとえば共通軽鎖などの軽鎖（ＬＣ）ベクターと、二重重鎖（ＨＣ）ベクター（「＊」がある場合、その２つのＨＣは異なっていることを示しており、たとえばＨＣ＊は、ＣＨ３ドメイン中に改変を含み、および／またはコドン改変されている）は、対象抗体の可変領域を適切なベクター内にクローニングすることにより作製される。ＬＣベクターの３’ＲＲＳ部位と、二重ＨＣベクターの５’ＲＲＳ部位は同一であり、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子の分割イントロン中に含まれる。ハイグロマイシン抵抗性遺伝子の分割イントロンは、効率的な組換え体の選択のために、結合し、イントロンを除去して、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子にコードされるタンパク質が発現されるように操作されている。矢印はプロモーターを表している。
【0045】
【図2】図２ 発現強化座位内への統合を目的とした二特異性クローニング戦略の例。５’ＲＲＳ（ＲＲＳ１）を有するユニバーサル軽鎖（たとえば、ＷＯ２０１３０２２７８２に記載されているヒト化ユニバーサル軽鎖（ＵＬＣ：Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｌｉｇｈｔ Ｃｈａｉｎ）ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ（登録商標）マウス由来の軽鎖を参照）を利用することで、ユニバーサル軽鎖用の発現カセットを含有する既存のプラスミド内に、第三のＲＲＳ（ＲＲＳ３）に隣接される１つの重鎖（ＨＣ＊）を挿入することによる新規二特異性抗体の効率的な構築が可能となる。第二の重鎖（ＨＣ）は、ＲＲＳ２部位とＲＲＳ３部位を有する第二のプラスミド内にクローニングされる。
【0046】
【図3】図３ 発現強化座位内への統合を目的とした二特異性クローニング戦略の例。二特異性抗体の３つの別個の抗体鎖（ＡｂＣ１、ＡｂＣ２、およびＡｂＣ３）はまずはじめに個々のベクターにクローニングされる。ＡｂＣ１ベクターとＡｂＣ３ベクターは各々、抗体発現カセットに隣接するＲＲＳ部位を有している。ＡｂＣ２用の発現カセットは、ＡｂＣ２プラスミドから切り出され、次いで、ＡｂＣ３発現プラスミド内にサブクローニングされる。それにより、５’から３’の方向に、ＲＲＳ３部位、ＡｂＣ２発現カセット、ＡｂＣ３発現カセット、およびＲＲＳ２部位を含有するプラスミドが生じる。このプラスミドが、ＡｂＣ１プラスミドおよびリコンビナーゼとともに、発現強化座位中にＲＲＳ１とＲＲＳ２を担持する宿主細胞内に導入される。二特異性抗体発現細胞株は、リコンビナーゼ介在カセット交換の後に単離される。
【0047】
【図4】図４ 発現強化座位内への統合を目的とした二特異性クローニング戦略の例。二特異性抗体の３つの別個の抗体鎖（ＡｂＣ１、ＡｂＣ２、およびＡｂＣ３）はまずはじめに個々のベクターにクローニングされる。ＡｂＣ１ベクターとＡｂＣ３ベクターは各々、抗体発現カセットに隣接するＲＲＳ部位を有している。ＡｂＣ２用の発現カセットは、ＡｂＣ２プラスミドから切り出され、次いで、ＡｂＣ１発現プラスミド内にサブクローニングされる。それにより、５’から３’の方向に、ＲＲＳ１部位、ＡｂＣ１発現カセット、ＡｂＣ２発現カセット、およびＲＲＳ３部位を含有するプラスミドが生じる。このプラスミドが、ＡｂＣ３プラスミドおよびリコンビナーゼとともに、発現強化座位中にＲＲＳ１とＲＲＳ２を担持する宿主細胞内に導入される。二特異性抗体発現細胞株は、リコンビナーゼ介在カセット交換の後に単離される。
【0048】
【発明を実施するための形態】
【0049】
用語の定義
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、４つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合によって相互結合した２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖から構成されるイムノグロブリン分子を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本発明においてＨＣＶＲまたはＶＨと省略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の３つのドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本発明においてＬＣＶＲまたはＶＬと省略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）を含む。ＶＨ領域およびＶＬ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分化することができ、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存的な領域に割り込まれている。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲによって構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで、以下の順序で配列される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４（重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３として省略されてもよく、軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３として省略されてもよい）。
「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、４つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合によって相互結合した２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖から構成されるイムノグロブリン分子を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本発明においてＨＣＶＲまたはＶＨと省略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の３つのドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本発明においてＬＣＶＲまたはＶＬと省略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）を含む。ＶＨ領域およびＶＬ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分化することができ、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存的な領域に割り込まれている。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲによって構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで、以下の順序で配列される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４（重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３として省略されてもよく、軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３として省略されてもよい）。
【0050】
「抗原結合タンパク質」という文言は、少なくとも１つのＣＤＲを有するタンパク質を含み、抗原を選択的に認識することができる。すなわち、少なくともマイクロモル単位のＫＤで抗原に結合することができる。治療用抗原結合タンパク質（たとえば治療用抗体）はしばしば、ナノモルまたはピコモル単位のＫＤを必要とする。典型的には、抗原結合タンパク質は２個以上のＣＤＲ、たとえば２個、３個、４個、５個、または６個のＣＤＲを含む。抗原結合タンパク質の例としては、抗体、たとえば抗体の重鎖と軽鎖の可変領域を含有するポリペプチドなどの抗体の抗原結合断片（たとえば、Ｆａｂ断片（Ｆ（ａｂ’）２断片）、抗体の重鎖と軽鎖の可変領域と、重鎖および／または軽鎖の定常領域由来の追加アミノ酸（たとえば１個以上の定常ドメイン、すなわち、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインのうちの１つ以上）を含有するタンパク質が挙げられる。
【0051】
「二特異性抗原結合タンパク質」という文言は、２個の異なる分子（たとえば抗原）上、または同じ分子上（たとえば同じ抗原上）のいずれかの２個以上のエピトープに対して、選択的に結合することができる、または異なる特異性を有する抗原結合タンパク質を含む。かかるタンパク質の抗原結合部分、または抗原結合断片部分（Ｆａｂ）は、特定の抗原に対する特異性をもたらし、典型的にはイムノグロブリンの重鎖可変領域と軽鎖可変領域から構成される。一部の環境下では、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、同系ペアではない場合があり、言い換えれば異なる結合特異性を有する場合がある。
【0052】
二特異性抗原結合タンパク質の例は、「二特異性抗体」であり、これには２個以上のエピトープに選択的に結合することができる抗体が含まれる。二特異性抗体は、多くの場合、２個の異なる重鎖を備え、各重鎖は２個の異なる分子（例えば抗原）上、または同じ分子上（例えば同じ抗原上）のいずれかの異なるエピトープに特異的に結合する。二特異性抗原結合タンパク質が、２つの異なるエピトープ（第一のエピトープと第二のエピトープ）に選択的に結合することができる場合、第一のエピトープに対する第一重鎖の可変領域のアフィニティは概して、第二のエピトープに対する第一重鎖の可変領域のアフィニティよりも少なくとも１～２桁、または３桁もしくは４桁低く、その逆もまた然りである。二特異性抗原結合タンパク質、たとえば二特異性抗体は、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖可変領域を含んでもよい。典型的な二特異性抗体は、２つの重鎖を有しており、その重鎖は各々、３つの重鎖ＣＤＲを有し、それに続けて（Ｎ末端からＣ末端方向に）ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを有している。また典型的な二特異性抗体は、イムノグロブリン軽鎖を有しており、そのイムノグロブリン軽鎖は、抗原結合特異性を付与しないが、各重鎖と会合可能であるか、または各重鎖と会合可能でありかつ重鎖抗原結合領域に結合するエピトープの１つ以上を結合させることができるか、または各重鎖と会合可能でありかつ重鎖の一方もしくは両方をエピトープの一方もしくは両方に結合させることができる。１つの実施形態では、Ｆｃドメインは少なくともＣＨ２とＣＨ３を含む。Ｆｃドメインは、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含んでもよい。
【0053】
ある具現化された二特異性形式は、第一重鎖（ＨＣ）、改変ＣＨ３（ＨＣ＊）を有する第二重鎖、および共通軽鎖（ＬＣ）（２コピーの同一軽鎖）を含む。別の実施形態では、第一重鎖（ＨＣ）、共通ＬＣ、およびＨＣ－ＳｃＦｖ融合ポリペプチドを含む（この場合、第二ＨＣは、ＳｃＦｖのＮ末端に融合されている）。別の実施形態では、第一重鎖（ＨＣ）、同系ＬＣ、ＨＣ－ＳｃＦｖ融合ポリペプチドを含む（この場合、第二ＨＣは、ＳｃＦｖのＮ末端に融合されている）。別の実施形態では、第一重鎖（ＨＣ）、ＬＣおよびＦｃドメインを含む。別の実施形態では、第一ＨＣ、ＬＣ、ＳｃＦｖ－Ｆｃ融合ポリペプチドを含む（この場合、Ｆｃは、ＳｃＦｖのＣ末端に融合されている）。別の実施形態では、第一ＨＣ、共通ＬＣ、およびＦｃ－ＳｃＦｖ融合ポリペプチドを含む（この場合、Ｆｃは、ＳｃＦｖのＮ末端に融合されている）。別の実施形態では、第一ＨＣ、ＬＣ、およびＳｃＦｖ－ＨＣを含む（この場合、第二ＨＣは、ＳｃＦｖのＣ末端に融合されている）。
【0054】
ある実施形態では、１つの重鎖（ＨＣ）は、天然型または「野生型」の配列であってもよく、第二重鎖は、Ｆｃドメインが改変されていてもよい。他の実施形態では、１つの重鎖（ＨＣ）は、天然型または「野生型」の配列であってもよく、第二重鎖は、コドン改変されていてもよい。
【0055】
「細胞」という用語は、組み換え型核酸配列の発現に適しており、外因性核酸の安定した統合および強化された発現を可能とする座位を有する任意の細胞を含む。細胞としては、たとえば非ヒト動物細胞、ヒト細胞、または細胞融合、例えば、ハイブリドーマまたはクアドローマなどの哺乳類細胞が挙げられる。一部の実施形態では、細胞はヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、またはマウス細胞である。一部の実施形態では、細胞は、以下の細胞から選択される哺乳類細胞である：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ－１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ－７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ ８０６５、ＨＬ－６０、（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ－１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、ＭＭＴ ０６０５６２、セルトリ細胞、ＢＲＬ ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、および前述細胞から派生する細胞株。一部の実施形態では、細胞は、一つ以上のウイルス遺伝子、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６ＴＭ細胞）を備えている。
【0056】
「細胞密度」とは、サンプル体積当たりの細胞数を指し、たとえば１ｍＬ当たりの細胞総数（生細胞および死細胞）である。細胞数は、手作業で、またはたとえばフローサイトメーターを用いて自動で計数されてもよい。自動細胞カウンターは、トリパンブルー取り込み標準法などを使用して、生細胞または死細胞または生／死細胞の両方を計数するよう適合されている。「生細胞密度」または「生細胞濃度」という文言は、サンプル体積当たりの生細胞数を指す（「生細胞数」とも呼称される）。多くの公知の手を用いた技術または自動化された技術を使用して細胞密度を決定してもよい。培養物のオンラインバイオマス測定が計測されてもよく、キャパシタンスまたは光学的密度が体積当たりの細胞数と相関している。たとえば製造培養などの細胞培養中の最終細胞密度は、開始細胞株に応じて、たとえば約１．０～１０ｘ１０６細胞／ｍＬの範囲で変化する。一部の実施形態では、最終細胞密度は、製造細胞培養から対象タンパク質を採取する前に１．０～１０ｘ１０６細胞／ｍＬに達する。他の実施形態では、最終細胞密度は、少なくとも５．０ｘ１０６細胞／ｍＬ、少なくとも６ｘ１０６細胞／ｍＬ、少なくとも７ｘ１０６細胞／ｍＬ、少なくとも８ｘ１０６細胞／ｍＬ、少なくとも９ｘ１０６細胞／ｍＬ、または少なくとも１０ｘ１０６細胞／ｍＬに達する。
【0057】
「コドン改変された」という用語は、タンパク質コードヌクレオチド配列が、１つ以上のヌクレオチド、すなわち１つ以上のコドンで、そのコドンにコードされるアミノ酸を変化させることなく改変され、当該ヌクレオチド配列のコドン改変型を生じさせることを意味する。ヌクレオチド配列のコドン改変は、核酸系アッセイ（たとえばとくにハイブリダイゼーション系アッセイ、ＰＣＲなど）において、そのコドン改変型からヌクレオチド配列を識別する簡便な基盤を提供することができる。一部の例では、当分野に公知のコドン最適化技術を使用することにより、コードされたタンパク質の宿主細胞中の発現が改善または最適化されるようにヌクレオチド配列のコドンが改変される（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２２：３４６－３５３；Ｃｈｕｎｇ，Ｂ．Ｋ．－Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６７：３２６－３３３；Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ，８３（１）：３７－４６）。かかる技術を使用した配列設計ソフトウェアツールも当分野に公知であり、限定されないが、とくにＣｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ（Ｆｕｇｌｓａｎｇ Ａ．２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ，３１：２４７－２４９）、Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓ Ａ，ｅｔ ａｌ．，２００６，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａ，７：２８５）、およびＯＰＴＩＭＩＺＥＲ（Ｐｕｉｇｂｏ
Ｐ，ｅｔ ａｌ．２００７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５：Ｗ１２６－Ｗ１３１）が挙げられる。
Ｐ，ｅｔ ａｌ．２００７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５：Ｗ１２６－Ｗ１３１）が挙げられる。
【0058】
「相補性決定領域」という文言または「ＣＤＲ」という用語には、生物体のイムノグロブリン遺伝子の核酸配列にコードされるアミノ酸配列が含まれ、該アミノ酸配列は通常（すなわち、野生型動物では）、イムノグロブリン分子（例えば、抗体またはＴ細胞受容体）の軽鎖または重鎖の可変領域中の２つのフレームワーク領域の間に存在する。ＣＤＲは、例えば生殖細胞系の配列または再構成配列もしくは非再構成配列によってコードされ、例えば、ナイーヴＢ細胞もしくは成熟Ｂ細胞またはＴ細胞によってコードされ得る。一部の環境下（例えば、ＣＤＲ３に関して）では、ＣＤＲは２つ以上の配列（例えば、生殖細胞系配列）によりコードすることができ、その２つ以上の配列は（例えば、非再構成核酸配列においては）連続していないが、配列のスプライシングまたは連結（例えば、重鎖ＣＤＲ３を形成するためのＶ－Ｄ－Ｊ再構成）の結果として、Ｂ細胞核酸配列では連続している。
【0059】
「発現強化座位」という用語は、細胞ゲノム中の座位を指し、当該座位は、配列を含有し、当該配列中に、または当該配列の近くに適切な遺伝子または構築物が外生的に加えられた（すなわち統合された）場合に、または当該配列に「動作可能に連結された」場合に、ゲノム中の他の領域または配列と比較して高い発現レベルを示す。
【0060】
発現強化を記載するために使用される場合、「強化された」という用語は、ゲノム中に外因性配列が無作為に統合されたことにより、または別の座位に統合されたことにより通常観察される発現よりも、たとえば同じ発現構築物の単一コピーのさまざまな無作為統合物と比較して、少なくとも約１．５倍～少なくとも約３倍の発現強化を含む。本発明配列を使用して観察された倍数発現強化は、同じ遺伝子の発現レベルとの比較であり、本発明配列が非存在下で、実質的に同じ条件下で測定され、たとえば同種ゲノム内に別の座位で統合された場合と比較している。強化組み換え効率は、座位の組み換え能力（例えば、リコンビナーゼ認識部位（ＲＲＳ）の利用）の強化を含む。強化とは、無作為組み換えを越える組み換え効率を指し、たとえばリコンビナーゼ認識部位または同種物を利用しない場合は通常、０．１％である。好ましい強化組み換え効率は、無作為の約１０倍であり、または約１％である。特定されない限り、特許請求される発明は特定の組み換え効率に限定されない。発現強化座位は多くの場合、宿主細胞による対象タンパク質の高い生産性を支持する。ゆえに強化発現には、単純に培養中の細胞のコピー数が多いことによって高い力価を得ることよりも、細胞当たりの対象タンパク質の産生が高いことを含む（タンパク質１グラム当たりの力価が高い）。特異的生産性Ｑｐ（ｐｇ／細胞／日、すなわちｐｃｄ）は、持続可能な生産性の測定とみなされる。５ｐｃｄよりも高い、１０ｐｃｄよりも高い、または１５ｐｃｄよりも高い、または２０ｐｃｄよりも高い、または２５ｐｃｄよりも高い、またはさらに３０ｐｃｄよりも高いＱｐを示す組み換え宿主細胞が望ましい。発現強化座位または「ホットスポット」に対象遺伝子が挿入された宿主細胞は、高い特異的生産性を示す。
【0061】
「外生的に加えられた遺伝子」、「外生的に加えられた核酸」、または単純に「外因性核酸」という文言が、対象座位に関連して使用された場合、当該文言は、当該座位が自然界に存在する場合には対象座位内に存在しない任意のＤＮＡ配列または遺伝子を指す。たとえば、ＣＨＯ座位（たとえば、配列番号１または配列番号２の配列を備えた座位）内の「外因性核酸」は、自然界の特定のＣＨＯ座位内には存在しないハムスターの遺伝子（すなわち、ハムスターゲノムの別の座位に由来するハムスター遺伝子）、任意の他の種に由来する遺伝子（たとえば、ヒトの遺伝子）、キメラ遺伝子（たとえば、ヒト／マウス）、または自然界でＣＨＯ座位内に存在することが判明していない任意の他の遺伝子であってもよい。
【0062】
「重鎖」または「イムノグロブリン重鎖」という文言には、任意の生物体由来のイムノグロブリン重鎖定常領域配列が含まれ、特別の規定がない限り、重鎖可変ドメインが含まれる。特別の規定がない限り、重鎖可変ドメインには、３つの重鎖ＣＤＲと４つのＦＲ領域とが含まれる。典型的な重鎖は、可変ドメインに続いて（Ｎ末端からＣ末端方向に）、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを備える。「重鎖の断片」または「重鎖断片」（本明細書において「ＨＣＦ」とも呼称される）という用語は、重鎖の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上のアミノ酸のペプチドを含み、１つ以上のＣＤＲ、１つ以上のＦＲと組み合わされた１つ以上のＣＤＲ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２もしくはＣＨ３、可変領域、定常領域、定常領域の断片（たとえば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含んでもよい。ＨＣＦの例としては、ＶＨｓ、およびＦｃ領域のすべて、または一部が挙げられる。「ＨＣＦをコードするヌクレオチド配列」という文言は、ＨＣＦからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、ＨＣＦを含有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、たとえば、特定のＨＣＦに加えて追加アミノ酸を含有し得るポリペプチドを含む。たとえば、ＨＣＦをコードするヌクレオチド配列はとくに、ＶＨからなるポリペプチド、ＣＨ３に連結されたＶＨからなるポリペプチド、全長重鎖からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【0063】
核酸配列に関する文脈において「相同配列」とは、参照核酸配列に対し、実質的に相同な配列を指す。一部の実施形態では、二つの配列は、残基の関連する区間に渡って、その対応ヌクレオチドの少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が同一の場合、実質的に相同であるとみなされる。一部の実施形態では、関連する区間は完全（すなわち、全長）配列である。
【0064】
「軽鎖」という文言には、任意の生物体由来のイムノグロブリン軽鎖定常領域配列が含まれ、別段の規定がない限り、ヒトカッパ軽鎖およびヒトラムダ軽鎖が含まれる。軽鎖可変（ＶＬ）ドメインには、特別の規定がない限り、３つの軽鎖ＣＤＲと４つのフレームワーク（ＦＲ）領域が含まれるのが典型的である。一般に、完全長軽鎖には、アミノ末端からカルボキシル末端の方向に、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を含むＶＬドメインと、軽鎖定常ドメインとが含まれる。本発明で使用可能な軽鎖には、例えば、二特異性抗体に選択的に結合される第一エピトープまたは第二エピトープのいずれにも選択的に結合しない軽鎖が含まれる。また、適切な軽鎖として、抗体の抗原結合領域に結合される１つまたは両方のエピトープに結合することができる、または結合に寄与することができる軽鎖が挙げられる。「軽鎖の断片」または「軽鎖断片」（または「ＬＣＦ」）という文言は、軽鎖の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上のアミノ酸のペプチドを含み、１つ以上のＣＤＲ、１つ以上のＦＲ、可変領域、定常領域、定常領域の断片またはそれらの組み合わせと組み合わされた１つ以上のＣＤＲを含んでもよい。ＬＣＦの例としては、ＶＬｓおよび軽鎖定常領域（ＣＬｓ）の全部または一部が挙げられる。「ＬＣＦをコードするヌクレオチド配列」という文言は、ＬＣＦからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、ＬＣＦを含有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、たとえば、特定のＬＣＦに加えて追加アミノ酸を含有し得るポリペプチドを含む。たとえば、ＬＣＦをコードするヌクレオチド配列はとくに、ＶＬからなるポリペプチド、または全長軽鎖からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【0065】
「動作可能に連結された」という文言は、連結された分子が意図されるように機能する様式での、核酸またはタンパク質の連結を指す。相互に機能的に関係しているとき、ＤＮＡ領域は動作可能に連結される。例えば、プロモーターが配列の転写に参画する能力を有す場合、プロモーターはコード配列に動作可能に連結し；リボソーム結合部位は、翻訳を許容するように位置する場合、コード配列に動作可能に連結する。一般的に、動作可能に連結しているとは、連続性を含むことができるが、連続性を必要としない。分泌リーダーなどの配列の場合には、連続性およびリーディングフレーム内での適正な配置は典型的な特徴である。対象座位の発現強化配列は、対象遺伝子（ＧＯＩ）と機能的に関連付けられている場合、例えば、その存在が結果としてＧＯＩの発現の強化をもたらす場合、ＧＯＩに動作可能に連結されている。
【0066】
「同一性割合」とは、対象座位、たとえば配列番号１または配列番号２またはそれらの断片を記載する場合、連続相同領域に沿って同一性の列挙を示す相同性配列を含むことを意味するが、比較配列中の相同性が無いギャップ、欠失、または挿入は、同一性割合の算出に考慮されない。
【0067】
本明細書に使用される場合、たとえば配列番号１またはその断片と種ホモログの間の「同一性割合」の決定は、その種ホモログが、アライメントにおいて比較を行うための相同配列を有していない配列の比較は含まない（すなわち、配列番号１またはその断片が、その点で挿入を有しているか、または場合によっては種ホモログがギャップまたは欠失を有している配列の比較は含まない）。ゆえに「同一性割合」は、ギャップ、欠失および挿入のペナルティを含まない。
【0068】
「認識部位」または「認識配列」は、ヌクレアーゼに認識される特定のＤＮＡ配列、またはＤＮＡ骨格に結合し、部位特異的切断を指示する他の酵素により認識される特定のＤＮＡ配列である。エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子内でＤＮＡを切断する。認識部位は当分野において、認識標的部位とも呼称される。
【0069】
「リコンビナーゼ認識部位」（「ＲＲＳ」）は、たとえばＣｒｅリコンビナーゼ（Ｃｒｅ）またはフリッパーゼ（ｆｌｐ）などのリコンビナーゼにより認識される特定のＤＮＡ配列である。部位特異的リコンビナーゼは、その標的認識配列のうちの１つ以上が生物ゲノム内に戦略的に配置された場合、欠失、転位、および転座を含むＤＮＡ再構成を実行することができる。１つの例では、Ｃｒｅは、そのＤＮＡ標的認識部位であり、８ｂｐのスペーサーにより分離される２個の１３ｂｐの逆位リピートから構成されるｌｏｘＰで、組み換え事象を特異的に介在する。２つ以上のリコンビナーゼ認識部位を使用して、たとえば組み換え介在性のＤＮＡ交換を促進することができる。リコンビナーゼ認識部位、たとえばｌｏｘ部位などの多様体または変異体を使用してもよい（Ａｒａｋｉ，Ｎ．ｅｔ ａｌ，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３０：１９，ｅ１０３）。
【0070】
「リコンビナーゼ介在性カセット交換」または「ＲＭＣＥ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｅｘｃｈａｎｇｅ）」は、ゲノム標的カセットを、ドナーカセットと正確に置換させるプロセスに関する。このプロセスを実行するために通常提供される分子構成は、１）特定のリコンビナーゼに対し特異的な認識標的部位により、５’と３’の両方に隣接されたゲノム標的カセット、２）認識標的部位を合致させることにより隣接されたドナーカセット、および３）部位特異的リコンビナーゼ、を含む。リコンビナーゼタンパク質は当分野に公知であり（Ｔｕｒａｎ，Ｓ．ａｎｄ Ｂｏｄｅ Ｊ．，２０１１，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，２５，ｐｐ．４０８８－４１０７）、ヌクレオチドを付加または欠失させることなく、特定の認識標的部位（ＤＮＡ配列）内で、ＤＮＡを正確に切断することが可能である。普遍的なリコンビナーゼ／部位の組み合わせとしては、限定されないが、Ｃｒｅ／ｌｏｘおよびＦｌｐ／ｆｒｔが挙げられる。ＲＭＣＥ用の、Ｒ４－ａｔｔＰ 部位を含有するベクターと、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼをコードするベクターは、市販のキットでも提供される。（たとえば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０００４９４６号も参照のこと）
【0071】
「部位特異的統合」または「標的挿入」とは、ゲノム中の特定の位置への遺伝子もしくは核酸配列の挿入または統合を指示する、すなわち、連続ポリヌクレオチド鎖中の２つのヌクレオチド間の特定の部位へＤＮＡを移動させるために使用される遺伝子標的化方法を指す。部位特異的な統合または標的挿入は、複数の発現単位またはカセット、たとえば各々自身の制御因子（たとえばプロモーター、エンハンサー、および／または転写終結配列など）を有する複数の遺伝子を含む特定の核酸に対し行われてもよい。「挿入」と「統合」は相互交換可能に使用される。遺伝子または核酸配列（たとえば発現カセットを備えた核酸配列）の挿入は、使用された遺伝子編集技術に応じて１つ以上の核酸の置換または欠失が生じ得る（またはそのように操作され得る）と理解されている。
【0072】
「安定した統合」とは、宿主細胞ゲノム中に統合された外因性核酸が、細胞培養において、たとえば少なくとも７日、少なくとも１０日、少なくとも１５日、少なくとも２０日、少なくとも２５日、少なくとも３０日、少なくとも３５日、少なくとも４０日、少なくとも４５日、少なくとも５０日、少なくとも５５日、少なくとも６０日、またはそれ以上の長期間、統合状態を維持することを意味する。大規模な製造および精製を目的とした、二特異性抗原結合タンパク質の製造は難題であると理解されている。安定性およびクローン性は、任意の生物分子、とくに治療用に使用される生物分子の再現性にとって必須である。本開示方法により作製される、二特異性抗体を発現する安定クローンは、治療用生物分子生成のための一貫性と再現性のある手段を提供する。
【0073】
概要
本開示は、宿主細胞中の発現強化座位を使用することによる、宿主細胞、とくにチャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）細胞株における複数のポリペプチドの発現改善のための組成物および方法を提供する。より具体的には、本開示は、二特異性抗原結合タンパク質をともにコードする複数の外因性核酸を、たとえばＣＨＯ細胞などの宿主細胞中の発現強化座位内に統合するよう設計された組成物および方法を提供する。特に本開示は、発現強化座位内の特定の部位で統合された複数の外因性核酸を含有する細胞を提供するものであり、当該複数の外因性核酸はともに二特異性抗原結合タンパク質をコードしている。本開示はさらに、発現強化座位内への複数の外因性核酸の部位特異的な統合を目的として設計された核酸ベクターを提供する。本開示は、２個以上のリコンビナーゼ認識部位（ＲＲＳ）を含有する宿主細胞、および合致ＲＲＳと複数の外因性核酸を含有するベクターのセットを含む、当該複数の外因性核酸を、当該ベクターから発現強化座位内に部位特異的に統合することを目的としたシステムをさらに提供する。さらに本開示は、本明細書に開示される細胞、ベクター、およびシステムを使用して二特異性抗原結合タンパク質を作製する方法を提供する。
本開示は、宿主細胞中の発現強化座位を使用することによる、宿主細胞、とくにチャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）細胞株における複数のポリペプチドの発現改善のための組成物および方法を提供する。より具体的には、本開示は、二特異性抗原結合タンパク質をともにコードする複数の外因性核酸を、たとえばＣＨＯ細胞などの宿主細胞中の発現強化座位内に統合するよう設計された組成物および方法を提供する。特に本開示は、発現強化座位内の特定の部位で統合された複数の外因性核酸を含有する細胞を提供するものであり、当該複数の外因性核酸はともに二特異性抗原結合タンパク質をコードしている。本開示はさらに、発現強化座位内への複数の外因性核酸の部位特異的な統合を目的として設計された核酸ベクターを提供する。本開示は、２個以上のリコンビナーゼ認識部位（ＲＲＳ）を含有する宿主細胞、および合致ＲＲＳと複数の外因性核酸を含有するベクターのセットを含む、当該複数の外因性核酸を、当該ベクターから発現強化座位内に部位特異的に統合することを目的としたシステムをさらに提供する。さらに本開示は、本明細書に開示される細胞、ベクター、およびシステムを使用して二特異性抗原結合タンパク質を作製する方法を提供する。
【0074】
発現強化座位内の特定の部位で統合された複数の外因性核酸を有する細胞
１つの態様において、本開示は、発現強化座位内の特定の部位で統合される外因性核酸を含有する細胞を提供するものであり、当該外因性核酸配列は二特異性抗原結合タンパク質をコードしている。
１つの態様において、本開示は、発現強化座位内の特定の部位で統合される外因性核酸を含有する細胞を提供するものであり、当該外因性核酸配列は二特異性抗原結合タンパク質をコードしている。
【0075】
本明細書に提供される細胞は、高い力価および／または高い特異的生産性（ｐｇ／細胞／日）で、二特異性抗原結合タンパク質（たとえば二特異性抗体）を産生することができる。一部の実施形態では、細胞は、少なくとも５ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ、２５ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ、３５ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ、４５ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌまたはそれ以上の力価で、二特異性抗原結合タンパク質を産生する。一部の実施形態では、細胞は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％またはそれ以上の、総抗原結合タンパク質力価に対する二特異性抗原結合タンパク質力価の比率で、二特異性抗原結合タンパク質を産生する。一部の実施形態では、二特異性抗原結合タンパク質を産生する細胞は、１日当たり、１細胞当たりで産生される総抗原結合タンパク質（ｐｇ）に基づき決定される、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５ピコグラム／細胞／日（ｐｃｄ）またはそれ以上の特異的生産性を有する。
【0076】
発現強化座位内の特定の部位に統合された二特異性抗原結合タンパク質をコードする外因性核酸配列を備えた宿主細胞は、たとえば１～１０ｘ１０６細胞／ｍＬなど、製造培養において高い細胞密度を示す。他の実施形態では、二特異性抗原結合タンパク質をコードする宿主細胞は、少なくとも５ｘ１０６細胞／ｍＬ、６ｘ１０６細胞／ｍＬ、７ｘ１０６細胞／ｍＬ、８ｘ１０６細胞／ｍＬ、９ｘ１０６細胞／ｍＬ、または１０ｘ１０６細胞／ｍＬの最終細胞密度を有する。
【0077】
一部の実施形態では、二特異性抗原結合タンパク質は、異なる抗原特異性を有する２つのＨＣ断片（ＨＣＦ）と、２つのＬＣＦを含有する。２つのＶＬ領域が使用される場合において、その２つのＶＬ領域は同一であっても、異なってもよい。特定の実施形態では、２つのＶＬ領域は同一であり、たとえば共通軽鎖である。
【0078】
一部の実施形態では、２つのＨＣＦの各々は、たとえばＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３などの重鎖定常領域由来のアミノ酸を含む。特定の実施形態では、２つのＨＣＦの各々は、ＣＨ３ドメインを含む。特定の実施形態では、２つのＨＣＦの各々は、定常領域を含み、すなわち定常領域全長を含む。
【0079】
一部の実施形態では、２つのＨＣＦの各々は、ＶＨを含み、その２つのＶＨは、同一であっても、異なってもよい。
【0080】
一部の実施形態では、二特異性抗原結合タンパク質は、２つの重鎖（すなわち、２つの全長重鎖）を含む。
【0081】
一部の実施形態では、２つのＬＣＦの各々は、ＶＬを含む。特定の実施形態では、各ＬＣＦはＶＬ領域からなり、ＶＬ領域は、軽鎖定常領域由来のアミノ酸を含むアミノ酸配列に動作可能に連結されている。特定の実施形態では、各ＶＬ領域はＣＬ領域に動作可能に連結されている。すなわち二特異性抗原結合タンパク質は、軽鎖（すなわち、全長軽鎖）を含む。
【0082】
一部の実施形態では、発現強化座位内に統合された外因性核酸配列は、第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を含有する第一の外因性核酸、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を含有する第二の外因性核酸、および第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を含有する第三の外因性核酸を含む。
【0083】
一部の実施形態では、第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、軽鎖可変（ＶＬ）領域配列をコードしてもよい。特定の実施形態では、第一のＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列は、第一の軽鎖をコードする。
【0084】
一部の実施形態では、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一の重鎖定常領域（たとえば、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインの内の１つ以上）由来のアミノ酸をコードし、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第二の重鎖定常領域由来のアミノ酸をコードする。第一の重鎖定常領域由来のアミノ酸は、第二の重鎖定常領域由来のアミノ酸と同一であっても、異なっていてもよい。たとえば、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一のＣＨ３ドメインをコードし、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第二のＣＨ３ドメインをコードし、この場合において当該第一および第二のＣＨ３ドメインは、同一であってもよく、または二特異性抗原結合タンパク質に関し本明細書において以下に記載されるように、１つ以上のアミノ酸の位置で異なっていてもよい。
【0085】
一部の実施形態では、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一のＶＨをコードし、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第二のＶＨをコードする。
【0086】
一部の実施形態では、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一の重鎖をコードし、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第二の重鎖をコードする。当該第一および第二の重鎖は、同一の定常領域を有してもよく、または１つ以上のアミノ酸において異なってもよい。異なる重鎖定常ドメイン（たとえば異なるＣＨ３ドメイン）を有する二特異性抗原結合タンパク質の様々な例を、本明細書の以下においてさらに記載する。コードされるアミノ酸配列にかかわらず、２つの重鎖定常領域由来のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列は、当該２つのコードヌクレオチド配列の内の１つがコドン改変され得るという点で異なってもよく、それにより、核酸系検出アッセイにおいて当該２つのヌクレオチド配列を識別するための便利な基盤が提供される。
【0087】
一部の実施形態では、各ＨＣＦまたはＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、独立して、プロモーターを含有する転写制御配列に動作可能に連結される。「独立して」とは、各コード配列が、たとえばプロモーターなどの別個の転写制御配列に動作可能に連結され、それにより、当該コード配列の転写が別個の制御および管理下にあることを意味する。一部の実施形態では、２つのＨＣＦ含有ポリペプチドの転写の指示を行うプロモーターは同じである。一部の実施形態では、２つのＨＣＦ含有ポリペプチドの転写の指示を行うプロモーター、ならびにＬＣＦ含有ポリペプチドの転写の指示を行うプロモーターは、たとえばＣＭＶプロモーターなど、すべて同一のプロモーターである。一部の実施形態では、各ＨＣＦまたはＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、独立して、誘導性プロモーターまたは抑制性プロモーターに動作可能に連結される。誘導性プロモーターおよび抑制性プロモーターによって、例えば、生産期（流加培養）でのみ産生が発生し、増殖期（シードトレイン（ｓｅｅｄ ｔｒａｉｎ）培養）の間は発生しないことが可能となる。各遺伝子産物の産生（発現）の良好な管理は、異なるプロモーターによって達成され得る。
【0088】
そのような１つの例では、細胞は最初にテトラサイクリンリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）を発現するよう改変され、各ＨＣＦコードヌクレオチド配列とＬＣＦコードヌクレオチド配列は、その活性がＴｅｔＲにより制御されるプロモーターの転写管理下に置かれる。２つのタンデムＴｅｔＲオペレーター（ｔｅｔＯ）は、ＣＭＶプロモーターのすぐ下流に配置される。一部の実施形態では、各ＨＣＦおよび／またはＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、独立して、少なくとも１つのＴｅｔＲオペレーター（ＴｅｔＯ）またはＡｒｃオペレーター（ＡｒｃＯ）の上流のプロモーターに動作可能に連結される。他の実施形態では、各ＨＣＦおよび／またはＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、独立して、ＣＭＶ／ＴｅｔＯまたはＣＭＶ／ＡｒｃＯハイブリッドプロモーターに動作可能に連結される。追加の適切なプロモーターを、本明細書において以下に記載する。
【0089】
座位内の複数の外因性核酸の相対的な位置は変化し得る。任意の学説に拘束されることは意図していないが、２つのＨＣＦ含有ポリペプチドのバランスの取れた（すなわち同等な）発現レベルを達成することが重要であると考えられている。一部の実施形態では、ＬＣＦをコードする核酸は、ＨＣＦをコードする両方の核酸に対し、上流に位置付けられる。ＬＣＦを含有するポリペプチドと、２つのＨＣＦを含有するポリペプチドの発現を管理するための３つのプロモーターが同一である場合、適切な配置としては、５’から３’の方向に、ＬＣＦをコードするヌクレオチド配列、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列、ヌクレオチド配列（たとえば選択マーカー遺伝子）に動作可能に連結された追加の異なるプロモーター、そして第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列、が挙げられる。他の適切な配置としては、５’から３’の方向に、ＬＣＦをコードするヌクレオチド配列、ヌクレオチド配列（たとえば選択マーカー遺伝子）に動作可能に連結された追加の異なるプロモーター、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列、そして第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列、が挙げられる。ＨＣＦをコードするヌクレオチド配列が定常領域配列をコードしている場合、上流に配置された各ヌクレオチド配列が改変型の定常領域配列（たとえば改変型ＣＨ３）をコードしてもよく、または上流に配置されたヌクレオチド配列が改変型の定常領域配列をコードし、他方が非改変型の定常領域配列をコードしてもよい。
【0090】
一部の実施形態では、細胞は、座位内にさらに統合された１つ以上のＲＲＳをさらに含有する。一部の実施形態では、細胞は第一ＲＲＳと第二ＲＲＳを含み、それらは互いに異なっており、そして外因性核酸配列に隣接している。この場合において当該外因性核酸配列は、第一のＬＣＦをコードする核酸、第一のＨＣＦをコードする核酸、そして第二のＨＣＦをコードする核酸を順に含有する。特定の実施形態では、ＬＣＦをコードする核酸は、ＨＣＦをコードする核酸の両方に対して上流に配置され、細胞は、第一のＬＣＦをコードする核酸に対し３’に、そしてＨＣＦをコードする外因性核酸のうちの１つ、または両方に対し５’に配置される第三のＲＲＳを含み、この場合において、第三のＲＲＳは、第一ＲＲＳおよび第二ＲＲＳとは異なっている。第三のＲＲＳは、ＨＣＦをコードする配列またはＬＣＦをコードする配列のうちのいずれか２つの間に配置され得る遺伝子のイントロン中に含有されるよう操作されてもよい。
【0091】
二特異性抗原結合タンパク質
本開示に記載される細胞、ベクターおよびシステムにおけるクローニングと産生に適した、たとえば二特異性抗体などの二特異性抗原結合タンパク質は、二特異性抗原結合タンパク質の任意の特性の形式に限定されない。
本開示に記載される細胞、ベクターおよびシステムにおけるクローニングと産生に適した、たとえば二特異性抗体などの二特異性抗原結合タンパク質は、二特異性抗原結合タンパク質の任意の特性の形式に限定されない。
【0092】
様々な実施形態では、二特異性抗原結合タンパク質は２つのポリペプチドを含み、各ポリペプチドは、抗原結合部分（たとえばＶＨ領域）とＣＨ３ドメインを含有し、この場合において当該２つのポリペプチドの抗原結合部分は異なる抗原特異性を有し、およびこの場合において当該２つのＣＨ３ドメインは、ＣＨ３ドメインのうちの１つが少なくとも１つのアミノ酸位置で改変され、当該２つのポリペプチド間で異なるプロテインＡ結合特性を生じさせているという点で、互いに関しヘテロ二量体性である。たとえば、米国特許第８，５８６，７１３号に記載される二特異性抗体を参照のこと。この方法において、異なるプロテインＡ単離スキームを使用して、ホモ二量体からヘテロ二量体性二特異性抗原結合タンパク質を容易に単離することができる。
【0093】
一部の実施形態では、二特異性抗原結合タンパク質は、異なる抗原特異性を有し、およびＣＨ３ドメイン中の少なくとも１つのアミノ酸位置が異なり、それにより２つの重鎖の間で異なるプロテインＡ結合特性が生じる、２つの重鎖を含む。
【0094】
一部の実施形態では、２つのポリペプチドは、ヒトＩｇＧのＣＨ３ドメインを含有し、この場合において当該２つのポリペプチドの内の１つは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４から選択されるヒトＩｇＧのＣＨ３ドメインを含有し、当該２つのポリペプチドのうちの他の１つは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４から選択されるヒトＩｇＧの改変ＣＨ３ドメインを含有し、この場合において当該改変は、プロテインＡに対する改変ＣＨ３領域の結合を減少させ、または消滅させる。特定の実施形態では、当該２つのポリペプチドのうちの１つは、ヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメインを含有し、当該２つのポリペプチドのうちの他の１つは、ヒトＩｇＧ１の改変ＣＨ３ドメインを含有し、この場合において当該改変は、ＩＭＧＴエクソンナンバリングシステムにおける（ｉ）９５Ｒならびに（ｉｉ）９５Ｒおよび９６Ｆからなる群から選択される。他の特定の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、ＩＭＧＴエクソンナンバリングシステムにおける、１６Ｅ、１８Ｍ、４４Ｓ、５２Ｎ、５７Ｍ、および８２Ｉからなる群から選択される１～５個の追加改変を備えている。
【0095】
他の様々な実施形態では、当該２つのポリペプチドは、マウスＩｇＧのＣＨ３ドメインを含有し、この場合において当該２つのポリペプチドのうちの１つは、未改変マウスＩｇＧのＣＨ３ドメインを含有し、当該２つのポリペプチドのうちの他の１つは、マウスＩｇＧの改変ＣＨ３ドメインを含有し、この場合において、当該改変は、プロテインＡに対する改変ＣＨ３領域の結合を減少させ、または消滅させる。様々な実施形態では、マウスＩｇＧ ＣＨ３ドメインは、以下からなる群から選択される特定の位置（ＥＵナンバリング）で、特定のアミノ酸を備えるよう改変される：２５２Ｔ、２５４Ｔ、および２５６Ｔ；２５２Ｔ、２５４Ｔ、２５６Ｔ、および２５８Ｋ；２４７Ｐ、２５２Ｔ、２５４Ｔ、２５６Ｔ、および２５８Ｋ；４３５Ｒおよび４３６Ｆ；２５２Ｔ、２５４Ｔ、２５６Ｔ、４３５Ｒ、および４３６Ｆ；２５２Ｔ、２５４Ｔ、２５６Ｔ、２５８Ｋ、４３５Ｒ、および４３６Ｆ；２４ｔＰ、２５２Ｔ、２５４Ｔ、２５６Ｔ、２５８Ｋ、４３５Ｒ、および４３６Ｆ；ならびに４３５Ｒ。特定の実施形態では、以下からなる群から選択される改変の特定群が作製される：Ｍ２５２Ｔ、Ｓ２５４Ｔ、Ｓ２５６Ｔ；Ｍ２５２Ｔ、Ｓ２５４Ｔ、Ｓ２５６Ｔ、Ｉ２５８Ｋ；Ｉ２４７Ｐ、Ｍ２５２Ｔ、Ｓ２５４Ｔ、Ｓ２５６Ｔ、Ｉ２５８Ｋ；Ｈ４３５Ｒ、Ｈ４３６Ｆ；Ｍ２５２Ｔ、Ｓ２５４Ｔ、Ｓ２５６Ｔ、Ｈ４３５Ｒ、Ｈ４３６Ｆ；Ｍ２５２Ｔ、Ｓ２５４Ｔ、Ｓ２５６Ｔ、Ｉ２５８Ｋ、Ｈ４３５Ｒ、Ｈ４３６Ｆ；Ｉ２４７Ｐ、Ｍ２５２Ｔ、Ｓ２５４Ｔ、Ｓ２５６Ｔ、Ｉ２５８Ｋ、Ｈ４３５Ｒ、Ｈ４３６Ｆ；およびＨ４３５Ｒ。
【0096】
様々な実施形態では、二特異性抗原結合タンパク質は、マウスとラットのモノクローナル抗体または抗原結合タンパク質のハイブリッドであり、たとえばマウスＩｇＧ２ａとラットＩｇＧ２ｂのハイブリッドである。これら実施形態に従い、二特異性抗体は、２つの抗体のヘテロ二量体から構成され、当該抗体は各々の１つの重鎖／軽鎖のペアを備え、それらは自身のＦｃ部分を介して結合している。記載されるヘテロ二量体は、２つの元の抗体ホモ二量体と二特異性ヘテロ二量体の混合物から容易に精製されることができる。その理由は、プロテインＡに対する二特異性抗体の結合特性は、元の抗体の結合特性とは異なっているためである。ラットのＩｇＧ２ｂは、プロテインＡには結合せず、一方でマウスＩｇＧ２ａは結合する。結論として、マウス－ラットのヘテロ二量体は、プロテインＡに結合するが、マウスＩｇＧ２ａホモ二量体よりも高いｐＨで溶出する。これが二特異性ヘテロ二量体の選択的精製を可能にする。
【0097】
他の様々な実施形態では、二特異性抗原結合タンパク質は、当分野において「ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ」と呼称される形式のものである（たとえば米国特許第７，１８３，０７６号を参照のこと）。これらの実施形態では、２つの抗体のＦｃ部分を操作して、１つに「こぶ（ｋｎｏｂ）」を突き出させ、他方に相補的な「穴（ｈｏｌｅ）」が作られる。同じ細胞において産生される場合、操作された「こぶ」と操作された「穴」の結合により、重鎖は、ホモ二量体よりもヘテロ二量体を優先的に形成すると言われている。
【0098】
別の実施形態では、第一の重鎖と第二の重鎖は、ＣＨ３ドメインにおいて１つ以上のアミノ酸改変を備え、それによって２つの重鎖の間の相互作用が可能となる。ＣＨ３－ＣＨ３の接触面のアミノ酸残基が荷電アミノ酸と置換され、それによりホモ二量体の形成が静電的に不利となる。（たとえば、ＰＣＴ国際出願公開ＷＯ２００９０８９００４および欧州公開ＥＰ１８７０４５９を参照のこと）
【0099】
他の実施形態では、第一の重鎖は、アイソタイプＩｇＡのＣＨ３ドメインを備え、第二の重鎖はＩｇＧのＣＨ３ドメインを備え（逆もまた然り）、ヘテロ二量体の優先的な形成を促進する。（たとえば、ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ２００７１１０２０５を参照のこと）
【0100】
他の実施形態では、たとえばＦａｂ－アーム交換（ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ２００８１１９３５３；ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ２０１１１３１７４６）、コイル化コイルドメイン相互作用（ＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ２０１１０３４６０５）、またはロイシンジッパーペプチド（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２，１４８（５）：１５４７－１５５３）などの、ヘテロ二量体の形成を促す操作方法により、様々な形式がイムノグロブリン鎖に組み込まれ得る。
【0101】
二特異性抗原結合タンパク質を作製するために使用され得るイムノグロブリン重鎖可変領域は、当分野に公知の任意の方法を使用して作製することができる。たとえば、第一の重鎖は、核酸によりコードされる可変領域を備え、当該核酸は第一動物の成熟Ｂ細胞のゲノムに由来し、当該第一動物は第一抗原で免疫化されており、そして第一の重鎖は第一の抗原を特異的認識する。第二重鎖は核酸によりコードされる可変領域を備え、当該核酸は第二動物の成熟Ｂ細胞のゲノムに由来し、当該第二動物は第二抗原で免疫化されており、そして第二の重鎖は第二の抗原を特異的に認識する。免疫グロブリン重鎖可変領域配列はたとえばファージディスプレイ法など当分野に公知の任意の他の方法により取得することもできる。他の例では、重鎖可変領域をコードする核酸は、当分野に報告されている、または別の手段により入手可能な抗体のものを含む。一部の実施形態では、２つの重鎖コード配列のうちの１つはコドン改変され、それにより核酸系アッセイにおいて当該２つのコード配列を識別するための簡便な基盤が提供される。
【0102】
２つの異なるエピトープ（または２つの異なる抗原）を認識する２つの重鎖を備えた二特異性抗体は、それらが同じ軽鎖（すなわち、軽鎖が同一の可変ドメインと定常ドメインを有している））とペア形成できる場合に、より簡易に単離される。たとえば米国特許第８，５８６，７１３号に記載され、およびその中に開示される技術のように、重鎖可変ドメインと、その標的抗原との選択性および／またはアフィニティに干渉することなく、または実質的に干渉することなく、異なる特異性の２つの重鎖とペア形成できる軽鎖を作製するための様々な方法が当分野において公知である。
【0103】
二特異性抗原結合タンパク質は様々な二面的な抗原特異性と、関連した有用なアプリケーションを有し得る。
【0104】
一部の例では、腫瘍抗原とＴ細胞抗原に対する結合特異性を備え、細胞上の抗原、たとえばＣＤ２０を標的とし、およびＴ細胞上の抗原、たとえばＣＤ３などのＴ細胞受容体も標的とする二特異性抗原結合タンパク質が作製され得る。この場合では、二特異性抗原結合タンパク質は、患者中の対象細胞（たとえばＣＤ２０結合を介してリンパ腫患者のＢ細胞）ならびに患者のＴ細胞の両方を標的とする。様々な実施形態では、二特異性抗原結合タンパク質は、たとえばＣＤ３へ結合するなど、Ｔ細胞に結合することで、Ｔ細胞を活性化するように設計され、それによりＴ細胞活性化が特定の選択腫瘍細胞へと結び付けられる。
【0105】
１つの部分がＣＤ３に結合し、他方の部分が標的抗原に結合する場合の二特異性抗原結合タンパク質の文脈において、標的抗原は腫瘍関連抗原である。特定の腫瘍関連抗原の非限定的な例としては、たとえば、ＡＦＰ、ＡＬＫ、ＢＡＧＥタンパク質、ＢＩＲＣ５（サバイビン）、ＢＩＲＣ７、β－カテニン、ｂｒｃ－ａｂｌ、ＢＲＣＡ１、ＢＣＭＡ、ＢＯＲＩＳ、ＣＡ９、炭酸脱水酵素ＩＸ、カスパーゼ－８、ＣＡＬＲ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０（ＭＳ４Ａ１）、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、ＣＬＥＣ－１２、ＣＴＬＡ４、サイクリン－Ｂ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、Ｆｒａ－１、ＦＯＬＲ１、ＧＡＧＥタンパク質（たとえば、ＧＡＧＥ－１、－２）、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧｌｏｂｏＨ、グリピカン－３、ＧＭ３、ｇｐ１００、Ｈｅｒ２、ＨＬＡ／Ｂ－ｒａｆ、ＨＬＡ／ｋ－ｒａｓ、ＨＬＡ／ＭＡＧＥ－Ａ３、ｈＴＥＲＴ、ＬＭＰ２、ＭＡＧＥタンパク質（たとえば、ＭＡＧＥ－１、－２、－３、－４、－６、および－１２）、ＭＡＲＴ－１、メソテリン、ＭＬ－ＩＡＰ、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ２、Ｍｕｃ３、Ｍｕｃ４、Ｍｕｃ５、Ｍｕｃ１６（ＣＡ－１２５）、ＭＵＭ１、ＮＡ１７、ＮＹ－ＢＲ１、ＮＹ－ＢＲ６２、ＮＹ－ＢＲ８５、ＮＹ－ＥＳＯ１、ＯＸ４０、ｐ１５、ｐ５３、ＰＡＰ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＣＴＡ－１、ＰＬＡＣ１、ＰＲＬＲ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ（ＦＯＬＨ１）、ＲＡＧＥタンパク質、Ｒａｓ、ＲＧＳ５、Ｒｈｏ、ＳＡＲＴ－１、ＳＡＲＴ－３、Ｓｔｅａｐ－１、Ｓｔｅａｐ－２、ＴＡＧ－７２、ＴＧＦ－β、ＴＭＰＲＳＳ２、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ－ｎｏｕｖｅｌｌｅ抗原（Ｔｎ）、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、チロシナーゼ、およびウロプラキン－３が挙げられる。
【0106】
一部の実施形態では、二特異性抗原結合タンパク質は、抗ＣＤ３ｘ抗ＣＤ２０二特異性抗体（米国特許出願公開ＵＳ２０１４／００８８２９５Ａ１およびＵＳ２０１５０２６６９６６Ａ１に記載され、参照により本明細書に援用される）、抗ＣＤ３ｘ抗Ｍｕｃｉｎ １６二特異性抗体（たとえば抗ＣＤ３ｘ抗Ｍｕｃ１６二特異性抗体）、および抗ＣＤ３ｘ抗前立腺特異的膜抗原二特異性抗体（たとえば抗ＣＤ３ｘ抗ＰＳＭＡ二特異性抗体）からなる群から選択される。他の実施形態では、二特異性抗原結合タンパク質は、ＣＤ３に結合する１つの部分を備えている。抗ＣＤ３抗体部分の例は、米国特許出願公開ＵＳ２０１４／００８８２９５Ａ１およびＵＳ２０１５０２６６９６６Ａ１、ならびに国際特許出願公開ＷＯ２０１７／０５３８５６に記載されており、２０１７年３月３０日に公開され、それらすべて本明細書に参照により援用される）。さらに他の実施形態では、二特異性抗原結合タンパク質は、ＣＤ３に結合する１つの部分、およびＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２８、ＣＬＥＣ－１２、Ｈｅｒ２、ＨＬＡタンパク質、ＭＡＧＥタンパク質、Ｍｕｃ１６、ＰＳＭＡ、またはＳｔｅａｐ－２に結合する１つの部分を備えている。
【0107】
１つの部分がたとえばＣＤ３に結合するなど、Ｔ細胞受容体に結合し、他方の部分が標的抗原に結合する場合に二特異性抗原結合タンパク質の文脈において、標的抗原は感染性疾患関連抗原であってもよい。感染性疾患関連抗原の非限定的な例としては、たとえば、ウイルス粒子の表面上に発現される抗原、または優先的にウイルスに感染した細胞上に発現される抗原が挙げられ、この場合において当該ウイルスは、ＨＩＶ、肝炎ウイルス（Ａ、ＢまたはＣ）、ヘルペスウイルス（たとえば、ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２、ＣＭＶ、ＨＡＶ－６、ＶＺＶまたはエプスタインバールウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶ、デングウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス、およびアルボウイルス脳炎ウイルスからなる群から選択される。あるいは標的抗原は、細菌表面上に発現される抗原であってもよく、または優先的に細菌に感染した細胞上に発現される抗原であってもよく、この場合において当該細菌は、クラミジア属、リケッチア属、マイコバクテリウム属、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、肺炎球菌、髄膜炎菌、淋菌、クレブシエラ属、プロテウス属、セラチア属、シュードモナス属、レジオネラ属、ジフテリア菌、サルモネラ属、バチルス属、コレラ菌、破傷風菌、ボツリヌス菌、炭そ菌、ペスト菌、レプトスピラ属、およびライム病の細菌からなる群から選択される。ある実施形態では、標的抗原は、真菌の表面上に発現される抗原であり、または優先的に真菌に感染した細胞上に発現される抗原であり、この場合において当該真菌は、カンジダ属（アルビカンズ（ａｌｂｉｃａｎｓ）、クルーセイ（ｋｒｕｓｅｉ）、グラブラータ（ｇｌａｂｒａｔａ）、トロピカリス（ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）など）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、アスペルギルス属（フミガーツス（ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）など）、ケカビ目（ムコール属（ｍｕｃｏｒ）、アブシジア属（ａｂｓｉｄｉａ）、リゾプス属（ｒｈｉｚｏｐｕｓ））、スポロスリックス・シエンキー（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｋｉｉ）、ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、南アメリカ分芽菌（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、およびヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）からなる群から選択される。ある実施形態では、標的抗原は寄生虫の表面上に発現される抗原であり、または優先的に寄生虫に感染した細胞上に発現される抗原であり、この場合において当該寄生虫は、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、大腸バランチジウム（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ）、ネグレリア・フォーレリ（Ｎａｅｇｌｅｒｉａｆｏｗｌｅｒｉ）、アカントアメーバ種（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ ｓｐ．）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｉａ）、クリプトスポリジウム種（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）、カリニ肺炎菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、ネズミバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ
ｍｉｃｒｏｔｉ）、トリパノソーマ・ブルーセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、ドノバンリーシュマニア（，Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、ブラジル鉤虫（Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、タエニア・クラシセプス（Ｔａｅｎｉａ ｃｒａｓｓｉｃｅｐｓ）、およびマレー糸条虫（Ｂｒｕｇｉａ ｍａｌａｙｉ）からなる群から選択される。特定の寄生虫関連抗原の非限定的な例としては、たとえばＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ ＣＤ４、Ｂ型肝炎ウイルス糖タンパク質Ｌ、Ｂ型肝炎ウイルス糖タンパク質Ｍ、Ｂ型肝炎ウイルス糖タンパク質Ｓ、Ｃ型肝炎ウイルス Ｅ１、Ｃ型肝炎ウイルス Ｅ２，、肝細胞特異的タンパク質、単純ヘルペスウイルスｇＢ、サイトメガロウイルスｇＢ、およびＨＴＬＶエンベロープタンパク質が挙げられる。
ｍｉｃｒｏｔｉ）、トリパノソーマ・ブルーセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、ドノバンリーシュマニア（，Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、ブラジル鉤虫（Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、タエニア・クラシセプス（Ｔａｅｎｉａ ｃｒａｓｓｉｃｅｐｓ）、およびマレー糸条虫（Ｂｒｕｇｉａ ｍａｌａｙｉ）からなる群から選択される。特定の寄生虫関連抗原の非限定的な例としては、たとえばＨＩＶ ｇｐ１２０、ＨＩＶ ＣＤ４、Ｂ型肝炎ウイルス糖タンパク質Ｌ、Ｂ型肝炎ウイルス糖タンパク質Ｍ、Ｂ型肝炎ウイルス糖タンパク質Ｓ、Ｃ型肝炎ウイルス Ｅ１、Ｃ型肝炎ウイルス Ｅ２，、肝細胞特異的タンパク質、単純ヘルペスウイルスｇＢ、サイトメガロウイルスｇＢ、およびＨＴＬＶエンベロープタンパク質が挙げられる。
【0108】
各々が、同一細胞表面上の結合パートナーに指向する（すなわち、各々が異なる標的に指向する）２つの結合部分を備えた二特異性結合タンパク質が作製されてもよい。この設計は特に、同一細胞表面上に両方の標的を発現する特定の細胞または細胞型を標的化する場合に適している。標的は、他の細胞上にも個々に現れ得るが、これら結合タンパク質の結合部分は、各結合部分が比較的低いアフィニティ（たとえば低マイクロモルまたは高ナノモル、たとえば百ナノモルＫＤ超、たとえば５００、６００、７００、８００ナノモル）でその標的に結合するよう選択される。この場合では、長期の標的結合は、２つの標的が同じ細胞上で近接している状況下でのみ好ましい。
【0109】
同一標的に、同一標的の異なるエピトープで結合する２つの結合部分を備えた二特異性結合タンパク質が作製されてもよい。この設計は、結合タンパク質を用いて標的をブロッキングする成功率を最大化したい場合に特に適している。たとえば膜貫通チャンネルまたは細胞表面受容体の複数の細胞外ループを、同一の二特異性結合分子により標的化してもよい。
【0110】
免疫抑制をもたらす免疫シグナル伝達の負の制御因子をクラスター化し、活性化する２つの結合分子を備えた二特異性結合タンパク質を作製してもよい。ｉｎ ｃｉｓでの抑制は、標的が同一細胞上にある場合に実施することができる。ｉｎ ｔｒａｎｓでの抑制は、標的が異なる細胞上にある場合に実施することができる。ｉｎ ｃｉｓでの抑制は、たとえば抗ＩｇＧＲＩＩｂ結合部分と抗ＦｅｌＤ１結合部分を有する二特異性結合タンパク質を用いて実施することができ、それによって、ＩｇＧＲＩＩｂはＦｅｌＤ１の存在下でのみクラスター化され、ＦｅｌＤ１への免疫応答が下方制御される。ｉｎ ｔｒａｎｓでの抑制は、たとえば抗ＢＴＬＡ結合部分と、対象の組織特異的抗原に特異的に結合する結合部分を有する二特異性結合タンパク質を用いて行うことができ、それによって阻害性ＢＴＬＡ分子のクラスター化が選択標的組織中でのみ発生し、自己免疫疾患への対処法となる可能性がある。
【0111】
多成分性受容体を活性化する二特異性結合タンパク質を作製してもよい。この設計では、受容体の２成分に指向する２つの結合部分が、当該受容体に結合、架橋し、受容体からのシグナル伝達を活性化する。これは、ＩＦＮＡＲ１に結合する結合部分と、ＩＦＮＡＲ２に結合する結合部分を有する二特異性結合タンパク質を使用することで行うことができ、この場合、結合が受容体を架橋する。かかる二特異性結合タンパク質は、インターフェロン治療の代替法を提供し得る。
【0112】
半透過性バリア、たとえば血液脳関門を交差し、結合部分を輸送する二特異性結合タンパク質を作製してもよい。この設計では、１つの結合部分が、特定の選択バリアを通過することができる標的に結合し、他方の結合部分が、治療活性を有する分子を標的とし、この場合において治療活性を有する標的分子は通常、当該バリアを越えることができない。この種の二特異性結合タンパク質は、別の手段では治療剤が到達しない組織への治療剤の送達に有用である。一部の例としては、消化管または肺へ治療剤を輸送するｐＩＧＲ受容体の標的化、または脳血液関門を交差し、治療剤を輸送するトランスフェリン受容体の標的化が挙げられる。
【0113】
結合部分を特定の細胞または細胞型へと輸送する二特異性結合タンパク質が作製されてもよい。この設計では、１つの結合部分は、容易に細胞内に内在化される細胞表面タンパク質（たとえば受容体）を標的とする。他方の結合部分は、細胞内タンパク質を標的化し、当該細胞内タンパク質の結合が治療効果を生じさせる。
【0114】
貪食免疫細胞の表面受容体と、感染性病原体（たとえば酵母又は細菌）の表面分子に結合する二特異性結合タンパク質は、貪食免疫細胞の周辺に感染性病原体を送達させ、病原体の貪食を促進する。かかる設計の例は、ＣＤ６４分子またはＣＤ８９分子と、さらに病原体も標的とする二特異性抗体である。
【0115】
１つの結合部分として抗体可変領域を有し、第二の結合部分として非Ｉｇ部分を有する二特異性結合タンパク質。抗体可変領域は標的化を行い、一方で非Ｉｇ部分はＦｃに連結されたエフェクターまたは毒素である。この場合では、リガンド（たとえばエフェクターまたは毒素）は、抗体可変領域に結合された標的に送達される。
【0116】
各々Ｉｇ領域（たとえばＣＨ２領域とＣＨ３領域を含有するＩｇ配列）に結合される２つの部分を有する二特異性結合タンパク質は、Ｆｃ環境下で互いの周辺に任意の２つのタンパク質部分を運ばせることができる。この設計の例としては、たとえば、ホモ二量体またはヘテロ二量体のトラップ分子などのトラップが挙げられる。
【0117】
発現強化座位
本発明の使用に適した発現強化座位としては、たとえば、米国特許第８，３８９，２３９号に記載される配列番号１に対し、実質的な相同性を有するヌクレオチド配列を備えた座位（本明細書において、「ＥＥＳＹＲ（登録商標）座位」とも呼称される）、米国特許出願１４／９１９，３００に記載される配列番号２または配列番号３に対し、実質的な相同性を有するヌクレオチド配列を備えた座位（本明細書において、「ＹＡＲＳ座位」とも呼称される）、およびその他の発現強化座位ならびに当分野に報告される配列（たとえば、ＵＳ２０１５０１６７０２０Ａ１および米国特許第６，８００，４５７号）が挙げられる。
本発明の使用に適した発現強化座位としては、たとえば、米国特許第８，３８９，２３９号に記載される配列番号１に対し、実質的な相同性を有するヌクレオチド配列を備えた座位（本明細書において、「ＥＥＳＹＲ（登録商標）座位」とも呼称される）、米国特許出願１４／９１９，３００に記載される配列番号２または配列番号３に対し、実質的な相同性を有するヌクレオチド配列を備えた座位（本明細書において、「ＹＡＲＳ座位」とも呼称される）、およびその他の発現強化座位ならびに当分野に報告される配列（たとえば、ＵＳ２０１５０１６７０２０Ａ１および米国特許第６，８００，４５７号）が挙げられる。
【0118】
一部の実施形態では、本発明で使用される２つの発現強化座位は、配列番号１に対し実質的な相同性を有するヌクレオチド配列を備えた座位、または配列番号２もしくは配列番号３に対し実質的な相同性を有するヌクレオチド配列を備えた座位から選択される。これらの座位は配列を含有し、当該配列は、配列に対し動作可能に連結されて、（すなわち配列内に、または配列の近傍内に）統合された遺伝子の発現強化をもたらすだけではなく、ゲノム中の他の配列と比較し、高い組み換え効率と統合安定性の改善を示す。
【0119】
配列番号１、配列番号２、および配列番号３は、ＣＨＯ細胞から同定された。他の哺乳類種（たとえばヒトまたはマウス）は、同定された発現強化領域に対し、限定的な相同性を有していることが判明している。しかしながら、チャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）の他の組織型から誘導された細胞株、または他の同系種において、配列が発見される可能性があり、当分野に公知の技術により単離することができる。たとえば、異種間ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ系技術により、他の相同配列が特定される可能性がある。さらに、当分野に公知の部位特異的突然変異誘導技術または無作為突然変異誘導技術により、配列番号１、配列番号２、または配列番号３に記載されるヌクレオチド配列に、変化を発生させることができる。次いで得られた配列変異体を、発現強化活性に関し検証してもよい。発現強化活性を有する配列番号１、配列番号２、または配列番号３に対する核酸同一性において少なくとも約９０％同一であるＤＮＡは、日常的な実験で単離され、そして発現強化活性を示すことが予期される。
【0120】
１つ以上の外因性核酸の挿入物の統合部位、部位、またはヌクレオチド位置は、発現強化配列（たとえば配列番号１、配列番号２、または配列番号３）のいずれかの内にあるか、または隣接している任意の位置であってもよい。対象座位の内、または隣接する特定の染色体位置が、統合される外因性遺伝子の安定した統合および効率的な転写を支持するかどうかは、当分野に公知の標準的な方法、たとえば米国特許第８，３８９，２３９号および米国特許出願１４，９１９，３００に記載される方法に従い決定することができる。
【0121】
本明細書において検討される統合部位は、発現強化配列内に位置し、または染色体ＤＮＡ上の発現強化配列の位置に対し、たとえば約１ｋｂ未満、５００塩基対（ｂｐ）、２５０ｂｐ、１００ｂｐ、５０ｂｐ、２５ｂｐ、１０ｂｐまたは約５ｂｐ未満で上流（５’）または下流（３’）など、配列の近傍内に位置している。さらに一部の他の実施形態では、使用される統合部位は、染色体ＤＮＡ上の発現強化配列の位置に対し、約１０００塩基対、２５００塩基対、５０００塩基対またはそれ以上、上流（５’）または下流（３’）に位置している。
【0122】
当分野において、たとえばスキャホールド／マトリクス付着領域などの大きなゲノム領域が、染色体ＤＮＡの効率的な複製と転写に使用されると理解されている。スキャホールド／マトリクス付着領域（Ｓ／ＭＡＲ：ｓｃａｆｆｏｌｄ／ｍａｔｒｉｘ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）は、スキャホールド－付着領域（ＳＡＲ：ｓｃａｆｆｏｌｄ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）またはマトリクス関連領域もしくはマトリクス付着領域（ＭＡＲ：ｍａｔｒｉｘ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄまたはｍａｔｒｉｘ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）とも呼称されることが知られており、真核細胞のゲノムＤＮＡ領域であり、ここに核マトリクスが付着する。いずれか１つの学説に拘束されないが、Ｓ／ＭＡＲｓは多くの場合、非コード領域にマッピングされ、その近辺から所与の転写領域（たとえばクロマチンドメイン）を隔て、また、転写を実行可能とする因子の構造および／または結合のためのプラットフォーム、たとえばデオキシリボヌクレアーゼまたはポリメラーゼに対する認識部位などを提供する。一部のＳ／ＭＡＲｓは、約１４～２０ｋｂの長さで特徴解析されている（Ｋｌａｒ，ｅｔ ａｌ．２００５，Ｇｅｎｅ ３６４：７９－８９）。したがって、発現強化座位（たとえば、配列番号１、配列番号２、もしくは配列番号３の内または近傍）での遺伝子の統合は、発現強化をもたらすことが予測される。一部の実施形態では、発現強化座位内の特定の部位に統合された、二特異性抗原結合タンパク質をコードする外因性核酸配列を備えた宿主細胞は、高い特異的生産性を示す。他の実施形態では、二特異性抗原結合タンパク質をコードする宿主細胞は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、または３０ピコグラム／細胞／日（ｐｃｄ）の特異的生産性を有する。
【0123】
一部の実施形態では、統合部位は、配列番号１のヌクレオチド配列を備えた座位内である。特定の実施形態では、統合部位は、配列番号１のヌクレオチド配列の内、または近傍内である。特定の実施形態では、統合部位は、１０～１３，５１５；２０～１２，０２０；１，０２０～１１，０２０；２，０２０～１０，０２０；３，０２０～９，０２０；４，０２０～８，０２０；５，０２０～７，０２０；６，０２０～６，９２０；６，１２０～６，８２０；６，２２０～６，７２０；６，３２０～６，６２０；６，４２０～６，５２０；６，４６０～６，５００；６，４７０～６，４９０；および６，４７５～６，４８５と番号づけられた位置に及ぶヌクレオチドから選択される、配列番号１内の位置である。他の実施形態では、統合部位は、配列番号１のヌクレオチド５，０００～７，４００、５，０００～６，５００、６，４００～７，４００、および配列番号１のヌクレオチド６，４００～６，５００からなる群から選択される配列中である。特定の実施形態では、統合部位は、配列番号１の「作動する」３つ組ヌクレオチド６４７１～６４７３の前、後、またはその中である。
【0124】
一部の実施形態では、統合部位は、配列番号２または配列番号３のヌクレオチド配列を備えた座位内である。特定の実施形態では、統合部位は、配列番号２のヌクレオチド配列の内、または近傍内である。特有の実施形態では、統合部位は、配列番号３のヌクレオチド配列の内、または近傍内である。一部の実施形態では、統合部位は、配列番号３のヌクレオチド１９９０～１９９１、１９９１～１９９２、１９９２～１９９３、１９９３～１９９４、１９９５～１９９６、１９９６～１９９７、１９９７～１９９８、１９９９～２０００、２００１～２００２、２００２～２００３、２００３～２００４、２００４～２００５、２００５～２００６、２００６～２００７、２００７～２００８、２００８～２００９、２００９～２０１０、２０１０～２０１１、２０１１～２０１２、２０１２～２０１３、２０１３～２０１４、２０１４～２０１５、２０１５～２０１６、２０１６～２０１７、２０１７～２０１８、２０１８～２０１９、２０１９～２０２０、２０２０～２０２１または２０２１～２０２２の内である。特定の実施形態では、統合は、配列番号３のヌクレオチド２００１～２０２２で、またはその内である。一部の実施形態では、外因性核酸は、配列番号３のヌクレオチド２００１～２００２またはヌクレオチド２０２１～２０２２で、またはその内に挿入され、挿入の結果として、配列番号３のヌクレオチド２００２～２０２１は削除される。
【0125】
発現強化座位内への部位特異的統合
部位特異的な様式で発現強化座位内への、すなわち、本明細書に開示される発現強化座位内の１つの特定の部位内への、複数の外因性核酸の統合は、いくつかの方法で実施することができ、たとえば、当分野に報告される相同組み換え、およびリコンビナーゼ介在性カセット交換などの方法が挙げられる（例えば米国特許第８，３８９，２３９号およびその中に開示される技術を参照のこと）。
部位特異的な様式で発現強化座位内への、すなわち、本明細書に開示される発現強化座位内の１つの特定の部位内への、複数の外因性核酸の統合は、いくつかの方法で実施することができ、たとえば、当分野に報告される相同組み換え、およびリコンビナーゼ介在性カセット交換などの方法が挙げられる（例えば米国特許第８，３８９，２３９号およびその中に開示される技術を参照のこと）。
【0126】
一部の実施形態では、対象の複数の外因性核酸または遺伝子を含有する核酸配列の統合に便利な発現強化座位内に、少なくとも２つ、すなわち２個以上の異なるリコンビナーゼ認識配列（ＲＲＳ）を含有する細胞が提供される。かかる細胞は、たとえば米国特許第８，３８９，２３９号およびその中に開示される技術など、本明細書において以下に解説され、および当分野において解説されるように相同組み換えを含む様々な手段を用いて２つ以上のＲＲＳを含有する外因性核酸配列を、所望される座位内に導入することにより取得することができる。
【0127】
特定の実施形態では、複数の外因性核酸の統合に便利な発現強化座位内に、３つ以上の異なるリコンビナーゼ認識配列（ＲＲＳ）を含有する細胞が提供される。特定の実施形態では、２つの別個の外因性核酸の統合を介在することができる発現強化座位内に３つの異なるリコンビナーゼ認識配列（ＲＲＳ）を含有する細胞が提供され、たとえば、この場合においてゲノム中の５’ＲＲＳおよび中間ＲＲＳは、統合される第一の外因性核酸に隣接する５’ＲＲＳと３’ＲＲＳに合致し、そしてゲノム中の中間ＲＲＳと３’ＲＲＳは、統合される第二の外因性核酸に隣接する５’ＲＲＳと３’ＲＲＳに合致する。
【0128】
適切なＲＲＳは、ＬｏｘＰ、Ｌｏｘ５１１、Ｌｏｘ５１７１、Ｌｏｘ２２７２、Ｌｏｘ２３７２、Ｌｏｘｍ２、Ｌｏｘ－ＦＡＳ、Ｌｏｘ７１、Ｌｏｘ６６、およびそれらの変異体を含有する群から選択されてもよく、この場合において部位特異的リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼまたはその誘導体であり、これを使用して、リコンビナーゼ介在性カセット交換（ＲＭＣＥ）が実施される。他の例において、適切なＲＲＳは、ＦＲＴ、Ｆ３、Ｆ５、ＦＲＴ 変異体－１０、ＦＲＴ 変異体＋１０、およびそれらの変異体を含有する群から選択されてもよく、この場合において、部位特異的リコンビナーゼのＦｌｐリコンビナーゼまたはその誘導体が使用され、ＲＭＣＥが実施される。さらに別の例では、ＲＲＳは、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、およびそれらの変異体を含有する群から選択されてもよく、部位特異的リコンビナーゼがｐｈｉＣ３１インテグラーゼまたはその誘導体である場合、これを使用してＲＭＣＥが実施される。
【0129】
他の実施形態では、天然細胞は、相同組み換え技術により改変され、それにより複数の外因性核酸を含有する核酸配列が発現強化座位内の特定部位に統合される。
【0130】
相同組み換えに関しては、相同なポリヌクレオチド分子（すなわち、相同アーム）が並び、その配列区間を交換する。導入遺伝子が相同ゲノム配列に隣接されている場合、この交換の間に導入遺伝子が導入され得る。１つの例において、リコンビナーゼ認識部位は、相同組み換えを介し、統合部位で宿主細胞ゲノム内に導入されてもよい。他の例では、たとえば二特異性抗原結合タンパク質をともにコードする複数の核酸などの複数の外因性核酸を含有する核酸配列が宿主ゲノム内に挿入され、この場合において当該核酸配列は標的座位の配列に対し相同な配列（相同アーム）により隣接されている。
【0131】
染色体のＤＮＡ内の統合部位に切断を導入することによって真核細胞内での相同的組み換えを容易にすることができる。これは、ある一定の核を特定の統合部位へと標的化することによって遂行されてもよい。標的の遺伝子座においてＤＮＡ配列を識別するＤＮＡ結合したタンパク質は当該技術分野で既知である。遺伝子標的化ベクターは、相同的組み換えを容易にするためにも採用される。
【0132】
相同組み換えを実施するための遺伝子標的化ベクター構築およびヌクレアーゼ選択は、本発明が関連する当該技術分野の当業者の技能の範疇内である。一部の例では、モジュラー構造を有し、かつ個別のジンクフィンガードメインを含有するジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、標的配列内の特定の３－ヌクレオチド配列を識別する（例えば、標的とされる組み込みの部位）。一部の実施形態は、多重標的配列を標的化する個別のジンクフィンガードメインの組み合せを用いてＺＦＮを利用することができる。転写活性化物質様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、部位特異的なゲノム編集にも採用されてもよい。ＴＡＬエフェクタータンパク質ＤＮＡ結合ドメインは、典型的にはＦｏｋＩなどの制限ヌクレアーゼの非特定的な開裂ドメインと組み合せて利用される。一部の実施形態では、ＴＡＬエフェクタータンパク質ＤＮＡ結合したドメインおよび制限ヌクレアーゼ開裂ドメインを含む融合タンパク質は、本発明の遺伝子座内の標的配列においてＤＮＡを識別および分割するために採用される（Ｂｏｃｈ Ｊ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０９－１５１２）。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）は、細菌性適応性免疫機構から開発されたプログラム可能なゲノムエンジニアリングツールである。このシステム、すなわちクラスター化された規則的な配置の短い回文の繰返し（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲに関連付けられた（Ｃａｓ）免疫応答では、２つのＲＮＡで複合化されたときタンパク質Ｃａｓ９は、配列特異的なエンドヌクレアーゼを形成し、そのうちの１つは標的選択を誘導する。ＲＧＥＮは構成要素（Ｃａｓ９およびｔｒａｃｒＲＮＡ）および標的に特異的なＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）から成る。ＤＮＡ標的開裂の効率と開裂部位の場所との両方とも、標的認識のための追加要件であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の位置に基づいて変化する（Ｃｈｅｎ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１４年３月１４日にオンラインで出版、マニュスクリプトとしてはＭ１１３．５３９７２６）。座位（たとえば配列番号１、配列番号２、または配列番号３）の特異的な標的化に対し特有な配列は、これら配列の多くを、ＣＨＯゲノムに並行に並べることにより特定することができ、１６～１７塩基対の合致で、潜在的なオフターゲット部位を明らかにすることができる。
【0133】
一部の実施形態では、５’および３’の相同アームに隣接される対象核酸（たとえば、１つ以上の選択マーカー遺伝子に任意で隣接する１つ以上のＲＲＳを含有する核酸、またはともに二特異性抗原結合タンパク質をコードする複数の外因性核酸を含有する核酸）を担持する標的化ベクターが、１つ以上の追加ベクターまたはｍＲＮＡとともに細胞内に導入される。１つの実施形態では、１つ以上の追化ベクターまたはｍＲＮＡは、限定されないが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質、およびＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼをはじめとする部位特異的ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含有する。ある実施形態では、当該１つ以上のベクターまたはｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびＣａｓ酵素をコードするヌクレオチド配列を備えた第一ベクターと、ドナー（外因性）ヌクレオチド配列を備えた第二ベクターを含む。かかるドナー配列は、対象遺伝子をコードするヌクレオチド配列、または認識配列をコードするヌクレオチド配列、または標的挿入が意図されたこれら外因性要素の内のいずれか１つを備えた遺伝子カセットをコードするヌクレオチド配列を含有する。ｍＲＮＡが使用される場合、ｍＲＮＡは、当業者に公知の普遍的なトランスフェクション法を用いて細胞内にトランスフェクトされることができ、およびたとえばトランスポーゼーズまたはエンドヌクレアーゼなどの酵素をコードしてもよい。細胞内に導入されるｍＲＮＡは一過性であってもよく、ゲノム内に統合されないが、ｍＲＮＡは、統合が発生するために必要な、または有益な外因性核酸を担持してもよい。一部の例では、ｍＲＮＡは、付随ポリヌクレオチドの長期継続する副作用の任意のリスクを除外するために選択され、この場合、核酸の所望される統合を実施するためには短期発現のみが必要とされる。
【0134】
部位特異的統合のためのベクター
本明細書において、部位特異的統合を介して発現強化座位内に外因性核酸を導入するための核酸ベクターが提供される。適切なベクターとしては、ＲＭＣＥを介した統合のためのＲＲＳに隣接された外因性核酸配列を含有するように設計されたベクターと、相同組み換えを書いた統合のための相同アームに隣接された対象外因性核酸配列を含有するよう設計されたベクターが挙げられる。
本明細書において、部位特異的統合を介して発現強化座位内に外因性核酸を導入するための核酸ベクターが提供される。適切なベクターとしては、ＲＭＣＥを介した統合のためのＲＲＳに隣接された外因性核酸配列を含有するように設計されたベクターと、相同組み換えを書いた統合のための相同アームに隣接された対象外因性核酸配列を含有するよう設計されたベクターが挙げられる。
【0135】
様々な実施形態では、ＲＭＣＥを介した部位特異的統合を実施するためのベクターが提供される。一部の実施形態では、ベクターは、標的座位内への複数核酸の同時統合が達成されるように設計される。連続統合とは対照的に、同時統合は、二特異性抗原結合タンパク質を産生する望ましいクローンの効率的で迅速な単離を可能とする。
【0136】
一部の実施形態では、ベクターセットが提供され、当該セットは２個以上のベクターを含み、各ベクターは、１つ以上の核酸に隣接するＲＲＳを少なくとも２個含有し、この場合において当該ベクターセット中の核酸はともに、二特異性抗原結合タンパク質をコードする。
【0137】
１つの実施形態では、ベクターセットは、５’から３’に向かって第一のＲＲＳ、第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列を備える第一の核酸、および第三のＲＲＳを備える第一のベクター；５’から３’に向かって第三のＲＲＳ、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列を備える第二の核酸、第二のＲＲＳを備える第二のベクターを含む。この場合において、第一または第二の核酸のいずれかは、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列をさらに備え、およびこの場合において第一および第二のＨＣＦ、ならびに第一のＬＣＦは、二特異性抗原結合タンパク質の領域（たとえば可変領域）をコードする。一部の実施形態では、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一のベクター上の第一の核酸中に含まれ（すなわち１つのベクター上に第一のＬＣＦと第二のＨＣＦ）、たとえば第一のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列の下流などに任意で配置される。他の実施形態では、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第二のベクター上の第二の核酸中に含まれる（すなわち、１つのベクター上に第一のＨＣＦと第二のＨＣＦ）。
【0138】
ＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、たとえば定常領域由来のアミノ酸またはドメインなどのアミノ酸をコードしてもよく、または定常領域全体をコードしてもよい。特定の実施形態では、ＨＣＦまたはＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、１つ以上の定常ドメイン、たとえばＣＬ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３またはそれらの組み合わせをコードしてもよい。ある実施形態では、ＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、ＣＨ３ドメインをコードしてもよい。たとえば、第一のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第一のＣＨ３ドメインをコードしてもよく、第二のＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、第二のＣＨ３ドメインをコードしてもよい。第一および第二のＣＨ３ドメインは同一であってもよく、または少なくとも１つのアミノ酸が異なっていてもよい。ＣＨ３ドメインにおける差異、または定常領域における差異は、本明細書に記載される二特異性抗原結合タンパク質に対する形式のいずれも取ることができ、たとえば異なるプロテインＡ結合特性を生じさせる差異、静電ステアリング、または「ｋｎｏｂ－ａｎｄ－ｈｏｌｅ」形式を生じさせる差異がある。いずれのアミノ酸配列の差異にも関係なく、２つのＨＣＦコードヌクレオチド配列は、当該２つのヌクレオチド配列の内の１つがコドン改変されているという点で異なっていてもよい。
【0139】
一部の実施形態では、各ＨＣＦをコードするヌクレオチド配列は、独立して、たとえばプロモーターをはじめとする転写制御配列に動作可能に連結される。一部の実施形態では、２つのＨＣＦ含有ポリペプチドの転写の指示を行うプロモーターは同じである。一部の実施形態では、２つのＨＣＦ含有ポリペプチドの転写の指示を行うプロモーター、ならびにＬＣＦ含有ポリペプチドの転写の指示を行うプロモーターはすべて同じプロモーターである（たとえばＣＭＶプロモーターなど）。一部の実施形態では、各ＨＣＦまたはＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、独立して、誘導性プロモーターまたは抑制性プロモーターに動作可能に連結される。誘導性プロモーターおよび抑制性プロモーターによって、例えば、生産期（流加培養）でのみ産生が発生し、増殖期（シードトレイン（ｓｅｅｄ ｔｒａｉｎ）培養）の間は発生しないことが可能となる。誘導性プロモーターまたは抑制性プロモーターによって、１つ以上の対象遺伝子の特異的な発現も可能となる。一部の実施形態では、各ＨＣＦおよび／またはＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、独立して、少なくとも１つのＴｅｔＲオペレーター（ＴｅｔＯ）またはＡｒｃオペレーター（ＡｒｃＯ）の上流のプロモーターに動作可能に連結される。さらに他の実施形態では、各ＨＣＦおよび／またはＬＣＦをコードするヌクレオチド配列は、独立して、ＣＭＶ／ＴｅｔＯまたはＣＭＶ／ＡｒｃＯハイブリッドプロモーターに動作可能に連結される。ハイブリッドプロモーター（制御性融合タンパク質とも呼称される）の例は、２００３年１２月１１日に公開された国際特許出願公開ＷＯ０３１０１１８９Ａ１（参照により本明細書に援用される）に見出される。
【0140】
一部の実施形態では、第一のベクター中の第一の核酸は、第一のベクター中の第三のＲＲＳに対し５’に位置付けられる、選択マーカー遺伝子の５’部分をさらに備える。そして第二の核酸は、第二のベクター中の第三のＲＲＳに対し３’に位置付けられる、選択マーカー遺伝子の残りの３’部分をさらに備える。これらの実施形態では、第一、第二、および第三のＲＲＳは、第一および第二の核酸の部位特異的統合を介在し、それにより、選択マーカー遺伝子の５’部分と３’部分の適切な結合が生じ、同時に、簡便な選択のための統合クローンが作製される。ある実施形態では、第一のベクター中の第三のＲＲＳは、選択マーカー遺伝子のイントロンの５’部分内にあるよう設計される。第二のベクター中の第三のＲＲＳは、選択マーカー遺伝子のイントロンの３’部分内にあるよう設計される。さらに他の実施形態では、第一のベクター中の第三のＲＲＳは、動作可能に連結される（が、他のベクター上では分離されている）プロモーターと選択マーカー遺伝子の間にあるように設計される。第一のベクター中の第三のＲＲＳは、プロモーターの３’にあるように設計される。そして第二のベクター中の第三のＲＲＳは、選択マーカー遺伝子の５’であるように設計される。
【0141】
上述のベクターセットは、３個以上のベクターを含んでもよい。たとえば上述の２個のベクターに加え、ベクターセットは、第二のＬＣＦをコードするヌクレオチド配列に隣接するＲＲＳを少なくとも２個備えた第三のベクターを含んでもよい。ベクターセットは、ＲＲＳを認識するリコンビナーゼを１個以上コードするベクターをさらに含んでもよい。
【0142】
他の実施形態では、相同組み換えを介した部位特異的統合を達成するためのベクターが提供される。一部の例では、宿主ゲノム内に統合されるポリヌクレオチド配列は、その後の二特異性抗原結合タンパク質をコードする核酸の統合に望ましい座位中に統合されるＲＲＳを１個以上有する細胞の作製を目的とした、たとえば１個のＲＲＳまたは複数のＲＲＳなどのＤＮＡ配列であってもよく、それらＲＲＳは、１個以上の選択マーカー遺伝子に隣接する。他の例では、宿主ゲノム内に統合されるポリヌクレオチド配列は、ともに二特異性抗原結合タンパク質をコードする複数の核酸を含む。たとえばポリヌクレオチド配列は、二特異性抗体の２つの異なる重鎖と共通軽鎖をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、ともに二特異性抗原結合タンパク質をコードする複数の核酸は各々独立して（すなわち別々に）、制御性配列（たとえばプロモーター、エンハンサー、転写終結配列、またはそれらの組み合わせ）に動作可能に連結されている。すなわち当該複数核酸の各々に対する制御性配列（たとえばプロモーター）は別個であり、それらは同一であっても、異なっていてもよい（すなわち、同じヌクレオチド配列または異なるヌクレオチド配列を含有する）。複数の核酸の中のある核酸が、複数のコード配列を含む場合、各コード配列、またはポリペプチドのＮ末端部分をコードする各ヌクレオチド配列は独立して、それら自身の制御性配列（たとえばプロモーター）に動作可能に連結される。
【0143】
発現強化座位内の配列に相同な配列を選択し、標的化ベクター中に相同アームとして当該選択された配列を含ませることは、当業者の技術範囲内にある。一部の実施形態では、ベクターまたは構築物は、第一の相同アームと第二の相同アームを備え、この場合において、組み合わされた第一および第二の相同アームは、座位内で、内因性配列を置き換える標的配列を備える。他の実施形態では、第一および第二の相同アームは、座位内の内因性配列内に統合される、または挿入される標的配列を備えている。一部の実施形態では、相同アームは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３に存在するヌクレオチド配列に対し相同なヌクレオチド配列を含有する。特定の実施形態では、ベクターは、配列番号３のヌクレオチド１００１～２００１に相当するヌクレオチド配列を有する５’相同アームと、配列番号３のヌクレオチド２０２２～３０２２に相同するヌクレオチドを有する３’相同アームを含有する。相同アーム、たとえば第一の相同アーム（５’相同アームとも呼ばれる）と、第二の相同アーム（３’相同アームとも呼ばれる）は、座位内の標的配列に対し相同である。５’から３’の方向に相同アームは、少なくとも１ｋｂ、または少なくとも２ｋｂ、または少なくとも３ｋｂ、または少なくとも４ｋｂ、または少なくとも５ｋｂ、または少なくとも１０ｋｂを備える、座位内の領域または標的配列を伸長してもよい。他の実施形態では、第一および第二の相同アームに選択された標的配列のヌクレオチドの総数は、少なくとも１ｋｂ、または少なくとも２ｋｂ、または少なくとも３ｋｂ、または少なくとも４ｋｂ、または少なくとも５ｋｂ、または少なくとも１０ｋｂを含有する。一部の例では、５’相同アームと３’相同アームの間の距離（標的配列に対し相同）は、少なくとも５ｂｐ、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、または少なくとも１ｋｂ、または少なくとも約２ｋｂ、または少なくとも約３ｋｂ、または少なくとも約４ｋｂ、または少なくとも５ｋｂ、または少なくとも約１０ｋｂを含有する。配列番号３のヌクレオチド１００１～２００１と２０２２～３０２２が５’相同アームと３’相同アームに選択された場合の例では、その２つの相同アームの間の距離は、２０ヌクレオチド（配列番号３のヌクレオチド２００２～２０２１に相当する）であってもよい。かかる相同アームは、配列番号３を含有する座位内、たとえば配列番号３のヌクレオチド１９９０～２０２１または２００２～２０２１内への外因性核酸配列の統合と、配列番号３のヌクレオチド２００２～２０２１の同時削除を介在することができる。
【0144】
発現強化座位内へ部位特異的統合を行うための外因性核酸を導入するための本明細書に開示されるベクターは、追加の遺伝子と、対象の外因性核酸とコードされるポリペプチドの発現を指示するための配列、および対象の外因性核酸の統合が成功した細胞の選択と特定のための配列を含んでもよい。かかる追加配列としては、たとえば転写及び翻訳の制御配列、選択マーカー遺伝子、およびそれに類するものが挙げられ、本明細書において以下にも記載されている。
【0145】
制御配列
部位特異的な様式で発現強化座位内に外因性核酸を導入するための本明細書に開示されるベクター、および部位特異的統合の結果として得られた細胞は、対象の外因性核酸、およびコードされるポリペプチドの発現を指示するための制御配列を含んでもよい。制御配列としては、転写プロモーター、エンハンサー、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の停止を管理する配列が挙げられる。転写管理配列および翻訳管理配列は、ウイルス性の供給源によって提供されてもよい。たとえば、普遍的に使用されているプロモーターとエンハンサーは、たとえばポリオーマ、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、マウスまたはヒトのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）などのウイルス、ＣＭＶ前初期（ＣＭＶ－ＩＥ）またはＣＭＶ主要ＩＥ（ＣＭＶ－ＭＩＥ）のプロモーター、ならびにＲＳＶ、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＬ３－３、ＭＭＴＶ、ユビキチン（Ｕｂｉ）、ユビキチンＣ（ＵｂＣ）、およびＨＩＶ ＬＴＲのプロモーターに由来する。ウイルス性ゲノムプロモーター、制御配列、および／またはシグナル配列は、発現を駆動するために利用されてもよく、提供されたかかる制御配列は、選ばれた宿主細胞と両立する。対象タンパク質が発現される細胞型に応じて、非ウイルス性細胞プロモーター（例えば、β－グロビンおよびＥＦ－１αプロモーター）を使用することもできる。外因性ＤＮＡ配列の発現に有用なその他の遺伝子要素を提供するために、ＳＶ４０ウイルス性ゲノムに由来するＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０起源の前期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライス、ならびにポリアデニル化部位を使用してもよい。前期プロモーターおよび後期プロモーターは特に有用である。その理由は、両プロモーターとも、断片としてＳＶ４０ウイルスから用意に取得され、これらも複製のＳＶ４０ウイルス起源を含むためである（Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３，１９７８）。より小さいＳＶ４０断片またはより大きいＳＶ４０断片も使用されてもよい。典型的には、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位から複製のＳＶ４０起源に位置付けられたＢｇｌＩ部位に向かって延在するほぼ２５０ｂｐの配列が含まれる。誘導性プロモーター（たとえば化合物、補因子、制御性タンパク質により誘導される）を使用することができ、それらは、生産期（流加培養）でのみ抗原結合タンパク質の産生を発生させ、増殖期（シードトレイン（ｓｅｅｄ ｔｒａｉｎ）培養）の間は発生させない場合に、特に有用である。誘導性または抑制性プロモーターの例としては、アルコール脱水素酵素Ｉ遺伝子プロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター系、グルココルチコイド受容体プロモーター、エストロゲン受容体プロモーター、エクジソン受容体プロモーター、メタロチオネイン系プロモーター、およびＴ７ポリメラーゼ系プロモーターが挙げられる。バイシストロニックベクターを介した複数の転写物の発現に適した配列は従前に報告されており（Ｋｉｍ Ｓ．Ｋ．ａｎｄ Ｗｏｌｄ Ｂ．Ｊ．，Ｃｅｌｌ ４２：１２９，１９８５）、これを本発明に使用することができる。タンパク質のマルチシストロニック発現に好適な戦略例としては、２Ａペプチド（Ｓｚｙｍｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ５：６２７－６３８（２００５））の使用、および内部リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）の使用が挙げられ、それらは両方とも当分野に公知である。その他のタイプの発現ベクターも有用であり、例えば、米国特許第４，６３４，６６５号（Ａｘｅｌら）および米国特許第４，６５６，１３４号（Ｒｉｎｇｏｌｄら）に記述されるものがある。
部位特異的な様式で発現強化座位内に外因性核酸を導入するための本明細書に開示されるベクター、および部位特異的統合の結果として得られた細胞は、対象の外因性核酸、およびコードされるポリペプチドの発現を指示するための制御配列を含んでもよい。制御配列としては、転写プロモーター、エンハンサー、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の停止を管理する配列が挙げられる。転写管理配列および翻訳管理配列は、ウイルス性の供給源によって提供されてもよい。たとえば、普遍的に使用されているプロモーターとエンハンサーは、たとえばポリオーマ、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、マウスまたはヒトのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）などのウイルス、ＣＭＶ前初期（ＣＭＶ－ＩＥ）またはＣＭＶ主要ＩＥ（ＣＭＶ－ＭＩＥ）のプロモーター、ならびにＲＳＶ、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＬ３－３、ＭＭＴＶ、ユビキチン（Ｕｂｉ）、ユビキチンＣ（ＵｂＣ）、およびＨＩＶ ＬＴＲのプロモーターに由来する。ウイルス性ゲノムプロモーター、制御配列、および／またはシグナル配列は、発現を駆動するために利用されてもよく、提供されたかかる制御配列は、選ばれた宿主細胞と両立する。対象タンパク質が発現される細胞型に応じて、非ウイルス性細胞プロモーター（例えば、β－グロビンおよびＥＦ－１αプロモーター）を使用することもできる。外因性ＤＮＡ配列の発現に有用なその他の遺伝子要素を提供するために、ＳＶ４０ウイルス性ゲノムに由来するＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０起源の前期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライス、ならびにポリアデニル化部位を使用してもよい。前期プロモーターおよび後期プロモーターは特に有用である。その理由は、両プロモーターとも、断片としてＳＶ４０ウイルスから用意に取得され、これらも複製のＳＶ４０ウイルス起源を含むためである（Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３，１９７８）。より小さいＳＶ４０断片またはより大きいＳＶ４０断片も使用されてもよい。典型的には、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位から複製のＳＶ４０起源に位置付けられたＢｇｌＩ部位に向かって延在するほぼ２５０ｂｐの配列が含まれる。誘導性プロモーター（たとえば化合物、補因子、制御性タンパク質により誘導される）を使用することができ、それらは、生産期（流加培養）でのみ抗原結合タンパク質の産生を発生させ、増殖期（シードトレイン（ｓｅｅｄ ｔｒａｉｎ）培養）の間は発生させない場合に、特に有用である。誘導性または抑制性プロモーターの例としては、アルコール脱水素酵素Ｉ遺伝子プロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター系、グルココルチコイド受容体プロモーター、エストロゲン受容体プロモーター、エクジソン受容体プロモーター、メタロチオネイン系プロモーター、およびＴ７ポリメラーゼ系プロモーターが挙げられる。バイシストロニックベクターを介した複数の転写物の発現に適した配列は従前に報告されており（Ｋｉｍ Ｓ．Ｋ．ａｎｄ Ｗｏｌｄ Ｂ．Ｊ．，Ｃｅｌｌ ４２：１２９，１９８５）、これを本発明に使用することができる。タンパク質のマルチシストロニック発現に好適な戦略例としては、２Ａペプチド（Ｓｚｙｍｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ５：６２７－６３８（２００５））の使用、および内部リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）の使用が挙げられ、それらは両方とも当分野に公知である。その他のタイプの発現ベクターも有用であり、例えば、米国特許第４，６３４，６６５号（Ａｘｅｌら）および米国特許第４，６５６，１３４号（Ｒｉｎｇｏｌｄら）に記述されるものがある。
【0146】
選択マーカー
部位特異的な様式で発現強化座位内に外因性核酸を導入するための本明細書に開示されるベクター、および部位特異的統合の結果として得られた細胞は、１つ以上の選択マーカー遺伝子を含んでもよい。
部位特異的な様式で発現強化座位内に外因性核酸を導入するための本明細書に開示されるベクター、および部位特異的統合の結果として得られた細胞は、１つ以上の選択マーカー遺伝子を含んでもよい。
【0147】
一部の実施形態では、選択マーカー遺伝子はたとえばＫａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．（１９８８）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：５３７の表１に記載されるものなど、薬剤耐性を寄与するものであり、ＤＨＦＲ－ＭＴＸ抵抗性、Ｐ－糖たんぱく質および多剤耐性（ＭＤＲ）－様々な脂溶性細胞毒性剤（たとえば、アドリアマイシン、コルヒチン、ビンクリスチン）、およびアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）－Ｘｙｌ－Ａ、またはアデノシンおよび２’－デオキシコホルマイシンへの耐性が挙げられる。他の主要な選択マーカーとしては、たとえばネオマイシン抵抗性、カナマイシン抵抗性、またはハイグロマイシン抵抗性などの微生物由来抗生物質抵抗性遺伝子が挙げられる。いくつかの適切な選択システムが、哺乳類宿主用に存在している（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記、頁１６．９－１６．１５）。２つの主要選択マーカーを用いた共トランスフェクションのプロトコールも報告されている（Ｏｋａｙａｍａ ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ５：１１３６，１９８５）。
【0148】
他の実施形態では、選択マーカー遺伝子は、場合により挿入および／もしくは置換が成功した、または成功していない遺伝子カセットの認識用の検出シグナルを提供する、または検出シグナルを生成することができるポリペプチドをコードする。適切な例としては、とくに蛍光マーカーまたはタンパク質、検出シグナルを生成する化学反応を触媒する酵素が挙げられる。蛍光マーカーの例は当分野に公知であり、限定されないが、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａサンゴ（ＤｓＲｅｄ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、藍色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、高感度藍色蛍光タンパク質（ｅＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、高感度黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）、および近赤外蛍光タンパク質（たとえば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙまたはＥ２－クリムゾン）が挙げられる。たとえば、Ｎａｇａｉ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．２００２ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０：８７－９０；Ｈｅｉｍ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．１９９５年２月２３日 Ｎａｔｕｒｅ ３７３：６６３－６６４；およびＳｔｒａｃｋ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．２００９ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４８：８２７９－８１を参照のこと。
【0149】
二特異性抗原結合タンパク質を作製するためのシステム
さらなる態様において、本開示は、細胞と、１つ以上のベクターの組み合わせを含み、および発現強化座位内に外因性核酸が統合された細胞の作製に利用可能なシステムを提供するものであり、当該外因性核酸はともに二特異性抗原結合タンパク質をコードする。当該システムは、たとえばキットの形態で提供されてもよい。
さらなる態様において、本開示は、細胞と、１つ以上のベクターの組み合わせを含み、および発現強化座位内に外因性核酸が統合された細胞の作製に利用可能なシステムを提供するものであり、当該外因性核酸はともに二特異性抗原結合タンパク質をコードする。当該システムは、たとえばキットの形態で提供されてもよい。
【0150】
一部の実施形態では、システムは、効率的なベクター構築、および発現強化座位内の特定の部位へＲＭＣＥを介して複数の外因性核酸を同時統合することが可能となるよう設計される。同時統合により、所望されるクローンの迅速な単離が可能となり、１つの発現強化座位を使用することは、安定した細胞株の生成にも重要である。
【0151】
一部の実施形態では、ＲＭＣＥを介して複数の外因性核酸が統合されるよう設計された上述のベクターセットの内のいずれか１つと、発現強化座位内の特定の部位に統合され、ベクターセット中のＲＲＳと合致しているＲＲＳを含有する細胞を含むシステムが提供される。たとえばシステムは細胞とベクターセットを含み、この場合において当該細胞は、５’から３’の方向に、そのゲノムの発現強化座位内に統合された以下を含有する：第一のＲＲＳ、第一の外因性核酸、第二のＲＲＳ、第二の外因性核酸、および第三のＲＲＳ。この場合においてその３つのＲＲＳは互いに異なっている。この場合においてベクターセットは、５’から３’の方向に第一のＲＲＳ、第一のＬＣＦ（たとえば第一のＶＬ）をコードするヌクレオチド配列を備えた第一の核酸、そして第二のＲＲＳを備えた第一のベクターと、第二のＲＲＳ、第一のＨＣＦ（たとえば第一のＶＨ）をコードするヌクレオチド配列を備えた第二の核酸、そして第三のＲＲＳを備えた第二のベクターを含み、この場合において第一の核酸または第二の核酸のいずれかは第二のＨＣＦ（たとえば第二のＶＨ）をコードするヌクレオチド配列をさらに備える。ベクターが細胞内に導入されると、ベクター中の第一および第二の核酸が、第一、第二および第三のＲＲＳにより介在される組み換えを介して発現強化座位内に統合する。ベクターから座位内に適切に統合された核酸を有するトランスフェクタントのスクリーニングを容易にするために、システムの細胞中の第一の外因性核酸は、第一の選択マーカー遺伝子を含んでもよく、細胞中の第二の外因性核酸は、第二の選択マーカー遺伝子を含んでもよく、この場合において第一および第二の選択マーカー遺伝子は互いに異なっており、そしてベクターによりもたらされる任意の選択マーカー遺伝子とも異なっている。特定の実施形態では、第一および第二の選択マーカー遺伝子は、蛍光タンパク質（ネガティブ選択を提供することができる）をコードし、ベクター上の第一および第二の核酸は、ポジティブ選択を提供するために分割形式で追加の選択マーカー遺伝子を提供する。ネガティブ選択単独でも迅速なクローン単離が可能であるが、意図される組み換えを伴うクローンの単離効率は限定的である場合がある（約１％）。ポジティブ選択（新たな蛍光、または薬剤もしくは抗生物質に対する抵抗性）とネガティブ選択を組み合わせることで、陽性クローンの単離効率は大幅に改善され得る（約８０％まで）。
【0152】
システムは、追加の構成要素、試薬、または情報、たとえばトランスフェクションによる、システムの細胞内へのシステムのベクター導入に関するプロトコールなどを含んでもよい。非限定的なトランスフェクション方法としては、化学系のトランスフェクション法が挙げられ、リポソーム、ナノ粒子、リン酸カルシウム（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２（２）：４５６－６７，Ｂａｃｃｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９７７） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７４（４）：１５９０－４ ａｎｄ，Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ（１９９１） Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ．ｐｐ．９６－９７）、デンドリマー、またはたとえばＤＥＡＥデキストランもしくはポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーの使用が挙げられる。非化学的な方法としては、エレクトロポレーション法、ソノ－ポレーション法、および光学的トランスフェクション法が挙げられる。粒子系のトランスフェクション法としては、遺伝子銃、磁性補助トランスフェクション法（Ｂｅｒｔｒａｍ，Ｊ．（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７，２７７－２８）の使用が挙げられる。ウイルス法もトランスフェクションに使用することができる。ｍＲＮＡ送達は、ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（商標）およびＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）（Ｂｉｒｅ ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１３，１３：７５）を使用する方法が挙げられる。普遍的に使用されている細胞内に異種ＤＮＡを導入する１つの方法は、リン酸カルシウム沈殿法であり、たとえば、Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５６７，１９８０）に記載されている。細菌プロトプラストと、哺乳類細胞のポリエチレン誘導性融合（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１６３）は、もう１つの有用な異種ＤＮＡ導入方法である。エレクトロポレーション法は、宿主細胞の細胞質内に直接ＤＮＡを導入するために使用することもでき、たとえば、Ｐｏｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：７１６１，１９８８）またはＳｈｉｇｅｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：７４２，１９８８）に記載されている。哺乳類細胞内への異種ＤＮＡの導入に有用な他の試薬は、たとえばＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）試薬およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、米国メリーランド州、ゲイザースバーグ）などが報告されている。これらの市販の試薬は両方とも脂質－核酸複合体（またはリポソーム）を形成するために使用され、培養細胞に適用される場合、細胞内への核酸取り込みを促進する。
【0153】
二特異性抗原結合タンパク質の作製方法
本開示は、二特異性抗原結合タンパク質の作製方法もさらに提供する。本方法を利用することで、二特異性抗原結合タンパク質（たとえば二特異性抗体）が高力価および／または高い特異的生産性（ｐｇ／細胞／日）で産生され得る。一部の実施形態では、二特異性抗原結合タンパク質は、少なくとも５ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ、２５ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ、３５ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ、４５ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌまたはそれ以上の力価で産生される。一部の実施形態では、総抗原結合タンパク質力価に対する二特異性抗原結合タンパク質力価の比率が、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％またはそれ以上で、二特異性抗原結合タンパク質が産生される。一部の実施形態では、二特異性抗原結合タンパク質は、１日当たり、１細胞当たりで産生される総抗原結合タンパク質（ｐｇ）に基づき決定される特異的生産性が、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５ピコグラム／細胞／日またはそれ以上で、産生される。
本開示は、二特異性抗原結合タンパク質の作製方法もさらに提供する。本方法を利用することで、二特異性抗原結合タンパク質（たとえば二特異性抗体）が高力価および／または高い特異的生産性（ｐｇ／細胞／日）で産生され得る。一部の実施形態では、二特異性抗原結合タンパク質は、少なくとも５ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１５ｍｇ／Ｌ、２０ｍｇ／Ｌ、２５ｍｇ／Ｌ、３０ｍｇ／Ｌ、３５ｍｇ／Ｌ、４０ｍｇ／Ｌ、４５ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌまたはそれ以上の力価で産生される。一部の実施形態では、総抗原結合タンパク質力価に対する二特異性抗原結合タンパク質力価の比率が、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％またはそれ以上で、二特異性抗原結合タンパク質が産生される。一部の実施形態では、二特異性抗原結合タンパク質は、１日当たり、１細胞当たりで産生される総抗原結合タンパク質（ｐｇ）に基づき決定される特異的生産性が、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５ピコグラム／細胞／日またはそれ以上で、産生される。
【0154】
１つの実施形態では、当該方法は、本明細書に開示されるシステムを利用し、そしてトランスフェクションによって当該システムの細胞内に、当該システムのベクターを導入する。ＲＭＣＥを介して細胞の標的強化発現座位内に外因性核酸が適切に統合されたトランスフェクト細胞がスクリーニングされ、特定されてもよい。２つのＨＣＦ含有ポリペプチドおよび少なくとも１つのＬＣＦ含有ポリペプチドは、統合核酸から発現されることができ、その３つのポリペプチドすべてを含有する二特異性抗原結合タンパク質は、特定されたトランスフェクト細胞から取得され、公知の方法を使用して精製されることができる。
【0155】
一部の実施形態では、方法は、（ｉ）細胞とベクターセットを含むシステムを提供することであって、当該細胞は、５’から３’の方向に、そのゲノムの発現強化座位内に統合された、第一のＲＲＳ、第一の外因性核酸、第二のＲＲＳ、第二の外因性核酸、および第三のＲＲＳを含有し、この場合においてその３つのＲＲＳは互いに異なっており、当該ベクターセットは、５’から３’の方向に第一のＲＲＳ、第一のＬＣＦ（たとえば第一のＶＬ）をコードするヌクレオチド配列を備えた第一の核酸、そして第二のＲＲＳを備えた第一のベクターと、第二のＲＲＳ、第一のＨＣＦ（たとえば第一のＶＨ）をコードするヌクレオチド配列を備えた第二の核酸、そして第三のＲＲＳを備えた第二のベクターを含み、この場合において第一の核酸または第二の核酸のいずれかは第二のＨＣＦ（たとえば第二のＶＨ）をコードするヌクレオチド配列をさらに備えること、（ｉｉ）当該ベクターを、当該細胞内に同時に導入すること、および（ｉｉｉ）ベクター中の第一の核酸と第二の核酸が、第一、第二、および第三のＲＲＳにより介在される組み換えを介して強化発現座位内に同時に統合された形質転換細胞をスクリーニングすること、を含む。
【0156】
本方法の特定の実施形態では、ベクターから座位内に適切に統合された核酸を有する形質転換体のスクリーニングを容易にするために、システムの細胞中の第一の外因性核酸は、第一の選択マーカー遺伝子を含んでもよく、細胞中の第二の外因性核酸は、第二の選択マーカー遺伝子を含んでもよく、この場合において第一および第二の選択マーカー遺伝子は互いに異なっており、そしてベクター上の第一および第二の核酸はともに、分割形式で追加の選択マーカーをコードし、分割形式では、同時統合の後に、当該追加の選択マーカー遺伝子をコードする完全配列がもたらされる。形質転換体のスクリーニングは、第一および第二の選択マーカーに対する選択（ネガティブ選択）、そして追加の選択マーカーを目的とした選択（ポジティブ選択）を行うように実施されてもよい。
【0157】
別の実施形態では、当該方法は単純に、細胞の発現強化座位内の特定の部位で統合された外因性核酸配列を有する細胞を利用するものであり、この場合において当該外因性核酸配列は、二特異性抗原結合タンパク質をコードし、当該細胞から当該二特異性抗原結合タンパク質を発現させる。特定の統合部位内で連続的なクローン化発現カセット。
【0158】
本明細書は、限定するものとして解釈すべきではない以下の実施例により、さらに例示される。全ての引用参考文献（本出願全体で引用される文献参照、発行特許、及び公表された特許出願を含む）は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【実施例】
【0159】
実施例１：二特異性抗体発現プラスミドのクローニング：
二特異性抗体の重鎖と軽鎖の構成要素を、ハイブリドーマ細胞、Ｂ細胞、プラズマ細胞、または組み換え抗体遺伝子ライブラリから、当分野に公知の方法を使用してクローニングしてもよい。たとえば、抗体は、ファイブプライムＲＡＣＥ ＰＣＲ、またはリーダーペプチド、フレームワーク１配列、フレームワーク４配列、もしくは定常領域配列に対するプライマーを使用したＰＣＲにより、ハイブリドーマまたはＢ細胞からクローニングされてもよい。あるいは、抗体発現細胞中の抗体遺伝子またはｍＲＮＡを次世代シークエンスにより配列解析し、その後、バイオインフォマティクスを介して特定してもよい。抗体タンパク質を配列解析し、合成ＤＮＡ技術により対応する抗体遺伝子をクローニングすることも実現可能である。たとえば酵母ライブラリまたはファージライブラリなどの組み換え抗体ライブラリも、抗体遺伝子の供給源である。
二特異性抗体の重鎖と軽鎖の構成要素を、ハイブリドーマ細胞、Ｂ細胞、プラズマ細胞、または組み換え抗体遺伝子ライブラリから、当分野に公知の方法を使用してクローニングしてもよい。たとえば、抗体は、ファイブプライムＲＡＣＥ ＰＣＲ、またはリーダーペプチド、フレームワーク１配列、フレームワーク４配列、もしくは定常領域配列に対するプライマーを使用したＰＣＲにより、ハイブリドーマまたはＢ細胞からクローニングされてもよい。あるいは、抗体発現細胞中の抗体遺伝子またはｍＲＮＡを次世代シークエンスにより配列解析し、その後、バイオインフォマティクスを介して特定してもよい。抗体タンパク質を配列解析し、合成ＤＮＡ技術により対応する抗体遺伝子をクローニングすることも実現可能である。たとえば酵母ライブラリまたはファージライブラリなどの組み換え抗体ライブラリも、抗体遺伝子の供給源である。
【0160】
ＣＨＯ発現細胞株のＲＳＸ４１８９－１、ＲＳＸ４１８７－１、ＲＳＸ４１９１－１、およびＲＳＸ４１８８－１はそれぞれ、３つの別個のポリペプチドから構成される二特異性抗体を産生する：ＡｂＣ１、ＡｂＣ２、およびＡｂＣ３（図５）。ＲＳＸ４１８９－１構築用のプラスミドを作製するために、Ｍｆｅ Ｉで消化することによりＡｂＣ１プラスミドを直線化させた。Ｍｆｅ Ｉは、ＡｂＣ１遺伝子に対し、３’であった。Ｍｆｅ Ｉ消化によりＡｂＣ２プラスミドから切り出されたＡｂＣ２発現カセットは、直線化ＡｂＣ１プラスミドのＭｆｅ Ｉ部位にライゲートされた。ライゲーション産物を、ＤＨ１０Ｂ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換した。形質転換を行い、アンピシリン含有ＬＢ培地中で増殖させた後、ＡｂＣ１遺伝子とＡｂＣ２遺伝子を含有する所望のプラスミドの担持に関し、個々の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コロニーを解析した。ＡｂＣ３プラスミドと、ＡｂＣ１－ＡｂＣ２二重発現プラスミドに対するマキシ‐プレップＤＮＡ（ｍａｘｉ－ｐｒｅｐ ＤＮＡ）の配列は、サンガーシークエンスにより確認された。これら２つのプラスミドは、Ｃｒｅ発現プラスミドのｐＲＧ８５８とともに、リポフェクタミンを使用して、ＥＥＳＹＲ（登録商標）座位でＲＲＳ１とＲＲＳ３部位を担持するＥＥＳＹＲ（登録商標）宿主細胞へとトランスフェクトされた。トランスフェクトされた細胞は１２日間、抗生物質を使用して選択され、その後、組み換え細胞はＲＳＸ４１８９－１として保存された。
【0161】
ＲＳＸ４１８７－１構築用のプラスミドを作製するために、Ｍｌｕ Ｉ部位とＮｈｅ Ｉ部位に隣接されるＡｂＣ３発現カセットを、ＡｂＣ２プラスミド中のＭｌｕ Ｉ部位とＳｐｅ Ｉ部位内にクローニングした。Ｍｌｕ Ｉ部位とＳｐｅ Ｉ部位は、ＡｂＣ２遺伝子に対し３’であった。ＡｂＣ２－ＡｂＣ３プラスミド、ＡｂＣ１プラスミド、そしてＣｒｅプラスミドｐＲＧ８５８を１つにまとめ、リポフェクタミンを使用して、ＥＥＳＹＲ（登録商標）宿主細胞へと共トランスフェクトした。ＲＭＣＥを経た細胞を、ＲＳＸ４１８７－１として保存した。
【0162】
ＲＳＸ４１９１－１構築用のプラスミドを作製するために、ＡｂＣ３発現カセットを、ＡｂＣ１プラスミド中のＭｆｅ Ｉ部位内にクローニングした。Ｍｆｅ Ｉ部位は、ＡｂＣ１遺伝子に対し３’であった。ＡｂＣ１－ＡｂＣ３プラスミド、ＡｂＣ２プラスミド、そしてＣｒｅプラスミドｐＲＧ８５８を１つにまとめ、リポフェクタミンを使用して、ＥＥＳＹＲ（登録商標）宿主細胞へと共トランスフェクトした。ＲＭＣＥを経た細胞を、ＲＳＸ４１９１－１として保存した。
【0163】
ＲＳＸ４１８８－１構築用のプラスミドを作製するために、Ｍｌｕ Ｉ部位とＮｈｅ Ｉ部位に隣接されるＡｂＣ２発現カセットを、ＡｂＣ３プラスミド中のＭｌｕ Ｉ部位とＳｐｅ Ｉ部位内にクローニングした。Ｍｌｕ Ｉ部位とＳｐｅ Ｉ部位は、ＡｂＣ３遺伝子に対し３’であった。ＡｂＣ３－ＡｂＣ２プラスミド、ＡｂＣ１プラスミド、そしてＣｒｅプラスミドｐＲＧ８５８を１つにまとめ、リポフェクタミンを使用して、ＥＥＳＹＲ（登録商標）宿主細胞へと共トランスフェクトした。ＲＭＣＥを経た細胞を、ＲＳＸ４１８８－１として保存した。
【0164】
実施例２：ＥＥＳＹＲ（登録商標）座位からの二特異性抗体の発現
二特異性抗体発現細胞株のＲＳＸ４１８９－１、ＲＳＸ４１８７－１、ＲＳＸ４１９１－１、およびＲＳＸ４１８８－１を、無血清培地中、懸濁状態で培養した。それらの二特異性抗体の発現レベルを定量するために、培養物の細胞数を、Ｇｕａｖａフローサイトメーター上で計測し、１ｍｌの培地当たり２００万個の細胞を含有する振とうフラスコ培養を新たに開始した。４日後、馴化培地を遠心後に回収し、細胞を除去した。二特異性抗体価は、その二特異性抗体に特異的なプロテインＡ ＨＰＬＣアッセイを使用して決定された。ＲＳＸ４１８９－１、ＲＳＸ４１８７－１、ＲＳＸ４１９１－１、およびＲＳＸ４１８８－１から発現された二特異性抗体タンパク質の力価はそれぞれ、３７．８ｍｇ／Ｌ、４０．５ｍｇ／Ｌ、４８．３ｍｇ／Ｌ、および２１．８ｍｇ／Ｌであった。これら細胞株から発現されたすべての抗体タンパク質（二特異性抗体タンパク質と一特異性抗体タンパク質を含む）の総力価と、総抗体タンパク質力価に対する二特異性抗体タンパク質力価の比率を、以下の表に示す。
二特異性抗体発現細胞株のＲＳＸ４１８９－１、ＲＳＸ４１８７－１、ＲＳＸ４１９１－１、およびＲＳＸ４１８８－１を、無血清培地中、懸濁状態で培養した。それらの二特異性抗体の発現レベルを定量するために、培養物の細胞数を、Ｇｕａｖａフローサイトメーター上で計測し、１ｍｌの培地当たり２００万個の細胞を含有する振とうフラスコ培養を新たに開始した。４日後、馴化培地を遠心後に回収し、細胞を除去した。二特異性抗体価は、その二特異性抗体に特異的なプロテインＡ ＨＰＬＣアッセイを使用して決定された。ＲＳＸ４１８９－１、ＲＳＸ４１８７－１、ＲＳＸ４１９１－１、およびＲＳＸ４１８８－１から発現された二特異性抗体タンパク質の力価はそれぞれ、３７．８ｍｇ／Ｌ、４０．５ｍｇ／Ｌ、４８．３ｍｇ／Ｌ、および２１．８ｍｇ／Ｌであった。これら細胞株から発現されたすべての抗体タンパク質（二特異性抗体タンパク質と一特異性抗体タンパク質を含む）の総力価と、総抗体タンパク質力価に対する二特異性抗体タンパク質力価の比率を、以下の表に示す。
【表1】
【0165】
配列表
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【表2-4】
【表2-5】
【表2-6】
【表2-7】
【表2-8】
【表2-9】
【表2-10】
【表2-11】
【表2-12】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】